JP2022554165A - ハロゲン結合に基づく分離を実施するための材料および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ハロゲン置換芳香環を含む官能基を有する新規な固定相に関する。標的分子は、ハロゲン結合によってこの固定相と相互作用できる。固定相は、ＳＰＥまたはクロマトグラフ的分離に好適である。

Description

本発明は、ハロゲン置換芳香環を含む官能基を有する新規な固定相に関する。標的分子は、ハロゲン結合によってこの固定相と相互作用できる。固定相は、ＳＰＥおよびクロマトグラフ的分離に好適である。

本発明の背景
ハロゲン結合は、いくつかの分子、ＲＸ（ルイス酸）中のハロゲン原子Ｘの、他の中性またはアニオン性ルイス塩基上の、ルイス塩基の孤立対電子などの負の部位との非共有結合の相互作用を指す。Ｘは、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。ハロゲン結合は、ＲＸ軸の中心にあるハロゲンの表面の最外部位に正の静電的電位の領域、α－ホールが存在することによって説明され得る。相互作用の強度は、塩基、臭素、ヨウ素の順に増加し、およびハロゲンの残基Ｒを修正することによってさらに修正され得る。典型的には、ハロゲン結合の相互作用の強度は、１０～１８０ｋＪ／ｍｏｌであり、およびよって水素結合の強度と同等である。これは、例えば、DOI: 10.2021/acs.chem.rev.5b00484からわかる。

ハロゲン結合は、目下、有機化合物の結晶化学の制御に、超分子化学において、触媒作用において、および分子認識において利用されている。加えて、ハロゲン結合は、分離用途に適用される。Xiao Qing Yan et al.、Analytica Chimica Acta 753 (2012) 48-56は、全フッ素化ヨードアルカンの固相抽出を開示している。P. Peluso et al., Journal of Chromatography A, 1467(2016)228-238は、アトロプ異性体のポリハロゲン化４，４’－ビピリジンのクロマトグラフ的エナンチオ分離を記載している。

ハロゲン結合の原理が、結合のルイス酸部分を形成する分子Ｒ－Ｘを含有するハロゲンを分離するために使用され得るだけではなく、ルイス塩基を分離するためにも使用され得ることがこの度見出された。本発明者らは、所定の分子Ｒ－Ｘを固相に固定化することによって、ルイス塩基部分を含む幅広い種類の標的分子が固定化されたＲ－Ｘと相互作用し得ることを見出した。この相互作用によって、新しいクロマトグラフ的分離原理が確立されることができ、クロマトグラフ的分離にさらなる自由度を提供する。タンパク質でさえ、ハロゲン結合に基づき分離され得ることが示され得た。

本発明の簡単な説明
よって、本発明は、基材および少なくとも１のタイプの官能基を含む固定相であって、
これによって、官能基は、－－－Ｎ（Ｒ’_２）^＋－ＡｒＸであり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ６アリール、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、およびＡｒＸは、

であり、
Ｌは、－－Ｎ（Ｒ’_２）^＋に結合し、
ＸおよびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであるか、またはＦまたはＮＯ_２などの別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、
Ｒは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ６アリールであり、
Ｙは、互いに独立して、ＣまたはＮであり、
これによって、式Ｉにおいて、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、好ましくは、１以上のＸは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、
これによって、式ＩＩにおいて、少なくとも１のＬが存在し、および
これによって、少なくとも１のＹは、Ｃであり、およびこれによって、Ｎである各Ｙについて、このＮにおいてＬ／Ｒ／Ｘは不在であり；
もしくは、官能基は、少なくとも１のＣｌ、ＢｒまたはＩ残基を有する正に帯電した複素環式芳香族基である、
前記固定相に向けられる。

好ましい態様において、少なくとも１のＣｌ、ＢｒまたはＩ残基を有する正に帯電した複素環式芳香族基は、以下の構造：

Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、好ましくは少なくとも１のＸは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである、
の１を有する。

式ＩＩＩにおける、ならびに、以下の式における蛇行線は、基材への連結を示す。これは単結合、または、好ましくは、リンカーまたは別の構造、例としてテンタクル（tentacle）の一部であってもよい。

Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、または電子吸引基または電子供与基であり、
Ｙは、互いに独立して、ＮまたはＰであり、
Ｘは、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、好ましくは、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。

式ＩＶに従う可能な構造の例は、以下である：

別の可能な構造は、式Ｖ、

これによって、基材への接続を提供するものではない、芳香環の１の原子Ａは、Ｏ^＋またはＳ^＋であり、および他の環原子Ａは、Ｃ－Ｘ’であり、Ｘ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
と同様である。

式Ｖに従う可能な構造の例は、以下である：

Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリールまたは電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、好ましくは、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。

Ｏの代わりにＳをもつ同じ構造が可能である。
他の可能な構造は、以下である：

Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’およびＸ’’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリールまたは電子供与基であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６アリール、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、または電子吸引基またはおよび電子供与基であり、およびこれによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、好ましくは、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。

好ましい態様において、官能基の残基または置換基は、Ｃｌ、Ｂｒおよび／またはＩならびにＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキルおよび／または１以上の電子吸引基のみを含む。
好ましい態様において、官能基は、１の複素環式環のみを含む。
別の好ましい態様において、複素環式芳香族基は、１のタイプのヘテロ原子を有する。
好ましい態様において、複素環式環におけるヘテロ原子は、Ｎ原子である。
別の好ましい態様において、官能基の芳香環は、１または２のヨウ素原子で置換されている。

最も好ましい官能基の構造は、以下である：

Ｒ’は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、
ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３または電子吸引基、好ましくはＨ、ＣＨ_３、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ_２であり、
およびＨａｌは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、好ましくはＢｒまたはＩであり、これによって、少なくとも１のＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。

ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、電子吸引基、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ_２であり、
およびＨａｌは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、好ましくはＢｒまたはＩであり、これによって、少なくとも１のＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。

Ｒ’は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、
ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３または電子吸引基、好ましくはＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ_２であり、
およびＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。

Ｒ／Ｌは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、および他のＲ／Ｌは、基材への接続であり、
ＥＷは、Ｈ、ＣＨ_３または電子吸引基、好ましくはＦ、Ｃｌ、ＮＯ_２であり、
およびＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである。

式ＸＩＩＩ（Ｒ^３は、構造ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよび／またはＩＸに従う官能基である）に従うモノマーを使用する下記に記載されるグラフト化プロセスによって作られる、テンタクルとも称される、ポリマー鎖を介して固体支持体に付着される、構造ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩまたはＩＸ、最も好ましくはＶＩＩに従う官能基が極めて好ましい。任意に、加えて、少なくとも１の官能基が構造ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよび／またはＩＸから選択される、２以上の異なる官能基を有するポリマー鎖が生成されるように、他のＲ^３を含む式ＩＩＩに従う他のモノマーが使用され得る。

官能基が１以上の正電荷を有する場合において、負の対イオンがある。対イオンのタイプは重要ではない。好適な対イオンは、ハロゲンイオン、アセタート、ニトラート、トリフラート等々である。
好ましい態様において、官能基は、基材に共有結合的に結合される。
一態様において、基材は、ビーズまたは膜である。
一態様において、官能基は、リンカーを介して基材へ結合される。
一態様において、基材上にグラフト化される、テンタクルとも称される官能基が、ポリマー鎖中に含まれる。
好ましい態様において、基材は、有機ポリマー、好ましくはポリエチレンベースのポリマーまたはポリビニルエーテルベースのポリマーである。

本発明は、本発明の固定相を含む分離デバイスにもさらに向けられる。
好ましい態様において、分離デバイスは、本発明の固定相を含むクロマトグラフィーカラムである。
本発明は、標的分子の少なくとも１の他の化合物からの分離のためのプロセスにさらに向けられ、これによって、上記に記載されるとおりの本発明に従う固定相、好ましくは、分離デバイスにおいて存在するものは、標的分子および少なくとも１の他の化合物を含む液体と接触し、およびこれによって、標的分子は、他の化合物の結合とは異なる固定相への結合を示し、例として、他の化合物よりも強くまたは弱く固定相と相互作用する。

好ましい態様において、化合物が電子を供与できるほど、固定相へより強く結合する。
好ましい態様において、プロセスは、標的分子の少なくとも１の他の化合物からのクロマトグラフ的分離のためのプロセスであり、これによって上記に記載されるとおりの本発明に従う固定相は、クロマトグラフィーカラム中に存在し、および標的分子および少なくとも１の他の化合物を含む液体が、カラムを流れ、これによって、液体中に存在する標的分子および他の化合物が、それらの固定相との相互作用に応じてカラムから溶出される。
好ましい態様において、標的分子は、タンパク質である。

