[go: up one dir, main page]

JP2022532174A - 修飾多能性細胞 - Google Patents

修飾多能性細胞 Download PDF

Info

Publication number
JP2022532174A
JP2022532174A JP2021566507A JP2021566507A JP2022532174A JP 2022532174 A JP2022532174 A JP 2022532174A JP 2021566507 A JP2021566507 A JP 2021566507A JP 2021566507 A JP2021566507 A JP 2021566507A JP 2022532174 A JP2022532174 A JP 2022532174A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
hla
protein
modified pluripotent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021566507A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020231882A5 (ja
Inventor
シュレプファー ソニヤ
デュース トバイアス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California San Diego UCSD filed Critical University of California San Diego UCSD
Publication of JP2022532174A publication Critical patent/JP2022532174A/ja
Publication of JPWO2020231882A5 publication Critical patent/JPWO2020231882A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本発明は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、及び低免疫多能性細胞を含み、ＡＢＯ血液群Ｏ型リーサス因子陰性であり、且つ、血液型抗原不適合に起因する拒絶反応を回避する多能性細胞を初めて開示する。本発明はさらに、特定の組織及び臓器を作製又は再生するための普遍的に許容される「市販の」多能性細胞及びその誘導体も提供する。

Description

Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、２０１９年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４６，３９９号明細書、及び２０１９年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／８５５，４９９号明細書に対する優先権を主張し、これらの各々は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
ＩＩ．発明の分野
本発明は、再生細胞療法に関する。一部の実施形態では、再生細胞療法は、細胞株を、それを必要とする患者に移植することを含む。一部の実施形態では、細胞株は、Ｏ Ｒｈ－低免疫原性多能性細胞を含む。一部の実施形態では、再生細胞療法は、細胞移植片レシピエントの免疫系が、同種異系材料を拒絶する傾向を低減する。一部の実施形態では、再生細胞療法は、傷害を受けた臓器及び組織の治療に使用される。一部の実施形態では、再生細胞療法は、心筋梗塞後の損傷組織を回復させるために使用される。
ＩＩＩ．発明の背景
再生細胞療法は、傷害を受けた臓器及び組織を再生させるための重要且つ有望な治療法である。移植用の臓器が入手困難であること、並びにそれに伴う長い待ち時間のために、容易に入手できる細胞株を患者に移植することによる組織再生の可能性は、当然のことながら魅力的である。再生細胞療法は、動物モデル（例えば、心筋梗塞後の）への移植後に、損傷組織を再生するのに見込みのある初期結果を示している。しかし、移植片レシピエントの免疫系が、同種異系材料を拒絶する傾向は、治療薬の潜在的有効性を大幅に低下させ、そうした治療法に関連する、起こり得るプラスの効果を低減する。
自家人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、理論的には、患者特異的細胞ベースの臓器修復戦略のための無制限の細胞供給源となる。しかし、それらの作製には、技術的及び製造上の課題があり、工程は時間がかかるため、概念上、あらゆる急性治療法が妨げられる。同種異系ｉＰＳＣベースの治療法又は胚性幹細胞ベースの治療法は、製造の観点から、より容易であり、良く分別され、標準化された、高品質細胞産物の作製を可能にする。多能性幹細胞は、３つの胚葉の全ての細胞型に分化することができるため、幹細胞療法の潜在的用途は多岐にわたる。分化し続けて、移植部位の臓器環境中で成熟する前駆細胞を移植することにより、エクスビボ又はインビボで分化を実施することができる。エクスビボ分化によって、研究者又は臨床医は、処置を綿密にモニターして、移植の前に適切な細胞集団が産生されることを確実にすることができる。しかし、同種異系起源であるために、そうした細胞産物は、拒絶反応を受ける可能性がある。
当技術分野では、異常細胞又は欠損細胞を再生若しくは置換するのに用いられる細胞を産生することができる幹細胞が求められている。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、それらが急速に増殖し、多くの潜在的細胞型に分化するために、使用され得る。ＰＳＣのファミリーは、様々な技術により作製され、異なる免疫原的特徴を有するいくつかのメンバーを含む。ＰＳＣ由来の操作細胞又は組織との患者の適合性によって、免疫拒絶反応のリスク及び免疫抑制の必要性が決定される。
胚盤胞の内部細胞塊から単離された胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、レシピエントとのミスマッチである組織適合性抗原を提示する。この免疫学的障壁は、ＥＳＣのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型バンクでは解決することができない。というのは、ＨＬＡ適合ＰＳＣ移植片であっても、マイナー抗原として機能する非ＨＬＡ分子中のミスマッチのために、拒絶反応を受けるからである。これはまた、同種異系人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）についても当てはまる。
拒絶反応の問題を回避するために、患者特異的多能性幹細胞を作製するための様々な技術が開発されている。これらは、除核卵母細胞への体細胞核の移植（体細胞核移植（ＳＣＮＴ）幹細胞）、体細胞とＥＳＣの融合（ハイブリッド細胞）、及び特定の転写因子を用いた体細胞のリプログラミング（人工ＰＳＣ又はｉＰＳＣ）を含む。しかしながら、ＳＣＮＴ幹細胞及びｉＰＳＣは、染色体同一性にもかかわらず、それぞれ核又は細胞ドナーと免疫不適合性を有し得る。ＳＣＮＴ幹細胞は、卵母細胞から伝達されたミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を担持する。ｍｔＤＮＡコード化タンパク質は、関連マイナー抗原として作用して、拒絶反応をトリガーし得る。ＤＮＡ及びｍｔＤＮＡ突然変異並びにｉＰＳＣのリプログラミング及び培養増殖に関連する遺伝的不安定性も免疫拒絶反応に関連するマイナー抗原を生成し得る。このハードルが、ＳＣＮＴ幹細胞又はｉＰＳＣを用いた適合性患者特異的組織の大規模操作の成功の可能性を低くしている。
さらに近年では、宿主同種異系免疫系による拒絶反応を回避する低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞の出現が、同種異系移植に関して大きな成功を収めている。国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレットを参照されたい。これらの細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ発現を低減することにより免疫応答の開始を回避すると共に、ＣＤ４７の産生を増大させて食作用性自然免疫監視を抑制するために、操作される。本明細書に記載される発明は、この技術を基礎として、ＨＩＰ細胞拒絶反応をさらに低減する。
ＩＶ．発明の概要
これまで認識されていなかった移植細胞拒絶反応の原因は、血液型抗原と関係していた。血液産物は、ヒトの身体中の全ての赤血球の表面上の抗原の存在又は非存在によって、異なる型に分類することができる（ＡＢＯ血液型）。Ａ、Ｂ、ＡＢ、及びＡ１抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列により決定される。血液型抗原群の遺伝子は、抗原タンパク質を作製するための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内で多様な機能を果たす。こうしたタンパク質機能としては、他のタンパク質及び分子の細胞内及び細胞外への輸送、細胞構造の維持、他の細胞及び分子への接着、並びに化学反応への参加が挙げられる。
リーサス因子（Ｒｈ）血液型は、ＡＢＯ血液型系に次ぐ、第２の最も重要な血液型系である。Ｒｈ血液型系は、４９の規定血液型抗原から構成され、そのうち、５つの抗原、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、及びｅが、最も重要である。個体のＲｈ（Ｄ）ステータスは、通常、ＡＢＯ型の後に陽性又は陰性の接尾辞を付けて表される。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈ陽性」、及び「Ｒｈ陰性」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原だけを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血性輸血反応に関与する可能性があり、Ｒｈ（Ｄ）及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクをもたらす。ＡＢＯ抗体は、全てのヒトにおいて若年期に発生する。しかし、Ｒｈ－ヒトのリーサス抗体は、人が感作された場合にのみ発生する。これは、ｒｈ＋新生児の出産によるか、又はＲｈ＋血液の輸血を受けることによって起こる。
本発明は、移植及び／又は分化に好適な多能性（ＰＳＣＯ－）細胞のＡＢＯ血液型Ｏ及び／又はリーサス因子陰性（Ｏ－）集団を提供する。ＰＳＣＯ－細胞としては、人工ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣＯ－）、胚性ＥＳＣ（ＥＳＣＯ－）、及びこれらの細胞から分化した細胞、例えば、Ｏ－内皮細胞、Ｏ－心筋細胞、Ｏ－肝細胞、Ｏ－ドーパミン作動性ニューロン、Ｏ－膵島細胞、Ｏ－網膜色素内皮細胞、並びに移植及び医療に用いられる他のＯ－細胞型が挙げられる。これらは、Ｏ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及び他の改変細胞集団を含み得る。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞ではない。本発明は、さらに、特定の組織及び臓器を作製又は再生するための、普遍的に許容される「市販の（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）」ＥＣＯ－及びＰＳＣＯ－並びにその誘導体も提供する。
本発明の別の態様は、移植用のＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－及び他のＯ－細胞の集団を作製する方法を提供する。本発明はまた、多能性又は分化細胞の集団の移植から利益を受ける疾患、障害、及び状態を治療する方法も提供する。
本発明の一部の実施形態では、ＡＢＯ血液群Ｏ型は、ＡＢＯ血液群タンパク質発現の低減によって得られる。他の態様では、ＡＢＯ血液群は、内因的にＯ型である。本発明の一部の態様では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＡＢＯ遺伝子のヒトエキソン７の破壊によって得られるＡＢＯ血液群Ｏ型を有する。一部の実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエキソン７の両対立遺伝子は破壊される。一部の実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエキソン７の両対立遺伝子の破壊は、両対立遺伝子を破壊する、クラスター化され、規則的に間隔をあけた短い回文構造の反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応によって達成される。
他の態様では、ＡＢＯ血液群Ｏ型は、細胞の表面上のＡＢＯ遺伝子産物の酵素修飾によって得られる。好ましい態様では、酵素修飾により、ＡＢＯ遺伝子産物から炭水化物を除去する。別の好ましい態様では、酵素修飾により、ＡＢＯ Ａ１抗原、Ａ２抗原、又はＢ抗原から炭水化物を除去する。
本発明の一部の実施形態では、Ｒｈ血液群は、内因的にＲｈ－である。別の態様では、Ｒｈ－血液群は、Ｒｈタンパク質発現の低減又は排除によって得られる。別の態様では、Ｒｈ－型は、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、若しくは／及び、又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１をコードする遺伝子を破壊することによって得られる。一部の実施形態では、破壊は、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、若しくは／及び、又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１をコードする遺伝子の両対立遺伝子を破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応によって達成される。
本発明の一部の実施形態では、本発明のＯ－細胞（例えば、ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－及びそれらに由来する細胞）は、哺乳動物由来、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモット由来のものである。
具体的な実施形態では、本発明は、宿主同種異系免疫系による拒絶反応を回避すると共に、血液抗原型拒絶反応を回避する低免疫多能性ＡＢＯ血液型Ｏリーサス因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞を提供する。一部の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ発現を低減若しくは排除し、マクロファージ食作用に対する多能性細胞の感受性を低減する内在性タンパク質の発現を高めると共に、普遍的な血液群ＯＲｈ－（「Ｏ」）血液型を含むように、操作される。普遍的血液型は、ＡＢＯ血液群Ａ及びＢ抗原並びにＲｈ因子発現を排除することにより、又はＯ細胞株で開始することによって達成され得る。これらの新たなＨＩＰＯ細胞は、損傷した抗原提示能力、自然免疫クリアランスからの保護を有し、血液群拒絶反応を欠いているために、宿主免疫拒絶反応を回避する。
特定の実施形態では、本発明のＨＩＰＯ－細胞は、以下：非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能；非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能；ＮＫ細胞殺傷に対する感受性を低減する非修飾多能性細胞と比較して、ＣＤ４７の発現増大；ＡＢＯ血液群Ｏ型（Ｏ）；並びにリーサス因子（Ｒｈ）血液型陰性（－）を含み；ここで、ヒト低免疫原性多能性Ｏ－（ＨＩＰＯ－）細胞は、被験者とＡＢＯ血液群又はＲｈ因子不適合であり、それ以外は類似した低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞と比較して、被験者に移植されたとき、拒絶反応に対する感受性が低い。
本発明の特定の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、β－２ミクログロブリンタンパク質発現の低減によって低減されたＨＬＡ－Ｉ機能を有する。別の態様では、β－２ミクログロブリンタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。一部の実施形態では、ＭＢ２遺伝子の両対立遺伝子が破壊される。一部の実施形態では、この破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応によって起こる。一部の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－Ａタンパク質発現の低減によって低減されたＨＬＡ－Ｉ機能を有する。別の態様では、ＨＬＡ－Ａタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。別の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ機能は、ＨＬＡ－Ｂタンパク質発現の低減によって低減される。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。他の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－Ｃタンパク質発現の低減によって低減されたＨＬＡ－Ｉ機能を有する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。一部の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－Ｉ機能を含まない。
本発明の特定の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質発現の低減によって低減されたＨＬＡ－Ｉ機能を有する。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。本発明の一態様では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質発現の低減によって低減されたＨＬＡ－Ｉ機能を有する。別の態様では、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。別の態様では、ＨＬＡ－ＩＩ機能は、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質発現の低減によって低減される。別の態様では、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる。別の態様では、ＨＬＡ－ＩＩ機能は、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質発現の低減によって低減される。別の態様では、ＨＬＡ－ＤＱをコードする遺伝子がノックアウトされる。別の態様では、低免疫原性多能性細胞は、ＨＬＡ－ＩＩ機能を含まない。
一実施形態では、本発明のＨＩＰＯ－細胞は、マクロファージ食作用に対する多能性細胞の感受性を低減するタンパク質の増大した発現を有するように操作される。一部の実施形態では、増大した発現は、内在性遺伝子座に対する修飾から得られる。一部の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＮＫ細胞殺傷に対し低下した感受性を有し、これは、ＣＤ４７タンパク質の増大した発現によって達成される。別の態様では、増大したＣＤ４７タンパク質発現は、内在性ＣＤ４７遺伝子座への修飾によって得られる。別の態様では、増大したＣＤ４７タンパク質発現は、ＣＤ４７トランスジーンの付加によって得られる。一部の実施形態では、増大したＣＤ４７タンパク質発現は、ヒトＣＤ４７遺伝子の少なくとも１つのコピーを、プロモータの制御下で、細胞に導入することによって達成される。好ましい態様では、プロモータは、構成性プロモータである。
一部の実施形態では、本発明のＨＩＰＯ－細胞は、低免疫原性多能性細胞を死滅させるトリガーにより活性化される自殺遺伝子をさらに含む。別の態様では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、トリガーは、ガンシクロビルである。別の態様では、自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である。別の態様では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質であり、トリガーは、タンパク質二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である。別のより好ましい態様では、ＣＩＤは、ＡＰ１９０３である。
本発明の一態様は、本明細書に記載されるＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及び／又はＨＩＰＯ－細胞に由来する細胞を提供し、ここで、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。好ましい態様では、ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
本発明は、本発明の細胞又はその誘導体を伴う移植から利益を受ける疾患、障害、及び状態を治療する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されるＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、ＨＩＰＯ－及び／又は他のＡＢＯ－細胞を投与することを含む。一態様では、ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、ＨＩＰＯ－及び／又は他のＡＢＯ－細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患は、Ｉ型糖尿病、心臓病、神経系疾患、癌、眼病、及び血管病からなる群から選択される。本発明の一部の実施形態では、この方法は、ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、ＨＩＰＯ－細胞、並びにＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞由来の細胞をはじめとする本発明のＡＢＯ－細胞を、哺乳類の被験者に移植することを含む。一部の実施形態では、被験者は、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモットである。
本発明の別の態様は、Ｏ－ｉＰＳＣから低免疫原性多能性ＡＢＯ群ＯＲｈ因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞を作製する方法を提供し、以下：（ａ）非修飾多能性細胞と比較して、主要組織適合性抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能を排除するか、又はＨＬＡ－Ｉ機能を低減するステップ；（ｂ）非修飾多能性細胞と比較して、主要組織適合性抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能を排除するか、又はＨＬＡ－Ｉ機能を低減するステップ；（ｃ）非修飾ｉＰＳＣ中のＣＤ４７の発現と比較して、ＣＤ４７の発現を増大するステップを含む。一部の実施形態では、出発ｉＰＳＣは、Ｏ－ではなく、従って本方法は、さらに以下：（ｄ）いずれかのＡＢＯ血液群抗原を排除して、ＡＢＯ血液型Ｏをもたらすステップ；及び（ｅ）いずれかのリーサス因子（Ｒｈ）血液群抗原を排除して、Ｒｈ型陰性（－）をもたらすステップを含む。
本発明はまた、本明細書に記載される人工ＡＢＯ血液群Ｏ－Ｒｈ因子（－）多能性（例えば、ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－）細胞から誘導又は分化される１つ又は複数の細胞も提供する。これらの細胞は、ＡＢＯ血液群Ｏ型（Ｏ）及びリーサス因子（Ｒｈ）血液型陰性（－）を含み、被験者に移植されたとき、ＡＢＯ血液群であるか又は被験者とＲｈ因子不適合である細胞と比較して、拒絶反応に対して低感受性にする。
本発明はまた、低免疫原性細胞の投与を目的とする被験者のスクリーニング及び／又は層別化も実施し、ここで、低免疫原性細胞のＡＢＯ血液群型と被験者のＡＢＯ血液群型をマッチングした後、細胞の投与を行う。例えば、本発明は、以下：ＡＢＯ血液群Ａ若しくはＡＢ型であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ａ型低免疫原性細胞の投与；ＡＢＯ血液群Ｂ若しくはＡＢ型であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｂ型低免疫原性細胞の投与；ＡＢＯ血液群ＡＢ型であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群ＡＢ型低免疫原性細胞の投与；又は、ＡＢＯ血液群Ａ、Ｂ、ＡＢ、若しくはＯ型であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｏ型低免疫原性細胞の投与を実施し得る。
本発明の別の態様は、低免疫原性細胞の投与を目的とする被験者のスクリーニング及び／又は層別化を提供し、ここで、低免疫原性細胞のＡＢＯ血液群型及びＲｈ血液型と被験者のＡＢＯ血液群型及びＲｈ血液型をマッチングした後、細胞の投与を行う。例えば、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ又はＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ａ型、Ｒｈ陽性（＋）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ｂ又はＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｂ型、Ｒｈ陽性（＋）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群ＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群ＡＢ型、Ｒｈ陽性（＋）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯ型、且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｏ型、Ｒｈ陽性（＋）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ又はＡＢ型且つＲｈ陰性（－）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ａ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ｂ又はＡＢ型且つＲｈ陰性（－）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｂ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群ＡＢ型且つＲｈ陰性（－）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群ＡＢ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯ型で、且つＲｈ陰性（－）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｏ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。
本発明の別の態様は、低免疫原性細胞の投与を目的とする被験者のスクリーニング及び／又は層別化を提供し、ここで、低免疫原性細胞のＡＢＯ血液群型と被験者のＡＢＯ血液群型と適合するが、低免疫原性細胞のＲｈ血液型と被験者のＲｈ血液型は適合しない。この態様では、細胞が、Ｒｈ血液型陰性（－）である場合に限り、投与され、細胞は、Ｒｈ血液型陽性（＋）である被験者に投与される。例えば、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ又はＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ａ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ｂ又はＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｂ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群ＡＢ型且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群ＡＢ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。別の例では、本発明は、ＡＢＯ血液群Ａ、Ｂ、又はＡＢ型、且つＲｈ陽性（＋）であると判定された被験者に対するＡＢＯ血液群Ｏ型、Ｒｈ陰性（－）低免疫原性細胞の投与を提供し得る。
