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JP2022544771A - 優先的にｉｌ－２ｒアルファに結合するｉｌ－２融合タンパク質 - Google Patents

優先的にｉｌ－２ｒアルファに結合するｉｌ－２融合タンパク質 Download PDF

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JP2022544771A JP2022508874A JP2022508874A JP2022544771A JP 2022544771 A JP2022544771 A JP 2022544771A JP 2022508874 A JP2022508874 A JP 2022508874A JP 2022508874 A JP2022508874 A JP 2022508874A JP 2022544771 A JP2022544771 A JP 2022544771A
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Abstract

本発明はインビトロおよびインビボで制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を優先的に活性化する新規の単離ＩＬ－２融合分子を提供する。さらに、炎症性疾患や自己免疫疾患を治療するために、該新規融合分子を製造および使用する方法も含まれる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１９年８月１２日に出願された米国仮出願第６２／８８５,４７１号、２０２０年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／０１５,６４４号、２０２０年５月２日に出願された米国仮出願第６３／０１９,３１９号および２０２０年６月２５日に出願された米国仮出願第６３／０４４,２９４号に基づく優先権を主張する。優先権主張出願の内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願はASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体を引用することにより、本明細書に組み込む。２０２０年８月１２日に作成された当該ASCIIコピーは025471_WO005_SL.txtなる名称であり、１６３,７０８バイトサイズである。
発明の背景
インターロイキン２(ＩＬ－２)はリンパ球の生成、生存、ホメオスタシスに中心的な役割を果たしている。１３３個のアミノ酸を有し、機能に不可欠な四次構造を形成する４個の逆平行、両親媒性α－ヘリックスからなる(Smith, Science (1988) 240:1169-76; Bazan, Science (1992) 257:410-13)。ＩＬ－２は最大で３個の独立したサブユニットからなるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)に結合することで、その活性を発揮する。α(ＣＤ２５またはＴａｃ抗原)、β(ＣＤ１２２)、γ(γｃ、共通γ鎖またはＣＤ１３２)のサブユニットの結合はＩＬ－２に対する三量体、高親和性受容体をもたらす(ＫＤ約０.０１nM)。βサブユニットとγサブユニットからなる二量体ＩＬ－２受容体は中親和性ＩＬ－２Ｒ(ＫＤ約１nM)と呼ばれている。αサブユニットは単独で単量体低親和性ＩＬ－２受容体を形成する(ＫＤ約１０nM)。例えば、Kim et al., Cytokine Growth Factor Rev. (2006) 17:349-66参照。二量体中間親和性ＩＬ－２受容体は三量体の高親和性受容体よりも約１００倍低い親和性でＩＬ－２を結合するが、二量体および三量体のＩＬ－２受容体の両者ともＩＬ－２の結合によりシグナルを伝達できる(Minami et al., Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-68)。このように、αサブユニットは受容体のＩＬ－２への高親和性結合を助けるものの、ＩＬ－２シグナル伝達には必須ではないと考えられる。しかしながら、βおよびγサブユニットはＩＬ－２シグナル伝達に必須である(Krieg et al., Proc Natl Acad Sci. (2010) 107:11906-11)。三量体ＩＬ－２受容体はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞に発現する。Ｔｒｅｇ細胞はインビボで一貫して最高レベルのＩＬ－２Ｒαを発現する(Fontenot et al., Nature Immunol. (2005) 6:1142-51)。また、慣用の活性化Ｔ細胞では三量体ＩＬ－２受容体が一過性に誘導されるが、休止状態ではこれら細胞は二量体のＩＬ－２受容体しか発現していない。
公開されたＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒ複合体の結晶構造(Wang et al., Science (2005) 310:1159-63)に基づいて、研究者たちはＣＤ２５、ＣＤ１２２および／またはＣＤ１３２との相互作用を調節するためにＩＬ－２に変異をしている。一例として、ヒトＩＬ－２のＤ２０、Ｎ８８またはＱ１２６の変異はＴ細胞を活性化する効力対ＮＫ細胞を活性化する効力の改変を示したことが報告される(米国特許第６,９５５,８０７号)。別の例では６９位および７４位に変異があるＩＬ－２はＣＤ２５と強固に結合するが、８８位または９１位の変異はＣＤ１２２との相互作用を阻害し、１２６位の変異はＣＤ１３２との相互作用を阻害することが示された(ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０６１８５３)。
Ｔｒｅｇ細胞は自己免疫を抑制し、炎症を制御するのに必須である。ＦＯＸＰ３－ＣＤ２５＋ Ｔエフェクター細胞(Ｔｅｆｆ)はＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞であり得て、何れも炎症、自己免疫、臓器移植片の拒絶または移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)の原因となる。ＩＬ－２刺激ＳＴＡＴ５シグナルは正常なＴｒｅｇ細胞増殖および生存ならびに高ＦＯＸＰ３発現に不可欠である。
Ｔｒｅｇの活性におけるＩＬ－２の役割にもかかわらず、Ｔｒｅｇ活性を制御するための安全かつ効果的なＩＬ－２ベースの治療法は臨床的に証明されていない。したがって、炎症性疾患や自己免疫疾患の処置のために、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に拡大または刺激するＩＬ－２ベースの治療を開発する必要がある。
発明の概要
本発明は担体部分、サイトカイン部分および１以上のマスキング部分を含む、単離ＩＬ－２融合分子を提供し、ここで、サイトカイン部分は担体部分またはマスキング部分に融合され、１以上のマスキング部分は担体部分またはサイトカイン部分に融合される。サイトカイン部分は(ｉ)Ｃ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓの置換または(ii)Ｔ３Ａ、Ｃ１２５Ｓ、Ｖ６９ＡおよびＱ７４Ｐから選択される１以上の置換(ナンバリングは配列番号１に従う)を含むＩＬ－２アミノ酸配列を含むＩＬ－２ポリペプチドであり、１以上のマスキング部分はサイトカイン部分に結合し、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞)上のＩＬ－２Ｒαではなく、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγへのサイトカイン部分の結合を阻害する。ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドは野生型ＩＬ－２と同等またはそれ以上の親和性でＩＬ－２Ｒαに結合する。
本発明はまた、炎症状態または自己免疫疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、担体部分、サイトカイン部分および１以上のマスキング部分を含む治療量の単離ＩＬ－２融合分子を投与することを含み、ここで、サイトカイン部分が担体部分にまたはマスキング部分に融合されており、１以上のマスキング部分が担体部分またはサイトカイン部分に融合しており、サイトカイン部分がＩＬ－２ポリペプチドを含み、１以上のマスキング部分はサイトカイン部分に結合し、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞)上のＩＬ－２Ｒαではなく、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγへのサイトカイン部分の結合を阻害する、方法も提供する。ある実施態様において、炎症状態または自己免疫疾患は喘息、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、アレルギー、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、臓器移植片拒絶反応および移植片対宿主病からなる群から選択される。
ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドは野生型ＩＬ－２と同等またはそれ以上の親和性でＩＬ－２Ｒαに結合する。
ある実施態様において、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログは配列番号３と少なくとも９５％(例えば、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％)同一のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログは配列番号６と少なくとも９５％(例えば、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％)同一のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドは配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、所望により、アミノ酸配列は配列番号２である。
ある実施態様において、ＩＬ－２融合分子はＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含むマスキング部分を含み、マスキング部分はペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、担体部分に融合される。他の実施態様において、ＩＬ－２融合分子はＩＬ－２ＲβもしくはＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む第１マスキング部分(ここで、第１マスキング部分はペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、担体部分に融合される)およびＩＬ－２ＲγもしくはＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログを含む第２マスキング部分(ここで、第２マスキング部分はペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、サイトカイン部分または第１マスキング部分に融合される)を含む。ある実施態様において、本発明のＩＬ－２融合分子は少なくとも２個のマスキング部分を含み、その一方はＩＬ－２ＲαのＥＣＤまたはその機能的アナログであり、ＩＬ－２ＲαのＥＣＤマスキング部分は開裂可能なペプチドリンカーを介して、サイトカイン部分、担体部分または別のマスキング部分に融合される。特定の実施態様において、ＩＬ－２Ｒα ＥＣＤ部分は配列番号７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、サイトカイン部分は開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体部分またはマスキング部分に融合され、マスキング部分は開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体部分またはサイトカイン部分に融合される。特定の実施態様において、マスキング部分は少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも１８個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２２個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸または最大４４個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、担体部分またはサイトカイン部分に融合される。
ある実施態様において、担体部分はＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミンフラグメント、抗体のＦｃドメイン、抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される。ある実施態様において、担体部分は抗体Ｆｃドメインであり、融合分子はＮ末端からＣ末端方向で、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｅ２およびＦ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｅ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖と、Ｎ末端からＣ末端方向で、分子式Ｆ２－Ｌ３－Ｃを含む第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、ここでＦ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である。他の実施態様において、担体部分は抗体Ｆｃドメインであり、融合分子はＮ末端からＣ末端方向で、Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１、Ｅ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｆ１およびＥ２－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｆ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖と、Ｎ末端からＣ末端方向で、分子式Ｃ－Ｌ３－Ｆ２を含む第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、ここで、Ｆ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である。他の実施態様において、担体部分は抗体Ｆｃドメインであり、融合分子は、Ｎ末端からＣ末端方向で、次の
Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ２、
Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｃ、
Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ１、
Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｃ、
Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、
Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｆ２、
Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２および
Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｆ２
の組から選択される分子式で構成される第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、ここで、Ｆ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である。ある実施態様において、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は開裂可能ではない。特定の実施態様において、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は独立して、配列番号４０～４６、５５～５７および５９から選択されるアミノ酸配列を有する。他の特定の実施態様において、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つは２０～４４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。
特定の実施態様において、本発明のＩＬ－２融合分子は配列番号５０、５１または５２と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号５３または５４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖を含む。特定の実施態様において、本発明のＩＬ－２融合分子は配列番号５０と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖と、配列番号５３と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖を含む。
ある実施態様において、本発明のＩＬ－２融合分子は以下の特性:
(ａ)α、βおよびγサブユニットを有する高親和性のＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒαβγ)に、βおよびγサブユニットを有する中間型ＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒβγ)の１００倍以上の親和性で結合する、
