JP2022546282A

JP2022546282A - Ｇｏｌｄ制御導入遺伝子による併用療法

Info

Publication number: JP2022546282A
Application number: JP2022510911A
Authority: JP
Inventors: ワン，ベンジャミン; ザイナー，グスティ; ディラ，スコット
Original assignee: キメラ・バイオエンジニアリング，インコーポレーテッド
Priority date: 2019-08-18
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-11-04
Also published as: WO2021034653A1; WO2021034653A4; US20210046117A1; EP4013431A1; EP4013431A4; CN114786686A; US11648277B2; US20220257658A1; AU2020334884A1

Abstract

真核細胞におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む導入遺伝子と組み合わされたＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）を含む制御デバイスが開示される。これらのＲＤＥは、例えばエフェクター機能が最適化されるように、導入遺伝子、例えばＣＡＲの真核細胞における発現を最適化するのに使用することができる。ＣＡＲおよび導入遺伝子ペイロードもまた、導入遺伝子ペイロードが所望の時間に真核細胞から発現および送達されるように操作して真核細胞に入れることができる。導入遺伝子ペイロードを含むそのようなＣＡＲＴ細胞は、他の分子、例えば、抗がん療法などの他の治療法の投与と組み合わせることができる。

Description

配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
[0001]配列表の正式な写しは、ファイル名「ＣＢＩＯ０４６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０２０年１月２４日、サイズ９ＫＢのＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で出願された配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[0002]キメラ抗原受容体は、ＣＡＲによって認識された標的を攻撃するようＴ細胞に指示することができるヒトの操作された受容体である。例えば、ＣＡＲＴ細胞療法は、急性リンパ球性白血病および他のＢ細胞関連悪性腫瘍に対する完全奏効の誘導に有効であることが示されており、難治性／再発急性リンパ球性白血病の寛解の達成および持続に有効であることが示されている（Ｍａｕｄｅら、ＮＥＪＭ、３７１：１５０７頁、２０１４）。しかし、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、Ｂ細胞形成不全、およびｏｎ－ｔｕｍｏｒ、ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ毒性に関連する危険な副作用が一部の患者で認められている。

[0003]現在、ＣＡＲ技術を制御する２つの戦略が存在する。１つ目は、誘導性「キルスイッチ」である。このアプローチでは、アポトーシス経路を惹起する１つまたは複数の「自殺」遺伝子がＣＡＲ構築物に組み込まれる（ＢｕｄｄｅらＰＬｏＳ１、２０１３ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）。これらの自殺遺伝子の活性化は、アポトーシス誘導タンパク質が翻訳的に融合されるヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２（Ｆｖ）のホモ二量体化を惹起する脂質透過性タクロリムスアナログ、ＡＰ１９０３（リミデュシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）としても知られる）の添加によって惹起される。理想的なシナリオでは、これらのキルスイッチは、ＣＡＲ技術の長期監視の利点を犠牲にして毒性から防御しようとする。しかし、ｉｎｖｉｖｏでは、これらの自殺スイッチはこの目標を実現しそうにない。その理由は、これらの自殺スイッチが、ＡＰ１９０３に応答しないＣＡＲＴ細胞への強力な選択圧に反して作動しており、患者Ｔ細胞への安定な導入遺伝子の挿入と関連した有害でエラーを起こしやすいレトロウイルスの複製によって状況が悪化するためである。このシナリオでは、非応答性ＣＡＲＴ細胞クローンが増殖し続け、抗原依存的に標的細胞を死滅させ続けることになる。したがって、キルスイッチ技術は毒性に対する十分な防御を提供しそうにない。

[0004]２つ目のＣＡＲ調節アプローチは、いくつかの方法で達成され得る一過性ＣＡＲ発現である。１つのアプローチでは、Ｔ細胞が非血縁ドナーから採取され、ＨＬＡ遺伝子がゲノム編集技術によって欠失され、ＣＡＲコード導入遺伝子がこれらの細胞のゲノムに挿入される。養子移入すると、これらのＣＡＲＴ細胞はレシピエントの免疫系によって異物として認識され、破壊される。したがって、この系におけるＣＡＲ曝露は一過性となる。別の一過性ＣＡＲ曝露アプローチでは、ＣＡＲコード遺伝子のｍＲＮＡが採取された患者Ｔ細胞に導入される（Ｂｅａｔｔｙ、ＧＬ２０１４．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ２（２）：１１２～２０頁．ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１３－０１７０）。ｍＲＮＡは半減期が短く、細胞中で複製されないかまたは安定に維持されないことから、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の永続的な変化はなく、したがってＣＡＲ発現および活性は短期間となるであろう。しかし、キルスイッチアプローチと同様に、これらの一過性ＣＡＲ曝露アプローチは、ＣＡＲの監視の利点を犠牲にする。さらに、これらの一過性の系では、急性毒性は制御が困難な場合がある。

[0005]一態様では、本記載は、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）（阻害剤システインノットタンパク質（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｙｓｔｉｎｅ－ｋｎｏｔｐｒｏｔｅｉｎまたはｃｙｓｔｅｉｎｅｋｎｏｔｐｒｏｔｅｉｎ））をＣＡＲの抗原認識部分として使用する新規のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。ノッチンはペプチドループがコア構造を囲んでいるコア構造（足場）を有し、ペプチドループは異なる結合特性および特異性を生じるように操作することができることから、目的の標的を認識するようにノッチンを操作することができる。ノッチンは小さくなり得、そのため生物製剤（抗体など）の結合親和性を有する小分子の特性を有し得る。ノッチンは、ｐＨ、熱、および酵素に対する高い安定性を有する。

[0006]一態様では、本記載は、ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）の制御下でＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、または他の標的ポリペプチドおよび導入遺伝子を含む真核細胞を開示する。ＲＤＥは複数の導入遺伝子を制御し得、または複数のＲＤＥは複数の導入遺伝子を制御し得る。複数の導入遺伝子は、連続的におよび／またはコンカテマーとしておよび／または他の配置で配置されてもよい。複数のＲＤＥが導入遺伝子を調節するのに使用されてもよく、これらの複数のＲＤＥは、コンカテマーとして構成されてもよく、転写物の領域内に分散されてもよく、または転写物の異なる部分に位置していてもよい。複数の導入遺伝子は、ＲＤＥまたはＲＤＥの組み合わせによって調節することができる。ＲＤＥは、３’－ＵＴＲ、５’－ＵＴＲおよび／またはイントロンに局在化されてもよい。ＲＤＥには、例えば、ＡＵ１（ＣＤ４０Ｌ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１１（ＣＤ１９）、ＡＵ１２（ＩＬ４）、ＡＵ１３（ＩＬ５）、ＡＵ１４（ＩＬ６）、ＡＵ１５（ＩＬ９）、ＡＵ１６（ＩＬ１０）、ＡＵ１７（ＩＬ１３）、ＡＵ１８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、ＡＵ２４（ＣＤ８）、ＡＵ２７（ｂＧＨ）、および／またはＡＵ１０１（インターフェロンガンマまたはＩＦＮｇ）由来のＲＤＥを挙げることができる。他のＲＤＥは、以下の記載に開示される。ＲＤＥ制御は、導入遺伝子のコドン最適化と組み合わせて導入遺伝子のコドンの一部または全部においてゆらぎ位置（コドンの第３位置）のＧＣ含量を増加させることもできる。このコドン最適化は、発現の効率（オンシグナル）を最大１００倍増加させることができる。そのようなコドン最適化導入遺伝子はＲＤＥに連結され、コドン最適化なしの導入遺伝子－ＲＤＥと比べてＲＤＥ制御から発現のより大きなダイナミックレンジをもたらすことができる。

[0007]一態様では、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスの制御下にあってもよい。そのようなＳｍａｒｔＲＤＥは、ＲＤＥ制御を、リガンド制御をＲＤＥに導入するＲＮＡ制御デバイスの調節下に置く。ＲＮＡ制御デバイスは、リガンドが結合されると（または結合されないと）ＲＤＥを妨害し、ＲＤＥ制御の喪失をもたらすことができ、リガンドが添加されると（または除去されると）ＲＮＡ制御デバイスが阻害され、ＲＤＥ構造はＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に利用可能となる。ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥを妨害する転写物の部分にも作動し得（例えば、転写物の部分は、ＲＮＡ結合タンパク質がＲＤＥに結合するのを阻害する、ＲＤＥを含む二次構造を形成し得る）、ＲＮＡ制御デバイスが結合すると（またはリガンドがないと）、ＲＮＡ制御デバイスは転写物の阻害性部分を妨害し、そのためＲＤＥとの相互作用に利用することができず、ＲＤＥは今やＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に利用可能となる。このＲＮＡ制御デバイス調節により、ＲＤＥの活性はＲＮＡ制御デバイスの作動を通じてリガンド制御できるようになる。

[0008]一態様では、ＲＤＥ制御導入遺伝子を含むＣＡＲＴリンパ球を利用する療法は、別の療法と組み合わされ、または別の療法に継承される。他の療法は、例えば、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子薬物、生物学的薬物、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、または上述の組み合わせを含む任意の治療用分子を含んでもよい。適切な分子は以下に記載される。他の療法は、（ＲＤＥ制御導入遺伝子を含むまたは含まない）ＣＡＲ療法と同時に、（ＲＤＥ制御導入遺伝子を含むまたは含まない）ＣＡＲ療法の投与前に、または（ＲＤＡ制御導入遺伝子を含むまたは含まない）ＣＡＲ療法の投与後に対象に投与されてもよい。例えば、対象は、化学療法および／または免疫療法（例えば、抗体－薬物コンジュゲート）により処置され、その後、必要に応じてＲＤＥ制御ペイロードを含むＣＡＲＴ細胞により処置され得る。ＣＡＲＴ細胞処置は、化学療法および／または免疫療法後の様々な時点、例えば、１、２、３、４、５、または６週間の時点で対象に与えることができる。化学療法および／または免疫療法（例えば、ＡＤＣ）は、処置の複数サイクルにわたってＣＡＲＴ細胞処置とサイクル投与することができる。ＣＡＲＴ細胞による処置は、標的Ｘペプチド、または標的Ｘペプチドを負荷したウイルスもしくは細胞をブーストすることもできる（標的ＸはＣＡＲによって結合される標的である）。

[0009]一態様では、ＲＤＥ、ＲＤＥの組み合わせ、および／または修飾ＲＤＥは、例えば、発現量、定常状態濃度、Ｃ_ｍａｘ（得られた遺伝子産物の最大濃度）、Ｔ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａＸに達するまでの時間）、ベースライン発現、誘導スピード（加速）、誘導速度（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｅ）（速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ））、調節倍率（ｆｏｌｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（誘導発現／基底発現）としても知られるダイナミックレンジ、最大ダイナミックレンジ（ＤＲ_ｍａｘ）、ＤＲ_ｍａｘまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）等を含む、遺伝子産物の調節に対する所望の動態パラメーターを提供するのに使用することができる。所望される調節のレベル、程度、時間、および量を提供する動態パラメーターの所望のセットを有するＲＤＥ構築物が作られてもよい。さらに、構築物の動態性能を変更するのにＲＤＥコンカテマーが使用されてもよい。

[00010]ＲＤＥの組み合わせは、２つ以上の導入遺伝子間で時間的調節をするのに使用することができる。ＲＤＥは、細胞の活性化（または発現の誘導）後異なる時間に最大発現率（および異なる最大発現量）をもたらすように選択することができる。この時間的制御により、第１の導入遺伝子コードポリペプチドは細胞の状態を変更できるようになり、その結果、細胞は後になって発現をもたらすＲＤＥを含む第２の導入遺伝子によってコードされる第２のポリペプチドによって作動する準備が整う。この時間的制御は、細胞の活性化後の２つ、３つまたはそれ以上の導入遺伝子の発現を時間調整するのに使用することもできる。導入遺伝子コードポリペプチドが分泌される場合、それらは標的細胞に一時的に作用することができる。例えば、第１の導入遺伝子ポリペプチド（早期発現ＲＤＥを含む）が分泌され、標的細胞の状態を変化させる（例えば、受容体の発現を誘導する）ように標的細胞に作用し得る。第２の導入遺伝子ポリペプチドは後になって発現され（後期発現ＲＤＥの制御下で）、状態が変化した標的細胞に作用する（例えば、第２のタンパク質は、誘導された受容体のリガンドであってもよい）。

[00011]一態様では、ＲＤＥは、ＲＤＥと相互作用するＲＮＡ結合タンパク質の結合親和性を増加または減少させるように操作されてもよい。ＲＮＡ結合タンパク質の親和性の変更は、ＲＮＡ結合タンパク質によって制御される導入遺伝子発現のタイミングおよび応答を変えることができる。一態様では、ＲＤＥで結合するＲＮＡ結合タンパク質は細胞の代謝状態によって変更され、ＲＮＡ結合タンパク質に対するＲＤＥの結合親和性の変化は、細胞の代謝状態による導入遺伝子発現に対する応答および／または導入遺伝子発現のタイミングを変更する。一態様では、ＲＤＥで結合するＲＮＡ結合タンパク質は細胞のレドックス状態によって変更され、ＲＮＡ結合タンパク質に対するＲＤＥの結合親和性の変化は、細胞のレドックス状態による導入遺伝子発現に対する応答および／または導入遺伝子発現のタイミングを変更する。

[00012]一態様では、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体、または他のターゲティング受容体もしくはターゲティングポリペプチドは、標的部位（例えば、腫瘍細胞または他の病変組織／細胞）で抗原を認識し、細胞を活性化する。導入遺伝子は、標的部位で第２の抗原を認識する別のＣＡＲであってもよく、第１のＣＡＲ、Ｔ細胞受容体または他のターゲティングポリペプチドによる細胞の活性化は、第２のＣＡＲを誘導し、第２の抗原によって真核細胞が標的部位を認識できるようにする。一態様では、真核細胞は標的部位で抗原を認識する第１のＣＡＲを有し、細胞の活性化状態を直接または間接的に低下させるポリペプチドをコードする導入遺伝子を（ＲＤＥを通じて）活性化する。例えば、導入遺伝子は、健康な組織で抗原を認識する第２のＣＡＲをコードしてもよく、その結果、第１のＣＡＲが非標的細胞で抗原と反応すると、真核細胞は健康な細胞抗原（標的部位には存在しない、または低減量で存在する）との第２のＣＡＲ相互作用によって不活性化されることになる。

[00013]いくつかの態様では、真核細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞である。これらの態様では、ＣＡＲによる細胞の活性化、または他の方法での免疫細胞の代謝状態の変化は、ＲＤＥを通じた導入遺伝子の発現を誘導することができる。導入遺伝子を制御するＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有してもよく、これらのマイクロＲＮＡ結合部位の１つまたは複数を除去するために操作されてもよい。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）によって結合されてもよい。理論に縛られることを望むものではないが、ＨｕＲは一部のＲＤＥに結合し、ｍＲＮＡを安定化させるように作用し、翻訳の増大をもたらし得ることが予想される。一部のＲＤＥは、真核細胞が活性化されていない（低解糖活性）、静止状態である、または休止しているとき、ＲＤＥに結合することができる酵素グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、他のデヒドロゲナーゼ、他の酸化還元酵素、または他の解糖系酵素を通じて真核細胞の解糖状態に結びつくことができる。ＧＡＰＤＨまたは他の酵素がＲＤＥに結合すると、これはＲＤＥを含むＲＮＡの半減期を低減し得る。この態様では、真核細胞（例えば、Ｔリンパ球）のＣＡＲ活性化は、ＲＮＡのＧＡＰＤＨ結合を低下させ、ＲＮＡの半減期を増加させる解糖を細胞で誘導し得、ＲＮＡにコードされＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現の増加をもたらす。理論に縛られることを望むものではないが、ＧＡＰＤＨがＲＤＥを明け渡すとき、ＨｕＲまたは他のＲＤＥ結合タンパク質はその後、同じＲＤＥかまたは以前は近づくことができなかったＲＤＥ（ＧＡＰＤＨの存在によって立体的に妨害された）のどちらかを結合し得、ｍＲＮＡをさらに安定化させ、ｍＲＮＡの半減期を増加させ、ＲＮＡによってコードされおよび前記ＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現のさらなる増加をもたらし得る。したがって、ＣＡＲ活性化は、導入遺伝子の発現を誘導することができる。他の態様では、免疫細胞の他の活性化がＧＡＰＤＨを解糖に関与させ、そのためＲＤＥの制御下で導入遺伝子の発現を誘導し得る。ＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥの例には、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）が挙げられる。

[00014]ＲＤＥを含む転写物からの発現は、細胞の代謝状態に応答し得る。例えば、ＲＤＥは、代謝系または解糖系酵素によって結合されてもよく、これらの代謝系または解糖系酵素を通じて導入遺伝子の発現を細胞の活性化状態に結び付ける。いくつかの代謝系または解糖系酵素は転写物中のＲＤＥに結合し、転写物を分解する、または転写物の分解を標的にする。それらの代謝系または解糖系酵素が活性になると、酵素はもはやＲＤＥに結合せず、転写物はより長期間安定であり、転写物はこのより長い期間にわたって翻訳され得る。そのようなＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現する細胞は、所望の時間に細胞の代謝状態を変更し、所望の時間に導入遺伝子の発現をもたらし得るＣＡＲを発現するように操作することもできる。あるいは、真核細胞の代謝状態を変更し、導入遺伝子の発現をもたらすのに他の刺激が使用されてもよい。例えば、細胞の代謝状態は、例えば、小分子（例えば、ＰＭＡ／イオノマイシン）、サイトカイン、リガンドとのＴＣＲおよび共刺激ドメイン会合、酸素レベル、細胞ストレス、温度、または光／放射線を含む刺激によって導入遺伝子発現を引き起こす（または発現を阻害する）ように変更されてもよい。

[00015]ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合は、例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨード酢酸、フッ化物、オキサミン酸、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、または他の代謝阻害剤（例えば、デヒドロエピアンドロステロンなど）などの解糖を阻害する小分子を細胞に導入することによって増加され得る。他の小分子は、ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合を低下させるのに使用され得る。例えば、ＣＧＰ３４６６Ｂマレエートまたはヘプテリジン酸（両方ともＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により販売されている）、ペンタレノラクトン、または３－ブロモピルビン酸を含むそのような小分子は、ＧＡＰＤＨのＲＤＥ結合部位を遮断し得る。他の小分子は、他の酵素またはポリペプチドがＲＤＥに結合するのを同様に阻害するのに使用され得る。他の小分子は、ＧＡＰＤＨのレドックス状態を変化させ、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの親和性の変更をもたらすのに使用され得る。ＧＡＰＤＨ機能と相互作用することが知られている、ビタミンＣ、サフラマイシン、サリチル酸、インスリン、ビタミンｄ３、メトホルミン、またはスラミンなどの他の小分子は、ＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾することができる。トレハロース、ガラクトースおよび他の糖類を含む他の分子がＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾してもよい。ＧＡＰＤＨ構造を変更することが知られている、一酸化窒素および硫化水素を含む他の分子がＲＤＥに対するＧＡＰＤＨの結合を修飾してもよい。

[00016]ＲＤＥのＧＡＰＤＨ結合は、アセチルＣｏＡによって修飾することもできる。ＧＡＰＤＨは、ＧＡＰＤＨ配列中のいくつかのリジンでアセチル化することができる。あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｂｏｎｄら、ＦＡＳＥＢＪ．３１：２５９２～２６０２頁（２０１７）。リジン２５４のアセチル化は、グルコースに応答したＧＡＰＤＨ活性を増加させ得る。ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）は、細胞中のアセチルＣｏＡのレベルを増加させ、それによってＧＡＰＤＨのアセチル化を増加させることができる。ＡＣＬＹは、真核細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）中で所望の時間に発現され得、これがＧＡＰＤＨのアセチル化を増加させ得、これがＲＤＥ制御転写物からの発現を増加させ得る。例えば、ＡＣＬＹは、ＲＤＥによって調節されるペイロードとして使用されてもよい。この例では、真核細胞（例えば、免疫細胞）が活性化され、ＲＤＥ制御ＡＣＬＹが発現される。ＡＣＬＹはＧＡＰＤＨのアセチル化を増加させることができ、これがＲＤＥ制御転写物からのより多くの発現を引き起こし得る。この例では、別のペイロードがＲＤＥの制御下にある場合、そのペイロードの発現の増加は、ＲＤＥに結合したＧＡＰＤＨをアセチル化が低減するとき、ＡＣＬＹの同時発現によって増加され得る。

[00017]一態様では、細胞活性化および／または代謝状態の変化を導入遺伝子の発現に結び付けるための補完としてまたはＲＤＥ制御の代わりに、選択的スプライシングが使用される。例えば、ｈｎＲＮＰＬＬによって媒介される選択的スプライシングが使用されてもよい。ｈｎＲＮＰＬＬは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）が活性化されると発現される。ｈｎＲＮＰＬＬはＲＮＡ転写物に結合し、イントロンおよび／またはエクソンの保持または切除を引き起こし、ＲＮＡの（例えば、ｍＲＮＡ）の選択的スプライシングをもたらし得る。ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシング制御は、単独でまたはＲＤＥ制御と組み合わせて使用されて導入遺伝子の発現を調節する。細胞が活性化されると（例えば、細胞の代謝状態を変化させ得る受容体でのリガンド結合によって）ｈｎＲＮＰＬＬの発現を誘導し得、これがｈｎＲＮＰＬＬ結合部位を有する転写物において選択的スプライシング産物を産生し得る。上記および以下に論じるように、そのような細胞活性化は、ＲＤＥ部位を有する転写物における発現も誘導する。ＲＤＥ制御をｈｎＲＮＰＬＬ制御と組み合わせることによって、細胞活性化（例えば、リガンドの受容体結合）時の導入遺伝子の制御のダイナミックレンジは増加され得る。

[00018]一態様では、免疫細胞の活性化は、標的（活性化）部位へ送達されるべきペイロードをコードし得る導入遺伝子の発現を誘導する。導入遺伝子は、ＣＡＲ活性化および／または免疫細胞活性化および／または他の受容体活性化の部位へ送達するためのペイロードをコードし得る。ペイロードは、サイトカイン、抗体、レポーター（例えば、イメージング用の）、受容体（ＣＡＲなど）、または標的部位で所望の効果を及ぼし得る他のポリペプチドであってもよい。ペイロードは、細胞中または細胞表面に止まって細胞の挙動を修飾してもよい。ペイロードは、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、エピジェネティック修飾酵素、遺伝子編集酵素等などの細胞内タンパク質であってもよい。ペイロードは、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等などの遺伝子制御ＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ系と共に使用するガイドＲＮＡであってもよい。ペイロードは、核酸（例えば、ベクター、またはヒト人工染色体（ＨＡＣ））であってもよい。ペイロードは、ＧＰＣＲ、トランスポーター等などの膜結合タンパク質でもあってもよい。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であってもよい（標的部位は、ＣＡＲによって結合された所望の量の標的抗原を有する）。ペイロードは、チェックポイント阻害剤であってもよく、ＣＡＲおよび／または他の結合タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体、抗体または自然免疫受容体）は腫瘍関連抗原を認識することができるため、真核細胞はチェックポイント阻害剤を腫瘍へ優先的に送達する。ペイロードは、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、細胞傷害性小分子、または補体を含む細胞傷害性化合物であってもよい。ペイロードは、例えば、抗４－１ＢＢアゴニスト抗体（抗ＣＤ１３７抗体）、抗ＩＬ１ｂ抗体（抗炎症性）、抗ＣＤ２９／抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、二特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ）、または抗ＣＤ１１ｂ抗体などの抗体であってもよい。ペイロードは、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１２）、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドを含む免疫ポリペプチドであってもよい。ペイロードは、例えば、ヒアルロニダーゼ、またはヘパリナーゼを含む酵素であってもよい。ペイロードは、例えば、ＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４）、ＮＯシンターゼ（例えば、ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳ、ｅＮＯＳ）、ＨＳＶ－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＢｉＴＥ（免疫抑制Ｔ細胞を活性化する）、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ６０を含むポリペプチドであってもよい。ペイロードは、ペイロードが標的部位の近くまたは標的部位でコラーゲンに結合するように、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン／ルミカンと融合または会合されてもよい。この戦略は、細胞傷害性ペイロードを標的細胞（例えば、腫瘍）に局在させておくのに特に有用である。ペイロードは、ウイルスをペイロードとして送達する導入遺伝子であってもよい。例えば、ＲＤＥは、複製およびコート／エンベロープタンパク質に対するウイルス遺伝子の発現を制御するマスター制御エレメントを制御してもよい。あるいは、Ｒｅｐおよびコート／エンベロープタンパク質は、調節タンパク質によって制御される誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、その調節タンパク質がＲＤＥによって制御されてもよい。さらにあるいは、ウイルスのＲｅｐタンパク質がＲＤＥの制御下にあってもよく、および／またはウイルスのコート／エンベロープタンパク質がＲＤＥの制御下にあってもよい。他のペイロードと同様に、この複合体ペイロードは、細胞において解糖を誘導するＣＡＲＴ細胞調節または任意の他の調節を使用してもよい。Ｔ細胞中のヘルパー構築物、または他の送達細胞が、ウイルス複製およびウイルスパッケージングに必要な遺伝子をコードしてもよい。

[00019]いくつかの態様では、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの発現は、ＲＤＥ結合活性を有する解糖酵素、例えば、ＧＡＰＤＨと相互作用するＲＤＥによって少なくとも部分的に制御される。解糖酵素は、ＲＤＥに結合し、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の導入遺伝子産物の産生を低下させることができる。ポリペプチド産生のこの低下は、翻訳の阻害および／またはｍＲＮＡ分解の速度の増加（ＲＤＥ結合はｍＲＮＡの半減期を短縮し得る）のために生じ得る。いくつかのＲＤＥ結合タンパク質は、翻訳を低下させ、ＲＮＡの分解を増強して、作られるポリペプチドのレベルを低下させ得る。ＲＤＥは、転写物（例えば、ＩＬ－２またはＩＦＮ－γをコードする転写物）の３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントであってもよく、または１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ部位を除去するように操作されている修飾３’ＵＴＲ（例えば、ＩＬ－２またはＩＦＮ－γの修飾３’－ＵＴＲ）であってもよい。一態様では、解糖酵素、例えば、ＧＡＰＤＨによって結合されたＲＤＥの制御下の導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの発現は、解糖を行う上で酵素の活性を増加させることによって増加される。解糖における酵素の活性は、細胞培地で増加したグルコースを細胞に提供し、細胞中のトリオースイソメラーゼ活性を増加させること、または細胞中の解糖を増加させる化合物、例えば、タモキシフェンもしくはグルコースを細胞に提供することによって増加され得る。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）に結合してもよい。理論に縛られることを望むものではないが、ＨｕＲは、いくつかのＡＵリッチＲＤＥおよびＵリッチＲＤＥに結合し、ＲＮＡを安定化し、翻訳の増強をもたらすように作用し得ることが予想される。したがって、ＨｕＲ発現の増加をもたらす細胞状態は、適当なＡＵリッチエレメントおよび／またはＵリッチエレメントを含む導入遺伝子の発現を増加させ得、ＨｕＲ発現を低下させる状態は、これらの導入遺伝子の発現を減少させ得る。導入遺伝子（または天然遺伝子）の３’ＵＴＲとのＨｕＲ相互作用は、ＨｕＲ結合部位を含有する組換え転写物を発現させることによって変更することもできる。これらの転写物の発現は、導入遺伝子転写物または天然ＨｕＲ調節転写物への結合に利用可能なＨｕＲの量を低減し、これらの転写物の半減期を低減し、発現の減少をもたらすであろう。

[00020]一態様では、ＲＤＥ制御は、対象におけるＣＡＲ発現を下げるのに使用されてもよく、免疫反応に関するＣＡＲポリペプチドの利用可能性を低下させ得る。これは、ＣＡＲを含むトランスジェニック免疫細胞の免疫原性を下げることができる。１つには、このより低い免疫原性は、ＣＡＲペプチドの免疫系への曝露が低下するために生じる。

[00021]一態様では、免疫細胞の刺激時の免疫細胞の応答をブーストするのに核酸が使用され得る。例えば、免疫細胞は、より速い産生動態でより高量の免疫ポリペプチドを産生することができる（より大きなＣ_ｍａｘ）。免疫ポリペプチドには、例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム、アポトーシス誘導ポリペプチド等を挙げることができる。ＲＮＡ中の核酸が発現すると、ＲＮＡ中のＲＤＥがポリペプチド、例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドの発現を抑制するＲＤＥ結合タンパク質を結合できるように、免疫応答をブーストする核酸は、選択されたＲＤＥ結合タンパク質に対するＲＤＥをコードする核酸に作動可能に連結した制御領域を含んでもよい。ＲＤＥを含むＲＮＡの発現は、ＲＤＥによって制御されるポリペプチドの発現に対して真核細胞を準備することができる。例えば、ＲＤＥを含むＲＮＡの発現は免疫細胞で行われて、免疫細胞の刺激時の免疫ポリペプチドの発現に対して細胞を準備してもよい。

[00022]一態様では、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ６４、ＣＤ６６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１５７、ＣＬＬ－１、ＣＸＣＲ４、ＬｅＹ、ＰＲ１、ＲＨＡＭＭ（ＣＤ１６８）、ＴＩＭ－３、および／またはＷＴ１を含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞で見出される抗原を対象にしてもよい。モノクローナル抗体２９３Ｃ３－ＳＤＩＥは、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの細胞外エレメントとして使用することができる（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら、２０１５、ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）。ＡＭＬの他の抗原は当技術分野で公知であり、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または他の受容体の標的となり得る。オンコ－シアリル化（ｏｎｃｏ－ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ＣＤ４３は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と関連しており、このオンコ－シアリル化ＣＤ４３は正常な細胞および組織では見出されない。このオンコ－シアリル化ＣＤ４３は、モノクローナル抗体ＡＴ１４－０１３によって結合され、この抗体の可変領域は、抗オンコシアリル化ＣＤ４３ＣＡＲを作るのに使用される。ＡＴ１４－０１３は、このオンコ－シアリル化ＣＤ４３で見出される固有のシアリル化エピトープを認識する。このＣＡＲはＡＭＬに特異的であり、対象における正常組織とは副反応性を持たない。一態様では、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ５、ＣＤ１０、およびＣＤ４３を含む、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞で見出される抗原を対象にし得る。ＤＬＢＣＬの他の抗原は当技術分野で公知であり、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または他の受容体の標的となり得る。

[00023]ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲまたは他の受容体によって標的にされ得る他の抗原には、例えば、ＤＬＬ３、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＦＡＰ、ＭＵＣ１６（ＣＡ－１２５）、ＣＥＡ、ＣＤ１３３（ＰＲＯＭ１）、ＩＬ１３Ｒａ、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、（ＩＬ３Ｒ）、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ３）、ＬｅＹ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＢＣＭＡおよび／またはＥＰＨＡ２が挙げられる。これらの抗原をターゲティングするＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲまたは他の受容体を含む真核細胞は、例えば、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、他のアンチセンスＲＮＡ、および／または抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）の１つまたは複数などのペイロードを含むことができる。ペイロードは、デコリン、ビグリカンおよび／またはルミカンなどのスモールロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）（それらの全てが、標的部位中または標的部位の近くで細胞マトリックスに融合タンパク質を固定することができる）との融合タンパク質として提示されてもよい。デコリンおよび／またはビグリカントの融合は、標的部位中および標的部位の周辺でＴＧＦ－ベータを結合することもでき、免疫抑制を低下させ得る。例えば、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＴＮＦα、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）および／またはＩＬ－１２を含む、骨髄細胞に起因する免疫抑制または阻害を低下させる骨髄修飾（ｍｙｅｌｏｉｄｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）ペイロード（「ＭＭペイロード」）が送達されてもよい。２つ以上のＭＭペイロードも、送達について異なる薬物動態をもたらすＲＤＥを使用してＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲおよび／または他の受容体細胞（例えば、Ｔ細胞）によって送達することができる。例えば、異なるＭＭペイロードの送達のＣｍａｘが異なる時間に生じるように、異なるＭＭペイロードが異なるＲＤＥによって制御され得る。

[00024]ＡＢ毒素は、所望のタンパク質産物を標的細胞に送達する融合ペイロードを操作するのに使用することができる。ＡＢ毒素には、例えば、ジフテリア毒素、破傷風毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、ウェルシュ菌のイオタ毒素Ｉａ、クロストリジウム・ボツリヌムのＣ２毒素ＣＩ、クロストリジウム・ディフィシルのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。ＡＢ毒素は、修飾ＡＢ毒素がその受容体を結合し、ＡＢ毒素のＢドメインを通じて所望のタンパク質を標的細胞に送達できるように、ＡＢ毒素の触媒（毒性）成分（Ａドメイン）を所望のタンパク質と置き換えるために操作され得る。これらのＢ毒素融合物も、Ｂドメインの受容体結合部分を、所望の標的細胞上の所望の抗原および／または受容体に結合する結合ドメイン（例えば、リガンド）と置き換えるために操作され得る。これらの修飾Ｂ毒素融合物は、毒素のＢドメインを使用して所望のタンパク質ペイロードを標的細胞に送達することができる。

[00025]ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体は、例えば、αｖβ６などのインテグリン（数多くの固形腫瘍（例えば、口腔扁平細胞がん、結腸がん、膵臓がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん等を含む）で見出される）などの固形腫瘍で見出される抗原を対象にしてもよい。

[00026]一態様では、ＲＤＥを結合するためのＧＡＰＤＨまたは他のＲＤＥ結合タンパク質の利用可能性に影響を与える小分子および他の分子が、ＧＡＰＤＨ、他のＲＤＥ結合解糖系酵素、ならびに／またはエネルギーおよび細胞代謝に関与する他のＲＤＥ結合酵素によって遺伝子発現を調節するのに使用されてもよい。細胞における解糖を増加させる分子は、ＲＤＥへの結合に利用可能なＧＡＰＤＨの量を低減させ得、ＧＡＰＤＨ制御下の転写物からの翻訳を増加させ得る。同様に、他の解糖系酵素および代謝酵素がＲＤＥに結合してもよく、細胞における解糖および他のエネルギー経路の活性化は、対応するＲＤＥを結合するのに利用可能なこれらの酵素の量を低減し得る。この低下した結合は、これらのＲＤＥ結合タンパク質によって制御される転写物からの翻訳を増加させ得（ＲＤＥに結合する酵素が発現を減少させる）、または酵素結合が発現に対してプラスの効果を与えるならば翻訳を減少させ得る。これらの分子は、炎症および／または自己免疫疾患と関連する特定のタイプの神経変性の処置においても有用であり得る。これらの分子は、ＲＤＥが結合され、免疫細胞がＲＤＥ制御遺伝子の発現を低下させるように、免疫細胞中のＧＡＰＤＨの量を変更するのに使用されてもよい。免疫細胞中のＲＤＥ制御下のいくつかの遺伝子は炎症と関連しており、そのため、炎症関連転写物を阻害するＲＤＥ結合タンパク質の量を増加させる分子は炎症を低下させ得る。