図１Ａは、低免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ内皮細胞が生存しなかったアカゲザル（Ｍａｃａｑｕｅ Ｒｈｅｓｕｓ）からの血液を用いた免疫アッセイにおいて、適応免疫細胞及び自然免疫細胞が活性化されなかったことを示す。低免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ内皮細胞は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、又はＮＫ細胞により拒絶された。図１Ｂは、低免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ内皮細胞が抗体産生をトリガーせず、マクロファージにより拒絶されなかったことを示す。細胞は、サルから排除されたため、これらの結果は、細胞死に関する別の機構を示唆した。 図２Ａは、非修飾ヒトｉＰＳＣ由来内皮細胞を拒絶したアカゲザル（Ｍａｃａｑｕｅ Ｒｈｅｓｕｓ）からの血液を用いた免疫アッセイにおいて、適応免疫細胞（Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及びＢ細胞）が活性化されたことを示す。図２Ｂは、ＨＬＡ－Ｉ欠損／ＨＬＡ－ＩＩ欠損ヒトｉＰＳＣ由来内皮細胞を拒絶したアカゲザル（Ｍａｃａｑｕｅ Ｒｈｅｓｕｓ）からの血液を用いた免疫アッセイにおいて、自然免疫細胞（ＮＫ細胞及びマクロファージ）が活性化されたことを示す。図２Ｃは、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ）血液型Ｂ血清が、血液型Ａの野生型（ｗｔ）誘導内皮細胞（ｉＥＣ）の補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を引き起こすことを示す。図２Ｄは、血液型ＯのｉＥＣが、影響を受けなかったことを示す。図２Ｅは、胚性幹細胞由来のＥＣが、ｉＰＳＣ由来ｉＥＣと同じＡＢＯ血液型依存性ＣＤＣを被ることを示す。 ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ低免疫原性内皮細胞をアカゲザル血清と一緒にインキュベートすることにより、ＡＢＯ血液型不適合性血清による標的化細胞殺傷が確認された。ヒト低免疫原性内皮細胞（血液型Ａ）をアカゲザル血清（血液型Ｂ）と一緒にインキュベートすると、細胞は直ちに殺傷される。ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体のいずれかの欠失によって、ＡＢＯ－抗体がＩｇＭ型由来であることが証明された。 ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ細胞は、異種バリアを介して移植したとき、他の既存抗体によって拒絶されなかった。ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ ｉＰＳＣ由来内皮細胞（血液型Ａ）は、ＡＢＯ－不適合アカゲザル血清（血液型Ｂ）と一緒にインキュベートされると、殺傷された。しかし、血液型ＡＢのアカゲザルからの血清を使用すると、ヒト細胞は生存した。 図５Ａは、ヒト低免疫原性ｉＰＳＣ由来心筋細胞（血液型Ａ）が、同種異系ヒト血清血液型Ａ及びＡＢと一緒にインキュベートされると、生存することを示す。しかし、Ａに対して既存抗体を含有する血清（血液型Ｏ及びＢ）は、細胞を直ちに殺傷した。図５Ｂは、成熟心筋細胞（血液型Ａ）が、ＡＢＯ適合同種異系ヒト血清（血液型Ａ及びＡＢ）と一緒にインキュベートされると生存するが、Ａに対する既存抗体を含む血清（血液型Ｏ及びＢ）と一緒にインキュベートされると殺傷されることを示す。 図６は、血液型Ａヒト肝細胞が、ＡＢＯ適合血清（血液型Ａ及びＡＢ）と一緒にインキュベートされると生存するが、ＡＢＯ不適合血清（血液型Ｏ及びＢ）と一緒にインキュベートされると殺傷されることを示す。同様に、血液型ＡＢヒト肝細胞は、ＡＢＯ適合血清（血液型ＡＢ）と一緒にインキュベートされると生存するが、ＡＢＯ不適合血清（血液型Ａ、Ｂ、及びＯ）と一緒にインキュベートされると殺傷されることを示す。 図７Ａは、血清をＲｈ因子に事前に感作させていない場合、内皮細胞（血液型Ａ Ｒｈ＋又はＲｈ－）が、Ｒｈ＋又はＲｈ－のいずれかのＡＢＯ適合血清（血液型Ａ）と一緒にインキュベートされると、生存することができることを示す。図７Ｂは、血清がＲｈ因子への事前の感作によって抗Ｒｈ抗体を含有する場合、Ｒｈ－であるＡＢＯ適合性血清（血液型ＡＢ）と一緒に内皮細胞（血液型Ａ又はＢ Ｒｈ＋）をインキュベートすると、それらの内皮細胞は殺傷されることを示す。内皮細胞（血液型Ａ Ｒｈ－）は、抗Ｒｈ抗体を含有する同じ血液型ＡＢ血清と一緒にインキュベートされた場合、ＥＣ細胞がＲｈ抗原を発現しないため殺傷されない。低免疫原性内皮細胞（Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ）（血液型Ａ Ｒｈ＋）も、Ｒｈ－で且つＲｈ因子に事前に感作されたＡＢＯ－適合性血清（血液型ＡＢ）と一緒にインキュベートされると、殺傷される。図７Ｃは、血液型Ｏ Ｒｈ＋である内皮細胞が、Ｒｈ因子に事前に感作されたＯ Ｒｈ－血清を用いると、殺傷されることを示す。図７Ｄは、血液型Ａ Ｒｈ＋のＨ９由来ＥＣが、Ｒｈ抗体を含有するＡＢＯ－適合性血清と一緒にインキュベートされると、ＣＤＣ殺傷を被ったことを示す。図７Ｅは、Ｒｈ抗体を含有する血清と一緒にインキュベートされたＨＥＫ２９３細胞が、殺傷を被らなかったことを示す。
ＶＩ．本発明の詳細な説明
本発明は、あらゆるＡＢＯ血液型、例えば、Ｏ型のリーサス因子陰性多能性細胞を提供し、これらの細胞は、本明細書に概説するように、１つ若しくは複数の遺伝子又は酵素操作によって、宿主免疫応答を回避又は最小限にする。これらの細胞は、免疫応答をトリガーする主要血液群及び免疫抗原が欠如しており、さらに、拒絶反応、食作用、又は殺傷を回避するように操作することもできる。これによって、特殊な組織及び臓器を作製するための「市販の」細胞産物の誘導が可能になる。ヒト患者におけるヒト同種異系ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞及びその誘導体の使用は、重要な利益をもたらし、そうしたものとして、同種異系移植において一般的に見られる長期補助免疫抑制療法及び薬剤の使用を必要とすることなく、細胞移植片拒絶反応を回避できることがある。また、これは、各患者に対して個々の処置を必要としない細胞療法を使用することができるため、かなりの費用節約を可能にする。近年、自家細胞供給源から作製された細胞産物が、僅かな、或いはたった１つの抗原突然変異によって免疫拒絶反応を被り得ることがわかっている。従って、自家細胞産物は、本質的に非免疫原性ではない。また、個別患者の細胞操作及び品質管理も膨大な労力及び費用を要するため、自家細胞は、急性治療の選択肢としては稀にしか利用することができない。同種異系細胞産物は、免疫のハードルを克服することができて初めて、より大きな患者集団に使用することができるようになるだろう。本発明のＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、並びにこうした細胞由来の細胞は、普遍的に許容される誘導体を作製するための、普遍的細胞供給源を提供するであろう。
Ｏ血液型に加えて、本発明は、一部に、妊娠中の女性に存在する母子間免疫寛容も利用する。胎児のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、父性遺伝されて、胎児は、主要ＨＬＡ不適合抗原を発現するが、母性免疫系は、胎児を同種異系実体として認識せず、例えば、免疫反応の「宿主対移植片」に見られるような免疫応答を開始しない。母子間免疫寛容は、主として、母体・胎児界面における栄養膜合胞体層細胞により媒介される。栄養膜合胞体層細胞は、主要組織適合性複合体Ｉ及びＩＩ（ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ）のタンパク質をほとんど又は全く示さず、さらには、食作用自然免疫監視及びＨＬＡ－欠失細胞の排除を抑制する「ドントイートミー（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」タンパク質として知られるＣＤ４７の発現増大を提示する。驚くことに、妊娠中に胎児の拒絶反応を阻止する同じ寛容原性機構も、本発明のＨＩＰＯ－細胞が、拒絶反応を免れて、同種異系移植後にこれらの細胞の長期生存及び生着を促進することを可能にする。
母子間免疫寛容は、僅か３つの遺伝子修飾（非修飾ｉＰＳＣ、例えば、ｈｉＰＳＣと比較して）：２つの活性低減（本明細書にさらに詳しく説明される「ノックアウト」）と１つの活性増大（本明細書に説明される「ノックイン」）によって導入することができる。概して、他に、ｉＰＳＣの免疫原性を抑制しようとした者もあるが、部分的にしか成功していない：Ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４：１２１－１３０（２０１４）及びＧｏｒｎａｌｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０）、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット及び米国仮特許出願第６２／６９８，９４１号明細書、同第６２／６９８，９６５号明細書、同第６２／６９８，９７３号明細書、同第６２／６９８，９７８号明細書、同第６２／６９８，９８１号明細書、及び同第６２／６９８，９８４号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
自家人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、患者特異的な、自家細胞ベースの臓器修復戦略のための無制限の細胞供給源を構成する。しかしながら、前述したように、自家ｉＰＳＣの作製とそれに続く組織細胞へのその分化は、技術及び製造上の課題を呈し、急性治療のモダリティでそれらを使用するまでには長いプロセスを要する。これらの欠点は、同種異系起源の既製のすぐに使える細胞又は組織生成物を利用可能にすることによって、はじめて克服することができる。
同種異系起源の既製のすぐに使える細胞又は組織生成物のためのスターター細胞株は、「普遍的」でなければならない。本発明のＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞は、維持、所望の細胞及び組織型への分化、並びに最終的に、それを必要とする患者へのその誘導体の移植のための、容易に入手可能な非免疫原性多能性細胞を初めて提供する。
定義
「多能性細胞」という用語は、未分化状態を維持しながら、自己再生及び増殖することができ、しかも、適切な条件下で、特異性細胞型に分化するように誘導され得る細胞を指す。用語「多能性細胞」は、本明細書で使用される場合、胚性幹細胞及び他のタイプの幹細胞を包含し、そうしたものとして、胎児、羊膜、又は成体幹細胞が挙げられる。例示的なヒト幹細胞株として、Ｈ９ヒト胚性幹細胞株がある。別の例示的な幹細胞株としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ及びＨｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＨＵＥＳコレクションから入手可能にされたものがある（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載の通り）。
本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃の内膜、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、尿路性器組織など）又は外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系組織）のいずれかに分化する可能性を有する。用語「多能性幹細胞」は、本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」、又は「ｉＰＳＣ」、即ち、非多能性細胞から誘導された多能性幹細胞のタイプも包含する。親細胞の例として、様々な手段によって、多能性、未分化表現型を誘導するようにリプログラミングされた体細胞がある。こうした「ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することにより、又は特定のタンパク質の外部適用によって作製することができる。ｉＰＳ細胞の誘導方法は、当技術分野で公知であり、以下にさらに詳しく説明する。（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）を参照されたい；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製については以下に概説する。本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞であり、「ｍｉＰＳＣ」は、マウス人工多能性幹細胞である。
多能性幹細胞のいくつかの特徴により、それらは他の細胞から識別される。例えば、適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の全てから、細胞系列に関連する特徴を集合的に示す細胞型への分化を経ることができる子孫を生み出す能力は、多能性幹細胞の特徴である。また、分子マーカの特定の組合せの発現又は非発現も、多能性幹細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、非限定的リスト：ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、及びＮａｎｏｇからのマーカの少なくともいくつか、また一部の実施形態では、その全部を発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態もまた多能性幹細胞の特徴である。細胞は、内皮前駆細胞及び／又は肝細胞にリプログラミングされるために分化多能性を経る必要はない。
本明細書で使用される場合、「複能性」又は「複能性細胞」は、限定的な数の他の特定の細胞型を生み出すことができる細胞型を指す。例えば、人工複能性細胞は、内皮細胞を形成することができる。加えて、複能性血液幹細胞は、リンパ球、単球、好中球などをはじめとする数種の血液細胞にそれ自体で分化することができる。
本明細書で使用される場合、「少能性」という用語は、成体幹細胞が、少数の異なる細胞型だけに分化する能力を指す。例えば、リンパ系又は骨髄系幹細胞は、それぞれ、リンパ系又は骨髄系の細胞を形成することができる。
本明細書で使用される場合、「単能性」という用語は、細胞が、単一の細胞型を形成する能力を意味する。例えば、精原幹細胞は、精細胞だけを形成することができる。
本明細書で使用される場合、「全能性」という用語は、細胞が、生物全体を形成する能力を意味する。例えば、哺乳動物では、接合子及び第１卵割期割球のみが全能性である。
本明細書で使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞ではない哺乳動物細胞を指す。こうした細胞の例として、分化細胞、並びに前駆細胞が挙げられる。分化細胞の例として、限定されないが、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織及び末梢血から選択される組織由来の細胞が挙げられる。例示的な細胞型として、限定されないが、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、及びＴ細胞が挙げられる。人工複能性細胞、内皮前駆細胞、及び肝細胞を作製するために使用される出発細胞も非多能性細胞であり得る。
分化細胞としては、限定されないが、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。特定の実施形態では、能力の低い細胞は、より高い能力の細胞に関して、「分化されている」とみなされる。
「体細胞」は、生物の身体を形成する細胞である。体細胞は、生物の臓器、皮膚、血液、骨及び結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。
細胞は、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来するものであってよい。例示的なヒト以外の哺乳動物として、限定されないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及びヒト以外の霊長類が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、成人又はヒト以外の哺乳動物由来である。一部の実施形態では、細胞は、新生児、成人、又はヒト以外の哺乳動物由来である。
本明細書で使用される場合、「被験者」又は「患者」という用語は、家畜、動物園の動物、又はヒトなどのあらゆる動物を指す。「被験者」又は「患者」は、イヌ、ネコ、トリ、家畜、又はヒトなどの哺乳動物であってよい。「被験者」及び「患者」の具体的な例として、限定されないが、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄などに関連する疾患又は障害を有する個体（特に、ヒト）が挙げられる。
哺乳動物細胞は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来であってよい。例示的なヒト以外の哺乳動物として、限定されないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及びヒト以外の霊長類（例えば、チンパンジー、マカク、及び類人猿）が挙げられる。
本明細書において「低免疫原性多能性」細胞又は「ＨＩＰ」細胞とは、その多能性特徴を保持し、しかも、同種異系宿主に移植されると、低下した免疫拒絶応答をもたらす多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩＰ細胞は、免疫応答を生み出さない。従って、「低免疫原性」は、非修飾又は野生型（即ち、「ｗｔ」）多能性細胞、即ち、本明細書に概説するような免疫操作前の細胞の免疫応答と比較して、有意に低下した、又は排除された免疫応答を指す。多くの事例で、ＨＩＰ細胞は、免疫学的にサイレントであり、しかも、多能性能力を依然として保持する。ＨＩＰ特徴に関するアッセイは、以下に概説する。
本明細書において、「低免疫原性多能性細胞Ｏ－」、「低免疫原性多能性ＯＲｈ－」細胞又は「ＨＩＰＯ－」細胞とは、ＡＢＯ血液群Ｏ及びリーサス因子Ｒｈ－でもあるＨＩＰ細胞を意味する。ＨＩＰＯ－細胞は、Ｏ－細胞から作製されたか、Ｏ－となるように酵素修飾されたか、又はＯ－となるように遺伝子操作されたかのいずれであってもよい。
本明細書において「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体とは、ヒトにおける主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体を意味する。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節を担う。ヒトの場合、２つのＭＨＣ、クラスＩ及びクラスＩＩ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」がある。ＨＬＡ－Ｉは、細胞の内部からペプチドを提示する３つのタンパク質、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃを含み、ＨＬＡ－Ｉ複合体により提示された抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる）を引き寄せる。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と結合している。ＨＬＡ－ＩＩは、５つのタンパク質、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲを含み、これらは、細胞の外側からＴリンパ球に対して抗原を提示する。これは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られる）を刺激する。「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」のいずれの使用も、限定を意図しないことは理解すべきである。従って、哺乳動物細胞に関係する場合、これらの用語は本明細書において互換可能に使用され得る。
本明細書において「遺伝子ノックアウト」とは、特定の遺伝子を、それが常在する宿主細胞において不活性にし、それによって、目的のタンパク質が生成されないようにするか、又はそれを不活性形態にするプロセスを意味する。当業者には理解され、また以下にさらに詳しく説明されるように、これは、いくつかの異なる方法によって達成することができ、そうした方法として、例えば、遺伝子からの核酸配列の除去、又は他の配列による配列の分断、リーディングフレームの改変、又は核酸の調節要素の改変が挙げられる。例えば、目的の遺伝子のコード領域の全部若しくは一部を除去するか、又は「ナンセンス」配列で置換することができ、プロモータなどの調節配列の全部若しくは一部を除去又は置換することができ、翻訳開始配列を除去又は置換することができるなどである。
本明細書において「遺伝子ノックイン」とは、遺伝子機能を宿主細胞に与えるプロセスを意味する。これにより、コード化されたタンパク質のレベルが増大する。当業者には理解されるように、これは、いくつかの方法で達成することができ、そうした方法として、宿主細胞への遺伝子の１つ若しくは複数のコピーの付加、又は生成されるタンパク質の発現を増大する内在性遺伝子の調節要素の改変がある。これは、プロモータの修飾、異なるプロモータの付加、エンハンサーの付加、又は他の遺伝子発現配列の修飾によって達成され得る。
「β－２マイクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下に示すアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍを指し；ヒト遺伝子は、アクセッション番号ＮＣ＿００００１５．１０：４４７１１４８７－４４７１８１５９を有する。
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、以下に示すアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＤ４７タンパク質を指し；ヒト遺伝子は、アクセッション番号ＮＣ＿００００１６．１０：１０８６６２２０８－１０９４１５６２を有する。
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、以下に示すアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；ヒト遺伝子は、アクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２：１０８０４３０９４－１０８０９４２００を有する。
本明細書における細胞に関連して、「野生型」とは、天然に存在する細胞を意味する。しかし、本明細書で使用される多能性幹細胞に関連して、これは、多能性をもたらす核酸変更を含み得るが、低免疫原性を獲得するための本発明の遺伝子編集方法に付されていないｉＰＳＣも意味する。
本明細書において「同系」とは、免疫学的適合性がある；例えば、免疫応答が発生しない宿主生物と細胞移植片の遺伝的類似性又は同一性を意味する。
本明細書において「同種異系」とは、免疫応答が発生しない宿主生物と細胞移植片の遺伝的不同性を意味する。
本明細書において「Ｂ２Ｍ－／－」とは、両方の染色体でＢ２Ｍ遺伝子が不活性化された二倍体細胞を意味する。本明細書に記載される通り、これは、様々な方法で実施することができる。
本明細書において「ＣＩＩＴＡ－／－」とは、両方の染色体でＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化された二倍体細胞を意味する。本明細書に記載される通り、これは、様々な方法で実施することができる。
本明細書において「ＣＤ４７ｔｇ」（「トランスジーン」を表す）とは、宿主細胞が、いくつかの事例で、ＣＤ４７遺伝子の少なくとも１つの追加コピーを有することにより、ＣＤ４７を発現することを意味する。
「Ｏｃｔポリペプチド」とは、転写因子のオクタマーファミリーの天然に存在するメンバー、又はその変異体のいずれかを指す。それらは、最も近縁の天然に存在するファミリーメンバーと比較して、少なくとも５０％、８０％、又は９０％以内の類似転写因子活性を維持する。Ｏｃｔポリペプチドはまた、天然に存在するファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインも含んでいてもよく、さらに、転写活性化ドメインを含み得る。例示的なＯｃｔポリペプチドとして、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｃｔ－６、Ｏｃｔ－７、Ｏｃｔ－８、Ｏｃｔ－９、及びＯｃｔ－１１が挙げられる。Ｏｃｔ－３／４（本明細書では「Ｏｃｔ４」と呼ばれる）、並びにＰＯＵドメイン、Ｐｉｔ－１、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２、及びｕｒｉｃ－８６の間で保存された１５０アミノ酸配列を含む。（Ｒｙａｎ，Ａ．Ｋ．＆Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１：１２０７－１２２５（１９９５）を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、変異体は、天然に存在するＯｃｔポリペプチドファミリーメンバー、例えば、上に挙げたもの、又はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ－００２６９２．１（ヒトＯｃｔ４）若しくはＮＰ－０３８６６１．１（マウスＯｃｔ４）と比較して、その配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｃｔポリペプチド（例えば、Ｏｃｔ－３／４又はＯｃｔ４）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であってよい。一部の実施形態では、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質を用いる。Ｏｃｔポリペプチドは、非多能性細胞において複能性の誘導を補助することができる多能性因子であってもよい。
「Ｋｌｆポリペプチド」は、クルッペル（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ）様因子（Ｋｌｆ）のファミリーの天然に存在するメンバー、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚パターン調節因子クルッペル（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ）と類似するアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質、又は最も近縁の天然に存在するファミリーメンバーと比較して類似の転写因子活性を維持する（少なくとも５０％、８０％、若しくは９０％活性以内の）天然に存在するメンバーの変異体、或いは天然に存在するファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドのいずれかを指し、さらに、転写活性化ドメインを含み得る。（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｐｅｖｓｎｅｒ，Ｊ．＆ Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１２１（２０００）を参照されたい）。例示的なＫｌｆファミリーメンバーとして、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ－４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６、及びＫｌｆ１７が挙げられる。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ－４は、マウスにおいてｉＰＳ細胞を産生することができる因子であることが判明し、関連遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５も、効率は低いが、同様に可能であった。（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１０６（２００７）を参照されたい）。一部の実施形態では、変異体は、天然に存在するＫｌｆポリペプチドファミリーメンバー、例えば、上に挙げたもの、又はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＸ１６０８８（マウスＫｌｆ４）若しくはＣＡＸ１４９６２（ヒトＫｌｆ４）と比較して、その配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｋｌｆポリペプチド（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であってよい。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質を用いる。Ｋｌｆポリペプチドは、多能性因子であってよい。Ｋｌｆ４遺伝子又はポリペプチドの発現は、出発細胞又は出発細胞の集団において複能性を誘導する上で役立ち得る。
「Ｍｙｃポリペプチド」は、Ｍｙｃファミリーの天然に存在するメンバーのいずれかを指す。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｄｈｉｋａｒｙ，Ｓ．＆Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６３５－６４５（２００５）を参照されたい）。これはまた、最も近縁の天然に存在するファミリーメンバーと比較して、類似の転写因子活性を維持する（即ち、少なくとも５０％、８０％、若しくは９０％活性以内の）変異体も含む。これはさらに、天然に存在するファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドを含み、さらには、転写活性化ドメインも含み得る。例示的なＭｙｃポリペプチドとして、例えば、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ及びＬ－Ｍｙｃが挙げられる。一部の実施形態では、変異体は、天然に存在するＭｙｃポリペプチドファミリーメンバー、例えば、上に挙げたもの、又はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２５０１５（ヒトＭｙｃ）と比較して、その配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｍｙｃポリペプチド（例えば、ｃ－Ｍｙｃ）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であってよい。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質を用いる。Ｍｙｃポリペプチドは、多能性因子であってよい。
「Ｓｏｘポリペプチド」は、高移動度群（ＨＭＧ）ドメインの存在を特徴とする、ＳＲＹ関連ＨＭＧ－ｂｏｘ（Ｓｏｘ）転写因子の天然に存在するメンバー、又は最も近縁の天然に存在するファミリーメンバーと比較して、類似の転写因子活性を維持する（即ち、少なくとも５０％、８０％、若しくは９０％活性以内の）変異体のいずれかを指す。これはまた、天然に存在するファミリーメンバーのＤＮＡ結合ドメインを少なくとも含むポリペプチドも含み、さらには、転写活性化ドメインをも含み得る。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１２１（２０００）を参照されたい）。例示的なＳｏｘポリペプチドとして、例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ８、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ１１、Ｓｏｘ１２、Ｓｏｘ１３、Ｓｏｘ１４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、Ｓｏｘ２１、及びＳｏｘ３０が挙げられる。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率で、ｉＰＳ細胞を産出することが判明しており、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、及びＳｏｘ１８も、効率はＳｏｘ２より幾分低いが、ｉＰＳ細胞を産生することが判明している。（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１０６（２００７）を参照されたい）。一部の実施形態では、変異体は、天然に存在するＳｏｘポリペプチドファミリーメンバー、例えば、上に挙げたもの、又はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ８３４３５（ヒトＳｏｘ２）と比較して、その配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓｏｘポリペプチド（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、又はＳｏｘ１８）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であってよい。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質を用いる。Ｓｏｘポリペプチドは、多能性因子であってよい。本明細書に論じるように、Ｓｏｘ２タンパク質は、ｉＰＳＣの作製に特に有用である。