(ｂ)３７℃の表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約５nM以上または１０nM以上のＫＤでＩＬ－２Ｒβγに結合する、
(ｃ)ＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイにおいて、約１nM未満かつ０.０１nM、０.２５nMまたは０.０５nM以上のＥＣ５０値を有する、
(ｄ)ＮＫ９２細胞の増殖アッセイにおいて、約０.０５nM、０.１nM、０.２５nMまたは０.５nMよりも大きいＥＣ５０値を有する、
(ｅ)中和ＣＤ２５抗体の存在下でのＮＫ９２細胞の増殖アッセイにおいて、中和ＣＤ２５抗体の非存在下と比較して、Ｅｍａｘ値が少なくとも５倍または少なくとも１０倍低い、
(ｆ)Ｔエフェクター細胞やＮＫ細胞よりも、ＦＯＸＰ３＋ Ｔ制御細胞を優先的に刺激する、
(ｇ)ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の成長または生存を促進する、および
(ｈ)はＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導するが、ＦＯＸＰ３－ Ｔ細胞においてはＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導する能力が低下する、
の１つ以上を有する。
他の態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２融合分子および薬学的に許容される賦形剤；ＩＬ－２融合分子をコードする１以上のポリヌクレオチド、１以上のポリヌクレオチドを含む１以上の発現ベクター；およびベクターを含む宿主細胞を含む医薬組成物であって、宿主細胞は原核細胞または哺乳類細胞などの真核細胞であり得る、医薬組成物も提供する。ある実施態様において、哺乳類宿主細胞はｕＰＡ、ＭＭＰ－２および／またはＭＭＰ－９をコードする遺伝子または遺伝子がノックアウトされる(例えば、これらの遺伝子の１以上のヌル変異を含む)。したがって、本発明はまた、ＩＬ－２融合分子を製造する方法であって、ＩＬ－２融合分子の発現を可能にする条件下で哺乳類細胞である宿主細胞を培養し、ＩＬ－２融合分子を単離することを含む、方法を提供する。
本発明の他の特徴、目的および利点は以下の詳細な説明で明らかになる。しかし、詳細な説明は本発明の実施態様および態様を示すものの、限定するものではなく、例示のために示されることを理解すべきである。本発明の範囲内での様々な変更および修正は詳細な説明から当業者には明らかになる。
図１Ａおよび１ＢはＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)とＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図１Ａ)または開裂可能なリンカー(図１Ｂ)を介して、他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。「ノブ・イントゥ・ホール」はＦｃポリペプチドのノブ・イントゥ・ホール変異を示す。
図２Ａおよび２Ｂは、ＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子と、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤのＣ末端にＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤはもう一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に、開裂不可能なリンカーを介して融合する。ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図２Ａ)または開裂可能なリンカー(図２Ｂ)を介して、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤのＣ末端に融合される。
図３Ａおよび３ＢはＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤとＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子と、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤはもう一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に、開裂不可能なリンカーを介して融合する。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図３Ａ)または開裂可能なリンカー(図３Ｂ)を介して、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤのＣ末端に融合される。
図４Ａおよび４Ｂは、ＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子およびＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端にＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤは開裂可能なリンカーを介してＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端と融合される。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図４Ａ)または開裂可能なリンカー(図４Ｂ)を介して、他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。
図５Ａおよび５ＢはＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤとＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子およびＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒβは開裂可能なリンカーを介して、ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図５Ａ)または開裂可能なリンカー(図５Ｂ)を介して、他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合される。
図６Ａおよび６Ｂは、ＦｃドメインのＣ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤが融合し、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤのＣ末端にＩＬ－２ポリペプチドが融合したＩＬ－２融合分子の模式図である。図６ＡではＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤは開裂可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合され、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂不可能なリンカーを介して他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合され、ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介してＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤのＣ末端に融合される。図６ＢではＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂可能なリンカーを介して一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合され、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤは開裂不可能なリンカーを介して他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合され、ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なリンカーを介してＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤのＣ末端に融合される。
図７Ａおよび７Ｂは、ＦｃドメインのＮ末端にＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２ポリペプチドを融合させたＩＬ－２融合分子の模式図である。ＩＬ－２ポリペプチドは１つのＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは開裂不可能なリンカー(図７Ａ)または開裂可能なリンカー(図７Ｂ)を介して、他のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。
図８は、図１Ｂに示される概略構造を有する、配列番号１２および２３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する２個のポリペプチド鎖から構成されるＩＬ－２融合分子ＪＲ３.１１６.５のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
図９はプロテアーゼ処理による活性化の前と後のＩＬ－２融合分子ＪＲ３.１１６.５のＣＴＬＬ２ベースの生物活性アッセイの結果を示す。
図１０Ａおよび１０ＢはＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｃ２、９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２の模式図である。９８２ Ｃ１および９８２ Ｃ２はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤの２個のマスキング部分を持ち、ＩＬ－２のムテインがＩｇＧ４のＦｃドメインのＣ末端に融合される。図１０Ａは(Ｇ４Ｓ)２ＡＡ(Ｇ４Ｓ)２(配列番号５９)の開裂不可能なリンカーを介して、１個のＩｇＧ４ ＦｃポリペプチドのＣ末端に融合したＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤを示す。ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤは配列番号４６に示すとおり、４３アミノ酸長の開裂不可能なリンカーを介して、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤのＣ末端に融合される。ＩＬ－２ムテインは開裂不可能なリンカーを介して他のＩｇＧ４ポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２のムテインはＣ１２５Ａの置換(９８２ Ｃ１)またはＴ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｖ６９Ａ／Ｑ７４Ｐの置換(９８２ Ｃ２)を有する。図１０Ｂは(Ｇ４Ｓ)２ＡＡ(Ｇ４Ｓ)２(配列番号５９)の開裂不可能なリンカーを介して、１個のＩｇＧ４ ＦｃポリペプチドのＣ末端に融合したＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤを示す。ＩＬ－２ムテインは開裂不可能なリンカーを介して他のＩｇＧ４ポリペプチドのＣ末端に融合される。ＩＬ－２のムテインはＣ１２５Ａの置換(９８２ Ｄ１)またはＴ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｖ６９Ａ／Ｑ７４Ｐの置換(９８２ Ｄ２)を有する。
図１１は、ＣＤ２５に対する中和抗体の存在下または非存在下で、９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２、ＩＬ－２および対照分子を用いたＮＫ９２細胞の増殖アッセイを示す。対照分子(９８２ Ｒｅｆ)はＶ９１ＫとＣ１２５Ａの変異を持つＩＬ－２を持つＦｃ－ＩＬ－２融合分子である。９８２－Ｒｅｆは各鎖が配列番号５８のアミノ酸配列を含むホモ二量体Ｆｃ－融合－ＩＬ－２ムテイン分子である。
図１２はＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２のラットＣＤ４＋ Ｔ細胞への結合を示す。Ｎ.Ｃ.は緩衝液対照である。
図１３Ａおよび１３ＢはＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１、９８２ Ｃ１および９８２ Ｄ２、９８２ ＲｅｆのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞への結合を示す。Ｎ.Ｃ.は緩衝液対照である。
図１４は９８２ Ｄ１、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ２、９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子によって誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞の濃度依存的増殖を示す。また、ＩＬ－２単独も試験した。
図１５はラットＰＫ試験における９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子の血清濃度の経時変化を示す。ラットに分子を皮下注射した。
図１６は２回目のラットＰＫ試験からの９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子の経時的な血清濃度を示す。
図１７Ａおよび１７Ｂは、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子で誘導したラットのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－細胞の割合の経時変化を示す。
図１８Ａおよび１８Ｂは、初回ＰＫ試験のラットにおいて、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆにより誘発されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞の増殖状態(増殖マーカーＫｉ６７で示される)の経時変化を示す。
図１９Ａおよび１９Ｂは、ラットのＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋および９８２ ＩＬ－２融合分子によって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－細胞の割合の経時変化を示す。
図２０Ａおよび２０Ｂは、ラットの９８２ ＩＬ－２融合分子によって誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞の増殖状態の経時変化を示す。
図２１は９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２および９８２ Ｒｅｆを単回皮下投与した後の各処置群の体重を示す。
発明の詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲における単数表現は、文脈から明らかに他のことが指示されない限り、複数表現を含む。本明細書ではある値またはパラメータにおける「約」の言及は、その値またはパラメータ自体に対する偏差を含む(そして意味する)。例えば、「約Ｘ」なる記載は、数値「Ｘ」を含む。さらに、一連の数字の前への「約」の使用は、その一連の引用された数字のそれぞれの「約」を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」なる記載は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」を記載することを意図する。
用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは相互作用するポリペプチドのセットをいい、抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、二重特異性または二特異性抗体、抗イディオタイプ抗体または二官能性ハイブリッド抗体)またはその抗原結合フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’’２＜／ｓｕｂ例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体(ｄＡｂ)またはダイアボディ)、一本鎖抗体およびイムノアドヘシンなどのＦｃ含有ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗体は何れの重鎖アイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ)またはサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)であってもよい。ある実施態様において、抗体は何れの軽鎖アイソタイプ(例えば、カッパまたはラムダ)であってもよい。抗体はヒト、非ヒト(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたは他の非ヒト動物由来)、キメラ(例えば、非ヒト可変領域とヒト定数領域を有する)またはヒト化(例えば、非ヒトＣＤＲとヒトフレームワークおよび定数領域を有する)であってもよい。ある実施態様において、抗体は誘導体化抗体である。
用語「サイトカインアゴニストポリペプチド」は、野生型サイトカインまたはその類似体をいう。野生型サイトカインのアナログは野生型サイトカインと同じ生物学的特異性(例えば、同じ受容体に結合し、同じ標的細胞を活性化する)を有するが、アナログの活性レベルは野生型サイトカインとは異なり得る。アナログは、例えば、野生型サイトカインのムテイン(すなわち、変異したポリペプチド)であってもよく、野生型サイトカインに対して、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の変異を含み得る。