[00027]選択されたＲＤＥを含む転写物をコードする核酸構築物は、免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球で発現され得る。選択されたＲＤＥを含む組換え転写物は、Ｔリンパ球中のＲＤＥ結合タンパク質に結合し、該タンパク質のレベルを枯渇させることができ、その結果、枯渇したＲＤＥ結合タンパク質によって制御されるポリペプチドをコードする転写物は、他の細胞シグナルに対する活性化の異なる閾値点で発現される。ＲＤＥ構築物の使用は、ＲＤＥによって発現が制御されるポリペプチドの発現動態および／または発現のＣｍａｘを増加させることができる。

[00028]一態様では、ＣＡＲＴリンパ球は、移植片対宿主反応を低減または防止するために修飾される。これは、Ｔリンパ球を活性化するＴ細胞受容体の能力をノックアウトすることによって行われる。優性ＣＤ３イプシロン鎖変異体がＴリンパ球に導入されると、該変異体はＴリンパ球を活性化するＴ細胞受容体の能力をノックアウトし得る。１つのそのようなＣＤ３イプシロン変異体は、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃモチーフのシステイン残基をセリン残基と置き換える二重変異体である（Ｃ１１９ＳおよびＣ１２２Ｓ変異体）。この変異体ＣＤ３イプシロン鎖はＴ細胞受容体からのシグナル伝達を妨害し、Ｔ細胞受容体を通じたＴリンパ球のリガンド誘導活性化を阻止する。過剰なＣＤ３イプシロンＣ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ変異体をＴリンパ球で発現させることにより、ＣＡＲＴリンパ球のＴリンパ球受容体に結合する宿主抗原に応答してＴリンパ球が活性化することはないであろう。これは、移植片対宿主反応が低下した対象における同種ＣＡＲＴリンパ球の使用を可能にする。

[00029]一態様では、発現ベクターは、ＣＡＲカセットおよびＣＤ３イプシロン変異体（Ｃ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓなどの優性変異体）カセットを有する。これらの２つの発現カセットは、強力なプロモーターに（例えば、Ｔリンパ球において活性な強力なエンハンサーと）作動可能に連結される。２つのカセットは異なるプロモーターを有してもよく、または同じプロモーターから発現されてもよい。発現構築物は、ＣＡＲによる細胞の刺激時に導入遺伝子発現を活性化するＲＤＥに作動可能に連結した導入遺伝子を、異なるプロモーターの制御下で含むこともできる。

[00030]一態様では、Ｔリンパ球またはＴ細胞でのＴｏｘ発現は、エフェクター状態（低いＴｏｘ）かまたは消耗状態（Ｔｏｘが高いＴ_ｅｘ）のいずれかを生じるように調節される。Ｔｏｘは、Ｔｏｘを標的にするｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡにより活性化Ｔリンパ球において下方調節され得る。操作されたＴリンパ球におけるＴｏｘ遺伝子座は、機能的産物を産生しないようにノックアウトすることもできる。反対に、Ｔｏｘが操作されたＴリンパ球で発現されて、細胞を消耗させ、遮断（オフスイッチ）してもよい。

[00031]３つの変数が、ＣＡＲコピー数、標的エピトープコピー数、およびＣＡＲ結合親和性である、最適なＣＡＲ活性に対するダイヤグラムを示す。 [00032]休止期のＴ細胞の生物発光と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化の後のＲＤＥによって制御されたルシフェラーゼを伴うＴ細胞からの生物発光に対するグラフを示す。 [00033]休止期のＴ細胞の生物発光と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化の後のＲＤＥＧｏｌｄ１、Ｇｏｌｄ２、またはＧｏｌｄ３によって制御されたルシフェラーゼを伴うＴ細胞からの生物発光に対するグラフを示す。 [00034]休止期のＴ細胞のＩＬ－１２発現と比較した、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化の後のＲＤＥによって制御されたＩＬ－１２発現を伴うＴ細胞からのＩＬ－１２発現に対するグラフを示す。 [00035]ジャーカット細胞における制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。 [00036]初代Ｔ細胞における制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。 [00037]制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する１、３、６、および８日後の活性化ルシフェラーゼ発現／基底ルシフェラーゼ発現を示す。 [00038]制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。 [00039]制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する活性化の１、３／４、６、および８日後に測定したダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。 [00040]制御エレメントとして異なるＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対する活性化の１、３／４、６、および８日後に測定したダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。 [00041]グルコースおよびガラクトースの存在下での制御エレメントとしてＲＤＥを用いたルシフェラーゼ構築物に対するルシフェラーゼ発現への影響を示す。

[00042]様々な実施形態について説明する前に、この開示の教示は、説明される特定の実施形態に限定されることはなく、そのため、当然のことながら、変更することも可能であることは理解されるべきである。本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、ただ単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。

[00043]特に明記されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または同等の任意の方法および材料も、本教示の実践または試験において使用することができ、いくつかの例示的な方法および材料について、以下において説明する。

[00044]文脈において明確に示されない限り、明細書および添付された特許請求の範囲において用いられている場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数指示対象も含むことに留意しなければならない。さらに、特許請求の範囲は全ての必要に応じた要素を排除するように作成することができることにも留意されたい。そのため、この記述は、クレーム要素の列挙との関連における「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用、または「否定的」制限の使用のための根拠として機能することが意図される。ある物質の濃度またはレベルに関して与えられる数値限界は、文脈において明記されない限り、おおよその値であることが意図される。したがって、濃度が、（例えば）１０μｇであることが示される場合、当該濃度は、少なくともおよそまたは約１０μｇであることが意図される。

[00045]この開示を読む際に当業者には明らかであるように、本明細書において説明および例示される個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく任意の他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離することができるかまたはそれらと組み合わせることができる別々の構成要素および特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序において、または論理的に可能な任意の他の順序において、実施することができる。
定義
[00046]本開示により、本明細書の説明において使用される技術用語および学術用語は、特に明記されない限り、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。

[00047]本明細書において使用される場合、「アクチュエーターエレメント」は、ＲＮＡ制御デバイスのシステム制御機能をコードするドメインであると定義される。アクチュエータードメインは、必要に応じて、遺伝子調節機能をコードすることができる。

[00048]本明細書において使用される場合、「抗体」は、リガンド結合タンパク質として機能的に定義され、ならびに免疫グロブリンの可変領域に由来するとして当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むとして構造的に定義される、タンパク質であると定義される。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子（異なる動物の遺伝情報を組み合わせることによって作製された）、または合成免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなり得る。当該認識された天然の免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子および複数のＤセグメントおよびＪセグメントが挙げられる。軽鎖は、κまたはλのどちらかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらはさらに、それぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、様々なペプチターゼによる消化によって生成された十分に特徴付けられたいくつかの断片として、または組換えＤＮＡ技術によって作製された様々な断片として、存在する。抗体は、多くの異なる種（例えば、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、ヒト、または齧歯動物、例えば、マウスまたはラットなど）から得ることができ、または合成することもできる。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ）抗体であり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの多鎖または単鎖状の断片もしくは無傷の免疫グロブリンであり得る。

[00049]本明細書において使用される場合、「抗体断片」は、無傷の抗体の少なくとも１つの一部分、またはその組換え変異体であると定義され、ならびに、標的、例えば、抗原などに抗体断片の認識および特異的結合を与えるのに十分な、抗原結合性ドメイン、例えば、無傷の抗体の抗原決定可変領域を意味する。抗体断片の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）＠２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのどちらか）など、ラクダ化ＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質であると定義され、この場合、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することができ、ならびに、当該ｓｃＦｖは、それらが由来する当該無傷の抗体の特異性を維持する。特に明記されない限り、本明細書に使用される場合、ｓｃＦｖは、例えば、当該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に対して、どちらかの順序においてＶＬおよびＶＨ可変領域を有し得、当該ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るか、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。

[00050]本明細書において使用される場合、「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子であると定義される。免疫応答は、抗体の産生、または特異的免疫適格細胞の活性化、またはその両方に関与する。当業者は、任意の巨大分子、例えば、これらに限定されるわけではないが、ほとんど全てのタンパク質またはペプチド、例えば、グリコシル化ポリペプチド、リン酸化ポリペプチド、および他の翻訳後修飾ポリペプチド、例えば、脂質で修飾されたポリペプチドなどは、抗原として機能することができる。その上、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから得ることができる。当業者は、免疫応答を引き起こすタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくは部分的ヌクレオチドを含む任意のＤＮＡは、結果として、その用語が本明細書において使用されるような「抗原」をコードする。その上、当業者は、抗原が、必ずしも遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされるわけではないことを理解するであろう。本発明は、２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、それらに限定されるものではないこと、ならびに、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を引き起こすポリペプチドをコードするために様々な組み合わせにおいて配置されることは、容易に明らかとなるであろう。その上、当業者は、抗原が必ずしも「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、合成することができ、または生物試料から得ることができ、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは、容易に明らかとなるであろう。そのような生物試料としては、これらに限定されるわけではないが、組織試料、腫瘍試料、他の生物学的構成要素を伴う細胞または体液を挙げることができる。

[00051]本明細書において使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」および用語「ＣＡＲ」は、相互互換的に使用される。本明細書において使用される場合、「ＣＡＲ」は、抗原認識部分と細胞活性化エレメントとを含む融合タンパク質であると定義される。

[00052]本明細書において使用される場合、「ＣＡＲＴ細胞」または「ＣＡＲＴリンパ球」は、相互互換的に使用され、実際の発現レベルにかかわらずＣＡＲポリペプチドを産生する能力を有するＴ細胞であると定義される。例えば、ＣＡＲを発現することができる細胞は、細胞でのＣＡＲの発現のための核酸配列を含むＴ細胞である。

[00053]本明細書において使用される場合、「共刺激エレメント」または「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ポリペプチド」は、共刺激ポリペプチドの細胞内部分であると定義される。共刺激ポリペプチドは、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ナチュラルキラー細胞受容体、において表すことができる。そのようなポリペプチドの例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＭｙＤ８８などが挙げられる。

[00054]本明細書において使用される場合、「Ｃｍａｘ」は、ポリペプチドを産生するように細胞が刺激または活性化された後にその細胞によって産生されるポリペプチドの最大濃度を意味すると定義される。

[00055]本明細書において使用される場合、「サイトカインＣｍａｘ」は、サイトカインを産生するための刺激または活性化の後に免疫細胞によって産生されるサイトカインの最大濃度を意味すると定義される。

[00056]本明細書において使用される場合、「細胞傷害性ポリペプチドＣｍａｘ」は、細胞傷害性ポリペプチドを産生するための刺激または活性化の後に免疫細胞によって産生される細胞傷害性ポリペプチドの最大濃度を意味すると定義される。

[00057]本明細書において使用される場合、「有効量」または「治療有効量」は、相互互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書において説明される化合物、製剤、材料、または組成物の量であると定義される。

[00058]本明細書において使用される場合、「エピトープ」は、免疫応答を引き起こすことができる抗原の一部分、または抗体に結合する抗原の一部分であると定義される。エピトープは、抗体によって認識されるタンパク質配列またはサブ配列であり得る。

[00059]本明細書において使用される場合、「発現ベクター」および「発現構築物」は、相互互換的に使用され、両方とも、細胞におけるタンパク質発現のために設計されたプラスミド、ウイルス、または他の核酸であると定義される。ベクターまたは構築物は、遺伝子を宿主細胞内に導入するために使用され、それにより、当該ベクターは、当該ベクター／構築物においてコードされるタンパク質を発現するために、当該細胞のポリメラーゼと相互作用するであろう。発現ベクターおよび／または発現構築物は、細胞において染色体外に存在し得るか、または染色体に統合され得る。染色体に統合される場合、当該発現ベクターまたは発現構築物を含む核酸は、発現ベクターまたは発現構築物であろう。

[00060]本明細書において使用される場合、「細胞外エレメント」は、キメラ抗原受容体の抗原結合性エレメントまたは抗原認識エレメントとして定義される。
[00061]本明細書において使用される場合、「造血細胞」は、造血幹細胞から生じる細胞であると定義される。そのような細胞としては、これらに限定されるわけではないが、骨髄性前駆細胞、リンパ前駆細胞、巨核細胞、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、マクロファージ、血小板、単核細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、およびプラズマ細胞が挙げられる。

[00062]本明細書において使用される場合、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、宿主細胞に対して同種ではない核酸および／またはポリペプチドを意味すると定義される。例えば、構築物が、宿主細胞において見出されない様式において配置されたいくつかの相同配列を有する場合、および／または当該構築物が、宿主細胞において見出されないいくつかの異種配列を有する場合、構築物は、宿主細胞に対して異種である。

[00063]本明細書において使用される場合、「ｈｎＲＮＰＬＬ」は、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｌ様を意味すると定義される。
[00064]本明細書において使用される場合、「細胞内エレメント」は、真核細胞の細胞質膜の細胞質側に存在し、真核細胞内にシグナルを伝達する、キメラ抗原受容体の一部分として定義される。「細胞内シグナル伝達エレメント」は、特殊機能を実行するために真核細胞へ指示するエフェクター機能シグナルを変換する細胞内エレメントの一部分である。

[00065]本明細書において使用される場合、「ノッチン」または「阻害剤システイン－ノット」または「システイン－ノット」は、様々な機能を有する超安定なペプチドの構造的ファミリーである。ノッチンは、高い熱安定性、タンパク質分解安定性、および化学安定性を有するこれらのペプチドを与える、特定の配置において接続された３つのジスルフィド結合を含む。ノッチンは、ペプチドに結合特異性を与えることができるペプチドループを伴うコア足場構造を有する。ノッチンは、所望の標的に対する結合特異性を作り出すために、ループに多様性を導入するように操作されている。

[00066]本明細書において使用される場合、「ＲＮＡ不安定化エレメント」または「ＲＤＥ」は、相互互換的に使用され、両方とも、タンパク質によって結合され、タンパク質結合が、ＮＡの安定性および／または翻訳を変更する、ＲＮＡの核酸配列として定義される。ＲＤＥの例としては、クラスＩＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、クラスＩＩＡＲＥ、クラスＩＩＩＡＲＥ、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、およびステム－ループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）が挙げられる。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＲＤＥは、ＲＮＡ安定化ポリペプチド様Ｈｕｒにも結合し得る。

[00067]本明細書において使用される場合、「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、抗原結合活性において機能を有する免疫グロブリン分子として定義される。ｓｃＦｖ（単鎖断片可変）形式における抗体は、柔軟なペプチドリンカーによって一緒に接合されている重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域からなる。

[00068]本明細書において使用される場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、通常は胸腺において成長する造血細胞であると定義される。Ｔリンパ球またはＴ細胞としては、これらに限定されるわけではないが、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および粘膜インバリアントＴ細胞が挙げられる。

[00069]本明細書において使用される場合、「Ｔｏｘ」は、胸腺細胞選択関連高移動度群ボックスを意味すると定義される。
[00070]本明細書において使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入されるプロセスであると定義される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸によってトランスフェクト、または形質転換、または形質導入されている細胞である。当該細胞は、初代対象細胞およびその後代を包含する。本明細書において使用される場合、「膜貫通エレメント」は、細胞外エレメントと細胞内エレメントの間のエレメントとして定義される。膜貫通エレメントの一部分は、細胞膜内に存在する。

併用療法
[00071]この開示は、別の療法と併用して、または別の療法と連続した順序で、ＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現するＣＡＲＴ－リンパ球を提供するための組成物および方法を提供する。当該他の療法としては、例えば、化学療法剤、抗体、および抗体－薬物コンジュゲート、放射線療法、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬を挙げることができる。例えば、当該他の療法は、ＣＡＲＴ－リンパ球と同じかまたは異なる特異性を有する抗体薬物コンジュゲートであり得る。

[00072]抗体、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡＲのための標的として本明細書において説明される任意の腫瘍関連抗原などに結合することができる。ＡＤＣの薬物成分は、例えば、化学療法剤、放射性ヌクレオチド、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬であり得る。ＡＤＣの薬物成分は、本質的に切断可能または切断不可能であり得るリンカーによって抗体に取り付けることができる。

[00073]アルキル化剤としては、例えば、マスタードガス誘導体（例えば、メクロールエサミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、またはイホスファミド）、エチレンイミン（例えば、チオテパまたはヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（例えば、アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、またはテモゾロミド）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、またはストレプトゾシン）、および金属塩（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチン）を挙げることができる。植物アルカロイドとしては、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、またはビノレルビン）、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタクセル）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニソピド）、およびカンプトテシンアナログ（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）を挙げることができる。抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、またはイダルビシン）、およびクロモマイシン（例えば、ダクチノマイシンまたはプリカマイシン）を挙げることができる。抗代謝剤としては、例えば、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアンタゴニスト（例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、またはゲムシタビン）、プリンアンタゴニスト（例えば、６－メルカプトプリンまたは６－チオグアニン）、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、またはペントスタチン）を挙げることができる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、アムサクリン、エトポシド、エトポシド、リン酸、またはテニポシド）を挙げることができる。抗新生物薬としては、例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素）、副腎皮質ステロイド阻害剤（例えば、ミトタン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼまたはペガスパルガーゼ）、微小管阻害薬（例えば、エストラムスチン）、およびレチノイド（例えば、ベキサロテン、イソトレチノイン、またはトレチノイン）を挙げることができる。

[00074]当該薬物成分は、アントラサイクリン、カンプトテシン、チューブリン阻害剤、マイタンシノイド、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）二量体（ＰＢＤ）、アウリスタチン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸アナログ、タキサン、ＣＯＸ－２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、抗代謝剤、アルキル化剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、およびそれらの組み合わせでもあり得る。

[00075]使用の特定の薬剤は、５－フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン（Ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ－１０１、ＡＶＬ－２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＯＸ－２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ＳＮ－３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ディナシクリブ、ドセタクセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、ドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン（２－ＰＤｏｘ）、２－ＰＤｏｘのプロドラッグ形態（ｐｒｏ－２－ＰＤｏｘ）、シアノモルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エンドスタチン、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結着剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスフェート、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクシウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’－Ｏ－ジオレオイル－ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ－ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル蛋白トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ－０８３４、ＧＳ－１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、ラパチニブ、レノリダミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ＬＦＭ－Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６－メルカプトプリンメトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ－３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ－３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ＳＮ－３８、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、およびＺＤ１８３９からなる群から選択され得る。好ましくは、当該薬物は、ＳＮ－３８である。

[00076]ある態様において、併用療法は、タンパク質コンジュゲートである。タンパク質コンジュゲートは、治療薬、診断薬、またはリポーターであり得るペイロードを運ぶことができる。当該治療薬、診断薬、またはリポーターの単一の分子が存在してもよく、または２つ以上の分子が存在してもよい。当該治療薬は、化学療法剤、例えば、本明細書に記載された任意のもの、例えば、放射性ヌクレオチド、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬などであり得る。当該コンジュゲートのペイロードは、これらの治療薬、診断薬、および／またはリポーターのうちの任意の１つまたは複数であり得る。当該タンパク質は、断片、単量体、二量体、または多量体タンパク質であり得る。当該タンパク質は、抗体、抗体断片または誘導体、単鎖抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、および／または転写因子であり得る。

[00077]多くのコンジュゲート化試薬は、ペイロードをタンパク質にコンジュゲートするために使用することができる。そのような試薬は、タンパク質またはペプチドと反応することができる少なくとも１つの官能基を有し得る。例えば、当該コンジュゲート化試薬は、当該タンパク質に存在する少なくとも１つの求電子体または、とりわけ求核体と反応することができる官能基を含み得、この場合、当該官能基は、リンカーを介してペイロードに結合される。当該コンジュゲートを形成するために、任意のタイプの既知のコンジュゲート化反応が使用され得る。例えば、当該反応は、チオール結合、アミンコンジュゲート化、またはクリック化学の既知の方法を使用して実施することができる。当該試薬は、マレイミド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基、クリック化学基、例えば、アジドもしくはアルキン基、アミン基、カルボキシル基、カルボニル基、または活性エステル基を有し得る。他の可能なアプローチとしては、コンジュゲート化に対して特異的なアミノ酸によって遺伝子操作されているタンパク質の使用、例えば、操作されたシステインまたは非天然アミノ酸など、ならびに特異的酵素反応、例えば、トランスグルタミナーゼなどによる酵素コンジュゲート化が挙げられる。当該タンパク質上の反応部位は、本質的に求核性または求電子性のどちらかであり得る。一般的なタンパク質コンジュゲート化部位は、リジンもしくはシステインアミノ酸残基または炭水化物部分である。あるいは、コンジュゲート化は、結合タンパク質に取り付けられているポリヒスチジンタグにおいて生じ得る。

[00078]コンジュゲート化試薬は、有利には、タンパク質の求核体と反応することができ得、したがって、それらに化学的に結合することができ得る。これらの例において、コンジュゲート化試薬は、典型的には、求核体との反応において失われる少なくとも１つの脱離基を含む。コンジュゲート化試薬は、例えば、２つ以上の脱離基を含んでもよい。当該コンジュゲート化試薬は、２つの求核体と反応することができ得る。コンジュゲート化試薬は、少なくとも２つの脱離基を含むことができる。２つ以上の脱離基が存在する場合、これらは、同じであってもまたは異なっていてもよい。あるいは、コンジュゲート化試薬は、２つの脱離基と化学的に同等で２つの求核体と反応することができるような、単一の基を有してもよい。求核基としては、例えば、硫黄原子およびアミン基が挙げられ、タンパク質における求核基は、例えば、システイン残基、リジン残基、またはヒスチジン残基によって提供される。求核基は、タンパク質のシステイン残基に存在する硫黄原子であり得る。そのような構造体は、タンパク質におけるジスルフィド結合の反応によって得られ得る。求核基は、ポリヒスチジンタグに存在するような、タンパク質のヒスチジン残基のイミダゾール基であり得る。

[00079]当該コンジュゲートは、治療薬、診断薬、またはラベリング剤を当該コンジュゲートのタンパク質またはペプチドに接続するリンカーを含むことができる。当該リンカーの骨格は、一方の端の治療薬、診断薬、またはラベリング剤から、他方の端のタンパク質またはペプチドまでつながった、原子の連続した鎖であり得る。当該リンカーは、分解可能な基を含んでもよく、すなわち、それは、生理的条件下において破壊されてそれらが結合しているかまたは結合するであろう当該タンパク質からペイロードを分離するような基を含んでもよい。あるいは、当該リンカーは、生理的条件下において切断可能ではない。リンカーが生理的条件下において破壊する場合、それは、好ましくは、細胞内条件下において切断可能である。標的が細胞内である場合、好ましくは、当該リンカーは、細胞外条件に対して実質的に影響を受けない（すなわち、それにより、細胞内標的への十分な用量の治療薬の送達が妨害されない）。

[00080]当該リンカーが、分解可能な基を有する場合、これは、概して、加水分解性条件に対して影響を受けやすく、例えば、当該基は、ある特定のｐＨ（例えば、酸性条件）において分解する基であり得る。加水分解条件／酸性条件は、例えば、エンドソームまたはリソソームにおいて見出され得る。酸性条件下での加水分解に影響を受けやすい基の例としては、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニットアミド、オルソエステル、およびケタールが挙げられる。当該分解可能なリンカーは、酸切断可能リンカーまたは還元可能リンカーでもあり得る。還元可能リンカーは、ジスルフィド基を含み得る。当該リンカーは、酵素的分解に影響を受けやすい基も含み得、例えば、それは、プロテアーゼ（例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼ）またはペプチダーゼによる切断に影響を受けやすくあり得る。例えば、それは、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸残基を含むペプチジル基を含み得る（例えば、Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ）。例えば、それは、１から５のアミノ酸、例えば、２から４のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を含み得る。酵素切断可能リンカーは、１つまたは複数のリソゾーム酵素によって切断または分解することができる化学基も含むことができる。好適な基としては、例えば、バリン－シトルリンジペプチド基、フェニルアラニン－リジンジペプチド基、およびβ－グルクロニド基が挙げられる。

[00081]タンパク質コンジュゲートにおけるタンパク質が抗体（例えば、完全長、断片、および／または単鎖）である場合、第１のリンカーの一方の端は、当該抗体に共有結合によって取り付けることができる。当該リンカーの抗体反応性末端は、当該抗体上のシステインチオール基またはリジンアミン基によって当該抗体にコンジュゲートすることができる部位であり得、したがって、二重結合などのチオール反応基（マレイミドのような）、またはクロロ、ブロモ、またはヨードなどの脱離基、またはＲ－スルファニル基、またはカルボキシル基などのアミン反応基であり得る。

[00082]ＣＡＲ療法（例えば、ＧＯＬＤ制御された導入遺伝子による）および他の療法は、対象に対して同時に提供することができ、または一方を他方の前に対象に提供することができ、または当該ＣＡＲ療法および当該他の療法は、交互のサイクルにおいて提供することができ、または当該他の療法と一緒に当該ＣＡＲ療法を、サイクルにおいて提供することができ、または投与の他の組み合わせを使用することもできる。ＣＡＲ療法は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）療法と組み合わせることができ、その場合、ＣＡＲおよびＡＤＣは、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する。ＣＡＲおよびＡＤＣが、同じ抗原に結合する場合、当該ＣＡＲおよび当該ＡＤＣは、当該抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合することができる。ＡＤＣ療法またはＣＡＲ療法の一方を、最初に対象に提供し、その後に当該他方を、当該第１の療法による処置期間の後に提供することができる。ＡＤＣは、単独または別の承認された療法（例えば、化学療法および／または免疫チェックポイント阻害剤）との組み合わせのどちらかにおいて、対象の腫瘍量を減少させるために、ＣＡＲ療法の投与の前に最初に対象に提供することができる。あるいは、ＡＤＣ療法およびＣＡＲ療法は、同時に対象に提供することができる。あるいは、ＣＡＲ療法を最初に提供し、その後にＡＤＣ療法を提供することもできる。

ＲＮＡ不安定化エレメント
[00083]ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）は、ＲＮＡ分子の安定性またはＲＮＡ分子の翻訳動態に影響を及ぼすかまたは維持する核酸である。いくつかのＲＤＥは、ＲＮＡを不安定化する（例えば、切断する）ポリペプチドによって結合されるか、または翻訳を防ぎ、それによりＲＮＡに対する機能の損失を生じさせる。いくつかのＲＤＥ結合ポリペプチドは、ＲＮＡを安定化して、ＲＮＡの半減期を増加させる。ＲＤＥは、導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子、の発現を制御するために使用することができる。ＲＤＥは、導入遺伝子の表現を調節するために、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、および／またはＳｉｄｅＣＡＲと共に使用することができる。ＲＤＥは、ＣＡＲ以外のポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するためにも使用することができる。他の導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導物質、補体、細胞傷害性小分子、他の細胞傷害性化合物、イメージングのためのポリペプチド、または所望の効果を有することができる他のポリペプチドなどをコードし得る。ＲＤＥは、導入遺伝子ペイロードの送達を制御することができる。ＲＤＥの例としては、例えば、ＡＵリッチエレメント、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、およびある特定のステムループエレメントが挙げられる。例示的ＲＤＥは、Ｋｏｖａｒｉｋら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ８９：２１～２６（２０１７）；Ｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ４９９：１７２～１７７（２０１３）；Ｃａｓｔｅｌｌｏら，Ｃｅｌｌ１４９：１３９３～１４０６（２０１２）；Ｖｌａｓｏｖａら，Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ．２９：２６３～２７０（２００８）；Ｂａｒｒｅａｕら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．ｖｏｌ３３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２（２００６）；Ｍｅｉｓｎｅｒら，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ５：１４３２～１４４７（２００４）；Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら，Ｇｅｎｅ２６５：１１～２３（２００１）に記載されており、なお、これら全ての文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[00084]当該ＲＤＥは、クラスＩＡＵリッチエレメント（Ｕリッチ状況における分散されたＡＵＵＵＡ（配列番号１））、クラスＩＩＡＵリッチエレメント（重複（ＡＵＵＵＡ）＠ｎ）、クラスＩＩＩＡＵリッチエレメント（Ｕリッチストレッチ）、ステム－ループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）、サイトカイン３’ＵＴＲ（例えば、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－２、Ｔ－細胞受容体α鎖、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦなど）、およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ（配列番号２）の配列であり得る。Ｋｈａｂａｒ，ＷＩＲＥｓＲＮＡ２０１６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｗｒｎａ．１３６８（２０１６）；Ｐａｌａｎｉｓａｍｙら，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．９１：６５１～６５８（２０１２）、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当該ＲＤＥは、例えば、ＵＵＧＵＵ（配列番号３）、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号４）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号５）のうちの１つまたは複数で構成されるＧＵリッチエレメントでもあり得る。当該ＲＤＥは、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ（配列番号７）、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号８）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号９）、ＵＵＡＧＡ（配列番号１０）、またはＡＧＵＵＵ（配列番号１１）のうちの１つまたは複数で構成されるＵリッチエレメントであり得る。いくつかの態様において、複数のＲＤＥを組み合わせることによって調節ユニットを作り出すことができ、例えば、同じ配列を有する複数のＲＤＥは、コンカテマーに配置することができ、またはいくつかまたは全てのＲＤＥの間に、介在配列によって配置することができる。ＲＤＥ配列は、当該ＲＤＥに対するＲＮＡ結合タンパク質の親和性を増加または減少するように修飾することができる。例えば、ＡＵリッチＲＤＥは、ＲＤＥに対するグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の親和性を変えるように変更することができる。親和性におけるこの変化は、ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥによって調節される導入遺伝子の発現のためのＧＡＰＤＨ活性化閾値を変えることができる。

[00085]本開示は、ＡＵ＃指定をいくつかのＲＤＥに割り当て、これらのＲＤＥは、ＡＵ＃、または当該ＲＤＥが得られる遺伝子名によって参照することができる。いくつかのＡＵ＃およびＲＤＥを得られる対応する遺伝子としては、例えば、ＡＵ１（ＣＤ４０ＬＧ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１１（ＣＤ１９）、ＡＵ１２（ＩＬ４）、ＡＵ１３（ＩＬ５）、ＡＵ１４（ＩＬ６）、ＡＵ１５（ＩＬ９）、ＡＵ１６（ＩＬ１０）、ＡＵ１７（ＩＬ１３）、ＡＵ１８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、ＡＵ２４（ＣＤ８）、ＡＵ２７（ｂＧＨ）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）が挙げられる。

[00086]当該ＲＤＥは、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＰＧＥ２、ＣＯＸ－２、ＭＭＰ（マトリックスメタプロテイナーゼ）、ｂＦＧＦ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、デルタ－ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２、ＮＯＳＨＡＮＯＳ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ｂｃｌ－２、インターフェロン－β、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３、リンパ球抗原９６、ＳＵＰＶ３Ｌ１、ＳＦｔＰＡ２、ＢＬＯＣ１Ｓ２、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ８Ｄ１、ＴＲＰＴ１，ＣＩＰ２９、ＥＰ４００、ＰＬＥ２、Ｈ３ＳＴ３Ａ１、ＺＮＦ５７１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＳＰＡＧ４Ｌ、ＯＲ１０Ａ６、およびＫＩＲ３ＤＬ、をコードする遺伝子の３’ＵＴＲに由来し得る。他のＲＤＥは、例えば、ＧＬＭＮ、ＡＭＹ２Ｂ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ１Ａ、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＣＳＲＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＫＣＮＨ１、レチキュロン４、ＭＲＰＬ３０、Ｎａｖ１．２、組織因子経路阻害因子、ＥＥＦ１Ｂ２、ＣＲＹＧＢ、ＡＲＭＣ９、ＲＰＬ１５、ＥＡＦ２、ＭＲＰＳ２２、ＭＲＰＳ２２、ＣＯＰＢ２、ＰＤＣＤ１０、ＲＥ１抑制転写因子、アンフィレグリン、ＡＰ１ＡＲ、ＴＬＲ３、ＳＫＰ２、ペプチジルグリシンアルファアミド化モノオキシゲナーゼ、ＴＮＦＡＩＰ８、インターロイキン９、ＰＣＤＨＡ２、ＰＣＤＨＡ１２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ５ファミリーメンバーＡ１、ＫＣＮＱ５、ＣＯＸ７Ａ２、モノカルボキシレートトランスポーター１０、ＭＬＬＴ４、ＰＨＦ１０、ＰＴＰＮ１２、ＭＲＮＡ＿（グアニン－Ｎ７－）－メチルトランスフェラーゼ、ＷＨＳＣ１Ｌ１、毛髪鼻指節候群１型、インターフェロンアルファ－１、ＺＣＣＨＣ６、網膜色素性ＧＴＰａｓｅ調節因子、ＭＥＤ１４、ＣＬＣＮ５、ＤＮＡ２Ｌ、ＯＲ５２Ｄ１、ＮＥＬＬ１、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬＣ２２Ａ１０、ＴＲＰＣ６、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＥＰＳ８、ＣＴ２＿（遺伝子）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＴＡＯＫ３、ＮＵＰＬ１、エンドセリン受容体Ｂ型、生存運動ニューロンタンパク質相互作用タンパク質１、ＰＯＬＥ２、肝臓リパーゼ、ＴＰＳＧ１、ＴＲＡＰ１、ＲＰＳ１５Ａ、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＣＲＯＰ＿（遺伝子）、アポリポタンパク質Ｈ、ＧＲＢ２、ＣＥＰ７６、ＶＰＳ４Ｂ、インターロイキン２８Ｂ、ＩＺＵＭＯ１、ＦＧＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＬＩＮ７Ｂ、ｈｎＲＮＰＬＬ、Ｔｏｘ、およびＣＤＣ４５関連タンパク質由来の３’－ＵＴＲに見出される。

