JP2023524062A - 治療用タンパク質に対する中和抗体アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、概して、治療用タンパク質に対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在について試験する方法に関する。具体的には、本発明は、治療用タンパク質に対する中和抗体の検出のための、リガンド結合アッセイ又は細胞ベースのアッセイにおける干渉競合薬物に対する緩和剤の使用に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０１８，８２１号、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，７６８号、及び２０２１年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，４８８号の優先権及び恩典を主張し、それらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本出願は、治療用タンパク質に対する中和抗体の検出のための診断アッセイを行うためのアッセイ方法、モジュール、及びキットに関する。

背景
患者への生物学的治療薬の投与は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生をもたらし得る、患者において望ましくない免疫原性応答を誘導することができる（Ｍｉｒｅ－Ｓｌｕｉｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９（１）：１－１６（２００４）（非特許文献１））。中和抗体（ＮＡｂ）は、薬物のその標的への結合を阻害し、薬物を生物学的に不活性にする、ＡＤＡのサブセットである。定義によると、ＮＡｂは、薬物の効果を中和し、臨床活性を低減する可能性がある。加えて、薬物が内因性タンパク質の生物学的模倣物である場合、ＮＡｂは、薬物の内因性類似体と交差反応し得、これは、薬物の安全性に重要な結果を有し得る（Ｆｉｎｃｏ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ，５４（２）：３５１－３５８（２０１１）（非特許文献２）、Ｈｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１９：１－８（２０１５）（非特許文献３））。

免疫原性応答の検出は段階的アプローチを伴い、そこでは、典型的にはブリッジングイムノアッセイを使用して、まずＡＤＡの存在について試料が試験される（Ｍｉｒｅ－Ｓｌｕｉｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９（１）：１－１６（２００４）（非特許文献４））。ＡＤＡ応答の更なる特徴付けは、ＡＤＡの相対量を決定するための力価アッセイと、抗体応答が中和しているかどうかを判定するためのアッセイとを含み得る（Ｗｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（６）：１３３５－１３５０（２０１６）（非特許文献５）、Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ４８（５）：１２６７－１２８１（２００８）（非特許文献６）、Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ，５５（５）：８７８－８８８（２０１１）（非特許文献７））。

ＮＡｂアッセイは、治療用タンパク質に対する中和の正確な定量化を妨げる干渉に供され得る。例えば、内因性薬物標的が可溶性である場合、それは、対象試料中に存在し、治療薬と競合的に結合し、偽陽性ＮＡｂシグナルを生じる可能性がある。また、対象試料中には、治療薬の以前の投与からの残留薬物が存在している可能性があり、これは、ＮＡｂに競合的に結合し、偽陰性ＮＡｂシグナルを生じる可能性がある。こうした干渉原因に対処して、ＮＡｂの正確な定量化を得るために、様々な技術が開発されてきた（Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６２：３４－４１（２０１８）（非特許文献８）、Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１６：９４－１０４（２０１５）（非特許文献９）、Ｘｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２１（１）：４（２０１９）（非特許文献１０）、Ｓｌｏａｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，８（２０）：２１５７－２１６８（２０１６）（非特許文献１１））。

まだ特徴付けられていない潜在的な干渉の追加の原因は、試験されている治療用タンパク質とは異なる残留薬物による干渉であり、治療薬と同じ薬物標的に競合的に結合し、これは、偽陽性ＮＡｂシグナルを生じる。したがって、このタイプの干渉を緩和するための戦略も、現在まで開発されていない。

したがって、治療用タンパク質に対する中和抗体の検出のための、リガンド結合アッセイ又は細胞ベースのアッセイにおいて、競合薬物からの干渉を特定及び緩和するための方法に対するニーズが存在することが認識されるであろう。

Ｍｉｒｅ－Ｓｌｕｉｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９（１）：１－１６（２００４） Ｆｉｎｃｏ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ，５４（２）：３５１－３５８（２０１１） Ｈｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１９：１－８（２０１５） Ｍｉｒｅ－Ｓｌｕｉｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９（１）：１－１６（２００４） Ｗｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（６）：１３３５－１３５０（２０１６） Ｓｈａｎｋａｒ，Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ４８（５）：１２６７－１２８１（２００８） Ｇｕｐｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ，５５（５）：８７８－８８８（２０１１） Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６２：３４－４１（２０１８） Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１６：９４－１０４（２０１５） Ｘｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２１（１）：４（２０１９ Ｓｌｏａｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，８（２０）：２１５７－２１６８（２０１６）

概要
本開示は、試料中の治療用タンパク質に対する中和物質を検出するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）当該中和物質及び競合薬物を有する当該試料を（ｉ）当該治療用タンパク質、（ｉｉ）当該治療用タンパク質の標的、及び（ｉｉｉ）緩和剤に接触させることと、（ｂ）当該治療用タンパク質の当該標的への結合を測定することと、（ｃ）当該中和物質を検出するために（ｂ）の結果を対照測定値と比較することと、を含む。

一態様では、当該対照測定値は、中和物質の不在下で、当該治療用タンパク質の当該標的への結合を測定することによって得られる。別の態様では、当該中和物質は、中和抗体である。

一態様では、当該治療用タンパク質は、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、又は酵素である。特定の態様では、当該治療用タンパク質は、モノクローナル抗体である。更に別の特定の態様では、当該モノクローナル抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３８抗体、又は抗ＬＡＧ３抗体である。

一態様では、当該治療用タンパク質は、二重特異性抗体である。特定の態様では、当該二重特異性抗体は、ＣＤ２０×ＣＤ３抗体、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体、ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、又はＣＤ３８×ＣＤ２８抗体である。

一態様では、当該治療用タンパク質は、固体支持体に固定化される。別の態様では、当該治療用タンパク質は、検出のために標識される。特定の態様では、当該標識は、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、又は親和性精製によって検出可能である。更に別の特定の態様では、当該標識は、ルテニウムを含む。

一態様では、当該標的は、抗原、受容体、リガンド、又は酵素基質である。別の態様では、当該標的は、細胞表面タンパク質である。更に別の態様では、当該標的は、組換えタンパク質である。更に別の態様では、当該標的は、細胞によって発現される。特定の態様では、当該細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＯＬＰ－８細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、又はそれらの修飾型である。

一態様では、当該標的は、固体支持体に固定される。別の態様では、当該標的は、検出のために標識される。特定の態様では、当該標識は、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、又は親和性精製によって検出可能である。別の態様では、当該標的は、酵素基質である。更に別の態様では、当該標的は、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＴＮＦ、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３である。更に別の態様では、当該方法は、第２の標的を追加的に含む。

一態様では、当該競合薬物は、モノクローナル抗体である。特定の態様では、当該競合薬物は、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、又はアダリムマブである。別の態様では、当該競合薬物は、二重特異性抗体である。