用語「サイトカインアンタゴニスト」または「サイトカインマスク」は、サイトカインに結合し、それによりサイトカインが標的細胞の表面上の受容体に結合することを阻害しおよび／またはアンタゴニストまたはマスクによって結合される間にその生物学的機能を発揮することを阻害する、部分(例えば、ポリペプチド)をいう。サイトカインのアンタゴニストまたはマスクの例は、サイトカインと接触するサイトカインの天然の受容体の細胞外ドメインに由来するポリペプチドを含むが、これに限定されない。
用語「有効量」または「治療有効量」は、特定の障害、状態または疾患を処置、例えば、その症状の１つ以上を改善、緩和、軽減および／または遅延させるのに十分な、化合物または組成物の量をいう。
用語「機能的アナログ」は、対照分子と同じ生物学的特異性(例えば、同じリガンドに結合)および／または活性(例えば、標的細胞を活性化または阻害)を有する分子をいう。
２個のポリペプチド配列に関連する「融合された」または「融合」なる用語は、２個のポリペプチド配列がバックボーンのペプチド結合を介して結合することをいう。２個のポリペプチドは直接または１以上のアミノ酸長を持つペプチドリンカーを介して融合され得る。融合ポリペプチドは２個の融合パートナーのそれぞれのコード配列を含むコード配列から、間のペプチドリンカーのコード配列を伴いまたは伴わずに、組換え技術により製造され得る。ある実施態様において、融合は化学的なコンジュゲーションを包含する。
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、組成物に含まれる成分をいうために使用するとき、賦形剤が、ヒトを含む処置対象への投与に適しており、対象に過度の有害な副作用がなく、かつ医薬品有効成分(ＡＰＩ)の生物学的活性に影響を与えないことを意味する。
用語「対象」は、哺乳類をいい、ヒト、ペット(イヌ、ネコなど)、農場動物(ウシ、ウマなど)、齧歯類、霊長類を含むが、これらに限定されない。
本明細書使用する「処置」または「処置する」は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。有益で望ましい臨床結果には以下の１つ以上が含まれるが、これらに限定されるものではない：疾患に起因する１以上の症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の改善、疾患の安定化(例えば、疾患の悪化または進行の阻止または遅延)、疾患の拡散(例えば、転移)の阻止または遅延、疾患の再発の阻止または遅延、疾患の部分的または完全な寛解、疾患の安定化(例えば、疾患の悪化または進行の阻止または遅延)、疾患の拡大(例えば、転移)の阻止または遅延、疾患の再発の阻止または遅延、疾患の部分的または完全な寛解、疾患の処置に必要な１以上の他の薬剤の投与量の減少、患者の生活の質の向上および／または生存期間の延長。本発明の方法はこれらの処置の態様の何れか１つ以上を意図する。
本明細書に記載される様々な実施態様の特性の１つ、いくつかまたはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成できることは理解される。本書で使用されるセクションの見出しは整理を目的としたものであり、その下に記載される主題を限定するものとは解釈されるべきではない。
単離ＩＬ－２融合分子
本発明は炎症性疾患および自己免疫疾患の処置に有用なＩＬ－２融合分子を提供する。本発明者らはマスキング部分の開裂や除去を必要とせずに、所望のインビボ活性が達成されることに驚かされた。開裂不可能なペプチドリンカーを有するマスクドＩＬ－２融合分子は開裂可能にマスクされたＩＬ－２融合分子と比較して、多くの重要な利点を有する。例えば、開裂可能にマスクされたＩＬ－２分子は活性化されるためにプロテアーゼによるリンカーの開裂とマスキング部分の除去が必要である。疾患部位におけるプロテアーゼの分布が不均一であるため、サイトカインの活性化レベルが変動し、治療効果をさらに変動させ得る。さらに、循環中および／または製造中に非特異的な活性化が起こる可能性もあり、開裂可能にマスクされた分子に安全性の懸念と製造の複雑さが加わる。
ある実施態様において、本発明のＩＬ－２融合分子は中間親和性ＩＬ－２Ｒβγに対して減少した親和性(例えば、１nMよりも高い、５nMよりも高い、１０nMよりも高い、１００nMよりも高いまたは１μMよりも高いＫＤを有する)を有する一方で、ＩＬ－２Ｒα(ＣＤ２５)に対して野生型の親和性(例えば、ＫＤが約１０nM)を維持し、またはＩＬ－２Ｒαに対して、野生型親和性に類似する(例えば、ＫＤが約１～２０nM)または高い(例えば、ＫＤが１０nMよりも低い、５nMよりも低いまたは１nMよりも低い)親和性を有する。単離ＩＬ－２融合分子はＩＬ－２ポリペプチド(サイトカイン部分)、担体(担体部分)およびＩＬ－２アンタゴニスト(マスキング部分またはサイトカインアンタゴニスト)を含み得て、ここで、ＩＬ－２ポリペプチドは直接または開裂可能または開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体に融合されており、ＩＬ－２アンタゴニストは開裂不可能または開裂可能なペプチドリンカーを介してＩＬ－２ポリペプチドまたは担体に連結される。ある実施態様において、サイトカイン部分はマスキング部分と融合され得て、このマスキング部分は直接または開裂可能または非開裂可能なリンカーを介して担体部分に融合され得る。
好ましい実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドは開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体に融合され、ＩＬ－２アンタゴニストは開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体またはＩＬ－２ポリペプチドに結合される。例えば、ＩＬ－２アンタゴニストは配列番号５９の開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体に融合されてもよい。また、ＩＬ－２ポリペプチドは野生型のＩＬ－２ポリペプチドであるかまたはＣＤ２５に対するポリペプチドの結合親和性を低下させるような変異を含んでいないものである。
本発明のＩＬ－２融合分子は、担体部分に結合され、サイトカインアンタゴニスト(マスキング部分)によってマスキング(結合)された、ＩＬ－２ポリペプチド(サイトカイン部分)を含み得る。サイトカインアンタゴニストは、ＩＬ－２Ｒβ(ＣＤ１２２)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤの機能的アナログ、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤ(ＣＤ１３２)、ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤの機能的アナログおよびＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤの組み合わせから選択される。ある実施態様において、サイトカインアンタゴニストは、それを必要とする患者において、サイトカイン部分のＴ細胞上のＩＬ－２Ｒγおよび／またはＩＬ－２Ｒβへの結合を阻害し、一方で、ＩＬ－２Ｒα(ＣＤ２５)に結合するためのサイトカイン部分はインタクトのままである。ＩＬ－２Ｒα(ＣＤ２５)はＴｒｅｇ細胞に優先的に発現するため、本発明のＩＬ－２融合分子は、非Ｔｒｅｇ細胞への影響を最小限としながら、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激することができる。
ある実施態様において、担体部分はＦｃドメインである。ある実施態様において、本ＩＬ－２融合分子はＮ末端からＣ末端方向で、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｅ２およびＦ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｅ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖と、Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｅ２およびＦ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｅ１から選択される分子式を含む第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であって、ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体Ｆｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、ＣはＩＬ－２ポリペプチド(例えば、野生型ヒトＩＬ－２またはそのムテイン)を含むサイトカイン部分である。
ある実施態様において、本ＩＬ－２融合分子はＮ末端からＣ末端方向で、Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１、Ｅ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｆ１およびＥ２－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｆ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖と、Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｅ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｆ１およびＥ２－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｆ１を含む第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であって、ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体Ｆｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、ＣはＩＬ－２ポリペプチド(例えば、野生型ヒトＩＬ－２またはそのムテイン)を含むサイトカイン部分である。
ある実施態様において、本ＩＬ－２融合分子は、Ｎ末端からＣ末端方向で、次の
ａ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ２、
ｂ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｃ、
ｃ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ１、
ｄ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｃ、
ｅ. Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、
ｆ. Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｆ２、
ｇ. Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、および
ｈ. Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｆ２
の組から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体のＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である。
ある実施態様において、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は独立して、配列番号４０～４９および５５～５７から選択されるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つは少なくとも２０～４４個のアミノ酸(例えば、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個または少なくとも５５個)を含むアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、ペプチドリンカーの少なくとも１つは少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２７個、２８個、２９個、３１個、３２個、３３個、３４個、３６個、３７個、３８個、３９個、４１個または４２個のアミノ酸を有する。
ある実施態様において、本ＩＬ－２融合分子は図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａまたは７Ｂに例示される構造を有する。特定の実施態様において、ＩＬ－２融合分子は図１０Ａまたは１０Ｂに示される構造を有する。
ある実施態様において、単離融合分子は配列番号５０、５１および５２から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド鎖と、配列番号５３および５４から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド鎖を含む。
単離ＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、Ｃ２、Ｄ１、Ｄ２および９８２ Ｒｅｆは表１に示すアミノ酸配列を有する２個のポリペプチド鎖を含む。９８２ Ｃ１と９８２ Ｃ２の両分子はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤおよびＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤである２個のマスキング部分を含む。９８２ Ｄ１と９８２ Ｄ２の両方は、それぞれ、ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤである１個のマスキング部分を含む。９８２ Ｃ２および９８２ Ｄ２の両方のＩＬ－２部分は変異Ｔ３Ａ、Ｖ６９Ａ、Ｐ７４ＱおよびＣ１２５Ｓ(ナンバリングは配列番号１に従う)を含む。
Figure 2022544771000002
Ａ. ＩＬ－２ポリペプチドまたはムテイン
本発明のＩＬ－２融合分子において、ＩＬ－２ポリペプチドは野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチド(配列番号１)などの野生型ＩＬ－２ポリペプチドまたはヒトＩＬ－２に由来するＩＬ－２ムテインなどのＩＬ－２ムテインであり得る。ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－２の生物学的活性の少なくとも１以上の態様を保持するＩＬ－２誘導体である。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテインは配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸の配列を含む。特定の実施態様において、ＩＬ－２ムテインは配列番号１と同じ長さを有するが、７個以下(例えば、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下)のアミノ酸残基がは異なる。ＩＬ－２ムテインはＣＤ１２２および／またはＣＤ１３２に対する親和性が低下していてもよく、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、ｄ２０ｇ、ｄ２０ｔ、ｄ２０ｗ、ｍ２３ｒ、ｒ８１ａ、ｒ８１ｇ、ｒ８１ｓ、ｒ８１ｔ、ｄ８４ａ、ｄ８４ｅ、ｄ８４ｇ、ｄ８４ｉ、ｄ８４ｍ、ｄ８４ｑ ｄ８４ｒ、ｄ８４ｓ、ｄ８４ｔ、ｓ８７ｒ、ｎ８８ａ、ｎ８８ｄ、ｎ８８ｅ、ｎ８８ｆ、ｎ８８ｇ、ｎ８８ｍ、ｎ８８ｒ、ｎ８８ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｎ９０Ｔ、Ｎ９０Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｓ、Ｅ９５Ｇ、Ｑ１２６Ｅ、Ｑ１２６Ｆ、Ｑ１２６Ｇ、Ｑ１２６Ｉ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｍ、Ｑ１２６Ｎ、Ｑ１２６Ｒ、Ｑ１２６ＶおよびＱ１２６Ｙから選択される１以上の変異を含み得る。特に断らない限り、ＩＬ－２のすべての残基番号は配列番号１のナンバリングに従っている。ある実施態様において、ＩＬ－２のムテインはＣＤ２５に対する親和性を高める結果となる変異を有し得る。このような変異は６９位と７４位の変異から選択できる。ある実施態様において、ＩＬ－２ムテインはＴ３Ａ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５ＳおよびＣ１２５Ｇから選択される１以上の変異を含み得る。
Ｂ. 単離ＩＬ－２融合分子のマスキング部分
本発明の単離ＩＬ－２融合分子におけるサイトカインアンタゴニスト、すなわちマスキング部分はヒトＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγに由来するもの(例えば、配列番号３～６の何れか)などのＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγ細胞外ドメインまたはその機能的アナログである。ある実施態様において、ＩＬ－２融合分子は少なくとも１個のマスキング部分を含む。例えば、融合分子はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤの両方またはこれらのＥＣＤの一方のみを含み得る。ＥＣＤはヒトＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン全体または、その部分がＩＬ－２部分に結合できる状態を維持するかまたは他の方法でＩＬ－２部分がＴ細胞上のＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγに結合するのを阻害する限り、その一部のみを含み得る。
