JP2023528406A - ウイルス精製のための材料及び方法 - Google Patents

Abstract

クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えばＭＮａｓｅ）を用いたＡＡＶ粒子の精製方法、及びＡＡＶ粒子とクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えばＭＮａｓｅ）とを含む組成物が記載されている。ＡＡＶ粒子の精製のためのクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＭＮａｓｅ）を含む組成物及びキットも提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，４４９号、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，４９２号、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，５３１号、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，５４９号、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，６３１号、２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，６４３号、及び２０２０年６月２日出願の米国特許出願第６３／０３３，７３１号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus、ＡＡＶ）は、標的細胞に核酸を送達するように操作することができる非エンベロープウイルスであり、遺伝子治療及び遺伝子送達用途において有用なビヒクルとして浮上している。ウイルスＤＮＡを欠く組換えＡＡＶ（Recombinant AAV、ｒＡＡＶ）は、本質的に、細胞膜を横断するように操作されたタンパク質ベースのナノ粒子であり、最終的に、その核酸というカーゴを細胞の核内に輸送及び送達することができる。持続的な遺伝子発現、広範な組織向性を有してヒト集団において天然に存在すること、非組込み性、非病原性、低い免疫原性、有糸分裂後細胞の感染性、及び他のウイルス系と比較した場合の相対的な産生の容易さといった、このウイルスによって付与される特性は、ヒトでの使用の迅速な拡大をもたらした。ｒＡＡＶを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子送達ベクターは、広範な用途のために安全かつ有効なものとして再び登場してきた。

臨床環境におけるＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）の使用は、遺伝子治療における使用に適した十分なウイルス力価も有する、非常に大量の純粋なＡＡＶ粒子を生成することができる産生系及び精製系に対する緊急のニーズを明確に示している。しかし、現在の技術は、全ての不純物、例えば、ベクター産物が生成される産生系の成分に由来する、残留レベルのタンパク質及び核酸などを除去することができない。したがって、高度に純粋なＡＡＶ粒子及び高いウイルス力価を有するＡＡＶ粒子の組成物の産生に対して、未だ満たされていないニーズが存在している。

一態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、当該方法は、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む方法が本明細書で提供される。

一実施形態では、精製することは、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

一実施形態では、本方法は、ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子を結合するのに十分な時間にわたりインキュベートすることを更に含む。

一実施形態では、本方法は、固体支持体を洗浄することを更に含む。一実施形態では、洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である。

一実施形態では、本方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。

一実施形態では、上清は、清澄化された上清である。

一実施形態では、ステップ（ａ）のベンゾナーゼ（登録商標）組成物は、を更に含む。

一実施形態では、インキュベーションは、約１０分間～約１時間である。一実施形態では、インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である。一実施形態では、インキュベーションは、約３０分間である。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（micrococcal nuclease、ＭＮａｓｅ）である。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、結合されたＡＡＶ粒子を含有する固体支持体と共にインキュベートされる。

一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して、固体支持体から溶出される。一実施形態では、溶出は、低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である。

一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である。

一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー精製は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。

一実施形態では、溶出は、低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む。一実施形態では、中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む。

一実施形態では、溶出は、エタノールを更に含む。一実施形態では、エタノールは、約５％～約４０％である。一実施形態では、エタノールは、約１０％～約３０％である。一実施形態では、エタノールは、約１５％～約２５％である。一実施形態では、エタノールは、約２０％のエタノールである。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、増加したウイルス力価を有する。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（dynamic light scatter、ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比（full-to-empty capsid ratio）を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、減少した２６０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、減少した２８０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。

一態様では、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるための方法であって、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む方法が本明細書で提供される。

一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的ウイルス力価を含む。

一実施形態では、精製することは、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

一実施形態では、本方法は、ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子を結合するのに十分な時間にわたりインキュベートすることを更に含む。

一実施形態では、本方法は、固体支持体を洗浄することを更に含む。一実施形態では、洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である。

一実施形態では、本方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。

一実施形態では、上清は、清澄化された上清である。

一実施形態では、ステップ（ａ）のベンゾナーゼ（登録商標）組成物は、を更に含む。

１つの実施形態では、インキュベーションは、約１０分間～約１時間である。一実施形態では、インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である。一実施形態では、インキュベーションは、約３０分間である。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、結合されたＡＡＶ粒子を含有する固体支持体と共にインキュベートされる。

一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して、固体支持体から溶出される。一実施形態では、溶出は、低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である。

一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である。

一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー精製は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。

一実施形態では、溶出は、低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む。一実施形態では、中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む。

一実施形態では、溶出は、エタノールを更に含む。一実施形態では、エタノールは、約５％～約４０％である。一実施形態では、エタノールは、約１０％～約３０％である。一実施形態では、エタノールは、約１５％～約２５％である。一実施形態では、エタノールは、約２０％のエタノールである。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない。

一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、減少した２６０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、減少した２８０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。

一態様では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む精製方法によってＡＡＶ粒子が精製された、精製されたＡＡＶ粒子の組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、精製方法は、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

一実施形態では、精製方法は、ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子を結合するのに十分な時間にわたりインキュベートすることを更に含む。

一実施形態では、精製方法は、固体支持体を洗浄することを更に含む。一実施形態では、洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である。一実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である

一実施形態では、精製方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。

一実施形態では、上清は、清澄化された上清である。

一実施形態では、精製方法は、ベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む。

一実施形態では、精製方法は、低ｐＨ緩衝液による溶出を含む。一実施形態では、精製方法は、低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である。

一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である。一実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である。

一実施形態では、精製方法は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。一実施形態では、精製方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む。

一実施形態では、溶出は、低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む。一実施形態では、中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む。

一実施形態では、溶出は、エタノールを更に含む。一実施形態では、エタノールは、約５％～約４０％である。一実施形態では、エタノールは、約１０％～約３０％である。一実施形態では、エタノールは、約１５％～約２５％である。一実施形態では、エタノールは、約２０％のエタノールである。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、不純物を実質的に含まない。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である。一実施形態では、宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、組成物は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、陰イオン交換クロマトグラムによって測定される場合、低減されたポストプロダクトＡＡＶ粒子画分ピークを含む。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合、増加したウイルス力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する。

一実施形態では、組成物は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。一実施形態では、組成物は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。一実施形態では、組成物は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。

一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、２６０ｎｍでの吸光度が低下したＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。一実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、２８０ｎｍでの吸光度が低下したＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼはＭＮａｓｅである。

一態様では、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まないＡＡＶ粒子の産生に使用するための組成物であって、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む組成物が本明細書で提供される。

一実施形態では、組成物はベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する。

別の一態様では、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む組成物が本明細書で提供される。

一実施形態では、組成物はベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子不純物を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、巨視的不純物及び微視的不純物を含む。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される際、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一態様では、（ａ）ベンゾナーゼ（登録商標）と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含むキットが本明細書で提供される。

一実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。一実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子不純物を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、巨視的不純物及び微視的不純物を含む。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される際、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する。

一態様では、精製されたＡＡＶ粒子中の不純物を減少させるための手段を含む組成物が、本明細書で提供される。

一実施形態では、不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。一実施形態では、不純物は、巨視的不純物、微視的不純物、又はその両方である。

別の一態様では、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるための手段を含む組成物が、本明細書で提供される。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的ウイルス力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

更に別の一態様では、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるための手段を含む組成物が、本明細書で提供される。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

別の一態様では、ＡＡＶ粒子の完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるための手段を含む組成物が、本明細書で提供される。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である。

一態様では、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含む組成物が、本明細書で提供される。

一態様では、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含む組成物が、本明細書で提供される。

一態様では、ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を除去するための第１の手段と、残留宿主産生細胞核酸及び／又はタンパク質を除去するための第２の手段と、を含む組成物が、本明細書で提供される。

一態様では、（ｉ）ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を除去するためのステップを含む、ＡＡＶ粒子を精製する方法が、本明細書で提供される。一実施形態では、本方法は、（ｉｉ）残留宿主産生細胞核酸及び／又はタンパク質を除去するための第２のステップを更に含む。一実施形態では、本方法は、（ｉｉｉ）ウイルス力価を増加させるための第３のステップを更に含む。

一態様では、不純物を実質的に含まない、精製されたＡＡＶ粒子を作製及び取得するための手段を含むシステムが、本明細書で提供される。一実施形態では、不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。一実施形態では、不純物は、巨視的不純物、微視的不純物、又はその両方である。

一態様では、増加したウイルス力価を有するＡＡＶ粒子を作製及び取得するための手段を含むシステムが、本明細書で提供される。

一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一態様では、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるための手段を含むシステムが、本明細書で提供される。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一態様では、ＡＡＶ粒子の完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるための手段を含むシステムが、本明細書で提供される。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である。

一態様では、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含むシステムが、本明細書で提供される。

一態様では、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含むシステムが、本明細書で提供される。

一態様では、ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を除去するための第１の手段と、宿主産生から残留核酸を除去するための第２の手段と、を含むシステムが、本明細書で提供される。

