JP2022545732A

JP2022545732A - エピジチオジオキソピペラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含む、固形癌の予防又は治療用薬学的組成物

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Publication number: JP2022545732A
Application number: JP2022513352A
Authority: JP
Inventors: ウォンカン，サン; キョンリ，ウン
Original assignee: Vasthera CoLtd
Current assignee: Vasthera CoLtd
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2022-10-28
Also published as: EP4023224A1; EP4023224A4; US20220323453A1; KR102599052B1; KR20210027133A; WO2021040389A1; CN114641294A; CN114641294B

Abstract

本発明は、エピジチオジオキソピペラジン（epidithiodioxopiperazine）環に分子内ジスルフィド結合を含む母核構造に基づくエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、固形癌の予防又は治療用薬学的組成物に関する。

Description

癌とは、簡単に定義すると、体内で正常細胞より速く増殖して成長する細胞の総称である。癌を腫瘍ともいうが、腫瘍は、正常細胞が単に速く成長及び増殖して大きさが大きくなって塊りを形成する良性腫瘍と、異常に変形した細胞が成長及び／又は増殖して他の部位に転移する悪性腫瘍に分けられ、いわゆる癌とは、前記悪性腫瘍を意味する。

このような癌は、大きく固形癌と血液癌に分けられる。胃癌や肺癌などのように、特定臓器で発生し、成長して他の臓器に転移するのが固形癌である。それとは異なり、特定臓器ではなく、血液や免疫細胞を作る造血器官で発生する癌は、癌細胞が特定部位に位置するのではなく、血液やリンパ系を循環するので、血液癌という。

これら固形癌と血液癌は、由来、発生位置、転移機序が異なるように、治療法も異なる。固形癌においては、特定臓器で発生するので、特定臓器に限定される場合は手術や放射線治療を行い、それらの局所治療が困難な場合は抗癌治療を行う。しかし、血液癌においては、特定部位に限定されないので、疾患の進行程度に関係なく、抗癌療法が主な治療法となる。

韓国登録特許第１０－１６３３９７５号公報

Kirby and Robins, 1980, The Biosynthesis of Mycotoxins, New York: Academic Press Shah and Larsen, 1991, Mycopathologia, 116: 203-208 Sekita et al., 1981, Can. J. Microbiol., 27: 766-772

本発明者らは、固形癌治療のための天然物由来及び／又はその機能を模倣した合成小分子化合物を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、グリオトキシン、ケトミンなどの天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体及びそれに類似した母核構造を共有する合成小分子誘導体が乳癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌及び膵臓癌の成長、増殖及び／又は転移を抑制する活性を有することを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明は、エピジチオジオキソピペラジン（epidithiodioxopiperazine）環に分子内ジスルフィド結合を含む母核構造に基づくエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、固形癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。

本発明の天然及び合成小分子エピジチオジオキソピペラジン誘導体を含む薬学的組成物は、細胞の生存率には影響を与えることなく、乳癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌及び膵臓癌細胞を効率的に死滅させるだけでなく、腫瘍を移植したマウスモデルにおいて、腫瘍の成長を阻害したり、さらに腫瘍の体積を減少させることができる。