「分化ＡＢＯ－細胞」、例えば、本明細書に記載の分化ＰＳＣＯ－又はＨＩＰＯ細胞とは、血液群Ｏ、Ｒｈ因子－である多能性細胞を意味し、これは、低免疫原性（例えば、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのノックアウト及びＣＤ４７のノックインにより）を有するように操作されていてもよく、その後、被験者への最終的移植のための細胞型に分化される。従って、例えば、ＨＩＰＯ－細胞は、肝細胞（「ｄＨＩＰＯ－肝細胞」）、β様膵細胞又は膵島オルガノイド様の膵臓細胞（「ｄＨＩＰＯ－β細胞」）、内皮細胞（「ｄＨＩＰＯ－内皮細胞」）などに分化させることができる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連して、パーセント「同一性」という用語は、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを用いて、又は目視検査により測定して、比較し、最大一致のためにアラインメントしたとき、同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の指定パーセンテージを有する２つ以上の配列若しくは部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較しようとする配列の１領域にわたって、例えば、機能性ドメインにわたって存在し得るか、又はこれに代わり、比較しようとする２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のために、典型的には１配列は、試験配列を比較する基準配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４（１９８８）により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視検査（概要は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，後述を参照されたい）により実施され得る。
配列同一性及び配列類似性パーセントを判定するのに好適であるアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。
「阻害剤」、「活性化剤」及び「モジュレータ」は、生物学的に関連する分子の機能又は発現に影響を与える。「モジュレータ」という用語は、阻害剤及び活性化剤の両方を包含する。これらは、標的分子の発現又は活性についてのインビトロ及びインビボアッセイを使用して、同定することができる。
「阻害剤」は、例えば、発現を阻害する、又は結合して分子若しくはタンパク質をターゲティングする薬剤である。これらは、刺激を部分的に若しくは完全に阻止するか、又はプロテアーゼ阻害剤活性を有し得る。これらは、記載の標的タンパク質不活性化、脱感作、又はその活性の下方制御を含め、活性化を抑制、低減、防止、又は遅延し得る。モジュレータは、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであってもよい。
活性化剤は、例えば、標的分子又はタンパク質の機能若しくは発現を誘導又は活性化する薬剤である。これらは、標的分子活性に結合する、それを刺激する、増加させる、利用可能にする、活性化する、又は促進し得る。活性化剤は、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであってもよい。
「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能、又は構造レベルで、基準分子と類似する生物活性分子である。相同体は、基準配列と特定の同一性パーセントを共有する配列誘導体を含み得る。従って、一実施形態では、相同性又は誘導体配列は、少なくとも７０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同性又は誘導体配列は、少なくとも８０又は８５％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同性又は誘導体配列は、少なくとも９０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同性又は誘導体配列は、少なくとも９５％の配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同性又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を共有する。相同性又は誘導体核酸配列はまた、それらが、高緊縮度ハイブリダイゼーション条件下で、基準核酸配列との結合を維持する能力によって定義することもできる。基準分子に対する構造的又は機能的類似性を有する相同体は、基準分子の化学誘導体であり得る。構造的及び機能的相同体並びに誘導体を検出、作製、及びスクリーニングする方法は、当技術分野で公知である。
「ハイブリダイゼーション」は、概して、相補鎖が、その融解温度未満の環境に存在するとき、変性ＤＮＡが再アニーリングする能力に左右される。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間で要望される相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度も高くなる。その結果として、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にする傾向があるのに対して、低い温度はより低緊縮性となる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮度のさらなる詳細及び説明については、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照されたい。
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮度」は、当業者が容易に決定することができ、概して、プローブ長さ、洗浄温度、及び塩濃度に応じて変動する経験的計算である。一般に、プローブが長いほど、適切なアニーリングのために高い温度が必要となり、プローブが短いほど、低い温度が求められる。
本明細書に定義される通り、「緊縮条件」又は「高緊縮条件」は、以下：（１）洗浄のために低イオン強度及び高い温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用するもの；（２）ハイブリダイゼーション中に、４２℃で、変性剤、例えば、ホルムアルデヒド、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０Ｍｍ塩化ナトリウム、７５Ｍｍクエン酸ナトリウム含有のＰｈ６．５の５０Ｍｍリン酸ナトリウムバッファーを含有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを使用するもの；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０Ｍｍリン酸ナトリウム（Ｐｈ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波処理済サケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを使用する一晩のハイブリダイゼーションで、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃での１０分の洗浄、次に５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣから成る１０分の高緊縮度洗浄を伴うものによって識別することができる。
本明細書全体を通して与えられる全ての最大数値限界は、あたかも数値の下限が本明細書に明記されているかのように、そうした数値の下限を全て包含することを意図する。本明細書全体を通して与えられる全ての最小数値限界は、あたかも数値の上限が本明細書に明記されているかのように、そうした数値の上限を全て包含することを意図する。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、あたかも、より狭い数値範囲が本明細書に明記されているかのように、より広い数値範囲内に含まれる、そのようなより狭い数値範囲を全て包含する。
本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、親分子から、修飾された分子を物理的に区別する改変を指す。一実施形態では、本明細書に記載の方法に従って調製された、ＣＤ４７、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ－ＣＤ、若しくはｉＣａｓｐ９変異型ポリペプチドのアミノ酸変更は、本明細書に記載の方法に従って修飾されていない対応する親、例えば、野生型タンパク質、天然に存在する突然変異型タンパク質、又はそうした変異型ポリペプチドの修飾を含まない別の操作タンパク質からそれを区別する。別の実施形態では、変異型ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドから変異型ポリペプチドの機能を区別する１つ又は複数の修飾を含む。例えば、変異型ポリペプチドのアミノ酸変更は、その受容体結合プロフィールに影響を与える。他の実施形態では、変異型ポリペプチドは、置換、欠失、若しくは挿入修飾、又はそれらの組合せを含む。別の実施形態では、変異型ポリペプチドは、変異型ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対するその親和性を高める１つ又は複数の修飾を含む。
一実施形態では、変異型ポリペプチドは、対応する天然又は親配列に対して１つ若しくは複数の修飾、挿入、又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異型ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１～４０、４１～５０、又は５１以上の修飾を含む。
「約」という用語は、本明細書において、およそ、ほぼ、概ね、又は前後を意味するために用いられる。用語「約」が、数値／範囲と一緒に用いられる場合、それは、記載される数値を上下に超えて境界を拡大することにより、当該数値／範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書において、記載される数値を２０％の差で上下に超えて数値を変更するために用いられる。
「モジュレートされた」は、本明細書においてタンパク質発現に関して用いられる場合、タンパク質発現レベルが、当該タンパク質の対応する野生型レベルと比較して、増加又は減少していることを意味し、例えば、修飾多能性細胞中のタンパク質の発現は、非修飾（野生型）多能性細胞のタンパク質発現レベルと比べて増加又は減少している場合、モジュレートされている。
「エピソームベクター」は、本明細書において、細胞の細胞質中に存在し、自律的に複製することができる遺伝子ベクターを意味し；例えば、これは、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない。いくつかのエピソームベクターが当技術分野で公知であり、以下に記載する。
本明細書で使用される場合、「拒絶反応を回避する」、「拒絶反応を免れる」、「拒絶反応を回避する」といった用語、及び類似の用語は、互換可能に用いられて、本発明に従って遺伝子的に、又はそれ以外で修飾された細胞であって、本発明に従って遺伝子修飾されていない対応する細胞と比較して、被験者に移植されたとき、拒絶反応を受けにくい細胞を指す。一部の実施形態では、本発明の遺伝子修飾細胞は、被験者と不適合のＡＢＯ血液群又はＲｈ因子である対応する細胞と比較して、被験者に移植されたとき、拒絶反応を受けにくい。
ＶＩＩ．本発明の細胞
本発明は、血液型Ｏ－多能性（ＰＳＣＯ－）細胞を作製するための組成物及び方法を提供する。本発明の一部の態様では、細胞は、Ｏ－人工多能性幹（ｉＰＳＣＯ－）細胞、Ｏ－胚性幹（ＥＳＣＯ－）細胞、低免疫原性多能性Ｏ－（ＨＩＰＯ－）細胞、又はそれらから誘導若しくは分化された細胞であり得る。他の態様では、非分化細胞型は、Ｏ－である。他の態様では、細胞は、Ｏ－Ｒｈ－血液型に酵素的又は遺伝子的に修飾される。
Ａ．遺伝子改変の方法
本発明は、細胞内又は無細胞条件で、核酸配列を修飾することにより、多能性細胞及びＨＩＰ細胞の両方を作製する方法を含む。例示的な技術として、相同組換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が挙げられる。これらの技術は、所望の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡ切断を可能にする。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、特定の配列を認識して、それと結合し、核酸分子中の二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼを用いて、染色体などの核酸分子の特定の配列をターゲティングすることを目標とする。二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）のいずれかにより修復される。
当業者には理解されるように、いくつかの様々な技術を用いて、血液型Ｏ、Ｒｈ陰性、さらには任意選択で、本明細書に概説する通り低免疫原性となるように、本発明の多能性細胞を操作すると共に、ＰＳＣ又はｉＰＳＣを操作することができる。
一般に、これらの技術を個別に、又は組み合わせて使用することができる。例えば、ＨＩＰ細胞の作製の場合、ＣＤ４７機能性をノックインするためのウイルス技術（例えば、レンチウイルス）と共に、ＣＲＩＳＰＲを用いて、操作細胞中の活性Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減することができる。また、当業者には理解されるように、一実施形態では、Ｂ２ＭをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲステップ、次にＣＩＩＴＡをノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲステップ、続いてＣＤ４７機能性をノックインするためのレンチウイルスの最終ステップを順に使用するが、これらの遺伝子は、異なる技術を用いて、異なる順序で操作することができる。
以下に、より詳細に説明するように、多能性幹細胞を作製／誘導するために、一般に、リプログラミング遺伝子の一過性発現が使用される。
ａ．ＣＲＩＳＰＲ技術
一実施形態では、当技術分野で公知のようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を用いて、細胞を操作する。ＣＲＩＳＰＲを用いて、出発ＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、若しくはＥＳＣＯ－を作製するか、又はＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－、若しくはＥＳＣＯ－からＨＩＰＯ－細胞を作製することができる。ＣＲＩＳＰＲに基づく多数の技術があり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法を用いて、本発明のＨＩＰ細胞を作製する。ＴＡＬＥＮは、ほぼ全ての所望のＤＮＡ配列に結合して、それを切断するように操作することができるヌクレアーゼと組み合わせた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態では、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を用いて、細胞を操作する。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合させることにより作製された人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列をターゲティングするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼに、複雑なゲノム内のユニークな配列をターゲティングさせることができる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用して、これらの試薬を用いることにより、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、高等生物のゲノムを正確に改変することができる。
ｄ．ウイルスベースの技術
本発明のＨＩＰ細胞の作製（並びにｉＰＳＣの初期作製）に使用することができる多種多様なウイルス技術があり、そうしたものとして、限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウィルス及びセンダイウイルスベクターの使用が挙げられる。ｉＰＳＣの作製に使用されるエピソームベクターを以下に説明する。
ｅ．干渉ＲＮＡを用いる遺伝子の下方制御
他の実施形態では、ＨＬＡ分子に使用されるタンパク質をコードする遺伝子をＲＮＡｉ技術により下方制御する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が、多くの場合、特定のｍＲＮＡ分子を分解させることにより、遺伝子発現を阻害するプロセスである。２つのタイプのＲＮＡ分子、即ち、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉の中心となる。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合して、その活性を増大又は低減する。ＲＮＡｉは、ウイルス及びトランスポゾンなどに由来する寄生核酸から細胞を防御するのを助ける。ＲＮＡｉはまた、発生にも影響を与える。
ｓｄＲＮＡ分子は、１９～２１塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡの１クラスである。これらは、５’リン酸、２’Ｏｍｅ又は２’Ｆ修飾ピリミジン、及び３’位の６つのホスホチオエートを含有する。これらはまた、３’共役ステロール部分、３’位の２つのホスホチオエート、及び２’Ｏｍｅ修飾ピリミジンを含有するセンス鎖も含む。いずれの鎖も、３の長さ以下の非修飾プリンの連続した区間を有する２’Ｏｍｅプリンを含む。ｓｄＲＮＡは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７９６，４４３号明細書に開示されている。
これらの技術の全てについて、よく知られている組換え技術を用いて、本明細書に概説される組換え核酸を作製する。特定の実施形態では、組換え核酸（所望のポリペプチド、例えば、ＣＤ４７、又は妨害配列をコードするいずれか）を発現構築物中の１つ若しくは複数の調節ヌクレオチド配列と作動可能に連結してもよい。調節ヌクレオチド配列は、一般に、治療しようとする宿主細胞及び被験者に対して適切となる。様々な宿主細胞のための多種の適切な発現ベクター及び好適な調節配列が当技術分野で知られている。典型的には、１つ又は複数の調節ヌクレオチド配列は、限定されないが、プロモータ配列、リーダ若しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクティベータ配列を含み得る。当技術分野で公知の構成性又は誘導性プロモータも考慮される。プロモータは、天然に存在するプロモータ、又は１つ以上のプロモータのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモータのいずれであってもよい。発現構築物は、細胞中で、エピソーム、例えば、プラスミド上に存在してもよいし、又は発現構築物を染色体に挿入してもよい。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカ遺伝子を含む。特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列と作動可能に連結された変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用される調節配列としては、プロモータ、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントが挙げられる。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換しようとする宿主細胞、発現させようとする特定の変異型ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、又はベクターによりコードされるいずれか他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカなどの発現の選択のために設計される。
好適な哺乳動物プロモータの例として、例えば、以下の遺伝子由来のプロモータが挙げられる：ハムスターのユビキチン／Ｓ７２ａプロモータ（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、シミアン空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、アデノウィルス主要後期プロモータ、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復領域、並びにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータ。他の異種哺乳動物プロモータの例として、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショックプロモータがある。
別の実施形態では、哺乳動物宿主細胞に使用されるプロモータは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許第２，２１１，５０４号明細書）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから取得することができる。さらに別の実施形態では、異種哺乳動物プロモータを使用する。例として、アクチンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、及び熱ショックプロモータが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモータは、好都合には、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として取得される。Ｆｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３－１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、好都合には、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２）。以上の参照文献は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
Ｂ．多能性細胞の作製
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を生産する方法を提供する。従って、第１ステップでは、多能性細胞幹細胞を提供する。
マウス及びヒト多能性幹細胞（概して、ｉＰＳＣと呼ばれる；マウス細胞の場合にはｍｉＰＳＣ、又はヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の作製は、一般に当技術分野で周知されている。当業者には理解されるように、ｉＰＳＣを作製するための多様で、異なる方法がある。初期誘導は、４つの転写因子、即ち、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を用いて、マウス胚性又は成体線維芽細胞から実施された；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）（その全体、特にそこに概説される技術について、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。それ以来、いくつかの方法が開発されている；概要については、Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）、並びにＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３（これらのいずれも、全体、とりわけ、ｈｉＰＳＣの作製方法（例えば、後者文献の第３章を参照されたい）について、参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。
一般に、ｉＰＳＣは、宿主細胞における１つ又は複数の「リプログラミング因子」の一過性発現により作製され、通常、これらの因子は、エピソームベクターを用いて導入される。こうした条件下で、少量の細胞を、ｉＰＳＣになるように誘導する（一般に、選択マーカが使用されないため、このステップの効率は低い）。一旦細胞が「リプログラミング」され、多能性となったら、それらはエピソームベクターを失って、内在性遺伝子を利用して上記因子を産生する。このエピソームベクターの喪失により、「ゼロフットプリント」細胞と呼ばれる細胞が生じる。遺伝子修飾が少なければ少ないほど（特に、宿主細胞のゲノム中では）良いため、これは望ましい。従って、得られたｈｉＰＳＣは、永続的遺伝子修飾を一切含まないことが望ましい。
当業者には理解されるように、使用することができる、又は使用されるリプログラミング因子の数は変動し得る。一般に、使用されるリプログラミング因子が少ないほど、分化多能状態への細胞の形質転換効率、並びに「多能性」は低下し、例えば、リプログラミング因子が少ない場合、十分に多能性ではないが、僅かな細胞型にのみ分化することができる細胞が得られる可能性がある。
一部の実施形態では、１つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４とＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０ＬＴ抗原から選択される５、６又は７つのリプログラミング因子を用いることができる。
一般に、これらのリプログラミング因子遺伝子は、当技術分野で公知であり、市販されているような、エピソームベクター上に提供される。例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ｈｉＰＳＣのゼロフットプリント作製用のセンダイウイルスリプログラミングキット（カタログ番号Ａ３４５４６を参照されたい）を販売している。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒはまた、ＥＢＮＡベースのシステム（カタログ番号Ａ１４７０３を参照されたい）も販売している。
加えて、いくつかの市販されているｈｉＰＳＣ株もある；例えば、ゼロフットプリント、ウイルス組込みなしヒトｉＰＳＣ細胞株であるＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｈｉＰＳＣ株、Ｋ１８９４５を参照されたい（また、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１、前掲も参照）。
一般に、当技術分野で公知のように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載のリプログラミング因子を一過性発現させることによって、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、線維芽細胞などの非多能性細胞から作製される。
例えば、リプログラミング効率は低下したが、Ｃ－Ｍｙｃを省いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４だけを用いても、ｉＰＳＣ作製に成功した。
一般に、ｉＰＳＣは、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＥＳＲＲＢ、ＴＢＸ３、ｃ－Ｍｙｃ及びＴＣＬ１を含む特定の因子の発現を特徴とする。本発明の目的のためのこれらの因子の新たな、又は増大した発現は、内在性遺伝子座の誘導若しくはモジュレーションを介して、又はトランスジーンからの発現から可能である。
例えば、マウスｉＰＳＣは、Ｄｉｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５，Ｊａｎ．２８；５：８０８１（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｃｒｅｐ０８０８１）（その全体、並びに特にｍｉＰＳＣ作製のための方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込む）の方法と、ｍｉＰＳＣの作製用の試薬を用いて、作製することができる。また、例えば、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１１ ６（４）：１８２９３（その全体、並びに特にそれに概説される方法について、参照により本明細書に組み込む）も参照されたい。
いくつかの事例では、細胞の多能性を本明細書に概説するように、例えば、多能性を示す一般に許容されるマーカ、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｂｘ３、及びＴｃ１１などについてアッセイすることにより、細胞の多能性を測定又は確認する。或いは、細胞の多能性は、実施例に概説される分化反応を実施することにより、測定又は確認することができる。
Ｃ．多能性Ｏ－細胞の作製
本発明の一部の態様では、前述したように作製されたｉＰＳＣ細胞は、このプロセスが、Ｏ－血液型を有する多能性細胞で出発したであろうから、既に血液型Ｏ、Ｒｈ因子陰性細胞であり得る。