本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。

上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
ＭＮａｓｅ処理が、ＡＡＶ粒子のアフィニティークロマトグラフィーに影響を及ぼさないことを示す。ウイルス粒子を含有する上清を通常のｐＨ（７．５）でカラムに結合させ、ベンゾナーゼ（登録商標）を、ＭＮａｓｅと共に（図１Ａ）又はＭＮａｓｅなしで（図１Ｂ）、ＡＡＶＸ含有結合ウイルスに直接添加した。このステップにおけるＭＮａｓｅの添加は、クロマトグラムの形状又はウイルス粒子の収量に影響を与えなかった。 ＭＮａｓｅ処理が、ＡＡＶ粒子のアフィニティークロマトグラフィーに影響を及ぼさないことを示す。ウイルス粒子を含有する上清を通常のｐＨ（７．５）でカラムに結合させ、ベンゾナーゼ（登録商標）を、ＭＮａｓｅと共に（図１Ａ）又はＭＮａｓｅなしで（図１Ｂ）、ＡＡＶＸ含有結合ウイルスに直接添加した。このステップにおけるＭＮａｓｅの添加は、クロマトグラムの形状又はウイルス粒子の収量に影響を与えなかった。 ＭＮａｓｅの添加が、ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を放出させたことを示す。図２Ａは、無処理（第１のレーン）、２．５Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅ、又は６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅの３０分後に、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、産生物ピーク（左）に対応する試料画分を収集した後のゲル電気泳動及び銀染色（右）を示す。６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅは、約１０ｋＤａ付近に強いバンドを生じ、これはヒストンの予測された分子量付近である。ポストプロダクトピーク画分から試料を採取し、電気泳動を実施して、試料中に存在し得るあらゆるクロマチンを可視化した（図６Ｂ）。結果は、アフィニティー捕捉クロマトグラフィー中のＭＮａｓｅによる処理が、ｒＡＡＶ８粒子からクロマチンを除去するのに十分であることを示した。レーン１は１ｋｂラダーであり、レーン２は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用して、懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン３はレーン２の試料の１：１０希釈であり、レーン４は、トランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン５はレーン４の試料の１：１０希釈であり、レーン６は、トランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生され、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化させたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン７は、レーン６の試料の１：１０希釈である。 ＭＮａｓｅの添加が、ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を放出させたことを示す。図２Ａは、無処理（第１のレーン）、２．５Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅ、又は６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅの３０分後に、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、産生物ピーク（左）に対応する試料画分を収集した後のゲル電気泳動及び銀染色（右）を示す。６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅは、約１０ｋＤａ付近に強いバンドを生じ、これはヒストンの予測された分子量付近である。ポストプロダクトピーク画分から試料を採取し、電気泳動を実施して、試料中に存在し得るあらゆるクロマチンを可視化した（図６Ｂ）。結果は、アフィニティー捕捉クロマトグラフィー中のＭＮａｓｅによる処理が、ｒＡＡＶ８粒子からクロマチンを除去するのに十分であることを示した。レーン１は１ｋｂラダーであり、レーン２は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用して、懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン３はレーン２の試料の１：１０希釈であり、レーン４は、トランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン５はレーン４の試料の１：１０希釈であり、レーン６は、トランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生され、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化させたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン７は、レーン６の試料の１：１０希釈である。 接着細胞培養物におけるＡＡＶ粒子産生中の最小限の細胞死が、アフィニティー捕捉中に、有意でないポストプロダクトピークを生じることを示す。 クロマチン消化のための６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅ処理（図４Ｂ）が、ＭＮａｓｅ処理されないＡＡＶ粒子精製（図４Ａ）と比較した場合に、ＡＡＶ粒子精製を強化することを示す。ポストプロダクトピークに対する、２６０ｎｍ（ＲＮＡ／ＤＮＡ）吸光度の大きな寄与は、ＭＮａｓｅ処理後に、２８０ｎｍ（タンパク質）吸光度ピークと同様に大きく減少する。 クロマチン消化のための６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅ処理（図４Ｂ）が、ＭＮａｓｅ処理されないＡＡＶ粒子精製（図４Ａ）と比較した場合に、ＡＡＶ粒子精製を強化することを示す。ポストプロダクトピークに対する、２６０ｎｍ（ＲＮＡ／ＤＮＡ）吸光度の大きな寄与は、ＭＮａｓｅ処理後に、２８０ｎｍ（タンパク質）吸光度ピークと同様に大きく減少する。 ＭＮａｓｅで処理した又は処理されなかった試料を含むｒＡＡＶ８粒子からのクロマトグラムのオーバーレイを示す。ＭＮａｓｅの添加は、ＤＮＡ／ＲＮＡ（２６０ｎｍ）（図５Ａ）及びタンパク質（２８０ｎｍ）（図５Ｂ）に対するポストプロダクトピーク高さの有意な減少を引き起こし、これは、ポストプロダクトピークが、ウイルス外で結合したクロマチンを含有するＡＡＶ粒子であること、及びＭＮａｓｅ処理がＡＡＶ粒子の精製を強化したことを示した。 ＭＮａｓｅで処理した又は処理されなかった試料を含むｒＡＡＶ８粒子からのクロマトグラムのオーバーレイを示す。ＭＮａｓｅの添加は、ＤＮＡ／ＲＮＡ（２６０ｎｍ）（図５Ａ）及びタンパク質（２８０ｎｍ）（図５Ｂ）に対するポストプロダクトピーク高さの有意な減少を引き起こし、これは、ポストプロダクトピークが、ウイルス外で結合したクロマチンを含有するＡＡＶ粒子であること、及びＭＮａｓｅ処理がＡＡＶ粒子の精製を強化したことを示した。 ＭＮａｓｅ処理が、正常なＡＡＶ粒子精製操作の間に、クロマチンが消化及び除去されることを可能にすることを示す。陰イオン交換クロマトグラフィー後のポストプロダクトピークの銀染色分析は、約２０ｋＤａのバンドを含む、非ＭＮａｓｅ消化試料中に存在するタンパク質不純物を明らかにした（図６Ａ）。レーン１は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサーを使用して懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生したｒＡＡＶ８粒子であり、レーン２は、エンハンサーを含まない懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子であり、レーン３は、エンハンサーを含まない懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生され、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化されたｒＡＡＶ８粒子である。 ＭＮａｓｅなし（図７Ａ）又はＭＮａｓｅが２．５Ｕ／ｍＬ（図７Ｂ）から、ＭＮａｓｅが６０Ｕ／ｍＬ（図７Ｃ）へのＭＮａｓｅ量の増加が、陰イオン交換クロマトグラフィー仕上げステップにおけるクロマチン結合ＡＡＶ粒子を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅなし（図７Ａ）又はＭＮａｓｅが２．５Ｕ／ｍＬ（図７Ｂ）から、ＭＮａｓｅが６０Ｕ／ｍＬ（図７Ｃ）へのＭＮａｓｅ量の増加が、陰イオン交換クロマトグラフィー仕上げステップにおけるクロマチン結合ＡＡＶ粒子を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅなし（図７Ａ）又はＭＮａｓｅが２．５Ｕ／ｍＬ（図７Ｂ）から、ＭＮａｓｅが６０Ｕ／ｍＬ（図７Ｃ）へのＭＮａｓｅ量の増加が、陰イオン交換クロマトグラフィー仕上げステップにおけるクロマチン結合ＡＡＶ粒子を減少させたことを示す。 ポストプロダクトピークの検査が、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサーを使用して又はエンハンサーなしで産生された、ＭＮａｓｅ処理しなかった試料において、目に見える沈殿物を示したことを示す。しかし、ＭＮａｓｅによる消化は、ウイルス粒子の凝集及び沈殿を妨げた。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理なしの高／低ｐＨ溶出（図９Ａ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理なしのクエン酸塩溶出（図９Ｂ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理なしの低ｐＨ溶出（図９Ｃ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理ありの高／低ｐＨ溶出（図９Ｄ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理ありのクエン酸塩溶出（図９Ｅ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、３つの異なるタイプの溶出を使用した、ＭＮａｓｅ処理されなかった試料と比較した場合に、プロダクトピーク画分中のＤＮＡの量を増加させたことを示す。ＭＮａｓｅ処理有の低ｐＨ溶出（図９Ｆ）。レーン１（酵素負荷、「Ｌ」）、レーン２（酵素ウォッシュアウト、「Ｗ」）、レーン３（高ｐＨウォッシュ「Ｈ」又は空レーン「Ｘ」）、レーン４（アニオン交換プロダクトピーク「Ｐ」）、レーン５（アニオン交換ポストプロダクトピーク「ＰＰ」）、及びレーン６（ＡＡＶＸストリップピーク「Ｓ」）。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていない試料及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサーを使用して生成された試料と比較した場合に、ウイルス力価（図１０Ａ）を増加させ、産生されたポストプロダクトの量を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていない試料及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサーを使用して生成された試料と比較した場合に、細胞あたりのゲノムコピー（図１０Ｂ）を増加させ、産生されたポストプロダクトの量を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていない試料及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサーを使用して生成された試料と比較した場合に、総ゲノムコピー数（図１０Ｃ）を増加させ、産生されたポストプロダクトの量を減少させたことを示す。 細胞あたりのゲノムコピー（ＧＣ／細胞）の増加（図１１Ａ）が、３つの異なる溶出緩衝液（クエン酸塩、低ｐＨ、及び低／高ｐＨ）の各々について、ＭＮａｓｅ処理されていない試料（四角）と比較した場合に、ＭＮａｓｅ処理された試料（丸）において一貫して観察されたことを示す。 全ゲノムコピー数の増加（図１１Ｂ）が、３つの異なる溶出緩衝液（クエン酸塩、低ｐＨ、及び低／高ｐＨ）の各々について、ＭＮａｓｅ処理されていない試料（四角）と比較した場合に、ＭＮａｓｅ処理された試料（丸）において一貫して観察されたことを示す。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていないプロダクト画分（左上）と比較した場合に、高／低ｐＨ溶出プロダクト画分（右上）の感染性を増加させ、ＭＮａｓｅ処理されていないポストプロダクト画分（左下）と比較した場合に、ＭＮａｓｅ処理されたポストプロダクト画分（右下）の感染性を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていないプロダクト画分（左上）と比較した場合に、クエン酸塩溶出プロダクト画分（右上）の感染性を増加させ、ＭＮａｓｅ処理されていないポストプロダクト画分（左下）と比較した場合に、ＭＮａｓｅ処理されたポストプロダクト画分（右下）の感染性を減少させたことを示す。 ＭＮａｓｅ処理が、ＭＮａｓｅ処理されていないプロダクト画分（左上）と比較した場合に、低ｐＨ溶出プロダクト画分（右上）の感染性を増加させ、ＭＮａｓｅ処理されていないポストプロダクト画分（左下）と比較した場合に、ＭＮａｓｅ処理されたポストプロダクト画分（右下）の感染性を減少させたことを示す。 酵素による処理をされていないか又はベンゾナーゼ（登録商標）のみで処理された試料が、銀染色によって測定した場合に、不純物を含有することを示す。図１５Ａは、オンカラムでの酵素による処理をされていない精製ＡＡＶ試料を示す。ＰＥ＝溶出前ピーク、Ｅ＝溶出、Ｒ＝未透過液（１００ｋＤａアミコン）、Ｆ＝濾液、Ｓ＝ストリップ。マーカーサイズの単位はｋＤａである。 酵素による処理をされていないか又はベンゾナーゼ（登録商標）のみで処理された試料が、銀染色によって測定した場合に、不純物を含有することを示す。図１５Ｂは、ベンゾナーゼ（登録商標）のみで処理された試料を示す図である。ＰＥ＝溶出前ピーク、Ｅ＝溶出、Ｒ＝未透過液（１００ｋＤａアミコン）、Ｆ＝濾液、Ｓ＝ストリップ。マーカーサイズの単位はｋＤａである。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びＭＮａｓｅ処理の前、アフィニティークロマトグラフィー中に適用される高ｐＨ洗浄緩衝液が、ＡＡＶ粒子精製後の不純物の量を、銀染色によって測定した場合に、減少させることを示す。図１６Ａは、高ｐＨ（９．５）洗浄＋オンカラムでのベンゾナーゼ（登録商標）処理／ＭＮａｓｅ処理及びクエン酸塩（ｐＨ１．５）溶出に供したＡＡＶ試料を示す。３つの強いバンドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に対応する。Ｗ＝洗浄ピーク、Ｅ＝溶出ピーク、Ｒ＝未透過液（１００ｋＤａアミコン）、Ｆ＝濾液、Ｓ＝ストリップピーク。マーカーサイズの単位はｋＤａである。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びＭＮａｓｅ処理の前、アフィニティークロマトグラフィー中に適用される高ｐＨ洗浄緩衝液が、ＡＡＶ粒子精製後の不純物の量を、銀染色によって測定した場合に、減少させることを示す。図１６Ｂは、高ｐＨ（１０．２）洗浄＋オンカラムでのベンゾナーゼ（登録商標）処理／ＭＮａｓｅ処理及びリン酸（ｐＨ１．５）溶出に供したＡＡＶ試料を示す図である。３つの強いバンドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に対応する。Ｗ＝洗浄ピーク、Ｅ＝溶出ピーク、Ｒ＝未透過液（１００ｋＤａアミコン）、Ｆ＝濾液、Ｓ＝ストリップピーク。マーカーサイズの単位はｋＤａである。 表５に記載の異なる精製条件を使用したウイルス精製の概要を示す。図１７Ａは、精製されたＡＡＶ粒子の銀染色を示す。３つの強いバンドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に対応する。Ｃ＝クエン酸塩、ｐＨ２．５、Ｐ＝リン酸、ｐＨ１．５、「＋^１」＝ｐＨ１０．３、「＋^２」＝ｐＨ９．５、「＋^３」＝ｐＨ１０．２、「＋^４」＝ｐＨ１０．４、^＊＝（Ｃ_２Ｈ_５）ＮＣＬ陰イオン交換溶出。 表５に記載の異なる精製条件を使用したウイルス精製の概要を示す。図１７Ｂは、ＤＮＡアガロースゲル電気泳動及びＡＡＶ内に含まれるＩＴＲ導入遺伝子の存在を示す。Ｃ＝クエン酸塩、ｐＨ２．５、Ｐ＝リン酸、ｐＨ１．５、「＋^１」＝ｐＨ１０．３、「＋^２」＝ｐＨ９．５、「＋^３」＝ｐＨ１０．２、「＋^４」＝ｐＨ１０．４、^＊＝（Ｃ_２Ｈ_５）ＮＣＬ陰イオン交換溶出。 ＡＡＶ粒子精製の純度を改善するために、不純物及びＤＮＡをどのように除去することができるかについてのスキームを示す。 エタノールを含むように溶出条件を改変することにより、陰イオン交換カラムからのウイルスの回収率を改善することができることを示す。図１９Ａは、ベンゾナーゼ（登録商標）処理及び高ｐＨ洗浄の後に、リン酸（ｐＨ１．５）を使用して溶出された試料を示す。矢印は、カラムストリッピング後に検出された残留ウイルスを示す。 エタノールを含むように溶出条件を改変することにより、陰イオン交換カラムからのウイルスの回収率を改善することができることを示す。図１９Ｂは、ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びＭＮａｓｅ処理、並びに高ｐＨ洗浄の後に、リン酸（ｐＨ１．５）を使用して溶出された試料を示す。矢印は、カラムストリッピング後に検出された残留ウイルスを示す。 エタノールを含むように溶出条件を改変することにより、陰イオン交換カラムからのウイルスの回収率を改善することができることを示す。図１９Ｃは、ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びＭＮａｓｅ処理、並びに高ｐＨ洗浄の後に、リン酸（ｐＨ１．５）及び２０％エタノールを使用して溶出された試料を示す。矢印は、カラムストリッピング後に検出された残留ウイルスを示す。 酵素による処理を行わなかった場合（図２０Ａ）の動的光散乱（ＤＬＳ）からの結果並びにタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）曲線及び融解（Ｔｍ）曲線を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理のみを行った場合（図２０Ｂ）の動的光散乱（ＤＬＳ）からの結果並びにタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）曲線及び融解（Ｔｍ）曲線を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びＭＮａｓｅ処理を行った場合（図２０Ｃ）の動的光散乱（ＤＬＳ）からの結果並びにタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）曲線及び融解（Ｔｍ）曲線を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理あり、ＭＮａｓｅ処理なし、高ｐＨ洗浄あり、及びリン酸溶出ありの場合（図２０Ｄ）の動的光散乱（ＤＬＳ）からの結果並びにタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）曲線及び融解（Ｔｍ）曲線を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理あり、ＭＮａｓｅ処理あり、高ｐＨ洗浄あり、及びリン酸溶出ありの場合（図２０Ｅ）の動的光散乱（ＤＬＳ）からの結果並びにタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）曲線及び融解（Ｔｍ）曲線を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理もＭＮａｓｅ処理もなし（「酵素なし」）で精製を行った場合、（２）ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びクエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩（アフィニティー）」）を行った場合、（３）ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びクエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩」）を行った場合、（４）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、ＭＮａｓｅ処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、（５）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、高ｐＨ（ｐＨ１０．３）洗浄、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、並びに（６）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、ＭＮａｓｅ処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合の宿主細胞ＤＮＡを検出するためにＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用した生のカウント数（図２１Ａ）を示す。 ベンゾナーゼ（登録商標）処理もＭＮａｓｅ処理もなし（「酵素なし」）で精製を行った場合、（２）ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びクエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩（アフィニティー）」）を行った場合、（３）ベンゾナーゼ（登録商標）処理及びクエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩」）を行った場合、（４）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、ＭＮａｓｅ処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、（５）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、高ｐＨ（ｐＨ１０．３）洗浄、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、（６）ベンゾナーゼ（登録商標）処理、ＭＮａｓｅ処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合の宿主細胞ＤＮＡを検出するためにＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用した濃度結果（図２１Ｂ）を示す。 ＡＡＶ粒子試料画分を収集した後の、ゲル電気泳動及び銀染色を示し、そのＡＡＶ粒子試料画分が、それぞれプロトコル＃１後のプロダクトピークに対応するＡＡＶ粒子試料画分（レーン１）、プロトコル＃２後のプロダクトピークに対応するＡＡＶ粒子試料画分（レーン２）、及びプロトコル＃２後のポストプロダクトピークに対応するＡＡＶ粒子試料画分（レーン３）である。

「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、「含む（comprise）」という用語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用するとき、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又はときに本明細書で使用するとき、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。

本明細書で使用するとき、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップは除外しない。本出願の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、「からなる」又は「から本質的になる」という用語に置き換えることができる。

本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。

本明細書で使用される場合、「精製する」という用語は、不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、クロマチン、及び／又は核酸）を除去し、ＡＡＶ粒子を濃縮させることができる任意の技術を意味することが意図される。ＡＡＶ粒子を精製するための例示的な技術としては、例えば、遠心分離（例えば、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせ）、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）、濾過、又はそのような技術の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。精製は、一段階精製技術、又は２つ以上のタイプの精製技術を組み合わせた多段階精製技術を含み得るということが理解される。

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」は、全ての異なるＡＡＶ血清型を含む天然に存在する形態、並びにＡＡＶの天然に存在しない形態（例えば、組換えｒＡＡＶ、及び偽型）の両方、及びそれらの改変体を意味することが意図される。ＡＡＶウイルスは、レップ遺伝子（ＡＡＶのライフサイクルに必要なＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０として翻訳される）及びキャップ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３－カプシドタンパク質として翻訳される）からなる。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」は、宿主細胞の外側のＡＡＶウイルスの完全な感染形態を意味することが意図され、これは、核酸を含み、そしてキャプシドと呼ばれるタンパク質の保護コートによって取り囲まれる。

本明細書で使用される場合、用語「力価」は、所定の容量中のウイルスの量を意味することが意図される。ウイルス力価は、「物理的力価」又は「機能的力価」を含み得る。物理的力価は、どれだけのウイルスが存在するかの尺度であり、一般に、１ｍＬ当たりのウイルス粒子数（ＶＰ／ｍＬ）、又は１ｍＬ当たりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｍＬ）として表される。機能的力価又は感染力価は、どれだけのウイルスが実際に標的細胞に感染するかの尺度であり、一般に、１ｍＬ当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）の形態で、又はアデノウイルスについては１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）若しくは１ｍＬ当たりの感染単位（ｉｆｕ／ｍＬ）として表される。機能的力価は、一般に、物理的力価よりも、通常、約１０～約１００倍低いことが理解される。

本明細書で使用される場合、「十分な量」という用語は、例えば、アフィニティー支持体などの固体支持体へのＡＡＶ粒子の結合、又はＡＡＶ粒子を含有する試料からの不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、クロマチン、及び／又は核酸）の除去など、所望の効果をもたらすか、又は所望の結果を達成することができる量を意味することが意図される。

本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、ＡＡＶ粒子の試料に関して使用される場合には、ＡＡＶ粒子の試料が、対応する陰性対照試料と比較した場合に、約５０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満の不純物を含むことを意味することが意図される。例示的な不純物としては、宿主細胞タンパク質、及びウイルス外のクロマチン結合ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。試料は、１つ以上の不純物を「実質的に含まない」ことができるが、少量の（例えば、検出不能なレベルの）なんらかの不純物を有し続け、「実質的に含まない」ことは、全ての不純物の完全な除去を必要としないということが更に理解される。

特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬを含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

本出願の読者を助けるため、明細書の記載は、様々な段落若しくはセクションに分けられているか、又は本出願の様々な実施形態に向けられている。これらの分離は、段落又はセクション又は実施形態の実体を別の段落又はセクション又は実施形態の実体から切り離すものと見なされるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の記載が広範な用途を有し、想到され得る様々な段落、パラグラフ、及び文章の全ての組み合わせを包含することを理解するであろう。いかなる実施形態の考察も、単なる例示であることを意味するものであり、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの実施例に限定されることを示唆することを意図するものではない。例えば、本明細書で提供される精製技術のタイプは、本明細書で提供されるＡＡＶ粒子の産生のための様々な例示的方法のいずれかと組み合わせることができる。本出願は、特定の組み合わせが明示的に記載されているか否かにかかわらず、適用可能な構成要素の任意のものを、任意の組み合わせで使用することを企図する。

クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを使用して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を精製するための方法、組成物、キット、及びシステムが本明細書において提供される。小規模産生のためのＡＡＶ粒子を精製するための様々な精製技術（例えば、密度勾配遠心分離）、又は大規模産生のためのＡＡＶ粒子を精製するための様々な精製技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィーを含むアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそのような技術の組み合わせ）が当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｕｒｏｖａ ａｎｄ Ｉｏｆｆｅ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，Ｓ５－Ｓ１７を参照されたい）。しかしながら、一般に高純度の生成物を生じる技術を用いても、ＡＡＶ粒子製造において遭遇するプロセス関連不純物が問題となり得る。例えば、本明細書に提供されるように、本開示は、ウイルス外のクロマチン結合ＡＡＶ粒子が、精製されたＡＡＶ粒子生成物において検出され得る重要な不純物を代表し、これが、精製された生成物の目に見える沈殿を引き起こす可能性があり、例えば、ＡＡＶ粒子の下流での適用に対して問題となり得る（例えば、ウイルス感染性を制限するようなものなど）ことを提供する。したがって、本開示は、最終精製産物の純度及び／又は力価を高めるために、ＡＡＶ粒子を精製するための当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかに組み込むことができる。