[00087]さらなる他のＲＤＥは、例えば、ＳＣＦＤ１、ＭＡＬ２、ＫＨＳＲＰ、ＩＱＣＢ１、ＣＡＭＰ応答エレメントモジュレーター、ＭＦＡＰ５、ＳＢＦ２、ＦＫＢＰ２、ＰＤＣＤ１０、ＵＢＥ２Ｖ２、ＮＤＵＦＡＢ１、コイルドコイルドメイン含有タンパク質、ＡＬＧ１３、ＴＰＴＥ、エナプチン、チモポエチン、デルタ様１、Ｃ１１ｏｒｆ３０、アクチニンアルファ４、ＴＭＥＭ５９、ＳＰ１１０、ダイサー、ＴＡＲＤＢＰ、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１４、ＺＭＹＭ３、インターロイキン９、Ｉ型、ＯＰＮ１ＳＷ、ＴＨＳＤ１、ＥＲＧＩＣ２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＷＤＲ８、ＦＸＲ１、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ＯＳＢＰＬ３、Ｒａｎ、ＧＹＰＥ、ＡＫＡＰ４、ＬＯＣ６４２６５８、Ｌ２ＨＧＤＨ、ＡＫＡＰ１、ジンクフィンガータンパク質３３４、ＴＣ２Ｎ、ＦＫＢＰＬ、ＧＲＢ１４、ＣＸｏｒｆ６７、ＣＸｏｒｆ６６、ＣＥＰ７６、ガストリクシン、ＣＥＰ７０、ＣＹＰ２６Ａ１、ＮＡＡ３５、アリール炭化水素受容体核内輸送体、ＫＬＣ４、ＧＰＲ１１２、ＬＡＲＰ４、ＮＯＶＡ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＩＴＧＡ６、ＧＰＲ１８、ＭＧＳＴタイプＡ、ＲＥ１抑制転写因子、ＡＳＰＭ、ＺＮＦ４５２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＡＨＳＡ１、ＴＭＴＣ４、ＶＳＸ１、Ｐ１６、ＭＲＰＬ１９、ＣＣＬ２０、ＴＲＰＴ１、肝臓リパーゼ、ＰＤＬＩＭ５、ＣＣＤＣ５３，’ＣＣＤＣ５５、ＧＡＰＶＤ１、ＨＯＸＢ２、ＫＣＮＱ５、ＢＲＣＣ３、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＣＤＫ５ＲＡＰ３、転写因子ＩＩＢ、ＺＥＢ１、ＩＲＧＭ、ＳＬＣ３９Ａ６、ＲＨＥＢ、ＰＳＩＰ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ウロキナーゼ受容体、ＧＦＭ１、ＤＮＡＪＣ７、ホスホイノシチド依存性キナーゼ１、ＬＭＯＤ３、ＴＴＣ３５、ＲＲＰ１２、ＡＴＸＮ２、ＡＣＳＭ３、ＳＯＡＴ１、ＦＧＦ８、ＨＮＲＰＨ３、ＣＴＡＧＥ５、ＰＯＬＧ２、ＤＹＲＫ３、ＰＯＬＫ、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１Ｃ、ＣＤ１３７、カルモジュリン１、ＺＮＦ５７１、ＣＮＯＴ２、ＣＲＹＺＬ１、ＳＭＣ３、ＳＭＣ４、ＳＬＣ３６Ａ１、デコリン、ＨＫＲ１、ＥＲＣ１、Ｓ１００Ａ６、ＲＩＭＳ１、ＴＭＥＭ６７、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＭＥＣＰ２、ＲＮＦ１１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＭＹＬＫ３、ＴＩＮＡＧ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＧＰＤ５、ＵＢＥ２Ｖ１、ＳＡＲ１Ｂ、ＳＬＣ２７Ａ６、ＺＮＦ６３８、ＲＡＢ３３Ａ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＵＣＬ１、ＣＡＤＰＳ２、ＭＣＦ２Ｌ、ＴＢＣＡ、ＳＬＣ１７Ａ３、ＬＥＯ１、ＩＦＮＡ２１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＰＲＫＤ２、ＡＴＰ１１Ｂ、ＭＯＲＣ２、ＲＢＭ６、ＫＬＲＤ１、ＭＥＤ３１、ＰＰＨＬＮ１、ＨＭＧＢ２、ＤＮＡ修復および組換えタンパク質ＲＡＤ５４様、ＲＢＭ９’、ＡＲＬ１１、ＨｕＤ、ＳＰＥＦ２、ＣＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１、「カスパーゼ１」、Ｓ１００Ｇ、ＣＡ１＿、ＣＥＬＡ１、ＰＴＳ、ＩＴＭ２Ｂ、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ、ＴＲＰＰ３、ＩＭＰＤＨ２、ＤＰＹＳ、ＣＤＣＡ３、ＥＦＣＡＢ６、ＳＬＩＴ２、ＳＩＰＡ１Ｌ１、ＦＩＰ１Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＮＤＵＦＣ１、ＣＲＯＰ、ＣＤ４８、ＡＰＰＢＰ１、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ヒストンデアセチラーゼ２ＸＩ型、インターロイキン４、毛髪鼻指節症候群１型、ＳＥＣ６１Ｇ、ＴＲＩＰ１２、ＰＬＥＫＨＯ１、ＳＥＣ６１Ｂ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＰＶＬ、Ｅ２Ｆ７、ＵＴＰ２０、Ｅ２Ｆ５、ＰＡＲＤ３、ＥＸＯＣ７、ＨＥＸＢ、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質８、ＭＢＤ４、ＰＰＰ４Ｃ、ヘリカーゼ、ホスデューシン、ＳＰＧ１１、ＣＧＧＢＰ１、ＰＳＫＨ１、カテプシンＳ、オレキシン、ＩＭＭＰ２Ｌ、Ｃ２ｏｒｆ２８、ラミニン、ＥＩＦ３Ｓ６、ＬＲＲＣ４１ＸＩＩ型、カテプシンＣ、ＨＰＳ６、ＡＲＡＦ、ジンクフィンガーおよびＢＴＢドメイン含有タンパク質１６、性ホルモン結合グロブリン、ＦＢＬＮ２、サイトカインシグナル伝達抑制因子１、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＤＯＭ３Ｚ、ＴＳＦＭ＿ＰＯＬＱ－ｌｉｋｅ、ＤＹＮＬＴ３、ＣＤＨ９、ＥＡＦ２、ＭＩＰＥＰ、ＮＤＵＦＡ１２、ＨＤＡＣ８、ＭＫＫＳ、ＦＧＧ、ＩＬ３６Ｇ、ＣＤＣＡ７、ＣＲＩＳＰＬＤ２、オルファクトメジン様２ｂ、ＭＲＰＬ３２、ＭＲＰＬ３３、ＡＨＩ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＵＴＰ１４Ａ、ＳＳＨ－２、ジストニン、コンタクチン６、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＨＯＣ１、ＣＮＯＴ１、ＲＨＣＥ、ＳＬＣ４１Ａ３、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＮＡＰ２３、ＲＦＸ３、ＧＮＧ４、ＭＲＰＬ４０、ＬＳＲ、アンギオゲニン、ＴＲＩＰ４、ＶＲＫ１、ＣＯＵＰ－ＴＦＩＩ、ＦＯＸＰ２、ＳＮＸ２、ヌクレオポリン８５、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ２７Ａ、ＳＥＣ６２、カルシウム活性化カリウムチャネルサブユニットアルファ－１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＲＰＬ１７、ＣＥＰ１０４、ＣＥＰ２９０、ＶＰＳ２９、ＡＮＸＡ４、ジンクフィンガータンパク質７３７、ＤＤＸ５９、ＳＡＰ３０、ＮＥＫ３、エキソソーム構成要素９、活性化Ｃキナーゼ１の受容体、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ、ＴＩＮＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＤＩＳＣ１、ＬＲＲＴＭ１、ＰＯＰ１ラミンＢ１、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質、ＣＯＸ６Ｃ、ＴＬＲ＿１、ＡＲＩＤ２、ＬＡＣＴＢ、ＭＭＳ２２Ｌ、ＵＢＥ２Ｅ３、ＤＡＰ３、ＺＮＦ２３、ＳＫＰ２、ＧＰＲ１１３、ＩＲＦ９、グレリンＯ－アシルトランスフェラーゼ、ＮＥＩＬ３、ＥＥＦ１Ｅ１、ＣＯＸ１７、ＥＳＤ＿、デンチンシアロホスホプロテイン、ＨＤＡＣ９、ＲＦＣ４、ＣＹＬＤ、ＲＰＬＰ０、ＥＩＦ２Ｂ３、ＵＧＴ２Ａ１、ＦＡＢＰ７、ＴＲＩＰ１１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＩＮＴＳ１２、ＭＹＨ１、ＺＢＴＢ１７、ＭＹＨ４、ＮＬＲＰ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＹＨ８、サーモゲニン受容体２、ＩＦＩ１６、ＴＨＹＮ１、ＲＡＢ１７、ＥＴＦＡ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子、Ｆ１３Ｂ、ＲＡＢ６Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＡＴＢ２、ＳＡＴＢ１、ＨＭＧ２０Ｂ、ＵＨＲＦ１、ＣＮＯＴ３、プロスタグランジンＥＰ２受容体、ＦＡＭ６５Ｂ、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ、ＫｖＬＱＴ２、ＧＲＩＫ５、ＳＨＯＣ２、コルタクチン、ＦＡＮＣＩ、ＫＩＡＡ１１９９、キヌレニナーゼ、デコイ受容体１、ＮＥＵ３、ＰＨＦ１０、メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２、ＲＡＢＧＡＰ１、ＣＥＰ５５、ＳＦ３Ｂ１、ＭＳＨ－５、ＭＳＨ－６、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＬＩＭＳ１、ＳＬＣ５Ａ４、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＲＮＦ３４、ＳＯＲＢＳ２、ＵＩＭＣ１、ＳＯＸ５、ＹＷＨＡＺ、ＩＣＯＳＬＧ、ＮＯＰ５８、ジンクフィンガータンパク質６７９、ＰＨＫＢ、ＭＥＤ１３、ＡＢＣＢ７、ＣＯＱ９、Ｃ１４ｏｒｆ１０４、ジンクフィンガータンパク質５３０、ＫＬＲＣ２、ＬＳＭ８、ＮＢＲ１、ＰＲＫＣＤ、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＭＴＳＳ１、ソマトスタチン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼＬ５、ＷＤＲ７２、ＦＥＲＭＴ３、核内受容体関連－１タンパク質、クエン酸シンターゼ、ＶＰＳ１１、ＫＩＺ、ＺＦＹＶＥ２７、ＢＣＫＤＨＢ、ヒポクレチン、ＣＡＣＮＧ２、ＰＴＣＨ１、カルボニックアンヒドラーゼ４、ヌクレオポリン１０７、ＬＤＬ受容体、ＬＥＫＴＩ、ＦＢＸＯ１１、ＮＤＵＦＢ３、ＦＣＨＯ２、ＣＥＰ７８、ＲＡＰＧＥＦ６、ＰＰＩＬ３、ＮＩＮ、ＲＡＰＧＥＦ２、成長ホルモン１、成長ホルモン２、ＭＮＡＴ１、Ｎａｖ１、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＵＧＴ１、ＬＡＩＲ１、ヒアルロナン媒介運動受容体、ＭＡＰ３Ｋ２、ＭＰＰ２、ＴＦＢ２Ｍ、ＣＲＢ３、ＭＰＰ５、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＤＬＧＡＰ２、ＩＮＨＢＡ、ＭＡＧＩ２、ＣＩＰ２９、ＳＥＴＤＢ１、チトクロームｂ５、ＴＲＰＶ２、インターロイキン１受容体、ＨＯＸＤ８、ＴＩＭＭ１０、ＡＴＸＮ２Ｌ、ＣＬＣＮ２、ＣＲＥＢ１、ＴＮＩＰ１、ＣＢＬＢ、第Ｖ因子、ＵＳＰ３３、ＳＯＮ、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＰＴＰＮ１２、ＡＤＣＹ８、ＭＹＬＫ、ＫＩＦ２３、ＲＥＸＯ２、ＢＳＴ１、ＴＯＰ３Ｂ、ＣＯＰＢ１、ＡＸＩＮ２、ＣＯＰＢ２、ＴＮＲＣ６Ｂ、グアニジノアセテートＮ－メチルトランスフェラーゼ、アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ９、Ｃ４ｏｒｆ２１、ＴＳＨＢ、ＦＲＳ３、ＥＰＢ４１、Ｃｙｃｌｉｎ＿Ｔ２、ＬＡＩＲ２、ヌクレオポリン４３、ＡＰＬＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１９、死関連タンパク質６、上皮細胞接着分子、ＣＬＥＣ７Ａ、ゲフィリン、ＣＬＤＮＤ１、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＣＤＨＡＣ２、骨形成タンパク質４、ＮＶＬ、ＲＢＭ３３、ＲＮＦ１３９、精子関連抗原５、ＰＬＣＢ１、グリア細胞株由来神経栄養因子、ＰＡＲＰ４、ＰＡＲＰ１、ＭＡＮ２Ａ１、骨形態形成タンパク質１、ＰＡＸ４、ＢＣＣＩＰ、ＭＭＰ７、デコイ受容体３、ＲＡＭＰ２、ＮＣＡＰＤ３、ＬＲＲＣ３７Ａ、ＲＷＤＤ３、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｃ、ＳＬＣ３Ａ１、ＭＲＰＳ２２、ＣＤＣ１４Ａ、ＩＴＳＮ１、ＰＯＬＥ２、ＭＹＣ誘発性核抗原、ＴＭＬＨＥ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＧＰＲ１７７、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＫＩＡＡ１３３３、ＲＰＰ３８、ＭＹＯ１Ｆ、ファルネソイドＸ受容体、カルデスモン、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＯＰＮ１ＭＷ、ＰＩＧＮ、ＡＲＮＴＬ２、ＢＣＡＳ３、Ｃ６ｏｒｆ５８、ＰＨＴＦ２、ＳＥＣ２３Ａ、ＮＵＦＩＰ２、ＯＡＺ１、オステオプロテゲリン、ＡＮＡＰＣ４、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＳＰＡＭ１、ＰＳＭＡ６、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＲＡＢＥＰ１、ＤＰＭ３、ＳＬＣ６Ａ１５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＡＲＨＧＡＰ２４、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＥＲＣＣ５、転写開始タンパク質ＳＰＴ３ホモログ、ＯＲ１Ｅ１、ＺＮＲＦ１、ＧＭＥＢ１、ＣＣＴ２＿ＧＮＡＱ、ムシン６、ムシン４、ＬＲＰ５、ＰＤＥ９Ａ、Ｃ２ｏｒｆ３、ＥＺＨ２、上皮成長因子受容体、ＴＭＴＣ２、ＰＤＥ４Ａ、ＥＰＨ受容体Ａ４、ＰＰＩＢ、ＤＥＮＮＤ４Ａ、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２、ヌクレオポリン８８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＣＯＧ８、ＲＢＭＳ１、ＭＡＰ７、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＡＥＢＰ２、ＤＣＬＲＥ１Ａ、ＲＰＬ２４、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２３、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＡＴＧ７、ＳＥＲＰＩＮＩ２、ＧＹＬＴＬ１Ｂ、ＡＴＰ５Ｇ２、ＤＩＰ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＣＥＰ６３、ＴＤＲＤ７、ＰＩＥＺＯ１、ＣＬＤＮ２０、ＧＲＸＣＲ１、ＰＭＥＬ、ＮＩＦ３Ｌ１、ＭＣＣ＿、ＰＣＮＸ、ＴＭＢＩＭ４、ＤＵＳＰ１２、ＺＭＹＮＤ８、ＧＯＳＲ１、インターフェロンガンマ受容体１、ＬＤＢ３、ＰＯＮ３、Ｃ１Ｄ、ＡＢＣＣ８、ＣＯＱ７、ＣＯＱ６、ＡＭＥＬＹ、ＨＡＶＣＲ１、ＰＩＣＡＬＭ、シェーグレン症候群抗原Ｂ、ＰＬＫ４、ＨＢＢ、ＡＫＴ１、ＰＣＤＨＧＢ７、Ｃ６ｏｒｆ１０、ＵＢＲ１、網膜芽細胞腫様タンパク質１、ＧＲＫ６、ＷＷＣ２、ＧＲＫ４、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＳＬＣ３４Ａ１、ＧＯＬＧＡ２、ＭＹＣＢＰ２、ＰＴＰ４Ａ２、ＮＵＣＢ２、ＭＡＧＯＨ、ＲＰＰ４０、アルファ－２Ａアドレナリン受容体、ＳＰＡＧ１１Ｂ、ヌクレオポリン２０５、ＣＯＧ１、運動性精子ドメイン含有３、ＫＣＮＭＢ３、運動性精子ドメイン含有１、ＫＬＨＬ７、ＫＣＮＮ２、ＴＳＰＡＮ８、ＧＰＲ２１、輸送体タンパク質、ＨＮＲＮＰＬＬ、ＡＢＨＤ５、ＣＡＢ３９Ｌ、アンフィレグリン、ＧＰＲ１、インターロイキン１８、ＥＩＦ４Ｇ３、インターロイキン１５、ＣＣＤＣ８０、ＣＤ２ＡＰ、ＮＦＳ１、ＧＲＢ２、ＵＬＢＰ２、血管内皮増殖因子Ｃ、ＲＰＳ３、ＴＬＲ８、ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１、ＲＨＯＴ１、コラーゲン、セントロメアプロテインＥ、ＳＴＭＮ２、ＨＥＳＸ１、ＲＰＬ７、カリリン、ＰＣＭＴ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＳＵＭＯ２、ＮＯＸ３、ＥＰ４００、ＤＮＭ３、ＥＥＤ、ＮＧＬＹ１、ＮＰＲＬ２、ＰＬＡＣ１、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質３、Ｃ７ｏｒｆ３１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＨＡＵＳ３、ＩＦＮＡ１０、ＭＹＳＴ４、ＤＣＨＳ１、ＳＩＲＴ４、ＥＦＥＭＰ１、ＡＲＰＣ２、ＭＥＤ３０、ＩＦＴ７４、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＤＹＮＣ１ＬＩ２、ＰＯＬＲ２Ｂ、ＰＯＬＲ２Ｈ、ＫＩＦ３Ａ、ＰＲＤＭ１６、ＰＬＳＣＲ５、ＰＥＸ５、副甲状腺ホルモン１受容体、ＣＤＣ２３、ＲＢＰＭＳ、ＭＡＳＴ１、ＮＲＤ１、ＢＡＴ５、ＢＡＴ２、Ｄｏｃｋ１１、ＧＣＳＨ、ＰＯＦ１Ｂ、ＵＳＰ１５、ＰＯＴ１、ＭＵＴＹＨ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＦＡＭ１２２Ｃ、Ａ１ポリペプ

チド、フラビン含有モノオキシゲナーゼ３、ＨＰＧＤ、ＬＧＡＬＳ１３、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、生存運動ニューロンドメイン含有１、ＰＳＭＡ３、ＭＲＰＳ３５、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、ＳＧＣＥ、ＲＥＰＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＰＡＢＰＣ１、ＭＡＰＫ８、ＰＤＣＤ５、ホスホグルコムターゼ３、ユビキチンＣ、ＧＡＢＰＢ２、ミトコンドリア翻訳放出因子１、ＰＦＤＮ４、ＮＵＢ１、ＳＬＣ１３Ａ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ガレクチン－３、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＧＣＡ、組織因子経路阻害因子、ＵＣＫＬ１、ＩＴＦＧ３、ＳＯＳ１、ＷＷＴＲ１、ＧＰＲ８４、ＨＳＰＡ１４、ＧＪＣ３、ＴＣＦ７Ｌ１、マトリックスメタロペプチダーゼ１２、ＩＳＧ２０、ＬＩＬＲＡ３、血清アルブミン、ホスデューシン様、ＲＰＳ１３、ＵＴＰ６、ＨＰ１ＢＰ３、ＩＬ１２Ａ、ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ２、ＬＡＴＳ１、ＢＭＦ＿、サイモシンベータ－４、Ｂ細胞リンカー、ＢＣＬ２Ｌ１１、凝固因子ＸＩＩＩ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＰＲＰＦ１９、ＳＦＲＳ５、インターロイキン２３サブユニットアルファ、ＮＲＡＰ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１４、Ｃ９ｏｒｆ６４、テスチン、ＶＰＳ１３Ａ、ＤＧＫＤ、ＰＴＰＲＢ、ＡＴＰ５Ｃ１、ＫＣＮＪ１６、ＫＡＲＳ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＭＢＮ、ＵＳＰ１３、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＴＲＯ＿、ＲＴＦ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ２、ＳＳＢＰ１、ＳＮＲＰＮ上流リーディングフレームタンパク質、ＲＰＳ２９、ＳＮＲＰＧ、ＡＢＣＣ１０、ＰＴＰＲＵ、ＡＰＰＬ１、ＴＩＮＦ２、ＴＭＥＭ２２、ＵＮＣ４５Ａ、ＲＰＬ３０、ＰＣＤＨ７、ガラクトサミン－６スルファターゼ、ＵＰＦ３Ａ、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＩＬ３ＲＡ、ＳＤＨＢ、カテプシンＬ２、ＴＡＳ２Ｒ７、カテプシンＬ１、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、ＲＰＮ２、ＤＹＮＬＬ１、ＫＬＫ１３、ＮＤＵＦＢ３、ＰＲＰＦ８、ＳＰＩＮＴ２、ＡＨＳＡ１、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＤＲＡＰ１、ＲＮＡＳＥ１、オルファクトメジン様２ｂ、ＶＲＫ１、ＩＫＫ２、ＥＲＧＩＣ２、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＭＫ２Ｂ、エストロゲン受容体ベータ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＲＰＬ１９、ＮＵＣＢ２、ＫＣＴＤ１３、ユビキノン、Ｈ２ＡＦＹ、ＣＥＰ２９０、ＰＡＢＰＣ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＤＨＸ３８、ＫＩＡＡ０９２２、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＤＤＸ５９、ＭＩＢ２＿、ＺＢＰ１、Ｃ１６ｏｒｆ８４、ＵＡＣＡ、Ｃ６ｏｒｆ１４２、ＭＲＰＬ３９、サイクリン依存性キナーゼ７、遠位上流エレメント結合タンパク質１、ＳＧＯＬ１、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＡＴＧ１０、デルムシジン、ＥＰＳ８Ｌ２、デコリン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＤＣ２０、ＭＹＢ、ＷＮＴ５Ａ、ＲＢＰＪ、ＤＥＦＢ１０３Ａ、ＲＰＳ１５Ａ、ＡＴＰ５Ｈ、ＲＰＳ３、ＦＡＢＰ１、ＳＬＣ４Ａ８、血清アミロイドＰ構成要素、ＡＬＡＳ１、ＭＡＰＫ１、ＰＤＣＤ５、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＣＨＲＮＡ３、ＡＴＸＮ１０、ＭＮＡＴ１、ＡＬＧ１３、アタキシン３、ＬＲＲＣ３９、ＡＤＨ７、デルタ－サルコグリカン、ＴＡＣＣ１、ＩＦＮＡ４、胸腺間質リンホポエチン、ＬＧＴＮ、ＫＩＡＡ１３３３、ＭＳＨ６、ＭＹＯＴ、ＲＩＰＫ５、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＲＰＬ２７、Ｒｎｄ１、血小板因子４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＬＳＭ８、ＣＥＰ６３、ＩＮＴＳ８、ＣＴＮＳ、ＡＳＡＨＬ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＨＥＸＢ、ＳＬＣ１６Ａ５、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＦＲＭＤ６、の３’ＵＴＲに見出される。

[00088]さらなるＲＤＥが、長い非コードＲＮＡの３’－ＵＴＲ、またはｍｉＲＮＡをコードする一次転写物に見出される。例えば、ＴＨＲＩＬ（ｌｉｎｃ１９９２）、ＮＩＫＩＬＡｌｎｃＲＮＡ、ＳｅＴｌｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓｕｃ．１９７、ＲＰ１１－１７２Ｅ９．２、ＬＩＮＣ００５９８、ｌｎｃＲＮＡｓＬＯＣ１００１２８０９８、ＲＰ１１－１５００１２．３の３’－ＵＴＲ、ならびにｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－ｌｅｔ７ｅ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２５ｂ、およびｍｉＲ－１６をコードする一次転写物、からのＲＤＥ。

[00089]ＲＤＥのクラスは、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などの解糖系酵素によって結合されるものを含む。ＲＤＥのこのグループは、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）を含む。

[00090]当該ＲＤＥは、例えば、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｂｅｔａｌ－ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２、またはＮＯＳＨＡＮＯＳをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩＡＵリッチエレメントであり得る。当該ＲＤＥは、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ＣＯＸ－２、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ｂｃｌ－２、インターフェロン－ベータ、またはＶＥＧ－Ｆなどをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩＩＡＵリッチエレメントでもあり得る。当該ＲＤＥは、例えば、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ｈｓｐ７０、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３などをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩＩＩＡＵリッチエレメントであり得る。他のＲＤＥは、Ｔ細胞性受容体サブユニット（α、β、γ、またはδ鎖）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、ならびに他のチェックポイント阻害剤の３’－ＵＴＲから得られ得る。さらなる他のＲＤＥが、Ｃｏｐｐｅら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．５：９９－１１８（２０１０）において開示される老化関連分泌表現型遺伝子の３’－ＵＴＲから得られ得、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（例えば、表１を参照されたい）。

[00091]ＲＤＥは、ある特定のポリペプチド、例えば、ＡＲＥポリ（Ｕ）結合／分解因子（ＡＵＦ－１）、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）、ヒト抗原関連タンパク質（ＨｕＲ）、ブチラート応答因子１（ＢＲＦ－１）、ブチラート応答因子２（ＢＲＦ－２）、Ｔ細胞制限細胞内抗原－１（ＴＩＡ－１）、ＴＩＡ－１関連タンパク質（ＴＩＡＲ）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ－１）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質２（ＣＵＧＢＰ－２）、ヒトニューロン特異的ＲＮＡ結合タンパク質（Ｈｅｌ－Ｎ１、Ｈｅｌ－Ｎ２）、ＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＡ、ＨｕＢ、およびＨｕＣ、ＫＨタイプスプライシング調節タンパク質（ＫＳＲＰ）、３－メチルグルタコニル－ＣｏＡヒドラターゼ（ＡＵＨ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒートショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）、ヒートショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ２（ｈｎＲＮＰＡ２）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ３（ｈｎＲＮＰＡ３）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ（ｈｎＲＮＰＣ）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｌ（ｈｎＲＮＰＬ）、Ｂｃｌ－２ＡＵリッチエレメントＲＮＡ結合タンパク質（ＴＩＮＯ）、ポリ（Ａ）結合タンパク質相互作用タンパク質２（ＰＡＩＰ２）、ＩＲＰ１、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、およびアルドラーゼなどによって結合され得る。ＲＤＥ結合タンパク質は、解糖または炭水化物代謝に関与する酵素、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＰＭ１）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ－２）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などでもあり得る。ＲＤＥ結合タンパク質は、ペントースリン酸経路に関与する酵素、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）などであり得る。さらなる例示的ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓｔｅｌｌｏら，Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ６３：６９６－７１０（２０１６）；Ｋｏｖａｒｉｋら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ８９：２１～２６（２０１７）；Ｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ４９９：１７２～１７７（２０１３）；Ｃａｓｔｅｌｌｏら，Ｃｅｌｌ１４９：１３９３～１４０６（２０１２）；Ｖｌａｓｏｖａら，Ｍｏｌｃ．Ｃｅｌｌ．２９：２６３～２７０（２００８）；Ｂａｒｒｅａｕら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．ｖｏｌ３３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２（２００６）；Ｍｅｉｓｎｅｒら，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ５：１４３２～１４４７（２００４）；Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら，Ｇｅｎｅ２６５：１１～２３（２００１）に記載されるものであり、なお、これら全ての文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[00092]ＲＤＥ結合タンパク質は、例えば、ＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（配列番号１２）およびＡＵＵＵＡ（配列番号１）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合することができるＴＴＰ、あるいは、ＡＵリッチＲＤＥに結合するＫＳＲＰ、あるいは、例えば、ＵＵＧＡ（配列番号１３）、ＡＧＵＵＵ（配列番号１１）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号５）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＡｕｆ１、あるいは、例えば、ＵＵＧＵＵ（配列番号３）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＣＥＬＦ－１、あるいは、例えば、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号８）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号９）、またはＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＨｕＲ、あるいは、例えば、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号１４）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＥＳＲＰ１またはＥＳＲＰ２、あるいは、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号６）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＥＬＡＶ、であり得る。当該ＲＤＥ結合タンパク質は、解糖に関与する酵素、例えば、ＡＵＵＵＡ（配列番号１）エレメントのうちの１つまたは複数などのＡＵリッチエレメントに結合するＧＡＰＤＨ、あるいは、例えば、ＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号１５）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＥＮＯ３／ＥＮＯ１、あるいは、例えば、ＡＵＵＧＡ（配列番号１６）のうちの１つまたは複数などのＲＤＥに結合するＡＬＤＯＡ、であり得る。

[00093]ある態様において、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスと組み合わせることによって、ＲＤＥリガンドによる調節を誘導可能にすることができる。例えば、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結させることができ、その場合、当該ＲＮＡ制御デバイスによるリガンド結合は、ＲＤＥを阻害する調節エレメント（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ）を活性化する（例えば、リボザイムは、ＲＤＥ結合タンパク質がもはや結合しないように、ＲＤＥを切断し、またはリボスイッチは、二次構造を変更する）。これは、ＲＤＥおよびＲＮＡ制御デバイスによる転写を、ＲＤＥからの２種類の制御下に置き、すなわち、第１に、ＲＤＥは、細胞内の状態によって支配されるように、ＲＤＥ結合タンパク質の結合に対する転写対象を調節することができ、第２に、当該ＲＤＥ制御は、リガンドによってＲＮＡ制御デバイスを誘導することによって、除去することができる。リガンドが加えられると、当該ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥを結合のために利用できなくさせ、ＲＤＥの調節は除去される。リガンドが除去されると、転写される転写物は、ＲＤＥの制御下になり得る（ＲＮＡ制御デバイスは活性化されないので）。あるいは、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結することができ、この場合、リガンド結合は、調節エレメント（例えば、リボザイム）を無効にする。この例において、リガンドの存在は、ＲＮＡ制御デバイスを阻害し、転写物は、ＲＤＥによって調節することができる。リガンドが除去されると、当該ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥを、ＲＤＥ結合タンパク質への結合に対して利用できなくさせ、転写物のＲＤＥ調節は除去される。ＲＮＡ制御デバイスは、当該ＲＤＥに結合することによりＲＤＥタンパク質がＲＤＥに結合するのを阻害する構造（例えば、ヘリックス）を形成するポリヌクレオチドを切断することもできた。この例において、ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥに結合しないかまたはＲＤＥへの結合に対して阻害される抑制性ポリヌクレオチドを切断することができる。ＲＮＡ制御デバイスによるこの切断は、リガンド結合によって刺激することができるか、またはリガンド結合によって阻害することができる。

[00094]異なるＲＤＥは、異なる動態パラメーター、例えば、異なる安定発現レベル、異なるＴｍａｘ（最大発現レベルまでの時間）、異なるＣｍａｘ（最大発現レベル）、異なるダイナミックレンジ（発現／基底発現）、異なるＡＵＣ、誘導の異なる動態（発現率の促進および発現率の速度）、発現量、ベースライン発現、最大ダイナミックレンジ（ＤＲｍａｘ）、ＤＲｍａｘまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）などを有する。加えて、ＲＤＥのこれらの動態特性は、同じＲＤＥのコンカテマーを作製すること、または異なるＲＤＥを調節ユニットへと組み合わせることによって変更することができる。作動可能に連結されたＲＮＡ制御デバイスの制御下にＲＤＥを置くことは、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、またはＲＤＥ組み合わせの動態特性も変えることができる。さらに、ＲＤＥの結合に対するＲＤＥ結合タンパク質の有用性に影響を及ぼす小分子または他の分子は、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせの動的応答も変更することができる。ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせの動的応答は、転写物において競合性ＲＤＥを発現する構築物を使用して変更することができる。１つまたは複数の競合するＲＤＥを伴うそのような転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質に対して競合することができ、そのため、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせよって所望の遺伝子の調節を変更する。これらの競合性ＲＤＥ転写物は、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせへの結合のために利用することができるＲＤＥ結合タンパク質の量を減少させるＲＤＥ結合タンパク質に結合することができる。したがって、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組み合わせは、導入遺伝子の発現に対して所望の動的応答を提供するために、選択することができ、および／または他の条件（上記において説明される）と組み合わせることができる。

[00095]実施例２０の表２は、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）が発現の異なる動態を提供したことを示している。例えば、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時点において最大誘導（誘導倍率としても知られる最大ダイナミックレンジ）に達した。ＲＤＥＡＵ２、およびＡＵ１０１は、１日目に最大ダイナミックレンジ（ＤＲｍａｘ）に達し、次いで、当該ダイナミックレンジは減少し、基底発現と比較して減少した発現を示した。ＲＤＥＡＵ５、およびＡＵ２１は、３／４日目にＤＲｍａｘを有し、この発現は、８日目まで維持された。ＲＤＥＡＵ３、ＡＵ７、ＡＵ１０、ＡＵ２０、およびＡＵ２３は、６日目にＤＲｍａｘを有し、発現は、８日目に減少した。ＲＤＥＡＵ１９、およびＡＵ２２は、８日目にＤＲｍａｘを有した。当該ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、ＡＵ７からＡＵ１０の発現と比較して約５５００倍の範囲に及ぶ発現量の違いも有した（表１を参照されたい）。したがって、当該ＲＤＥ（ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現率を提供するように、ならびに所望の時点で所望の量のポリペプチドを提供するように、選択することができる。

[00096]いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへ結合した後にＲＮＡ分解率を増加させる。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥに結合した後にＲＮＡの分解率を減少させる。２つ以上のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥに結合することができる。いくつかのＲＤＥ調節ユニットにおいて、２つ以上のＲＮＡ結合タンパク質が、２つ以上のＲＤＥに結合する。１つまたは複数のＲＤＥへの１つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解率を増加させることができる。１つまたは複数のＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解率を減少させることができる。分解を増加させるＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへの結合に対して、分解を減少させるＲＮＡ結合タンパク質と競合し得、それにより、当該ＲＮＡの安定性は、当該２つのＲＮＡ結合タンパク質の相対的結合に依存する。他のタンパク質も、当該ＲＤＥ結合タンパク質に結合することができ、ＲＤＥによって当該ＲＮＡに対する当該ＲＮＡ結合タンパク質の効果を調整する。当該ＲＮＡ結合タンパク質へのタンパク質の結合は、ＲＮＡ安定性を増加または減少させることができる。ＲＮＡは、タンパク質ＨｕＲおよびＴＴＰによって結合された複数のＲＤＥを有することができる。当該ＨｕＲタンパク質は、当該ＲＮＡを安定化することができ、ならびに当該ＴＴＰタンパク質は、当該ＲＮＡを不安定化することができる。ＲＮＡは、タンパク質ＫＳＲＰ、ＴＴＰおよび／またはＨｕＲと相互作用する少なくとも１つのＲＤＥを有することができる。ＫＳＲＰは、当該ＲＮＡを不安定化することができ、ならびに結合に対して、ＲＮＡを安定化することができるＨｕＲタンパク質と競合することができる。当該ＫＳＲＰタンパク質は、当該ＲＤＥに結合することができ、当該ＲＮＡを不安定化し、当該ＴＴＰタンパク質は、ＫＳＲＰに結合することができ、当該ＲＮＡの分解を防ぐことができる。異なるタンパク質が、同じ転写物に結合する場合があり、それらは、分解率および安定化率に対して競合効果を有し得る。異なるタンパク質が、同じ転写物に結合する場合があり、それらは、分解率および安定化率に対して協調効果を有し得る。異なるタンパク質が、異なるタイミングで同じ転写物に結合する場合があり、それにより、分解および安定化に対して異なる効果を付与し得る。

[00097]ＲＤＥは、クラスＩＩＡＵリッチエレメントであり得、ならびに当該ＲＮＡ結合タンパク質は、ＧＡＰＤＨであり得る。ＧＡＰＤＨによって結合されたクラスＩＩＡＵリッチエレメントは、ＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ（配列番号２）であり得る。当該クラスＩＩＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、ＣＡＲ、ＳｍａｒｔＣＡＲ（ＲＮＡ制御デバイス－ＣＡＲ）、ＤＥ－ＣＡＲ（不安定化エレメント－ＣＡＲ）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を制御するために使用することができる。当該クラスＩＩＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、Ｔリンパ球における導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するためにも使用することができる。当該クラスＩＩＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球における導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用することができる。当該クラスＩＩＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球における導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用することができる。当該クラスＩＩＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ナチュラルキラー細胞における導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用することができる。