天然エピジチオジオキソピペラジン（epidithiodioxopiperazine; ETP）化合物、グリオトキシン（gliotoxin）及びケトミン（chetomin）の乳癌（breast cancer）細胞に対する化合物の各処理濃度における（Ａ）生存率、（Ｂ及びＣ）増殖抑制効果を示す図である。グリオトキシンのトリプルネガティブ乳癌（triple-negative breast cancer; TNBC）細胞に対する細胞周期進行（cell cycle progression）抑制効果を示す図である。天然エピジチオジオキソピペラジン化合物、グリオトキシンの乳癌細胞に対する転移活性（migratory activity）抑制効果を示す図である。天然エピジチオジオキソピペラジン化合物、ケトミンの乳癌細胞に対する転移活性抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の様々な癌細胞及び正常細胞に対する細胞毒性効果を示す図である。Ａ～Ｊはそれぞれ乳癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、正常乳房細胞、正常線維芽細胞及び正常上皮細胞を表記ＥＴＰ化合物で２４時間処理し、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイシステムで定量した細胞生存率を示す図である（ｎ＝３）。線形回帰プログラム（linear regression program, GraphPad Prism）によりＩＣ_５０値を決定した。それをＫに示す。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の乳癌細胞に対するコロニー形成（colony formation）抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の肺癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の胃癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の皮膚癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の結腸癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の前立腺癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の膵臓癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を示す図である。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体のＡ５４９、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＭＫＮ－２８及びＬｕｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植に対する腫瘍成長抑制効果を示す図である。１００ｍＬのビヒクル対照群（０．１％ＤＭＳＯ）及び表記ＥＴＰ化合物（３００μｇ／ｋｇ）を３日おきに２０日間腹腔内注射し、４週間後に各群のマウスから異種移植を摘出した。Ａ～ＤはそれぞれＡ５４９、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＭＫＮ－２８及びＬｕｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植マウスにおいて測定した対照群（黒色）、Ａ２（赤色）、Ａ５（黄緑色）及びＡ１０（黄色）処理による腫瘍異種移植体積及び質量を示す。グラフのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで示した（ｎ＝４，＊＊Ｐ＜０．０５）。ＴｕｒｋｅｙＨＳＤ事後テストを伴う一元配置ＡＮＯＶＡ（one-way ANOVA with Tukey HSD post hoc test）により統計的分析を行った。合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の生体内癌細胞増殖抑制効果を示す図である。Ａ及びＣとＢ及びＤはＭＤＡ－ＭＢ２３１由来腫瘍及びＭＫＮ２８由来腫瘍のＫｉ－６７免疫染色により決定された増殖指数（proliferative index）と免疫組織化学を示す。グラフのデータは免疫蛍光染色における１フィールド当たりのＫｉ－６７^＋細胞の数の平均±Ｓ．Ｄである（ｎ＝４，＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｅ及びＦはそれぞれＭＤＡ－ＭＢ２３１及びＭＫＮ－２８誘導腫瘍異種移植におけるＴＵＮＥＬ染色により決定されたＥＴＰ－誘導アポトーシス発生率（apoptosis incidence）を示す。ＧはＴＵＮＥＬ染色における陽性対照群として用いられるＤＮａｓｅで処理した試料である。具体的には、組織切片をＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／ｍＬ）で２分間処理したものである。ヒト化マウス（humanized mice）に移植した患者由来肺腺癌（patient-derived lung adenocarcinoma）に対する合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体の阻害効果を示す図である。

本発明は、化学式（１）で表されるエピジチオジオキソピペラジン（epidithiodioxopiperazine）環に分子内ジスルフィド結合を含む母核構造に基づくエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、固形癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明は、エピジチオジオキソピペラジン環に分子内ジスルフィド結合を有する一連の天然又は合成小分子化合物が、それに含まれる分子内ジスルフィド結合により固形癌疾患に対して治療効果を発揮することを見出したことに基づくものである。具体的には、本発明者らは、代表的な天然物由来エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるグリオトキシン及びケトミン、並びに核心作用機序を確認するために合成した小分子エピジチオジオキソピペラジン誘導体である５，７－ジメチル－２，３－ジチア－５，７－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン－６，８－ジオン（Ａ２）、５，７－ジアリル－２，３－ジチア－５，７－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン－６，８－ジオン（Ａ５）及び５ａ，１０ａ－ジチオ－オクタヒドロジピロロ［１，２－ａ：１’，２’－ｄ］ピラジン－５，１０－ジオン（Ａ１０）の全てが乳癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌などの固形癌に対して優れた治療効果を発揮することを確認したので、分子内ジスルフィド結合を含むエピジチオジオキソピペラジン誘導体であれば、その大きさや置換基の種類に関係なく、固形癌に対して治療効果を発揮することは明らかである。

例えば、本発明の薬学的組成物に含まれる前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、それぞれ化学式（２）又は（３）で表される天然物由来のエピジチオジオキソピペラジン化合物であってもよい。

例えば、化学式（２）の化合物は、グリオトキシン（gliotoxin; GT）という代表的なＥＴＰ化合物であり、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、トリコデルマ・ビレンス（Trichoderma virens）、ペニシリウム種（Penicillium spp.）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などの菌、その培養液、代謝物又は二次代謝物から分離される［非特許文献１，２］。

