JP2023521646A - アルツハイマー病の治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アルツハイマー病または他の神経疾患を有する患者、またはそれを発症するリスクがある患者における、アルツハイマー病または他の神経疾患の治療またはその発症の遅延方法であって、有効量の抗血管形成薬を対象に投与することを含む方法を提供する。特に、本発明は、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによるアルツハイマー病または他の神経疾患の治療および／またはその発症の遅延方法であって、有効量のアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬を対象に投与することを含む方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、治療、特にアルツハイマー病に関する治療の分野に関する。

［背景］
高齢者の進行性神経変性疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶力および他の知的能力の低下を引き起こして認知症をもたらす。この疾患の正確な原因は、依然として不明であり、発病の機序が盛んに議論されている。アミロイドβ（Ａβ）ペプチドが、脳血管機能障害および脳血流（ＣＢＦ）の低下とともに、この病気の中核をなす。脳血管機能障害とＡＤとの強い関連性が示された。この関連性は、様々なＡＤ神経病理に先立つ血液－脳関門（ＢＢＢ）の完全性の低下が明白になったことから証明された。また、ＢＢＢ機能障害は、ＣＢＦに影響を及ぼし、それが血管の成長に影響を及ぼす可能性がある。ＡＤ ＢＢＢ漏出は、血管の劣化に起因する可能性が高いというのが現在の定説である。ＡＤ脳の炎症的変化は、血管内皮増殖因子、並びに、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメイン２を持つチロシンキナーゼ受容体（Ｔｉｅ－２）のようなメディエータの上方制御をもたらし、病的血管形成を引き起こす。病的血管形成およびＢＢＢの破壊は、ＣＢＦの低下に対する代償性反応として生じることが研究により示唆されている。Ａβに誘発される神経炎症反応は、活性酸素種の生成およびさらなる内皮損傷を助長する。Ａβは、血管形成機構を介した血管密集および血管リモデリングのモジュレーターになることが示されている。ＡＤマウスモデルの脳血管完全性についての研究により、密着結合の破壊の発生率の有意な増加が示された。この破壊は、血管新生および全体的な微小血管密度の上昇に直接的に関連づけられた。これは、アミロイド形成に誘発される血管形成がＢＢＢ破壊の根源であることを強固に裏づけるものである。

この背景情報は、出願人が、本発明に関連するであろうと考える公知の情報を与えることを目的として提示されるものである。前述の情報は、本発明に対する先行技術であると認めることを必ずしも意図するものでなく、そのように捉えられるべきものでもない。

［発明の概要］
本発明の目的は、アルツハイマー病の治療方法を提供することである。

本発明の一態様によれば、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによるアルツハイマー病の治療および／またはその発症の遅延方法であって、有効量のアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬を対象に投与することを含む方法が提供される。

本発明の一態様によれば、脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法であって、有効量のアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬を対象に投与することを含み、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによって脳血管新生が阻害される、方法が提供される。

本発明の一態様によれば、アルツハイマー病を発症するリスクがある対象、または初期段階のアルツハイマー病もしくは他の神経疾患を有する対象を特定するための診断方法であって、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路からのバイオマーカーをスクリーニングすることを含む方法が提供される。

本発明の一態様によれば、アキシチニブ、スニチニブおよびＤＣ１０１からなる群から選択されるＶＥＧＦＲの阻害薬によって脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法が提供される。