ある実施態様において、ＩＬ－２融合分子はＩＬ－２ＲαのＥＣＤ(例えば、配列番号７)またはその機能的アナログであるさらなるマスキング部分を含み、ここで、ＩＬ－２ＲαのＥＣＤマスキング部分は開裂可能なペプチドリンカーを介して融合分子内のサイトカイン部分、担体部分または別のマスキング部分に融合される。融合分子に開裂可能なリンカーを介して結合したＩＬ－２Ｒαマスキング部分の存在により、融合分子は非標的部位の細胞に結合することなく標的部位にホーミングでき、標的部位に到達すると、開裂可能なリンカーが標的部位に高濃度で存在するプロテアーゼにより開裂され、活性化された融合分子が標的部位の細胞(例えばＴｒｅｇ細胞)上のＩＬ－２Ｒαと結合し、結合した細胞を刺激できる。
ＩＬ－２Ｒサブユニット(α、β、γ)のＥＣＤの機能的アナログは、ＩＬ－２に対して野生型ＥＣＤと同様の親和性を有するポリペプチドをいう。例えば、機能的アナログは野生型ＥＣＤのコアＩＬ－２結合領域を含み、アナログの全長にわたって野生型ＥＣＤ(例えば、配列番号３～７、上記)と少なくとも９５％(例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％)同一である配列を有し得る。
Ｃ. 単離ＩＬ－２融合分子の担体部分
本発明のＩＬ－２融合分子の担体部分は抗原結合部分または抗原結合部分ではない部位であり得る。担体部分はサイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善し、また、サイトカインアゴニストポリペプチドを腫瘍部位などの体内の標的部位にターゲティングできる。
１. 抗原結合担体部分
担体部分は抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合部分は２個の重鎖と２個の軽鎖を有する完全長の抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原上の２個の異なるエピトープに結合できる。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドにさらなる治療効果または相乗的な治療効果をもたらし得る。
ＩＬ－２ポリペプチドおよびそのマスクは抗原結合部分の軽鎖および／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。例として、ＩＬ－２ポリペプチドおよびそのマスクは抗体重鎖またはその抗原結合フラグメントあるいは抗体軽鎖またはその抗原結合フラグメントと融合し得る。ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドは抗体の重鎖の一方または両方のＣ末端に融合され、サイトカインのマスクは開裂不可能なまたは開裂可能なペプチドリンカーを介してサイトカイン部分の他方の末端に融合される。ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドが抗体の一方の重鎖のＣ末端に融合しており、サイトカイン’マスクが開裂不可能なまたは開裂可能なペプチドリンカーを介して抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合しており、２個の重鎖は、２個の異なる重鎖の特異的な対合を可能にする変異を含む。
ヘテロ二量体を形成する戦略はよく知られる(例えば、Spies et al., Mol Imm. (2015) 67(2)(A):95-106参照)。例えば、単離ＩＬ－２融合分子の２個の重鎖ポリペプチドは「ノブ・イントゥ・ホール」変異によって安定したヘテロ二量体を形成し得る。「ノブ・イントゥ・ホール」変異は抗体重鎖のヘテロ二量体の形成を促進するために行われ、一般的に二特異的抗体を作るために使用される(例えば、米国特許第８,６４２,７４５号参照)。例えば、抗体のＦｃドメインは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗの変異と、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖの変異から構成され得る。ＣＨ３ドメイン間に追加の鎖間ジスルフィドブリッジを使用することもでき、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入し、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を導入できる(例えば、Merchant et al., Nature Biotech (1998) 16:677-81参照)。他の実施態様において、抗体部分は２個のＣＨ３ドメインのうち一方のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗの変異があり、他方のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖの変異があってもよい。特定の実施態様において、抗体部分は２個のＣＨ３ドメインのうち一方のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗの変異があり、他方のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ(またはＥ３５６Ｃ)、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖの変異があり、一方のＣＨ３ドメインにさらなるＹ３４９Ｃの変異があり、他方のＣＨ３ドメインにさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃの変異があり、鎖間ジスルフィドブリッジを形成し得る(ナンバリングは常にＫａｂａｔのＥＵ ｉｎｄｅｘに従う；Kabat; Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されるもののような他のノブ・イントゥ・ホール技術をこれに代えてまたはこれに加えて使用できる。このように、抗体部位のノブ・イントゥ・ホール変異の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｅ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ変異を有することである(ＥＵナンバリング)。
ある実施態様において、単離ＩＬ－２融合分子の抗体部分はそのＦｃドメインにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)変異を含む。ＬＡＬＡ変異は補体の結合および固定ならびにＦｃγ依存性のＡＤＣＣを排除する(例えば、Hezareh et al. J. Virol.(2001) 75(24):12161-8)。さらに、ＬＡＬＡ変異はノブ・イントゥ・ホール変異に加えて、抗体部分にも存在する。
ある実施態様において、抗体部分はＦｃドメインのＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ(「ＹＴＥ」)変異を含む。ＹＴＥの変異により、ＩｇＧ１の血清半減期、組織分布、活性を同時に調節できる(Dall’Acqua et al., J Biol Chem. (2006) 281(33): 23514-24; and Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother. (2013) 57(12):6147-53参照)。さらなる実施態様において、ＹＴＥ変異はノブ・イントゥ・ホール変異に加えて、抗体部分に存在する。特定の実施態様において、抗体部位はＹＴＥ、ＬＡＬＡ、ノブ・イン・トゥ・ホール変異またはそれらの組み合わせを有する。
ある実施態様において、抗原結合部分はＩＬ－１β、ＩＬ－１β受容体、ＩＬ－４、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１３、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７受容体、ＩＬ－２３、ＩＬ－２３受容体、ＴＮＦαまたはＴＮＦα受容体に結合する。
２. その他の担体部分
本発明の単離ＩＬ－２融合分子には他の非抗原結合担体部分を使用できる。例えば、抗体のＦｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子を使用できる。
例として、ＩＬ－２ポリペプチドとそのアンタゴニストを抗体のＦｃドメインに融合させ、Ｆｃ融合タンパク質を形成させ得る。ある実施態様において、ＩＬ－２ポリペプチドはＦｃドメインポリペプチド鎖の一方のＣ末端またはＮ末端に(直接またはペプチドリンカーを介して)融合しており、サイトカインマスクは開裂不可能なまたは開裂可能なペプチドリンカーを介して他方のＦｃドメインポリペプチド鎖のＣ末端またはＮ末端に融合しており、２個のＦｃドメインポリペプチド鎖は２個の異なるＦｃ鎖の特異的な対合を可能にする変異を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは上記ノブ・イントゥ・ホール変異を含む。さらなる実施態様において、Ｆｃドメインは上記ＹＴＥおよび／またはＬＡＬＡ変異も含み得る。ある実施態様において、ＦｃドメインはＮ２９７(ＥＵナンバリング)での変異を含む。
単離ＩＬ－２融合分子の担体部分はアルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)またはそのフラグメントから構成され得る。ある実施態様において、アルブミンまたはアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントと約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上である。約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９.５％以上または９９.８％以上同一である。
ある実施態様において、担体部分は約１０個以上、２０個以上、３０個以上４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、１２０個以上、１４０個以上、１６０個以上、１８０個以上、２００個以上、２５０個以上、３００個以上、３５０個以上、４００個以上、４５０個以上、５００個以上、５５０個以上のアミノ酸長を有するアルブミンフラグメント(例えば、ヒト血清アルブミンフラグメント)から構成される。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは長さが約１０アミノ酸から約５８４アミノ酸の間(長さが約１０から約２０、約２０から約４０、約４０から約８０、約８０から約１６０、約１６０から約２５０、約２５０から約３５０、約３５０から約４５０または約４５０から約５５０アミノ酸の間など)である。ある実施態様において、アルブミンフラグメントはSudlow IドメインもしくはそのフラグメントまたはSudlow IIドメインもしくはそのフラグメントを含む。
Ｄ. 単離融合分子のリンカー成分
ＩＬ－２ポリペプチドはペプチドリンカーを使用してまたは使用せずに、担体部分に融合され得る。ペプチドリンカーは開裂可能または開裂不可能であり得る。ある実施態様において、サイトカイン部分はペプチドリンカーを介して担体に融合しており、該ペプチドリンカーは配列番号４０～４６および５５～５７から選択される。特定の実施態様において、ペプチドリンカーは配列番号４２、４４、４５、４６、５５、５６または５７のアミノ酸配列を含む。マスキング部分は開裂不可能なまたは開裂可能なリンカーを介してまたはペプチドリンカーなしで、サイトカイン部分または担体に融合されてもよい。開裂可能なリンカーは１個以上(例えば、２個または３個)の開裂可能な部位(ＣＭ)を含み得る。各ＣＭはレグメイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ－３／４、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ＭＴ１－ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、β－セクレターゼ、ｕＰＡ、ＰＳＡから選択される酵素またはプロテアーゼの基質となり得る。ある実施態様において、マスキング部分はペプチドリンカーを介して担体に融合されており、該ペプチドリンカーは配列番号４０～４６、５５、５６および５７から選択される。特定の実施態様において、ペプチドリンカーは配列番号４２、４４、４５、４６、５５、５６または６７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、該ペプチドリンカーは少なくとも１０個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、２１個のアミノ酸、２２個のアミノ酸、２５個のアミノ酸、２７個のアミノ酸または３０個のアミノ酸を含む。
ＩＬ－２ポリペプチド、サイトカインマスク、担体、ペプチドリンカーおよび単離ＩＬ－２融合分子の具体的な非限定的な例は以下の配列のセクションに示される。さらに、本発明の単離融合分子は周知の組換え技術により産生され得る。例えば、単離融合分子のポリペプチド鎖のコード化配列を含む１以上の発現ベクターを哺乳類宿主細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)にトランスフェクトし、コード化配列の発現および発現されたポリペプチドの単離ＩＬ－２融合分子複合体への組み立てを可能にする条件で細胞を培養し得る。
医薬組成物
本発明の単離ＩＬ－２融合分子(すなわち、医薬品有効成分(ＡＰＩ))を含む医薬組成物は所望の純度を有するＡＰＩを、１以上の任意の薬学的に許容される賦形剤(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed.(1980)参照)と混合し、凍結乾燥製剤または水溶液の形で調製する。薬学的に許容される賦形剤(または担体)は採用される用量および濃度において、一般的に対象に無害であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、酢酸塩などの無機または有機酸またはその塩を含む緩衝液、アスコルビン酸またはメチオニンなどの酸化防止剤、防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾールなど、低分子量(約１０残基以下)のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸、スクロース、グルコース、マンノース、デキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体(例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体)および／またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
緩衝液は特に安定性がｐＨに依存する場合、治療効果を最適化する範囲でｐＨを制御するために使用される。緩衝液は約５０mM～約２５０mMの範囲の濃度で存在することが好ましい。本発明で使用するのに適した緩衝液にはクエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩など、有機および無機の酸およびその塩がある。さらに、緩衝液はトリスのようなヒスチジンとトリメチルアミンの塩から構成され得る。
防腐剤は微生物の繁殖を抑えるために添加され、通常０.２％～１.０％(ｗ／ｖ)の範囲で存在する。本発明で使用するのに適した防腐剤は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド(塩化物、臭化物、ヨウ化物など)、ベンゼトニウムクロリド、チメロサール、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシン、シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールを含む。
「安定剤」と呼ばれることもある等張化剤は、組成物中の液体の張性を調整または維持するために存在する。タンパク質や抗体のような大型の帯電生体分子に使用する場合、アミノ酸の側鎖の帯電基と相互作用して、分子間および分子内の相互作用の可能性を減少させることができるため、しばしば「安定剤」と呼ばれる。等張化剤は他の成分との相対的な量を考慮して、０.１％～２５％、より好ましくは１％～５％の範囲で含有できる。好ましい等張化剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの多価の糖アルコール、好ましくは３価以上の糖アルコールを含む。
非イオン性界面活性剤または洗剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療剤の可溶化を助けるだけでなく、製剤がせん断面ストレスに曝される撹拌での凝集によって生じる活性治療用タンパク質や抗体の変性から保護するためにも使用する。非イオン性界面活性剤は約０.０５mg／ml～約１.０mg／ml、好ましくは約０.０７mg／ml～約０.２mg／mlの範囲で使用する。
適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(２０、４０、６０、６５、８０など)が挙げられる。ポリオキサマー(１８４、１８８など)、プルロニック(登録商標)ポリオール、トリトン(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(トゥイーン(登録商標)－２０、トゥイーン(登録商標)－８０など)、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース。使用できるアニオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムを含む。カチオン系洗浄剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
医薬担体、賦形剤、希釈剤は、意図された投与経路および標準的な製薬慣行を考慮して選択し得る。医薬組成物は、さらに、あらゆる適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。
種々の送達系に応じて、種々の組成／製剤化要素が存在し得る。例えば、本発明で有用な医薬組成物はミニポンプを使用して投与されるように製剤化でき、粘膜経路、例えば、吸入用の鼻腔スプレーやエアロゾル、摂取可能溶液として投与されるように製剤化できり、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮下などの経路で送達するために、注射剤の形で製剤化される。
