JP2023520568A

JP2023520568A - モジュラー合成受容体及びその使用方法

Info

Publication number: JP2023520568A
Application number: JP2022560520A
Authority: JP
Inventors: トゥーチンタン; ヤムナンナ; ブラウンマイケル; エクスラインコリン; スティーブンズシーン
Original assignee: ラングバイオテクノロジーピービーシー
Priority date: 2020-04-06
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2023-05-17
Also published as: KR20220164569A; US20240343777A1; AU2021252514A1; US12049488B2; IL296565A; US20210317185A1; WO2021207074A3; WO2021207074A2; CA3171795A1; CN115667292A; EP4132965A2

Abstract

モジュラー合成受容体が提供される。前記合成受容体は、１つ以上のリガンド分子に結合することができて、結合した後に合成受容体から遊離することのできる細胞外ドメインと、Ｎｏｔｃｈ受容体に由来する膜貫通ドメインと、合成受容体から遊離すると１つ以上の機能活性を有することができる細胞内ドメインとを、含み得る。前記合成受容体の使用方法も提供され、前記方法では、細胞外ドメインが特定のリガンドに結合したとき、前記合成受容体が、タンパク質切断を起こして細胞外ドメイン及び細胞内ドメインの両方又はそのいずれかを遊離させる。前記細胞外結合ドメインは、遊離した場合、同族リガンドに結合し続けることが可能で、１つ以上のさらなる機能活性を働かせ得る。細胞内ドメインは、遊離すれば、１つ以上の細胞内活性を刺激又は抑制し得る。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月６日出願の米国仮出願第６３／００５，７３９号に基づく優先権を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用される。

技術分野
本願は、新規受容体に関し、具体的には、移植、腫瘍学、及び自己免疫療法のために設計されたＮｏｔｃｈ合成受容体又はＣＴＬＡ－４合成受容体に関する。

哺乳類細胞は、細胞外分子を認識することができて細胞内応答を引き起こす膜貫通受容体を有する。Ｎｏｔｃｈ受容体は、同族リガンドとの結合に応答して、タンパク質切断の利用により細胞外ドメインと細胞内ドメインとを遊離させるシグナル伝達受容体の、進化上保存されたファミリーでる。タンパク質切断を起こす能力は、Ｎｏｔｃｈ受容体の限られた領域内に含まれており、この領域は、切断現象に係わる膜貫通ドメイン及び認識部位を含む。リガンド結合に応答して切断を起こす能力は、伝達性を有しており、結合時に、改変された種々の細胞外サブドメイン及び細胞内サブドメインを遊離させることのできる、種々のリガンド特異性を持った合成受容体の産生を可能にする。

本開示は、少なくとも３つのドメインを含む合成受容体を提供する。本開示の特定の態様では、合成受容体は、ａ）１つ以上のリガンドに特異的に結合し、前記リガンドに結合した後に場合によっては前記合成受容体から遊離するよう構成された細胞外ドメインを含む少なくとも１つのドメインと、ｂ）Ｎｏｔｃｈ受容体を含むか又はＮｏｔｃｈ受容体に由来する膜貫通ドメインを含む少なくとも１つのドメインと、ｃ）前記合成受容体から遊離したときに１つ以上の機能活性を場合によっては起動させるように構成された細胞内ドメインを含む少なくとも１つのドメインとを、含んでもよい。

いくつかの実施形態では、前記細胞外ドメインが特定のリガンドに結合したとき、前記合成受容体は、タンパク質切断を起こして前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインの両方又はそのいずれかを遊離させ得る。前記細胞外結合ドメインは、同族リガンドに結合し続け、また、遊離しても１つ以上の機能活性を働かせ続け得る。機能活性としては、抗体依存性細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性、アポトーシス、又は酵素機能のうち少なくとも１つが挙げられる。さらに、例示であって限定するものではないが、前記活性は、タンパク質－タンパク質の相互作用の遮断又は誘発と、細胞外機能分子の分泌とのうちの少なくとも１つであり得る。いくつかの実施形態では、前記細胞外機能分子は、サイトカイン又はケモカインの少なくとも１つであってもよい。