特定の実施形態において、対象は、ヒトまたは動物であってもよい。場合により、動物は、ネコまたはイヌなどのペットである。

本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明でより明らかになる。

ＡＤマウスモデルＴｇ２５７６における血管形成促進エフェクター発現の増加。図１－１のａ，ｂ）倍率変化で示される、１１月齢の未処理Ｔｇ２５７６マウスの齢適合未処理ＷＴ同腹仔と対比した様々なキナーゼのリン酸化レベルおよび血管形成に関与するタンパク質の発現レベル。データは、３つの個別の実験によるＷＴと比較したＴｇ２５７６の平均倍率変化±Ｓ．Ｅ．Ｍを表す。 ＡＤマウスモデルＴｇ２５７６における血管形成促進エフェクター発現の増加。図１－２のｃ）血管形成の調節に関与するいくつかのエフェクター分子についての免疫ブロット。 Ａβ１－１６ペプチド（可溶性アミロイド種）により処理されたヒト脳内皮細胞における、主要血管形成受容体のＴｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２の上方制御、ならびにＡｎｇ－２および血管新生マーカーＣＤ１０５の発現増加。図２－１のａ）インビトロ処理によるヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ）溶解物における対象タンパク質のウエスタンブロッティング分析を示す。ヒストグラムは、標的タンパク質の発現レベルの定量的表現である。 Ａβ１－１６ペプチド（可溶性アミロイド種）により処理されたヒト脳内皮細胞における、主要血管形成受容体のＴｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２の上方制御、ならびにＡｎｇ－２および血管新生マーカーＣＤ１０５の発現増加。図２－２のｂ）Ａβ１－４２およびＡβ１－１６ならびにＡｎｇ－２による処理後のＨＢＥＣ－５ｉ細胞の溶解物におけるＴｉｅ－２およびリン酸化Ｔｉｅ－２のウエスタンブロッティング分析。 ＡＤ患者の脳は、血管分布の増加および不連続な密着結合とともに、Ｔｉｅ－２のＡｎｇ－２およびＣＤ－１０５との共局在化を示す。図３のａ）正常およびＡＤ脳のヒト小脳の免疫染色；Ｔｉｅ－２（レッド）、Ａｎｇ－２（ブルー）およびＣＤ－１０５（グリーン）。黄色矢印は、ＡＤ脳のパネルにおけるＴｉｅ－２、Ａｎｇ－２およびＣＤ－１０５の共局在化を示す。白丸は、正常脳においてＣＤ１０５とＴｉｅ－２との共局在化がないことを示す。図３のｂ，ｃ）顕微鏡写真は、ＣＤ－３１（グリーン）、Ａβ（レッド）およびオクルディン（ブルー）で染色された正常およびＡＤ脳のヒト小脳を示す。正常脳（ｂ）は、丸で示すように、無傷血管におけるオクルディンの連続発現を示すのに対して、ＡＤ脳（ｃ）は、黄色矢印で示すように、無傷血管におけるオクルディンの不連続発現を示す。 アミロイドは、血管形成開始受容体Ｔｉｅ－２との物理的相互作用を示す。図４－１のａ）ウエスタンブロット分析を実施してＡｎｇ－１の発現レベルを調べた。図４－１のｂ）Ｔｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２の相互プルダウン。１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよび齢適合媒体処理ＷＴマウスの脳ホモジネートにおける、Ａβと血管形成受容体Ｔｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２との共免疫沈降。 アミロイドは、血管形成開始受容体Ｔｉｅ－２との物理的相互作用を示す。図４－２のｃ）近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）：可溶性Ａβで処理されたＨＢＥＣ－５ｉ細胞における、ＡβとＡｎｇ－２との相互作用（左パネル）と、ＡβとＴｉｅ－２との相互作用（右パネル）。顕微鏡写真で赤色に見える蛍光は、タンパク質の２つのセットの相互作用を示し、ブルーは、ＤＡＰＩによる核対比染色である。 抗血管形成薬のアキシチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスの認知障害が抑制される。異なる記憶の側面の分析のための試験により、処理前の１０月齢マウスおよび処理後の１１月齢マウスの認知状態を評価した。データは、３つの異なる試行からプールされたものであり、平均±標準偏差で表される。ボンフェローニ試験による多重比較の補正を伴う２元ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図５－１のａ）オープンフィールド試験。ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）は、フィールドの中央で過ごす時間がより短く、アキシチニブで処理しても処理前と有意差が見られなかった。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスまたはＷＴマウスと比較して中央を探索する時間が有意に長かった。処理前ＷＴとＴｇ２５７６との間に有意差が見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも有意差が見られた。ＷＴマウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意差は認められなかった。図５－１のｂ）オープンフィールド試験による代表的な軌跡プロット。認知力のあるＷＴおよびアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、認知障害のある処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、試験アリーナのオープン中央を探索する時間が短く、縁を探検する時間が長い。各ボックスは、異なるマウスの軌跡を示す。図５－１のｃ）自発的交替（Ｙ－迷路）試験。処理前ＷＴマウスでは高い交替率が認められ、媒体処理とアキシチニブ処理とに有意差は観察されなかった。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、試験での能力が劣っており、それぞれ処理前および媒体処理ＷＴマウスと比較して交替率が有意に低かった。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、有意に高い交替率を示した。ＷＴマウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間に有意差は観察されなかった。図５－１のｄ）文脈的恐怖条件づけ試験。処理前、媒体処理およびアキシチニブ処理ＷＴマウスは、高い凍結率を示すことにより良好な連想記憶を発揮した。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、それぞれ処理前および媒体処理ＷＴマウスと比較して有意に低い凍結率を示した。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６動物の能力はＷＴマウスと類似していた。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に高い能力を示した。 抗血管形成薬のアキシチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスの認知障害が抑制される。異なる記憶の側面の分析のための試験により、処理前の１０月齢マウスおよび処理後の１１月齢マウスの認知状態を評価した。データは、３つの異なる試行からプールされたものであり、平均±標準偏差で表される。ボンフェローニ試験による多重比較の補正を伴う２元ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図５－２のｅ，ｆ）ラジアルアーム水迷路。ラジアルアーム水迷路。（ｅ）マウスが避難台を突き止める時間、すなわち、潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）、および（ｆ）マウスが避難台を突き止める際に犯したエラー（作業および参照記憶エラー）の数。試験１日目と試験５日目とを比較すると、処理前、媒体処理およびアキシチニブ処理ＷＴマウスは、潜時および犯したエラーの数の有意な減少を示した。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでも試行の過程で類似の改善が認められた。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、試験１日目と試験５日目との間で有意差が見られなかった。 Ｔｇ２５７６マウスを抗血管形成薬のアキシチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ、血管形成マーカーであるＣＤ１０５、ならびに密着結合タンパク質のＺＯ１およびオクルディンの発現が抑制される。かん流マウス由来の脳を分子分析に使用した。ホモジネートをウエスタンブロッティング分析に使用した。データは、個別の動物についての平均を示し、エラーバーは、３つの個別の実験の標準偏差を表し、処理群当たりＷＴについてｎ＝６とし、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６とする（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６のａ）媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳では、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６またはＷＴ動物の脳よりも、血管形成マーカーのＣＤ１０５の発現が有意に大きかった。図６のｂ）媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＷＴマウスまたはアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、密着結合タンパク質のＺＯ１の発現が有意に小さかった。図６のｃ）Ｔｇ２５７６マウスの脳におけるアミロイドの存在は、ＷＴの脳で認められたものと類似したレベルであったアキシチニブ処理動物よりも、媒体処理動物の方がはるかに大きかった。異なる群のマウスについての代表的なブロットが示されている。 免疫蛍光分析により、アキシチニブ処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、アミロイド負荷、血管形成脳血管分布を抑制し、密着結合タンパク質発現を増大させることが示される。ここでの顕微鏡写真は、格子で表される画像化切片の視野のボクセルを示す。データは、３つの異なる試行からプールされ、平均±標準偏差で表されたものである。処理群当たりＷＴについてｎ＝６であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６とする独立スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図７－１のａ）異なる群のマウスの脳切片をマーカーＣＤ１０５、ＡβおよびＣＤ３１の組合せについて染色した。顕微鏡写真パネルは、異なる処理群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表す。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳では、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６またはＷＴマウスと比較して、強いアミロイドＡβ染色およびより多くのＡβ斑が認められた。群間での成熟血管マーカー（ＣＤ３１）の全体的な発現には差がなかったが、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６またはＷＴマウスと比較して、新生血管マーカー（ＣＤ１０５）の発現がはるかに大きかった。白色格子は、三次元体積の視野を表す。ＣＤ１０５（グリーン）、Ａβ（レッド）およびＣＤ３１（ブルー）の共局在化が明るい紫色で示されている。 免疫蛍光分析により、アキシチニブ処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、アミロイド負荷、血管形成脳血管分布を抑制し、密着結合タンパク質発現を増大させることが示される。ここでの顕微鏡写真は、格子で表される画像化切片の視野のボクセルを示す。データは、３つの異なる試行からプールされ、平均±標準偏差で表されたものである。処理群当たりＷＴについてｎ＝６であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６とする独立スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図７－２のｂ）異なる群のマウスの脳切片をマーカーＣＤ１０５、ＣＤ３１および密着結合タンパク質のオクルディンの組合せについて染色した。顕微鏡写真パネルは、異なる処理群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表す。白色矢印は、正常な連続したオクルディンの発現を示す。媒体処理Ｔｇ２５７６では、ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）またはアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、オクルディン発現が有意に小さいことが認められた。顕微鏡写真は、二次元で示されている。 アキシチニブは、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、密着結合構造の減少を抑制し、ＢＢＢの機能性を維持する。図８－１のａ）かん流マウス由来の脳をＢＢＢの免疫蛍光分析に使用した。脳切片をマーカーＣＤ１０５、ＣＤ３１および密着結合タンパク質であるオクルディンの組合せについて染色した。ＷＴについてｎ＝５であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６とする。データは、３つの個別の実験を表す（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。最初のパネルは、ＣＤ３１（レッド）、ＣＤ１０５（グリーン）およびオクルディン（ブルー）染色の統合顕微鏡写真を示す。他の２つのパネルはＣＤ１０５およびオクルディンであり、これらは、ＷＴマウスにおいて観察される正常なオクルディン発現の構造（白色矢印で示す）および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスにおいて認められる異常なオクルディン発現のより詳細な図を得るために、重ね合わされたグリッドで示されるように視野を拡大したものである。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスまたはＷＴマウスと比較して、密着結合タンパク質（ＴＪＰ）の破壊の割合が有意に高かった。この図は、図３のｂの顕微鏡写真の拡大視野を示すことに留意されたい。図３のｂのオクルディンタンパク質の発現レベルに対する密着結合の完全性を評価している。図８－１のｂ）６２０ｎｍにおける色素の吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ１９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で読み取った。読取値を脳の重量で除した。この実験を２回繰り返した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスのＣＮＳにおけるエバンスブルーの取込みの増加は、ホモジネートに存在する色素の吸光度が高いことによって示唆された。これにより、媒体処理Ｔｇ２５７６動物では、ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）マウスと比較してＢＢＢの透過性または漏出が増加したことが暗示された。媒体処理Ｂ６／ＳＪＬマウスと薬物処理Ｂ６／ＳＪＬマウスとの間には差が認められなかった。Ｔｇ２５７６マウスをアキシチニブ処理すると、媒体処理動物よりも弱いエバンスブルー染色が見られたことにより、機能的なＢＢＢが示唆された。 アキシチニブは、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、密着結合構造の減少を抑制し、ＢＢＢの機能性を維持する。図８－２のｃ）ＷＴマウスからの摘出脳は、着色していなかったが、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、脳が全体的に青く着色していた。図８－２のｄ）ここでの顕微鏡写真は、グリッドで表された画像化切片の視野のボクセルを示す。顕微鏡写真は、Ｔｇ２５７６およびＷＴの両方をアキシチニブまたは媒体で処理し、ＣＮＳにおけるアルブミンについて染色した個別の実験によるマウスの脳切片を表す。レッドは、脳内に漏出した免疫染色アルブミンを示し、シアンは、細胞核を示す（ＤＡＰＩ）。媒体処理Ｔｇ２５７６ではアルブミン染色がより強いのに対して、アキシチニブ処理では、脳内へのアルブミン漏出がより小さく、より機能的なＢＢＢを示唆するものである。 アキシチニブは、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、密着結合構造の減少を抑制し、ＢＢＢの機能性を維持する。 血管形成は、アミロイドベータと正に相関し、密着結合タンパク質と負に相関する。顕微鏡写真は、図９のａ）ＣＤ１０５（グリーン）、Ａβ（レッド）およびＣＤ３１（ブルー）、ならびに、図９のｂ）ＣＤ１０５（グリーン）、オクルディン（ブルー）およびＣＤ３１（レッド）の、海馬および皮質の共局在化を表している。最初の列は、抗体染色の組合せで染色された脳を示す顕微鏡写真を表す。白色のオーバレイは、拡大され、ＣＤ１０５およびＡβ、またはＣＤ１０５およびオクルディンのいずれかとラベルされた、次の２つの列に示された視野における領域を示す。全蛍光体積（ｔｏｔａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｏｌｕｍｅ）を用いて、１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと媒体処理ＷＴ同腹仔との脳切片を比較し、閾値のあるピアソンの相関係数（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を算出して、Ａβと血管新生マーカーのＣＤ１０５との相関性、および血管新生マーカーのＣＤ１０５と密着結合タンパク質のオクルディンとの相関性を評価した。これにより、Ｔｇ２５７６マウスでは、ＡβとＣＤ１０５との間にｒ＝＋０．６２の正の相関係数が認められ、ＣＤ１０５とオクルディンとの間に－０．７３の負の相関係数が認められた。 アミロイドベータが病的血管形成、および密着結合タンパク質の破壊、および神経血管単位の破綻を引き起こすモデルメカニズムを示す概略図。図１０－１のａ）アンジオポイエチン－１活性化Ｔｉｅ－２による血管成長の正常な生理活性。 アミロイドベータが病的血管形成、および密着結合タンパク質の破壊、および神経血管単位の破綻を引き起こすモデルメカニズムを示す概略図。図１０－２のｂ）病的および不安定化血管成長の開始。低酸素条件の存在下では、脳血管と相互作用するアミロイドベータのレベルの増加が認められ、Ｔｉｅ－２受容体の付近ではアンジオポイエチン－１リクルートＶＥＧＦのレベルが小さい。これは、アンジオポイエチン－２がＴｉｅ－２に結合し、不安定化した血管形成を活性化するものであり、それは、下流シグナル伝達経路の増加、ならびに、内皮の生存、増殖、移動およびＶＥＧＦの産生のための血管形成促進転写因子の活性化によって示唆される。ＶＥＧＦエフェクターは、細胞外空間へと移動することで、Ａｎｇ－２が連続的にＴｉｅ－２受容体分子に結合し、内皮細胞を構成的に活性化するのをさらに容易にして、病的新生血管の形成をもたらす。ＦＡＫのような特定のエフェクター分子が増加すると、密着結合の物理的無損傷を維持するアクチン細胞骨格の再編成が生じ、血管を不安定化することにより、血管透過性が高まる。これにより、毒性血液分子が中枢神経系に入り込んで、炎症、低酸素症および神経疾患を引き起こす。このようにして、血管形成は、ＡＤ病理および認知低下に至る。 抗血管形成薬のスニチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスの認知障害が抑えられる。１０月齢のＴｇ２５７６およびＷＴ同腹仔マウスを、抗血管形成チロシンキナーゼ阻害薬のスニチニブにより、８０ｍｇ／ｋｇの用量にて３日／週で１カ月間処理した。異なる記憶の側面の分析のための試験により、処理前の１０月齢マウスおよび処理後の１１月齢マウスの認知状態を評価した。データは、３つの異なる試行からプールされたものであり、平均±標準偏差で表される。ボンフェローニ試験による多重比較の補正を伴う２元ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。オープンフィールド試験、恐怖条件づけ、およびＲＡＷＭ試験では、処理前－ＷＴについてｎ＝８とし、ＷＴ－媒体についてｎ＝６とし、ＷＴ－スニチニブについてｎ＝７とし、処理前－Ｔｇ２５７６についてｎ＝８とし、Ｔｇ２５７６－媒体についてｎ＝９とし、Ｔｇ２５７６－スニチニブについてｎ＝１１とした。Ｙ－迷路では、処理前－ＷＴについてｎ＝８とし、ＷＴ－媒体についてｎ＝１１とし、ＷＴ－スニチニブについてｎ＝１０とし、処理前－Ｔｇ２５７６についてｎ＝８とし、Ｔｇ２５７６－媒体についてｎ＝１１とし、Ｔｇ２５７６－スニチニブについてｎ＝１５とした。図１１－１のａ）オープンフィールド試験。ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）は、フィールドの中央で過ごす時間がより短く、スニチニブで処理しても処理前と有意な差が見られなかった。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、中央を探索する時間がより長かったが、これは、Ｔｇ２５７６マウスをスニチニブで処理したときには認められなかった。処理前ＷＴとＴｇ２５７６との間には有意差が見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも有意差が見られた。スニチニブ処理ＷＴマウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意差が認められなかった。しかし、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意差が観察された。中央広場に入る回数および総移動距離についても、異なるマウス群で同様の結果が観察された。図１１－１のｂ）自発的交替（Ｙ－迷路）。処理前、媒体処理およびスニチニブ処理ＷＴマウスに認められたように、認知力のあるマウスは、高い交替率を示す。処理前ＷＴマウスとＴｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理ＷＴマウスとＴｇ２５７６マウスとの間には、有意差があった。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して交替率の有意な増加が認められたが、スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと処理前Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意差が見られなかった。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、スニチニブ処理ＷＴマウスほどの能力のレベルに達しておらず、これら２つの群の間には有意差が見られた。図１１－１のｃ）文脈的恐怖条件づけ。処理前および媒体処理ＷＴマウスは、良好な連想記憶を示唆する高凍結率を示した。スニチニブ処理ＷＴマウスは、媒体処理ＷＴマウスと比較して凍結率の有意な増加を示したが、処理前と比較すると有意ではなかった。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、それぞれ処理前および媒体ＷＴマウスと比較して有意に低い凍結率を示した。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意な増加が認められたが、この増加は、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較すると有意でなかった。スニチニブ処理ＷＴマウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意差が依然として存在した。 抗血管形成薬のスニチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスの認知障害が抑えられる。１０月齢のＴｇ２５７６およびＷＴ同腹仔マウスを、抗血管形成チロシンキナーゼ阻害薬のスニチニブにより、８０ｍｇ／ｋｇの用量にて３日／週で１カ月間処理した。異なる記憶の側面の分析のための試験により、処理前の１０月齢マウスおよび処理後の１１月齢マウスの認知状態を評価した。データは、３つの異なる試行からプールされたものであり、平均±標準偏差で表される。ボンフェローニ試験による多重比較の補正を伴う２元ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。オープンフィールド試験、恐怖条件づけ、およびＲＡＷＭ試験では、処理前－ＷＴについてｎ＝８とし、ＷＴ－媒体についてｎ＝６とし、ＷＴ－スニチニブについてｎ＝７とし、処理前－Ｔｇ２５７６についてｎ＝８とし、Ｔｇ２５７６－媒体についてｎ＝９とし、Ｔｇ２５７６－スニチニブについてｎ＝１１とした。Ｙ－迷路では、処理前－ＷＴについてｎ＝８とし、ＷＴ－媒体についてｎ＝１１とし、ＷＴ－スニチニブについてｎ＝１０とし、処理前－Ｔｇ２５７６についてｎ＝８とし、Ｔｇ２５７６－媒体についてｎ＝１１とし、Ｔｇ２５７６－スニチニブについてｎ＝１５とした。図１１－２のｄ，ｅ）ラジアルアーム水迷路。（ｄ）マウスが避難台を突き止める時間、すなわち、潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）、および（ｅ）マウスが避難台を突き止める際に犯したエラー（作業および参照記憶エラー）の数。試験１日目と試験５日目とを比較すると、処理前、媒体処理およびスニチニブ処理ＷＴマウスは、潜時と犯したエラーの数の有意な減少を示した。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでも試行の過程で同様の改善が認められた。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、試験１日目と試験５日目との間で有意差が見られなかった。処理前ＷＴマウスとＴｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理ＷＴマウスとＴｇ２５７６マウスとの間には５日目の潜時および犯したエラーの数に有意差が見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも有意差が観察された。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウス、ならびにスニチニブ処理ＷＴおよびＴｇ２５７６マウスによる試験５日目の潜時およびエラーの数を比較すると、有意差が認められなかった。 スニチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ、血管形成マーカーであるＣＤ１０５、ならびに密着結合タンパク質のＺＯ１およびオクルディンの発現が抑えられる。かん流マウス由来の脳を分子分析に使用した。ホモジネートをウエスタンブロッティングに使用し、固定脳切片を組織学的分析に使用した。３つの個別の実験による代表的なデータが、ＷＴについてｎ＝６でありＴｇ２５７６についてｎ＝６である異なる群のマウスについて示されている。ヒストグラムは、平均±標準偏差を示す。独立スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を実施する（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１２－１のａ～ｃ）半定量的ウエスタンブロット分析：ａ）ＣＤ１０５およびＺＯ１の発現。血管形成マーカーであるＣＤ１０５の脳での発現は、Ｔｇ２５７６マウスのスニチニブ処理後に有意に低下し、ＷＴの脳でのレベルと同様になった。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＷＴマウスおよびスニチニブで処理したＴｇ２５７６マウスと比較して、密着結合タンパク質のＺＯ１の発現が有意に低かった。ｂ）Ａβの存在量、およびｃ）ＡＰＰの存在量は、スニチニブ処理後に、Ｔｇ２５７６マウスの脳における媒体処理と比較して、スニチニブ処理動物の脳におけるレベルがＷＴ動物におけるレベルと類似するくらいに低下した。 スニチニブで処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおけるＡβ、血管形成マーカーであるＣＤ１０５、ならびに密着結合タンパク質のＺＯ１およびオクルディンの発現が抑えられる。図１２－２のｄ）免疫蛍光分析：異なる群のマウスの脳切片を、マーカーＣＤ１０５、Ａβおよび密着結合タンパク質オクルディンの組合せについて染色した。示されている顕微鏡写真パネルは、異なる処理群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表す。Ｔｇ２５７６マウス脳では、ＷＴマウスと比較してアミロイド染色が強かった。媒体処理Ｔｇ２５７６では、ＷＴまたはスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、新生血管（ＣＤ１０５）およびＡβ斑が多く、オクルディン発現が小さかった。 抗血管形成薬のスニチニブで高齢Ｔｇ２５７６マウスを処理すると、脳血管の密着結合の減少が抑制される。異なる群のマウスの脳切片を密着結合タンパク質のオクルディンについて染色した。示されている顕微鏡写真パネルは、異なる処理群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表し、ＷＴについてｎ＝６であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６である。媒体処理Ｔｇ２５７６では、ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）と比較して破壊されたオクルディン発現が認められた。対照的に、スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスにおけるオクルディン発現は、ＷＴと類似していた。オクルディンの正常な発現パターンは、顕微鏡写真に白色矢印で示されている。 スニチニブ処理後の高齢Ｔｇ２５７６マウスにおける機能的なＢＢＢ。図１４のａ）エバンスブルー色素を処理試行後のマウスに腹腔内注射した。脳を摘出し、５０％トリクロロ酢酸でホモジナイズした後、エタノールで希釈した。ＥＬＩＳＡプレートリーダにより６２０ｎｍの吸光度を読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）。読取値を脳の重量で除した。この実験を２回繰り返した。データは、平均±標準偏差を表す。独立スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を実施した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。異なる群における色素の吸光度。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳ホモジネートでは、ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）またはスニチニブ処理Ｔｇ２５７６動物と比較して、ＣＮＳにおけるエバンスブルーの取込みが大きく、ＢＢＢの透過性または漏出が大きかった。図１４のｂ）媒体またはスニチニブで処理したＷＴおよびＴｇ２５７６マウスの冠状脳切片の代表的な二次元顕微鏡写真において、グリーンは、脳に漏出したアルブミンを示し、レッドはエバンスブルー色素を示す。高齢Ｔｇ２５７６をスニチニブ処理すると、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、脳におけるアルブミンおよびエバンスブルーが減少し、これは機能的なＢＢＢを示唆するものであった。 抗血管形成薬のＤＣ－１０１は、高齢のＡＤマウスモデルＴｇ２５７６に伴う認知低下を部分的に予防する。１０月齢のＴｇ２５７６およびＷＴ同腹仔マウスを、ＶＥＧＦＲ－２を標的とするモノクローナル抗体であるＤＣ－１０１により、０．８ｍｇ／マウスの用量にて３日／週で１カ月間処理した。処理後、異なる記憶の側面の分析のための試験によりマウスの認知状態を評価した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。上記データは、３つの異なる試行の平均±標準偏差を表す。２－ｗａｔＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（処理前ＷＴおよびＴｇ２５７６についてｎ＝８；ＷＴ－媒体およびＷＴ－ＤＣ１０１についてｎ＝１０；Ｔｇ２５７６－媒体およびｇ２５７６－ＤＣ１０１についてｎ＝１４）。図１５－１のａ）オープンフィールド試験：処理前および媒体処理ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）は、フィールドの中央で過ごす時間がより短く、ＤＣ－１０１で処理しても処理前と有意差が見られなかった。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、ＷＴマウスおよびＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、中央を探索する時間が有意に長かった。マウスの総移動距離およびフィールドの中央に入る回数についても同様の結果が見られた。 抗血管形成薬のＤＣ－１０１は、高齢のＡＤマウスモデルＴｇ２５７６に伴う認知低下を部分的に予防する。１０月齢のＴｇ２５７６およびＷＴ同腹仔マウスを、ＶＥＧＦＲ－２を標的とするモノクローナル抗体であるＤＣ－１０１により、０．８ｍｇ／マウスの用量にて３日／週で１カ月間処理した。処理後、異なる記憶の側面の分析のための試験によりマウスの認知状態を評価した（＊ｐ＜０．０３、＊＊ｐ＜０．００２、＊＊＊ｐ＜０．０００２、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。上記データは、３つの異なる試行の平均±標準偏差を表す。２－ｗａｔＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した（処理前ＷＴおよびＴｇ２５７６についてｎ＝８；ＷＴ－媒体およびＷＴ－ＤＣ１０１についてｎ＝１０；Ｔｇ２５７６－媒体およびｇ２５７６－ＤＣ１０１についてｎ＝１４）。図１５－２のｂ）自発的交替（Ｙ－迷路）：処理前および媒体処理ＷＴマウスに認められたように、認知力のあるマウスは、高い交替率を示し、ＤＣ－１０１による処理後に有意な変化が観察されない。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、試験での能力が劣っており、ＷＴマウスと比較して交替率が有意に低かった。ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意差を示したが、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較すると有意差を示さなかった。図１５－２のｃ）文脈的恐怖条件づけ：ＷＴマウス、処理前、媒体処理およびＤＣ－１０１処理マウスは、良好な連想記憶を示唆する高凍結率を示した。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、有意により低い凍結率を示した。ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６動物は、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意差を示したが、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較すると有意差を示さなかった。 高齢Ｔｇ２５７６マウスをＤＣ１０１処理すると、Ａβ、血管形成マーカーであるＣＤ１０５の発現が低下し、密着結合タンパク質の発現が増加する。かん流マウス由来の脳を分子分析に使用した。ホモジネートをウエスタンブロッティングに使用した。グラフは、平均±標準偏差としてのデータを示しており、全体でＷＴについてｎ＝１２であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝１２である３つの個別の実験からプールされる。独立スチューデントのｔ検定を用いて統計分析を実施した。図１６－１のａ～ｂ）半定量的ウエスタンブロット分析：ａ）Ｔｇ２５７６マウスの脳におけるＡβおよびＣＤ１０５の存在量は、ＤＣ－１０１処理によって、脳におけるレベルがＷＴでのレベルと類似するほどに有意に低下した。ｂ）媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、密着結合タンパク質のＺＯ１の発現が、ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスまたはＷＴマウスよりも有意に少なかった。 高齢Ｔｇ２５７６マウスをＤＣ１０１処理すると、Ａβ、血管形成マーカーであるＣＤ１０５の発現が低下し、密着結合タンパク質の発現が増加する。かん流マウス由来の脳を分子分析に使用した。固定脳切片を免疫蛍光分析に使用した。図１６－２のｃ）免疫蛍光分析：ＣＤ１０５、Ａβおよび密着結合タンパク質オクルディンのマーカーの組合せについて染色された異なる群のマウスの脳切片。示されている顕微鏡写真パネルは、異なる処理群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表す。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳では、ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６またはＷＴマウスと比較して強いアミロイド染色およびより多くのＡβ斑が見られる。媒体処理Ｔｇ２５７６では、ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６またはＷＴと比較して多くの新生血管（ＣＤ１０５）が見られる。媒体処理Ｔｇ２５７６では、ＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）と比較して、オクルディン発現が実質的に低下することが認められた。 抗血管形成抗体のＤＣ－１０１で高齢Ｔｇ２５７６マウスを処理すると、脳血管における密着結合の減少が抑制される。異なる群のマウスの脳切片を密着結合タンパク質のオクルディンについて染色した。示されている顕微鏡写真パネルは、ＷＴについてｎ＝５であり、Ｔｇ２５７６についてｎ＝６である異なる群に属するマウスの脳の皮質および海馬領域を表す。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳では、ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）またはＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、異常なオクルディン発現が認められた。オクルディンの正常な発現パターンは、顕微鏡写真における白色矢印で示されている。 ＤＣ－１０１処理後の高齢Ｔｇ２５７６マウスにおける機能的なＢＢＢ。媒体またはＤＣ－１０１で処理したマウス（ＷＴまたはＴｇ２５７６）の冠状脳切片の代表的な顕微鏡写真において、グリーンは、脳内に漏出したアルブミンの免疫染色を示し、レッドはエバンスブルー色素を示す。媒体処理およびＤＣ１０１処理ＷＴマウスならびにＤＣ１０１処理Ｔｇ２５７６マウスでは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、エバンスブルー色素および免疫染色アルブミンが少ない。 マウス血漿および脳において定量されたアキシチニブの濃度。選択された薬物投与量の効果および生体利用能を証明するための、異なる時点における１０ｍｇ／ｋｇ／マウスでのアキシチニブの薬物動態分析。サンプル中のアキシチニブの濃度を、内部標準較正を含む線形回帰較正曲線により算出した。ＡＵＣ＝曲線下面積。曲線は、経時的な薬物の代謝を表し、ＡＵＣは、系における経時的な総薬物曝露を表す。マウスにおけるアキシチニブの無有害作用量（ｎｏ－ｏｂｓｅｒｖｅｄ－ａｄｖｅｒｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ－ｌｅｖｅｌｓ：ＮＯＡＥＬｓ）は、２６週間にわたる１日１回の強制経口投与で１０ｍｇ／ｋｇ／日未満に設定される。 血管形成は、Ｔｇ２５７６マウスの脳皮質において、アミロイドベータと正に相関し、密着結合タンパク質と負に相関する。図２０－１のａ）ＣＤ１０５およびＡβの共局在化を示す、Ｔｇ２５７６マウスの脳の皮質領域を表す顕微鏡写真。ＣＤ１０５（グリーン）、Ａβ（レッド）、および、統合においてはレッド＋グリーン＝イエロー。各顕微鏡写真のサイズ：１００μｍ＊１００μｍ。図２０－１のｂ）散布図は、Ａβ（レッド）対ＣＤ１０５（グリーン）の統合図（ａ）にプロットされたピクセルの数および強度を表す。閾値のあるピアソンの相関係数をＡβ対ＣＤ１０５の１２の個別的な比較の散布図から算出し、相対頻度ヒストグラムに示す。ここでは、（ｒ）の平均値＝＋０．６３３で標準偏差が０．０９６であり、ｐ＝０．０１である（フリーの統計電卓（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄａｎｉｅｌｓｏｐｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｃａｌｃから入手可能）を使用して算出される統計的に有意な片側検定）。 血管形成は、Ｔｇ２５７６マウスの脳皮質において、アミロイドベータと正に相関し、密着結合タンパク質と負に相関する。図２０－２のｃ）ＣＤ３１（レッド）、ＣＤ１０５（グリーン）およびオクルディン（ブルー）の共局在化を示す、Ｔｇ２５７６マウスの脳の皮質領域を表す顕微鏡写真。統合顕微鏡写真は、グリーン＋レッド＝イエロー、レッド＋ブルー＝パープル、ブルー＋グリーン＝シアン、およびレッド＋ブルー＋グリーン＝ホワイトを示す。各顕微鏡写真のサイズ：１００μｍ＊１００μｍ。 血管形成は、Ｔｇ２５７６マウスの脳皮質において、アミロイドベータと正に相関し、密着結合タンパク質と負に相関する。図２０－３のｄ）散布図は、ＣＤ３１（レッド）対オクルディン（ブルー）についての統合図にプロットされたピクセルの数および強度を表す。閾値のあるピアソンの相関係数をＣＤ３１対オクルディンの１３の個別的な比較の散布図から算出し、相対頻度ヒストグラムに示す。ここでは、（ｒ）の平均値＝＋０．５５２で標準偏差が０．０９５であり、ｐ＝０．０３である（フリーの統計電卓（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄａｎｉｅｌｓｏｐｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｃａｌｃから入手可能）を使用して算出される統計的に有意な片側検定）。図２０－３のｅ）散布図は、ＣＤ１０５（グリーン）対オクルディン（ブルー）についての統合図にプロットされたピクセルの数および強度を表す。閾値のあるピアソンの相関係数をＣＤ１０５対オクルディンの１０の個別的な比較の散布図から算出し、相対頻度ヒストグラムに示す。ここでは、（ｒ）の平均値＝－０．１４０で標準偏差が０．０７３であり、ｐ＝０．３４である（統計的に有意でない片側検定）。

