JP2023508400A - 遺伝子発現を増強させる哺乳動物配列への標的組込み - Google Patents

Abstract

内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）の少なくとも一部を含む配列、または代替的に、細胞のゲノムの一部であるかもしくは一部であったＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴを含む配列の組込み部位内またはその近傍において、ゲノムに、外因性核酸配列、例えば、導入遺伝子が安定に組込まれた細胞、ならびにそのような細胞の作製法および使用法が本明細書において開示される。有利には、導入遺伝子発現産物の高レベルおよび／または安定な産生が達成され得る。導入遺伝子の組込みおよび発現は、細胞のＤＮＡ修復経路を調整することによって、例えば、導入遺伝子の組込み中にＤＮＡ修復経路の一部を形成するタンパク質をコードする遺伝子を一過的に発現させることによって、促進され得る。【選択図】図１

Description

哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質の生体技術的産生ならびに／または遺伝子療法および細胞療法などの治療的使用に非常に重要である。それぞれの細胞株の生成には、導入遺伝子を宿主ゲノムへうまく組込み、その細胞で発現させることが必要である。現在、細胞株開発のための主流な戦略は、ｉ）細胞の染色体への導入遺伝子のランダムな組込み、ｉｉ）導入遺伝子が組込まれた細胞の選択、およびｉｉｉ）最適な産生能力特徴を呈する特定の細胞の選択する、というものである。しかしながら、このアプローチは、組込まれる導入遺伝子コピーの数、ならびに導入遺伝子のゲノム環境によるエピジェネティックな作用によって制限され、多くの場合低く不安定な転写および／または高いクローン変動が引き起こされる。

一般に細胞株開発に付随するこれらの問題を克服するために、エピジェネティック調節剤を使用して、導入遺伝子を負の位置効果から保護することができる（Ｂｅｌｌ ａｎｄ Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ， １９９９）。これらのエピジェネティック調節剤としては、境界またはインシュレーターエレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、安定化および抗リプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、偏在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）、ならびにマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。これらのエピジェネティック調節剤はすべて、哺乳動物細胞株における組換えタンパク質産生（Zahn-Zabal et al., 2001、Kim et al., 2004）および遺伝子療法（Agarwal et al., 1998、Castilla et al., 1998）に使用されている。

本発明を例示するため、および具体的には本発明の実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書において使用される特許および特許出願を含む刊行物および他の材料は、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。便宜上、刊行物は、以下の文章において、添付の参考文献目録を参照して番号で、著者名および公開年によって、または特許／特許公開番号によってのいずれかで参照される。

とりわけ、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現を増加および安定化させるのに好適である、導入遺伝子の部位特異的標的組込みが必要とされている。導入遺伝子の部位特異的標的組込みはまた、有利なことに、同一なゲノム設定を有する細胞をもたらし、高いレベルの導入遺伝子発現を有するものを特定しそれを選択するために多くの細胞クローンをスクリーニングする必要性を排除するため、必要とされている。導入遺伝子の特定のサブクラスに好適な「ランディングパッド」と称される組込み部位もまた、必要とされている。これらの組込み部位は、有利なことに、単一の導入遺伝子または低いコピー数から、組込まれる細胞株の安定性および長期的な高い発現率を確保する。したがって、特に、効率的かつ信頼性の高い導入遺伝子発現のために、哺乳動物細胞における導入遺伝子の好適な挿入部位を特定および検証することが、当該技術分野において必要とされている。内在性レトロウイルス配列（ＥＲＶ）の発現が欠如しており、かつ／または産生される治療用タンパク質と一緒に、ウイルス粒子を細胞上清中に放出しないかもしくは放出の程度が低い、治療用タンパク質産生に使用される細胞クローンもまた、必要とされている。上述の必要性のうちの１つまたは複数、ならびに他の必要性が、本明細書において扱われる。

とりわけ、哺乳動物ゲノムの内在性レトロウイルス配列（ＥＲＶ）またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）の少なくとも一部の挿入配列内またはその近傍における、外因性核酸配列、例えば、導入遺伝子の安定な組込みが、開示される。ある特定の実施形態において、これは、高いレベルおよび／または安定した導入遺伝子発現産物の産生をもたらす。これは、ある特定の実施形態において、宿主細胞のＤＮＡ修復経路を調整することによって達成および／または促進される。

ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列の挿入部位を含む、少なくとも１つの遺伝子座と、
少なくとも１つの遺伝子座に組込まれた導入遺伝子とを含む、細胞のゲノムを含む、操作された細胞、好ましくは、哺乳動物細胞株のもの、例えば、操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む、操作されたＣＨＯ細胞、操作されたブタ細胞、または操作されたヒト細胞が、開示される。

導入遺伝子が組込まれる少なくとも１つの遺伝子座、および任意選択により、対応する対立遺伝子遺伝子座は、ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座であり得る。

導入遺伝子が組込まれる少なくとも１つの遺伝子座は、ＥＲＶ配列挿入遺伝子座またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座（例えば、ＥＲＶ組込み型またはＬＴＲ－ＲＴ組込み型ゲノム配列）の対立遺伝子野生型（例えば、ＥＲＶ欠損またはＬＴＲ－ＲＴ欠損）対応遺伝子座であり得る。導入遺伝子はまた、挿入遺伝子座における対応するＥＲＶ配列または対応するＬＴＲ－ＲＴ配列に隣接して組込まれてもよく、またはそれを置き換えてもよい。導入遺伝子はまた、好ましくは、細胞集団内の導入遺伝子含有細胞のうちの２０％よりも多く、３０％よりも多く、またはさらには４０％よりも多くの導入遺伝子含有細胞において、いずれか一方または両方の遺伝子座に、組込まれ得る。遺伝子座は、ホモ接合性であり得、例えば、配列番号１もしくは配列番号２、またはそれらの一部の少なくとも２つのコピーを含み得る。遺伝子座は、ヘテロ接合性であり得、例えば、配列番号１および配列番号２の両方、またはそれらの一部を含み得る。

特定の実施形態は、
細胞のゲノム内に、
内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む少なくとも１つの遺伝子座であって、
（ｉ）ａ）ＥＲＶ配列もしくはＬＴＲ－ＲＴ配列、またはｂ）挿入部位、および任意選択によりａ）の配列の一部、ならびに／または
（ｉｉ）（ｉ）の対立遺伝子野生型対応配列
を含む、少なくとも１つの遺伝子座と、
少なくとも１つの遺伝子座に組込まれた少なくとも１つの導入遺伝子発現産物をコードする少なくとも１つの導入遺伝子と
を含む、操作された細胞、好ましくは、哺乳動物細胞株のもの、例えば、操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む、操作されたＣＨＯ細胞、操作されたブタ細胞、または操作されたヒト細胞を、対象とする。細胞は、（ｉ）および（ｉｉ）を、異なる染色体、例えば、ＣＨＯ細胞の第１５染色体および第９染色体に含み得る。細胞は、（ｉ）および（ｉｉ）を含み得、少なくとも１つの導入遺伝子は、（ｉｉ）に組込まれ得、（ｉ）には組込まれなくてもよいか、または（ｉ）にも組込まれる場合がある。

特定の実施形態は、本明細書に記載される操作された細胞を含む、細胞集団を対象とする。少なくとも１つの導入遺伝子は、前記細胞集団内の細胞の（ｉ）および／または（ｉｉ）のうちの２０％よりも多く、３０％よりも多く、またはさらには４０％よりも多くの細胞に組込まれ得る。細胞集団の操作された細胞は、上述の（ｉ）および（ｉｉ）を含み得る。（ｉ）は、少なくとも、配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７（もしくは２９５２１～３９７４７）、または配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７（もしくは２９５２１～３９７４７）との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み得、（ｉｉ）は、少なくとも、配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０（もしくは２９５２０～３０５２０）、または配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０（もしくは２９５２０～３０５２０）との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。操作された細胞／細胞集団は、ある特定の好ましい実施形態において、内在性レトロウイルス配列（ＥＲＶ）の発現が欠如している。ある特定の好ましい実施形態において、細胞集団の培養上清に含まれる検出可能なウイルス粒子は、存在しない。

少なくとも１つの導入遺伝子発現産物は、目的の産物、例えば、目的のタンパク質であり得る。細胞／細胞集団は、任意選択により、単位時間当たりで、少なくとも１つの導入遺伝子が少なくとも１つの遺伝子座外でゲノムに組込まれている場合の目的の産物／タンパク質の量を、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、またはそれ以上上回る量（例えば、細胞当たり１日当たりのピコグラム数、μｇ／ｌまたはｍｇ／ｌ）で、目的の産物／タンパク質を発現し得る。

ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴは、Ｃ型内在性レトロウイルスエレメント（ＥＲＶ Ｃ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＸＭＲＶ（異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）、ＭＥＲＶ－Ｌ（Ｌ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するマウスＥＲＶ）、ＶＬ３０（ウイルス様３０）、ＩＡＰ（槽内Ａ型粒子）、ＭｕｓＤ（Ｍｕｓ型Ｄ関連レトロウイルス）、ＰＥＲＶ（ブタ内在性レトロウイルス）、ＫｏＲＶ（コアラレトロウイルス）、ｅｎＪＳＲＶ（ヤーグジークテヒツジレトロウイルス）、ＭａＬＲ（哺乳動物見かけのＬＴＲレトロトランスポゾン）、ＨＥＲＶ（ヒト内在性レトロウイルス）、例えば、ＨＥＲＶ－Ｅ（Ｅ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｈ（Ｈ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｋ（Ｋ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｌ（Ｌ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｗ（Ｗ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、およびこれらの組合せからなる群から選択され得る。

ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列は、ｇａｇ（群特異的抗原）遺伝子、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）遺伝子、ｅｎｖ（エンベロープ）遺伝子、ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）をコードする配列、ＳＰ１（スペーサーペプチド１）をコードする配列、ＳＰ２（スペーサーペプチド２）をコードする配列、またはｐｐ１２もしくはｐ６などのタンパク質をコードするさらなるドメイン、およびＥＲＶの長い末端反復配列（LTR）ならびにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＥＲＶ部分配列を含み得、導入遺伝子は、任意選択により、部分配列のうちの１つに組込まれている。

細胞には、表２の１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、１つまたは複数のベクターがトランスフェクトされ得、細胞の細胞質は、任意選択により、１つまたは複数のＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）の外因性化学的阻害剤および／または刺激剤、例えば、ＮＵ７４４１、オラパリブ、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤、Ｓｃｒ７、ＫＵ－００６０６４８、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５（セツキシマブ）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，ｌ－ａ］イソキノリン－４－オン）、バニリン、ウォルトマニン、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＯＫ－１０３５、ＣＯ１５、ＮＫ３１４、ＰＩ１０３塩酸塩、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ＮＨＥＪ阻害剤、ミリン、ミリンの誘導体、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤、およびこれらの組合せの群から選択される、ＭＭＥＪ阻害剤、ＨＲ阻害剤、例えば、ＲＩ－１およびＢＯ２、ＨＲ刺激剤、例えば、ＲＳ－１、ＮＨＥＪ刺激剤、例えば、ＩＰ６、ならびに上記の阻害剤および／または刺激剤のうちのいずれか１つの組合せを、さらに含み得る。操作された細胞のいずれにおいても、遺伝子座は、配列番号１および／または配列番号２から選択される配列との少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。導入遺伝子は、ランディングパッドであり得る。操作された細胞は、ある特定の好ましい実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト細胞もしくはブタ細胞である。

１つの実施形態は、細胞、好ましくは、哺乳動物細胞株のゲノムへの導入遺伝子の組込みのための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの導入遺伝子を、少なくとも１つの導入遺伝子を含むベクター、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターの一部として提供することであって、ベクターが、導入遺伝子を、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む、細胞の少なくとも１つの遺伝子座に組込む、提供すること、または
（ｂ）任意選択によりベクターの一部としての少なくとも１つの導入遺伝子と、少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼとを提供することであって、ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼが、好ましくは、少なくとも１つのベクターによってコードされ、ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼが、導入遺伝子を中に組込むために、二本鎖および／もしくは一本鎖切断を内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む細胞の少なくとも１つの遺伝子座に導入する、提供することと、さらに、任意選択により、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする少なくとも１つのベクターを提供することと、
任意選択により、細胞の少なくとも１つの第１のＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）を上方調整、特に、刺激し、任意選択により、細胞の少なくとも１つの第２のＤＲＰを下方調整、特に、刺激すること、またはその逆を同様に行うことと、
細胞に、少なくとも１つの導入遺伝子をトランスフェクトすることと、
任意選択により、遺伝子座に組込まれた導入遺伝子を含む、操作された細胞を単離することと、
を含む、方法を含む。

また、細胞／細胞株には、好ましくは１つまたは複数のさらなるベクターの一部として、表２の１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列がトランスフェクトされてもよく、かつ／または細胞／細胞株を、細胞のＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）に影響を及ぼす化学物質と接触させてもよい。また、細胞には、配列番号２５～２８、３８～５８、および／または５９、好ましくは、配列番号２５～２８を含みそれを発現する、１つまたは複数のさらなるベクターがトランスフェクトされてもよい。

少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼは、トランスポサーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、例えば、部位特異的リコンビナーゼ、ニッカーゼ、もしくはヌクレアーゼ、例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質、もしくはこれらの任意の組合せ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、制限酵素、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくは亜鉛フィンガーニッカーゼ、メガヌクレアーゼもしくはメガニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼもしくは転写活性化因子様エフェクターニッカーゼ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼ、ＤＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＤＮＡガイドニッカーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、ＢｕｒｒＨヌクレアーゼ、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ、それらの改変もしくはキメラバージョンもしくはバリアント、ならびにこれらの任意の組合せ、特に、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくは亜鉛フィンガーニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼもしくは転写活性化因子様エフェクターニッカーゼ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼであり得、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼは、任意選択により、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステム、制限酵素、およびこれらの組合せの一部である。リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ラムダインテグラーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ｘｂ１インテグラーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、またはＴＰ９０１－１リコンビナーゼであり得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドヌクレアーゼである。

本明細書において使用されるベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターであり得る。

第１および／または第２のＤＲＰは、切除、カノニカル相同性指向型修復（カノニカルＨＤＲ）、相同組換え（ＨＲ）、代替的相同性指向型修復（Ａｌｔ－ＨＤＲ）、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、切断に誘導される複製（ＢＩＲ）、代替的末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）、マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）、ＤＮＡ合成依存性マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）、カノニカル非相同末端結合修復（Ｃ－ＮＨＥＪ）、代替的非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）、損傷乗り越えＤＮＡ合成修復（ＴＬＳ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）、平滑末端結合、一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）、鎖間架橋修復（ＩＣＬ）、ファンコニ貧血（ＦＡ）経路、およびこれらの組合せからなる群から選択され得る。

特定の実施形態において、少なくとも１つの第１のＤＲＰが、相同組換え（ＨＲ）であり、少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路である；少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり得、少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路であり得る；少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり得、少なくとも１つの第２のＤＲＰが、相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復経路であり得る；または少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり得、少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の代替的なＤＮＡ修復経路であり得る。

ＤＲＰの妨害／変化は、その上方調整であってもよく、ａ）前記細胞におけるＤＲＰの少なくとも１つの成分の過剰発現を引き起こすことを含めて、それを発現させること、ｂ）前記細胞に、前記ＤＲＰの少なくとも１つの成分を導入すること、ならびに／またはｃ）前記細胞を、ＤＲＰの成分の少なくとも１つの刺激剤、例えば、化学的刺激剤、例えば、ＨＲ刺激剤、例えば、ＲＳ－１および／もしくはＮＨＥＪ刺激剤、例えば、ＩＰ６と接触させることの形態を取り得る。

その妨害／変化は、下方調整であってもよく、ａ）前記細胞を、ＤＲＰの成分の少なくとも１つの阻害剤、例えば、化学的阻害剤、例えば、ＮＵ７４４１、オラパリブ、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤、Ｓｃｒ７、ＫＵ－００６０６４８、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５（セツキシマブ）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，ｌ－ａ］イソキノリン－４－オン）、バニリン、ウォルトマニン、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＯＫ－１０３５、ＣＯ１５、ＮＫ３１４、ＰＩ１０３塩酸塩、およびこれらの組合せの群から選択される、ＮＨＥＪ阻害剤、ミリン、ミリンの誘導体、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤、およびこれらの組合せの群から選択される、ＭＭＥＪ阻害剤、ＨＲ阻害剤、例えば、ＲＩ－１および／またはＢＯ２と接触させること、
ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの阻害性核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡと接触させるか、もしくは前記細胞においてそれを発現させることによって、ＤＲＰの少なくとも１つの成分を、不活性化もしくは下方調節すること、ならびに／または
ｃ）前記細胞において、前記ＤＲＰを阻害するタンパク質を発現させること、またはそれらの任意の組合せ
の形態をとり得る。

