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JP2022528061A - 抗クローディン１８．２抗体及びその用途 - Google Patents

抗クローディン１８．２抗体及びその用途 Download PDF

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JP2022528061A JP2021557129A JP2021557129A JP2022528061A JP 2022528061 A JP2022528061 A JP 2022528061A JP 2021557129 A JP2021557129 A JP 2021557129A JP 2021557129 A JP2021557129 A JP 2021557129A JP 2022528061 A JP2022528061 A JP 2022528061A
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Abstract

Figure 2022528061000001
本開示は、抗クローディン18.2抗体及びその適用に関する。具体的には、本発明は、抗クローディン18.2抗体、抗クローディン18.2抗体のCDRを含むマウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびそれらの抗原結合フラグメント、並びに医薬としてのそれらの使用に関する。特に、本開示は、クローディン18.2陽性疾患または障害を治療するための薬の調製における抗クローディン18.2抗体の使用に関する。
【選択図】図１

Description

優先権の主張
本出願は、2019年4月1日に出願された特許出願201910257853.6の優先権を主張する。この特許出願は、その全体としてここに含まれる。
本開示は、抗菌薬の分野に関するものである。具体的には、本開示は、クローディン18.2の抗生物質及びそれらの用途に関する。
本説明は、本開示に関する背景情報のみを提供するものであり、必ずしも先行技術を構成するものではない。
クラウジン‐18(CLDN18)はヒトClaudin18遺伝子によりコードされる蛋白質であり、細胞内のタイトジャンクション蛋白質ファミリーに属する。Claudin-18は細胞の層間の分子の流れを制御することができる。
クラウジン‐18蛋白質は構造的に4つの膜貫通領域と2つの細胞外ループを含み、N末端とC末端は細胞質内部に存在する。Claudin-18には2つのスプライシングバリアント、Claudin 18.1とClaudin 18.2がある。2つの配列は、最初の細胞外ループの8個のアミノ酸だけが互いに異なっている。Claudin 18.1はClaudin 18.2とは異なった発現と分布をしている。Claudin 18.1は正常肺細胞に選択的に発現するが、Claudin 18.2の発現は正常細胞では高度に限定されているが、異所性に活性化され、種々の腫瘍(胃癌、肺がん、膵癌など)で過剰発現することが多い。クラウジン18.2は、胃癌および他のタイプの癌の電位治療標的と考えられている。この標的の発見は、胃癌治療の新たな選択肢にもなる。
本開示は、抗クローディン18.2の抗クローディンを提供する。
幾つかの実施例において、上述のような反クラウジン18.2のAnti-Claudin bidは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、以下のようなものである。
i) 重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 3に示されている重鎖可変領域のものと同じHDR1、HDR2、HDR3シークエンスを含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 4に示されている軽鎖可変領域のものと同じLCDR1、LCDR2、およびLCDR3シークエンスを含み、または、
ii)重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 5に示されている重鎖可変領域のものと同じHDR1、HDR2およびHDR3シークエンスを含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 6に示されている軽鎖可変領域のものと同じLCDR1、LCDR2およびLCDR3シークエンスを含む。幾つかの実施例において、上述のような反クラウジン18.2のAnti-Claudin bidは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、以下のようなものである。
iii)重鎖可変領域は、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:11に示されるようにHDR1、HDR2、HDR3からなり、軽鎖可変領域は、No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14に示されるようにLCDR1、LCDR2、LCDR3からなり、
iv)重鎖可変領域は、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17に示されるようにHDR1、HDR2、HCDR3からなり、軽鎖可変領域は、No:18、SEQ ID No:19、およびSEQ ID No:20に示されるようにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3からなる。
当業者は、i)、ii)、a)、b)等のような項目番号は、列挙された技術的解決策又は元素をより明確にし、かつ容易に識別されることを目的としているにすぎず、いかなる点においても、以下の技術的解決策又は元素を制限するものではないことを理解すべきである。同一品目番号を使用した場合、下記の技術的解決策や要素が同一であるという意味ではない。
上記の防クラウジン18.2抗体のいくつかの実施形態において、防クラウジン18.2抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。
幾つかの実施例において、上述のような反クラウジン18.2のAnti-Claudin bidは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、以下のようなものである。
(v) 重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 3又は24に示すように少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%等の重チェーン可変領域を有し、また、ライトチェーン可変領域は、SEQ ID NO: 4又は21に示すように少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%等の軽チェーン可変領域を有している。
(vi) 重鎖可変領域は、配列番号5または31に示されるように、重鎖可変領域に対して少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域は、配列番号6または28に示されるように、軽鎖可変領域に対して少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアイデンティティを有する。
幾つかの実施例において、上述のような反クラウジン18.2のAnti-Claudin bidは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、以下のようなものである。
(1)重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3に示されるように、または配列番号3に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号4に示されるように、または配列番号4に対して少なくとも90%のアイデンティティを有する。
(2)重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号24に示されるように、または配列番号24と少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号21に示されるように、または配列番号21と少なくとも90%のアイデンティティを有する。
(3)重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 5に対して少なくとも90%のアイデンティティを有すること、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 6に対して少なくとも90%アイデンティティを有すること、または、
(4)重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 31に対して少なくとも90%同一であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 28またはSEQ ID NO: 28に対して少なくとも90%同一である。
上記のような抗クラウジン18.2抗体のいくつかの実施形態において、抗クラウジン18.2抗体はヒト化抗体であり、ヒト化抗体はヒト抗体骨格領域またはその骨格領域変異体由来の骨格領域を含み、骨格領域変異体はヒト抗体軽鎖骨格領域および/または重鎖骨格領域の各々にせいぜい10個の背突然変異を有する。
いくつかの実施形態において、ヒト抗体重鎖骨格領域は、アミノ酸配列番号:24に示されるような重鎖可変領域の骨格領域と同じであるか、またはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号:21に示されるような軽鎖可変領域の骨格領域と同じであるか、またはヒト抗体重鎖骨格領域は、アミノ酸配列番号:31に示されるような重鎖可変領域の骨格領域と同じであるか、またはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号:28に示されるような軽鎖可変領域の骨格領域と同じである。
いくつかの実施形態において、好ましくは、フレームワーク領域変異は、以下の(a)または(b)から選択された突然変異を含む。
(a)22S、85Iまたは87Hの1つ以上のアミノ酸バック突然変性、および/またはそれ以上のバック突然変性(s)は、重鎖可変領域を構成する48I、82Tおよび69Mからなる群から選択され、
(b)軽鎖可変領域から成る4Lと22Sから成る群から選ばれた1つ以上のアミノ酸バック突然変性、および/またはそれ以上のバック突然変性(s)は、重鎖可変領域から成る38K、40R、48I、66K、67A、69、71Lおよび73Kから成る群から選ばれた。
上述したように、Anti-Claudin 18.2 bidの幾つかの実施例において、フレームワーク領域バリアントは、以下の(a-1)または(b-1)から選択された突然変異を含む。
(a-1) アミノ酸の復帰突然変異22S、85I及び87Hは軽鎖可変領域に含まれ、アミノ酸の復帰突然変異48I及び82Tは重鎖可変領域に含まれる、又は(b-1)アミノ酸の復帰突然変異4Lは軽鎖可変領域に含まれる。
上述したような抗クローディン18.2の実施形態において、以下を含む。
(vii)重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO: 3に示される通りであり、軽鎖可変領域配列はSEQ ID NO: 4に示されている通りである、または、
(viii) 重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO: 24、25、26又は27に示され、軽鎖可変領域配列はSEQ ID NO: 21、22又は23に示されているとおりである。
(ix) 重鎖可変領域配列は配列番号5に示される通りであり、軽鎖可変領域配列は配列番号6に示される通りである、または
(x) 重鎖可変領域配列はSEQ ID NO: 31、32、33または34に示され、軽鎖可変領域配列はSEQ ID NO: 28、29または30に示されている。
上述したようなAnti-Claudin18.2 adbidの幾つかの実施例において、Anti-Claudin18.2 adbid又はその抗原結合フラグメントは、以下に示すように重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を構成する。
(xi) SEQ ID NO: 31およびSEQ ID NO:29に示されているような重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列、または
(xii) SEQ ID NO: 26に示すような重鎖可変領域配列とSEQ ID NO: 23に示すような軽鎖可変領域配列である。
上述したように、Anti-Claudin 18.2 bidの幾つかの実施例において、軽鎖可変領域及び重チェーン可変領域は、以下の表に示すように、軽鎖可変領域とヘビーチェーン可変領域の組み合わせであることができる。
mAb1901人工抗菌の光・重鎖可変領域の組み合わせ
[表１]
mAb1902人工抗原の光・重鎖可変領域の組み合わせ
[表２]
上述したように、Anti-Claudin 18.2 adbidの幾つかの実施例において、このAndignはさらに、定常領域(s)を構成する。幾つかの特定の実施において、当該重鎖不変領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の定常領域、ならびにそれらの変形領域から構成される群から選択され、また、当該液体の軽鎖不変領域は、ヒトAbid Kappa、ラムダチェーン不変領域およびそれらの変形領域から構成される群から選択される。いくつかの具体的な実施例では、SEQ ID NO: 7に示されているような重鎖不変領域配列と、SEQ ID NO: 8に示されているような軽鎖不変領域配列からなる。
いくつかの具体的な実施例において、本発明は、配列番号 NO: 35又は42に示されるように、ウエイトチェーンが少なくとも90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%、100%を有し、また、ウエイトチェーンが少なくとも90%、92%、94%、95%、95%、96%、98%、99%、100%を有し、また配列番号 NO: 36に示されるように、ウエイトチェーンが最低90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%、またはウエイトチェーンを有し、又は配列番号 No: 38または46で示されるように、ウエイトチェーンが最低90%、94%、96%、97%、98%、99%を有する。
幾つかの実施例において、上述のような防クローディン18.2の抗菌は、以下を含む。
(c) SEQ ID NO: 35と/またはSEQ ID NO: 36に示すようなL鎖のような重い鎖である。
(d) SEQ ID NO: 42、43、44または45の順番で示されるような重鎖、またはSEQ ID NO: 39、40または41の順番で示されるようなL鎖である。
(e) SEQ ID No:37および/またはSEQ ID No:38に示されているようなL鎖のような重い鎖である。
(f) SEQ ID NO: 49、50、51、52、および/またはSEQ ID NO: 46、47、48に示されているようなL鎖のような重鎖である。
上記のような抗Claudin 18.2抗体のいくつかの実施形態において、抗体は、上記のような抗Claudin 18.2抗体またはその抗原結合フラグメントと競合して、ヒトClaudin 18.2に結合する。
幾つかの実施例において、上述のような防クローディン18.2の抗菌は、以下を含み、
アミノ酸配列番号44に示される重鎖、配列番号41に示される軽鎖、またはアミノ酸配列番号49に示される重鎖、および配列番号47に示される軽鎖である。
本開示のもう1つの側面は、上述のように、反クラウジン18.2の検出をエンコードする核酸分子も提供する。
本開示の別の態様はまた、上記の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
本開示の別の態様はまた、宿主細胞を提供し、該宿主細胞は、上記の核酸分子または上記の発現ベクターを含み、好ましくは、細胞は細菌細胞、真菌細胞、昆虫動物細胞または哺乳動物細胞である。
本開示のもう1つの側面は、また、前述の抗クローディン18.2抗菌抗菌薬を細胞毒薬に接合することによって形成される、抗ドラッグ共役を提供する。
本開示のもう1つの側面はまた、細胞毒薬と同価に結合することを上述したように、抗クロージン18.2の抗クロージンを含む、またはそれらからなる、抗ドラッグ・共役を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、上述したように、抗クローディン18.2抗菌を準備するための方法を提供する。
幾つかの実施例において、本開示は、上述したように、抗クロージン18.2-抗薬物活用剤を準備するための方法を提供する。
いくつかの実施例において、本開示は、上述のような抗クロージン18.2.bideの治療効果のある量、又は上述のような核酸分子、又は上述したような抗クロージング共役、並びに1又はそれ以上の薬事的に薬学的に許容可能な担体、溶剤、緩衝液又は補助剤からなる医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、上述の反Claudin18.2 のサンプルと接触する工程を含む、Claudin18.2のウィムスアッセイ又は検出のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヒトClaudin 18.2の免疫測定のための試薬の準備のために、上述したような反Claudin 18.2 bidの使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、クラウジン18.2の免疫測定または検出の使用のために、上記のような抗クラウジン18.2抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、上述したように、抗クローディン18.2抗菌を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記のような抗クラウジン18.2抗体、または上記のような抗体-薬物複合体、または上記のような医薬組成物の、癌または腫瘍の処置のための使用を提供し、ここで、癌または腫瘍は、好ましくは、頭頸部扁平上皮癌、頭頸部癌、神経膠腫、多形膠芽腫、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、喉頭咽頭癌、上咽頭癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、肝細胞癌、肝細胞癌、肝臓および胆嚢癌、胃癌、腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌である 卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、 白血病、リンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、異形成症候群、骨髄腫、扁平上皮癌、ユーイング肉腫およびメルケル細胞癌;リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群から選択され、肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群から選択され、白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記のような抗クラウジン18.2抗体、または上記のような核酸分子、または上記のような医薬組成物の治療有効量を被検者に投与することを含み、疾患は、好ましくは、癌または腫瘍であり、より好ましくは、クラウジン18.2陽性癌または悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮癌、頭頸部癌、神経膠腫、多形膠芽腫、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、喉頭咽頭癌、上咽頭癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、肝細胞腫瘍、肝細胞癌および胆嚢癌、膵臓癌、胃腸癌からなる群から選択される 腸癌、大腸癌、腎癌、明細胞腎癌、卵巣癌 子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨癌、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌である。より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、一次縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され、肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群より選択され、白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄性白血病からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、治療有効量は、上記のような抗クラウジン18.2抗体、または上記のような抗体-薬物複合体の0.1mg～3000mgまたは1mg～1000mgを、組成物の単位用量に含まれる。
いくつかの実施形態において、本開示は、クラウジン18.2に関連する疾患の治療に使用するために、上記の抗クラウジン18.2抗体、または上記のような抗体-薬物複合体、または上記のような医薬組成物を提供し、該疾患は、好ましくは、癌または腫瘍であり、より好ましくは、クラウジン18.2陽性癌または悪性腫瘍、頭頸部癌、神経膠芽腫、多形性膠芽腫、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、喉頭咽頭癌、上咽頭癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、肝細胞癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃腸癌、大腸癌、腎臓癌淡明細胞型腎細胞癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌 精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨癌、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌からなる群から選択され、より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、一次縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され、肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群より選択され、白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄性白血病からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、がんは、胃がん、食道がん、肺がんまたは膵臓がんである。
幾つかの実施例において、上述したように、クローディン18.2の高、中、低の表情を有するガンにおいて、抗たん薬又は抗たん薬の活用が治療上の役割を果たすことができる。
本開示において提供されるクローディン18.2の血液型および抗菌薬は、細胞表面抗原への優れた親和性、良好な内細胞効率、強い細胞抑制効果、およびより広範な薬物適用を有し、医薬としての臨床使用に適している。