クロマチンは、ＤＮＡ、タンパク質、及び関連タンパク質の複合体である。クロマチン中の主要なタンパク質はヒストンである。ヒストンは、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４と呼ばれる小さな正に荷電したタンパク質のファミリーであり、負に荷電したＤＮＡに強く接着し、ヌクレオソームと呼ばれる複合体を形成する。ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンは、ＤＮＡがヒストンによって保護され、ヌクレアーゼにはアクセスできないので、一般にヌクレアーゼに対する耐性を有する。

クロマチン結合タンパク質としては、とりわけ、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ポリコーム群（ｐＣｇ）タンパク質ＥＺＨ２、ＤＯＴＬ１、ＰＲＭＴ５）、ヒストンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１、ＪｍｊＣ－ドメイン含有ヒストンデメチラーゼ）、ブロモドメイン含有のＢＥＴファミリー（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４、並びにＢＲＤＴ）などが挙げられる。更なるクロマチン修飾タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、亜鉛フィンガー（ＺｎＦ）タンパク質又は他のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。

したがって、本開示は、特定のタイプのヌクレアーゼ、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、小球菌ヌクレアーゼ、ＭＮａｓｅ）を、任意のタイプのＡＡＶ粒子精製方法に追加することにより、下流での精製中に回収されるＡＡＶ粒子の品質、並びに回収されるＡＡＶ粒子の収率を有意に改善することができるということを提供する。

したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清をクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む、ＡＡＶ粒子を精製するための方法が、本明細書において提供される。

上記のように、ＡＡＶ粒子は、当該技術分野で既知の種々の方法を使用して精製され得るが、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、任意のタイプのＡＡＶ粒子精製方法と組み合わされ得る。一般に、精製は、遠心分離、クロマトグラフィー、若しくは濾過、又は場合によってはそれらの組み合わせを伴う。いくつかの実施形態では、精製は、２つのステップの精製プロトコルを含むことができ、例えば、２つのクロマトグラフィーのステップ、又はクロマトグラフィーと超遠心分離／濾過との組み合わせを含み得る。例として、２つのステップの精製プロトコルは、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ヘパリンアフィニティー樹脂を使用するもの）と、それに続くイオン交換カラム上での仕上げとによる精製を含むことができる。別の例示的な２つのステップの精製プロトコルは、超遠心分離（例えば、イオジキサノール密度超遠心分離）と、それに続くクロマトグラフィー（例えば、ヘパリンアフィニティー精製などのアフィニティークロマトグラフィー）と、を伴い得る。

精製プロセスで使用される出発材料の濾過及び／又は遠心分離は、例えば細胞デブリ及び／又は細胞断片などのバルク不純物の一部を除去するのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態では、上清は清澄化された上清である。ある特定の実施形態では、濾過及び／又は遠心分離が、例えば、クロマトグラフィー精製などの１つ以上の追加の精製ステップの前に実施される。上清を清澄化するための様々な方法が、当該技術分野で既知である。例えば、０．２μｍフィルターを使用して上清を清澄化することができる。具体的な実施形態では、清澄化された上清は、精製の１つ以上の更なるステップの前に、ベンゾナーゼ（登録商標）で処理され得る。

ＡＡＶ粒子の精製のための遠心分離技術としては、例えば、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。例示的なタイプの密度勾配遠心分離は、強い遠心力場に供された場合に密度勾配を形成する、ＣｓＣｌを伴い得る。例えば、ウイルスがＣｓＣｌ塩中で平衡に達するまで遠心分離される場合、それらは汚染物質から分離され、それらの浮遊密度に基づいて集団で回収される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の精製は、複数のＣｓＣｌ勾配遠心分離ステップを含む。ＡＡＶ粒子の精製のための別の例示的な密度培地は、イオジキサノールを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の精製は、予備精製ステップとしての密度勾配遠心分離（例えば、不連続イオジキサノール勾配遠心分離）と、それに続くアフィニティークロマトグラフィーウイルス精製ステップ、例えばヘパリン化支持マトリックスクロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどによるものを含み得る。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の精製は、クロマトグラフィーを伴う。例えば、大規模量のＡＡＶ粒子の精製は、一般的に、溶液（移動相）中の分子が、固定材料（固相又は固体支持体）との化学的又は物理的相互作用の差異に基づいて分離される、ある形態のクロマトグラフィーを含む。例示的なタイプのクロマトグラフィーとしては、例えば、ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＥＣとも呼ばれる）が挙げられ、これは、多孔質の樹脂材料を用いて、分子を分子のサイズに基づいて分離するものである（すなわち、物理的排除）。別の例示的なタイプのクロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティー精製とも呼ばれる）である。

特定の実施形態では、クロマトグラフィーはクロマトグラフィーカラムを伴う。本明細書に開示されるように、様々なタイプのクロマトグラフィーカラムを使用して、ＡＡＶ粒子を精製することができる。ある特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、モノリスである。モノリスは、多くの相互接続されたチャネルを有する均質な固定相の単一ブロックを有するクロマトグラフィーカラムである。モノリスの固定相は、異なる特性を有する異なる種類の生体分子の精製を可能にする、様々な化学的性質のものであり得る。しかしながら、カラムはモノリスである必要はなく、ビーズ、多孔質粒子ベースのカラム、及び膜吸着体も使用できるということが理解される。

アフィニティークロマトグラフィーは、標的分子へのリガンド結合又は標的分子との特異的イオン相互作用などの分子間の特異的結合相互作用を利用する。例示的なタイプのアフィニティークロマトグラフィーは、ウイルスキャプシドと、クロマトグラフィーマトリックスに結合された特定の生物学的リガンド又はレセプターとの間の可逆的相互作用に基づいて、タンパク質及び核酸汚染物からウイルス粒子を分離することを伴う。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーによる精製は、負に荷電したセルロースアフィニティー媒体硫酸セルロファインを含むことができる。代替的なアフィニティー精製アプローチは、モノクローナル抗体（例えば、Ａ２０）によるＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ２粒子）の認識に基づくものであり、アセンブルされていないカプシドタンパク質の分離を可能にする。アフィニティークロマトグラフィーの更なる例示的な例としては、ヘパリンアフィニティーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、精製されるＡＡＶ粒子のＡＡＶカプシド血清型又は偽型に特異的であり得る。例えば、いくつかのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、４、及び５など）は、ヘパリンカラムにあまり効率的に結合しない。したがって、いくつかの実施形態では、例えばＡＡＶ５粒子の捕捉のためのアフィニティーマトリックスは、ＣＮＢｒ活性化セファロースに共有結合した、ムチンと呼ばれるシアル酸を豊富に有するタンパク質を含むことができる。あるいは、ＰＤＧＦＲ－α及びＰＤＧＦＲ－βは、例えばＡＡＶ５粒子の捕捉のための特異的分子として使用することができる。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィーである。イオン交換クロマトグラフィーは、固相材料との全体的なイオン相互作用の強度に従って、分子を分離することを含む。イオン交換クロマトグラフィーによる精製は、ウイルスキャプシドの外側のタンパク質の正味の電荷に基づく。表面タンパク質の正味の電荷は、露出したアミノ酸基のｐＨに依存する。

イオン交換クロマトグラフィーの１つの例示的なタイプは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり、これは、分子をそれらの正味の表面電荷に基づいて分離するために使用される。陰イオン交換クロマトグラフィーは、正味の負の表面電荷を有する分子に対する親和性を有する、正に荷電したイオン交換樹脂を使用する。上記で提供された例は、例示的であることが意図され、本開示と共に使用され得るクロマトグラフィーのタイプを網羅することは意図されないことが理解される。

本明細書において提供されるように、ＡＡＶ粒子を精製するプロセスにおいて使用され得る精製の１つの例示的なタイプは、アフィニティークロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、固体支持体（例えば、アフィニティー支持体）に化学的に固定化又は「結合」された特定のリガンドを含むことができ、その結果、複合混合物がカラムを通過すると、リガンドに対する特異的結合親和性を有する分子が結合する。他の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、特異的正味表面電荷に基づくイオン相互作用を伴い得るが、そのため、それらの正味表面電荷に基づいて固体支持体に対する特異的結合親和性を有する分子が結合される。

いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィーである。前述したように、イオン交換クロマトグラフィーは、親和性支持体などの固相材料との全体的なイオン相互作用の強度に従って、分子を分離する。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーである。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、正味の表面電荷に基づいて分子を分離することができる。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーは、正味の負の表面電荷を有する分子に対する親和性を有する、正に荷電したイオン交換樹脂を使用する。

上述したように、クロマトグラフィーは、一般に、固定材料（固相又は固体支持体）との化学的又は物理的相互作用の差に基づいて、分離される溶液（移動相）中の分子と関わる。クロマトグラフィーの種々の形態はまた、必要に応じて、固体支持体から不要な成分を除去するための洗浄を伴い得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、固体支持体を洗浄することを伴う。他の試料成分が洗い流された後、結合した分子は支持体から剥がされ（すなわち、溶出され）、元々の試料から精製される。

ＡＡＶ粒子の溶出は、直線勾配溶出又は段階的均一濃度の溶出のいずれかによって溶出することができる。多くの場合、勾配溶出を用いて、溶出条件を最適化することができる。目的のタンパク質の溶出プロファイルが確立され、どのイオン強度又はｐＨでタンパク質が溶出するかが分かると、精製プロセスを加速するために段階的溶出を使用することができる。ＡＡＶ粒子を精製するために使用されるクロマトグラフィーのタイプに依存して、溶出条件は、競合リガンドを伴うか、又はｐＨ、イオン強度、若しくは極性を変化させることを伴う。標的タンパク質は、精製及び濃縮された形態で溶出され得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィーについて、最終生成物は、それらの正味の表面電荷に依存する順序で溶出され得る。７．５に近いｐＩ値を有する試料は、より低いイオン強度で溶出し、非常に低いｐＩ値を有する試料は、高い塩濃度で溶出する。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して溶出され得る。特定の実施形態では、高ｐＨ緩衝液は、低ｐＨ緩衝液の使用の直前に使用され、「高／低ｐＨ緩衝液」と呼ばれる。具体的な実施形態では、低いｐＨは約２．５である。いくつかの実施形態では、低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である。特定の実施形態では、低ｐＨ緩衝液は弱酸を含む。

本明細書で提供されるように、溶出ステップへのエタノールの添加は、イオン交換カラムからのウイルスの回収を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態では、溶出緩衝液はエタノールを含むことができる。いくつかの実施形態では、エタノールは、約５％～約４０％のエタノールであり得る。いくつかの実施形態では、エタノールは、約１０％～約３０％のエタノールであり得る。いくつかの実施形態では、エタノールは、約１５％～約２５％のエタノールであり得る。具体的な実施形態では、エタノールは、約２０％のエタノールであり得る。

低ｐＨ緩衝液を使用して行われる溶出は、しばしば、溶出緩衝液が直ちに中和されることを必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、溶出は、緩衝液のｐＨを中和することを更に含む。具体的な実施形態では、中和は、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）を添加することを含む。ある特定の実施形態では、中和することは、トリスを添加することを含む。Ａｄ又はＡＡＶの精製の手順のために使用される多くのクロマトグラフィー溶出緩衝液は、インビボでの操作に適していないので、分解又は濃縮のような追加の精製ステップが必要であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、精製はまた、ＡＡＶウイルス粒子の分解及び／又は濃縮を含む。

したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子を結合させるのに十分な時間インキュベートすることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｃ）精製されたＡＡＶ粒子を溶出させることと、を含む、ＡＡＶ粒子を精製するための方法が、本明細書で提供される。クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触させることはまた、ＡＡＶ粒子の結合の前に行われ得るということが理解される。したがって、いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子を結合させるのに十分な時間インキュベートすることと、（ｃ）精製されたＡＡＶ粒子を溶出させることと、を含む方法が本明細書で提供される。同様に、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触させることは、固体支持体の設定において組み合わされる必要はなく、当該技術分野で既知の任意のＡＡＶ粒子精製技術と組み合わされ得るということもまた理解される。ある特定の実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子を仕上げるための１つ以上の追加の精製に供される。例えば、粒子は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得るが、次いで、異なるタイプのクロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）によって仕上げられ得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、試料を溶出させる前に、固体支持体を洗浄することを更に含む。本明細書中に記載されるように、支持体から、非結合試料成分を洗浄除去することは、標的とリガンドとの間の結合相互作用を維持する適切な緩衝液を使用して行われ得る。洗浄により、いくつかの結合していない汚染物質を除去することができる。いくつかの実施形態では、非特異的結合相互作用は、低い濃度の界面活性剤を添加することによって、又は結合緩衝液及び／若しくは洗浄緩衝液中の塩濃度を適度に調整することによって、最小限に抑えることができる。

本明細書で提供されるように、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の純度は、高いｐＨで洗浄することによって増加させることができる。例えば、バルク回収物をアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、次いで高ｐＨ緩衝液で洗浄して不純物を除去することができる。いくつかの実施形態では、高ｐＨ洗浄の後に、ベンゾナーゼ及び／又はクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼによる、オンカラムでの酵素処理が続く。ある特定の実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ９より大きい。いくつかの実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ９．５～ｐＨ１０．９である。他の実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ９．５である。いくつかの実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ１０．２である。いくつかの実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ１０．３である。いくつかの実施形態では、高ｐＨ洗浄緩衝液は、ｐＨ１０．４である。

いくつかの実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）（ＥＣ３．１．３１．１）である。黄色ブドウ球菌から単離されたＭＮａｓｅは、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を消化することができる非特異的エンド－エキソヌクレアーゼ活性を有するホスホジエステラーゼである。ＭＮａｓｅは、障害物（ヌクレオソーム又は他の核酸結合タンパク質）に達するまで、２つのヌクレオソームを接続するリンカー領域内の露出した核酸を消化する。ＭＮａｓｅは、細胞溶解物から核酸を除去し、クロマチン結合タンパク質を放出するのに好適であり得るが、ＤＮａｓｅは、ヌクレオソーム枯渇ＤＮＡ又は「ヌクレオソームを含まない」ＤＮＡを優先的に切断する。ＭＮａｓｅは、二本鎖、一本鎖、環状及び直鎖状核酸を消化する。いくつかの実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）より大きい。ある特定の実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。具体的な実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。より具体的な実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＭＮａｓｅの活性を有するポリペプチドである。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子不純物を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ＡＡＶ粒子不純物は、巨視的不純物及び微視的不純物を含む。一実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、物理的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される。一実施形態では、ウイルス力価は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約３倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約７倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価は、約８０倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ウイルス力価比は、約２倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約５倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する。一実施形態では、ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である。一実施形態では、完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。一実施形態では、ＭＮａｓｅは、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される際、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する。

一実施形態では、ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する。

クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼが、ＡＡＶ粒子及び遊離核酸とウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を放出するのに必要な時間の長さの決定は、当業者の技能の範囲内である。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、約１０分間～約１時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である。具体的な実施形態では、インキュベーションは約３０分間である。

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物はまた、ベンゾナーゼ（登録商標）ヌクレアーゼ（セラチア・マルセッセンス由来のエンドヌクレアーゼ；酵素委員会（ＥＣ）番号：３．１．３０．２）を含み得る。ベンゾナーゼ（登録商標）は、アクセス可能なＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、非クロマチンＤＮＡ）を分解することができる、無差別的なエンドヌクレアーゼである。それは、ＤＮＡ及びＲＮＡの全ての形態（例えば、一本鎖、二本鎖、直鎖状及び環状）を攻撃及び分解し、広範囲の操作条件にわたって有効である。例えば、天然又は熱変性したＤＮＡ及びＲＮＡを消化することができる。

