JP2022543569A - ポリ（ａ）およびポリ（ｕ）ポリメラーゼを使用するポリヌクレオチドの鋳型なしの酵素による合成 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用して、３’－Ｏ－可逆的ブロック－ヌクレオシド三リン酸から所定の配列のポリリボヌクレオチドを、鋳型なしの酵素による合成を行うための方法および組成物に関する。本発明は、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼならびにそのバリアントを使用して、ポリヌクレオチドの鋳型なしの酵素による合成を行うための方法、キットおよび組成物に関する。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する方法は、所定の配列のＲＮＡ生成物を合成するために使用される。
Description
背景
化学ベースの合成方法を、鋳型なしのポリメラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））を使用する酵素ベースの方法によって補うかまたは置き換えることに、このような酵素の効率および温和な非毒性反応条件の利益が証明されていること（例えば、Ｙｂｅｒｔら，国際特許公開ＷＯ２０１５／１５９０２３； Ｈｉａｔｔら， 米国特許第５７６３５９４号； Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２（２０１８）など）から関心が起こっている。酵素ベースの合成における大部分のアプローチは、ＤＮＡ合成に制限され、ポリヌクレオチド生成物における所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。不運なことには、天然のＴｄＴは、改変されていないヌクレオシド三リン酸と比較して、このような改変されたヌクレオシド三リン酸を低減した効率で取り込む。従って、改変されたヌクレオシド三リン酸のより良好な取り込み効率を有する新たなＴｄＴバリアントを開発して、ＤＮＡを合成することにたくさんの努力が注がれている（例えば、Ｃｈａｍｐｉｏｎら， 米国特許公開ＵＳ２０１９／０２１１３１５； Ｙｂｅｒｔら， 国際特許公開ＷＯ２０１７／２１６４７２など）。
上記に鑑みて、鋳型なしの酵素ベースのポリヌクレオチド合成の分野は、ＤＮＡおよびＲＮＡを合成するために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の取り込みが改善された新たな鋳型なしのポリメラーゼが利用可能であれば、進歩すると思われる。
化学ベースの合成方法を、鋳型なしのポリメラーゼ（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））を使用する酵素ベースの方法によって補うかまたは置き換えることに、このような酵素の効率および温和な非毒性反応条件の利益が証明されていること（例えば、Ｙｂｅｒｔら，国際特許公開ＷＯ２０１５／１５９０２３； Ｈｉａｔｔら， 米国特許第５７６３５９４号； Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２（２０１８）など）から関心が起こっている。酵素ベースの合成における大部分のアプローチは、ＤＮＡ合成に制限され、ポリヌクレオチド生成物における所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。不運なことには、天然のＴｄＴは、改変されていないヌクレオシド三リン酸と比較して、このような改変されたヌクレオシド三リン酸を低減した効率で取り込む。従って、改変されたヌクレオシド三リン酸のより良好な取り込み効率を有する新たなＴｄＴバリアントを開発して、ＤＮＡを合成することにたくさんの努力が注がれている（例えば、Ｃｈａｍｐｉｏｎら， 米国特許公開ＵＳ２０１９／０２１１３１５； Ｙｂｅｒｔら， 国際特許公開ＷＯ２０１７／２１６４７２など）。
上記に鑑みて、鋳型なしの酵素ベースのポリヌクレオチド合成の分野は、ＤＮＡおよびＲＮＡを合成するために、可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸の取り込みが改善された新たな鋳型なしのポリメラーゼが利用可能であれば、進歩すると思われる。
Ｊｅｎｓｅｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５７： １８２１－１８３２（２０１８）
発明の要旨
本発明は、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼならびにそのバリアントを使用して、ポリヌクレオチドの鋳型なしの酵素による合成を行うための方法、キットおよび組成物に関する。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する方法は、所定の配列のＲＮＡ生成物を合成するために使用される。他の実施形態において、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する方法は、所定の配列のＤＮＡ生成物を合成するために使用される。
いくつかの実施形態において、本発明は、所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供する工程；ならびにｂ）上記ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントと、３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸および鋳型なしのポリメラーゼとを、上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントを３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長して、３’－Ｏ－ブロック－伸長されたフラグメントを形成するように接触させる工程、および（ｉｉ）上記伸長されたフラグメントを脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されたフラグメントを形成する工程のサイクルを反復する工程；を包含し、ここで上記鋳型なしのポリメラーゼは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、方法に関する。さらなる実施形態において、上記イニシエーターは、５’末端によって支持体に結合され得る。さらなる実施形態において、上記支持体は、固体支持体であり得る。
本発明は、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼならびにそのバリアントを使用して、ポリヌクレオチドの鋳型なしの酵素による合成を行うための方法、キットおよび組成物に関する。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する方法は、所定の配列のＲＮＡ生成物を合成するために使用される。他の実施形態において、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼを使用する方法は、所定の配列のＤＮＡ生成物を合成するために使用される。
いくつかの実施形態において、本発明は、所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供する工程；ならびにｂ）上記ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントと、３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸および鋳型なしのポリメラーゼとを、上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントを３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長して、３’－Ｏ－ブロック－伸長されたフラグメントを形成するように接触させる工程、および（ｉｉ）上記伸長されたフラグメントを脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されたフラグメントを形成する工程のサイクルを反復する工程；を包含し、ここで上記鋳型なしのポリメラーゼは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、方法に関する。さらなる実施形態において、上記イニシエーターは、５’末端によって支持体に結合され得る。さらなる実施形態において、上記支持体は、固体支持体であり得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ポリヌクレオチドを上記イニシエーターから切断する工程をさらに包含し得る。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、ポリ－２’－デオキシリボヌクレオチドであり、上記３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸である。さらなる実施形態では、上記３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸または３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸である。さらなる実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、上記３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸である。いくつかの実施形態において、上記３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸である。さらなる実施形態において、上記３’－アジドメチル－Ｏ－リボヌクレオシド三リン酸は、３’－アジドメチル－Ｏ－アデノシン三リン酸、３’－アジドメチル－Ｏ－グアノシン三リン酸、および３’－アジドメチル－Ｏ－シチジン三リン酸、３’－アジドメチル－Ｏ－ウリジン三リン酸からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、本発明の方法において用いられる上記ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１に関しては位置３１０において、配列番号２に関しては位置３１８において、配列番号３に関しては位置３１８において、配列番号８に関しては位置３１６において、配列番号９に関しては位置３０９において、配列番号１０に関しては位置３１６において、配列番号１１に関しては位置２７２において、配列番号１２に関しては位置３１６において、配列番号１３に関しては位置３０７において、配列番号１４に関しては位置３１３において、配列番号１５に関しては位置３１２において、配列番号１６に関しては位置３１７において、配列番号１７に関しては位置３１６において、配列番号１８に関しては位置３１６において、配列番号１９に関しては位置３１２において、配列番号２０に関しては位置３１０において、配列番号２１に関しては位置３０９において、配列番号２２に関しては位置３１７において、配列番号２３に関しては位置３１４において、配列番号２４に関しては位置３０７において、配列番号２５に関しては位置３１５において、配列番号２６に関しては位置３１６において、および配列番号２７に関しては位置３１１において、メチオニンの置換を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントである。特に、上記位置における上記メチオニンの上記置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、ＥまたはＴから選択され得る。上記配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択される上記アミノ酸配列は、配列番号１に関しては位置２３４において、配列番号２に関しては位置２４０において、配列番号３に関しては位置２４０において、配列番号９に関しては位置２３２において、配列番号１０に関しては位置２４０において、配列番号１１に関しては位置１９６において、配列番号１２に関しては位置２４０において、配列番号１３に関しては位置２２９において、配列番号１４に関しては位置２３６において、配列番号１５に関しては位置２３６において、配列番号１６に関しては位置２４１において、配列番号１７に関しては位置２３３において、配列番号１８に関しては位置２４０において、配列番号１９に関しては位置２４０において、配列番号２０に関しては位置２３４において、配列番号２１に関しては位置２３３において、配列番号２２に関しては位置２３７において、配列番号２３に関しては位置２３８において、配列番号２４に関しては位置２３１において、配列番号２５に関しては位置２３９において、配列番号２６に関しては位置２４０において、および配列番号２７に関しては位置２３５においてバリンの置換をさらに含み得る。特に、上記位置での上記バリンの上記置換は、アラニンまたはグリシンであり得る。
上記組成物のさらなる実施形態において、配列番号２または３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列は、配列番号２または３に関しては位置４１０においてアラニンの置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、位置４１０でのアラニンの置換は、バリンである。