［発明の詳細な説明］
血管機能障害は、アルツハイマー病を含むがそれに限定されない多くの神経疾患の重大な病理学的特質であることが今では明らかであり、ＡＤにおける神経変性的変化およびＡβ沈着の２つの主要な前駆体は、ＢＢＢ破綻およびＣＢＦ障害である。本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）においてＡβの過剰生成によりアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路が異常に刺激されて、脳血管形成の不安定化および血液－脳関門の破壊を招くという、本明細書に記載の所見に関する。本明細書では、この経路を標的とし、Ａβ沈着物の減少を可能にするとともに、認知低下を逆転させることによって脳の健康および健全性を向上させることが可能であることをさらに実証する。

特定の実施形態において、脳における血管形成を阻害することによるアルツハイマー病の治療および／またはその発症の遅延方法が提供される。具体的な実施形態において、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによるアルツハイマー病の治療および／またはその発症の遅延方法が提供される。特定の実施形態において、脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法が提供される。具体的な実施形態において、認知低下は、空間認識、探索、連想記憶、作業記憶および参照記憶のうちの１つ以上に関連する。具体的な実施形態において、認知低下は、空間認識、探索、連想記憶、作業記憶および参照記憶のうちの１つ以上に関連する。

具体的な実施形態において、脳血管新生は、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによって阻害される。この経路は、アンジオポイエチン－２ Ｔｉｅ－２結合の阻害、Ｔｉｅ２シグナル伝達の遮断、エフェクター分子の遮断、Ｔｉｅ－２と相互作用する可溶性Ａβの遮断によって阻害されてもよい。特定の実施形態において、それらの薬剤としては、ＡＮＧ－２および／またはＴＩＥ２に結合する抗体、ならびにその断片および変異体；ＴＩＥ２細胞外ドメインを含む可溶性ＴＩＥ２受容体ならびにその断片および変異体を含むが、それらに限定されない、ＡＮＧ－２に結合する非抗体ペプチド；ＡＮＧ－２系ペプチドを含む、ＴＩＥ２に結合する非抗体ペプチド；ＡＮＧ－２発現のヌクレオチド系阻害薬；ならびに、ＡＮＧ－２またはＴＩＥ２の小分子阻害薬が挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、阻害薬はｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである。

アンジオポイエチン－２ ｔｉｅ２経路を遮断する例示的な薬剤は、当該技術分野で公知であり、トレバナニブ、バヌシズマブ、ＭＥＤＩ３６１７、ネスバクマブ、レバスチニブ、ＭＧＣＤ－２６５、ペクスメチニブ、ＣＥＰ－１１９８１、ＢＡＹ－８２６、３，２１－ジオキソ－オレアン－１８－エン酸、アルチラチニブ、４－［４－（６－メトキシ－２－ナフタレニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－ピリジン、ＡＢ５３６、２ｘＣＯＮおよびＬ１－７を含むが、それらに限定されない。

トレバナニブは、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２経路を標的とし、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２とＴｉｅ２受容体との相互作用を遮断することにより血管形成を阻害するペプチド－Ｆｃ融合タンパク質である。バヌシズマブは、アンジオポイエチン－２（Ａｎｇ２）およびＶＥＧＦ－Ａ）に結合する二重特異性モノクローナル抗体である。ＭＥＤＩ３６１７は、選択的抗アンジオポイエチン－２（Ａｎｇ２）モノクローナル抗体である。ネスバクマブは、アンジオポイエチン２を標的とするモノクローナル抗体である。（国際公開第２０１３１０５９０号に記載の）ＢＡＹ－８２６は、ＴＩＥ－２阻害薬である。ＣＥＰ－１１９８１は、Ｐａｎ－ＶＥＧＦＲ／Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ阻害薬である。レバスチニブは、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体の阻害薬である。ＭＧＣＤ－２６５は、ＭＥＴ、ＶＧＦＲ１－３、ＴｉｅおよびＲｏｎを阻害する多重標的チロシンキナーゼ阻害薬である。アルチラチニブは、抗血管形成および抗腫瘍活性を有する可能性のある、ｃ－Ｍｅｔ／肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦＲ２）、Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼ（ＴＩＥ２）およびトロポミオシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）の経口生体利用可能な阻害薬である。ペクスメチニブは、抗腫瘍、抗炎症および抗血管形成活性を有する可能性のある、ｐ３８およびＴｉｅ２キナーゼの経口生体利用可能な小分子阻害薬である。３，２１－ジオキソ－オレアン－１８－エン酸は、アカシアアウラコカルパ（Ａｃａｃｉａ ａｕｌａｃｏｃａｒｐａ）から単離されるＴｉｅ２キナーゼの天然非タンパク質阻害薬である。４－［４－（６－メトキシ－２－ナフタレニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－ピリジンは、選択的Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ阻害薬である。は、ＡＮＧ－２阻害薬 Ｏｌｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ６（５）：５０７～５１６）。

特定の実施形態において、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路のモジュレーターは、天然の産物または抽出物である。例示的な産物または抽出物としては、例えば、アカシアアウラコカルパ（Ａｃａｃｉａ ａｕｌａｃｏｃａｒｐａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）（モクビャッコウ）、ヤドリギ（Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ）（オウシュウヤドリギ）、ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）（クルクミン）、コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）（チャイニーズスカルキャップ）、レスベラトロルおよびプロアントシアニジン（ブドウ種子抽出物）、コウボク（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（チャイニーズマグノリアツリー）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（緑茶）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、ケルセチン、マツホド（Ｐｏｒｉａ ｃｏｃｏｓ）、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（生姜）、オタネニンジン（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）、ヤマハッカ（Ｒａｂｄｏｓｉａ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ ｈｏｒａ）（シソ）、チャイニーズデスタグネーションハーブ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｄｅｓｔａｇｎａｔｉｏｎ ｈｅｒｂｓ）、リコリス（甘草、マメ科植物）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、連翹（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｆｒｕｃｔｕｓ）およびキョウチクトウ科植物（Ｖｏａｃａｎｇａ ａｆｒｉｃａｎａ）からの産物または抽出物が挙げられる。特定の実施形態において、天然の産物は、ボアカンギン、タンニン酸、オレアノール酸、テルペン、サポニンおよびグリチルリチンから選択される。

特定の実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害薬を単独で使用または併用して血管形成を阻害する。例示的なＶＥＧＦＲとしては、アキシチニブおよびスニチニブなどのチロシンキナーゼ阻害薬、抗ＶＥＧＦＲ２抗体ＤＣ１０１などのＶＥＧＦＲを阻害する抗ＶＥＧＦＲ抗体が挙げられるが、それらに限定されない。

特定の実施形態において、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによって脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法が提供される。特定の実施形態において、脳血管新生をＶＥＧＦＲの阻害薬で阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法が提供される。当該阻害薬としては、アキシチニブ、スニチニブおよびＤＣ１０１が挙げられるが、それらに限定されない。

特定の実施形態において、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによる、アルツハイマー病における脳血管病、脳Ａβ負荷および密着結合破壊の低減方法が提供される。具体的な実施形態において、アキシチニブまたはスニチニブを含むが、それに限定されないＶＥＧＦＲ阻害薬による、アルツハイマー病における脳血管病、脳Ａβ負荷および密着結合破壊の低減方法が提供される。

本発明の特定の実施形態では、薬剤の組合せの使用も考えられる。薬剤は、個別に、または単一組成物として投与されてもよい。

薬剤は、当該技術分野で知られているように製剤化されてもよい。当該製剤は、薬物送達系およびカチオン性界面活性剤を含むが、それらに限定されない。

特定の実施形態において、アルツハイマー病および上記の疾患を含むが、それらに限定されない、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路に関連する疾患に関するバイオマーカーが提供される。ＡＤの動物モデルにおいて、ＳＴＡＴ３、ｃ－ｆｏｓ、ＣＲＥＢおよびｐ５３といった血管形成の促進の原因となる転写因子と同様に、細胞増殖、内皮遊走および細胞生存に関与する下流のシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＷｎｔが、強く活性化された。他の血管形成促進因子の中でもＣＤ１０５、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、オステオポンチン、増殖、血小板第４因子、アンギオジェニンおよびＩＬ－１０が上方制御されることが観察された。動物モデルでは、Ｔｉｅ－２受容体リガンド、Ａｎｇ－１が減少した。ＡＰＰ、ｐＥＲＫ－１、ＮＯＴＣＨ－１およびｐ－ＦＡＫの増加も認められた。

したがって、バイオマーカーとしては、血管形成促進因子およびアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の成分を挙げることができるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、バイオマーカーとしては、他の血管形成促進因子の中でもＣＤ１０５、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、オステオポンチン、増殖、血小板第４因子、アンギオジェニンおよびＩＬ－１０、Ｔｉｅ－２受容体リガンド、Ａｎｇ－１、ＡＰＰ、ｐＥＲＫ－１、ＮＯＴＣＨ－１およびｐ－ＦＡＫが挙げられる。

いくつかの実施形態において、本発明は、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路に関連する疾患の予防および／または治療のための薬剤を特定する方法であって、脳における血管形成を阻害する候補薬剤の能力を試験することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アンジオポイエチン２－媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路に関連する疾患の予防および／または治療のための薬剤を特定する方法であって、選択されたバイオマーカーに対する薬剤の影響を試験することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の予防および／または治療のための薬剤を特定する方法であって、脳における血管形成を阻害する候補薬剤の能力を試験することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の予防および／または治療のための薬剤を特定する方法であって、選択されたバイオマーカーに対する薬剤の影響を試験することを含む方法を提供する。

本発明の特定の実施形態は、アルツハイマー病を発症するリスクがある対象、または初期段階のアルツハイマー病を有する対象を特定するための診断方法であって、選択されたバイオマーカーをスクリーニングすることを含む方法を提供する。

バイオマーカーをスクリーニングする適切な方法は、当該技術分野で公知であり、ホスホキナーゼおよび血管形成プロテオームアレイ分析を含むが、それらに限定されない。

［実施例］
［例示的方法］
マウス、細胞およびヒト脳サンプル：Ｔｇ２５７６ＡＤモデルマウスは、ハムスタープリオンタンパク質プロモーター（Ｔａｃｏｎｉｃ）の制御下で、アミロイド前駆体タンパク質のスウェーデン型変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）（Ｈｓｉａｏら、１９９６年；Ｈｓｉａｏら、１９９５年）を発現する。マウスは、ヘテロ接合Ｔｇ２５７６の雄をＣ５７Ｂ１６／ＳＪＬ Ｆ１の雌とつがわせることによって混合Ｃ５７Ｂ１６／ＳＪＬバックグラウンドに維持した。対照として野生型同腹仔を使用した。

遺伝子型決定プロトコルをＰＣＲにより（Ｈｓｉａｏら、１９９５年）に記載されているように実施した：手短に述べると、２つの並行ＰＣＲ反応を実施して、ヘテロ接合体を野生型から区別した。プライマー１５０２（ハムスターＰｒＰプロモーター、５’－ＧＴＧＧＡＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＣＡ－３’）および１５０３（ヒトＡＰＰ、５’－ＣＴＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴ－３’）を使用して、ＰｒＰ－ＡＰＰ融合ＤＮＡ（接合体に相当）を増幅させた。プライマーの組合せ１５０２および１５０１（マウスＰｒＰ、５’－ＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡ－３’）を反応のための陽性対照として使用した。

１０月齢の雌雄の高齢Ｔｇ２５７６マウスおよび野生型マウスを使用した。

それぞれのアルツハイマーのマウスの実験に使用したマウスの数は、図の凡例に記されている。マウスは、標準的な飼料および水を自由摂取で与えられ、１２時間の明暗サイクルで維持された。これらの試験における動物のケアおよび使用を含むプロトコルおよび手順はすべて、ＵＢＣ動物ケア委員会に確認および承認されたものである。

ヒト脳内皮細胞のＨＢＥＣ－５ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２４５^ＴＭ）を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ；ｃａｔ．＃Ａ３１６０７－０１）および４０μｇ／ｍｌ内皮増殖サプリメント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；ｃａｔ．＃Ｅ２７５９）が補給されたＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ；ｃａｔ．＃１０５６５－０１８）中で、０．１％ゼラチンコート組織培養プレートにて培養した。細胞を７０％コンフルエンスに達するまで増殖させた後、実験に使用した。

アルツハイマー病の脳の組織および正常脳の組織を含むパラフィン組織切片パネル（ｃａｔ＃Ｔ８２３６４４６Ａｌｚ）の形態のヒト脳サンプルをＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標）（カリフォルニア州Ｎｅｗａｒｋ）より入手した。