一態様では、当該緩和剤は、モノクローナル抗体である。別の態様では、当該方法は、２種、３種、４種、又はそれ以上の緩和剤を使用することを含む。

一態様では、当該治療用タンパク質の当該標的への結合は、受容体リン酸化、シグナル伝達経路における下流タンパク質のリン酸化、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞死、又は二次タンパク質の産生を測定することによって測定される。別の態様では、当該治療用タンパク質の当該標的への結合は、レポーター遺伝子の発現によって測定される。特定の態様では、当該レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼである。

一態様では、当該方法は、当該試料を当該治療用タンパク質又は当該標的に接触させる前に、当該試料を当該緩和剤に接触させる前処理工程を更に含む。

本開示はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。いくつかの例示的な実施形態では、キットは、治療用タンパク質と、当該治療用タンパク質の標的と、当該治療用タンパク質に対する中和物質と、競合薬物と、緩和剤と、を含む。

一態様では、当該キットは、当該標的を発現する細胞を更に含む。特定の態様では、当該キットは、当該治療用タンパク質の当該標的への結合に応答して、測定可能な活性又はシグナルを生じる細胞を更に含む。別の特定の態様では、当該活性は、ルシフェラーゼの発現である。

一態様では、当該標的は、固体支持体に固定される。別の態様では、当該キットは、当該治療用タンパク質に付着した標識を更に含む。特定の態様では、当該標識は、ルテニウムを含む。

本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮される場合に、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、又は再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

図１Ａは、例示的な実施形態に従った、細胞ベースの中和抗体（ＮＡｂ）アッセイの図を示す。図１Ｂは、例示的な実施形態に従った、陰性対照抗体がルシフェラーゼシグナルを誘導しない一方で、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の増加を示す。図１Ｃは、例示的な実施形態に従った、２つの二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の増加を示す。 例示的な実施形態に従った、治療用抗体の各アームに対する中和抗体を添加した細胞ベースＮＡｂアッセイの図を示す。 例示的な実施形態に従った、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体のＣＤ２０アーム又はＣＤ３アームのいずれかに対する代理中和抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体のＢＣＭＡアームに対する代理中和抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体のＣＤ３アームに対する代理中和抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイに対して、アイソタイプ対照抗体の添加によるルシフェラーゼ活性の変化がないことを示す。 例示的な実施形態に従った、第２の二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体のＢＣＭＡアームに対する代理中和抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、第２の二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体のＣＤ３アームに対する代理中和抗体の濃度の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、第２の二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイに対して、アイソタイプ対照抗体の添加によるルシフェラーゼ活性の変化がないことを示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＣＤ２０に対する競合抗体の添加による、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＣＤ３に対する競合抗体の添加による、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＢＣＭＡ又はＣＤ３に対する競合抗体の添加による、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＢＣＭＡ又はＣＤ３に対する競合抗体の添加による、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＢＣＭＡ又はＣＤ３に対する競合抗体の添加による、第２の二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 例示的な実施形態に従った、薬物標的ＢＣＭＡ又はＣＤ３に対する競合抗体の添加による、第２の二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の減少を示す。 図４Ａは、例示的な実施形態に従った、治療用抗体の濃度の増加に伴う、ＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の増加を示す。ナイーブヒト血清の添加は、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。図４Ｂは、例示的な実施形態に従った、薬物対照の存在下でのルシフェラーゼ活性を実験試料の存在下でのルシフェラーゼ活性と比較することによる、ＮＡｂアッセイシグナルの定量化を示す。 例示的な実施形態に従った、６０個の薬物ナイーブ臨床試料からの細胞ベースのＮＡｂアッセイ結果を示す。 例示的な実施形態に従った、臨床試料中のリツキシマブの濃度とＮＡｂアッセイシグナルとの間の相関を示す。 図７Ａは、例示的な実施形態に従った、リツキシマブを添加した細胞ベースのＮＡｂアッセイの図を示す。図７Ｂは、例示的な実施形態に従った、リツキシマブ及びリツキシマブに対する緩和抗体を添加したＮＡｂアッセイの図を示す。図７Ｃは、例示的な実施形態に従った、リツキシマブに対する緩和抗体を添加した、ＮＡｂアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の回復を示す。 例示的な実施形態に従った、リツキシマブに対する緩和抗体を添加した、薬物非投与臨床試料中の偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルの低減を示す。 図９Ａは、例示的な実施形態に従った、標的捕捉リガンド結合ＮＡｂアッセイの図を示す。図９Ｂは、例示的な実施形態に従った、治療用タンパク質のアームに対するＮＡｂを添加した標的捕捉リガンド結合ＮＡｂアッセイの図を示す。図９Ｃは、例示的な実施形態に従った、薬物捕捉リガンド結合ＮＡｂアッセイの図を示す。 図１０Ａは、例示的な実施形態に従った、競合薬物を添加したリガンド結合ＮＡｂアッセイの図を示す。図１０Ｂは、例示的な実施形態に従った、競合薬物の濃度の増加に伴う、リガンド結合ＮＡｂアッセイにおける偽陽性シグナル阻害の増加を示す。 図１１Ａは、例示的な実施形態に従った、競合薬物及び競合薬物に対する緩和抗体を添加したリガンド結合ＮＡｂアッセイの図を示す。図１１Ｂは、例示的な実施形態に従った、競合薬物に対する緩和抗体を添加した、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルの排除を示す。

詳細な説明
治療用タンパク質は、様々なヒト疾患を治療するために使用される薬物の重要なクラスである。しかしながら、治療用タンパク質は、投与されたレシピエントにおいて免疫応答を誘発し、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生成し得る。中和抗体（ＮＡｂ）は、治療用タンパク質の生物学的活性を遮断することによって、患者の安全性に潜在的に影響を与え、薬効の損失を媒介することができるＡＤＡの部分集団である。したがって、ＮＡｂの特徴付け及び監視は、免疫原性評価の重要な態様であり、治療作用機序を反映する感度及び信頼性の高い方法を必要とする（Ｗｕ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（６）：１３３５－１３５０（２０１６））。

ＮＡｂアッセイは、適切な感度、特異性、選択性、及び精度でＮＡｂを確実に検出することが予想される。細胞ベースのアッセイ及び非細胞ベースのアッセイの両方が、ＮＡｂ評価のための選択肢である。概して、ＮＡｂアッセイは、治療用タンパク質の標的を提示し、及び治療用タンパク質のその標的への結合への応答としてのシグナル出力の機序を提示するので、結合の定量化が可能になる。共インキュベートされた試料中にＮＡｂが存在する場合、それらは、治療用タンパク質の標的への結合を阻害し、シグナル出力を低減するので、試料中のＮＡｂの定量化が可能になる。