１つの実施形態は、本明細書に開示される方法のうちの１つによって産生される、操作された細胞を含む。

別の実施形態は、少なくとも１つの導入遺伝子を細胞に導入するためのキットであって、
１つの容器に、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列、例えば、配列番号１および２の挿入部位を含む、少なくとも１つの遺伝子座、好ましくは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７、もしくは配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列、（ｉｉ）少なくとも、配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０、もしくは配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む遺伝子座、または配列番号１のヌクレオチド２９５２１～３９７４７もしくは配列番号１のヌクレオチド２９５２１～４２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を含み、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０、または配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、遺伝子座、例えば、挿入部位に組込まれたＥＲＶ配列もしくはＬＴＲ－ＲＴ配列、例えば、配列番号３、を標的とする、ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼをコードするベクター、ならびに任意選択により、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする、少なくとも１つのベクター、
任意選択により、別個の容器に、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする少なくとも１つのベクター、
別個の容器に、ＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）の少なくとも１つの刺激剤および／または阻害剤、ならびに／または
表２のＤＲＰタンパク質のうちの１つもしくは複数をコードする１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、１つまたは複数のベクター、
ならびに、少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼ、ならびに少なくとも１つの刺激剤および／もしくは阻害剤を使用して、細胞に導入遺伝子をトランスフェクトする方法の説明書
を含む、キットを含む。

図１は、組込み部位を有する遺伝子座の概略図であり、ＥＲＶ配列、ここでは、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ（配列番号３）を含む対立遺伝子、およびその１つの野生型対応対立遺伝子を含む、１つの組込み部位を示す。 図２Ａは、導入遺伝子組込みの標的をＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座、野生型対立遺伝子に定めるための二重ＣＲＩＳＰＲに基づくアプローチを示す。 図２Ｂは、導入遺伝子組込みの標的をＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子に定めるための二重ＣＲＩＳＰＲに基づくアプローチを示す。 図３Ａは、相同性配列を有さないベクターを使用した、Ａｌｔ－ＥＪ修復経路の刺激ありまたはなしでのＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子への標的組込みに使用されるベクターを示す。 図３Ｂは、相同性配列を有さないベクターを使用した、Ａｌｔ－ＥＪ修復経路の刺激ありまたはなしでの野生型対立遺伝子（図３Ｂ）への標的組込みに使用されるベクターを示す。 図４Ａは、相同性配列を有するベクターを使用した、ＨＲ修復経路の刺激ありまたはなしでのＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子への標的組込みに使用されるベクターを示す。 図４Ｂは、相同性配列を有するベクターを使用した、ＨＲ修復経路の刺激ありまたはなしでの野生型対立遺伝子への標的組込みに使用されるベクターを示す。 図５Ａは、野生型対立遺伝子のＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイの開発を示す。枠で囲んだ太い水平方向の線は、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイのアンプリコンの位置を示す。 図５Ｂは、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子のＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイの開発を示す。枠で囲んだ太い水平方向の線は、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイのアンプリコンの位置を示す。 図６は、ＤＰＲ刺激ありまたはなしのいずれかで、ＤＮＡ相同性配列ありまたはなしのいずれかでの、両方の対立遺伝子、野生型対立遺伝子、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子における導入遺伝子の組込み、またはランダムな遺伝子座における導入遺伝子の組込みを含む、クローンのパーセンテージを示す。 図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＥＲＶ遺伝子座における組込み事象の検出のための導入遺伝子プローブを使用した蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを示す。注目すべきことに、染色体再配列に起因して、１つの「ＥＲＶ遺伝子座」が、ＣＨＯ細胞の２つの異なる染色体（第１５染色体および第９染色体）において見出され得る。 図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＥＲＶ遺伝子座における組込み事象の検出のための導入遺伝子プローブを使用した蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを示す。注目すべきことに、染色体再配列に起因して、１つの「ＥＲＶ遺伝子座」が、ＣＨＯ細胞の２つの異なる染色体（第１５染色体および第９染色体）において見出され得る。 図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＥＲＶ遺伝子座における組込み事象の検出のための導入遺伝子プローブを使用した蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを示す。注目すべきことに、染色体再配列に起因して、１つの「ＥＲＶ遺伝子座」が、ＣＨＯ細胞の２つの異なる染色体（第１５染色体および第９染色体）において見出され得る。 図８Ａは、それぞれのタイプの細胞クローンのＧＦＰ蛍光測定を示す：ＤＮＡ相同性なし／Ａｌｔ－ＥＪ刺激（図６と比較）。 図８Ｂは、それぞれのタイプの細胞クローンのＧＦＰ蛍光測定を示す：ＤＮＡ相同性なし／Ａｌｔ－ＥＪ刺激なし（図６と比較）。 図８Ｃは、それぞれのタイプの細胞クローンのＧＦＰ蛍光測定を示す：ＤＮＡ相同性／ＨＲ刺激（図８Ｃ）（図６と比較）。 図８Ｄは、それぞれのタイプの細胞クローンのＧＦＰ蛍光測定を示す：ＤＮＡ相同性／ＨＲ刺激なし（図８Ｄ）（図６と比較）。 図９は、ＨＲ機構調整を、ＨＲ機構調整の不在と比較した、導入遺伝子ベクターにおいてＤＮＡ配列相同性を用いた標的組込みを使用して、クローンについて得られたＧＦＰ蛍光の結果の比較である。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、第１５染色体におけるＣ型ＥＲＶ １０９Ｆ配列（図１０Ａ）、および第９染色体におけるその対立遺伝子野生型対応遺伝子座（図１０Ｂ）の組込み部位の図である。ＣＲＩＳＰＲ切断部位は、上部パネルではＤＮＡ配列の下の三角形で、または図１０Ｃの下部では枠によって、示されている。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、第１５染色体におけるＣ型ＥＲＶ １０９Ｆ配列（図１０Ａ）、および第９染色体におけるその対立遺伝子野生型対応遺伝子座（図１０Ｂ）の組込み部位の図である。ＣＲＩＳＰＲ切断部位は、上部パネルではＤＮＡ配列の下の三角形で、または図１０Ｃの下部では枠によって、示されている。 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、第１５染色体におけるＣ型ＥＲＶ １０９Ｆ配列（図１０Ａ）、および第９染色体におけるその対立遺伝子野生型対応遺伝子座（図１０Ｂ）の組込み部位の図である。ＣＲＩＳＰＲ切断部位は、上部パネルではＤＮＡ配列の下の三角形で、または図１０Ｃの下部では枠によって、示されている。 図１１Ａは、トラスツズマブを産生するＣＨＯ細胞クローンを生成するためのトランスフェクションに使用したベクターを示す。図の左側において、一過的発現のためのコトランスフェクトされるベクターが、示されている。 図１１Ｂは、トラスツズマブを産生するＣＨＯ細胞クローンを生成するためのトランスフェクションに使用したベクターを示す。図において、免疫グロブリン（Ig）発現ベクター、すなわち、Ｔｒａｓ＿Ｈｃ（重鎖）およびＴｒａｓ＿Ｌｃ（軽鎖）配列を有するベクター、ならびにそれぞれ、第１５染色体および第９染色体におけるそれらの組込み部位が、示されている。 図１２Ａは、ＣＨＯ－Ｍ細胞のＥＲＶ１０９Ｆゲノム遺伝子座における導入遺伝子の標的組込み後に特徴付けした、４つのタイプのクローンの概略図である。導入遺伝子が、遺伝子座の両方の遺伝子座対立遺伝子に組込まれる（図において、「両方の遺伝子座への組込み」または単に「両方」と称される）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）。 図１２Ｂは、ＣＨＯ－Ｍ細胞のＥＲＶ１０９Ｆゲノム遺伝子座における導入遺伝子の標的組込み後に特徴付けした、４つのタイプのクローンの概略図である。導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれない（図において、「ＥＲＶ遺伝子座への組込み」または単に「ＥＲＶ」と称される）。 図１２Ｃは、ＣＨＯ－Ｍ細胞のＥＲＶ１０９Ｆゲノム遺伝子座における導入遺伝子の標的組込み後に特徴付けした、４つのタイプのクローンの概略図である。導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれない（図において、「ＥＲＶを有さない遺伝子座への組込み」または単に「ＥＲＶ欠損」と称される）。 図１２Ｄは、ＣＨＯ－Ｍ細胞のＥＲＶ１０９Ｆゲノム遺伝子座における導入遺伝子の標的組込み後に特徴付けした、４つのタイプのクローンの概略図である。導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれないが、宿主染色体にランダムに組込まれる。灰色の矢印は、クローン導入遺伝子ゲノム組込み部位の特徴付けに使用したＰＣＲプライマーを表す。 図１３Ａは、親ＣＨＯ－Ｍ細胞と対比した、導入遺伝子組込み後のＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ発現の減少倍数を示す。総ＲＮＡを、示されている細胞クローンから抽出し、ウイルスＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定し、デルタデルタＣｔ（サイクル閾値）計算方法を使用してプロセシングした。ハッチングは、図１２Ａ～１２Ｃに示されるハッチングに対応している。図は、低い力価の培養物を示す。 図１３Ｂは、親ＣＨＯ－Ｍ細胞と対比した、導入遺伝子組込み後のＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ発現の減少倍数を示す。総ＲＮＡを、示されている細胞クローンから抽出し、ウイルスＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定し、デルタデルタＣｔ（サイクル閾値）計算方法を使用してプロセシングした。ハッチングは、図１２Ａ～１２Ｃに示されるハッチングに対応している。図は、中等度の力価の培養物を示し。 図１３Ｃは、親ＣＨＯ－Ｍ細胞と対比した、導入遺伝子組込み後のＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ発現の減少倍数を示す。総ＲＮＡを、示されている細胞クローンから抽出し、ウイルスＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲによって判定し、デルタデルタＣｔ（サイクル閾値）計算方法を使用してプロセシングした。ハッチングは、図１２Ａ～１２Ｃに示されるハッチングに対応している。図は、高い力価の培養物を示す。 図１４Ａは、様々なＣＨＯ細胞クローンタイプの上清におけるトラスツズマブ産生レベルの判定を示す。示されるゲノム「遺伝子座」（対立遺伝子）に組込まれたＴｒａｓ発現コンストラクトを有するクローンタイプについて、ＥＬＩＳＡアッセイを、９６ウェルプレートにおいて３日間の培養物の無細胞上清に行った。パネルは、それぞれのクローンタイプについて、低いレベルの産生を示す培養物から得られたトラスツズマブ抗体の力価を示す。 図１４Ｂは、様々なＣＨＯ細胞クローンタイプの上清におけるトラスツズマブ産生レベルの判定を示す。示されるゲノム「遺伝子座」（対立遺伝子）に組込まれたＴｒａｓ発現コンストラクトを有するクローンタイプについて、ＥＬＩＳＡアッセイを、９６ウェルプレートにおいて３日間の培養物の無細胞上清に行った。パネルは、それぞれのクローンタイプについて、中等度のレベルの産生を示す培養物から得られたトラスツズマブ抗体の力価を示す。 図１４Ｃは、様々なＣＨＯ細胞クローンタイプの上清におけるトラスツズマブ産生レベルの判定を示す。示されるゲノム「遺伝子座」（対立遺伝子）に組込まれたＴｒａｓ発現コンストラクトを有するクローンタイプについて、ＥＬＩＳＡアッセイを、９６ウェルプレートにおいて３日間の培養物の無細胞上清に行った。パネルは、それぞれのクローンタイプについて高いレベルの産生を示す培養物から得られたトラスツズマブ抗体の力価を示す。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（PERKIN ELMER, Inc.）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（PERKIN ELMER, Inc.）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１５Ａ～Ｆは、２４ディープウェルプレートにおいて１０日間のフェッドバッチ培養（図１５Ａ（低い力価）、１５Ｂ（中等度の力価）、および１５Ｃ（高い力価）、ならび３０００００個の細胞／ｍｌの出発材料を有する３ｍｌの培養培地、または９６ウェルプレートで行った培養、図１５Ｄ（低い力価）、１５Ｅ（中等度の力価）、および１５Ｆ（高い力価）中の、クローンのトラスツズマブ産生能力の測定を提供する。Ｔｒａｓタンパク質の力価測定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（登録商標）（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ， Ｉｎｃ．）を使用して行った。ハッチングは、図１３Ａ～１３Ｃおよび１４Ａ～１４Ｃにおいて示されるハッチングの表記に対応する：それぞれのグラフにおいて、左から右へ：導入遺伝子が遺伝子座の両方の対立遺伝子に組込まれたもの（「両方」）（第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子および第９染色体の野生型対立遺伝子）；導入遺伝子が、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれるが、第９染色体の野生型対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ」）；導入遺伝子が、遺伝子座のいずれの対立遺伝子にも組込まれなかったが、宿主染色体にランダムに組込まれたもの、導入遺伝子が、第９染色体の野生型対立遺伝子に組込まれるが、第１５染色体のＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子には組込まれないもの（「ＥＲＶ欠損」）。 図１６Ａは、より大きな規模でそれらの産生能力を評価するための、図１５Ｃから得られた高度に産生する４つのクローンの、１４日間のＡｍｂｒ（登録商標）１５自動化マイクロスケールバイオリアクターシステム（SARTORIUS Stedim, Germany）における試験を示す。 図１６Ｂは、より大きな規模でそれらの産生能力を評価するための、図１５Ｆから得られた高度に産生する４つのクローンの、１４日間のＡｍｂｒ（登録商標）１５自動化マイクロスケールバイオリアクターシステム（SARTORIUS Stedim, Germany）における試験を示す。

導入遺伝子産生細胞および細胞株、ならびにそれらを作製および使用する方法が、本明細書において開示される。目的の導入遺伝子の産生のために、細胞のゲノム内の１つまたは複数のＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ遺伝子座が、導入遺伝子の組込みおよび発現の標的とされる。ウイルス粒子を形成することができるＥＲＶ配列は、ある特定の実施形態において、排除され得るか、または少なくとも、ウイルス粒子産生に関して非機能的にされるか、もしくはされたものであり得る。標的とされるＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ遺伝子座は、実際に、ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列を含む（または除去の前にＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含んでいた）１つの対立遺伝子を含み得るが、他方の対立遺伝子は、それを含まず、いわゆる野生型対立遺伝子であり、ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列を含んでいたことがない。導入遺伝子は、好ましくは、ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ遺伝子座において、ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列を含む対立遺伝子に、ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列を含まない対立遺伝子に、またはその両方に組込むために、細胞に導入され得る。

１つの例において、導入遺伝子は、抗生物質選択遺伝子、ならびに目的のタンパク質をコードする遺伝子、例えば、免疫グロブリンまたはヒトエリスロポエチンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をコードする。導入遺伝子は、導入遺伝子の上流のプロモーターおよび導入遺伝子の下流のＳＧＥ（Ｓｅｌｅｘｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むベクターに挿入される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ニッカーゼは、ＤＮＡの特定の配列を認識し、ＥＲＶ組込み部位の５ｂｐ上流かつＥＲＶ組込み部位の５ｂｐ対下流にあるＥＲＶ遺伝子座でそれを切断するように操作されている。選択されたＥＲＶは、遺伝子座で２つの対立遺伝子のうちの一方にしか組込まれず、他方の対立遺伝子は、ＥＲＶを含んだことがない、いわゆる野生型対立遺伝子である。ＣＨＯ－Ｋ１細胞に、ＴＡＬＥニッカーゼをコードする遺伝子を有するベクター、導入遺伝子を有するベクター、ならびにＭＲＥ１１の一過的発現のために設計されたベクターをトランスフェクトする。ＥＲＶ配列の対立遺伝子野生型対応遺伝子座／対立遺伝子への導入遺伝子の組込みを示すが、ＥＲＶを含む対立遺伝子への組込みを示さない細胞を、目的のタンパク質の産生に選択する。

別の例において、目的の導入遺伝子を産生するＣＨＯ細胞を作製するために、キットが使用される。キットのＣＨＯ細胞は、ウイルス粒子またはウイルス様粒子を産生する、任意の組込まれたＥＲＶ配列を除去するように操作されている。細胞はまた、ＥＲＶ配列の対立遺伝子野生型対応遺伝子座／対立遺伝子に、ランディングパッドを挿入するようにも操作されている。ランディングパッドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。キットはまた、ランディングパッドにおける配列のニッカーゼをコードするベクター、ならびに前記少なくとも１つのニッカーゼをランディングパッドにガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする少なくとも１つのベクターを含む。キットはまた、ＣＩＲＢＰの一過的発現のために設計されたベクター、ならびに目的の導入遺伝子を組込むことができるベクターも含む。単一ドメイン抗体である目的の導入遺伝子を組込んだ後、すべてのベクターを、操作されたＣＨＯ細胞にコトランスフェクトする。ＧＦＰを発現しないＣＨＯ細胞が、選択される。ＲＡＤ５１刺激剤であるＲＳ－１の発現ベクターもまた、キットの一部であり、コトランスフェクションの際に、相同組換え（ＨＲ）を刺激するために加えられる。