[00098]当該ＲＤＥは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有し得る。当該ＲＤＥは、これらのｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の１つまたは複数を除去するように操作することができる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の除去は、ＲＤＥによって構築物からの発現を少なくとも５、１０、１５、２０、５０、または１００倍増加させることができる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位を有するＲＤＥは、ＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥであり得る。ＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥからのｍｉｃｒｏＲＮＡ部位の除去は、ＧＡＰＤＨ感応性ＲＤＥによって構築物の発現を少なくとも５～１０倍増加させることができる。ＲＤＥによるこのＧＡＰＤＨ制御は、ペイロードを標的部位に送達するために使用することができる。ＧＡＰＤＨ制御は、標的部位において優先的に見出される抗原を認識するＣＡＲによる真核細胞の活性化に結び付けることができる。

[00099]ＲＤＥは、ＩＬ－２またはＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲであり得、ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡ部位の除去は、ＲＤＥによって導入遺伝子ＲＮＡからの発現率および／または発現のダイナミックレンジを増加させることができる。ＲＤＥは、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲであり得、ならびに除去されたｍｉｃｒｏＲＮＡ部位は、欠失が発現の動態を増加させ発現のダイナミックレンジを約５０倍に増加させる、ＭＩＲ－１８６部位であり得る。ＲＤＥは、ＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲであり得、ならびに除去されたｍｉｃｒｏＲＮＡ部位は、ＭＩＲ－１２５部位であり得る。

[000100]ＲＤＥによる発現のダイナミックレンジ（制御）は、ＲＤＥによって制御される導入遺伝子のコドンを最適化することによって、増加させることができる。導入遺伝子の当該コドンの不安定位置のＧＣ含有量を増加させることにより、翻訳の効率を、１～２ｌｏｇ（１０～１００倍）増加させることができる。翻訳の効率の増加は、ＲＤＥによる「オン」状態での発現の量が増加されることを意味する。「オフ」状態の発現率が、全く変更されないかまたはわずかに変更される場合、ＲＤＥによる制御のダイナミックレンジ全体が増加される。

[000101]新しいＲＤＥは、分子育種および／またはＲＤＥを有することが知られている遺伝子の３’－ＵＴＲへの指向性進化などの技術を適用することにより、既知のＲＤＥの一部を組み合わせ的に混合してマッチングすることによって作製された合成ライブラリーから得ることができる。例えば、異なるＲＤＥを伴う複数の３’－ＵＴＲは、断片化され、合成３’－ＵＴＲへと組み立てられ、次いで、それらは、ＲＤＥ活性に対してスクリーニングされるかまたは選択される。所望の特性を有するＲＤＥは、ポジティブおよび／またはネガティブ選択を使用してそのようなライブラリーから発見することができる。

選択的スプライシング
[000102]選択的スプライシングは、細胞の代謝状態における変化を、所望のポリヌクレオチドをコードしそれへと翻訳されるｍＲＮＡへのｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物のスプライシングにリンクさせることができる。例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物は、細胞の代謝状態の変化の後に、当該細胞においてペイロードを作製するために選択的スプライシングを受けることができる。当該ｐｒｅ－ｍＲＮＡ転写物は、選択的スプライシングの前に、ナンセンスポリペプチドをコードする転写物へと、または異なるポリペプチド産物をコードするｍＲＮＡへとスプライシングすることができる。

[000103]ｈｎＲＮＰＬＬ（ヘテロ核リボ核タンパク質Ｌ様）は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が活性化されるとき（代謝状態の変化）に作製されるＲＮＡ結合性ポリペプチドである。ｈｎＲＮＰＬＬは、Ｔ細胞およびＢ細胞などのリンパ球における活性化誘導選択的スプライシングのマスター調節因子である。Ｔ細胞において、ｈｎＲＮＰＬＬは、ＣＤ４５を含む様々な転写物のスプライシング、Ｔ細胞発達に必須のチロシンホスファターゼ、および活性化を達成する。

[000104]ｈｎＲＮＰＬＬは、ＣＡリピートに結合し、さらにＣリッチモチーフ、Ａリッチモチーフ、およびＴリッチモチーフ、例えば、ＣＡＣＡＣＡ（ＣＡ）ｎ、ＣＴＴＣＣｔ／ｃ、ＣＡＴｔ／ａ、ＣＡＴＴ、およびＴＴＴＡｔ／ａＡなどにも結合する。ｈｎＲＮＰＬＬ結合性部位が、転写物の３’－ＵＴＲにある場合、当該部位へのｈｎＲＮＰＬＬの結合は、当該転写物を安定化させることができる。ｈｎＲＮＰＬＬ結合性部位が、エクソンの５’末端の約１キロベース以内にある場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、スプライシングの際にエクソンの封入を促進する。ｈｎＲＮＰＬＬ結合性部位が、エクソンの３’側の約１キロベース以内にある場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、エクソンの除外を促進する。ｈｎＲＮＰＬＬが転写物に結合する場合、それは、当該転写物のスプライシングパターンを変更することができ、結果として、新たなｍＲＭＡ転写物および新たな非コード切除産物（切除されたイントロンあるいはイントロンおよびエクソン）を生じる。この選択的スプライシングパターンは、所望のポリペプチド（例えば、ペイロード）をコードする、選択的スプライシングされたｍＲＮＡを生じることができ、および／または当該新たな非コード切除産物は、選択的スプライシングの際に唯一産生されるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードすることができる。

[000105]ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、単独において、またはＲＤＥなどの他の調節シグナルと組み合わせて使用することができる。ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングとＲＤＥの併用は、それが、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または当該細胞において発現される他の受容体に結合するリガンドを有する標的部位に達する場合、細胞の活性化の際のペイロードの発現を制御することができる（代謝状態の変化）。当該受容体（例えば、ＣＡＴまたはＴＣＲ）へのリガンドの結合は、細胞を活性化し、ＲＤＥメカニズムによってペイロードの発現を増加させ、ならびにｈｎＲＮＰＬＬ発現に続いて選択的スプライシングを生じさせる。ＲＤＥ制御と選択的スプライシングの併用は、所望の量のペイロードまたは他の導入遺伝子を生じる。

[000106]ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、細胞が静止状態である間に発現される遺伝子を無効にするためにも使用することができる。静止状態の細胞が、受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）へのリガンドの結合によって活性化される場合、これは、細胞の代謝状態を変更し、ならびにｈｎＲＮＰＬＬが発現される。細胞が静止状態の間に発現される遺伝子が、ｈｎＲＮＰＬＬ結合性部位を有する場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、ｍＲＮＡがもはや当該遺伝子産物をコードしないように、転写物のスプライシングを変更することができる。例えば、細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）は、細胞が静止状態の間にステムネス因子（ｓｔｅｍｎｅｓｓｆａｃｔｏｒ）（例えば、Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７）を発現するように操作することができる。Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７をコードする核酸は、ｈｎＲＮＰＬＬ結合性部位を伴うイントロンを含むことができ、それにより、ｈｎＲＮＰＬＬの不在下において、転写物は、Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７ポリペプチドを作製するためにスプライシングされるが、細胞活性化およびｈｎＲＮＰＬＬの発現に対してはそうではなく、これらの転写物は、選択的スプライシングを受け、もはやＴｏｘおよび／またはＴＣＦ７をコードする転写物を産生しない。

[000107]ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、新たな「イントロン」または非コード切除産物ならびに新たなｍＲＮＡも生成する。新たなイントロンは、新たなイントロンにおいてのみ発現される活性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）をコードすることができる。これは、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが、細胞のエフェクター状態に有害な活性化された細胞の遺伝子、例えば、Ｔｏｘ、ＳＣＦ７、および他の消耗因子などを無効にすることができるような、さらなる別のレベルの制御をｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングに加える。この方法で制御することができるｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ１５５、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、およびｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０）が挙げられる。

キメラ抗原受容体
[000108]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合性／認識エレメントと、受容体を細胞膜にアンカー固定する膜貫通エレメントと、少なくとも１つの細胞内成分とを含む融合タンパク質であり得る。これらのＣＡＲエレメントは、例えば、米国特許出願公開第２０１４０２４２７０１号に記載されるように、当技術分野において既知であり、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当該ＣＡＲは、少なくとも細胞外の抗原結合性エレメントと、膜貫通エレメントと、刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントとを含む構築物から発現される組換えポリペプチドであり得る。当該刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するζ鎖であり得る。当該細胞質シグナル伝達エレメントは、さらに、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達エレメントを含み得る。共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択することができる。当該ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメントと、膜貫通エレメントと、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントとを含むキメラ融合タンパク質であり得る。当該ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメントと、膜貫通エレメントと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントとを含むキメラ融合タンパク質を含み得る。当該ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメントと、膜貫通エレメントと、１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントとを含むキメラ融合タンパク質であり得る。当該ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメントと、膜貫通エレメントと、１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントとを含むキメラ融合タンパク質を含み得る。当該ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）における必要に応じたリーダー配列を含み得る。当該ＣＡＲはさらに、細胞外抗原認識エレメントのＮ末端におけるリーダー配列を含み得、この場合、当該リーダー配列は、必要に応じて、プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の際に抗原認識エレメント（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。

キメラ抗原受容体－細胞外エレメント
[000109]ＣＡＲの作製において有用な例示的細胞外エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、なお、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[000110]細胞外エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されるように、疾患に対して免疫されている対象の免疫細胞から得られた抗体のレパートリーから得ることができ、なお、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[000111]細胞外エレメントは、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号、米国特許第５，３５９，０４６号、同第５，６８６，２８１号、および同第６，１０３，５２１号に記載されるような、リガンド結合および／またはシグナル変換に関連する様々な細胞外エレメントまたは分泌されたタンパク質のいずれかから得られ得、なお、これら全ての文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[000112]当該細胞外エレメントは、様々な足場タンパク質ファミリーからも得ることができ、それらは、結合特異性を付与することができるタンパク質ループを伴うタンパク質足場コアの共通の特徴を共有し、ループを変更することにより、異なる結合特異性を提供することができる。ノッチンは、そのような足場タンパク質の１つであり、異なる結合特異性を生じるように操作することができるペプチドループを有する。例えば、ノッチンは、特定のインテグリンペプチドに対して高い親和性を有するように操作することができる。例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８５：１０６４～７５（２００９）およびＫｉｍｕｒａら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７７：３５９～６９（２００９）を参照されたく、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかのがんは、ある特定のインテグリンペプチドを過剰発現し、そのようながんは、当該過剰発現されたインテグリンに対して特異的なノッチンである細胞外エレメントを有するＣＡＲによって標的にされ得る。そのようなインテグリンの１つは、複数の固形腫瘍、例えば、結腸、肺、乳房、頚、卵巣／卵管、膵臓、および頭頸部に由来するものなどにおいて上方調節されるインテグリンαｖβ６である。例えば、Ｗｈｉｌｄｉｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．４４：３４９～３５５（２０１６）を参照されたく、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

[000113]細胞外エレメントは、素晴らしいタンパク質分解耐性および熱安定性を付与するジスルフィド結合コアを有するペプチドのファミリーであるノッチンから得ることもできる。プロテアーゼ阻害剤、抗菌抗生物質、および毒素として天然に機能するノッチンは、ファミリーメンバーのうち、様々な配列を有するいくつかのループで構成される。ノッチンは、新たな結合特異性を増加させならびに作り出すために当該ループの配列のさらなる多様性を含むように操作することができる。操作されたノッチンは、所望の特異性を有する所望の標的（例えば、所望の抗原）に結合するように作製することができる。いくつかのノッチンは、ｎＭ特異性においてインテグリンに結合し、ＣＡＲに対してある特定のインテグリン（例えば、αｖβ３／αｖβ５、αｖβ３／αｖβ５／α５β１、またはαｖβ６インテグリン）を標的にするために使用することができる。αｖβ６などのインテグリンは、固形腫瘍において上方調節され得、そのため、ＣＡＲにとって好適な標的となり得る。そのようなαｖβ６特異的ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外エレメントとしてのαｖβ６インテグリンに対して特異的なノッチンを使用して作製することができる。αｖβ６ノッチン－ＣＡＲによる操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化は、ＣＡＲ細胞活性化においてペイロードの発現を生じさせるＲＤＥの制御下においてペイロードを固形腫瘍に送達するために使用することができる。

[000114]ある態様において、当該細胞外ドメインは、ＡＮＬおよびＭＤＳ芽球において広く見出されるオンコ－シアリル化ＣＤ４３に対して特異的に結合する抗体または他の結合性分子であり得る。Ｈａｚｅｎｂｅｒｇら，ＥｕｒｏｐｅａｎＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅａｂｓｔｒａｃｔｓ，ＡｂｓｔＳ５１１（２０１６）を参照されたく、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体ＡＴ１４－０１３は、正常細胞および組織に関連するＣＤ４３にエピトープが見出されないオンコ－シアリル化ＣＤ４３上の特定のシアリル化エピトープに結合する。ＷＯ２０１６／２０９０７９およびＷＯ２０１５／０９３９４９を参照されたく、なお、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この抗体または、オンコ－シアリル化ＣＤ４３結合に対してＡＴ１４－０１３と競合する他の結合性分子は、抗オンコシアリル化ＣＤ４３ＣＡＲを作るのに使用される。例えば、ＡＴ１４－０１３の重鎖および軽鎖の可変領域を取り、ＣＡＲの細胞外ドメインとしての使用のための単鎖抗体として再形式化することができる。ＣＡＲ上のそのような細胞外ドメインは、当該ＣＡＲ細胞による細胞致死または改変のために、当該ＣＡＲ細胞（例えば、抗オンコシアリル化ＣＤ４３ＣＡＲＴリンパ球）を、それらを標的にするＡＭＬおよび／またはＭＤＳ細胞に向かわせる。

[000115]ＣＡＲの標的となり得る他の腫瘍関連抗原としては、例えば、ｃ－Ｍｅｔ（例えば、ＮＳＣＬＣ）、ｇｐＮＭＢ（例えば、黒色腫、乳がん、他の固形腫瘍）、ＴＲＡＰ－２（例えば、上皮性腫瘍および他の固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ５（例えば、結直腸がん）、ＣＤ５６（例えば、ＳＣＬＣ）、ＣＤ２５（例えば、血液がん）、グアニルシクラーゼＣ（例えば、膵がん）、ＣＡＧ（例えば、固形腫瘍）、ＬＩＶ－１（例えば、乳がん）、ＰＴＫ７（例えば、肺がん、結直腸がん、乳がん、および卵巣がん）、ＬＡＭＰ－１（例えば、結直腸がん、黒色腫、喉頭がん）、Ｐ－カドヘリン３（例えば、上皮性腫瘍）、ＨＥＲ－３（例えば、乳がん）、ＣＤ１３３（例えば、肝細胞がん、膵がん、結直腸がん、胆管がん）、ＢＣＭＡ（例えば、多発性骨髄腫）、ＣＤ１３８（例えば、多発性骨髄腫）、Ｉｇκ軽鎖（例えば、白血病、リンパ腫、ＮＨＬ、および多発性骨髄腫）、ＣＤ３０（例えば、ＮＨＬ、ＨＤ）、ＩＬ１３Ｒａ２（例えば、グリア芽腫）、およびＮＫＧ２Ｄのためのリガンド（例えば、ＡＭＬ、ＭＤＳ、およびＭＭに対する結合性ドメインとしてＮＫＧ２Ｄ受容体を使用する）が挙げられる。

[000116]ＣＡＲの標的となり得る他の腫瘍関連抗原としては、例えば、メソテリン、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、Ｈｅｒ－２、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＡＭ、ルイス－Ｙ抗原、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＯＬＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＥＰＨＡ２、ＰＤ－１、Ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＴＳＨＲ、ＣＤ７０、ＥＲＢＢ、ＡＸＬ、死受容体５、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＳＨＲ、ＲＯＲ２、ＣＤ１４７、κＩＧＧ、ＩＬ－１３、ＭＵＣ１６、ＩＬ－１３Ｒ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＤＬＬ３、ＦＡＰ、ＬＭＰ１、ＴＳＨＲ、ＢＣＭＡ、ＮＥＣＴＩＮ－４、ＭＧ７、ＡＦＰ（α－フェトタンパク）、ＧＰ１００、Ｂ７－Ｈ３、ネクチン－４、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＡＡ、ＧＰ１００、チログロブリン、ＥＢＶ、ＨＰＶＥ６、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＷＴ１、ＧＲＡＳＧ１２Ｖ、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＨＰＶ－Ｅ７、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＩＧＧＦＣ、ＭＵＣ１、ルイス－Ｙ抗原、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２Ｄ、κ軽鎖、ＣＤ３４、ＣＬＬ－１、ＴＳＬＰ、ＣＤ１０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＥＢＶ、ＣＤ５、ＧＰＣ３、ＣＤ５６、インテグリンＢ７、ＣＤ７０、ＭＵＣＬ、ＣＫＩＴ、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＢＣ１、ＴＡＣ１、ＣＤ５６、およびＣＤ４が挙げられる。

[000117]ＣＡＲの標的となり得るさらなる他の腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８３、ＣＤ１１７、ＣＤ１７２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＤＲ５、ＨＥＲ２、ＣＳ１、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ３４Ａ１、ｓｌｃ４５Ａ３、ＳＬＣ４６Ａ２、Ｆｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ１、ＣＬＤ１８、ＮＡＮＯＧ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＴＳＰＡＮ１６、ＧＬＲＢ、ＤＹＲＫ４、ＳＶ２Ｃ、ＳＩＧＬＥＣ８、ＲＢＭＸＬ３、ＨＩＳＴ１ＨＩＴ、ＣＣＲ８、ＣＣＮＢ３、ＡＬＰＰＬ２、ＺＰ２、ＯＴＵＢ２、ＬＩＬＲＡ４、ＧＲＭ２、ＰＧＧ１、ＮＢＩＦ３、ＧＹＰＡ、ＡＬＰＰ、ＳＰＡＴＡ１９、ＦＣＲＬＩ、ＦＣＲＬＡ、ＣＡＣＮＧ３、ＵＰＫ３Ｂ、１２ＵＭＯ４、ＭＵＣ１２、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＢＰＩ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＨＭＭＲ、ＵＰＫ１Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＨＥＲＣ５、Ｃ３ＡＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＮＧＢ、ＣＥＬＳＲ３、ＣＤ３Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＴＮＦＲＳＦＢＣ、ＭＳ４ＡＢ、Ｓ１ＰＲ５、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＮ３Ａ、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＢ１、ＡＮＯ１、ＫＣＮＤ２、ＨＴＲ４、ＣＡＣＮＢ４、ＨＴＲ４、ＣＮＲ２、２６ＬＲＢ、ＥＸＯＣ１、ＥＮＴＰＰ１、ＩＣＡＭ３、ＡＢＣＧＢ、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＰＮ、ＣＤ６８、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＴＲ、ＣＹＹＲ１、ＣＬＣＮ２ＳＬＡＲＡ３、およびＪＡＧ３が挙げられる。

細胞内エレメント
[000118]細胞内エレメントは、ＳｍａｒｔＣＡＲ（ＲＮＡ制御デバイス－ＣＡＲ）、ＤＥ－ＣＡＲ（不安定化エレメント－ＣＡＲ）、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ａｎｄ／ｏｒＳｉｄｅ－ＣＡＲ（一括して「ＣＡＲＳ」）の細胞外エレメントが抗原に結合する（と相互作用する）ときに、細胞内にシグナルを伝達することができる分子であり得る。細胞内シグナル伝達エレメントは、概して、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担うことができる。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊機能を意味する。Ｔ細胞のエフェクター機能は、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達エレメント」は、特殊機能を実行するために、エフェクター機能シグナルを変換して細胞に送るタンパク質の一部分を意味する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、細胞内エレメントまたは細胞内シグナル伝達エレメントは、必ずしもドメイン全体からなる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた一部分が使用される場合、そのようなトランケートされた一部分は、それがエフェクター機能のシグナルを変換する限り使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達エレメントなる用語は、エフェクター機能シグナルを変換するのに十分な、当該細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた一部分を包含することも意味される。本発明のＳｍａｒｔＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達エレメントの例としては、シグナル伝達とその後の抗原受容体連結を開始するために協力して機能するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびに、これらの配列の任意の誘導体または変異体、および同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。

[000119]細胞内エレメントならびに細胞内エレメントと共にまたは細胞内エレメントとして有用なポリペプチドの組み合わせは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、なお、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
膜貫通エレメントおよびスペーサーエレメント
[000120]ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲは、膜貫通エレメントを含み得る。当該膜貫通エレメントは、ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲの細胞外エレメントに結合させることができる。当該膜貫通エレメントは、当該膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通タンパク質が由来した元のタンパク質の細胞外領域に関連する１つまたは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大で１５まで、のアミノ酸）、および／または、膜貫通タンパク質が由来した元のタンパク質の細胞内領域に関連する１つまたは複数のさらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大で１５まで、のアミノ酸）を含むことができる。当該膜貫通エレメントは、ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲにおいて使用される他のエレメントの１つに関連付けることができる。当該膜貫通エレメントは、例えば、受容体複合体の他の膜との相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通エレメントへのそのようなエレメントの結合を回避するように選択され得るかまたはアミノ酸置換によって修飾され得る。当該膜貫通エレメントは、クリプティクな切断部位を除去するように改変することができ（例えば、ｃｄ８膜貫通ドメインによって作製されたＣＡＲＳは、クリプティクな切断部位を除去するように操作することができる）、および／または、膜貫通エレメントは、クリプティクな切断部位を有さないＣＡＲ構築物において使用することができる。当該膜貫通エレメントは、細胞表面上の別のＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲによるホモ二量体化が可能であり得る。当該膜貫通エレメントのアミノ酸配列は、同じ細胞内に存在する天然の結合パートナーの結合エレメントとの相互作用を最小化するように、改変または置換され得る。

[000121]本発明において有用な膜貫通エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、なお、当該文献は両方とも、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

キメラ抗原受容体：Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ
[000122]ＳｉｄｅＣＡＲ、ＳｉｄｅＣＡＲの選択、およびテザーありまたはなしでのその使用は、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されており、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

受容体
[000123]ＣＡＲＳは、受容体として細胞およびＲＤＥ－導入遺伝子と共に使用することができる。ＣＡＲＳは上記に記載されている。ＣＡＲＳに加えて、ＲＤＥの制御下の導入遺伝子が発現されるように細胞中の状態を活性化するまたはさもなければ変化させるのに、他の受容体が使用されてもよい。化学シグナルを認識し応答する受容体は、ＲＤＥを通じて導入遺伝子の発現と共役することができる。例えば、イオンチャネル連結型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質連結型（代謝型）受容体、および酵素連結型受容体は、導入遺伝子の発現と共役することができる。

[000124]導入遺伝子発現と共役することができる受容体の１つのクラスは、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体（別名、抗原受容体または免疫グロブリン受容体）、および自然免疫受容体などの免疫受容体である。

[000125]Ｔ細胞受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体である。ヒトでは、ほとんどのＴ細胞がアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖でできたＴ細胞受容体を有し、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）でできたＴ細胞受容体を有する。リンパ球由来のＴ細胞受容体鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に販売されているＳＭＡＲＴｅｒＨｕｍａｎＴＣＲａ／ｂＰｒｏｆｉｌｉｎｇＫｉｔ、Ｂｏｒｉａら、ＢＭＣＩｍｍｕｎｏｌ．９：５０～５８頁（２００８）；Ｍｏｏｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１６９：４１～５１頁（１９９４）；Ｋｉｍら、ＰＬｏＳＯＮＥ７：ｅ３７３３８頁（２０１２）；Ｓｅｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３：１２０５７～６２頁（２００６）に記載されており、これらの全てはあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。ＴＣＲレパートリーは、抗原結合ドメインを形成するのに別個の鎖として使用されてもよい。ＴＣＲレパートリーは、単鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。単鎖ＴＣＲは、例えば、それらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：８１９～８２９頁（１９９６）；Ａｇｇｅｎら、「ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＨｕｍａｎＳｉｎｇｌｅ－ＣｈａｉｎＴｃｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒｓ」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校博士論文（２０１０）（そのコピーは、ｉｄｅａｌｓ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１に見出される）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、ヒトアルファおよびベータ鎖をコードする核酸から作ることができる。

[000126]Ｂ細胞受容体には、膜結合性である免疫グロブリン、シグナル伝達部分、ＣＤ７９、およびＩＴＡＭが挙げられる。ヒト抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは当技術分野で周知であり、例えば、それらの全てがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、ＰｒｏＧｅｎ’ｓＨｕｍａｎＩｇＧａｎｄＩｇＭＬｉｂｒａｒｙＰｒｉｍｅｒＳｅｔ、カタログ番号Ｆ２０００；Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆら、「ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＦａｂＡｎｔｉｂｏｄｙＬｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙｏｆＬｉｇｈｔａｎｄＨｅａｖｙＣｈａｉｎＣｏｄｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１；Ｌｉｍら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１０８～１１７頁（２０１０）；Ｓｕｎら、ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：３８１～３８６頁（２０１２）；Ｃｏｒｏｎｅｌｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２８：ｅ８５頁（２０００）に記載されている。マウス抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは当技術分野で周知であり、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，１４３，００７号；Ｗａｎｇら、ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍ．７（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ９頁（２００６）に記載されている。抗体レパートリーは、抗原結合ドメインで別個の鎖として使用されてもよく、または単鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。単鎖抗体は、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｐａｎｓｒｉら、ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：６頁（２００９）；Ｐｅｒａｌｄｉ－Ｒｏｕｘ、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌｃ．Ｂｉｏｌ．９０７：７３～８３頁（２０１２）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、ヒト軽鎖および重鎖をコードする核酸から作られてもよい。単鎖抗体は、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｉｍａｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９：１３２５～１３３０頁（２００６）；Ｃｈｅｎｇら、ＰＬｏＳＯＮＥ６：ｅ２７４０６頁（２０１１）に記載されているものを含む当技術分野で周知の手法を使用して、マウス軽鎖および重鎖をコードする核酸から作られてもよい。

[000127]自然免疫受容体には、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ）、２Ｂ４受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ８０受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＲＰ１０５）が挙げられる。

[000128]７回膜貫通ドメイン受容体としても知られるＧタンパク質連結型受容体は、Ｇタンパク質を通じてリガンドの受容体結合を細胞応答と共役させる受容体の大きなファミリーである。これらのＧタンパク質は、ＧＴＰに結合されると活性になり、ＧＤＰに結合されると不活性になる、α、β、およびγサブユニット（それぞれ、Ｇα、Ｇβ、およびＧγとして知られる）の三量体である。受容体がリガンドを結合するとコンフォメーション変化を受け、Ｇタンパク質をアロステリックに活性化してＧＴＰを結合ＧＤＰに交換する。ＧＴＰ結合後、Ｇタンパク質は受容体から解離してＧα－ＧＴＰ単量体およびＧβγ二量体を生じる。Ｇタンパク質連結型受容体は、例えば、ロドプシン様受容体、セクレチン受容体、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体、真菌交配フェロモン受容体、環状ＡＭＰ受容体、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体を含むクラスにグループ化されている。Ｇタンパク質受容体は、電磁放射線の検出、味覚（味）、嗅覚、神経伝達、免疫系調節、増殖、細胞密度感知等を含む多種多様な生理学的プロセスで使用される。

[000129]触媒型受容体としても知られる酵素連結型受容体は、細胞外リガンドの結合が細胞の内側で酵素活性を引き起こす膜貫通受容体である。酵素連結型受容体は、ポリペプチドの膜貫通部分（またはドメイン）によって結合された２つのドメインを有する。２つの末端ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインおよび触媒機能を有する細胞内ドメインである。例えば、Ｅｒｂ受容体ファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子受容体ファミリー、ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリー、ｔｒｋニューロトロフィン受容体ファミリー、およびｔｏｌｌ様受容体ファミリーを含む、酵素連結型受容体の複数のファミリーがある。

[000130]リガンド開口型イオンチャネルとしても知られるイオンチャネル連結型受容体は、例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＣｌ^－などのイオンが、受容体へのリガンドの結合に応答して膜を通過できるようにする受容体である。例えば、カチオン性ｃｙｓループ受容体、アニオン性ｃｙｓループ受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体）、ＧＡＢＡ受容体、５－ＨＴ受容体、ＡＴＰ開口型チャネル、およびＰＩＰ_２開口型チャネルを含む、リガンド開口型イオンチャネルの複数のファミリーがある。

真核細胞
[000131]様々な真核細胞が、真核細胞として使用され得る。真核細胞は、動物細胞であってもよい。真核細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌなどの哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含むがこれらに限定されない霊長類の細胞であってもよい。マウスは他の哺乳動物、とりわけヒトのモデルとして日常的に役割を果たしていることから、哺乳動物細胞はマウス細胞であってもよい（例えば、Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：１９２０～２３頁、２００７；Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．１０３（６）：Ｒ１５～Ｒ２１頁、１９９９；Ｗａｒｒｅｎ、Ｒ．Ｓ．ら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．９５：１７８９～１７９７頁、１９９５を参照のこと；各刊行物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。動物細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓、乳腺、前立腺、肺）、角化細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞が挙げられる。動物細胞は、成体細胞（例えば、最終分化、分裂または非分裂）または胚細胞（例えば、胚盤胞細胞等）または幹細胞であってもよい。真核細胞は、動物または他の供給源に由来する細胞株でもあってもよい。

[000132]真核細胞は、幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば、神経、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵臓、表皮等）を含む、様々な幹細胞タイプが当技術分野で公知であり、真核細胞として使用され得る。幹細胞は、対象から採取された細胞に由来する幹細胞株であってもよい。

[000133]真核細胞は、ヒトを含む哺乳動物の循環系で見出される細胞であってもよい。例示的な循環系細胞には、特に、赤血球、血小板、血漿細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球等、およびこれらの前駆体細胞が挙げられる。これらの細胞は、グループとして本発明の循環真核細胞と定義される。真核細胞は、これらの循環真核細胞のいずれかに由来してもよい。導入遺伝子は、循環細胞に由来するこれらの循環細胞または真核細胞のいずれかを用いて使用されてもよい。真核細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、または上述の細胞の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラー細胞の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、Ｂ細胞、またはＢ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、好中球または好中球前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、巨核球または巨核球の前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。真核細胞は、マクロファージまたはマクロファージの前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。

[000134]真核細胞は、対象から得ることができる。対象は任意の生体であってもよい。細胞は、対象から得られた細胞に由来してもよい。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。当技術分野で利用可能な多くのＴ細胞株も使用することができる。Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者に公知の多くの手法を使用して対象から収集された血液単位から得ることができる。個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞は洗浄されて、血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために適当な緩衝液または培地に細胞を入れてもよい。細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することができる。代わりの態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、または全てではないとしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。カルシウムの非存在下の最初の活性化ステップは、活性化の増大をもたらすことができる。

[000135]負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体を組み合わせて達成することができる。細胞は、細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用して、負の磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択により濃縮されてもよい。例えば、ＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を典型的には発現する調節性Ｔ細胞を濃縮することが望ましい場合がある。あるいは、特定の態様では、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって枯渇される。

[000136]Ｔ細胞は、例えば、その各々があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、一般に活性化および拡大することができる。

[000137]ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５および４－１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように遺伝子修飾されている骨髄細胞株の存在下で拡大することができる。このようにして修飾された、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を持たない細胞株は、ＮＫ細胞溶解に対して高度に感受性であり、ＮＫ細胞を活性化する。例えば、Ｋ５６２骨髄細胞は、ヒトＣＤ８αおよびＧＦＰのシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインに融合されたヒトＩＬ－１５成熟ペプチドからなるキメラタンパク質構築物を形質導入することができる。形質導入された細胞は次いで、限界希釈によって単一細胞クローニングされ、ＧＦＰ発現および表面ＩＬ－１５が最も高いクローンが選択され得る。このクローンに次いでヒトＣＤ１３７Ｌを形質導入し、Ｋ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株を作出してもよい。ＮＫ細胞を優先的に拡大するために、ＮＫ細胞を含有する末梢血単核細胞培養物が、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下、ＮＫ細胞の集団を活性化し濃縮するのに十分な期間にわたってＫ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株と培養される。この期間は２～２０日、好ましくは約５日に及ぶことがある。拡大ＮＫ細胞は次いで、抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζキメラ受容体を形質導入されてもよい。

Ｔリンパ球でのＣＤ３イプシロンの修飾
[000138]Ｔリンパ球は、移植片対宿主反応を低下させるように修飾されてもよい。例えば、同種Ｔリンパ球は、移植時に移植片対宿主反応が低下するように修飾されてもよい。同種Ｔリンパ球はＣＡＲ療法で使用することができ、および／またはＴリンパ球によって標的部位へ送達するための他の導入遺伝子を保有することができる。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体機能に優性効果がある変異体を導入することによって修飾されてもよい。例えば、変異体は、Ｔ細胞受容体をノックアウトすることができ、またはＴ細胞受容体からのシグナル伝達を妨害することができる。ＣＤ３イプシロン鎖の変異は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達に対してそのようなドミナントネガティブ効果を有し得る。ＣＤ３イプシロンのネガティブドミナント変異体の例は、ＣＤ３イプシロンのＣ－Ｘ－Ｘ－ＣモチーフをＳ－Ｘ－Ｘ－Ｓに変更するＣ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ二重変異体である。この二重変異体は、活性化Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達が欠損し、そのためＴリンパ球（例えば、同種Ｔリンパ球）による宿主抗原の結合はＴリンパ球を活性化せず、移植片対宿主病を低減する。

[000139]ＣＤ３イプシロン二重変異体（Ｃ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ）は、Ｔリンパ球のＣＤ３イプシロン遺伝子座に組み込むことによってＴリンパ球に導入されてもよく、またはこの二重変異体はネガティブドミナントであるため、Ｔリンパ球ゲノムの他の部位に導入されてもよく、またはＴリンパ球に一過性にトランスフェクト／形質導入されてもよい。一過性トランスフェクションは、標的部位でのＣＡＲ（または他の受容体）の結合による活性化の前に、Ｔリンパ球のＴ細胞受容体に会合したＣＤ３イプシロン二重変異体を含むＴリンパ球を産生することができる。Ｔリンパ球が標的に達し、そのＣＡＲと相互作用したときに一過性発現が終了するならば、ＣＡＲＴリンパ球は、同種Ｔ細胞受容体を通じたＣＡＲ反応および移植片対宿主／腫瘍細胞反応により死滅し得る。

[000140]一例では、Ｔリンパ球は宿主（例えば、同種宿主）から得られ、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより活性化される。これらの活性化Ｔリンパ球は、ＣＡＲ（および／または他の所望の導入遺伝子）および二重変異体ＣＤ３イプシロン（Ｃ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ）をコードする構築物でトランスフェクトされる。ＣＡＲをトランスフェクト／形質導入したＴリンパ球が単離され（例えば、ＣＡＲを用いた親和性単離によって、または活性ＴＣＲを有する活性Ｔリンパ球に対する選択が行われてもよい）、対象に投与される。