細胞レベルでのヒト化Claudin 18.2への人工抗生物質の結合に関するFACS試験結果である。 NUGC4細胞における人工抗生物質のエンドサイトシスアッセイである。 Claudin 18.2の異なる発現レベルを持つNUGC4細胞におけるADCC効果の検出である。図3Aは野生型NUGC4細胞に対するADCC効果の検出(Claudin18.2の低い発現)、図3BはClaudin18.2の中発現のNUGC4細胞に対するADCC効果の検出、図3CはClaudin18.2の高発現細胞に対するADCC効果の検出を示している。
用語
本開示をよりわかりやすくするために、以下に特定の専門用語及び科学的用語を定義する。ここに明確に定義されていない限り、ここで使用される他のすべての技術的及び科学的用語は、この開示に関する当業者によって一般に理解されている意味を持つ。
本開示におけるアミノ酸のための3文字コードおよび1文字コードは、J. biol.chem, 243, p3558 (1968)に記載されている。
「細胞毒薬」という用語は、細胞の機能を抑制または防止し、細胞の死または破壊を引き起こす物質を意味する。細胞毒薬物には、毒素、安価な上記薬物、その他の細胞を殺すために使用できる化合物が含まれている。
「毒素」という用語は、細胞の成長または拡散に有害な影響を与えることができる小分子、菌類、植物または動物からの派生物であり、その中にはエクサテシン、メイタンシノイドおよびその派生物(DM1, DM4, Orlistatin F (AF))のようなカンプトテシンの派生物、およびそれらの派生物(CN10157384)、MMAF, MMAE, 3024 (WO 2016/12790 A1, 7)、ジフテリア毒素、外毒素、ブリンA鎖、モデッキン、α-サリン、アレウティス・フォルディイ有毒タンパク質、フィトロカアメリカ有毒タンパク質(PAPI, PAPI およびPAP-S)、モモルジカ・チャーランチア抑制剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス抑制剤、ジェロニン、ミトゲリン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセンが含まれる。
「安価な薬」という言葉は、腫瘍の治療にも使える。このような定義にはまた、ガンの成長を促進しうるホルモン効果を調整、低減、遮断、または抑制することができ、全般的に体系的または体系的な療法の形成をとる抗ホルモン剤も含まれる。それらはホルモン自体でありうる。安価な薬の例としては、チオテパ、シクロスファミド(CYTOXANTM)、プルファン、インポスルファン、ピポウルパのようなアルキルスフォネート、ベナオドパ、カルボコン、メチリドーパのようなアジリジン、アジリジン、アルトレタミン、トリエチレンチオフォラミドおよびトリメロロロムラミン、クロラムブシル、クロルナファミド、イフォスファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ノベステリン、プレドニムスチン、トロスファミド、ウロスチンのようなニトロスアミド、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、クラリスロマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、ブレオマイシンのような抗生物質がある。サクタイノマイシン、カリコマイシン、カラビシン、クロモマイシン、カルビシン、デトロビシン、エゾルビシン、マルビシン、マイコペノマイシン、ペプロマイシン、プロマイシン、ロドロビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チューベニミン、ゾルビシン、メトトレキサート、5-FUのような抗代謝物、デノプチン、メソトレキサート, エロプテリン、トリメトレキサート、フワタラビン、6-メソトレキサートの類似物、チオガノプテリン、アザシチジン、6-アズリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシトルリジン、エノシタビン、5-FU、カラステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン、アミノグテチミド、ミトタンなどのアントロゲン フロリニン酸、アルドフォルコスタニン、アムサクリン、アムトラシン、ベストラビアン、デファミン、ジアジコン、エルフォミティナム、アセットエリプト、エトグルシド、ガリウム、硝酸、ロニダミン、ミトグアゾン、モピアントロン、ニトスタチン、フェナント、ピラルビシン、ポドフィジン、プロカザイン、PSK(R)、ラゾキサン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、アルタニアテニノ酸、2,2',2'トリクロロチラミン、ウレタン、ビンブラスチン、ダカルバジン、マンニトールマスタード、ジブロモニム ピブロマン、ガシトシン及びアラビノシド(「アラ-C」)、シクロホスファミド及びチオテパ パクリタキセル(TAXOL(R)、ブリストル・マイヤーズスクイブオンコロジー、ニュージャージー州プリンストン)およびドセタキセル(TAXOTERE(R)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)、クロラムブシル、ゲムシタビン、6-thioguanine、Metheoguanine、Methotrexate、プラチナアナログ(シスプラチンおよびカルボプラチンのような)、ビンブラスチン、プラチナ、エトポシド(VP-16)、イフォスファト、マイトマイシン、マイトマイシンC、ミトロン、ビンクリスチン、ミトロン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノルビシン、アノプテリン、アンドロン、また、この定義には、腫瘍に対するホルモンの影響を調整または抑制することができる抗ホルモン剤も含まれる。例えば、抗エストロゲンには、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラロキシン、アロマターゼ阻害剤4(5)-イミダゾル、4-ハイドロキシルタモキシフェン、フェオキシン、フェオキシン、ケフェオキシン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(ファレストン)、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ルプロリドおよびゴセレリンのような防アンドロゲン、ならびにこれらの物質のいずれかの薬事上許容される塩、酸または派生物が含まれる。
ここで用いられるように、「apid」とは、イムノグロブリンを意味し、完成abdyは、同一の2つのL鎖にインターハインジスルフィド結合により結合した2つの同一重鎖によって形成される4つのペプチド連鎖構造である。イムノ免疫グロブリン鎖定常領域は異なったアミノ酸組成と配列を示し、したがって異なった抗原性を示す。従って、イムグロブリンは、5つのタイプ、すなわち、IgM、IgD、IgG、IgA、IgEに分類することができ、対応する重鎖はそれぞれ、マイクロ、デルタ、α、および、イグロブリンである。ヒンジ領域のアミノ酸組成および重鎖ジスルフィド結合の数と位置により、同じタイプのIgはさらに異なるサブタイプに分けることができ、例えば、IgGはIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に分けることができる。軽いチェーンは、一定の異なる領域に基づいて、カッパチェーンまたはOOIチェーンに分けることができる。5種類のイグはそれぞれカッパ鎖またはラムダ鎖を持つことができる。
重鎖および軽鎖のNターミナルに隣接する約110のアミノ酸配列は、可変領域(Fv領域)として知られており、非常に可変である。Cターミナルに近い残りのアミノ酸配列は、定常領域として知られている比較的安定である。可変領域は、比較的保守的な配列を持つ3つの超可変領域(HVRs)と4つのフレームワーク領域(FRs)を含む。抗体の特異性を決定する3つの超可変領域は、相補性決定領域(CDR)としても知られている。各軽鎖可変領域(VL)と各重チェーン可変領域(VH)は、3つのCDR領域と4つのFR領域からなり、アミノ端からカーボキシル終末までの順序は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4である。L鎖の3つのCDR領域は、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3であり、重鎖の3つのCDR領域は、HCDR1、HCL2およびHDR3である。
本開示の抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を含む。
ここで用いられるように、「murine bid」という用語は、当該技術の知識及び技能に基づき調製された抗ヒトClaudin18.2モノクローナル抗生物質を指す。準備の間、試験被検者にClaudin18.2またはそのエピトープを抗原として注入し、その後、望ましい配列または機能的特徴を有する遺伝子を発現するハイブリドマを分離する。本開示の好ましい実施の形態では、ムリン・クラウディン18.2.抗原結合フラグメントは、さらに、ムリン・カッパチェーンまたはその変形例の軽鎖定常領域、さらに、ムリン・IgG1、IgG2、IgG3またはその変形例の重いチェーンコンスタント領域を構成している。
「キメラ」とは、ヒトの一定領域と相まって、ネズミの可変領域を融合することで得られる「キメラ」という用語であり、このような「キメラ」は、ネズミの抗たん性反応を緩和することができる。キメラ抗体を確立するために、まず、比ネズミモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、可変領域遺伝子をネズミハイブリドーマからクローニングする。次に、必要に応じてヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変部遺伝子をヒト定常部遺伝子に連結してキメラ遺伝子を形成し、その後発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメリック・コンディションの分子は真核あるいは原核系で発現される。本開示の好ましい実施の形態では、キメリック・バイオレンスのブランド・ライト・チェーンは、さらに、人間のカッパ、ラムダ・チェーンまたはそれらの変形物のライト・チェーン・コンスタント・領域を含む。Claudin18.2キメリック・バイオレンスのヘビーチェーンは、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4の鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2またはIgG4の鎖定常領域を含み、または、アミノ酸突然変形例IgG1、IgG2またはIgG4の鎖定常領域(例えば、L234Aおよび/またはL235A突然変形例、および/またはS228P突然変形例)を含むIgG1、IgG2またはIgG4の鎖定常領域を構成する。
「ヒト化抗体」という用語は、CDRグラフト化抗体としても知られ、ヒト抗体可変領域フレームワーク、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系抗体フレームワーク配列において産生される抗体に非ヒトCDR配列をグラフト化することによって産生される抗体を指す。人為化された抗生物質は、多数の異種性たんぱく質成分を含むキメラ抗生物質によって引き起こされた異種反応を回避することができる。そのようなフレームワーク配列は、ゲルムラインの遺伝子配列または公表された引用文献を対象とする公共のDNAデータベースから得ることができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のゲルムラインDNA配列配列は、「VBase」のヒトゲルムライン配列データベース(www.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能)およびKabat, EA, et al. 1991 Sequences of Immunological Interest, 5th Edで見ることができる。免疫原性の低下に起因する活性の低下を避けるために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列に最小限の復帰突然変異または復帰突然変異を与えて活性を維持することができる。また、本開示の人間化抗物質は、CDR親和性熟成が酵母ディスプレイによって行われる人間化抗物質にも言及している。
本開示の実施形態では、その「当該」又は「抗原結合フラグメント」は、更に、ヒト又はミューイン・カッパチェーンから派生した軽鎖不変領域、すなわち、更に、ヒト又はムリエンIgG1、IgG2、IgG3、IgG4から派生した重鎖不変領域を含んでいる。好ましくは、ヒトIgG1、IgG2又はIgG4から派生した重鎖不変領域、又は、アミノ酸突然性(例えば、L234A及び/又はL235A突然性、並びに/又はS228P突然性)を有するIgG1又はIgG2又はIgG4変形例から派生した重鎖不変領域を含んでいる。
ここに記載されているように、重鎖コンスタント領域の「バリアンツ」および人の抗菌の軽鎖コンスタント領域は、先行技術で開示されている重鎖軽鎖定常領域、それらは、抗菌可変領域の構造および機能に変化しない。模範的な変形例としては、部位指向工学により得られたIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4鎖定常領域改良および鎖定常領域上のアミノ酸置換が含まれる。比置換は、例えば、YTEの突然変異、L234Aおよび/またはL235Aの突然変異、S228Pの突然変異、および/または、ノブ・イン・ホール構造をもたらす突然変異(つまみ-Fcとホール-Fcの組合せを、重い鎖にすること) である。これらの突然変異は、抗体可変領域の機能を変化させることなく、新しい性質をもつ抗体を与えることが証明されている。
「ヒト抗体(HuMAb)」、「ヒト由来抗体」、「完全ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」は、互換的に使用され、ヒト由来抗体または抗原刺激に応答して特異的ヒト抗体を産生するために当技術分野で公知の任意の方法によって「操作された」遺伝子改変生物から得られた抗体であり得る。いくつかの技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、胚性幹細胞系に由来する細胞株に導入し、その中で内因性重鎖および軽鎖遺伝子座を破壊の標的とする。遺伝子組み換え生物は、ヒト抗原に特有の人類の抗物質を合成することができ、また人類の抗物質を秘密にするハイブリドーマを作るのに利用することができる。また、重鎖とL鎖が、1つ以上のヒトDNA源から得られた核酸配列によってエンコードされる、このような人類のDNAであってもよい。完全なヒトの抗生物質は、遺伝子または色素トランスフェクション法およびファージディスプレイ法により構築することもでき、又は、ビトロで活性化されたB細胞から構築することもできるが、これらはいずれも本技術で知られている。
「全長」、「全長」、「全長」と「全量」とは、ここでは同義に使用され、また、以下に定義する抗原結合フラグメントと区別される、実質的に完全な形の「完成」を意味する。用語は、軽鎖および重鎖において一定の領域を含む「抗原」を意味する。本開示の「抗原」には、「全長」およびそれらの抗原結合フラグメントが含まれる。
幾つかの実施例において、本開示のフルレングス・オープン・レグス・バイオレンスは、下表の軽鎖及び重鎖の組合せに示されるように、軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を結び、重鎖可変領域と重鎖不変領域を結びつけて形成されるフル・レングス・アボディを含む。当業者は、ヒトの抗菌剤由来のライトチェーンコンスタント領域や重チェーンコンスタント領域など、実際のニーズに応じて、各種抗菌剤源からライトチェーン鎖定常領域選択することができる。
「抗原結合フラグメント」または「機能断片」という用語は、抗原に上記結合する能力を保持すること(例えば、Claudin18.2)を意味する。「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合断片の例としては、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片、(ii)F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィードブリッジによって結合された2つのFab断片、(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFv断片、(iv)VHおよびVLによりジスルフィド結合を経て形成された抗原結合フラグメント、(v）VHとVLが鎖間ジスルフィド結合を介して形成する抗原結合フラグメントdsFv、(vi) ダイアボディ scFv、dsFv、およびFabである。さらに、FvフラグメントのVLドメインおよびVHドメインは、合成リンカーによって連結されて、単一タンパク質鎖を生成し、これは、VLおよびVHドメイン(単鎖Fv (scFvと呼ばれる)を対合することによって形成される一価分子であり、例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883を参照されたい)である。このようなシングルチェーン・アディスは、また、抗菌の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる。このような抗体フラグメントは、当該分野で公知の従来の技術を用いて得られ、無傷の抗体についてのものと同じ方法を使用することによって、機能的断片についてスクリーニングされる。アンチゲン結合部分は、遺伝子組み換えDNA技術や、無傷のイムグロブリンを化学的に破壊することによって作り出すことができる。アンチボディは、異なるアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgMのいずれかの形成をとることができる。
Fabとは、パパインと同じ活性を持つエンザイムでIgG(IgG)の分子を処理することによって得られた抗原結合活動を有する抗原フラグメントである。
F(ab‘)2は、ペプシンと同じ活動性を持つIgGを消化することによって得られる抗原結合活性を持つ、抗原断片である。
Fab'は前述のF(ab')2.をきれいにすることで得られる抗原結合活動を持つ断片である。
さらに、Fab'は、発現ベクトルにFab'フラグメントをエンコードしたDNAを挿入し、ホストにベクトルを導入することによって生成することができる。
「単鎖抗体・エコノミクス」、「単鎖抗体Fv」または「scFv」という用語は、リンカーによって、重鎖可変ドメイン(または領域、VH)を含む、重鎖可変ドメイン(または領域、VH)を含む分子を意味する。このようなscFv分子は、NH2‐VL‐linker‐VH‐COOHまたはNH2‐VH‐linker‐VL‐COOHの一般的な構造を持つ。本開示において使用可能な他のリンカは、以下の文献によって説明される。例えば、以下のようなHolliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731; Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106; Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061; Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunolであるが、限定されない。
Diabodyは、scFvやFabがデミライズされた抗原であり、同じ抗原結合活動を持つ抗原断片である。二価抗原結合活動では、2つの抗原は同じか異なっている可能性がある。
二重特異性および多重特異性抗体は、2つ以上の抗原または抗原決定基に結合することができる抗体を意味する。
dsFvは、VHおよびVLの各1つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、次いで、2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して置換ポリペプチドを連結することによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、公知方法(例えば、Protein Engineering, 7, 697 (1994))に従って抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる。
「アミノ酸の相違」または「アミノ酸の変異」という用語は、元々のタンパク質またはポリペプチドに比べて、タンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸の相違または変異を指し、元々のタンパク質またはポリペプチドに基づいて1、2、3またはそれ以上のアミノ酸の挿入、削除または置換を含む。
「Abid framework」または「FR region」という用語は、この可変ドメインの抗原結合ループ(CDR)の足場として役立つVLまたはVHの可変ドメインの一部を意味する。基本的には、CDR がない変数ドメインである。
「相補性決定領域」、「CDR」または「超可変領域」という用語は、抗原結合に主に寄与する抗体可変ドメインに存在する6つの超可変領域のうちの1つを指し、一般的に、各重鎖可変領域には3つのCDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)および各軽鎖可変領域には3つのCDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)が存在する。CDRのアミノ酸配列境界は、「Kabat」の番号付け基準(Kabatら(1991)、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、米国国立衛生研究所、Bethesda、MD)、「Chothia」の番号付け基準(Al-Lazikaniら(1997)、JMB 273:927-948)、およびImmunoGenTics (IMGT)の番号付け基準(Lefranc MP、Immunologist、7、132136(1999)、Lefranc、MP, etc. Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)など)を含む、様々な既知のスキームのいずれかによって決定することができる。たとえば、カバトの基準に従い、重鎖可変領域(VH)のCDRアミノ酸残基は31-35(HCR1)、50-65(HCR2)および95-102(HDR3)と数えられ、軽鎖可変領域(VL)のCDRアミノ酸残基は24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、および89-97(LCDR3)と数えられる。Chothia基準に従い、VH中のCDRアミノ酸残基は26-32(HDR1)、52-56(HCR2)および95-102(HDR3)であり、VL中のアミノ酸残基は26-32(LCDR1)、5052(LCDR2)および91-96(LCDR3)である。CDRを定義するためにKabatとChothiaの両方を組み合わせることにより、CDRはヒトVHにおけるアミノ酸残基26-35(HCL1)、50-65(HCR2)、および95-102(HDR3)からなり、ヒトVLにおけるアミノ酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)および89-97(LCDR3)からなる。IMGTの基準に従い、VH中のCDRアミノ酸残基は、おおよそ26-35(CDR1)、51-57(CDR2)および93-102(CDR3)であり、VL中のCDRアミノ酸残基は、およそ27-32(CDR1)、50-52(CDR2)および89-97(CDR3)であった。IMGTの基準に従えば、IMGT/DomainGap Alignプログラムを用いて、抗原のCDR領域を決定することができる。
「エピトープ」または「抗原行列式」という用語は、イムグロブリンまたは抗原が結合する抗原上のサイト(例えば、Claudin18.2分子上の特定部位)を意味する。エピトープは、通常、ユニークな三次元構造を持つ、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の連続性または非連続性のアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。