化学式（３）の化合物は、ケトミン（chetomin）というＥＴＰ化合物であり、ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）から分離される［非特許文献３］。

また、本発明の薬学的組成物に含まれる前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、化学式（１－１）で表される合成小分子化合物であってもよい。

化学式（１－１）において、Ｒ_１～Ｒ_４はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１－６直鎖もしくは分岐鎖アルキル（alkyl）、アルケニル（alkenyl）、アルキニル（alkynyl）、Ｃ_１－６アルコキシ－アリール－Ｃ_１－６アルキル、又は５～１０員ヘテロアリール－Ｃ_１－６アルキルであるか、Ｒ_１とＲ_２、及びＲ_３とＲ_４がそれぞれ独立して互いに連結され、それらが結合された炭素及び窒素原子を含む４～１０員ヘテロサイクルを形成する。

具体的には、化学式（１－１）で表される化合物は、化学式（４）～（１４）で表される合成小分子化合物であるが、これらに限定されるものではない。

例えば、本発明の薬学的組成物に含まれる前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、化学式（２）、（３）、（５）、（７）又は（１４）の化合物であってもよい。

前記エピジチオジオキソピペラジン化合物の誘導体とは、活性を示す母核としてエピジチオジオキソピペラジン環を含む化合物を意味する。前記誘導体は、化学式（４）で表される化合物の環のＮＨ基又はＣＨ基が当該技術分野で公知の種類の様々な置換基に置換された化合物であってもよく、通常の技術者にとって明らかな様々な化合物を結合させた構造を有する化合物であってもよいが、これらに限定されるものではない。化学式（４）の化合物構造の改変、置換は、例えば次の過程により当業者が容易に行うことができる。

化学式（４）～（１４）の化合物は、公知の方法を参照して当業者が合成することにより用いることができる。具体的な合成方法は、特許文献１に開示されている方法を参照した。

本発明の組成物は、ＰｒｘＩＩの細胞内活性を模倣することにより固形癌の予防又は治療効果を達成することができるが、具体的な作用機序がこれに限定されるものではない。例えば、本発明の組成物に含まれるエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、ＰｒｘＩＩの活性を模倣することができるので、ペルオキシレドキシン発現が低いか、全く発現しない癌細胞を標的化して抗癌活性を示すことができるが、これらに限定されるものではない。

例えば、本発明の組成物を用いて予防又は治療できる固形癌は、具体的には乳癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌又は膵臓癌であるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「薬学的に許容される塩」とは、前記化合物又は誘導体の望ましい生物学的及び／又は生理学的活性を有し、望ましくない毒物学的効果を最小限に抑えたあらゆる塩を意味する。本発明においては、分子内のジスルフィド結合を含むジケトピペラジン環を保持するものであれば、いかなる種類の塩であってもよい。塩としては、薬学的に許容される遊離酸（free acid）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば化合物を過剰量の酸水溶液に溶解し、その塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルを用いて沈殿させて作製する。等モル量の化合物及び水中の酸又はアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次に上記混合物を蒸発させて乾燥させるか、又は析出した塩を吸引濾過させてもよい。ここで、遊離酸としては無機酸と有機酸を用いることができ、無機酸としては塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸などを用いることができ、有機酸としてはメタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸（maleic acid）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸（fumaric acid）、マンデル酸、プロピオン酸（propionic acid）、クエン酸（citric acid）、乳酸（lactic acid）、グリコール酸（glycollic acid）、グルコン酸（gluconic acid）、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（glutaric acid）、グルクロン酸（glucuronic acid）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

また、塩基を用いて薬学的に許容される金属塩を形成することができる。アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、例えば化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液に溶解し、溶解しない化合物の塩を濾過して濾液を蒸発、乾燥させて得る。ここで、金属塩としては、特にナトリウム、カリウム又はカルシウム塩を製造することが製薬上好ましいが、これらに限定されるものではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を好適な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。

本発明によるエピジチオジオキソピペラジン化合物又はその誘導体の薬学的に許容される塩には、特に断らない限り、存在し得る酸性基又は塩基性基の塩が全て含まれる。例えば、薬学的に許容される塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩などが挙げられ、アミノ基のその他の薬学的に許容される塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、ｐ－トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）などが挙げられ、当該技術分野で公知の塩の製造方法で製造することができる。