[000141]ＣＤ３イプシロンの別の変異は、該ポリペプチドの１つまたは複数のＩＴＡＭ部分の欠失を作り得る。これらのＩＴＡＭ欠失は、これらのＩＴＡＭ変異体で作られるＣＡＲＳのシグナル伝達能力を低下させる。ＣＡＲのＣＤ３イプシロンは、１つまたは複数のＩＴＡＭ配列のＩＴＡＭ欠失を有するように操作され得る。ＣＡＲおよびΔＩＴＡＭを有するこれらのＣＤ３イプシロン遺伝子により操作されたＴ細胞は、ＲＤＥの制御下のペイロードと共に使用することができる。これらのＴ細胞がＣＡＲによって活性化されると、ペイロードが発現される。ΔＩＴＡＭは、ＣＡＲに対する細胞の応答性を低下させ（無能力化ＣＡＲ）、Ｔ細胞消耗を低減または防止し得る。これにより、Ｔ細胞は導入遺伝子ペイロードをより長期間産生できるようになる。

核酸
[000142]また、本開示には、本明細書に記載された個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＤＥ、および他の転写後制御デバイスを少なくとも部分的にコードする核酸も記載される。核酸は、天然、合成またはその組み合わせであってもよい。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。

[000143]本発明の核酸には、プラスミド、またはウイルスベクター、または直鎖状ベクター、または染色体ＤＮＡに組み込まれるベクターなどの発現ベクターも含まれる。発現ベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞でベクターが複製できるようにする核酸配列を含有し得る。そのような配列は、様々な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適している。真核生物宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞では、発現ベクターは宿主細胞染色体に組み込まれ、次いで宿主染色体により複製することができる。同様に、ベクターは、原核細胞の染色体に組み込むことができる。

[000144]発現ベクターは一般に、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子も含有する。本発明の宿主細胞を含む原核細胞および真核細胞のための選択可能なマーカーは、当技術分野で周知である。一般に、選択遺伝子は、選択培地で増殖される形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、桿菌のＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。例示的な選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用し得る。異種遺伝子で成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き延びる。細菌または真核生物（哺乳動物を含む）系で使用するための他の選択可能なマーカーは、当技術分野で周知である。

[000145]ＳｍａｒｔＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ導入遺伝子を哺乳動物Ｔ細胞で発現させることができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素送達に関与する伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動する上で有効であることが示されている。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３～１４６４頁（２００９）を参照のこと。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な恒常的プロモーター配列である。限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを含む修飾ＭｏＭｕＬＶＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓｖｏｌ．１８９、５６～６４頁（２０１０）を参照のこと）、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチニンキナーゼプロモーターを含む、他の恒常的プロモーター配列も使用することができる。さらに、本発明は、恒常的プロモーターの使用に限定されない。

[000146]誘導性または抑制性プロモーターも、本開示における使用に企図される。誘導性プロモーターの例には、活性化Ｔ細胞核因子誘導性プロモーター（ＮＦＡＴ）、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、ｃ－ｆｏｓプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターからの発現をテトラサイクリンオペレーターの制御下に置くＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴ－ＲＥｘ系、およびＩｎｔｒｅｘｏｎのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｍａｃｉａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０：２４７６～２４８９頁（２００１）；Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓ３９：１９１～１９６頁（２００５）；Ｄａｉ，Ｘ．ら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ４２：２３６～２４５頁（２００５）；Ｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１３０８～１５１５頁（２００３）；Ｄｈａｄｉａｌｌａ，Ｔ．Ｓ．ら、ＡｎｎｕａｌＲｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５～５６９頁（１９９８）；Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２７２１１～２７２１８頁（２００４）；Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ，Ｍ．ら、Ａｎｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：４３７８～４３８５頁（２００２）；Ｋａｔａｌａｍ，Ａ．Ｋ．ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ１３：Ｓ１０３頁（２００６）；およびＫａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ１３：Ｓ１９４頁（２００６）、米国特許第８，８９５，３０６号、第８，８２２，７５４号、第８，７４８，１２５号、第８，５３６，３５４号、これらの全ては、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。誘導性プロモーターには、中程度の温熱療法に応答するヒートショックエレメントを含むプロモーターも挙げられる。ヒートショックエレメントは、例えば、ヒートショック遺伝子由来のプロモーター（例えば、ＨＳＰＢ１）などのプロモーターの上流に位置するコンセンサス配列５’－ｎＧＡＡｎ－３’の多数の逆方向反復からなる。

[000147]発現ベクターは、典型的には、転写開始の頻度を調節するプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーを有する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能性エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は柔軟である場合が多く、その結果、エレメントが反転するかまたは互いと比べて動く場合にプロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が減退しはじめる前に５０ｂｐまで増加し得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために協同してまたは独立して機能し得るようである。

[000148]発現ベクターは、二シストロン性構築物または多シストロン性構築物であってもよい。２つのシストロンは、シストロンの制御領域が２つのシストロンの間に位置する状態で逆方向に配向されてもよい。構築物が２つを超えるシストロンを有する場合、シストロンは２つのグループが転写と逆方向に配向される状態で２つのグループに配置されてもよい。例示的な二シストロン構築物は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ａｍｅｎｄｏｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１０８～１１６頁（２００５）に記載されている。一方のシストロンに対する制御領域は高い転写活性能力があってもよく、他方は使用条件下で低い転写活性を有してもよい。一方または両方の制御領域は誘導性であってもよい。高転写活性制御領域の例には、例えば、ＭＮＤ、ＥＦ１－アルファ、ＰＧＫ１、ＣＭＶ、ユビキチンＣ、ＳＶ４０初期プロモーター、テトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、細胞特異的プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、およびＣＢＧ（ニワトリベータ－グロビン）が挙げられ、必要に応じてＣＭＶ初期エンハンサーを含む。低転写活性制御領域の例には、例えば、ＴＲＥ３Ｇ（基底発現を低下させる変異を有するテトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に販売されている）、Ｔ－ＲＥｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって商業的に販売されている）、および最小ＴＡＴＡプロモーター（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｋｉｒａｎら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１４２：３６４～３７６頁（２００６））、ＨＳＰ６８、および最小ＣＭＶプロモーターが挙げられる。誘導性制御領域の例には、例えば、ＮＦＡＴ制御領域（Ｍａｃｉａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０：２４７６～２４８９頁（２００１））、および上記した誘導性制御領域が挙げられる。

[000149]二シストロン性構築物は、ＣＡＲおよび、標的部位に送達されるべきペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードし得る。例示的なペイロードは、上記および以下に記載される。ＣＡＲをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、必要に応じて、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、または上述の組み合わせに作動可能に連結されてもよい。ＣＡＲは、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲフォーマットで核酸によってコードされてもよい。ポリペプチドをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよい。ペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＤＥの制御下にあってもよい。ＲＤＥは、例えば、解糖系酵素（例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、またはホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）など）を通じて細胞の活性化状態に応答するものであってもよい。ＲＤＥはまた、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ２）、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＳＵＧＬＧ１）、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１／２）などの他のエネルギー代謝酵素によって結合および制御することもできる。宿主細胞は、対象における標的部位でその抗原に結合するＣＡＲを発現してもよい。標的部位でのこの抗原結合は、細胞を活性化し、細胞に解糖を増加させ、（解糖系酵素または他のエネルギー代謝酵素によって結合された）ＲＤＥの制御下でポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する。

[000150]多シストロン構築物は、各々が制御領域（必要に応じて誘導性）および導入遺伝子のいくつかまたは全てに作動可能に連結したＲＤＥを有する、３つ以上のシストロンを有することができる。これらのカセットは、構築物において逆方向に転写される２つのグループで構成され得る。２つの以上の導入遺伝子が同じ制御領域から転写されてもよく、２つの以上の導入遺伝子が、下流の導入遺伝子に作動可能に連結したＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列を有してもよい。あるいは、２つの以上の導入遺伝子は、ｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｌａｓｍｉｄｓ－１０１－ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｎｉｃ－ｖｅｃｔｏｒｓに見出されるＰｌａｓｍｉｄｓ１０１：ＭｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃＶｅｃｔｏｒｓに記載されている２Ａエレメントによって作動可能に一緒に連結される。一般に使用される２Ａ配列には、例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）（配列番号１７）、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｐ２Ａ）（配列番号１８）；ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｅ２Ａ）（配列番号１９）；およびＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｆ２Ａ）（配列番号２０）が挙げられ、それらの全ては必要に応じて配列ＧＳＧをアミノ末端に含み得る。これにより、複数の導入遺伝子が、ＲＤＥ（または複数のＲＤＥ）を含む３’－ＵＴＲによって調節される単一の転写物に転写できるようになる。

[000151]二シストロン性／多シストロン性ベクターは、２つ以上のシストロンの全体の発現を増加させることができる（別個の構築物にシストロンを導入することと比べて）。二シストロン性／多シストロン構築物は、レンチ－ウイルスベクターに由来してもよい。二シストロン性／多シストロン構築物は、ＣＡＲおよび、導入遺伝子（例えば、ペイロード）にコードされるポリペプチドをコードすることができ、二シストロン性構築物は、細胞がＣＡＲによって活性化されると、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を増加させることができる。

[000152]発現構築物は、発現構築物の形質導入頻度を高めるために構築物の５’－ＬＴＲのＲＮＡスプライス部位を除去するように修飾することができる。多くのレンチウイルス形質導入構築物は５’－ＬＴＲに残存スプライス部位を有し、導入されるべき核酸を変更するこの部位を含むスプライシング事象により形質導入頻度を低下させる可能性がある。例えば、ｐＣＤＨベクター（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、レンチウイルスベクターｐＬＶＴＨ、ｐＲＲＬＳＩＮ、ｐＷＰＩ、およびｐＷＰＸＬによって代表されるレンチウイルスベクター、ならびに他のレンチウイルスベクターは、スプライスアクセプター部位を含むＨＩＶ５’－ＬＴＲの一部を含有する。ベクターからのこのスプライス部位の除去は、修飾ベクターによる形質導入頻度を高める（非修飾ベクターと比べて）。残存ＨＩＶ５’－ＬＴＲセグメントのスプライスドナー部位は、２つのヌクレオチド変化、Ｇ２９０ＣおよびＵ２９１Ａ（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｋｅａｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３４８：９１７～９２１頁（２０１５）に従ってＨＩＶスプライス部位をナンバリング）を作ることによって妨害することができる。このスプライス部位をノックアウトするために、このスプライスドナー部位の他の変化も作られ得る。他の形質導入ベクターも、形質導入／トランスフェクション後に所望の配列を妨害し得る残存スプライス部位を含み、これらのスプライス部位の除去は、これらのベクターによる形質導入／トランスフェクション頻度を高めるはずである。

[000153]本明細書に記載されたポリペプチドを修飾することが望ましい場合がある。当業者は、所与の核酸構築物に変更をもたらしてバリアントポリペプチドを生成する多くの方法を認識するであろう。そのような周知の方法には、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の変異誘発剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きな核酸を生成するためのライゲーションおよび／またはクローニングと併用した）、および他の周知の手法（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ８：８１～９７頁、１９７９；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２８：７３１～７３４頁、１９８７を参照のこと）が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された生物で核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するように修飾されてもよい。

[000154]ポリヌクレオチドには、本明細書に記載された他のポリヌクレオチドと実質的に同等のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含まれ得る。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。核酸は、本明細書に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであってもよい。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは当業者に周知であり、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを日常的に単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定する方法が挙げられ得る。

[000155]タンパク質アナログまたはバリアント（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸が、野生型ポリペプチドとは異なるように設計されている）をコードする核酸は、部位特異的変異誘発、またはプライマーが所望の点変異を有するＰＣＲ増幅を使用して産生することができる。適切な変異誘発法の詳細な説明については、その各々があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＩｎｃ．およびＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、Ｎ．Ｙ（１９９４）を参照のこと。Ｅｎｇｅｌｓら、ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔｌＥｄ．２８：７１６～３４頁、１９８９（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる）によって記載されたものなど当技術分野で周知の方法を使用する化学合成も、そのような核酸を調製するのに使用することができる。

[000156]バリアントを作出するためのアミノ酸「置換」は、好ましくは、１個のアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または関与する残基の両親媒性の類似性に基づき行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ；ならびに負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

[000157]また、ＣＡＲＳをコードする導入遺伝子を含む、導入遺伝子をコードする核酸も本明細書に開示される。導入遺伝子をコードする核酸は、従来の方法によってＲＮＡ制御デバイスの配列と組み合わされた指定されたＣＡＲのアミノ酸配列から容易に調製することができる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各エレメントのアミノ酸配列に関する上述のＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋの受託番号から入手でき、本発明の核酸は、標準的な分子生物学的および／または化学的手順を使用して調製することができる。例えば、塩基配列に基づいて核酸は合成することができ、本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡライブラリーから得られるＤＮＡ断片を組み合わせて調製されてもよい。

[000158]核酸は、適切なプロモーターの制御下で発現されるように別の核酸に連結されてもよい。核酸はまた、核酸の効率的な転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と協同する他の調節性エレメント、例えば、エンハンサー配列、ポリＡ部位、またはターミネーター配列を含む核酸にも連結され得る。本発明の核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬物耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が組み込まれてもよい。

[000159]核酸がｅｘｖｉｖｏで細胞に導入される場合、本発明の核酸は、上述の賦形剤に加えて、細胞への核酸の転移を促進する物質、例えば、リポソームまたはカチオン性脂質などの核酸を導入するための試薬と組み合わされてもよい。あるいは、本発明の核酸を担持するベクターも有用である。特に、適切なベクターによって担持された本発明の核酸を含有する、生体への投与に適した形態の組成物は、ｉｎｖｉｖｏでの遺伝子療法に適している。

真核細胞への核酸の導入
[000160]導入遺伝子を発現する細胞を産生するプロセスは、本明細書に記載された導入遺伝子をコードする核酸を真核細胞に導入するステップを含む。このステップは、ｅｘｖｉｖｏで実行されてもよい。核酸を真核細胞に導入するための例示的な方法は、例えば、そのいずれもがあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されている。

ウイルスペイロード
[000161]導入遺伝子を標的細胞に送達するのにウイルスが使用されてもよい。ウイルスは、核酸構築物（例えば、トランスファープラスミド）をペイロードとして担持することができ、そのため、標的細胞遺伝子型および／または表現型を修飾する（一過性にまたは安定に）ための所望の核酸を標的細胞に送達することができる。これらの形質導入適用の多くでは、ウイルスによって担持される核酸はウイルスゲノムの全てを含むわけではなく、ウイルスゲノムの残りのほとんどまたは全てを含むことなく、核酸構築物をウイルスにパッケージングするのに必要なウイルスゲノムシグナルを含む場合が多い。例えば、標的細胞の形質導入のためのレンチウイルスヘルパープラスミドおよびトランスファープラスミド系は、ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である。他のヘルパーおよびトランスファープラスミド系は、いくつかの供給源（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）から市販されている。

[000162]ペイロードとして使用される場合、ウイルスカプシドの合成、ペイロード核酸のパッケージング、およびペイロード核酸を含むウイルスの放出は、複製およびコートタンパク質のためのウイルス遺伝子の発現のタイミングを、標的部位での受容体によるリガンドの結合に合わせることによって標的部位に限定することができる。そのような制御は、細胞が代謝状態の変化（例えば、標的への受容体結合後の解糖の活性化）を受けると発現を誘導するＲＤＥを使用して達成することができる。このＲＤＥ制御は、ウイルス遺伝子発現のマスタースイッチ因子の発現を調節することができる。例えば、転写調節因子は適切なＲＤＥの制御下に置かれてもよく、複製、コートタンパク質等のためのウイルス遺伝子がこの転写因子の制御下に置かれてもよい。宿主細胞が標的部位で適当な受容体（例えば、ＣＡＲ）を通じてリガンドに結合すると、これは細胞を活性化し、適当なＲＤＥによる転写因子の発現を誘導し、ウイルス複製タンパク質、コートタンパク質等の発現をもたらす。

ウイルスベクターによる形質導入
[000163]形質導入は、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて達成されてもよく、またはセンダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターが使用されてもよい。ウイルスベクターは、感染細胞で自己複製しないように複製能力を欠いてもよい。

[000164]レトロウイルスベクターが宿主細胞を形質導入するのに使用される場合、そのプロセスは、ベクターによって保有されるＬＴＲ配列およびパッケージングシグナル配列に基づき適切なパッケージング細胞を選択し、パッケージング細胞を使用してレトロウイルス粒子を調製して実行され得る。パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，２７８，０５６号）、ならびにＰｓｉ－Ｃｒｉｐ（あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ、８５巻、６４６０～６４６４頁（１９８８））が挙げられる。レトロウイルス粒子は、高いトランスフェクション効率を有する２９３細胞またはＴ細胞を使用して調製することもできる。レトロウイルスに基づき産生されるレトロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターのパッケージングに使用され得るパッケージング細胞の多くの種類が多くの企業から広く市販されている。

[000165]いくつかのウイルスベースの系が哺乳動物細胞への遺伝子導入用に開発されている。選択された遺伝子は、当技術分野で公知の手法を使用してベクターに挿入され、ウイルス粒子にパッケージングされ得る。組換えウイルスは、次いで単離され、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達され得る。いくつかのウイルス系は当技術分野で公知である。アデノウイルスベクターが使用されてもよい。いくつかのアデノウイルスベクターは当技術分野で公知であり、使用されてもよい。さらに、レンチウイルスベクターが使用されてもよい。

[000166]ＲＮＡウイルスに由来するウイルスベクターは、ポリヌクレオチドをコードするＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを細胞に誘導するのに使用され得る。ＲＮＡウイルスベクターは、ＲＮＡ制御デバイスおよびＣＡＲ構築物をコードするポリヌクレオチドの逆相補鎖またはアンチセンス鎖をコードすることができる（相補鎖は、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物のセンス鎖をコードする）。したがって、ＲＮＡ制御デバイスは、一本鎖のＲＮＡウイルスベクターにおいて活性であるべきではない。ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子をコードするＲＮＡウイルス構築物のセンス鎖が使用され得、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物を含むウイルスベクターが、ＲＮＡ制御デバイスのセンサーエレメントのリガンドの存在（または非存在）下で（またはＲＤＥが安定な条件下で）維持され、複製されてＲＮＡの切断を防止する。ウイルスベクター中にＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子構築物のセンス鎖をコードするウイルスベクターは次いで、センサーエレメントのリガンドが有る（または無い）状態で維持され、複製され得る。形質導入効率は、解凍および形質導入の前にパッケージング構築物を凍結保存することによって向上し得る。効率の向上は、約１０％～約７０％に及んだ。

医薬組成物
[000167]本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現細胞を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化物質；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、１つの態様では静脈内投与用に製剤化される。

[000168]医薬組成物は、処置（または予防）されるべき疾患に適した方法で投与され得る。適正な投与量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定されることになる。

[000169]適切な薬学的に許容される賦形剤は当業者に周知である。薬学的に許容される賦形剤の例には、リン酸緩衝食塩水（例えば０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８ＭＮａＣｌ、０．００２７ＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、食塩水、グリコールまたはエタノール溶液、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩などの有機酸の塩が挙げられる。湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、およびｐＨ緩衝剤も使用されてもよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された薬学的に許容される賦形剤が、適正に使用されてもよい。組成物は、非経口投与、例えば、注射または注入に適した公知の形態へ製剤化することができる。組成物は、懸濁剤、防腐剤、安定化剤および／または分散剤、ならびに貯蔵中の有効期間を延長するための保存剤などの製剤添加物を含んでもよい。

[000170]本明細書に記載された真核細胞を活性成分として含む組成物は、例えば、がん（血液がん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、または深在性真菌症などの疾患の処置のために、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドが結合する抗原に応じて投与され得る。

[000171]対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む、任意の好都合な方法で実行され得る。本明細書に記載された組成物は、患者に対し、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、鼻腔内、動脈内、腫瘍内、輸入リンパ管へ、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与され得る。１つの態様では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。１つの態様では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射されてもよい。投与は、養子移入によって行われてもよい。

[000172]「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療的量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載された真核細胞を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重（それらの範囲内の全ての整数値を含む）の投与量で投与され得る。真核細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる。真核細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入法を使用して投与することもできる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６頁、１９８８を参照のこと）。

真核細胞の使用
[000173]ＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドを真核細胞で発現させるのに使用することができる。真核細胞は、例えばヒト細胞またはマウス細胞を含む、哺乳動物細胞であってもよい。真核細胞は、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージを含む、例えば造血細胞でもあってもよい。

[000174]Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを用いて操作することができる。ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、またはＳｉｄｅＣＡＲのリガンドが、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞に、エフェクター機能の所望の量を得るために漸増量で添加され得る。エフェクター機能の所望の量は、標的細胞上の標的抗原の既知の量（および／または密度）でのエフェクター機能の最適化量であってもよい。エフェクター機能は、標的細胞死滅、宿主免疫細胞の活性化、サイトカイン分泌、グランザイムの産生、アポトーシス誘導リガンドの産生、免疫系等をモジュレートする他のリガンドの産生であってもよい。エフェクター機能は、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０などのサイトカインの分泌であってもよい。エフェクター機能は、標的細胞の死滅であってもよい。標的細胞は、グランザイムにより死滅され得る。標的細胞は、アポトーシスを受けるように誘導され得る。ＣＡＲＳを含む真核細胞は、アポトーシスおよびグランザイムにより標的細胞を死滅させることができる。

[000175]ＲＤＥ、ＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、またはＳｉｄｅＣＡＲ調節エレメントは、導入遺伝子の発現を制御するのに使用することができる。この導入遺伝子発現は、ペイロードを標的部位に送達することができる。これらの導入遺伝子は、ウイルス構築物、またはペイロードがウイルスである場合はウイルスによって担持されることもできる。導入遺伝子の発現は、真核細胞で所望の変化を引き起こすことができる。ＧＡＰＤＨによって制御されるＲＤＥは、ペイロード送達に使用されてもよく、真核細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞）は、標的部位に達すると活性化され得る（例えば、ＣＡＲによって）。ＣＡＲを通じて真核細胞が標的部位で活性化すると、細胞は解糖およびＲＤＥからのＧＡＰＤＨ放出を誘導し、ペイロード発現および送達を可能にした。標的部位は、腫瘍または感染であってもよく、導入遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、細胞傷害性小分子を作るための酵素、ペプチドまたは糖類を切断する酵素（例えば、バイオフィルムを消化するための）、他の細胞傷害性化合物、または標的部位で所望の効果を与えることができる他のポリペプチドをコードし得る。チェックポイント阻害剤には、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）を含む、免疫チェックポイントで作用する薬剤が挙げられる。ペイロードとして使用され得るチェックポイント阻害剤の例には、例えば、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペンブロリズマブ（キートルーダ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、アベルマブ（バベンチオ（登録商標））、デュルバルマブ（イミフィンジ（登録商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））、リリルマブ、およびＢＭＳ－９８６０１６が挙げられる。ニボルマブ、アテゾリズマブおよびペンブロリズマブは、チェックポイントタンパク質ＰＤ－１で作用し、抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスを阻害する。いくつかのチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を妨げる。イピリムマブはＣＴＬＡ４で作用し、ＣＴＬＡ４が腫瘍において活性化Ｔ細胞を下方調節するのを妨げる。リリルマブはＫＩＲで作用し、ナチュラルキラー細胞の活性化を促す。ＢＭＳ－９８６０１６はＬＡＧ３で作用し、抗原特異的Ｔリンパ球を活性化し、腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介溶解を増強する。

[000176]ペイロードは、抗ＩＬ３３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗４１ＢＢ抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、および／またはレプチンの１つまたは複数であってもよい。ＩＬ－３３受容体はＴ_ｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）で上方調節され、抗ＩＬ３３抗体はＴ_ｒｅｇの増殖および活性化を低下させる。抗ＬＡＧ３抗体もＴ_ｒｅｇの活性を減少させることができる。抗Ｉｌ３３抗体および抗ＬＡＧ３抗体は、ＣＡＲＴ細胞および他の抗がんＴ細胞の抑制を低下させ得るＴ_ｒｅｇの活性を低下させるために、単独でまたは一緒に使用することができる。抗ＴＩＭ－３抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＤＣ－１細胞の共局在を可能にする（抗腫瘍応答を改善する）。ＭＡＲＣＯはマクロファージで発現され、腫瘍微小環境でこれはＴ細胞に抑制的に働くことができる。抗ＭＡＲＣＯ抗体は、マクロファージによるこの腫瘍抑制を妨げる。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、腫瘍微小環境で好中球の量を低減する。腫瘍微小環境での高い好中球対Ｔ細胞比は、不良な患者転帰と相関している。腫瘍中の好中球を減少させることは、患者転帰および腫瘍細胞死滅を改善することができる。ＩＬ－１５およびＩｌ－２１はナチュラルキラー細胞の拡大を増加させ、Ｉｌ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞を低減し得、Ｔ細胞消耗を防ぎ得る。ＣＤ４０Ｌは、免疫応答におけるＴ細胞のプライミング、共刺激および活性化に中心的な役割を果たす。抗ＣＤ３９抗体は、腫瘍微小環境中のアデノシンレベルを低下させることができる。腫瘍微小環境中のアデノシンの高いレベルは、免疫抑制を誘導し得る。抗ＣＤ３９抗体は、この免疫抑制を低下させることができる。抗４１ＢＢ抗体は、Ｔ細胞がアポトーシスを受けるのを妨げることができ、腫瘍細胞にＰＤ１の発現を上方調節させることもできる（そのため抗ＰＤ１療法と併用することができる）。

[000177]サイトカインには、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０が挙げられ得る。細胞傷害性薬剤には、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、または細胞傷害性小分子が挙げられ得る。ペイロードは、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等、またはＣＲＩＳＰＲ系と共に使用するガイドＲＮＡなどの遺伝子調節ＲＮＡであってもよい。ペイロードは、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体，抗ＩＬ３３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、ＰＧＣ－アルファ、レプチン、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｏｘ４０－４１ＢＢ、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）、ＩＬ－２１、レプチン、ＧＯＴ２、ＮＡＭＰＴ、ＣＤ５６、ＩＬ－２スーパーカイン（ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）、抗ＲＥＧＮＡＳＥ－１ペイロード（例えば、ｍｉＲＮＡ）、Ｃ－ｊｕｎ、システイナーゼ酵素、シスチナーゼ酵素、ＰＣＢＰ１（ポリ（ＲＣ）結合タンパク質１）、補体（Ｂ、Ｃ１－Ｃ９、Ｄ、Ｃ５ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａの１つまたは複数）、ＢＭＰ－１、抗ＴＧＦｂ剤（例えば、抗ＴＧＦｂ抗体、可溶性ＴＧＦｂＲ、抗ａｖＢ６インテグリン抗体、天然のＴＧＦｂ結合タンパク質、ＧＷ７８８３８８などの小分子、トラニラスト、ロサルタン、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤、メシル酸イマチニブ、ＰＰＡＲ－ｇアゴニスト、ロシグリタゾン、ピルフェニドン、ハロフジノン）、ＣＣＬ１９と組み合わせたＩＬ７（例えば、ＩＬ７－ｔ２Ａ－ＣＣＬ１９）、ｄｎＴＮＦＲ２、ｄｎＴＧＦＢＲ２、ＤＣＮ、ＤＫＫ１、ＯＫＴ３、ＮＯＳ２、ＣＣＬ５、抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ２８アゴニストＡｂ、抗ＣＤ２９／抗ＶＥＧＦ、抗ＣＴＬＡ４Ａｂ、抗ＩＬ１ｂＡｂ、ＢｉＴＥ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒアルロニダーゼ、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２、抗ＣＳＦ１Ｒおよび抗ＩＧＦ１、抗ＩＬ４、ＩＬ４受容体アンタゴニスト、ＩＬ４結合剤（例えば、可溶性ＩＬ４Ｒ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（例えば、分泌型ｅｃｔｏ－ＣＤ４０Ｌ）、膜ＣＤ４０リガンド、ＴＧＦＢＲアンタゴニスト、および／または４－１ＢＢリガンドであってもよい。ペイロードは、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、ＵＳ２０１９０１８３９３２に見出されるものも含んでもよい。標的部位（例えば、非腫瘍標的部位）に送達されるペイロードは、例えば抗炎症性因子などの標的部位を保護する因子、調節性Ｔ細胞を標的部位に誘引する因子、またはサイトカインもしくは免疫活性の抑制および低下をもたらす他の因子であってもよい。ペイロードは、ペプチドまたは糖類を切断する酵素、例えば、ヒアルロニダーゼ、ヘパラナーゼ、メタロプロテイナーゼ、および例えば望ましくないバイオフィルムを消化するのに使用することができる他のタンパク質分解酵素であってもよい。例えば、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＴＮＦα、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）および／またはＩＬ－１２を含む、骨髄細胞に起因する免疫抑制または阻害を低下させる骨髄修飾ペイロード（「ＭＭペイロード」）が送達されてもよい。２つの以上のＭＭペイロードも、送達について異なる薬物動態をもたらすＲＤＥを使用してＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲおよび／または他の受容体細胞（例えば、Ｔ細胞）によって送達することができる。例えば、異なるＭＭペイロードの送達のＣｍａｘが異なる時間に生じるように、異なるＭＭペイロードが異なるＲＤＥによって制御され得る。例えば、骨髄修飾ペイロードは、炎症誘発性および殺腫瘍性であるＭ１マクロファージの活性化を促進することができる。Ｍ１表現型を促進するＭＭペイロードは、ＣＳＦ１Ｒのアンタゴニスト（ＣＳＦ１受容体を遮断し、ＣＳＦ１受容体を活性化しないアンタゴニストであり、ＣＳＦ１を結合し、ＣＳＦ１がＣＳＦ１Ｒと相互作用するのを防ぐ薬剤）である。ＣＳＦ１Ｒのそのようなアンタゴニストには、例えば、小分子阻害剤、ＰＬＸ３３９７（ペキシダルチニブ、Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ＰＬＸ７４８６（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ＡＲＲＹ－３８２（ＡｒｒａｙＢｉｏｐｈａｒｍａ）、ＪＮＪ－４０３４６５２７（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、およびＢＬＺ９４５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。ＣＳＦ１Ｒのアンタゴニストである例示的な抗体には、例えば、エマクツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＭＧ８２０（Ａｍｇｅｎ）、ＩＭＣ－ＣＳ４（ＬＹ３０２２８５５、ＥｌｉＬｉｌｌｙ）、およびＭＣＳ１１０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｃａｎｎａｒｉｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒｐ．Ｃａｎｃｅｒ５：５３（２０１７）。ペイロードは、デコリン、ビグリカン、またはフィブロモジュリン／ルミカンなどのスモールロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）とペイロードを融合または会合させることによって、標的細胞（例えば、腫瘍部位）に局在化されてもよい。デコリン、ビグリカン、またはルミカンは、標的細胞の近くでコラーゲンに結合することができ、この結合が標的部位にまたは標的部位の近くにペイロードを局在化させることになる。この戦略は、細胞傷害性ペイロードを標的細胞（例えば、腫瘍）に局在化させ続けることに特に有用である。デコリンおよびビグリカンはまた、標的部位でまたは標的部位の近くでＴＧＦ－ベータに結合し、操作されたＴ細胞の抑制を低下させることもでき、そのためこれらは、自らをペイロードとして使用してＴＧＦｂを低下させることができる。デコリン、ビグリカン、および／またはルミカンペイロードは、恒常的に発現されてもよく、またはＲＤＥの制御下で中程度レベルのベースライン発現（細胞活性化時の発現増加と相まった低レベルの恒常的発現を模倣）で発現されてもよい。ペイロードは、上記のいずれかの１つまたは複数であってもよい。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であってもよい。ペイロードは、直接画像化され得るポリペプチドであってもよく、または基質と相互作用して画像化され得る産物を作るポリペプチドであってもよい。イメージングポリペプチドには、例えば、チミジンキナーゼ（ＰＥＴ）、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、ヨウ化ナトリウムトランスポーター（ＮＩＳ）、デオキシシチジンキナーゼ、ソマトスタチン受容体サブタイプ２、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）、カンナビノイド受容体、グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｔ１）、チロシナーゼ、ヨウ化ナトリウムトランスポーター、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、修飾ハロアルカンデハロゲナーゼ、チロシナーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびソマトスタチン受容体２が挙げられる。これらのレポーターペイロードは、例えば、光学イメージング、超音波イメージング、コンピュータ断層撮影イメージング、光干渉断層イメージング、Ｘ線撮影イメージング、核医学イメージング、陽電子放出断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、熱イメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージングを使用して画像化することができる。これらのイメージング方法には、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。

[000178]ＡＢ毒素は、所望のタンパク質産物を標的細胞に送達する融合ペイロードを操作するのに使用することができる。ＡＢ毒素には、例えば、ジフテリア毒素、破傷風毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、ウェルシュ菌のイオタ毒素Ｉａ、クロストリジウム・ボツリヌムのＣ２毒素ＣＩ、クロストリジウム・ディフィシルのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。ＡＢ毒素は、修飾ＡＢ毒素がその受容体を結合し、ＡＢ毒素のＢドメインを通じて所望のタンパク質を標的細胞に送達できるように、ＡＢ毒素の触媒（毒性）成分（Ａドメイン）を所望のタンパク質と置き換えるように操作され得る。ＡＢ毒素のＢドメインは一般に、標的細胞上の特徴に結合する受容体結合部分、および孔を形成し、標的細胞タンパク質と相互作用してＡドメインを標的細胞に輸送する膜貫通ドメイン部分を含む。Ｂ毒素融合は、Ｂドメインが、標的細胞からの細胞質転移因子複合体（ＣＴＦ）を利用してＢドメイン孔を通じて標的細胞に輸送する所望のタンパク質と、Ａドメインを置き換える。

[000179]これらのＢ毒素融合物は、Ｂドメインの受容体結合部分を、所望の標的細胞上の所望の抗原および／または受容体に結合する結合ドメイン（例えば、リガンド）と置き換えるように操作することもできる。これらの修飾Ｂ毒素融合物は今や所望の標的細胞に結合し、次いで所望のタンパク質を、Ｂドメイン孔および標的細胞のＣＴＦを使用して標的細胞に輸送する。例えば、Ｂ毒素融合物は、Ｂ毒素融合物がＣＡＲ細胞からのペイロードを標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に送達するように、ＣＡＲの抗原標的に結合するように操作され得る。導入遺伝子ペイロードは、細胞膜透過ペプチドをコードすることができる。細胞膜透過ペプチドを別のタンパク質に融合させてキメラタンパク質（別名融合タンパク質）を作ることができ、ＣＰＰ部分がキメラタンパク質を標的細胞の細胞質に導く。