「特別に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的に結合する」、「特定の結合する」という用語は、抗原上の既定のエピトープへの抗原の結合を意味する。典型的には、約10-8 M未満の親和性(KD)、例えば、約10-9 M未満、10-10 M、10-11 M、10-12 M以下で結合する。
「KD」という用語は、特定の反応‐抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。一般的には、本開示の標記クローディン18.2又はそのエピトープを、約10M-7以下の解離平衡定数(KD)で結合する。例えば、約10M-8又は10M -9未満であり、例えば、本開示中の細胞表面抗原への標識の親和性は、FACS法によりKD値を測定することによって決定される。
「競争」という用語が、同じエピトープを競合する抗原結合タンパク質の文脈において使用される場合、それは、抗原結合たんぱく質の間で競争が発生することを意味し、これは、検査されるべき抗原結合たんぱく質(例えば、その抗原または機能フラグメント)が、参照抗原結合たんぱく質(例えば、リガンドまたは参照たんぱく質)の共通抗原(例えば、Claudin18.2抗原またはそのフラグメント)への比結合を防止または抑制する(または抑制する)アッセイによって決定される。抗原結合性タンパク質が他のタンパク質と競合するかどうかを決定するために、多くのタイプの競合結合アッセイが利用可能である。これらのアッセイは、例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ(RIA)、固相直接または間接酵素免疫アッセイ(例えば、Stahliら、1983、Methods in Enzymology 9: 242-253参照)、固相直接ビオチン-アビジンEIA (例えば、Kirklandら、1986、J. Immunol. 137: 3614-3619参照)、固相直接標識サンドイッチアッセイ(例えば、Harlow and Lane、1988、抗体、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press参照)、I-125標識による固相直接標識RIA (例えば、Morelら、1988、Molec. Immunol25: 7-15参照)、固相直接ビオチン-アビジンEIA (例えば、Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552)、および直接標識RIA (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J . Immunol. 32: 77-82))である。通常、このアッセイは、標識されていない抗原結合タンパク質と標識された参照抗原結合タンパク質の両方を積み込んだ固体表面または細胞に結合することができる精製抗原の使用を含む。競合抑制は、抗原結合タンパク質が試験されているときに、固体表面または細胞に結合したラベルの量を測定することによって決定される。通常、抗原結合性タンパク質が過剰に存在する。競合アッセイ(抗原結合性タンパク質と競合する)によって同定された抗原結合タンパク質には、以下が含まれ、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープと結合する抗原結合タンパク質、および参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近いエピトープに結合する抗原結合タンパク質である。ここでは、2つのエピトープが空間的に相互に干渉しあって結合を妨げる。競合的拘束力を決定する方法に関する追加の詳細は、ここに示す例に示されている。典型的には、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、参照抗原結合タンパク質の共通抗原に対する特異的結合を少なくとも40～45%、45～50%、50～55%、55～60%、60～65%、65～70%、70～75%または75%またはさらに多く阻害する(例えば、減少させる)。場合によっては、結合が少なくとも80～85%、85～90%、90～95%、95～97%、または97%以上阻害される。
ここでいう「核酸分子」とは、「DNA」及び「RN分子」を指し、「核酸分子」とは、一本鎖又は二本鎖のものであり、二本鎖及び一本鎖のもの、又は一本鎖のものが好ましく、核酸を別の核酸配列と機能的な関係に置くと「機能的にリンク」するものである。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与える場合には、コーディング配列に動作的にリンクされている。
「配列同一性アイデンティティの最大パーセンテージを達成するために(必要に応じてギャップを導入する)アミノ酸配列が揃うと、最初の配列と2番目の配列の間に同一であるアミノ酸残基の割合を意味し、控えめな置換は配列アイデンティティの一部とはみなされない。アミノ酸配列同一性の割合を決定するために、並列は、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術の範囲内で様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大の配向を達成するために必要なアルゴリズムを含む、配向を測定するのに適したパラメータを決定することができる。
「式ベクトル」という用語は、それがリンクされている別の核酸を運ぶことができる核酸を意味し、ある実施形態では、ベクトルは「プラスミド」である。これは、追加のDNAセグメントをリグテーションすることができる、円形の二本鎖DNAされたDNAループを意味する。別の実施形態では、ベクトルは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムにリガント化することができる、ウイルスベクトルである。本明細書に開示されているベクトルは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することが可能であるか(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクトルおよびエピソーム哺乳動物ベクトル)、または宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれることができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクトル)。
抗生物質及び抗原結合フラグメントを製造し、浄化する方法は、この当業者でよく知られている。例えば、アンティボディーズ:実験マニュアル、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー、第5-8章及び第15章である。例えば、マウスにヒトClaudin18.2またはそのフラグメントをワクチン接種することができ、その結果得られた抗生物質を、周知の通常の方法を用いて再成、精製、及び配列決定することができる。抗原結合フラグメントも従来の方法で作ることができる。本開示の抗毒物又は抗原結合フラグメントは、非ヒトの抗菌から派生したCDR領域に1つ以上の人的骨格領域を組み込むように工夫されている。Human FR germline配列は、免疫遺伝学 (IMGT)からウェブサイトhttp://imgt.cines.frで、または、The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351から、MOEソフトウェアを使用してIMGT人種変性ゲルムライン遺伝子データベースと整合させることによって得られる。
「ホストセル」という用語は、発現ベクトルが導入された細胞を意味する。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物細胞が含まれる。形質転換されやすい細菌には、大腸菌またはサルモネラ菌株のような腸内細菌科の部材、枯草菌のようなバチルス科、肺炎球菌、レンサ球菌およびインフルエンザ菌が含まれる。適当な微生物はSaccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む。適切な動物宿主細胞系には、CHO (中国語ハムスターオバリ細胞線)、293細胞およびNS0細胞が含まれる。
本開示の抗物質又は抗原結合フラグメントは、従来の方法により調製し、浄化することができる。たとえば、重鎖とL鎖をエンコードしているcDNA配列をクローンし、式ベクトルに組み換えることができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターを宿主細胞に安定にトランスフェクトすることができる。より推奨される先行技術として、哺乳動物の式システムは、特にFc領域の高度に保存されたN-端子サイトにおいて、抗物質のグリコシル化を導くことができる。ヒトClaudin 18.2に特に結合した抗菌を発現することにより安定したクローンを得た。バイオリアクターでは、正のクローン化を増やすことができ、それによって、抗菌作用を生み出すことができる。これまでの技術では、抗原が秘密にされてきた文化媒体を精製することができる。たとえば、緩衝液で調整したProtein A またはG Sepharose FF の列で精製を行うことができる。非特定バインディング成分を洗い流す。pHの傾きによって結合した抗菌は溶出され、SDS‐PAGEによって検出され、その後プールされる。一般的な技法を用いて、抗生物質をフィルタリングし、濃縮することができる。ソルブル混合物と多量体は、サイズ排除やイオン交換のような一般的な手法によって効果的に取り除くことができる。その結果、たとえば-70℃で即座に冷凍されたり、親水性になることがある。
「管理」、「ドーシング」、又は「トリートメント」とは、動物、ヒト、細胞、被検者、細胞、臓器、又は生体液に適用される外生薬、治療薬、診断薬又は組成物に動物、ヒト、被検者、細胞、組織、臓器、組織、又は生体液と接触することを指す。「管理」、「ドーシング」又は「トリートメント」とは、例えば、治療法、薬理学的、医学的、診断的、診断的、調査的、及び実験的方法を指すことができる。細胞のトリートメントは、細胞と試薬と接触すること、並びに液体と試薬と接触することを意味する。「管理」、「ドーシング」又は「トリートメント」はまた、体外又は体内トリートメント、例えば、細胞と試薬、診断、結合剤、結合剤、又は他の細胞と接触することを意味する。「トリートメント」は、ヒト、獣医、又はリサーチ被検者、施策、研究、診断の応用に適用される。
「治療」とは、治療剤が既知の治療効果を有する1つ以上の病徴を有する患者に対して、本開示のどれかの抗毒剤又は抗原結合フラグメントを包含する組成物のような治療剤の投与を意味する。典型的には、治療を受けるべき患者または集団の1つ以上の病気の徴候を緩和し、医学的に測定可能な程度によりそのような徴候の退行を誘発または抑制するために、薬を効果的に使用する。患者の病状、年齢、体重、希望する反応を引き出す能力などにより、特定の病気の徴候を緩和する効果のある治療剤(「治療有効量」とも呼ばれる)の量は異なってくることがある。疾患症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって一般的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本開示の実施例(例えば、処理方法又は製造物)は、全ての患者の標的病気の兆候を緩和するのに効果的ではないかもしれないが、学生のt-試験、t-square 試験、マン&ホイットニーによるU-試験、クラスカル-Wallis 試験 (H-試験)、Jonckheere-Terpstra-試験、ウィルコクソン-試験のような、当該技術で知られている統計的に有意な数の患者において、標的病気の徴候を緩和するべきである。
「控えめな変更」または「控えめな置換または置換」とは、タンパク質中のアミノ酸が、同じような特性(たとえば電荷、側鎖の大きさ、好水性/親水性、背骨の配合および硬さなど)を持つ他のアミノ酸と置換することを意味し、このような変化はタンパク質の生物学的な活性を変化させることなく頻繁に起こりうる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非不可欠な領域における単一のアミノ酸置換が生物活動を実質的に変化させないことを理解している(例えば、Watsonら(1987)、遺伝子の分子生物学、The Benjamin/Cummings Pub(株)ページ224、第4版)を参照されたい)。さらに、構造的にも、あるいは機能的にも似たようなアミノ酸との置換は、生物活動を破壊する可能性が低い。保守的な置換の例は、下の表「典型的なアミ酸の保守的代替物」に示されている。
典型的なアミノ酸の控えめな置換
［表３］
「有効量」または「有効な量」とは、有益な、あるいは望ましい結果を得るために必要な薬品、化合物、または医薬品の組成の量を指す。予防的適用のためには、有益な、または望ましい結果として、その条件の生化学的、組織学的、および行動の現れ、その複雑さ、ならびにその条件の開発中の中間体病理発現を含む、リスクの除去または削減、重大性の低下、または病気の開始の遅れが含まれる。治療上の適用のために、有益な又は望ましい結果には、発明開示の標的抗原に関連する様々な状態の発生率の低減、又は条件の1つ以上の症状の改善、条件を治療するために必要な他の剤の量の減少、他の剤の有効性の向上、及び/又は患者における発明開示の標的抗原に関連する状態の進行の遅延が含まれる。
「外生的」とは、状況に応じて、生物、細胞、人間以外で発生する物質のことである。
「内生」とは、細胞、生物、人体などの中で、状況に応じて発生する物質のことである。
「アイデンティティ」とは、2つのポリヌクレオチド配列または2つのポリペプチド配列間の配列の類似性を指す。比較される2つの配列の両方の位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で同質性を持つ。2つの配列間のアイデンティティの割合は、2つの配列間で共有されたマッチングまたはホモロゴスの位置の数を、比較すべき位置の数で割って、それに100を掛けた割合の関数である。たとえば、2つの配列が最適に並べられている場合、2つの配列の10のうち6つが一致またはホモロゴスである場合、2つの配列は60%のホモロゴスであり、2つの配列の100のうち95が一致またはホモロゴスである場合、2つの配列は95%のホモロゴスである。一般的に、2つの配列が揃うと、最大のアイデンティティ割合を与えるために比較が行われる。例えば、比較は、アルゴリズムのパラメータを選択し、各リファレンス配列の全長にわたる各配列間の最大のマッチングを与えるBLASTアルゴリズムによって実行することができる。以下の文献は、配列解析に頻繁に使用されるBLASTアルゴリズムを参照している。BLAST algorithm (BLAST ALGORITHMS): Altschul, SF et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, TL et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, SF et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. et al. (1997) Genome Res. 7:649-656である。NCBI BLASTから入手可能なもののような他の従来のBLASTアルゴリズムも、当業者に公知である。
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、すべてのそのような呼称は子孫を含むので、「形質転換体」および「形質転換細胞」は、継代数にかかわらず、一次被検者細胞およびそこから誘導された培養物を含む。また、意図的または非意図的な突然変異のために、すべての子孫がDNA含量において正確に同一ではない可能性があることを理解しておくべきである。元来形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が含まれる。明確な指定が意図されている場合は、文脈から明確に理解されるだろう。
「分離された」とは、分子が核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、他の材料、セルデブリや成長媒体などの生体情報分子を実質的に含まないことを意味する。一般的に、「分離された」という用語は、これらの物質が完全に存在しないこと、あるいは水、緩衝液または塩が存在しないことを意味するものではない。ただし、これらの物質が、ここに記載されているように、この複合体の実験または治療上の使用を著しく妨げる量に存在しない限り、「分離された」という用語は意図されていない。
「オプション」または「オプション」とは、後に続く事象または状況が必ずしも起こりうるが、必ずしも起こらないことを意味し、また、その事象または状況が起こるか、起こらない場合を含む記述である。
「医薬組成」とは、本開示または生理学的/薬学的に容認可能な塩またはそれらの製造物および生理学的/薬学的に容認可能なキャリアおよび補助剤のような他の化学成分の混合物をいう。医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進することにより、生物への影響を与えることを目的としている。
「薬事上許容される運搬体」という用語は、配合薬又は配合原結合フラグメントを運搬するための調剤に使用するのに適した不活性物質を意味する。担体は、抗粘着剤、接着剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤又は溶剤、防腐剤(抗酸化剤、抗菌剤又は抗菌剤等)、甘味料、吸収遅延剤、湿化剤、乳酸剤、緩衝液等であり得る。適切な薬学的に許容可能な担体の実施例としては、水、エタノール、ポリオール(グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)デキストロース、植物油(オリーブ油など)、生理食塩水、緩衝液、緩衝化生理食塩水、および等張剤(糖、ポリオール、ソルビトールおよび塩化ナトリウムなど)が挙げられる。
さらに、本開示には、標的抗原に関連する疾患(例えば、クラウジン18.2)ポジティブセル、すなわち、本開示の抗クラウジン18.2上記またはその上記結合断片を活性成分として構成する剤を含む。
本開示におけるClaudin 18.2関連疾患については、本疾患がClaudin 18.2に関連する限り、特段の制限はない。例えば、本開示の分子によって引き起こされた治療反応には、(1)クラウジン18.2がそのレセプター/リガンドに結合することを防ぐこと、すなわち、本開示の分子をヒトクラウジン18.2に結合すること、または(2)クラウジン18.2を過度に発現しすぎたがん細胞を殺すことが含まれる。従って、本開示の分子は、治療用に適した調製及び配合で構成される場合、好ましくはメラノマ、大腸ガン、乳ガン、肺ガン、胃ガン、胃ガン、肺ガン、腎臓ガン、非小細胞肺ガン、ブラッダーガン等を有する者にとって、非常に有用である。
さらに、本開示は、標的抗原(例えば、Claudin18.2)、標的抗原の免疫検出または決定のための試薬(例えば、Claudin18.2)、標的抗原を発現する細胞(例えば、Claudin18.2)の免疫検出または決定のための方法、および標的抗原(例えば、ヒトClaudin18.2)を特異的に認識し、細胞外アミノ酸配列またはその三次構造に活性成分として結合する本開示の抗体または抗体断片を含む、標的抗原(例えば、Claudin18.2)陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断薬に関する。
本開示では、標的抗原(例えばClaudin18.2)の量を検出または測定するための方法は、何らかの公知方法である。例えば、免疫測定法またはイムノディテクション法が挙げられる。
イムアッセイ又はイムノ検出法は、ラベル付き抗原又は抗原を用いて、抗原又は抗原の量を検出又は測定する方法である。免疫測定法または免疫検出法の実施例としては、放射性物質標識免疫抗体法(RIA)、酵素免疫測定法(EIAまたはELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法、物理化学的方法などが挙げられる。
Claudin18.2-ポジティブ細胞に関連する上記の病気は、本開示の抗物質又は抗菌断片を用いてClaudin18.2-expressing細胞を検出又は測定することにより、診断することができる。
ポリペプチドを発現する細胞は、公知の免疫検出方法によって、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織染色などによって検出することができる。また、FMAT8100HTSシステム(Applied Biosystem)による蛍光抗体汚染法などの方法も利用可能である。
本開示では、標的抗原(例えばClaudin18.2)のために検出、上記測定される試料(例えばClaudin18.2)が、標的抗原(例えばClaudin18.2)を発現する細胞を含み得、組織、細胞、血液、プラズマ、美容液、パンクレートジュース、尿、便、組織流体上記文化媒体のような、特別な制限はない。
必要な診断方法に依存して、本開示のモノクローン・ニーズ又はその中のそれらのモノクローン・ニーズ・ベースの断片から成る診断剤は、また、反応を検出するための抗原-ニーズ反応又は試薬を行うための試薬を含んでいることができる。抗原抗体反応を行うための試薬には、緩衝剤、塩類等が含まれる。検出のための試薬には、免疫測定または免疫検出法において一般的に使用される試薬、例えば、モノクローナル抗体を認識する標識二次抗体、その抗体フラグメントまたは共役、および標識に対応する基質が含まれる。
本開示の1つ以上の実施形態の詳細は、上述の明細書に記載されている。好ましい方法及び材料は、以下に説明するが、本記載の方法及び材料に類似又は同一の方法及び材料は、本開示の実践又は試験において使用することができる。本明細書及びクレームを通して、本開示の他の特徴、目的及び利点が明らかになる。明細書及びクレームにおいて、単数形は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の側面を含んでいる。ここに明確に定義されていない限り、ここで使用されるすべての技術的及び科学的用語は、この開示が属する当業者によって一般に理解されている意味を持つ。明細書に引用される全ての特許及び出版物は、参考文献に組み込まれている。本開示の好ましい実施例をより完全に説明するために、以下の例を提示する。これらの例は、何らかの形で本開示の範囲を制限するものと解釈されるべきではなく、本開示の範囲はクレームによって定義される。
（実施例1）Claudin 18.2を高く発現するセルラインの構築
リポフェクトアミン3000のトランゼクション試薬を用いて、pCDH-Claudin18.2レニチビル発現ベクトル及びpVSV-G, pCMV-dR8.91レニビル・システム包装ベクトルをウイルス包装セル293Tに移植し、当該ウイルスを含有する培地の上生剤を採取し、フィルターをかけて超高速で遠心し、集中ウイルスを用いてヒト消化網環細胞株NUGC4に感染させ、2～3週間にわたってピュロマイシンでスクリーニングした後、FACS単細胞選別で選別した。
Claudin 18.2の発現レベルは腫瘍IHCスコアに従って測定した。IHCスコア3の腫瘍と同等のClaudin 18.2の発現レベルを有する細胞を高発現細胞とし、IHCスコア2の腫瘍と同等のClaudi 18.2の発現レベルを有する細胞を中発現細胞とする。レンチウイルスに感染したNUGC4細胞表面のClaudin18.2式をFACS検出により検出し、Claudin18.2式が最も高いNUGC4/hClaudin18.2モノクローナル細胞系統を選択した。一方、野生型NUGC4細胞表面のClaudin 18.2式はFACSによって検出され、Claudin 18.2の中間式を持つNUGC4クローン化系統を選択した。野生型NUGC4は、Claudin 18.2の低い発現を持つ細胞であった。
選抜されたモノクローナル細胞株を拡大・栽培し、凍結・保存して、その後の試験に供した。
Claudin 18.2 Sequence Genbank: NP_001002026:(配列番号1)
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV.