本発明による組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。前記組成物は滅菌されているか、無菌性であり、その溶液も滅菌されているか、無菌性であり、水、緩衝剤、等張化剤、又は動物もしくはヒトに適用してもアレルギー又はその他の有害な反応を起こさない、当該技術分野の通常の知識を有する者に公知のその他の成分を含んでもよい。

本発明における「薬学的に許容される担体」には、任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤などが含まれる。薬学的活性物質用として上記媒体及び製剤を用いることは当該技術分野で公知である。活性成分と非混和性である通常の媒体又は製剤以外に、治療学的組成物におけるそれらの使用も考えられる。また、補充性活性成分を当該組成物に混入してもよい。

前記組成物は、液剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤などの剤形に製造してもよく、非経口で用いてもよい。前記組成物の用量は、血管再狭窄防止における通常の用量を用いることができ、患者の年齢、性別、健康状態、体内での活性成分の吸収度、不活性率、併用される薬物などに応じて異なる用量が適用されることが好ましい。

また、本発明は、前記薬学的組成物を必要とする個体に前記薬学的組成物を投与するステップを含む、固形癌を予防又は治療する方法を提供する。

本発明における「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により固形癌の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記薬学的組成物の投与により固形癌による症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

本発明における「個体」とは、固形癌が発症したか、発症するリスクのある、ヒトをはじめとする、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどのあらゆる動物を意味し、本発明の薬学的組成物を個体に投与することにより、前記疾患を効果的に予防又は治療することができる。また、本発明の薬学的組成物は、公知の固形癌治療剤と並行して投与してもよい。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾病の重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、配合又は同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により当業者が容易に決定することができる。

本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、いかなる一般的な経路で投与してもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の薬学的組成物は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。好ましい投与方法及び製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などである。注射剤は、生理食塩液、リンゲル液などの水性溶剤や、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて作製することができ、変質を防止する安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨを調節する緩衝剤、微生物の増殖を阻止する保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの薬学的担体を含んでもよい。

本発明の薬学的組成物は、固形癌の予防又は治療のために、有効成分としてエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物又はその薬学的に許容される塩以外の公知の固形癌の予防又は治療に用いられる公知の薬物、例えば公知の抗癌剤をさらに含んでもよい。さらに、これらの疾患の治療のために、公知の他の治療と併用してもよい。他の治療としては、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、骨髄移植、幹細胞治療、他の生物学的治療、免疫治療などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

例えば、前記癌疾患は、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、肝癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、前立腺癌、胆嚢癌、胆道癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭部癌、子宮癌、直腸癌、脳腫瘍、肛門周囲腺癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、尿管癌、腎臓細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、神経膠腫、神経膠肉腫、退形成星細胞腫、髄芽腫、頸部癌、脊索腫、咽頭癌、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、結腸直腸癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、睾丸腫瘍、ウィルムス腫瘍、ユーイング腫瘍、血管肉腫、内皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺肉腫、乳頭状肉腫、乳頭状腺癌、嚢性腺肉腫、気管支癌、髄様癌、肥満細胞腫、中皮腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起膠腫、聴神経腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、上衣腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胚性癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫又はそれらの転移癌であってもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

実験例１：細胞株及び培養条件
ＡＴＣＣ（american type culture collection）から乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ－５７８Ｔ、肺癌細胞株であるＡ５４９及びＨ４６０、胃癌細胞株であるＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４、皮膚癌細胞株であるＳＫ－ＭＥＬ－５及びＳＫ－ＭＥＬ－２８、結腸癌細胞株であるＲＫＯ及びＨＣＴ１１６、前立腺癌細胞株であるＰＣ３、膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１細胞、正常乳房細胞株であるＭＣＦ－１０Ａ、正常肺線維細胞株であるＩＭＲ９０、並びに正常結腸細胞株であるＣＣＤ－８４１を入手した。Ｈｓ－５７８Ｔ、Ｈ４６０、ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４細胞は、１０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum; FBS, Hyclone）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（penicillin）、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（streptomycin）で補強した高濃度グルコース（high-glucose）ＲＰＭＩ１６４０で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ａ５４９、ＰＣ３及びＰａｎｃ－１細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンで補強した高濃度グルコースＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）で培養した。ＳＫ－ＭＥＬ－５及びＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンで補強した高濃度グルコースＥＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium）で培養し、ＩＭＲ９０及びＣＣＤ－８４１細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンで補強した高濃度グルコースＭＥＭ（Minimum Essential Medium）で培養した。ＲＫＯ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンで補強した高濃度グルコースＭｃＣｏｙで培養し、ＭＣＦ－１０Ａ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンで補強したＤＭＥＭＦ１２で培養した。これらの細胞を５％ＣＯ_２大気、３７℃で継代培養（sub-culture）した。