好ましい態様において、プロセスは、本発明に従う固定相ならびに所定のｐＨおよび所定のイオン強度の水性のローディングバッファーを充填すること、および標的分子を同じｐＨであるが別のイオン強度、典型的にはより高いイオン強度の水性の溶出バッファーを用いて溶出することによって実施される。
別の態様において、プロセスは、本発明に従う固定相ならびに所定のｐＨおよび所定のイオン強度の水性のローディングバッファーを充填すること、および標的分子を別のｐＨおよび／または別のイオン強度の水性のバッファーを用いて溶出することによって実施される。
別の態様において、プロセスは、本発明に従う固定相および有機充填媒体を充填すること、および標的分子を同じ媒体またはより極性の媒体を用いて、例としてグラジエント溶出を使用して溶出することによって実施される。有機充填媒体は、１０％を超える水を含まない液体、例として、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ＴＨＦ、ヘプタン、トルエン等々またはそれらの混合物である。

本発明は、異なるｐｌ（等電点）および／または異なるカルボン酸の含量を有するタンパク質の、ハロゲン結合による、好ましくは本発明の従う固定相を使用するクロマトグラフ的分離にさらに向けられる。

図１は、本発明に従う固定相および他のものを用いて行われたクロマトグラムを示す。さらなる詳細は、適用例２．１に見出すことができる。 図２は、本発明に従う固定相および他のものを用いて行われたクロマトグラムを示す。さらなる詳細は、適用例２．１に見出すことができる。

本発明を詳細に説明する前に、かかるものは、変化し得るものであるとおり、特定の組成物またはプロセスステップに限定されない発明であると理解されるべきである。本明細書および添付の請求項に使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に決定づけない限り、複数形の言及を包含することが留意されなければならない。よって、例えば、「リガンド（a ligand）」への言及が複数のリガンドを包含し、「抗体（an antibody）」への言及が複数の抗体等を包含する。
別様に定義されない限り、本明細書中に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解されるとおりの同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書に記載されるとおりの本発明の目的のために定義される。

本明細書に使用されるとき、用語「標的分子」は、１以上の他の成分から単離、分離、または精製される、あらゆる分子、物質または化合物、例として、試料中の不純物を指す。製造および／または精製プロセスにおいて、標的分子は、典型的には、液体中に存在する。液体は、水、バッファー、エタノール、アセトニトリル、へプタンなどの非水性有機溶媒、または指定された液体のあらゆる混合物であってもよい。標的分子の他に、該液体は１以上の不純物を含んでもよい。液体はまた、試料と称されてもよい。液体の組成物は、実施されるプロセスステップに応じて、製造および／または精製の間に変化してもよい。クロマトグラフのステップの後、液体は、クロマトグラフのステップにおいて使用される溶出液のため、典型的には、その前よりも他の溶媒を含む。標的分子の例は、ほぼ２０００ｇ／ｍｏｌまたは２０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する薬物などの、低分子量分子である。標的分子は、タンパク質、例として抗体などの高分子量化合物であってもよい。

用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「抗体」または「ＩｇＧ」は、検体（抗原）に特異的に結合して認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数）または免疫グロブリン遺伝子（複数）によって実質的にコードされるポリペプチドをさらに指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。軽鎖は、ガンマまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、カッパ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それは順に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの夫々を定義する。
例示の免疫グロブリン（抗体）構造単位は、ポリペプチド鎖の二対から構成され、各対は、１の「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１の「重鎖」（約５０～７０ｋＤ）を有し、該鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。各鎖のＮ末端は、抗原認識に関与している約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、これらの軽鎖および重鎖を夫々指す。

抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、およびモノマー形態またはポリマー形態、例えば、ペンタマー形態中に存在するＩｇＭ抗体、および／またはモノマー形態、ダイマー形態、またはマルチマー形態中に存在するＩｇＡ抗体であってもよい。抗体はまた、それらがまたはリガンド特異性結合ドメインを保持する限り、または含むように改変される限り、多特異性抗体（例として、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを包含する。用語「フラグメント」は、損傷のないまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の、一部または部分を指す。フラグメントは、損傷のないまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的処置または酵素処置を介して得ることができる。フラグメントはまた、組み換え手段によって得ることもできる。組み換えで製造された場合、フラグメントは、単独で、または融合タンパク質と称されるより大きいタンパク質の一部として表現されてもよい。例示のフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントを包含する。例示の融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質を包含する。本発明に従って、融合タンパク質は、用語「抗体」によっても網羅される。
いくつかの態様において、抗体は、タンパク質、例として免疫グロブリンを含有するＦｃ領域である。

本明細書に使用されるとき、および別要に述べられない限り、用語「試料」は、標的分子を含有するあらゆる組成物または混合物を指す。試料は、生物学的供給源または他の供給源に由来してもよい。生物学的供給源は、動物またはヒトなどの真核生物供給源を包含する。試料はまた、標的分子と混合されることが見出される、希釈剤、バッファー、洗浄剤、および汚染種等を包含してもよい。

本明細書に使用されるとき、用語「不純物」または「夾雑物」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１以上の宿主細胞タンパク質、核酸、エンドトキシン、脂質、合成起源の不純物、および１以上の外来分子または好ましくない分子から分離される標的分子を含有する試料中に存在していてもよい１以上の添加剤などの生物学的高分子を包含する、あらゆる外来分子または好ましくない分子を指す。

本明細書に互換的に使用される用語「精製する」、「分離する」、または「単離する」は、標的分子および１以上の他の成分、例として不純物を含む組成物または試料から標的分子を分離することによって、標的分子の純度を増加させることを指す。典型的には、標的分子の純度は、組成物から少なくとも１の不純物を（完全または部分的に）除去することによって増大される。

用語「クロマトグラフィー」は、目的とする検体（例として、標的分子）を混合物中に存在する他の分子から分離するあらゆる種類の技法を指す。大抵、標的分子は、混合物の個々の分子が移動相の影響を受けた固定相を介して、または結合プロセスおよび溶出プロセスにおいて、移動する速度における差の結果として他の分子から分離する。クロマトグラフ的分離プロセスの例は、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーである。本発明のクロマトグラフィープロセスは、ハロゲン結合、ならびに上記に言及されたあらゆる追加的な１以上の他の分離プロセスに基づく。

「バッファー」は、酸塩基共役成分の作用によるｐＨにおける変化に抵抗する溶液である。様々なバッファーが、例えば、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)に記載されるバッファーの所望されるｐＨに依存して採用され得る。バッファーの非限定例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Tris、ＨＥＰＥＳ、ホスファート、アセタート、シトラート、スクシナート、グリシンおよびアンモニウムバッファーならびにこれらの組み合わせを包含する。水性バッファーは、溶媒が９０％超、好ましくは１００％の水を含むバッファーである。

用語「固定相」は、標的分子を混合物中に存在する他の分子から分離する分離プロセスにおける、あらゆる種類の吸着剤、マトリックス、樹脂または固相を指す。大抵、標的分子は、混合物の個々の分子が固定相に結合する速度および／または移動相の影響を受けて固定相を介して移動する速度における差の結果として、他の分子から分離される。固定相は、カラムまたはカートリッジ中に入れることができる。本発明に従う固定相は、少なくとも１のタイプの官能基を含む。

「官能基」は、固定相の基材に付着し、および固定相の結合特性を決定するリガンドである。「官能基」の例は、これらに限定されないが、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオ親和性（thiophilic）相互作用基、金属親和性基、親和性基、バイオアフィニティー基、および混合モード基（先述の組み合わせ）を包含する。本発明に従う固定相は、少なくともハロゲン結合の官能基を含む。それらは、上記に列挙されるとおりの追加的な１以上の他の基を含んでもよい。しばしば、１の官能基は、１より多くの結合特性を有する。

結合および溶出モードにおけるクロマトグラフィーカラムを「充填する」とき、バッファーは、標的分子および１以上の不純物を含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラムに充填するために使用される。バッファーは、標的分子が固定相に結合し、一方で理想的にはすべての不純物が結合せず、およびカラムに流通するように、導電率および／またはｐＨを有する。結合標的分子の１以上の不純物からの分離は、標的分子が洗浄されるか、または１以上の不純物の前または後に溶出されるように、導電率および／またはｐＨの変化を用いて追加的に行うことができる。

典型的には、試料が固定相上に充填されるバッファーは、ローディングバッファーまたは試料バッファーと称される。
標的分子を「流通させる」ためにクロマトグラフィーカラムを「充填する」とき、バッファーは、標的分子および１以上の不純物を含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラムに充填するために使用される。バッファーは、標的分子が固定相に結合してカラムに流通し、一方で理想的にはすべての不純物がカラムに結合しなように、導電率および／またはｐＨを有する。

用語「平衡化」は、標的分子のローディングに先立ち、固定相を平衡化させるために使用するバッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーは、平衡化のために使用される。
固定相を「洗浄」または「洗浄すること」は、適切な液体、例としてバッファーを固定相に通過させるかまたは通り越させることを意味する。典型的には、洗浄することは、標的分子の溶出に先立ち結合／溶出モードにおいて固定相から弱く結合する夾雑物を除去する、またはローディング後に結合しないかまたは弱く結合する標的分子を除去するために使用される。
このケースにおいて、典型的には、洗浄バッファーおよびローディングバッファーは同じである。ウイルス不活化バッファーが使用される場合、標的分子の溶出に先立ち所定の存在するウイルスを不活化させるために使用される。このケースにおいて、典型的には、ウイスル不活化バッファーは、洗浄剤（単数）／洗浄剤（複数）を含有するかまたは異なる特性（ｐＨ／導電率／塩またはそれらの量）を有し得るため、ローディングバッファーとは異なる。