ベンゾナーゼ（登録商標）の添加は、粗試料中に存在するヌクレアーゼ感受性核酸を除去、例えば、宿主産生細胞から、残留核酸を除去するのに役立ち得る。ベンゾナーゼ（登録商標）の添加は、遊離核酸を消化するために、例えばタンパク質試料中の粘度を低下させるために含めることができるが、それ自体では、ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を放出させるには不十分である。いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼ（登録商標）及びクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、一緒にインキュベートされる。具体的な実施形態では、ベンゾナーゼ（登録商標）及びクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、アフィニティー交換クロマトグラフィー後に、一緒にインキュベートされる。しかしながら、ベンゾナーゼ（登録商標）処理は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと同時に行われる必要はないことが理解される。例えば、いくつかの実施形態では、ベンゾナーゼ（登録商標）は、精製前にバルク収集物に添加される。任意のベンゾナーゼ（登録商標）生成物が、本開示に適していることが更に理解される。

本開示は、ある特定の実施形態では、例示的なエンドヌクレアーゼとしてベンゾナーゼ（登録商標）の使用を記載するが、残留宿主細胞ＤＮＡを低減することができる任意のヌクレアーゼ、又は残留宿主細胞ＤＮＡを低減することができるヌクレアーゼの活性を有するポリペプチドを使用することができるということが理解される。このような代替的なヌクレアーゼとしては、例えば、クリオナーゼ（低温菌、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．に由来する組換えエンドヌクレアーゼ）、塩活性ヌクレアーゼ（salt active nuclease、ＳＡＮ）、又はＤＮａｓｅ Ｉ（商標）を挙げることができる。

本明細書で提供されるように、ＡＡＶ粒子を含有する試料をＭＮａｓｅと接触させることは、クロマチン結合ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質を除去し、ＭＮａｓｅで処理していない試料と比較した場合に、ＡＡＶ粒子の全体的な収率を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法を用いて調製された精製ＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない。特定の実施形態では、精製ＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、増加した収率を有する。

本明細書で提供されるように、本開示は、ＡＡＶ粒子の精製におけるクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼの使用が、ウイルス力価を増加させるために使用され得るということを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の力価を増加させるための方法であって、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む方法が、本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、増加したウイルス力価は、総ゲノムコピー、並びに細胞あたりのゲノムコピー（すなわち、物理的力価）の増加を含み得る。他の実施形態では、増加したウイルス力価は、機能的力価の増加を含み得る。更なる実施形態では、増加したウイルス力価は、物理的力価及び機能的力価の両方の増加を含み得る。

物理的力価は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウイルスゲノムＲＮＡの測定（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ又はノーザンブロッティングによる）などの非機能的方法を使用して決定することができる。機能的力価は、どれだけのウイルスが標的細胞に入るかを測定し、ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含有する場合、又はベクターが蛍光タンパク質を含有する場合、抗生物質選択後のコロニー形成単位の数の評価、標的細胞のフローサイトメトリー又は免疫蛍光分析を含み得る。あるいは、ベクターが蛍光タンパク質を発現しない場合には、ｑＰＣＲによる細胞あたりの組み込まれたプロウイルスＤＮＡコピーの数の決定は、機能的力価を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。

力価の増加は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触していないＡＡＶ粒子を含む上清と比較した場合に、１．０より大きい任意の整数の倍数での変化を含み得る。いくつかの実施形態は、倍数での変化は、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０倍超、５０倍超、又は１００倍超である。機能的力価は、一般に、物理的力価よりも、通常１０～１００倍低いことが理解される。したがって、いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０倍超、５０倍超、又は１００倍超である。具体的な実施形態において、物理的力価の増加は、１．５倍超である。いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は、２．０倍超である。いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は、５．０倍超である。いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は１０倍超である。いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は、５０倍超である。いくつかの実施形態では、物理的力価の増加は、１００倍超である。他の実施形態では、機能的力価の増加は、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０倍超、５０倍超、又は１００倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、１．５倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、１．５倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、２．０倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、５．０倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、１０倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、５０倍超である。いくつかの実施形態では、機能的力価の増加は、１００倍超である。

本明細書で提供されるように、本開示は、ＡＡＶ精製プロセスへのクロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＭＮａｓｅ）の添加が、プロダクト画分のウイルス力価を増加させ得ること、かつポストプロダクト画分のウイルス力価を減少させ得ること、を実証するものである。したがって、ウイルス力価の増加はまた、ＡＡＶプロダクト画分のＡＡＶポストプロダクト画分に対する比率として記載され得る。したがって、一部の態様では、増加したウイルス力価は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、ＭＮａｓｅ）と接触していないＡＡＶ粒子に対して、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス力価比の増加は、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０倍超、５０倍超、又は１００倍超である。具体的な実施形態では、ウイルス力価比の増加は、約２倍以上である。他の実施形態では、ウイルス力価比の増加は、約５倍以上である。更に他の実施形態では、ウイルス力価比の増加は、約１０倍以上である。他の実施形態では、ウイルス力価比の増加は、約２５倍以上である。

本明細書に記載されるように、本開示の方法は、不純物を実質的に含まない高純度ＡＡＶ粒子の産生に関する。ＡＡＶの物理的特性（例えば、ＡＡＶ粒径）を測定するための様々な技術が、当該技術分野において既知である。例えば、粒径及び凝集を測定するための例示的な技術としては、動的光散乱法（ＤＬＳ）、静的光散乱法（ＳＬＳ）、ＤＬＳ及びＳＬＳ、並びに透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）が挙げられる（例えば、Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｖ．２０１６；８（４）：４０９～４２７を参照のこと）。

ＤＬＳは、ＡＡＶ開発の分野において十分に確立された分析技術である。その主な用途は、凝集体形成について試験することである。大きな種に対するその高い感度のために、凝集によって引き起こされる小さな不純物でさえ検出することができる。ＤＬＳをＳＬＳと組み合わせることも可能である。ＤＬＳでは、溶液中の粒子の流体力学的サイズ及びサイズ分布を得ることができる。時間及び温度の関数としてこの測定値を調べることは興味深いことであり得る。例えば、低温ではタンパク質は安定であり得、反復可能なサイズ（及び散乱強度）測定値を示し得るが、典型的にはある高温（Ｔａｇｇ）では、タンパク質分子はオリゴマー化又は凝集する傾向を示す。これが起こる温度は、タンパク質それ自体に加えて緩衝液組成に依存する。したがって、ＤＬＳ、又はＤＬＳとＳＬＳとの組み合わせは、機器使用者が、融解温度（Ｔｍ）、凝集温度（Ｔａｇｇ）及び開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）をスクリーニングすることを可能にする。Ｔｍとほぼ同様のＴａｇｇを有する試料は、不純物を実質的に含まない高度に純粋なＡＡＶ粒子を示す。

したがって、本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＤＬＳによって測定される場合、Ｔａｇｇの約１０℃未満以内のＴｍを有する。ある特定の実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＤＬＳによって測定される場合、Ｔａｇｇの約５℃未満以内のＴｍを有する。更なる実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、ＤＬＳによって測定される場合、Ｔａｇｇの２℃未満以内のＴｍを有する。

本開示はまた、ＡＡＶ粒子の精製プロセスへのＭＮａｓｅの添加が、回収される完全なカプシドの量を増加させ得ることを実証する。本開示のいくつかの態様では、精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。他の実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。なお更なる実施形態では、精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む。

本開示はまた、本明細書で提供される方法のいずれかによって産生されるＡＡＶ粒子の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、可視の又は肉眼では見ることができない（すなわち、巨視的又は微視的）沈殿物を、実質的に含まない。ある特定の実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、ＤＮＡ結合タンパク質及び／又はクロマチン関連タンパク質を実質的に含まない。具体的な実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストン（例えば、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４）を含み、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、ヒストンを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、増加したウイルス力価を有する。具体的な実施形態では、ウイルス力価は物理的力価を含む。他の実施形態では、ウイルス力価は、機能的力価を含む。具体的な実施形態では、組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、陰イオン交換クロマトグラムによって測定される場合、低減されたポストプロダクトピークを有する。より具体的な実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼはＭＮａｓｅである。

（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼとを含む組成物も本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、組成物はベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む。具体的な実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼはＭＮａｓｅである。

本開示はまた、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まないＡＡＶ粒子の産生に使用するための組成物であって、（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物はベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む。具体的な実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼはＭＮａｓｅである。

組成物に適したＭＮａｓｅの濃度の決定は、当業者の技能の範囲内である。いくつかの実施形態では、ＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい。特定の実施形態では、ＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい。具体的な実施形態では、ＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである。いくつかの具体的な実施形態では、上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである。

（ａ）ベンゾナーゼ（登録商標）と、（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含むキットも本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼはＭＮａｓｅである。特定の実施形態において、ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子精製を強化するのに十分な量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭＮａｓｅは、クロマチン結合タンパク質を放出するのに十分な量で存在する。

種々のシステム及び粒子産生プラットフォームが、ＡＡＶ粒子の作製のために現在使用されており、当該技術分野で既知であり、これらの各々は、本明細書中に記載される精製方法、組成物、及びシステムにおける使用に好適である。ＡＡＶ粒子の大規模な生成のための例示的な方法及びシステムは、例えば、哺乳動物細胞におけるプラスミドＤＮＡトランスフェクション、安定な哺乳動物細胞株のＡｄ感染、組換え単純ヘルペスウイルス（recombinant herpes simplex virus、ｒＨＳＶ）による哺乳動物細胞の感染、及び組換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の感染を伴い得る（例えば、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｊａｎ ８；８：１６６－１８０を参照のこと）。

ＡＡＶ粒子の産生のための例示的な方法又はシステムは、例えば、ヒト胚性ＨＥＫ２９３細胞のプラスミドトランスフェクションである。例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、無機化合物（例えば、リン酸カルシウム）、有機化合物（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、又は非化学薬品（例えば、電気穿孔）のいずれかを用いて、目的の遺伝子を含むプラスミド及び１つ又は２つのヘルパープラスミドで同時にトランスフェクトされ得る。ヘルパープラスミドは、４つのＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）、３つのＡＡＶ構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）、ＡＡＰ、並びにアデノウイルス補助機能Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡの発現を可能にする。ＡＡＶ複製に必要な、更なるアデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂの補因子は、ＨＥＫ２９３プロデューサー細胞において発現され得る。プラスミドは、細菌起源及び抗生物質耐性遺伝子を使用した大腸菌における従来の技術によって、又はミニサークル（minicircle、ＭＣ）技術によって産生され得る。プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３プロデューサー細胞）は、接着培養物又は懸濁培養物であり得る。

産生のための別の例示的な方法又はシステムは、ｒＨＳＶベクターでの哺乳動物細胞の感染を含む。ハムスターＢＨＫ２１細胞株又はＨＥＫ２９３及び誘導体などの細胞を、２つのｒＨＳＶに感染させることができるが、そのうち一方は、ＡＡＶ ＩＴＲ（ｒＨＳＶ－ＡＡＶ）によって囲まれた目的の遺伝子を有し、他方は、ＡＡＶ粒子の産生のための所望の血清型（ｒＨＳＶ－ｒｅｐｃａｐ）のＡＡＶレップ及びキャップＯＲＦを有する。

ＡＡＶ粒子産生のための安定なプロデューサー細胞株は、ＡＡＶ粒子の産生のための更なる例示的なシステムを提供する。例えば、安定なプロデューサー細胞株は、細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、又は誘導体）から誘導し得るが、産生されるＡＡＶレップ及びキャップ遺伝子（パッケージング細胞株）及び／又はＡＡＶゲノム（例えば、ｒＡＡＶゲノム）を導入することにより遺伝子操作され得る（プロデューサー細胞）。ＡＡＶ粒子の産生のための別の例示的な安定細胞株としては、通常毒性のあるＡＡＶ複製（ｒｅｐ、レップ）遺伝子並びにＡＡＶカプシド（ｃａｐ、キャップ）遺伝子、及び導入遺伝子を組み込む安定細胞株が挙げられる（例えば、その全体が本明細書に開示される米国特許出願第６２／８７７，５０８号を参照されたい）。

プロデューサー細胞株は哺乳動物細胞株である必要はなく、昆虫細胞のような非哺乳動物細胞及び酵母が産生のために使用され得るということが更に理解される。ＡＡＶ粒子の産生に適した非哺乳動物プラットフォームの例示的な例としては、バキュロウイルス－Ｓｆ９昆虫細胞プラットフォームが挙げられる。ＡＡＶ粒子の産生に適した非哺乳動物細胞株は、トランスフェクション法を使用して、又は安定な細胞株として生成可能である（例えば、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４；２５：２１２－２２２；Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７；２８：１５－２２を参照のこと）。上記のＡＡＶ粒子産生プラットフォームの例は、例示的であり、限定することを意図しないと理解され、様々な産生プラットフォームのいずれも、本明細書に記載される精製方法及び組成物と組み合わせることができる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝物質を細胞に運ぶために使用される核酸分子であり、複製及び／又は発現され得る。本開示を考慮して当業者に既知の任意のベクターを使用することができる。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、コスミド、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。当業者は、本開示を考慮して、標準的な組換え技術によって本出願のベクターを構築することができる。

本出願のベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物をいう。発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡプラスミド及びウイルスベクターなどの、組換えタンパク質を発現させるためのベクター、及びＤＮＡプラスミド及びウイルスベクターなどの、対象の体内に核酸を送達させて対象の組織で発現させるためのベクターなどが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得るということが、当業者には理解されよう。

本願のいくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられる。好ましくは、非ウイルスベクターは、ＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」又は「プラスミドＤＮＡベクター」と互換的に使用される「ＤＮＡプラスミド」は、適切な宿主細胞中で自己複製することができる二本鎖の一般的に環状のＤＮＡ配列を指す。コードされたポリヌクレオチドの発現のために使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る）を含む。使用され得る好適なＤＮＡプラスミドの例としては、周知の発現系（原核生物系及び真核生物系の両方を含む）において使用するための市販の発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）製）は、大腸菌におけるタンパク質の産生及び／又は発現のために使用され得るものであり、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における産生及び／又は発現のために使用され得るものであり、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）は、完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、昆虫の細胞内での産生及び／又は発現のための使用され得るものであり、ｐｃＤＮＡ（商標）又はｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）は、哺乳動物細胞における高いレベルの構成タンパク質の発現に使用され得るものであり、ｐＶＡＸ又はｐＶＡＸ－１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）は、ほとんどの哺乳動物細胞における目的のタンパク質の高レベルな一過性発現のために使用され得るものである。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格は、宿主細胞におけるタンパク質発現を最適化する、例えば、特定のエレメント（例えば、複製起点及び／又は抗生物質耐性カセット）の配向を逆転させるように、プラスミドに対して内因性のプロモーター（例えば、抗生物質耐性カセット中のプロモーター）を置き換えるように、かつ／又は転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置き換えるように、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質を使用することによって改変され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。

好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターである。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現に適した発現ベクターとしては、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡＴＭ、ｐｃＤＮＡ３ＴＭ、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ－１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ベクターは、ｐＵＣ複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＵＣ５７に基づき得る。それは更に、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼコード領域、及びウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルから構築された哺乳動物ピューロマイシン耐性遺伝子カセットを含み得る。ベクターはまた、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）ＯｒｉＰ複製起点フラグメントを含み得るが、これは、ＥＢＶの「ダイアド対称性」領域及び「反復ファミリー」領域の複合体を表す。

本願のベクターはまた、ウイルスベクターであり得る。一般に、ウイルスベクターは、非感染性にされた改変ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを保有する遺伝子操作されたウイルスであるが、依然としてウイルスプロモーター及び導入遺伝子を含有し、したがってウイルスプロモーターを介した導入遺伝子の翻訳を可能にする。ウイルスベクターはしばしば感染配列を欠いているので、それらは、大規模トランスフェクションのためにはヘルパーウイルス又はパッケージング株を必要とする。使用され得るウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、痘瘡ウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、非ウイルスベクターであってもよい。