実験例２：細胞増殖アッセイ
細胞（２×１０^３細胞／ウェル）を９６ウェルプレートで２４時間培養し、その後本発明の化合物で２時間処理した。前記細胞を新鮮な完全培地に播種し、表記時間をかけて培養した。細胞増殖は、前記細胞をＷＳＴ－１試薬で１時間処理し、４５０ｎｍでホルマザン生成物の吸光度をＵＶ／ＶＩＳＥＬＩＳＡリーダーで測定した。

実験例３：細胞生存率アッセイ
細胞毒性を確認することのできるＩＣ_５０値を決定するために、細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに分注し、様々な濃度の表記化合物で２４時間処理した。細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光アッセイ試薬キット（Promega, G7570）で測定し、発光をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。ビヒクル対照群（０．１％ＤＭＳＯ処理細胞）に対する細胞成長の百分率を算出した。

実験例４：細胞周期アッセイ
細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を６ウェルプレートで２４時間培養し、その後本発明の化合物で２時間処理した。前記細胞を新鮮な完全培地に播種し、さらに２４時間培養した。前記細胞を４℃で７０％エタノールに一晩固定し、冷たいＰＢＳで洗浄し、その後ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ溶液に３７℃で３０分間再浮遊（re-suspended）させた。前述した浮遊細胞をヨウ化プロピジウム（propidium iodide; PI, ５０μｇ／ｍＬ, Invitrogen）で５分間染色し、フローサイトメトリー（flow cytometry, FACS Calibur, BD）を行った。細胞集団（cell population）をＭｏｄｉＦｉｔＬＴソフトウェアで分析した。

実験例５：転移アッセイ
細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を６ウェルプレートで２４時間培養し、その後本発明の化合物で２時間処理した。処理後に、０．５％ＦＢＳを含有する新鮮な培養培地でさらに１２時間培養し、前記細胞を血清飢餓（serum-starved）させた。底層を０．１％ゼラチンＢ（Sigma Aldrich）で予めコーティングした２４ウェルトランスウェル培養プレート（Costar）の上部チャンバ（upper chamber, ８μｍ気孔サイズ）に、血清飢餓させた細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を移した。下部チャンバには、２０％ＦＢＳを含有する培養培地を充填した。プレーティングの２４時間後に、上部チャンバ内の移動しない（non-migrated）細胞を除去した。上部から移動しない細胞を除去し、その後上部チャンバをメタノールで固定し、０．６％ヘマトキシリン（hematoxylin, DAKO）で染色した。染色された細胞の写真を撮って計数した。移動した細胞（migratory cells）の数は、３つのウェルにおける値を平均した。

実験例６：コロニー形成アッセイ
細胞（２×１０^３細胞／ウェル）を６ウェルプレートで２４時間培養し、その後本発明の化合物で２時間処理した。前記細胞を新鮮な完全培地（complete media）に播種し、さらに１０日間培養した。前記細胞をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色した。青色に染色されたコロニーを手動で計数した。

実験例７：マウス異種移植アッセイ
Ａ５４９、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＭＫＮ－２８及びＬｕｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（２×１０^６細胞）を１００μＬのマトリゲル（Matrigel）溶液（BD Biosciences）に浮遊させ、５週齢の雄マウスに皮下注射した。７日後に、マウスに１００μＬのビヒクルコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）及び表記化合物（３００μｇ／ｋｇ）を３日おきに２０日間腹腔内注射した。Ａ５４９、ＳＫ－ＭＥＬ２８及びＭＫＮ２８細胞により誘導された腫瘍において、異種移植された腫瘍の幅（width; W）及び長さ（length; L）のキャリパー測定により次の式で腫瘍の体積を算出した。