本発明による細胞／細胞集団（後者は、細胞集団内の細胞の同種性質を示す細胞株の細胞を指して使用されることが多い）は、細胞培養条件下において維持することができる、
真核生物、好ましくは、哺乳動物の細胞／細胞集団、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物細胞である。このタイプの細胞の非限定的な例は、ヒト細胞、例えば、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞を含むマウス骨髄腫細胞、ブタ細胞、例えば、ＬＬＣＰＫ（ブタ腎臓上皮）細胞である。ＣＨＯ細胞の改変されたバージョンとしては、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１、およびＣＨＯ ｐｒｏ－３が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、ＳＵＲＥ ＣＨＯ－Ｍ細胞（商標）株（ＳＥＬＥＸＩＳ ＳＡ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が、使用される。

細胞のゲノムの内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位は、（ｉ）ａ）ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列、すなわち、本明細書において組込まれたＥＲＶ／ＬＴＲ－ＲＴ配列とも称される、細胞のゲノムに組込まれたＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含み、（ｉ）ｂ）ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列の完全もしくは部分的な除去の前にＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含んでいたか、または（ｉｉ）本明細書においてＥＲＶ欠損と称されることがある（ｉ）の対立遺伝子野生型対応遺伝子座である、１００個以下のヌクレオチド、好ましくは９０個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下のヌクレオチドの長さを有する核酸配列である。（ｉ）ａ）およびｂ）は、本明細書において、「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座／対立遺伝子」、または「ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ挿入遺伝子座／対立遺伝子」と称され、（ｉｉ）は、本明細書において、「ＥＲＶ配列挿入遺伝子座／対立遺伝子の対立遺伝子野生型対応遺伝子座／対立遺伝子」または「ＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座／対立遺伝子の対立遺伝子野生型対応遺伝子座／対立遺伝子」または単純に上記の「対立遺伝子野生型（ｗｔ）対応配列」と称される。当業者には容易に理解されるように、
－ １つの対立遺伝子が、
（ｉ）ａ）ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含むか、または
（ｉ）ｂ）ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列の完全もしくは部分的な除去の前に、ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含んでいた、かつ／または
（ｉｉ）（ｉ）の対立遺伝子野生型対応物である、
遺伝子座が存在するであろう。

１つの遺伝子座の少なくとも２つの異なる対立遺伝子、例えば、（ｉ）ａ）および（ｉｉ）、または（ｉ）ｂ）および（ｉｉ）を組み合わせた細胞は、本明細書において、その遺伝子座に関してヘテロ接合性であると称されることがある。

（ｉ）ａ）および（ｉｉ）を組み合わせた細胞は、単一コピーＥＲＶ配列に関してヘミ接合性であると称される。

１つの遺伝子座において２つの同一の対立遺伝子、例えば、（ｉ）ａ）および（ｉ）ａ）を有する細胞は、その遺伝子座に関してホモ接合性であると称される。

－ １つの対立遺伝子および対応する対立遺伝子遺伝子座、したがって両方の対立遺伝子が、（ｉ）ａ）ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含むか、または（ｉ）ｂ）ＥＲＶ ＬＴＲ－ＲＴ配列の完全もしくは部分的な除去の前にＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を含んでおり、
－ １つの対立遺伝子および対応する対立遺伝子遺伝子座、したがって両方の対立遺伝子が、（ｉｉ）ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座の対立遺伝子野生型対応遺伝子座である、細胞もまた、本発明の範囲内である。

ＥＲＶ配列のそのような挿入部位の１つの非限定的な例は、配列番号１、２に含まれ、配列番号４の３’末端および配列番号５の５’末端にある。ＥＲＶ配列は、配列番号３に示される。

組込み部位の対応する１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個、５個、４個、３個、２個のヌクレオチドを含む、（ｉ）の対立遺伝子野生型対応遺伝子座は、しかしながら、現在または過去のＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列の組込みの証拠はない。配列番号１に対するそのような対立遺伝子対応の非限定的な例は、配列番号２であり、挿入部位は、ヌクレオチド３００２０周辺のヌクレオチドである。配列番号１は、「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座」であり、一方で、配列番号２は、対応する「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座の対立遺伝子野生型対応遺伝子座」である。

遺伝子座は、本文脈において、一般に、最大でゲノムの６００００個のヌクレオチド（図５ＡおよびＢを参照されたい）であるが、１０００個以上、９００個以上、８００個以上、７００個以上、または６００個以上のヌクレオチドを有する特定のゲノム配列が位置している、真核生物細胞の染色体上の位置である。しかしながら、当業者には公知のように、例えば、ヒトゲノムにおいて、６１２～４７６７７４７個の塩基対の長さを有する遺伝子座を、特定することができる（Taher and Ovcharenko, 2009）。対立遺伝子は、遺伝子座の特定の形態であり、その特定のヌクレオチド配列によって他の形態と区別される。細胞培養条件下において維持することができ、導入遺伝子産物の産生に使用することができる多くの細胞である、強力なゲノム再配列に供される細胞において、そのような遺伝子座は、このゲノム再配列に起因して、異なる染色体上に見出され得る。一般に、遺伝子座を定義する１０００～６００００個のヌクレオチドから構成されるゲノム配列を共有するこれらの構成を捕捉するために、そのような遺伝子座の異なる対立遺伝子は、例えば、本明細書において他の箇所で考察されるように、「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座の対立遺伝子野生型対応遺伝子座」および「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座」と称され得る。そのような遺伝子座の例は、ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆの挿入部位を有する遺伝子座である。この遺伝子座は、再配列に起因して、第１５染色体および第９染色体に存在する（図７Ａ～７Ｃを参照されたい）。第１５染色体において、ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆ配列は、ゲノムに組込まれるが、第７染色体には、「対立遺伝子野生型対応遺伝子座」が位置している。これが、実際に２つの染色体に存在する１つの遺伝子座であるという事実は、挿入部位の５’および／または３’の対応する周囲の配列から、例えば、ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆについては、例えば、配列番号１および配列番号２、例えば、配列番号１のヌクレオチド１～３００２０および配列番号２のヌクレオチド１～３００２０から、推測することができる。したがって、複数染色体の遺伝子座は、高い配列同一性、例えば、ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆ挿入部位の上流の配列（配列番号１のヌクレオチド１～３００２０および配列番号２のヌクレオチド１～３００２０）について、しばしば１００％の配列同一性を有する。しかしながら、配列同一性を、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、または９５％に低下させるわずかなミスマッチが、可能である。また、ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入部位の周辺に、欠失が存在する場合がある。

内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む遺伝子座は、一般に、最大６００００個、５００００個、４００００個、３００００個であるが、しかしながら、一般には２００００個未満かまたは１００００個未満のヌクレオチド、ある特定の事例では、９０００個未満、８０００個未満、７０００個未満、６０００個未満、５０００個未満、４０００個未満、３０００個未満、２０００個未満のヌクレオチドの配列によって特定可能であるか、もしくはそのような配列であるか、または約９００個、８００個、７００個のヌクレオチドを含め、１０００～６００個のヌクレオチドの配列によって特定可能であるか、もしくはそのような配列である。上述のように、１つのそのような遺伝子座は、配列番号１に示されており、その対応する対立遺伝子野生型対応遺伝子座は、配列番号２に示されている。当業者には理解されるように、例えば、導入遺伝子の組込みが、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列（例えば、配列番号３を参照されたい）もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）の配列の任意の部分内で、またはＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列に隣接する遺伝子座の染色体配列（ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ隣接配列）内で生じ得るか、または遺伝子座の完全もしくは部分的に欠失したＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列またはＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ隣接配列（例えば、配列番号４および／もしくは５を参照されたい）を置き換え得ることは、本発明の範囲内である。ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列の挿入部位を含む好ましい遺伝子座は、ＥＲＶ配列が、完全なｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子が好ましいが、その少なくとも一部、および／または少なくとも１つの、好ましくは２つのＬＴＲ、もっとも好ましくは、ＥＲＶのこれらの部分配列のすべて、またはＬＴＲ－ＲＴのそれぞれの部分配列を含む、遺伝子座である。ある特定の実施形態において、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含むさらにより好ましい遺伝子座は、任意のＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列が欠損した、対応する対立遺伝子野生型対応遺伝子座である。

当業者には理解されるように、配列番号１～５に示されるもの以外のＥＲＶ配列、ならびにＬＴＲ－ＲＴ配列およびそれらのそれぞれの遺伝子座もまた、本発明の範囲内である。そのようなＥＲＶ配列のいくつかの非限定的な例は、表１において、配列番号１２～２４として列挙されている。

示されるように、ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列を含む遺伝子座およびその挿入部位は、挿入部位を含むが、ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列を含む場合も含まない場合もある、対立遺伝子対応遺伝子座を有する。さらに上述のように、ある特定の実施形態において、遺伝子座のいずれも、ＥＲＶ配列もＬＴＲ－ＲＴ配列も有さない場合がある：細胞は、ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列またはそれらの一部、ならびにある特定の実施形態においては、遺伝子座の一部、すなわち、ＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ挿入部位／そこに挿入されるＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列に隣接する配列を除去するように操作されていてもよく、または操作されてもよい。細胞は、導入遺伝子の組込みの時点において、そのように操作されてもよく、または代替的には、導入遺伝子は、ＥＲＶ配列もしくはＬＴＲ－ＲＴ配列の一部を除去もしくは変化させるようにすでに操作されている細胞に組込まれてもよい。それぞれの変化および結果として得られる細胞は、例えば、米国特許出願第６２／７８４，５６６号および米国指定の国際特許出願公開第２０２０／１３６１４９号に開示されており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。

ＥＲＶ配列／ＬＴＲ－ＲＴ配列に関するヘミ接合性とは、二倍体細胞の特定の遺伝子座において所与のＥＲＶ配列／ＬＴＲ－ＲＴ配列のコピーが１つしかないという事実を指す。これは、「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座」および「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座の対立遺伝子野生型対応遺伝子座」が存在することを意味する。ＥＲＶ配列／ＬＴＲ－ＲＴ配列に関するホモ接合性とは、遺伝子座の対立遺伝子が、対応しており、二倍体細胞の特定の遺伝子座において、両方が「ＥＲＶ配列またはＬＴＲ－ＲＴ配列挿入遺伝子座」を有するか、または両方が「対立遺伝子野生型対応物」であることを意味する。

導入遺伝子は、ＥＲＶ配列／ＬＴＲ－ＲＴ配列に関してヘミ接合性またはホモ接合性である遺伝子座に組込まれ得る。

哺乳動物ＬＴＲ－レトロトランスポゾン配列またはＭａＬＲ配列とも称されるＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列は、２つの酵素をコードする領域に隣接する少なくとも２つのＬＴＲ配列を含む：少なくとも、少なくとも２つの酵素、インテグラーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）に関して翻訳され得る、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子がある。ＥＲＶとは対照的に、ＬＴＲ－ＲＴ配列は、エンベロープタンパク質（ＥＮＶ）をコードするｅｎｖ遺伝子を含有することはない（Havecker et al., 2004）。

内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列は、細胞のゲノムへのレトロウイルス組込みの残留物を構成し、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部、ならびに／または少なくとも１つ、好ましくは２つのＬＴＲを含む。ＥＲＶ配列を構成する機能的単位またはその一部はまた、ＥＲＶ部分配列とも称される。したがって、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ＬＴＲは、ＥＲＶ部分配列と考えられる。好ましい実施形態において、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｅｎｖ遺伝子のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つは、それぞれのタンパク質を発現する。ＥＲＶ選択のさらにより好ましい実施形態において、ＥＲＶ配列は、ＶＰ（ウイルス粒子）またはＶＬＰ（ウイルス様粒子）を放出する。完全な内在性レトロウイルスのサイズは、平均で６～１２ｋｂであり、これは、常に同じ順序で生じるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。コーディング配列には、２つのＬＴＲ（長い末端反復配列）が隣接する。ほとんどのＥＲＶは、多数の不活性化突然変異を有するため、欠損している。加えて、それらは、エピジェネティックサイレンシング作用によって不活性化され得る（すなわち、転写されなくなり得る）。しかしながら、一部のＥＲＶは、依然として、そのゲノムにオープンリーディングフレームを有し、かつ／またはそれらは、転写的に活性であり得る。哺乳動物のＥＲＶは、強力な類似性を有し、槽内Ａ型粒子（ＩＡＰまたはＩＡＰＳ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、コアラ伝染病ウイルス（ＫｏＲＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）を含む、ガンマレトロウイルスおよびベータレトロウイルスの属を起源とし得る。ＥＲＶは、ゲノム内に維持され、それらがゲノム内に組込まれた細胞にとって、遺伝的多様性の供給源および他のウイルス病原体に対する保護を提供することを含め、ある特定の利点を有し得る。しかしながら、それらは、本明細書の他の箇所に記載の導入遺伝子、すなわち、タンパク質、本明細書において他の箇所で記載される発現の状況では、特に、がん、細胞ストレス、および／またはエピジェネティック改変に起因するＥＲＶ覚醒の結果として、感染性を有し、リスクを伴う可能性がある。

レトロウイルスゲノム内にコードされる３つの主要なタンパク質は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖである。ｇａｇ遺伝子によってコードされるＧａｇ（抗原群）は、レトロウイルスコアを決定する核タンパク質コア粒子を含む、マトリックスおよび他のコアタンパク質へとプロセシングされる、ポリタンパク質である。Ｐｏｌは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされる逆転写酵素であり、ＲＮａｓｅ Ｈおよびインテグラーゼ機能を有する。その活性は、ウイルスの二本鎖ＤＮＡ前組込み形態をもたらし、インテグラーゼ機能によって宿主ゲノムへの組込み、およびＲＮａｓｅ機能によって宿主のゲノムへ組込まれた後の逆転写をもたらす。Ｅｎｖは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされるエンベロープタンパク質であり、ウイルスの脂質層に存在し、ウイルスの親和性を決定する

ｇａｇ遺伝子は、Ｇａｇ前駆体タンパク質を生じ、これは、スプライシングされていないウイルスｍＲＮＡから発現される。Ｇａｇ前駆体タンパク質は、ウイルスの成熟プロセス中に、ウイルスによりコードされるプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によって、一般に、ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）、およびさらなるタンパク質ドメイン（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）におけるｐｐ１２またはＨＩＶにおけるｐ６）と表記される４つの小さなタンパク質へと切断される。

ウイルスプロテアーゼ（Ｐｒｏ）、インテグラーゼ（ＩＮ）、ＲＮａｓｅ Ｈ、および逆転写酵素（ＲＴ）は、Ｇａｇ－Ｐｏｌ融合タンパク質の状況内で発現される。Ｇａｇ－Ｐｏｌ前駆体は、一般に、リボソームフレームシフト事象によって生成されるが、これは、特定のシス作用ＲＮＡモチーフ（Ｇａｇ ＲＮＡの遠位領域においてヘプタヌクレオチド配列に短いステムループが続いているもの）によってトリガーされる。リボソームがこのモチーフに遭遇すると、それらは、翻訳を中断することなく、時間のおよそ５％をｐｏｌリーディングフレームにシフトさせる。リボソームフレームシフトの頻度により、ＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体がおよそ２０：１の比で産生される理由が説明される。

ウイルス成熟の際、ウイルスによりコードされるプロテアーゼは、ＰｏｌポリペプチドをＧａｇから切断し、さらにそれを消化して、プロテアーゼ、ＲＴ、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびインテグラーゼ活性を分離させる。これらの切断は、すべてが効率的に生じるわけではなく、例えば、ＲＴタンパク質のうちのおよそ５０％が、単一のポリペプチド（ｐ６５）としてＲＮａｓｅ Ｈに連結されたままとなる（Hope & Trono, 2000）。

ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素をコードする。逆転写のプロセス中に、ポリメラーゼは、ビリオンに存在する一本鎖ゲノムＲＮＡの二量体の二本鎖ＤＮＡコピーを作製する。ＲＮａｓｅ Ｈは、もともとのＲＮＡ鋳型を第１のＤＮＡ鎖から除去し、ＤＮＡの相補鎖の合成を可能にする。ポリメラーゼの主要な機能的種は、ヘテロ二量体である。ｐｏｌ遺伝子産物のすべては、放出されるビリオンのキャプシド内に見出すことができる。

ＩＮタンパク質は、感染した細胞のゲノムＤＮＡへのプロウイルスＤＮＡの挿入を媒介する。このプロセスは、ＩＮの３つの異なる機能によって媒介される。

Ｅｎｖタンパク質は、単一スプライシングｍＲＮＡから発現される。まず、小胞体において合成され、Ｅｎｖは、ゴルジ複合体まで遊走し、そこでグリコシル化を受ける。Ｅｎｖグリコシル化は、一般に、感染能力に必要とされる。細胞プロテアーゼは、タンパク質を、膜貫通ドメインおよび表面ドメインに切断する。