試料マトリックスは、例えば、ＮＡｂ、治療用タンパク質、又は標的と直接相互作用することによって、ＮＡｂの正確な定量化を妨げる干渉物質を含み得る。ＮＡｂと相互作用し、ＮＡｂを占有することによって干渉し得るマトリックス構成成分としては、例えば、治療用タンパク質の以前の投与からの残留薬物が挙げられる。治療用タンパク質と相互作用し、治療用タンパク質を占有することによって干渉し得る別の構成成分としては、例えば、可溶性薬物標的が挙げられる。これらの干渉物質は、従来技術において特徴付けられており、これらの干渉原因に対処して、ＮＡｂの正確な定量化を得るために、技術が開発されてきた（Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６２：３４－４１（２０１８）、Ｘｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１６：９４－１０４（２０１５）、Ｘｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２１（１）：４（２０１９）、Ｓｌｏａｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，８（２０）：２１５７－２１６８（２０１６））。

しかしながら、まだ特徴付けられていない又は対処されていない別の考えられる干渉物質は、試験されている治療用タンパク質とは異なる、対象試料中の残留競合薬物であり、これは、治療用タンパク質の標的と相互作用し、それを占有し、ＮＡｂの偽陽性の定量化をもたらし得る。

治療用タンパク質に対する中和抗体を正確に測定する課題に対応するために、中和抗体アッセイにおける干渉を防止するために競合薬物に対する緩和剤を使用するための方法及びキットが、本明細書に記載される。また、治療用タンパク質の標的に競合的に結合する薬物からのＮＡｂアッセイにおける干渉の検出も、本明細書に開示される。この干渉は、ＮＡｂアッセイにおける治療用タンパク質結合シグナル又は活性、及び偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルの低減をもたらし得る。この干渉を克服するために、競合薬物の標的への結合を低減し、治療用タンパク質がその標的に結合することを可能にし、正確なＮＡｂアッセイシグナルを回復させる緩和剤が、用いられ得る。

残留競合薬物からの干渉は、例えば、実施例５及び６で実証されるように、臨床使用のための治療用タンパク質を試験する際の、ＮＡｂの正確な評価における重大な課題である。新規の治療薬は、患者が、同じ標的と競合的に相互作用し得る第一選択の療法をすでに投与された後に試験され得る。これらの場合、競合薬物からの干渉は、特定及び緩和されなければならない。例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）又はＣＤ３の共有標的を有する多数の薬剤候補が、表１に列挙される。多くの競合薬物が存在し得る他の治療標的としては、例えば、セツキシマブなどの薬物若しくは薬物候補によって標的とされ得る上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ＣＤ２８；ダラツムマブなどの薬物若しくは薬物候補によって標的とされ得るＣＤ３８；リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）；セミプリマブ、ペムブロリズマブ、若しくはニボルマブなどの薬物若しくは薬物候補によって標的とされ得るプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）；プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）；アダリムマブなどの薬物若しくは薬物候補によって標的とされ得る腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；又はリツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、若しくはウブリツキシマブなどの薬物又は薬物候補によって標的とされ得るＣＤ２０が挙げられる。本明細書の開示は、これら及び他の薬物及び薬物候補からのＮＡｂアッセイ干渉を緩和するのに好適である方法を教示する。

（表１）共有標的を有する薬剤候補の例

別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を実施又は試験において使用することができるが、特定の方法及び材料をこれから説明する。

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが意図され、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味することが理解される。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「目的のタンパク質」という用語は、共有結合されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、概して「ポリペプチド」として当技術分野において既知の、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの天然に存在しない合成類似体、関連する天然に存在する構造バリアント、並びにそれらの天然に存在しない合成類似体からなるポリマーを指す。「合成のペプチド又はポリペプチド」は、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを指す。合成のペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成方法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能的な生体分子を形成するために、１つ又は複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。目的のタンパク質は、生物治療用タンパク質、研究又は治療で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体のうちのいずれかを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物治療用タンパク質及びそれらの産生を考察する最近のレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、それらの教示全体は、本明細書に組み込まれる）を参照されたい。タンパク質は、組成及び溶解性に基づいて分類され得、したがって、球状タンパク質及び線維状タンパク質などの単純タンパク質；ヌクレオタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質；並びに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質を含み得る。

いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、及びそれらの組み合わせであり得る。

本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞に導入されている組換え発現ベクター上で担持される遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されるタンパク質を指す。ある特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、抗体分子は、完全長抗体（例えば、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４免疫グロブリン）であるか、又は代替的に、抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片若しくはＦａｂ断片）であり得る。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（若しくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原を特異的に結合して複合体を形成する、天然発生型の、酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、ポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、完全な抗体分子から、抗体可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関連するタンパク質消化、又は組換え遺伝子工学技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、得ることができる。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／又は例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変及び／若しくは定常ドメインを好適な構成へと配置するか、又はコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失などするために、分子生物学技術を使用することによって配列決定及び化学的に操作され得る。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの完全なままの抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、線形抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的又は化学的に産生され得、かつ／又はそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的又は追加的に、抗体断片は、完全に又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代替的又は追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド連結によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。

「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することが可能である場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、概して、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性より少なくとも１～２、又は３、又は４桁低く、逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中で発現し得る。

典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、並びに免疫グロブリン軽鎖を有し、免疫グロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されたエピトープのうちの１つ以上と会合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、かつ重鎖のうちの一方若しくは両方が一方若しくは両方のエピトープと結合することを可能にする。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を保有するもの（ＩｇＧ様）と、Ｆｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分けることができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、オルト－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワン若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλ－ボディなどであるが、これらに限定されない異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体が挙げられる（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）（それらの教示全体は、本明細書に組み込まれる））。

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。そのような分子は通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの更なる特異性を有する抗体は、本明細書に開示される系及び方法の対象であり得る。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能な又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンに由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において既知の多種多様な技術を使用して調製され得る。

いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、哺乳動物細胞から産生され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源又は非ヒト起源のものであり得、初代上皮細胞（例えば、角化細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、及び網膜上皮細胞）、確立された細胞株及びそれらの株（例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞、又はそれらの誘導体）、任意の組織又は器官由来の線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃腺、扁桃腺、骨髄、及び血液を含むが、これらに限定されない）、脾臓、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１株（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、又はそれらの誘導体）を含み得る。

本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」という用語は、疾患又は障害の治療のために対象に投与され得る任意のタンパク質を指す。いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、がんの治療を対象とする。治療用タンパク質は、薬理学的効果を有する任意のタンパク質、例えば、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、又は酵素であってもよい。いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、治療用タンパク質は、セミプリマブなどのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）に対するモノクローナル抗体であり得る。他の実施形態では、治療用タンパク質は、二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、二重特異性ＣＤ３８×ＣＤ２８抗体、モノクローナル抗ＴＮＦ抗体、モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体、モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体、モノクローナル抗ＣＤ２０抗体、モノクローナル抗ＣＤ３８抗体、又はモノクローナル抗ＬＡＧ３抗体であり得る。