例示的なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、用語「組換えアデノウイルスベクター」及び「組換えアデノウイルスベクター」及び「組換えアデノウイルス粒子」は、交換可能に使用され、そしてポリヌクレオチドが引き続いて発現されるように、目的のポリヌクレオチドを真核生物細胞に挿入するように設計され、遺伝子操作されたアデノウイルスを指す。本発明のウイルスベクターとして使用することができるアデノウイルスの例としては、血清型Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、Ａｄ５２（例えば、ＲｈＡｄ５２）、及びＰａｎ９（ＡｄＣ６８としても知られる）を有するか、又はそれらに由来するものが挙げられる。これらのベクターは、例えば、ヒト、チンパンジーから由来し得る（例：ＣｈＡｄ１、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２１、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２３、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２５、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ２７．１、ＣｈＡｄ２８．１、ＣｈＡｄ２９、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１．１、ＣｈＡｄ３２、ＣｈＡｄ３３、ＣｈＡｄ３４、ＣｈＡｄ３５．１、ＣｈＡｄ３６、ＣｈＡｄ３７．２、ＣｈＡｄ３９、ＣｈＡｄ４０．１、ＣｈＡｄ４１．１、ＣｈＡｄ４２．１、ＣｈＡｄ４３、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ４５、ＣｈＡｄ４６、ＣｈＡｄ４８、ＣｈＡｄ４９、ＣｈＡｄ４９、ＣｈＡｄ５０、ＣｈＡｄ６７、又はＳＡ７Ｐ）か、又はアカゲザルアデノウイルス（例えばｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２、又はｒｈＡｄ５３）に由来し得る。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ又はＡｄＨｕ）、又はチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣＨ、又はＳＡｄＶ）などのサルアデノウイルス、又はアカゲザルアデノウイルス（ｒｈＡｄ）に由来し得る。

好ましくは、アデノウイルスベクターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６、４、３５、７、４８などのいずれか１つである。本願に有用な組換えウイルスベクターは、本開示を考慮して、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。例えば、遺伝暗号の縮重を考慮して、同じポリペプチドをコードするいくつかの核酸配列を設計することができる。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意選択でコドン最適化され得るが、それにより、宿主細胞（例えば、細菌細胞又は哺乳動物細胞）における適切な発現を確実にする。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術であり、コドン最適化ポリヌクレオチドを得るための方法は、本開示を考慮すれば当業者に周知であろう。

天然に存在しない核酸分子又はベクターは、１つ以上の発現カセットを含み得る。「発現カセット」は、ＲＮＡ及びタンパク質を作製するための細胞機構を指向する、核酸分子又はベクターの一部である。発現カセットは、プロモーター配列と、オープンリーディングフレームと、任意選択的にポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）と、を含み得る。オープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）は、開始コドンから終止コドンへの目的のタンパク質（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、組換え酵素、又は目的の組換えタンパク質）のコード配列を含むリーディングフレームである。発現カセットの調節エレメントは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結され得る。

本願の天然に存在しない核酸分子又はベクターは、様々な制御配列を含有することができる。本明細書で使用される場合、用語「制御配列」は、複製、複写、転写、スプライシング、翻訳、安定及び／又は宿主細胞又は生物への核酸又はその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の輸送を含む核酸分子の機能制御を可能にするか、貢献するか、又は調節する任意の配列をいう。調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、翻訳終止コドン、リボソーム結合エレメント、転写ターミネーター、選択マーカー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない。

天然に存在しない核酸分子又はベクターは、目的のタンパク質の発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモーター配列を含み得る。「プロモーター」という用語は、その従来の意味で使用され、操作可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、転写されたヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は抑制型であり得る。プロモーターは、天然又は合成であり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同じ遺伝子源に由来する）又は異種プロモーター（すなわち、異なるベクター又は遺伝子源に由来する）であり得る。例えば、使用されるベクターがＤＮＡプラスミドである場合、プロモーターは、プラスミドに対して内因性であり得る（同種）か、又は他の供給源に由来し得る（異種）。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。

使用され得るプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（mouse mammary tumor virus、ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）プロモーター（例えば、ウシ免疫不全ウイルス（bovine immunodeficiency virus、ＢＩＶ）末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモーター）、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus、ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ））、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターは、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。好ましくは、プロモーターは、強力な真核生物プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｎｔ－６７２～＋１５）、ＥＦ１－αプロモーター、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターなど）である。

非自然発生核酸分子又はベクターは、発現転写物を安定化させ、ＲＮＡ転写物の核輸送を向上させ、かつ／又は転写翻訳カップリングを改善する、追加のポリヌクレオチド配列を更に含むことができる。そのような配列の例としては、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ベクターの発現カセット内の目的のタンパク質（例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、組換え酵素）のコード配列の下流に位置する。エンハンサー配列は、転写因子によって結合したときに関連する遺伝子の転写を向上させる調節ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、好ましくはプロモーター配列の下流にあり、ベクターの発現カセット内のコード配列の下流又は上流にあり得る。

本開示を考慮して当業者に既知の任意のポリアデニル化信号を使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＡＡＶ２ポリアデニル化信号（ｂｐ４４１１～４４６６、ＮＣ＿００１４０１）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子由来のポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（bovine growth hormone、ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（human growth hormone、ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号４４１１～４４６６を有するＡＡＶ２のポリアデニル化シグナル、又はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。

本開示を考慮して当業者に既知の任意のエンハンサー配列を使用することができる。例えば、エンハンサー配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はウイルスエンハンサー（例えば、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、若しくはＥＢＶ由来のエンハンサー）であり得る。特定のエンハンサーの例としては、ウッドチャックＨＢＶ転写後制御要素（Woodchuck HBV Post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体（ＡｐｏＡ１）由来のイントロン／エキソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T-cell leukemia virus type 1、ＨＴＬＶ－１）末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ－Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサー、合成ウサギβ－グロビンイントロン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましくは、エンハンサー配列は、ＡＡＶのＰ５プロモーターを含む。Ｐ５プロモーターは、レップ遺伝子のコード配列内のシス作用性Ｒｅｐ依存性エレメント（cis-acting Rep-dependent element、ＣＡＲＥ）の一部である。ＣＡＲＥは、シスで存在する場合、複製及びキャプシド形成を増強することが示された。ＣＡＲＥはまた、いくつかのＡＡＶ粒子プロデューサー細胞株におけるように、染色体に組み込まれたレップ遺伝子（ＡＡＶ ＩＴＲが存在しない場合）の増幅のために重要である。理論に束縛されるものではないが、キャップコード配列の下流に配置されたＰ５プロモーターは、キャップ発現、したがってＡＡＶ粒子収量を増加させるためのエンハンサーとして潜在的に作用し、染色体に組み込まれた遺伝子を増幅するためのエンハンサー活性も提供すると考えられる。

天然に存在しない核酸分子又はベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドはまた、細菌細胞（例えば、大腸菌）におけるプラスミドの選択及び維持のための細菌複製起点及び抗生物質耐性発現カセットを含み得る。複製起点（origin of replication、ＯＲＩ）は、複製が開始される配列であり、プラスミドが細胞内でコピー及び生存することを可能にする。本出願における使用に適したＯＲＩの例としては、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、及び１５Ａ、好ましくはｐＵＣが挙げられるが、これらに限定されない。

細菌細胞における選択及び維持のためのベクターは、典型的には、抗生物質耐性遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター配列は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結されたプロモーター配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子はコドン最適化することができ、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は通常、細菌（例えば、大腸菌）のコドン使用頻度に合わせて調整される。本開示を考慮して当業者に既知の任意の抗生物質耐性遺伝子が使用され得るが、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^ｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）、及びテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ^ｒ）、並びにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリンなどに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の特定の実施形態が本明細書に記載される。前述の説明を読むと、開示された実施形態の変形形態は、当業者に明らかになり得、必要に応じてそのような変形形態を採用し得ることが予想される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されること、並びに本発明が、適用法によって許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての修正物及び同等物を含むことが意図される。また、全ての可能性のあるこれらの変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において別途記載のない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、本明細書に包含される。本発明の多くの実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、実施例のセクションにおける説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するのではなく、例示することを意図するものである。