ゲノムのいくつかのＥＲＶから発現されるウイルスゲノムＲＮＡは、ＶＰの形態で細胞から放出され得る。他の発現されるＥＲＶは、ＶＬＰ、例えば、ＲＶＬＰ（レトロウイルス様粒子）の形成を引き起こし得るが、ＶＰの形成は引き起こさず、したがって、ウイルスゲノムＲＮＡを含む粒子の放出をもたらさない可能性がある。しかしながら、一般に、放出されるものは、感染する可能性が高い。

本出願の文脈において、ＶＰは、ウイルスゲノムの少なくとも一部を含むウイルス粒子を指す。いくつかの事例において、ＶＰは、全長ウイルスゲノムＲＮＡを含み得、したがって、機能性ＶＰであり得る。本発明の文脈において使用されるＶＬＰは、ＶＰであると見られるが、ウイルスゲノムの任意の部分が欠如している、粒子である。

本発明によるベクターは、それに連結されている他の核酸を輸送することができる、核酸分子である。プラスミドは、例えば、ベクターの１つのタイプである。ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、別のタイプのベクターである。

本発明のある特定の態様において、ベクターは、外因性核酸を細胞または細胞集団に輸送するために使用される。

本明細書に使用される場合、外因性核酸は、参照された核酸が、宿主細胞に導入されることを意味する。外因性核酸の供給源は、例えば、例として、目的のタンパク質を発現する、同種または異種核酸であり得る。それに対応して、内在性という用語は、宿主細胞にすでに存在している核酸分子を指す。異種核酸という用語は、宿主細胞の種ではない供給源に由来する核酸分子を指し、一方で同種核酸は、宿主細胞と同じ種に由来する核酸分子を指す。したがって、本発明による外因性核酸は、異種および／または同種核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。

例えば、ヒトインターフェロン遺伝子のｃＤＮＡは、ＣＨＯ細胞に導入される場合、異種外因性核酸であるが、ＨｅＬａ細胞においては同種外因性核酸である。外因性遺伝子は、細胞に導入されるときに、ベクターの一部であってもよく、または追加の内在性もしくは外因性核酸配列とともに導入されてもよい。

導入遺伝子は、「導入遺伝子発現産物」とも称される目的のタンパク質などの産物をコードする外因性核酸である。ある特定の実施形態において、１つを上回る導入遺伝子が、目的の産物、具体的には、目的のタンパク質、例えば、抗体を産生する細胞株を生成するために必要とされ、これには、抗体、すなわち目的のタンパク質を産生するための軽鎖をコードする導入遺伝子および重鎖をコードする導入遺伝子、ならびに安定にトランスフェクトされた細胞を選択するために使用される抗生物質選択導入遺伝子が必要であり得る。導入遺伝子発現産物はまた、単なるマーカータンパク質、例えば、抗生物質選択遺伝子、高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはβ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）であってもよい。この場合には、導入遺伝子は、特定の遺伝子プロモーターの制御下となるように組込まれ得、完全もしくは部分的に除去されたＥＲＶもしくはＬＴＲ－ＲＴ配列を置き換えてもよいか、または対立遺伝子野生型対応物に組込まれてもよい。そのような導入遺伝子は、別の導入遺伝子、例えば、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子、または別の導入遺伝子発現産物と一緒になって目的のタンパク質、例えば、治療用タンパク質をもたらす導入遺伝子発現産物の組込みのためのランディングパッドとしての機能を果たし得る。例えば、導入遺伝子発現産物は、抗体の軽鎖または重鎖であってもよいが、しかしながら、「目的のタンパク質」は、４つの鎖から構成される免疫グロブリンである。しかしながら、目的の産物、例えば、目的のタンパク質は、一般に、シグナル伝達タンパク質、例えば、α－ＩＦＮ、β－ＩＦＮ、γ－ＩＦＮ、τ－ＩＦＮ、ω－ＩＦＮ、サイトカイン、例えば、エリスロポエチン、または抗体、例えば、モノクローナル抗体、融合タンパク質などだけでなく、調節性ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたはｍＲＮＡなどであるがこれらに限定されない、タンパク質（融合タンパク質を含む）である。「目的のタンパク質」は、細胞上清から回収され、細胞当たり１日当たりのピコグラム数、μｇ／ｌまたはｍｇ／ｌで測定される、治療用タンパク質である。

本明細書において使用されるトランスフェクションとは、ネイキッド核酸もしくは精製された核酸、または特定の核酸を有するベクターを含む、核酸の、細胞、具体的には、哺乳動物細胞を含む真核生物細胞への導入を指す。任意の公知のトランスフェクション方法を、本発明の文脈において利用することができる。これらの方法のうちのいくつかは、核酸を細胞内に入れるために、生体膜の透過性を増強させることを含む。顕著な例は、エレクトロポレーションまたはマイクロポレーションである。方法は、それ自体で使用してもよく、または宿主細胞への核酸の流動率を選択的に増強させるために、超音波、電磁、および熱エネルギー、化学的透過増強剤、圧力などによって補助してもよい。リポフェクションまたはウイルス（形質導入とも称される）を含む担体に基づくトランスフェクション、および化学物質に基づくトランスフェクションなど、他のトランスフェクション方法もまた、本発明の範囲内である。しかしながら、核酸を細胞内に入れる任意の方法を、使用することができる。一過的にトランスフェクトされた細胞は、短い期間、トランスフェクトされたＲＮＡ／ＤＮＡを保持／発現し、それを継代することはないであろう。安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされたＤＮＡを継続的に発現し、それを継代することになり、外因性核酸は、細胞のゲノムに組込まれている。

「ＤＮＡ修復経路」または「ＤＲＰ」は、本明細書において使用される場合、ＤＮＡ損傷、例えば、一本鎖または二本鎖切断の検出に応答して、細胞がそのゲノム完全性およびその機能を維持することを可能にする細胞機構を指す。ＤＮＡ損傷のタイプおよび長さ、または前記損傷の時点における細胞の細胞周期などの複数のパラメーターに応じて、ＤＲＰは、切除、カノニカル相同性指向型修復（カノニカルＨＤＲ）、相同組換え（ＨＲ）、代替的相同性指向型修復（Ａｌｔ－ＨＤＲ）、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、切断に誘導される複製（ＢＩＲ）、代替的末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）、マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）、ＤＮＡ合成依存性マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、例えば、カノニカル非相同末端結合（Ｃ－ＮＨＥＪ）修復、代替的非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）経路、損傷乗り越えＤＮＡ合成（ＴＬＳ）修復、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）、平滑末端結合、一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）、鎖間架橋修復（ＩＣＬ）、ファンコニ貧血経路（ＦＡ）を指すが、これらに限定されない。本発明のＤＲＰは、しかしながら、好ましくは、上述の群から選択される。

ＤＮＡ修復経路は、阻害され得るか、またはむしろ優先／増強されてもよい。そのような経路に関与する遺伝子、ｍＲＮＡ、または対応するタンパク質は、経路を阻害または優先／増強するように調整することができる（表２の例を参照されたい）。

ＮＨＥＪ阻害剤（＝ＰＡＲＰ１、Ｋｕ７０／８０、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４／ＸＬＦ、リガーゼＩＶ、リガーゼＩＩＩ、ＸＲＣＣｌ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＰＮＫの阻害剤）の例としては、例示的な阻害剤をいくつか挙げると、限定することなく、ＮＵ７４４１（Leahy et al., Identification of a highly potent and selective DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) inhibitor (NU7441) by screening of chromenone libraries. (Leahy et al., (2004)、ＮＵ７０２６（Willmore et al., 2004）、オラパリブ、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤、Ｓｃｒ７（Maruyama et al., 2015））、ＫＵ－００６０６４８（Robert et al., 2015）、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５（セツキシマブ）（Dittmann et al., 2005）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，ｌ－ａ］イソキノリン－４－オン）、バニリン、ウォルトマニン、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＯＫ－１０３５、ＣＯ１５、ＮＫ３１４、ＰＩ１０３塩酸塩が挙げられる。

ＭＭＥＪ阻害剤としては、ＭＲＥ１１阻害剤、例えば、ミリンおよび誘導体（Shibata et al, 2014）、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤（Sfeir and Symington, 2015）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＨＲ阻害剤の例としては、ＲＩ－１およびＢＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。

ＨＲ刺激剤の例としては、ＲＳ－１（ＲＡＤ５１刺激剤）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＮＨＥＪ刺激剤としては、ＩＰ６（イノシトールヘキサキスホスフェート、ＤＮＡ－ＰＫ増強剤、Hanakahi 2000、Ma 2002、Cheung 2008）が挙げられるが、これに限定されない。

ＤＲＰの下方調整は、細胞または細胞集団におけるそのようなＤＲＰの活性を低減させる。ＤＲＰの下方調整は、下方調整なしでの修復活性（以降、「活性」）の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る。下方調整は、前記細胞または細胞集団を、１つまたは複数の阻害剤、例えば、ＤＲＰ／その成分の化学的阻害剤と接触させること、ＤＲＰ／その成分を不活性化すること、ＤＲＰ／その成分を下方調節すること（例えば、前記細胞もしくは細胞集団において、１つもしくは複数の阻害性核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはこれらの任意の組合せを接触させるか、もしくは前記細胞もしくは細胞集団においてそれを発現させることによって）、ならびに／または前記ＤＲＰ／その成分の１つまたは複数の遺伝子を突然変異させることなどであるが、これらに限定されない、多数の手段で達成することができる。

好ましい実施形態において、非産生性であるかまたは別のＤＲＰと競合するかのいずれかであり、したがって、競合経路または非産生性経路と称される、ＤＲＰが、下方調整される。

例えば、ＮＨＥＪ経路は、例えば、ＭＭＥＪおよび関連機構によって、外因性ＤＮＡの産生性組込みを優先するように阻害され得る。本発明の文脈において、任意の活性なＤＲＰは、細胞において別の活性なＤＲＰと競合し得、したがって、競合的ＤＲ経路である。本発明の文脈における非産生性ＤＲＰは、細胞ゲノムへの外因性ＤＮＡの組込みを媒介しないか、または非効率的にしか媒介しないであろう経路である。例えば、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、切断に誘導される複製（ＢＩＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）、平滑末端結合、一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）、および鎖間架橋修復（ＩＣＬ）は、一般に、外因性ＤＮＡの組込みを媒介することにおいて非効率的である。

１つのＤＲＰの下方調整により、一般に、１つまたは複数の他のＤＮＡ修復経路が、下方調整されたＤＲＰの修復機能を受け継ぐことになる。修復機能を受け継ぐ１つまたは複数のＤＲＰは、一般に、上方調整される。１つまたは複数のＤＲＰの上方調整は、下方調整なしでの活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る。別の競合するＤＲＰの下方調整の結果として上方調整されるＤＲＰは、下方調整されるＤＲＰと比べて「優先される」（または増強される）と考えられる。優先／増強の程度は、下方調整の程度に比例し得、例えば、下方調整されるＤＲＰの下方調整なしでの活性と比べて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％高い活性であり得る。下方調整されるＤＲＰの活性は、１つの経路へとシフトし得るが、また、下方調整されるＤＲＰのＤＮＡ修復機能を受け継ぐ２つ以上の経路にシフトしてもよい。

別のＤＲＰを下方調整することとは別に、ＤＲＰはまた、例えば、前記細胞もしくは細胞集団において前記ＤＲＰの１つもしくは複数の成分の過剰発現を引き起こすことを含めて、それらを発現させ、前記細胞もしくは細胞集団に、前記ＤＲＰの成分を異種的に導入することによって、または前記細胞もしくは細胞集団を、前記ＤＲＰの１つもしくは複数の成分の１つもしくは複数の調整因子、好ましくは、刺激剤、例えば、化学的刺激剤と接触させ、前記ＤＲＰの１つもしくは複数の遺伝子を突然変異させることによって、上方調整され得、ここで、前記突然変異させることは、前記ＤＲＰの１つまたは複数の成分の発現または活性を増強させる。

調整、特に、上方調整は、細胞／細胞集団に、表２に記載される１つもしくは複数の遺伝子、ならびに／または配列番号２５～２８および３８～５９に列挙されている遺伝子および本明細書において他の箇所に記載されているこれらの配列との配列同一性（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、もしくは９５％）を有する配列を有する、１つまたは複数のベクターを、図１１Ｂに示される組込みベクターをトランスフェクトするのと同時、またはその２４時間未満、１８時間未満、１２時間未満、８時間未満、４時間未満、２時間未満、１時間未満前およびある特定の実施形態においては後に、一般には一過的に、トランスフェクトすること、例えば、コトランスフェクトすること（すなわち、同時または１時間以内に）によって、達成することができる。図１１Ａにおいて、いくつかの代表的なベクターが、示されている。しかしながら、当業者には理解されるように、ＤＲＰに関与するタンパク質をコードする任意の遺伝子を、そのようなベクターにおいて使用することができる。これらの遺伝子のうちのいくつかが、表２に列挙されており、ある特定の好ましい遺伝子が、配列番号２５～２８および３８～５９で列挙されている。図１１Ａにおいて見ることができるように、ある特定の好ましいベクターは、ＤＲＰ遺伝子を、ＩＴＲ（末端逆位反復配列）の間に挿入する、すなわち、ＤＲＰ遺伝子は、２つのＩＴＲが「両側に隣接」しており、ある特定の好ましい実施形態においては、遺伝子エレメント、例えば、ＭＡＲ（例えば、ＳＧＥ）も含む。ＭＲＥ１１、ＰＯＬＱ、ＣＩＲＢＰ、および／またはＲＡＤ５１を有する１つまたは複数のベクター、例えば、配列番号２５（ｈＭＲＥ１１）、配列番号２６（ｃｇＰＯＬＱ）、配列番号２７（ｈＣＩＲＢＰ）、および／または配列番号２８（ｈＲＡＤ５１）を有する１つまたは複数のベクターでのトランスフェクションが、好ましい。他の好ましいＤＲＰ遺伝子は、発現産物が、（ｉ）ＭＭＥＪおよびＨＲの両方によって使用されるもの（Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、Ｎｂｓ１、ＣｔＩＰ、Ｅｘｏ１、ＢＬＭ、ＡＴＭ、ＥＲＣＣ１、Ｓｒｓ２、Ｘｐｆ、Ｐｏｌ δ、リガーゼＩ、リガンドＩＩＩ）、（ｉｉ）ＭＭＥＪによって使用されるがＨＲによっては使用されないもの（例えば、ＬｉｇＩＶ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ１、ＰＯＬＱ、ＷＲＮ、ＰＯＬＢ、Ｐｏｌ４）、および（ｉｉｉ）ＨＲによって使用されるがＭＭＥＪタンパク質によっては使用されないもの（例えば、ＢＲＣＡ１、５３ＢＰ１、ＭＤＣ１）である。

化学的刺激剤は、本明細書において使用される場合、遺伝子の発現またはタンパク質の活性を増強させるために使用することができる化学的化合物を指す。当業者には容易に認識されるように、化学的刺激剤は、どのＤＰＲ（ＤＮＡ修復経路）のどの成分を刺激するかに依存するであろう。例えば、ＲＡＤ５１刺激剤であるＲＳ－１は、ＨＲを刺激する。ＩＰ６（イノシトールヘキサキスホスフェート）および他のＤＮＡ－ＰＫ増強剤は、ＮＨＥＪ刺激剤である（例えば、Hanakahi 2000、Ma 2002、Cheung 2008を参照されたい）。

化学的阻害剤は、本明細書において使用される場合、遺伝子の発現またはタンパク質の活性を阻害するために使用することができる化学的化合物を指す。同様に当業者には容易に認識されるように、化学的阻害剤は、どのＤＰＲのどの成分が刺激されるかに依存するであろう。ＭＭＥＪの化学的阻害剤の例としては、ＭＲＥ１１阻害剤、例えば、ミリンおよび誘導体（Shibata et al, Molec. Cell (2014) 53:7-18）、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤（Sfeir and Symington, “Microhomology-Mediated End Joining: A Back-up Survival Mechanism or Dedicated Pathway?” Trends Biochem Sci (2015) 40:701-714）が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＲ阻害剤の例：ＲＩ－１（ＲＡＤ５１阻害剤１）およびＢＯ２（３－（フェニルメチル）－２－［（１Ｅ）－２－（３－ピリジニル）エテニル］－４（３Ｈ）－キナゾリノン）。米国特許公開第２０１９／０１９４６９４号Ａ１および同第２０１５／０３６１４５１号Ａ１もまた、参照されたい。

化学的刺激剤および阻害剤は、一般に、外因性であり、すなわち、細胞上清に添加され、細胞によって取り込まれる。そのような阻害剤は、本明細書に記載される様々なベクターとともに、例えば、同時、または１時間以内もしくは２４時間、１８時間、１２時間、８時間、４時間、２時間以内に、細胞／細胞集団に添加され得る。
ヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼ：二本鎖／一本鎖切断の導入