前記合成受容体の細胞内ドメインは、遊離した場合、１つ以上の細胞内活性を刺激又は抑制してもよい。本開示の特定の態様では、前記細胞内ドメインは、遊離した場合、１つ以上の細胞外活性を刺激又は抑制する分泌タンパク質である。

これらの細胞外活性は、シグナル伝達、輸送、接着、タンパク質－タンパク質相互作用の遮断、及び／又は安定性の少なくとも１つを含み、但し、それらに限定されるものではない。前記１つ以上の細胞内活性は、シグナル伝達、遺伝子発現、輸送、及び／又は安定性の少なくとも１つを含む。

前記細胞外ドメインは、抗体又はその断片を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する、抗体の一本鎖可変部（ｓｃＦＶ）分子であってもよい。

前記細胞内活性はまた、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の野生型Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも１つの分泌融合タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、前記ヒトＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つであってもよい。

前記細胞内ドメイン活性はまた、ヒトインターロイキンの少なくとも１つの導入遺伝子を含み得る。

例えば、特定の実施形態では、前記細胞内活性は、ヒトインターロイキン２をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む。なおも他の一実施形態では、前記少なくとも１つの導入遺伝子は、ヒトインターロイキン１２をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの導入遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－３９、又はＩＬ－４０のいずれか１つをコードしてもよい。

本開示の特定の態様では、前記合成受容体のＮｏｔｃｈ受容体はヒトＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーであり得る。前記合成受容体の他の実施形態では、前記Ｎｏｔｃｈ受容体は、ハエ、虫、ブタ、及びネズミの少なくとも１つに由来するＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーである。

前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。これらの実施形態では、前記受容体は、配列番号１又は配列番号３に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでもよい。前記受容体はまた、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したマウスＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。これらの実施形態では、前記導入遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記合成受容体はまた、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したジヌツキシマブに由来する一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。これらの実施形態では、前記受容体は、配列番号２に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる融合タンパク質をコードする導入遺伝子をさらに含む。

特定の他の実施形態では、前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトインターロイキン２分子をコードする導入遺伝子をさらに含む。これらの実施形態では、前記導入遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

さらなる実施形態では、前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した改変一本鎖ヒトインターロイキン１２分子をコードする導入遺伝子を含む。これらの実施形態では、前記導入遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

本明細書では、合成受容体を用いて標的細胞の活性を調節する方法も提供される。前記方法は、合成受容体を標的細胞上の受容体に接触させることと、細胞外結合ドメインが前記標的細胞に結合している間に前記合成受容体の切断を可能にすることと、細胞内ドメインを、その細胞内ドメインが遺伝子の発現を誘発するところである核の中に遊離させることとを、含んでもよい。本開示のいくつかの態様では、前記細胞外ドメインは抗体又はその断片であってもよい。特定の実施形態では、前記細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシドに結合する、抗体の一本鎖Ｆｖ分子であってもよい。

前記方法の細胞内活性は、ヒトＩｇＧの野生型Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも１つの融合タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、このＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４を含み得る。前記細胞内活性はまた、ヒトインターロイキンをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトインターロイキンはヒトＩＬ２である。特定の他の実施形態では、前記細胞内活性は、ヒトＩＬ１２をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの導入遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－３９、又はＩＬ－４０のいずれか１つをコードしてもよい。

合成受容体を標的細胞上の受容体に接触させることは、がんを患っている対象に前記合成受容体を投与することを含んでもよい。前記接触はさらに、自己免疫障害を患っている対象に前記合成受容体を投与することを含んでもよい。前記接触はさらに、同種移植後又は異種移植後の対象に前記合成受容体を投与することを含んでもよい。