本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣは、Ａ及びＢ抗原の酵素変換により血液型Ｏにされ得る。好ましい態様では、Ｂ抗原は、酵素を用いてＯに変換される。より好ましい態様では、酵素は、αガラクトシダーゼである。この酵素は、Ｂ抗原の末端ガラクトース残基を排除する。本発明の他の態様は、Ａ抗原からＯへの酵素変換を含む。好ましい態様では、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼを用いて、Ａ抗原をＯに変換する。酵素変換については、例えば、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ １１：３３－３９（２００４）；米国特許第４，４２７，７７７号明細書、同第５，６０６，０４２号明細書、同第５，６３３，１３０号明細書、同第５，７３１，４２６号明細書、同第６，１８４，０１７号明細書、同第４，６０９，６２７号明細書、及び同第５，６０６，０４２号明細書；並びに国際公開第９９２３１２０号パンフレット（それらの各々は、その全体を、参照により本明細書に組み込む）に論述されている。
本発明の他の実施形態は、ＡＢＯ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８０９０８）のエキソン７をノックアウトするように細胞を操作することにより、ｉＰＳＣを遺伝子修飾して、血液型Ｏにすることを含む。ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガー、又は相同組換えなど、当技術分野で公知の、又は本明細書に記載されるいずれのノックアウト方法を使用してもよい。
本発明の他の実施形態は、Ｒｈ血液群システム（ＲＨ）のＣ及び／若しくはＥ抗原、Ｋｅｌｌシステム（ＫＥＬ）のＫ、Ｄｕｆｆｙシステム（ＦＹ）のＦｙａ及びＦｙ３、Ｋｉｄｄシステム（ＪＫ）のＪｋｂ、又はＭＮＳ血液群システムのＵ及び／若しくはＳをノックアウトすることにより、血液型Ｏ多能性細胞をＲｈ因子陰性にすることを含む。或いは、本発明の細胞は、ＳＬＣ１４Ａ１（ＪＫ）遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５６３）をサイレンシングすることにより、Ｒｈ陰性にすることもできる。ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガー、又は相同組換えなど、当技術分野で公知の、又は本明細書に記載されるいずれのノックアウト方法を使用してもよい。
Ｄ．低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞の作製
多能性細胞からのＨＩＰ、又はＰＳＣＯ－、ｉＰＳＣＯ－細胞からのＨＩＰＯ－細胞の作製は、たった３つの遺伝子変更によって実施されるため、細胞活性の破壊を最小にするが、細胞に免疫サイレンシングを与える。
最初の２つの遺伝子変更は、ＭＨＣＩ及びＩＩ（細胞がヒト由来の場合、ＨＬＡＩ及びＨＬＡＩＩ）のタンパク質活性の低減又は排除に関与する。これは、それらの構成要素をコードする遺伝子を改変することにより、達成することができる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲを用いて、遺伝子のコーディング領域又は調節配列を破壊する。別の実施形態では、干渉ＲＮＡ技術を用いて、遺伝子翻訳を低減する。第３の変更は、マクロファージ食作用に対する感受性を調節する遺伝子、例えば、ＣＤ４７の発現を増大することに関する。これは、ウイルス又はトランスジーン技術による遺伝子の「ノックイン」を用いて、実施することができる。
ＣＲＩＳＰＲが、遺伝子修飾のために用いられるいくつかの事例では、細胞株の高効率編集を可能にするＣａｓ９構築物を含有するｈｉＰＳＣ又はｈｉＰＳＣＯ－細胞を使用することができる；例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＨｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｃａｓ９ ｉＰＳＣ細胞株、Ａ３３１２４を参照されたい。
１．ＨＬＡ－低減
本発明のＨＩＰＯ－細胞は、ＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞由来の場合、ＨＬＡ Ｉ）の低減を含む。
当業者には理解されるように、機能の低減は、いくつかの方法で達成することができ、そうしたものとして、遺伝子からの核酸配列の除去、他の配列による当該配列の分断、又は核酸の調節要素の改変が挙げられる。例えば、目的の遺伝子のコーディング領域の全部又は一部を除去するか、又は「ナンセンス」配列で置換する、フレームシフト突然変異を作製する、プロモータなどの調節配列の全部若しくは一部を除去又は置換する、翻訳開始配列を除去又は置換する、などができる。
当業者には理解されるように、多能性細胞のＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞由来の場合、ＨＬＡＩ）の好適な低減は、当技術分野で公知の、又は以下に記載する技術；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用する；例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗体のα鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、若しくはＣ抗体を使用する、ＦＡＣＳ技術を用いて測定することができる。
ａ．Ｂ２Ｍ改変
一実施形態では、ＨＬＡ－Ｉ活性の低減は、β－２ミクログロブリン発現を低減することにより達成される。これは、多能性幹細胞のβ－２ミクログロブリン遺伝子（そのヒト配列は本明細書に開示される）の発現を破壊することによって達成される。この改変は、一般に、遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＨＩＰ細胞において、これは、宿主細胞中の両対立遺伝子に対して実施される。概して、両方の破壊を実施するための技術は、同じである。
特に有用な実施形態では、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。いくつかの事例では、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、機能性タンパク質が生成されるように、小さな欠失又は挿入を遺伝子のコーディング領域に導入する。多くの場合、フレームシフト突然変異の結果、停止コドンが発生して、短縮、非機能性タンパク質が生成される。
従って、有用な技術は、マウスのＢ２Ｍ遺伝子又はヒトのＢ２Ｍ遺伝子のコーディング配列をターゲティングするように設計されたＣＲＩＳＰＲ配列を用いることである。遺伝子編集後、トランスフェクトされたｉＰＳＣ培養物を単一細胞に分離する。単一細胞をフルサイズコロニーに増殖させてから、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常配列の存在下でスクリーニングすることにより、ＣＲＩＳＰＲ編集について検査する。両対立遺伝子において欠失を含むクローンを採取する。こうしたクローンは、ＰＣＲにより実証されるように、Ｂ２Ｍを発現せず、ＦＡＣＳ分析により実証されるように、ＨＬＡ－Ｉを発現しない（例えば、実施例１及び６を参照されたい）。
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは知られており、本明細書に記載される。一実施形態では、このアッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプロービングされる細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）により、不活性化改変の存在を確認する。
さらには、ＨＬＡＩ複合体が細胞表面に発現されていないことを確認するために細胞を試験することができる。これは、前述したように、１つ又は複数のＨＬＡ細胞表面構成要素に対する抗体を用いたＦＡＣＳ分析によりアッセイすることができる。
２．ＨＬＡ－ＩＩ低減
ＨＬＡＩの低減に加えて、本発明のＨＩＰＯ－細胞は、ＭＨＣＩＩ機能（細胞がヒト細胞由来の場合、ＨＬＡＩＩ）も欠如している。
当業者には理解されるように、機能の低減は、いくつかの方法で達成することができ、そうしたものとして、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子への核酸配列の付加、リーディングフレームの破壊、他の配列による当該配列の分断、又は核酸の調節要素の改変が挙げられる。一実施形態では、目的の遺伝子のコーディング領域の全部又は一部を除去するか、又は「ナンセンス」配列で置換することができる。別の実施形態では、プロモータなどの調節配列を除去又は置換する、翻訳開始配列を除去又は置換する、などができる。
多能性細胞又はその誘導体のＭＨＣＩＩ機能（細胞がヒト細胞由来の場合、ＨＬＡＩＩ）の好適な低減は、当技術分野で公知の技術、例えば、タンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ｒｔ－ＰＣＲ技術などを用いて、測定することができる。
ａ．ＣＩＩＴＡ改変
一実施形態では、ＨＬＡ－ＩＩ活性の低減は、多能性細胞のＣＩＩＴＡ遺伝子（そのヒト配列は本明細書に開示される）の発現を破壊することにより行われる。この改変は、概して、本明細書では遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＨＩＰＯ－細胞において、これは、宿主細胞中の両対立遺伝子に対して実施される。
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書に記載される。一実施形態では、このアッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプロービングされる細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）によって不活性化改変の存在を確認する。
さらには、ＨＬＡＩＩ複合体が細胞表面に発現されていないことを確認するために細胞を試験することができる。やはりこのアッセイも当技術分野で公知であり、以下に概説するように、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及び他のほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づく、ウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析のいずれかを用いて実施される。
特に有用な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する。ＣＲＩＳＰＲは、ＭＨＣＩＩ分子の必須転写因子である、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコーディング配列をターゲティングするように設計されている。遺伝子編集後、トランスフェクトｉＰＳＣ培養物を単一細胞に分離する。単一細胞をフルサイズコロニーに増殖させてから、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常配列についてスクリーニングすることにより、好適なＣＲＩＳＰＲ編集について検査する。欠失を含むクローンは、ＰＣＲにより決定される通り、ＣＩＩＴＡを発現せず、ＦＡＣＳ分析により決定される通り、ＭＨＣＩＩ／ＨＬＡ－ＩＩを発現しない。
３．食作用低減
ＨＬＡ－Ｉ及びＩＩ（又はＭＨＣＩ及びＩＩ）の低減以外にも、一般に、Ｂ２Ｍ及ＣＩＩＴＡノックアウトを用いて、本発明のＨＩＰＯ－細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷に対する感受性が低減している。得られたＨＩＰＯ－細胞は、１つ又は複数のＣＤ４７トランスジーンによって、免疫マクロファージ及び自然経路を「免れる」。
ａ．ＣＤ４７増加
一部の実施形態では、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷感受性の低減は、ＨＩＰＯ－細胞上の増加したＣＤ４７の増加によって起こる。これは、当業者に理解されるような様々なやり方で、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を用いて実施され得る。いくつかの事例では、ＣＤ４７発現の増大は、１つ又は複数のＣＤ４７トランスジーンによって達成される。
従って、一部の実施形態では、ＣＤ４７遺伝子の１つ又は複数のコピーを誘導性又は構成性プロモータの制御下でＨＩＰＯ－細胞に付加するが、後者が好ましい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるか、又は当技術分野で公知のように、レンチウイルス構築物を使用する。ＣＤ４７遺伝子は、当技術分野で公知の通り、好適なプロモータの制御下で、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
ＨＩＰＯ－細胞株をＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣから作製することができる。ＣＤ４７を発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞は、ブラストサイジンマーカを用いて選択され得る。ＣＤ４７遺伝子配列を合成し、そのＤＮＡを、ブラストサイジン耐性を有するプラスミドレンチウイルスｐｌｅｎｔｉ６／Ｖ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にクローニングする。
一部の実施形態では、内在性ＣＤ４７遺伝子の調節配列を改変する、例えば、内在性プロモータを構成性プロモータ又は異なる誘導性プロモータと交換することによって、ＣＤ４７遺伝子の発現を増大することができる。これは、一般に、ＣＲＩＳＰＲなどの公知の技術を用いて実施することができる。
改変されたら、実施例に記載するものなどの公知の技術、例えば、抗ＣＤ４７抗体を用いるウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＦＡＣＳアッセイを用いて、十分なＣＤ４７発明の存在をアッセイすることができる。概して、これに関連して「十分な」とは、ＮＫ細胞殺傷を抑制するＨＩＰＯ－細胞表面でのＣＤ４７の発現の増大を意味する。細胞でのその天然の発現レベルは、一旦それらのＭＨＣＩが除去されると、ＮＫ細胞溶解からそれらを保護するには低すぎる。
４．他の修飾
一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、例えば、国際公開第２０１６／０７３９５５号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、例えば、ＣＲＩＳＰＲ又はＴＡＬＥＮなどのゲノム編集ツールを用いて、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を編集して、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４タンパク質表面発現を低減若しくは排除することにより作製される。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、国際公開第２０１６／０７３９５５号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、Ｂ２Ｍ遺伝子に加えてＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を編集して、ＭＨＣクラス１表面発現を低減又は排除することにより作製される。
一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、国際公開第２０１６／１８３０４１号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ又はＴＡＬＥＮなどのゲノム編集ツールを用いて、ＮＩＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、及び／又はＢ２Ｍ遺伝子を編集して、ＮＩＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、及び／又はＢ２Ｍタンパク質の表面発現及び／又は活性を低減若しくは排除することにより作製される。一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、国際公開第２０１６／１８３０４１号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃｌ－阻害因子、及びＩＬ－３５などの１つ若しくは複数の寛容原性因子遺伝子の発現をモジュレートすることにより作製される。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、国際公開第２０１６／１８３０４１号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、及び／又はＩＲＦ－１などの１つ若しくは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることにより作製される。さらに別の実施形態では、細胞に対するさらなる修飾は、国際公開第２０１６／１８３０４１号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＣＣＲ５、及び／又はＡＰＯＣ３などの１つ若しくは複数の発現をモジュレートすることを含む。
一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、国際公開第２０１８／２２７２８６号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、及び／又はＳＥＲＰＩＮ Ｂ９などの１つ若しくは複数のトランスジーン、或いは、ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、及び／又はＳＥＲＰＩＮ Ｂ９のアゴニストとして作用する生物剤をコードする遺伝子の導入により作製される。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、国際公開第２０１８／２２７２８６号パンフレット（その全体を、特に、そこに概説される関連技術に関して、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／又はＩＦＮγＲ１ ｄ３９の１つ若しくは複数のトランスジーン、或いは、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／又はＩＦＮγＲ１ ｄ３９のアゴニストとして作用する生物剤をコードする遺伝子の導入により作製される。
５．自殺遺伝子
一部の実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含むＨＩＰＯ－細胞を提供する。これらは、万一、低免疫原性多能性細胞が望まれない様式で増殖及び分化した場合に、それらの死を引き起こすことができる「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。「自殺遺伝子」アブレーション手法は、特定の化合物によって活性化された場合に限り、細胞殺傷を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子輸送ベクター内の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、非毒性化合物を猛毒の代謝物質に選択的に変換する酵素をコードすることができる。これにより、酵素を発現する細胞の限定的排除が起こる。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーは、ガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（Ｓ－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２），Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）、いずれも、その全体を参照により本明細書に組み込む）。
他の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態では、カスパーゼタンパク質の上記部分は、配列番号６に例示される。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓ９である。これは、一連のアミノ酸を介して、ヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に連結された、Ｆ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６－結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、高い親和性で、小分子二量体化剤、ＡＰ１９０３に結合する。従って、本発明のｉＣａｓ９の自殺機能は、タンパク質二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によってトリガーされる。一実施形態では、ＣＩＤは、小分子薬剤ＡＰ１９０３である。二量体化は、アポトーシスの急速な誘導を引き起こす。（国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）（これらの各々は、その全体を参照により本明細書に組み込む）。
６．ＨＩＰＯ－表現型及び多能性の保持についてのアッセイ
ＨＩＰＯ－細胞が作製されたら、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に概要が記載されている通り、その低免疫原性及び／又は多能性の保持についてアッセイしてもよい。
例えば、いくつかの技術を用いて、低免疫原性をアッセイすることができる。これらの技術は、同種異系宿主への移植、続いて、宿主免疫系を免れるＨＩＰＯ－細胞増殖（例えば、奇形腫）のモニタリングを含む。ルシフェラーゼを発現するように、ＨＩＰＯ－誘導体を形質移入した後、生物発光イメージングを用いて追跡することができる。同様に、ＨＩＰ細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／又はＢ細胞応答を試験して、ＨＩＰ細胞が宿主動物に免疫反応を引き起こさないことを確認することができる。Ｔ細胞機能は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｅｌｉｓａ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、又は質量サイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）により評価することができる。Ｂ細胞応答又は抗体応答は、ＦＡＣＳ又はルミネクスを用いて評価することができる。これに加えて又は代わり、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞殺傷を回避する能力について、細胞をアッセイしてもよい。Ｋ細胞溶解活性は、インビトロ又はインビボで評価することができる。
同様に、多能性の保持をいくつかの方法で試験することができる。一実施形態では、本明細書及び国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレットに概略的に記載されている通り、特定の多能性特異的因子の発現により多能性をアッセイする。これに加えて又は代わり、ＨＩＰＯ－細胞を、多能性の指標として１つ又は複数の細胞型に分化させることもできる。
Ｅ．本発明の実施形態
本発明のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はそれらの誘導体を用いて、１型糖尿病、心臓病、神経系疾患、癌、失明、血管病、及び再生医療治療法に応答する他の疾患／障害を治療することができる。特に、本発明は、あらゆる細胞型への分化のためにＨＩＰＯ－細胞の使用を考慮する。従って、本明細書には、ヒト患者などの同種異系宿主に、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はこれらの細胞の分化した産物のいずれかとして移植されたとき、多能性を提示するが、宿主免疫応答を起こさないｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はそれらの誘導体が提供される。
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、単離されたｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はそれらの誘導体を提供し、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されている。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＣＤ１７１、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原に結合する。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達細胞内ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達細胞内ドメインを含む。
本発明の別の態様では、本明細書に記載される、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はそれらの誘導体のいずれか１つのインビトロ分化により生産される単離されたＯ－ＣＡＲ－Ｔ（Ｏ－ＣＡＲ－Ｔ）又は低免疫Ｏ－ＣＡＲ－Ｔ（ＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ）細胞が提供される。一部の実施形態では、ＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞傷害性ＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
様々な実施形態において、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ若しくは複数の増殖因子又はサイトカインを含む培地中で、ＣＡＲ構築物を担持する、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞、又はそれらの誘導体を培養するステップを含む。一部の実施形態では、培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害因子、ＲＯＣＫ阻害因子、ＴＧＦ受容体／ＡＬＫ阻害因子、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ若しくは複数の増殖因子又はサイトカインをさらに含有する。
特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ構築物を担持するｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞のいずれか１つのインビトロ分化により生産される、単離されたＯ－ＣＡＲ－Ｔ又はＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を癌の治療に使用することができる。
本発明の別の態様では、本明細書に記載の単離されたＯ－ＣＡＲ－Ｔ又はＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを治療有効量で含む組成物を投与することにより、癌患者を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療有効量の担体を含有する。
一部の実施形態では、投与ステップは、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、脊髄内投与、胸腔内投与、及び腹腔内投与を含む。特定の事例では、投与はさらに、ボラス又は連続灌流によるものを含む。
一部の実施形態において、癌は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である。様々な実施形態では、癌は、固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の、単離されたＯ－ＣＡＲ－Ｔ又はＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか１つを作製する方法を提供する。この方法は、本発明のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞のいずれか１つをインビトロで分化させることを含み、ここで、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ若しくは複数の増殖因子又はサイトカインを含む培地中で、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞を培養するステップを含む。一部の実施形態では、培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害因子、ＲＯＣＫ阻害因子、ＴＧＦ受容体／ＡＬＫ阻害因子、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ若しくは複数の増殖因子又はサイトカインをさらに含有する。
一部の実施形態では、インビトロ分化は、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞をフィーダ細胞上で培養するステップを含む。様々な実施形態において、インビトロ分化は、疑似微小重力下で培養するステップを含む。特定の事例では、疑似微小重力下での培養は、少なくとも７２時間にわたって行う。
一部の態様において、本明細書には、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞から分化され、単離された、操作低免疫心細胞（低免疫原性心細胞）、例えば、心筋細胞が提供される。
心筋細胞は、これまで、ＡＢＯ血液群抗原を欠如していると考えられていた。ＡＢＯ血液群Ｂ型ヒト胚性幹細胞株の心筋細胞様細胞への分化は、Ｂ抗原の喪失を招くことが見出されたが、これは、これらの抗原の喪失が、ヒト胚発生中の早期に起こり得ることを示している。例えば、Ｍｏｅｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．８６（１０）：１４０７－１３（２００８）（その全体を参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。また他の研究も、心筋細胞様細胞への人工ヒト多能性幹細胞の分化が、これらの細胞中のＡＢＯ血液群Ａ型抗原の段階的喪失を招くことを報告している。例えば、Ｓａｅｌｊｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．１３０７２：１－１４（２０１７）を参照されたい。しかし、驚くことに、本発明者らは、心筋細胞が、不適合レシピエントに対してこうした細胞の拒絶反応を引き起こし得るＡＢＯ血液群抗原を発現することを見出した。
従って、一部の態様では、心臓病又は疾患を患う患者を治療する方法が本明細書に提供される。この方法は、本明細書に記載のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞から誘導され、単離された、操作Ｏ－若しくは低免疫Ｏ－心細胞のいずれか１つの集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療有効量の担体を含有する。