異なる分子は、二本鎖および／または一本鎖切断をゲノム核酸に導入することができる。本発明のヌクレアーゼまたはニッカーゼとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼ、制限酵素、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくは亜鉛フィンガーニッカーゼ、メガヌクレアーゼもしくはメガニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥニッカーゼ、ガイドされる、特に、核酸ガイドヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼ、ＤＮＡガイドヌクレアーゼ、例えば、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉのアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）もしくはＤＮＡガイドニッカーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、ＢｕｒｒＨヌクレアーゼ、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ、それらの改変またはキメラバージョンまたはバリアント、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡガイドヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドニッカーゼは、任意選択により、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステムの一部である。

好ましい実施形態において、これらの二本鎖および／または一本鎖切断は、１つまたは複数のヌクレアーゼまたはニッカーゼによって導入される。ヌクレアーゼは、二本鎖および／または一本鎖切断を導入することができる。ニッカーゼという用語は、一本鎖切断を導入する分子に対して用いられ、部分的に不活性なＤＮＡ切断ドメインを有するヌクレアーゼであり得る。例えば、ヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、互いに独立して突然変異されて、それぞれのヌクレアーゼと同じ特異性で一本鎖切断を導入することができるＤＮＡ「ニッカーゼ」が作製され得る。本明細書に記載される制限により、以下のヌクレアーゼに関する考察は、ニッカーゼに同等に適用される。

ヌクレアーゼは、核酸のモノマー間のホスホジエステル結合を切断することができる。多数のヌクレアーゼが、損傷部位を認識し、それらを、周囲のＤＮＡから切断することによって、ＤＮＡ修復に関与している。これらの酵素は、複合体の一部であってもよい。エクソヌクレアーゼは、核酸を末端から消化するヌクレアーゼである。本文脈において好ましいエンドヌクレアーゼは、標的分子の中心領域に作用するヌクレアーゼである。デオキシリボヌクレアーゼは、ＤＮＡに対して作用し、リボヌクレアーゼは、ＲＮＡに対して作用する。ＤＮＡ修復に関与する多数のヌクレアーゼは、配列特異的ではない。本文脈においては、しかしながら、配列特異的ヌクレアーゼが、好ましい。１つの好ましい実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、標的ゲノムにおける大きめのヌクレオチド片に特異的であり、例えば、５個以上のヌクレオチド、または１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、またはさらには５０個、もしくはそれよりも多くのヌクレオチド、５～５０個、１０～５０個、１５～５０個、１５～４０個、１５～３０個の範囲が、ある特定の実施形態において、標的ゲノムにおける標的配列として好ましい。そのような「認識配列」が大きくなるほど、ゲノム内の標的部位は少なくなり、ヌクレアーゼまたはニッカーゼがゲノムに行う切断が特異的であるほど、結果として切断が部位特異的となる。部位特異的ヌクレアーゼは、一般に、ゲノム内に１０個を下回る、５個を下回る、４個を下回る、３個を下回る、２個を下回る、または単一（１個だけ）の標的部位を有する。特定のゲノム標的配列を切断することによるものを含む、ゲノム核酸を変化させるように操作されているヌクレアーゼは、本明細書において、操作されたヌクレアーゼと称される。ＣＲＩＳＰＲに基づくシステムは、操作されたヌクレアーゼの１つのタイプである。しかしながら、そのような操作されたヌクレアーゼは、本明細書に記載される任意のヌクレアーゼに基づき得る。１つの好ましい実施形態において、それぞれのヌクレアーゼのコドンは、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。本発明のヌクレアーゼ／システムはまた、１つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５－３’エクソヌクレアーゼもしくは３－５’エクソヌクレアーゼ、または他の非ヌクレアーゼドメイン、例えば、ヘリカーゼドメインを呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含み得る。

制限酵素は、しばしば小さめのヌクレオチド片に特異的であり、その結果、短い認識配列を有する、配列特異的ヌクレアーゼである。名称の最初の文字は、属に由来し、２番目の２つの文字は、それが単離された原核生物細胞の種に由来する。例えば、ＥｃｏＲＩは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３菌に由来する。多数の制限酵素は、制限エンドヌクレアーゼであり、例えば、核酸の中央に、平滑な切断または互い違いの切断を導入する。多数の制限酵素は、それが標的とするＤＮＡのメチル化状態に感受性である。切断は、酵素の認識部位における特定の塩基が改変されている場合、遮断または損傷され得る。

エピジェネティクスにおいて重要なメチル化感受性制限酵素の例としては、ＧＡＴＣ認識部位内のＮ６－メチルアデニン検出に感受性であるＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ、ならびにＣＣＧＧ認識部位内のＣ５－メチルシトシン検出に感受性であるＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩが挙げられる。

例において使用されるいくつかの例示的な制限酵素が、参照ＣＨＯゲノムにおいて見出されるそれらの認識部位、それらのＣｐＧメチル化感受性、および標的部位の数とともに、表３に列挙されている。

１２塩基対よりも大きな配列を認識するエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと称される。メガヌクレアーゼ／ニッカーゼは、大きな認識部位（例えば、１２～４０塩基対、例えば、２０～４０もしくは３０～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、結果として、この部位は、任意の所与のゲノムにおいて一度しか発生し得ない。

「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、メガヌクレアーゼの形態であり、大きな非対称の認識部位、および通常イントロンもしくはインテインのいずれかに埋め込まれるコーディング配列を有する、二本鎖ＤＮａｓｅである。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、ゲノム内では極めて珍しいため、それらは、非常に少ない位置、場合によってはゲノム内の単一の位置で切断する（国際公開第２００４０６７７３６号、米国特許第８６９７３９５号Ｂ２も参照されたい）。

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ／ニッカーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される、人工的な制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、特定の所望されるＤＮＡ配列を標的とするように操作することができる。ＺＦＮは、例えば、Ｕｒｎｏｖ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（Highly efficient endgenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases (2005) Nature 435:646-651）によって説明されている。

転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ／ニッカーゼは、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる、制限酵素である。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、事実上あらゆる所望されるＤＮＡ配列に結合するように操作することができるため、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせた場合、ＤＮＡを、特定の位置で切断することができる。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、例えば、Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （A Novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity (2011) Nucl.Acids Res. 39 (21):9283-9293）によって説明されている。

ＲＮＡガイドヌクレアーゼ／ニッカーゼ、特に、エンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムは、詳細に説明されている。任意のＣＲＩＳＰＲに基づくシステムは、本発明の一部である。別のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが使用される場合には、適切なガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、もしくはｃｒＲＮＡ、またはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと相互作用し、ゲノム核酸においてゲノム標的部位を標的とする他の好適なＲＮＡ配列を、使用することができる。

ある特定の好ましい実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼである。本開示において使用するための、核酸ガイドヌクレアーゼを含む、ＲＮＡガイドヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘｌ２としても公知である）、Ｃａｓ１０、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１，Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｍｓ１、Ｃｐｆ１、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらの改変バージョン、ＭＡＤ７、例えば、ＭＡＤザイム（ＩＮＳＣＲＩＰＴＡ）、Ｃ２ｃｌ、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の好ましい実施形態において、ヌクレアーゼは、ＤＮＡガイドヌクレアーゼである。「ＤＮＡガイドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡガイド（ｇＤＮＡ）およびエンドヌクレアーゼを含むシステムを指す。ＤＮＡガイド、例えば、５’－リン酸化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、エンドヌクレアーゼを、ＤＮＡガイドニッカーゼ内の二本鎖ＤＮＡ標的を切断するようにガイドする。「アルゴノートに基づくシステム」は、一本鎖ＤＮＡガイド（ｇＤＮＡ）およびアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質ファミリーに由来するエンドヌクレアーゼに基づく、ＤＮＡガイドヌクレアーゼを指す。ｇＤＮＡは、エンドヌクレアーゼの標的を特定のＤＮＡ配列に定め、配列特異的ＤＮＡ切断をもたらす。Ａｇｏタンパク質は、３７℃において改善された活性を有するように、突然変異生成によって変化させることができる。いくつかのアルゴノートタンパク質は、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ（ＮｇＡｇｏ、例えば、Gao et al., DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute, Nature Biotechnology, published online May 2, 2016を参照されたい）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（RsAgo、例えば、Olivnikov et al.を参照されたい）、Ｔｈｅｒｍｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ＴａＡｇｏ、例えば、Swarts et al (2014), Nature 507(7491): 258-261を参照されたい）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓアルゴノート（ＰｆＡｇｏ）から特徴付けられている。

アルゴノートに基づくシステムの使用により、細胞内のゲノムＤＮＡの標的された切断が可能となる。

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。（例えば、Swarts et al, ibid, G. Sheng et al, (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. III, 652を参照されたい）。

もっともよく知られている原核生物Ａｇｏタンパク質のうちの１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（TtAgo、Swarts et al.、同書）。ＴｔＡｇｏが結合したこの「ガイドＤＮＡ」は、第三者のＤＮＡ分子においてワトソンクリック相補性ＤＮＡ配列に結合するように、タンパク質－ＤＮＡ複合体を誘導する。これらのガイドＤＮＡにおける配列情報により、標的ＤＮＡの特定が可能となると、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このような機構は、標的ＤＮＡに結合している間のＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても裏付けられる（G. Sheng et al、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓに由来するＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、同様の特性を有する（同書）。

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質にロードすることができる（Swarts et al.、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって誘導されるため、外因性のインベスティゲーターにより指定されたガイドＤＮＡを用いて形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、相補的なインベスティゲーターにより指定された標的ＤＮＡへと指向させる。この様式で、ＤＮＡに標的二本鎖切断を作製することができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム（または他の生物に由来するオルソログＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム）の使用により、細胞内でのゲノムＤＮＡの標的切断が可能となる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断については、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたバージョンのＴｔＡｇｏを使用することが、好ましいであろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合されている、インビトロで形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で、細胞を処置することが好ましい場合がある。Ａｇｏ－ＲＮＡに媒介されるＤＮＡ切断は、ＤＮＡ切断片の利用の分野における標準的な技法を使用して、遺伝子ノックアウト、標的遺伝子付加、遺伝子修正、標的遺伝子欠失を含む、多数の結果を実現するために使用することができる。

アルゴノートに基づくシステムおよびｇＤＮＡの設計の例示的な例は、国際公開第２０１７／１０７８９８号、中国公開第１０５４８３１１８号、国際公開第２０１７／１３９２６４号、米国特許出願第２０１７３６７２８０号および同第２０１８０２０１９２１号、ならびにそれらに引用されている参考文献に開示されており、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。アルゴノートに基づくシステムは、任意選択により、１つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５－３’エクソヌクレアーゼもしくは３－５’エクソヌクレアーゼ、または他の非ヌクレアーゼドメイン、例えば、ヘリカーゼドメインを呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。

「メガＴＡＬヌクレアーゼ／ニッカーゼ」は、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、および操作されたメガヌクレアーゼまたは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、操作されたヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ゲノム内の核酸配列のほぼすべての遺伝子座においてＤＮＡに結合するように設計することができ、そのようなＤＮＡ結合ドメインが操作されたメガヌクレアーゼに融合されている場合、標的配列を切断することができる。メガＴＡＬヌクレアーゼおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの設計の例示的な例は、例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（MegaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic genome engineering (2013),Nucleic Acids Research 42 (4):2591-2601）およびそこに引用されている参考文献に記載されて開示されており、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。メガＴＡＬヌクレアーゼは、任意選択により、１つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）ポリペプチド、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）ポリペプチド、５－３’エクソヌクレアーゼもしくは３－５’エクソヌクレアーゼ、または他の非ヌクレアーゼドメイン、例えば、ヘリカーゼドメインを呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物トランスクリプトームを操作する植物転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Kay et al., 2007. Science 318:648-651を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、デノボで操作されているか、または天然に存在するＴＡＬＥから操作されており、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅに由来するＡｖｒＢｓ３、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに由来するｂｒｇｌ １およびｈｐｘｌ７が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡ結合ドメインを誘導および設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号およびそこに引用されている参考文献において開示されており、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。

「ＢｕｒｒＨヌクレアーゼ」は、モジュール式の塩基ごとの特定の核酸結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）を含む、ヌクレアーゼ活性を有する融合タンパク質を指す。これらのドメインは、細菌細胞内共生生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ Ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａに由来するタンパク質に由来するか、または海洋生物から特定される他の同様のタンパク質に由来する。これらの結合ドメインの異なるモジュールを一緒に組み合わせることにより、モジュール式の塩基ごとの結合ドメインを、特定の核酸配列、例えば、ＤＮＡ結合ドメインに対する結合特性を有するように操作することができる。そのような操作されたＭＢＢＢＤは、それによって、ゲノム内の核酸配列のほぼすべての遺伝子座においてＤＮＡを切断するように、ヌクレアーゼ触媒ドメインに融合することができる。ＢｕｒｒＨヌクレアーゼおよびＭＢＢＢＤの設計の例示的な例は、国際公開第２０１４／０１８６０１号および米国公開第２０１５２２５４６５号Ａ１、ならびにそこに引用される参考文献に開示されており、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組込まれる。ＢｕｒｒＨヌクレアーゼは、任意選択により、１つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５－３’エクソヌクレアーゼもしくは３－５’エクソヌクレアーゼ、または他の非ヌクレアーゼドメイン、例えば、ヘリカーゼドメインを呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。

トランスポサーゼまたはインテグラーゼなどの酵素もまた、開示される方法および細胞の文脈において、ニッカーゼ／ヌクレアーゼとして使用され得る。

内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む細胞のゲノムの少なくとも１つの遺伝子座を標的とするための標的エレメントは、一般に、ニッカーゼおよび／またはヌクレアーゼの活性を促進および／またはガイドする配列である。そのような標的エレメントは、例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡを含み、ＣＲＩＳＰＲ、ならびに例えば、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ ５’ゲノム配列（配列番号８および配列番号１０）およびにＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ ３’ゲノム配列（配列番号９および配列番号１１）を標的とするＣａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｍｓ１ヌクレアーゼ発現ベクターによってコードされる。上方調節および／または下方調節され得るＤＲＰは、使用されるエレメントのタイプに応じて調整され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ切断部位１６およびＣＲＩＳＰＲ切断部位１７によって作製されるＤＳＢ（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）については、相同組換え（ＨＲ）経路が、ある特定の実施形態において、上方調節される。加えて、特に、導入遺伝子を有するベクターは、５’および３’相同性アーム（配列番号６および配列番号７）を含み得、これらは、挿入部位を含む、ベクターおよび遺伝子座に存在する。

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復配列）システムの配列特異性は、小さなＲＮＡによって決定される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、バクテリオファージおよび他の可動遺伝子エレメントのゲノムと一致する、「スペーサー」配列によって分離される一連の反復配列から構成される。反復配列－スペーサーのアレイは、長い前駆体として転写され、反復配列内でプロセシングされて、ＣＲＩＳＰＲシステムによって切断される標的配列（プロトスペーサーとしても公知）を指定する小さなｃｒＲＮＡが生成される。切断については、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）としても公知の標的配列のすぐ下流の配列モチーフの存在が必要とされることが多い。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、通常、反復配列－スペーサーのアレイが両側に隣接し、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）生物発生および標的を担う酵素機構をコードする。例えば、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡガイドを使用して切断の部位を指定する、ｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９へのｃｒＲＮＡガイドのローディングは、ｃｒＲＮＡ前駆体のプロセシング中に生じ、前駆体に対してアンチセンスの小さなＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＲＮＡｓｅ Ｉｌｌを必要とする。ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮでのゲノム編集とは対照的に、Ｃａｓ９の標的特異性を変更することは、タンパク質操作を必要とせず、ｃｒＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）に融合された場合にはｓｇＲＮＡとも称される、短いｃｒＲＮＡガイドの設計のみを必要とする。

現在までに、３つの異なるタイプのＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ ９）が、ゲノム編集プロトコールにおいて採用されている。第１のものは、野生型Ｃａｓ９であり、これは、二本鎖ＤＮＡを部位特異的に切断し、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構の活性化をもたらし得る。ＤＳＢは、細胞内非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって修復され、標的とされる遺伝子座を破壊する挿入および／または欠失（インデル）をもたらし得る。代替的には、標的とされる遺伝子座に対する相同性を有するドナー鋳型が提供される場合、ＤＳＢは、相同性指向型修復（ＨＤＲ）経路によって修復され、正確な置き換え突然変異を行うことが可能となる。

さらにニッカーゼ活性のみを持つ突然変異型（ｎＣａｓ９）（例えば、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）を開発し、Ｃａｓ９システムの精度を向上させた。つまり、１つのＤＮＡ鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化させないことを意味する。代わりに、相同修復鋳型が提供された場合、ＤＮＡ修復が、高忠実度ＨＤＲ経路のみを介して行われ、インデル突然変異の減少をもたらす。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａは、したがって、遺伝子座が、隣接するＤＮＡニックを生成するように設計された対合Ｃａｓ９複合体によって標的される場合に、標的特異性の点で、多くの適用においてより魅力的である。そのようなＣａｓニッカーゼはまた、他の機能的ドメインまたは触媒ドメイン、例えば、脱アミノ化活性を提供するドメインに融合させることもできる（例えば、塩基編集目的で）。