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。

１組の実施形態では、以下が提供される。
Ａ１．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、当該方法は、
（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、
（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む方法。
Ａ２．精製することは、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ４．クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ５．ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子に結合するのに十分な時間インキュベートすることを更に含む、実施形態Ａ４に記載の方法。
Ａ６．固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態Ａ５に記載の方法。
Ａ７．洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む、実施形態Ａ６に記載の方法。
Ａ８．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ９．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１０．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１１．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１２．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１３．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である、実施形態Ａ７に記載の方法。
Ａ１４．方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ａ４～Ａ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５．
アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
Ａ１６．イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ａ１５に記載の方法。
Ａ１７．上清は、清澄化された上清である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８．ステップ（ａ）の組成物は、ベンゾナーゼを更に含む、実施形態Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９．インキュベーションは、約１０分間～約１時間である、実施形態Ａ１～Ａ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０．インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である、実施形態Ａ１９に記載の方法。
Ａ２１．インキュベーションは、約３０分間である、実施形態Ａ１９又はＡ２０に記載の方法。
Ａ２２．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、実施形態Ａ１～Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、実施形態Ａ２２に記載の方法。
Ａ２４．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、実施形態Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、実施形態Ａ２３又はＡ２４に記載の方法。
Ａ２６．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、実施形態Ａ２３～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７．ＭＮａｓｅは、結合したＡＡＶ粒子を含有する固体支持体と共にインキュベートされる、実施形態Ａ２２～Ａ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して固体支持体から溶出される、実施形態Ａ５～Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む、実施形態Ａ２８に記載の方法。
Ａ３０．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である、実施形態Ａ２８又はＡ２９に記載の方法。
Ａ３１．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３２．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３３．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である、実施形態Ａ３０に記載の方法。
Ａ３４．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である、実施形態Ａ２８～Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３５．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である、実施形態Ａ３４に記載の方法。
Ａ３６．低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である、実施形態Ａ３４に記載の方法。
Ａ３７．アフィニティークロマトグラフィー精製は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ａ１４～Ａ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３８．方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ａ３７に記載の方法。
Ａ３９．低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む、実施形態Ａ２８～Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４０．中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む、実施形態Ａ３９に記載の方法。
Ａ４１．約５％～約４０％のエタノールを更に含む、実施形態Ａ２８～Ａ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４２．約１０％～約３０％のエタノールを含む、実施形態Ａ４１に記載の方法。
Ａ４３．約１５％～約２５％のエタノールを含む、実施形態Ａ４１又はＡ４２に記載の方法。
Ａ４４．約２０％のエタノールを含む、実施形態Ａ４１～Ａ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４５．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態Ａ１～Ａ４４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４６．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態Ａ１～Ａ４５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４７．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ａ４６に記載の方法。
Ａ４８．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ａ４６に記載の方法。
Ａ４９．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ａ４６に記載の方法。
Ａ５０．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５１．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で生成された精製ＡＡＶ粒子と比較した場合、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ａ５０に記載の方法。
Ａ５２．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ａ５１に記載の方法。
Ａ５３．精製されたＡＡＶ粒子は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない、実施形態Ａ１～Ａ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５４．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、増加したウイルス力価を有する、実施形態Ａ１～Ａ５３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５５．ウイルス力価は、物理的力価を含む、実施形態Ａ５４に記載の方法。
Ａ５６．ウイルス力価は、機能的力価を含む、実施形態Ａ５４に記載の方法。
Ａ５７．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ａ５４～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５８．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ａ５４～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５９．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ａ５４～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６０．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ａ５４～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６１．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ａ５４～Ａ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６２．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む、実施形態Ａ１～Ａ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６３．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ａ６２に記載の方法。
Ａ６４．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ａ６２に記載の方法。
Ａ６５．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ａ６２に記載の方法。
Ａ６６．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ａ６２に記載の方法。
Ａ６７．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ａ１～Ａ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６８．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する、実施形態Ａ６７に記載の方法。
Ａ６９．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ａ６７に記載の方法。
Ａ７０．精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ａ１～Ａ６９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７１．精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ａ７０に記載の方法。
Ａ７２．精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ａ７０に記載の方法。
Ａ７３．精製されたＡＡＶ微粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ微粒子と比較した場合に、減少した２６０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ａ１～Ａ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７４．精製されたＡＡＶ微粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ微粒子と比較した場合に、減少した２８０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ａ１～Ａ７３のいずれか１つに記載の方法。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｂ１．ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるための方法であって、当該方法は、
（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、
（ｂ）ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む方法。
Ｂ２．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ４．ウイルス力価は、機能的ウイルス力価を含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ５．精製することは、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ６．遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ５に記載の方法。
Ｂ７．クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ５に記載の方法。
Ｂ８．ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子に結合するのに十分な時間インキュベートすることを更に含む、実施形態Ｂ７に記載の方法。
Ｂ９．固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１０．洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む、実施形態Ｂ９に記載の方法。
Ｂ１１．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１２．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１３．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１４．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１５．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１６．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である、実施形態Ｂ１０に記載の方法。
Ｂ１７．方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｂ７～Ｂ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１８．アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ｂ１７に記載の方法。
Ｂ１９．イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ｂ１８に記載の方法。
Ｂ２０．上清は、清澄化された上清である、実施形態Ｂ１～Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２１．ステップ（ａ）の組成物は、ベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２２．インキュベーションは、約１０分間～約１時間である、実施形態Ｂ１～Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２３．インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である、実施形態Ｂ２２に記載の方法。
Ｂ２４．インキュベーションは、約３０分間である、実施形態Ｂ２２又はＢ２３に記載の方法。
Ｂ２５．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、実施形態Ｂ１～Ｂ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｂ２５に記載の方法。
Ｂ２７．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｂ２６に記載の方法。
Ｂ２８．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、実施形態Ｂ２６又はＢ２７に記載の方法。
Ｂ２９．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、実施形態Ｂ２６～Ｂ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３０．ＭＮａｓｅは、結合されたＡＡＶ粒子を含有する固体支持体と共にインキュベートされる、実施形態Ｂ２６～Ｂ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３１．ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して溶出される、実施形態Ｂ１～Ｂ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３２．低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む、実施形態Ｂ３１に記載の方法。
Ｂ３３．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である、実施形態Ｂ３１又はＢ３２に記載の方法。
Ｂ３４．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である、実施形態Ｂ３３に記載の方法。
Ｂ３５．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である、実施形態Ｂ３３に記載の方法。
Ｂ３６．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である、実施形態Ｂ３３に記載の方法。
Ｂ３７．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である、実施形態Ｂ３１～Ｂ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３８．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である、実施形態Ｂ３７に記載の方法。
Ｂ３９．低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である、実施形態Ｂ３７に記載の方法。
Ｂ４０．アフィニティークロマトグラフィー精製は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｂ１４～Ｂ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４１．方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｂ４０に記載の方法。
Ｂ４２．低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む、実施形態Ｂ３１～Ｂ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４３．中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む、実施形態Ｂ４２に記載の方法。
Ｂ４４．約５％～約４０％のエタノールを更に含む、実施形態Ｂ３１～Ｂ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４５．約１０％～約３０％のエタノールを含む、実施形態Ｂ４４に記載の方法。
Ｂ４６．約１５％～約２５％のエタノールを含む、実施形態Ｂ４４又はＢ４５に記載の方法。
Ｂ４７．約２０％のエタノールを含む、実施形態Ｂ４４～Ｂ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４８．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＡＡＶを実質的に含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４９．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ４８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５０．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｂ４９に記載の方法。
Ｂ５１．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｂ４９に記載の方法。
Ｂ５２．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｂ４９に記載の方法。
Ｂ５３．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ５２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５４．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ｂ５３に記載の方法。
Ｂ５５．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｂ５４に記載の方法。
Ｂ５６．精製されたＡＡＶ粒子は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５７．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５８．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５９．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６０．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６１．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６２．ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比が増加する、実施形態Ｂ１～Ｂ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６３．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｂ６２に記載の方法。
Ｂ６４．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｂ６２に記載の方法。
Ｂ６５．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｂ６２に記載の方法。
Ｂ６６．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｂ６２に記載の方法。
Ｂ６７．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ｂ１～Ｂ６６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６８．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する、実施形態６７に記載の方法。
Ｂ６９．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ｂ６７に記載の方法。
Ｂ７０．精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７１．精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｂ７０に記載の方法。
Ｂ７２．精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｂ７０に記載の方法。
Ｂ７３．精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、減少した２６０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７４．精製されたＡＡＶ微粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ微粒子と比較した場合に、減少した２８０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ７３のいずれか１つに記載の方法。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｃ１．ＡＡＶ粒子は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む精製方法によって精製されている、精製されたＡＡＶ粒子の組成物。
Ｃ２．精製方法は、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ１に記載の組成物。
Ｃ３．遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ４．クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ２に記載の組成物。
Ｃ５．精製方法は、ＡＡＶ粒子を含む上清を、固体支持体と共に、ＡＡＶ粒子に結合するのに十分な時間インキュベートすることを更に含む、実施形態Ｃ４に記載の組成物。
Ｃ６．精製方法は、固体支持体を洗浄することを更に含む、実施形態Ｃ５に記載の組成物。
Ｃ７．洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む、実施形態Ｃ６に記載の組成物。
Ｃ８．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ９．高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ１０．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ１１．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ１２．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ１３．高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である、実施形態Ｃ７に記載の組成物。
Ｃ１４．精製方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｃ４～Ｃ１３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１５．アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ｃ１４に記載の組成物。
Ｃ１６．イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、実施形態Ｃ１５に記載の組成物。
Ｃ１７．上清は、清澄化された上清である、実施形態５～１６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１８．精製方法は、ベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ１９．精製方法は、低ｐＨ緩衝液での溶出を含む、実施形態Ｃ５～Ｃ１８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２０．精製方法は、低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む、実施形態Ｃ１９に記載の組成物。
Ｃ２１．低ｐＨ緩衝剤は、約ｐＨ３．０未満である、実施形態Ｃ１９又はＣ２０に記載の組成物。
Ｃ２２．低ｐＨ緩衝剤は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である、実施形態Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ２３．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である、実施形態Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ２４．低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である、実施形態Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ２５．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である、実施形態Ｃ１９～Ｃ２４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２６．低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である、実施形態Ｃ２５に記載の組成物。
Ｃ２７．低ｐＨ緩衝剤は、リン酸緩衝液である、実施形態Ｃ２５に記載の組成物。
Ｃ２８．精製方法は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｃ１４～Ｃ２７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ２９．精製方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、実施形態Ｃ２８に記載の組成物。
Ｃ３０．精製方法は、低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む、実施形態Ｃ１９～Ｃ２９のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３１．中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む、実施形態Ｃ３０に記載の組成物。
Ｃ３２．精製方法は、約５％～約４０％エタノールによる溶出を更に含む、実施形態Ｃ１９～Ｃ３１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３３．精製方法は、約１０％～約３０％のエタノールを含む、実施形態Ｃ３２に記載の組成物。
Ｃ３４．精製方法は、約１５％～約２５％のエタノールを含む、実施形態Ｃ３２又はＣ３３に記載の組成物。
Ｃ３５．精製方法は、約２０％のエタノールを含む、実施形態Ｃ３２～Ｃ３４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３６．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、不純物を実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ３５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３７．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ３６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３８．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含まない方法によって精製された組成物と比較した場合に、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ３７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ３９．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｃ３８に記載の組成物。
Ｃ４０．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｃ３８に記載の組成物。
Ｃ４１．宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である、実施形態Ｃ３８に記載の組成物。
Ｃ４２．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ４１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ４３．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ４２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ４４．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｃ４３に記載の組成物。
Ｃ４５．組成物は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ４４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ４６．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、陰イオン交換クロマトグラムによって測定される場合、低減されたポストプロダクトＡＡＶ粒子画分ピークを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ４７．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、増加したウイルス力価を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ４８．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｃ４７に記載の組成物。
Ｃ４９．ウイルス力価は、物理的力価を含む、実施形態Ｃ４７に記載の組成物。
Ｃ５０．ウイルス力価は、機能的力価を含む、実施形態Ｃ４７に記載の組成物。
Ｃ５１．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｃ４７～Ｃ５０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５２．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｃ４７～Ｃ５０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５３．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｃ４７～Ｃ５０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５４．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｃ４７～Ｃ５０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５５．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｃ４７～Ｃ５０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５６．組成物は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ５７．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｃ５６に記載の組成物。
Ｃ５８．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｃ５６に記載の組成物。
Ｃ５９．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｃ５６に記載の組成物。
Ｃ６０．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｃ５６に記載の組成物。
Ｃ６１．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ｃ１～Ｃ６０のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ６２．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する、実施形態Ｃ６１に記載の組成物。
Ｃ６３．精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態Ｃ６１に記載の組成物。
Ｃ６４．組成物は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ６３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ６５．組成物は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｃ６４に記載の組成物。
Ｃ６６．組成物は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、実施形態Ｃ６４に記載の組成物。
Ｃ６７．精製されたＡＡＶ粒子は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、２６０ｎｍでの吸光度が低下したＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ６６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ６８．精製されたＡＡＶ粒子は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと接触していない組成物と比較した場合に、２８０ｎｍにおける吸光度が減少したＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ６７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｃ６９．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、ＭＮａｓｅである、実施形態Ｃ１～Ｃ６８のいずれか１つに記載の組成物。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｄ１．クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まないＡＡＶ粒子の産生における使用のための組成物であって、その組成物は、
（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と
（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む、組成物。
Ｄ２．ベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む、実施形態Ｄ１に記載の組成物。
Ｄ３．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、実施形態Ｄ１又はＤ２に記載の組成物。
Ｄ４．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｄ３に記載の組成物。
Ｄ５．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｄ４に記載の組成物。
Ｄ６．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、実施形態Ｄ４又はＤ５に記載の組成物。
Ｄ７．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、実施形態Ｄ４～Ｄ６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ８．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ３に記載の組成物。
Ｄ９．組成物であって、
（ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清と
（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む、組成物。
Ｄ１０．ベンゾナーゼ（登録商標）を更に含む、実施形態Ｄ９に記載の組成物。
Ｄ１１．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、実施形態Ｄ９又はＤ１０に記載の組成物。
Ｄ１２．ＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ１３．ＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ１４．ＭＮａｓｅの濃度は、３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ１５．上清中のＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、実施形態Ｄ１１～Ｄ１３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ１６．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子不純物を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ１７．ＡＡＶ粒子不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つ以上を含む、実施形態Ｄ１６に記載の組成物。
Ｄ１８．ＡＡＶ微粒子不純物は、巨視的不純物及び微視的不純物を含む、実施形態Ｄ１６又はＤ１７に記載の組成物。
Ｄ１９．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｄ１７に記載の組成物。
Ｄ２０．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ２１．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｄ２０に記載の組成物。
Ｄ２２．ウイルス力価は、物理的力価を含む、実施形態Ｄ２０に記載の組成物。
Ｄ２３．ウイルス力価は、機能的力価を含む、実施形態Ｄ２０に記載の組成物。
Ｄ２４．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｄ２０～Ｄ２３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ２５．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｄ２０～Ｄ２３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ２６．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｄ２０～Ｄ２３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ２７．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｄ２０～Ｄ２３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ２８．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｄ２０～Ｄ２３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ２９．ＭＮａｓｅは、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ２０～Ｄ２８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｄ３０．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｄ２９に記載の組成物。
Ｄ３１．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｄ２９に記載の組成物。
Ｄ３２．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｄ２９に記載の組成物。
Ｄ３３．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｄ２９に記載の組成物。
Ｄ３４．ＭＮａｓｅが、完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ３５．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である、実施形態Ｄ３４に記載の組成物。
Ｄ３６．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である、実施形態Ｄ３４に記載の組成物。
Ｄ３７．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である、実施形態Ｄ３４に記載の組成物。
Ｄ３８．Ｍｎａｓｅは、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ３９．ＭＮａｓｅは、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ４０．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ４１．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む、精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。
Ｄ４２．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む精製されたＡＡＶ粒子を生成するのに十分な量で存在する、実施形態Ｄ１１に記載の組成物。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｅ１．キットであって、
（ａ）ベンゾナーゼ（登録商標）と、
（ｂ）クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼと、を含む、キット。
Ｅ２．クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、実施形態Ｅ１に記載のキット。
Ｅ３．ＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ４．ＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ５．ＭＮａｓｅの濃度は、３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ６．ＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ７．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子と結合したクロマチンを消化するのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ８．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子不純物を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２又はＥ７に記載のキット。
Ｅ９．ＡＡＶ粒子不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質のうちの１つ以上を含む、実施形態Ｅ８に記載のキット。
Ｅ１０．ＡＡＶ粒子不純物は、巨視的不純物及び微視的不純物を含む、実施形態Ｅ８又はＥ９に記載のキット。
Ｅ１１．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｅ９に記載のキット。
Ｅ１２．ＭＮａｓｅは、ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ１３．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｅ１２に記載のキット。
Ｅ１４．ウイルス力価は、物理的力価を含む、実施形態Ｅ１２に記載のキット。
Ｅ１５．ウイルス力価は、機能的力価を含む、実施形態Ｅ１２に記載のキット。
Ｅ１６．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｅ１２～Ｅ１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１７．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｅ１２～Ｅ１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１８．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｅ１２～Ｅ１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ１９．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｅ１２～Ｅ１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ２０．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｅ１２～Ｅ１５のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ２１．ＭＮａｓｅは、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ１２～Ｅ２０のいずれか１つに記載のキット。
Ｅ２２．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｅ２１に記載のキット。
Ｅ２３．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｅ２１に記載のキット。
Ｅ２４．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｅ２１に記載のキット。
Ｅ２５．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｅ２１に記載のキット。
Ｅ２６．ＭＮａｓｅは、完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ２７．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である、実施形態Ｅ２６に記載のキット。
Ｅ２８．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である、実施形態Ｅ２６に記載のキット。
Ｅ２９．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である、実施形態Ｅ２６に記載のキット。
Ｅ３０．ＭＮａｓｅは、２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ３１．ＭＮａｓｅは、２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ３２．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ３３．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。
Ｅ３４．ＭＮａｓｅは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を含む精製されたＡＡＶ粒子を産生するのに十分な量で存在する、実施形態Ｅ２に記載のキット。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｆ１．精製されたＡＡＶ粒子中の不純物を減少させるための手段を含む、組成物。
Ｆ２．不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選択される、実施形態Ｆ１に記載の組成物。
Ｆ３．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｆ２に記載の組成物。
Ｆ４．不純物は、巨視的不純物、微視的不純物、又はその両方である、実施形態Ｆ１に記載の組成物。
Ｆ５．ＡＡＶ粒子のウイルス力価を増加させるための手段を含む、組成物。
Ｆ６．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｆ５に記載の組成物。
Ｆ７．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価を含む、実施形態Ｆ５に記載の組成物。
Ｆ８．ウイルス力価は、機能的ウイルス力価を含む、実施形態Ｆ５に記載の組成物。
Ｆ９．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｆ５～Ｆ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｆ１０．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｆ５～Ｆ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｆ１１．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｆ５～Ｆ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｆ１２．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｆ５～Ｆ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｆ１３．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｆ５～Ｆ８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｆ１４．プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるための手段を含む、組成物。
Ｆ１５．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｆ１４に記載の組成物。
Ｆ１６．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｆ１４に記載の組成物。
Ｆ１７．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｆ１４に記載の組成物。
Ｆ１８．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｆ１４に記載の組成物。
Ｆ１９．ＡＡＶ粒子の完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるための手段を含む、組成物。
Ｆ２０．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である、実施形態Ｆ１９に記載の組成物。
Ｆ２１．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である、実施形態Ｆ１９に記載の組成物。
Ｆ２２．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である、実施形態Ｆ１９に記載の組成物。
Ｆ２３．２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含む、組成物。
Ｆ２４．２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含む、組成物。
Ｆ２５．ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化されたＤＮＡ結合タンパク質を除去するための第１の手段、並びに残留宿主産生細胞核酸及び／又はタンパク質を除去するための第２の手段を含む、組成物。
Ｆ２６．ＡＡＶ粒子を精製する方法であって、（ｉ）ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化されたＤＮＡ結合タンパク質を除去するステップを含む、方法。
Ｆ２７．（ｉｉ）残留宿主産生細胞核酸及び／又はタンパク質を除去するための第２のステップを更に含む、実施形態Ｆ２６に記載の方法。
Ｆ２８．（ｉｉｉ）ウイルス力価を増加させるための第３のステップを更に含む、実施形態Ｆ２６又はＦ２７に記載の方法。

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｇ１．実質的に不純物を含まない、精製されたＡＡＶ粒子を作製及び取得するための手段を含むシステム。
Ｇ２．不純物は、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、クロマチン結合ＤＮＡ、及びＤＮＡ結合タンパク質からなる群から選択される、実施形態Ｇ１に記載のシステム。
Ｇ３．ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、実施形態Ｇ２に記載のシステム。
Ｇ４．不純物は、巨視的不純物、微視的不純物、又はその両方である、実施形態Ｇ１に記載のシステム。
Ｇ５．増加したウイルス力価を有するＡＡＶ粒子を作製及び取得するための手段を含むシステム。
Ｇ６．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価、又はその両方を含む、実施形態Ｇ５に記載のシステム。
Ｇ７．ウイルス力価は、物理的ウイルス力価を含む、実施形態Ｇ５に記載のシステム。
Ｇ８．ウイルス力価は、機能的ウイルス力価を含む、実施形態Ｇ５に記載のシステム。
Ｇ９．ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、実施形態Ｇ５～Ｇ８のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ１０．ウイルス力価は、約２倍以上増加する、実施形態Ｇ５～Ｇ８のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ１１．ウイルス力価は、約３倍以上増加する、実施形態Ｇ５～Ｇ８のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ１２．ウイルス力価は、約７倍以上増加する、実施形態Ｇ５～Ｇ８のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ１３．ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、実施形態Ｇ５～Ｇ８のいずれか１つに記載のシステム。
Ｇ１４．プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分のウイルス力価比を増加させるための手段を含むシステム。
Ｇ１５．ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、実施形態Ｇ１４に記載のシステム。
Ｇ１６．ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、実施形態Ｇ１４に記載のシステム。
Ｇ１７．ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、実施形態Ｇ１４に記載のシステム。
Ｇ１８．ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、実施形態Ｇ１４に記載のシステム。
Ｇ１９．ＡＡＶ粒子の完全なカプシド対空のカプシドの比を増加させるための手段を含むシステム。
Ｇ２０．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約５０％超である、実施形態Ｇ１９に記載のシステム。
Ｇ２１．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約６０％超である、実施形態Ｇ１９に記載のシステム。
Ｇ２２．完全なカプシド対空のカプシドの比は、約７０％超である、実施形態Ｇ１９に記載のシステム。
Ｇ２３．２６０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させる手段を含むシステム。
Ｇ２４．２８０ｎｍでの吸光度によって測定される場合、ＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を減少させるための手段を含むシステム。
Ｇ２５．ＡＡＶ粒子にウイルス外で複合体化したＤＮＡ結合タンパク質を除去するための第１の手段と、宿主産生細胞から残留核酸を除去するための第２の手段と、を含むシステム。

本出願の以下の実施例は、本出願の本質を更に説明するためのものである。当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

（実施例Ｉ）
精製後に不純物として同定された、ＡＡＶ粒子と結合したウイルス外ＤＮＡ結合タンパク質
本実施例は、ＡＡＶ粒子の下流精製に続いて、ＡＡＶ粒子と結合する残留ＤＮＡ結合タンパク質／クロマチン複合体が、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）の添加によって検出及び放出され得ることを確立する。

簡潔に述べると、ＡＡＶ８粒子を含有する懸濁培養物の清澄化された（０．２μｍで濾過された）上清を、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＱＡ－モノリシックカラム（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用する陰イオン交換仕上げステップと組み合わせた市販のＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶＸ親和性樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用するアフィニティー交換クロマトグラフィーに供した。ＡＡＶ粒子産生培養物からの清澄化した上清を、５．５ｍＬ／分の一定流速でＰＯＲＯＳカラムにロードした。ウイルス含有上清を、通常のｐＨ（７．５）でカラムに結合させた。粘度を低下させ、経時的なプレカラム圧力上昇を低下させるために、精製中に５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）を添加した。続いて、ウイルスを低ｐＨ（２．５）のクエン酸緩衝液を用いて溶出させ、直ちにＢＴＰ（ｐＨ１０．２）で中和した。

ウイルス精製の第２の段階は、ウイルスについて予測されるｐＫａよりも高いｐＨである、ｐＨ１０の高イオン強度緩衝液を使用する陰イオン交換仕上げを伴った。このｐＨで、ＡＡＶ粒子はモノリスに強固に結合し、ウイルス凝集を減少させ、更に残留宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを排除する。漸増塩勾配を用いてウイルスを溶出し、「完全カプシド」対「空カプシド」を含有するＤＮＡ間の電荷の差に基づいて、所望のウイルス集団をプロダクトピークとして分離した。しかしながら、複数種の「ポストプロダクトピーク」が、アニオン交換仕上げ中に日常的に観察された。