一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は注入を含む。
一部の実施形態では、心臓病又は疾患は、小児心筋症、加齢に伴う心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、その他の心筋症、心筋炎、心筋虚血再灌流傷害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心不全、アテローム性動脈硬化、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、動脈炎、又は心血管病からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、インビトロ分化によりＨＩＰＯ－細胞の集団からＯ－低免疫心細胞の集団を生産する方法が提供され、ここで、非修飾ｉＰＳＣＯ－細胞と比較して、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されている。この方法は、以下：（ａ）ＧＳＫ阻害因子を含有する培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養するステップ；（ｂ）ＷＮＴアンタゴニストを含有する培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して、心前駆細胞の集団を生産するステップ；及び（ｃ）インスリンを含有する培地中で心前駆細胞の集団を培養して、Ｏ－低免疫心細胞の集団を生産するステップを含む。一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害因子は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＧＳＫ阻害因子は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＷＮＴアンタゴニストは、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の態様において、本明細書には、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－細胞から分化され、単離された、操作Ｏ－若しくはＯ－低免疫内皮細胞が提供される。他の態様では、単離された、操作Ｏ－若しくはＯ－低免疫内皮細胞は、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞、及び腎内皮細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、血管病又は疾患を患う患者を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、単離された、操作Ｏ－若しくはＯ－低免疫内皮細胞の集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の、単離された、操作Ｏ－又はＯ－低免疫内皮細胞のいずれか１つの集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療に有効な担体を含有する。一部の実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は注入を含む。
一部の実施形態では、血管病又は疾患は、血管傷害、心血管疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織傷害、下肢虚血、発作、神経障害、及び脳血管疾患からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、インビトロ分化によりＨＩＰＯ－細胞の集団からＯ－低免疫内皮細胞の集団を生産する方法が提供され、ここで、ＨＩＰＯ－細胞において、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されている。この方法は、以下：（ａ）ＧＳＫ阻害因子を含有する第１培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養するステップ；（ｂ）ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有する第２培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して、内皮前駆細胞の集団を生産するステップ；及び（ｃ）ＲＯＣＫ阻害因子及びＡＬＫ阻害因子を含有する第３培地中で内皮前駆細胞の集団を培養して、低免疫内皮細胞の集団を生産するステップを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害因子は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＧＳＫ阻害因子は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害因子は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＲＯＣＫ阻害因子は、約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害因子は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＡＬＫ阻害因子は、約０．５μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、第１培地は、２μＭ～約１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含有する。一部の実施形態では、第２培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する。他の実施形態では、第２培地はさらに、Ｙ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２を含有する。様々な実施形態では、第３培地は、１０μＭのＹ－２７６３２と１μＭのＳＢ－４３１５４２を含有する。特定の実施形態では、第３培地はさらに、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有する。特定の事例では、第１培地及び／又は第２培地は、インスリンを含有しない。
一部の態様において、本明細書には、ＨＩＰＯ－細胞から分化され、単離された操作Ｏ－低免疫ドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）が提供され、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されており、ニューロンは、血液型Ｏ及びＲｈ－である。
一部の実施形態では、単離されたＯ－低免疫ドーパミン作動性ニューロンは、ニューロン幹細胞、ニューロン前駆細胞、未成熟ドーパミン作動性ニューロン、及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、神経変性疾患又は状態を患う患者を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロンのいずれか１つの集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療に有効な担体を含む。一部の実施形態では、単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団は、生分解性スカフォールド上にある。一部の実施形態では、投与は、移植又は注射を含み得る。一部の実施形態では、神経変性疾患又は状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、インビトロ分化によりＨＩＰＯ－細胞の集団からＯ－低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団を生産する方法が提供され、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されており、ＨＩＰＯ－細胞において、血液型はＯ及びＲｈ－である。一部の実施形態では、本方法は、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害因子、ＡＬＫ阻害因子、及びＲＯＣＫ阻害因子から選択される１つ若しくは複数の因子を含む第１培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して、未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を生産するステップ；並びに（ｂ）第１培地とは異なる第２培地中で未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を培養して、ドーパミン作動性ニューロンの集団を生産するステップを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫβ阻害因子は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＧＳＫβ阻害因子は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害因子は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＡＬＫ阻害因子は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、第１培地及び／又は第２培地は、動物血清が存在しない。
一部の実施形態では、本方法はまた、非ドーパミン作動性ニューロンから低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団を単離するステップも含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団を低温保存するステップも含む。
いくつかの態様では、ＨＩＰＯ－細胞から分化され、単離された操作Ｏ－低免疫膵島細胞が提供され、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されており、血液型は、Ｏ及びＲｈ－である。
一部の実施形態では、単離されたＯ－低免疫膵島細胞は、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、及び成熟膵島細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、糖尿病を患う患者を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載の、単離されたＯ－低免疫膵島細胞のいずれか１つの集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療に有効な担体を含有する。一部の実施形態では、単離された低免疫膵島細胞の集団は、生分解性スカフォールド上にある。いくつかの事例では、投与は、移植又は注射を含む。
一部の態様において、本明細書には、インビトロ分化によりＨＩＰＯ－細胞の集団からＯ－低免疫膵島細胞の集団を生産する方法が提供され、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されており、ＨＩＰＯ－細胞において、血液型はＯ及びＲｈ－である。本方法は、以下：（ａ）インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害因子、ＡＬＫ阻害因子、ＢＭＰ１型受容体阻害因子、及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ若しくは複数の因子を含有する第１培地中で、ＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して、未成熟膵島細胞を生産するステップ；並びに（ｂ）第１培地とは異なる第２培地中で、未成熟膵島細胞の集団を培養して、低免疫膵島細胞の集団を生産するステップを含む。
一部の実施形態では、ＧＳＫ阻害因子は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＧＳＫ阻害因子は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害因子は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＡＬＫ阻害因子は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、第１培地及び／又は第２培地は、動物血清が存在しない。
一部の実施形態では、本方法はまた、非膵島細胞から低免疫膵島細胞の集団を単離するステップも含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、低免疫膵島細胞の単離集団を低温保存するステップも含む。
いくつかの態様では、ＨＩＰＯ－細胞から分化され、単離された操作Ｏ－低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が提供され、ここで、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されており、血液型は、Ｏ及びＲｈ－である。
一部の実施形態では、単離されたＯ－低免疫ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、及び機能性ＲＰＥ細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、眼病を患う患者を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載の、単離された低免疫ＲＰＥ細胞の集団のいずれか１つの集団を治療有効量で含む組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、組成物はさらに、治療に有効な担体を含む。一部の実施形態では、単離された低免疫ＲＰＥ細胞の集団は、生分解性スカフォールド上にある。一部の実施形態では、投与は、患者の網膜への移植又は注射を含む。一部の実施形態では、眼病は、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年型黄斑変性、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性症、及び網膜■離からなる群から選択される。
いくつかの態様では、インビトロ分化により、ＨＩＰＯ－細胞の集団から、Ｏ－低免疫網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を生産する方法が提供され、ここでは、ＨＩＰＯ－細胞において、内在性β－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除され、ＣＤ４７発現が増大されている。本方法は、以下：（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害因子、ＡＬＫ阻害因子、ＲＯＣＫ阻害因子、及びＶＥＧＦＲ阻害因子からなる群から選択される因子のいずれか１つを含有する第１培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して、ＲＰＥ前駆細胞の集団を生産するステップ；並びに（ｂ）第１培地とは異なる第２培地中でＲＰＥ前駆細胞の集団を培養して、低免疫ＲＰＥ細胞の集団を生産するステップを含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ阻害因子は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＡＬＫ阻害因子は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害因子は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はその変異体である。いくつかの事例では、ＲＯＣＫ阻害因子は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態では、第１培地及び／又は第２培地は、動物血清が存在しない。
一部の実施形態では、本方法はまた、非ＲＰＥ細胞からＯ－低免疫ＲＰＥ細胞の集団を単離するステップも含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、低免疫ＲＰＥ細胞の集団を低温保存するステップも含む。
一態様では、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣＯ－）は、以下：ａ）各対立遺伝子でのＢ２Ｍ遺伝子の破壊（例えば、Ｂ２Ｍ－／－）、ｂ）各対立遺伝子でのＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊（例えば、ＣＩＩＴＡ、－／－）、及びｃ）ＣＤ４７遺伝子の過剰発現（ＣＤ４７＋、例えば、ＣＤ４７遺伝子の１つ若しくは複数の追加コピーの導入又はゲノム遺伝子の活性化を介して）により、低免疫原性にされる。これによって、ｈｉＰＳＣＯ－集団をＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤｔｇにする。好ましい態様では、細胞は、非免疫原性である。別の実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、前述したように、非免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇにするが、必要に応じてインビボで細胞を殺傷するように誘導される誘導性自殺遺伝子を含有させることによって、さらに修飾する。他の態様では、ＡＢＯ遺伝子エキソン７のノックアウト又はＳＬＣ１４Ａ１（ＪＫ）遺伝子のサイレンシングにより血液型をＯにすると共に、Ｒｈ血液群システム（ＲＨ）のＣ及びＥ抗原、Ｋｅｌｌシステム（ＫＥＬ）のＫ、Ｄｕｆｆｙシステム（ＦＹ）のＦｙａ及びＦｙ３、Ｋｉｄｄシステム（ＪＫ）のｊｋｂ、又はＭＮＳ血液群系のＵ及びＳをノックアウトすることにより、ＨＩＰ細胞をＲｈ－にしたとき、ＨＩＰＯ－細胞が作製される。
Ｆ．Ｏ－多能性細胞の維持
一旦作製してから、ｉＰＳＣの維持について知られている通り、本発明のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞を未分化状態に維持することができる。例えば、分化を防ぎ、且つ多能性を維持する培地を用いたＭａｒｔｉｇｅｌ上でＨＩＰＯ－細胞を培養することができる。
Ｇ．Ｏ－多能性細胞の分化
本発明は、後に被験者に移植するための様々な細胞型に分化されるｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞を提供する。当業者には理解されるように、分化方法は、公知の技術を用いて、所望の細胞型に左右される。細胞は、懸濁液中で分化させた後、マトリゲル、ゼラチンなどのゲルマトリックス形態、又はフィブリン／トロンビン形態に導入して、細胞の生存を助ける。分化は、当技術分野で公知のように、一般には、細胞特異的マーカの存在下で評価することによりアッセイされる。
一部の実施形態では、本発明のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、肝細胞機能性の喪失又は肝硬変に対処するために、肝細胞に分化させる。ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞を肝細胞に分化させるために使用することができるいくつかの技術があり；例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）及びＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）（それらは全て、全内容を、特に、分化の方法及び試薬について、参照により本明細書に明示的に組み込む）を参照されたい。分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、肝細胞関連マーカ及び／又は特定のマーカ（限定されないが、アルブミン、αフェトプロテイン、及びフィブリノーゲンを含む）の存在を評価することによりアッセイされる。分化はまた、例えば、アンモニアの代謝、ＬＤＬ蓄積及び取込み、ＩＣＧ取込み及び放出並びにグリコーゲン蓄積など、機能性により測定することもできる。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用のβ様細胞又は膵島オルガノイドに分化させる。細胞システムは、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３を参照されたい。加えて、Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．は、ｈｉＰＳＣからのβ－細胞の分化の成功について報告している（ｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照されたい、尚、その全体を、特にそれに概説されるヒト多能性幹細胞からの機能性ヒトβ細胞のラージスケール生産のための方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込む）。さらには、Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の生産、その後、宿主による免疫拒絶反応を回避するためのカプセル化を示している；（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０を参照されたい、尚、その全体を、特に、それに概説されるヒト多能性幹細胞からの機能性ヒトβ細胞のラージスケール生産のための方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込む）。
分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、β細胞関連マーカ又は特定のマーカ（限定されないが、インスリンを含む）の存在を評価することによりアッセイされる。分化はまた、グルコース代謝など、機能性により測定することもでき、概要については、Ｍｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２を参照されたい、尚、その全体を、特に、それに概説されるバイオマーカについて、参照により本明細書に組み込む）。
ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－β細胞が作製されたら、それらを門脈／肝臓、大網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉、又は皮下嚢に移植する（本明細書に記載のように、細胞懸濁物として、又はゲルマトリックス内のいずれかで）ことができる。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、目の視力を脅かす疾患に対処するために、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させる。ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その全体を、特に、分化技術及び試薬のためのそこに概説される方法及び試薬について、参照により本明細書に組み込む）に概説される技術を用いて、ＲＰＥ細胞に分化されており；また、Ｍａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も参照されたい（ＲＰＥ細胞のシート作製技術及び患者への移植について、その全体を参照により本明細書に組み込む）。
分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、ＲＰＥ関連マーカ及び／若しくは特定のマーカの存在を評価することにより、又は機能性を測定することによってアッセイされる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７を参照（その全体、また特に、結果セクションの第１パラグラフに概説されるマーカについて、参照により本明細書に組み込む）。
一部の実施形態では、本発明のｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、心血管疾患に対処するために、心筋細胞に分化させる。心筋細胞へのｈｉＰＳＣの分化のための技術は、当技術分野で公知であり、実施例に論述する。分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、心筋細胞関連マーカ若しくは特定のマーカの存在を評価することにより、又は機能性を測定することによってアッセイされ；例えば、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１（その全体を、また特に、心筋細胞を含む幹細胞を分化する方法について、参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、末梢動脈疾患に対処するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化させる。内皮細胞に分化させる技術は、公知である。例えば、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８（その全体を、特に、ヒト多能性幹細胞から内皮細胞の作製のための方法及び試薬について、並びに移植技術について、参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、内皮細胞関連マーカ若しくは特定のマーカの存在を評価することにより、又は機能性を測定することによってアッセイされる。
一部の実施形態では、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、自己免疫甲状腺炎に対処するために、甲状腺ホルモンを分泌することができる甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞若しくはオルガノイドに分化させる。甲状腺細胞を分化させための技術は、当技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｒｍａｎｎ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照（その全体を、特に、ヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞の作製のための方法及び試薬について、並びに移植技術について、参照により本明細書に明示的に組み込む）を参照されたい。分化は、当技術分野で公知のように、一般的には、甲状腺細胞関連マーカ若しくは特定のマーカの存在を評価することによってか、又は機能性を測定することによってアッセイされる。
Ｈ．分化したＨＩＰＯ－細胞の移植
当業者には理解されるように、分化したＨＩＰＯ－細胞を当技術分野で公知の技術を用いて移植するが、これらの技術は、細胞型及びそうした細胞の最終的用途の両方に左右される。一般に、本発明の分化ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－細胞は、静脈内、又は患者の特定の位置への注射のいずれかによって移植される。特定の位置に移植する場合、細胞が生着する間の分散を防止するために、細胞をゲルマトリックスに懸濁させてもよい。
本明細書に記載の発明がさらによく理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、あくまでも例示を目的としており、いかなる方法でも本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１：ヒトｉＰＳＣの作製
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの３－プラスミド、７－因子（ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０ＬＴ抗原）ＥＢＮＡベースのエピソームシステムを用いて、ヒトエピソームｉＰＳＣ株をＣＤ３４＋臍帯血細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３３１２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から誘導した。このｉＰＳＣ株は、リプログラミング事象からゲノムへの組込みがなかったため、ゼロフットプリントを有すると考えられる。全てのリプログラミング遺伝子を含有しないことが明らかにされた。ｉＰＳＣは、正常ＸＸ核型、並びにＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ（ＲＴ－ＰＣＲにより示される通り）ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１（ＩＣＣにより示される通り）のような多能性マーカの内在性発現を有する。分化誘導及び奇形主分析において、これらのｈｉＰＳＣは、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉系列についてそれらの分化能を保持した。加えて、血管、内皮、及び心臓系列は、堅調な効率で誘導された。
ｉＰＳＣ作製のためのいくつかの遺伝子送達ビヒクルが好適に使用されており、そうしたものとして、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）並びにウイルスフリーリプログラミング方法（エピソームベクター、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、合成ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、組換えタンパク質、及び小分子薬剤などを用いる）が挙げられる。
山中因子として知られるＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣの最初に報告された組合せのように、様々な因子がリプログラミングのために好適に使用されている。一実施形態では、リプログラミング効率は低下するものの、これら因子の３つだけを組み合わせ、Ｃ－ＭＹＣは省くことで成功した。
一実施形態では、Ｃ－ＭＹＣに代わってＬ－ＭＹＣ又はＧＬＩＳ１が、リプログラミング効率の向上を示した。別の実施形態では、リプログラミング因子は、多能性に関連する遺伝子に限定されない。
データは全て、±ＳＤとして、又は中央値と最小から最大の範囲を示す箱ひげ図に表す。群同士の差は、対応のないスチューデントｔ検定、又はボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の事後検定を用いた１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより適切に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