図１は、本開示の合成受容体の模式図を示す。図２Ａ～２Ｅは、合成コンストラクトから正しい大きさの産生物を産生することを実証する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子からなる合成受容体を示す。図２Ｂは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したジヌツキシマブ（ユニツキシン（登録商標）（ジヌツキシマブ）の商標の下でユナイテッド・セラピューティクス・コーポレーションから販売されたもの）に由来する一本鎖Ｆｖ分子からなる合成受容体を示す。図２Ｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる融合タンパク質であるベラタセプトをコードする導入遺伝子を示す。図２Ｄは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトインターロイキン２分子をコードする導入遺伝子を示す。図２Ｅは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した改変一本鎖ヒトインターロイキン１２分子をコードする導入遺伝子を示す。図３は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる、導入遺伝子によってコードされたベラタセプトが、ブタＣＤ８０／ＣＤ８６分子に結合することを実証するフローサイトメトリー分析をグラフで示す。図４は、ＣＤ３を認識してベラタセプトの発現及び分泌を伴う応答をするヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子からなる細胞外ドメインを有する合成受容体の機能をグラフで示す。抗ｈＣＤ３合成受容体と、ベラタセプトをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞を、ＣＤ３を自然に発現するヒトジャーカットＴ細胞に４８時間接触させて、ベラタセプトの発現について分析した。結果は、合成受容体を発現する細胞だけが、ヒトＴ細胞の存在下でベラタセプトの発現を誘発するということを示し、このことは、ＣＤ３とＣＤ８０／８６の遮断という２重の利点を有するものと考えられる。図５Ａは、ジヌツキシマブ（ユニツキシン（登録商標）の商標の下で販売されたもの）合成受容体を発現するブタ大動脈内皮細胞を、標的糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を自然に発現するＣＨＰ－１３４細胞で４８時間共培養したときの、ＩＬ－２Ｆｃの産生をグラフで示す。図５Ｂは、前記ユニツキシン合成受容体を発現するブタ大動脈内皮細胞を、標的糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を自然に発現するＣＨＰ－１３４細胞で４８時間共培養したときの、ｓｃＩＬ－１２Ｆｃの産生レベルをグラフで示す。ＩＬ－２Ｆｃタンパク質及びｓｃＩＬ１２－Ｆｃタンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡ法で定量化した。図６Ａは、導入遺伝子によってコードされた改変ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質が、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定法（相対蛍光単位）において、未変性ヒトＩＬ２に類似のレベルで機能することをグラフで示す。図６Ｂは、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定の結果を示し、この測定では、抗ＧＤ２合成受容体と、ヒトＩＬ２－Ｆｃをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞に由来する上清を、標的糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を自然に発現するヒトＣＨＰ－１３４細胞の存在下又は非存在下で４８時間培養した。「陰性」はＣＴＬＬ－２細胞単独を指し、「陽性」は、精製ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質で培養したＣＴＬＬ－２細胞を指す。図６Ａは、導入遺伝子によってコードされた改変ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質が、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定法（相対蛍光単位）において、未変性ヒトＩＬ２に類似のレベルで機能することをグラフで示す。図６Ｂは、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定の結果を示し、この測定では、抗ＧＤ２合成受容体と、ヒトＩＬ２－Ｆｃをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞に由来する上清を、標的糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を自然に発現するヒトＣＨＰ－１３４細胞の存在下又は非存在下で４８時間培養した。「陰性」はＣＴＬＬ－２細胞単独を指し、「陽性」は、精製ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質で培養したＣＴＬＬ－２細胞を指す。図７は、ハエ（ｄＮｏｔｃｈ）、虫（ＧＬＰ－１）、ブタ（ｐＮｏｔｃｈ１）、ネズミ（ｍＮｏｔｃｈ１）、及びヒト（ｈＮｏｔｃｈ１－４）のＮｏｔｃｈ受容体の膜貫通ドメイン及び隣接する第１及び第２切断認識配列の配列比較を示す。

定義：
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの単数の冠詞及び類似の指示的用語は、各要素を叙述することに照らした場合、本明細書において他のように示されているか又は文脈によって明確に否定されていなければ、単数と複数の両方を含むと解釈されるものとする。