抗体、ペプチドおよび化学薬品：ウエスタンブロット、免疫蛍光および免疫沈降に使用した抗体（使用濃度は、別段の指示がない限り会社のデータシート通りとした）は、抗ＣＤ１０５／エンドグリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ１０９７）、抗アミロイドベータ６Ｅ－１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；３９３２０）、抗ＺＯ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ｃａｔ．＃６１－７３００）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（ａｂｃａｍ；ａｂ１８１６０２）、抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ｓｃ１６１５）、抗オクルディン（ａｂｃａｍ；ａｂ３１７２１）、抗ＣＤ３１（ａｂｃａｍ；ａｂ２８３６４）、抗アルブミン（ａｂｃａｍ；ａｂ１９１９４）、抗ホスホＴｉｅ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、；ＡＦ３９０９）、抗Ｔｉｅ－２（Ａ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ３１３；１：１００） 抗Ｔｉｅ２／ＴＥＫ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ｃａｔ．＃０５－５８４）、抗アミロイド（１－１６）６Ｅ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ｃａｔ．＃８０３００２）、抗アミロイド（ａｂｃａｍ；ａｂ３９３７７；１：７００）、抗ＶＥＧＦＲ２（ａｂｃａｍ；ａｂ１１９３９）、抗ｐＶＥＧＦＲ２－ホスホＹ１２１４（ａｂｃａｍ；ａｂ１３１２４１） 抗ＦＡＫ（ａｂｃａｍ；ａｂ４０７９４）、抗ホスホＦＡＫ（ａｂｃａｍ；ａｂ８１２９８）、抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５（ａｂｃａｍ；ａｂ６９４７９）、抗Ａｎｇ－１（ａｂｃａｍ；ａｂ８４５１）、抗Ａｎｇ－２（ａｂｃａｍ；ａｂ８４５２）である。

ＨＢＥＣ－５ｉ細胞の処理に使用したペプチド並びに免疫ブロッティングおよび免疫沈降のための陽性対照として使用したペプチドは、Ａβ１－４２ペプチド（ＮｏｖｏＰｒｅｐ合成ペプチド；ｃａｔ．＃Ａ－４２－Ｔ－１）、Ａβ１－１６ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ；ＡＳ－２４２２５）、ヒトＡｎｇ－２ペプチド（ａｂｃａｍ；ａｂ９９４８２）、ヒトＶＥＧＦＡペプチド（ａｂｃａｍ；ａｂ４６１６０）である。

ＦＡＣＳのための抗体は、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４５．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ｃａｔ．＃１０９８０５）、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ４５．１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ｃａｔ．＃１１０７２９）である。

使用した化学薬品は、ＮＰ－４０（ａｂｃａｍ；ａｂ１４２２２７）、１００Ｘ Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ｃａｔ．＃７８４４０）である。

ホスホキナーゼおよび血管形成プロテオームアレイ：全脳組織ホモジネートを上記のように調製した。プロテオームプロファイラヒトホスホ－キナーゼアレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ０００３Ｂ）およびプロテオームプロファイラマウス血管形成アレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ０１５）で提供された２連でプリントされた異なる抗体を含むニトロセルロース膜上で、ホモジネートをインキュベートした。プロテオームプロファイラヒトホスホ－キナーゼアレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ０００３Ｂ）は、マウスサンプルにも使用できる。ホスホキナーゼ分析および血管形成分析をメーカーの説明書に準じて実施した。Ｔｇ２５７６マウス対ＷＴ同腹仔におけるホスホ－キナーゼレベルおよび血管形成に関与するタンパク質のレベルを倍率変化として示した。

細胞培養：ヒト脳内皮細胞を１０ｃｍの組織培養プレートにて増殖した。細胞を飢餓培地中にてＰＢＳ、Ａβ１－４２ペプチド（１０μＭ）、Ａβ１－１６ペプチド（１０μＭ）、Ａｎｇ－２ペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＡ－１６５（１００ｎｇ／ｍｌ）ペプチドで２４時間処理した。処理後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬を含むＲＩＰＡバッファーで溶解した。次いで、これらの細胞を使用して対象となる異なるタンパク質を分析した。

免疫ブロッティング分析および共免疫沈降：ウエスタンブロット分析では、サンプルバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ６．８）、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび２００ｍＭ ＤＴＴ）中ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で分画ホモジネートサンプルを調製した。ホモジネートを電気泳動し、指定の抗体で免疫ブロットした。共免疫沈降では、ホモジネートを、まずビーズスラリーとともにインキュベートすることによって予備洗浄し、４℃にて１４，０００ｘｇで４時間遠心分離した。ビーズを廃棄し、上清を共免疫沈降のために維持した。プロテインＡまたはプロテインＧビーズを洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｘ Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬カクテルおよび２０ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド）で２回洗浄し、４℃にて３，０００ｘｇで２分間遠心分離し、回転シェーカにおいて４℃にて指定の抗体とともに４時間インキュベートした。次いで、ビーズを２回洗浄し、予備洗浄したホモジネートとともに４℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄し、ＤＴＴを含まない２×５０μｌのＳＤＳローディングバッファーを使用し、５０℃で１０分間加熱することにより複合体を溶出させた。ＤＴＴの存在下で２ｘＳＤＳバッファーにより第２の溶出を実施した。溶出液中のタンパク質を標準的技法によりアクリルアミド上で分離させた。それぞれのタンパク質に対する一次抗体を使用して免疫ブロッティングを実施した。オデッセイ赤外画像システム（ＬＩＣＯＲ）を使用することによってシグナル強度を画像化し、免疫反応性の相対的レベルをＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアによって解析した。

薬理学的処理：スニチニブ（ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州）、ＤＣ－１０１（Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州）およびアキシチニブ（ＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州）をＴｇ２５７６マウスおよびそれらのＷＴ同腹仔に投与した。Ｔｇ２５７６およびＷＴの両方の動物を含む対照群には媒体（ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ）のみを投与した。８０ｍｇ／ｋｇの用量のスニチニブまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量のアキシチニブ（両者は、それぞれ３０ｍｇ／ｍｌの溶解度および４０ｍｇ／ｍｌの溶解度で１００％ＤＭＳＯに溶解され、ＰＢＳで所望の濃度に希釈された）、または媒体を、強制経口投与によりマウスに投与した。処理スケジュールは、週３回で１カ月間とした。ＤＣ－１０１を週２回で０．８ｍｇ／マウスの用量にて１カ月間腹腔内投与した。１カ月間処理した後、動物の認知能力試験を行い、オープンフィールド試験、Ｙ－迷路、恐怖条件づけおよびラジアルアーム水迷路の一連の試験により異なる側面の記憶および学習を評価した後、マウスを安楽死させて、脳組織を分析した。

オープンフィールド試験：寸法５０ｃｍ（長さ）×５０ｃｍ（幅）×３８ｃｍ（高さ）で、暗色の壁および中央に焦点を合わせる光源を有する、プレキシガラス製チャンバを使用した。すべての群を通じて、動物を１度に１匹ずつアリーナに配置した。チャンバの床を中央と周辺領域に区分した。フィールドの較正もコンピュータソフトウェアで行ったため、カメラはピクセルベースの情報を基に物理的距離データを作成できる。オープンフィールドの上方に配置されたＲＴＶ２４ Ｄｉｇｉｔｉｚｅｒを有する白黒アナログ追跡カメラにシステムを接続した。このコンピュータ追跡システム（ＡＮＹ－ｍａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して、合計５分間、移動経路、およびフィールドのどちらかの領域で費やした時間を追跡し、記録した。試験では、マウスがオープンフィールドの陰になった端部に留まり、より明るい中央から遠ざかる傾向にあるという、生来の「接触走性（ｔｈｉｇｍｏｔａｘｉｓ）」の行動を活用する。これは、環境内の潜在的危険の認知および意識が損なわれていないマウスは、フィールドの中央で費やす時間がより少なくなることを暗に意味する。この試験では、新しい環境における動物の不安、移動および探索を評価する。

自発的交替（Ｙ－迷路）：空間および作業記憶を用いる新規性探索を試す試験を、灰色の鋼製底板および灰色のＰｅｒｓｐｅｘ（登録商標）壁（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ、イリノイ州、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ）を有する対称形Ｙ迷路を使用して実施した。Ｙ迷路の各アームは、長さ３５ｃｍ、幅５ｃｍ、高さ１０ｃｍで、各アームの端部の壁は白、ブルーまたはレッドの色分けによって特定された。空間学習段階は、８分間のセッション中にＹ迷路の３つのアームを通って自由に移動する途中のマウスを追跡する、１日の試行を含んでいた。コンピュータ追跡システム（ＡＮＹ－ｍａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）によって移動を追跡した。総交替回数×１００／（総アーム進入回数－２）として算出される交替率により、能力を測定した。交替は、重複する３セットにおいて、３つのアームに連続して侵入すること、と定義された。交替率が高い場合、その動物が前回どのアームに進入したかを記憶しており、進入し直しを避けているに違いないことから、認知の持続を意味した。

文脈的恐怖条件づけ：装置は、動画撮影できるよう天井に開口を有する筐体の内側に配置された透明なチャンバで構成された。チャンバは、衝撃発生装置スクランブラに接続された鋼製格子状床で構成された。試験は、条件づけと文脈試験の２つのセッションを包含した。条件づけの日には、マウスを個別にチャンバに入れ、５分間自由に探索させ、その途中、１８０秒経過時点でマウスは床の棒を介して３秒間、０．５０～０．８０ｍＡの衝撃を足に受けた。条件づけの２４時間後にマウスは個別にチャンバに４分間戻され、今度は不快な刺激を受けなかった。マウスの移動を監視し、コンピュータソフトウェア（Ｌｉｍｅｌｉｇｈｔ、ＡｃｔｉＭｅｔｒｉｃｓ、米国イリノイ州、Ｗｉｌｍｅｔｔｅ）を使用して凍結行動を記録した。除外基準は、凍結事象が２秒未満の場合とした。この試験を用いて、連想作業記憶を判定した。我々は、動物が環境をそこで体験した不快な事象に関連づける能力を探究した。動物は同じ環境に戻ると、概して、衝撃を思い出し、衝撃を環境に関連づければ凍結応答を示す。凍結（Ｆｒｅｅｚｉｎｇ）とは、恐怖に対する種特有の応答であり、「呼吸以外の動きがない状態」と定義される。これは、嫌悪刺激の強さや、対象が衝撃を想起できるか否かに応じて、数秒から数分間続く場合がある。

ラジアルアーム水迷路（ＲＡＷＭ）：ＲＡＷＭは、開けた中央区域から延びる８つの泳路（アーム）を含み、「ゴールアーム」と呼ばれる４つの代替的アームのいずれかの端部に避難台が設けられている。研究の間は終始、出発位置とゴールアームを固定した。マウスを個別に迷路の「出発位置」に配置し、６０秒間で４つの避難台の１つを突き止めさせた。試行の都度、避難に使用した台を除去し、当日の試験が終わるまで迷路に戻さなかった。残りの台が１つだけになるまで試験を繰り返した。動物が最後の台を見つけたら、それを当日の試験終了の合図とした。各試行の間に、動物を取り出し、加熱されたホームケージに９０秒間戻して低体温症を防いだ。これらの試行を毎日、合計５日間実施した。試行の都度の台に到達するまでの潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）と、アーム進入回数を手作業で記録した。記憶と学習の能力を、毎日、避難台を見つけるまでの平均所要時間、およびエラー総数、すなわち参照記憶エラー＋作業記憶エラー、に基づいて測定した。参照記憶エラーは、避難台がなかったアームへの進入と定義され、作業記憶エラーは、前回試行時に台が除去されていたアームに続けて進入することとされている。

組織の調製：行動調査後、動物を最終的にケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させ、ＰＢＳで５分間、毎分５ｍｌの流量でかん流した。脳を除去し、１つの半球を組織分析向けに４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定して４℃で保管し、もう１つの半球を生化学研究向けに急速冷凍し、分析準備が整うまで－８０℃で保管した。

ＰＦＡ固定した半球を４％のアガロースブロックに包埋し、免疫蛍光分析向けにミクロトームで切片を切り出した一方、急速冷凍したマウスの脳半球はダウンサー（Ｄｏｕｎｃｅｒ）を使用して機械的にホモジナイズした。細胞画分を可溶性タンパク質の検出に使用した。初回遠心分離後に残ったペレットを、ｄＨ２Ｏ中の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液に再懸濁した。この処理からの上清は、膜結合タンパク質を含んでいた。ペレットのうち２％ＳＤＳに溶解しなかった部分は斑関連Ａβ（ｐｌａｑｕｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａβ）を含み、これを７０％硫酸処理によって可溶化し、凍結乾燥させ、１Ｘ ＰＢＳ溶液中で再懸濁した。１Ｘ Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７８４４０）を添加してタンパク質分解を防止した。

免疫蛍光および共焦点画像処理：４％のＰＦＡで一晩固定した脳半球を、ＰＢＳ＋０．０１％アジ化ナトリウムに移し、４℃で保管した。脳を４％のアガロースに包埋し、ミクロトームステージに固定し、厚さ５０μｍの切片を切り出した。マウスの海馬（ＣＡ１とＤＧ）および大脳皮質（内嗅皮質と前頭葉皮質）、すなわちＡＤに影響される学習と記憶に関係する領域を検証した。脳切片を室温で１時間にわたりバッファー（ＰＢＳ中の３％のスキムミルク、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０）でブロッキングし、続いて、様々な対象タンパク質に対する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした：ＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１０９７）、Ａβ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３９３２０）と密着結合タンパク質、オクルディン（ａｂｃａｍ、ａｂ３１７２１）、ＣＤ－３１（ａｂｃａｍ、ａｂ２８３６４）、およびアルブミン（ａｂｃａｍ、ａｂ１９１９４）。共局在化実験向けに、複数の抗体を切片上で同時に使用した。蛍光標識二次抗体インキュベーションを、室温で１時間実施した。ＤＡＰＩを核対比染色に使用した。次いで切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇでカバースリップ処理する前に、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで洗浄した。スライドを暗所に一晩放置して空気乾燥させた。

高解像度のＯｌｙｍｐｕｓ ６０ Ｘ／１．４油浸対物レンズを装着したＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ－１０ｉ共焦点顕微鏡を使用して画像取得を行った。三次元画像データを取得するために、励起ビームをまず、脳組織サンプル内の最大シグナル強度焦点位置に合焦させ、ピクセル飽和を避けるよう適切な露出時間を選択した。一連の二次元画像（Ｚスタック）を１μｍの刻み幅で取得した。三次元スタックの始点と終点を、シグナルレベル低下に基づいて設定した。次いでＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、取得した一連の画像を処理し、組織の三次元再構築を生成した。

脳組織サンプルにおける４つ以上の皮質または視床下部領域から記録された三次元画像データセットを基に、体積推定（Ｖｏｌｕｍｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）を実施した。この手順では、ノイズ除去フィルタ（３×３のガウスまたはカーネルサイズ）を使用して、画像に付随するノイズを除去した。物体（例えば毛細血管またはアミロイド）と背景との間の境界を定義するため、可能なすべての背景ボクセル値を除外するよう、ヒストグラムにおける下限閾値レベルを設定した。この閾値レベルを超えるすべてのボクセルの合計を、体積として判定した。総蛍光体積（ｔｏｔａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｏｌｕｍｅ）（ＴＦＶ）を対象視野内で検出し、これをソフトウェアによって背景より上方に統合した。ＴＦＶと総視野体積（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ）の比を、ボクセルの単位体積における対象タンパク質の発現の数値表現として使用した。背景を対象区域として選択することにより、タンパク質の共局在化を立証した（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ＿ｕｓｅｒ＿ｇｕｉｄｅ、２０１１）。この対象領域（ＲＯＩ）を使用して、異なるチャネル／標的タンパク質の閾値を設定した。ＲＯＩ外の点をクリックすると、画像全体の散布図が得られた（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ＿ｕｓｅｒ＿ｇｕｉｄｅ、２０１１）。閾値のあるピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を、ソフトウェアで計算した（Ｖｏｌｏｃｉｔｙ＿ｕｓｅｒ＿ｇｕｉｄｅ、２０１１）。ＰＣＣの値が１に近いほど、２つの標的間の統計的相関が強くなる。

ＴＪ形態の半定量分析：共局在化ＣＤ－３１およびオクルディンタンパク質向けの染色により、脳切片を免疫蛍光分析向けに処理した。海馬および大脳皮質において、抗ＣＤ３１で染色した個々の血管を、オクルディン発現に関して正常（１）または異常（０）のいずれかとして評定した。強い、連続的、集中的および直線形の染色の観察により、正常なオクルディン発現を定義した。対照的に、異常なオクルディン発現は、弱い、点状および／または不連続の染色として判断した。オクルディン染色において観察される「隙間」が原因で不完全または起伏のある血管を異常として記録することを最小限に抑えるため、ＣＤ３１染色の助けを借りて、画像における血管連続性の証拠を追求した。脳の所与の領域におけるＴＪ破壊の割合を、異常なＴＪ形態を示す血管の割合として定義した。画像の取得と分析を、上述の通り行った。