実施例２：ヒトＨＩＰ細胞の作製
低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞は、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット並びに米国仮特許出願第６２／６９８，９４１号明細書、同第６２／６９８，９６５号明細書、同第６２／６９８，９７３号明細書、同第６２／６９８，９７８号明細書、同第６２／６９８，９８１号明細書、及び同第６２／６９８，９８４号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される通りに作製した。
ヒトＣａｓ９ｉＰＳＣは、２つの遺伝子編集ステップを経た。第１ステップでは、ＣＲＩＳＰＲ配列５’－ＣＧＴＧＡＧＴＡＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＴＴ－３’を用いたヒトβ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のコーディング配列と、ＣＲＩＳＰＲ配列５’－ＧＡＴＡＴＴＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣ－３’を用いたヒトＣＩＩＴＡ遺伝子のコーディング配列とのターゲティング組合せにより、ＣＲＩＳＰＲ技術を実施した。Ｔ７プロモータを含む線状化ＣＲＩＳＰＲ配列を用いて、キットの指示（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従い、ｇＲＮＡを合成した。次に、収集したインビトロ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。ＩＶＴｇＲＮＡ送達のために、単数化された細胞を、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション装置を用いて、３００ｎｇのＩＶＴｇＲＮＡでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、編集Ｃａｓ９ｉＰＳＣを単一細胞接種のために増殖し；ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、ｉＰＳＣ培養物を単一細胞に分離し、Ｔｒａ１－６０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａセルソータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別し、前方及び側方散乱光に対する選択的ゲーティングにより、接種からダブレット及び残屑を除去した。ＰＩの非存在、及びＴｒａ１－６０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８染色の存在に基づいて、生存多能性細胞を選択した。次に、単一細胞をフルサイズコロニーに増殖させてから、コロニーをＣＲＩＳＰＲ編集について検査した。ＣＲＩＳＰＲ媒介切断を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて評価した。ゲノムＤＮＡを１×１０６個のｈｉＰＳＣから単離し、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、並びにＢ２Ｍ用のプライマーセットＦ：５’－ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＴＣ－３’及びＲ：５’－ＴＣＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴ－３’、並びにＣＩＩＴＡ用のプライマーセットＦ：５’－ＣＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣ－３’及びＲ：５’－ＴＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴ－３’を用いて、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅した。ＴＩＤＥ分析の目的で、得られたＰＣＲ産物を清浄化し（ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、インデル頻度の予測のためにＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施した。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡノックアウトの確認後、核型分析及びＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により細胞をさらに特性決定した。ＰＳＣは多能性であることが判明し、ゲノム編集プロセスの間、正常な（４６、ＸＸ）核型を維持した。
第２ステップでは、ＣＤ４７遺伝子を合成し、ＤＮＡをＥＦ１ａプロモータ及びピューロマイシン耐性を有するプラスミドレンチウイルスにクローニングする。細胞を１×１０７ＴＵ／ｍＬ及び６μｇ／ｍＬのポリブレンのレンチウイルスストック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で形質導入した。形質導入後、培地を毎日取り替えた。形質導入から３日後、細胞を増殖させ、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択した。抗生物質選択から５日後、抗生物質耐性コロニーが出現し、これらをさらに増殖させて、安定したプールを作製した。ＣＤ４７のレベルをｑＰＣＲにより確認した。多能性アッセイ（ＴａｑＭａｎ ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及び核型分析を再度実施して、細胞の多能性ステータスを確認した。
実施例３：アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ）及びブタにおけるＨＩＰ細胞拒絶反応
１千万個の低免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇｉＰＳＣ由来の内皮細胞（ルシフェラーゼを発現する）をアカゲザルに皮下注射し、生物発光イメージングを用いて、細胞を長期追跡し；Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録商標）２００ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｌｍｅｄａ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２２７９９）を用いたインビボイメージングのために末梢血管から、１００ｍｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を各動物に静脈内注射した。本発明者らの移植前スクリーニングアッセイ及び検証試験によって、細胞が拒絶されることはなく、安定したＢＬＩシグナルが得られることを予測した。しかし、ＢＬＩシグナルは、６日目に減少し、１６日目までに検出されなくなった。加えて、注射部位に「瘤」が観察された（データは示していない）。同じサルから血液を採取したところ、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞（図１Ａ）、Ｂ細胞（ＤＳＡ；ドナー特異的抗体）、又はマクロファージ活性化（図１Ｂ）は観察されなかった。ＰＣＲによるサルの血液型判定によって、試験対象のサルは全て、血液型Ｂであることが確認された。従って、低免疫原性内皮細胞移植は、ＡＢＯ不適合であった（データは示していない）。これらの結果とは対照的に、非修飾ヒトｉＰＳＣ由来の内皮細胞をアカゲザル（Ｍａｃａｑｕｅ Ｒｈｅｓｕｓ）に移植すると、細胞の拒絶反応及び適応免疫応答の活性化が起こった（図２Ａ）。さらに、ＨＬＡ－Ｉ欠失／ＨＬＡ－ＩＩ欠失Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ヒトｉＰＳＣ由来の内皮細胞をサルに移植すると、細胞の拒絶反応及び自然免疫応答の活性化が起こった（図２Ｂ）。
実施例４：ＩｇＭ抗体は、ｈｉＰＳＣからの内皮細胞を殺傷した
アカゲザル血清と一緒にヒト低免疫原性内皮細胞をインキュベートすることにより、血液型拒絶反応を確認した。
ｈｉＥＣへのヒトｉＰＳＣの分化。６ウェルプレート内の希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｒｙ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５６２３１）にｈｉＰＳＣを平板培養し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２８５８５０１）中に維持した。分化を６０％密集度で開始し、培地を、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（いずれも、Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１８９５６０１）と５μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１２６３）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に取り替えた。２日目、低減培地：２％Ｂ－２７マイナスインスリンと２μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替えた。４日目から７日目まで、ＲＰＭＩ－１６４０ＥＣ培地（ＲＰＭＩ－１６４０、２％Ｂ－２７マイナスインスリン、５０ｎｇ ｍｌ／ｌのヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１００－２０）、１０ｎｇ ｍｌ－１ヒト線維芽細胞増殖因子（塩基性）（ＦＧＦｂ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１００－１８Ｂ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１０４９）、及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｒｅａｇｅｎｔｓｄｉｒｅｃｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１－Ａ９４）に細胞を暴露した。
７日目に内皮細胞クラスターが目視可能となり、１０％ウシ胎仔血清ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８２１４７）、２５ｎｇ ｍｌ－１ＶＥＧＦ、２ｎｇ ｍｌ－１ＦＧＦｂ、１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１μＭ ＳＢ４３１５４２を加えたＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ－３１６２）中に維持した。１４日後に分化プロセスを完了し、未分化細胞は分化プロセス中に分離した。精製のために、細胞を２０μＭ ＰｌｕｒｉＳｌｎ－１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７２８２４）で４８時間処理した。高度に精製したＥＣを、補充物質及び１０％ＦＣＳｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地中で培養した。細胞の継代培養のために、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを３～４日毎に１：３で使用した。
ヒト低免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ内皮細胞（血液型Ａ）をアカゲザル血清（血液型Ｂ）と一緒にインキュベートすると、細胞は直ちに殺傷された。細胞を殺傷した抗体型を抗体欠失分析により決定した。
ＩｇＭ欠失は、５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ０６３２）中で実施した。１０μｌのＤＴＴを９０μｌの血清と混合した。
ＩｇＧ欠失は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８８０３）を用いて実施した。ビーズを洗浄バッファーで洗浄した後、磁気により収集した。０．５ｍｇの洗浄済ビーズを１００μｌのアカゲザル血清と合わせ、１０分毎に穏やかに反転させながら、室温で６０分間インキュベートした。ビーズを磁気により分離してから、血清を新しいチューブに移し、使用するまで氷上に維持した。
ＩｇＭ又はＩｇＧ抗体のいずれかの欠失によって、ＡＢＯ－抗体がＩｇＭ型のものであることが判明した（図３）。また、ＨＩＰ由来心筋細胞及び成体心組織を用いたＩｇＭ又はＩｇＧ抗体の欠失により、血液型拒絶反応も同様に確認された（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３６０４４－１５－６２５、データは示していない）。
アカゲザル血液型Ｂ血清は、血液型Ａのヒトｗｔ ｉＥＣの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こす。血液型Ａ又はＯのヒトｗｔ ｉＰＳＣをｗｔ ｉＥＣに分化させた後、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）プラットフォーム上で血液型Ｂのアカゲザル由来の血清と一緒にインキュベートした。血液型Ａの分化ｉＥＣは急速に殺傷された（図２Ｃ）のに対し、血液型ＯのｉＥＣは影響を受けなかった（図２Ｄ）。抗Ａ抗体が、このアカゲザル１に検出された（臨床的に承認される凝集検査を用いて）ことから、Ａ血液型抗原を担持するｉＥＣは殺傷され、Ａ抗原を発現しないｉＥＣは生存した。
胚性幹細胞由来ＥＣは、ｉＰＳＣ由来のｉＥＣと同じＡＢＯ血液型依存性ＣＤＣを経る。ｉＰＳＣ由来のｉＥＣに見られるＡＢＯ血液型感受性が、ｉＰＳＣスターター細胞に固有であることを確認するために、Ｈ９ヒト胚性幹細胞株を使用した。ＥＳは、血液型Ａ、Ｒｈ＋を有するＨ９から分化させた。ｉＰＳＣ由来ｉＥＣで得られた観察結果と同様に、Ｈ９由来ＥＣは、ヒトＡＢＯ－不適合性血清（図２Ｅ）及びアカゲザルＡＢＯ－不適合性血清（データは示していない）と一緒にインキュベートすると、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプラットフォーム上でＣＤ殺傷を被った。
実施例５：ヒトＨＩＰ由来心筋細胞又は成熟心筋細胞は、血液群適合性異種血清曝露下で生き残る
ヒト細胞は、異種移植に際し、他の既存抗体に拒絶されなかった。ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－リーサスＣＤ４７ｔｇ由来の内皮細胞（血液型Ａ）は、ＡＢＯ－不適合性アカゲザル血清（血液型Ｂ）と一緒にインキュベートすると、殺傷された。しかし、血液型ＡＢのアカゲザルからの適合性血清を使用すると、ヒト細胞は生存した（図４）。従って、アカゲザルは、ヒト細胞に対して他の既存抗体を持たない。
ヒトｉＰＳＣは、ｈｉＣＭに分化されなかった。６ウェルプレート内の希釈ＭａｔｒｉｇｅｌにｈｉＰＳＣを平板培養し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に維持した。分化を９０％密集度で開始し、２％Ｂ－２７マイナスインスリンと６μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１を含有する５ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０に、培地を取り替えた。２日後、ＣＨＩＲなしで２％Ｂ－２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替えた。３日目に、５μｌのＩＷＲ１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ７０８６）を培地にさらに２日わたって添加した。５日後、再度２％Ｂ－２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替えて、４８時間放置した。７日目に、Ｂ２７と共にインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替え、その後３日毎に同じ培地と交換した。１０日目前後に、心筋細胞の自発的拍動を初めて目視することができた。分化から１０日後に心筋細胞の精製を実施した。手短には、培地を低グルコース培地に取り替えて、３日間維持した。１３日目に、Ｂ２７と共にインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を再度取り替えた。１４日目に、この手順を繰り返した。
ヒト低免疫原性ｉＰＳＣ由来心筋細胞（血液型Ａ）は、同種異系ヒト血清血液型Ａ及びＡＢと一緒にインキュベートされた場合、生存する。しかし、Ａに対する既存抗体（血液型Ｏ及びＢ）は、細胞を直ちに殺傷した（図５Ａ）。これらの結果を、成熟心筋細胞を用いて検証した。成熟心筋細胞（ＣＥＬＰＲＯＧＥＮから購入）（血液型Ａ）は、同種異系ＡＢＯ適合ヒト血清（血液型Ａ及びＡＢ）と一緒にインキュベートされると生存したが、Ａに対する既存抗体（血液型Ｏ及びＢ）を含む血清と一緒にインキュベートされると、殺傷された（図５ｂ）。
全ての血液型からのヒト内皮細胞と一緒にブタ血清（血液型Ａ）をインキュベートすることにより、翻訳分析を実施した。血液型Ｂ又はＡＢを有する細胞だけが殺傷された（データは示していない）。これによって、ヒト細胞は、ＡＢＯ不適合ブタに移植されると、超急性期に拒絶されることが確認される。
実施例６：肝細胞は、ＡＢＯ血液群不適合性血清曝露に対して生存することができない
細胞生存／殺傷をモニターするためのＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した場合、ヒト肝細胞（血液型Ａ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｃａｔ．Ｎｏ．４５４５４３）は、ＡＢＯ適合ヒト血清（血液型Ａ及びＡＢ）と一緒にインキュベートすると、生存するが、ＡＢＯ－不適合性ヒト血清（血液型Ｂ及びＯ；ＢｉｏＣｈｅｍｅｄ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）とインキュベートすると、殺傷された（図６）。同様に、血液型ＡＢであるヒト肝細胞は、ＡＢＯ適合ヒト血清（血液型ＡＢ）と一緒にインキュベートすると、生存したが、ＡＢＯ－不適合性ヒト血清（血液型Ａ、Ｂ、及びＯ）とインキュベートすると、殺傷された。
この実施例は、成熟及び分化肝細胞におけるＡＢＯ適合の重要性を証明している。
実施例７：感作血清中のリーサス因子の関連性
内皮細胞（血液型ＡＲｈ＋又は血液型ＡＲｈ－は、ＡＢＯ適合ヒト血清（血液型Ａ）と一緒にインキュベートしたとき、血清がＲｈについて不適合（Ｒｈ＋又はＲｈ－）であった場合でも、血清が、Ｒｈ因子抗原に対して事前に感作されていない限り、生存した（図７Ａ）。しかし、血液型ＡＲｈ＋又は血液型ＢＲｈ＋である内皮細胞を、ＡＢＯ－適合性（血液型ＡＢ）であるが、Ｒｈ不適合（Ｒｈ－）である血清と一緒にインキュベートしたとき、血清が、Ｒｈ抗原因子に対して事前に感作されており、抗Ｒｈ抗体を含有する場合、細胞は殺傷された（図７Ｂ）。低免疫原性内皮細胞（Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇ）（血液型ＡＲｈ＋）も、Ｒｈ－で、且つＲｈ抗原因子に対して事前に感作されており、抗Ｒｈ抗体を含有するＡＢＯ－適合性血清（血液型ＡＢ）と一緒にインキュベートすると、殺傷された。さらには、血液型ＯＲｈ＋である内皮細胞は、Ｒｈ因子に対して事前に感作されており、抗Ｒｈ抗体を含有するＯＲｈ－を用いた場合、殺傷された（図７Ｃ）。この実施例は、Ｒｈ－細胞の使用が、事前に感作された被験者への移植に重要となり得ることを証明している。
胚性幹細胞由来のＥＣは、ｉＰＳＣ由来ｉＥＣ及び一次ｗｔ ＥＣと同じＲｈ血液型依存性ＣＤＣを受ける。図７Ｄは、血液型ＡＲｈ＋のＨ９由来ＥＣを、Ｒｈ抗体含有のＡＢＯ－適合性血清と一緒にインキュベートすると、それらが、ＣＤＣ殺傷を受けたことを示す。
血液型ＯＲｈ－ＥＣは、ＡＢＯ－又はＲｈ－媒介性ＣＤＣを受けない。組織培養で増殖させたヒト胚性腎細胞由来の細胞株である、樹立されたＥＣ株ＨＥＫ２９３は、血液型ＯＲｈ－である。図７Ｅは、Ｒｈ抗体を含有する血清とインキュベートしたＨＥＫ２９３が、殺傷を受けなかったことを示す。
実施例８：ヒトＨＩＰＯ－細胞の作製
一部の実施形態では、スターター細胞としてＯＲｈ－多能性幹細胞を用い、本明細書に記載のＨＩＰ細胞作製プロトコルに従って、ＨＩＰＯ－細胞を作製する。従って、ＨＩＰ細胞は、ＨＩＰＯ－細胞である。
他の態様では、ＨＩＰＯ－細胞は、非普遍的血液群ｉＰＳＣ、ＥＳＣ又はＨＩＰ細胞から作製する。例えば、コーディング配列（遺伝子ＩＤ；２８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７５１６４ ＭＩＭ：１１０３００）のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ＡＢＯ遺伝子のノックアウト細胞株を作製することにより、血液型Ｂ－胚性又はｉＰＳＣ細胞株をＯ－に形質転換する。そのため、Ｂ遺伝子のコーディング配列をターゲティングするＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、Ｃａｓ９発現カセットを含むベクターに連結した後、ｈｉＰＳＣにトランスフェクトする。Ｔ７プロモータを含む線状化ＣＲＩＳＰＲ配列を用いて、キットの指示（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従い、ｇＲＮＡを合成する。次に、得られたインビトロ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡをＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔを用いて精製する。ＩＶＴｇＲＮＡを送達するために、Ｃａｓ９を安定して発現するｈｉＰＳＣへの、１，２００Ｖ、３０ｍｓ、１パルスを使用するＮｅｏｎエレクトロポレーション装置を用いて、３００ｎｇのＩＶＴｇＲＮＡで、細胞をエレクトロポレーションする。
エレクトロポレーションの後、編集ｈｉＰＳＣを単一細胞接種のために増殖し；ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、ｈｉＰＳＣ培養物を単一細胞に分離し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８共役抗ＴＲＡ－１６０ｍＡｂ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色する。ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を選別に使用し、前方及び側方光散乱特性に対する選択的ゲーティングにより、接種からダブレット及び残屑を除去する。ヨウ化プロピジウムの非存在、及びＴｒａ１－６０染色の存在に基づいて、生存多能性細胞を選択する。次に、単一細胞をフルサイズコロニーに増殖させた後、シーケンシングにより、コロニーをＣＲＩＳＰＲ編集について検査する。
初期編集プールの検査のために、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＣＲＩＳＰＲ媒介切断を評価する。単離クローンをスクリーニングするために、ゲノムＤＮＡを１×１０６個のｈｉＰＳＣから単離し、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＢゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅する。ＴＩＤＥ分析の目的で、得られたＰＣＲ産物を清浄化し（ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、インデル頻度の予測のためにＳａｎｇｅｒシーケンシングを実施する。Ｂ破壊の確認後、核型分析及びＴａｑＭａｎ ｈｉＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、細胞をさらに特性決定する。
別の例は、Ｏｒｈ＋細胞株を使用し、前述したＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９技術（ＲＨＡＧ ｇＲＮＡ配列：ＣＣＡＧＴＧＧＧＧＣＡＣＴＡＴＴＧＴＡＣ）を用いて、ＲＨＡＧ（Ｒｈ－関連糖タンパク質；アンモニウム輸送；ＲｈＤに関連；染色体６ｐ２１－ｑｔｅｒ）を欠失させることにより、上記細胞株をＯｒｈ－細胞株に形質転換するものである。
実施例９：ヒトＨＩＰＯ－細胞の分化
１．ヒト心筋細胞へのｈＨＩＰＯ－細胞の分化
これは、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１５ ｄｏｉ：１０．３７９１／５２６２８（その全体を、特に、細胞を分化させる技術について、参照により本明細書に組み込む）から改変したプロトコルを用いて実施する。６ウェルプレート内の希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨＩＰＯ－細胞を平板培養し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に維持する。細胞が、９０％密集度に達した後、分化を開始し、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（いずれも、Ｇｉｂｃｏ）と６μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ）を含有する５ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０に、培地を取り替える。２日後、ＣＨＩＲなしの２％Ｂ－２７マイナスインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替える。３日目に、５ｕＬのＩＷＲ１を、培地にさらに２日わたって添加する。５日目に、再度２％Ｂ－２７マイナスインスリン培地を含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替えて、４８時間インキュベートする。７日目に、Ｂ２７と共にインスリン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替え、その後３日毎に同じ培地と交換する。約１０～１２日目に、心筋細胞の自発的拍動が初めて目視され得る。分化から１０日後に心筋細胞の精製を実施する。手短には、培地を低グルコース培地に取り替えて、３日間維持する。１３日目に、Ｂ２７と共にインスリンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に培地を取り替える。１４日目に、この手順を繰り返す。残った細胞は、高度に精製された心筋細胞である。
２．ヒト内皮細胞へのＨＩＰＯ－細胞の分化
６ウェルプレート内の希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（３５６２３１，Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＨＩＰＯ－細胞を平板培養し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に維持する。細胞が、６０％密集度に達した後、分化を開始し、培地を、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（いずれも、Ｇｉｂｃｏ）と５μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に取り替える。２日目に、低減培地：２％Ｂ－２７マイナスインスリン（いずれも、Ｇｉｂｃｏ）と２μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０に、培地を取り替える。４日目から７日目まで、ＲＰＭＩ ＥＣ培地、即ち、２％Ｂ－２７マイナスインスリンに加えて、５０ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（塩基性）（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ１６４０に細胞を暴露する。７日目から内皮細胞クラスターを目視することができ、１０％ＦＣＳｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｎｇ／ｍＬの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）、２ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子（塩基性）（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び１μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｇ）中に細胞を維持する。１４日後に分化プロセスを完了すると考えられ、分化プロセス中に未分化細胞が分離する。精製のために、ＣＤ３１マイクロビーズ（Ｍｉｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、細胞をＭＡＣＳプログレスに通過させる。高度に精製されたＥＣ細胞を、補充物質及び１０％ＦＣＳｈｉ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＥＧＭ－２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｇ）中で培養する。細胞の継代培養のために、ＴｒｙｐＬＥを３～４日毎に１：３で使用する。
ＩＸ．例示的な配列：
配列番号１－ヒトβ－２マイクログロブリン
Figure 2022532174000001
配列番号２－ヒトＣＩＩＴＡタンパク質、１６０アミノ酸Ｎ末端
Figure 2022532174000002
配列番号３－ヒトＣＤ４７
Figure 2022532174000003
配列番号４－単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ）チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）
Figure 2022532174000004
配列番号５－大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）
Figure 2022532174000005
配列番号６－短縮ヒトカスパーゼ９
Figure 2022532174000006
本明細書に開示又は参照される刊行物及び特許文献は全て、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上の記載内容は、あくまでも例示及び説明の目的で提供されている。この記載内容は、本発明を、開示される具体的な形態に限定することを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定められることが意図される。