洗浄することはまた、標的分子の溶出後に固定相から夾雑物を除去するためにも使用され得る。これは、標的分子の溶出後に、適切な液体、例としてバッファーを固定相に通過させるか通り越させることによって行われる。このケースにおいて、典型的には洗浄バッファーは、ローディングバッファーとは異なる。それは、洗浄剤（単数）／洗浄剤（複数）を含有するかまたは異なる特性（ｐＨ／導電率／塩またはそれらの量）を有し得る。洗浄バッファーは、例えば、酸性のバッファーであり得る。

分子（例として、標的分子または不純物）を固定相から「溶出」することは、そこから分子を除去することを意味する。溶出は、標的分子がローディングバッファーの溶媒フロントを用いて溶出されるとき、フロースルーモードにおいて直接的に行われてもよく、または、ローディングバッファーとは異なるバッファーが固定相上のリガンドに対して目的分子と競合するように、溶液条件を変更することによって行われてもよい。非限定例は、バッファーがイオン交換材料上の帯電した部位に対して分子と競合するようにイオン交換材料を取り囲むバッファーのイオン強度を変更することによって、分子をイオン交換樹脂から溶出する。

本明細書において互換的に使用される、用語「フロースループロセス」、「フロースルーモード」および「フロースルー操作」は、１以上の不純物と共に試料中に含有される少なくとも１の標的分子が、大抵１以上の不純物を結合するクロマトグラフィー固定相を流れることが意図され、ここで、標的分子は大抵結合せず（すなわち、流通する）、およびローディングバッファーを用いて固定相から溶出される分離技法を指す。
用語「結合および溶出モード」および「結合および溶出プロセス」は、本明細書中で使用されるとき、試料中に含有される少なくとも１の標的分子が好適な固定相に結合し、ローディングバッファーとは異なるバッファーを用いて溶出される分離技法を指す。

固相抽出（ＳＰＥ）は、液体混合物中に溶解されるかまたは懸濁される化合物がそれらの物理的および化学的特性に応じて他の化合物から分離される試料の調製方法である。結果は、試料中の標的分子または望ましくない不純物のいずれかが固定相上に保持される。固定相を通過する部位は、それが標的分子または望ましくない不純物のを含有するかどうかに応じて回収されるかまたは処分される。固定相上に保持される部位が標的分子を包含する場合、次いでそれらは追加のステップにおいて回収のために固定相から除去され、ここで固定相は適切な溶出液を用いてリンスされる。

粒子サイズは、レーザー回折によって、好ましくはMalvern ‘Master Sizerを用いたものによって決定される。
孔サイズは、inverse SECによって決定される。粒子サイズは、ふるいによって決定される。
電子吸引基は、水素、および電子吸引誘導効果および／またはメソメリー効果を有し、および水素より電気陰性である原子または原子の基を包含する。例示の電子吸引基は、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＯ_２Ｈ、ＮＯ_２、ＣＮである。
電子供与基は、電子供与誘導効果および／またはメソメリー効果を有し、および水素よりも電気陰性の小さい原子または原子の基を包含する。例示の電子供与基は、－ＯＨ、Ｏ－アルキルである。

アルキルまたはアルキル基は、典型的には１～２０個のＣ原子を有するかまたは指し示されるとおりのＣ原子の数を有する、直鎖または分枝のアルキル基、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチルまたはｔｅｒｔ－ブチル、さらにまたペンチル、１－、２－または３－メチルブチル、１，１－、１，２－または２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、ｎ－へプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシルまたはｎ－ドデシル、ｎ－トリデシル、ｎ－テトラセシル、ｎ－ペンタデシル、ｎ－ヘキサデシル、ｎ－へプタデシル、ｎ－オクタデシル、ｎ－ノナデシルまたはｎ－エイコシルを示し、好ましくは、アルキル基は、１～１０個のＣ原子を有する。

アルケニルまたはアルケニル基は、典型的には２～２０個のＣ原子を有し、ここで、加えて複数の二重結合が存在していてもよい、直鎖または分枝のアルケニル基を示し、例えば、アリル、２－または３－ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ－ブテニル、さらにまた４－ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、－Ｃ_９Ｈ_１７、－Ｃ_１０Ｈ_１９～－Ｃ_２０Ｈ_３９；好ましくはアリル、２－または３－ブテニル、イソブテニル、ｓｅｃ－ブテニルである。
アリールまたはアリール基は、典型的には６～１２個のＣ原子を有するアリール基、例えば、フェニル、ナフチルまたはアントラセニルを示し、それは非置換であるか、またはＨａｌ、ＮＨ_２、ＮＡｌｋ_２、ＮＨアルキル、ＮＯ_２、ＣＮ、ＳＯ_３ＨまたはＯアルキルによって置換されていてもよい。置換は、指し示される置換基によって１回または複数回、好ましくは１回行われてもよい。

本発明は、クロマトグラフィーのためまたは固相抽出のための、樹脂またはマトリックスとも称される分離材料として使用され得る固定相の新しいクラスを提供する。本発明に従う固定相は、基材および好ましくは基材に共有結合的に付着する官能基を含む。ハロゲン結合の原理が、芳香環に接続するＣｌ、Ｂｒまたは好ましくはＩを有し、これによって芳香環が環に直接隣接する正電荷に起因するかまたは環内の正電荷のいずれかに起因して正電荷である官能基を含む固定相への異なる結合に基づき、混合物において標的分子を他の化合物から分離するために使用され得ることが見出された。芳香環構造に連結されているハロゲン原子と組み合わされた正電荷は、ルイス塩基への有効なハロゲン結合を可能にするハロゲン原子における有効なシグマホールをもたらす。

基材は、粒子サイズが２および１０００μｍの間であり得る、規則的に成形された粒子または球状の粒子からなっていてもよい。３および３００μｍの間の粒子サイズが好ましい。
基材は、とりわけ、非多孔性のコアシェル、または好ましくは多孔質の粒子の形態であってもよい。孔サイズは、２および３００ｎｍの間であり得る。５および２００ｎｍの間の孔サイズが好ましい。
基材は、同様に、また、膜、繊維、中空繊維、コーティング、フィルター、毛細管、面またはモノリシック成形体の形態であってもよい。モノリシック成形体は、好ましくは、多孔質の三次元体、例えば、円柱状の形態である。好ましくは、基材は、多孔質のビーズまたは膜である。基材はまた、３Ｄプリンティングなどの追加的な製作によって作られてもよい。

一態様において、基材は、無機材料、例としてＳｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムなどの金属酸化物から作られるものである。それはまた、制御された孔のガラスなどの他のシリカベース材料から作られてもよい。
基材は、無機－有機ハイブリッド材料、または有機材料および無機材料のあらゆる他の組み合わせであってもよい。
別の態様において、基材は、天然ポリマー、好ましくは多孔質のビーズの形態におけるもの、例として、アガロース、セルロース、セルロース誘導体に基づく多糖類およびデキストランに基づくポリマーから作られる。天然ポリマービーズは、例として、Sepharose（登録商標）またはSephadex（登録商標）として知られる種類である。代替態様において、基材は、合成ポリマー、好ましくは、多孔質のビーズまたは膜の形態における、架橋された合成ポリマー、例えば、スチレンまたはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリラートエステル、メタクリラートエステル、ビニルエステル、ビニルアミド等々からなるものから作られる。ポリスチレン、ポリビニルアルコールまたは（メタ）アクリラート誘導体のコポリマーに基づくポリマーおよび脂肪族ヒドロキシル基をもつコモノマーが好ましい。所定のタイプの構造、例として、ポリスチレンまたはポリビニルエーテルポリマーに基づくポリマーは、該構造を含むポリマーである。それらはまた、他の構造、例として、２の異なるモノマーの共重合からもたらされるものを含んでもよい。

別の好ましい態様において、基材は、ポリビニルエーテルベースの材料、とくに基ａ）およびｂ）からの少なくとも１の化合物の共重合によって形成されるコポリマーであり、
ａ） 式ＩＸで表される少なくとも１の親水性置換アルキルビニルエーテル、

ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、相互に独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは－ＣＨ_３であり得、
およびＲ４は、少なくとも１のヒドロキシル基を有するラジカルであり、
および

ｂ） 式Ｘおよび／またはＸＩおよび／またはＸＩＩに適合する少なくとも１の架橋剤、

ここで、Ｘは、２～５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、ここで、Ｎに隣接せず、および近接して位置付けられない１以上のメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられていてもよく、およびメチレン基の１以上のＨ原子は、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル、Ｎ－（Ｃ１～Ｃ８）－アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨによって置換されていてもよく、および