Claudin 18.2 DNA配列: (SEQ ID No:2)
1 AGAATTGCGC TGTCCACTTG TCGTGTGGCT CTGTGTCGAC ACTGTGCGCC ACCATGGCCG
61 TGACTGCCTG TCAGGGCTTG GGGTTCGTGG TTTCACTGAT TGGGATTGCG GGCATCATTG
121 CTGCCACCTG CATGGACCAG TGGAGCACCC AAGACTTGTA CAACAACCCC GTAACAGCTG
181 TTTTCAACTA CCAGGGGCTG TGGCGCTCCT GTGTCCGAGA GAGCTCTGGC TTCACCGAGT
241 GCCGGGGCTA CTTCACCCTG CTGGGGCTGC CAGCCATGCT GCAGGCAGTG CGAGCCCTGA
301 TGATCGTAGG CATCGTCCTG GGTGCCATTG GCCTCCTGGT ATCCATCTTT GCCCTGAAAT
361 GCATCCGCAT TGGCAGCATG GAGGACTCTG CCAAAGCCAA CATGACACTG ACCTCCGGGA
421 TCATGTTCAT TGTCTCAGGT CTTTGTGCAA TTGCTGGAGT GTCTGTGTTT GCCAACATGC
481 TGGTGACTAA CTTCTGGATG TCCACAGCTA ACATGTACAC CGGCATGGGT GGGATGGTGC
541 AGACTGTTCA GACCAGGTAC ACATTTGGTG CGGCTCTGTT CGTGGGCTGG GTCGCTGGAG
601 GCCTCACACT AATTGGGGGT GTGATGATGT GCATCGCCTG CCGGGGCCTG GCACCAGAAG
661 AAACCAACTA CAAAGCCGTT TCTTATCATG CCTCAGGCCA CAGTGTTGCC TACAAGCCTG
721 GAGGCTTCAA GGCCAGCACT GGCTTTGGGT CCAACACCAA AAACAAGAAG ATATACGATG
781 GAGGTGCCCG CACAGAGGAC GAGGTACAAT CTTATCCTTC CAAGCACGAC TATGTGTAAT
841 GCTCTAAGAC CTCTCAGCAC GGGCGGAAGA AACTCCCGGA GAGCTCACCC AAAAAACAAG
901 GAGATCCCAT CTAGATTTCT TCTTGCTTTT GACTCACAGC TGGAAGTTAG AAAAGCCTCG
961 ATTTCATCTT TGGAGAGGCC AAATGGTCTT AGCCTCAGTC TCTGTCTCTA AATATTCCAC
1021 CATAAAACAG CTGAGTTATT TATGAATTAG AGGCTATAGC TCACATTTTC AATCCTCTAT
1081 TTCTTTTTTT AAATATAACT TTCTACTCTG ATGAGAGAAT GTGGTTTTAA TCTCTCTCTC
1141 ACATTTTGAT GATTTAGACA GACTCCCCCT CTTCCTCCTA GTCAATAAAC CCATTGATGA
1201 TCTATTTCCC AGCTTATCCC CAAGAAAACT TTTGAAAGGA AAGAGTAGAC CCAAAGATGT
1261 TATTTTCTGC TGTTTGAATT TTGTCTCCCC ACCCCCAACT TGGCTAGTAA TAAACACTTA
1321 CTGAAGAAGA AGCAATAAGA GAAAGATATT TGTAATCTCT CCAGCCCATG ATCTCGGTTT
1381 TCTTACACTG TGATCTTAAA AGTTACCAAA CCAAAGTCAT TTTCAGTTTG AGGCAACCAA
1441 ACCTTTCTAC TGCTGTTGAC ATCTTCTTAT TACAGCAACA CCATTCTAGG AGTTTCCTGA
1501 GCTCTCCACT GGAGTCCTCT TTCTGTCGCG GGTCAGAAAT TGTCCCTAGA TGAATGAGAA
1561 AATTATTTTT TTTAATTTAA GTCCTAAATA TAGTTAAAAT AAATAATGTT TTAGTAAAAT
1621 GATACACTAT CTCTGTGAAA TAGCCTCACC CCTACATGTG GATAGAAGGA AATGAAAAAA
1681 TAATTGCTTT GACATTGTCT ATATGGTACT TTGTAAAGTC ATGCTTAAGT ACAAATTCCA
1741 TGAAAAGCTC ACTGATCCTA ATTCTTTCCC TTTGAGGTCT CTATGGCTCT GATTGTACAT
1801 GATAGTAAGT GTAAGCCATG TAAAAAGTAA ATAATGTCTG GGCACAGTGG CTCACGCCTG
1861 TAATCCTAGC ACTTTGGGAG GCTGAGGAGG AAGGATCACT TGAGCCCAGA AGTTCGAGAC
1921 TAGCCTGGGC AACATGGAGA AGCCCTGTCT CTACAAAATA CAGAGAGAAA AAATCAGCCA
1981 GTCATGGTGG CCTACACCTG TAGTCCCAGC ATTCCGGGAG GCTGAGGTGG GAGGATCACT
2041 TGAGCCCAGG GAGGTTGGGG CTGCAGTGAG CCATGATCAC ACCACTGCAC TCCAGCCAGG
2101 TGACATAGCG AGATCCTGTC TAAAAAAATA AAAAATAAAT AATGGAACAC AGCAAGTCCT
2161 AGGAAGTAGG TTAAAACTAA TTCTTTAAAA AAAAAAAAAA GTTGAGCCTG AATTAAATGT
2221 AATGTTTCCA AGTGACAGGT ATCCACATTT GCATGGTTAC AAGCCACTGC CAGTTAGCAG
2281 TAGCACTTTC CTGGCACTGT GGTCGGTTTT GTTTTGTTTT GCTTTGTTTA GAGACGGGGT
2341 CTCACTTTCC AGGCTGGCCT CAAACTCCTG CACTCAAGCA ATTCTTCTAC CCTGGCCTCC
2401 CAAGTAGCTG GAATTACAGG TGTGCGCCAT CACAACTAGC TGGTGGTCAG TTTTGTTACT
2461 CTGAGAGCTG TTCACTTCTC TGAATTCACC TAGAGTGGTT GGACCATCAG ATGTTTGGGC
2521 AAAACTGAAA GCTCTTTGCA ACCACACACC TTCCCTGAGC TTACATCACT GCCCTTTTGA
2581 GCAGAAAGTC TAAATTCCTT CCAAGACAGT AGAATTCCAT CCCAGTACCA AAGCCAGATA
2641 GGCCCCCTAG GAAACTGAGG TAAGAGCAGT CTCTAAAAAC TACCCACAGC AGCATTGGTG
2701 CAGGGGAACT TGGCCATTAG GTTATTATTT GAGAGGAAAG TCCTCACATC AATAGTACAT
2761 ATGAAAGTGA CCTCCAAGGG GATTGGTGAA TACTCATAAG GATCTTCAGG CTGAACAGAC
2821 TATGTCTGGG GAAAGAACGG ATTATGCCCC ATTAAATAAC AAGTTGTGTT CAAGAGTCAG
2881 AGCAGTGAGC TCAGAGGCCC TTCTCACTGA GACAGCAACA TTTAAACCAA ACCAGAGGAA
2941 GTATTTGTGG AACTCACTGC CTCAGTTTGG GTAAAGGATG AGCAGACAAG TCAACTAAAG
3001 AAAAAAGAAA AGCAAGGAGG AGGGTTGAGC AATCTAGAGC ATGGAGTTTG TTAAGTGCTC
3061 TCTGGATTTG AGTTGAAGAG CATCCATTTG AGTTGAAGGC CACAGGGCAC AATGAGCTCT
3121 CCCTTCTACC ACCAGAAAGT CCCTGGTCAG GTCTCAGGTA GTGCGGTGTG GCTCAGCTGG
3181 GTTTTTAATT AGCGCATTCT CTATCCAACA TTTAATTGTT TGAAAGCCTC CATATAGTTA
3241 GATTGTGCTT TGTAATTTTG TTGTTGTTGC TCTATCTTAT TGTATATGCA TTGAGTATTA
3301 ACCTGAATGT TTTGTTACTT AAATATTAAA AACACTGTTA TCCTACAGTT.
（実施例2）抗ヒトクラウディン18.2モノクローナル検出
1 予防接種
ヒトに対する抗クロージン18.2単クローン性抗生物質を、マウスに予防接種して作った。
SJLホワイトマウス、雌、6～8週間を実験に使用した(北京バイタルリバー研究所動物技術株式会社、動物生産ライセンス番号: SCXK (北京)2012～0001)。給餌環境はSPFレベルである。購入後、マウスは1週間、12時間/12時間の光/暗いサイクル、20～25℃、40～60%の温度で実験環境に保管された。その後、環境に適応したネズミを以下の方法で予防接種した。免疫抗原はhuClaudin18.2-HEK293細胞(ヒトClaudin 18.2プラスミドを安定にトランスフェクトしたHEK-293細胞株)とした。
イミュニゼーションプロトコルは、細胞に対する一次予防接種の前に、マウスにTiterMax(R) Gold Adjuvant (Sigma Cat No. T2684)、0.1ml/mouseを腹内(IP)に注入し、1時間後に、各マウスに細胞流体を希釈して1×108/ml/mlの濃度に0.1mlの食塩水を加えて腹内(IP)を注入した。細胞をパイプで均一に分散した後、0日目、14日目、28日目、42日目、56日目に接種した。血液試料は21日、35日、49日、63日に採取し、マウス血清中の血液価はELISA法により測定した。4～5回の免疫後、プラトー傾向にある血清抗体価の高いマウスを選択し、脾細胞との融合を行った。スプレノサイトとの融合の3日前に、昇圧予防接種のために、1×107細胞を腹膜内(IP)に注入した。
2. 脾細胞との融合
PEGを介した溶融法を用いて、スプレニック細胞と骨髄細胞Sp2/0細胞(ATCC(R) CRL-8287TM)を溶融させることにより、ハイブリドマ細胞を得た。ハイブリドマ細胞は、0.5×10～1×6/mlの密度で、完全な媒体(20% FBS、1×ハット、1×OPIからなるIMMMM媒体)で、100mm/wellの96ウェルプレートに播種し、37℃で3～4日間、5% CO2で育成し、ハット完全媒体の100mm/wellを補充し、クローン形成まで3～4日間維持した。上層部を取り除き、HT完成媒体(20% FBS、1×HTおよび1×OPIからなるIMDM媒体)の200mmul/wellを加え、37℃でインキュベートし、3日間CO25%を行った後、ELISA検出を行った。
3 ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
Hybridoma細胞の成長密度によれば、ELISA法を結合させることにより、栽培上質物質を検出した。HEK293細胞と結合しないが、HuClaudin18.2-HEK293細胞に強い結合能力を持つ細胞を選択し、その後、時間をかけて拡大し、凍結保存し、単一細胞クローンが得られるまで、サブクローン化を2～3回行った。
各サブクローニング後の細胞もセルバインディング法で試験した。ハイブリドマクローンは、上記の分析によりスクリーニングにより得られた。さらに、無液細胞栽培法により、抗生物質を調製した。浄化の例に基づいて浄化し、試験例に用いた。
（実施例3）マウス抗体のヒト化
モノクローナルハイブリドマ細胞株Abm1901とAbm1902を、in vitro活動の高い個体を選び、モノクローン検出した後、ヒト化、再結合を表し、活動を評価した。
ハイブリドマからの配列のクローン化の手順は次のとおりであった。対数成長期のハイブリドーマ細胞を採集した。RNAをキットの指示に従ってトリゾル(Invitrogen, 15596 -018)で抽出し、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (Takara, cat # 2680A)によって逆転転写した。逆転転写から生じるcDNAはPCRによってマウスIg-Primer Set (Novagen, TB326 Rev. B 0503)を用いて増幅され、増幅された製品は配列決定のために会社に送られた。得られたDNA配列に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO:3-6に示されている。
mAbm1901 murine重鎖可変領域(SEQ ID NO: 3)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS
mAbm1901 murine軽鎖可変領域(SEQ No:4)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK
mAbm1902 murine重鎖可変領域(SEQ ID NO: 5)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS
mAbm1902 murine軽鎖可変領域(SEQ ID NO:6)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK。
上述のネズミ重鎖および軽鎖可変領域は、以下に述べるように、ヒトIgG1重鎖定常領域とヒトカッパ軽鎖定常領域とそれぞれ結びつき、キメリック抗作用ch1901およびch1902を形成した。
定常領域は、以下の配列から選ばれ、
ヒトIgG1の鎖定常領域(SEQ ID NO: 7)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
人のカッパ軽鎖定常領域: (SEQ ID no: 8)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECである。
ネズミのモノクローン抗生物質は、この分野の多くの文書で明らかにされているように、人為化された。簡単に言うと、親(ムリン)の(イノシシ)の定常領域は、ヒトの定常領域に置き換えられ、CDR接木を行うために、ネズミとヒトの抗生物質のホモロジーに基づいて、ヒトのゲルムライン検出配列を選択した。本発明では、ヒト化のために良好な活性を有する候補分子を選択したが、その結果は以下の通りである。
1. マウス抗体のCDR領域
表4のVH/VL CDRアミノ酸残留物を測定し、カバトナンバリング基準により注釈を付けた。
ネズミの抗生物質のCDR配列は表4に示されている。
マウス抗体のCDR配列
[表４]
2. ヒト生殖細胞系FR領域配列の選択
ネズミのVH/VLCDRの得られた典型的な構造に基づいて、重および軽鎖可変領域配列を、高いホモロジーを持つヒトのゲルムラインテンプレートを得るために、Abid Germlineデータベースと比較した。ヒト生殖細胞系軽鎖フレームワーク領域は、ヒトカッパ軽鎖遺伝子に由来した。
2.1 mAb1901のヒト化および復帰突然変異デザイン
適切なヒト抗体生殖系列を、mAb1901マウス抗体のヒト化のために選択した。Murine acdy mAb1901のCDR領域を選択した人工化テンプレートに接ぎ木し、人工可変領域取得した。SEQ ID NO: 24に示されているような人間化重鎖可変領域配列と、SEQ ID NO: 21に示されているような軽鎖可変領域配列をIgG定常領域と結合し、無傷の抗菌を形成した。同時に、ヒト化された抗たんのV領域のFR領域は、復帰突然変異にさらされ、そして典型的な復帰突然変異と組み合わせは以下のとおりである。
ヒト化mAb1901抗体および復帰変異*
[表５]
*表中のアミノ酸の位置はすべて、カバトの番号づけ基準に従って番号づけされている。重鎖可変領域のN82Tの場合、82はカバト基準によれば82Aの位置を指す。
mAb1901ヒト化抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列
[表６]
上表に示す対応する重鎖可変領域は、配列番号7に示すようにヒトIgG1重鎖定常領域と連結して全長抗体の重鎖を形成することができ、軽鎖可変領域は、配列番号8に示すようにヒトカッパ軽鎖定常領域と連結して全長抗体の軽鎖を形成することができる。他の実施形態では、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が、別々に他の重鎖軽鎖定常領域リンクして、完全な長さの抗菌を形成することができる。
2.2 mAb1902のヒト化および復帰突然変異デザイン
適切なヒト抗体生殖系列を、mAb1902マウス抗体のヒト化のために選択した。mAb1902ネズミのCDR領域を選択した人工化テンプレートに接ぎ木し、人工化された可変領域を得た。ヒューマン化された重鎖可変領域配列は、SEQ ID NO: 31に示されており、軽鎖可変領域配列はSEQ ID NO:28に示されているとおりである。その後、IgG定常領域と再結合され、無傷の検出された。同時に、ヒト化抗体のV領域のFR領域をバック変異させたが、例示的なバック変異法および組合せは以下の通りである。
ヒト化mAb1902抗体及びその復帰突然変異デザイン*
[表７]
*表中のアミノ酸の位置はすべて、カバトの番号づけ基準に従って番号づけされている。
mAb1902ヒト化抗体軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列
[表８]
上表に示す対応する重鎖可変領域は、配列番号7に示すようにヒトIgG1重鎖定常領域と連結して全長抗体の重鎖を形成することができ、軽鎖可変領域は、配列番号8に示すようにヒトカッパ軽鎖定常領域と連結して全長抗体の軽鎖を形成することができる。
一例を挙げると、全長配列は次のとおりである。
キメリック反応ch1901
ch1901 重鎖(SEQ ID NO:35)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ch1901 ライトチェーン(SEQ ID NO: 36)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
キメラ反応ch1902:
ch1902重鎖(SEQ ID No:37)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ch1902 ライトチェーン(SEQ ID No:38)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ヒト化mAb1901抗体
[表９]
フルレングス・イノベーションの軽鎖および重鎖配列は、以下のとおりである。
mAb1901ヒト化抗体軽鎖および重鎖配列
[表１０]
ヒト化mAb1902抗体
[表１１]
フルレングス・イノベーションの軽鎖および重鎖配列は、以下のとおりである。
mAb1901ヒト化抗体軽鎖および重鎖配列
[表１２]
本開示の陽性対照・バイオレンスは、IMAB-362であった(WO2016166122より入手可能)。
IMAB-362 重鎖(SEQ ID NO: 53)
1 QVQLQQPGAE LVRPGASVKLSCKASGYTFT SYWINWVKQRPGQGLEWIGN
51 IYPSDSYTNY NQKFKDKATLTVDKSSSTAY MQLSSPTSEDSAVYYCTRSW
101RGNSFDYWGQ GTTLTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDY
151FPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYI
201CNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKD
251TLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNST
301YRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVY
351TLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLD
401SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK.
IMAB-362 ライトチェーン(SEQ ID NO: 54)
1 DIVMTQSPSS LTVTAGEKVTMSCKSSQSLL NSGNQKNYLTWYQQKPGQPP
51 KLLIYWASTR ESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVQAEDLAVYYCQNDYSY
101PFTFGSGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASVVCLLNNFYPREA
151KVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYAC
201EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC.