(数１)
体積＝［Ｌ×Ｗ^２］／２

Ｌｕｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞により誘導された腫瘍においては、２Ｄ光トポグラフィ（optical topography）により腫瘍体積を測定した。簡単に述べると、マウスにＤ－ルシフェリン溶液（１５０ｍｇ／ｋｇ, Caliper Life Sciences）を腹腔内注射し、１０分後に２％イソフルラン（isoflurane）で麻酔し、次いでＩＶＩＳ２００システム（Xenogen）により１０秒間の映像を撮影した。

実験例８：免疫組織化学及び免疫蛍光
パラフィンブロックに包埋した腫瘍組織試料を４μｍの厚さに切断した。標準プロトコルに従って組織切片を脱パラフィン化し、一連の等級化アルコール（a series of graded alcohols）に再水和した。抗原を抗原アンマスキング溶液（antigen unmasking solution; VECTOR, H-3300-250）に９５℃で１５分間浸漬し、温度が室温まで低下したらＰＢＳで洗浄した。内在性ペルオキシダーゼ活性（endogenous peroxidase activity）をＢＬＯＸＡＬＬ（登録商標）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓブロッキング溶液（Blocking Solution）で低下させ、３０分間インキュベーションした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に正常ヤギ血清を含有させたブロッキング溶液で１時間ブロッキングし、その後組織切片を抗Ｋｉ６７抗体（１：１００, Invitrogen, PA1-38032）と室温で２時間反応させた。免疫組織化学（immunohistochemistry; IHC）のために、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００でビオチン化した二次抗体（１：２００）と室温で１時間インキュベーションした。スライド上にＩｍｍＰＡＣＴ（登録商標）ＤＡＢ基質（VECTOR, SK-4105）を添加して陽の色を表した。免疫蛍光（immunofluorescence; IF）のために、洗浄したスライドを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で蛍光体に結合した二次抗体（１：２００）と１時間インキュベーションした。蛍光を可視化して共焦点顕微鏡（Nikon A1R）でイメージ化した。

実験例９：ＴＵＮＥＬアッセイ
Ｌｕｃ－ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＫＮ－２８異種移植腫瘍試料を外科的に分離し、その後ＯＣＴ（optimal cutting temperature）化合物溶液に入れてドライアイス上で１０分間凍結包埋し、次いで凍結試料を１０μｍの厚さに切断した。組織切片を蒸留水で１０分間洗浄し、４％ホルマリンで２０分間固定した。その後、組織切片をＰＢＳで３０分間洗浄し、透過化溶液（permeabilization solution, 0.1% Triton X-100）で５分間インキュベーションした。アポトーシス細胞（apoptotic cells）をＩｎｓｉｔｕ細胞死検出キット（In situ Cell Death Detection Kit, Roche,11684795910）によりメーカーの指示に従って可視化した。細胞の画像を顕微鏡（Zeiss LSM880 Airyscan）により得た。

実験例１０：患者由来腫瘍異種移植実験
動物実験は、ソウル大学校医科大学の動物実験倫理委員会（Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC）の承認を受け、ＡＲＲＩＶＥ（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments）指針を遵守した。患者由来（patient-derived）肺腫瘍を４週齢及び１７週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ－ＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ）及びヒト化（humanized）ＮＳＧ（ＨｕＮＳＧ）マウスの背中にそれぞれ皮下移植（subcutaneously implanted）した。ＰＢＳに溶解した化学式（７）の化合物（Ａ５，３００ｍｇ／ｋｇ）及び／又はペムブロリズマブ（pembrolizumab, humanized anti-PD-1 antibody, ５ｍｇ／ｋｇ）を前記マウスにそれぞれ３日おきに３週間及び５日おきに３週間腹腔内（intraperitoneally）注射した。腫瘍を２８日間成長させ、除去して計量した。腫瘍体積をノギス（Vernier calipers）で３日おきに測定し、次の式で計算した。