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は凍結乾燥されたタンパク質製剤である。他の実施態様において、医薬組成物は水性液体製剤であり得る。
処置方法
ＩＬ－２融合分子は炎症性疾患や自己免疫疾患の処置に用い得る。ある実施態様において、対象における疾患(自己免疫疾患など)を処置する方法は、ここに開示する単離ＩＬ－２融合分子の有効量を対象に投与することを含む。ある実施態様において、炎症性または自己免疫性疾患は喘息、糖尿病(例えば、Ｉ型糖尿病または潜在性自己免疫性糖尿病)、ループス(例えば、全身性エリテマトーデス)、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎)、アレルギー、臓器移植片拒絶反応、ＧＶＨＤ、アジソン病、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜病、自己免疫性肝炎、皮膚炎、グッドパスチャー症候群グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病(ＨＳＰ)、若年性筋炎、川崎病、炎症性腸疾患(例えばクローン病、潰瘍性大腸炎)、多発性硬化症、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＰＡＮＤＡＳ、乾癬、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、全身性強皮症、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病からなる群から選択される。
一般的に、本発明の医薬組成物の投与量および投与経路は標準的な薬学実施要領に従って、対象の体格および状態に応じて決定される。ある実施態様において、医薬組成物は経口、経皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接塗布、手術部位への塗布、腹腔内、座薬、皮下、皮膚内、経皮、噴霧、胸腔内、心室内、関節内、眼内、頭蓋内または鼻腔内を含む何れかの経路で対象に投与される。ある実施態様において、本組成物は対象に静脈内投与される。
ある実施態様において、医薬組成物の投与形態は単回投与または反復投与である。ある実施態様において、投与は１日１回、１日２回、１日３回または１日４回以上、対象に行われる。ある実施態様において、約１回以上(約２回、３回、４回、５回、６回または７回以上など)の投与を１週間で行う。ある実施態様において、医薬組成物は毎週、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、３週間のうち２週間は毎週または４週間のうち３週間は毎週投与される。ある実施態様において、数日、数週間、数ヶ月または数年にわたって複数回投与される。ある実施態様において、投与回数は１回以上(約２回、３回、４回、５回、７回、１０回、１５回または２０回以上など)である。
本明細書で特に定義されていなければ、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を持つものとする。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載されたものと同様のまたは同等の方法および材料も、本発明の実施または試験に使用できる。矛盾が生じるなら、本明細書の記載(定義を含めて)が優先する。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医学および薬化学、タンパク質および核酸化学、ハイブリダイゼーションなどの技術に関連して使用される命名は当技術分野で周知のものであり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製法は製造者の仕様に従って、当技術分野で一般的に行われている方法またはここに記載される方法で実施される。さらに、文脈上特段の要請がなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施態様を通じて、「有する」および「含む」という表現および「有し」、「有して」、「包含する」または「含んで」などの変形は、記載された整数または整数群を含むが、他の整数または整数群を除外しないと理解される。本明細書に記載される本発明の態様およびバリエーションには「からなる」および／または「本質的にからなる」の態様およびバリエーションが含まれることが理解されるべきである。ここに記載されるすべての出版物およびその他の文献は、引用によりその全体がここに組み込まれる。ここでは多数の文書を引用するが、この引用はこれらの文書が当技術分野における一般的な知識の一部を形成することを認めるものではない。
例示的な実施態様
本発明のさらなる特定の実施態様を以下に説明する。これらの実施態様は本発明に記載される組成物および方法を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
１. １以上の点変異を含むＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤの変異体であって、該ＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤの変異体が野生型のものに比べて熱安定性が向上する、ＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤの変異体。
２. Δ１～５(最初の５個のアミノ酸の欠失)、Ｆ１１、Ｖ２１、Ｌ２８、Ｗ３８、Ｌ５１、Ｐ５２、Ｖ５３、Ｉ６３、Ｐ６７、Ｉ７７、Ｖ８８、Ｖ９２、Ｍ９３、Ｉ９５、Ｍ１０７、Ｉ１１０、Ｖ１１５、Ｐ１５６、Ｌ１５７、Ｑ１６２、Ｑ１６４、Ｗ１６６、Ｐ１７４、Ｌ１８７、Ｆ１９１、Ｐ１９６、Ｐ２００、Ｐ２０７、Ｗ９０、Ｈ１５０、Ｗ１５２、Ｗ１６６、Ｗ１９４およびＷ１９７(ナンバリングは配列番号３に従う)から選択される位置に１以上の変異を有する、実施態様１のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体。
３. 以下の：
ａ. Ｆ１１およびＦ１９１、
ｂ. Ｌ５１、Ｐ５２およびＶ５３、
ｃ. Ｖ９２、Ｍ９３、Ｉ９５、
ｄ. Ｍ１０７、Ｐ１９６、Ｉ１１０および
ｅ. Ｐ１５６およびＬ１５７
の群(ナンバリングは配列番号３に従う)から選択された位置の変異を含む、実施態様１のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体。
４. 該疎水性アミノ酸またはアミノ酸がＳ、Ｇ、Ｎ、ＴおよびＱから選択される親水性アミノ酸またはアミノ酸に変異する、実施態様２または３に記載のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体。
５. 以下の：
ａ. Ｆ１１ＳおよびＦ１９１Ｇ、
ｂ. Ｌ５１Ｓ、Ｐ５２ＧおよびＶ５３Ｓ、
ｃ. Ｖ９２Ｓ、Ｍ９３Ｇ、Ｉ９５Ｇ、
ｄ. Ｍ１０７Ｇ、Ｐ１９６Ｓ、Ｉ１１０Ｇ、および
ｅ. Ｐ１５６ＳおよびＬ１５７Ｇ、
ｆ. Ｗ１６６Ｎ、
ｇ. Ｑ１６４Ｅ. Ｗ１６６Ｎ、Ｖ１１５Ｓ
ｉ. Ｗ１５２Ｎ、
ｊ. Ｗ１５２Ｎ、Ｗ１６６Ｎ
ｋ. Ｖ９２Ｓ
ｌ. Ｗ１６６Ｎ、Ｖ９２Ｓ
ｍ. Ｌ１５７Ｓ、
ｎ. Ｗ１６５Ｎ、Ｗ１５７Ｓ
の群(ナンバリングは配列番号３に従う)から選択される変異を含む、実施態様３のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体。
６. 配列番号４７、４８および４９から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体。
７. 炎症性疾患および自己免疫疾患の処置に有用な単離ＩＬ－２融合分子であって、サイトカイン部分およびマスキング部分を含み、該サイトカイン部分がＩＬ－２ポリペプチドまたはＩＬ－２ムテインを含み、該マスキング部分がＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログもしくは変異体を含み；そして該融合分子がインビトロアッセイにおいて、他のＴ細胞またはＮＫ細胞と比較してＴ調節細胞を優先的に刺激する、単離ＩＬ－２融合分子。
８. 該融合分子がＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイにおいて約１nM未満のＥＣ５０値を有する、実施態様７に記載の単離ＩＬ－２融合分子。
９. 該融合分子がＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイにおいて約０.１nM未満のＥＣ５０値を有する、実施態様７に記載の単離ＩＬ－２融合分子。
１０. 該マスキング部分が実施態様１～６の何れかに記載のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤの変異体を含む、実施態様７～９の何れかに記載の単離融合分子。
１１. ＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログをさらに含む、実施態様７～１０の何れかに記載の単離融合分子。
１２. 担体をさらに含む、実施態様７～１１の何れかに記載の単離融合分子。
１３. 該マスキング部分が開裂可能または非開裂可能なペプチドリンカーを介して担体部分に連結される、実施態様１２に記載の単離融合分子。
１４. 該ＩＬ－２ポリペプチドまたはＩＬ－２ムテインが配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、該ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログもしくは変異体が配列番号３と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、実施態様７～１３の何れかに記載の単離融合分子。
１５. 該ＩＬ－２ムテインが配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、実施態様７～１３の何れかに記載の単離融合分子。
１６. 該ＩＬ－２ムテインがＬ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ａ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４Ｑ Ｄ８４Ｒ,Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｎ９０Ｔ、Ｎ９０Ｓ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ,Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｓ、Ｅ９５Ｇ、Ｑ１２６Ｅ、Ｑ１２６Ｆ、Ｑ１２６Ｇ、Ｑ１２６Ｉ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｍ、Ｑ１２６Ｎ、Ｑ１２６Ｒ、Ｑ１２６ＶおよびＱ１２６Ｙ(ナンバリングは配列番号１に従う)から選択される少なくとも１つの変異を有する、実施態様７～１３の何れかに記載の単離融合分子。
１７. 該担体部分がＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミンフラグメント、抗体Ｆｃドメインまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントから選択される、実施態様７～１６の何れかに記載の単離融合分子。
１８. 担体部分がＮ２９７での変異および／または変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)(ＥＵナンバリング)を有する抗体Ｆｃドメインを含む、実施態様１７に記載の単離融合分子。
１９. 担体部分がノブ・イントゥ・ホール変異を含む抗体Ｆｃドメインを含み、サイトカイン部分およびマスキング部分が抗体Ｆｃドメインの異なるポリペプチド鎖に融合する、実施態様１７または１８に記載の単離融合分子。
２０. サイトカイン部分およびマスキング部分がＦｃドメインの２個の異なるポリペプチド鎖のＣ末端または抗体の２個の異なる重鎖のＣ末端に融合される、実施態様１９の単離融合分子。
２１. 担体が抗体のＦｃドメインであり、サイトカイン部分とマスキング部分がＦｃドメインの２個の異なるポリペプチド鎖のＮ末端に融合する、請求項１９に記載の単離融合分子。
２２. 担体部分が抗体のＦｃドメインであり、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｅ２およびＦ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｅ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖および分子式Ｆ２－Ｌ３－Ｃを含む第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成するＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である、実施態様１２に記載の単離融合分子。
２３. 担体部分が抗体のＦｃドメインであり、Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１、Ｅ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｆ１およびＥ２－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｆ１から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖および分子式Ｃ－Ｌ３－Ｆ２を含む第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成するＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である、実施態様１２に記載の単離融合分子。
２４. 担体部分が抗体Ｆｃドメインであり、以下の：
ａ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ２、
ｂ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｃ、
ｃ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ１、
ｄ. Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｃ、
ｅ. Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、
ｆ. Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｆ２、
ｇ. Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、および
ｈ. Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｆ２；
組から選択される分子式を含む第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成するＦｃドメインのサブユニットであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｃはサイトカイン部分である、実施態様１２に記載の単離融合分子。
２５. 該ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤが配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、該ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤが配列番号６に示すアミノ酸配列を有し、該サイトカイン部分が配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ムテインを含む、実施態様２２～２４の何れかに記載の単離融合分子。
２６. 実施態様２１～２５の何れかに記載の単離融合分子であって、Ｆｃドメインがノブインホール変異を含むことを特徴とする単離融合分子。
２７. ノブ・イントゥ・ホール変異がＦｃドメインのポリペプチド鎖上のＴ３６６Ｙ「ノブ」変異およびＦｃドメインの他方のポリペプチドにおけるＹ４０７Ｔ「ホール」変異(ＥＵナンバリング)を含む、実施態様１８～２６の何れかの単離融合分子。
２８. ノブ・イントゥ・ホール変異が「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗの変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ(ＥＵナンバリング)の変異を含む、実施態様１８～２１および２６の何れかの単離融合分子。
２９. 担体部分が抗体のＦｃドメインであり、融合分子が配列番号８～１１、２８、２９および３０から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド鎖および配列番号１６～２１から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド鎖を含む、実施態様１２に記載の単離融合分子。
３０. 担体部分が抗体Ｆｃドメインであり、融合分子が配列番号１２～１５、３１、３２および３３から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド鎖と、配列番号２２～２７から選択されたものと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド鎖を含む、実施態様１２に記載の単離融合分子。
３１. 該ＦｃドメインがＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇ(ＥＵナンバリング)の変異をさらに含む、実施態様２９または３０に記載の単離融合分子。
３２. 該担体がＩｇＧ４ Ｆｃであり、ノブ・イントゥ・ホール変異も含む、実施態様１２に記載の単離融合分子である。