血液脳関門透過性アッセイ：薬物および媒体処理したマウス（ｎ＝３）を計量し、マウスの体重１グラム当たり５０μｇのエバンスブルー色素（ＰＢＳ中；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｅ２１２９）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。注射の３時間後、マウスを最終的にケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．；Ｎａｒｋｅｔａｎ、Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．；Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ）で安楽死させ、毎分５ｍｌの流量で５分間にわたりＰＢＳで経心的にかん流した（Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。小脳と嗅球を除去した後、脳を計量した。下記のプロセスを通じてエバンスブルー色素を抽出した；１ｍＬの５０％トリクロロ酢酸を脳に添加し、サンプルをダウンサーで均質化した（プランジャを上下に１０回引く）。ホモジネートを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００％エタノールで１：４に希釈した。エタノールで希釈した上清をＥＬＩＳＡプレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ １９０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）にて６２０ｎｍで読み取り、エバンスブルーの光学密度を判定した。読取値を脳の重量で除し、データを独立ｔ検定で統計的に分析した。エバンスブルーは、血清アルブミンとの親和性が高い色素である（Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。無傷のＢＢＢは血清アルブミンに対して不透過性であるため、注射したエバンスブルーは血清アルブミンに結合した状態を維持し、神経組織を染色しない。ＢＢＢが損傷していると、アルブミンに結合したエバンスブルーがＣＮＳに進入し、青く染色するため、蛍光定量的免疫組織学アッセイに加えて視覚的な定性的確認が可能となる。

近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）：１０％のウシ胎仔血清を添加した５００μＬのＤＭＥＭ培地で２４ウェルプレート（１ウェル当たり７５，０００個の細胞）の培養スライドにＨＢＥＣ－５ｉ細胞を播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地中で１０μＭのＡβペプチドで処理した。処理の翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％のＰＦＡに固定した。ＰＬＡ分析向けに、細胞を３％のＢＳＡでブロッキングし、ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、０．５％で透過処理し、抗アンジオポイエチン２（ａｂ８４５２、ａｂｃａｍ）の１／５００希釈物、抗β－アミロイド（品番３９３７７、ａｂｃａｍ）の１／２００希釈物、抗β－アミロイド（品番９３３２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の１／５００希釈物、抗ｔｉｅ２（品番０５－５８４、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）の１／２００希釈物または抗ＶＥＧＦ受容体２抗体（ａｂ１１９３９、ａｂｃａｍ）の１／２００希釈物とともに、４℃で一晩インキュベートした。Ｄｕｏｌｉｎｋベースのｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、メーカーの指示に従って、タンパク質－タンパク質相互作用を分析した。共焦点顕微鏡およびＤｕｏｌｉｎｋ Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌを使用して、シグナルを定量した。クラスカルワリス検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで統計分析を実施し、続いてテューキー多重比較を実施した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

Ｔｇ２５７６マウスにおけるホスホキナーゼレベルおよび血管形成タンパク質レベルの倍率変化を、ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）マウスと比較して平均ピクセル密度を正規化することによって算出した。

ホスホキナーゼおよび血管形成プロテオームアレイ
全脳組織ホモジネートを上述の通り調製した。プロテオームプロファイラヒトホスホキナーゼアレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ００３Ｂ）およびプロテオームプロファイラマウス血管形成アレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ０１５）で提供された２連でプリントされた異なる抗体を含有するニトロセルロース膜上で、ホモジネートをインキュベートした。プロテオームプロファイラヒトホスホキナーゼアレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＹ００３Ｂ）は、マウスサンプルに対しても使用でき、以前［２０５、２０６］［１２７、１２８］によって試験されたことがある。ホスホ－キナーゼ分析および血管形成分析を、メーカーの指示に従って実施した。Ｔｇ２５７６マウス対ＷＴ同腹仔におけるホスホ－キナーゼレベルと血管形成に関与するタンパク質のレベルを、倍率変化として描写した。

リンパ球のＦＡＣＳ分析
マウスの採血を実施し、ＥＤＴＡ被覆チューブに採取した。ＲＢＣ溶解後にリンパ球を単離し、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１に対する抗体とともにＦＡＣＳバッファー中でインキュベートした。サンプルをＣＤ４５型について分析した。

統計分析：データは平均±標準偏差として示される。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアの助けを借りて、２群を比較する場合は独立スチューデントｔ検定を用いて、また、多重比較の場合には２元ＡＮＯＶＡ検定と多重比較の補正のためのボンフェローニ試験を用いて、行った。各実験のサンプルサイズが図の注釈に記載されている。

［実施例１］
［序文］
神経細胞に加え、神経血管単位もＡＤの影響を受けるという概念（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｃｌａａｓｓｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ、２０１１；Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００２）、および、ＡＤには病的血管形成が媒介すると考えられるという概念（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）、（Ｃｈａａｈａｔ Ｓｉｎｇｈ、２０１７）、（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、２０１３）を裏づける証拠が増加している。血管機能障害は現在、ＡＤにおける重要な病理学的特徴であると見られており、ＡＤにおける神経変性的変化およびＡβ沈着の２つの主要な前兆は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破綻および脳血流（ＣＢＦ）障害である（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｖａｇｎｕｃｃｉ ａｎｄ Ｌｉ、２００３）。これらの所見は、アミロイド形成によって引き起こされる血管形成が神経－血管系の欠陥に繋がることにより、ＢＢＢを破壊し、ＣＢＦを障害させ、Ａβのクリアランスを損ねると考えられるという、新たな仮説に繋がった（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。血管向性（ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ）であることから、このモデルでは、Ａβがより多くの血管病理を助長する結果、異常血管形成の悪循環が疾患を下支えする（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．、２００９；Ｄｉｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｉａｄｅｃｏｌａ、２００４；Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。

ＣＢＦは、ＢＢＢの透過性に影響を及ぼす基軸的役割を果たし、重度のＣＢＦ低下が、認知低下およびＡＤのリスクが高い高齢者に認められている。ＣＢＦ障害およびＢＢＢ損傷は、脳内の末梢循環からの潜在的に神経毒性の血液生成物の蓄積をもたらす（Ｄｉｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００６；Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３；Ｚｌｏｋｏｖｉｃ、２００８）。また、血管形成中のＢＢＢの物理的破綻は、密着結合（ＴＪ）または接着結合の破壊、周皮細胞の減少、および毛細血管基底膜の劣化をもたらす（Ｃｌａａｓｓｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ、２０１１；Ｚｌｏｋｏｖｉｃ、２０１１）。

ＡＤにおけるＢＢＢに関して新たに浮上してきた病原の特徴と整合的に、我々は、血管新生によって引き起こされる血管過剰増生の相殺が脳の生理学的状態の回復に役立つと考えられるという、ＡＤにおいて観察された病態生理学に血管のリモデリングを統合するための新しい検証可能なパラダイムを提案した。血管形成は、ＡＤ臨床サンプルおよびＡＤの動物モデルの両方において増強される（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。ＡＤにおける血管病理学のメカニズムを掘り下げるには、血管形成における正常な生理学的プロセスがどのように病的になるのかを理解する必要がある。成体の血管系は、脈管形成によって胚内に創出される血管のネットワークに由来する（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。創出される内皮細胞格子は、血管形成の足場の役割を果たし、血管形成プロセスにおける既存の血管からの新しい血管の新生および分岐によってリモデルされる一次毛細血管集網を形成する（Ｐａｐｅｔｔｉ ａｎｄ Ｈｅｒｍａｎ、２００２）。血管形成は、成体において、創傷治癒などの生理学的修復プロセスの過程で発生する。脳内での血管形成を調節する主要な因子は、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメイン２を持つチロシンキナーゼ受容体（Ｔｉｅ－２）（Ｔｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１７）と、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、２００５）、（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９９５）、（Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．、２００５）である。血管形成は、受容体Ｔｉｅ－２の活性化とともに開始し、周皮細胞の除去に繋がり、血管の不安定化を引き起こす。内皮細胞は、ＶＥＧＦＲ２の活性化によって増殖し、その結果、血管が新生し始める（Ｐａｐｅｔｔｉ ａｎｄ Ｈｅｒｍａｎ、２００２）。

Ｔｉｅ－２は２つのリガンド、すなわち、血管が安定しているときのアンジオポイエチン－１（Ａｎｇ－１）、および血管が不安定なときのアンジオポイエチン－２（Ａｎｇ－２）を有する。過剰なＶＥＧＦ、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）および低酸素症が存在すると、Ｔｉｅ－２は選択的にアンジオポイエチン－２に結合する。Ａｎｇ－１は、静止状態の成熟した血管内でＴｉｅ２／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の強い活性化を促進することが研究により示されている。Ａｎｇ－１が存在する場合、Ａｎｇ－２はＴｉｅ－２アンタゴニストである；しかし、Ａｎｇ－１が存在しない場合には、Ａｎｇ－２がＴＩＥ２アゴニストとして作用するが、その度合いはＡｎｇ－１より弱い（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２００９）。Ａｎｇ－１／Ｔｉｅ－２のシグナル伝達が弱いと、ＡＫＴレベルが低下し、Ａｎｇ－２発現を増大させる転写因子ＦＯＸＯ１が活性化される。Ａｎｇ－２はＴｉｅ－２のリン酸化を増大させることにより、強いＡｎｇ－１シグナルの不在を補う（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｌｙ、２０１２）。Ａｎｇ－２は、Ｔｉｅ－２の活性化を介して腫瘍血管形成を促進することが知られている。両方のリガンドがＴｉｅ－２に結合する一方、Ａｎｇ－１のＴｉｅ－２への結合はＴｉｅ－１によって変化する。Ｔｉｅ－１細胞外ドメインの存在下では、Ａｎｇ－１はＴｉｅ－２に結合できない（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。しかし、Ａｎｇ－２のＴｉｅ－２への結合は、Ｔｉｅ－１の有無を問わず阻害されない（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。

Ａｎｇ－２は、Ｔｉｅ－２アンタゴニストであると考えられているが、近年、血管形成の活性化において、より微妙な役割を果たすことが示されている。低酸素症、炎症性サイトカインおよびＶＥＧＦＡは、Ａｎｇ－２のＴｉｅ－２との相互作用を調節する。Ａｎｇ２：Ｔｉｅ２結合は、血管の不安定化を促進し、新血管形成を開始させる（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｌｙ、２０１２）。ＶＥＧＦＡが増加するとＡｎｇ－２は内皮細胞の遊走と増殖を促進できるようになる一方、ＶＥＧＦＡの欠乏は、Ａｎｇ－２が内皮細胞死を開始する状況に繋がる（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｌｙ、２０１２）。これらの観察により、我々は、Ａｎｇ－２とＴｉｅ－２が媒介するメカニズムがＡＤにおける血管形成の増大を下支えし、血管形成を抑制する抗がん剤がＡＤ病理を逆転し得る、という仮説を検証するに至った。

［結果］
Ｔｇ２５７６マウスは、血管形成促進タンパク質および下流のシグナル伝達エフェクタータンパク質の、より高い発現を示す：ＡβのＴｉｅ－２およびそのリガンドであるＡｎｇ－２との物理的相互作用が機能的結果をもたらすか否かを調査するため、アミロイドを過剰産生するＴｇ２５７６マウスに関与する下流のシグナル伝達分子および転写因子のタンパク質発現を分析した。ホスホキナーゼおよび血管形成プロテオームアレイの分析を実施した。ＳＴＡＴ３、ｃ－ｆｏｓ、ＣＲＥＢおよびｐ５３といった血管形成の促進の原因となる転写因子と同様に、細胞増殖、内皮遊走および細胞生存に関与する下流のシグナル伝達経路ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＷｎｔが、１１月齢の未処理Ｔｇ２５７６マウスにおいて強く活性化された（図１－１のａ）。未処理ＷＴ同腹仔と比較して、未処理のＴｇ２５７６マウスは、血管形成促進因子の中でもＣＤ１０５、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、オステオポンチン、増殖、血小板第４因子、アンギオジェニンおよびＩＬ－１０の上方制御を示すことが確認された（図１－１のｂ）。Ｔｉｅ－２受容体リガンドのＡｎｇ－１が、Ｔｇ２５７６マウスでは減少した。

様々な血管形成エフェクターを考察するために、媒体またはアキシチニブのいずれかで処理された１１月齢のＴｇ２５７６マウスおよびＷＴ同腹仔について、ウエスタンブロット分析を実施した。Ａβを過剰発現した媒体処理Ｔｇ２５７６動物の脳では、ＡＰＰ、ｐＥＲＫ－１、ＮＯＴＣＨ－１およびｐ－ＦＡＫが増加しており、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでは、これらのエフェクターの発現がより少ないことが認められた（図１－２のｃ）。

アミロイドベータで処理したヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ）は、血管形成の主要な開始因子であるＶＥＧＦＲ２およびＴｉｅ－２受容体の産生と活性の増大を示す：ヒト脳内皮細胞をコンフルエンスまで増殖させ、２４時間にわたり、ＰＢＳ、Ａβ１－４２ペプチド、Ａβ１－１６ペプチド、Ａｎｇ－２ペプチドまたはＶＥＧＦＡ－１６５ペプチドのいずれかで処理した。異なる対象タンパク質について、細胞溶解物をウエスタンブロット分析によって試験した。

細胞をＡβ１－１６ペプチドで処理した場合、対照（ＰＢＳ処理）細胞と比べ、ＶＥＧＦＲ２の発現が増加した。Ａβ１－４２ペプチドは、細胞に対して同様の効果を発揮しなかった。細胞をＶＥＧＦＡ（受容体リガンド）およびＡｎｇ－２ペプチドで処理した場合、ＶＥＧＦＲ２発現が微増したが、Ａβ１－１６ペプチドで達成されたレベルほどではなかった。Ａβ１－１６ペプチド処理後は、他の処理と比べて、リン酸化ＶＥＧＦＲ２も増加した（図２－１のａ）。同様に、Ｔｉｅ－２受容体は、Ａβ１－１６ペプチドでの処理後、ＰＢＳで処理した細胞またはＡβ１－４２ペプチドで処理した細胞と比べて、上方制御された。Ａｎｇ－２は、Ｔｉｅ－２の無制御活性を開始するＴｉｅ－２受容体リガンドである（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｌｙ、２０１２；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２００９）。Ａβ１－１６ペプチド処理は、対照細胞またはＡβ１－４２ペプチド処理細胞よりも多くの、Ａｎｇ－２の上方制御を実証した（図２－２のｂ）。

アルツハイマー病患者の脳は、小脳におけるＡβおよびＴｉｅ－２、ならびに、Ａｎｇ－２、Ｔｉｅ－２およびＣＤ１０５の共局在化を示す：アルツハイマー病および正常なヒトの脳切片を染色し、分析した。ＡＤ脳の小脳ではＴｉｅ－２とＡｎｇ－２およびＣＤ１０５の共局在化が見られる（図３のａ）。近接ライゲーション分析（図３のｂ）では、Ｔｉｅ－２とＡβとの間の相互作用が見られる。また、図２－１、２－２及び３において、Ａβの存在下では、血管新生マーカーＣＤ－１０５の発現が増加し、Ｔｉｅ－２のリガンドであるＡｎｇ－２が高度に発現することも示す。これはヒトＡＤ脳切片においても同様に裏づけられた。また、図３のｃにおいて、ＡＤ脳切片は、不連続なオクルディン密着結合タンパク質発現パターンを有し、破壊されたＢＢＢの存在を示唆することも観察した。これらのデータは、アルツハイマー病の脳における血管過剰状態およびＢＢＢ破壊に繋がる、Ａβに誘発されＡｎｇ－２が媒介するＴｉｅ－２活性の不安定化の重要性を示唆するものである。

アミロイド血管形成開始受容体Ｔｉｅ－２の間における物理的相互作用の実証：ウエスタンブロット分析を実施して、血管形成開始受容体Ｔｉｅ２の２つのリガンドであるＡｎｇ－１およびＡｎｇ－２の発現レベルを評価した。（図４－１のａにおいて）１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６の脳ホモジネートでは、媒体処理ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）同腹仔と比較して、Ａｎｇ－１の発現が少なく、Ａｎｇ－２の発現が多いことが示された。これは、Ｔｇ２５７６マウスにおける、Ａβの過剰産生を伴う、Ａｎｇ－２媒介血管形成活性化の発生を示唆した。これを分析するため、より高いＡｎｇ－２発現を示したＴｇ２５７６マウスからのホモジネートを使用して、ＡβとＴｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２との共免疫沈降を実施し（図４－１のｂ）、これにより、Ｔｉｅ－２およびＶＥＧＦＲ２とＡβとの直接の相互作用が立証された。これを確認するため、より多くの生理学的に関連のある近接ライゲーションアッセイを実施した。ＰＬＡアッセイを用いて、ＡβとＴｉｅ－２との間、およびＡβとＡｎｇ－２との間の有意な相互作用が、ＰＢＳで処理した細胞（陰性対照）と比較して、Ａβ１－１６ペプチドで処理した生体ＨＢＥＣ－５ｉ細胞において見られた（図４－２のｃ）。