本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、薬理学的効果を達成するために治療用タンパク質と特異的に相互作用し得る任意の分子を指す。例えば、抗体の標的は、抗体が対象とする抗原であってもよく、リガンドの標的は、リガンドが選択的に結合する受容体であってもよく、その逆も同様であり、酵素の標的は、酵素が選択的に結合する基質であってもよい、などである。単一の治療用タンパク質は、２つ以上の標的を有してもよい。様々な標的は、特定の用途に従った本発明の方法での使用に好適である。標的は、例えば、細胞表面に存在し得るか、可溶性であり得るか、細胞質であり得るか、又は固体表面上に固定化され得る。標的は、組換えタンパク質であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、標的は、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＴＮＦ、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３であり得る。

本明細書で使用される場合、「抗薬物抗体」又は「ＡＤＡ」という用語は、治療用タンパク質上のエピトープを標的とする対象の免疫系によって産生される抗体を指す。ＡＤＡのサブセットは、「中和抗体」又は「ＮＡｂ」であり、これは、治療用タンパク質に、その薬理学的活性を阻害又は中和する様式で結合することができる。ＮＡｂは、治療用タンパク質の臨床的有効性に影響を及ぼし得、したがって、治療用タンパク質を対象に投与するときに監視されなければならない。

本明細書で使用される場合、「中和物質」という用語は、治療用タンパク質と、その薬理学的活性を阻害又は中和する様式で相互作用し得る分子を指す。中和物質は、例えば、アプタマーなどのオリゴヌクレオチド、又は抗体などのタンパク質であり得る。中和物質は、様々な供給源から、例えば、化学合成によって、組換え産生によって、又は対象の免疫系から生じ得る。簡潔にするために、対象の免疫系によって産生される中和抗体（ＮＡｂ）は、本明細書で考察される一次中和物質であるが、本発明の方法が任意の中和物質の検出に適用され得ることを理解されたい。

ＮＡｂは、様々なアッセイを使用して監視され得る。ＮＡｂアッセイは、細胞ベースのアッセイ又は非細胞ベースのアッセイに大別され得る。細胞ベースのアッセイ対非細胞ベースのアッセイの選択は、問題の治療用タンパク質、標的、及び適用に依存し、当業者は、それらのニーズに従ってアッセイを選択することができるであろう。

細胞ベースのアッセイは、少なくとも１つの細胞型を含む。治療用タンパク質は、細胞事象が影響を受けるように標的に結合し得、次いで、治療用タンパク質結合の出力として測定され得る。測定可能なシグナル又は活性をもたらす有用な細胞事象としては、例えば、受容体リン酸化、シグナル伝達経路における下流タンパク質のリン酸化、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞死、二次タンパク質の産生、又は任意の他の細胞活性が挙げられ得る。追加的又は代替的に、標的に結合する治療用タンパク質によって引き起こされる細胞事象に応答して発現するレポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はそれらの任意のバリアントなどの蛍光タンパク質が使用されてもよい。

標的に結合する治療用タンパク質によって生じるシグナルの測定、及びＮＡｂによるそのシグナルの阻害の測定は、「直接的な」細胞ベースのアッセイと呼ばれ得る。逆に、「間接的な」細胞ベースのアッセイでは、治療用タンパク質の標的への結合は、測定可能なシグナルを阻害し、そのシグナルの回復は、ＮＡｂを検出するために使用される。簡潔にするために、考察は、直接的な細胞ベースのアッセイに限定されるが、本明細書に記載される方法は、同様に、間接的な細胞ベースのアッセイに適用され得る。

治療用二重特異性抗体によって架橋されたときに測定可能な細胞事象を生じさせる２つの細胞型を含む、細胞ベースのＮＡｂアッセイが、本明細書に開示される。各細胞型は、二重特異性抗体の一方のアームによって認識される抗原である標的を、その細胞表面上に提示し得る。両方の標的の同時結合は、２つの細胞を架橋し、治療用タンパク質結合の指標として測定され得る下流の細胞事象を生じさせる。細胞ベースのＮＡｂアッセイに使用される細胞の例としては、ヒトＣＤ２０を発現するＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞、ＢＣＭＡを内因的に発現するＭＯＬＰ－８細胞、及びＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞が挙げられる。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞は、その細胞表面上にＣＤ３及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。二重特異性抗体、例えば二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体又は二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体がこの細胞を第２の細胞と架橋するときに、ＴＣＲは、ルシフェラーゼレポーターの発現をもたらすシグナル伝達経路を開始し、測定可能なシグナルを生じる。このシグナルは、実施例に更に記載されるように、アッセイにおけるＮＡｂの存在によって、又は競合薬物によって低減され得る。

多くの細胞型が、試験されている治療用タンパク質及び標的に従って、本発明の細胞ベースのアッセイで使用され得るが、ただし、細胞が、標的を発現するか、若しくは発現するように修飾され得ること、及び／又は測定可能なシグナル若しくは活性をもたらすことによって、治療用タンパク質及び標的の結合に応答することができることが条件であることを理解されたい。本発明の方法で使用され得る細胞の非限定的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞、ＨＥＫ２９３／ＭｆＢＣＭＡ細胞、ＨＥＫ２９３／ｈＢＣＭＡ細胞、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞、ＭＯＬＰ－８細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＣＤ３細胞、及びそれらの修飾型が挙げられる。

非細胞ベースのアッセイは、細胞の不在下でＮＡｂの存在を検出することができる。非細胞ベースのアッセイの１つのタイプは、競合リガンド結合（ＣＬＢ）アッセイと呼ばれる。ＣＬＢアッセイ、又は本明細書で言及されるように、リガンド結合アッセイは、治療用タンパク質の標的への結合を測定し、標的は、例えば、精製された組換えタンパク質、又は調製された細胞膜と会合した天然標的であり得る。標的は、マイクロプレート又はビーズなどの固体支持体上に固定化され、標識された治療用タンパク質の捕捉を可能にし得、その標識の検出は、結合を測定するために使用され得る。試料中のＮＡｂは、治療用タンパク質の標的への結合を遮断し、シグナルを低減する。代替的に、治療用タンパク質は、可溶性標的が標識されている間、固体表面に固定化されてもよく、同じ原理が別の方法で適用される。標識は、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、又は親和性精製によって検出可能であり得、かつ／又はシグナル若しくは活性をもたらし得る。

標的に結合する治療用タンパク質によって生じるシグナルの測定、及びＮＡｂによるそのシグナルの阻害の測定は、直接結合アッセイと呼ばれ得る。逆に、間接結合アッセイでは、治療用タンパク質の標的への結合は、測定可能なシグナルを阻害し、そのシグナルの回復は、ＮＡｂを検出するために使用される。簡潔にするために、考察は、直接的結合アッセイに限定されるが、本明細書に記載される方法は、同様に、間接結合アッセイに適用され得る。