[000180]標的細胞を直接死滅させ得る複数の系が、使用のために想定される。これらには、例えば、標的細胞へのウイルスまたは細菌遺伝子の導入が挙げられる。このアプローチは、非毒性プロドラッグを毒性のものに変える。広範に研究されている系がある：プロドラッグ５－フルオロシトシン（「５－ＦＣ」）を５－フルオロウラシル（「５－ＦＵ」）に変換する大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子（「ＣＤ」）；およびガンシクロビル（「ＧＣＶ」）を、がん細胞の酵素によってガンシクロビル三リン酸に変換されるガンシクロビル一リン酸に変換する、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（「ＨＳＶ－ｔｋ」）。腫瘍細胞を直接死滅させるのに有用なＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系は、腫瘍細胞へのＨＳＶ－ｔｋのアデノウイルス導入と、その後のガンシクロビルの投与を伴う。具体的には、組換え複製欠損アデノウイルスが、チミジン、ＨＳＶ－ｔｋを肝細胞癌（「ＨＣＣ」）細胞に導入してガンシクロビルに対する感受性を付与するのに使用される。３つの有用なＨＣＣ細胞株には、例えば、ｌａｃＺレポーター遺伝子を担持する組換えアデノウイルス（「Ａｄ－ＣＭＶｌａｃＺ」）によって、ｉｎｖｉｔｒｏで効率的に感染させることができるＨｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＨｅｐＧ２が挙げられる。ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を担持する組換えアデノウイルス（「ＡｄＣＭＶｔｋ」）に感染したＨＣＣ細胞でのＨＳＶ－ｔｋの発現は、ガンシクロビルに対する感受性を用量依存的に誘導する（Ｑｉａｎら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｂｙａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２２：１１８～１２３頁（１９９５））ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｈｅｐ．１８４０２２０１１９。

[000181]ペイロードが、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）などの遺伝子調節ＲＮＡである場合、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）は導入遺伝子であってもよく、またはポリペプチドをコードする導入遺伝子のイントロンに含められてもよい。例えば、Ｄｕら、ＦＥＢｓＪ．２７３：５４２１～２７頁（２００６）およびＣｈｕｎｇら、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ．３４：ｅ５３頁（２００６）に記載されているようなｍｉｒ１５５カセットがペイロードとして使用されてもよく、または操作してペイロードとして使用される導入遺伝子のイントロンに入れてもよい。ｍｉｒ１５５カセット（または他の調節ＲＮＡカセット）を操作してイントロンとして導入遺伝子に入れてもよく、または導入遺伝子が必要に応じて追加のヌクレオチドを含むｍｉｒ１５５カセットであってもよい。調節ＲＮＡ導入遺伝子（または調節ＲＮＡをイントロンとして含む導入遺伝子）は、ＲＤＥの制御下にあってもよい。ＲＤＥは、核内でのＲＮＡプロセシングおよび安定性に影響を与え得る。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）をコードする、または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子をコードする導入遺伝子が転写された後、転写物は、核マイクロプロセッサー複合体または他の核成分によって核内で処理されて、ヌクレオチドステムループ前駆体調節ＲＮＡ（例えば、プレｍｉｒ１５５）を作り得る。前調節ＲＮＡ（例えば、前ｍｉｒ１５５）ステムループは、核内でダイサーによって処理されて短いＲＮＡ二重鎖を形成し、核から輸出される。短いＲＮＡ二重鎖は、アルゴノート（Ａｇｏ）によって結合されてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるマルチサブユニット複合体のコアを形成する。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子をコードする導入遺伝子にＲＤＥを作動可能に連結することによって、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の発現はＲＤＥによって制御され得る。異なるＲＤＥは、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）導入遺伝子または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子に作動可能に連結されて、真核細胞の活性化（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲによるＴ細胞の活性化）後の異なる発現のタイミングおよび動態をもたらし得る。細胞の活性化後すぐに発現をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ２またはＡＵ１０１）、活性化の７２～９６時間後に高い発現をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ５またはＡＵ２１）、または発現後１９２時間まで増加する発現をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ１９またはＡＵ２２）が使用され得る。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の連続発現をもたらすであろうＲＤＥ、または細胞の活性化後の一定期間の発現と、その後の発現低下をもたらすであろうＲＤＥも選択され得る。異なるＲＤＥを含む多重調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）構築物（例えば、導入遺伝子としてのｍｉｒ１５５、またはｍｉｒ１５５イントロンを含む導入遺伝子を含む）が、連続発現を一緒にもたらす発現の異なる薬物動態プロファイルを提供するＲＤＥを使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化後に調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の連続発現を提供するのに使用されてもよい（例えば、実施例１１を参照のこと）。あるいは、選ばれたＲＤＥまたはＲＤＥの組み合わせまたは異なるＲＤＥを含む調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の組み合わせが、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の所望の発現プロファイルを提供するのに使用されてもよい。

[000182]ｍｉｒ１５５の上方調節は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞および免疫学的チャレンジ後のメモリーＴ細胞の形成と関連している。Ｔ細胞（例えば、標的抗原によって活性化されるＣＡＲＴ細胞）の活性化の間のｍｉｒ１５５発現の上方調節は、標的細胞に対するＣＡＲＴ細胞応答を強化するであろう。ｍｉｒ１５５を異種ＲＤＥ（例えば、ＧＡＰＤＨに応答するＲＤＥ）の制御下に置くことは、ｍｉｒ１５５の上方調節をＴ細胞の活性化と結び付け、その結果、ｍｉｒ１５５は活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋、ＣＡＲＴ細胞）で上方調節される。この上方調節は、活性化Ｔ細胞の増殖を増加させることができる。上方調節は、Ｔ細胞消耗および老化を減少させることもできる。上方調節は、Ｔ細胞エフェクター機能を強化し、標的細胞死滅の増加をもたらすこともできる。

[000183]Ｔ細胞のエフェクター機能は、ＴＣＦ７および／もしくはＴｏｘ発現の下方調節、ならびに／またはＩＬ－１５発現の上方調節によって増大させることもできる。ＴＣＦ７は、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス転写活性化因子のＴ細胞因子／リンパ系エンハンサー結合因子ファミリーのメンバーである。この遺伝子はＴ細胞で優勢的に発現され、ナチュラルキラー細胞および自然リンパ系細胞発生において重要な役割を果たす。ＨＭＧボックスタンパク質ＴＣＦ７は、自己再生と分化の間の切り換えの調節因子となり得る。ＴＣＦ７は、部分的に分化したＣＤ３４－状態で活性化される遺伝子を抑制する一方、ＣＤ３４＋細胞の自己再生に特有の遺伝子の発現を促進する上で二重の役割をこなすことができる。ＴＣＦ７は、ナイーブな未分化状態から分化したエフェクター細胞状態に細胞を切り換える転写因子のネットワークを調節することができる。ＴＣＦ７が発現されると、細胞はよりナイーブでより分化されていない自己再生状態をとる。ＴＣＦ７は、例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、および／またはｍｉＲ－５４１－３ｐなどのｍｉＲＮＡを使用して下方調節することができる。一例では、これらのｍｉＲＮＡの１つまたは複数は、転写物がｈｎＲＮＰＬＬによって結合されるとスプライスアウトされるペイロードの１つまたは複数のイントロンにコードされてもよく（上記を参照のこと）、ｈｎＲＮＰＬＬを作る活性化細胞でペイロードが発現されると、これらのｍｉＲＮＡはＴＣＦ７を下方調節するであろう。あるいは、ＴＣＦ７をコードする導入遺伝子が、活性化ＣＡＲＴ細胞のオフスイッチとして使用されてもよい。エフェクター、ＣＡＲＴ細胞が標的がん細胞を死滅させた後でＴＣＦ７が発現される場合、これはＣＡＲＴ細胞をナイーブな未分化状態（ＣＡＲＴ細胞のオフ状態）に追い込むはずである。ＴＣＦ７をコードする導入遺伝子は、誘導性プロモーター（例えば、リガンド誘導性である誘導性プロモーター）の制御下に置かれ得、または細胞活性化の８日以上後で発現をもたらすＲＤＥの制御下に置かれ得る（例えば、実施例１１を参照のこと）。ＴＣＦ７の発現は、リガンド（または誘導性プロモーターの他の誘導因子）の除去によってオフにすることができ、および／またはＲＤＥ制御が発現をオフにするであろう。これは、他のがん細胞で標的リガンドへの結合によって再活性化され得る状態にＣＡＲＴ細胞を戻すことができる。

[000184]胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）タンパク質は、ほぼ同一のＨＭＧ－ボックス配列を共有するタンパク質（ＴＯＸ２、ＴＯＸ３、およびＴＯＸ４）の小さなサブファミリーのメンバーである。ＴＯＸはＴ細胞受容体の高い抗原刺激によって誘導することができ、ＴＯＸはＴ_ＥＸ（消耗Ｔ細胞）の中心的調節因子となり得る。ロバストなＴＯＸ発現は、Ｔ_ＥＸ細胞タイプの発生への関与をもたらすことができる。ＴＯＸ消耗は、慢性抗原刺激の状況でＴ細胞過剰刺激および活性化誘導細胞死を相殺し、バランスを保ち得る。エフェクターＴ細胞（例えば、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞）が低Ｔｏｘを有するのに対し、より高レベルのＴｏｘは、エフェクター細胞をＴ_ＥＸ細胞になるように後押しする。ＴＥＸ細胞はエフェクター機能が低下するが、低レベル感染または少数のがん細胞に対しては依然として有効である。

[000185]Ｔ細胞のエフェクター機能は、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））をコードするペイロードをＲＤＥの調節下に含めることによって増大させることができる。Ｔ細胞の活性化後、ＲＤＥ制御はＴｏｘに対するｍｉＲＮＡの発現をもたらすであろう。このｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞中のＴｏｘのレベルを下げ、活性化Ｔ細胞によるＴ_ＥＸ形成を阻害し、標的に対してより活性なエフェクターＴ細胞をもたらすであろう。さらに、ペイロードは、活性化Ｔ細胞を所望の時間にＴ_ＥＸ表現型に追い込むオフスイッチとして使用されるＴｏｘそれ自体であってもよい。オフスイッチとして使用される場合、Ｔｏｘ発現は、Ｔｏｘを所望の時間に（例えば、適当なリガンドの添加によって）発現するように誘導することができる誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、ＴｏｘはＲＮＡ制御デバイスまたはＤＥによって制御されてもよく（リガンドは発現を誘導することができる）、またはＴｏｘは細胞の活性化後、遅い時間間隔で発現をもたらすＲＤＥの制御下に置かれてもよい（例えば、実施例１１を参照のこと）。Ｔ細胞の機能的状態およびタイプは、電磁放射線でＴ細胞を処置することによって目的に合わせることができる。ＵＶ領域中の電磁放射線は、Ｔｒｅｇ細胞になるようにＴ細胞を調整することができる。例えば、ＵＶＡ／ＵＶＢの線量はＴｒｅｇの形成を誘導し得る。青色光領域中の電磁放射線はＴ細胞を活性化し得る。

[000186]例示的なペイロードは、細胞から分泌されるＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３および／またはＡＰｏＥ４）をコードする導入遺伝子である。ＡｐｏＥは、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）で受容体（例えば、ＬＲＰ８）に結合し、ＭＤＳＣの生存を低減することができる。ＭＤＳＣは、特定の疾患状態で拡大し得る抑制性の自然免疫細胞の不均一な集団である。一部のがん（例えば、黒色腫、肺がん、乳がんおよび卵巣がん）では、ＭＤＳＣレベルは、腫瘍および患者の血漿中で実質的に上昇し得る。高レベルの循環ＭＤＳＣを有するそのような患者は、チェックポイント遮断にあまり応答することができない。ＭＤＳＣは、これらの患者で免疫抑制を媒介し、血管新生を誘導する可能性がある。ＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ４）のペイロード発現は、腫瘍および血清中循環におけるＭＤＳＣの数を低減し、腫瘍進行および転移コロニー形成の抑制をもたらし得る。腫瘍中のＭＤＳＣの低減は、他の免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）が腫瘍細胞をより効率的に死滅させることも可能にする。ＡｐｏＥペイロードは、ＬＲＰ８受容体を発現する骨髄性悪性腫瘍に直接作用することができる。そのような例では、骨髄がん細胞へのＡｐｏＥのペイロード送達は、該がん細胞を抑制および／または死滅させることができる。したがって、ＡｐｏＥは、ＬＲＰ８＋ＡＭＬを含む、ＬＲＰ８＋である骨髄性悪性腫瘍に送達するためのペイロードとなり得る。真核細胞（例えば、初代Ｔ細胞）によるＡｐｏＥペイロードの送達は、例えば、抗がん剤（例えば、ＣＡＲＴ細胞、化学療法剤、放射線、チェックポイント阻害剤、または本明細書に記載された抗がん治療薬のいずれか）などの別の治療剤と組み合わされてもよい。ＭＤＳＣに対するＡｐｏＥ効果は、他の抗がん剤の作用を強化することができる。

[000187]別の例示的なペイロードは、ＮＯ合成酵素（例えば、ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳ）をコードする導入遺伝子である。ＮＯシンターゼはＧＡＰＤＨに結合することができ、細胞が活性化され、解糖が誘導されるとＧＡＰＤＨを隔離し、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）制御導入遺伝子（または天然遺伝子）を発現できるようにする、またはＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２））制御導入遺伝子（または天然遺伝子）からの発現を増加させることができる。ＮＯシンターゼの発現は、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）制御発現を誘導することができ（ＧＡＰＤＨへの結合により）、ならびに／またはＲＤＥを結合し得るＧＡＰＤＨの量を減少させ、および／もしくはＧＡＰＤＨがＲＤＥに結合できない時間を増加させてＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）制御発現を強化することができる。ＮＯシンターゼが細胞活性化に対するＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）応答を増加させるのに使用される場合、ＮＯシンターゼをコードする導入遺伝子は、ＲＤＥの制御下に置かれてもよく、その結果、細胞が活性化されると、ＮＯシンターゼをコードする導入遺伝子からの発現が誘導される。ＮＯシンターゼがＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）制御遺伝子からの発現を誘導するのに使用される場合、ＮＯシンターゼは誘導性制御下に置かれてもよく（例えば、あらゆる目的のためにその全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７７７，０６４に開示されている誘導性プロモーター、ＲＮＡ制御デバイス、または不安定化エレメント）、ＮＯシンターゼ発現の誘導は、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨによって結合された）制御遺伝子からの発現を誘導する。

[000188]例示的なペイロードは、ＨＳＶ－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする導入遺伝子である。ＨＳＶ－ＴＫは、アジュバントとして、および／または患者において炎症性応答を誘導するスーパー抗原として使用することができる。このようにして使用される場合、細胞は標的部位でＨＳＶ－ＴＫペイロードを分泌し、炎症性応答を誘導する。ＨＳＶ－ＴＫをコードする導入遺伝子は、操作された細胞（例えば、ＲＤＥ制御ペイロードを含むまたは含まないＣＡＲＴ細胞）を排除するためのキルスイッチとして使用することもできる。キルスイッチとして使用される場合、ＨＳＶ－ＴＫは後期発現ＲＤＥによって制御されてもよく、そのためＨＳＶ－ＴＫはＣＡＲＴ細胞は標的部位で作用した後で発現され、またはＨＳＶ－ＴＫを発現する導入遺伝子はリガンド誘導性制御手段によって制御されてもよく、その結果、ＨＳＶ－ＴＫタンパク質は所望の時間に導入されるリガンドに応答して発現される。キルスイッチ適用では、ガンシクロビルが細胞に提供されてもよく、ＨＳＶ－ＴＫは、細胞傷害性効果によって細胞を死滅させるＧＣＶ三リン酸にガンシクロビルを変換する。ＨＳＶ－ＴＫを発現する導入遺伝子はウイルスペイロードに含めることもでき、その結果、ウイルスが標的細胞を感染させると、標的細胞はＨＳＶ－ＴＫを発現する。ＨＳＶ－ＴＫを使用して標的細胞に毒性であるＧＣＶ三リン酸にガンシクロビルを変換する標的細胞に、ガンシクロビルが提供される。

[000189]チミジンキナーゼは、例えば、［^１８Ｆ］９－（４－［^１８Ｆ］－フルオロ－３－ヒドロキシメチルブチル）－グアニン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）によってリン酸化されると細胞内に保持されるようになる、または５－（７６）Ｂｒ－ブロモ－２’－フルオロ－２’－デオキシウリジンであるフッ素１８標識ペンシクロビルアナログなどのＰＥＴレポータープローブと共に使用することができる。各ＰＥＴレポーターに適したレポータープローブは、当業者に周知である。ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体の例示的なレポータープローブは、３－（２’－［^１８Ｆ］フルオロエチル）スピペロン（ＦＥＳＰ）である（ＭａｃＬａｒｅｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６（５）：７８５～９１頁（１９９９））。ヨウ化ナトリウムトランスポーターの例示的なレポータープローブは、トランスポーターによる輸送後に細胞中に保持される^１２４Ｉである。デオキシシチジンキナーゼの例示的なレポータープローブは、２’－デオキシ－２’－^１８Ｆ－５－エチル－１－β－ｄ－アラビノフラノシルウラシル（^１８Ｆ－ＦＥＡＵ）である。ソマトスタチン受容体サブタイプ２の例示的なレポータープローブは、^１１１Ｉｎ－、^{９９ｍ／９４ｍ}Ｔｃ－、^９０Ｙ－、または^１７７Ｌｕ標識オクトレオチドアナログ、例えば^９０Ｙ－、または^１７７Ｌｕ－標識ＤＯＴＡＴＯＣ（Ｚｈａｎｇら、ＪＮｕｃｌＭｅｄ．５０（ｓｕｐｐｌ２）：３２３頁（２００９））；^６８Ｇａ－ＤＯＴＡＴＡＴＥ；および^１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡＢＡＳＳである（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｄｅｒら、ＪＮｕｃｌＭｅｄ．５４（２）：１６７～１７２頁（２０１３）を参照のこと）。ノルエピネフリントランスポーターの例示的なレポータープローブは、^１１Ｃ－ｍ－ヒドロキシエフェドリン（Ｂｕｕｒｓｍａら、ＪＮｕｃｌＭｅｄ．４６：２０６８～２０７５頁（２００５））。カンナビノイド受容体の例示的なレポータープローブは、^１１Ｃ－標識ＣＢ２リガンド、^１１Ｃ－ＧＷ４０５８３３である（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅら、ＪＮｕｃｌＭｅｄ．５２（７）：１１０２～１１０９頁（２０１１））。グルコーストランスポーターの例示的なレポータープローブは、［^１８Ｆ］フルオロ－２－デオキシ－ｄ－グルコースである（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、Ｈ．Ｒ．、ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ５１：１９１～２０４頁（２００４））。チロシナーゼの例示的なレポータープローブは、Ｎ－（２－（ジエチルアミノ）エチル）－^１８Ｆ－５－フルオロピコリンアミドである（Ｑｉｎら、ＳｃｉＲｅｐ．３：１４９０頁（２０１３））。他のレポータープローブは当技術分野では、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｇｈｏｕｂｉら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ２（４）：３７４～３９１頁（２０１２）に記載されている。

[000190]β－ガラクトシダーゼの例示的な光音響レポータープローブは、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトシド（Ｘ－ｇａｌ）である（Ｌｉら、ＪＢｉｏｍｅｄＯｐｔ．１２（２）：０２０５０４頁（２００７））。例示的なＸ線レポーターには、特に、ソマトスタチン受容体２、または他のタイプの受容体ベースの結合剤が挙げられる。レポータープローブは、レポータープローブに結合され、例えば、Ｘ線またはコンピュータ断層撮影によって画像化される放射線不透過性標識部分を有してもよい。例示的な放射線不透過性標識は、ヨウ素、特にポリヨウ素化化学基（例えば、米国特許第５，１４１，７３９号を参照のこと）、および常磁性標識（例えば、ガドリニウム）であり、これらは従来の手段によってレポータープローブに付着させることができる。光学イメージング剤には、例えば、蛍光ポリペプチドが挙げられる。蛍光ポリペプチドには、例えば、オワンクラゲまたはウミシイタケ由来の緑色蛍光タンパク質、およびそれらの活性バリアント（例えば、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等）；ハイドロイドクラゲ、カイアシ類（Ｃｏｐｅｐｏｄ）、クシクラゲ類（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）、花虫綱（Ａｎｔｈｒｏｚｏａｓ）、およびサンゴイソギンチャク由来の蛍光タンパク質、およびそれらの活性バリアント；ならびにフィコビリタンパク質およびその活性バリアントが挙げられる。光学イメージング剤は、生物発光ポリペプチドでもあってもよい。これらには、例えば、エクオリン（および他のＣａ^＋２制御光タンパク質）、ルシフェリン基質に基づくルシフェラーゼ、セレンテラジン基質に基づくルシフェラーゼ（例えば、レニラ、ガウシア、およびメトリディア）、およびウミホタル由来のルシフェラーゼ、およびそれらの活性バリアントが挙げられる。

[000191]ＣＡＲＳおよび／またはユニバーサルＣＡＲは、細菌、真菌またはウイルス起源である抗原に対する受容体を含むように設計されてもよい。ＣＡＲＳは、免疫低下患者における毒性の供給源である感染と戦うために利用することができるため、そのような抗病原体ＣＡＲＳがＴＡＡに特異的なＣＡＲＳＴ細胞療法と併用して使用されてもよい。

[000192]真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを介して特異的抗原に結合し、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドにシグナルを真核細胞へ伝達させることができ、その結果として、真核細胞が活性化され得、そのため適当なＲＤＥ－導入遺伝子を発現し得る。ＣＡＲＳを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類およびＣＡＲＳの細胞内エレメントに応じて異なる。真核細胞は、ＣＡＲＳを通じた真核細胞の刺激時のエフェクター機能に細胞を備えさせるＲＤＥ転写物を発現することができる。

[000193]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、疾患を処置するための治療剤として使用することができる。治療剤は、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を活性成分として含むことができ、適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物用の薬学的に許容される賦形剤が挙げられる。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞が投与される疾患は、疾患が真核細胞および／またはＲＤＥ－導入遺伝子の産物に対して感受性を示す限り、特に限定されない。

[000194]処置され得る疾患の例には、がん（血液がん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症、他の免疫媒介性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患、ならびに糖尿病のような代謝疾患が挙げられる。受容体（例えば、ＣＡＲ）は、真核細胞を病変細胞に標的化することができ、病変細胞で受容体がその標的に結合すると受容体は真核細胞にシグナルを送り、ＲＤＥ－導入遺伝子の発現をもたらすことができる。ＲＤＥ－導入遺伝子は、病変細胞を処置または死滅させる上で有用なポリペプチドをコードする。がんおよび／または固形腫瘍は、腫瘍関連（またはがん関連）抗原、例えば上記したものに結合する受容体を発現する真核細胞で処置することができる。受容体が腫瘍関連抗原に結合すると、受容体は細胞にシグナルを送り、細胞はＲＤＥ－導入遺伝子を発現する（例えば、シグナルは、ＲＤＥ－転写物の発現をもたらすＲＤＥ結合タンパク質を生じさせる）。ＲＤＥ－転写物は、真核細胞ががんを処置し、および／またはＲＤＥ－転写物がそれ自体がんを処置するポリペプチド（例えば、細胞傷害性ポリペプチド）をコードするように、真核細胞を活性化するポリペプチドをコードすることができる。

[000195]自己免疫疾患（例えば、尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病）は、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または自己免疫疾患に関連する免疫タンパク質に結合する他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞で処置することができる。受容体またはターゲティングポリペプチドは、自己免疫疾患の処置において有用なポリペプチドをコードするＲＤＥ－導入遺伝子の発現の引き金を引くことができる（例えば、ポリペプチドは、自己免疫疾患を引き起こす細胞を調節することができ、またはこれらの細胞を死滅させることができる）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患と関わる抗体を作る細胞を標的化することができる（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、抗体産生細胞を死滅させる、またはこれらの細胞による抗体の産生を阻害するポリペプチドをコードすることができる）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患と関わるＴリンパ球を標的化することができる（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、標的Ｔリンパ球を死滅させる、またはＴリンパ球の活性を調節するポリペプチドをコードすることができる）。

[000196]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、アレルギーを処置するための治療剤として使用されてもよい。処置され得るアレルギーの例には、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対するアレルギーが挙げられる。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こす抗体を作る細胞を標的化することができる。標的化細胞は、Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、プレＢ細胞、および前駆Ｂ細胞の１つまたは複数であってもよい。標的化細胞には、例えば、花粉、動物の鱗屑、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、魚介類、甲殻類、および大豆に対してアレルギー反応を引き起こすＴリンパ球も含まれてもよい。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプ決定基に結合することができる。

[000197]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、疾患または状態の処置のために投与されてもよい。例えば、真核細胞は、感染症を処置するために利用されてもよい。真核細胞は、感染症病原体またはそのような病原体に感染した細胞で見出される抗原に結合する受容体またはターゲティングポリペプチドを発現することができる。受容体またはターゲティングポリペプチドは、感染症と関連する抗原を結合し、真核細胞にシグナルを送り、真核細胞はＲＤＥ－導入遺伝子の発現をもたらす。ＲＤＥ－導入遺伝子は、感染症を処置するために真核細胞を活性化することができる産物をコードする（例えば、真核細胞は、細胞傷害性ポリペプチドまたは免疫細胞を活性化するサイトカインを産生することができる）。ＲＤＥ－導入遺伝子は、それ自体が細胞傷害性ポリペプチドまたはサイトカインであるポリペプチドもコードすることができる。真核細胞は、例えば、骨髄移植または放射線への曝露、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等の後で、感染症の予防に利用する（予防的に使用する）こともできる。

[000198]ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を活性成分として含む治療剤は、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内に、または輸入リンパ管へ、非経口投与、例えば、注射または注入によって投与することができるが、投与経路は限定されない。

[000199]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに必要に応じて、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体もしくはターゲティングポリペプチドは、攻撃的な抗腫瘍特性を有するＴリンパ球、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる、Ｐｅｇｒａｍら、ＣＤ２８ｚＣＡＲｓａｎｄａｒｍｏｒｅｄＣＡＲｓ、２０１４、ＣａｎｃｅｒＪ．２０（２）：１２７～１３３頁に記載されているものと共に使用されてもよい。ＲＤＥ転写物は、攻撃的な抗腫瘍特性をＴリンパ球にもたらすポリペプチドをコードしてもよい。

[000200]導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅＣＡＲポリペプチドは、ＩＬ－２をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲまたはＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲ由来のＲＤＥによって制御されてもよい。これらのＲＤＥは、ＲＤＥで見出されるマイクロＲＮＡ部位を不活性化するように修飾されてもよい。これらの制御エレメントの使用は、ＲＤＥとグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）との相互作用により、宿主細胞の解糖状態の変化に対してＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子の発現を感受性にする。宿主細胞が静止状態にあるとき、ＧＡＰＤＨの大部分は解糖に関与せず、ＲＤＥに結合することができ、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドをコードする転写物の翻訳の低下をもたらす。グルコース、または解糖活性を増加させる他の小分子を宿主細胞に提供することによって、解糖を増加させるように宿主細胞が誘導されると、ＧＡＰＤＨは酵素的に活性になり、ＲＤＥに結合することができない。ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合の低下は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、または他の導入遺伝子をコードする転写物の翻訳を増加させる（例えば、転写物の半減期を増加させる、および／または翻訳速度を高めることによって）。ＧＡＰＤＨの解糖活性は、トリオースイソメラーゼの量および／または活性を増加させることによって増加されてもよい。宿主細胞は、組換えトリオースイソメラーゼを過剰発現するように誘導されてもよく、この過剰発現はＧＡＰＤＨの解糖活性を増加させる。ＲＤＥを含む転写物の発現を減少させるために、解糖阻害剤が添加されてもよい。そのような解糖阻害剤には、例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨード酢酸、フッ化物、オキサミン酸、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、キノン（例えば、クロロキン、ヒドロキシクロロキン等）、または例えば、デヒドロエピアンドロステロンなどの他の代謝阻害剤が挙げられる。ＲＤＥ制御転写物からの発現は、ＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）によるＲＤＥの結合を阻害するＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）阻害剤の添加によって増加されてもよい。そのようなＧＡＰＤＨ阻害剤には、例えば、ＣＧＰ３４６６Ｂマレエートまたはヘプテリジン酸（両方ともＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により販売されている）、ペンタレノラクトン、または３－ブロモピルビン酸が挙げられる。例えば、クロロキンおよびヒドロキシクロロキンなどのキノンは、ＡＰＣによる抗原プロセシングを損なうエンドソームを脱酸し、ｔｏｌｌ様受容体からのシグナル伝達を減少させ、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞代謝活性、Ｔ細胞サイトカイン分泌を低下させ、ＩＬ－２産生を妨げ、ＩＬ－２に対するＴ細胞応答を妨げることができる。

[000201]ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物は、真核細胞で発現されて、ＲＤＥ結合タンパク質に結合し、そのため細胞中の天然の転写物と相互作用するそれらのＲＤＥ結合タンパク質の能力を低下させることができる。組換え転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質の結合を競合し得、これが、ＲＤＥ結合タンパク質による真核細胞内の天然の転写物の阻害および／または活性化を低下させ得る。ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物はこのように使用されて、天然の転写物が真核細胞でいつおよびどのように発現されるかを変化させることができる。真核細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＢ細胞であってもよく、組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性転写物と共有されるＲＤＥを（例えば、それらの３’非翻訳領域に）有する。組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドの発現を調節し、サイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドを発現するために必要とされる閾値（例えば、ＧＡＰＤＨの解糖活性）を変化させるＲＤＥ結合タンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨおよび／または上記した他の解糖系酵素）と結合を競合し得る。これは、免疫細胞の刺激（例えば、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体を通じた）に応答してより高量のサイトカインおよび／または細胞傷害性タンパク質（より大きなＣ_ｍａｘ）を分泌するであろうスーパーＴ細胞（別名、アングリーＴ細胞（ＡｎｇｒｙＴ－ｃｅｌｌ）またはホーネットＴ細胞（ＨｏｒｎｅｔＴ－ｃｅｌｌ））を作出するのに使用され得る。Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体によって刺激されると、Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２および他のエフェクターポリペプチドをより速い動態で産生するように、Ｔ細胞は、ＩＬ－２転写物由来のＲＤＥをコードする組換え転写物によりリプログラミングされてもよい。これらのリプログラミングＴ細胞は、他の炎症性サイトカインおよび細胞傷害性ポリペプチド（例えば、グランザイムおよび／またはパーフォリン）をより大量におよびより速い動態で産生することもできる。Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞をそのようなアングリー／ホーネット状態にリプログラミングすることは、例えば、腫瘍、他のがん、および感染症を含む疾患および障害の処置に有用であり得る。

[000202]ＲＤＥは、免疫細胞でのＣＡＲ発現を、それらの免疫細胞が標的によってまたは所望の時間に活性化されるまで低下させるのに使用することができる。これは、ＣＡＲへの対象の全身曝露を低減する一方で、治療効果にとって所望の時間にＣＡＲの発現をもたらし得る。全身曝露の低減は、対象の免疫系が時間と共により少ないＣＡＲを経験することになるため、ＣＡＲに対する免疫応答の発生を低減および／または阻害し得る。

[000203]受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）発現の制御は、免疫療法のＰＫ－ＰＤ軸を調節するのに使用することができる。細胞の表面で発現される受容体の量は、プロモーターの強度、プロモーターの誘導性、２つのシストロンを発現する異なるプロモーター強度を有する二シストロン性構築物の使用、ＲＤＥ（ＲＤＥの選択は、発現のダイナミックレンジおよびタイミングに影響を与える）、転写物のＧＣ３含量、ＲＮＡ制御デバイス、デグロンおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲによりモジュレートされ得る。単独でまたは組み合わせて使用されるこれらの制御エレメントは、細胞表面の受容体の量を変化させ、これが細胞を活性化するのに必要とされるインプットシグナル（例えば、受容体のリガンドの量）を変化させ、その結果、アウトプット（例えば、ペイロード送達または標的細胞死滅）をもたらす。この制御を使用して、受容体細胞に必要とされるインプットシグナルは、所与の標的、身体区画、副作用の低減等に関して望み通りに最適化され得る。ＲＤＥは、受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）での活性化後、細胞からのアウトプットのタイミングを変化させるのに使用することもできる。

[000204]いくつかの神経変性疾患および症候群は、多くの他の非神経疾患および症候群と同じように炎症と関連している。そのような炎症関連疾患は、免疫細胞内の阻害性ＲＤＥ結合タンパク質の利用可能性を高める小分子（または他の分子）を対象に提供することによって、少なくとも部分的に処置され得る。そのような小分子には、例えば、解糖阻害剤（例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨード酢酸、フッ化物、オキサミン酸、プログリタゾン、ジクロロ酢酸）、他の代謝阻害剤（例えば、デヒドロエピアンドロステロン）等が挙げられる。例えば、解糖阻害剤は、細胞における解糖を低下させ、ＲＤＥに結合する遊離ＧＡＰＤＨ（解糖に関与しない）の量を増加させ、これらの転写物の発現を低下させることができる。免疫細胞中のいくつかの炎症性遺伝子産物（例えば、免疫系を活性化する遺伝子産物）は、ＧＡＰＤＨを結合することができるＲＤＥによって調節される。解糖の減少は、ＲＤＥ結合のための遊離ＧＡＰＤＨの量を増加させ、これらの炎症性遺伝子のＲＤＥに結合されるＧＡＰＤＨの量を増加させ、これらの炎症性遺伝子の発現を低下させる。炎症性遺伝子には、例えば、ＩＬ－１、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－ｇ、およびＧＭ－ＣＳＦなどの炎症誘発性サイトカインが挙げられる。これらのサイトカインは、ＧＡＰＤＨを含むＲＤＥ結合タンパク質を結合してそれらの発現を調節することができるＲＤＥを含む３’－ＵＴＲを有する。増加したＧＡＰＤＨはこれらのＲＤＥに結合し、これらの炎症誘発性サイトカインの発現を減少させることができる。炎症誘発性サイトカインの発現の低下は、これらの対象における免疫系の活性を低下させ、炎症を低下させ得る。炎症の低下はプラスの治療効果を与え得、これらの炎症関連神経疾患、ならびに他の炎症関連疾患および症候群の症状を軽減し、および／または基礎病態を処置し得る。

[000205]ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現を提供し、その時点でポリペプチドの所望の量を提供するように選択することができる。ＲＤＥは、ポリペプチドの所望の曲線下面積を提供するように選択することもできる。実施例２０の表２に示されているように、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時間に最大発現率に達した。また、表１に示されているように、異なるＲＤＥは、時間と共に異なるプロファイルを有する異なる発現量を提供し、異なるＡＵＣを示した。これらのＲＤＥを異なる導入遺伝子と組み合わせて使用することは、細胞の活性化後、異なる導入遺伝子が、互いとの関連でいつ最大発現率に達するかという時間的プログラミングを可能にする。さらに、異なるＲＤＥを使用することで、導入遺伝子コードポリペプチドの所望の量、および／または導入遺伝子によってコードされるポリペプチドのＡＵＣもしくは該ポリペプチドへの曝露の所望の量を発現するように、導入遺伝子をプログラミングすることができるようになる。したがって、ＲＤＥは、異なる導入遺伝子ポリペプチドの所望の量を、異なる（または同じ）所望の時間に産生する制御を提供するのに使用することができる。