抗がん剤のＡＤ治療への転用：ＡＤ患者およびＡＤの動物モデルにおけるＴｉｅ－２血管形成の基礎をなすメカニズムを実証した上で、我々は、抗血管形成薬のアキシチニブがＴｇ２５７６マウスモデルにおいて脳血管増殖を抑制し、ＡＤ病理を逆転させるか否かの検証を追求した。アキシチニブは、ＶＥＧＦＲ１～３のチロシンキナーゼ（ＴＫ）の阻害薬である。これは、多重標的ＴＫ阻害薬であるスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ、Ｐｆｉｚｅｒ）など第一世代の阻害薬と比較して阻害力が５０～４５０倍高い、第二世代のＴＫ阻害薬である。アキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ、Ｐｆｉｚｅｒ）は、米国、カナダ、欧州、英国およびオーストラリアで腎臓がんへの使用を承認されており（ＢＣ＿Ｃａｎｃｅｒ＿Ａｇｅｎｃｙ、２０１５；Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ＿ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ、２０１８）、血管形成、腫瘍増殖および転移を阻害することが示されている。我々は、スウェーデン系ＡＤマウスモデルのＴｇ２５７６（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）に付随する病的な脳血管活性化、ＢＢＢ破綻および認知機能低下を緩和するアキシチニブの能力を探究する。

Ｔｇ２５７６ ＡＤマウスモデルは、９月齢での斑の形成、ならびに６月齢で始まって動物の死亡まで進行する認知低下に関して、既に十分に特徴づけられている（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）。以前の研究では、４月齢での血管病理およびＢＢＢ破壊が、斑形成に先行したことを示した（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。我々は１０月齢のＴｇ２５７６マウスの使用を選択したが、これらのマウスは、この齢までに既に実質的な血管病理（Ｇａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．、２０１０）、ＢＢＢ破壊（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｋｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、２０１３）、アミロイド負荷および認知低下（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、２００１；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、２００２）が生じていると予想されたためである。

アキシチニブ処理はＴｇ２５７６ ＡＤマウスの認知状態を維持する：新規の開放的なアリーナでマウスが示す注意と意識を評価するため、発病から１カ月間にわたり週３回、アキシチニブまたは媒体のみ（ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ）のいずれかで処理された、遺伝子組換えＴｇ２５７６ ＡＤモデルマウスおよびそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔について、オープンフィールド試験を実施した。雌雄双方の１０月齢のマウスを使用した。雌雄のマウス間において、行動試験または処置に対する反応に差が認められなかったため、雌雄双方からのデータを統合した。３回の別々のマウス試行からのデータを、統計分析向けにプールした（ＷＴ媒体処理およびＷＴアキシチニブ処理は、それぞれｎ＝１５；Ｔｇ２５７６媒体処理およびＴｇ２５７６アキシチニブ処理は、それぞれｎ＝２０）。

図５－１のａでは、フィールドの中央で費やした時間を示し、図５－１のｂでは、オープンフィールド試験において異なる群に属したマウスの代表的な軌跡プロットを示す。マウス固有の性質として、処理前および媒体処理のＷＴマウス（Ｂ６／ＳＪＬ）は、時間の大部分をフィールドの周辺領域に限って過ごし、オープンフィールドの中央をほとんど探索しなかったことが観察された。結果はアキシチニブ処理ＷＴマウスでも同様であった。他方、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、フィールド全体を無差別に探索し、他のすべての群と比較して移動距離が長く、それぞれのＷＴ同腹仔と比較してフィールドの中央で過ごした時間が有意に長かった。興味深いことに、アキシチニブ処理後、Ｔｇ２５７６マウスは、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、フィールドを探索する度合いが少なく、開けた中央区域に向かうよりむしろ壁に沿って移動することを好み、中央で過ごす時間が有意に少なかったことから、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、より周囲を意識し、オープンフィールドでは注意深くなることが示唆された。

自発的交替試験（Ｙ迷路）を用いて、空間および作業記憶の評価を行った。処理前および媒体処理のＷＴマウスはそれぞれ６７±５．５％（平均±標準偏差）および７０±１３．８％の交替を示し、薬物で処理した場合に有意な変化は見られなかった（図５－１のｃ）。対照的に、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、それぞれのＷＴ同腹仔と比較して劣る能力を試験で示し、交替率が有意に低く、それぞれ５２．８±４．７％および４１．２±８．３％であった。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスよりも有意に高い交替率を示し、能力はＷＴマウスと区別できないほどであった。

連想記憶評価に関する文脈的恐怖条件づけでは、正常なマウスは以前に電気ショックを受けたことのある環境に置かれると「凍結（ｆｒｅｅｚｅ）」（静止した状態を維持）すると予想される。処理前、媒体処理およびアキシチニブ処理のＷＴ動物（Ｂ６／ＳＪＬ）は、それぞれ１５．９±３．２％、１８．５１±９．１％および１７．７４±１４．４％の凍結率を示すことにより、良好な連想記憶スコアを発揮した（図５－１のｄ）。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスはかなり低い凍結スコア（２．３±１．５％）を示した一方、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６動物のスコアはＷＴ対照動物のスコアと同等であった（１４．４±７．３％）。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間に有意な差があった。マウスをラジアルアーム水迷路（ＲＡＷＭ）で試験することにより、参照記憶（長期）と作業記憶（短期）の評価を行った。

図５－２のｅでは総潜時（ｔｏｔａｌ ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）を示し、図５－２のｆでは、水面下の避難台の所在を突き止める際にマウスがエラーを犯した回数を示す。エラー数および潜時の比較を、各群内で試験１日目と試験５日目との間で行った。試験１日目対試験５日目での能力の有意な差が、処理前ＷＴマウス、媒体処理ＷＴマウスおよびアキシチニブ処理ＷＴマウスに見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスおよび媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、１日目を５日目と比較して有意な差が見られなかった。興味深いことに、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、試験１日目と試験５日目との間で能力を比較した場合に、潜時とエラー数における有意な差を示した。試験５日目の潜時および犯したエラー数を、異なる群間で比較した。処理前ＷＴマウスと処理前Ｔｇ２５７６マウスとの間ならびに媒体処理ＷＴマウスと媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間でも、潜時とエラー数の有意な減少が認められた。

処理前Ｔｇ２５７６マウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも、有意な差が見られた。アキシチニブ処理ＷＴマウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間では、５日目の潜時とエラー数の成績に有意な差は観察されなかった。したがって、５日間にわたり、処理前、媒体処理およびアキシチニブ処理のＷＴマウス、ならびにアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスも、参照記憶と作業記憶の側面に関して認知的学習を示したと言える。

処理前ＷＴマウスとＴｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理ＷＴマウスと媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には、試験５日目の潜時および犯したエラーの数に有意な差が見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスとアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも、有意な差が観察された。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウス、ならびにスニチニブ処理ＷＴおよびＴｇ２５７６マウスによる試験５日目の潜時およびエラーの数を比較すると、有意な差が観察されなかった。

アキシチニブ処理は、Ｔｇ２５７６マウスにおける脳血管病、脳Ａβ負荷および密着結合破壊を低減する
ＡＤ病理に対する薬物の効果を評価するため、処理されたマウスの脳を、血管新生マーカーＣＤ１０５、ならびに、Ａβ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および密着結合タンパク質ＺＯ１の発現を調べる半定量的ウエスタンブロッティングによって分析した。

Ｔｇ２５７６マウスを１カ月間にわたりアキシチニブで処理した結果、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比べて、ＣＤ１０５の発現が有意に減少した（図６のａ）。興味深いことに、アキシチニブ処置Ｔｇ２５７６動物では、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較してＡβ発現が半分未満と有意に減少した（図６のｃ）。対照的に、ＺＯ－１の発現は、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスの方が媒体処理Ｔｇ２５７６マウスより多かった（図６のｂ）。

マウスの脳の皮質と海馬の双方におけるこれらのタンパク質の免疫蛍光分析により、ウエスタンブロッティングデータが確証された。図７－１及び７－２は、皮質と海馬の代表的な顕微鏡写真である。顕微鏡写真とヒストグラムに示されているように、アミロイド染色は、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６動物の脳と比較して、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの脳において大幅に濃い。成熟血管マーカーであるＣＤ３１の染色は、異なる群のすべてにおいて類似するが、新生血管マーカーであるＣＤ１０５は、アキシチニブ処理のＴｇ２５７６マウスまたはＷＴマウスと比較して媒体処理Ｔｇ２５７６マウスの方が多く、これは媒体処理Ｔｇ２５７６動物における血管過剰増生状態を示唆する（図７－１のａ）。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスおよびＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）動物と比較して低いオクルディン発現が見られた（図７－２のｂ）。

アキシチニブ処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおける密着結合構造およびＢＢＢ完全性の喪失を低減する
ＢＢＢの物理的密閉は、主に、神経血管単位における他の要素とともに、密着結合タンパク質（ＴＪＰ）、ＺＯ１、クローディンおよびオクルディンの無傷の連続的な配列によって維持される。それらの変化は、内皮細胞間の密着結合の破壊に繋がる可能性があり、そうなると関門の透過性の増大に繋がり、その結果、毒性血液生成物の脳内への移動が阻害されず、ＡＤ病理が進行する。

ＴＪＰ破壊を、Ｔｇ２５７６マウスおよびそれらのＷＴ同腹仔の脳で分析した。正常なオクルディン発現パターンは、図８－１のａにおいて白色矢印で示されている通り、強固で連続的である。ＷＴマウスは正常なＴＪＰ発現パターンを示し（顕微鏡写真における白色矢印で示されている通り）、したがって、アキシチニブ処理または媒体処理のいずれを問わず破壊率が低いことが観察された。しかし、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＴＪＰ破壊が有意に増大した。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、ＷＴと同様に、密着結合破壊率がより低かった。

この無傷のＴＪＰ配列が動物におけるＢＢＢの透過性に影響を及ぼしたことを証明するために、エバンスブルーアッセイを実施した。エバンスブルー色素は、ＢＢＢが透過できないタンパク質である血清アルブミンに結合する。ＢＢＢが破壊されると、脳内における色素の存在によって示される通り、アルブミンが中枢神経系（ＣＮＳ）に進入できるようになる。

図６は、無傷のＢＢＢを有するマウスにエバンスブルー色素を注射した場合、色素は脳に進入して脳を染色することができないことを示す。図８－２のｃでは、ＷＴの脳は正常に見える一方、媒体処理Ｔｇ２５７６の脳は青く染まっている。これらの脳（皮質のみ）について、色素がＣＮＳに進入した度合いを評価した。図８－１のｂでは、脳の単位質量当たりの光学密度で表される吸光度として測定されたエバンスブルー染色を示している。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは吸光度の増大が認められたことから、ＷＴ同腹仔およびアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して脳へのエバンスブルーの取込みがかなり多かったことが分かる。

別の実験では、アキシチニブまたは媒体で処理したＴｇ２５７６マウスおよびＷＴ同腹仔の脳切片を免疫染色して、ＣＮＳ内でのアルブミンの存在を探索した。図８－２のｄにおける脳の皮質および海馬領域の代表的な顕微鏡写真は、ＣＮＳ内でのアルブミンの存在を示している。ＷＴ脳では最小限の量のアルブミンが見られ、無傷のＢＢＢであることを示唆した一方、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは実質的なアルブミン染色が見られ、これは破壊され透過性が高くなったＢＢＢであることを意味した。アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスの脳は、脳内に見られたアルブミンが少なく、ＢＢＢがより機能的であることを実証した。

病的な新生血管は、病的なＡβおよび破壊された密着結合タンパク質と共局在化する
ＣＤ１０５のＡβおよびオクルディンとの共局在化が図９および２０－１～２０－３に示されている。閾値のあるピアソンの相関係数を算出して、媒体処理した１１月齢のＴｇ２５７６マウスおよび媒体処理した齢適合ＷＴ同腹仔から採取した脳切片における、Ａβ発現とＣＤ１０５発現との間、およびＣＤ１０５発現とオクルディン発現との間の相関関係を評価した。ただし、「＋１」は２つの事象間における正の相関を意味し、その場合１つの変数の増加に伴ってそれに対応する他の変数も増加し、「０」は無相関を意味し、「－１」は負の相関を意味し、その場合１つの変数の増加に伴ってそれに対応する他の変数は減少する。

Ａβが過剰生成されている媒体処理Ｔｇ２５７６マウスにおけるｒ＝＋０．６２（ｐ＝０．０２１）の相関係数は、ＡβとＣＤ１０５との間での正の相関を意味し、これは過剰な量のアミロイドの存在と、脳血管系における新生の病的血管の増加との間の関係を示唆した。他方、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスにおけるｒ＝－０．７３（ｐ＝０．００６）の相関係数は、ＣＤ１０５発現とオクルディン発現が負の相関関係にあることを意味した。ＷＴ脳はＡβとＣＤ１０５の低い発現を示し、密着結合タンパク質のレベルは正常である。

［論考］
本研究では、ヒトと動物におけるＡＤの病的血管形成の基礎をなすＴｉｅ－２メカニズムを記述し、この知識を応用してＡＤを阻止および逆転する抗がん剤の効能を検証する。ＡＤのＴｇ２５７６マウスの脳に関する我々の遺伝子発現プロファイリングは、血管形成遺伝子プログラムの向上を実証するものである。アミロイドベータで処理したヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ－５ｉ）の培養物による研究は、いずれも血管形成の主要な開始因子であるＶＥＧＦＲ２およびＴｉｅ－２受容体の産生と活性の増大を示す。我々の研究では、アルツハイマー病患者の脳は、アミロイド斑、脳アミロイド血管症、血管過剰増生および密着結合破壊を示した。ヒトＡＤ脳は、中心前回と小脳における、ＡβおよびＴｉｅ－２、ならびにＡｎｇ－２、Ｔｉｅ－２およびＣＤ１０５の共局在化も示す。

ＰＬＡ法を用いた直接結合および相互作用の研究は、ベータアミロイドが血管形成開始因子である受容体Ｔｉｅ－２と物理的に相互作用することを実証するものである。斑数の顕著な減少、ＢＢＢの再確立、認知機能の回復、および脳血管増殖の逆転が、１０月齢のＴｇ２５７６マウスを抗血管形成チロシンキナーゼ阻害薬のアキシチニブで１カ月間処理した後に観察された。これらの発見は、ＡＤ治療のための新たな参入点をもたらし、ＡＤの血管病因論の証拠を強化する。ＡＤには、Ａβ沈着が脳軟膜血管と脳内血管に認められる脳血管アミロイド血管症（ＣＡＡ）との密接な関連性がある（Ｃｌａａｓｓｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ、２０１１）。これはＡＤ症例の約９０％において観察される。ＣＡＡは、徐々に、血管平滑筋の劣化および血管剛性の増大を引き起こし、最終的に血管機能を変化させる。それは血管周囲およびＢＢＢにおけるＡβ排出経路の閉塞に繋がる恐れもある（Ｃｌａａｓｓｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ、２０１１）。病的血管形成およびＢＢＢの破壊は、ＣＢＦの低下に対する代償性反応として生じることが研究により示唆されている（Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２００５；Ｖａｇｎｕｃｃｉ ａｎｄ Ｌｉ、２００３）。我々のデータは、これらの従前の研究の説明になる。

本研究より前は、血管形成が、Ａβによる活性化または酸化性ストレスや炎症などのメカニズムに対する応答としての直接または間接のＢＢＢ破壊の開始因子であるのかどうか、不明であった。Ａβ誘発性神経炎症反応は、ＶＥＧＦやトロンビンのような血管形成活性化因子の放出を助長する。ＶＥＧＦは血管形成を刺激するだけでなく、血管の透過性にも影響を及ぼす。トロンビンはＶＥＧＦとの相乗効果により内皮細胞増殖を増大させることが知られている（２０１８）。トロンビンは内皮細胞によるさらなるＡβ分泌を誘発し、活性酸素種の生成およびさらなる内皮損傷を促進し、神経毒（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ｉｎｓｕｌｔ）のサイクルを引き起こす（Ｖａｇｎｕｃｃｉ ａｎｄ Ｌｉ、２００３）。Ａβは、血管形成メカニズムによる血管密度および血管リモデリングのモジュレーターとして関与すると考えられている（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。

従前の研究では、Ｔｇ２５７６マウスにおけるＢＢＢ完全性は、早ければ４月齢時点で血管過剰増生によって損なわれ、これが斑形成に先行する、と報告された（Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。ＴＪ破壊は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、齢適合ＷＴ同腹仔や両方の遺伝子型の幼若マウスと比較して大幅に多いことが実証された（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。同じ研究において、Ｔｇ２５７６マウスモデルの脳血管完全性が、血管形成およびアポトーシスのマーカーとともに検証された。高齢Ｔｇ２５７６マウスは、齢適合ＷＴ同腹仔と比較した場合、ＴＪ破壊の発生の有意な増大を示し、これは血管新生および全体的な微小血管密度の増大に直接関連づけられたが、アポトーシスには関連づけられなかった（Ｕｊｉｉｅ ｅｔ ａｌ．、２００３）。ＡＤマウスモデルにおけるこれらの所見は、ＡＤ患者を対照群と比較した場合に見られる所見と同等である（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１）。