１つの局面において、本発明は、所定の配列を有するポリリボヌクレオチドを合成するための方法およびキットであって、上記方法は、ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供する工程；ならびにｂ）上記ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントと、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸およびポリ（Ａ）ポリメラーゼとを、上記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントを３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長して、３’－Ｏ－ブロック－伸長フラグメントを形成するように接触させる工程、および（ｉｉ）上記伸長されたフラグメントを脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されたフラグメントを形成する工程のサイクルを反復する工程、を包含する方法およびキットに関する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、上記ポリヌクレオチドを上記イニシエーターから切断する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸である。別の局面において、本発明は、所定の配列を有するポリリボヌクレオチドの鋳型なしの合成を行うためのキットであって、上記キットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、固体支持体に結合されたイニシエーター、および３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸モノマーを含む、キットに関する。上記３’－Ｏ－保護－リボヌクレオシド三リン酸モノマーは、３’－Ｏ－アジドメチル－リボアデノシン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボグアノシン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボシチジン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボチミジン三リン酸および３’－Ｏ－アミノ－リボウリジン三リン酸のうちの１またはこれより多くを含み得る。上記ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、かつＭ３１０において置換を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％同一であり、かつＭ３１８において置換を有するアミノ酸配列を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントを含み得；ここで上記ポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）上記３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに取り込むことができる。別の局面では、本発明は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントであって、配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１に関しては位置３１０において、配列番号２に関しては位置３１８において、配列番号３に関しては位置３１８において、配列番号８に関しては位置３１６において、配列番号９に関しては位置３０９において、配列番号１０に関しては位置３１６において、配列番号１１に関しては位置２７２において、配列番号１２に関しては位置３１６において、配列番号１３に関しては位置３０７において、配列番号１４に関しては位置３１３において、配列番号１５に関しては位置３１２において、配列番号１６に関しては位置３１７において、配列番号１７に関しては位置３１６において、配列番号１８に関しては位置３１６において、配列番号１９に関しては位置３１２において、配列番号２０に関しては位置３１０において、配列番号２１に関しては位置３０９において、配列番号２２に関しては位置３１７において、配列番号２３に関しては位置３１４において、配列番号２４に関しては位置３０７において、配列番号２５に関しては位置３１５において、配列番号２６に関しては位置３１６において、および配列番号２７に関しては位置３１１において、メチオニンの置換を有し、ここで上記ＰＡＰバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる、ポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントに関する。特に、上記位置における上記メチオニンの上記置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、ＥまたはＴから選択され得る。ポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントは、配列番号１に関しては位置２３４において、配列番号２に関しては位置２４０において、配列番号３に関しては位置２４０において、配列番号９に関しては位置２３２において、配列番号１０に関しては位置２４０において、配列番号１１に関しては位置１９６において、配列番号１２に関しては位置２４０において、配列番号１３に関しては位置２２９において、配列番号１４に関しては位置２３６において、配列番号１５に関しては位置２３６において、配列番号１６に関しては位置２４１において、配列番号１７に関しては位置２３３において、配列番号１８に関しては位置２４０において、配列番号１９に関しては位置２４０において、配列番号２０に関しては位置２３４において、配列番号２１に関しては位置２３３において、配列番号２２に関しては位置２３７において、配列番号２３に関しては位置２３８において、配列番号２４に関しては位置２３１において、配列番号２５に関しては位置２３９において、配列番号２６に関しては位置２４０において、および配列番号２７に関しては位置２３５においてバリンの置換をさらに含み得る。特に、上記位置でのバリンの上記置換は、アラニンまたはグリシンであり得る。
別の局面では、本発明は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）バリアントであって、上記ＰＵＰバリアントはそれぞれ、配列番号４、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列であって、配列番号４に関しては位置２１２において、配列番号２８に関しては位置１８９において、配列番号２９に関しては位置１８４において、配列番号３０に関しては位置２２７において、配列番号３１に関しては位置４７８において、配列番号３２に関しては位置１９２において、配列番号３３に関しては位置１８６において、配列番号３４に関しては位置２４３において、配列番号３５に関しては位置１９６において、配列番号３６に関しては位置２５３において、配列番号３７に関しては位置２８４において、配列番号３８に関しては位置１８２において、配列番号３９に関しては位置１８７において、配列番号４０に関しては位置２０３において、配列番号４１に関しては位置２２４において、配列番号４２に関しては位置２０４において、配列番号４３に関しては位置３３７において、配列番号４４に関しては位置２９６において、配列番号４５に関しては位置２９１において、配列番号４６に関しては位置２１８において、および配列番号４７に関しては位置３６６において、チロシンの置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで上記ＰＵＰバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる、ＰＵＰバリアントに関する。
本発明は、有利なことには、成長中のＲＮＡフラグメントへのより高速のリボヌクレオチド取り込みを提供する、鋳型なしのポリメラーゼおよび３’－Ｏ－改変されたリボヌクレオシド三リン酸を提供することによって、酵素によるポリヌクレオチド合成の分野において上記の問題を克服する。
発明の詳細な説明
本発明の一般原理は、特に、例示（例えば、図面に示され、詳細に記載されるもの）によって本明細書でより詳細に開示される。しかし、その記載される特定の実施形態に本発明を限定することが意図されないことは理解されるべきである。本発明は、種々の改変および代替形態に適しており、そのうちの具体的なものが、いくつかの実施形態に関して示される。その意図は、本発明の原理および範囲内に入る全ての改変、均等物、および代替物を網羅することである。
本発明の一般原理は、特に、例示（例えば、図面に示され、詳細に記載されるもの）によって本明細書でより詳細に開示される。しかし、その記載される特定の実施形態に本発明を限定することが意図されないことは理解されるべきである。本発明は、種々の改変および代替形態に適しており、そのうちの具体的なものが、いくつかの実施形態に関して示される。その意図は、本発明の原理および範囲内に入る全ての改変、均等物、および代替物を網羅することである。
本発明の実施は、別段示されなければ、有機化学、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、および生化学の従来の技術および説明を使用し得、これらは、当該分野の技術範囲内である。このような従来技術としては、合成ペプチド、合成ポリヌクレオチド、モノクローナル抗体、核酸クローニング、増幅、配列決定および分析、ならびに関連技術の調製および使用が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような従来技術のプロトコールは、製造業者からの製品文献および標準的実験マニュアル（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（第Ｉ～ＩＶ巻）； ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）； Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ（編）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００９）； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００８）；および類似の参考文献に見いだされ得る。
本発明は、ポリヌクレオチド（ポリリボ核酸またはポリデオキシリボ核酸のいずれか）を、同じ合成においてポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）、またはＰＡＰおよびＰＵＰの両方を使用して合成するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、ＰＡＰおよび／またはＰＵＰは、３’－Ｏ－可逆的保護－ｒＮＴＰ前駆体を使用してポリリボ核酸を合成するために使用され、ここで単一のＰＵＰまたはＰＡＰバリアントが、全てのリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用され得るか、または代替の実施形態において、異なるＰＵＰおよびＰＡＰが、特定のＲＮＡの合成において、異なる種類のリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用され得る。同様に、他の実施形態において、ＰＡＰおよび／またはＰＵＰは、３’－Ｏ－可逆的保護－ｄＮＴＰ前駆体を使用して、ポリデオキシリボ核酸を合成するために使用され得、ここで単一のＰＵＰまたはＰＡＰは、全てのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）モノマーをカップリングするために使用されるか、または代替の実施形態において、異なるＰＵＰおよびＰＡＰポリメラーゼが、異なる種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸モノマーをカップリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸および３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸を、合成において成長中のポリヌクレオチド鎖にカップリングする効率を改善するために、遺伝子操作によって改変されたＰＡＰおよび／またはＰＵＰバリアントを使用する。
本発明の方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡを合成するためであろうとなかろうと、工程の反復サイクル（例えば、図１に示されるもの）を含み、ここでＲＮＡ合成に関しては所定のリボヌクレオチドモノマー（またはＤＮＡ合成に関しては２’－デオキシリボヌクレオチドモノマー）が、各サイクルに添加される。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）が提供される（例えば、固体支持体（１０２）に結合され、遊離３’－ヒドロキシル基（１０３）を有する）。ＲＮＡを合成するために、代表的には、イニシエーターはポリリボヌクレオチドであり、ＤＮＡを合成するために、代表的には、イニシエーターはポリデオキシリボヌクレオチドである。上記イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（またはその後のサイクルにおける伸長したイニシエーターポリヌクレオチド）には、３’－Ｏ－可逆的保護－ｒＮＴＰ（またはＤＮＡ合成の場合には、３’－Ｏ－可逆的保護－ｄＮＴＰ）およびＰＡＰまたはＰＵＰが、イニシエーターポリヌクレオチド（１００）または（伸長したイニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端への３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ（または３’－Ｏ－保護－ｄＮＴＰ）の酵素による取り込みに効果的な条件下で添加される（１０４）。この反応は、３’－ヒドロキシルが保護された伸長したイニシエーターポリヌクレオチド（１０６）を生成する。その伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが企図された配列を含む場合、その３’－Ｏ－保護基は除去されるか、または脱保護され、その所望の配列が、元々のイニシエーターポリヌクレオチドから切断される。このような切断は、種々の１本鎖切断技術のうちのいずれかを使用して、例えば、切断可能なヌクレオチドを、元々のイニシエーターポリヌクレオチド内の所定の位置に挿入することによって、行われ得る。例示的な切断可能なヌクレオチドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチドであり得る。さらに、広く種々の切断可能な連結または切断可能なヌクレオチドは、この目的のために使用され得る。いくつかの実施形態において、所望のポリヌクレオチドの切断は、切断された鎖に天然の遊離５’－ヒドロキシルを残す；しかし、代替の実施形態において、切断工程は、例えば、ホスファターゼ処理によって、その後の工程において除去され得る部分、例えば、５’－リン酸を残し得る。切断工程は、化学的に、熱的に、酵素によって、または光化学的方法によって、行われ得る。いくつかの実施形態において、切断可能なヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシウリジンまたは８－オキソ－デオキシグアノシン）であり得る。これらは、特異的グリコシラーゼ（例えば、それぞれ、ウラシルデオキシグリコシラーゼ、続いて、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、および８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）によって認識される。いくつかの実施形態において、切断は、イニシエーターに、端から２番目の３’ヌクレオチドとしてデオキシイノシンを提供することによって達成され得、これは、イニシエーターの３’末端においてエンドヌクレアーゼＶによって切断され得、放出されたポリヌクレオチドに５’－リン酸を残す。１本鎖ポリヌクレオチドを切断するためのさらなる方法は、以下の参考文献（これらは、参考として援用される）に開示される：米国特許第５，７３９，３８６号、同第５，７００，６４２号および同第５，８３０，６５５号；ならびに米国特許公開２００３／０１８６２２６および同２００４／０１０６７２８号；ならびにＵｒｄｅａ ａｎｄ Ｈｏｒｎ， 米国特許第５３６７０６６号。
伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドが、完成された配列を含まない場合、３’－Ｏ－保護基は除去されて、遊離３’－ヒドロキシル（１０３）を露出し、上記伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド付加および脱保護の別のサイクルに供される。