アビジンコーティングされたマイクロプレート上に固定化され、ルテニル化治療用タンパク質、例えば、セミプリマブと共インキュベートされたビオチン化標的、例えば、ＰＤ－１を含む、リガンド結合ＮＡｂアッセイが、本明細書に開示される。固定化されたＰＤ－１への標識されたセミプリマブの結合は、この結合を測定するために使用され得るシグナルの検出を可能にする。実施例で更に考察されるように、アッセイにおけるＮＡｂ又は競合薬物の存在は、このシグナルを低減し得る。

第２のタイプの非細胞ベースのアッセイは、酵素活性ベースのアッセイと呼ばれる。酵素活性ベースのアッセイは、好適な基質を生成物に変換することによって、その作用機序に生物学的に関連する反応を触媒する酵素製剤の能力を測定する。酵素活性は、酵素のその基質への結合を直接測定することによって、又は生成される生成物の量を測定することによって測定され得る。アッセイにおけるＮＡｂ又は競合薬物の存在は、生成物の結合の低減又は産生の低減によって示され得る。したがって、本明細書に開示される方法はまた、酵素活性ベースのアッセイにおけるＮＡｂの正確な定量化にも適用可能である。

試料中のＮＡｂの存在を検出するために、ＮＡｂアッセイは、実験条件及び対照条件を含むべきである。実験条件は、ＮＡｂの存在について試験されている試料を含む。対照条件は、例えば、ＮＡｂを含まないことが既知である陰性対照条件であり得る。シグナル又は活性は、標的に結合する治療用タンパク質の尺度としてＮＡｂアッセイにおいてもたらされ、対照条件と比較した実験条件における当該シグナルの低減は、治療用タンパク質の中和の尺度であり、したがって、例えば図４Ｂに示されるように、実験条件におけるＮＡｂの存在である。

逆に、陽性対照条件は、ＮＡｂ又は別の中和物質を含むことが既知であり得、例えば、ＮＡｂアッセイを検証するために、又はそのシグナルを較正するために使用され得る。

実験条件と対照条件との間のシグナルの変化は、干渉物質からの干渉によっても引き起こされ得る。試料中のＮＡｂの存在が正確に検出され得るように、当該干渉を低減する方法が、本明細書に開示される。

本明細書で使用される場合、「干渉物質」という用語は、ＮＡｂの正確な測定に干渉し得る、ＮＡｂアッセイ又は試料マトリックス中に存在する任意の分子を指す。干渉は、ＮＡｂ、治療用タンパク質、治療用タンパク質標的、又はＮＡｂアッセイの任意の構成成分との会合によって引き起こされ得る。干渉物質の例としては、治療用タンパク質の可溶性標的、したがって同じＮＡｂによって標的とされる治療用タンパク質と同様の配列を有するタンパク質、又は治療用タンパク質の以前の投与からの残留薬物が挙げられ得る。

特定のクラスの干渉物質は、治療用タンパク質ではないが、治療用タンパク質標的などのＮＡｂアッセイの構成成分に競合的に結合することができる、試料マトリックス中に存在する「競合薬物」であり得る。競合薬物は、対象に以前に投与された残留薬物であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、競合薬物は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＴＮＦ、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３を含む治療標的に競合的に結合し得る。いくつかの例示的な実施形態では、競合薬物は、表１に列挙される薬物又は薬物候補のいずれかであり得る。いくつかの例示的な実施形態では、競合薬物は、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、又はアダリムマブであり得る。

本明細書で使用される場合、「緩和剤」という用語は、ＮＡｂアッセイにおける干渉を低減又は防止し、試料中のＮＡｂの正確な検出を可能にするために、干渉物質に結合し得る任意の分子を指す。干渉物質と特異的に相互作用し、ＮＡｂ、治療用タンパク質、標的、又はＮＡｂアッセイの他の構成成分とのその干渉を防止することができる任意の分子は、好適な緩和剤であり得る。緩和剤は、例えば、アプタマーなどのオリゴヌクレオチド、又は抗体などのタンパク質であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、緩和剤は、競合薬物に対する遮断抗体、例えば、抗リツキシマブ遮断抗体、抗ペムブロリズマブ遮断抗体、又は抗ニボルマブ遮断抗体であり得る。

本発明の方法を実施するためのキットも、本明細書に開示される。本発明のキットは、使用者が、競合薬物からの干渉を緩和することによって、試料中のＮＡｂの存在を正確に検出することを可能にする。本発明のキットは、例えば、治療用タンパク質、当該治療用タンパク質の標的、緩和剤、当該治療用タンパク質と当該標的との間の結合の尺度としてシグナル又は活性をもたらす手段、及びキットの使用説明書を含み得る。それらはまた、陽性対照として使用され得る中和物質を含み得る。それらは、陽性対照として使用され得る競合薬物を追加的に含み得る。

キットは、細胞ベース若しくは非細胞ベースのＮＡｂアッセイ、又はその両方を対象とし得る。細胞ベースのＮＡｂアッセイを対象とするキットは、標的の発現に、かつ当該標的に結合する治療用タンパク質の尺度としてシグナル又は活性をもたらすのに好適な細胞、例えば、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞、ＭＯＬＰ－８細胞、又は標的を発現することができ、かつ／又は測定可能なシグナル若しくは活性をもたらすことによって治療用タンパク質の標的への結合に応答することができる、任意の他の細胞を含み得る。細胞ベースのＮＡｂアッセイを対象とするキットにおける好適な標的は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３８、又はそれらの組み合わせであり得る。好適な治療用タンパク質は、例えば、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体、二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、又は二重特異性ＣＤ３８×ＣＤ２８抗体であり得る。

非細胞ベースのＮＡｂアッセイを対象とするキットは、例えば、アビジンでコーティングされることによって、標的及び／又は治療用タンパク質に結合することができる固体支持体、例えば、マイクロプレート又はビーズを含み得る。それらは、例えば、ビオチンにコンジュゲートされることによって、当該固体支持体に結合することができる標的及び／又は治療用タンパク質を追加的に含み得る。それらは、標識された標的及び／又は治療用タンパク質、例えば、ルテニウムで標識された標的及び／又は治療用タンパク質を更に含み得る。非細胞ベースのＮＡｂアッセイを対象とするキットにおける好適な標的は、例えば、ＰＤ－１、ＴＮＦ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、又はＬＡＧ３であり得る。好適な治療用タンパク質は、例えば、セミプリマブ、又は前述の標的のうちのいずれかに対するモノクローナル抗体であり得る。

本発明は、前述の治療用タンパク質、標的、中和物質、細胞ベースのアッセイ、細胞型、非細胞ベースのアッセイ、レポーター、標識、干渉物質、競合薬物、又は緩和剤のうちのいずれかに限定されず、任意の治療用タンパク質、標的、中和物質、細胞ベースのアッセイ、細胞型、非細胞ベースのアッセイ、レポーター、標識、干渉物質、競合薬物、又は緩和剤が、任意の好適な手段によって選択され得ることを理解されたい。