３３. 配列番号５０、５１および５２から選択されるものとして少なくとも９９％同一または１００％同一のアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド鎖および配列番号５３および５４から選択されるものとして少なくとも９９％同一または１００％同一のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド鎖を含む、実施態様３２に記載の単離融合分子。
３４. 該ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３が独立して、配列番号４０～４６、５５～５７、５９および６０から選択されるアミノ酸配列を有する、実施態様２２～２４の何れかに記載の単離融合分子。
３５. 該ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが２０～４４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、実施態様２２～２４の何れかに記載の単離融合分子。
３６. 該融合分子がα、βおよびγサブユニットを有する高親和性ＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒαβγ)に、βおよびγサブユニットで形成される中親和性ＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒβγ)に結合するよりも、少なくとも１００倍強い親和性で結合する、実施態様７～１１の何れかに記載の単離融合分子。
３７. ３７℃の表面プラズモン共鳴アッセイで測定された約５nM以上の結合解離平衡定数(ＫＤ)でＩＬ－２Ｒβγに結合する、実施態様７～１１の何れかに記載の単離融合分子。
３８. ＦＯＸＰ３陽性の制御Ｔ細胞の成長または生存をインビトロで促進する、実施態様７～３７の何れかに記載の単離融合分子。
３９. 機能的なＩＬ－２受容体複合体を構成するエクスビボＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導するが、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導する能力が低下する、実施態様７～３７の何れかに記載の単離融合分子。
４０. ＩＬ－２Ｒαまたはその機能的アナログの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)をさらに含み；該ＩＬ－２ＲαＥＣＤまたはその機能的アナログが開裂可能なペプチドリンカーを介して融合分子に連結される、実施態様７～１１の何れかに記載の融合分子。
４１. 該ＩＬ－２ＲαＥＣＤまたはその機能的アナログが配列番号７に示されるものと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、実施態様４０に記載の融合分子。
４２. 実施態様７～４１の何れかに記載の融合分子または実施態様１～６の何れかに記載のＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤ変異体をコードする１以上のポリヌクレオチド。
４３. 実施態様４２の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
４４. 実施態様４３のベクターを含む宿主細胞。
４５. 請求項４４に記載の宿主細胞を、融合分子の発現を可能にする条件下で培養し、融合分子を単離することを含む、実施態様７～４１の何れかの単離融合分子の製造方法。
４６. 実施態様７～４１の何れかに記載のキメラ分子および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
４７. 対象の炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施態様７～４１の何れかに記載のキメラ分子を投与することを含む、方法。
４８. 対象の炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法であって、その治療を必要とする対象に、治療有効量の実施態様４６の医薬組成物を投与することを含む、方法。
４９. 炎症性疾患または自己免疫疾患が喘息、糖尿病、関節炎、アレルギー、臓器移植片拒絶および移植片対宿主病からなる群から選択される、実施態様４８に記載の方法。
一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を用いた一過性トランスフェクションではＰＥＩ(ポリエチレンイミン)を用いて３×１０６細胞／mLのフリースタイルＨＥＫ２９３細胞に発現プラスミドを２.５～３μg／mLで共導入した。Ｆｃベースの単離ＩＬ－２融合分子について、Ｆｃ－ＩＬ－２ムテイン融合ポリペプチドとＦｃマスキング部分融合ポリペプチドの比率は１：２比であった。抗体ベースの単離ＩＬ－２融合分子の場合、ノブ重鎖(ＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む)およびホール重鎖(マスキング部分を含む)と軽鎖ＤＮＡの比率は２：１：２モル比であった。トランスフェクション後６日目に、９,０００rpmで４５分間遠心分離後、０.２２μM濾過により細胞培養物を回収した。
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を用いた一過性のトランスフェクションについて、Expifectamine CHO Reagentを用いて、６×１０６細胞／mL ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に発現プラスミドを１～２μg／mLで共トランスフェクトした。９８２ Ｄ１についてはノブ重鎖のＩＬ－２ムテイン融合ポリペプチドとホール重鎖(βマスキング部分ポリペプチドを含む)の比率は１：４であった。同様に、９８２ Ｄ２については、ノブ重鎖のＩＬ－２Ｅムテインポリペプチドとホール重鎖(βマスキング部分ポリペプチドを含む)の比率が１：４であった。１２,０００rpmで４０分間遠心分離した後、０.２μMまたは０.４５μM濾過を行い、トランスフェクションから約７日後に細胞培養物を採取した。
タンパク質の精製
タンパク質ＩＬ－２融合分子(タンパク質)の精製はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーCaptivA(登録商標)樹脂(Repligen, Waltham, MA)を用いて行った。９８２ Ｒｅｆ、９８２ Ｃ１および９８２ Ｃ２のサンプルについてはSepharose(登録商標) Q FF樹脂またはSepharose(登録商標) Q HP樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーをフロースルーモードで実施し、続いてCaptoTM MMC ImpRes樹脂を用いた第３のカラムステップで、さらなる精製を行った。９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２のサンプルではSepharose(登録商標) Q HP樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーをフロースルーモードで実施し、続いてCaptoTM SP ImpRes樹脂を用いた３回目のカラムステップで、さらなる精製を行った。Sepharose(登録商標)およびCaptoTM樹脂はすべてGE Healthcare Life Sciences(現Cytiva, Marlborough, MA)から取り寄せた。このサンプルはインビボ試験に先立ち、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により９８％以上の純度に精製された。サンプルは２０mMヒスチジン、７％スクロース、０.０３％ポリソルベート－２０で製剤化された。サンプルは使用するまで－８０℃のフリーザーで保存した。
プロテアーゼ処理
０.１μg／μLのHuman MMP2(Sino Biological #10082-HNAH)を１mMの酢酸ｐ－アミノフェニル水銀(APMA, Sigma #A-9563)で活性化した。２００μgのＩＬ－２融合分子を、２mMのＣａＣｌ２および１０μＭのＺｎＣｌ２を含むＨＢＳ緩衝液(２０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ２、ｐＨ７.４)中で、０.５μgのヒトＭＭＰ２と３７℃で１６時間(オーバーナイト)インキュベートした。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
１０μLの培養上清または２０μgの精製タンパク質サンプルを、還元試薬を含むまたは含まないBoltTM LDS Sample Buffer(Novex)と混合した。７０℃で３分間加熱した後、NuPAGETM ４～１２％BisTris Gel(Invitrogen)に負荷した。このゲルをNuPAGETM MOPS SDS Running buffer(Invitrogen)で２００Ｖ、４０分間流した後、クーマシーブルーで染色した。
図８は単離ＩＬ－２融合分子ＪＲ３.１１６.５の活性化前(非還元および還元)および上記プロテアーゼ処理による活性化後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＪＲ３.１１６.５は配列番号１２および２３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を持つ２個のポリペプチド鎖を含み、図１Ｂに示される構造を有する。データは、プロテインＡカラムのプールの大部分はＪＲ３.１１６.５の意図したヘテロ二量体分子であることを示した。ホール鎖のホモ二量体(配列番号２３)の小さなバンドがあるように見えた。驚くべきことに、不対鎖またはあらゆるノブ鎖のホモ二量体の明らかなバンドはなかった。サイトカイン部分とマスク部位の相互作用が、ノブ鎖(配列番号１２)とホール鎖(配列番号２３)の正しいヘテロ二量化を促進した可能性がある。
ＣＴＬＬ－２アッセイ
ＣＴＬＬ－２細胞はＬ－グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１０％非必須アミノ酸、１０％ピルビン酸ナトリウム、５５μMのβ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＣＴＬＬ－２細胞は非接着性で、１００ng／mLのＩＬ－２を添加した培地で５×１０４～１×１０６細胞／mLに維持した。一般的に、細胞を週２回分割した。バイオアッセイでは継代後４８時間以上の細胞を使用するのが最良であった。
サンプルは９６ウェルプレートで５０μL／ウェルで２倍濃度に希釈した。ＩＬ－２標準液は２０ng／mL(２倍濃度)から３倍の連続希釈で１２ウェル力価測定した。サンプルの力価を適宜試験した。ＣＴＬＬ－２細胞を５回洗浄してＩＬ－２を除去した後、５０００細胞／ウェルを５０μLに分注し、サンプルを用いて一夜または少なくとも１８時間培養した。その後、１００μL／ウェルのCell Titer Glo試薬(Promega)を加え、発光を測定した。図９にＣＴＬＬ－２の分析結果を示す。このデータはマスキング部分がＪＲ３.１１６.５の活性を約２０倍も低下させたことを示す。さらに、このマスキング効果は可逆的で、プロテアーゼでマスキング部分を開裂して活性化すると、融合分子の活性が回復する。
ＮＫ９２細胞増殖アッセイ
ＮＫ９２細胞株は成長と生存にＩＬ－２を必要とする因子依存性の細胞株である。アッセイの前に、ＮＫ９２細胞を洗浄してＩＬ－２を除去し、成長因子なしで一夜培養した。細胞を回収し、再度洗浄して残留する成長因子を除去した。細胞を４０００,０００細胞／mLに再懸濁した。その後、細胞(２０,０００／ウェル)を９６ウェルプレートに加えた。抗ＣＤ２５抗体であるバシリキシマブを１０μg／mLでプレートの半分(４８ウェル)に添加した。細胞を１５分間インキュベートした。ＩＬ－２融合分子の連続滴定を５０μL／ウェルで各ウェルに加えた。プレートを一夜インキュベートし、発光を測定する前にCell Titer Glo(Promega)を加えた。これにより、細胞の生存率の指標となるＡＴＰレベルを測定できた。図１１は抗ＣＤ２５中和抗体の存在下および非存在下での９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ１および９８２ ＲｅｆのＮＫ９２増殖アッセイを示す。対照分子(９８２ Ｒｅｆ)は置換変異Ｖ９１ＫおよびＣ１２５Ａを有するＩＬ－２を備えたＩＬ－２融合分子である(ＩＬ－２部分のナンバリングは配列番号１に従う)。抗ＣＤ２５抗体を用いたアッセイでは抗ＣＤ２５抗体を１０μg／mLで細胞に添加した。
このデータから、９８２ Ｒｅｆは９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２よりも強いＮＫ９２細胞の増殖を促す活性があることが分った。試験したすべての融合分子は中和抗ＣＤ２５抗体をアッセイに加えたときに最小の活性を示した。
結合アッセイ：ラットＣＤ４＋ Ｔ細胞
Sprague-Dawley系雄性ラットから頸静脈カニューレで採取した血液を溶血し、赤血球を除去した。残りの細胞は様々な濃度の試験品９８２ Ｄ１または９８２ Ｄ２と氷上で約６０分間インキュベートした。検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ－ＡＰＣ(Jackson ImmunoResearch Lab. Cat#109-135-170)を各ウェルに加えた。インキュベーションとその後の洗浄の後、ラットＣＤ４Ｔ細胞を染色するために、抗ラットＣＤ４抗体(BD Bioscience, cat#554866)を加えた。染色したサンプルを再度洗浄した後、フローサイトメトリーでラットＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合するＩＬ－２融合分子を検出した。
図１２は９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２のラットＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合活性を示す。Ｎ.Ｃ.は無関係なＡｂ対照を表す。驚くべきことに、９８２ Ｄ１は９８２ Ｄ２に比べてラットＣＤ４＋Ｔ細胞との結合がわずかに強かったが、その差は有意ではなかった。
結合アッセイ：ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞
ヒト末梢血単核細胞(ｈＰＢＭＣ)はバフィーコート血液(ＢｉｏＩＶＴおよびＲＢＣ)から分離し、１０％ＦＢＳ(Life Technologies, cat# 10099141)を含む完全培地ＲＰＭＩ１６４０(Life Technologies, cat# 12633-020)で一夜培養した。翌日、ヒトＰＢＭＣを抗ヒトＣＤ３抗体(Biolegend cat#317302)で２日間処理し、完全培地ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した後、３日間静置した。洗浄緩衝液で４～５×１０６細胞／mLの濃度に調整した後、５０μLの細胞(２００～２５０Ｋ細胞／ウェル)、次いで５０μLのＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２、９８２ Ｒｅｆを様々な濃度で９６ウェルプレートの対応するウェルに充填した。陰性対照として、無関係なＡｂを同じ様々な濃度範囲で加えた。氷上で約６０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、検出抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ－ＡＰＣ(Jackson ImmunoResearch Lab.Cat#109-135-170)を加えた。広範囲の洗浄で遊離のＩｇＧ Ｆｃγ－ＡＰＣを除去した後、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４ Ａｂ(BD bioscience, cat#555346)およびＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ２５ Ａｂ(BD bioscience, cat#555432)を細胞染色用のウェルに加えた。最後に、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)およびＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)細胞へのＩＬ－２融合分子の結合を検出するために、染色したサンプルをフローサイトメトリーで分析した。
図１３Ａおよび１３Ｂは９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ ＲｅｆのヒトＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋／ＣＤ２５－ Ｔ細胞への結合を示す。結果は、９８２ Ｒｅｆは９８２ Ｄ２、９８２ Ｄ１、９８２ Ｃ１に比べて、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ細胞に対する強い結合親和性を示した。このアッセイではＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体で２日間処理し、３日間休ませた後、さまざまな濃度のＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆおよび緩衝液対照(Ｎ.Ｃ.)と室温で約４０分間インキュベートした。抗ｈＦｃ二次抗体を加え、続いて抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ２５抗体で染色した。染色したサンプルをフローサイトメトリーで分析し、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)およびＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)細胞へのＩＬ－２融合分子の結合をそれぞれ検出した。その後、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｄ２を比較したところ、９８２ Ｄ２＞９８２ Ｄ１＞９８２ Ｃ１の順で結合力が高いことが示された。９８２ Ｄ２のＩＬ－２部分にはＣＤ２５との結合を高める２個の点変異がある。これらの結果から、ＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤでマスキングすると９８２ Ｄ１の結合が減少し、ＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤとＩＬ－２Ｒγ－ＥＣＤのダブルマスキングではマスキングされたＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１の結合がさらに減少することが示唆された。ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞でも同じような結合活性の順位が見られたが、９８２ Ｒｅｆ、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆ、８２ Ｄ２および９８２ Ｃ１のＭＦＩはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞に比べて低く、ＩＬ－２融合分子がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞に優先的に結合することが示された。