いくつかの実施形態において、オリゴリボヌクレオチドを合成する上記方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；（ｂ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する、上記イニシエーターまたは伸長中間体（すなわち、伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）と、ＰＡＰとを、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸の存在下で反応させて、３’－Ｏ－ブロック－伸長中間体を生成する工程；（ｃ）上記伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）上記ポリヌクレオチドが合成されるまで、工程（ｂ）および（ｃ）を反復する工程を包含する。（用語「伸長中間体（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」とは、「伸長フラグメント（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とも本明細書でいわれ得る）。いくつかの実施形態において、上記で注記したように、イニシエーターは、固体支持体に、例えば、その５’末端によって結合されたオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応工程、または伸長工程後に、および脱ブロックする工程の後に、洗浄する工程を包含し得る。例えば、上記反応させる工程は、所定のインキュベーション期間、または反応時間後に、組み込まれなかったリボヌクレオシド三リン酸を、例えば、洗浄する工程によって除去するという下位工程を包含し得る。このような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒間、例えば、３０秒間から数分間、例えば、３０分間であり得る。
いくつかの実施形態において、オリゴリボヌクレオチドを合成する上記方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；（ｂ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する、上記イニシエーターまたは伸長中間体（すなわち、伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）と、ＰＡＰまたはＰＵＰとを、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸の存在下で反応させて、３’－Ｏ－ブロック－伸長中間体を生成する工程；（ｃ）上記伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）上記ポリヌクレオチドが合成されるまで、工程（ｂ）および（ｃ）を反復する工程を包含する。（用語「伸長中間体」とは、「伸長フラグメント」または「伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド」とも本明細書でいわれ得る）。いくつかの実施形態において、上記で注記したように、イニシエーターは、固体支持体に、例えば、その５’末端によって結合されたオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応工程、または伸長工程後に、および脱ブロックする工程の後に、洗浄する工程を包含し得る。例えば、上記反応させる工程は、所定のインキュベーション期間、または反応時間後に、組み込まれなかったリボヌクレオシド三リン酸を、例えば、洗浄する工程によって除去するという下位工程を包含し得る。このような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒間、例えば、３０秒間から数分間、例えば、３０分間であり得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドを合成する上記方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを提供する工程；（ｂ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する、上記イニシエーターまたは伸長中間体（すなわち、伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）と、ＰＡＰまたはＰＵＰとを、３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸（3’-O-blocked-nucleoside triphosphate）の存在下で反応させて、３’－Ｏ－ブロック－伸長中間体を生成する工程；（ｃ）上記伸長中間体を脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長中間体を生成する工程；ならびに（ｄ）上記ポリヌクレオチドが合成されるまで、工程（ｂ）および（ｃ）を反復する工程を包含する。（用語「伸長中間体」とは、「伸長フラグメント」または「伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド」とも本明細書でいわれ得る）。いくつかの実施形態において、上記で注記したように、イニシエーターは、固体支持体に、例えば、その５’末端によって結合されたオリゴヌクレオチドとして提供される。上記の方法はまた、反応工程、または伸長工程後に、および脱ブロックする工程の後に、洗浄する工程を包含し得る。例えば、上記反応させる工程は、所定のインキュベーション期間、または反応時間後に、組み込まれなかったリボヌクレオシド三リン酸を、例えば、洗浄する工程によって除去するという下位工程を包含し得る。このような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒間、例えば、３０秒間から数分間、例えば、３０分間であり得る。
上記の方法はまた、上記反応させる工程、または伸長させる工程後に、および脱ブロックする工程の後に、キャップする工程（複数可）および洗浄する工程を包含し得る。上記で言及されるように、いくつかの実施形態において、キャップする工程が包含され得、ここで伸長されなかった遊離３’－ヒドロキシルは、そのキャップされた鎖のいかなるさらなる伸長をも防止する化合物と反応される。いくつかの実施形態において、このような化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。他の実施形態において、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されなかった鎖は、これらを３’－エキソリボヌクレアーゼ活性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））で処理することによって分解され得る。同様に、いくつかの実施形態において、脱ブロックされない鎖は、その鎖を除去するか、またはその鎖をさらなる伸長に対して不活性にするかのいずれかのために処理され得る。
オリゴリボヌクレオチドの連続合成を含むいくつかの実施形態において、キャップする工程は、望ましくない場合もある。なぜならキャップする工程は、複数のオリゴヌクレオチドの等モル量の生成を防止し得るからである。キャップする工程がない場合、配列は、欠失エラーの均一な分布を有するが、複数のオリゴリボヌクレオチドの各々は、等モル量で存在する。これは、伸長されなかったフラグメントがキャップされる場合には該当しない。
いくつかの実施形態において、ＰＡＰまたはＰＵＰを使用する伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）工程の反応条件は、以下を含み得る：反応条件１（プライマー＋ＡＭ－ｒＡＴＰについて）： ２５０μＭ ＡＭ－ｒＡＴＰ、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５、１μＭ ＰＡＰ、１× ＡＴＰバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ、１０％ グリセロール、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７～８）、３７C、３０分間。反応条件２（プライマー＋ＡＭ－ｒＧＴＰについて）： ２５０μＭ ｒＧＴＰ、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５、１μＭ ＰＡＰ、１× ＧＴＰバッファー（０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ６）、３７C、３０分間。前述において、「ＡＭ－ｒＮＴＰ」とは、３’－アジドメチル－Ｏ－リボヌクレオシド三リン酸をいう。
特定の適用に依存して、脱ブロックするおよび／または切断する工程は、種々の化学的条件または物理的条件（例えば、光、熱、ｐＨ、特定された化学結合を切断し得る特異的試薬（例えば、酵素）の存在）を含み得る。３’－Ｏ－ブロック基および相当する脱ブロック条件を選択するにあたってのガイダンスは、参考文献（例えば、Ｗｕｔｓ， Ｇｒｅｅｎ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第５版（Ｗｉｌｅｙ ２０１４））に見出され得る。いくつかの実施形態において、切断剤（ときおり、脱ブロック試薬または脱ブロック剤ともいわれる）は、化学的切断剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような）である。代替の実施形態において、切断剤は、３’－リン酸ブロック基を切断し得る酵素的切断剤（例えば、ホスファターゼのような）であり得る。脱ブロック剤の選択は、１個または複数のブロック基が使用されているかどうか、イニシエーターが生きている細胞もしくは生物に、または温和な処理を必要とする固体支持体に結合されているかどうかなど、使用される３’－ヌクレオチドブロック基のタイプに依存することは、当業者によって理解される。例えば、ホスフィン（例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））は、３’Ｏ－アジドメチル基を切断するために使用され得るか、パラジウム錯体は、３’Ｏ－アリル基および３’－Ｏ－プロパルギル基を切断するために使用され得るか、または亜硝酸ナトリウムは、３’Ｏ－アミノ基を切断するために使用され得る。
上記で注記したように、いくつかの実施形態において、直交脱ブロック条件を使用して除去され得る２またはこれより多くのブロック基を使用することが、望ましい。ブロック基の以下の例示的な対は、２またはこれより多くの配列が同じ反応混合物中で合成される並行合成実施形態において使用され得る。他のブロック基の対、または２より多くを含む基は、本発明のこれらの実施形態における使用に利用可能であり得ることは理解される。
本明細書で使用される場合、「イニシエーター」（または「開始フラグメント」、「イニシエーター核酸」、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」などのような同等の用語）は、鋳型なしのポリメラーゼ（例えば、ＰＡＰまたはＰＵＰ）によってさらに伸長され得る遊離３’末端を有する短いオリゴヌクレオチド配列をいう。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、ＤＮＡまたはＲＮＡ開始フラグメントである。代替の実施形態において、上記開始フラグメントは、ＲＮＡ開始フラグメントである。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、３～１００個の間のヌクレオチド、特に、３～２０個の間のヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、上記開始フラグメントは、１本鎖である。代替の実施形態において、上記開始フラグメントは、２本鎖である。特定の実施形態において、５’－一級アミンで合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドは、製造業者のプロトコールを使用して、磁性ビーズに共有結合で連結され得る。同様に、３’－一級アミンで合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドは、製造業者のプロトコールを使用して、磁性ビーズまたはアガロースビーズに共有結合で連結され得る。本発明の実施形態での使用に適した種々の他の結合化学反応は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｂｒｏｃｈｕｒｅ， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，” ｖ．６（２０１４）； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， 第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００８）；および同様の参考文献）。
本発明において使用される３’－Ｏ－ブロック－ｒＮＴＰのうちの多くは、商業ベンダー（例えば、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭｙＣｈｅｍＬａｂｓなど）から購入され得るか、または公開された技術（例えば、米国特許第７０５７０２６号；国際特許公開ＷＯ２００４／００５６６７、ＷＯ９１／０６６７８；Ｃａｎａｒｄら， Ｇｅｎｅ（上記で引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２： ４２５９－４２６７（１９９４）；Ｍｅｎｇら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １４： ３２４８－３２５２（３００６）；米国特許公開２００５／０３７９９１；Ｚａｖｇｏｒｏｄｎｙら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３２（５１）： ７５９３－７５９６（１９９１））を使用して合成され得る。
さらなる特定の実施形態において、上記３’－ブロック－ヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－プロパルギル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２または３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされる。
さらに他の実施形態において、本発明の３’－Ｏ－ブロック基は、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、および３’－Ｏ－プロパルギルを含む。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよび有用なバリアント
広く種々のＰＡＰが、改善された特性（例えば、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ（３’－Ｏ－アジドメチルのような特定の保護基を含む）のより高い取り込み率、より高い安定性および貯蔵寿命、熱安定性、溶解度など）のために操作されているＰＡＰバリアントを含め、本発明の方法とともに使用され得る。特に、Ｍ３１０において変異を有する酵母ＰＡＰ（配列番号１）、または他のＰＡＰ（例えば、種々の異なる種に由来するＰＡＰ）における機能的に等価な残基は、野生型ＰＡＰに関して、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰの改善された取り込みを示す。いくつかの実施形態において、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における変異を除いて、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、このような置換は、Ｍ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔから選択される。特に、置換Ｍ３１０Ｆ／Ｙは、３’－Ｏ－アミノ－ｒＡＴＰの取り込みを可能にし、置換Ｍ３１０Ｖ／Ｅ／Ｔは、３’－Ｏ－保護－ｒＧＴＰの取り込み率を改善する。他の実施形態において、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における置換を除いて、配列番号１の少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