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料及び方法。本発明は、当業者によって実施される場合、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，３^ｒｄ ｅｄ．２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，５^ｔｈ ｅｄ．１９９５、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ（ｅｄｓ．）．“ＰＣＲ ２：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，１９９５、“Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”１９８８、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．）“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”，４^ｔｈ ｅｄ．２０００、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”ｖｏｌ．１４９（“Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ”ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００１、及びこれらの論文の後の版（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇｒｅｅｎ（４^ｔｈ Ｅｄ．２０１２）及び“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（７^ｔｈ Ｅｄ．，２０１５）、並びに最新の電子版に記載されるような、薬化学、免疫学、分子生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡ技術、及びアッセイ技術の分野の従来の技術を利用し得る。

本発明の方法及び本発明のキットの態様を実施するための試薬は、ビオチン化ＰＤ－１（標的）、抗リツキシマブ抗体であるα－Ｒｉｔｕｘ Ａｂ１、α－Ｒｉｔｕｘ Ａｂ２、及びα－Ｒｉｔｕｘ Ａｂ３、抗ペムブロリズマブ抗体、並びに抗ニボルマブ抗体（緩和剤）；抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、及びニボルマブ（競合薬物）；並びに二重特異性抗体ＣＤ２０×ＣＤ３、二重特異性抗体ＢＣＭＡ×ＣＤ３、及びセミプリマブ（治療用タンパク質）を含み、例えば、米国特許第９，６５７，１０２号及び同第１０，５５０，１９３号を参照されたい（それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。陰性対照抗体、例えば、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４は、いくつかの商業的供給源から入手可能である。

本発明の方法及び本発明のキットの態様を実施するのに好適な細胞としては、ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０、ＭＯＬＰ－８、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ、及びＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＭｆＣＤ３細胞が挙げられ、それらは全て、いくつかの商業的供給源から入手可能である。

ルシフェラーゼアッセイは、製造業者からのガイドラインに従って実施され、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを参照されたい。

実施例１．治療用タンパク質に対する中和抗体（ＮＡｂ）を検出するための細胞ベースのアッセイ設計
この実施例は、治療用タンパク質候補を評価するための、本発明の細胞ベースの中和抗体（ＮＡｂ）アッセイの実験設計を示す。簡潔に述べると、細胞表面ヒト抗原ＣＤ２０を発現するように操作されたヒト不死化Ｂ細胞を調製した（ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０と表す）。これらの細胞は、ＣＤ２０を発現するヒトがん細胞を模倣する、アッセイの「標的細胞」を表す。加えて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び細胞表面抗原ＣＤ３を発現するヒト不死化Ｔ細胞を調製し、ＴＣＲ／ＣＤ３誘導性プロモーター（活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ））の制御下で、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を発現するように操作した。図１Ａに示されるように、これらのＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞は、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体などの薬物抗体と架橋されたときに、細胞媒介性細胞傷害性応答を介してＣＤ２０発現がん細胞に結合し、それを潜在的に排除することができる患者の免疫細胞を模倣する、アッセイの「レポーター細胞」を表す。

図１Ｂに示されるように、レポーター細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクラスター化を媒介する、ＣＤ２０及びＣＤ３に結合する抗体（二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体）の添加は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現をもたらし、堅牢な用量依存的ルシフェラーゼシグナルをもたらす。ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体の添加は、図１Ｂの白抜きの四角形によって示されるように、ルシフェラーゼ活性をもたらさなかった。

上述のようにレポーター細胞としてＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を使用し、標的細胞としてＭＯＬＰ－８細胞と組み合わせて、別の細胞ベースのＮＡｂアッセイを設計した。ＭＯＬＰ－８は、細胞表面タンパク質Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を内在的に発現する多発性骨髄腫細胞株である。図１Ｃに示されるように、二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体は、レポーター細胞と標的細胞とを架橋し、レポーター細胞上のＴＣＲのクラスター化を媒介し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子及び用量依存的ルシフェラーゼシグナルの発現をもたらすことができる。２つのＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体を試験し、点線は、後続のアッセイで使用される濃度を示す。

これらの結果は、本発明の細胞ベースのアッセイが、堅牢な用量応答曲線を提供し、陽性対照及び陰性対照に予測通りに応答することを示す。

実施例２．細胞ベースのＮＡｂアッセイを使用した、治療用タンパク質に対するＮＡｂの検出
この実施例は、本発明のＮＡｂアッセイの実験設計の更なる概念実証を示す。細胞ベースのＮＡｂアッセイにおいて、治療用タンパク質に対するＮＡｂは、治療用タンパク質のその標的細胞及び／又はレポーター細胞への結合を阻害し、それによってレポーターシグナルを排除する。ＮＡｂアッセイにおけるレポーターシグナル又は活性の低減は、試料中のＮＡｂの存在の尺度である。

例えば、図２Ａは、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体に対するＮＡｂの作用を示し、二重特異性抗体の抗ＣＤ２０アーム又は抗ＣＤ３アームに対するＮＡｂの結合は、それぞれＣＤ２０又はＣＤ３への結合を妨げ、ルシフェラーゼ活性を排除する。この細胞ベースのＮＡｂアッセイを更に検証するために、代理ＮＡｂをＮＡｂアッセイに添加し、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体の抗ＣＤ２０アーム又は抗ＣＤ３アームのいずれかを標的とした。図２Ｂに示されるように、ＮＡｂの添加は、用量依存的にルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。

この細胞ベースのＮＡｂアッセイの有効性を、２つの二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体との使用について更に検証した。代理ＮＡｂをＮＡｂアッセイに添加し、２つの二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体の抗ＢＣＭＡアーム又は抗ＣＤ３アームのいずれかを標的とした。図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｆ、及び図２Ｇに示されるように、ＮＡｂの添加は、用量依存的にルシフェラーゼ活性の減少を引き起こした。図２Ｅ及び図２Ｈに示されるように、アイソタイプ対照の添加は、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。

これらの結果は、本発明のアッセイが、用量依存的に治療用タンパク質に対する中和抗体の存在を確実に測定することを示す。

実施例３．競合薬物による、細胞ベースのＮＡｂアッセイの干渉
ＮＡｂアッセイは、マトリックス構成成分からの干渉に起因して、偽陽性又は偽陰性の結果を起こしやすい可能性がある。干渉の１つの潜在的な原因は、試験されている治療用タンパク質の標的に競合的に結合する第２の薬物である。このタイプの干渉の概念の証明として、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体のＮＡｂアッセイを、図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＣＤ２０又はＣＤ３のいずれかに対する競合抗体を添加して行った。競合薬物の添加は、ルシフェラーゼ活性の用量依存的な低減を引き起こし、代理ＮＡｂによって引き起こされるルシフェラーゼ活性の低減を模倣し、したがって、偽陽性の結果を生じさせた。