Claims (123)

  1. 修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞であって、前記細胞が、ＡＢＯ血液群Ｏ型及びリーサス因子陰性（Ｒｈ－）であり、前記細胞が、（ａ）Ａ１、Ａ２、及びＢからなる群から選択されるＡＢＯ血液群抗原が低減若しくは排除されており；並びに／又は（ｂ）Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、ＭＮＳ抗原Ｕ、及びＭＮＳ抗原Ｓからなる群から選択されるＲｈタンパク質抗原発現が低減若しくは排除されている、修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  2. 修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞であって、（ａ）Ａ１、Ａ２、及びＢからなる群から選択される１つ若しくは複数のＡＢＯ血液群抗原の抗原性を低減若しくは排除して、前記細胞をＡＢＯ血液群Ｏ型にする修飾；並びに／又は（ｂ）Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、ＭＮＳ抗原Ｕ、及びＭＮＳ抗原Ｓからなる群から選択される１つ若しくは複数のＲｈ抗原の抗原性を低減若しくは排除して、前記細胞をＲｈ－にする修飾を含む、修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  3. 前記細胞が、以下：
    ａ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能；
    ｂ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能；及び
    ｃ．ＮＫ細胞殺傷に対する感受性を低減する、増大したＣＤ４７機能
    を含む低免疫原性（ＨＩＰ）多能性細胞である、請求項１又は２に記載の修飾多能性細胞。
  4. 修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞であって、前記細胞が、ＨＬＡ－Ｉヒト白血球抗原、ＨＬＡ－ＩＩヒト白血球抗原、ＣＤ４７、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃｌ－阻害因子、ＩＬ－３５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮ Ｂ９、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／又は野生型幹細胞に関連するＩＦＮγＲ１ｄ３９のうち１つ若しくは複数の、モジュレートされた発現を含み、ここで、前記細胞は、ＡＢＯ血液群Ｏ型又はリーサス因子陰性（Ｒｈ－）である、修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  5. 修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞であって、前記細胞が、以下：
    ａ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラス（ＨＬＡ－Ｉ）機能；
    ｂ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラス（ＨＬＡ－ＩＩ）機能；
    ｃ．ＮＫ細胞殺傷に対する感受性を低減する、増大したＣＤ４７機能；
    ｄ．ＡＢＯ血液群Ｏ型（Ｏ）；並びに
    ｅ．任意選択で、リーサス因子陰性（Ｒｈ－）血液型
    を含む、Ｏ－低免疫原性多能性（ＨＩＰＯ－）細胞である、修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  6. 前記細胞が、Ｏ－人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣＯ－）、Ｏ－胚性幹細胞（ＥＳＣＯ－）、Ｏ－内皮細胞、Ｏ－心筋細胞、Ｏ－肝細胞、Ｏ－ドーパミン作動性ニューロン、Ｏ－膵島細胞、Ｏ－網膜色素内皮細胞、並びに、Ｏ－キメラ抗原受容体（Ｏ－ＣＡＲ）細胞を含め、移植及び医学的療法に用いられるその他のＯ－細胞型から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  7. 前記Ｏ－ＣＡＲ細胞が、Ｏ－キメラ抗原受容体Ｔ（Ｏ－ＣＡＲ－Ｔ）細胞である、請求項６に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  8. 前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、低減したＡＢＯ血液群タンパク質発現によって得られる、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  9. 前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、前記ＡＢＯ遺伝子のヒトエキソン７の破壊によって得られる、請求項８に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  10. 前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、前記細胞の表面でのＡＢＯ遺伝子産物の酵素修飾によって得られる、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  11. 前記酵素修飾が、前記ＡＢＯ遺伝子産物から炭水化物を除去する、請求項１０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  12. 前記酵素修飾が、ＡＢＯ Ａ１抗原、Ａ２抗原、及び／又はＢ抗原から炭水化物を除去する、請求項１０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  13. 前記Ｒｈ－が、低減したＲｈタンパク質発現によって得られる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  14. 前記Ｒｈ－が、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、ＤｕｆｆｙＦｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１遺伝子の破壊によって得られる、請求項１３に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  15. 前記ＡＢＯ血液群型が、内因的にＯ型である、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  16. 前記Ｒｈ－血液型が、内因的にＲｈ－型である、請求項１～７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  17. 前記ＨＬＡ－Ｉ機能が、β－２マイクログロブリンタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～１６のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  18. 前記β－２マイクログロブリンタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項１７に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  19. 前記ＨＬＡ－Ｉ機能が、ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～１６のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  20. 前記ＨＬＡ－Ａタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項１９に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  21. 前記ＨＬＡ－Ｉ機能が、ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～１６のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  22. 前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項２１に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  23. 前記ＨＬＡ－Ｉ機能が、ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～１６のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  24. 前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項２３に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  25. 前記ＨＩＰＯ－細胞が、ＨＬＡ－Ｉ機能を含まない、請求項３～２４のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  26. 前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～２５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  27. 前記ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項２６に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  28. 前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～２５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  29. 前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項２８に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  30. 前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～２５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  31. 前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項３０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  32. 前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現の低減によって低減される、請求項３～２５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  33. 前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされる、請求項３２に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  34. 前記低免疫原性多能性細胞が、ＨＬＡ－ＩＩ機能を含まない、請求項３～３３のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  35. ＮＫ細胞殺傷に対する前記低減した感受性が、ＣＤ４７タンパク質の増大した発現に起因する、請求項３～３４のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  36. 前記増大したＣＤ４７タンパク質発現が、内在性ＣＤ４７遺伝子座への修飾によって得られる、請求項３５に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  37. 前記増大したＣＤ４７タンパク質発現が、ＣＤ４７トランスジーンから得られる、請求項３５に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  38. 前記ＣＤ４７タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  39. 前記ＣＤ４７タンパク質が、前記配列番号３の配列を有する、請求項３８に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  40. 前記低免疫原性多能性細胞を死滅させるトリガーによって活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項３～３９のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  41. 前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、前記トリガーが、ガンシクロビルである、請求項４０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  42. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項４１に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  43. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする、請求項４２に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  44. 前記自殺遺伝子が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、前記トリガーが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である、請求項４０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  45. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子が、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項４４に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  46. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子が、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする、請求項４５に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  47. 前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼタンパク質をコードし、前記トリガーが、タンパク質二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項４０に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  48. 前記遺伝子が、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項４７に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  49. 前記遺伝子が、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項４８に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  50. 前記ＣＩＤが、ＡＰ１９０３である、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  51. 細胞が、以下：Ｏ－キメラ抗原受容体（Ｏ－ＣＡＲ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、心細胞、膵島細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項３～５０のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞に由来する、細胞。
  52. 前記Ｏ－ＣＡＲ細胞が、Ｏ－ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項５１に記載の細胞。
  53. 前記修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞が、心筋細胞又は心筋細胞前駆細胞である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  54. ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４遺伝子の低減若しくは排除された発現をさらに含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  55. ＮＬＲＣ５遺伝子の発現を低減又は排除することをさらに含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  56. 以下：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、Ｃｌ－阻害因子、及びＩＬ－３５からなる群から選択される遺伝子の少なくとも１つの修飾発現をさらに含む、請求項１～５５のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  57. 以下：ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、及びＩＲＦ－１から選択される少なくとも１つの遺伝子の修飾発現をさらに含む、請求項１～５６のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  58. 以下：ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＡＬＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＣＣＲ５、及びＡＰＯＣ３からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の修飾された発現をさらに含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  59. 以下：ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮ Ｂ９からなる群から選択される少なくとも１つのトランスジーン、又は以下：ＰＤＬ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、若しくはＳＥＲＰＩＮ９のアゴニストをコードする少なくとも１つのトランスジーンをさらに含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  60. 以下：ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及びＩＦＮγＲ１ ｄ３９からなる群から選択される少なくとも１つのトランスジーン、又は以下：ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、若しくはＩＦＮγＲ１ ｄ３９のアゴニストをコードする少なくとも１つのトランスジーンをさらに含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞又はそれに由来する細胞。
  61. 細胞を移植する方法であって、請求項１～６０のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞に由来する１つ若しくは複数の細胞を、それを必要とする被験者に投与するステップを含み、ここで、前記被験者が、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモットである方法。
  62. 前記修飾多能性細胞由来の前記細胞が、以下：Ｏ－ＣＡＲ細胞、Ｏ－内皮細胞、Ｏ－ドーパミン作動性ニューロン、Ｏ－心細胞、Ｏ－膵島細胞、及びＯ－網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. 移植細胞を必要とする患者の疾患を治療する方法であって、前記患者に、請求項１～６０のいずれか１項に記載の修飾多能性細胞由来の細胞を投与するステップを含む方法。
  64. 前記修飾多能性細胞由来の前記細胞が、Ｏ－ＣＡＲ細胞、Ｏ－内皮細胞、Ｏ－ドーパミン作動性ニューロン、Ｏ－心細胞、Ｏ－膵島細胞、及びＯ－網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記疾患が、Ｉ型糖尿病、心臓疾患、神経系疾患、癌、眼病、及び血管疾患からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  66. Ｏ－ではない多能性細胞から、ＡＢＯ血液型Ｏ及びＲｈ因子陰性（Ｒｈ－）である修飾多能性細胞を作製する方法であって、以下：
    ａ．いずれかのＡＢＯ血液群抗原Ａ１、Ａ２、及び／若しくはＢの発現を排除又は低減して、ＡＢＯ血液型Ｏを付与するステップ；並びに／又は
    ｂ．リーサス因子（Ｒｈ）血液群抗原の発現を排除又は低減して、血液型Ｒｈ陰性（－）を付与するステップ
    を含む方法。
  67. Ｏ－多能性細胞に由来する、低免疫原性多能性ＡＢＯ血液型Ｏ Ｒｈ因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞を作製する方法であって、以下：
    ａ．非修飾多能性細胞と比較して、主要組織適合性抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能を排除するステップ；
    ｂ．非修飾多能性細胞と比較して、主要組織適合性抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能を排除するステップ；及び
    ｃ．非修飾多能性細胞と比較して、ＣＤ４７の発現を増大するステップ
    を含む方法。
  68. 前記多能性細胞が、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモット由来である、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、ＡＢＯ血液群タンパク質発現の排除によって得られる、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記細胞が、内因的にＯ型である、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記多能性細胞が、ヒト由来であり、前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、前記ＡＢＯ遺伝子のヒトエキソン７の破壊によって得られる、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記ＡＢＯ遺伝子の前記ヒトエキソン７の破壊が、前記エキソン７の両対立遺伝子を破壊する、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応によって達成される、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ＡＢＯ血液群Ｏ型が、前記多能性細胞の表面上のＡＢＯ遺伝子産物の酵素修飾によって得られる、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記酵素修飾が、前記ＡＢＯ遺伝子産物から炭水化物を除去する、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記酵素修飾が、ＡＢＯ Ａ１抗原、Ａ２抗原、及び／又はＢ抗原から炭水化物を除去する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記細胞が、内因的にＲｈ－である、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  77. Ｒｈタンパク質発現の排除を含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記Ｒｈ－型が、以下：Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１をコードする遺伝子を破壊することによって得られる、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記破壊が、前記遺伝子の両対立遺伝子を破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応によって達成される、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記増大したＣＤ４７発現が、プロモータの制御下で、前記親細胞にヒトＣＤ４７の少なくとも１つのコピーを導入することによって達成される、請求項６７～６９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記プロモータが、構成性プロモータである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両対立遺伝子の破壊（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９反応を用いて）を含む、請求項６７～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記ＨＬＡ－Ｉ機能が、β－２マイクログロブリンタンパク質の発現を低減することにより低減される、請求項６７～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記β－２マイクログロブリンタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記β－２マイクログロブリンタンパク質の発現が低減される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記β－２マイクログロブリンタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記β－２マイクログロブリンタンパク質が、前記配列番号１の配列を有する、請求項８５に記載の方法。
  87. ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－Ｉ機能が低減される、請求項６７～８１のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記ＨＬＡ－Ａタンパク質コードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低減される、請求項８７に記載の方法。
  89. ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－Ｉ機能が低減される、請求項６７～８１のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現が低減される、請求項８９に記載の方法。
  91. ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－Ｉ機能が低減される、請求項６７～８１のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現が低減される、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記低免疫原性多能性細胞が、ＨＬＡ－Ｉ機能を含まない、請求項６７～９２のいずれか１項に記載の方法。
  94. ＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が低減される、請求項６７～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が低減される、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記ＣＩＩＴＡタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ＣＩＩＴＡタンパク質が、前記配列番号２の配列を有する、請求項９６に記載の方法。
  98. ＣＩＩＴＡ遺伝子の両対立遺伝子を破壊するＣＲＩＳＰＲ反応により、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低減するステップを含む、請求項６７～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が低減される、請求項６７～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現が低減される、請求項９９に記載の方法。
  101. ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が低減される、請求項６７～９８のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現が低減される、請求項１０１に記載の方法。
  103. ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低減することにより、前記ＨＬＡ－ＩＩ機能が低減される、請求項６７～９８のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより、前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現が低減される、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記低免疫原性多能性細胞が、ＨＬＡ－ＩＩ機能を含まない、請求項６７～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記ＣＤ４７の増大した発現が、ＣＤ４７タンパク質をコードするトランスジーンの発現に起因する、請求項６７～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記ＣＤ４７タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記ＣＤ４７タンパク質が、前記配列番号３の配列を有する、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記低免疫原性多能性細胞を死滅させるトリガーによって活性化される自殺遺伝子を発現させるステップをさらに含む、請求項６７～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、前記トリガーが、ガンシクロビルである、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子が、前記配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記自殺遺伝子が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、前記トリガーが、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である、請求項１０９に記載の方法。
  114. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子が、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子が、前記配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼタンパク質であり、前記トリガーが、特定のタンパク質二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１０９に記載の方法。
  117. 前記遺伝子が、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記遺伝子が、前記配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記ＣＩＤが、ＡＰ１９０３である、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞又はそれに由来する細胞を、それを必要とする被験者に移植する方法であって、以下：前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞のＡＢＯ血液群型を判定するステップ、前記被験者のＡＢＯ血液群型を判定するステップ、及び前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞の前記ＡＢＯ血液群型が、前記被験者の前記ＡＢＯ血液群型と適合する場合に限り、前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞を移植するステップを含む方法。
  121. さらに以下：前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞のリーサス（Ｒｈ）因子型を判定するステップ、前記被験者のＲｈ因子型を判定するステップ、及び前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞の前記Ｒｈ血液型が、前記被験者の前記Ｒｈ血液型と適合する場合に限り、前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞を移植するステップを含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記ＨＩＰ細胞又はそれに由来する細胞が、以下：
    ａ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能；
    ｂ．非修飾多能性細胞と比較して、低減した内在性主要組織適合性抗原クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能；及び
    ｃ．ＮＫ細胞殺傷に対する感受性を低減する、増大したＣＤ４７機能
    を含む、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  123. 前記ＨＩＰ細胞に由来する前記細胞が、心筋細胞又は心筋前駆細胞である、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
JP2021566507A 2019-05-10 2020-05-09 修飾多能性細胞 Pending JP2022532174A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962846399P 2019-05-10 2019-05-10
US62/846,399 2019-05-10
US201962855499P 2019-05-31 2019-05-31
US62/855,499 2019-05-31
PCT/US2020/032272 WO2020231882A2 (en) 2019-05-10 2020-05-09 Modified pluripotent cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022532174A true JP2022532174A (ja) 2022-07-13
JPWO2020231882A5 JPWO2020231882A5 (ja) 2023-07-11