広く種々のＰＡＰが、改善された特性（例えば、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ（３’－Ｏ－アジドメチルのような特定の保護基を含む）のより高い取り込み率、より高い安定性および貯蔵寿命、熱安定性、溶解度など）のために操作されているＰＡＰバリアントを含め、本発明の方法とともに使用され得る。特に、Ｍ３１０において変異を有する酵母ＰＡＰ（配列番号１）、または他のＰＡＰ（例えば、種々の異なる種に由来するＰＡＰ）における機能的に等価な残基は、野生型ＰＡＰに関して、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰの改善された取り込みを示す。いくつかの実施形態において、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における変異を除いて、配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、このような置換は、Ｍ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔから選択される。特に、置換Ｍ３１０Ｆ／Ｙは、３’－Ｏ－アミノ－ｒＡＴＰの取り込みを可能にし、置換Ｍ３１０Ｖ／Ｅ／Ｔは、３’－Ｏ－保護－ｒＧＴＰの取り込み率を改善する。他の実施形態において、本発明の酵母ＰＡＰバリアントは、Ｍ３１０における置換を除いて、配列番号１の少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明とともに使用するためのＰＡＰバリアントは、以下の表１に列挙されるものを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＰＡＰバリアントは、表１に示される第２の位置において少なくとも置換を含む。他の実施形態において、本発明のＰＡＰバリアントの実施形態は、表１に示される第１の位置において少なくとも置換を含む。
いくつかの実施形態において、表１に示されるとおりの第１の位置における置換は、ＡまたはＧである（従って、例えば、配列番号１に関しては、置換は、Ｖ２３４Ａ／Ｇと記され得る）。いくつかの実施形態において、表１に示されるとおりの第２の位置における置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｅ、またはＴである（従って、例えば、配列番号１に関しては、置換は、Ｍ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔと記され得る）。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＡＰバリアントは、表１の置換のうちの１またはこれより多くを、および示された配列番号と少なくとも８０％同一性の％同一性値を有する；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、示された配列番号と少なくとも９０％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、示された配列番号と少なくとも９５％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９７％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９８％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９９％同一性である。
いくつかの実施形態において、熱安定性ＰＡＰは、上記方法が、合成されているＲＮＡまたはＤＮＡにおける二次構造の形成を低減または排除する温度において実施され得るように使用される。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＡＰに関して起こる上記温度範囲は、４０℃超である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＡＰに関して起こる上記温度範囲は、５０℃超である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＡＰに関して起こる上記温度範囲は、４０℃～８５℃の間である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＡＰに関して起こる上記温度範囲は、５０℃～８５℃の間である。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよび有用なバリアント
ＰＡＰと同様に、広く種々のＰＵＰが、改善された特性（例えば、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ（３’－Ｏ－アジドメチルのような特定の保護基を含む）のより高い取り込み率、より高い安定性および貯蔵寿命、熱安定性、溶解度など）のために操作されているＰＵＰバリアントを含め、本発明の方法とともに使用され得る。本発明とともに使用するためのＰＵＰバリアントは、以下の表２に列挙されるものを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＰＵＰバリアントは、表２に示される第１の位置において少なくとも置換を含む。他の実施形態において、本発明のＰＡＰバリアントの実施形態は、表２に示される第２の位置において少なくとも置換を含む。
ＰＡＰと同様に、広く種々のＰＵＰが、改善された特性（例えば、３’－Ｏ－保護－ｒＮＴＰ（３’－Ｏ－アジドメチルのような特定の保護基を含む）のより高い取り込み率、より高い安定性および貯蔵寿命、熱安定性、溶解度など）のために操作されているＰＵＰバリアントを含め、本発明の方法とともに使用され得る。本発明とともに使用するためのＰＵＰバリアントは、以下の表２に列挙されるものを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＰＵＰバリアントは、表２に示される第１の位置において少なくとも置換を含む。他の実施形態において、本発明のＰＡＰバリアントの実施形態は、表２に示される第２の位置において少なくとも置換を含む。
いくつかの実施形態において、表２に示されるとおりの第１の位置における置換は、ＡまたはＧである（従って、例えば、配列番号４に関しては、置換は、Ｙ２１２Ａ／Ｇと記され得る）。いくつかの実施形態において、表２に示されるとおりの第２の位置における置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｅ、またはＴである（従って、例えば、配列番号４に関しては、置換は、Ｈ３３６Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔと記され得る）。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＵＰバリアントは、表２の置換のうちの１またはこれより多くを、および示された配列番号と少なくとも８０％同一性の％同一性値を有する；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、示された配列番号と少なくとも９０％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、示された配列番号と少なくとも９５％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９７％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９８％同一性である；いくつかの実施形態において、上記の％同一性値は、少なくとも９９％同一性である。
いくつかの実施形態において、熱安定性ＰＵＰは、上記方法が、合成されているＲＮＡまたはＤＮＡにおける二次構造の形成を低減または排除する温度において実施され得るように使用される。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＵＰに関して起こる上記温度範囲は、４０℃超である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＵＰに関して起こる上記温度範囲は、５０℃超である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＵＰに関して起こる上記温度範囲は、４０℃～８５℃の間である。いくつかの実施形態において、最高の取り込み率が熱安定性ＰＵＰに関して起こる上記温度範囲は、５０℃～８５℃の間である。
ＰＡＰおよびＰＵＰバリアントの生成
本発明のバリアントは、公知の参照または野生型のＰＡＰコードまたはＰＵＰコードポリヌクレオチドを変異させ、次いで、それを従来の分子生物学技術を使用して発現させることによって生成され得る。例えば、所望の配列のポリペプチドをコードする所望の遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｇｅｎｅ， １６４： ４９－５３（１９９５）； Ｋｏｄｕｍａｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０１： １５５７３－１５５７８（２００４）；などによって記載されるプロトコールを使用して、合成フラグメントからアセンブリされ得るか、またはこのような遺伝子もしくはＤＮＡフラグメントは、従来のプロトコールを使用して、選択された種の細胞から直接クローニングされ得る。
本発明のバリアントは、公知の参照または野生型のＰＡＰコードまたはＰＵＰコードポリヌクレオチドを変異させ、次いで、それを従来の分子生物学技術を使用して発現させることによって生成され得る。例えば、所望の配列のポリペプチドをコードする所望の遺伝子またはＤＮＡフラグメントは、従来の分子生物学技術を使用して、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら， Ｇｅｎｅ， １６４： ４９－５３（１９９５）； Ｋｏｄｕｍａｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０１： １５５７３－１５５７８（２００４）；などによって記載されるプロトコールを使用して、合成フラグメントからアセンブリされ得るか、またはこのような遺伝子もしくはＤＮＡフラグメントは、従来のプロトコールを使用して、選択された種の細胞から直接クローニングされ得る。
所望のＰＡＰまたはＰＵＰバリアントをコードする単離された遺伝子は、発現ベクターへと挿入されて、次いで、バリアントＰＡＰまたはＰＵＰタンパク質を、従来のプロトコールを使用して作製および発現するために使用され得る発現ベクターを与え得る。正確な配列を有するベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉプロデューサー株において形質転換され得る。
以下の手順は、ＰＡＰバリアントに関して記載されるが、類似の手順が、当業者によってＰＵＰバリアントに適用され得る。形質転換された株は、従来技術を使用してペレットになるまで培養され、そのペレットからＰＡＰタンパク質が抽出される。例えば、以前に調製したペレットを、３０～３７℃のウォーターバスの中で融解する。いったん完全に融解された後、ペレットを、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５％ グリセロール（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）および１００ｍＬに対してプロテアーゼカクテルインヒビターを１錠（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から構成される溶解バッファー中で再懸濁する。早過ぎる溶解および凝集物の残留を回避するために、注意深く再懸濁を行う。再懸濁した細胞を、完全な色の均質性が得られるまで、数サイクルのフレンチプレスを通じて溶解する。使用される通常の圧力は、１４，０００ｐｓｉである。次いで、溶解物を、１時間から１時間３０分、１０，０００ｒｐｍにおいて遠心分離する。遠心分離物を０．２μｍフィルターに通して、カラム精製前にいかなるデブリをも除去する。
ＰＡＰタンパク質は、１工程のアフィニティー手順において上記遠心分離物から精製され得る。例えば、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＡＰポリメラーゼを結合させ得る。最初に、上記カラムを洗浄し、１５カラム容積の５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で平衡化する。ＰＡＰポリメラーゼを、平衡化後に上記カラムに結合させる；次いで、洗浄バッファー（例えば、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｍＭ イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）から構成される）を、１５カラム容積にわたって上記カラムに適用し得る。このような洗浄後、上記ＰＡＰポリメラーゼを、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ） ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および０．５Ｍ イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）で溶離する。目的のＰＡＰポリメラーゼの最高濃度に相当する画分を集め、単一のサンプルでプールする。そのプールした画分を、透析バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、１００ｍＭ ［ＮＨ４］２ＳＯ４）に対して透析する。その後、その透析物を、濃縮フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－３０， Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の助けを借りて濃縮する。濃縮した酵素を、少量のアリコートに分配し、最終的に５０％ グリセロールになるように添加し、次いで、それらのアリコートをー２０℃で凍結し、長期間貯蔵する。その精製酵素の５μＬの種々の画分を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルで分析する。
いくつかの実施形態において、ＰＡＰバリアントは、共有結合または非共有結合；アミノ酸タグ（例えば、ポリ－アミノ酸タグ、ポリ－Ｈｉｓタグ、６Ｈｉｓ－タグなど）；化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合対（例えば、ビオチン－アビジン）；アフィニティーカップリング；捕捉プローブ；またはこれらの任意の組み合わせを含むリンカー部分に作動可能に連結し得る。上記リンカー部分は、ＰＡＰバリアントからまたはその一部から分離され得る。本発明のＰＡＰバリアントとともに使用するための例示的なＨｉｓ－タグは、ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＮＬＹＦＱＴＧＳＳＧ－（配列番号５））である。上記タグ－リンカー部分は、上記ＰＡＰバリアントのヌクレオチド結合活性や触媒活性に干渉しない。
上記のプロセス、または同等のプロセスは、活性および／または保存のために必要または有用な種々の試薬（例えば、塩、ｐＨバッファー、キャリア化合物など）と混合され得る単離されたＰＡＰまたはＰＵＰバリアントをもたらす。