競合薬物からの干渉は、２つの二重特異性ＢＣＭＡ×ＣＤ３薬物抗体についてのＮＡｂアッセイにおいても見られた。図３Ｃ及び図３Ｅに示されるように、ＢＣＭＡ又はＣＤ３に対する二価親抗体の添加は、両方のアッセイにおいてルシフェラーゼシグナルの減少をもたらした。図３Ｄ及び図３Ｆに示されるように、ＢＣＭＡに対する様々な臨床候補抗体の添加もまた、両方のアッセイにおいてルシフェラーゼシグナルの減少を引き起こした。

これらの結果は、競合する第２の薬物の存在が、細胞ベースのＮＡｂアッセイにおいて偽陽性結果をもたらす可能性があるという概念実証を示す。

実施例４．細胞ベースのＮＡｂアッセイへのヒト血清の添加
上で考察されたように、ＮＡｂアッセイは、マトリックス構成成分からの干渉を受けやすい可能性がある。潜在的な干渉に対する本発明のＮＡｂアッセイの回復力を試験するために、図４Ａに示されるように、薬物ナイーブヒト血清を添加して、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体のＮＡｂアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性は、ヒト血清の添加による影響を受けず、ヒト血清構成成分からの干渉に対する本発明のＮＡｂアッセイの回復力、したがって臨床応用への適合性を実証した。

図４Ｂは、「ＮＡｂアッセイシグナル」の単純な表現を示す。試料中のＮＡｂの相対的な存在は、薬物対照で誘導されるルシフェラーゼ活性を、実験試料中で誘導されるルシフェラーゼ活性で割ることによって、定量化される。ルシフェラーゼ活性は、ＮＡｂの存在下で用量依存的に低減され、より高いＮＡｂアッセイシグナルをもたらす。

実施例５．臨床試料中での、細胞ベースのＮＡｂアッセイの干渉
図５に示されるように、本発明のＮＡｂアッセイを使用して、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体に対するＮＡｂの存在について、臨床試験からの６０個の薬物ナイーブヒト試料を試験した。試験した患者は、薬物抗体に曝露されていなかったが、多くの試料は、ＮＡｂについて偽陽性の結果を示した。

実施例３で考察されたように、ＮＡｂアッセイにおける偽陽性シグナルの考えられる原因の１つは、競合する第２の薬物である。この臨床試験の多くの患者は、抗ＣＤ２０療法の既往歴があった。競合する抗ＣＤ２０薬物がＮＡｂアッセイの偽陽性の結果に関与し得るかどうかを評価するために、１７個のヒト試料のサブセットを、市販のＥＬＩＳＡを使用して、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブの存在について試験した。図６に示されるように、リツキシマブの存在は、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルと相関した。

これらの結果は、残留競合薬物からの干渉が、臨床応用においてＮＡｂアッセイにおける偽陽性の結果をもたらし得、治療用タンパク質に対するＮＡｂを正確に検出するために対処されなければならないことを実証する。

実施例６．競合薬物による、細胞ベースのＮＡｂアッセイ干渉の緩和
上述のように、競合薬物の存在は、ＮＡｂアッセイにおける治療用タンパク質のその標的への結合に干渉し、レポーター活性の低減及び偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルをもたらし得る。これは、治療用タンパク質としての二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体、及び競合薬物としての抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブの例を使用した、図７Ａに示される。競合薬物の存在下で治療用タンパク質に対するＮＡｂを正確に検出するためには、共通標的への競合薬物の結合が緩和されなければならない。これは、競合薬物からの干渉を防止し、治療用タンパク質に対するＮＡｂの正確な検出を可能にする緩和剤としての抗リツキシマブ抗体の例を使用した、図７Ｂに示される。

リツキシマブに対する遮断抗体を、本発明のＮＡｂアッセイにおける干渉を緩和する能力について試験した。図７Ｃに示されるように、抗リツキシマブ抗体を、リツキシマブでスパイクした血清中で共インキュベートし、ＮＡｂアッセイに添加した。抗リツキシマブ抗体の添加は、ルシフェラーゼ活性を回復させ、リツキシマブによって引き起こされる偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除した。

これらの結果は、競合薬物に対する緩和剤の使用が、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除し、治療用タンパク質に対するＮＡｂの正確な検出を可能にすることができることを実証する。

実施例７．臨床試料中の競合薬物による、細胞ベースのＮＡｂアッセイ干渉の緩和
実施例５に示されるように、臨床試験からの多くの薬物ナイーブヒト試料は、二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３薬物抗体に対するＮＡｂについて試験されたときに、競合薬物である抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの存在に起因する可能性がある、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルをもたらした。図８に示されるように、リツキシマブからの干渉を緩和するために、抗リツキシマブ遮断抗体を添加した臨床試料を使用して、ＮＡｂアッセイを行った。試料番号１は、低いＮＡｂアッセイシグナルを有する対照試料である。試料番号２及び番号３は、高い偽ＮＡｂアッセイシグナルを示した。抗リツキシマブ抗体の添加は、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除した。

これらの結果は、臨床試料中の残留競合薬物、この場合はリツキシマブが、ＮＡｂアッセイに干渉し、ＮＡｂアッセイの結果を不正確にする可能性があることを確認する。それらは、競合薬物に対する緩和剤が、臨床応用における偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除することができることを更に実証する。競合薬物に対する緩和剤の使用は、試験されている治療用タンパク質に対するＮＡｂの正確な検出を可能にする。

実施例８．治療用タンパク質に対するＮＡｂを検出するためのリガンド結合アッセイ設計
この実施例は、治療用タンパク質候補を評価するための、本発明のリガンド結合ＮＡｂアッセイの実験設計を示す。本発明の例示的な実施形態は、標的捕捉リガンド結合ＮＡｂアッセイを含む。簡潔に述べると、試料を、ビオチン化標的とともにインキュベートし、アビジンコーティングされたマイクロプレートに移す。ルテニル化薬物を、後続の工程でマイクロプレートに添加する。図９Ａに示されるように、ＮＡｂの不在下では、ルテニウム標識薬物は、固定化されたビオチン標的に結合し、アッセイにおいてシグナルを生じる。図９Ｂに示されるように、ＮＡｂの存在下では、ルテニウム標識薬物は、ビオチン標的に結合することができず、アッセイシグナルの阻害をもたらす。

追加のリガンド結合ＮＡｂアッセイは、治療用タンパク質に対するＮＡｂの評価に好適であり得る。例えば、標的捕捉設計の代わりに、リガンド結合アッセイを薬物捕捉のために設計してもよく、目的の治療用タンパク質を固定化し、標的をアッセイシグナルの発生のために標識する。図９Ｃは、アビジンコーティングされたマイクロプレート上にビオチン化薬物が固定化され、ルテニル化標的がアッセイシグナルを生じ、固定化された薬物に対するＮＡｂが標的への結合を遮断し、それによってアッセイシグナルを阻害する、リガンド結合アッセイ設計を示す。