第３のタイプは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼデッド（ｄｅａｄ Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９）としても公知の酵素的に不活性なＣａｓ９（ｅｉＣａｓ９）に基づく。このシステムは、そのエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメイン）における突然変異に起因してエンドヌクレアーゼ活性が欠如しているＣａｓ９突然変異体を含む。ｄＣａｓ９は、依然としてそのガイドＲＮＡおよびＤＮＡ鎖に結合することが可能であり、機能性または触媒ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性（例えば、Ｆｏｋ１）、Ｃｌｏ５１、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、脱プリン化活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、およびリコンビナーゼ活性から選択されるがこれらに限定されない、ＤＮＡ改変活性を提供するドメインに融合され得る。タンパク質改変活性を提供する他のドメインとしては、抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン）、活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６）、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性、および脱グリコシル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。

配列同一性という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、配列は、もっとも高い程度の一致が得られるように、アライメントされる。「同一性」は、それ自体が、当該技術分野において認識されている意味を有し、公開されている技法を使用して計算することができる。（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991を参照されたい）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は、配列内の所与の位置における同一なヌクレオチドまたはアミノ酸を定義するものとして、当業者に周知である（Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。

任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１、２、３、４、５、またはその一部のガンマレトロウイルス様配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Hitachi Software, San Bruno, Calif.）を、初回配列アライメントに使用して、続いて、ＥＳＥＥバージョン３．０ ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェアを、複数回の配列アライメントに使用して、従来的に決定することができる。

アミノ酸配列が、例えば、配列番号１もしくは３またはその一部によって発現されるタンパク質に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、コンピュータプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）を使用して、従来的に決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間のもっとも高い相同性のセグメントを見出す。

ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴ、または任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に対して９５％同一であるかどうかを判定する場合、同一性のパーセンテージが、参照核酸またはアミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるヌクレオチドの総数の最大５％の相同性におけるギャップが、許容されるように、パラメーターが設定される。

グローバル配列アライメントとも称される、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間のもっとも高い全体的な一致を判定するための別の好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．（Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定され得る。配列アライメントにおいて、クエリー配列および対象配列は、いずれも、ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって、比較することができる。前記グローバル配列アライメントの結果は、パーセント同一性単位である。パーセント同一性を計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて使用される好ましいパラメーターは、マトリックス＝ユニタリー、ｋ－ｔｕｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さの短い方である。

例えば、本発明の参照配列に対して９５％の「同一性」を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチドの１００個のヌクレオチドごとに平均で最大で５つの点突然変異を含み得ることを除き、参照配列と同一である。換言すると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの最大５％が、欠失していてもよく、もしくは別のヌクレオチドと置換されていてもよいか、または参照配列における総ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが、参照配列に挿入されていてもよい。クエリー配列は、配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載されるように指定される任意のフラグメントであり得る。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（BLAST）（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（NCBI, Bethesda, Md.）およびインターネットを含むいくつかの供給業者から、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、入手可能である。それは、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて、このプログラムを使用して配列同一性および配列類似性を判定する方法についての説明とともに、アクセスすることができる。

本発明はまた、本明細書に開示される配列とのある特定の配列同一性を有する配列に対するものだけでなく、本明細書に開示される配列のうちのいずれかの配列バリアントも同等に対象とする。本発明は、したがって、ある特定の配列同一性について言及される任意の文脈における配列バリアント、およびその逆も同等に対象とする。「配列バリアント」は、本明細書に開示される配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）とは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般に、バリアントは、本明細書に開示される配列と緊密に類似しており、多数の領域において、同一である。

バリアントは、コーティング領域、非コーディング領域、または両方における変化を含み得る。サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、例えば、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない、変化を含む配列バリアントが、特に好ましい。遺伝子コードの縮重に起因して、サイレント置換によって産生されるヌクレオチドバリアントは、好ましい。さらに、５～１０個、１～５個、または１～２個のアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されているバリアントもまた、好ましい。

バリアントポリペプチドのアミノ酸配列は、１つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失、および／または１つもしくは複数のアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基との置換によって、配列番号３に示されるアミノ酸配列とは異なり得る。好ましくは、アミノ酸の変更は、例えば、タンパク質のフォールディングおよび／もしくは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換、典型的には１個～約３０個のアミノ酸の小規模な欠失、小規模なアミノ末端もしくはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０～２５個の残基の小規模なリンカーペプチド、または正味電荷もしくは別の機能、例えば、ポリ－ヒスチジントラクト、抗原性エピトープ、もしくは結合ドメインを変更することにより精製を促進する小規模な伸長である、軽微な性質のものである。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ならびに小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、およびメチオニン）の群内のものである。一般に特定の活性を変化させないアミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって説明されている。もっとも一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、ならびにこれらの逆である。ある特定のパーセンタイルの「連続したヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが互いに直接続いていることを意味する。したがって、６００００個のヌクレオチドを含む配列番号２のヌクレオチドの１０％は、ヌクレオチド１～６０００、またはヌクレオチド２～６００１などであり得る。

例えば、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングは、他の場所、例えば、米国特許公開第２０１８００１６５８３号に記載されており、これは、参照によりその全体が、特に、その開示および遺伝子サイレンシングに関して、本明細書に組込まれる。

以下の実施例の目的は、第１に、ここではＣＲＩＳＰＲに媒介される切断（図２）を介した、遺伝子座への導入遺伝子の挿入を確認することであり、第２には、組込み遺伝子座を有する導入遺伝子配列に対する相同性の作用を、導入遺伝子に対する相同性がないものと比較することである（図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ）。加えて、ＤＮＡ修復経路、例えば、相同組換え（ＨＲ）または代替的末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）の上方／下方調節、刺激／阻害の作用を、比較した（図６）。

実施例１：ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座への標的組込み
この実施例は、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座への導入遺伝子の組込みを例示する（配列番号１、２）。

ＣＨＯ－Ｍ細胞に、ゲノムＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座のそれぞれを標的とするベクターをトランスフェクトした（図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ）。そのようなベクターは、相同性配列を含まない（図３Ａ、３Ｂ）か、または相同性配列を含む（図４Ａ、４Ｂ）かのいずれかである。「相同性なし」および「相同性」の両方のアプローチについて、非相同末端結合（NHEJ）ＤＮＡ修復経路を、化学的阻害剤Ｎｕ７４４１を使用して阻害した。さらに、それぞれのアプローチには、相同組換え（ＨＲ）または代替的末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）の刺激の存在または不在の評価を目指した実験が含まれた。

いずれのアプローチについても、定義されるＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座における導入遺伝子組込みには４つの可能性が存在していた：ｉ）導入遺伝子なしの組込み、またはｉｉ）ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座の野生型対立遺伝子における組込み、またはｉｉｉ）対立遺伝子ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆにおける組込み、または最後にｉｖ）本明細書において「両方の遺伝子座」と称されることもある（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の両方の対立遺伝子における組込み。

これらの結果を、それぞれのクローンのカテゴリーを判定するために開発された３つのＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して得た。これらのアッセイは、図５Ａおよび５Ｂ、ならびに図１２との関連で説明される。

図６は、上記に定義されるカテゴリー（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）に入るクローンのパーセンテージを示す。図は、特に、ランダムな組込みと比較した、ＣＲＩＳＰＲ標的の標的効率を示す。非標的組込みによって得られたクローンは、ＣＨＯ－Ｍ野生型細胞について得られたシグナルに類似する蛍光シグナルを示すクローンに対応し、このことから、導入遺伝子の組込みが、ＥＲＶ遺伝子座を標的としていなかったため、ランダムなゲノム配列において生じたと推定された。

この実施例において、ＨＲ刺激およびＮＨＥＪ阻害を行うと、ＤＮＡ相同性を用いた導入遺伝子組込みが、ＤＮＡ相同性を用いない場合よりも高い、ＥＲＶを含む対立遺伝子における導入遺伝子組込み頻度をもたらしたことが、認められる。これは、相同性が、相同組換えによる標的された導入遺伝子組込みの補助を表すという事実を反映する可能性がある。しかしながら、両方の対立遺伝子におけるもっとも高い頻度の標的組込みは、相同性を用いない発現ベクターを使用した場合、ならびにＡｌｔ－ＥＪ刺激およびＮＨＥＪ阻害の際に生じた（図６）。

結論として、ＣＲＩＳＰＲおよびｇＲＮＡを用いた導入遺伝子組込みのための高効率性プロセスが、ここに設計されており、非標的組込みと比べて７０％～９０％高い標的組込みが、観察される。さらに、ＨＲまたはＡｌｔ－ＥＪのいずれかの経路の刺激は、この実施例において、ＥＲＶを含む対立遺伝子または両方の対立遺伝子における組込みについて、ＤＮＡ相同性の存在または不在に応じて、標的組込みの効率性を増加させた。

図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、プール１およびプール３（プールの組成については、表４を参照されたい）におけるＤＮＡ－ＦＩＳＨシグナルの染色体分布頻度のヒストグラムを示す：プール１およびプール３の集団に由来する細胞を、コルセミドを使用して分裂中期で遮断し、ガラススライドに拡げた。次いで、ＤＮＡ－ＦＩＳＨ実験を、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現を作動させるプロモーターを標的とするプローブを使用して、それぞれのサンプルに行い、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００を使用して画像を収集した。最後に、画像を、核型分析装置を使用して分析し、核型が得られた。第１５染色体（Ｃｈｒ１５）および第９染色体（Ｃｈｒ９）における標的組込みは、プール１においては最大６０％および１９，５％濃縮され、プール３については最大４５％および３２％濃縮された。ｎ値は、分析した核型の数を示す。

いずれのプールにおいても、複数の導入遺伝子組込み部位が、他の染色体で観察されたが、ランダムな導入遺伝子組込み事象の総数が、約２０％を示すため、はるかに低い頻度であった。

最後に、この結果により、ＮＨＥＪの阻害およびＨＲまたは特にＡｌｔ－ＥＪ ＭＭＥＪ機構の活性化と組み合わせたＣＲＩＳＰＲ切断が、第１５染色体および第９染色体における高い効率での標的導入遺伝子の組込みを可能にすることを確認した。

これらの結果により、標的された組込みが、Ａｌｔ－ＥＪ活性化を行った場合に高い効率となり得、組込みの合計最大約８０％が、ＥＲＶ－１０９Ｆ遺伝子座の２つの対立遺伝子、すなわち、ＥＲＶ欠損野生型およびＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ含有対立遺伝子を含む第９染色体および／または第１５染色体の部分に生じることがわかる。すべてのＣＨＯ細胞に関して、それらを本来のチャイニーズハムスター細胞から単離した後にインビトロにおいて最適な成長特性に関して選択する際に、広範囲の染色体再配列に供されているため、ＣＨＯ－Ｍ細胞は、相同染色体のすべての染色体遺伝子座について、相同配列を有するわけではない。これにより、試験した遺伝子座において観察されるように、ゲノムの相同配列が異なる染色体上に位置し得る理由が、説明される。

図７Ｃは、プール１から得られた細胞について、それぞれ、第９染色体および第１５染色体において生じる導入遺伝子挿入の代表的な核型を示し、ＤＮＡは灰色で染色されており、テロメア反復配列（配列ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ［配列番号６０］）およびＧＦＰの発現を作動させるプロモーターに対するＤＮＡ－ＦＩＳＨプローブは白色で染色されている。白色の矢印は、ＥＲＶおよび野生型対立遺伝子のＦＩＳＨシグナルの位置を示す。

実施例２：ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座を標的とすることによる導入遺伝子発現の増加
この実施例は、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座が、外因性導入遺伝子の増強された安定な発現を可能にすることを例証する。図８は、ＦＩＴＣ蛍光分析に基づいた、ＧＦＰを発現するＣＨＯクローンの分析を示す。３４０，０００個の細胞に、条件ごとにトランスフェクションを行い、トランスフェクションの２日後に、抗生物質選択の存在下において半固体培地に播種した。蛍光強度に基づいて、４２個のクローンを選出し（ＣｌｏｎｅＰｉｘ（登録商標））し、培養した。選出の９日後に、クローン当たり２０００個の細胞でＦＩＴＣを測定し（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（登録商標））、導入遺伝子組込み事象のタイプを、それぞれのクローンについて、ｑＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって判定した。４２個のクローンを、前述のように、導入遺伝子が、野生型対立遺伝子、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆを含む対立遺伝子、両方の対立遺伝子、または標的外ゲノム組込み事象に対応する非標的組込みのいずれに位置するかで、４つのカテゴリーに入れた。

図８Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、導入遺伝子遺伝子座組込みタイプに応じた蛍光強度（FITC）を示す。それぞれのタイプの組込みについて、蛍光の表示は、１つの遺伝子座が、他のものと比較して高い導入遺伝子発現を提供するかどうか、および修復経路の調整により導入遺伝子発現レベルが変化するかどうかを調べることを可能にした。

結果は、全体として、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座を標的とすることで、非標的組込みによって表されるランダムなゲノム組込みと比較して、高いＦＩＴＣ蛍光を媒介すると見られることを示す。さらに、ＤＮＡ修復経路の調整により、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座の野生型対立遺伝子への組込みが、ＥＲＶ対立遺伝子よりも高い蛍光レベルをもたらしたことを、理解することができる（例えば、プール１および３から単離されたクローンのＦＩＴＣ蛍光、図８Ａおよび８Ｃ）。ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座の野生型対立遺伝子における組込みはまた、両方の対立遺伝子における組込みと比較して、より高い蛍光をもたらした。したがって、本発明のある特定の実施形態において、対応するＥＲＶに占有される対立遺伝子への組込みを伴わない、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ遺伝子座の野生型対立遺伝子への組込みが、好ましい。この実施形態は、可能性のある負の影響が、ＥＲＶ含有対立遺伝子における組込みの後に生じ得る場合、および／または野生型ＥＲＶ欠損対立遺伝子が、ＥＲＶ含有対立遺伝子よりも高レベルかつ安定した導入遺伝子の発現のため、望ましい場合に、特に好ましい。当業者であれば、ＥＲＶ含有対立遺伝子における導入遺伝子の組込みがない実施形態においても、ウイルス粒子の放出がもはや検出可能とならないように、ＥＲＶ配列が、ある特定の実施形態において、細胞からのウイルス粒子の放出を排除または低減するように改変されていることを理解するであろう（Duroy, 2020を参照されたい）。

また、ＤＮＡ修復経路の調整は、特に、Ａｌｔ－ＥＪ調整を用いない場合よりも明らかに高い発現をもたらすこの調整を適用した場合に、この遺伝子座における導入遺伝子の発現の増強を提供するとも考えられるため、ある特定の実施形態において、特に好ましい（例えば、図８Ａおよび８Ｂにおける蛍光強度の中央値を示す破線を参照されたい）。

図９は、プール３およびプール４から得られた別のトランスフェクションおよび別のバッチのクローンで得られた結果を示す。これらの結果は、ＨＲ調整を使用して生成された細胞（プール３、図８Ｃ）をＨＲ調整の不在（プール４、図８Ｄ）と比較した際の、ＤＮＡ相同性を用いた標的組込みを使用して生成されたクローンから得られた蛍光を示す。

これらの結果は、特に、ＥＲＶ含有対立遺伝子のみにおける組込みまたは非標的組込みと比較して、導入遺伝子が、野生型対立遺伝子もしくは両方の対立遺伝子に組込まれた場合に、ＨＲ修復経路の調整が、導入遺伝子発現の増加を示す細胞クローンを生成するためにも使用することができることを示すことによって、これまでに得られた結果を検証する。この結果は、さらに、ＤＮＡ修復機構の調整が、導入遺伝子発現の増加を得るために有利であることを検証する。

実施例３：複合体タンパク質の発現
この実施例は、第９染色体ＥＲＶ１０９Ｆ欠損野生型対立遺伝子および／または相同第１５染色体ＥＲＶ１０９Ｆ含有対立遺伝子に組込んだときにＧＦＰ発現を可能にする設定（図１０）により、トラスツズマブ治療用タンパク質の発現も可能となったことを示す。

まず、ＣＨＯ細胞に、ＣＲＩＳＰＲに媒介される切断のための発現ベクターを、トラスツズマブ発現ベクターと一緒にトランスフェクトした（図１１Ｂ）。トランスフェクションのいくつかについては、代替的末端結合機構、例えば、マイクロホモロジーに媒介される末端結合（ＭＭＥＪ）経路を増加させるＰＯＬＱ、ＭＲＥ１１、およびＣＩＲＢＰタンパク質の発現を媒介するベクターもまた、含まれた（図１１Ｂ）。トラスツズマブ発現ベクターは、相同性配列を有さないために染色体遺伝子座と有意なＤＮＡ配列相同性を示さないため、染色体ＣＲＩＳＰＲ切断部位におけるトラスツズマブ発現ベクターの組込みを促進することを目標として、これを行った。ゲノムに組込まれた導入遺伝子配列を含む細胞を、ピューロマイシン抗生物質耐性のために選択し、その後、クローン集団を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣからのＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）ＦＬ Ｉｍａｇｅｒを使用して単離した。