(数２)
Ｖ＝ａ×ｂ^２／２

上記式において、ａ及びｂはそれぞれ長軸及び短軸の外径（superficial diameter）を示す。

天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体による細胞毒性及び癌細胞増殖抑制効果
実験例１で準備した癌細胞のうち乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ－５７８Ｔに対して、対照群ビヒクルとしてのＤＭＳＯ及び天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるグリオトキシンで処理し、実験例２のように、処理化合物の各濃度における細胞毒性及び増殖率を算出した。その結果を図１に示す。

図１のＡに示すように、グリオトキシン及びケトミンで処理すると、約２００ｎＭの濃度までは８０％以上の高い細胞生存率を示す。これは、当該濃度でこれらの化合物が細胞毒性を有さないことを示唆するものであるので、以下の薬理活性を確認するための実験においては、上記範囲内の濃度を選択的に用いた。

一方、図１のＢ及びＣに示すように、対照群であるＤＭＳＯ処理細胞に比べて、グリオトキシン（１００ｎＭ）又はケトミン（５０ｎＭ）で処理した細胞において、増殖率が大幅に減少した。これは、天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体が効果的に癌細胞増殖を抑制することを示すものである。

天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体による癌細胞の細胞周期進行に対する阻害効果
実験例１で準備した癌細胞のうち乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ－５７８Ｔに対して、天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるグリオトキシンで処理し、又は処理せず、実験例４のように、細胞周期を分析し、Ｇ１相の細胞百分率を算出した。その結果を図２に示す。

図２に示すように、グリオトキシンを添加して培養すると、Ｇ１相の細胞百分率が未処理群に比べて１０％以上増加することが確認された。

天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体による癌細胞の転移活性抑制効果
実験例１で準備した癌細胞のうち乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ－５７８Ｔに対して、対照群ビヒクルとしてのＤＭＳＯ及び天然エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるグリオトキシンで処理し、実験例５のように、ＦＢＳ含有培地への細胞移動を観察し、移動した細胞数を計数した。その結果を図３及び図４に示す。

図３及び図４に示すように、グリオトキシン及びケトミンで処理すると、血清含有培地に誘導される乳癌細胞の移動が大幅に減少した。

合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による選択的な癌細胞死滅効果
本発明の合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による様々な癌細胞及び正常細胞に対する細胞毒性効果を確認した。その結果を図５に示す。図５に示すように、本発明の合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体は、３種の正常細胞（ＭＣＦ－１０Ａ，ＩＭＲ９０，ＣＣＤ－８４１）に比べて、各種癌細胞株において著しく低いＩＣ_５０値を示した。これは、正常細胞でない癌細胞を選択的に死滅させることを示すものである。

合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による癌細胞コロニー形成抑制効果
実験例１で準備した癌細胞のうち、乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ－５７８Ｔ、肺癌細胞株であるＡ５４９及びＨ４６０、胃癌細胞株であるＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４、皮膚癌細胞株であるＳＫ－ＭＥＬ－５及びＳＫ－ＭＥＬ－２８、結腸癌細胞株であるＲＫＯ及びＨＣＴ１１６、前立腺癌細胞株であるＰＣ３、並びに膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ－１に対して、対照群ビヒクルとしてのＤＭＳＯ、並びに合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるＡ２、Ａ５及びＡ１０で処理し、実験例６のように、これらの癌細胞に対するエピジチオジオキソピペラジン誘導体の死滅活性を肉眼で観察し、形成されたコロニー数を計数した。その結果を図６～図１２に示す。

図６～図１２に示すように、程度の差はあるが、Ａ２、Ａ５及びＡ１０の全てにおいて、非特異的な細胞毒性（cytotoxicity）を示さない低い濃度（５０ｎＭ及び２００ｎＭ）でこれらの癌細胞のコロニー形成が効率的に阻害された。例えば、Ａ１０化合物においては、５０ｎＭの濃度でもほとんどの癌細胞に対してコロニー形成を抑制したが、Ａ２及びＡ５においては、５０ｎＭの濃度で処理すると、対照群ビヒクル処理群と同等又は多少優れたコロニー形成抑制効果を示し、２００ｎＭに処理濃度を上昇させると、テストした細胞全体で肉眼でも確認可能なレベルで著しく優れたコロニー形成阻害効果を示した。