本明細書で用いられる場合、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当業者によって理解されているものとし、それが用いられている文脈によりある程度異なっていてもよい。用語「約（ａｂｏｕｔ）」が用いられている文脈があって、その用語が当業者にとって不明確に用いられている場合、「約（ａｂｏｕｔ）」は、その特定の用語の１０％マイナスから１０％プラスまでを意味するものとする。

当業者に理解される通り、あらゆる目的のために、本明細書で開示される全ての範囲はまた、あらゆる可能な部分的範囲又はそのような部分的範囲の組み合わせをも包含する。さらに、当業者に理解される通り、範囲は個々の構成要素を包含する。

本明細書で用いられる場合、用語「適例な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」は、「例（ｅｘａｍｐｌｅ）、例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）、又は例示（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として働く」ことを指し、「好適な」や「他の実施形態よりも有利である」ことを指すものではない。

本明細書で用いられる場合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とも言われる「抗体依存性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性免疫防御によって免疫系の効果器細胞が標的細胞を活発に溶解させる、その細胞媒介性免疫防御の機構を指し、その標的細胞は、膜表面抗原に特定の抗体が結合しているものである。それは、液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限及び抑制するように作用する機構の１つである。

本明細書で用いられる場合、「ベラタセプト」は、可溶性融合タンパク質を指すことがあり、これは、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）の細胞外ドメインを、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾Ｆｃ（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３の各ドメイン）部分に連結しているものである。構造的には、アバタセプトは、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ分子量が９２，３００Ｄａであるグリコシル化融合タンパク質であり、それぞれ３５７アミノ酸を有する２つの相同ポリペプチド鎖のホモダイマーである。それは、哺乳類ＣＨＯ細胞において、組み換えＤＮＡ技術によって産生される。この薬剤は、Ｔリンパ球に対して抑制的活性を有する選択的共刺激修飾因子として活性を有する。

本明細書で用いられる場合、「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、免疫グロブリン、典型的にはＩｇＧ及びＩｇＭ抗体のエフェクター機能を指すことがある。これら抗体が標的細胞（例えば、細菌性又はウイルス性感染細胞）上の表面抗原に結合したとき、タンパク質Ｃ１ｑをこれら抗体に結合させることによって古典的な補体経路が誘発され、結果として、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が形成され、標的細胞が溶解される。

本明細書で用いられる場合、「ジヌツキシマブ」（ユニツキシン（登録商標）（ジヌツキシマブ）の商標の下でユナイテッド・セラピューティクス・コーポレーションによって販売されるもの）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及び１３－ｃｉｓ－レチノイン酸（ＲＡ）との併用が必要であるとされるＧＤ２－結合モノクローナル抗体であり、先行のファーストライン多剤併用集学的療法に少なくとも部分的な応答をする、高リスク神経芽細胞腫の小児科患者の治療のためのものでる。

本明細書で用いられる場合、他に特に指定がなければ、「ヒトインターロイキン」は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－３９、又はＩＬ－４０のいずれか１つを指すことがある。インターロイキンは、免疫細胞の増殖、成熟、移動、及び接着だけでなく、活性化及び分化に不可欠の役割を果たす。それはまた、炎症誘発性及び抗炎症性を有する。

合成受容体：
前記合成受容体は、ａ）１つ以上のリガンドに特異的に結合し、前記リガンドに結合した後に場合によっては前記合成受容体から遊離するよう構成された細胞外ドメインを含む少なくとも１つのドメインと、ｂ）Ｎｏｔｃｈ受容体に由来する膜貫通ドメインを含む少なくとも１つのドメインと、ｃ）前記合成受容体から遊離したときに１つ以上の機能活性を場合によっては起動させるように構成された細胞内ドメインを含む少なくとも１つのドメインとを、含む。