ヌクレオチド取り込み活性の測定
本発明のバリアントによるヌクレオチド取り込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅら（下記で引用）； Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（下記で引用）；およびＨｉａｔｔら， 米国特許第５８０８０４５号（このうちの後者は、本明細書に参考として援用される）に記載されるように、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）、アッセイによって測定され得る。簡潔には、このようなアッセイの１形態において、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを、ＰＡＰ伸長条件下でＰＡＰバリアントと反応させて、可逆的にブロックされたリボヌクレオシド三リン酸の存在下で所定の継続時間にわたって試験し、その後、伸長反応を停止させ、伸長生成物および伸長しなかったイニシエーターオリゴヌクレオチドの量を、ゲル電気泳動による分離後に定量する。このようなアッセイによって、ＰＡＰバリアントの取り込み効率を、他のバリアントの効率、あるいは野生型もしくは参照ＰＡＰ、または他のポリメラーゼの効率と容易に比較され得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＰバリアント効率の尺度は、同等のアッセイにおいて野生型ＰＡＰを使用して伸長した生成物の量に対するＰＡＰバリアントを使用して伸長した生成物の量の比（パーセンテージとして示される）であり得る。試薬を、水から開始し、次いで、表３の順序でチューブに添加する。
本発明のバリアントによるヌクレオチド取り込みの効率は、例えば、Ｂｏｕｌｅら（下記で引用）； Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（下記で引用）；およびＨｉａｔｔら， 米国特許第５８０８０４５号（このうちの後者は、本明細書に参考として援用される）に記載されるように、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）、アッセイによって測定され得る。簡潔には、このようなアッセイの１形態において、遊離３’－ヒドロキシルを有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを、ＰＡＰ伸長条件下でＰＡＰバリアントと反応させて、可逆的にブロックされたリボヌクレオシド三リン酸の存在下で所定の継続時間にわたって試験し、その後、伸長反応を停止させ、伸長生成物および伸長しなかったイニシエーターオリゴヌクレオチドの量を、ゲル電気泳動による分離後に定量する。このようなアッセイによって、ＰＡＰバリアントの取り込み効率を、他のバリアントの効率、あるいは野生型もしくは参照ＰＡＰ、または他のポリメラーゼの効率と容易に比較され得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＰバリアント効率の尺度は、同等のアッセイにおいて野生型ＰＡＰを使用して伸長した生成物の量に対するＰＡＰバリアントを使用して伸長した生成物の量の比（パーセンテージとして示される）であり得る。試薬を、水から開始し、次いで、表３の順序でチューブに添加する。
上記アッセイの生成物は、従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され得る。例えば、上記アッセイの生成物は、１６％ ポリアクリルアミド変性ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において分析され得る。ガラスプレート内部にポリアクリルアミドを注ぎ、それを重合させることによって、ゲルを分析の直前に作製する。上記ガラスプレート内部のゲルを、電気泳動工程のために、ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ）を満たした適合したタンクに取り付ける。分析されるべきサンプルを、上記ゲルの頂部に載せる。５００～２，０００Ｖの電圧を、上記ゲルの頂部と底部との間に３～６時間、室温において印加する。分離後、ゲル蛍光を、例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスキャンする。ゲル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）、またはその等価物を使用して分析して、改変されたヌクレオチドの取り込みのパーセンテージを計算する。
キット
本発明は、本発明の方法を行うためのキットを包含する。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ならびにアデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの１またはこれより多くの３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸を含む。他の実施形態において、このようなキットは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ならびにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンのうちの１またはこれより多くの３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。他の実施形態において、このようなキットは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、５’末端によって支持体に結合された遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを含み得る。いくつかの実施形態において、このような支持体は、固体支持体である。このような固体支持体は、ビーズ（例えば、磁性ビーズまたはアガロースビーズ）、平らな固体（例えば、ガラススライド）、または膜などを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、取り込まれた３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオチドから３’ブロック基を除去し得る脱ブロック剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、酵母ＰＡＰ（例えば、配列番号１の酵母ＰＡＰ）のＭ３１０変異体、または異なる種に由来するＰＡＰにおけるＭ３１０に対して機能的に等価な残基を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号１、２または３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列であって、配列番号１に関しては位置３１０においてメチオニンの、または配列番号２および３に関しては位置３１８においてメチオニンの置換を有するアミノ酸配列を含むＰＡＰバリアントを含み得、ここで上記バリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる。
本発明は、本発明の方法を行うためのキットを包含する。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ならびにアデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの１またはこれより多くの３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸を含む。他の実施形態において、このようなキットは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ならびにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンのうちの１またはこれより多くの３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。他の実施形態において、このようなキットは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、５’末端によって支持体に結合された遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを含み得る。いくつかの実施形態において、このような支持体は、固体支持体である。このような固体支持体は、ビーズ（例えば、磁性ビーズまたはアガロースビーズ）、平らな固体（例えば、ガラススライド）、または膜などを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、取り込まれた３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオチドから３’ブロック基を除去し得る脱ブロック剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、酵母ＰＡＰ（例えば、配列番号１の酵母ＰＡＰ）のＭ３１０変異体、または異なる種に由来するＰＡＰにおけるＭ３１０に対して機能的に等価な残基を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号１、２または３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列であって、配列番号１に関しては位置３１０においてメチオニンの、または配列番号２および３に関しては位置３１８においてメチオニンの置換を有するアミノ酸配列を含むＰＡＰバリアントを含み得、ここで上記バリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる。
いくつかの実施形態において、前述のキットのＰＡＰバリアントにおいて、配列番号１の位置３１０におけるメチオニンの、または配列番号２もしくは３の位置３１８におけるメチオニンの置換は、Ｍ３１０Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｅ／Ｔから選択される。いくつかの実施形態において、前述のキットのＰＡＰバリアントにおいて、配列番号１に関しては位置２３４においてバリンの、ならびに配列番号２および３に関しては位置２４０においてバリンの置換が存在する。いくつかの実施形態において、前述のキットのＰＡＰバリアントにおいて、配列番号１の位置２３４においてバリンの、ならびに配列番号２および３に関しては位置２４０のバリンの置換は、アラニンである。いくつかの実施形態において、前述のキットのＰＡＰバリアントにおいて、配列番号２または３に関しては位置４１０においてアラニンの置換が存在する。
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、表１に示されるような選択された配列の第１の位置において置換を、または第２の位置において置換を、または両方の位置において置換を有する表１の配列番号１～３および８～２７から選択される配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＰＡＰバリアントを含み得る。いくつかの実施形態において、上記選択された配列のこのような％同一性は、少なくとも９０％同一性である。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、表２に示されるような選択された配列の第１の位置において置換を、または第２の位置において置換をまたは両方の位置に置いて置換を有する表２の配列番号４および２８～４７から選択される配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＰＵＰバリアントを含み得る。いくつかの実施形態において、選択された配列のこのような％同一性は、少なくとも９０％同一性である。
実施例１
固体支持体に固定されたイニシエーターポリヌクレオチドへの１～５個のリボヌクレオチドの付加
ＰＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ）の存在下での３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸（ＡＭ－ＮＴＰｓ）でのＣｐ－ＲＮＡプライマーの２～３サイクルの伸長。実験手順： １）Ｃｐ－ビーズの調製： １００μＬ Ｃｐ－ビーズ（ビーズ上に約１μＭ 濃度のＣｐプライマー） ＋ １μＬ １００μＭ ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡ； 室温において３０分間インキュベートし、ビーズを３×２００μＬ 結合バッファー（ＢＢ）（２００ｍＭ ｃａｃｏ、ＬｉＣｌ）で洗浄し、ビーズを２５μＬ ＢＢ中で再懸濁する； ２） ＋１付加反応： ２５０μＭ ３’Ｏ－終結ヌクレオチド； ３．２μＭ Ｃｐ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡ； １× ＰＡＰ＿ｙｅａｓｔ Ｔｈｅｒｍｏ反応バッファー； １００Ｕ／μＬ ＰＡＰ＿ｙｅａｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）； ２０μＬ 最終容積； エッペンドルフチューブ中； ３０分間、３７℃、サーモミキサー， １５００ｒｐｍ、３）＋１生成物を洗浄する： ３× ２００μＬ ＢＢ、４）ＴＣＥＰ脱保護： ビーズを、５０μＬ ２００μＭ ＴＣＥＰ， ｐＨ７．０（新しく開封したアンプルから希釈）中、３７Cで１５分間、サーモミキサー，１５００ｒｐｍにおいて再懸濁する； ５）脱保護した＋１生成物を洗浄する： ３× ２００μＬ 結合バッファー、６）＋２／脱保護／＋３付加： １）～５）を参照のこと、８）溶離＋ゲル： ２０μＬ Ｂ－ｂｌｕｅを添加し、ボルテックスにかけ、溶離し、ゲルにアプライする。使用される上記Ｃｐ－ＲＮＡビーズを、以下の方法で調製した： ｉ）ＤＮＡオリゴ（ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡ－ＮＨ２）（配列番号６）での、末端カルボン酸基を示す市販のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の共有結合官能化。これらのビーズを、Ｃｐ－ビーズと称する。次いで、Ｃｐ－ビーズを、配列 ＡＴＴＯ４８８－ＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧｒＵｒＧｒＵｒＧｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒ－ＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＡｒＧｒＧ（ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡと称する）（配列番号７）のＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドプライマーとともにインキュベートした。
固体支持体に固定されたイニシエーターポリヌクレオチドへの１～５個のリボヌクレオチドの付加
ＰＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ）の存在下での３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸（ＡＭ－ＮＴＰｓ）でのＣｐ－ＲＮＡプライマーの２～３サイクルの伸長。実験手順： １）Ｃｐ－ビーズの調製： １００μＬ Ｃｐ－ビーズ（ビーズ上に約１μＭ 濃度のＣｐプライマー） ＋ １μＬ １００μＭ ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡ； 室温において３０分間インキュベートし、ビーズを３×２００μＬ 結合バッファー（ＢＢ）（２００ｍＭ ｃａｃｏ、ＬｉＣｌ）で洗浄し、ビーズを２５μＬ ＢＢ中で再懸濁する； ２） ＋１付加反応： ２５０μＭ ３’Ｏ－終結ヌクレオチド； ３．２μＭ Ｃｐ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡ； １× ＰＡＰ＿ｙｅａｓｔ Ｔｈｅｒｍｏ反応バッファー； １００Ｕ／μＬ ＰＡＰ＿ｙｅａｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）； ２０μＬ 最終容積； エッペンドルフチューブ中； ３０分間、３７℃、サーモミキサー， １５００ｒｐｍ、３）＋１生成物を洗浄する： ３× ２００μＬ ＢＢ、４）ＴＣＥＰ脱保護： ビーズを、５０μＬ ２００μＭ ＴＣＥＰ， ｐＨ７．０（新しく開封したアンプルから希釈）中、３７Cで１５分間、サーモミキサー，１５００ｒｐｍにおいて再懸濁する； ５）脱保護した＋１生成物を洗浄する： ３× ２００μＬ 結合バッファー、６）＋２／脱保護／＋３付加： １）～５）を参照のこと、８）溶離＋ゲル： ２０μＬ Ｂ－ｂｌｕｅを添加し、ボルテックスにかけ、溶離し、ゲルにアプライする。使用される上記Ｃｐ－ＲＮＡビーズを、以下の方法で調製した： ｉ）ＤＮＡオリゴ（ＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡ－ＮＨ２）（配列番号６）での、末端カルボン酸基を示す市販のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の共有結合官能化。これらのビーズを、Ｃｐ－ビーズと称する。次いで、Ｃｐ－ビーズを、配列 ＡＴＴＯ４８８－ＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＧｒＵｒＧｒＵｒＧｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒ－ＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＡｒＧｒＧ（ＳｙｎＲＤＡ＿ＤＮＡ－ＳｙｎＲＤＡ＿ＲＮＡと称する）（配列番号７）のＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドプライマーとともにインキュベートした。
結果を図２Ａ～２Ｃに示す。このデータは、ｉ）３’－Ｏ－ＡＭ－ｒＡＴＰおよび３’－Ｏ－ＡＭ－ｒＵＴＰを用いると、少なくとも５サイクルの付加／脱保護を、同じヌクレオチドで達成し得る； ｉｉ）少なくとも２サイクルの付加／脱保護を、２種の異なる３’－Ｏ－ＡＭ－ｒＮＴＰｓ（ＡおよびＵ）で達成し得る；ならびにｉｉｉ）３’－Ｏ－ＡＭ－保護－ＲＮＡの少なくとも＞９５％ 脱保護を達成し得る、ことを示す。
実施例２
ＡＭ－ｒＡＴＰ伸長およびリボグアニル化の活性に対するＰＡＰ Ｍ３１０変異の効果
この実験では、ＲＮＡプライマーのＡＭ－ｒＡＴＰ伸長（図３Ａ）およびＲＮＡプライマーのリボグアニル化（図３Ｂ）の活性に対するＰＡＰ位置Ｍ３１０における変異の効果を調べる。ＲＮＡプライマーのＡＭ－ｒＡＴＰ伸長（図３Ａ）を、伸長ＡＭ－ｒＡＴＰバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ、１０％ グリセロール、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７～８）中で、３０分間、３７Cで総反応容積２０μＬにおいて、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５プライマー、０．５μＭ ＰＡＰ変異体、２５０μＭ ＡＭ－ｒＡＴＰの存在下で行った。ＲＮＡプライマーのリボグアニル化（図３Ｂ）を、ｒＧＴＰ重合バッファー（０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ イミダゾール， ｐＨ６．２）中で、３０分間、３７Cで総反応容積２０μＬにおいて、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５ プライマー、０．５μＭ ＰＡＰ変異体、２５０μＭ ＡＭ－ｒＡＴＰの存在下で行った。
ＡＭ－ｒＡＴＰ伸長およびリボグアニル化の活性に対するＰＡＰ Ｍ３１０変異の効果
この実験では、ＲＮＡプライマーのＡＭ－ｒＡＴＰ伸長（図３Ａ）およびＲＮＡプライマーのリボグアニル化（図３Ｂ）の活性に対するＰＡＰ位置Ｍ３１０における変異の効果を調べる。ＲＮＡプライマーのＡＭ－ｒＡＴＰ伸長（図３Ａ）を、伸長ＡＭ－ｒＡＴＰバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ、１０％ グリセロール、１００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７～８）中で、３０分間、３７Cで総反応容積２０μＬにおいて、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５プライマー、０．５μＭ ＰＡＰ変異体、２５０μＭ ＡＭ－ｒＡＴＰの存在下で行った。ＲＮＡプライマーのリボグアニル化（図３Ｂ）を、ｒＧＴＰ重合バッファー（０．６ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ イミダゾール， ｐＨ６．２）中で、３０分間、３７Cで総反応容積２０μＬにおいて、０．１μＭ ＡＴＴＯ４８８－（ｒＡ）５ プライマー、０．５μＭ ＰＡＰ変異体、２５０μＭ ＡＭ－ｒＡＴＰの存在下で行った。
実施例３
ＡＭ－ｒＮＴＰ取り込みに対するＴｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰバリアントの効果
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰ（配列番号３）を、従来の技術を使用して、３個の置換（Ｖ２４０Ａ、Ｍ３１８ＴおよびＡ４１０Ｖ）を有するように操作し、その後、改変されたポリペプチドを発現させ精製した。野生型Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰおよび変異したＰＡＰが、ＡＭ－ＮＴＰを取り込む能力を、以下の条件を除いて実施例２に記載されるアッセイを行うことによって比較した： ０．１μＭ Ａｔｔｏ４８８－（ｒＡ）７、３．０μＭ ＰＡＰ、２５０μＭ ＡＭ－ＮＴＰ。反応結果を、以下の表４に示す。
上記データは、Ｔｈｅｌａｖｉａ ＰＡＰバリアントが、相当する野生型ＰＡＰより遙かに効率的に、ＡＭ－ｒＧＴＰおよびＡＭ－ｒＣＴＰモノマーを取り込むことを示す。
ＡＭ－ｒＮＴＰ取り込みに対するＴｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰバリアントの効果
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰ（配列番号３）を、従来の技術を使用して、３個の置換（Ｖ２４０Ａ、Ｍ３１８ＴおよびＡ４１０Ｖ）を有するように操作し、その後、改変されたポリペプチドを発現させ精製した。野生型Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ＰＡＰおよび変異したＰＡＰが、ＡＭ－ＮＴＰを取り込む能力を、以下の条件を除いて実施例２に記載されるアッセイを行うことによって比較した： ０．１μＭ Ａｔｔｏ４８８－（ｒＡ）７、３．０μＭ ＰＡＰ、２５０μＭ ＡＭ－ＮＴＰ。反応結果を、以下の表４に示す。
実施例４
ＰＵＰによるＡＭ－ＮＴＰの取り込み
この実験では、ＡＭ－ＮＴＰを、実施例３の実験プロトコールを使用してイニシエーターへと取り込むためにｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＰＵＰ（配列番号４）を使用した。伸長生成物をゲル電気泳動によって分離して、図４に示される電気泳動図を得た。
ＰＵＰによるＡＭ－ＮＴＰの取り込み
この実験では、ＡＭ－ＮＴＰを、実施例３の実験プロトコールを使用してイニシエーターへと取り込むためにｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＰＵＰ（配列番号４）を使用した。伸長生成物をゲル電気泳動によって分離して、図４に示される電気泳動図を得た。
定義
アミノ酸を、以下の命名法に従って、それらの１文字コードまたは３文字コードのいずれかによって表す： Ａ：アラニン（Ａｌａ）； Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）； Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）； Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）； Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）； Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）； Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）； Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）； Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）； Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）； Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）； Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）； Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）； Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）； Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）； Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）； Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）； Ｖ：バリン（Ｖａｌ）； Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
アミノ酸を、以下の命名法に従って、それらの１文字コードまたは３文字コードのいずれかによって表す： Ａ：アラニン（Ａｌａ）； Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）； Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）； Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）； Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）； Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）； Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）； Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）； Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）； Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）； Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）； Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）； Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）； Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）； Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）； Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）； Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）； Ｖ：バリン（Ｖａｌ）； Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
置換された残基を参照して「機能的に等価」とは、バリアントＰＡＰの置換された残基が、配列番号１に相同な配列を有する別のＰＡＰの配列中の残基と同一の機能的役割を有することを意味する。機能的に等価な残基は、配列アラインメントを使用する、例えば、Ｍｕｔａｌｉｎラインアラインメントソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ； １９８８， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６（２２）， ２５ １０８８１－１０８９０）を使用することによって、同定され得る。アラインメントの後、その機能的に等価な残基は、その考慮される異なる配列上の相同な位置にある。配列アラインメントおよび機能的に等価な残基の同定は、任意のＰＡＰとそれらの天然のバリアント（種間のものを含む）との間で決定され得る。
タンパク質を参照して「単離された」とは、同定され、その天然の環境の成分から、もしくは異種の反応混合物から、分離および／または回収されているこのような化合物を意味する。天然の環境または反応混合物の汚染成分は、タンパク質の機能に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるように、タンパク質の９５重量％超になるまで、および最も好ましくは、９９重量％超になるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して、還元または非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。組換え方法論によって製造される場合、本発明の単離されたタンパク質は、インサイチュで組換え細胞内にある本発明のタンパク質を含み得る。なぜならそのタンパク質の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。通常は、本発明の単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
「キット」とは、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達するための任意の送達システムをいう。反応アッセイの文脈において、このような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中の、ＰＡＰ酵素、保護されたｒＮＴＰモノマーなど）および／または補助物質（例えば、バッファー、アッセイを行うための書面による指示など）を一方の場所からもう一方の場所へと貯蔵、輸送、または送達することを可能にする、システムおよび／または化合物（例えば、希釈剤（dilutant）、界面活性剤、キャリアなど）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助物質を含む１またはこれより多くの封入物（例えば、ボックス）を含む。このような内容物は、その意図した受取人に一緒にまたは別個に送達され得る。例えば、第１の容器は、酵素を含み得る一方で、第２のまたはさらなる容器は、ｒＮＴＰモノマー、バッファー、イニシエーターを有する固体支持体などを含む。