ここで、式ＸＩおよびＸＩＩにおけるＹ１およびＹ２は、相互に独立して、
Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはシクロアルキル、ここで、１以上の非隣接メチレン基またはＮに近接して位置付けられないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられていてもよく、およびメチレン基の１以上のＨは、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨによって置換されていてもよく、
または、Ｃ６～Ｃ１８アリール、ここで、アリール系における１以上のＨは、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨによって置換されていてもよい、であり、および

Ａは、２～５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、ここで、１以上の非隣接メチレン基またはＮに近接して位置付けられないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えられていてもよく、およびメチレン基の１以上のＨは、相互に独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ハロゲン、ＮＨ_２、Ｃ５～Ｃ１０－アリール、ＮＨ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１～Ｃ８）アルキル_２、Ｃ１～Ｃ６－アルコキシまたはＣ１～Ｃ６－アルキル－ＯＨによって置換されていてもよい。
式ＩＸにおけるＲ４は、典型的には、少なくとも１のヒドロキシル基を有する、アルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたはアリールラジカルである。

極めて好ましい態様において、マトリックスは、架橋剤としての、１，４－ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５－ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルおよびジビニルエチレンウレア（１，３－ジビニルイミダゾリン－２－オン）の群から採用され選択される親水性置換アルキルビニルエーテルの共重合によって形成される。
好適な市販のビニルエーテルベースの基材の例は、Eshmuno（登録商標）、Merck KGaA、Germanyである。

上記に定義されるとおりの官能基は、基材へ付着される。これは、非共有結合性、または好ましくは共有結合性付着を介して行われ得る。共有結合性付着は、例えば、官能基を、ＯＨ、ＮＨ_２、カルボキシル、フェノール、無水物、アルデヒド、エポキシドまたはチオール等々の基材上の好適な残基へ直接結合させることによって実施され得る。

好適なリンカーを介した官能基の付着もまた可能である。好適なリンカーの構造は、
－－Ｘ－－Ｚ－－Ｙ－－、ここで、ＸおよびＹは、第一および第二の反応性または活性化可能な基であり、およびＸおよびＹは、各々独立して、例えば、ヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシ、オキシラニル、ホルミル、ハロ、イソシアナート、およびクロロ スルホニルなどの部分から選択され得；およびＺは、例えば、
（ａ）Ｃ１～Ｃ１５アルキル、
（ｂ）アリール
（ｃ）Ｃ１～Ｃ１０アルキルアリール、
（ｄ）Ｃ１～Ｃ１０アルキルアリール、Ｃ１～６アルキル、ここで、アルキルの１、２以上の炭素原子は、酸素、硫黄または窒素によって置き換えられていてもよく、およびここで、アリールは、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、ピリジルまたはチエニルを包含し、およびここで、１以上の炭素原子は、ＯＨまたはＣ～Ｃ６アルキルで置換されていてもよく；および
（ｅ）２～１０個のアミノ酸のペプチド、該アミノ酸は、これらに限定されないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシ－リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、オルニチン、ベータ－アラニン、ホモセリン、ホモチロシン、ホモフェニルアラニンおよびシトルリンを包含する、Ｌ体およびＤ体のアミノ酸を包含する、
などの基から選択され得る。

他の好適なスペーサー基は、これらに限定されないが、ｐ－ベンゾキノン、ビス－（ジアゾベンジジン）、３，６－ビス－（メルクリメチル）ジオキサン、ビスオキシラン、シアヌルクロリド、ｐ，ｐ’－ジフルオロ－ｍ，ｍ’－、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジニトロフェニルスルホン、ジメチルアジポイミダート、ジメチルスペルイミダート、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス－（ヨードアセトアミド）、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンビス－（マレ－イミド）、ヘキサメチレンジイソシアナート、Ｎ，Ｎ’－１，３－フェニレン－ビス－（マレイミド）、フェノール－２，４－ジスルホニルクロリド、テトラ－アゾ化ｏ－ジアニシジン、トルエンジイソシアナート、ウッドワーク試薬Ｋ（Woodward's K reagent）、水溶性カルボジイミド、６－アミノヘキサン酸、ヘキサメチレンジ－アミン、１，７－ジアミノ－４－アザ－ヘプタン（３，３’－ジアミノ－ジプロピルアミン）、およびアミノ酸またはペプチドを包含してもよい。

官能基および重合性部分を含むモノマーを重合することによって、本発明に従う固定相を生成することもまた可能である。好適なモノマーの重合によって生成される固定相の例は、好適なスチロールまたはアクリロイルモノマーを重合することによって生成されるポリスチレン、ポリメタクリルアミドまたはポリアクリルアミドベースの固定相である。

別の態様において、固定相は、基材上に官能基をグラフト化することによって生成され得る。
「グラフト化する」場合、ポリマー鎖は、第一にモノマーから形成され、および第二ステップにおいて基材の表面に結合されなければならない。「グラフト化を受ける」場合、重合反応は、基材の表面上で開始され、およびグラフトポリマーは個々のモノマーから直接構築される。
「グラフト化を受ける」方法が好ましく、および分離されなければならない非共有結合的に結合されたポリマーなどの副産物がほとんと形成されないバリアントが具体的に好ましい。制御されたフリーラジカル重合、例えば、原子移動フリーラジカル重合（ＡＴＲＰ）の方法などを用いたプロセスが好適である。ここで、開始基は、第一のステップにおいて、所望される密度において、基材の表面に共有結合的に結合される。開始基は、例えば、２－ブロモ－２－メチルプロピオン酸エステルなどのエステル官能基を介して結合されるハロゲン化物であり得る。グラフト重合は、銅（Ｉ）塩の存在下の第二ステップにおいて実行される。

本発明の固定相の製造のための好適な重合反応からの極めて好ましいワンステップグラフト化は、ヒドロキシルを含有する支持体上のセリウム（ＩＶ）によって、支持体を活性化することなく、開始され得る。
グラフト化を開始するこのセリウム（ＩＶ）は、好ましくは、EP 0 337 144またはUS 5,453,186に従って実行される。製造された鎖は、モノマーユニットを介して基材へ連結される。この目的のために、本発明に従う基材は、モノマーの溶液中に、好ましくは水性溶液中に懸濁される。ポリマー材料へのグラフト化は、酸素を排除した従来の酸化還元重合の経過中に生じる。採用される重合の触媒はセリウム（ＩＶ）イオンであり、この触媒はモノマーのグラフト重合が開始される基材の表面上のフリーラジカル部位を形成するためである。この反応は、通常、希釈鉱酸において実行される。このグラフト重合を実行するために、酸は、通常、水性溶液において、１～０．００００１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１～０．００１の範囲における濃度で採用される。０．１～０．００１ｍｏｌ／ｌの範囲における濃度で採用される希釈硝酸の使用が、極めて具体的に好ましい。

本発明に従う分離材料の調製のため、モノマーは、通常、基材へ過剰に添加される。典型的には、堆積されたポリマー材料のリットルあたり０．０５～１００ｍｏｌの総モノマーが採用され、好ましくは０．０５～２５ｍｏｌ／ｌが採用される。
重合は、セリウム塩を伴う停止反応によって停止される。この理由のため、（平均）鎖長は、基材、開始剤およびモノマーの濃度比率によって影響され得る。さらにまた、均一なモノマーまたは異なるモノマーの混合物も採用され得る；後者の場合において、グラフト化コポリマーが形成される。

本発明に従う分離材料の調製のめに好ましく使用されるモノマーは、式ＸＩＩＩに従うものであり、

Ｒ^１、Ｒ^２およびＹは、互いに独立して、ＨまたはＣＨ_３、好ましくはＨである。
Ｒ^３は、本発明に従う官能基または本発明の官能基を含む化学構造である。

本発明に従う分離材料は、好ましくは、式ＸＩＩＩに従うモノマーから構築される、基材上にグラフト化されるテンタクル様の線状ポリマー構造体のみを含有する。好ましくは、それらは、式ＸＩＩＩに従う１つのタイプのモノマーによってのみ構築される線状ポリマーを含有する。
しかし、式ＸＩＩＩに従う２以上の異なるモノマーの共重合によって構築される線状ポリマーもまた可能である。式ＸＩＩＩに従う１以上の異なるモノマー、および、他のアクリルアミド、メタクリラート、アクリラート、メタクリラート等々の、例として、イオン性基、親水性基または疎水性基を用いて官能化される、１以上の他の重合性モノマーの共重合によって構築される線状モノマーもまた可能である。

異なるプロセスによって作られる本発明に従う固定相についても同じことが当てはまる。それらは、上記に記載されるとおりのハロゲン結合のための１、２以上の官能基、ならびにハロゲン結合のための官能基の近くにさらなる官能基を含んでもよい。これは、例えば、イオン性基、親水性基または疎水性基であってもよい。２の異なる官能基を用いて固定相を生成することによって、両方または数個のタイプの官能基からもたらされる分離特性をもつ混合モード材料を得て、これによって、本発明の場合において、少なくとも１の官能基は、ハロゲン結合に好適である。