本研究では、１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよびＷＴマウスの脳の免疫蛍光共局在化分析の結果、血管新生マーカーＣＤ１０５とＡβとの間における正の相関と、ＣＤ１０５と密着結合タンパク質であるオクルディンとの間における負の相関を実証した。これは、Ａβの増加がＣＤ１０５の増加に関連し、ＣＤ１０５の増加がオクルディン発現の減少に関連すると予想されることを示唆する。血管新生マーカーであるＣＤ１０５の上方制御は、Ｔｇ２５７６マウスの脳に見られる。ＶＥＧＦや低酸素誘導因子－１（Ｈｉｆ－α）のような血管形成促進シグナルの増加およびＡｎｇ－１の減少も、１１月齢のＴｇ２５７６マウスにおいて、媒体処理または未処理のいずれを問わず、齢適合媒体処理または未処理ＷＴ同腹仔と比較した場合に見られる。これらの所見は、Ａｎｇ－１の非存在下および／またはＶＥＧＦの存在下で血管形成が上方制御されるという研究と整合的である（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｌｙ、２０１２；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２００９）。Ｔｇ２５７６マウス系統は過剰な量のＡβを生成することが示されていることから、Ａβ自体が、ＶＥＧＦＲ－２および／またはＴｉｅ－２との相互作用による血管形成の活性化に役割を担い、ＶＥＧＦＡをリクルートしてＶＥＧＦＲ２を活性化し、Ａｎｇ－２依存性のＴｉｅ２活性化を媒介し、最終的に調節不全の新血管形成に繋がる、と言える。

図９にモデルが示されており、血管形成は、アミロイドベータと正に相関し、密着結合タンパク質と負に相関する。顕微鏡写真は、ａ）ＣＤ１０５（グリーン）、Ａβ（レッド）およびＣＤ３１（ブルー）、ならびにｂ）ＣＤ１０５（グリーン）、オクルディン（ブルー）およびＣＤ３１（レッド）の、海馬および皮質の共局在化を表している。最初の列は、抗体染色の組合せで染色された脳を示す顕微鏡写真を表す。白色のオーバレイは、拡大され、ＣＤ１０５およびＡβまたはＣＤ１０５およびオクルディンのいずれかとラベルされた次の２つの列に示された視野における領域を示す。全蛍光体積を用いて、１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと媒体処理ＷＴ同腹仔との脳切片を比較し、閾値のあるピアソンの相関係数を算出して、Ａβと血管新生マーカーのＣＤ１０５との相関性、および血管新生マーカーのＣＤ１０５と密着結合タンパク質のオクルディンとの相関性を評価した。これにより、Ｔｇ２５７６マウスでは、ＡβとＣＤ１０５との間にｒ＝＋０．６２の正の相関係数が見られ、ＣＤ１０５とオクルディンとの間に－０．７３の負の相関係数が見られた。

図は、アミロイドがどのように病的な血管形成を開始し、ＡＤに見られる病理の入口であるＢＢＢ破壊に繋がるのかを説明する図である。低レベルのＡｎｇ－１の存在下でＴｇ２５７６マウスの脳内で脳血管と相互作用するＡβのレベルが増大すると、Ｔｉｅ－２受容体付近でのＶＥＧＦのリクルートに繋がる。これは、Ａｎｇ－２のＴｉｅ－２への結合を補助し、不安定化した血管形成を活性化するものであり、それは、下流シグナル伝達経路の増加、ならびに内皮の生存、増殖、移動およびＶＥＧＦの産生のための血管形成促進転写因子の活性化によって示唆される。このＶＥＧＦエフェクターは、細胞外空間へと移動することで、Ａｎｇ－２が連続的にＴｉｅ－２受容体分子に結合し、内皮細胞を構成的に活性化するのをさらに容易にして、病的新生血管を形成する。エフェクター分子である焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のレベルが増大すると、密着結合の物理的無傷を維持するアクチン細胞骨格の再編成が生じるため、血管が不安定化することにより、血管の透過性が高まる。これにより、毒性血液分子がＣＮＳに入り込んで炎症、低酸素症および神経疾患を引き起こす。このようにして、血管形成は最終的にＡＤ病理および認知低下に至る。

提唱されたメカニズムを巡る疑問の一部に答えるため、ヒトの脳の内皮細胞をＡβ（１－１６）、斑中に多く認められるＡβ（１－４２）、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦＡまたはＰＢＳのいずれかで処理した。Ａβ（１－１６）は、非神経系源泉から産生される、より優勢な種類の末梢アミロイドの一種である（図２－１及び２－２）。Ａβ（１－１６）処理細胞は、ＰＢＳ処理細胞またはＡβ（１－４２）処理細胞と比較して、ＶＥＧＦＲ２およびＴｉｅ２受容体のより高い発現レベルおよびより高いリン酸化レベル、ならびにより高いＣＤ１０５発現を示すことが認められた。これは、血管形成を開始するのは可溶性および循環性のＡβ種であり、斑随伴種ではないという考えを裏づけるものである。Ａβ（１－１６）処理細胞は、Ａｎｇ－２の発現増加も示し、これは調整不全の血管形成のＡｎｇ－２依存的な活性化という提唱された考えを裏づけるものである。

我々はＡＤ対象の脳血管系において特定した血管形成メカニズムを基に、ＶＥＧＦＲファミリーを標的とする第二世代の抗血管形成小分子ＴＫＩであるアキシチニブの効果を探究したが、さらに、アミロイド形成がどのように、ＢＢＢ破綻を引き起こす病的血管形成の活性化に繋がるかを示す分子メカニズムの理解も試みる。１０月齢の処理前Ｔｇ２５７６マウスおよびＷＴ同腹仔を、１１月齢のアキシチニブおよび媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよびＷＴ同腹仔と併せて、認知の様々な側面について試験した。ＷＴマウスは、アキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと同様に、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、空間認識、探索、連想記憶、作業記憶および参照記憶に関して、有意に高い認知を示した。これらの結果から引き出される結論は、１カ月間にわたるアキシチニブ処理により、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて上述の記憶の側面を改善できるということである。アキシチニブ処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、より低い血管形成マーカーＣＤ１０５の発現、より低いアミロイド負荷、ＺＯ１やオクルディンのようなＴＪＰのより高い発現、および、より機能的なＢＢＢを示すことも認められた。したがって、アキシチニブは、ＡＤのＴｇ２５７６マウスモデルに見られる脳病理、アミロイド負荷および他の病理学的兆候を変化させることができるとともに、脳血管新生の阻害によって認知低下を治療できるほか、ＡＤに見られる分子病理も変化させることができるという概念実証としての多大な潜在性を示す。

本研究では、アキシチニブでの処理により、高齢Ｔｇ２５７６マウスの認知が改善することを示した。処理前の１０月齢Ｔｇ２５７６マウスを特徴づける更なる研究は、アキシチニブ処理が分子病理の進行を未然に防ぐまたは低減するか否かという、この疑問への対処に役立つであろう。１１月齢でのアキシチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスに見られる病理学的変化が、１０月齢での処理前Ｔｇ２５７６マウスに見られる変化と同様であるとすれば、この薬物は分子病理に対する予防薬と捉えられることになる。しかし、Ｔｇ２５７６マウスが、１カ月間のアキシチニブ処理後と比較して、処理前により悪い病態および機能的欠陥を示すとすれば、この薬物は分子病理に対する治療薬として証明されることになる。認知評価において見られたのと同様に、１０月齢の処理前Ｔｇ２５７６マウスと１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間で分子病理に有意な差はないと考えられるが、薬物処理Ｔｇ２５７６マウスと媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間には有意な差がある。したがって、分子病理学に関しては、薬物処理は単に予防的というよりむしろ治療的であると言えるが、抗血管形成薬のアキシチニブにおけるこの側面を証明するには、さらなる研究が必要であると考えられる。

アミロイドカスケード経路を標的とした療法は、これまでのところ失敗に終わっている。したがって、ＡＤの予防と治療のための新たなアプローチが緊急に必要とされている。血管機能障害は、今では、ＡＤの重大な病理学的特徴であることが明らかであり、神経変性的変化およびＡβ沈着の２つの主要な前兆は、脳血流障害および血液－脳関門破綻に起因する。このことから、脳血流障害がＡβのクリアランス障害に繋がり、血管形成、ＢＢＢ破綻および血管リモデリングを誘発する結果、中枢神経系におけるアミロイド斑、神経細胞死滅およびそれに続く認知低下をもたらすという、散発性ＡＤ病因論の新たな仮説が浮上した。家族性形態のＡＤにおいて、開始事象は、脳血流障害の要件を迂回して血管形成を誘発するＡβ産生の増大であろう。

結論として、ＡＤ病の進行に関する病態生理学の理解が不可欠であり、新たな研究の方向性が必要である。本研究は、アミロイドの過多が、アンジオポイエチン－２の媒介によるＴｉｅ－２の調節不全の脳血管形成を介して不安定で漏洩しやすい血管の活性化に繋がる結果、下流のシグナル伝達経路のカスケードが生じ、最終的にＡＤに見られる分子病理に至るというメカニズムを特定する、初の研究である。我々が記述する、脳血管形成の制御への抗がん剤の転用に向けられた治療アプローチは、アミロイドカスケードを標的とすることとは一線を画し、ＡＤおよび関連する脳血管疾患に対して有効と証明されると考えられる。

［実施例２］
スニチニブは、高齢の遺伝子組換えＡＤマウス、すなわちＴｇ２５７６マウスにおいて、認知を調節して特定の側面を改善し、他の側面の低下を予防する
新規の開放的なアリーナでマウスが示す注意と意識を評価するため、１０月齢時点で１カ月間にわたり週３回、スニチニブまたは媒体のみ（ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ）のいずれかで処理された、遺伝子組換えＡＤモデルマウスのＴｇ２５７６およびそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔について、オープンフィールド試験を実施した。本研究には雌雄双方のマウスを使用した。

図１１－１のａは、マウスがフィールドの中央で費やした時間、中央領域に進入した回数、および総移動距離を示す。マウス固有の性質として、処理前ＷＴ同腹仔マウス（Ｂ６／ＳＪＬ）は、１０月齢において、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較して、フィールドの中央で費やした時間が有意に少ないことが観察された。同様に、媒体処理ＷＴマウスも、フィールド全体を無差別に探索した媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、中央で費やした時間が有意に少なかった。スニチニブ処理ＷＴマウスも、時間の大部分をフィールドの周辺領域に限って過ごし、オープンフィールドの中央をほとんど探索しなかった。スニチニブ処理後、Ｔｇ２５７６マウスは中央で過ごした時間が少なく、スニチニブ処理ＷＴマウスと比較して有意な差はなかった。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよび処理前Ｔｇ２５７６マウスの両方との間にも有意な差が見られた。同様の結果が、マウスのフィールド中央への総進入回数および総移動距離に関しても観察された。

自発的交替試験（Ｙ－迷路）を用いて、空間記憶と作業記憶の評価を行った（図１１－１のｂ）。アーム間で、処理前ＷＴマウスは６７．２５±５．５％（平均±標準偏差）の交替を示し、媒体処理ＷＴマウスは４３．２７±３．６％の交替を示した。ＷＴ動物を薬物で処理した場合に有意な変化は認められなかった。対照的に、処理前Ｔｇ２５７６マウスは劣る能力を試験で示し、交替率は５２．８４±４．７％であった。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは媒体処理ＷＴマウスと比較して有意に低い交替率（２９．１±９．７％）を示した。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、交替率が４９．３±１２．１％で、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に高い交替率を示したが、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較すると有意な差ではなかった。

連想記憶評価に関する文脈的恐怖条件づけでは、マウスは以前に電気ショックを受けたことのある環境に置かれると、静止した状態を維持した（図１１－１のｃ）。処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスがそれぞれ３．２±１．６％および１．０４±１．１％の凍結率を示したのと比較して、処理前および媒体処理ＷＴ動物（Ｂ６／ＳＪＬ）はいずれも、より高い、それぞれ１５．９±３．２％および１１．５±２．５％の連想記憶を示した。スニチニブ処理ＷＴマウスは、媒体処理ＷＴマウスならびにスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して交替率が有意に高かった（２５．４±１９．４％）。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６動物の連想認知（１０．９±５．８％）は、媒体処理Ｔｇ２５７６動物より有意に高かったが、処理前Ｔｇ２５７６マウスより有意に高くはなかった。

マウスをラジアルアーム水迷路（ＲＡＷＭ）で試験することにより、参照記憶（長期）と作業記憶（短期）の評価を行った。図１１－２のｄでは総潜時（ｔｏｔａｌ ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）を示す一方、図１１－２のｅでは、水面下の避難台の所在を突き止める際にマウスがエラーを犯した回数を示す。

エラー数および潜時の比較を、各群内で試験１日目と試験５日目との間で行った。試験１日目対試験５日目での能力の有意な差が、処理前ＷＴマウス、媒体処理ＷＴマウスおよびスニチニブ処理ＷＴマウスに見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスおよび媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、１日目を５日目と比較して有意な差が見られなかった。興味深いことに、スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、試験１日目と試験５日目との間で能力を比較した場合に、潜時とエラー数における有意な差を示した。

試験５日目の潜時および犯したエラー数を、異なる群間で比較した。処理前ＷＴマウスと処理前Ｔｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理ＷＴマウスと媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとの間でも、潜時とエラー数の有意な減少が見られた。処理前Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間、ならびに媒体処理Ｔｇ２５７６マウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間にも、５日目の能力に有意な差が見られた。

スニチニブ処理ＷＴマウスとスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスとの間では、５日目の潜時とエラー数の成績に有意な差は観察されなかった。したがって、５日間にわたり、処理前、媒体処理およびスニチニブ処理ＷＴマウス、ならびにスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、参照記憶および作業記憶の側面に関して認知的学習を示したと言える。

スニチニブ処理は、Ｔｇ２５７６マウスにおける脳血管病、脳Ａβ負荷および密着結合破壊を低減する
ＡＤ病理に対する薬物の効果を評価するため、処理されたマウスの脳を、血管新生マーカーＣＤ１０５のタンパク質発現、ならびにＡβ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および密着結合タンパク質ＺＯ１の発現を調べるため、半定量的ウエスタンブロッティングによって分析した。１０月齢のＴｇ２５７６マウスを１カ月間にわたりスニチニブで処理した結果、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比べ、ＣＤ１０５の発現が有意に減少した（図１２－１のａ）。薬物処理したＴｇ２５７６マウスでは媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較してＺＯ１の発現が多く（図１２－１のａ）、これは、処理された動物における密着結合の存在を示唆した。スニチニブで処理されたＴｇ２５７６マウスでは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に低いＡβ発現が観察された（図１２－１のｂ）。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスでは、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、全体的なＡＰＰタンパク質発現の減少も観察された（図１２－１のｃ）。

マウスの脳の皮質と海馬におけるこれらのタンパク質の免疫組織分析により、ウエスタンブロッティングデータが確証された。図１２－２のｄは代表的な顕微鏡写真である。ヒストグラムを見ると、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスにアミロイド染色があることと、スニチニブ処理Ｔｇ２５７６群ではアミロイド存在量が有意に少ないことが分かる。新生血管マーカーＣＤ１０５の発現は、ＷＴ動物と比較して、媒体処理Ｔｇ２５７６群でより多く、これは血管過剰増生を示唆する。この血管過剰増生状態は、Ｔｇ２５７６マウスをスニチニブで処理した場合には見られなかった。密着結合タンパク質であるオクルディンの低発現は、ＢＢＢ障害の指標であるが、Ｂ６／ＳＪＬまたはスニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスにおいて見られる（図１２－２のｄ）。

スニチニブ処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおける密着結合構造およびＢＢＢ完全性の喪失を低減する
ＢＢＢの物理的密閉は、主に、神経血管単位における他の要素とともに、密着結合タンパク質（ＴＪＰ）、ＺＯ１、クローディンおよびオクルディンの無傷の連続的な配列によって維持される。それらの変化は、内皮細胞間の密着結合の破壊および関門の透過性の増大に繋がり、その結果、損傷を促進する血液生成物の脳内への移動が阻害されず、ＡＤ病理が進行する。

ＴＪＰ破壊率を、スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスと対照マウスにおいて分析した。ＷＴマウスは正常な連続的ＴＪＰ発現パターンを示し（図１３の顕微鏡写真において白色矢印で示されている通り）、したがって、スニチニブまたは媒体処理のいずれを問わず破壊率が低かった。しかし、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＴＪＰ破壊が有意に増大した。スニチニブで処理されたＴｇ２５７６マウスは、ＷＴマウスと同様のＴＪＰ発現パターンを示した。

この無傷のＴＪＰ配列が動物におけるＢＢＢの透過性に影響を及ぼしたことを証明するために、エバンスブルーアッセイを実施した。エバンスブルー色素は、正常なＢＢＢが透過できないタンパク質である血清アルブミンに結合する。ＢＢＢが破壊されると、脳内における色素の存在によって示される通り、アルブミンが中枢神経系（ＣＮＳ）を横断し進入できるようになる。