これらのポストプロダクトピークの溶出プロファイルが不均一であり、プロダクトピークと比較した場合に、より高いイオン強度を必要としたことを考慮すると、ウイルスのこれらの画分が依然として高電荷タンパク質と結合し得ることが疑われた。この観察に基づいて、ＡＡＶ粒子とベンゾナーゼ（登録商標）消化に耐性があるＤＮＡ含有複合体との間の相互作用を調査した。ベンゾナーゼ（登録商標）は、ヌクレオソームＤＮＡの消化において比較的無効であり、したがって、これらのウイルス粒子を溶出するために必要とされるより高いイオン強度が、ＡＡＶ粒子と結合する残留ＤＮＡ結合タンパク質／クロマチン複合体の直接的な結果であるかどうかの調査を実施した。

クロマチン構造がＡＡＶ粒子とウイルス外で結合しているという仮説を試験するために、カプシドを、ＭＮａｓｅを単独で又はベンゾナーゼ（登録商標）と組み合わせて使用して、核酸酵素消化の増加に供した。ベンゾナーゼ（登録商標）を、ＭＮａｓｅと共に又はそれなしで、ＡＡＶＸ含有結合ウイルスに直接添加した。このステップを３０分間保持して、ＤＮＡ及びクロマチン結合ＤＮＡを消化させた。漸増量のＭＮａｓｅを、アフィニティークロマトグラフィーステップの間に、「オンカラム」でのベンゾナーゼ（登録商標）ステップに、組み合わせて又は単独で添加した。結果は、クロマトグラムの形状が、ＭＮａｓｅなし（図１Ａ）又はＭＮａｓｅあり（図１Ｂ）で処理した試料について同じであり、ＭＮａｓｅがウイルスの収量に影響を及ぼさないことを示した。

ポストカラム酵素洗浄物を収集し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、続いてＤＮＡ結合タンパク質の存在について調べるため銀染色を行った。銀染色分析は、最適な（６０Ｕ／ｍＬ）ＭＮａｓｅ処理試料においてのみ同定可能な約１０ｋＤａの単一タンパク質バンドの存在を示した（図２Ａ、第３のレーン）。ベンゾナーゼ（登録商標）単独を含む又は含まない最適以下（２．５Ｕ／ｍＬ）濃度のＭＮａｓｅは、ウイルス外結合ＤＮＡ結合タンパク質の放出において非効率的であった（図２Ａ、第２のレーン）。これは、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅが、クロマチン結合ＤＮＡ結合タンパク質を放出させることができたということを示した。

更に、ポストプロダクトピーク画分を電気泳動によって分析して、試料中に存在し得るあらゆるクロマチンを可視化した。結果は、アフィニティー捕捉クロマトグラフィー中のＭＮａｓｅによる処理が、ポストプロダクトピーク画分からクロマチンを除去するのに十分であったことを示した（図２Ｂ）。具体的には、以下の試料を分析した：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットを使用して懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生されたｒＡＡＶ８粒子の、未希釈試料（レーン２）及び１：１０希釈試料（レーン３）；トランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において産生されたｒＡＡＶ８粒子の、未希釈試料（レーン４）及び１：１０希釈試料（レーン５）；並びにトランスフェクションキットなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において産生されたｒＡＡＶ８粒子を、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化させたｒＡＡＶ８粒子の未希釈試料（レーン６）及び１：１０希釈試料（レーン７）。結果は、ＭＮａｓｅ処理されていない試料（例えば、レーン２及び４）についてのポストプロダクトピーク中に、目に見える高分子量のＤＮＡが存在することを示しており、これは、クロマチンが大きすぎてゲルを透過できないことから、クロマチンを示していた。対照的に、ＭＮａｓｅ処理をした試料（例えば、レーン６）には、高分子量のＤＮＡは存在しなかった。

これらの結果は、ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ粒子と結合する残留ＤＮＡ結合タンパク質／クロマチン複合体を含有すること、及び精製プロセスにＭＮａｓｅを含めることによって複合体を破壊することができることを示した。

（実施例ＩＩ）
ＭＮａｓｅの添加により、陰イオン交換溶出プロファイルが改善される。
本実施例は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）の添加が、下流での精製の間に回収されるＡＡＶ粒子の品質を有意に改善することを立証する。

ウイルス外のクロマチン結合ＡＡＶ粒子は望ましくない生成物であり、精製された生成物の目に見える沈殿を引き起こす可能性があり、これはいかなる製剤研究にとっても問題となり得るものである。更に、増加したクロマチン／ＤＮＡ結合タンパク質は、望ましくない混入物であり、その両方が宿主細胞タンパク質／ＤＮＡ混入を増加させ得る。クロマチン結合ＡＡＶ粒子の問題を克服するために、本研究は、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼ、ＭＮａｓｅを、精製中に添加することができ、ＡＡＶ粒子の精製の改善をもたらすことを実証した。

接着細胞を使用したＡＡＶ粒子の産生は、最小限の細胞死をもたらすこと、及び陰イオン交換クロマトグラムによるわずかなポストプロダクトピークの産生をもたらすことが観察された（図３）。対照的に、懸濁細胞培養における生存率は、接着細胞培養と比較した場合に、低下し（５０～７０％に近づく）、優勢なポストプロダクトピークをもたらした（図４Ａ）。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーステップ中にＭＮａｓｅを添加すると、陰イオン交換クロマトグラフィー中のポストプロダクトピークの高さを低下させ、これは、生成物の純度の改善を示した（図４Ｂ）。具体的には、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅによる処理は、ポストプロダクトピークの大きな２６０ｎｍ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）吸光度ピーク及び２８０ｎｍ（タンパク質）吸光度ピークの両方を低下させた（図４Ｂ）。ＭＮａｓｅによる処理あり又はなしの懸濁培養から産生されたｒＡＡＶ８粒子のアフィニティー交換クロマトグラムを重ねて、ＤＮＡ／ＲＮＡ（２６０ｎｍ）及びタンパク質（２８０ｎｍ）についてのポストプロダクトピーク高さを直接比較すると、クロマチンを消化させるためのＭＮａｓｅによる処理が、ＡＡＶ粒子の精製を強化し、そして残留宿主細胞タンパク質汚染を検出不能なレベルまで有意に低下させるという更なる証拠（それぞれ、図５Ａ及び図５Ｂ）を提供した。特に、核酸スペクトル（２６０ｎｍ）で観察された、ポストプロダクトピーク高さの低下は非常に有意であり、ピーク高さ及び面積において９０％超の減少であると推定された（図５Ａ）。加えて、タンパク質スペクトル（２８０ｎｍ）でも、ポストプロダクトピークの低下が観察された（図５Ｂ）。

更に、陰イオン交換クロマトグラフィー後のポストプロダクトピークの銀染色分析は、ＭＮａｓｅで消化されていない試料中に存在するタンパク質不純物（約１０ｋＤａのバンドを含む）を明らかにし、これは、ＭＮａｓｅにより消化された試料中には存在しなかったＤＮＡ結合タンパク質の存在を示すものである（図６Ａ）。ゲル電気泳動によって分離され、銀染色を使用して染色された試料どうしの比較により、ヒストンの予想サイズに近い約１０ｋＤａの分子量に対応するかすかなバンドが明らかになった。具体的には、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において産生されたｒＡＡＶ８粒子（レーン１）と、エンハンサーを含まない懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において産生されたｒＡＡＶ８粒子（レーン２）と、エンハンサーを含まない懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において産生され、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化させたｒＡＡＶ８粒子（レーン３）とを分析した。矢印は、１０ｋＤａバンドが、ＭＮａｓｅで消化させなかった試料中に存在したが、ＭＮａｓｅで消化させた試料には存在しなかったことを示す（図６Ａ）。大量のクロマチン結合ＤＮＡが通常、精製中にＡＡＶ粒子とウイルス外で結合しているという更なる証拠は、ポストプロダクトピーク画分中のＡＡＶ粒子を溶出させるのに塩の増加が必要であるという観察、及びヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質が高度に正に荷電している（陰イオン交換体のように挙動する）という事実によって提供された。

溶出緩衝液が陰イオン交換溶出プロファイルに影響を及ぼしたかどうかを判定するために、３つの異なる溶出緩衝液（リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、及び高ｐＨ緩衝液）を使用した。プロダクトピーク（「ピークＡ」）についての面積の測定は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの両方について、ポストプロダクトピーク（ピークＡを超えて検出される任意の更なるピーク）と比較した場合に、ＭＮａｓｅによる処理が、全ての緩衝液についてプロダクトピーク中のＤＮＡ／ＲＮＡの量を改善することを明らかにした（表１）。

まとめると、これらの知見は、大量のクロマチン結合ＤＮＡが、通常、精製の間にＡＡＶ粒子とウイルス外で結合していること、及びＭＮａｓｅによる処理がＡＡＶ粒子の精製を強化し得ることを示した。

（実施例ＩＩＩ）
ＭＮａｓｅを増加させると、陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるポストプロダクトピークが低下した。
本実施例は、アフィニティー精製中にＭＮａｓｅを添加する量を増加させると、陰イオン交換クロマトグラフィー仕上げステップにおいて、クロマチン結合したＡＡＶ粒子を減少させたことを証明する。

ＭＮａｓｅの最適範囲を決定するために、試料をＭＮａｓｅで処理しなかった（図７Ａ）か、又は異なる量のＭＮａｓｅ、例えば、２．５Ｕ／ｍＬ（図７Ｂ）若しくは６０Ｕ／ｍＬ（図７Ｃ）で処理した。アフィニティークロマトグラフィーの結果は、より多量のＭＮａｓｅが、ＭＮａｓｅなし（図７Ａ）又は少量のＭＮａｓｅ（図７Ｂ）と比較した場合に、ポストプロダクトピークを減少させたことを示した（図７Ｃ）。

これらの結果は、アフィニティー精製中のＭＮａｓｅ添加量の増加により、陰イオン交換クロマトグラフィー仕上げステップにおいて、クロマチン結合ＡＡＶ粒子が減少することを実証し、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅが、クロマチン結合ＡＡＶ粒子を減少させるのに有効な濃度であることを証明した。

（実施例ＩＶ）
ＭＮａｓｅによる消化は、ＡＡＶ粒子の凝集を防止し、ＡＡＶ粒子の沈殿を減少させた。
この実施例は、ＭＮａｓｅ消化がＡＡＶ粒子の凝集及び沈殿を防止したことを立証する。

ポストプロダクトピーク画分を肉眼で検査した。その検査において、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で産生され、その後のＭＮａｓｅ処理をしなかったｒＡＡＶ８粒子、又はエンハンサーなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞中で産生され、その後のＭＮａｓｅ処理をしなかったｒＡＡＶ８粒子は、肉眼による検査で、視認可能な沈殿物を有していることが判明した（図８）。対照的に、エンハンサーなしで懸濁Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞において産生され、その後、６０Ｕ／ｍＬのＭＮａｓｅを用いて２５℃で３０分間消化させたｒＡＡＶ８粒子は、視認できるような沈殿物を有さなかった（図８）。

このデータは、ＭＮａｓｅによる消化が、ＡＡＶ粒子の凝集及び沈殿を防止することを実証した。

（実施例ＶＩ）
ＭＮａｓｅによる処理は、ＡＡＶ粒子の力価を増加させた。
この実施例は、ＭＮａｓｅによる処理を、異なる精製プロトコルに加えた場合に、ＡＡＶ粒子の力価を増加させたことを立証する。

ＭＮａｓｅによる処理が、異なる溶出方法に適合するかどうかを判定するために、高／低ｐＨ溶出法、クエン酸塩溶出法、及び低ｐＨ溶出法を使用して、３つの異なるタイプの溶出を実施した。ゲル電気泳動後、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色を用いて、ＭＮａｓｅによる処理あり又はなしの場合のＤＮＡ収量間の、定性的比較を行った（図９Ａ～図９Ｆ）。結果は、３つの異なるタイプの溶出法：高／低ｐＨ溶出、クエン酸塩溶出、及び低ｐＨ溶出を使用して、ＭＮａｓｅで処理した試料が、ＭＮａｓｅで処理していない試料と比較した場合に、プロダクトピーク中のＤＮＡ量が増加したことを示した（図９Ａ～図９Ｆ）。

加えて、１ｍＬあたりのゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）の力価（図１０）、１細胞あたりのゲノムコピー（ＧＣ／細胞）（図１０Ｂ）、及び総ゲノムコピー数（図１０Ｃ）の定量化により、ＭＮａｓｅによる処理が、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキットのエンハンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）あり又はなしの、ＭＮａｓｅで処理していない試料と比較した場合に、所望のプロダクトのウイルス力価を増加させ、望ましくないポストプロダクトの量を減少させるということを明らかにした。

図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、細胞あたりのゲノムコピー（ＧＣ／細胞）（図１１Ａ、表２）及び全ゲノムコピー（図１１Ｂ、表３）の増加は、３つの異なる溶出緩衝液（すなわち、クエン酸、低ｐＨ、及び低／高ｐＨ）の各々について、ＭＮａｓｅで処理した試料において一貫して観察された。

まとめると、これらのデータは、ＭＮａｓｅによる処理が、ＡＡＶ粒子の力価を増加させたこと、及びＡＡＶ粒子の力価の増加が溶出緩衝液に依存しなかったことを示す。

（実施例Ｖ）
ＭＮａｓｅによる処理は、プロダクト画分の機能的力価を増加させた。
この実施例は、ＭＮａｓｅによる処理が、プロダクト画分のより大きな感染性によって証明されるように、プロダクト画分の機能的力価を増加させたことを立証する。

ＭＮａｓｅを使用して生成されたウイルスの機能的力価を評価するために、標的細胞に、ＭＮａｓｅを用いて処理された又は処理されなかった、プロダクト画分又はポストプロダクト画分のいずれかから収集された赤色蛍光タンパク質を発現するウイルス粒子を形質導入した。標的細胞が感染性の代用として赤色蛍光タンパク質発現に何らかの差を示すかどうかを判定することによって、機能的力価を測定した。

簡単に説明すると、試料をＭＮａｓｅを用いて処理し、又は処理せずに、高／低ｐＨ（図１２）、クエン酸塩（図１３）、又は低ｐＨ（図１４）で溶出させ、プロダクトウイルス画分及びポストプロダクトウイルス画分を回収した。次いで、画分を細胞と接触させ、感染多重度（multiplicity of infection、ＭＯＩ）を測定して、機能的力価レベルを決定した。

プロダクト画分の感染性プロファイルは、ＭＮａｓｅによる処理が、異なる溶出緩衝液の各々について、より大きなＭＯＩを生じたことを示した（表４）。対照的に、ポストプロダクトの画分の感染性プロファイルは、ＭＮａｓｅによる処理が、異なる溶出緩衝液の各々について、減少したＭＯＩを生じることを示した。

これらの結果は、ＭＮａｓｅによる処理が、異なる溶出緩衝液の各々について、プロダクト画分の機能的力価を増加させたが、ポストプロダクト画分については増加させなかったことを示した。

（実施例ＶＩ）
高ｐＨによる洗浄は、ＡＡＶの純度を改善した。
この実施例は、ＡＡＶのアフィニティー交換クロマトグラフィー中の高ｐＨ洗浄が、ＡＡＶの純度を改善することができたことを立証する。

ＡＡＶを精製するための最適条件を決定するために、ＡＫＴＡシステムを使用し、精製中に試料を様々な洗浄及び／又は酵素処理条件に供した。異なる精製条件を表５に要約する。