[000206]この時間的制御は、細胞内で異なる導入遺伝子ポリペプチドを産生するための所望のタイミングを提供するのに使用されてもよい。この時間的制御を使用して細胞がプログラミングされて、後で発現される第２の導入遺伝子のポリペプチドによって影響を受ける準備をするように細胞の状態を変更する第１の導入遺伝子を発現させてもよい。例えば、第１の発現ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチド（例えば、グランザイムおよび／またはパーフォリン）を作り、貯蔵するように細胞を誘導し得、第２の発現ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチドの放出に関与し得る。時間的発現の別の例は、２つ以上の遺伝子産物の時間的発現を必要とする変化（例えば、分化または細胞の状態の変化）を受けるように細胞をプログラミングするための使用を含む。ＲＤＥは、この時間的発現を模倣し、細胞がいつその状態を変化させるかまたは分化するか（例えば、幹細胞のプログラム化された分化）を制御できるようにするために使用されてもよい。幹細胞例では、時間的制御および誘導制御は、幹細胞を所望の細胞タイプに分化させることが望ましい時（および場所）で分化するように、幹細胞をプログラミングするのに使用され得る。

[000207]時間的制御は、細胞の外側で異なる導入遺伝子ポリペプチドを産生する所望のタイミングを提供するのに使用することもできる。この時間的制御を使用して、標的細胞が、第２の導入遺伝子から後で発現されるポリペプチドの作用を受ける準備ができるように、細胞は活性化され得、標的細胞を調整および／または変更する第１の導入遺伝子ポリペプチドを分泌し得る。例えば、第１のポリペプチドは、標的細胞表面（例えば、ＦａｓＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１１等）で受容体を、または細胞中でポリペプチドを発現するように標的細胞を誘導し得る。第１の導入遺伝子はまた、標的細胞の状態を変化させるように該細胞を誘導する因子を分泌するように細胞を誘導し得る（例えば、第１の導入遺伝子は、標的細胞に標的細胞表面でＯＸ４０を発現させるＣｐＧを分泌する細胞を誘導し得る）。後で最大発現率に達する第２の導入遺伝子は、誘導された表面受容体（例えば、ＦａｓＬ、ハーセプチン、リツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、抗ＯＸ４０抗体等）に作用するポリペプチドをコードすることができる。時間的制御および誘導制御は、第１のポリペプチドが標的細胞を誘導してその状態（例えば、分化）を変更し、その結果、第２のポリペプチド（等、後で最大発現率に達する追加の導入遺伝子ポリペプチドのための）の作用を標的細胞が受け得るタイミングでポリペプチドを標的細胞に提供することによって、標的細胞の状態または分化を変化させるのに使用することもできる。

[000208]自己免疫疾患および過活動免疫系を伴う他の疾患状態（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）は、自己免疫疾患抗原に対して標的化されたΔＩＴＡＭＣＡＲＴ細胞で処置することができる。ΔＩＴＡＭＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０または他の免疫抑制薬のペイロードを含むことができる。ペイロードを含むまたは含まないΔＩＴＡＭＣＡＲＴ細胞は、自己免疫疾患を阻害する、および／または免疫系の過剰刺激もしくは慢性的刺激によって引き起こされる毒性を低下させることができるＴｒｅｇの形成を誘導し得る。

[000209]動態パラメーターが異なるＲＤＥ（Ｇｏｌｄエレメント）（例えば、細胞の活性化後早期の急速な発現と、その後の急速な発現の低下をもたらすＲＤＥ、または細胞活性化後２～３日間にわたり発現を遅らせるＲＤＥ）を使用して処置され得る疾患およびペイロードのいくつかの例には、以下が挙げられる：抗ＤＬＬ３ＣＡＲならびに、１つまたは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／または抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを使用するＤＬＬ３陽性がん（ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ、黒色腫、およびＳＣＬＣなど）。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＤＬＬ３ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＤＬＬ３に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＤＬＬ３ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。抗ＣＤ１９ＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを使用するＣＤ１９陽性リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ１９に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。変異したシアリル化を認識する抗腫瘍ＣＤ４３ＣＡＲ、ならびに１つもしくは複数の抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗抗ＣＸＣＲ４抗体、もしくはＩＬ－１２、および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを使用する、オンコ－ＣＤ４３（シアリル化変異体）を有するＡＭＬ。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗オンコＣＤ４３ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、オンコ－ＣＤ４３に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗オンコＣＤ４３ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。抗ＰＳＣＡＣＡＲ、ならびにヘパリナーゼもしくはＩＬ－１２、および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを使用するＰＳＣＡ陽性前立腺がん、膀胱がんまたは膵臓がん。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＰＳＣＡＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＰＳＣＡに結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＰＳＣＡＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。がん精巣抗原、ミスフォールドまたは変異体ＥＧＦＲ（トリプルネガティブ乳がんに関連した）、および／または葉酸受容体アルファペプチドを認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるトリプルネガティブ乳がん。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗がん精巣抗原ＣＡＲ、抗ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲＣＡＲ、または抗葉酸受容体アルファＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、がん精巣抗原、ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲ（トリプルネガティブ乳がんと関連した）、および／または葉酸受容体アルファペプチドに結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗がん精巣抗原ＣＡＲ、抗ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲＣＡＲ、または抗葉酸受容体アルファＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ＳＥＺ６を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるＳＥＺ６陽性小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、神経内分泌がん（例えば、甲状腺髄様がん）、大細胞肺がん（ＬＣＬＣ）、および悪性褐色細胞腫。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＳＥＺ６ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＳＥＺ６に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＳＥＺ６ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ＲＮＦ４３を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるＲＮＦ４３陽性結腸直腸がん、結腸がん、および子宮内膜がん。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＲＮＦ４３ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＲＮＦ４３に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＲＮＦ４３ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ＴｎＭＵＣ１を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、

ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるＴｎＭＵＣ１陽性乳がんまたは膵臓がん。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＴｎＭＵＣ１に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ネクチン４を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるネクチン４陽性尿路上皮がん、ＮＳＣＬＣ、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がん、および他の固形腫瘍。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ネクチン４ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ネクチン４に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ネクチン４ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ＥＦＮＡ４を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるＥＦＮＡ４陽性トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、および他の固形腫瘍。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＥＦＮＡ４ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＥＦＮＡ４に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＥＦＮＡ４ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。ＧＰＣ３を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２および／または１つもしくは複数の抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（完全長および単鎖抗体などの断片を含む）のペイロードを用いるＧＰＣ３陽性肝細胞癌、肺がんおよび他の固形腫瘍。必要に応じて、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＧＰＣ３ＣＡＲは、上記した別の療法と併用されまたは連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＧＰＣ３に結合するＡＤＣであってもよい。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＧＰＣ３ＣＡＲの投与の前、同時、または後で対象に提供することができる。

[000210]概して、ＲＤＥ制御導入遺伝子を含むまたは含まない上記のＣＡＲ細胞のいずれかを、別の分子（例えば、別の療法）と組み合わせて使用することができ、または連続して投与することができる。例えば、当該別の分子は、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子薬、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、生物製剤、または先述の任意の組み合わせであり得る。当該抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、本明細書において説明されるものを含む。ＡＤＣは、ＣＡＲと同じ抗原に結合することができ、または別の抗原に結合することもできる。ＡＤＣおよびＣＡＲが、同じ抗原に結合する場合、それらは、当該同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合し得る。ＡＤＣおよびＣＡＲ療法（ＲＤＥ制御ペイロードを含むまたは含まない）は、同時に提供することができ、または、一方を他方の前に対象に投与することもできる。例えば、ＡＤＣおよびＣＡＲは、腫瘍関連抗原を標的にすることができ、ＡＤＣは、腫瘍量を減少させるために、最初に対象に投与することができ、次いで、残りのがん細胞を除去するために、ＣＡＲ療法が投与される。

[000211]本発明は、以下の実験の詳細を参照することによって、さらによく理解されるであろう。しかしながら、当業者は、説明される特定の方法および結果は、下記の特許請求の範囲においてより完全に説明される本発明を単に例示するためのものであることを容易に理解するであろう。特に明記されない限り、本開示は、特定の手順、材料などに制限されず、そのため、それらは変更してもよい。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、制限であることを意図しないことも理解されるべきである。

実施例１．ＲＤＥ－ＣＡＲによるＴ細胞エフェクター活性の制御
[000212]ＲＤＥＣＡＲが、ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される第三世代抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、およびＩＬ－２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ番号：ＮＭ＿０００５８６．３）（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をコードする遺伝子の’３’－ＵＴＲを使用して作製される。ＩＬ－２３’－ＵＴＲをコードする核酸を操作して、適切な発現ベクターの抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットに入れる。使用するＩＬ－２、３’－ＵＴＲは、
ｔａａｔｔａａｇｔｇｃｔｔｃｃｃａｃｔｔａａａａｃａｔａｔｃａｇｇｃｃｔｔｃｔＡＴＴＴＡＴＴＴＡａａｔＡＴＴＴＡａａｔｔｔｔａｔＡＴＴＴＡｔｔｇｔｔｇａａｔｇｔａｔｇｇｔｔｔｇｃｔａｃｃｔａｔｔｇｔａａｃｔａｔｔａｔｔｃｔｔａａｔｃｔｔａａａａｃｔａｔａａａｔａｔｇｇａｔｃｔｔｔｔａｔｇａｔｔｃｔｔｔｔｔｇｔａａｇｃｃｃｔａｇｇｇｇｃｔｃｔａａａａｔｇｇｔｔｔｃａｃｔｔＡＴＴＴＡｔｃｃｃａａａａｔＡＴＴＴＡｔｔａｔｔａｔｇｔｔｇａａｔｇｔｔａａａｔａｔａｇｔａｔｃｔａｔｇｔａｇａｔｔｇｇｔｔａｇｔａａａａｃｔＡＴＴＴＡａｔａａａｔｔｔｇａｔａａａｔａｔａａａ（配列番号２１）
であった。

[000213]当該抗ＣＤ１９ＲＤＥＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲ構築物が、常法によってＴ細胞（初代ヒトＴ細胞）の異なる集団にトランスフェクトされ、Ｔ細胞の安定な集団が、適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用して選択される。抗ＣＤ１９ＲＤＥＣＡＲ（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）を伴うＴ細胞集団および抗ＣＤ１９ＣＡＲ（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）を伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化され、脱ビーズ後に静止状態へと戻される。

[000214]静止状態の抗ＣＤ１９ＲＤＥＣＡＲＴ細胞は、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥＣＡＲＴ細胞：Ｒａｊｉ標的比においてＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と共に共培養される。解糖アクティベーターグルコースが、１．０ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、および１０ｍＭ）において、当該培養培地に加えられる。当該ＲＤＥ－ＣＡＲＴ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に２４時間培養される。培養物は洗浄され、次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬によって染色され、続いて、ＣＤ２２^＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（ＳｍａｒｔＣＡＲＴ細胞）がカウントされる。これらの測定は、標的細胞致死率（例えば、半減期）および、ＲＤＥ－ＣＡＲ発現の異なるレベルでのＲＤＥ－ＣＡＲＴ細胞の増殖率を特定するであろう。

[000215]活性化された抗ＣＤ１９ＲＤＥＣＡＲＴ細胞は、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥＣＡＲＴ細胞：Ｒａｊｉ標的比においてＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と共に共培養される。解糖アクティベーターグルコースが、１．０ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、および１０ｍＭ）において、当該培養培地に加えられる。当該ＲＤＥ－ＣＡＲＴ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に２４時間培養される。当該培養培地から試料を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２に対して試験される。

[000216]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ＣＡＲＴが、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲＴ細胞：Ｒａｊｉ標的比においてＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と共に共培養される。解糖アクティベーターグルコースが、１．０ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、および１０ｍＭ）において、当該培養培地に加えられる。当該ＣＡＲＴ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に２４時間培養される。培養物は洗浄され、次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬によって染色され、続いて、ＣＤ２２^＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（ＣＡＲＴ細胞）がカウントされる。

[000217]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ＣＡＲＴが、２：１，５：１，および１０：１のＣＡＲＴ細胞：Ｒａｊｉ標的比においてＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と共に共培養される。解糖アクティベーターグルコースが、１．０ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、および１０ｍＭ）において、当該培養培地に加えられる。当該ＣＡＲＴ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に４８時間培養される。当該培養培地から試料を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２に対して試験される。

実施例２：ＲＤＥからＭｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の除去
[000218]ＩＬ－２の３’－ＵＴＲからのＡＵリッチエレメントは、ｍｉｒ－１８１およびｍｉｒ－１８６ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位の様々な組み合わせをＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した。ＭＩＲ１８６ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ部位をＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを伴う構築物からの発現のダイナミックレンジは、５０倍に増加した。改変されたＩＬ－２，３’－ＵＴＲは、配列のＣＴＴをＧＡＡで置き換えられ、下記に示される（新たなＧＡＡは、配列において下線が引かれている）：
ｔａａｔｔａａｇｔｇｃｔｔｃｃｃａｃｔｔａａａａｃａｔａｔｃａｇｇｃｃｔｔｃｔＡＴＴＴＡＴＴＴＡａａｔＡＴＴＴＡａａｔｔｔｔａｔＡＴＴＴＡｔｔｇｔｔｇａａｔｇｔａｔｇｇｔｔｔｇｃｔａｃｃｔａｔｔｇｔａａｃｔａｔｔａｔｔｃｔｔａａｔｃｔｔａａａａｃｔａｔａａａｔａｔｇｇａｔｃｔｔｔｔａｔｇａｔｔＧＡＡｔｔｔｇｔａａｇｃｃｃｔａｇｇｇｇｃｔｃｔａａａａｔｇｇｔｔｔｃａｃｔｔＡＴＴＴＡｔｃｃｃａａａａｔＡＴＴＴＡｔｔａｔｔａｔｇｔｔｇａａｔｇｔｔａａａｔａｔａｇｔａｔｃｔａｔｇｔａｇａｔｔｇｇｔｔａｇｔａａａａｃｔＡＴＴＴＡａｔａａａｔｔｔｇａｔａａａｔａｔａａａ（配列番号２２）

[000219]ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲからのＡＵリッチエレメントは、ｍｉｒ－１２５として特徴付けられるｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ結合部位も有する。ＩＦＮｇＲＤＥの配列は、以下の通りである：
ｔｇｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇｃａａｔａｔｔｔｇａａｔｔｔｔａａａｔｃｔａａａｔｃｔＡＴＴＴＡｔｔａａｔＡＴＴＴＡａｃａｔｔＡＴＴＴＡｔａｔｇｇｇｇａａｔａｔａｔｔｔｔｔａｇａｃｔｃａｔｃａａｔｃａａａｔａａｇｔＡＴＴＴＡｔａａｔａｇｃａａｃｔｔｔｔｇｔｇｔａａｔｇａａａａｔｇａａｔａｔｃｔａｔｔａａｔａｔａｔｇｔａｔｔＡＴＴＴＡｔａａｔｔｃｃｔａｔａｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｇｔｃｔｃａｃｔｔａａｔｃｃｔｔｔｇｔｔｔｔｃｔｇａｃｔａａｔｔａｇｇｃａａｇｇｃｔａｔｇｔｇａｔｔａｃａａｇｇｃｔｔｔａｔｃｔｃａｇｇｇｇｃｃａａｃｔａｇｇｃａｇｃｃａａｃｃｔａａｇｃａａｇａｔｃｃｃａｔｇｇｇｔｔｇｔｇｔｇｔｔｔａｔｔｔｃａｃｔｔｇａｔｇａｔａｃａａｔｇａａｃａｃｔｔａｔａａｇｔｇａａｇｔｇａｔａｃｔａｔｃｃａｇｔｔａｃｔｇｃｃｇｇｔｔｔｇａａａａｔａｔｇｃｃｔｇｃａａｔｃｔｇａｇｃｃａｇｔｇｃｔｔｔａａｔｇｇｃａｔｇｔｃａｇａｃａｇａａｃｔｔｇａａｔｇｔｇｔｃａｇｇｔｇａｃｃｃｔｇａｔｇａａａａｃａｔａｇｃａｔｃｔｃａｇｇａｇａｔｔｔｃａｔｇｃｃｔｇｇｔｇｃｔｔｃｃａａａｔａｔｔｇｔｔｇａｃａａｃｔｇｔｇａｃｔｇｔａｃｃｃａａａｔｇｇａａａｇｔａａｃｔｃａｔｔｔｇｔｔａａａａｔｔａｔｃａａｔａｔｃｔａａｔａｔａｔａｔｇａａｔａａａｇｔｇｔａａｇｔｔｃａｃａａｃｔａ（配列番号２３）

[000220]ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ部位の様々な組み合わせを、ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲから除去して、発現の増加に対して試験した。ｍｉｒ１２５ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ部位をＩＦＮｇの３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを伴う構築物からの発現率は増加する。

[000221]ＲＤＥ－ＧＦＰとｍｉｃｒｏＲＮＡ部位によってトランスフェクトされたＴ細胞におけるＧＦＰの発現が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位を除去した後でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって２４時間かけて活性化された、ＲＤＥ－ＧＦＰを伴うＴ細胞でのＧＦＰの発現と比較される。当該ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位の除去は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位を伴う細胞と比較して、２４時間後にＧＦＰの発現を２～５倍の間において増加させた。

実施例３：抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を使用したＤＬＢＣＬのペイロード送達
[000222]実施例６の抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲＴリンパ球および抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞リンパ球が、この実施例において使用される。これらのＣＡＲＴリンパ球が、ＭＩＲ１８６部位の除去によって改変されているＩＬ－２の３’－ＵＴＲの制御下においてＰＤ－１阻害剤をコードする構築物を含むようにさらに操作される。当該構築物によって発現されるＰＤ－１阻害剤としては、例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５８、ランブロリズマブ、またはこれらの薬物から得られるポリペプチドが挙げられる。当該構築物によって発現され得る他のＰＤ－１阻害剤としては、Ｈｅｒｂｓｔら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，３１：３０００（２０１３）；Ｈｅｅｒｙら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３０６４（２０１４）；Ｐｏｗｌｅｓら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，３２：５ｓ，５０１１（２０１４）；Ｓｅｇａｌら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３００２（２０１４）、または米国特許第８，７３５，５５３号；８，６１７，５４６号；同第８，００８，４４９号；同第８，７４１，２９５号；同第８，５５２，１５４号；同第８，３５４，５０９号；同第８，７７９，１０５号；同第７，５６３，８６９号；同第８，２８７，８５６号；同第８，９２７，６９７号；同第８，０８８，９０５号；同第７，５９５，０４８号；同第８，１６８，１７９号；同第６，８０８，７１０号；同第７，９４３，７４３号；同第８，２４６，９５５号；および同第８，２１７，１４９号において開示されるものが挙げられる。

[000223]抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を伴うＴ細胞集団および抗ＣＤ１９ＣＡＲ／ＰＤ－１（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化される。抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１９ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤を伴うＴ細胞を、０μＭ、７５μＭ、および２５０μＭのテオフィリンで７２時間インキュベートした。活性化された抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ＣＡＲ／ＰＤ－１Ｔ細胞を、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比において、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－Ｒａｊｉ標的細胞と共培養した。ＲＮＡ制御デバイスのリガンドであるテオフィリンが、培養培地において、０μＭ、７５μＭ、および２５０μＭの濃度に維持される。当該Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ／ＰＤ－１Ｔ細胞またはＣＡＲ／ＰＤ－１Ｔ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に１８時間増殖される。培養物は洗浄され、次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬によって染色され、続いて、ＣＤ２２^＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（ＳｍａｒｔＣＡＲＴ細胞）がカウントされる。培養培地からの試料が、６時間、１２時間、および１８時間においても採取され、ＥＬＩＳＡによってＰＤ－１阻害剤に対して試験される。

実施例４：抗ＣＤ１３３ＣＡＲＴ細胞を使用したＡＭＬへのペイロード送達
[000224]Ｂｕｄｄｅ２０１３（Ｂｕｄｄｅらｅｔａｌ．ＰＬｏＳ１，２０１３ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ２０ＣＡＲカセットを使用してＣＡＲが作製され、この場合、抗ＣＤ１３３ｍＡｂ２９３Ｃ３－ＳＤＩＥは、細胞外エレメント（Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら，２０１５，ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置き換えるために使用される。抗ＣＤ１３３ＣＡＲも、ＲＮＡ制御デバイスである３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ（ＷｉｎａｎｄＳｍｏｌｋｅ２００７Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（３６）：１４２８３～８８、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をコードすることができる。抗ＣＤ２０細胞外ドメインを抗ＣＤ１３３エレメントで置き換えるように、抗ＣＤ２０ＣＡＲカセットをコードする核酸が操作され、必要に応じて、ＲＮＡ制御デバイスも操作してカセットに入れる。ＲＮＡ制御デバイスを含むまたは含まない抗ＣＤ１３３ＣＡＲが、適切な発現ベクター中へとクローニングされる。

[000225]これらの抗ＣＤ１３３ＣＡＲおよび抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ構築物は、常法によってＴリンパ球（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴリンパ球）へとトランスフェクトされ、Ｔリンパ球の安定な集団が、適切な抗体（または他の選択スキーム）を使用して選択される。

[000226]これらのＣＡＲＴリンパ球は、ＭＩＲ１８６部位の除去によって改変されているＩＬ－２の３’－ＵＴＲからのＲＤＥの制御下においてＰＤ－１阻害剤をコードする構築物を含むようにさらに操作される。当該構築物によって発現されるＰＤ－１阻害剤としては、例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５８、ランブロリズマブ、またはこれらの薬物から得られるポリペプチドが挙げられる。当該構築物によって発現され得る他のＰＤ－１阻害剤としては、Ｈｅｒｂｓｔら、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．、３１：３０００（２０１３）；Ｈｅｅｒｙら、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３０６４（２０１４）；Ｐｏｗｌｅｓら、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ、３２：５ｓ、５０１１（２０１４）；Ｓｅｇａｌら、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．、３２：５ｓ、３００２（２０１４）、あるいは、米国特許第８，７３５，５５３号；８，６１７，５４６号；同第８，００８，４４９号；同第８，７４１，２９５号；同第８，５５２，１５４号；同第８，３５４，５０９号；同第８，７７９，１０５号；同第７，５６３，８６９号；同第８，２８７，８５６号；同第８，９２７，６９７号；同第８，０８８，９０５号；同第７，５９５，０４８号；同第８，１６８，１７９号；同第６，８０８，７１０号；同第７，９４３，７４３号；同第８，２４６，９５５号；および同第８，２１７，１４９号において開示されるものが挙げられる。

[000227]抗ＣＤ１３３ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化される。

[000228]活性化された抗ＣＤ１３３ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔリンパ球は、２：１、５：１、および１０：１の抗ＣＤ１３３ＣＡＲおよび／または抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲＴリンパ球：ＡＭＬ標的比において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３－ＡＭＬ標的細胞（例えば、Ｕ９３７、ＭＶ４－１１、ＭＯＬＭ－１４、ＨＬ－６０、および／またはＫＧ１ａ）と共に共培養される。ＲＮＡ制御デバイスのリガンドであるテオフィリンが、５００μＭから１ｍＭの範囲の濃度において培養培地に加えられる（Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ活性を所望のレベルまで滴定するために、より低いまたはより高い濃度も使用することができる）。抗ＣＤ１３３ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔリンパ球およびＡＭＬ細胞が、一緒に４８時間培養される。培養物は洗浄され、次いで、抗ＣＤ１３３および抗ＣＤ３試薬で染色され、続いて、ＣＤ１３３^＋（ＡＭＬ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（抗ＣＤ１３３ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３ＤＥ－ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ、および／または抗ＣＤ１３３ＤＥ－ＳｍａｒｔＣＡＲＴ－リンパ球）がカウントされる。これらの測定は、ＣＡＲ発現の異なるレベルでの、標的細胞致死率（例えば、半減期）および抗ＣＤ１３３ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３ＳｍａｒｔＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔ－リンパ球の増殖率を特定するであろう。培養培地からの試料は、１２時間、２４時間、２６時間、および４８時間においても採取され、ＥＬＩＳＡによってＰＤ－１阻害剤に対して試験される。

実施例５：第２の導入遺伝子を発現するためのＲＤＥ構築物
[000229]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇからの３’－ＵＴＲ）挿入体を使用して構築物を作製した。これら２つの挿入体／カセットを、同じレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ＧＦＰ－ＲＤＥを伴う挿入体が、それぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ＧＦＰ－ＲＤＥ挿入体に対する制御領域は、ＭｉｎＰであり、ＲＤＥは、ＩＦＮｇの内因性３’－ＵＴＲであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤであった（上記において説明したように）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000230]形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定するために、フローサイトメトリーに供した。

[000231]当該形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞を用いて培養した場合（ＣＡＲを活性化する）、１．０％から６．５％（約６．５倍）の蛍光の増加を示し、ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて培養した場合（ＴＣＲを活性化する）、１．０％から４．４％（約４．４倍）の蛍光の増加を示した。形質転換されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ細胞を用いて培養した場合、０．９％から８４．８％の当該集団における活性化された細胞の変化を示し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて培養した場合、０．９％から９０．８％の当該集団における活性化された細胞の変化を示した。

実施例６：第２の導入遺伝子を発現するための改変されたＲＤＥ２構築物
[000232]実施例１１および１２に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ２．１（ＩＬ－２ＲＤＥ）挿入体を使用して、構築物を作製した。ＭＩＲ１８６ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位を除去するようにＲＤＥ２．１を改変して、ＲＤＥ２として使用されるＬ－２の３’－ＵＴＲからのヌクレオチドを変更した。

[000233]これら２つの挿入体／カセットを、同じレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ＧＦＰ－ＲＤＥを伴う挿入体が、それぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ＧＦＰ－ＲＤＥ挿入体に対する制御領域は、ＭｉｎＰであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤであった（上記において説明したように）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000234]形質導入されたＴ細胞を休止状態へと戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定するために、フローサイトメトリーに供した。

[000235]当該形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ細胞を用いて培養した場合、３．９％から１２．１％の当該集団における活性化された細胞の変化を示し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて培養した場合、３．９％から１１．１％の当該集団における活性化された細胞の変化を示した。

実施例７：ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するためのＲＤＥ構築物
[000236]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、ならびにルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）挿入体またはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に対応して示差導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を使用して、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ１を伴う挿入体が、それぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ１挿入体およびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲのための制御領域は、
ＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧ
（ＭｉｎＰ）配列番号２４
ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ
（ＮＦＡＴ）配列番号２５
の配列を有するＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000237]形質導入されたＴ細胞を休止状態へと戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定するために、フローサイトメトリーに供した。

[000238]図２は、形質導入されたＴ細胞が、Ｒａｊｉ標的細胞を用いて培養した場合（ＣＡＲを活性化する）、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて培養した場合（ＴＣＲを活性化する）、休止期のＴ細胞の生物発光と比較して増加した生物発光を有することを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＩＦＮｇの３’－ＵＴＲを伴うＴ細胞（Ｇｏｌｄ１）は、ＣＡＲ刺激対ＴＣＲ刺激からのより大きなオン－オフ応答を示した。全ての条件下において、Ｇｏｌｄ１を伴うＴ細胞は、ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ（３’－ＵＴＲ）によって制御されないルシフェラーゼによる同じ条件下（および同じプロモーター）においてＴ細胞（３’－ＵＴＲ）より少ない量の生物発光を有した。

実施例８：ルシフェラーゼを制御するＲＤＥの比較
[000239]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、ならびにルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）挿入体、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ２（ＩＬ－２の３’ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ２）挿入体、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ３（ｍｉｒ１８６部位を除去するために上記において説明されるように改変されたＩＬ－２の３’ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ３）、またはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に対応して示差導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を使用して構築物を作製した。図３に示されるこれらの挿入体／カセットの組み合わせを、同様のレンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ルシフェラーゼ－ＲＤＥを伴う挿入体が、それぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ挿入体およびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲのための制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであり、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000240]形質導入されたＴ細胞を休止状態へと戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞を、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定するために、フローサイトメトリーに供した。

[000241]図３は、当該形質導入されたＴ細胞が、Ｒａｊｉ標的細胞を用いて培養した場合（ＣＡＲを活性化する）、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）、ＲＤＥ２（Ｇｏｌｄ２）、またはＲＤＥ３（Ｇｏｌｄ３）を伴う構築物に対して、休止期のＴ細胞の生物発光と比較して、増加した生物発光を有したことを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１を伴うＴ細胞は、ＭｉｎＰプロモーターおよび対応するＲＤＥを伴うＴ細胞より大きなオン－オフ応答を示した。全ての条件下において、ルシフェラーゼを制御するＲＤＥを伴うＴ細胞は、ＲＤＥによって制御されないルシフェラーゼカセットを伴うＴ細胞より少ない量の生物発光を有した。ＭｉｎＰプロモーターと組み合わせた場合、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激による生物発光において４．１倍の増加を与え、ＲＤＥ２は、生物発光において１．８倍の増加を与え、ＲＤＥ３は、１．４倍の増加を与えた。ＮＦＡＴプロモーターと組み合わせた場合、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激による生物発光において８．５倍の増加を与え、ＲＤＥ２は、生物発光において３．１倍の増加を与え、ＲＤＥ３は、１．３倍の増加を与えた。いずれかのプロモーターにより、ＲＤＥ３構築物は、最も多い量の生物発光を与え、ＲＤＥ１構築物は、最も少ない量の生物発光を与え、ＲＤＥ２構築物は、ＲＤＥ３とＲＤＥ１の間の量の生物発光を与えた。

実施例９：ＩＬ－１２を発現するためのＲＤＥ構築物
[000242]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、ならびにＩＬ－１２－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ）挿入体またはＩＬ－１２３’－ＵＴＲ（当該細胞の代謝状態に対応して示差導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ）、を使用して、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ＩＬ－１２－ＲＤＥ１を伴う挿入体が、それぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ＩＬ－１２－ＲＤＥ１挿入体およびＩＬ－１２３’－ＵＴＲのための制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのどちらかであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000243]形質導入されたＴ細胞を休止状態へと戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞を、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、におけるこれらのマーカーを測定するために、フローサイトメトリーに供した。Ｔ細胞におけるＩＬ－１２発現を、ＥＬＩＳＡによって測定した。

[000244]図４は、形質導入されたＴ細胞が、Ｒａｊｉ標的細胞を用いて培養した場合（ＣＡＲを活性化する）、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターによって制御される構築物を使用する休止期のＴ細胞のＩＬ－１２発現と比較して、増加したＩＬ－１２発現有することを示している。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１を伴うＴ細胞（Ｇｏｌｄ１）は、ＣＡＲ刺激に対して、休止期において、ＩＬ－２発現における１６８倍の変化を示した。ＮＦＡＴプロモーターおよび３’－ＵＴＲを伴うＴ細胞（ＣＡＲ刺激に応答しない、３’－ＵＴＲ）は、発現において５０倍の変化を示し、ＲＤＥ１を伴うｍｉｎＰプロモーター（Ｇｏｌｄ１）は、発現において６．３倍の変化を示した。

実施例１０：ＡＵエレメントおよび定常状態発現
[000245]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを用いて構築物を作製した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ１３（ＩＬ－５）、ＡＵ１４（ＩＬ－６）、ＡＵ１５（ＩＬ－９）、ＡＵ１６（ＩＬ－１０）、ＡＵ１７（ＩＬ－１３）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ－ＡＵ構築物を、初代Ｔ細胞に形質導入した。当該細胞を休止状態に戻した後、それらを播種し、模擬誘導するか（基底）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によって誘導した（活性化）。活性化の２４時間後に、それぞれにおけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの結果は、図５において棒グラフにプロットされる。

[000246]この実施例におけるＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間で）、および誘導倍率における異なるレベルを有した。当該ＡＵ構築物は、異なる基底発現量、異なる誘導発現量、および異なる量の誘導倍率（または、ダイナミックレンジ）を示した。

実施例１１：ＡＵエレメントおよび発現パラメーター
[000247]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを用いて構築物を作製した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ－ＡＵ構築物を、初代Ｔ細胞に形質導入した。当該細胞を休止状態に戻した後、それらを播種し、そして、処理しないか（基底）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によって活性化した（活性化）。活性化の２４時間後、それぞれにおけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの量は、図６の棒グラフにプロットされる。あるいは、当該細胞を休止状態に戻した後、それらを、各時点：１日目、３日目、６日目、および８日目において、測定のためにクワドルプリケート（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）において９６ウェルプレートに播種した。当該細胞を、処理しないか、あるいは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によって活性化し、１日目、３日目、６日目、および８日目にルシフェラーゼ活性を測定した。これらの結果は、図７の棒グラフにプロットされ、下記の表１に示される。図８は、棒グラフにプロットされた選択されたデータを示している。下記の表１の丸括弧の数値は、１日目のルシフェラーゼ単位で割った３日目、６日目、および８日目のルシフェラーゼ単位である。

[000248]図６、図７、および表１のＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間で）、および誘導倍率における異なるレベルを有した。基底発現レベルは、これらのＡＵエレメントに対して約２０００倍の範囲において異なり（ＡＵ７からＡＵ２０）、誘導発現レベルは、約５５００倍の範囲において異なる（ＡＵ７からＡＵ１０）。当該構築物に対する基底発現は、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）の場合の１３９０から、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）の場合の２，９２７，０００まで及んだ。活性化発現は、ＡＵ７（１日目）の場合の４９１４から、ＡＵ２０（８日目）の場合の２７，８００，００００まで及んだ。図８および表１は、例えば、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）など、いくつかのＡＵエレメントは、より低いレベルの結果を有したことを示している。いくつかのＡＵエレメントは、中間の量の結果を有した：ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）およびＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）。ならびに、いくつかのＡＵエレメントは、高い結果を有した：ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）およびＡＵ１０（Ｍｙｃ）。

[000249]当該ルシフェラーゼデータを、それぞれのルシフェラーゼ－ＡＵ構築物のダイナミックレンジ（誘導倍率またはルシフェラーゼ活性化／ルシフェラーゼ基底）に対しても分析した。１日目、３／４日目（活性化発現は、３日目に測定し、基底発現は、４日目に測定した）、６日目、および８日目における各ＡＵ構築物に対するダイナミックレンジ（誘導倍率）。このデータは、下記の表２に示され、図９および図１０の棒グラフにプロットされる。

[000250]１日目に、ダイナミックレンジ（誘導倍率＝活性化／基底）は、約１（ＡＵ２２）から約１７（ＡＵ１０１）まで及んだ。３／４日目に、ダイナミックレンジは、約４．５（ＡＵ２２）から約２７（ＡＵ２１）へ変化した。６日目に、ダイナミックレンジは、約７（ＡＵ２２）から約２９（ＡＵ２１）へ変化した。８日目に、ダイナミックレンジは、約７（ＡＵ２２）から約３０（ＡＵ２１）へ変化した。当該ＡＵ構築物は、関連するパターンの数値を示した。ＡＵ２およびＡＵ１０１は、１日目にダイナミックレンジの急速な増加を示し、次いで、当該ダイナミックレンジは、６日目および８日目に減少した。ＡＵ５およびＡＵ２１は、０日目から３／４日目までは増加するダイナミックレンジを示し、次いで、当該ダイナミックレンジは、６日目および８日目を通して維持される。ＡＵ３、ＡＵ２０、ＡＵ１０、ＡＵ７およびＡＵ２３は、０日目から６日目まで、上昇するダイナミックレンジを示し、次いで、当該ダイナミックレンジは、８日目に減少した。ＡＵ１９およびＡＵ２２は、０日目から８日目まで、上昇するダイナミックレンジを示した。