導出されたクローンを、次いで、図１２において矢印で示されるプライマーを使用して、ＰＣＲアッセイによって分析して、導入遺伝子が組込まれたゲノム遺伝子座を判定した：図１２Ｂにおいて矢印で示されるプライマーを用いた増幅は、ＥＲＶ欠損野生型対立遺伝子に生じた導入遺伝子挿入はなかったことを示す（図において、ＥＲＶなしの遺伝子座と称される）。図１２Ｃに示されるプライマーは、ＥＲＶが、導入遺伝子の挿入なしでその通常の遺伝子座に依然として挿入されるかどうかを評価する。図１２Ｄに示されるすべてのプライマーを用いた増幅は、両方の対立遺伝子がインタクトであること、および導入遺伝子の組込みが、ゲノム内の他の箇所で生じたはずであることを示す。図１２Ａにおいて、いずれものプライマー対での増幅されないということは、両方の対立遺伝子に挿入があることを示す。したがって、ランダムな位置、ＥＲＶ１０９Ｆを含有する第１５染色体の対立遺伝子、ＥＲＶ１０９Ｆ欠損第９染色体野生型対立遺伝子、または第１５染色体および第９染色体の両方の対立遺伝子のずれかに組込まれた導入遺伝子を含む、４つのタイプのクローンが特定された。予測した通り、ＥＲＶを含む対立遺伝子または両方の対立遺伝子にＴｒａｓ導入遺伝子が導入されており、したがって、ＥＲＶ１０９Ｆ配列がＴｒａｓコーディング配列で置き換えられているクローンが、ＥＲＶ発現のもっとも強力な低減、最大で１７倍を超える低減を有し、ＰＣＲバックグラウンド内での検出不可能なレベルに達した（図１３Ａ～Ｃ）。

クローンを、次いで、トラスツズマブ選択のためにスクリーニングし、低い（図１４Ａ）、中等度（図１４Ｂ）、および高いレベル（図１４Ｃ）でトラスツズマブを発現する代表的なクローンを、次いで、それぞれのクローンタイプについて選択した。ＧＦＰ発現に関して観察されたように、もっとも高いレベルのトラスツズマブ産生レベルは、ＥＲＶ欠損第９染色体遺伝子座へのＴｒａｓコーディング配列の組込み時に得られ、これに両方の遺伝子座にＴｒａｓ配列が組込まれているクローンが続いた。ＥＲＶ１０９Ｆ含有および／または欠損野生型対立遺伝子における標的組込みにより得られる産生レベルは、ランダムなゲノム組込みにより得られるものよりもはるかに高かった。全体として、これらの発見により、ＥＲＶ遺伝子座のゲノム環境が、遺伝子発現に非常に有利であり、およびもっとも産生性の高いクローンは、ＥＲＶ欠損第９染色体野生型対立遺伝子における導入遺伝子の組込み時に得られることが、示された。

次に、小規模および短期間の非フィード培養物の上清において得られた高いＴｒａｓ力価が、治療用タンパク質産生様培養物に移行できるかどうかを評価した。小規模な９６ウェルプレートの６～１０日間の間隔で得られた特定の産生能力レベル（図１５Ｄ～Ｆ）、ならびに振盪２４ウェルプレートに置いて行ったフェッドバッチ培養物の上清から得られた力価（図１５Ａ～Ｃ）は、最適なＴｒａｓ発現が、ＥＲＶ欠損野生型対立遺伝子への導入遺伝子の組込みにより得られたことを示した。
アップスケーリング

それぞれのタイプのゲノム組込みについてもっとも高い力価を媒介するクローンの産生能力（図１５Ｃおよび１５Ｆ）を、Ａｍｂｒ（登録商標）１５バイオリアクターにおいて行ったフェッドバッチ培養物を使用して、より大きな規模で評価した。細胞当たり１日当たりの分泌されるＴｒａｓ ＩｇＧが２０ピコグラムを上回る特定の産生能力は、ＥＲＶ欠損野生型対立遺伝子において導入遺伝子が組込まれたクローンについて、得られた（図１６Ｂ）。このクローンはまた、細胞培養上清中に放出される抗体のもっとも高い力価も取り持つ（図１６Ａ）。

まとめると、驚くべきことに、高い導入遺伝子発現および治療用タンパク質の最適な産生に最適な標的組込み遺伝子座は、高発現ＥＲＶが組込まれている染色体遺伝子座、より好ましくは、ＥＲＶ１０９Ｆを含有する第１５染色体ゲノム対立遺伝子、なおもさらにより好ましくは、第９染色体のＥＲＶ１０９Ｆ欠損野生型対立遺伝子であることが、見出された。ＭＲＥ１１およびＰｏｌＱ ＭＭＥＪタンパク質などの代替的末端結合因子の発現ベクター（図１１Ａを参照されたい）を、この好ましいゲノム遺伝子座における非相同プラスミド配列の高い頻度での標的組込みを優先するように、治療用タンパク質ベクターとコトランスフェクトすることができ、これをコトランスフェクトした。ＥＲＶ含有およびＥＲＶ欠損野生型の両方の対立遺伝子における治療用タンパク質発現ベクターの二重組込みもまた非常に好ましく、単回のトランスフェクションの結果として、治療用タンパク質の高レベルの発現、ならびに目的の治療用タンパク質と一緒に、細胞上清中へのウイルス粒子の放出をもたらす有害な可能性のあるレトロウイルス配列の発現の停止が可能となる。
材料および方法
細胞培養

懸濁液に適合させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｍ）由来細胞を、Ｌ－グルタミン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を補充した無血清ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において維持した。緑色蛍光トランスフェクト細胞のＣＨＯ－Ｍ生存細胞密度および蛍光シグナルを、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して評価した。細胞を、５０ｍｌのＣ５０バイオリアクターチューブ（ＴＰＰ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、３７℃、５％ ＣＯ２で、１８０ｒｐｍ撹拌速度の加湿インキュベーターにおいて培養し、３～４日ごとに継代させた。
プラスミドの構築

２つのＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）発現ベクターを、この研究において使用した。２つのベクターは、抗生物質耐性カセット、続いてＥＧＦＰ発現カセットから構成される同じ真核生物発現カセットを、下流のＳＶ４０エンハンサーおよびＳＥＬＥＸＩＳ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＧＥ）とともに有する。ＳＥＬＥＸＩＳ ＳＧＥは、すべての哺乳動物細胞にわたってクロマチンの動的組織化を制御する固有のエピジェネティックＤＮＡに基づくエレメントである。それらは、組込まれた導入遺伝子を周囲のクロマチンのサイレンシング作用から単離することによって、転写の促進を可能にする。

Ｄｕｒｏｙ ｅｔ ａｌ．２０１９は、ＣＨＯゲノムにおいて特定されている１７３個のＣ型ＥＲＶのうち１つのみが、転写することができ、ＣＨＯ培養上清中に存在するウイルス粒子を産生することができることについて記載している。このＥＲＶ配列は、ＣＨＯ細胞ゲノムにおいてヘミ接合性状態でしか存在しないため、組込みの遺伝子座は、特異的である（図１）。これは、一方の対立遺伝子が、ＥＲＶ組込みを有さない（野生型（ＷＴ）もしくはＥＲＶ欠損野生型対立遺伝子）ＣＨＯゲノムに存在し、もう一方の対立遺伝子が、組込まれたＥＲＶを見出すことができるＣＨＯゲノム内の相同ＤＮＡ配列（ＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆ含有対立遺伝子、またはＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆ対立遺伝子と称される）に存在することを意味する。最後の対立遺伝子だけが、対応するウイルス配列を細胞において発現し、細胞質におけるＥＲＶ－Ｃ １０９Ｆ ｍＲＮＡの存在をもたらすであろう。

本願において使用されるＥＧＰを有するベクターのうちの１つは、さらに、図２に記載される対立遺伝子切断点およびＣＲＩＳＰＲ切断部位（５’および３’相同性アーム）の両側に位置する、ＥＲＶ Ｃ １０９Ｆ含有およびＥＲＶ欠損野生型対立遺伝子（配列番号６および配列番号７）の周囲のゲノム遺伝子座に由来するＤＮＡ配列に対応する、７５０ｂｐの長さの２つの相同性配列を含む。

ＣＲＩＳＰＲベクターの２つのセットを、部位特異的ＤＳＢを導入するために、ＥＧＦＰベクターに加えて使用した。ＣＲＩＳＰ １６およびＣＲＩＳＰ １７ ＤＳＢ（配列番号８および配列番号９）は、好ましくは、ベクターならびに遺伝子座の野生型対立遺伝子および／またはＥＲＶ含有対立遺伝子に相同性配列として存在する、５’および３’相同性アームを使用して、相同組換え経路によって修復される。ＣＲＩＳＰ ５０およびＣＲＩＳＰ ５１ ＤＳＢ（配列番号１０および配列番号１１）は、好ましくは、ベクターおよび野生型対立遺伝子に存在するマイクロホモロジー配列を使用して、Ａｌｔ－ＥＪ経路によって修復される。
トランスフェクションおよび単一細胞の単離

ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路の阻害のために、懸濁液中で成長しているＣＨＯ－Ｍ細胞を、ＤＮＡ－ＰＫｃを阻害するように、０．５μＭのＮｕ７４４１で事前処置した。相同組換え（ＨＲ）経路が刺激された細胞を、さらに、１μＭ ＲＳ－１で処置した。事前処置した細胞に、検出を容易にするために、図３および４に提示されるように、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）コーディング配列を含有する２つの発現ベクターをトランスフェクトした（３４０，０００個の細胞／トランスフェクション）。Ａｌｔ－ＥＪ修復経路、すなわち、ＭＭＥＪ経路を刺激するために、細胞には、別個の発現ベクターにクローニングしたｈＭＲＥ１１（配列番号２５）、ｃｇＰＯＬＱ（配列番号２６）、およびｈＣＩＲＢＰ（配列番号２７）遺伝子もトランスフェクトした。一方で、ＨＲ修復経路を刺激するために、細胞には、別個の発現ベクターにクローニングしたｈＭＲＥ１１およびｈＲＡＤ５１（配列番号２８）遺伝子もトランスフェクトした。

トランスフェクションの１日後に、細胞を遠心分離し、Ｎｕ７４４１およびＲＳ－１を除去するために、培地を交換した。トランスフェクションの２日後に、細胞を、５０００個の細胞／ｍｌの細胞密度で、３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する半固体培地に播種した。半固体培地において１０日間成長させた後、トランスフェクション当たり４２個のＥＧＦＰ発現クローンを、蛍光強度に基づいて選定し（ＣｌｏｎｅＰｉｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ培地において培養した。選定から９日後（ＤＮＡ修復経路刺激ありの経験）および選定から６日後（ＤＮＡ修復経路刺激なしの経験）に、クローン当たり２０００個の細胞において、ＥＧＦＰ発現レベル（ＦＩＴＣ）を測定した（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（登録商標））。結果を、ｑＰＣＲ分析（ＴａｑＭａｎ（登録商標））によって判定したカテゴリーで示す。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ抽出

ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲキット（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を、製造業者の説明書に従って使用して、２×１０Ｅ６個の細胞から抽出した。ｇＤＮＡ定量化を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を使用して行った。
ｑＰＣＲアッセイ

３つのＴａｑｍａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイを設計した（図５Ａおよび５Ｂ、プローブおよびプライマーは、配列番号２９～配列番号３７に示される）。すべてのＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイの線形性および効率を、標準曲線のアプローチを使用して検証した。すべてのアッセイは、線形性が高く（＝０．９９９）、非常に良好な効率性を示した（≧０．９７）。

ｑＰＣＲの実施は、ＱＩＡＧＥＮのＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅにおいて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲキット（登録商標）およびＦＡＭまたはＨＥＸ標識化ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイを使用して、行った。データ分析は、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）ソフトウェア（ｖ２．３．１）を使用して行った。

参照遺伝子座の不在または存在を検証するために、３つの遺伝子座の検証のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）特異度ｑＰＣＲアッセイを、適切な陰性対照を使用し、標準曲線アプローチを使用して、行った。

対照に対応するＣＴ範囲における１つのアンプリコンの不在または存在により、ＥＲＶ含有対立遺伝子またはＥＲＶ組込みの遺伝子座の野生型対立遺伝子の組込みの標的遺伝子座が、トランスフェクトされていないＣＨＯ－Ｍ細胞と同様であるかどうかを判定することが可能であった。３つの異なるＴａｑＭａｎアッセイの「はい、または。いいえ」の結果により、それぞれのクローンがどのカテゴリーに入るかを判定することが可能である。
蛍光Ｉｎ－Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験

細胞を、コルセミドを使用して分裂中期で遮断し、ガラススライドに拡げた。ＤＮＡ－ＦＩＳＨ実験を、ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ベクターの発現を作動させるプロモーターを標的とするプローブを使用して、それぞれのサンプルに行った。画像を、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００を使用して収集した。最後に、画像を、核型分析装置を使用して分析し、核型を得た。
トラスツズマブ産生細胞クローンの生成および特徴付け

ＥＲＶ１０９Ｆ組込みゲノム遺伝子座へのＩｇＧをコードするベクターの標的組込みを可能にするために、ＣＨＯ－Ｍ細胞に、ＰｕｒｏＢＴ＋＿Ｔｒａｓ＿ＨｃおよびＰｕｒｏＢＴ＋＿Ｔｒａｓ＿Ｌｃトラスツズマブ（Ｔｒａｓ）免疫グロブリン（ＩｇＧ）発現プラスミド（図１１Ｂ）ならびにＣＲＩＳＰＲ－ｓｇＲＮＡベクターをコトランスフェクトした。細胞を、ピューロマイシンに対する耐性について選択し、単一細胞に由来するクローンを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ，ＬＬＣのＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）ＦＬ Ｉｍａｇｅｒを使用して単離した。
ＣＨＯ－Ｍ細胞株およびフェッドバッチ培養

ヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体を安定に発現する親Ｓｅｌｅｘｉｓ ＣＨＯ－Ｍ細胞、および導出されたクローン細胞株を、次のように培養した：シードトレイン培養物を、Ｎ－１播種の前に３～４日ごとに継代させた。マイクロバイオリアクター接種の４日前に、ＣＨＯ－Ｍ培養物を、プロセス要件に従った体積で０．３０×１０^６個の細胞／ｍｌ（Ｎ－１）の播種細胞密度において、振盪フラスコで継代させた。細胞を、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ， ＵＳＡ）を補充した化学的に定義されたＢａｌａｎＣＤ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ（登録商標）培養培地（ＩＲＶＩＮＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ， ＵＳＡ）において、３７．０℃、５％ ＣＯ_２、および１２０ｒｐｍのインキュベーター（ＫＵＨＮＥＲ，Ｇｅｒｍａｎｙ）設定で、培養した。
総タンパク質定量化アッセイ

自動化マイクロ流体キャピラリーゲル電気泳動システムであるＬａｂＣｈｉｐ ＬＣＧＸＩＩシステム（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ， Ｉｎｃ．）を、総タンパク質アッセイに使用した。タンパク質を含有するサンプルを、タンパク質を非特異的に標識するアミン反応性蛍光色素と混合し、タンパク質を、分離チャネルの排出口においてレーザー誘起蛍光によって検出した。
標的組込みの有効性に関するクローンの特徴付け

ＩｇＧを産生する細胞クローンのＴｒａｓ発現ベクターのゲノム組込み部位を、ゲノムＤＮＡに対して行われるｑ－ＰＣＲアッセイによって分析した。定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）を、３つのＴａｑｍａｎプローブを使用して、多重に行った。２つのＴａｑｍａｎアッセイは、第１５染色体（Ｃｈｒ）のＥＲＶ組込み遺伝子座の両側におけるＥＲＶとゲノムＤＮＡとの間のＥＲＶ１０９Ｆジャンクション配列の存在を判定するように設計した。増幅の欠如により、１つまたは複数の導入遺伝子コピーが、ＥＲＶ１０９Ｆ対立遺伝子に組込まれていること、およびＥＲＶ配列が欠失されていることが示された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。３つの目のＴａｑｍａｎアッセイは、この遺伝子座における導入遺伝子の組込みを評価するために、野生型対立遺伝子、すなわち、ＥＲＶ欠損第９染色体ゲノム配列の存在を評価するように設計した（図１２Ａおよび１２Ｃ）。

３つのｑ－ＰＣＲアッセイから産物が得られなかった場合、導入遺伝子コピーが、両方の対立遺伝子に組込まれていると推測することができる（図１２Ａ）。３つのＴａｑｍａｎアッセイすべてが肯定的な結果を出した場合、これにより、両方の対立遺伝子がインタクトであること、およびＴｒａｓをコードする配列が、したがって、ゲノムの他の箇所に組込まれていることが示された（図１２Ｄ）。したがって、そのようなクローンは、導入遺伝子組込みがランダムに生じたものとして分類した。
ＥＲＶ１０９Ｆ発現

ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを製造業者のプロトコールに従って使用して、総細胞ＲＮＡを抽出した。２回のＤＮＡｓｅ処置を、抽出中および抽出後に行った。ＰＲＯＭＥＧＡのＧｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（ＲＴ）キットを使用して、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写した。

Ｔｒａｓ産生クローンおよび親ＣＨＯ－Ｍ細胞のＥＲＶ１０９Ｆ ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを、細胞ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡを参照物として使用して、ＥＲＶ１０９Ｆ長い末端反復配列を検出するように設計されたＴａｑｍａｎアッセイを使用して行った。ＥＲＶ１０９Ｆ発現の減少倍数の判定を、デルタデルタＣＴ計算方法（Livak and Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method, Methods 25, 402-408, 2001）に従って行った。このアッセイは、ＥＲＶ遺伝子座における導入遺伝子組込み後のＥＲＶ発現の減少の判定を可能にし、それによって、ＥＲＶ１０９Ｆ遺伝子座における導入遺伝子の組込みおよびＥＲＶ配列検出をさらに検証した。
細胞クローンの培養およびトラスツズマブ抗体産生能力のアッセイ

フェッドバッチ培養においてＴｒａｓ産生を判定するために使用した細胞培養プロセスは、次のように行った：細胞成長および産生性能を、９６ディープウェルプレートまたは２４ディープウェルプレートにおいて、撹拌下で、古典的なフェッドバッチ静的培養を使用して、評価した。温度シフトを可能にする冷却システムが装備されたＡｍｂｒ１５（登録商標）自動化マイクロスケールバイオリアクターシステム（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ Ｓｔｅｄｉｕｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたフェッドバッチ培養もまた、行った。すべての培養は、４０％の溶解酸素（ＤＯ）、１０００～１４００ｒｐｍの撹拌速度、３６．５℃で温度を維持し、次いで３３．０℃にシフトし（播種密度に応じた時間シフト）、６．９０±０．１０でｐＨを制御し、次いでＣＯ２および１Ｍカーボネートを使用して７．００±０．２０にシフトして（播種密度に応じた時間シフト）、行った。

２４ディープウェルまたは９６ディープウェル中のフェッドバッチ培養物を、それぞれ、３ｍｌおよび２５０ｍｌの培養体積を使用して、３００ ０００個の細胞／ｍｌの標的細胞密度で播種した。マイクロバイオリアクターに、Ａｍｂｒ１５の播種密度プロセスに応じて、１３ｍＬの初期作業体積において、１．００×１０^６個の細胞／ｍＬの標的細胞密度で播種した。細胞培養補充物質１および細胞培養補充物質２のフィード補充物質を、播種密度プロセスに応じて、様々な日数時点で培養物に添加した。グルコース溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ、ＵＳＡ）を、毎日のグルコース濃度に基づいて添加した。良好な細胞生存率および高いレベルの産生を維持するのに必要な通りにした。マイクロバイオリアクターサンプルを、細胞計数および生存細胞密度（ＶＣＤ）の判定のために毎日採取した。細胞生存率を、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ２（ＮＯＶＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ， ＵＳＡ）を使用して測定した。細胞を、最大１４日間成長させた。

当業者であれば、上述の説明が、限定するものではなく、本発明のある特定の実施形態の例を提供するものであることを理解するであろう。上記に提供される案内により、当業者は、本明細書に具体的に記載されていない広範な代替形態を想起し得る。
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Claims (28)

1. 細胞のゲノム内に、
   内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列またはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む少なくとも１つの遺伝子座であって、
   （ｉ）ａ）前記ＥＲＶ配列もしくは前記ＬＴＲ－ＲＴ配列、またはｂ）前記挿入部位、および任意選択によりａ）の配列の一部、ならびに／または
   （ｉｉ）（ｉ）の対立遺伝子野生型対応配列
   を含む、少なくとも１つの遺伝子座と、
   前記少なくとも１つの遺伝子座に組込まれた少なくとも１つの導入遺伝子発現産物をコードする少なくとも１つの導入遺伝子と
   を含む、操作された細胞、好ましくは、哺乳動物細胞株のもの、例えば、操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を含む、操作されたＣＨＯ細胞、操作されたブタ細胞、または操作されたヒト細胞。
2. （ｉ）および（ｉｉ）を、異なる染色体、例えば、ＣＨＯ細胞の第１５染色体および第９染色体に含む、請求項１に記載の操作された細胞。
3. （ｉ）および（ｉｉ）を含み、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、（ｉｉ）に組込まれている、請求項１または２に記載の操作された細胞。
4. 前記少なくとも１つの導入遺伝子が、（ｉ）に組込まれていない、請求項３に記載の操作された細胞。
5. 前記少なくとも１つの導入遺伝子が、（ｉ）にも組込まれている、請求項３に記載の操作された細胞。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の操作された細胞を含む、細胞集団であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、前記細胞集団内の細胞の（ｉ）および／または（ｉｉ）の２０％よりも多く、３０％よりも多く、またはさらには４０％よりも多くに組込まれている、細胞集団。
7. 前記細胞が、（ｉ）および（ｉｉ）を含み、（ｉ）が、少なくとも、配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７、または配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉ）が、少なくとも、配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０、または配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むか、あるいは
   少なくとも、配列番号１のヌクレオチド２９５２１～３９７４７、または配列番号１のヌクレオチド２９５２１～４２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉ）が、少なくとも、配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０、または配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、
   請求項６に記載の細胞集団。
8. 前記細胞または細胞集団が、内在性レトロウイルス配列（ＥＲＶ）の発現が欠如している、および／または前記細胞集団の培養上清に含まれる検出可能なウイルス粒子が存在しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞、または請求項６もしくは７のいずれか一項に記載の細胞集団。
9. 前記少なくとも１つの導入遺伝子発現産物が、目的のタンパク質であり、前記細胞または細胞集団が、任意選択により、単位時間当たりで、前記少なくとも１つの導入遺伝子が前記少なくとも１つの遺伝子座外で前記ゲノムに組込まれている場合の目的のタンパク質の量を、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、またはそれ以上上回る量（例えば、細胞当たり１日当たりのピコグラム、μｇ／ｌまたはｍｇ／ｌ）で、前記目的のタンパク質を発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞、または請求項６、７、もしくは８のいずれか一項に記載の細胞集団。
10. 前記ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴが、Ｃ型内在性レトロウイルスエレメント（ＥＲＶ Ｃ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＸＭＲＶ（異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）、ＭＥＲＶ－Ｌ（Ｌ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するマウスＥＲＶ）、ＶＬ３０（ウイルス様３０）、ＩＡＰ（槽内Ａ型粒子）、ＭｕｓＤ（ＭｕｓＤ型関連レトロウイルス）、ＰＥＲＶ（ブタ内在性レトロウイルス）、ＫｏＲＶ（コアラレトロウイルス）、ｅｎＪＳＲＶ（ヤーグジークテヒツジレトロウイルス）、ＭａＬＲ（哺乳動物見かけのＬＴＲレトロトランスポゾン）、ＨＥＲＶ（ヒト内在性レトロウイルス）、例えば、ＨＥＲＶ－Ｅ（Ｅ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｈ（Ｈ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｋ（Ｋ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｌ（Ｌ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、ＨＥＲＶ－Ｗ（Ｗ－ｔＲＮＡ ＰＢＳを有するヒトＥＲＶ）、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞集団。
11. 前記ＥＲＶまたはＬＴＲ－ＲＴ配列が、ｇａｇ（群特異的抗原）遺伝子、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）遺伝子、ｅｎｖ（エンベロープ）遺伝子、ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）をコードする配列、ＳＰ１（スペーサーペプチド１）をコードする配列、ＳＰ２（スペーサーペプチド２）をコードする配列、またはｐｐ１２もしくはｐ６などのタンパク質をコードするさらなるドメイン、およびＥＲＶの長い末端反復配列（LTR）ならびにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのＥＲＶ部分配列を含み、前記導入遺伝子が、任意選択により、前記部分配列のうちの１つに組込まれている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞集団。
12. 前記細胞に、表２の１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、１つまたは複数のベクターがトランスフェクトされており、前記細胞の細胞質が、任意選択により、１つまたは複数のＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）の外因性化学的阻害剤および／または刺激剤、例えば、ＮＵ７４４１、オラパリブ、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤、Ｓｃｒ７、ＫＵ－００６０６４８、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５（セツキシマブ）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，ｌ－ａ］イソキノリン－４－オン）、バニリン、ウォルトマニン、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＯＫ－１０３５、ＣＯ１５、ＮＫ３１４、ＰＩ１０３塩酸塩、およびこれらの組合せからなる群から選択される、ＮＨＥＪ阻害剤、ミリン、ミリンの誘導体、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤、およびこれらの組合せの群から選択される、ＭＭＥＪ阻害剤、ＨＲ阻害剤、例えば、ＲＩ－１およびＢＯ２、ＨＲ刺激剤、例えば、ＲＳ－１、ＮＨＥＪ刺激剤、例えば、ＩＰ６、ならびに上述の阻害剤および／または刺激剤のうちのいずれか１つの組合せをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞集団。
13. 前記遺伝子座が、配列番号１および／または配列番号２から選択される配列との少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された細胞。
14. 前記導入遺伝子が、ランディングパッドである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作された細胞。
15. 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト細胞、またはブタ細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された細胞。
16. 細胞、好ましくは、哺乳動物細胞株のゲノムへの導入遺伝子の組込みのための方法であって、
    （ａ）少なくとも１つの導入遺伝子を、前記少なくとも１つの導入遺伝子を含むベクター、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターの一部として提供することであって、前記ベクターが、前記導入遺伝子を、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列の挿入部位を含む、前記細胞の少なくとも１つの遺伝子座に組込む、提供すること、または
    （ｂ）任意選択によりベクターの一部としての少なくとも１つの導入遺伝子と、少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼとを提供することであって、前記ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼが、好ましくは、少なくとも１つのベクターによってコードされ、前記ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼが、前記導入遺伝子を中に組込むために、二本鎖および／もしくは一本鎖切断を内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列に導入する、提供することと、さらに、任意選択により、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする少なくとも１つのベクターを提供することと、
    任意選択により、前記細胞の少なくとも１つの第１のＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）を上方調整、特に、刺激し、任意選択により、前記細胞の少なくとも１つの第２のＤＲＰを下方調整、特に、刺激すること、またはその逆を同様に行うことと、
    前記細胞に、前記少なくとも１つの導入遺伝子をトランスフェクトすることと、
    任意選択により、前記遺伝子座に組込まれた前記少なくとも１つの導入遺伝子を含む、操作された細胞を単離することと、
    を含む、方法。
17. 前記細胞が、さらに、
    －好ましくは１つまたは複数のさらなるベクターの一部として、表２の１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列でトランスフェクトされる、ならびに／あるいは
    －前記細胞の前記ＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）に影響を及ぼす化学物質と接触させられる、
    請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞が、配列番号２５～２８、３８～５８、および／または５９、好ましくは、配列番号２５～２８を含みそれを発現する、１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされる、請求項１６に記載の方法。
19. 前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼが、
    トランスポサーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、例えば、部位特異的リコンビナーゼ、ニッカーゼ、もしくはヌクレアーゼ、例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質、もしくはこれらの任意の組合せ、または
    ホーミングエンドヌクレアーゼ、制限酵素、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくは亜鉛フィンガーニッカーゼ、メガヌクレアーゼもしくはメガニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼもしくは転写活性化因子様エフェクターニッカーゼ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼ、ＤＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＤＮＡガイドニッカーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、ＢｕｒｒＨヌクレアーゼ、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ、それらの改変もしくはキメラバージョンもしくはバリアント、ならびにこれらの任意の組合せ、特に、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくは亜鉛フィンガーニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼもしくは転写活性化因子様エフェクターニッカーゼ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼであり、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドニッカーゼが、任意選択により、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステム、制限酵素、およびこれらの組合せの一部である、
    請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ラムダインテグラーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ｘｂ１インテグラーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、またはＴＰ９０１－１リコンビナーゼである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記第１および／または第２のＤＲＰが、切除、カノニカル相同性指向型修復（カノニカルＨＤＲ）、相同組換え（ＨＲ）、代替的相同性指向型修復（Ａｌｔ－ＨＤＲ）、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、切断に誘導される複製（ＢＩＲ）、代替的末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）、マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）、ＤＮＡ合成依存性マイクロホモロジー媒介型末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）、カノニカル非相同末端結合修復（Ｃ－ＮＨＥＪ）、代替的非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）、損傷乗り越えＤＮＡ合成修復（ＴＬＳ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）、平滑末端結合、一本鎖切断修復（ＳＳＢＲ）、鎖間架橋修復（ＩＣＬ）、ファンコニ貧血（ＦＡ）経路、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記少なくとも１つの第１のＤＲＰが、相同組換え（ＨＲ）であり、前記少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路である、
    前記少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり、前記少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路である、
    前記少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり、前記少なくとも１つの第２のＤＲＰが、相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復経路である、または
    前記少なくとも１つの第１のＤＲＰが、Ａｌｔ－ＥＪ経路、例えば、ＭＭＥＪであり、前記少なくとも１つの第２のＤＲＰが、１つもしくは複数の代替的なＤＮＡ修復経路である、
    請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記上方調整が、
    ａ）前記細胞において、過剰発現を引き起こすことを含めて、前記ＤＲＰの少なくとも１つの成分を発現させること、
    ｂ）前記細胞に、前記ＤＲＰの少なくとも１つの成分を導入すること、および／または
    ｃ）前記細胞を、少なくとも１つの刺激剤、例えば、ＤＲＰの成分の化学的刺激剤、例えば、ＨＲ刺激剤、例えば、ＲＳ－１、および／もしくはＮＨＥＪ刺激剤、例えば、ＩＰ６と接触させること
    を含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記下方調整が、
    ａ）前記細胞を、ＤＲＰの成分の少なくとも１つの阻害剤、例えば、化学的阻害剤、例えば、ＮＵ７４４１、オラパリブ、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤、Ｓｃｒ７、ＫＵ－００６０６４８、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５（セツキシマブ）、化合物４０１（２－（４－モルホリニル）－４Ｈ－ピリミド［２，ｌ－ａ］イソキノリン－４－オン）、バニリン、ウォルトマニン、ＤＭＮＢ、ＩＣ８７３６１、ＬＹ２９４００２、ＯＫ－１０３５、ＣＯ１５、ＮＫ３１４、ＰＩ１０３塩酸塩、およびこれらの組合せの群から選択される、ＮＨＥＪ阻害剤、ミリン、ミリンの誘導体、ＰｏｌＱの阻害剤、ＣｔＩＰの阻害剤、およびこれらの組合せから選択される、ＭＭＥＪ阻害剤、ＨＲ阻害剤、例えば、ＲＩ－１および／またはＢＯ２と接触させること、
    ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの阻害性核酸、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡと接触させるか、もしくは前記細胞においてそれを発現させることによって、ＤＲＰの少なくとも１つの成分を、不活性化もしくは下方調節すること、ならびに／または
    ｃ）前記細胞において、前記ＤＲＰを阻害するタンパク質もしくはそれらの任意の組合せを発現させること
    を含む、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法によって産生された、操作された細胞。
28. 少なくとも１つの導入遺伝子を細胞に導入するためのキットであって、
    １つの容器に、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列もしくはＬＴＲ－レトロトランスポゾン（ＬＴＲ－ＲＴ）配列、例えば、配列番号１および２の挿入部位を含む、少なくとも１つの遺伝子座、好ましくは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７、もしくは配列番号１のヌクレオチド２９０２１～４０２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列、（ｉｉ）少なくとも、配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０、もしくは配列番号２のヌクレオチド２９０２０～３１０２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む遺伝子座、または配列番号１のヌクレオチド２９５２１～３９７４７もしくは配列番号１のヌクレオチド２９５２１～４２４７との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を含み、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０、または配列番号２のヌクレオチド２９５２０～３０５２０との９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、遺伝子座、例えば、挿入部位に組込まれたＥＲＶ配列もしくはＬＴＲ－ＲＴ配列、例えば、配列番号３、を標的とする、ヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼをコードするベクター、ならびに任意選択により、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする少なくとも１つのベクター、
    任意選択により、別個の容器に、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼをガイドする少なくとも１つの標的エレメントをコードする、少なくとも１つのベクター、
    別個の容器に、ＤＮＡ修復経路（ＤＲＰ）の少なくとも１つの刺激剤および／または阻害剤、ならびに／または
    表２のＤＲＰタンパク質のうちの１つもしくは複数をコードする１つもしくは複数の遺伝子、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９、または配列番号２５～２８、３８～５８、および／もしくは５９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、１つまたは複数のベクター、
    ならびに、前記少なくとも１つのヌクレアーゼおよび／もしくはニッカーゼ、ならびに前記少なくとも１つの刺激剤および／もしくは阻害剤を使用して、前記細胞に前記少なくとも１つの導入遺伝子をトランスフェクトする方法の説明書
    を含む、キット。

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