上記の抗菌剤は、従来の遺伝子クローン法と組換え発現法により、クローン化され、発現され、精製された。
in vitro生物学的評価
試験例1:細胞レベルでのELISA結合アッセイ
細胞ベースのELISAアッセイを用いて、Claudin 18.2の結合特性を検出した。Claudin 18.2を安定的に発現するNUGC4細胞を96ウェルセルプレート(Corning,3599)で栽培し、細胞成長密度が90%に達するまで、4%のパラホルムアルデヒドを1時間保存した。プレートをPBSTバッファー(PBSに0.05%ツイーン20, pH 7.4を含むPBS)で3回洗浄し、その後、PBSをブロック液として希薄化した5%スキームミルク(ブライトスキームミルク粉末)の200μl/油井を加えて遮断し、37℃インキュベーターで2.5時間または4℃のオーバーナイト(16～18時間)インキュベーターでインキュベーターした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをPBST緩衝液で3回洗浄し、サンプル希釈液(1%脱脂乳含有PBS、pH7.4)で希釈した試験抗体50μl/ウェルを加え、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションが終わった後、板をPBSTで5回洗浄し、試料溶解液で希釈したHRP標識ヤギ(Jackson Immuno Research, Cat. No. 109-035-003)の100mmul/wellを加え、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで6回洗浄した後、TMB発色性基質(KPL, Cat No.52-00-03)の50mm/wellを加え、室温で10～15時間インキュベートし、1M H2 SO4 の50mm/wellを加えて反応を止めた。吸収値はMD Versa Max TMマイクロプレートリーダーで450nmで読み取り、Claudin18.2との結合を示すEC50値を計算した(結果は下表)。
抗体の結合活性
[表１３]
mAb1901ヒト化抗体の結合活性
[表１４－１]
mAb1902ヒト化抗体の結合活性
[表１４-２]
試験例2:細胞レベルでの結合アッセイ
1×106/ml細胞懸濁液を、クラウジン18.2およびFACS緩衝液(2%ウシ胎児血清(Gibco、10099141)をPBS (Sigma、P4417-100TAB)、pH7.4中で安定に発現するNUGC4細胞を用いて調製し、100μl/ウェルで96ウェル丸底プレート(コーニング、3795)中に添加した。遠心分離後、FACS緩衝液で希釈したClaudin 18.2の種々の濃度を50mm/wellで加え、暗所の4℃冷蔵庫で1時間インキュベートした。遠心分離し、300gのFACS緩衝液で3回洗浄した後、Alexa Fluor 488-coated anti-human IgG (H+L) (Invitrogen, A-11013)の作業濃度を加え、40分間暗所の4℃冷蔵庫でインキュベートした。遠心分離し、300gのFACSバッファで3回洗浄した後、BD FACS CantoIIフローサイトメーターで幾何学的平均蛍光強度を測定し、Claudin 18.2を安定的に発現するNUGC4細胞に結合するClaudin 18.2を示すEC50値を計算した。その結果を図1に示す。
試験例3:抗体のエンドサイトーシスアッセイ
DyLight 488 NHS 酸エステル (サーモフィッシャー、46403)でプレ標識したクラウジン18.2抗体を、最終濃度5μg/mlでクラウジン18.2を安定的に発現する1×10 6/ml NUGC4細胞に添加し、暗所で1時間インキュベートした後、遠心分離し、プレクールFACS緩衝液(PBS中2%ウシ胎児血清、pH 7.4)で3回洗浄した後、上澄みを除去し、プレウォームした完全培地を添加し、37℃、5% CO2の細胞インキュベーターに入れた。細胞は、それぞれ0,0.5,1,2,4時間後に取り出し、暗闇の氷上に置いた。すべての試料を採取し、低温で300gで遠心分離し、溶出緩衝液(0.05Mグリシン、塩化ナトリウム0.1M、pH1.7)を加え、室温で7分間インキュベートした。試料を一度300gのFACSバッファーで遠心分離洗浄し、BD FACS CantoIIフローサイトメーターで幾何学的平均蛍光強度を測定し、Claudin 18.2を安定的に発現するNUGC4細胞に対するClaudin 18.2の内細胞効率を計算した。その結果(図2を参照)、人間化された抗生物質は良好な内細胞性効率を持っていることがわかった。
試験例4:フローサイトメトリーを基にした、親和性の判定
試験当日、HEK293/hClaudin18.2細胞を、1ウェル当たり1×105～2×10 5のUボトム96ウェルプレートで採集した。Claudin 18.2/ml、2×傾き希釈(12集中点)の初期濃度を加え、4℃で1時間インキュベートした。ポジティブ・コントロールはIMAB362であり、また、検出なしのウェルをネガティブ・コントロールとした。抗体を遠心分離法で除去した後、FITC 抗ヒトIgG Fc抗体(200×)の100μl/ウェルを加え、4℃で暗い中、30分間インキュベートし、PBS+2% FBSで2回洗浄し、フローサイトメトリー検出用に調製した。BD FACS CantoII が開始され、事前加熱され、BD FACSDiva ソフトウェアによって新しい分析法が確立された。HEK293/hClaudin18.2の陰性対照試料を検出し、FSCとSSC電圧を適切な値に調整して保存した。QuantumTM FITC-5 MESF Kit の指示に従って、ブランクの試料B と標準曲線1 をそれぞれ検出した。FITCの電圧を適宜調整し、節約した。U底96ウェルプレートの試料を保存電圧の下で検出し、データを記録した。Flowjoソフトウェアを用いて実験データを解析し、Geo Mean値を取得し、MESF-Geo Mean標準曲線をQuantumTM FITC-5 MESF Kitの指示に従って適合させた。HEK293/hClaudin18.2細胞に結合したClaudin18.2のモル濃度とフリービーズの濃度は、FITC抗ヒトIgG Fcの濃度蛍光値に基づいて計算し、Scatchardプロット法を用いてBmaxと解離定KDを計算した。結果を表15に示す。
細胞レベルでのヒト化抗体の親和性
[表１５]
試験例5:抗体のADCC効果の評価
種々のNUGC4細胞(Claudin 18.2の高、中、低式)を消化し、1000rpmで遠心分離し、カウントに再び費やした。細胞は、10% FBS (ニュージーランドウルトラローIgG Fetal Bovine Serum, Gibco, 1921005PJ)を含むフェノールレッドフリーRPMI 1640(Gibco, CAT# 11835-030)で3×105細胞/mlで再浮遊した。96ウェルプレート(コーニング、3903)、7500セル/ウェルの各ウェルに25mmの細胞を加えた。上述のフェノールレッドフリー媒体で液体化した3×Abid希釈液を、セルプレートに25mm/wellのAbindを加え、37℃、5% CO2インキュベーターで0.5時間、インキュベーターで育成した。
エフェクター細胞(FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat細胞)を採集し、1000rpmで遠心分離し、計数に再び費やした。細胞は、10%FBS (ニュージーランド超低IgG Fetal Bovine Serum)を含むフェノールレッドフリーRPMI 1640で3×106/mlで再浮遊させ、25mmの細胞をアッセイプレート(7.5×104細胞/ウェル)に加え、37℃、5% CO2インキュベーターで6時間インキュベートした。
Bright-Glo (Promega, E2610)の75mmull/wellをアッセイプレートの各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー(PerkinElmer, VITOR3)で化学発光を検出した。
結果は(表16と図3A-図3Cを参照)、H1901-11とH1902-5の両方が、Claudin 18.2の低、中、高いレベルを表すNUGC4細胞において非常に強いADCC活性を示すことを示している。
Claudin 18.2の異なった発現レベルを持つNUGC4細胞における抗毒素のADCC効果
[表１６]
本出願は、その全体を参照により本明細書に組み込む、２０１９年４月１日に出願された中国特許出願第２０１９１０２５７８５３．６号の優先権を主張する。
本開示は、抗体薬の分野に関する。特に、本開示は、クローディン１８．２抗体及びその用途に関する。
本明細書中の記載は、本開示に関する背景情報を提供するにすぎず、必ずしも従来技術を構成するとは限らない。
クローィン１８（ＣＬＤＮ１８）は、ヒトクローディン１８遺伝子によってコードされるタンパク質であり、細胞内にあるタイトジャンクションタンパク質ファミリーに属する。クローディン１８は、細胞の層間での分子の流れを制御することができる。
クローディン１８タンパク質は、４つの膜貫通領域及び２つの細胞外ループを構造内に含み、Ｎ末端及びＣ末端が細胞質の内部に存在するものである。クローディン１８は、クローディン１８．１及びクローディン１８．２という、２種のスプライシングバリアントを有する。これら２つの配列は、第１の細胞外ループ内にある８個のアミノ酸のみが異なる。クローディン１８．１は、クローディン１８．２とは異なる様式で発現及び分配される。クローディン１８．１は、正常な肺細胞内に選択的に発現するが、これに対してクローディン１８．２の発現は、正常な細胞内では非常に限定的であるが、様々な腫瘍（胃がん、肺がん、膵臓がん等）では、異所的に活性化され、過剰発現することが非常に多い。クローディン１８．２は、胃がん及び他の種類のがんを対象とする潜在的な治療標的として想定されている。この標的の発見により、胃がんを処置するための新たな選択肢も提供される。
本開示は、抗クローディン１８．２抗体を提供する。
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖可変領域が、配列番号：３に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：４に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含むか；又は、
ｉｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：６に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号：１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むか；又は、
ｉｖ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１８、配列番号：１９及び配列番号：２０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
ｉ）、ｉｉ）、ａ）、ｂ）等の項目番号は、列記された技術的解決法又は要素をより明確にして、容易に識別されるものにするためのものにすぎず、いかなる点においても下記の技術的解決法又は要素を限定するものではないことは、当業者ならば理解すべきである。同じ項目番号が使用されている場合、これにより、次の技術的解決法又は要素が同じものであることが意味されるわけではない。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ｖ）重鎖可変領域が、配列番号：３若しくは２４に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：４若しくは２１に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するか；又は、
（ｖｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５若しくは３１に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：６若しくは２８に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（２）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２４に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２１に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（３）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：５に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：５に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：６に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：６に対して少なくとも９０％の同一性を有し；又は、
（４）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２８に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体は、ヒト化抗体であり、ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントに由来するフレームワーク領域を含み、フレームワーク領域バリアントは、ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域のそれぞれに最大１０個の復帰変異を有する。
一部の実施形態において、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸配列番号：２４に示される重鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり、若しくはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号：２１に示される軽鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり；又は、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸配列番号：３１に示される重鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり、若しくはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号：２８に示される軽鎖可変領域のフレームワーク領域と同じである。
一部の実施形態において、好ましくは、フレームワーク領域バリアントは、下記（ａ）又は（ｂ）から選択される変異を含む：
（ａ）軽鎖可変領域に含まれる２２Ｓ、８５Ｉ若しくは８７Ｈのうちの１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる４８Ｉ、８２Ｔ及び６９Ｍからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異；又は、
（ｂ）軽鎖可変領域に含まれる４Ｌ及び２２Ｓからなる群より選択される１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる３８Ｋ、４０Ｒ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９、７１Ｌ及び７３Ｋからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、フレームワーク領域バリアントは、下記（ａ－１）又は（ｂ－１）から選択される変異を含む：
（ａ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異２２Ｓ、８５Ｉ及び８７Ｈ、並びに重鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４８Ｉ及び８２Ｔ；又は、
（ｂ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４Ｌ。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、
（ｖｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３示されたとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：４に示されるとおりであり；又は、
（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：２４、２５、２６若しくは２７に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２１、２２若しくは２３に示されるとおりであり；又は、
（ｉｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：５に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：６に示されるとおりであり；又は、
（ｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３１、３２、３３若しくは３４に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２８、２９若しくは３０に示されるとおりである。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントは、以下に示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ｘｉ）配列番号：３１に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２９に示される軽鎖可変領域配列；又は、
（ｘｉｉ）配列番号：２６に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２３に示される軽鎖可変領域配列。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、以下の表に示される軽鎖可変領域と重鎖可変領域との組合せであってもよい。
Figure 2022528061000005
Figure 2022528061000006
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗体は、抗体定常領域をさらに含む。一部の特定の実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４定常領域並びにこれらのバリアントからなる群より選択され、抗体の軽鎖定常領域は、ヒト抗体κ、λ鎖定常領域及びこれらのバリアントからなる群より選択される。一部の特定の実施形態において、抗体は、配列番号：７に示される重鎖定常領域配列及び配列番号：８に示される軽鎖定常領域配列。一部の特定の実施形態において、抗体は、配列番号：３５若しくは４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する重鎖、及び配列番号：３６若しくは３９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する軽鎖；又は、
配列番号：３７若しくは４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する重鎖、及び／若しくは配列番号：３８若しくは４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する軽鎖
を含む。
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、
（ｃ）配列番号：３５に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３６に示される軽鎖；
（ｄ）配列番号：４２、４３、４４若しくは４５に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：３９、４０若しくは４１に示される軽鎖；
（ｅ）配列番号：３７に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３８に示される軽鎖；又は、
（ｆ）配列番号：４９、５０、５１若しくは５２に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：４６、４７若しくは４８に示される軽鎖
を含む。
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗体は、上記抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントと競合して、ヒトクローディン１８．２に結合する。
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、
アミノ酸配列番号：４４に示される重鎖及び配列番号：４１に示される軽鎖；又は、
アミノ酸配列番号：４９に示される重鎖及び配列番号：４７に示される軽鎖
を含む。
本開示の別の態様は、上記抗クローディン１８．２抗体をコードする核酸分子も提供する。
本開示の別の態様は、上記核酸分子を含む発現ベクターも提供する。
本開示の別の態様は、上記核酸分子又は上記発現ベクターを含む、宿主細胞であって、好ましくは、細菌細胞、真菌細胞、昆虫動物細胞又はほ乳類細胞である、宿主細胞も提供する。
本開示の別の態様は、上記抗クローディン１８．２抗体を細胞傷害薬にコンジュゲート化することによって形成された、抗体－薬物コンジュゲートも提供する。
本開示の別の態様は、細胞傷害薬に共有結合した上記抗クローディン１８．２抗体を含み、又はからなる、抗体－薬物コンジュゲートも提供する。
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を調製するための方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体－薬物コンジュゲートを調製するための方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、治療有効量の上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲートと、１種又は複数種の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、バッファー又は賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を、被試験サンプルと接触させるステップを含む、クローディン１８．２のイムノアッセイ又は検出のための方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、ヒトクローディン１８．２のイムノアッセイ用の試薬の調製のための、上記抗クローディン１８．２抗体の使用を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、クローディン１８．２のイムノアッセイ又は検出に使用するための、上記抗クローディン１８．２抗体を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を含む、キットを提供する。
一部の実施形態において、本開示は、がん又は腫瘍を処置する医薬の調製のための、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物の使用であって、がん又は腫瘍が、好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん（ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんであり；リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんが、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される、使用を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、治療有効量の上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物を対象に投与することを含む、クローディン１８．２に関連する疾患を処置する方法であって、疾患が、好ましくは、がん又は腫瘍であり、より好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんからなる群より選択される、方法を提供する。より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される。
一部の実施形態において、治療有効量は、組成物の単位用量に含まれる上記抗クローディン１８．２抗体又は上記抗体－薬物コンジュゲート０．１ｍｇ～３０００ｍｇ又は１ｍｇ～１０００ｍｇを指す。
一部の実施形態において、本開示は、クローディン１８．２に関連する疾患の処置に使用するための、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物であって、疾患が、好ましくは、がん又は腫瘍であり、より好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんからなる群より選択される、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物を提供する。より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される。
一部の実施形態において、がんは、胃がん、食道がん、肺がん又は膵臓がんである。
一部の実施形態において、抗体又は抗体－薬物コンジュゲートは、上記のように、上記クローディン１８．２が高発現、中発現及び低発現しているがんに治療効果を及ぼすことができる。
本開示において提供されたクローディン１８．２抗体及び抗体－薬物コンジュゲートは、細胞表面抗原に対する優れたアフィニティ、好ましいエンドサイトーシス効率、有力な腫瘍阻害効率、及びより広範な薬学的応用範囲を有し、医薬として臨床で使用するのに適している。
細胞レベルにおけるヒトクローディン１８．２へのヒト化抗体の結合のＦＡＣＳ試験結果。 ＮＵＧＣ４細胞におけるヒト化抗体のエンドサイトーシスアッセイ。 クローディン１８．２の発現レベルが異なるＮＵＧＣ４細胞における、抗体のＡＤＣＣ効果の検出の図である。図３Ａは、（クローディン１８．２が低発現した）野生型ＮＵＧＣ４細胞に対する抗体のＡＤＣＣ効果の検出を示している。図３Ｂは、クローディン１８．２が中発現したＮＵＧＣ４細胞に対する抗体のＡＤＣＣ効果の検出を示している。図３Ｃは、クローディン１８．２が高発現したＮＵＧＣ４細胞に対する抗体のＡＤＣＣ効果の検出を示している。
用語
本開示をより容易に理解するために、下記において、特定の専門用語及び科学技術用語が厳密に規定されている。そうではないと本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されている他のすべての専門用語及び科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示において使用されているアミノ酸に関する３文字のコード及び１文字のコードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）で説明されている。
「細胞傷害薬」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞死又は細胞破壊を起こす物質を指す。細胞傷害薬は、毒素及び化学療法薬等、細胞を死滅させるために使用することができる、化合物を含む。
「毒素」という用語は、細胞の成長又は増殖を可能にする、任意の物質を指すが、このような物質は、細菌、真菌、植物又は動物に由来の低分子毒素及びその誘導体であってよく、エキサテカン等のカンプトテシン誘導体、マイタンシノイド及びＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４等のマイタンシノイド誘導体（ＣＮ１０１５７３３８４）、オーリスタチンＦ（Ｏｒｌｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）（ＡＦ）及びＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、３０２４等のオーリスタチンＦ誘導体（ＷＯ２０１６／１２７７９０Ａ１、化合物７）、ジフテリア毒素、外毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン、α－サルシン、アレウチテス・フォルディ（Ａｌｅｕｔｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）毒性タンパク質、ジアンチン毒性タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）毒性タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。
「化学療法薬」という用語は、腫瘍の処置のために使用することができる、化合物である。このような規定は、がんの増殖を促進し得るホルモン作用を調節、低減、遮断又は阻害することが可能であり、一般には、全身的な方式又は全身療法の方式におけるものである、抗ホルモン剤も含む。化学療法薬自体がホルモンであってもよい。化学療法薬の例には、チオテパ等のアルキル化剤；シクロスファミド（シトキサン（商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベナオドーパ（ｂｅｎａｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むアジリジン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミノキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｏｘｉｄｅ）等のニトロゲンマスタード；メルファラン、ノブエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラムスチン；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソ尿素；クラリスロマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、クロモマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキシ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン等の抗生物質；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、５－ＦＵ等の代謝拮抗物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプテリン、チオメトプテリン、チオグアノプテリン（ｔｈｉｏｇｕａｎｏｐｔｅｒｉｎ）等のメトトレキサートアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アズリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオロウリジン、５－ＦＵ等のピリミジンアナログ；カルステロン、ドロモスタノロングプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗アドレナリン剤；フォリン酸等の葉酸サプリメント；グルクロン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；コルチシン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ピントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；アルテルナリア・テナース（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ）ケト酸；トリイミンキノン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンブラスチンアミド；ダカルバジン；マンニトールマスタード；ミトブロニトール；ジブロモニシキギアルコール（ｄｉｂｒｏｍｏ ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌｃｏｈｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）等のタキサン；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスフェート（ｉｆｏｓｐｈａｔｅ）；ミトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノルビシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸エスペラミシン；カペシタビン；並びに、上記物質のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。上記規定は、腫瘍に対するホルモンの効果を調節又は阻害することができる、抗ホルモン剤も含む。例えば、抗エストロゲンは、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシルタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；並びに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリン等の抗アンドロゲン；並びに、上記物質のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。
本明細書において使用されているとき、「抗体」は、免疫グロブリンを指し、完全な抗体は、鎖間ジスルフィド結合によって２本の同一の軽鎖に連結された２本の同一の重鎖によって形成された、４本のペプチド鎖からなる構造である。免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸の組成及び配置を示すため、異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは、５種類に分類することができ、又は、免疫グロブリンアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと呼ばれることもあり、対応する重鎖は、それぞれμ、δ、γ、α及びεである。ヒンジ領域のアミノ酸組成、並びに重鎖ジスルフィド結合の化造及び場所に応じて、同じ種類のＩｇは、異なるサブタイプにさらに分類することができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域に基づいて、κ鎖又はλ鎖に分類することができる。５種類のＩｇのそれぞれが、κ鎖又はλ鎖を有し得る。
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸配列は可変性が高く、可変領域（Ｆｖ領域）として知られており；Ｃ末端に近いアミノ酸配列の残り部分は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、比較的保存的な配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である。各軽鎖可変領域（ＶＬ）及び各重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端までの順番は、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。
本明細書において使用されているとき、「マウス抗体」という用語は、当技術分野における知識及び技能に従って調製された、抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を指す。その調製においては、クローディン１８．２又はそのエピトープを抗原として試験対象に注射し、その後、所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現させるハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい一実施形態において、マウスクローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とを融合させることによって得られた抗体であり、このような抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫反応を緩和することができる。キメラ抗体を樹立するために、最初に、特異的マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、マウスハイブリドーマから可変領域遺伝子をクローニングする。その後には、必要に応じて、ヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニング化する。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子に連結して、キメラ遺伝子を形成するが、このキメラ遺伝子は、続いて、発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメラ抗体分子を、真核生物系又は原核生物系中で発現させる。本開示の好ましい一実施形態において、キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。クローディン１８．２キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含み、又は、アミノ酸変異（Ｌ２３４Ａ変異及び／又はＬ２３５Ａ変異及び／又はＳ２２８Ｐ変異等）があるＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。