いくつかの実施形態では、細胞外ドメインが特定のリガンドに結合したとき、前記合成受容体は、タンパク質切断を起こして前記細胞外ドメインと前記細胞内ドメインの両方又はそのいずれかを遊離させ得る。前記細胞外結合ドメインは、同族リガンドに結合し続け、また、遊離しても１つ以上の機能活性を働かせ続け得る。機能活性としては、抗体依存性細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性又は酵素機能のうち少なくとも１つが挙げられる。前記活性は、タンパク質－タンパク質の相互作用の遮断又は誘発と、細胞外機能分子の分泌とのうちの少なくとも１つであり得る。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害とも言われる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性免疫防御によって免疫系の効果器細胞が標的細胞を活発に溶解させる、その細胞媒介性免疫防御の機構であり、その標的細胞は、膜表面抗原に特定の抗体が結合しているものである。それは、液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限及び抑制するように作用する機構の１つである。いくつかの実施形態では、前記細胞外機能分子は、サイトカイン又はケモカインの少なくとも１つであってもよい。

前記合成受容体の細胞内ドメインは、遊離した場合、１つ以上の細胞内活性又は細胞外活性を刺激又は抑制してもよい。

本開示の特定の態様では、前記細胞内ドメインは、細胞外活性を刺激又は抑制する分泌タンパク質であり得る。これらの細胞外活性は、シグナル伝達、輸送、接着、タンパク質－タンパク質相互作用の遮断、及び／又は安定性の少なくとも１つを含み、但し、それらに限定されるものではない。前記１つ以上の細胞内活性は、シグナル伝達、遺伝子発現、輸送、及び／又は安定性の少なくとも１つを含む。

細胞外ドメインは、抗体又はその断片を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、前記細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ分子であってもよい。

前記細胞内活性はまた、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の野生型Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも１つの分泌融合タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、前記ヒトＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つであってもよい。図３を参照すると、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる、導入遺伝子によってコードされたベタラセプト（Ｂｅｔａｌａｃｅｐｔ）が、ブタＣＤ８０／ＣＤ８６分子に結合することを実証するフローサイトメトリー分析をグラフが示す。

本開示の特定の態様では、前記合成受容体のＮｏｔｃｈ受容体サブドメインはヒトＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーであり得る。前記合成受容体の他の実施形態では、前記Ｎｏｔｃｈ受容体は、ハエ、虫、ブタ、ネズミ、又はヒトの少なくとも１つに由来するＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーである。

前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。いくつかの実施形態では、表１に開示されるように、前記受容体は、配列番号１に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでもよい。前記受容体はまた、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したマウスＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。いくつかの実施形態では、表３に開示されるように、前記受容体は、配列番号３に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでもよい。Ｎｏｔｃｈ受容体は、（図７に示す通り）ヒトＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのさらなるメンバーか、又は、配列は異なるがタンパク質切断機能性を保有する他の種に由来するＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーに、由来してもよい。図７は、細胞外ドメインが特定のリガンドに結合したときの、第１及び第２切断領域の部分的配列比較を示す。ハエ（ｄＮｏｔｃｈ）、虫（ＧＬＰ－１）、ブタ（ｐＮｏｔｃｈ１）、ネズミ（ｍＮｏｔｃｈ１）、及びヒト（ｈＮｏｔｃｈ１－４）のＮｏｔｃｈ受容体の配列が示されている。

いくつかの実施形態では、前記合成受容体はまた、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したジヌツキシマブに由来する一本鎖Ｆｖ分子を含み得る。これらの実施形態では、表２に開示されるように、前記受容体は、配列番号２に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

特定の他の実施形態では、前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトインターロイキン２分子をコードする導入遺伝子をさらに含む。これらの実施形態では、表４に開示されるように、前記導入遺伝子は、配列番号４に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

さらなる実施形態では、前記受容体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した改変一本鎖ヒトインターロイキン１２分子をコードする導入遺伝子を含む。これらの実施形態では、表５に開示されるように、前記導入遺伝子は、配列番号５に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

使用と治療の方法：
本明細書では、合成受容体を用いて標的細胞の活性を調節する方法も提供される。前記方法は、合成受容体を標的細胞上の受容体に接触させることと、細胞外結合ドメインが前記標的細胞に結合している間に前記合成受容体の切断を可能にすることと、細胞内ドメインを、その細胞内ドメインが遺伝子の発現を誘発するところである核の中に遊離させることとを、含んでもよい。