「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」または「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、交換可能に使用され、配列番号１に由来し、１またはこれより多くの位置において改変または変更（すなわち、置換、挿入、および／または欠失）を含み、鋳型なしのポリメラーゼ活性および１またはこれより多くの可逆的にブロックされたヌクレオシド三リン酸前駆体を取り込む能力の両方を有するポリペプチドをいう。上記バリアントは、当該分野で周知の種々の技術によって得られ得る。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変化させるための技術の例としては、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発および合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発活性は、タンパク質の、または本発明の場合には、ポリメラーゼの配列において１または数個のアミノ酸を欠失、挿入または置換することにある。以下の用語法は、置換を指定するために使用される： Ｌ２３８Ａは、参照または野生型配列の位置２３８におけるアミノ酸残基（ロイシン， Ｌ）が、アラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の位置１３２におけるアミノ酸残基（アラニン， Ａ）が、以下のアミノ酸： バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）のうちの１つによって置換されていることを示す。上記置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および低分子アミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）の群内である。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、各々、ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、モノマー－対－モノマーの相互作用の通常のパターン（例えば、ワトソン－クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対合など）によって、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。このようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間連結は、天然に存在していてもよいし、そのアナログ、例えば、天然に存在するまたは天然に存在しないアナログであってもよい。天然に存在しないアナログとしては、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、標識（例えば、発蛍光団、またはハプテンなど）の結合を可能にする連結基を含む塩基が挙げられ得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、酵素による処理（例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションなど）を要求する場合は常に、当業者は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、それらの場合に、ヌクレオシド間連結、糖部分、または任意のもしくはいくつかの位置における塩基のある特定のアナログを含まないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、代表的には、それらが通常、「オリゴヌクレオチド」といわれる場合、数個のモノマーユニット（例えば、５～４０個のサイズ）から数千個のモノマーユニットの範囲に及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字配列（大文字または小文字）によって表される場合は常に、上記ヌクレオチドが左から右に５’→３’の順序にあり、別段示されなければまたは文脈から明らかでなければ、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、「Ｉ」がデオキシイノシンを示し、「Ｕ」がウリジンを示すことは、理解される。相当するリボヌクレオチドは、「ｒＡ」、「ｒＣ」、「ｒＧ」、および「ｒＴ」として指定され得る。別段注記されなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９）に開示されるものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４つの天然のヌクレオシド（例えば、ＤＮＡに関してはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはＲＮＡに関してはそれらのリボース対応物）を含む；しかし、それらはまた、非天然のヌクレオチドアナログ（例えば、改変された塩基、糖、またはヌクレオシド間連結を含む）を含み得る。酵素が、活性に関して特異的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件（例えば、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質のための適切な組成の選択が、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）および同様の参考文献のような約束事に由来するガイダンスとともに、十分に当業者の知識の範囲内であることは、当業者に明らかである。同様に、上記オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、１本鎖形態または２本鎖形態（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびそのそれぞれの相補体の二重鎖）のいずれかを指し得る。どちらの形態が、または両方の形態が、用語の使用法の文脈から意図されるのかどうかは、当業者に明らかである。
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型とともに二重鎖を形成すると、核酸合成の開始点として作用し、伸長した二重鎖が形成されるように、その３’末端からテンプレートに沿って伸長することができる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）で行われる。伸長プロセスにおいて付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常は、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４～４０ヌクレオチドの範囲にあるか、または１８～３６ヌクレオチドの範囲にある長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応（例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、または２またはこれより多くのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応）において使用される。特定の適用のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、以下の参考文献（これらは参考として援用される）によって証明されるように、当業者に周知である： Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編）， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００３）。
「配列同一性」とは、２つの配列（例えば、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列）間のマッチ（例えば、同一アミノ酸残基）の数（または割合、通常は、パーセンテージとして表される）をいう。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながら重複および同一性を最大化するように整列される場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、その２つの配列の長さに依存して、多くの数学的な全体のまたは局所的なアラインメントアルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、全体の長さにわたって配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０）を使用して整列される一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， ２００５））を使用して整列される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該分野の技術範囲内である種々の方法において（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／のようなインターネットウェブサイト上で入手可能な公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して）達成され得る。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定し得る。本明細書における目的のために、％ アミノ酸配列同一性値は、２つの配列の最適なグローバルアラインメントを、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用して作成するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成される値をいい、ここで全ての検索パラメーターは、デフォルト値に設定される（すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０およびエンドギャップ伸長＝０．５）。
「置換」とは、１つのアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基によって置き換えられることを意味する。好ましくは、用語「置換」とは、１個のアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基、希な天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、および天然に存在しないアミノ酸残基（しばしば、合成して作製される）（例えば、シクロヘキシル－アラニン）から選択される別のアミノ酸残基による置き換えをいう。好ましくは、用語「置換」とは、１個のアミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基から選択される別のアミノ酸残基による置き換えをいう。記号「＋」は、置換の組み合わせを示す。
アミノ酸は、以下の命名法に従って、それらの１文字コードまたは３文字コードによって本明細書で表される： Ａ：アラニン（Ａｌａ）； Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）； Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）； Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）； Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）； Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）； Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）； Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）； Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）； Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）； Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）； Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）； Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）； Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）； Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）； Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）； Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）； Ｖ：バリン（Ｖａｌ）； Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本文書において、以下の用語法は、置換を指定するために使用される： Ｌ２３８Ａは、親配列の位置２３８におけるアミノ酸残基（ロイシン， Ｌ）が、アラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の位置１３２におけるアミノ酸残基（アラニン， Ａ）が、以下のアミノ酸：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）のうちの１つによって置換されることを示す。置換は、保存的または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および低分子アミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）の群内である。