ＣＤＲグラフト化抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域フレームワークへの非ヒトＣＤＲ配列のグラフト化によって生成された抗体、すなわち、異なる種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において生成された抗体を指す。ヒト化抗体は、多数の異種タンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される、異種反応を回避することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を収載した公開ＤＮＡデータベース又は公開されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）で確認することもできるし、さらには、Ｋａｂａｔ，ＥＡら １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版で確認することもできる。免疫原性の低下によって起きる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域中のフレームワーク配列には、活性を維持するように最小限の逆変異（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は復帰変異を発生させてもよい。本開示のヒト化抗体は、酵母ディスプレイによってＣＤＲアフィニティ成熟が実施された、ヒト化抗体も指す。
本開示の一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒト若しくはマウスκ鎖、λ鎖若しくはこれらのバリアントに由来する軽鎖定常領域をさらに含み、又は、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはこれらのバリアントに由来する重鎖定常領域をさらに含み；好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域を含み、又は、アミノ酸変異（Ｌ２３４Ａ変異及び／又はＬ２３５Ａ変異及び／又はＳ２２８Ｐ変異等）があるＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４バリアントを含む。
本明細書において記載されているとき、ヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の「バリアント」は、抗体可変領域の構造及び機能の変更がない、従来技術において開示された重鎖又は軽鎖定常領域バリアントを指す。例示的なバリアントには、重鎖定常領域に対する部位特異的な改変及びアミノ酸置換によって得られた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントが挙げられる。特異的置換は例えば、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、並びに／又は、ノブ・イントゥ・ホール構造（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（これにより、抗体重鎖は、ノブ型Ｆｃとホール型Ｆｃとの組合せを有する。）を生じさせる変異である。これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更することなく、新たな特性を抗体に付与することが実証されている。
「ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）」、「ヒトに由来する抗体」、「完全ヒト抗体」及び「完全ヒト型抗体」は、互換的に使用されており、ヒトに由来する抗体であってもよいし、又は、抗原刺激に反応して特異的なヒト抗体を生成することが当技術分野において知られた任意の方法によって「改変」された遺伝子組換え生物から得られた抗体であってもよい。一部の技術においては、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素が、胚性幹細胞株に由来する細胞株に導入されるが、この場合、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座の破壊が目的とされている。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することが可能であり、トランスジェニック生物を使用して、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖が、１種以上のヒトＤＮＡ供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされるような抗体であってもよい。完全ヒト抗体は、遺伝子若しくは染色体トランスフェクション法及びファージディスプレイ技術によって構築することもできるし、又は、インビトロで活性化されたＢ細胞から構築することもできるが、これらはすべて、当技術分野において公知である。
「完全長抗体」、「完全抗体」、「全抗体」及び「完全な抗体」という用語は、本明細書においては互換的に使用されており、下記に規定された抗原結合性フラグメントとは区別される、実質的に完全な形態の抗体を指す。前述の用語は厳密には、軽鎖及び重鎖中に定常領域を含む抗体を指す。本開示の「抗体」は、「完全長抗体」及びその抗原結合性フラグメントを含む。
一部の実施形態において、本開示の完全長抗体は、以下の表の軽鎖と重鎖との組合せに示されているように、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域とを連結することによって形成された、完全長抗体を含む。当業者は、実際の必要性に応じて、様々な抗体供給源から、ヒト抗体由来の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域等の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を選択することができる。
「抗原結合性フラグメント」又は「機能的フラグメント」という用語は、抗原（例えば、クローディン１８．２）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１種以上のフラグメントを指す。完全長抗体のフラグメントを使用して、抗原結合機能を獲得できることが示されてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる結合性フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域中のジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントによって形成された二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のアームのうちの１つに属するＶＨ及びＶＬドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）鎖間ジスルフィド結合を介してＶＨ及びＶＬによって形成された抗原結合性フラグメントである、ｄｓＦｖ；並びに、（ｖｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及びＦａｂ等のフラグメントを含有する二重特異性抗体、二特異性抗体及び多特異性抗体が挙げられる。さらに、ＦｖフラグメントのＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ＶＬドメインとＶＨドメインとの対合によって形成された一価分子である単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９～５８８３を参照されたい。）を生成するように、合成リンカーによって連結されている。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる。このような抗体フラグメントは、当技術分野において知られた慣用的な技法を用いて得られるが、インタクト抗体の場合と同じ方法を用いることにより、機能的フラグメントについてスクリーニングされる。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術又はインタクト免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的破壊によって生成することができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体の形態であり得る。
Ｆａｂは、パパインと同じ活性を有する酵素によってＩｇＧ抗体分子を処理することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンと同じ活性を有する酵素によってＩｇＧを消化することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２を切断することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
さらに、Ｆａｂ’は、Ｆａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、ベクターを宿主に導入することによって、生成することができる。
「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＬ）に連結された抗体重鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＨ）を含む、分子を指す。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を有する。本開示において使用され得る他のリンカーは、限定されるわけではないが、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～６４４８；Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５～７３１；Ｃｈｏｉら（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４～１０６；Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５～３０６１；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１～５６及びＲｏｏｖｅｒｓら（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ等の文献によって説明されている。
二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ又はＦａｂがダイマー化された抗体フラグメントであり、二価抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。これらの２種の抗原は、二価抗原結合活性が同じであってもよいし、又は異なってもよい。
二特異性抗体及び多特異性抗体は、２個以上の抗原又は抗原決定基に結合することができる抗体を指す。
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬのそれぞれの中にある１個のアミノ酸残基を、システイン残基によって置換し、次いで、置換されたポリペプチドを、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結することによって得られる。システイン残基によって置換すべきアミノ酸残基は、公知の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４））による抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる。
「アミノ酸の差異」又は「アミノ酸変異」という用語は、元々のタンパク質又はポリペプチドに比較した、タンパク質バリアント又はポリペプチドバリアント中におけるアミノ酸の変化又は変異を指し、元々のタンパク質又はポリペプチドを基準にした１つ、２つ又は３つ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む。
「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のための足場として機能する、ＶＬ又はＶＨである可変ドメインの一部を指す。本質的には、「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」は、ＣＤＲを有さない可変ドメインである。
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」又は「超可変領域」という用語は、抗原結合の主因となる抗体可変ドメイン中に存在する６つの超可変領域のうちの１つを指す。一般に、各重鎖可変領域中には３種のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域中には３種のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、様々な周知のスキームのいずれかによって決定することが可能であり、「Ｋａｂａｔ」式ナンバリング基準（Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照されたい。）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」式ナンバリング基準（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７～９４８を参照されたい。）及びＩｍｍｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング基準（Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２～１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＰ等、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５～７７（２００３））等が挙げられる。例えば、古典的なフォーマットに関しては、Ｋａｂａｔ式基準に従った場合、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５番（ＨＣＤＲ１）、５０～６５番（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２番（ＨＣＤＲ３）として付番されており；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４番（ＬＣＤＲ１）、５０～５６番（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７番（ＬＣＤＲ３）として付番されている。Ｃｈｏｔｈｉａ式基準に従った場合、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３２番（ＨＣＤＲ１）、５２～５６番（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２番（ＨＣＤＲ３）；ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６～３２番（ＬＣＤＲ１）、５０～５２番（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６番（ＬＣＤＲ３）として付番されている。Ｋａｂａｔ式とＣｈｏｔｈｉａ式との両方を組み合わせて、ＣＤＲを規定することにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）とから構成される。ＩＭＧＴ基準に従った場合、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３５番（ＣＤＲ１）、５１～５７番（ＣＤＲ２）及び９３～１０２番（ＣＤＲ３）として概ね付番されており、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２７～３２番（ＣＤＲ１）、５０～５２番（ＣＤＲ２）及び８９～９７番（ＣＤＲ３）として概ね付番されている。ＩＭＧＴ式基準に従った場合、抗体のＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍによって決定することができる。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が結合する抗原上の部位（例えば、クローディン１８．２分子上にある特定の部位）を指す。エピトープは、一般的に、一意な三次構造の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の隣接する又は隣接しないアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的結合」又は「特異的結合」という用語は、抗原上にある所定のエピトープへの抗体の結合を指す。一般的に、抗体は、約１０－８Ｍ未満、例えば、約１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満又はより低いアフィニティ（ＫＤ）によって結合する。
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体と抗原との相互作用に関する解離平衡定数を指す。一般に、本開示の抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ未満又は１０－９Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）により、クローディン１８．２又はそのエピトープに結合し、例えば、細胞表面抗原に対する本開示の抗体のアフィニティは、ＦＡＣＳ法によるＫＤ値の測定によって判定された。
同じエピトープに関して競合する抗原結合性タンパク質との関連において「競合」という用語が使用されている場合、この「競合」という用語は、競合が抗原結合性タンパク質間で起きることを意味するが、このような競合は、被試験抗原結合性タンパク質（例えば、抗体又はその機能的フラグメント）が、共通抗原（例えば、クローディン１８．２抗原又はそのフラグメント）への参照用抗原結合性タンパク質（例えば、リガンド又は参照用抗体）の特異的結合を阻止又は阻害（例えば、低減）する、アッセイによって判定される。ある抗原結合性タンパク質が別の抗原結合性タンパク質と競合するかどうかを判定するためには、数多くの種類の競合的結合アッセイが利用可能である。これらのアッセイは、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、競合サンドイッチアッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２～２５３を参照されたい。）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４～３６１９を参照されたい。）、固相調節標識アッセイ、固相調節標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。）；Ｉ－１２５標識を用いる固相調節標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７～１５を参照されたい。）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６～５５２を参照されたい。）；及び調節標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７～８２）である。一般的に、アッセイは、無標識の試験用抗原結合性タンパク質と、標識された参照用抗原結合性タンパク質との両方を担持した固体表面又は細胞に結合することができる、精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験用抗原結合性タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定することによって決定される。通常、試験用抗原結合性タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイ（抗原結合性タンパク質と競合する）によって同定される抗原結合性タンパク質は、参照用抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質；及び、参照用抗原結合性タンパク質が結合するエピトープに十分に近いものであるエピトープに結合する抗原結合性タンパク質を含み、これらの２種のエピトープが互いに対して空間的に干渉して、結合を妨害する。競合的結合を判定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例において提供されている。一般的に、競合する抗原結合性タンパク質が過剰に存在する場合、これにより、共通抗原への参照用抗原結合性タンパク質の特異的結合の少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％又は７５％以上を阻害（例えば、低減）する。場合によっては、前述の結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％又は９７％以上阻害される。
本明細書において使用されているとき、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖であってもよいし、又は二本鎖であってもよく、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ｍＲＮＡ若しくは修飾ｍＲＮＡである。核酸は、別の核酸配列との間に機能的関係があるように配置されている場合、「機能可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に機能可能に連結されている。
アミノ酸配列の「同一性」は、最大の配列同一性の百分率を与えるようにアミノ酸配列がアラインメントされた（必要に応じてギャップも導入する）ときの、第１の配列と第２の配列との間で同一であるアミノ酸残基の百分率を指し、いかなる保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）も、配列同一性の一部として考えない。アミノ酸配列同一性の百分率を決定するために、アラインメントは、当技術分野の範囲に含まれる様々な方法によって達成することが可能であり、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。
「発現ベクター」という用語は、自身が連結している別の核酸の輸送を可能にする、核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であるが、「プラスミド」は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションすることもできる、円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態において、ベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされていてもよい、ウイルスベクターである。本明細書において開示されたベクターは、このベクターが導入された宿主細胞（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーマル型ほ乳類ベクター）内で自己複製することでき、又は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るが、これにより、宿主ゲノム（例えば、非エピソーマル型ほ乳類ベクター）と一緒に複製される。
抗体及び抗原結合性フラグメントを生成及び精製するための方法は、当技術分野、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第５～８章及び第１５章において周知である。例えば、マウスは、ヒトクローディン１８．２又はそのフラグメントによって免疫化することが可能であり、得られた抗体は後で、当技術分野において周知の慣用的な方法によって復元、精製及びアミノ酸配列のシーケンシングを行うことができる。抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製することもできる。本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域に１つ以上のヒトフレームワーク領域を組み込むように改変されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ経由でＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から得ることもできるし、又は、ＭＯＥソフトウェアを使用して、ＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースに突き合わせてアラインメントすることにより、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、２００１、ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から得ることもできる。
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞又は動物細胞を含み得る。トランスフォーメーションしやすい細菌には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株等の腸内細菌のメンバー；バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、２９３細胞及びＮＳ０細胞が挙げられる。
本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、発現ベクター内に組み換えることもできる。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、宿主細胞内に安定的にトランスフェクションすることができる。より推奨される一従来技術として、ほ乳類発現系により、抗体を、特に、Ｆｃ領域に属する高度に保存されたＮ末端位をグリコシル化することができる。安定なクローンは、ヒトクローディン１８．２に特異的に結合する抗体を発現させることによって、得られる。陽性クローンをバイオリアクター内で増やして、抗体を産生することもできる。抗体が分泌された培地は、慣用的な技法によって精製することができる。例えば、精製は、バッファーによって調整されたプロテインＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムによって実施することができる。非特異的結合性成分は、洗い流される。結合した抗体を、ｐＨの勾配によって溶出させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって抗体フラグメントを検出し、次いで貯留した。抗体は、一般的な技法を用いてろ過及び濃縮することができる。可溶性の混合物及びマルチマーは、サイズ排除又はイオン交換等の一般的な技法によって効果的に取り除くことができる。次いで、得られた生成物は、例えば－７０℃で直ちに凍結され、又は凍結乾燥されてもよい。
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生体液に対して用いられているときの「投与」、「投薬」又は「処置」は、外因性医薬、治療剤、診断薬又は組成物を、動物、人間、対象、細胞、組織、器官又は生体液と接触させることを指す。「投与」、「投薬」又は「処置」は、例えば、治療法、薬物動態に関する方法、診断法、研究方法及び実験方法を指し得る。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させることと、試薬を流体と接触させた後、細胞と接触させることとを包含する。「投与」、「投薬」又は「処置」は、試薬、診断薬、結合作用のある化合物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）又は別の細胞によって、例えば細胞をインビトロ又はエクスビボで処置することも意味する。ヒト、獣医学的対象又は研究対象に適用された場合の「処置」は、治療処置、予防的又は予防措置、研究及び診断の適用を指す。
「処置する」は、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントのいずれかを含む組成物等の治療剤を、それに対して治療剤が治療活性を有することが知られている１種以上の疾患症状のある患者に、内用方式又は外用方式で投与することを意味する。一般的に、治療剤は、処置すべき患者又は集団の１種以上の疾患症状を緩和するのに効果的な量で与えられ、これによって、臨床的に測定できる任意の度合いまでこのような症状の後退を誘導し、又はこのような症状の進行を阻害する。何らかの特定の疾患症状を緩和するのに効果的な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに、望ましい反応を患者に誘発させる薬物の能力等の様々な因子に応じて変化し得る。疾患症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度又は進行状況を評価するために医師又は他の熟練の医療従事者によって一般的に使用されている任意の臨床測定によって、評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、処置方法又は製造物）は、あらゆる患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するのに有効ではないこともあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ検定及びウィルコクソン検定等の当技術分野において知られた任意の統計学的な検定によって判定されたときに、統計学的に有意な数の患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するはずである。
「保存的修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「保存的置換又は保存的置きかえ」は、タンパク質の生物活性を変化させることなく高頻度で変更を起こすことができるように、類似の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造及び剛直性等）を有する他のアミノ酸によって、タンパク質中のアミノ酸を置換することを指す。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの必須でない領域における単一のアミノ酸置換が、生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁、第４版を参照されたい。）。さらに、構造的に又は機能的に類似するアミノ酸による置換は、生物活性を乱す可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下の表の「例示的なアミノ酸の保存的置換」に記載されている。
Figure 2022528061000007
「有効量」又は「有効用量」は、何らかの１種以上の有益な又は望ましい結果を得るために必要な医薬、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的な用途に関しては、有益な又は望ましい結果は、状態の生化学的徴候、組織学的徴候及び行動上の徴候、状態の合併症、並びに、状態の発症中における中間的な病理学的表現型を含む、疾患の危険性の排除若しくは低減、重症度の低下又は発症の遅延を含む。治療的な用途に関しては、有益な又は望ましい結果は、本開示の標的抗原に関連する様々な状態の罹患率の低下若しくはこのような状態の１種以上の症状の改善、前述の状態を処置するために必要な他の作用物質の投薬量の低減、別の作用物質の有効性の向上、及び／又は、患者における本開示の標的抗原に関連する状態の進行の遅延等の臨床結果を含む。
「外因性」は、状況に応じて生物、細胞又は人間の外部で生成された物質を指す。
「内因性」は、状況に応じて細胞、生物又は人体で生成された物質を指す。
「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。比較すべき２つの配列の両方に含まれるある位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれに含まれるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子は、前述の位置のところが相同である。２つの配列間の同一性の百分率は、比較すべき位置の数で割った後で１００をかけた、２つの配列に共有される一致している位置又は相同な位置の数の関数である。例えば、２つの配列が最適にアラインメントされた場合、２つの配列中にある１０の位置のうちの６つが一致している又は相同であるとき、これらの２つの配列は、６０％相同であり；２つの配列中にある１００の位置のうちの９５が一致している又は相同であるとき、これらの２つの配列は、９５％相同である。一般に、２つの配列がアラインメントされた場合、比較は、最大の同一性の百分率を与えるように実施される。例えば、比較は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実施することが可能であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、アルゴリズムのパラメータは、各参照配列の全長にわたって各配列間で最大の一致を与えるように選択される。次の参考文献は、配列分析のために頻繁に使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに言及している：ＢＬＡＳＴ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ）：Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳＦら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６～２７２；Ｍａｄｄｅｎ，ＴＬら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１～１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９～６５６。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴから入手可能なもの等、他の慣用的なＢＬＡＳＴアルゴリズムも当業者に周知である。
本明細書において使用されているとき、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用されてており、このような呼称はすべて、子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、継代数にかかわらず、初代被検細胞及びこの細胞由来の培養物を含む。すべての子孫は、意図的な変異又は意図的でない変異のため、ＤＮＡ含量が正確に同一ではないこともあり得ることも、理解すべきである。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する、変異のある子孫も含まれる。はっきりと異なる呼称が意図されている場合、そのことは、文脈から明確に理解されよう。
「単離される」は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、又は、細胞破片及び増殖培地等の他の物質等の他の生体分子を実質的に不含である分子を指す。前述の物質が実験又は治療における本明細書に記載の化合物の使用に有意に干渉する量で存在しない限り、一般には、「単離される」という用語は、前述の物質が完全に存在せず、又は水、バッファー若しくは塩が存在しないことを意味するように意図されていない。
「任意選択による」又は「任意選択により」は、後に続く事象又は状況が発生し得るが、必ずしも発生するとは限らないことを意味するが、その記載は、事象又は状況が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。
「医薬組成物」は、本開示による１種以上の化合物又はその生理学的に／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、生理学的に／薬学的に許容されるキャリア及び賦形剤等の他の化学成分とを含む、混合物を指す。医薬組成物は、生物への投与を容易にして、有効成分の吸収を促進することにより、生物学的効果を発揮することを目的とする。
「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、抗体又は抗原結合性フラグメントの送達を目的とした製剤中への使用に適した、任意の不活性物質を指す。キャリアは、粘着防止剤、粘着剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤又は希釈剤、保存料（抗酸化剤、抗菌剤又は抗真菌剤等）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤及びバッファー等であってよい。適切な薬学的に許容されるキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール）デキストロース、植物油（オリーブオイル等）、生理食塩水、バッファー、緩衝生理食塩水、並びに、ショ糖、ポリオール、ソルビトール及び塩化ナトリウム等の等張剤が挙げられる。
さらに、本開示は、有効成分として本開示の抗クローディン１８．２抗体又はその抗体結合性フラグメントを含む、標的抗原（クローディン１８．２等）に対して陽性の細胞に関連する疾患を処置するための作用物質を含む。
本開示におけるクローディン１８．２関連疾患には、その疾患がクローディン１８．２に関連する限り、特に制限はない。例えば、本開示の分子によって誘導される治療反応は、（１）ヒトクローディン１８．２への本開示の分子の結合により、クローディン１８．２の受容体／リガンドへのクローディン１８．２の結合を阻止すること、又は、（２）クローディン１８．２を過剰発現した腫瘍細胞を死滅させることを含む。したがって、本開示の分子は、治療用途に適した調製物及び製剤に含まれる場合、腫瘍又はがん、好ましくはメラノーマ、結腸がん、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、膀胱がん等を有する人物にとって非常に有用である。