Ｔ細胞増殖アッセイ
バフィーコート血液から分離したヒトＰＢＭＣ(ＢｉｏＩＶＴとＲＢＣ)を抗ＣＤ３抗体(Biolegend cat#317302)で２日間処理した後、３日間静置した。示された様々な濃度のＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２、９８２ ＲｅｆまたはＩＬ－２と３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間インキュベートした。その後、細胞を溶解／固定／透過処理し、マウス抗ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ(BD bioscience, cat#555346)、マウス抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ(BD bioscience, cat#555432)、マウス抗ヒトＫｉ６７ Ａｌｅｘ－６４７(BD bioscience, cat#558615)で抗体染色を行った。洗浄後、染色した細胞をフローサイトメトリーで分析し、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)のＫｉ６７＋(増殖マーカー)細胞をそれぞれ確認した。
図１４は９８２ Ｄ１、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ２および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子によって誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞の濃度依存的な増殖を示す。このアッセイではＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体で２日間処理し、３日間休ませた。その後、ＰＢＭＣは３７℃, ５％ＣＯ２インキュベーターで３日間、様々な濃度のＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２および９８２ Ｒｅｆとインキュベートした。その後、細胞を溶解／固定／透過処理し、抗ＣＤ４、ＣＤ２５およびＫｉ６７抗体で染色した。洗浄後、染色した細胞をフローサイトメトリーで分析し、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)細胞とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)細胞のＫｉ６７＋(増殖マーカー)細胞をそれぞれ確認した。
ＩＬ－２融合分子のインビトロでの活性は強いものから弱いものへと、以下の順序であった。９８２ Ｒｅｆ、９８２ Ｄ２、９８２ Ｄ１、９８２ Ｃ１の順で、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞の方がＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞よりも全体的にはるかに大きな増殖が観察された。その結果、３つのインビトロアッセイの全てにおいて、９８２ Ｒｅｆが最も強い活性を示し、次いで９８２ Ｄ２、９８２ Ｄ１および９８２ Ｃ１の順であった。これらの結果は図１３に示した結合活性の結果と一致する。
ラットＰＫおよびＰＤ試験
頸静脈カニューレを装着した雄のSprague-Dawleyラットに、ＩＬ－２融合分子を１mg／kgまたは３mg／kg皮下投与した。血液は０～１４４時間の様々な時点で採取された。
ＰＫ分析のために、血清サンプルはＥＬＩＳＡによって試験品を測定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ中、２μg／mLの１００μL／ウェルのＦ(ａｂ’)２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ(Jackson ImmunoResearch, Cat.# 109-006-170)で被覆した。プレートは４℃で一夜インキュベートした。プレートを、１０％ヤギ血清を含む１００μL／ウェルのＰＢＳで遮断した。１時間のインキュベーションとその後の洗浄(純水で４回)の後、ＰＢＳ／１０％ヤギ血清または標準液で希釈した血清サンプル１００μLを各ウェルに加えた。インキュベーション(１時間)と洗浄(純水で６回)の後、第二抗体(抗ＩＬ２－ビオチン(RandD Systems BAF202))をＰＢＳ／１０％ヤギ血清に０.５μg／mLで１００μLずつ各ウェルに加えた。インキュベーション(１時間)と洗浄(純水で６回)の後、１００μLのStreptavidin-HRP(Jackson ImmunoResearch, Cat.#016-30-84, 1:1000)をＰＢＳ／１０％ヤギ血清に溶解したものを各ウェルに加えた。インキュベーション(１時間)、ウォッシュ(ＤＩ水で８回)後、各ウェルに１００μLのＴＭＢ基質を加えて発色反応を開始した。１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を１００μL／ウェル加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４５０を測定した。
図１５はラットＰＫ試験における９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子の血清血漿濃度の経時変化を示したものである。このアッセイでは頸静脈カニューレを装着した雄のSprague-Dawleyラットに、ＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆを１mg／kgで皮下投与した。血液は０時間、１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１４４時間後に採取された。血清サンプルはヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγキャプチャーと抗ヒトＩＬ－２ビオチンを検出試薬として用いたＥＬＩＳＡにより、ＩＬ－２融合分子を測定した。９８２ Ｃ１は９８２ Ｄ１よりもＡＵＣ(０－ｔ)(最後に測定可能な濃度までの濃度時間曲線下面積)が大きく、一方、両者とも、９８２ ＲｅｆよりＡＵＣ(０－ｔ)が有意に大きかった。
図１６は２回目のラット試験における、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆおよび９８２ Ｄ２ ＩＬ－２融合分子の血清血漿濃度の経時変化を示したものである。このアッセイでは頸静脈カニューレを装着した雄のSprague-Dawleyラットに、ＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２および９８２ Ｒｅｆを１mg／kg、９８２ Ｄ１を３mg／kg、それぞれ示す通りに皮下投与した。血液は０時間、１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１４４時間後に採取された。血清検体はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγキャプチャーと抗ヒトＩＬ－２ビオチンを検出試薬として用いたＥＬＩＳＡ法により、試験品を測定した。９８２ Ｄ２は９８２ Ｄ１よりもＡＵＣ(０－ｔ)が大きく、９８２ Ｒｅｆよりも両者ともＡＵＣ(０－ｔ)が有意に大きかった。また、経時的な血漿中濃度の測定は、ＩＬ－２部分にＶ９１Ｋの変異がある９８２ Ｒｅｆよりも、マスクされたＩＬ－２融合分子のＰＫプロファイルが良好であることを示した。
ＰＤ分析では９８２分子を皮下注射した後、０～１４４時間の間の様々な時点で血液を採取した。９８２ ＩＬ－２融合分子を投与したラットのＫ２ ＥＤＴＡ採血管に採取した血液サンプルはメーカーの推奨に従い、各血液サンプルの１容量を、あらかじめ温めておいたBD PhosflowTM lyse/fix buffer(１×, BD Biosciences cat# 558049)と混合して溶解および固定した。血液サンプルを２％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した後、メーカーの指示に従い、低温の透過性処理緩衝液II(BD Biosciences cat#558052, -20℃)を用いて氷上で３０分間透過性処理を行った。その後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで４回広範囲に洗浄し、細胞ペレットを４℃で保存するか、染色用緩衝液に再懸濁した。
ＦＯＸＰ３およびＫｉ６７の測定には各サンプリングから上記固定／透過処理したラット血球細胞(３００ｋ－４００Ｋ細胞／ウェル)を５０μL／ウェルのアリコートで９６ウェルワーキングプレートに加えた。次に、マウス抗ラットＣＤ４－ＦＩＴＣ(Biolegend, cat#201505)、マウス抗ラットＣＤ２５－ＰＥ(BD Bioscience, cat#554866)、マウス抗ラットＦＯＸＰ３－ＡＰＣ(Biolegend, cat#320014)；またはマウス抗Ｋｉ６７－ＡＰＣ(Biolegend, cat#320514)を含むＡｂ混合液５０μLを各ウェルに加え、プレート内の細胞を室温で１時間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、経時的にＴｒｅｇ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋)細胞とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－)細胞をそれぞれ％変化させるフローサイトメトリー分析を行った。また、フローサイトメトリーを用いて、Ｋｉ６７＋(増殖マーカー)細胞の経時変化を調べた。
図１７Ａおよび１７Ｂは９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子によってＣＤ４＋／ＦＯＸＰ３＋およびＣＤ４＋／ＦＯＸＰ３－細胞(ラット)に誘発される変化を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂは第１回目の試験のラットにおいて、９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１および９８２ Ｒｅｆ ＩＬ－２融合分子によって誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞の増殖を示す。頸静脈カニューレを装着した雄のSprague-Dawleyラットに、ＩＬ－２融合分子９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｒｅｆを１mg／kg皮下投与した。０、２４、４８、９６、１４４時間後に血液を採取し、血液サンプルの溶解／固定／透過性処理後にＡｂ染色を行った。続いて、フローサイトメトリーによるＴｒｅｇ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋)およびＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－)細胞の％変化をそれぞれ分析した。また、Ｔｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)の経時変化をそれぞれ測定した(図１７Ａ、１７Ｂ)またはＫｉ６７＋(増殖マーカー)細胞の経時変化を測定した(図１８Ａ、１８Ｂ)。図１９Ａおよび１９Ｂはラットにおいて、９８２ ＩＬ－２融合分子によって誘発されたＣＤ４＋／ＦＯＸＰ３＋およびＣＤ４＋／ＦＯＸＰ３－細胞の変化を示した結果である。図２０Ａおよび２０Ｂは９８２－ＩＬ－２融合分子がラットのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋／ＣＤ２５－細胞の増殖を誘導した結果を示す。頸静脈カニューレを装着した雄のSprague-Dawleyラットに、ＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１を１mg／kgおよび３mg／kg、９８２ Ｄ２を１mg／kg、９８２ Ｒｅｆを１mg／kg皮下投与した。０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１４４時間後に血液を採取し、血液サンプルの溶解／固定／透過性処理後にＡｂ染色を行った。続いて、フローサイトメトリーによるＴｒｅｇ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋)とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－)細胞の経時変化をそれぞれ分析した。また、フローサイトメトリーを用いて、Ｋｉ６７＋(増殖マーカー)細胞の経時変化を調べたところ、ゲートされたＴｒｅｇ(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)細胞とＴｅｆｆ(ＣＤ４＋ＣＤ２５－)細胞の経時変化がそれぞれ見られた(図２０Ａおよび２０Ｂ)。
結果は、９８２ Ｄ１は９８２ Ｒｅｆに比べて、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞に対して、より大きく、より長い効果を示した。これは９８２ Ｒｅｆのインビトロでの活性が有意に高かったことを考えると、驚くべきことである。２回目のラットインビボ試験でも同様の結果が得られた(図１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、２０Ｂ)。驚くべきことに、９８２ Ｄ１は９８２ Ｄ２(図１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、２０Ｂ)と比較して、ラットのＣＤ４＋／ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋／ＣＤ２５－細胞の増殖を刺激することで、より高い効果を発揮した。これはラットＣＤ４Ｔ細胞に対する結合アッセイにおいて、９８２ Ｄ１が９８２ Ｄ２よりもわずかに高い結合活性を示したこととよく一致する(図１２)。しかし、９８２ Ｄ１と９８２ Ｄ２の間で観察された活性の違いはインビトロよりもインビボの方が明らかだった(図１９Ａおよび２０Ａ)。
９８２ Ｄ１と９８２ ＲｅｆはＴｅｆｆ細胞よりもＴｒｅｇ細胞を優先的に刺激する選択性を示したが、９８２ Ｄ１によるＴｅｆｆ細胞の刺激活性が９８２ Ｒｅｆに比べてほとんど見られなかったことから、９８２ Ｄ１が９８２ Ｒｅｆよりも優れた選択性を有することが明らかになった(図１８Ｂおよび２０Ｂ)。
体重
また、ＩＬ－２融合分子の安全性を評価するために、６日間の試験期間中に動物の体重を測定した。動物はＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１を１mg／kgおよび３mg／kg、９８２ Ｄ２を１mg／kgおよび９８２ Ｒｅｆを１mg／kg、それぞれ単回皮下投与された。体重(ＢＷ)は各動物について、０日目(投与)から６日目まで毎日測定した。その結果を図２１に示す。９８２ Ｄ１を１mg／kgおよび３mg／kgで単回投与したラットは９８２ Ｒｅｆを１mg／kgで投与したラットに比べて体重が増加した。
以上のように、インビトロおよびインビボ試験において、マスキングされたＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１はＩＬ－２部分に変異Ｖ９１ＫおよびＣ１２５Ａを含むホモ二量体ＩＬ－２融合分子である９８２ Ｒｅｆよりも驚くほど優れたＰＫプロファイルを有することが明らかになった。驚くべきことに、９８２ Ｄ１は９８２ Ｒｅｆに比べ、ラットのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞の増殖を刺激する強力なインビボ活性を有していた(図１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ、１８Ｂ、１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、２０Ｂ)。さらに、３つのマスクされたＩＬ－２融合分子(９８２ Ｃ１、９８２ Ｄ１、９８２ Ｄ２)は何れも９８２ ＲｅｆのＰＫよりも長かった(図１５および１６)。また、９８２ Ｄ１が９８２ Ｄ２よりもラットでのインビボ活性が強かったことも驚きである。９８２ Ｄ１は９８２ Ｄ２や９８２ Ｒｅｆ.に比べてインビトロでの活性が比較的低いにもかかわらず、同じラット試験でテストされた他の分子に比べてインビボでの活性が優れていた。さらに、体重データ(図２１)から、９８２ Ｄ１は９８２ Ｒｅｆよりも安全である可能性が示唆された。また、マスキングされたＩＬ－２融合分子９８２ Ｄ１の強力で選択的なインビボ活性は９８２ Ｄ１がいかなる開裂可能なペプチドリンカーからも構成されていないため、プロテアーゼ依存的な開裂やマスキング部分の除去を必要とせずに達成できることも驚きであった。このような新規の作用機序は疾患部位におけるプロテアーゼ(複数可)の分布が均一でない可能性があり、マスキング部分の非特異的な開裂および除去(または「漏出」)が、循環または他の正常な組織および疾患部位の外側で行われる可能性があるため、望ましい。