脳（皮質と海馬）について、色素がＣＮＳに進入した度合いを評価した。

図１４のａでは、エバンスブルー染色に由来するとされる吸光度を、脳の単位質量当たりの光学密度として示している。媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＷＴ同腹仔と比較して、より高い吸光度が認められた。Ｔｇ２５７６マウスをスニチニブで処理した後、ＣＮＳへのエバンスブルーの取込みは媒体処理Ｔｇ２５７６マウスより低いことが観察された。

図１４のｂは、蛍光色素標識抗体およびＣＮＳ中の自己蛍光エバンスブルーの助けを借りて検出されたアルブミンの存在を示す。ＷＴ脳では最小限の量のアルブミンが認められ、無傷のＢＢＢであることを示唆した一方、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスで見られた実質的なエバンスブルー染色は、破壊され透過性が高くなったＢＢＢであることを意味した。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスの脳は、媒体処理マウスと比較してＣＮＳに進入するアルブミンが大幅に少ないことを示し、これはスニチニブ処理後にＢＢＢが機能を果たしていることを実証するものである。

ＤＣ－１０１に関する結果
ＤＣ－１０１は、高齢の遺伝子組換えＡＤマウス、すなわちＴｇ２５７６マウスにおいて、認知を調節して特定の側面を改善し、他の側面の低下を予防する：新規の開放的なアリーナでマウスが示す注意と意識を評価するため、発病から１カ月間にわたり週３回、ＤＣ－１０１または媒体のみ（ＰＢＳ＋ＤＭＳＯ）のいずれかで処理された、遺伝子組換えＡＤモデルマウスのＴｇ２５７６およびそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔について、オープンフィールド試験を実施した。雌雄双方の１０月齢のマウスを使用した。雌雄のマウス間において、行動試験または処置に対する反応に差が認められなかったため、雌雄双方のデータをすべての分析向けにプールした。

マウス固有の性質として、処理前ＷＴ同腹仔（Ｂ６／ＳＪＬ）マウスは、媒体処理マウスと同様に、時間の大部分をフィールドの周辺領域に限って過ごし、オープンフィールドの中央をほとんど探索しなかったことが観察された。これはＤＣ－１０１で処理したＷＴマウスでも変化がなかった（図１５－１のａ）。他方、処理前および媒体処理のＴｇ２５７６マウスはフィールド全体を無差別に探索し、他のすべての群と比較して移動距離が有意に長く、ＷＴ同腹仔と比較してフィールドの中央で過ごした時間が有意に長く、フィールドの中央に進入した回数も多かった。ＤＣ－１０１での処理後、Ｔｇ２５７６マウスは処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、フィールドを探索した度合いが少なく、中央で過ごした時間が有意に短かった。

自発的交替試験（Ｙ－迷路）を用いて、空間および作業記憶の評価を行った。処理前および媒体処理ＷＴマウスはアーム間でそれぞれ６５．２５±５．５％および７０．１±１３．６％（平均±標準偏差）の交替率を示したが、ＤＣ－１０１処理後に有意な変化はなかった（７１．２．６±１２．１％）。対照的に、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは劣る能力を試験で示し、交替率が統計的に有意に低く、それぞれ５２．８２±４．７％および４０．４±５．３％であった。ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスは媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよびＤＣ１０１処理ＷＴマウスと比較して有意に異なったが、ＤＣ１０１処理Ｔｇ２５７６マウスは処理前Ｔｇ２５７６マウスと区別がつかなかった（図１５－２のｂ）。

連想記憶評価に関する文脈的恐怖条件づけでは、マウスは以前に電気ショックを受けたことのある環境に置かれると「凍結（ｆｒｅｅｚｅ）」（静止した状態を維持）が見られた。処理前、媒体処理およびＤＣ－１０１処理ＷＴ（Ｂ６／ＳＪＬ）動物は、それぞれ１５．９６±３．２％、２０．５±７．５％および２９．０６±１２．７％の凍結率で、良好な連想記憶を発揮した（図１５－２のｃ）。対照的に、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、それぞれ凍結率が３．２±１．６％および０．９８±１．３％と低かった。（図１５－２：抗血管形成薬のＤＣ－１０１は、高齢ＡＤマウスモデルＴｇ２５７６に伴う認知低下を部分的に予防する）。ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスの凍結率は９．６±６．２％であった。これは媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよびＤＣ－１０１処理ＷＴマウスと比較して有意に異なっていたが、処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較すると有意に異なってはいなかった。

ＤＣ－１０１は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、脳Ａβ、血管形成マーカーＣＤ１０５、および密着結合タンパク質の発現を低減する：ＡＤ病理に対する抗体ＤＣ－１０１の効果を評価するため、処理されたマウスの脳を、血管新生マーカーＣＤ１０５のタンパク質発現ならびにＡβおよび密着結合タンパク質ＺＯ１のタンパク質発現を調べる半定量的ウエスタンブロッティングによって分析した。Ｔｇ２５７６マウスを１カ月間にわたりＤＣ－１０１で処理した結果、媒体のみで処理したマウスと比較して、ＡβとＣＤ１０５の発現レベルが減少し（図１６－１のａ）、ＺＯ－１の発現が増加した（図１６－１のｂ）。

マウスの脳の皮質と海馬の双方におけるこれらのタンパク質の免疫蛍光分析により、ウエスタンブロッティングデータが確証された。図１６－２のｃは、皮質と海馬の代表的な顕微鏡写真である。より高いアミロイドおよびＣＤ１０５の染色が媒体処理Ｔｇ２５７６マウスで観察されたが、ＤＣ－１０１で処理したＴｇ２５７６マウスでは観察されなかった。オクルディン発現の減少が媒体処理Ｔｇ２５７６マウスで観察されたが、ＤＣ－１０１での処理後のオクルディン発現はＷＴ動物に認められた発現と同等であった。

ＤＣ－１０１処理は、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおける密着結合構造およびＢＢＢ完全性の喪失を低減する。
正常なオクルディン発現パターンは、図１７において白色矢印で示されている通り、強固で連続的である。ＷＴマウスは正常なＴＪＰ発現パターンを示し、したがってＤＣ－１０１処理または媒体処理のいずれを問わずＢＢＢ破壊率が低いことが観察された。しかし、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスでは、ＤＣ－１０１で処理したＴｇ２５７６マウスには見られなかったＴＪＰの破壊が生じていた。

この無傷のＴＪＰ配列がＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６動物におけるＢＢＢの不透過性に影響を及ぼすことを示すために、エバンスブルー色素をマウスに腹腔内注射した。エバンスブルー色素は、正常なＢＢＢが透過できないタンパク質である血清アルブミンに結合する。ＢＢＢが破壊されると、アルブミンが中枢神経系（ＣＮＳ）を横断して進入できるようになり、これは脳内における色素の存在によって示される。図１８は、無傷のＢＢＢを有するマウスにエバンスブルー色素を注射した場合、色素は脳に進入して脳を染色することができないことを示す。図１８における脳の皮質および海馬領域の代表的な顕微鏡写真は、ＷＴ脳におけるアルブミンの量が最小限であること、つまりＢＢＢが無傷であることを示している。対照的に、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスではエバンスブルーとアルブミン双方の実質的存在が認められ、これは関門が破壊され透過可能になったことを意味する。ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスの脳は、ＷＴマウスと同様に見え、これはＢＢＢが機能を果たしていることを意味する。

［論考］
１０月齢での処理前ＡＤマウスモデルであるＴｇ２５７６マウスは、齢適合ＷＴ同腹仔と比較して、特に空間認識、連想記憶、作業記憶および参照記憶に関して有意な認知低下を示した。１カ月間の処理後に１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスを媒体処理ＷＴマウスと比較した場合にも同様の結果が観察された。高齢Ｔｇ２５７６マウスおよびそれらの齢適合ＷＴ同腹仔について、小分子ＴＫＩのスニチニブまたはＶＥＧＦＲ２抗体のＤＣ１０１のいずれかで１カ月間処理した後の認知変化を評価した。

スニチニブ処理は、ＷＴマウスにおける空間記憶、参照記憶または作業記憶の側面の変化は示さなかったが、スニチニブ処理ＷＴマウスでは、処理前または媒体処理ＷＴマウスと比較して連想記憶の増大が見られた。

Ｔｇ２５７６マウスに対する１カ月間の処理後の薬物の効果は複雑であった。スニチニブ処理Ｔｇ２５７６マウスは、様々な記憶試験、すなわち、オープンフィールド、Ｙ－迷路、恐怖条件づけおよびラジアルアーム水迷路において、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意に高い能力スコアを示した。しかし、恐怖条件づけ試験によって評価される連想記憶またはＹ－迷路によって評価される空間認識など一部の記憶の側面においては、当該Ｔｇ２５７６マウスは処理前Ｔｇ２５７６マウスと比較して有意差を示さなかった。同様に、ＤＣ－１０１処理はＷＴ動物に対し、処理前および媒体処理ＷＴ動物と比較した場合に効果を示さなかった。Ｔｇ２５７６マウスにおいて、ＤＣ－１０１処理は、処理前および媒体処理Ｔｇ２５７６と比較して、不安レベル、運動および新規環境の意識の改善を示したが、連想および空間記憶の側面に関してはＤＣ－１０１処理マウスと処理前Ｔｇ２５７６マウスとの間で有意差が観察されなかった。

これらの結果から引き出される結論は、スニチニブで１カ月間処理すると、高齢Ｔｇ２５７６マウスにおいて、参照記憶、作業記憶および新規環境の意識といった記憶の側面を改善して接触走性（ｔｈｉｇｍｏｔａｘｉｓ）を促進することができ、また、空間および連想記憶のさらなる低下を防止することもできる、ということである。ＤＣ－１０１での１カ月間の処理もまた、Ｔｇ２５７６マウスにおいて、新規環境における意識を改善する一方、空間および連想記憶のさらなる低下を防止する。

スニチニブおよびＤＣ－１０１で１カ月間処理した後のＡＤ病理に関する分子および免疫組織化学分析により、媒体処理およびスニチニブ／ＤＣ－１０１処理のＷＴマウスのほか、スニチニブ／ＤＣ－１０１処理Ｔｇ２５７６マウスにおいても、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較して、ＡβおよびＣＤ１０５の発現が減少し、ＺＯ１およびオクルディンの発現が増加したことが分かる。スニチニブおよびＤＣ－１０１で１カ月間処理すると、媒体処理Ｔｇ２５７６マウスと比較してＢＢＢの機能性が高くなることも観察された。したがって、スニチニブおよびＤＣ－１０１は、ＡＤのＴｇ２５７６マウスモデルに認められる脳の病理、認知低下および他の病理学的兆候を調節する能力を有し、ＡＤ治療薬としての多大な潜在性を示す。

１１月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスは、齢適合ＷＴ同腹仔より高い脳内アミロイド存在量を示した。これについては、従前の研究において、このマウスモデルではＡβ蓄積が６～９カ月の間に始まり［Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．、２００１］、９月齢までに斑が発達する［Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ １９９６；Ｌｅｅ，Ｋ．－Ｗ．，ｅｔ ａｌ．、２００９］ことが既に記載されていることから予測された。Ｔｇ２５７６マウスでは、ＷＴ同腹仔と比較して、血管新生マーカーＣＤ１０５の発現増大によって示唆される微小血管密度の増大や、ＣＮＳにおけるエバンスブルーおよび免疫染色アルブミンの存在量の増大によって示唆されるＢＢＢ浸透性の増大を含む、血管病理の増大が認められた。この結果については、Ｔｇ２５７６マウスモデルでは、齢適合ＷＴ同腹仔と比較して、血管病理およびＢＢＢ破壊が早ければ４月齢で始まり、加齢に伴って有意に増大することが既に示されていたことから予測された（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１１）。本章に記載のデータおよび他の研究からのデータは、血管の変化がＡＤ病理における重要な要素であることを示唆するものである。

本章のデータは、血管病理がＡＤの病理における重要な要素であり、抗血管形成分子によるその調節が疾患病理の様々な側面の防止または治療に役立ち得ることを実証するものである。高齢Ｔｇ２５７６動物において、正常な血管系を示すＷＴ同腹仔とは対照的に血管の変化が観察されたことから、Ａβの産生は血管病理に繋がる血管新生の開始において役割を担うと推察できる。第二に、血管病理はＡβ蓄積と斑形成に先行する（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１１）ことから、血管病理は直接または間接的に、このＡβ蓄積と斑形成を促進すると結論づけることができる。ＡＤ病理全体の確立における分子メカニズムおよび血管病理が果たす役割をさらに理解するために、ＡＤ病理における血管の側面を深く研究する必要がある。

アミロイド形成は、ＢＢＢ破壊および他のＡＤ病理に繋がる調節不全の血管新生を促進する
１２月齢の媒体処理Ｔｇ２５７６マウスおよび齢適合媒体処理ＷＴマウスの脳ホモジネートに由来するサンプルを使用して実施されたＲＮＡマイクロアレイ分析（データ不図示）は、記憶、内皮増殖、低酸素状態への反応および生存などのプロセスに関連する、２群間での遺伝子発現の大域的変化を示した。これらのデータは、ＡＤにおける病理生理学のメカニズムの理解に役立つ潜在的標的になり得る候補をもたらす。これをさらに掘り下げるため、１１月齢の未処理Ｔｇ２５７６マウスからの脳タンパク質ホモジネートおよび齢適合ＷＴマウスからのホモジネートに対してプロテオームアレイを実施して、血管形成に関与する様々なエフェクタータンパク質を探索した。ＷＴと比較して、Ｔｇ２５７６マウスは、全体的な血管形成増加のための代償性メカニズムとして上方制御された可能性がある抗血管形成エンドスタチンを除き、全体的な血管形成促進エフェクターの増加および抗血管形成エフェクターの減少を示した。

本明細書において参照される、公開特許出願を含むすべての特許、刊行物、およびデータベース入力データの開示は、その全体が参照により明示的に、当該個別の特許、刊行物およびデータベース入力データが明示的かつ個別に参照により組み込まれると指示されていたと仮定した場合と同じ度合いで組み込まれる。

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本発明は特定の具体的実施形態に言及しながら記述されているが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更が明らかである。当業者にとって明らかであるそのような変更はすべて、下記の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (12)

1. アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによるアルツハイマー病の治療および／またはその発症の遅延方法であって、有効量のアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬を対象に投与することを含む方法。
2. 脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法であって、有効量のアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬を対象に投与することを含み、脳血管新生がアンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路を阻害することによって阻害される、方法。
3. 前記認知低下は、空間認識、探索、連想記憶、作業記憶および参照記憶のうちの１つ以上に関連するものである、請求項２に記載の方法。
4. 前記アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬は、天然の産物または抽出物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記産物または抽出物は、アカシアアウラコカルパ、クソニンジン（モクビャッコウ）、ヤドリギ（オウシュウヤドリギ）、ウコン（クルクミン）、コガネバナ（チャイニーズスカルキャップ）、レスベラトロルおよびプロアントシアニジン（ブドウ種子抽出物）、コウボク（チャイニーズマグノリアツリー）、チャノキ（緑茶）、イチョウ、ケルセチン、マツホド、ショウガ（生姜）、オタネニンジン、ヤマハッカ（シソ）、チャイニーズデスタグネーションハーブ、レンギョウ、連翹およびキョウチクトウ科植物からの抽出物からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路の阻害薬は、ＡＮＧ－２および／またはＴＩＥ２に結合する抗体、ならびにその断片および変異体；ＡＮＧ－２に結合する非抗体ペプチド、ＴＩＥ２に結合する非抗体ペプチド、ならびにＡＮＧ－２もしくはＴＩＥ２の小分子阻害薬である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路のモジュレーターは、トレバナニブ、バヌシズマブ、ＭＥＤＩ３６１７、ネスバクマブ、レバスチニブ、ＭＧＣＤ－２６５；ペクスメチニブ；ＣＥＰ－１１９８１、ＢＡＹ－８２６、３，２１－ジオキソ－オレアン－１８－エン酸、アルチラチニブ、４－［４－（６－メトキシ－２－ナフタレニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－ピリジン、ＡＢ５３６、２ｘＣＯＮおよびＬ１－７である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
8. 追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. アルツハイマー病を発症するリスクがある対象、または初期段階のアルツハイマー病もしくは他の神経疾患を有する対象を特定するための診断方法であって、アンジオポイエチン－２媒介Ｔｉｅ－２血管形成経路からのバイオマーカーをスクリーニングすることを含む方法。
10. 脳血管新生を阻害することによる認知低下の治療および／または予防方法であって、アキシチニブ、スニチニブおよびＤＣ１０１からなる群から選択されるＶＥＧＦＲの阻害薬を対象に投与することを含む方法。
11. 前記認知低下は、空間認識、探索、連想記憶、作業記憶、参照記憶、不安、抑鬱、嗜好行動（ａｄｄｉｃｔｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）、偏執行動（ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）、脅迫行動（ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）および反復行動（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）のうちの１つ以上に関連するものである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記対象はヒトまたは動物である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

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