本発明はさらに、本発明に従う固定相を含む分離デバイスにも向けられる。デバイスは、例えば、固相抽出のため、またはクロマトグラフ適用のために使用され得る。いずれの場合においても、それは、固定相を保持するための手段を含む。固定相は、デバイスによって取り囲まれていているか、またはそれに付着されていてもよい。一態様において、デバイスは、入口および出口を備えるハウジングを含む。別の態様において、それは、平板またはピンであり、固定相がその片側に付着されている。別の態様において、それは、固定相を含むフィルターである。好ましい態様において、デバイスは、本発明に従う上記に記載される固定相を含むクロマトグラフィーカラムである。クロマトグラフィーカラムは、当業者に知られている。典型的には、固定相で満たされた円柱状の管またはカートリッジ、および／または、管またはカートリッジ中に固定相を取り付けるための手段、および任意に、管またはカートリッジにおよび管またはカートリッジから溶媒を送達するための接続部を含む。クロマトグラフィーのサイズは、用途、例として、分析または分取に応じて変動する。

本発明に従う固定相はまた、分離エフェクターを備えて提供される基材としても記載されることができ、これによって、少なくとも１の分離エフェクターは、上記に定義されるとおりの官能基を含む。それらは、１以上の標的分子の試料液体からの分離を目的とした、選択的、部分的に選択的または非選択的結合または吸着、または二次成分のマトリックスからの分離を目的としたに１以上の二次成分の選択的、部分的に選択的または非選択的な結合または吸着、天然供給源からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または削減、組み換え供給源からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または削減、タンパク質およびペプチドの単離、濃縮および／または削減、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の単離、濃縮および／または削減、ウイルスの単離、濃縮および／または削減、宿主細胞タンパク質の単離、濃縮および／または削減、ＡＤＣの単離、濃縮および／または削減、アルカロイド、ジグリセリドまたはトリグリセリドなどの脂質、炭水化物、核酸または他の生体分子の単離、濃縮および／または削減に使用され得る。

標的分子は、試料からの少なくとも１以上の他の物質から分離され、これによって標的分子を含む試料は、液体であるか、または、本発明に従う固定相と接触させられる液体中に溶解される。接触時間は、大抵、３０秒～２４時間の範囲内である。液体を本発明の固定相を含有するクロマトグラフィーカラムに通過させることによって、液体クロマトグラフィーの原理に従って稼働させることが有利である。液体は、その重力のみを通じてカラムを流れることができ、または、それはポンプを用いて送り込まれることもできる。代替の方法は、標的分子が固定相を結合する必要がある限り、攪拌または振盪することによって固定相が液体と混合される、バッチクロマトグラフィーである。分離される液体を、例えば固定相を含む懸濁液中に導入することによって、クロマトグラフ的流動床の原理に従って稼働させることも同じく可能であり、ここで、分離材料は、その高密度および／または磁気コアにより所望される分離に好適であるように選択される。

クロマトグラフ的プロセスが結合および溶出モードにおいて行われる場合、標的分子は本発明に従う固定相に結合する。固定相は、任意に、続いて、洗浄バッファー、好ましくは、標的分子が固定相と接触させられる液体と同じイオン強度および同じｐＨを有するものを用いて洗浄され得る。洗浄バッファーは、固定相に結合しないすべての物質を除去する。他の好適なバッファーを用いたさらなる洗浄ステップが、標的分子を脱着させることなく、続いてもよい。結合した標的分子の脱着は、溶出液中のイオン強度を変化させることによって、および／または、溶出液中のｐＨを変化させることによって、および／または、溶媒を変化させることによって実行される。よって、標的分子は、溶出液中に精製または濃縮された形態において得ることができる。標的分子は、固定相から脱着後、大抵、７０パーセントから９０パーセント、好ましくは８５パーセントから９９パーセント、具体的に好ましくは９０パーセントから９９パーセントの純度を有する。

しかしながら、クロマトグラフ的プロセスがフロースルーモードにおいて行われる場合、標的分子は液体相中に残存するが、他の付随する物質は固定相に結合する。次いで、標的分子は、スルーフローにおいてカラム溶出液を回収することによって直接的に得られる。本発明に従う固定相は、多くの異なる用途に使用され得る。それらは、例えば、親水性分離および疎水性分離に、ならびに水性分離および非水性分離に使用され得る。
インスリンなどのタンパク質は、例えば、官能基が結合する親水性基材を含む固定相上で好適に精製され得る。好ましくは、官能基は、基材上にグラフト化される。例２．１は、この用途のための１の好適な固定相を示す。次いで、クロマトグラフ的分離は、中性ｐＨにおける水性バッファー系を使用することによって、および、溶出のためのバッファーのイオン強度を増加させることによって、例として、塩化ナトリウムを添加することによって実施される。

本発明のクロマトグラフィーカラムを使用するハロゲン結合によって、異なるｐｌ（等電点）および／またはカルボン酸の異なる含量を有する２のタンパク質を分離することもまた可能である。カルボン酸、とくにタンパク質の表面にさらされるものは、ハロゲン結合によって固定相と相互作用し得る。固定相と相互作用し得るカルボン酸基のより高い含量をもつタンパク質は固定相とより強く結合し、および高い導電率を用いて溶出される必要がある。これは、例２．２においても示される。
しかし、官能基が好ましくはグラフト化することによって結合する親水性基材に基づく固定相は、有機溶媒系において標的分子の分離にも使用され得る。この場合において、ローディングおよび溶出は、同じ溶媒を用いて、または、充填溶媒と比較してより極性な溶媒の量をゆっくり増加させることによる溶媒勾配を用いて行われ得る。
本発明に従う固定相は、また、ポリスチレンなどの疎水性基材を含み得る。官能基は、例えば、好適なリンカーを介してポリスチレン基材に接続され得る。かかる固定相は、ローディングおよび溶出のための有機溶媒を使用して低分子量化合物の分離に好適に適用され得る。

本発明に従う固定相およびプロセスは、幅広く適用可能である新しいクロマトグラフ的分離の原理を提供する。正に帯電したかまたは帯電可能な芳香環構造に結合される少なくとも１のＣｌ、ＢｒまたはＩを含む官能基の使用は、特定の分離タスクに調整され得る広範なリガンドを提供する。ハロゲンの選択は、例えば、標的分子との相互作用の強度に影響し得る。典型的には、ヨウ素は最も強い相互作用を示し、これにＢｒが続き、一方で塩素置換された官能基は最も強くない。
加えて、所定の芳香環構造または残基を選ぶことによって、相互作用のモードもまた改変され得る。例えば、典型的には、芳香環構造における電子吸引残基はハロゲン結合効果を増大させ、これによって電子供与基またはアルキル基はハロゲン結合の強度を減少させる。標的分子および実施される分離に応じて、官能基のハロゲン結合の強度は調整され得る。Ｈの近くに１のＣｌ、ＢｒまたはＩ残基のみを含み、および他の残基を含まない構造を用いて開始することができる。強度が増大される場合、ハロゲン原子のタイプはＢｒまたはＩに変化されることができ、および／または、ハロゲン原子の数が増加されることができ、および／または追加の電子吸引残基が挿入されることができる。他方、ハロゲン結合の強度が減少される場合、ハロゲン結合のタイプはＢｒまたはＣｌに変化されることができ、および／または、電子供与基、例としてＯ－アルキル基、またはアルキル基が挿入されることができる。

一態様において、本発明に従う固定相のハロゲン結合の特性は、オンオフされ得る。式ＩまたはＩＩに示されるとおりの官能基を含み、アニリン様の種の窒素原子をプロトン化させることによって芳香環に隣接する正電荷を含む固定相を使用するとき、低ｐＨ条件下で固定相を「活性化させる」ことが可能である。芳香環に隣接する窒素原子がプロトン化される限り、それは電子吸引基として作用し、これによって芳香環に隣接して位置付けられるハロゲン原子においてシグマホールを支持し、およびよってハロゲン結合を介して標的分子を結合する。次いで、ｐＨを上昇させ、およびＮ原子を脱プロトン化して、およびこれによって電子吸引機能を排除することによって、固定相を「不活性化させる」ことによって、溶出が実施され得る。

高濃度の、塩化ナトリウムなどの塩を使用することによって、固定相のクーロン相互作用を抑制することもまた可能である。
さらなる詳説なしに、当業者は先述の記載を使用して、本発明を最大限に使用することができる。したがって、好ましい特定の態様および例は、単に例示として解釈されるべきであり、および何であれいずれにしても、本開示に記載の残りの部分を限定するものではない。
上記および下記で引用されるすべての出願、特許、および刊行物、ならびに２０１９年１０月２４日に提出された対応するＥＰ出願EP19205109.2の全体の開示は、ここで、参照によって組み込まれる。