理論には拘束されないが、９８２ Ｒｅｆと比較して９８２ Ｄ１の優れたインビボ活性を説明するにはＰＫプロファイルの違いが部分的に影響する可能性がある。また、９８２ Ｄ１とＤ２の間で観察された生体内での活性の違いは化学種間の交差反応性によっても説明できる可能性がある。理論には拘束されないが、融合分子のＣＤ２５への結合時に、９８２ Ｄ１のマスキング部分と担体の間の長いリンカーが、内因性のＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒγの両方が存在する場合に、内因性のＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤとマスキング部分との競合を促進することも可能である。９８２ Ｄ１がＴｒｅｇ細胞の増殖を促すためには内因性のＩＬ－２ＲβとＩＬ－２Ｒγの両方にサイトカイン部分が結合することが必要である。マスキング部分であるＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤと担体の間の長いリンカーはサイトカイン部分が内因性のＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγと４量体の複合体を形成するために必要な柔軟性を提供すると考えられる。マスキング部分であるＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤと担体の間のリンカーが短く、特にサイトカイン部分と担体の間のリンカーも短ければ、マスキング部分が４分子複合体形成のための特別な制約となる可能性がある。図１１は９８２ Ｄ２が９８２ Ｄ１よりも強いヒトＴ細胞とのインビトロ活性を持っているにもかかわらず、９８２ Ｄ２はＤ１よりもラットＣＤ４＋ Ｔ細胞との結合力がわずかに弱いことを示す。しかし、ラットのＣＤ４＋細胞への結合力の差は比較的小さく、Ｄ１とＤ２のインビボでの活性の有意差を説明できないかもしれない(１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、２０Ｂ)。
配列
以下の配列において、ボックス内の残基は変異を示す。開裂可能なリンカーの下線はプロテアーゼ基質配列を示す。
Figure 2022544771000003
Figure 2022544771000004
Figure 2022544771000005
Figure 2022544771000006
Figure 2022544771000007
Figure 2022544771000008
Figure 2022544771000009
Figure 2022544771000010
Figure 2022544771000011
Figure 2022544771000012
Figure 2022544771000013

Claims (28)

  1. 単離ＩＬ－２融合分子であって、担体部分、サイトカイン部分および１以上のマスキング部分を含み、ここで
    サイトカイン部分は担体部分またはマスキング部分に融合され、
    １以上のマスキング部分が担体部分またはサイトカイン部分に融合され、
    該サイトカイン部分は(ｉ)Ｃ１２５ＡもしくはＣ１２５Ｓの置換または(ii)Ｔ３Ａ、Ｃ１２５Ｓ、Ｖ６９ＡおよびＱ７４Ｐから選択される１以上の置換を含むＩＬ－２アミノ酸配列を含むＩＬ－２ポリペプチドを含み(ナンバリングは配列番号１に従う)、
    １以上のマスキング部分がサイトカイン部分に結合し、免疫細胞上のＩＬ－２Ｒαではなく、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγへのサイトカイン部分の結合を阻害する、
    単離ＩＬ－２融合分子。
  2. 炎症状態または自己免疫疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、担体部分、サイトカイン部分および１以上のマスキング部分を含む治療量の単離ＩＬ－２融合分子を投与することを含み、ここで
    サイトカイン部分は担体部分またはマスキング部分に融合され、
    １以上のマスキング部分が担体部分またはサイトカイン部分に融合され、
    該サイトカイン部分はＩＬ－２ポリペプチドを含み、そして
    １以上のマスキング部分がサイトカイン部分に結合し、免疫細胞上のＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒγへのサイトカイン部分の結合を阻害するが、ＩＬ－２Ｒαへの結合は阻害しないものである、
    方法。
  3. 炎症状態または自己免疫疾患が喘息、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、アレルギー、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、臓器移植片拒絶反応および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項２の方法。
  4. ＩＬ－２融合分子が以下の特性：
    (ａ)α、βおよびγサブユニットを有する高親和性のＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒαβγ)に、βおよびγサブユニットを有する中間型のＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒβγ)の１００倍以上の親和性で結合する、
    (ｂ)３７℃の表面プラズモン共鳴アッセイで測定されたＫＤが約５nM以上または１０nM以上でＩＬ－２Ｒβγに結合する、
    (ｃ)ＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイにおいて、約１nM未満、０.０１nM、０.２５nMまたは０.０５nM以上のＥＣ５０値を有する、
    (ｄ)ＮＫ９２細胞の増殖アッセイにおいて、約０.０５nM、０.１nM、０.２５nMまたは０.５nMよりも大きいＥＣ５０値を有する、
    (ｅ)中和ＣＤ２５抗体の存在下でのＮＫ９２細胞の増殖アッセイにおいて、中和ＣＤ２５抗体の非存在下と比較して、Ｅｍａｘ値が少なくとも５倍または少なくとも１０倍低い、
    (ｆ)Ｔエフェクター細胞やＮＫ細胞に比べて、ＦＯＸＰ３＋ Ｔ制御細胞を優先的に刺激する、
    (ｇ)ＦＯＸＰ３＋制御Ｔ細胞の成長または生存を促進する、および
    (ｈ)はＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導するがＦＯＸＰ３－ Ｔ細胞においてはその誘導能力が低下する、
    の１つ以上を有する、請求項１のＩＬ－２融合分子または請求項２もしくは３の方法。
  5. ＩＬ－２融合分子がＩＬ－２ＲβもしくはＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含むマスキング部分を含み、マスキング部分がペプチドリンカーを用いてまたは用いずに担体部分に融合される、請求項１～４の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  6. ＩＬ－２融合分子が以下の部分：
    ＩＬ－２ＲβもしくはＩＬ－２Ｒγの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む第１マスキング部分であって、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに担体部分に融合される第１マスキング部分、および
    ＩＬ－２ＲγもしくはＩＬ－２ＲβのＥＣＤまたはその機能的アナログを含む第２マスキング部分であって、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、サイトカイン部分または第１マスキング部分に融合される第２マスキング部分
    を含む、請求項１～４の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  7. ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログが配列番号３と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項５または６のＩＬ－２融合分子または方法。
  8. ＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログが配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項５～７の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  9. ＩＬ－２ポリペプチドが配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、所望により、アミノ酸配列が配列番号２である、請求項１～８の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  10. 担体部分がＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミンフラグメント、抗体Ｆｃドメイン、抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、請求項１～９の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  11. サイトカイン部分が開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体部分またはマスキング部分に融合され、マスキング部分が開裂不可能なペプチドリンカーを介して担体部分またはサイトカイン部分に融合される、請求項１～１０の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  12. マスキング部分が少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも１８個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２２個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸または最大４４個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、担体部分またはサイトカイン部分に融合される、請求項１１のＩＬ－２融合分子または方法。
  13. 担体部分が抗体Ｆｃドメインであり、融合分子が：
    Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１、Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｅ２およびＦ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｅ１から選択される分子式で構成される第１ポリペプチド鎖および
    Ｎ末端からＣ末端方向で、分子式Ｆ２－Ｌ３－Ｃで構成される第２ポリペプチド鎖
    を含むヘテロ二量体であり、ここで、
    Ｆ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、
    Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、
    Ｃはサイトカイン部分である、
    請求項１～１２の何れかのＩＬ２融合分子または方法。
  14. 担体部分が抗体Ｆｃドメインであり、融合分子が：
    Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１、Ｅ１－Ｌ１－Ｅ２－Ｌ２－Ｆ１およびＥ２－Ｌ１－Ｅ１－Ｌ２－Ｆ１から選択される分子式で構成される第１ポリペプチド鎖および
    Ｎ末端からＣ末端方向で、分子式Ｃ－Ｌ３－Ｆ２で構成される第２ポリペプチド鎖
    を含むヘテロ二量体であり、ここで
    Ｆ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、
    Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、
    Ｃはサイトカイン部分である、
    請求項１～１２の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  15. 担体部分が抗体Ｆｃドメインであり、融合分子が、それぞれＮ末端からＣ末端方向で、次のペア：
    Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ２、
    Ｆ１－Ｌ１－Ｅ１およびＦ２－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｃ、
    Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｅ１、
    Ｆ１－Ｌ１－Ｅ２およびＦ２－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｃ、
    Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２、
    Ｅ１－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ２－Ｌ３－Ｆ２、
    Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＥ２－Ｌ２－Ｃ－Ｌ３－Ｆ２ならびに
    Ｅ２－Ｌ１－Ｆ１およびＣ－Ｌ２－Ｅ１－Ｌ３－Ｆ２
    から選択される分子式で構成される第１ポリペプチド鎖および第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体であり、ここで、
    Ｆ１およびＦ２はＦｃドメインのサブユニットであり、
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はペプチドリンカーであり、
    Ｅ１はＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、Ｅ２はＩＬ－２Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、
    Ｃはサイトカイン部分である、
    請求項１～１２の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  16. ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３が開裂可能ではない、請求項１３～１５の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  17. Ｌ１、Ｌ２およびＬ３がそれぞれ独立して、配列番号４０～４６、５５～５７および５９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１３～１６の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  18. Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが２０～４４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項１３～１７の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  19. ＩＬ－２融合分子が：
    配列番号５０、５１または５２と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖および
    配列番号５３または５４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖
    を含む、請求項１３～１８の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  20. ＩＬ－２融合分子が：
    (ａ)配列番号５０と９９％以上同一のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖および配列番号５３と９９％以上同一のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖または
    (ｂ)配列番号５０を含む第１ポリペプチド鎖および配列番号５３を含む第２ポリペプチド鎖
    を含む、請求項１９のＩＬ－２融合分子または方法。
  21. 融合分子が少なくとも２個のマスキング部分を含み、そのうちの一方がＩＬ－２ＲαのＥＣＤまたはその機能的アナログであり、ＩＬ－２ＲαのＥＣＤマスキング部分が開裂可能なペプチドリンカーを介してサイトカイン部分、担体部分または別のマスキング部分に融合される、請求項１～２０の何れかのＩＬ－２融合分子または方法。
  22. ＩＬ－２Ｒα ＥＣＤ部分が配列番号７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１のＩＬ－２融合分子または方法。
  23. 請求項１および４～２２の何れかのＩＬ－２融合分子をコードするポリヌクレオチド。
  24. 請求項２３のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  25. 請求項２４の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  26. 請求項１および４～２２の何れかのＩＬ－２融合分子および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  27. 請求項２または３の方法で対象を処置する際に使用するための、請求項１および４～２２の何れかのＩＬ－２融合分子または請求項２６の医薬組成物。
  28. 請求項２または３の方法における、対象を処置するための医薬品の製造のための、請求項１および４～２２の何れかのＩＬ－２融合分子の使用。
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