実施例９．競合薬物による、リガンド結合ＮＡｂアッセイの干渉
上述の細胞ベースのＮＡｂアッセイと同様に、リガンド結合ＮＡｂアッセイは、マトリックス構成成分からの干渉に起因して、偽陽性又は偽陰性の結果を起こしやすい可能性がある。図１０Ａに示されるように、干渉の潜在的な原因の１つは、試験されている治療用タンパク質の標的に競合的に結合する第２の薬物である。例えば、薬物抗体セミプリマブ、ペムブロリズマブ、及びニボルマブは、同じ薬物標的ＰＤ－１を共有する。臨床試料を、セミプリマブに対するＮＡｂについて試験する場合、ルテニル化セミプリマブのビオチン化ＰＤ－１への結合を使用してシグナルを生じさせると、臨床試料中の任意の残留ペムブロリズマブ、ニボルマブ、又は非標識セミプリマブは、標的に競合的に結合し、アッセイシグナルを阻害し、ＮＡｂの存在について偽陽性の結果を引き起こす。

概念実証として、図１０Ｂに示されるように、増加する濃度のセミプリマブ、ペムブロリズマブ、又はニボルマブを、セミプリマブに対するＮＡｂの標的捕捉ＮＡｂアッセイに添加した。１２５ｎｇ／ｍＬを超えるセミプリマブ、ペムブロリズマブ、又はニボルマブの濃度は、ルテニル化セミプリマブからのシグナルを阻害し、偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを生じた。

これらの結果は、競合薬物の存在が、偽陽性リガンド結合ＮＡｂアッセイシグナルをもたらす可能性があり、治療用タンパク質に対するＮＡｂを正確に検出するために対処されなければならないことを実証する。

実施例１０．競合薬物によるリガンド結合ＮＡｂアッセイ干渉の緩和
上述のように、競合薬物の存在は、リガンド結合ＮＡｂアッセイにおける治療用タンパク質のその標的への結合に干渉し、シグナルの低減及び偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルをもたらし得る。競合薬物の存在下で治療用タンパク質に対するＮＡｂを正確に検出するためには、共通標的への競合薬物の結合が緩和されなければならない。これは、競合薬物からの干渉を防止し、治療用タンパク質に対するＮＡｂの正確な検出を可能にする緩和剤としての、抗ペムブロリズマブ又は抗ニボルマブ抗体の例を使用した、図１１Ａに示される。

ペムブロリズマブ及びニボルマブに対する遮断抗体を、本発明のＮＡｂアッセイにおける干渉を緩和する能力について試験した。図１１Ｂに示されるように、抗ペムブロリズマブ又は抗ニボルマブ抗体を、それぞれペムブロリズマブ又はニボルマブでスパイクした試料中で共インキュベートし、リガンド結合ＮＡｂアッセイに添加した。競合薬物に対する緩和剤の添加は、標的への競合的結合によって引き起こされる偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除した。

これらの結果は、競合薬物に対する緩和剤の使用が、リガンド結合アッセイにおける偽陽性ＮＡｂアッセイシグナルを排除し、治療用タンパク質に対するＮＡｂの正確な検出を可能にすることができることを実証する。

Claims (39)

1. 試料中の治療用タンパク質に対する中和物質を検出するための方法であって、
   （ａ）前記中和物質及び競合薬物を有する前記試料を、前記治療用タンパク質、前記治療用タンパク質の標的、及び緩和剤に接触させることと、
   （ｂ）前記治療用タンパク質の前記標的への結合を測定することと、
   （ｃ）前記中和物質を検出するために、（ｂ）の結果を対照測定値と比較することと
   を含む、方法。
2. 前記対照測定値が、
   中和物質の不在下で、前記治療用タンパク質の前記標的への結合を測定すること
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記中和物質が、中和抗体である、請求項１に記載の方法。
4. 前記治療用タンパク質が、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、及び酵素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記治療用タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
6. 前記モノクローナル抗体が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３８抗体、及び抗ＬＡＧ３抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記治療用タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
8. 前記二重特異性抗体が、ＣＤ２０×ＣＤ３抗体、ＢＣＭＡ×ＣＤ３抗体、ＥＧＦＲ×ＣＤ２８抗体、及びＣＤ３８×ＣＤ２８抗体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記治療用タンパク質が、固体支持体に固定化される、請求項１に記載の方法。
10. 前記治療用タンパク質が、検出のために標識される、請求項１に記載の方法。
11. 前記標識が、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、又は親和性精製によって検出可能である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記標識が、ルテニウムを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記標的が、抗原、受容体、リガンド、又は酵素基質である、請求項１に記載の方法。
14. 前記標的が、細胞表面タンパク質である、請求項１に記載の方法。
15. 前記標的が、組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
16. 前記標的が、細胞によって発現される、請求項１に記載の方法。
17. 前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＯＬＰ－８細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、又はそれらの修飾型である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記標的が、固体支持体に固定化される、請求項１に記載の方法。
19. 前記標的が、検出のために標識される、請求項１に記載の方法。
20. 前記標識が、蛍光、化学発光、電気化学発光、放射能、又は親和性精製によって検出可能である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記標的が、酵素基質である、請求項１に記載の方法。
22. 前記標的が、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＴＮＦ、ＰＤ－Ｌ１、又はＬＡＧ３である、請求項１に記載の方法。
23. 第２の標的を追加的に含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記競合薬物が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
25. 前記競合薬物が、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、又はアダリムマブである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記競合薬物が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
27. 前記緩和剤が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
28. ２種、３種、４種、又はそれ以上の緩和剤を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
29. 前記治療用タンパク質の前記標的への結合が、受容体リン酸化、シグナル伝達経路における下流タンパク質のリン酸化、サイトカイン放出、細胞増殖、細胞死、又は二次タンパク質の産生を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
30. 前記治療用タンパク質の前記標的への結合が、レポーター遺伝子の発現によって測定される、請求項１に記載の方法。
31. 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記試料を前記治療用タンパク質又は前記標的に接触させる前に、前記試料を前記緩和剤に接触させる前処理工程
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
33. （ａ）治療用タンパク質と、
    （ｂ）前記治療用タンパク質の標的と、
    （ｃ）前記治療用タンパク質に対する中和物質と、
    （ｄ）競合薬物と、
    （ｅ）緩和剤と
    を含む、キット。
34. 前記標的を発現する細胞
    を更に含む、請求項３３に記載のキット。
35. 前記治療用タンパク質の前記標的への前記結合に応答して、測定可能な活性又はシグナルを生じる細胞
    を更に含む、請求項３４に記載のキット。
36. 前記活性が、ルシフェラーゼの発現である、請求項３５に記載のキット。
37. 前記標的が、固体支持体に固定化されている、請求項３３に記載のキット。
38. 前記治療用タンパク質に付着した標識を更に含む、請求項３３に記載のキット。
39. 前記標識が、ルテニウムを含む、請求項３８に記載のキット。

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