図１を参照すると、同族リガンドが細胞外結合ドメインに結合した後の第１タンパク質切断及び第２切断の可能性に関連して、本開示の合成受容体の模式図が提供されている。ここでは、いくつかの実施形態において、合成受容体の細胞外ドメインが標的細胞上の受容体に結合することが示されている。この結合は、前記合成受容体の切断を誘発してもよい。前記細胞外結合ドメインは、前記標的細胞に結合したままでもよい。細胞内の転写活性化ドメインは、細胞の細胞質の中に遊離してもよい。前記細胞内ドメインは次いで核の中に移動してもよく、そこで遺伝子の発現を誘発してもよく、その後遺伝子産物は細胞から分泌される。

本開示のいくつかの態様では、前記細胞外ドメインは抗体又はその断片であってもよい。特定の実施形態では、前記細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ分子であってもよい。

考えられる用途：
本願の合成受容体には、多くの用途が考えられる。例示であって限定するものではないが、前記合成受容体は、同種抗原及び異種抗原を認識し、免疫寛容応答を誘発することによって同種移植及び異種移植の患者に有用に働き得る。本開示の受容体はまた、腫瘍学における治療法として作用することも可能であり、腫瘍抗原を認識し、免疫原性応答（即ち、免疫活性化）を誘発する。本開示の受容体はまた、炎症誘発性又は免疫性の媒介物質を認識し、抗炎症性応答（即ち、免疫抑制）を誘発することによって自己免疫を調節する上でも有用であり得る。

実施例１：実証実験の設計
図２Ａ～２Ｅは、合成コンストラクトから正しい大きさの産生物を産生することを実証する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図２Ａは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子からなる合成受容体を示す。図２Ｂは、ユニツキシン（登録商標）の商標の下で販売されたもので、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したものであるジヌツキシマブに由来する一本鎖Ｆｖ分子からなる合成受容体を示す。図２Ｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる融合タンパク質であるベラタセプトを示す。図２Ｄは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトインターロイキン２を示す。図２Ｅは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した改変一本鎖ヒトインターロイキン１２分子を示す。

実施例２：抗ｈＣＤ３合成受容体
ここで図４を参照すると、ヒトＣＤ３に結合して、ベラタセプトの発現及び分泌を伴う応答をすることができる細胞外ドメインを持った合成受容体の測定の結果が示されている。ここで、抗ｈＣＤ３合成受容体と、ベラタセプトをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞を、ヒトジャーカットＴ細胞に４８時間接触させた。細胞からの上清を回収し、ベラタセプトの発現について分析した。前記合成受容体だけが、ヒトＴ細胞の存在下でベラタセプトの発現を誘発した。このことは、ＣＤ３とＣＤ８０／ＣＤ８６の遮断という２重の利点を有するものと考えられる。

実施例３：ｓｃＦＶジヌツキシマブ（ユニツキシン（登録商標）の商標の下で販売されるもの）がＦｃ－ＩｇＧ１と融合したもの
ジヌツキシマブ由来の一本鎖ＦｖをＩｇＧ１抗体のＦｃ部分と融合させて合成受容体を作成した。この合成受容体は、腫瘍細胞上のＧＤ２に結合し、ヒトＩＬ－２Ｆｃ又はヒトｓｃＩＬ－１２Ｆｃの発現及び分泌を伴う応答をする。抗ＧＤ２合成受容体と、ヒトＩＬ－２Ｆｃ又はヒトｓｃＩＬ－１２Ｆｃをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞を、ヒトＣＨＰ１３４細胞に４８時間接触させた。細胞からの上清を回収し、ヒトＩＬ－２Ｆｃ又はヒトｓｃＩＬ－１２Ｆｃの発現について分析した。図５Ａ及び図５Ｂはプロトコルの結果を示し、ＩＬ－２Ｆｃを図５Ａにグラフで示し、ｓｃＩＬ－１２Ｆｃを図５Ｂにグラフで示す。前記合成受容体だけが、ＧＤ２発現性ＣＨＰ－１３４細胞の存在下でヒトＩＬ２－Ｆｃ又はヒトｓｃＩＬ１２－Ｆｃの発現を誘発した。このことは、ＧＤ２の遮断と抗腫瘍サイトカインの産生という２重の利点を有するものと考えられる。