アミノ酸は、以下の命名法に従って、それらの１文字コードまたは３文字コードによって本明細書で表される： Ａ：アラニン（Ａｌａ）； Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）； Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）； Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）； Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）； Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）； Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）； Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）； Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）； Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）； Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）； Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）； Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）； Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）； Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）； Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）； Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）； Ｖ：バリン（Ｖａｌ）； Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本文書において、以下の用語法は、置換を指定するために使用される： Ｌ２３８Ａは、親配列の位置２３８におけるアミノ酸残基（ロイシン， Ｌ）が、アラニン（Ａ）に変更されていることを示す。Ａ１３２Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の位置１３２におけるアミノ酸残基（アラニン， Ａ）が、以下のアミノ酸：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）のうちの１つによって置換されることを示す。置換は、保存的または非保存的置換であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギンおよびスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システインおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および低分子アミノ酸（グリシン、アラニンおよびセリン）の群内である。
本開示は、示される特定の形態の範囲に限定されることは意図されないが、本明細書で記載されるバリエーションの代替、改変、および均等物を網羅することが意図される。さらに、本開示の範囲は、本開示に鑑みて、当業者に自明になり得る他のバリエーションを完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (22)
- 所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、前記方法は、
ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有するイニシエーターを提供する工程；ならびに
ｂ）前記ポリヌクレオチドが形成されるまで、（ｉ）伸長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有する前記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントと、３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸および鋳型なしのポリメラーゼとを、前記イニシエーターまたは伸長されたフラグメントを３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸の取り込みによって伸長して、３’－Ｏ－ブロック－伸長されたフラグメントを形成するように接触させる工程、および（ｉｉ）前記伸長されたフラグメントを脱ブロックして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長されたフラグメントを形成する工程のサイクルを反復する工程；
を包含し、
ここで前記鋳型なしのポリメラーゼは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、
方法。 - 前記イニシエーターは、５’末端によって支持体に結合される、請求項１に記載の方法。
- 前記支持体は、固体支持体である、請求項２に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドを前記イニシエーターから切断する工程をさらに包含する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、ポリ－２’－デオキシリボヌクレオチドであり、前記３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
- 前記３’－Ｏ－ブロック－２’－デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸または３’－Ｏ－アミノ－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸である、請求項５に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドであり、前記３’－Ｏ－ブロック－ヌクレオシド三リン酸は、３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号１に関しては位置３１０において、
配列番号２に関しては位置３１８において、
配列番号３に関しては位置３１８において、
配列番号８に関しては位置３１６において、
配列番号９に関しては位置３０９において、
配列番号１０に関しては位置３１６において、
配列番号１１に関しては位置２７２において、
配列番号１２に関しては位置３１６において、
配列番号１３に関しては位置３０７において、
配列番号１４に関しては位置３１３において、
配列番号１５に関しては位置３１２において、
配列番号１６に関しては位置３１７において、
配列番号１７に関しては位置３１６において、
配列番号１８に関しては位置３１６において、
配列番号１９に関しては位置３１２において、
配列番号２０に関しては位置３１０において、
配列番号２１に関しては位置３０９において、
配列番号２２に関しては位置３１７において、
配列番号２３に関しては位置３１４において、
配列番号２４に関しては位置３０７において、
配列番号２５に関しては位置３１５において、
配列番号２６に関しては位置３１６において、および
配列番号２７に関しては位置３１１において、
メチオニンの置換を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。 - 前記位置における前記メチオニンの前記置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、ＥまたはＴから選択される、請求項８に記載の方法。
- 前記配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択される前記アミノ酸配列は、
配列番号１に関しては位置２３４において、
配列番号２に関しては位置２４０において、
配列番号３に関しては位置２４０において、
配列番号９に関しては位置２３２において、
配列番号１０に関しては位置２４０において、
配列番号１１に関しては位置１９６において、
配列番号１２に関しては位置２４０において、
配列番号１３に関しては位置２２９において、
配列番号１４に関しては位置２３６において、
配列番号１５に関しては位置２３６において、
配列番号１６に関しては位置２４１において、
配列番号１７に関しては位置２３３において、
配列番号１８に関しては位置２４０において、
配列番号１９に関しては位置２４０において、
配列番号２０に関しては位置２３４において、
配列番号２１に関しては位置２３３において、
配列番号２２に関しては位置２３７において、
配列番号２３に関しては位置２３８において、
配列番号２４に関しては位置２３１において、
配列番号２５に関しては位置２３９において、
配列番号２６に関しては位置２４０において、および
配列番号２７に関しては位置２３５において
バリンの置換をさらに含む、請求項８または９に記載の方法。 - 前記位置での前記バリンの前記置換は、アラニンまたはグリシンである、請求項１０に記載の方法。
- 前記３’－ブロック－Ｏ－リボヌクレオシド三リン酸は、３’－アジドメチル－Ｏ－リボヌクレオシド三リン酸である、請求項７～１１のいずれかに記載の方法。
- 前記３’－アジドメチル－Ｏ－リボヌクレオシド三リン酸は、３’－アジドメチル－Ｏ－アデノシン三リン酸、３’－アジドメチル－Ｏ－グアノシン三リン酸、および３’－アジドメチル－Ｏ－シチジン三リン酸ならびに３’－アジドメチル－Ｏ－ウリジン三リン酸からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
- 所定の配列を有するポリリボヌクレオチドの鋳型なしの合成を行うためのキットであって、前記キットは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、固体支持体に結合されたイニシエーター、および３’－Ｏ－ブロック－リボヌクレオシド三リン酸モノマーを含む、キット。
- 前記３’－Ｏ－保護－リボヌクレオシド三リン酸モノマーは、３’－Ｏ－アジドメチル－リボアデノシン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボグアノシン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボシチジン三リン酸、３’－Ｏ－アジドメチル－リボチミジン三リン酸および３’－Ｏ－アミノ－リボウリジン三リン酸のうちの１またはこれより多くを含む、請求項１４に記載のキット。
- 前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、かつＭ３１０において置換を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％同一であり、かつＭ３１８において置換を有するアミノ酸配列を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントを含み；ここで前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）前記３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに取り込むことができる、請求項１４または１５に記載のキット。
- ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）バリアントであって、配列番号１、２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号１に関しては位置３１０において、
配列番号２に関しては位置３１８において、
配列番号３に関しては位置３１８において、
配列番号８に関しては位置３１６において、
配列番号９に関しては位置３０９において、
配列番号１０に関しては位置３１６において、
配列番号１１に関しては位置２７２において、
配列番号１２に関しては位置３１６において、
配列番号１３に関しては位置３０７において、
配列番号１４に関しては位置３１３において、
配列番号１５に関しては位置３１２において、
配列番号１６に関しては位置３１７において、
配列番号１７に関しては位置３１６において、
配列番号１８に関しては位置３１６において、
配列番号１９に関しては位置３１２において、
配列番号２０に関しては位置３１０において、
配列番号２１に関しては位置３０９において、
配列番号２２に関しては位置３１７において、
配列番号２３に関しては位置３１４において、
配列番号２４に関しては位置３０７において、
配列番号２５に関しては位置３１５において、
配列番号２６に関しては位置３１６において、および
配列番号２７に関しては位置３１１において、
メチオニンの置換を有し、
ここで前記ＰＡＰバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる、ＰＡＰバリアント。 - 前記位置における前記メチオニンの前記置換は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、ＥまたはＴから選択される、請求項１７に記載のＰＡＰバリアント。
- 配列番号１に関しては位置２３４において、
配列番号２に関しては位置２４０において、
配列番号３に関しては位置２４０において、
配列番号９に関しては位置２３２において、
配列番号１０に関しては位置２４０において、
配列番号１１に関しては位置１９６において、
配列番号１２に関しては位置２４０において、
配列番号１３に関しては位置２２９において、
配列番号１４に関しては位置２３６において、
配列番号１５に関しては位置２３６において、
配列番号１６に関しては位置２４１において、
配列番号１７に関しては位置２３３において、
配列番号１８に関しては位置２４０において、
配列番号１９に関しては位置２４０において、
配列番号２０に関しては位置２３４において、
配列番号２１に関しては位置２３３において、
配列番号２２に関しては位置２３７において、
配列番号２３に関しては位置２３８において、
配列番号２４に関しては位置２３１において、
配列番号２５に関しては位置２３９において、
配列番号２６に関しては位置２４０において、および
配列番号２７に関しては位置２３５において
バリンの置換をさらに含む、請求項１７または１８に記載のＰＡＰバリアント。 - 前記位置でのバリンの前記置換は、アラニンまたはグリシンである、請求項１９に記載のＰＡＰバリアント。
- ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）バリアントであって、前記ＰＵＰバリアントは、配列番号４、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６または４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列であって、
配列番号４に関しては位置２１２において、
配列番号２８に関しては位置１８９において、
配列番号２９に関しては位置１８４において、
配列番号３０に関しては位置２２７において、
配列番号３１に関しては位置４７８において、
配列番号３２に関しては位置１９２において、
配列番号３３に関しては位置１８６において、
配列番号３４に関しては位置２４３において、
配列番号３５に関しては位置１９６において、
配列番号３６に関しては位置２５３において、
配列番号３７に関しては位置２８４において、
配列番号３８に関しては位置１８２において、
配列番号３９に関しては位置１８７において、
配列番号４０に関しては位置２０３において、
配列番号４１に関しては位置２２４において、
配列番号４２に関しては位置２０４において、
配列番号４３に関しては位置３３７において、
配列番号４４に関しては位置２９６において、
配列番号４５に関しては位置２９１において、
配列番号４６に関しては位置２１８において、および
配列番号４７に関しては位置３６６において、
チロシンの置換を有するアミノ酸配列を含み、
ここで前記ＰＵＰバリアントは、（ａ）鋳型なしでリボ核酸フラグメントを合成することができ、（ｂ）３’－Ｏ－アジドメチル－リボヌクレオシド三リン酸をリボ核酸フラグメントに、または３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシリボヌクレオシド三リン酸をデオキシリボ核酸フラグメントに取り込むことができる、ＰＵＰバリアント。 - 前記位置における前記チロシンの前記置換は、アラニンまたはグリシンである、請求項２１に記載のＰＵＰバリアント。
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