合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による異種移植に対する成長抑制効果
実験例７で準備した各種癌細胞株を注入して作製したマウス異種移植モデルにおいて、本発明の合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体での処理による腫瘍成長抑制効果を確認した。その結果を図１３に示す。具体的には、３０日までは本発明の化合物を投与して腫瘍大きさを測定し、最終日の３０日にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出してその体積と重量を測定した。対照群としては、本発明の化合物の代わりに、ビヒクルとしてＤＭＳＯを投与したマウスを用いた。図１３に示すように、本発明の化合物での処理により、肺癌、皮膚癌、胃癌及び乳癌細胞株による全ての異種移植腫瘍の成長が大きく阻害され、形成された腫瘍の大きさが対照群に比べて著しく小さかった。これは、本発明の化合物が腫瘍の成長を効果的に阻害することを示すものである。

合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による生体内癌細胞増殖抑制効果
実験例８及び９における免疫組織化学、免疫蛍光及びＴＵＮＥＬアッセイを用いて、合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による生体内癌細胞増殖抑制効果を確認した。その結果を図１５に示す。図１５に示すように、本発明の化合物で処理すると、乳癌及び胃癌細胞株の両方において、腫瘍の増殖性に関与するＫｉ－６７の発現が対照群に比べて大幅に減少した。それに対して、癌細胞の死滅を測定するＴＵＮＥＬ染色を用いた場合、ビヒクル対照群及び本発明の化合物で処理すると、全てにおいて細胞死滅が観察されなかった。これらのＴＵＮＥＬアッセイの正確度は、組織切片をＤＮａｓｅで処理して人為的にＤＮＡ損傷を誘発することにより検証した（図１５のＧ）。これらは、本発明の化合物が癌細胞の死滅ではなく、増殖を効果的に抑制することにより、癌疾患に対する予防又は治療効果を発揮することを示唆するものである。

合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体による腫瘍成長抑制効果
実験例１０で準備した患者由来肺腺癌腫瘍を移植して準備したマウスモデルを、代表的な合成エピジチオジオキソピペラジン誘導体であるＡ５で処理せず、又は単独もしくは癌免疫治療に用いられることが知られているヒト化抗体であるペムブロリズマブと併用して処理し、腫瘍の体積変化を周期的に観察した。その結果を図１５に示す。

図１５に示すように、ＮＳＧマウスの非処理対照群においては、時間経過に伴って腫瘍の体積が増加するのに対して、Ａ５処理群においては、腫瘍の体積増加が抑制され、ヒト化ＮＳＧマウス（ＨｕＮＳＧ）にＡ５を投与すると、非処理対照群に比べて腫瘍の大きさが減少するという効果を発揮するだけでなく、ペムブロリズマブ処理群やペムブロリズマブと併用して処理した実験群に比べて、Ａ５単独処理群において、腫瘍の成長を抑制し、さらに腫瘍の大きさを減少させるという、より優れた効果を示した。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims

下記化学式（１）で表されるエピジチオジオキソピペラジン（epidithiodioxopiperazine）環に分子内ジスルフィド結合を含む母核構造に基づくエピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、固形癌の予防又は治療用薬学的組成物。
前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、下記化学式（２）又は（３）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、下記化学式（１－１）で表される化合物である、請求項１に記載の組成物。

前記化学式（１－１）において、
Ｒ_１～Ｒ_４はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１－６直鎖もしくは分岐鎖アルキル（alkyl）、アルケニル（alkenyl）、アルキニル（alkynyl）、Ｃ_１－６アルコキシ－アリール－Ｃ_１－６アルキル、又は５～１０員ヘテロアリール－Ｃ_１－６アルキルであるか、
Ｒ_１とＲ_２、及びＲ_３とＲ_４がそれぞれ独立して互いに連結され、それらが結合された炭素及び窒素原子を含む４～１０員ヘテロサイクルを形成する。
前記化学式（１－１）で表される化合物は、化学式（４）～（１４）の化合物から選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の組成物。
前記エピジチオジオキソピペラジン誘導体化合物は、化学式（２）、（３）、（５）、（７）又は（１４）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
前記固形癌の予防又は治療は、ＰｒｘＩＩの細胞内活性を模倣することにより達成される、請求項１に記載の組成物。
前記固形癌は、乳癌、肺癌、胃癌、皮膚癌、結腸癌、前立腺癌又は膵臓癌である、請求項１に記載の組成物。