ＢＴＰ：ビス－トリス－プロパン；ＮａＣｌ：塩化ナトリウム；Ｈ_３ＰＯ_４：リン酸

簡潔に述べると、バルク回収及びベンゾナーゼ（登録商標）による処理の後、粗試料をアフィニティークロマトグラフィーに供した。表５に示すように、特定の条件（すなわち、条件４～１０）下で、アフィニティーカラムを、ｐＨ９．５～ｐＨ１０．９の範囲の高ｐＨ緩衝液で洗浄した。更に、表５に示されるように、試料は、ベンゾナーゼ（登録商標）でもＭＮａｓｅでも処理されなかった（条件１）か、ベンゾナーゼ（登録商標）のみでオンカラムで処理された（条件２及び７）か、又はベンゾナーゼ（登録商標）とＭＮａｓｅとでオンカラムで処理された（条件３～５及び８～１０）かのいずれかとした。アフィニティーカラムからの溶出は、クエン酸塩、ｐＨ２．５（条件１、２、及び４）、又はリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、ｐＨ１．５（条件３、及び５～１０）を用いて行った。

アフィニティークロマトグラフィーによる精製後、次いで、ＣＩＭ ＱＡ（第四級アミン）モノリスカラムを使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーによって試料を仕上げた。その後、試料を、１０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ直線勾配を用いて溶出し、２０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ１０．２（条件１～９）中で中和するか、又は０～３００ｍＭ（Ｃ_２Ｈ_５）ＮＣｌ直線勾配を用いて溶出し、２０ｍＭのトリスｐＨ９．０（条件１０）中で中和した。

精製した試料を回収し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、続いて銀染色を行った。いかなる酵素処理も含まない条件（条件１）又はベンゾナーゼ（登録商標）による処理のみを含む条件（条件２）において、溶出されたＡＡＶは、大量の不純物を有することが判明した（それぞれ、図１５Ａ及び図１５Ｂ）。例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に対応する３つの強いバンドに加えて、銀染色によって検出される多くの他のタンパク質不純物が存在した。対照的に、アフィニティークロマトグラフィー精製ステップ（条件４）中に、ｐＨ９．５での洗浄を用いてＡＡＶ試料を精製した場合には、溶出画分中の不純物はかなり少なかった（図１６Ａ）。更なる改善が、アフィニティークロマトグラフィー精製ステップ中にｐＨ１０．４での洗浄を使用して観察された（図１６Ｂ）。しかしながら、ｐＨ１０．９でアフィニティーカラムを洗浄すると、ウイルスの大きな損失をもたらした。異なる精製条件の比較は、ベンゾナーゼ（登録商標）及びＭＮａｓｅによる処理と組み合わせた場合、ｐＨ１０．９未満の高ｐＨ洗浄条件が、高度に純粋なＡＡＶ試料をもたらしたことを示した（図１７Ａ）。更に、精製されたＡＡＶ試料のＤＮＡアガロースゲル電気泳動は、ＡＡＶ内に含まれるＩＴＲ導入遺伝子の存在を示した。

これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィー精製中に高ｐＨ（約ｐＨ９．５～ｐＨ１０．４）で洗浄を行うと、精製されたＡＡＶの純度を改善し得ることを示した（図１８）。

（実施例ＶＩＩ）
溶出条件の改変は、ウイルスの回収を改善する。
本実施例は、低ｐＨ緩衝液及びエタノールによる溶出により、精製されたＡＡＶの純度を改善することができたことを立証する（図１９）。

残留ウイルスが陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に残っているかどうかを判定するために、試料を、２つの異なる溶出条件を含む３つの別個の条件下で処理した。簡単に説明すると、試料を、ベンゾナーゼ（登録商標）で処理し、ＭＮａｓｅによって処理し又は処理せずに、アフィニティークロマトグラフィー精製に供し、先に記載したように陰イオン交換クロマトグラフィーによって仕上げた。次いで、２０％エタノールを含む又は含まない低ｐＨ緩衝液（リン酸、ｐＨ１．５）を使用して試料を溶出した。

結果は、ベンゾナーゼのみで処理され（すなわち、ＭＮａｓｅによる処理なし）、高ｐＨ緩衝液で洗浄され、リン酸（ｐＨ１．５）で溶出された試料において、示されたクロマトグラフィーピーク（矢印参照）によって強調されるように、残留ウイルスがストリッピング後にカラム上に残っていたことを示した（図１９Ａ）。アフィニティークロマトグラフィー精製ステップ中に、ＭＮａｓｅを添加すると、カラムストリップ中の残留ウイルスを減少させることができた（矢印参照）（図１９Ｂ）。カラムからのウイルスの溶出は、クロマトグラフィーピーク（矢印参照）がほぼ存在しないことによって示されるように（図１９Ｃ）、溶出中に２０％エタノールを添加することによって更に改善された（矢印参照）。

まとめると、これらの結果は、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムからのウイルスの回収が、溶出の間のエタノールの添加によって更に改善され得ることを示した。

（実施例ＶＩＩＩ）
ＭＮａｓｅによる処理は、動的光散乱（ＤＬＳ）及びＴｍ／Ｔａｇｇによって測定される不純物の除去を改善した。
本実施例は、ＭＮａｓｅによる処理が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるような不純物の除去、及びタンパク質凝集温度Ｔａｇｇがウイルスの融解と一致する温度の決定を改善したことを立証する。

ＡＡＶ血清型同一性の決定因子としての熱安定性は、当該技術分野において既知であり、ＡＡＶ粒子試料中の不純物を検出するために使用することもできる。例えば、不純物が除去されると、タンパク質凝集の開始（Ｔａｇｇ）はウイルスの融解温度（Ｔｍ）と一致する。

上記の以前の結果と一致して、動的光散乱（ＤＬＳ）及びＴｍ／Ｔａｇｇアッセイは、ＭＮａｓｅにより、ＡＡＶ粒子からの不純物の除去が改善されることを確認することができた。具体的には、ベンゾナーゼ（登録商標）でもＭＮａｓｅでも処理されなかった試料においては、Ｔａｇｇ及びＴｍは、１０℃を超えて異なることが見出された（図２０Ａ）。ベンゾナーゼ（登録商標）の添加は不純物の除去を改善したが、ベンゾナーゼ（登録商標）とＭＮａｓｅとを一緒に用いると、Ｔａｇｇ及びＴｍの一致が改善を示した（図２０Ｂ及び図２０Ｃ）。

ＭＮａｓｅで処理し、高ｐＨ条件下で溶出した試料においても、不純物の低減における改善が観察された。具体的には、ベンゾナーゼ（登録商標）及びＭＮａｓｅで処理し、リン酸（ｐＨ１０．３）で溶出した試料（図２０Ｅ）についてのＴａｇｇ及びＴｍの一致性は、ベンゾナーゼ（登録商標）のみで処理し、リン酸（ｐＨ１０．３）で溶出した試料（図２０Ｄ）と比較した場合に、高まっていた。

まとめると、これらの結果は、ＭＮａｓｅによる処理がＡＡＶ粒子試料中の不純物の量を減少させることができ、高ｐＨ条件と組み合わせたＭＮａｓｅによる処理が、不純物の量を更に減少させることができることを確認した。

（実施例ＩＸ）
精製中のＭＮａｓｅによる処理は、残留宿主細胞ＤＮＡを減少させる。
この実施例は、宿主細胞ＤＮＡが、ＭＮａｓｅによる処理によって有意に減少され得ることを立証する。

陰イオン交換（ＡＥＸ）精製後のＡＡＶ粒子試料中に、残留宿主細胞ＤＮＡが存在するかどうかを判定するために、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを実施して、分析物として宿主細胞ＤＮＡを検出した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡビーズベースの技術は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの増幅発光近接ホモジニアスアッセイに依存し、発光酸素チャネリング化学を使用して宿主細胞ＤＮＡを検出する（Ｂｅａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５，ａｎ８－ａｎ９，（２００８）を参照）。

ＡＥＸ精製後の残留宿主細胞ＤＮＡの分析を、６つの異なる条件下で調製された試料中のＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定した。（１）ベンゾナーゼ（登録商標）もＭＮａｓｅも用いない精製（「酵素なし」）、（２）ベンゾナーゼ（登録商標）による処理を行い、クエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩（アフィニティー）」）を行った場合、（３）ベンゾナーゼ（登録商標）による処理及びクエン酸塩溶出による精製（「Ｂ、クエン酸塩」）を行った場合、（４）ベンゾナーゼ（登録商標）による処理、ＭＮａｓｅによる処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、（５）ベンゾナーゼ（登録商標）による処理、高ｐＨ（ｐＨ１０．３）洗浄、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合、並びに（６）ベンゾナーゼ（登録商標）による処理、ＭＮａｓｅによる処理、及びリン酸溶出による精製（「Ｂ、Ｍ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）を行った場合。標準曲線を作成して、存在する宿主細胞ＤＮＡの濃度レベルを外挿した。

結果は、ＭＮａｓｅで処理した試料において、宿主細胞ＤＮＡのレベルが有意に減少したことを示した（図２１Ａ及び図２０Ｂ）。注目すべきことに、ベンゾナーゼ（登録商標）、ＭＮａｓｅ、及びリン酸溶出（「Ｂ、Ｍ、ｐＨ１０．３、Ｐｈｏｓ」）による精製は、ほぼ検出不可能なレベルの宿主細胞ＤＮＡをもたらした（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。

これらの結果は、ＭＮａｓｅによる処理が、ＡＡＶ粒子試料由来の宿主細胞ＤＮＡを有意に減少させることを示した。

（実施例Ｘ）
ＭＮａｓｅによる処理は、精製プロセスを改善する。
この実施例は、本明細書で提供される精製プロセスが、目下の最新技術も超越する改善を表すことを示す。

陰イオン交換及びベンゾナーゼ（登録商標）を使用するＡＡＶ粒子の精製の現在の方法が、説明されている（Ｗａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１９；１５：２５７－２６３を参照）。しかしながら、ＭＮａｓｅは、そのような方法では使用されていない。

ＭＮａｓｅによる処理を含む本明細書中に記載される精製方法が、上記の現在の精製方法よりも良好に機能し得るか否かを判定するために、ＭＮａｓｅによる処理プロトコル（プロトコル＃１）を、Ｗａｎｇらの方法（プロトコル＃２）を使用して得られた画分と比較した。

簡単に説明すると、Ｗａｎｇらによる精製法を、アフィニティー樹脂によって行った。カラムにロードする前に、バルクＡＡＶプールを、５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）で、３７℃で１時間処理し、１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって清澄化し、続いて１．２ｍｍ及び０．４５ｍｍフィルターを通して連続的に濾過した。低ｐＨ緩衝液を用いてカラムからＡＡＶを溶出させた。並行して、異なるセットの試料を、ＭＮａｓｅによる処理を含む本明細書に記載の方法に従って精製した。

プロトコル＃１とプロトコル＃２との比較は、ＭＮａｓｅによる処理が、銀染色によって測定した場合に、ＡＡＶ粒子の試料中に存在する不純物の量を大きく減少させることができたことを明らかにした（図２２）。

したがって、この実施例は、ＭＮａｓｅを使用する本明細書中で提供される精製方法が、ＡＡＶ精製のために使用される方法を超える改善を示すことを立証している。
^{＊ ＊ ＊ ＊ ＊}

当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

Claims (74)

1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、前記方法は、
   （ａ）ＡＡＶ粒子を含む上清を、クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼを含む組成物と接触させることと、
   （ｂ）前記ＡＡＶ粒子を精製することと、を含む、方法。
2. 前記精製することは、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記遠心分離は、密度勾配遠心分離、超遠心分離、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
5. ＡＡＶ粒子を含む前記上清を、固体支持体と共に、前記ＡＡＶ粒子を結合するのに十分な時間にわたりインキュベートすることを更に含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記固体支持体を洗浄することを更に含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記洗浄することは、高ｐＨ緩衝液を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０より大きい、請求項７に記載の方法。
9. 前記高ｐＨ緩衝液は、ｐＨ９．０とｐＨ１１の間である、請求項７に記載の方法。
10. 前記高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ９．５である、請求項７に記載の方法。
11. 前記高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．２である、請求項７に記載の方法。
12. 前記高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．３である、請求項７に記載の方法。
13. 前記高ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１０．４である、請求項７に記載の方法。
14. 前記方法は、１回以上のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、請求項４～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記上清は、清澄化された上清である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ステップ（ａ）の前記組成物は、ベンゾナーゼ（Benzonase、登録商標）を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記インキュベーションは、約１０分間～約１時間である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記インキュベーションは、約２０分間～約４０分間である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記インキュベーションは、約３０分間である、請求項１９又は２０に記載の方法。
22. 前記クロマチン－ＤＮＡヌクレアーゼは、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記上清中の前記ＭＮａｓｅの濃度は、２．５単位／ｍＬより大きい、請求項２２に記載の方法。
24. 前記上清中の前記ＭＮａｓｅの濃度は、１０単位／ｍＬより大きい、請求項２３に記載の方法。
25. 前記上清中の前記ＭＮａｓｅの濃度は、約３０単位／ｍＬ～約１００単位／ｍＬである、請求項２３又は２４に記載の方法。
26. 前記上清中の前記ＭＮａｓｅの濃度は、約６０単位／ｍＬである、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ＭＮａｓｅは、結合されたＡＡＶ粒子を含有する前記固体支持体と共にインキュベートされる、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ＡＡＶ粒子は、低ｐＨ緩衝液を使用して、前記固体支持体から溶出される、請求項５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記低ｐＨ緩衝液の前に、高ｐＨ緩衝液を更に含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ３．０未満である、請求項２８又は２９に記載の方法。
31. 前記低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５～約ｐＨ２．５である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ１．５である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記低ｐＨ緩衝液は、約ｐＨ２．５である、請求項３０に記載の方法。
34. 前記低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、又はリン酸緩衝液である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記低ｐＨ緩衝液は、クエン酸緩衝液である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記低ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液である、請求項３４に記載の方法。
37. 前記アフィニティークロマトグラフィー精製は、２回のアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、請求項１４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーがその後に続くアフィニティークロマトグラフィー精製を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記低ｐＨ緩衝液のｐＨを中和することを更に含む、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 中和することは、ビス－トリス－プロパン（ＢＴＰ）又はトリス緩衝液を添加することを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 約５％～約４０％のエタノールを更に含む、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 約１０％～約３０％のエタノールを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 約１５％～約２５％のエタノールを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
44. 約２０％のエタノールを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、クロマチン結合ＤＮＡを実質的に含まない、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞ＤＮＡを実質的に含まない、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記宿主細胞ＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記宿主細胞ＤＮＡの濃度は、１．５ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項４６に記載の方法。
49. 前記宿主細胞ＤＮＡの前記濃度は、１ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、宿主細胞タンパク質を実質的に含まない、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合、ＤＮＡ結合タンパク質を実質的に含まない、請求項５０に記載の方法。
52. 前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ヒストンを含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、巨視的不純物及び微視的不純物を実質的に含まない、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、増加したウイルス力価を有する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記ウイルス力価は、物理的力価を含む、請求項５４に記載の方法。
56. 前記ウイルス力価は、機能的力価を含む、請求項５４に記載の方法。
57. 前記ウイルス力価は、約２倍から約１００倍に増加される、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記ウイルス力価は、約２倍以上増加する、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記ウイルス力価は、約３倍以上増加する、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記ウイルス力価は、約７倍以上増加する、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記ウイルス力価は、約８０倍以上増加する、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、プロダクトＡＡＶ粒子画分対ポストプロダクトＡＡＶ粒子画分の増加したウイルス力価比を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記ウイルス力価比は、約２倍以上増加する、請求項６２に記載の方法。
64. 前記ウイルス力価比は、約５倍以上増加する、請求項６２に記載の方法。
65. 前記ウイルス力価比は、約１０倍以上増加する、請求項６２に記載の方法。
66. 前記ウイルス力価比は、約２５倍以上増加する、請求項６２に記載の方法。
67. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約１０℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の約５℃未満以内のＴｍを有する、請求項６７に記載の方法。
69. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される場合、凝集温度（Ｔａｇｇ）の２℃未満以内の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項６７に記載の方法。
70. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、約５０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、約６０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、請求項７０に記載の方法。
72. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、約７０％超の完全なカプシド対空のカプシドの比を含む、請求項７０に記載の方法。
73. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、減少した２６０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記精製されたＡＡＶ粒子は、ＭＮａｓｅ非接触で精製されたＡＡＶ粒子と比較した場合に、減少した２８０ｎｍでの吸光度を有するＡＡＶ粒子ポストプロダクト画分を含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。

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