例
以下の例は、本発明の実際の適用を提示する。
合成
Ｎ－（２－アミノエチル）－ピリジニウムクロリド塩酸塩の合成

丸底フラスコを、２－クロロエチルアミン塩酸塩（４．０４ｇ、３４．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）およびピリジン（５．４０ｍＬ、６８ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）で満たす。水（１４ｍＬ）の添加後、二相系を攪拌し、１４時間加熱して還流する。透明な黄色の溶液をトルエン（２×２５ｍＬ）、ｎ－ペンタン（２０ｍＬ）およびイソプロピルアルコール（３×５０ｍＬ）を用いて洗浄し、真空中で蒸発乾固させる。Ｎ－（２－アミノエチル）－ピリジニウムクロリド塩酸塩を無色固体として得る。
収率：５．５４ｇ（２８．４ｍｍｏｌ、８２％）。
1H-NMR (D₂O,300MHz): δ = 3.80 (m,2H,H₂N-CH₂),5.08 (m,2H,H₂C-N_pyridine),8.24 (m,2H,meta-H),8.71 (m,1H,para-H),9.03 ppm (m,2H,ortho-H)。
Ｍｐ．：１９９～２０２℃。
MS (ESI) pos.: 123.0 (100 ％) [M]⁺、281.1 (22 ％)、2[M]⁺ Cl-。

Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリド塩酸塩の合成

エタノール（１００ｍＬ）中２－クロロエチルアミン塩酸塩（３０．２ｇ、２６０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）および３－ブロモピリジン（４６．０ｇ、２９１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）の溶液を攪拌し、２週間加熱して還流する。沈殿物を濾過し、エタノール（５×５ｍＬ）を用いて洗浄する。Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリド塩酸塩を無色固体として得る。濾過物を部分的に蒸発させ、１週間再加熱して還流する。その結果得られる無色の固体をエタノール（５×５ｍＬ）を用いて洗浄し、真空中で蒸発乾固させ、先の生産物に添加する。
収率：４１．２ｇ、（２１１ｍｍｏｌ、８１％）。
¹H-NM,R (D₂O、300 MHz): δ = 3.68 (t,2H,J = 7 Hz,H₂N-CH₂),4.95 (t,2H,J = 7 HzH₂C-N_pyridine),8.03 (m,1H,meta-H),8.79 (m,1H,para-H),8.94 (m,1H,ortho-CH-CH-) 9.25 ppm (m,1H,ortho-CH-CBr-)。
元素分析: calc.: Ｎ １０．２６％、Ｃ ３０．６９％、Ｈ ４．０５％、測定された：Ｎ １０．３４％、Ｃ ３０．７６％、Ｈ ３．９９％。
Ｍｐ．：２３７℃
MS (ESI) pos.: 202.9 (100 ％) [M]⁺、157.8 (6 ％) ［３－ブロモピリジニウム］^＋。

Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ヨードピリジニウムクロリド塩酸塩の合成

２－クロロエチルアミン塩酸塩（３０．０ｇ、２５９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をエタノール（１００ｍＬ）中３－ヨードピリジン（５７．２ｇ、２７９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を用いて溶解させ、攪拌し、１週間加熱して還流する。沈殿物を濾過し、エタノール（６×２０ｍＬ）を用いて洗浄する。Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリド塩酸塩を無色固体して得る。濾過物を部分的に蒸発させ、１週間再加熱して還流する。その結果得られる無色固体をエタノール（４×５ｍＬ）を用いて洗浄し、真空中で蒸発乾固させ、先の生産物に添加する。この手順を、７６％の全収率になるまで繰り返す。
収率：６８．２ｇ、（２１３ｍｍｏｌ、７６％）。
Ｍｐ．：２６８．２℃
元素分析：calc.: Ｎ ８．７３％、Ｃ ２６．１９％、Ｈ ３．４５％、測定された：Ｎ ８．８２％、Ｃ ２６．２４％、Ｈ ３．４１％。
MS (ESI) pos.: 248.9 (100 ％) [M]⁺。
¹H-NMR (D₂O,300 MHz): δ = 3.64 (t,2H,J = 7 Hz,H₂N-CH₂),4.88 (t,2H,J = 7 Hz,H₂C-N_pyridine),7.84 (t,J = 6 Hz 1H,meta-H),8.91 (m、2H、para-H、ortho-CH-CH-),9.28 ppm (s、1H、ortho-CH-CBr-)。

１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドの合成

Ｎ－（２－アミノエチル）－ピリジニウムクロリド塩酸塩（３８．６ｇ、１４７ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）、次いでジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解し、トリブチルアミン（５４．７ｇ、２９５ｍｍｏｌ）およびメタクリル無水物（２４．８ｇ、１６１ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を室温にて１８時間攪拌し、次いで残存するＮ－（２－アミノエチル）－ピリジニウムクロリドについて^１Ｈ－ＮＭＲ分光法によって確認する。この場合、ジクロロメタンを再度用いて水性層を分離および混合し、残存する抽出物に従ってトリブチルアミンおよびメタクリル無水物を添加する。水性層を分離し、ジクロロメタン（２×５０ｍＬ）を用いて洗浄する。生成物の重合の性質のため、収率を、テトラフェニルホスホニウムクロリドを用いた水性溶液中で、^１Ｈ－ＮＭＲ分光法によって決定する。
収率：２６．２ｇ（１１６ｍｍｏｌ、７１％）
MS (ESI) pos.: 191.0 (100 ％) [M]⁺、234.1 (28 ％)［１－（２－（（２－メタクリルアミドエチル）アミノ）エチル）ピリジニウム］^＋。
¹H-NMR (H₂O,300 MHz): δ = 1.69 (s,3H,CH₃),3.77 (q,2H,J = 6 Hz、HN-CH₂),4.72 (t,2H,J = 5 Hz,HN-CH₂-CH₂),5.32 (s,1H,=CH^a),5.51 (s,1H、=CH^b),8.01 (t,J = 7 Hz,2H,meta-H),8.18 (m,1H,NH) ,8.49 (m,1H,J = 8 Hz,para-H),8.81 (d,2H,J = 6 Hz,ortho-H)。

１－（２－メタクリルアミドエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリドの合成

Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリド塩酸塩（３．０９ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）、次いでジクロロメタン（５０ｍＬ）中に溶解し、トリブチルアミン（３．３８ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）およびメタクリル無水物（２．２４ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を室温にて１９時間攪拌し、次いで残存するＮ－（２－アミノエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリドについて^１Ｈ－ＮＭＲ分光法によって確認する。この場合、ジクロロメタンを再度用いて水性層を分離および混合し、残存する抽出物に従ってトリブチルアミンおよびメタクリル無水物を添加する。６時間室温にて攪拌後、水性相を分離し、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）を用いて洗浄し、真空中で蒸発乾固させる。３－ブロモ－１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドを褐色ガラスとして得る。
収率：２．７７ｇ（９．０２ｍｍｏｌ、７０％）．
MS (ESI) pos.: 217.0 (100 ％) [M]⁺、575.0 (6 ％) 2[M]⁺Cl^-。
¹H-NMR (D₂O,300 MHz): δ = 1.78 (s,3H,CH₃),3.81 (m,2H,HN-CH₂),XXX (m、2H、HN-CH2-CH2-),5.41 (s,1H,=CH_2(A)),5.58 (s,1H,=CH_2(B)),7.97 (m,1H,meta-H),8.25 (m,1H,para-H),8.88 (m,1H,N-CH-CH),9.20 (s,1H,N-CH-CBr) 。

３－ヨード－１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドの合成

Ｎ－（２－アミノエチル）－３－ヨードピリジニウムクロリド塩酸塩（３２．０ｇ、９９．７ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）、次いでジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解し、トリブチルアミン（３７．０ｇ、２００ｍｍｏｌ）およびメタクリル無水物（１７．８ｇ、１１６ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を室温にて１７時間攪拌し、次いで残存するＮ－（２－アミノエチル）－３－ヨードピリジニウムクロリドについて^１Ｈ－ＮＭＲ分光法によって確認する。この場合、ジクロロメタンを再度用いて水性層を分離および混合し、残存する抽出物に従ってトリブチルアミンおよびメタクリル無水物を添加する。水性相を分離し、ジクロロメタン（２×１００ｍＬ）を用いて洗浄し、蒸発乾固させる。３－ヨード－１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドが褐色固体として残存する。
収率：３３．７６ｇ（９５．７ｍｍｏｌ、９６％）。
Ｍｐ．：２５４．５℃
元素分析：calc.:Ｎ ７．９４％、Ｃ ３７．４７％、Ｈ ４．００％、測定された：Ｎ ７．６７％、Ｃ ３６．１４％、Ｈ ４．３５％。
MS (ESI) pos.: 317.0 (100 ％) [M]⁺。
¹H-NMR (D₂O,300 MHz): δ = 1.79 (s,3H,CH₃),3.80 (t,J = 6 Hz,2H,HN-NH₂),5.41 (s,1H,=CH₂),5.57 (s,1H,=CH₂),7.79 (t,1H,J = 7 Hz,meta-H),8.21 (m,1H,NH),8.86 (m,2H,N-CH-CH-CH-),9.22 ppm (s,1H,N-CH-CI-)。
¹³C{H}-DEPT135-NMR (D₂O,75 MHz): δ = 17.7 (CH₃),39.8 (-NH-CH₂-),61.2 (-NH-CH₂-CH₂-),82.3 (CI),121.8 (=CH₂),128.5 (meta-C),138.3 (H₃C-C),143.7 (N-CH-CH-),150.3 (N-CH-CI-),154.4 (para-C),172.2 ppm (C=O)。
¹H,¹³C-HMBC (D₂O,300/75 MHz): δ = 4.7 / 61.2 ppm (J = 147 Hz,NH-CH₂-CH₂-N)。