Family

ID=73047143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021566507A Pending JP2022532174A (ja) 2019-05-10 2020-05-09 修飾多能性細胞

Country Status (12)

Country Link
US (2) US12221622B2 (ja)
EP (1) EP3966316A4 (ja)
JP (1) JP2022532174A (ja)
KR (1) KR20220007093A (ja)
CN (1) CN113811362A (ja)
AU (1) AU2020274027A1 (ja)
BR (1) BR112021022458A2 (ja)
CA (1) CA3138597A1 (ja)
IL (1) IL287553B2 (ja)
MX (1) MX2021013713A (ja)
SG (1) SG11202112506SA (ja)
WO (1) WO2020231882A2 (ja)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019008413A (es) * 2017-01-13 2019-09-13 Univ California Celulas pluripotentes inmunodiseñadas.
AU2021207810A1 (en) * 2020-01-13 2022-08-04 Sana Biotechnology, Inc. Modification of blood type antigens
EP4585223A2 (en) * 2020-01-15 2025-07-16 The Regents of the University of California Transplanted cell protection via inhibition of polymorphonuclear cells
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
IL303269A (en) 2020-12-03 2023-07-01 Century Therapeutics Inc Genetically engineered cells and uses thereof
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
US11473060B2 (en) 2020-12-30 2022-10-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells
IL303473A (en) 2020-12-31 2023-08-01 Sana Biotechnology Inc Methods and compositions for modulating car-t activity
CN117177749A (zh) 2021-03-03 2023-12-05 萨那生物科技公司 与心肌细胞疗法一起使用的免疫抑制疗法以及相关的方法和组合物
EP4304662A4 (en) * 2021-03-08 2025-06-18 The Regents of the University of California Lentivirus protection via fc overexpression
AU2022256513A1 (en) * 2021-04-16 2023-11-02 Beam Therapeutics Inc. Genetic modification of hepatocytes
AU2022277931A1 (en) * 2021-05-19 2023-11-30 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic rhd negative primary t cells
US20230014010A1 (en) * 2021-06-23 2023-01-19 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
WO2023109941A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Gracell Biotechnologies (Shanghai) Co., Ltd. Cell modification
WO2024012420A1 (zh) * 2022-07-11 2024-01-18 士泽生物医药（苏州）有限公司 一种表达faslg的通用型细胞及其制备方法
AU2023356353A1 (en) * 2022-10-05 2025-05-08 Garuda Therapeutics, Inc. Modified hematopoietic stem cells and progenies thereof
WO2024092015A1 (en) * 2022-10-25 2024-05-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Adhesion molecule inhibition for stem cell therapies
CN118207165A (zh) * 2022-12-07 2024-06-18 士泽生物医药（苏州）有限公司 一种表达stc1的通用型细胞及其制备方法
GB202218755D0 (en) * 2022-12-13 2023-01-25 Replay Holdings Llc Compositions and methods for non-immunogenicity
WO2024238938A1 (en) * 2023-05-18 2024-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modulation of the btla-hvem axis to enhance adoptive cell transfer immunotherapy
WO2025064822A2 (en) * 2023-09-20 2025-03-27 Factor Bioscience Inc. Cells and methods for engineering cells with persistent transgene expression

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4427777A (en) 1980-08-14 1984-01-24 New York Blood Center, Inc. Enzymatic conversion of red cells for transfusion
US4609627A (en) 1983-08-01 1986-09-02 New York Blood Center, Inc. Enzymatic conversion of certain sub-type A and AB erythrocytes
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
US5633130A (en) 1994-09-08 1997-05-27 The Curators Of The University Of Missouri Buffer system for increasing seroconversion efficiency
US5606042A (en) 1994-09-08 1997-02-25 The Curators Of The University Of Missouri Glycine α-D-galactosidases
DE19539493A1 (de) 1995-10-24 1997-04-30 Thomae Gmbh Dr K Starker homologer Promotor aus Hamster
US6184017B1 (en) 1996-05-08 2001-02-06 The Curators Of The University Of Missouri Glycine and phaseolus α-D-galactosidases
AU1298699A (en) 1997-11-03 1999-05-24 Curators Of The University Of Missouri, The Alpha-n-acetylgalactosaminidase from (clostridium perfringens)
US7223729B2 (en) 1997-11-07 2007-05-29 Trillium Therapeutics Inc. Methods of treating allergy by administering a CD200 protein
US7413904B2 (en) 1998-10-23 2008-08-19 Geron Corporation Human embryonic stem cells having genetic modifications
WO2002102997A2 (en) 2000-11-30 2002-12-27 Stemron Inc. Isolated homozygous stem cells differentiated cells derived therefrom and materials and methods for making and using same
US20030125273A1 (en) * 2001-12-05 2003-07-03 Isis Pharmaceuticals Inc, Antisense modulation of MHC class II transactivator expression
CA2432527A1 (en) 2000-12-22 2002-07-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Medicinal compositions for oral use
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US20040053836A1 (en) 2002-04-22 2004-03-18 Philipp Mayer-Kuckuk Method for modulating the production of a selected protein in vivo
US20040091936A1 (en) 2002-05-24 2004-05-13 Michael West Bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank
CA2505598A1 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Advanced Cell Technology, Inc. A bank of stem cells for transplantation
CA2488876A1 (en) 2002-06-13 2003-12-24 Oregon Health & Science University Activating mutations of platelet derived growth factor receptor alpha (pdgfra) as diagnostic markers and therapeutic targets
US8236771B2 (en) * 2004-05-18 2012-08-07 National Institute Of Transplantation Foundation Vectors and methods for long-term immune evasion to prolong transplant viability
EP1765870A2 (en) 2004-06-03 2007-03-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to fc gamma receptor i (cd64)
ES2530637T3 (es) 2006-03-02 2015-03-04 Alexion Pharma Inc Prolongación de la supervivencia de un aloinjerto por inhibición de la actividad del complemento
US20070274967A1 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Calvin Cao Compositions and methods of treating burn victims using stem cells
CA2720863A1 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 The University Of British Columbia Methods of diagnosing acute cardiac allograft rejection
US8247327B2 (en) 2008-07-30 2012-08-21 Cabot Microelectronics Corporation Methods and compositions for polishing silicon-containing substrates
US8796443B2 (en) 2008-09-22 2014-08-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
DK2438160T3 (en) 2009-06-05 2016-01-11 Cellular Dynamics Int Inc Reprogramming of T cells and hematopoietic cells
ES2927646T3 (es) 2009-09-15 2022-11-08 Univ Leland Stanford Junior Terapia anti-CD47 sinérgica para cánceres hematológicos
US9089520B2 (en) * 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
DK2838548T5 (en) 2012-04-17 2024-08-05 Univ Washington Through Its Center For Commercialization Hla class ii deficient cells, hla class i deficient cells capable of expressing hla class ii proteins, and uses thereof
WO2014165663A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
DK3004329T3 (da) 2013-06-05 2020-05-18 Bellicum Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåder til induktion af delvis apoptose under anvendelse af caspasepolypeptider
KR101696874B1 (ko) 2013-07-31 2017-01-16 한국생명공학연구원 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법
RU2557327C2 (ru) 2013-08-01 2015-07-20 Акционерное общество "Государственный научный центр Российской Федерации Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований" (АО "ГНЦ РФ ТРИНИТИ") Газоразрядный эксимерный лазер (варианты)
WO2015042356A1 (en) 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
JP6702866B2 (ja) 2013-11-18 2020-06-03 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 合成膜−レシーバー複合体
EP3114217A4 (en) 2014-03-07 2017-09-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
CA2945393C (en) * 2014-04-24 2021-03-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
WO2016034679A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Drk Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen Ggmbh Micro rna for the suppression of blood group antigens
US10725041B2 (en) * 2014-11-04 2020-07-28 Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. Method to bioengineer designer platelets using gene editing and stem cell methodologies
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
MX2017011418A (es) 2015-03-11 2017-12-14 Cellectis Metodos para manipular geneticamente celula t alogenica para aumentar su persistencia y/o injerto en pacientes.
WO2016146143A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
CA2988854A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
PT3344758T (pt) 2015-09-01 2021-10-28 Ncardia B V Um método in vitro para diferenciação de uma população de células estaminais pluripotentes humanas numa população de células de cardiomiócitos
GB201518136D0 (en) 2015-10-14 2015-11-25 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel chimeric antigen receptors
EP3367785A4 (en) 2015-10-27 2019-08-14 Regents of the University of Minnesota COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHIMERIC EMBRYO-ASSISTED ORGAN PRODUCTION
ES2953925T3 (es) 2015-11-04 2023-11-17 Fate Therapeutics Inc Ingeniería genómica de células pluripotentes
WO2017127755A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
US10257393B2 (en) 2016-02-12 2019-04-09 Contrast, Inc. Devices and methods for high dynamic range video
MX2019008413A (es) * 2017-01-13 2019-09-13 Univ California Celulas pluripotentes inmunodiseñadas.
JP2020506943A (ja) 2017-02-07 2020-03-05 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 養子免疫療法における抗原特異的ｔ細胞と組み合わせた免疫チェックポイント調節剤の使用
JP2020515246A (ja) 2017-03-14 2020-05-28 オリジェン， インコーポレイテッド ｉＰＳＣのＨＬＡによってインデックスされたリポジトリおよびｉＰＳＣ由来の幹細胞、ならびに関連するシステムおよび方法
WO2018227286A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Sinai Health System Allograft tolerance without the need for systemic immune suppression
TW201912789A (zh) 2017-09-01 2019-04-01 美商歐瑞３恩公司 ｉＰＳＣ－衍生分泌蛋白體組合物及相關的系統及方法
CN111556756A (zh) 2017-10-26 2020-08-18 明尼苏达大学董事会 重组免疫细胞、制备方法和使用方法
CN108048484B (zh) 2017-11-14 2021-07-06 海南一龄医疗产业发展有限公司 诱导性多能干细胞及其制备方法和应用
WO2019097083A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Tessa Therapeutics Pte. Ltd. Modified k562 cell
SG11202004581PA (en) 2017-11-21 2020-06-29 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
US20190201548A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for engineering erythroid cells
TWI708787B (zh) 2018-03-02 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 Pd-1促效劑抗體及其用途
EP3762002A4 (en) 2018-03-09 2022-03-16 Biohm Health LLC COMPOSITIONS TO BE USED TO BALANCE THE MICROBIOME
US20200109364A1 (en) 2018-05-31 2020-04-09 Washington University Methods for genome-editing and activation of cells
CA3109078A1 (en) 2018-07-17 2020-01-23 The Regents Of The University Of California Cells differentiated from immunoengineered pluripotent cells
EP3824075A4 (en) 2018-07-17 2022-04-20 The Regents of The University of California T LYMPHOCYTES CHEMERA ANTIGEN RECEPTORS DERIVED FROM PLURIPOTEN STEM CELLS OBTAINED BY GENETIC ENGINEERING
AU2020265741A1 (en) 2019-05-01 2021-11-25 Editas Medicine, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods
CN113784732B (zh) 2019-05-07 2024-03-22 亘喜生物科技（上海）有限公司 靶向bcma的工程化免疫细胞及其用途
US11162079B2 (en) * 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
CA3154076A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 Tobias Deuse Transplanted cell protection via fc sequestration
AU2021207810A1 (en) * 2020-01-13 2022-08-04 Sana Biotechnology, Inc. Modification of blood type antigens
EP4585223A2 (en) * 2020-01-15 2025-07-16 The Regents of the University of California Transplanted cell protection via inhibition of polymorphonuclear cells

Also Published As

Publication number Publication date
CA3138597A1 (en) 2020-11-19
AU2020274027A1 (en) 2021-11-11
WO2020231882A2 (en) 2020-11-19
IL287553B1 (en) 2023-04-01
BR112021022458A2 (pt) 2021-12-28
US20200354673A1 (en) 2020-11-12
US12221622B2 (en) 2025-02-11
US20220213434A1 (en) 2022-07-07
EP3966316A4 (en) 2023-01-25
WO2020231882A3 (en) 2020-12-24
MX2021013713A (es) 2021-12-10
IL287553A (en) 2021-12-01
CN113811362A (zh) 2021-12-17
KR20220007093A (ko) 2022-01-18
IL287553B2 (en) 2023-08-01
SG11202112506SA (en) 2021-12-30
EP3966316A2 (en) 2022-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12221622B2 (en) Modified pluripotent cells
US20230348862A1 (en) Immunoengineered pluripotent cells
JP2021530999A (ja) 免疫改変多能性幹細胞由来のキメラ抗原受容体ｔ細胞
US11162079B2 (en) Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
KR20230074718A (ko) 저면역원성 세포로 감작된 환자를 치료하는 방법 및 관련 방법 및 조성물
US20240091274A1 (en) TRANSPLANTED CELL PROTECTION VIA Fc SEQUESTRATION
JP2025513879A (ja) 免疫チェックポイントエンゲージャーによる免疫細胞の抑制
US20240325536A1 (en) TRANSPLANTED CELL PROTECTION VIA MODIFIED Fc RECEPTORS
CN117279651A (zh) 通过修饰的Fc受体的移植细胞保护

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230509

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230509

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230628

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240514

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240813

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240925

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241113

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20250212

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250611