さらに、本開示は、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の免疫検出又は測定のための方法と、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の免疫検出又は測定のための試薬と、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）を発現した細胞の免疫検出又は測定のための方法と、標的抗原（例えば、ヒトクローディン１８．２）を特異的に認識し、細胞外アミノ酸配列又はその三次構造に結合する、本開示の抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含む、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）に対して陽性の細胞に関連する疾患を診断するための診断薬とにも関する。
本開示において、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の量を検出又は測定するための方法は、任意の公知の方法であってよい。このような方法には、例えば、イムノアッセイ法又は免疫検出法が挙げられる。
イムノアッセイ法又は免疫検出法は、標識された抗原又は抗体によって、抗体又は抗原の量を検出又は測定する方法である。イムノアッセイ又は免疫検出法の例には、放射性物質標識免疫抗体方法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法、ウエスタンブロッティング及び物理化学的方法等が挙げられる。
クローディン１８．２陽性細胞に関連する上記疾患は、本開示の抗体又は抗体フラグメントを使用してクローディン１８．２を発現した細胞を検出又は測定することによって、診断することができる。
ポリペプチドを発現した細胞は、公知の免疫検出法、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色及び免疫組織染色（ｉｍｍｕｎｏｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）等によって検出することができる。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）による蛍光抗体染色法等の方法を使用することもできる。
本開示においては、組織、細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液又は培地等、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）について検出又は測定すべきサンプルには、そのサンプルが、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）を発現した細胞を含み得る限り、特に制限はない。
必要とされる診断法に応じて、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含む診断薬は、抗原－抗体反応を実施するための試薬又は抗原－抗体反応を検出するための試薬を含むこともできる。抗原－抗体反応を実施するための試薬には、バッファー及び塩等が挙げられる。検出のための試薬には、イムノアッセイ法又は免疫検出法において一般的に使用される試薬、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメント又はそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、及び標識に対応する基質が挙げられる。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細が上記明細書には記載されている。本開示の実施及び試験においては、本明細書に記載されたものに類似する又は同一の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に説明する。本明細書及び特許請求の範囲を通して、本開示に関する他の特徴、目的及び利点が明らかになろう。本明細書及び特許請求の範囲においては、そうではないと文脈により明確に示されていない限り、単数形は、複数の態様も含む。そうではないと本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語及び科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書において引用されたすべての特許及び刊行物は、参照により組み込む。下記の例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に説明するために提供されている。これらの例は、いかなる点においても本開示の範囲を限定するものとして解されるべきでなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
（実施例１）
クローディン１８．２を高発現する細胞株の構築
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬を使用して、ｐＣＤＨ－ｈクローディン１８．２レンチウイルス発現ベクタープラスミドと、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１レンチウイルスシステムパッケージングベクターとをウイルスパッケージング細胞２９３Ｔにトランスフェクションした。ウイルスを含有する培地の上清を収集し、ろ過し、超高速で遠心分離した。濃縮されたウイルスを使用して、ヒト胃印環細胞がん細胞株ＮＵＧＣ４を感染させ、ピューロマイシンによって２～３週間スクリーニングした後、ＦＡＣＳシングルセルソーティングによってソーティングした。
クローディン１８．２の発現レベルを、腫瘍ＩＨＣスコアに応じて判定した。クローディン１８．２の発現レベルがＩＨＣスコア３の腫瘍のものと同等の細胞は、高発現細胞として考えられており、クローディン１８．２の発現レベルがＩＨＣスコア２の腫瘍のものと同等の細胞は、中発現細胞として考えられている。レンチウイルスを感染させたＮＵＧＣ４細胞の表面上におけるクローディン１８．２の発現を、ＦＡＣＳ検出によって検出し、クローディン１８．２の発現が最も多いＮＵＧＣ４／ｈクローディン１８．２モノクローナル細胞株を選択した。同時に、野生型ＮＵＧＣ４細胞の表面上におけるクローディン１８．２の発現を、ＦＡＣＳによって検出し、クローディン１８．２が中発現したＮＵＧＣ４クローン細胞株を選択した。野生型ＮＵＧＣ４は、クローディン１８．２が低発現した細胞だった。
選択したモノクローナル細胞株を増加及び培養し、凍結させ、後続のアッセイのために貯蔵した。
クローディン１８．２配列Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＰ＿００１００２０２６：（配列番号：１）
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ。
クローディン１８．２ＤＮＡ配列：（配列番号：２）
１ ＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣ ＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧ ＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴ ＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧ
６１ ＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧ ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧ ＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧ ＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ ＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧ ＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧ
１２１ ＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣ ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣ ＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧ
１８１ ＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡ ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ ＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡ ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣ ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴ
２４１ ＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡ ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣ ＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧ ＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡ
３０１ ＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧ ＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴ ＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴ ＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴ
３６１ ＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴ ＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ ＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡ ＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧ ＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡ
４２１ ＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴ ＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡ ＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴ ＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣ
４８１ ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡ ＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧ ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡ ＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣ ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴ ＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣ
５４１ ＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡ ＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣ ＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧ ＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧ
６０１ ＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴ ＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴ ＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧ ＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧ ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧ
６６１ ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡ ＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ ＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧ ＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡ ＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣ ＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧ
７２１ ＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴ ＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴ ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡ ＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧ
７８１ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴ ＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣ ＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣ ＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴ
８４１ ＧＣＴＣＴＡＡＧＡＣ ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣ ＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡ ＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡ ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣ ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧ
９０１ ＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＴ ＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴ ＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣ ＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＧ
９６１ ＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴ ＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣ ＡＡＡＴＧＧＴＣＴＴ ＡＧＣＣＴＣＡＧＴＣ ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡ ＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣ
１０２１ ＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧ ＣＴＧＡＧＴＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＡＴＴＡＧ ＡＧＧＣＴＡＴＡＧＣ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣ ＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴ
１０８１ ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴ ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧ ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴ ＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
１１４１ ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴ ＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴ ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣ ＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡ
１２０１ ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣ ＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣ ＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴ ＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡ ＡＡＧＡＧＴＡＧＡＣ ＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴ
１２６１ ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＣ ＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴ ＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣ ＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴ ＴＧＧＣＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＡＣＡＣＴＴＡ
１３２１ ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡ ＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡ ＧＡＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＧＴＡＡＴＣＴＣＴ ＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧ ＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴ
１３８１ ＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧ ＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡ ＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡ ＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴ ＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧ ＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡ
１４４１ ＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣ ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣ ＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡ
１５０１ ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴ ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴ ＴＴＣＴＧＴＣＧＣＧ ＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴ ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡ
１５６１ ＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡ ＧＴＣＣＴＡＡＡＴＡ ＴＡＧＴＴＡＡＡＡＴ ＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴ ＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴ
１６２１ ＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴ ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡ ＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣ ＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＡＴＡＧＡＡＧＧＡ ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡ
１６８１ ＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴ ＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴ ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ
１７４１ ＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡ ＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣ ＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴ ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ ＧＡＴＴＧＴＡＣＡＴ
１８０１ ＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴ ＧＴＡＡＧＣＣＡＴＧ ＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡ ＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧ ＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧ
１８６１ ＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣ ＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧ ＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡ ＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣ
１９２１ ＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣ ＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡ ＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴ ＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡ
１９８１ ＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧ ＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣ ＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧ ＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴ
２０４１ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧ ＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣ ＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ ＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ
２１０１ ＴＧＡＣＡＴＡＧＣＧ ＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣ ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡ ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴ ＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣ ＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴ
２１６１ ＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧ ＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡ ＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧ ＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴ
２２２１ ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡ ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴ ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣ ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣ ＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧ
２２８１ ＴＡＧＣＡＣＴＴＴＣ ＣＴＧＧＣＡＣＴＧＴ ＧＧＴＣＧＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴ ＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡ ＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴ
２３４１ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣ ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴ ＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧ ＣＡＣＴＣＡＡＧＣＡ ＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣ ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣ
２４０１ ＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧ ＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ ＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴ ＣＡＣＡＡＣＴＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
２４６１ ＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣ ＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣ ＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ ＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣ
２５２１ ＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡ ＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡ ＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ ＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣ ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡ
２５８１ ＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣ ＴＡＡＡＴＴＣＣＴＴ ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡ ＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡ
２６４１ ＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧ ＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧ ＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴ ＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣ ＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＧ
２７０１ ＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴ ＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ ＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴ ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧ ＴＣＣＴＣＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＧＴＡＣＡＴ
２７６１ ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡ ＣＣＴＣＣＡＡＧＧＧ ＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧ ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧ ＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣ
２８２１ ＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＧＧ ＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣ ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣ ＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴ ＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧ
２８８１ ＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣ ＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡ ＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡ
２９４１ ＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧ ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＴＴＴＧＧ ＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧ ＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧ ＴＣＡＡＣＴＡＡＡＧ
３００１ ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡ ＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣ ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ ＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣ
３０６１ ＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣ ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣ ＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴ
３１２１ ＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴ ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ ＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡ ＧＴＧＣＧＧＴＧＴＧ ＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧ
３１８１ ＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣ ＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡ
３２４１ ＧＡＴＴＧＴＧＣＴＴ ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧ ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣ ＴＣＴＡＴＣＴＴＡＴ ＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡ ＴＴＧＡＧＴＡＴＴＡ
３３０１ ＡＣＣＴＧＡＡＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴ ＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡ ＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡ ＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴ。
（実施例２）
抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体の産生
１ 免疫化
マウスを免疫化することによって、抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を産生した。
６～８週齢の雌のＳＪＬ白色マウスを、実験（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（北京）２０１２－０００１）のために使用した。給餌環境：ＳＰＦレベル。購入後、マウスは、２０～２５℃の温度、４０～６０％の湿度において、１２／１２時間の明暗サイクルで１週間、実験環境の中で飼育した。次いで、環境に順応したマウスを、下記のスキームに従って免疫化した。免疫抗原は、ｈｕクローディン１８．２－ＨＥＫ２９３細胞（ヒトクローディン１８．２プラスミドを安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３細胞株）だった。