Ｎ－（３－ブロモフェニル）エタン－１，２－ジアミンの合成

３－ブロモアニリン（３．０００ｇ、２５．８６ｍｍｏｌ）、２－クロロエタン－１－アミン塩酸塩（４．７８６ｇ、２７．８２ｍｍｏｌ）およびエタノール（１１ｍＬ）を、１００ｍＬブレーカー中に提供する。反応混合物を、数分室温にて攪拌する。次いでそれを、マイクロ波の反応槽中に提供する。反応槽をマイクロ波中に置き、以下の方法を選択し、開始する：方法：Quick test；温度：１１０℃；出力：３００Ｗ；圧力：ｘ ｂａｒ；保持時間：３０ｍｉｎ；攪拌：オフ；冷却：オフ。冷却後、新しい方法を選択し、開始する：新しい方法；温度：１２０℃；出力：３００Ｗ；圧力：８ｂａｒ；保持時間：３０ｍｉｎ；攪拌：オン（ｍｅｄ）；冷却：オン。冷却後、終夜桃色結晶を濾過し、イソプロピルアルコールを用いて洗浄し、真空中で蒸発乾固させる。
収率：１．２２１ｇ（４．２４ｍｍｏｌ、１６％）。
Ｍｐ．：２１２．０℃～２１３．０℃
¹H-NMR (D₂O,300 MHz): δ = 3.12 (m,2H,H₂N-CH₂),3.38 (m,2H,HN-CH₂),6.66 (m,1H,ortho-CH-CH),6.88 (m,2H,ortho-CH-CBr,para-H)、7.07 (m,1H,meta-H) 。

１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドを用いたビーズの官能基化

水性溶液（１．２９ｍｏｌ／Ｌ、２．１３ｍＬ、２．７５ｍｍｏｌ）中の１－（２－メタクリルアミドエチル）－ピリジニウムクロリドを三口丸底フラスコ中に提供し、水（１５．３ｍＬ）を添加する。ｐＨを、硝酸を用いて１．５に設定する。市販のEshmuno（登録商標）吸着剤（１７．０ｇ、湿潤）（ビーズ）の基材と同様に、ＯＨ基を有する親水性のポリビニルエーテルビーズで作られた基材を添加する。開始溶液を、硝酸（２３９μＬ、３．８５ｍｍｏｌ）、水（７ｍＬ）およびセリウムアンモニウムニトラート（５１５ｍｇ、９３９μｍｏｌ）を滴下漏斗へ添加することによって調製する。両方の混合物を、真空および窒素によって脱気する。懸濁液を３０℃まで加熱し、開始溶液を可能な限り速く添加する。混合物を４時間攪拌し、次いで濾過し、以下で洗浄した：
３×１００ｍＬ脱イオン水（超純水／Milli-Q（登録商標）水）＝ＶＥ水（VE wasser）
７×１００ｍＬ １Ｍ硫酸、０，２Ｍアスコルビン酸
１０×１００ｍＬ脱イオン水
２×１００ｍＬ １Ｍ水酸化ナトリウム溶液
２×１００ｍＬ脱イオン水
ｐＨを２５％塩酸を用いて６．５～７．０に調整する。
１×１００ｍＬ脱イオン水
１×１００ｍＬエタノール。
その結果得られる無色固体を、真空中で乾燥させる。
収率：３．３８ｇ

１－（２－メタクリルアミドエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリドを用いたビーズの官能基化

１－（２－メタクリルアミドエチル）－３－ブロモピリジニウムクロリド（８３８ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を三口丸底フラスコ中に提供し、水（１７．５ｍＬ）を添加する。ｐＨを、硝酸を用いて１．５に設定する。ビーズ（１７．０ｇ、湿潤）を、添加する。開始溶液を、硝酸（２３９μＬ、３．８５ｍｍｏｌ）、水（７ｍＬ）およびセリウムアンモニウムニトラート（５１５ｍｇ、９３９μｍｏｌ）を滴下漏斗へ添加することによって調製する。両方の混合物を、真空および窒素によって脱気する。懸濁液を３０℃まで加熱し、開始溶液を可能な限り速く添加する。混合物を４時間攪拌し、次いで濾過し、上記に記載されるとおり洗浄する。その結果得られる無色固体を、真空中で乾燥させる。
収率：３．１７ｇ

１－（２－メタクリルアミドエチル）－３－ヨードピリジニウムクロリドを用いたビーズの官能基化

１－（２－メタクリルアミドエチル）－３－ヨードピリジニウムクロリド（９７０ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を三口丸底フラスコ中に提供し、水（１７．５ｍＬ）を添加する。ｐＨを、硝酸を用いて１．５に設定する。ビーズ（１７．０ｇ、湿潤）を添加する。開始溶液を、硝酸（２３９μＬ、３．８５ｍｍｏｌ）、水（７ｍＬ）およびセリウムアンモニウムニトラート（５１５ｍｇ、９３９μｍｏｌ）を滴下漏斗へ添加することによって調製する。両方の混合物を、真空および窒素によって脱気する。懸濁液を３０℃まで加熱し、開始溶液を可能な限り速く添加する。混合物を４時間攪拌し、次いで濾過し、上記に記載されるとおり洗浄する。その結果得られる無色固体を、真空中で乾燥させる。
収率：３．２２ｇ

スチレンベースの固定相の合成

反応器をＶＥ－水、ドデカン－１－スルホン酸ナトリウム塩（界面活性剤）およびポリビニルアルコール４０～８８（安定剤）で満たし、ＤＶＢ／エチルスチレン（８０／２０、８３．２ｇ）、ＥＧＤＭＡ（４１．６ｇ）、４－ビニルベンジルクロリド（１３．９ｇ）、トルエン（９０．３ｇ）、２－エチレン－１－ヘキサノール（９０．３ｇ）およびＡＩＢＮ（１．０ｇ）からなる有機相を添加する。
撹拌器スピードを１０ｓｅｃ中５００ｒｐｍに設定し、その結果得られるエマルションを３０分間２５℃にて攪拌する。
水（６４０ｇ）を添加し、撹拌器のスピードを１２０ｒｐｍに設定する。エマルションが安定した後、温度ランプを開始する。９０ｍｉｎにおいて２５℃～７２℃、１２０ｍｉｎ間７２℃を保持する。２０ｍｉｎにおいて７２℃～８２℃、１２０ｍｉｎ間８２℃を保持する。次いで、温度を３０ｍｉｎにおいて６０℃まで減少させ、１２時間これを保持する。
その結果得られるポリマーを、ＶＥ水および有機溶媒を用いて洗浄する。
次いで、ポリマーを、５０℃にて２４時間真空中で乾燥させる。
分析
算出されたＣｌ含量：２．３３％Ｃｌ
Ｘ線蛍光分析：２．５％Ｃｌ
元素分析：０．６２％Ｃｌ

官能基の付着
スチロールベースのポリマーを塩素にて官能基化できる。このために、塩素を、第一にフィンケルシュタイン（Finkelstein）反応によってヨウ素へ交換し、次いで官能基を誘導する。

２．適用例
２．１ インスリンの親水性分離のための（上記に記載されるとおり調製されたテンタクルを用いた）官能基化ビーズの使用
クロマトグラフィーカラムを、官能基化ビーズを用いて調製する。カラムを、ヨウ素を用いて官能基化された官能基を有するビーズを用いて、およびヨウ素を有さない官能基を有するビーズを用いて調製する。これによって、ヨウ素を有する固定相についてのみに見られ、ヨウ素によって官能基化されていない同一の固定相については見られない場合、その結果得られる分離が本当にハロゲン結合に起因することを確かめることができる。インスリンおよびデスアミドインスリンを含む試料を、次のとおり加工する：

条件１：
溶出液： （Ａ）５０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ｐＨ３，５
（Ｂ）５０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４＋１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ３，５
勾配： ０～１５ｍｉｎ １００％（Ａ）
３０～５０ｍｉｎ ５０％（Ａ）５０％（Ｂ）
流量： ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２１４ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：２５℃

結果は、図１においてわかる。
グラフは、以下の固定相についてのクロマトグラムを示す：
Ａ ヨウ素を有する官能基を用いて官能基化されたビーズ
Ｂ ヨウ素を有する官能基を用いて官能基化されたビーズ（Ａと比較して半量の官能基)
Ｃ ヨウ素を有さない官能基を用いて官能基化されたビーズ
Ｄ ヨウ素を有する官能基を用いて官能基化されたビーズ（Ｃと比較して半量の官能基）
Ｅ 官能基化されていないベースのビーズ
ヨウ素基をもつ材料を用いたグラフＡおよびＢは、ヨウ素を有さない材料と比較して強い保持を示すことがわかる。しかし、インスリンおよびＡ２１－デスアミドインスリンは分離されない。