実施例４：ＣＴＬＬ－２増殖反応測定
ＣＴＬＬは、Ｃ５７ＢＬ／６ネズミ由来のＴ細胞のサブクローンである。この細胞は増殖のためにＩＬ－２を必要とし、馴化培地中でＩＬ－２の有無を測定するために使用され、従って、ＣＴＬＬ－２細胞の増殖を測定することによってＴ－細胞サイトカインの有無を確認するために使用することができる。本実施例では、抗ＧＤ２合成受容体と、ヒトＩＬ－２Ｆｃをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞由来の上清を、ヒトＣＨＰ－１３４細胞の存在下又は非存在下で共培養したものを、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定において４８時間試験した。測定の結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。図６Ａは、導入遺伝子によってコードされた精製改変ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質が、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定（ＲＦＵは相対蛍光単位を指す）において、未変性ヒトＩＬ２に類似のレベルで機能することをグラフで示す。図６Ｂは、ＣＴＬＬ－２増殖反応測定におけるＩＬ－２－Ｆｃ活性を示す。図６Ｂは、抗ＧＤ２合成受容体と、ヒトＩＬ２－Ｆｃをコードする応答性導入遺伝子とで改変したブタ大動脈内皮細胞を、ＧＤ２－発現性ＣＨＰ１３４細胞の存在下又は非存在下で４８時間培養した結果をグラフで示す。図６Ｂでは、ＣＨＰ－１３４（－）は、ＣＨＰ－１３４細胞非存在下での培養を指し、ＣＨＰ－１３４（＋）は、ＣＨＰ－１３４細胞存在下での培養を指す。「陰性」はＣＴＬＬ－２細胞単独を指し、「陽性」は、精製ヒトＩＬ２－Ｆｃタンパク質を加えたＣＴＬＬ－２細胞を指す。図６Ｂに示す通り、前記合成受容体だけが、ＧＤ２－発現性ヒトＣＨＰ－１３４細胞との共培養においてＩＬ２－Ｆｃの発現を誘発した。このことは、ＣＴＬＬ－２増殖を刺激することのできるＣＨＰ－１３４上清の能力によって示される通りである。

均等物：
本明細書で本技術は広く包括的に記載されている。その包括的開示に含まれるより狭い分類及び下位分類のいずれもまた、本技術の一部を形成する。これには、包括的分類から何らかの内容を除去する条件又は否定的限定を本技術の包括的記載が伴っている場合が含まれ、但し、除去した内容が本明細書中に具体的に記載されているか否かを問わない。

加えて、本技術の特徴又は態様がマーカッシュ群の条件で記載されている場合には、本技術もそれにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又は任意のサブグループの複数メンバーを条件として記載されていることを、当業者は認識するものとする。

本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照物は、各々が個別に参照により援用されるのと同程度にその全体を、参照により明示的に援用される。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先する。添付文書が参照により本明細書に援用される。