[000251]ＡＵ２１およびＡＵ２３は、加速するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵ構築物も、低い基底発現を有した（それぞれ、１日目＝４８６５および２７３６３）。ＡＵ２およびＡＵ１０１は、２４時間から７２時間において減少するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵ要素も、低い基底発現を有した。ＡＵ５およびＡＵ２０も、１日目から３／４日目まで減少するダイナミックレンジを示し（ＡＵ２および１Ｕ１０１より多い発現によって）、ＡＵ５は、低い基底発現を有したが、その一方で、ＡＵ２０は、高い基底発現を有した。ＡＵ１０、ＡＵ１９、およびＡＵ２２は、１日目から３／４日目まで一定のダイナミックレンジを示し、ならびに発現の高い基底レベルを有した。ＡＵ３およびＡＵ７も１日目から３／４日目まで一定のダイナミックレンジを示し、ならびに低い基底発現を有した。

[000252]上記のデータは、異なるＡＵエレメントが、１～８日目の発現に対して異なる一時的効果を有することを示している。いくつかのＡＵエレメントは、時間範囲の異なる一部分において加速するダイナミックレンジを示している。当該ＡＵ要素は、異なる量の総発現（Ｃｍａｘ）および最大発現（Ｔｍａｘ）までの異なる時間を示している。当該ＡＵエレメントは、異なる最大ダイナミックレンジおよびこれらの最大値に達するまでの時間も示している。発現のこれらの異なる動態は、所望の導入遺伝子に対して、カスタマイズされた基底、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ダイナミックレンジ、およびダイナミックレンジを最大にするための時間を提供するために使用することができる。これらの異なる動態は、細胞の活性化の後に当該細胞における２つの導入遺伝子に対して一時的に異なる発現を提供するためにも使用することができる。
実施例１２：グルコースおよびガラクトースによるＡＵエレメント制御
[000253]ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを用いて構築物を作製した。ＲＤＥは、細胞の解糖状態に応答するＡＵエレメントであった。ＡＵエレメント－ルシフェラーゼ構築物を、Ｔ細胞に形質導入した。細胞が休止状態に達した後、それらをウェルに分け、グルコースまたはガラクトースのどちらかを含む培地を供給した。３日目および５日目にルシフェラーゼ活性を測定した。これらの結果は、図１１の棒グラフに示される。結果は、グルコースは、ガラクトースと比較してルシフェラーゼの発現を増加させ、発現量は、３日目から５日目まで増加したことを示している。３日目に、グルコースで処理した細胞は、ガラクトースで処理した細胞の１５倍のルシフェラーゼの発現を有し、５日目に、これは、２７倍の発現に増加した。

実施例１３：ウイルスペイロードの送達および設計
[000254]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される第三世代抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、およびＲＮＡ制御デバイスである３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（ＷｉｎａｎｄＳｍｏｌｋｅ２００７Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（３６）：１４２８３－８８、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用してＳｍａｒｔＣＡＲが作製される。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を操作して、適切な発現ベクターの抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットに入れる。当該抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ＣＡＲ構築物は、常法によってＴ細胞（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）の異なる集団へとトランスフェクトされ、Ｔ細胞の安定な集団が、適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用して選択される。抗ＣＤ１９ＲＤＥＳｍａｒｔＣＡＲ（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）を伴うＴ細胞集団および抗ＣＤ１９ＣＡＲ（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）を伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化される。

[000255]第三世代レンチウイルスのパッケージ、エンベロープ、およびトランスファープラスミドがＡｄｄｇｅｎｅから入手される。Ｒｅｖの３’－ＵＴＲにＡＵ１０１（ＩＮＦｇ）ＲＤＥを含むように、パッケージングプラスミドをコードするＲｅｖが操作される。改変されたＲｅｖパッケージングプラスミド、ＧａｇＰｏｌパッケージングプラスミド、およびエンベローププラスミドが、抗ＣＤ１９Ｔ－リンパ球細胞へとトランスフェクトされる。トランスファープラスミドにおける導入遺伝子としてＧＦＰを含むようにトランスファープラスミドが操作される。このトランスファープラスミドも、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ－リンパ球細胞へとトランスフェクトされる。

[000256]抗ＣＤ１９ＳｍａｒｔＣＡＲＴ－リンパ球が、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔＣＡＲＴリンパ球：Ｒａｊｉ標的比において、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ラモス標的細胞と共に共培養される。ＲＮＡ制御デバイスのリガンドであるテオフィリンが、２μＭから２ｍＭの範囲の濃度において（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）、当該培養培地に加えられる。当該Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲＴ細胞および当該Ｒａｊｉ細胞が、一緒に４８時間培養される。

[000257]インキュベーション期間の終了時に、当該培養培地が、Ｔ－リンパ球およびＲａｊｉ細胞から分離される。上清のウイルス価が、抗レンチウイルス抗体試薬を用いたＥＬＩＳＡを使用して測定される。当該ウイルスによる感染力およびペイロード送達が、ＨＥＫ２９３細胞に当該ウイルスを感染させることよって試験され、好適なインキュベーション時間の後、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞からのＧＦＰ蛍光を測定する。

実施例１４：マウスリンパ腫モデルにおけるＧｏｌｄを使用したペイロード送達
[000258]ＷＯ２０１２／０７９０００（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＡＵ（ＩＬ－６の３’ＵＴＲ）挿入体を使用して構築物を作製した。これらの構築物を、二シストロン性レンチウイルス構築物に入れた。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよび、ルシフェラーゼ－ＲＤＥを伴う挿入体が、当該二シストロン性ベクターにおいてそれぞれ反対を向けて転写され、それぞれに対する制御領域が、当該２つの挿入体／カセットの間に位置される。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ挿入体に対する制御領域は、ＭｉｎＰであった。抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、二シストロン性構築物によって形質導入した。

[000259]上記において説明した抗ＣＤ１９ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ挿入体を使用して、第２の構築物を作製した（ＲＤＥエレメントは用いず、そのため、発現は構成的であった）。両方の構築物を、Ｔ細胞の異なる群へと別々に形質導入した。

[000260]形質導入されたＴ細胞を休止状態へと戻させ、次いで、以下のように刺激の後に試験した。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞を培地において単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞を、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色し、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定するために、フローサイトメトリーに供した。これらのインビトロでの結果は、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ－細胞が、ＣＡＲによるＴ細胞の活性化の後に、ルシフェラーゼを作製することを示していた。

[000261]ルシフェラーゼ－ＲＤＥを伴うこれらの抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞も、リンパ腫のためのマウスモデルにおいて試験した。ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を、ＮＳＧマウスの脇腹に移植した。腫瘍の形成後、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を当該マウスに注射し、発光に対して当該マウスをスキャンした。当該マウスの撮像は、ＣＤ１９陽性腫瘍によって活性化されている抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞由来の腫瘍部位での発光を示した。より多くのＴ細胞が活性化されるため、経時において発光量も増加した。対照的に、ルシフェラーゼの構成的発現を伴う抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、マウス全体ならびに当該マウスの脇腹の腫瘍部位において発光するはずである。

実施例１５：αｖβ６陽性固形腫瘍へのペイロード送達
[000262]Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８５：１０６４～７５（２００９）およびＫｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７７：３５９～６９（２００９）（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ノッチンをコードする核酸は、抗αｖβ６ＣＡＲをコードする核酸を作製するために、ＣＡＲ構成要素であるＣＤ４３ｚ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通、４１ＢＢ（ＣＤ２８または他のＣｏＳｔｉｍ）、およびＣＤ３ｚをコードする核酸に作動可能に連結される。

[000263]抗αｖβ６ＣＡＲをコードする核酸が、常法によってＴ細胞（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）へとトランスフェクトされ、Ｔ細胞の安定な集団が、適切な抗体（または他の選択スキーム）を使用して選択される。抗αｖβ６ＣＡＲを伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化される。これらの細胞も、ＩＮＦｇからのＧｏｌｄエレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１２をコードする発現カセットを用いて操作されるか、またはＡＵ２１（ＣＣＲ７）が、プロモーターＭｉｎＰの制御下に置かれる。

[000264]当該抗αｖβ６ＣＡＲＴ細胞が、αｖβ６腫瘍細胞と共にウェルにおいてインキュベートされる。インキュベーション後、抗αｖβ６ＣＡＲＴ細胞からのＩＬ－１２の分泌に対して当該ウェルが試験される。抗αｖβ６ＣＡＲＴ細胞は、αｖβ６腫瘍細胞と共にインキュベートした場合、ＩＬ－１２を分泌し、対照は、ＣＡＲＴ細胞が刺激されない場合、低い分泌を示すか、または分泌を示さない。

実施例１６：ＡＭＬに対する抗オンコＣＤ４３ＣＡＲ
[000265]オンコ－シアリル化ＣＤ４３に対する単鎖抗体を、抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３抗体を使用して作製した。抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲをコードする核酸を作製するために、この単鎖抗体をコードする核酸を、ＣＡＲ構成要素であるＣＤ４３ｚ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通、４１ＢＢ（ＣＤ２８または他のＣｏＳｔｉｍ）、およびＣＤ３ｚをコードする核酸と組み合わせた。

[000266]抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲをコードする核酸が、常法によってＴ細胞（ジャーカット細胞および／または初代ヒトＴ細胞）へとトランスフェクトされ、Ｔ細胞の安定な集団が、適切な抗体（または他の選択スキーム）を使用して選択される。抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲを伴うＴ細胞集団が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた共インキュベーションによって活性化される。

実施例１７：ＣＤ４３陽性ＡＭＬへのペイロード送達
[000267]ＩＮＦｇまたはＡＵ２１（ＣＣＲ７）からのＧｏｌｄエレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１２をコードする発現カセットが、プロモーターＭｉｎＰの制御下に置かれ、それを操作して抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲＴ細胞に入れる。

[000268]抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲＴ細胞が、ＡＭＬ細胞と共にウェルにおいてインキュベートされる。インキュベーション後、抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲＴ細胞からのＩＬ－１２の分泌に対して当該ウェルが試験される。抗オンコ－シアリル化ＣＤ４３ＣＡＲＴ細胞は、ＡＭＬ細胞と共にインキュベートした場合、ＩＬ－１２を分泌し、対照は、ＣＡＲＴ細胞が刺激されない場合、低い分泌を示すか、または分泌を示さない。

実施例１８：ペイロードとしてのｍｉＲＮＡ
[000269]Ｄｕら，ＦＥＢｓＪｏｕｒｎａｌ２７３：５４２１～５４２７（２００６）またはＣｈｕｎｇら，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ３４：ｅ５３（２００６）において開示されるように、ｍｉｒ１５５カセットをコードする人工イントロンを有するように、ＩＬ－１２をコードするペイロード導入遺伝子が操作される。当該ｍｉｒ１５５カセットは、それに作動可能に連結されたＡＵエレメント、例えば、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）またはＡＵ１４（ＩＬ－６）などを含むように操作され、当該導入遺伝子も、ＡＵエレメント、例えば、ＡＵ１０１またはＡＵ１４などを用いて操作される。ｍｉｒ１５５イントロンを伴うこの導入遺伝子を操作して、初代Ｔ細胞に入れる。実施例１４において説明されるような抗ＣＤ１９ＣＡＲも操作して、当該初代Ｔ細胞に入れる。

[000270]ＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、休止状態に戻され、次いで、以下のような刺激の後に試験される。「刺激なし」設定の場合、形質導入されたＴ細胞が、培地において単独で２４時間インキュベートされる。「Ｒａｊｉ共培養」設定の場合、ＣＤ１９＋ＲａｊｉＢ細胞が、形質導入したＴ細胞と共に２４時間インキュベートされる。２４時間の時点で、当該Ｔ細胞は、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に対して染色され、これらのマーカーを測定するために、フローサイトメトリーに供される。当該細胞も、ペイロードＩＬ－１２の発現に対して試験される。

[000271]ＩＬ－１２ペイロードを含むこれらの抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞も、リンパ腫のためのマウスモデルにおいて試験される。ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞が、ＮＳＧマウスの脇腹に移植される。腫瘍の形成後、ＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、マウスに注射される。投与後４日目から２日おきに、当該マウスにおける腫瘍致死が、ノギスを使用して測定される。

実施例１９：ＩＬ－１２ペイロード送達
[000272]実施例１４において説明されるような抗ＣＤ１９ＣＡＲを伴う構築物を作製した。ＩＬ－１２をコードする核酸とそれに続いてＡＵ１０１（ＩＮＦｇからのＲＤＥ）とに作動可能に連結されたＮＦＡＴプロモーターを伴う構築物も作製した。当該構築物から作製されたＩＬ－１２転写物は、ＩＬ－１２に対するコード配列をＡＵ１０１ＲＤＥに作動可能に連結する。ＩＬ－１２の構造的発現を提供する第２のＩＬ－１２構築物を作製した。第３の構築物は、ルシフェラーゼをＡＵ１４（ＩＬ－６）の制御下に置いた。

[000273]当該構築物を初代Ｔ細胞へ形質導入し、それらを、休止状態に戻させた。これは、ＩＬ－１２のペイロード（ＲＤＥ制御、または構造的）またはルシフェラーゼのペイロードを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を生じた。

[000274]抗ＣＤ１９ＣＡＲおよびＩＬ－１２ペイロード（ＲＤＥ制御、または構造的）またはルシフェラーゼペイロードを含む初代Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋腫瘍を有するマウスにその脇腹において投与した。腫瘍細胞の致死を４２時間にわたってモニターした。抗ＣＤ１９ＣＡＲおよびルシフェラーゼペイロードを含むＴ細胞を投与されたマウスは、中程度の量の腫瘍細胞致死（約３ｌｏｇ）を示した。ＩＬ－１２ペイロードを投与されたマウスは、多量の腫瘍細胞致死（６～７ｌｏｇ）を有した。構造的またはＡＵ１０１制御ＩＬ－１２を投与されたマウスにおけるＩＬ－１２血清レベルの比較は、全身のＩＬ－１２レベルにおいて１０倍の差を有しており、この場合、ＡＵ１０１制御ペイロードは、構造的ＩＬ－１２ペイロードより１０倍少ない量のＩＬ－１２を有した。

[000275]ＩＬ－１２発現のＲＤＥ制御は、マウスにおいて全身のＩＬ－１２レベルを下げたが、ＩＬ－１２の局在化された濃度を与え、それが、腫瘍細胞致死を向上させた。活性化されたＣＡＲＴ細胞が腫瘍細胞を死に至らしめた後、それらのＣＡＲＴ細胞は、当該腫瘍部位から、リンパ節および／または脾臓に移動することができ、そこでそれらは、他のＴ細胞を教育して、メモリーＴ細胞を形成することができる。

実施例２０：ＤＬＬ３＋がん細胞へのペイロード送達
[000276]ＳＣ１６．１５として、例えば、ＵＳ２０１７０１３７５３３（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体ドメインを使用して、ＣＡＲ構築物を作製した。この抗ＤＬＬ３抗体ドメインは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）にされ、抗ＤＬＬ３ＣＡＲを作製するために、当該抗ＤＬＬ３ｓｃＦｖが、ＣＡＲ（例えば、ＷＯ２０１２／０７９０００に記載されるもの、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の膜貫通および細胞内部分と組み合わせる。

[000277]導入遺伝子が転写されたときに、当該導入遺伝子に対する転写物が当該導入遺伝子をＲＤＥに連結するように、当該ＲＤＥを伴う導入遺伝子を操作することによって、ペイロード構築物が作製される。当該ペイロード導入遺伝子は、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルウロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＴＮＦα、および／または抗ＣＤ２８抗体をコードすることができる。当該ＲＤＥは、ＡＵ１０１（ＩＮＦｇ）またはＡＵ１４（ＩＬ－６）であり得る。

[000278]当該構築物が、初代Ｔ細胞に形質導入され、次いで、休止状態に戻される。これは、ペイロード：抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＩＬ－１２、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルウロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＴｏｘのためのｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７のためのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／または抗ＣＤ２８抗体（全長または断片、例えば、単鎖抗体などを含む）、のうちの１つまたは複数を伴う抗ＤＬＬ３ＣＡＲＴ細胞を生じる。

[000279]ヒト黒色腫、ヒト肺小細胞がん（ＳＣＬＣ）、およびヒトＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマのがん異種移植を確立するために、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウスモデルが使用される。当該がん異種移植がマウスにおいて確立された後、当該マウスは、抗ＤＬＬ３ＣＡＲおよびペイロードのうちの１つを伴う初代Ｔ細胞で処置される。次いで、がん異種移植致死が、ＤＬＬ３－ＣＡＲＴ細胞の様々なペイロードの間で比較される。

実施例２１：標的細胞へのＢ毒素融合ペイロード送達
[000280]ＩＬ－１２ペイロードを下記において説明されるような改変されたＢ毒素融合で置き換えたことを除いて、実施例１９において説明されるようにＣＡＲＴ細胞が作製される。

[000281]Ｔｏｉｖｏｎｅｎら，Ｔｏｘｉｎｓ２：２６２２－４４（２０１０）に記載されるように、破傷風毒素を使用して、Ｂ毒素融合が作製され、破傷風毒素のＢドメインを、海洋性カイアシ類（Ｇａｕｓｓｉａｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来のルシフェラーゼ（分泌されたルシフェラーゼ）をコードするペイロードに融合させる。破傷風Ｂドメイン受容体結合性部分を、ＣＤ１９に結合する抗ＣＤ１９ＣＡＲ部分（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）で置き換えることによってＣＤ１９抗原へのターゲッティングを提供するように、このＢ毒素ペイロードが改変される。これは、ジフテリア毒素のＢドメインに対してＫｅｌｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：３９８０－８４（１９８８）に記載されるように、行うことができる。

[000282]抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび改変されたＢ毒素ペイロード（ＲＤＥ制御、または構造的）を伴う初代Ｔ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍を有するマウスにその脇腹において投与される。腫瘍細胞の致死および有害応答について、処置したマウスにおいてモニターする。ＲＤＥ制御、改変Ｂ毒素ペイロードを含むＣＡＲＴ細胞で処置したマウスは、腫瘍細胞致死の増加を示す。

実施例２２：ペイロード発現のｈｎＲＮＰＬＬ制御
[000283]ＧＦＰをコードする核酸が、コード領域の３’末端において過剰なイントロンおよび過剰なエクソンを有するように操作される。ＧＦＰをコードする核酸は、βグロビンからのイントロン１、ＣＤ４５のエクソン４（ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位を有する）、およびβグロビンの別のイントロン（ｈｎＲＮＰＬＬＣＡリピート結合部位を有するように操作される）によって後続される。この操作されたＧＦＰコード核酸は、構造的プロモーターに作動可能に連結される。

[000284]この操作されたＧＦＰをコードする核酸を伴う発現カセットは、初代Ｔ細胞へと形質導入され、次いで、静止状態においてＧＦＰを発現させる。これは、カルボキシル末端にＣＤ４５のエクソン４のアミノ酸を有するＧＦＰタンパク質を生じるはずである。この融合ポリペプチドは、減じられたＧＦＰ活性を有するはずである。次いで、ＧＦＰに対する発現カセットを伴う初代Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化される。これらの活性化された細胞は、ｈｎＲＮＰＬＬを生じるはずであり、それは、活性ＧＦＰをコードするＧＦＰ転写物からのＣＤ４５のエクソン４の除外を引き起こすはずである。この転写物の翻訳は、検出可能な活性ＧＦＰを生じる。

実施例２３：ＤＬＬ３＋がん細胞へのＣＸＣＬ９および抗ＰＤ１療法の協調的送達
[000285]抗ａｎｔｉ－ＤＬＬ３ＣＡＲが、実施例２０において説明されるように作製される。実施例２０において説明されるように、このＣＡＲ構築物も操作してＴ細胞に入れる。

[000286]抗ＤＬＬ３ＣＡＲＴ細胞による送達のために、２つのペイロードカセットが作製される。最初に、早期発現プロファイル（細胞の活性化後の早期最大発現）を有するＲＤＥ、例えば、ＡＵ２（ＣＳＦ－２、１日目に最大誘導倍率）、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ、１日目に最大誘導倍率）、またはＡＵ５（ＥＤＮ１、３／４日目に最大誘導倍率）などに作動可能に連結された分泌されたペイロードとしてＣＸＣＬ９をコードする構築物が作製される。次に、後期発現プロファイル（細胞の活性化後の後期最大発現）を有するＲＤＥ、例えば、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ、８日目において最大誘導倍率）またはＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９、８日目において最大誘導倍率）などに作動可能に連結された分泌されたペイロードとして抗ＰＤ１抗体（例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）））をコードする構築物が作製される。当該２つのペイロードは、二シストロン性構築物に入れることができ、または、同じ構築物に入れることもでき、あるいは、当該ペイロードを、別々の構築物から発現させることもできる。上記の実施例２０において説明されるように、当該ペイロード構築物を操作して、抗ＤＬＬ３ＣＡＲＴ細胞に入れる。

[000287]この操作されたＣＡＲＴ細胞が、実施例２０において説明されるようにＮＳＧマウスモデルに投与される場合。当該ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍標的におけるＤＬＬ３によって活性化され、ＣＸＣＬ９を伴うＲＤＥ構築物が、最初にこのペイロードを発現し、次いで、後で抗ＰＤ１抗体ペイロードが発現される。ＣＸＣＬ９構築物のＡＵ２、ＡＵ５、またはＡＵ１０１ＲＤＥは、がん標的におけるＤＬＬ３による細胞の活性化の約１日後に早期最大発現を有する。ＣＸＣＬ９は、ＤＬＬ３によるＴ細胞の活性化後早期に分泌され得、ならびに、ＣＸＣＬ９は、抗ＰＤ１抗体で処置された腫瘍に対応してＴ細胞を増強することができる。ＣＸＣＬ９の分泌後、抗ＰＤ１は、より遅い時期（約８日目）に最大に分泌され、この抗体の効果は、ＣＸＣＬ９による処置によって増加させることができる。

[000288]ＣＸＣＬ９の早期発現は、抗ＰＤ１抗体からの活性およびがん致死を増強する。

実施例２４：併用療法
[000289]ＳＣ１６．１５またはＳＣ１６．２５として、例えば、ＵＳ２０１７０１３７５３３（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体ドメインを使用して、ＣＡＲ構築物が作製される。この抗ＤＬＬ３抗体ドメインは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）にされ、抗ＤＬＬ３ＣＡＲを作製するために、当該抗ＤＬＬ３ｓｃＦｖが、ＣＡＲ（例えば、ＷＯ２０１２／０７９０００に記載されるもの、なお、当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の膜貫通および細胞内部分と組み合わされる。

[000290]導入遺伝子が転写されたときに、当該導入遺伝子に対する転写物が当該導入遺伝子をＲＤＥに連結するように、当該ＲＤＥを伴う導入遺伝子を操作することによって、ペイロード構築物が作製される。当該ペイロード導入遺伝子は、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルウロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＴＮＦα、および／または抗ＣＤ２８抗体をコードすることができる。当該ＲＤＥは、ＡＵ１０１（ＩＮＦｇ）またはＡＵ１４（ＩＬ－６）であり得る。

[000291]当該構築物は、初代Ｔ細胞に形質導入され、次いで、休止状態に戻される。これは、ペイロード：抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＩＬ－１２、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルウロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＴｏｘのためのｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７のためのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／または、抗ＣＤ２８抗体（全長または断片、例えば、単鎖抗体などを含む）、のうちの１つまたは複数を伴う抗ＤＬＬ３ＣＡＲＴ細胞を生じる。

[000292]抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、ＳＣ１６．１５またはＳＣ１６．２５として、例えば、ＵＳ２０１７０１３７５３３（当該文献は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体の間において作製される。この抗ＤＬＬ３抗体ドメインは、適切な形式（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、または全長ＩｇＧ）へと変換され、１つまたは複数の薬物（例えば、エトポシド、イリノテカン、シスプラチン、および／またはカルボプラチン）にコンジュゲートされる。

[000293]ヒト黒色腫、ヒト肺小細胞がん（ＳＣＬＣ）、およびヒトＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマのがん異種移植を確立するために、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウスモデルが使用される。当該がん異種移植がマウスにおいて確立された後、当該マウスは、抗ＤＬＬ３ＣＡＲおよびペイロードのうちの１つを伴う初代Ｔ細胞、抗ＤＬＬ３ＡＤＣ、あるいは抗ＤＬＬ３ＣＡＲおよびペイロードのうちの１つと抗ＤＬＬ３ＡＤＣとを伴う初代Ｔ細胞で処置される。次いで、がん異種移植致死が、当該ＡＤＣ、当該ＤＬＬ３－ＣＡＲＴ細胞の様々なペイロード、および当該抗ＤＬＬ３ＡＤＣを伴う当該ＤＬＬ３ＣＡＲＴ細胞の様々なペイロードの間において比較される。

[000294]本願明細書において説明および引用したあらゆる刊行物、特許、特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。説明される特定の方法論、プロトコル、および材料は、変更することができるため、開示される本発明は、それらに限定されないことは理解されるべきである。本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないということも理解されるべきである。

[000295]当業者は、常套的実験を使用して、本明細書において説明される本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するかまたはそれらを確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

[000295]当業者は、常套的実験を使用して、本明細書において説明される本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するかまたはそれらを確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］ペイロードを送達する方法であって、
がん細胞を治療剤に曝露するステップ；
キメラ抗原受容体を含む初代Ｔ細胞と、ＲＮＡ分解エレメント（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したペイロードをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む異種核酸とを得るステップであって、ここで、ＲＤＥがＡＵリッチエレメントであり、異種核酸が転写されて、ＲＤＥに作動可能に連結した導入遺伝子をコードする転写物を作製するステップ；
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップであって、ここで、リガンドががん細胞と会合し、受容体によるリガンドの結合が初代Ｔ細胞を活性化するステップ；および
導入遺伝子を発現させるステップであって、ここで、導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が、初代Ｔ細胞が活性化された後で増加するステップ；
を含む、上記方法。
［態様２］治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、放射性コンジュゲート、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１に記載の方法。
［態様３］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と同じリガンドに結合する、態様２に記載の方法。
［態様４］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と異なるリガンドに結合する、態様２に記載の方法。
［態様５］化学療法剤が、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、植物性アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬、および／または放射性核種である、態様２に記載の方法。
［態様６］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１に記載の方法。
［態様７］導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＦＮｇ、ＣＤ４０Ｌ、またはＴＮＦ－αをコードする、態様１に記載の方法。
［態様８］キメラ抗原受容体が抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体である、態様１に記載の方法。
［態様９］リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＤＬＬ３である、態様８に記載の方法。
［態様１０］腫瘍細胞が、ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ細胞、黒色腫細胞、または小細胞肺がん細胞である、態様９に記載の方法。
［態様１１］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１０に記載の方法。
［態様１２］治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１１に記載の方法。
［態様１３］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＤＬＬ３に結合する、態様１１に記載の方法。
［態様１４］キメラ抗原受容体が抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体である、態様１に記載の方法。
［態様１５］リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＴｎＭＵＣ１である、態様１４に記載の方法。
［態様１６］腫瘍細胞が乳がん細胞または膵臓がん細胞である、態様１５に記載の方法。
［態様１７］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードし、治療剤が非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１５に記載の方法。
［態様１８］がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップの前に行われる、態様１に記載の方法。
［態様１９］初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップが、がん細胞を治療剤に曝露するステップの前に行われる、態様１に記載の方法。
［態様２０］がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップと同時に行われる、態様１に記載の方法。
［態様２１］ペイロードを送達する方法であって、
がん細胞を治療剤に曝露するステップ；
キメラ抗原受容体を含む初代Ｔ細胞と、ＲＮＡ分解エレメント（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したペイロードをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む異種核酸とを得るステップであって、ここで、ＲＤＥがＡＵリッチエレメントであり、異種核酸が転写されて、ＲＤＥに作動可能に連結した導入遺伝子をコードする転写物を作製するステップ；
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップであって、ここで、リガンドががん細胞と会合し、受容体によるリガンドの結合が初代Ｔ細胞を活性化するステップ；および
導入遺伝子を発現させるステップであって、ここで、導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が、初代Ｔ細胞が活性化された後で増加するステップ；
を含む、上記方法。
［態様２２］治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、放射性コンジュゲート、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１に記載の方法。
［態様２３］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と同じリガンドに結合する、態様２に記載の方法。
［態様２４］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と異なるリガンドに結合する、態様２に記載の方法。
［態様２５］化学療法剤が、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、植物性アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬、および／または放射性核種である、態様２に記載の方法。
［態様２６］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１に記載の方法。
［態様２７］導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＦＮｇ、ＣＤ４０Ｌ、またはＴＮＦ－αをコードする、態様１に記載の方法。
［態様２８］キメラ抗原受容体が抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体である、態様１に記載の方法。
［態様２９］リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＤＬＬ３である、態様８に記載の方法。
［態様３０］腫瘍細胞が、ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ細胞、黒色腫細胞、または小細胞肺がん細胞である、態様９に記載の方法。
［態様３１］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１０に記載の方法。
［態様３２］治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１１に記載の方法。
［態様３３］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＤＬＬ３に結合する、態様１１に記載の方法。
［態様３４］キメラ抗原受容体が抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体である、態様１に記載の方法。
［態様３５］リガンドが、がん細胞で見出されるＣＤ１９である、態様１４に記載の方法。
［態様３６］がん細胞が、リンパ腫細胞、白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、または慢性リンパ球性白血病細胞である、態様１５に記載の方法。
［態様３７］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１５に記載の方法。
［態様３８］治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、態様１７に記載の方法。
［態様３９］治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＣＤ１９に結合する、態様１８に記載の方法。
［態様４０］キメラ抗原受容体が抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体である、態様１に記載の方法。
［態様４１］リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＴｎＭＵＣ１である、態様２０に記載の方法。
［態様４２］腫瘍細胞が乳がん細胞または膵臓がん細胞である、態様２１に記載の方法。
［態様４３］がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップの前に行われる、態様１に記載の方法。
［態様４４］初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップが、がん細胞を治療剤に曝露するステップの前に行われる、態様１に記載の方法。
［態様４５］がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップと同時に行われる、態様１に記載の方法。

Claims

ペイロードを送達する方法であって、
がん細胞を治療剤に曝露するステップ；
キメラ抗原受容体を含む初代Ｔ細胞と、ＲＮＡ分解エレメント（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したペイロードをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む異種核酸とを得るステップであって、ここで、ＲＤＥがＡＵリッチエレメントであり、異種核酸が転写されて、ＲＤＥに作動可能に連結した導入遺伝子をコードする転写物を作製するステップ；
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップであって、ここで、リガンドががん細胞と会合し、受容体によるリガンドの結合が初代Ｔ細胞を活性化するステップ；および
導入遺伝子を発現させるステップであって、ここで、導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が、初代Ｔ細胞が活性化された後で増加するステップ；
を含む、上記方法。
治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、放射性コンジュゲート、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と同じリガンドに結合する、請求項２に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と異なるリガンドに結合する、請求項２に記載の方法。
化学療法剤が、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、植物性アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬、および／または放射性核種である、請求項２に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１に記載の方法。
導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＦＮｇ、ＣＤ４０Ｌ、またはＴＮＦ－αをコードする、請求項１に記載の方法。
キメラ抗原受容体が抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＤＬＬ３である、請求項８に記載の方法。
腫瘍細胞が、ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ細胞、黒色腫細胞、または小細胞肺がん細胞である、請求項９に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１０に記載の方法。
治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１１に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＤＬＬ３に結合する、請求項１１に記載の方法。
キメラ抗原受容体が抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＴｎＭＵＣ１である、請求項１４に記載の方法。
腫瘍細胞が乳がん細胞または膵臓がん細胞である、請求項１５に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードし、治療剤が非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１５に記載の方法。
がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップの前に行われる、請求項１に記載の方法。
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップが、がん細胞を治療剤に曝露するステップの前に行われる、請求項１に記載の方法。
がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップと同時に行われる、請求項１に記載の方法。
ペイロードを送達する方法であって、
がん細胞を治療剤に曝露するステップ；
キメラ抗原受容体を含む初代Ｔ細胞と、ＲＮＡ分解エレメント（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したペイロードをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む異種核酸とを得るステップであって、ここで、ＲＤＥがＡＵリッチエレメントであり、異種核酸が転写されて、ＲＤＥに作動可能に連結した導入遺伝子をコードする転写物を作製するステップ；
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップであって、ここで、リガンドががん細胞と会合し、受容体によるリガンドの結合が初代Ｔ細胞を活性化するステップ；および
導入遺伝子を発現させるステップであって、ここで、導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が、初代Ｔ細胞が活性化された後で増加するステップ；
を含む、上記方法。
治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、放射性コンジュゲート、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と同じリガンドに結合する、請求項２に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがキメラ抗原受容体と異なるリガンドに結合する、請求項２に記載の方法。
化学療法剤が、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、植物性アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗薬、および／または放射性核種である、請求項２に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１に記載の方法。
導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＦＮｇ、ＣＤ４０Ｌ、またはＴＮＦ－αをコードする、請求項１に記載の方法。
キメラ抗原受容体が抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＤＬＬ３である、請求項８に記載の方法。
腫瘍細胞が、ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ細胞、黒色腫細胞、または小細胞肺がん細胞である、請求項９に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１０に記載の方法。
治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１１に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＤＬＬ３に結合する、請求項１１に記載の方法。
キメラ抗原受容体が抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
リガンドが、がん細胞で見出されるＣＤ１９である、請求項１４に記載の方法。
がん細胞が、リンパ腫細胞、白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、または慢性リンパ球性白血病細胞である、請求項１５に記載の方法。
導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤をコードする、請求項１５に記載の方法。
治療剤が、非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子療法、化学療法剤、治療用ペプチド、サイトカイン、局所放射線療法、手術、干渉ＲＮＡ、薬物、または毒素である、請求項１７に記載の方法。
治療剤がイムノコンジュゲートであり、イムノコンジュゲートがＣＤ１９に結合する、請求項１８に記載の方法。
キメラ抗原受容体が抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
リガンドが、腫瘍細胞で見出されるＴｎＭＵＣ１である、請求項２０に記載の方法。
腫瘍細胞が乳がん細胞または膵臓がん細胞である、請求項２１に記載の方法。
がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップの前に行われる、請求項１に記載の方法。
初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップが、がん細胞を治療剤に曝露するステップの前に行われる、請求項１に記載の方法。
がん細胞を治療剤に曝露するステップが、初代Ｔ細胞をキメラ抗原受容体のリガンドに曝露するステップと同時に行われる、請求項１に記載の方法。