免疫化プロトコル：細胞による一次免疫化の前に、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２６８４）を、０．１ｍｌ／マウスでマウスに腹腔内（ＩＰ）注射し；３０分後、各マウスには、０．１ｍｌの生理食塩水によって１×１０８／ｍｌの濃度に希釈された細胞液を腹腔内（ＩＰ）注射した。ピペッティングによって細胞を均一に分散させた後、０日目、１４日目、２８日目、４２日目及び５６日目に細胞に接種した。２１日目、３５日目、４９日目及び６３日目に血液サンプルを収集し；マウス血清中における抗体価をＥＬＩＳＡ法によって判定した。４～５回の免疫化の後、プラトーに達する高い血清抗体価を有するマウスを、脾細胞との融合のために選択した。脾細胞との融合の３日前には、ブースター免疫化のために、１×１０７個の細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。
２．脾細胞との融合
ＰＥＧ媒介式の融合手順を用いることにより、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞を、０．５×１０６～１×１０６／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に再懸濁させ、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＡＴ完全培地を添加したら、クローンが形成されるまでさらに３～４日間維持した。上清を取り除き、２００μｌ／ｗｅｌｌのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ及び１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出に供した。
３ ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、結合ＥＬＩＳＡ法（ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ）によって培養上清を検出した。ｈｕクローディン１８．２－ＨＥＫ２９３細胞への強直な結合能力を有するが、ＨＥＫ２９３細胞には結合しない細胞を選択した後、遅滞なく増やし、冷凍保存し；単一の細胞クローンが得られるまでサブクローニングを２～３回実施した。
各サブクローニング後の細胞も、細胞結合アッセイによって試験した。上記アッセイによるスクリーニングによって、ハイブリドーマクローンを得た。無血清細胞培養法によって、抗体をさらに調製した。抗体は、精製の例に従って精製し、試験例において使用した。
（実施例３）
マウス抗体のヒト化
インビトロ活性が高いモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１９０１及びｍＡｂ１９０２を選択し；モノクローナル抗体配列をクローニングした後、ヒト化し、組換え発現させ、活性について評価した。
ハイブリドーマから配列をクローニングする手順は、次のとおりだった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。キットの取扱説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）によってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）によって逆転写した。逆転写から得られたｃＤＮＡは、マウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ０５０３）を使用してＰＣＲによって増幅し、増幅された生成物は、シーケンシングのために、ある会社に送付した。得られたＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は、配列番号：３～６に示されている。
ｍＡｂ１９０１マウス重鎖可変領域（配列番号：３）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０１マウス軽鎖可変領域（配列番号：４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
ｍＡｂ１９０２マウス重鎖可変領域（配列番号：５）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０２マウス軽鎖可変領域（配列番号：６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ。
キメラ抗体ｃｈ１９０１及びｃｈ１９０２を形成するように、上記マウス重鎖及び軽鎖可変領域、それぞれ下記のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトκ軽鎖定常領域に連結した。
定常領域は、以下の配列から選択した：
ヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域（配列番号：７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ヒトκ軽鎖定常領域：（配列番号：８）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
当技術分野の多数の文献で開示されているようにして、マウスモノクローナル抗体をヒト化した。簡単に説明すると、親（マウス抗体）定常ドメインをヒト定常ドメインによって置きかえ、マウス抗体とヒト抗体との相同性に基づいて、ヒト生殖細胞系列抗体配列を選択して、ＣＤＲグラフト化を実施した。本発明においては、好ましい活性を有する候補分子をヒト化のために選択したが、その結果は、以下のとおりである。
１．マウス抗体のＣＤＲ領域
表４中のＶＨ／ＶＬ ＣＤＲアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。
マウス抗体のＣＤＲ配列は、表４に示されている。
Figure 2022528061000008
２．ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列の選択
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的構造に基づいて、重鎖及び軽鎖可変領域配列を抗体生殖細胞系列データベースと比較して、相同性が高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子に由来した。
２．１ ｍＡｂ１９０１のヒト化及び復帰変異の設計
ｍＡｂ１９０１マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０１のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。配列番号：２４に示されるヒト化重鎖可変領域配列及び配列番号：２１に示される軽鎖可変領域配列を、ＩｇＧ定常領域と合わせて、インタクト抗体を形成する。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異及び組合せは、以下のとおりである。
Figure 2022528061000009
 ＊表中のすべてのアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って付番した。重鎖可変領域のＮ８２Ｔの場合、８２は、Ｋａｂａｔ基準に従った８２Ａの位置を指す。
Figure 2022528061000010
上記表に示された対応する重鎖可変領域を、配列番号：７に示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結して、完全長抗体の重鎖を形成することもできるし、軽鎖可変領域を、配列番号：８に示されるヒトκ軽鎖定常領域に連結して、完全長抗体の軽鎖を形成することもできる。他の実施形態において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を他の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域に別々に連結して、完全長抗体を形成することもできる。
２．２ ｍＡｂ１９０２のヒト化及び復帰変異の設計
ｍＡｂ１９０２マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０２のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。ヒト化重鎖可変領域配列は、配列番号：３１に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列は、配列番号：２８に示されるとおりであるが；次いで、ＩｇＧ定常領域によって組み換えて、インタクト抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異の方法及び組合せは、以下のとおりである。
Figure 2022528061000011
Figure 2022528061000012
上記表に示された対応する重鎖可変領域を、配列番号：７に示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結して、完全長抗体の重鎖を形成することもできるし、軽鎖可変領域を配列番号：８に示されるヒトκ軽鎖定常領域に連結して、完全長抗体の軽鎖を形成することもできる。
一例として、抗体の完全長配列は、以下のとおりである：
キメラ抗体ｃｈ１９０１：
ｃｈ１９０１重鎖：（配列番号：３５）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０１軽鎖（配列番号：３６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
キメラ抗体ｃｈ１９０２：
ｃｈ１９０２重鎖（配列番号：３７）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０２軽鎖（配列番号：３８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
Figure 2022528061000013
完全長抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、以下のとおりである。
Figure 2022528061000014
Figure 2022528061000015
Figure 2022528061000016
Figure 2022528061000017
完全長抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、以下のとおりである。
Figure 2022528061000018
Figure 2022528061000019
本開示のポジティブコントロール抗体は、ＩＭＡＢ－３６２（ＷＯ２０１６１６６１２２から入手可能）だった。
ＩＭＡＢ－３６２重鎖（配列番号：５３）
１ ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥ ＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＳＹＷＩＮＷＶＫＱＲ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮ
５１ ＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹ ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬ ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ ＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤ ＳＡＶＹＹＣＴＲＳＷ
１０１ ＲＧＮＳＦＤＹＷＧＱ ＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳ ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１ ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１ ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ ＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳ ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１ ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１ ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１ ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴ ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１ ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ ＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ＩＭＡＢ－３６２軽鎖（配列番号：５４）
１ ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳ ＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴ ＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬ ＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰ
５１ ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹ
１０１ ＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ
１５１ ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ
２０１ ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
慣用的な遺伝子クローニング及び組換え発現方法によって上記抗体をクローニングし、発現させ、精製した。
インビトロ生物学的評価
試験例１：細胞レベルにおけるＥＬＩＳＡ結合アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、クローディン１８．２抗体の結合特性を検出した。クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞を、細胞増殖密度が９０％に到達するまで９６ウェル細胞プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）内で培養し、４％パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を１時間固定した。ＰＢＳＴバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によってプレートを３回洗浄した後、ＰＢＳによって希釈された２００μｌ／ｗｅｌｌの５％スキムミルク（Ｂｒｉｇｈｔ脱脂粉乳）をブロッキング溶液として加えることによってブロッキングし、３７℃のインキュベーター内で２．５時間又は４℃で終夜（１６～１８時間）インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴバッファーによって３回洗浄し、サンプル希釈剤（１％スキムミルクを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によって希釈された５０μｌ／ｗｅｌｌの試験用抗体を加え、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションの完了後、プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、サンプル希釈剤によって希釈された１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって６回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２－００－０３）を加え、室温で１０～１５分間インキュベートし、５０μｌ／ｗｅｌｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させた。ＭＤ Ｖｅｒｓａ Ｍａｘ（商標）マイクロプレートリーダーによって、吸光度の値を４５０ｎｍで読み取り、クローディン１８．２に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した（その結果は、以下の表に示されている。）。
Figure 2022528061000020
Figure 2022528061000021
Figure 2022528061000022
試験例２：細胞レベルにおける抗体の結合アッセイ
クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞と、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００タブ）、ｐＨ７．４）中のＦＡＣＳバッファー（２％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）とを用いて、１×１０６／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９５）に加えた。遠心分離して、上清を取り除いた後、ＦＡＣＳバッファーによって希釈された様々な濃度の試験用クローディン１８．２抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃冷蔵庫内の暗所で１時間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８によってコーティングされた作用濃度の抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫内の暗所で４０分間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した。その結果は、図１に示されている。
試験例３：抗体のエンドサイトーシスアッセイ
５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ＮＨＳエステル（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４６４０３）によってあらかじめ標識された試験用クローディン１８．２抗体を、クローディン１８．２を安定的に発現した１×１０６／ｍｌのＮＵＧＣ４細胞に加え、氷の上に置き、暗所で１時間インキュベーションし、遠心分離し、あらかじめ冷却されたＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清、ｐＨ７．４）によって３回洗浄し、上清を取り除いた後、あらかじめ加温された完全培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに入れた。０時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後及び４時間後のそれぞれで細胞を取り出し、暗所において氷の上に置いた。すべてのサンプルを収集し、低温において３００ｇで遠心分離した後、溶出バッファー（０．０５Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ１．７）を加え、室温で７分間インキュベートした。サンプルを３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって１回洗浄し、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に対するクローディン１８．２抗体のエンドサイトーシス効率を計算した。その結果により（図２を参照れたい。）、ヒト化抗体が好ましいエンドサイトーシス効率を有することが示されている。
試験例４：フローサイトメトリーに基づいた抗体のアフィニティの測定
試験当日には、ウェル１個当たり１×１０５～２×１０５個の細胞になるように、ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞を収集して、丸底９６ウェルプレートに入れた。５μｇ／ｍｌの初期濃度、２倍勾配希釈（１２の濃度点）でクローディン１８．２抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。ポジティブコントロールは、ＩＭＡＢ３６２であり、抗体を含まないウェルは、ネガティブコントロールとして設定した。遠心分離によって抗体を取り除いた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（２００×）を加え、暗所において４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳによって２回洗浄し、フローサイトメトリー検出用に調製した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを始動させ、予備加熱し、新たなアッセイを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアによって確立した。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２ネガティブコントロールサンプルを検出し、ＦＳＣ電圧及びＳＳＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ブランクサンプルＢ及び標準曲線１をそれぞれ検出した。ＦＩＴＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。保存した電圧下で、丸底９６ウェルプレート内のサンプルを検出し、データを記録した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して、実験データを分析し、これによって、Ｇｅｏ Ｍｅａｎ値を得たら、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ＭＥＳＦ－Ｇｅｏ Ｍｅａｎ標準曲線を当てはめた。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞に結合したクローディン１８．２抗体のモル濃度及び遊離抗体の濃度を、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体の濃度蛍光値に基づいて計算し、抗体のＢｍａｘ及び解離定数ＫＤを、スキャッチャードプロット法を用いることによって計算した。その結果は、表１５に示されている。
Figure 2022528061000023
試験例５：抗体のＡＤＣＣ効果の評価
様々なＮＵＧＣ４細胞（クローディン１８．２の高発現、中発現及び低発現）を消化し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させて、カウントした。１０％ＦＢＳ（ニュージーランド産Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ、１９２１００５ＰＪ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８３５－０３０）に、細胞を３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。２５μｌの細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）の各ウェルに７５００細胞／ｗｅｌｌで加えた。抗体を上記フェノールレッド不含培地に希釈して、３倍抗体希釈溶液を調製し、２５μｌ／ｗｅｌｌの抗体を細胞プレートに加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で０．５時間インキュベートした。
（ＦｃｒＲ３Ａ－Ｖ１５８－ＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｊｕｒｋａｔ細胞）エフェクター細胞を収集し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させて、カウントした。１０％ＦＢＳ（ニュージーランド産Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０に、細胞を３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、２５μｌの細胞をアッセイプレート（７．５×１０４細胞／ｗｅｌｌ）に加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６時間インキュベートした。
７５μｌ／ｗｅｌｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）をアッセイプレートの各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＶＩＴＯＲ３）によって化学発光を検出した。
その結果により（表１６及び図３Ａ～図３Ｃを参照されたい。）、抗体ｈ１９０１－１１とｈ１９０２－５は両方とも、低レベル、中レベル及び高レベルのクローディン１８．２を発現したＮＵＧＣ４細胞内で、非常に強いＡＤＣＣ活性を示すことが示されている。
Figure 2022528061000024

Claims (17)

  1. i)重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 3に示されている重鎖可変領域のものと同じHDR1、HDR2、HDR3シークエンスを含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 4に示されている軽鎖可変領域のものと同じLCDR1、LCDR2、およびLCDR3シークエンスを含み、または、
    ii)重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 5に示されている重鎖可変領域のものと同じHDR1、HDR2およびHDR3シークエンスを含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 6に示されている軽鎖可変領域のものと同じLCDR1、LCDR2およびLCDR3シークエンスを含む、
    重鎖可変領域と軽鎖可変領域からなるアンチクローディン18.2抗体である。
  2. iii) 重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11に示すHDR1、HDR2、HCDR3からなり、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14に示すLCDR1、LCDR2、LCDR3からなり、
    iv)重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17に示すHDR1、HDR2、HCDR3からなり、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、およびSEQ ID NO: 20に示すようにLCDR1、LCDR2、LCDR3からなる、
    重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗クラウジン18.2抗体である。
  3. マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項1または2に記載の抗クラウジン18.2抗体である。
  4. v) 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 3または24に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4または21に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、または
    vi)重鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 5または31に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 6または28に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、
    1) 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号3に示されるように、または配列番号3に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号4に示されるように、または配列番号4に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、
    2) 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号24に示されるように、または配列番号24と少なくとも90%のアイデンティティを有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号21に示されるように、または配列番号21と少なくとも90%のアイデンティティを有し、
    3) 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 5に対して少なくとも90%のアイデンティティを有し、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 6に対して少なくとも90%アイデンティティを有し、または、
    4) 重鎖可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 31またはSEQ ID NO: 31に対して少なくとも90%同一であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 28またはSEQ ID NO: 28に対して少なくとも90%同一である、
    重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1-3のいずれか一項に記載の抗クラウジン18.2抗体である。
  5. ヒト抗体由来の骨格領域またはその骨格領域変異体を含むヒト化抗体であって、該骨格領域変異体が、ヒト抗体軽鎖骨格領域および/または重鎖骨格領域に1～10個のバック変異を有する、請求項4に記載の抗クラウジン18.2抗体であり、
    できれば、フレームワーク領域のバリエーションは、下記のa)またはb)から選択された突然変形からなり、
    a) 軽鎖可変領域に含まれる22S、85Iおよび87H、および/または重鎖可変領域に含まれる48I、82Tおよび69Mからなる群から選択される1つ以上のバック突然変異、または、
    b)軽鎖可変領域に含まれる4Lおよび22Sからなる群から選択される1つ以上のバック突然変異、および/または重鎖可変領域に含まれる38K、40R、48I、66K、67A、69L、71Lおよび73Kからなる群から選択される1つ以上のバック突然変異、より好ましくは、フレームワーク領域変異は、下記のa-1またはb-1から選択された突然変異からなり、
    a-1) 軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸の復帰突然変異22S、85Iおよび87H、H鎖可変領域に含まれる復帰突然変異48Iおよび82T、または、
    b-1)軽鎖可変領域に含まれる復帰突然変異4L、
    バック変異82Tは重鎖可変領域に含まれ、「82」はカバトク基準によれば位置82Aを示す。
  6. 請求項3によれば、重鎖可変領域と次のような軽鎖可変領域からなる抗クローディン18.2の抗クローディンは、
    vii) 配列番号3に示される重鎖可変領域配列および配列番号4に示される軽鎖可変領域配列、または、
    viii)配列番号24、25、26または27に示される重鎖可変領域配列および配列番号21、22または23に示される軽鎖可変領域配列、または、
    ix)配列番号5に示される重鎖可変領域配列および配列番号6に示される軽鎖可変領域配列、または、
    x)配列番号31、32、33または34に示される重鎖可変領域配列および配列番号28、29または30に示される軽鎖可変領域配列、
    好ましくは、アンチクローディン18.2の、又はその抗原結合フラグメントは、以下に示すように、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
    xi) 配列番号31に示される重鎖可変領域配列および配列番号29に示される軽鎖可変領域配列、または12)配列番号26に示される重鎖可変領域配列および配列番号23に示される軽鎖可変領域配列である。
  7. 重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の抗クラウジン18.2抗体は、
    好ましくは、重鎖不変領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の定常領域(s)およびそれらの変形領域からなる群から選択され、好ましくは、軽鎖不変領域は、ヒトの抗・葛藤領域およびそれらの変形領域(s)からなる群から選択され、
    より好ましくは、抗クローディン18.2抗菌は、SEQ ID NO: 7に示すような重鎖不変領域と、SEQ ID NO: 8に示すような軽鎖不変領域を含み、
    もっとも望ましいのは、抗クローディン18.2の抗クローディンは、SEQ ID NO: 35または42に対して少なくとも90%のアイデンティティを有する重鎖、およびSEQ ID NO: 36または39に対して少なくとも90%アイデンティティを有する軽鎖、またはSEQ ID NO: 37または49に対して少なくとも90%アイデンティティを有する重鎖、およびSEQ ID NO: 38または46に対して少なくとも90%アイデンティティを有する軽鎖である。
  8. c) SEQ ID NO: 35とSEQ ID NO: 36に示されているような重いL鎖、
    d) SEQ ID NO: 42、43、44または45に示されているような重鎖と、SEQ ID NO: 39、40または41に示されているようなL鎖、
    e) SEQ ID NO: 37に示す重鎖とSEQ ID NO: 38に示す軽鎖、またはSEQ ID NO: 49、50、51、52に示す重鎖とSEQ ID NO: 46、47、48に示す軽鎖、
    を含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の抗クラウジン18.2抗体である。
  9. 請求項1から8のいずれかによれば、アンチ・クローディン18.2であり、
    SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 41に示すような重鎖、またはSEQ ID NO: 49に示すような重鎖、およびSEQ ID NO: 47に示すようなL鎖である。
  10. ヒトClaudin 18.2に結合するための請求項1から9のいずれかの抗Claudin 18.2と競合する、分離抗Claudin 18.2の1つである。
  11. 請求項1～10のいずれかの抗クローディン18.2のいずれかの抗クローディンをエンコードする1つの核酸分子である。
  12. 請求項11の核酸分子からなる宿主細胞である。
  13. 請求項1～10のいずれか1項に記載の抗クラウジン18.2抗体を細胞傷害性薬物に結合させることにより形成される抗体-薬物結合体である、抗体-薬物結合体である。
  14. 請求項1から10のいずれかによる抗クローディン18.2の治療有効量、または請求項11による核酸分子、または請求項13による抗クローディン抱合、および1つ以上の薬事的に容認可能なキャリア、溶剤、緩衝液または補助剤からなる医薬品組成物である。
  15. Claudin18.2の検査対象となる試料を用いてクレーム1から10のいずれかの抗クローディン18.2のいずれかに接触する段階を含む、
    イムアッセイまたは検出する方法。
  16. 請求項1から10のいずれかによれば、防クローディン18.2抗菌を含むキット。
  17. クラウジン18.2に関連する疾病治療のための方法であって、治療有効量の請求項1～10のいずれか一項に記載の抗クラウジン18.2抗体、または請求項11に記載の核酸分子、または請求項13に記載の抗体-薬物結合体、または請求項14に記載の医薬組成物、好ましくは、該疾患を被検者に投与することを含む、方法であり、
    より好ましくは、疾患は、頭頸部扁平上皮癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、神経内分泌腫瘍、咽頭癌、鼻咽頭癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺がん、肝細胞癌、肝細胞癌、肝臓および胆嚢癌、膵臓癌、胃癌、腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、子宮内膜がん、膀胱がん、前立腺癌、皮膚癌、黒色腫、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍からなる群より選択される 扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌であり、
    より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、一次縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫、およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され、
    肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群より選択され、
    白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄性白血病からなる群から選択される。
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