条件２：
溶出液： （Ａ）１００ｍＭ ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ ｐＨ７，３
（Ｂ）１００ｍＭ ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４＋１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７，３
勾配： ０～１５ｍｉｎ １００％（Ａ）
３０～５０ｍｉｎ ５０％（Ａ）５０％（Ｂ）
流量： ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２１４ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：２５℃

結果は、図２においてわかる。
グラフは、以下の固定相についてのクロマトグラムを示す：
Ａ ヨウ素を有する官能基を用いて官能基化されたビーズ
Ｂ ヨウ素を有する官能基を用いて官能基化されたビーズ（Ａと比較して半量の官能基)
Ｃ ヨウ素を有さない官能基を用いて官能基化されたビーズ
Ｄ ヨウ素を有さない官能基を用いて官能基化されたビーズ（Ｃと比較して半量の官能基）
Ｅ 官能基化されていないベースのビーズ
ヨウ素基をもつ材料を用いたグラフＡおよびＢは、ヨウ素を有さない材料と比較して強い保持を示し、およびそれらがインスリンおよびＡ２１－デスアミドインスリンの分離を示すことがわかる。材料Ｃ、ＤおよびＥは、極めて少しの保持ならびにインスリンおよびＡ２１－デスアミドインスリンの分離のみを示す。
これは、保持ならびにインスリンおよびＡ２１－デスアミドインスリンの分離がハロゲン結合に実際に基づくことを示す。Ａ／ＢおよびＣ／Ｄにおいて使用された材料の間の唯一の違いは、ヨウ素残基である。

２．２ 異なるタンパク質の親水性分離のための（上記に記載されるとおり調製されたテンタクルを用いた）官能基化ビーズの使用
より低いｐｌ（等電点）をもつタンパク質は、より高いｐｌをもつタンパク質よりも、本発明に従うヨウ化固定相により強く結合する傾向がある。より強いイオン性の強度は、より低いｐｌをもつタンパク質を溶出するために必要である。また、カルボン酸のより高い含量をもつタンパク質は、固定相により強く結合する傾向がある。この効果はタンパク質の三次構造に依存し、したがって、カルボン酸の曝露も考慮されなければならない。したがって、CarboanhydraseおよびInlB321-GFPなどのタンパク質は、容易に分離され得る。以下の表中に挙げられたタンパク質の一つを含む試料を、次のように加工する：

溶出液： （Ａ）２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ｐＨ８
（Ｂ）２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８
勾配： ０～１６ｍＬ １００％（Ａ）
１６～９６ｍＬ １００％（Ａ）～５０％（Ａ）５０％（Ｂ）
１９６～１２０ｍＬ １００％（Ｂ）
流量： ４ｍＬ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２８０／ＵＶ２６０
Ｔｅｍｐ．：４℃

この表は、試験されたタンパク質の名称およびそれらの個々の値を示す。ＭＷ：ｋＤａにおける分子量、ｐＩ：等電点、＃カルボキシ／ＭＷ：分子量によって除されたカルボン酸の数および溶出ピーク最大における溶出液導電率。
固定相上の官能基およびカルボン酸間の相互作用を３－ヨード－１－メチルピリジニウムアセタートから得られる結晶構造によって明らかした。ファン・デル・ワールス半径の和は３４５ｐｍであるが、ヨウ素および酸素の間の距離は２８６ｐｍであった。したがって、結合相互作用が存在する。

２．３ 低分子量化合物の疎水性分離のための（上記に記載されるとおり調製された）官能基化ビーズの使用
固定相をガラスカラム中に詰める。溶出液は、ｎ－ペンタンである。カラムをｎ－ペンタンを用いて洗浄し、次いで検体をカラムへ適用する。検出を、ＵＶインジケーターおよびＵＶランプを備えるシリカゲルＴＬＣプレートを用いてカラム出口にて行う。Ｒ_ｆは、カラム体積あたりの溶媒の質量によって除された、化合物の溶出までに使用された溶媒の重量に基づき算出される。
結果は、表１においてわかる。

Ｒ＝Ｈを用いた樹脂は、参照として扱う。電子供与の機能をもつ異なる物質を、移動相としてｎ－ペンタンを流した。結果は、参照材料およびＢｒ－置換材料の間で大きく異ならない保持係数を示す。しかし、Ｉ置換材料の保持係数は、Ｂｒ－置換材料との比較において有意な上昇を示す（括弧におけるパーセンテージ）。抑制率（restrain）は、物質の官能基に依存して、２５％および５２％高い。

Claims (15)

1. 基材および少なくとも１のタイプの官能基を含む固定相であって、これによって、官能基は、－－－Ｎ（Ｒ’_２）^＋－ＡｒＸから選択され、Ｒ’は、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ６アリールであり、およびＡｒＸは、
   

   

   であり、
   Ｌは、－－Ｎ（Ｒ’_２）^＋に結合し、
   ＸおよびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであるか、またはＦまたはＮＯ_２などの別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、
   Ｒは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ６アリールであり、
   Ｙは、互いに独立して、ＣまたはＮであり、
   これによって、式Ｉにおいて、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
   これによって、式ＩＩにおいて、少なくとも１のＬが存在し、および
   これによって、少なくとも１のＹは、Ｃであり、およびこれによって、Ｎである各Ｙについて、このＮにおいてＬ／Ｒ／Ｘは不在であり；
   もしくは、官能基は、少なくとも１のＣｌ、ＢｒまたはＩ残基を有する正に帯電した複素環式芳香族基である、
   前記固定相。
2. 少なくとも１のＣｌ、ＢｒまたはＩ残基を有する正に帯電した複素環式芳香族基が、以下の構造：
   

   

   Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
   

   

   Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、または電子吸引基または電子供与基であり、
   Ｙは、互いに独立して、ＮまたはＰであり、
   Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’が、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＮＯ_２、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
   

   

   これによって、基材への接続を提供するものではない、芳香環の１の原子Ａは、Ｏ^＋またはＳ^＋であり、および他の環原子Ａは、Ｃ－Ｘ’であり、Ｘ’は、互いに独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、または別の電子吸引基、またはＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルケニル、Ｃ１～Ｃ１０アルキニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、または電子供与基であり、これによって、少なくとも１のＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
   の１を有するか、または以下の構造：
   

   

   Ｘは、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、ＢｒまたはＣｌであり、およびＸ’およびＸ’’は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、または別の電子吸引基または電子供与基であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６アリール、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニルル、または電子吸引基または電子供与基であり、およびこれによって、少なくとも１のＸまたはＸ’は、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、
   の１を有することを特徴とする、請求項１に記載の固定相。
3. 官能基が、１の複素環式環を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の固定相。
4. 官能基が、以下の１以上から選択されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の固定相：
   

   

   Ｒが、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、
   ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、これによって、少なくとも１のＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり;
   

   

   ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、電子吸引基であり、
   およびＨａｌは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、これによって、少なくとも１のＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；
   

   

   Ｒ’が、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり、
   ＥＷは、互いに独立して、Ｈ、ＣＨ_３または電子吸引基であり、
   およびＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
   

   

   １のＲ／Ｌは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、および他のＲ／Ｌは、基材への接続であり、
   ＥＷは、Ｈ、ＣＨ_３または電子吸引基であり、
   およびＨａｌは、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
5. 官能基が、基材へ共有結合的に結合することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の固定相。
6. 基材が、ビーズまたは膜であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の固定相。
7. 官能基が、リンカーを介して基材へ結合することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の固定相。
8. 官能基が、基材上にグラフト化されるポリマー鎖の末端基であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の固定相。
9. 基材が、有機ポリマーであることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の固定相。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の固定相を含む、クロマトグラフィーカラム。
11. 標的分子の少なくとも１の他の化合物からの分離のためのプロセスであって、これによって請求項１～９のいずれか一項に記載の固定相は、標的分子および少なくとも１の他の化合物を含む液体と接触し、およびこれによって標的分子は、他の化合物の相互作用とは異なる、固定相との相互作用を示す、前記プロセス。
12. 化合物が電子を供与できるほど、固定相へ強く結合することを特徴とする、請求項１１に記載のプロセス。
13. プロセスが、標的分子の少なくとも１の他の化合物からのクロマトグラフ的分離のためのプロセスであり、これによって請求項１～９のいずれか一項に記載の固定相が、クロマトグラフィーカラム中に存在し、および標的分子および少なくとも１の他の化合物を含む液体が、カラムを流れ、これによって液体中に存在する標的分子および他の化合物が、それらの固定相との相互作用に応じてカラムから溶出される、前記プロセス。
14. 標的分子が、タンパク質であることを特徴とする、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
15. プロセスが、本発明に従う固定相ならびに所定のｐＨおよび所定のイオン強度の水性のローディングバッファーを充填すること、および標的分子を同じｐＨであるが別のイオン強度の水性の溶出バッファーを用いて溶出することによって実施されることを特徴とする、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。

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