Claims

少なくとも３つのドメインを含むモジュラー合成受容体であって、
ａ）少なくとも１つのドメインが、１つ以上のリガンドに特異的に結合し、そして任意に前記リガンドに結合した後に前記合成受容体から遊離するよう構成された細胞外ドメインを含み、
ｂ）少なくとも１つのドメインが、Ｎｏｔｃｈ受容体に由来する膜貫通ドメインを含み、かつ
ｃ）少なくとも１つのドメインが、前記合成受容体から遊離したときに機能活性を任意に起動させるように構成される細胞内ドメインを含む、モジュラー合成受容体。
細胞外ドメインが特定のリガンドに結合したとき、前記合成受容体はタンパク質切断を起こして前記細胞外ドメイン及び前記細胞内ドメインのいずれか又は両方を遊離させる、請求項１に記載の合成受容体。
前記細胞外結合ドメインが、同族リガンドに結合し続け、遊離しても１つ以上の機能活性を働かせ続ける、請求項１に記載の合成受容体。
前記機能活性が、抗体依存性細胞傷害性、補体依存性細胞傷害性、又は酵素機能の少なくとも１つを含む、請求項３に記載の合成受容体。
前記活性が、タンパク質－タンパク質の相互作用の遮断若しくは誘発、又は細胞外機能分子の分泌の少なくとも１つを含む、請求項４に記載の合成受容体。
前記細胞外機能分子が、サイトカイン又はケモカインの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の合成受容体。
前記細胞内ドメインが、遊離した場合、１つ以上の細胞内活性を刺激又は抑制する、請求項１に記載の合成受容体。
前記細胞内ドメインが、遊離した場合、１つ以上の細胞外活性を刺激又は抑制する分泌タンパク質である、請求項１に記載の合成受容体。
前記細胞外活性が、シグナル伝達、輸送、接着、タンパク質－タンパク質相互作用の遮断、及び／又は安定性の少なくとも１つを含む、請求項８に記載の合成受容体。
前記１つ以上の細胞内活性が、シグナル伝達、遺伝子発現、輸送、及び／又は安定性の少なくとも１つを含む、請求項７に記載の合成受容体。
前記細胞外ドメインが、抗体又はその断片を含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記細胞外ドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ分子を含む、請求項１１に記載の合成受容体。
前記細胞内活性が、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の野生型Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも１つの分泌融合タンパク質を含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記ヒトＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４を含む、請求項１３に記載の合成受容体。
前記細胞内ドメイン活性が、ヒトインターロイキンの少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記細胞内活性が、ヒトインターロイキン２をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項７に記載の合成受容体。
前記細胞内活性が、ヒトインターロイキン１２をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項７に記載の合成受容体。
前記Ｎｏｔｃｈ受容体がヒトＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーである、請求項１に記載の合成受容体。
前記Ｎｏｔｃｈ受容体が、ハエ、虫、ブタ、ネズミ、又はヒトの少なくとも１つに由来するＮｏｔｃｈ受容体ファミリーのメンバーである、請求項１に記載の合成受容体。
前記受容体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＤ３特異的一本鎖Ｆｖ分子を含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記受容体が、配列番号１又は配列番号３に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２０に記載の合成受容体。
前記受容体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したジヌツキシマブに由来する一本鎖Ｆｖ分子を含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記受容体が、配列番号２に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の合成受容体。
前記受容体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインからなる融合タンパク質をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記受容体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトインターロイキン２分子をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記導入遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２５に記載の合成受容体。
前記受容体が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した改変一本鎖ヒトインターロイキン１２分子をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の合成受容体。
前記導入遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項２７に記載の合成受容体。
請求項１の合成受容体を用いて標的細胞の活性を調節する方法であって、前記合成受容体を標的細胞上の受容体に接触させることと、前記細胞外結合ドメインが前記標的細胞に結合している間に前記合成受容体の切断を可能にすることと、前記細胞内ドメインを、その細胞内ドメインが遺伝子の発現を誘発するところである核の中に遊離させることとを、含む方法。
前記細胞外ドメインが、抗体又はその断片を含む、請求項２９に記載の方法。
前記細胞外ドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した糖脂質ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ分子を含む、請求項２９に記載の方法。
前記細胞内活性が、ヒト免疫グロブリンの野生型Ｆｃ領域又は修飾Ｆｃ領域に融合したヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも１つの融合タンパク質を含む、請求項２９に記載の方法。
前記ヒト免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４の少なくとも１つを含む、請求項３２に記載の方法。
前記細胞内活性が、ヒトインターロイキンをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項２９に記載の方法。
前記細胞内活性が、ヒトインターロイキン２及びヒトインターロイキン１２の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項２９に記載の方法。
接触させることが、がんを患っている対象に前記合成受容体を投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
接触させることが、自己免疫障害を患っている対象に前記合成受容体を投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
接触させることが、同種移植又は異種移植の少なくとも１つを対象が受けたあとに、前記対象に前記合成受容体を投与することを含む、請求項２９に記載の方法。