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JP2022527860A - 排出ポンプ－癌抗原マルチ特異性抗体ならびにそれに関する組成物、試薬、キットおよび方法 - Google Patents

排出ポンプ－癌抗原マルチ特異性抗体ならびにそれに関する組成物、試薬、キットおよび方法 Download PDF

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JP2022527860A
JP2022527860A JP2021560390A JP2021560390A JP2022527860A JP 2022527860 A JP2022527860 A JP 2022527860A JP 2021560390 A JP2021560390 A JP 2021560390A JP 2021560390 A JP2021560390 A JP 2021560390A JP 2022527860 A JP2022527860 A JP 2022527860A
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seq
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ウィリアム ロバート アラスーン、
エバン マシュー ビショップ、
ラファエラ ブリアンテ、
アリッサ ローレン ブリッグズ、
スチスミタ モハンティ、
ポール デビッド ポナス、
シンディー タン、
キャンティン ツァイ、
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ケンジョッケティ バイオテクノロジー，インク．
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Abstract

細胞の排出ポンプおよび癌関連抗原の両方を標的とする多特異性抗体、ならびにそのような多特異性抗体を含むかまたはコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、およびキットが提供される。細胞の排出ポンプおよび癌関連抗原の両方を標的とする多特異性抗体を対象に投与することを含む、癌について対象を治療する方法も提供される。記載された多特異性抗体を作製する方法および当該方法において有用な遺伝子組換え細胞株を含めそれに関連する試薬、ならびにそのような遺伝子組換え細胞株を作製する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年1月29日に出願された米国仮特許出願第62/967,478号及び2019年4月2日に出願された米国仮特許出願第62/828,044号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬剤耐性は、疾患が薬剤治療に耐性になったときに生じるよく知られた現象であり、腫瘍学を含む医学の様々な分野における主たるかつ増加している課題である。薬剤耐性のいくつかの方法は疾患特異的であるが、微生物やヒト薬剤耐性癌で観察される薬剤排出のような進化的に保存された方法もある。多くのタイプの癌は、最初は化学療法に感受性であるが、時間の経過とともに、これらの機序ならびに薬剤の阻害、分解および排出増強を促進するDNA突然変異および代謝変化のような他の機序を介して耐性を発達させ得る。
排出ポンプ（EP：efflux pump）は、実質的に全ての生きた細胞により発現される蛋白質であり、細胞から様々な化合物を自然に排出するように進化してきた。ATP結合カセット (ABC) トランスポーターファミリー蛋白質のメンバーは、薬剤排出を可能にするEPの例であり、健康な細胞の細胞膜における重要でよく研究された調節因子である。トランスポーターの構造はタンパク質ことに異なるが（例えば、ヒトのABCファミリーには49の既知メンバーが存在する）、それらはすべて2つの異なるドメイン、すなわち高度に保存されたヌクレオチド結合ドメインと、より変化の多い膜貫通ドメインとの存在によって分類される。ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1（ABCB1）遺伝子によりコードされる多剤耐性蛋白質1（Multidrug resistance protein 1）は、これらのうちで最初に同定され、広範に研究されてきた。MDR1の正常な発現は、ある種の組織（結腸、肝臓、腎臓など）が腫瘍性になるときにそれらの組織で増加し、また、ある種の化学療法剤による処置に応答して発現が増加することは、内因性機序および外因性機序の両方のMDR1過剰発現が作用していることを示す。
EPは、細胞および腫瘍が化学療法剤に対する耐性を発達させることを可能にする。このような耐性は、しばしば、耐性細胞からの治療分子の排出の増大と関連している。この化学療法耐性は、複数の化学療法剤が該当する場合、多剤耐性（MDR：multi drug resistance）と呼ばれる。EPを標的とし阻害する様々な低分子阻害剤が開発されてきたが、それらは様々な理由のためにヒトの臨床設定において成功していない。その理由の中には、細胞またはそれらの排出ポンプの機能とは関係なく体内の全ての細胞（自然に生じる細胞毒素の排出のためにEPを用いる健康な細胞を含む）へと浸透し影響を与える傾向を有することがある。
化学療法の使用によって転移性癌細胞集団の大部分が死滅し患者から除去された癌患者のあいだで、薬剤耐性癌細胞集団が出現し以前の治療法による新たな治療に反応せずに拡大することは、珍しくない。ほとんどの場合、別の作用機序を有する別の薬物が適用されるが、またしても、さらなる薬物耐性細胞集団および/または腫瘍が出現することとなる。
MDR1と腫瘍関連抗原（TAA：tumor-associated antigen）との両方を標的とする多特異性（multi-specific）抗体として使用することができる抗MDR1抗体、ならびにそのような多特異性抗体を含むかまたはコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、およびキットが提供される。この多特異性抗体は、MDR1のための抗原結合部位を含む共通の可変軽（VL：variable light）鎖、MDR1のための抗原結合部位を含む第1の可変重（VH：variable heavy）鎖、およびTAAのための抗原結合部位を含む第2のVH鎖を含む。MDR1およびTAAの両方を標的とする多特異性抗体を対象に投与することを含む、癌について対象を治療する方法も提供される。治療は、多特異性抗体を単独で投与すること、または多特異性抗体および化学療法剤を投与することを含むことができる。また、本発明の方法において有用となる遺伝子組換え細胞株およびそれを作製する方法を含め、記載された多特異性抗体を作製する方法およびそれに関連する試薬も提供される。
本明細書で提供される二重特異性抗体は、MDR1およびTAAの両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/またはTAAを発現する非癌細胞への結合は低下していることを示す。換言すると、本明細書で提供される二重特異性抗体は、(1) MDR1発現が低いかまたは存在しないTAA発現細胞、および (2) TAA発現が低いかまたは存在しないMDR1発現細胞に対しては低い親和性で結合し、かつMDR1およびCD47の少なくとも1つまたは両方を比較的高いレベルで、すなわち、正常細胞より高いレベルで発現する癌細胞に対して高い親和性で結合する。
また、本明細書には、抗MDR1抗体15D3と比べてMDR1に対して低減された親和性を有する抗MDR1抗体、および抗CD47抗体5F9と比べてCD47に対して低減された親和性を有する抗CD47抗体も開示される。これらの抗体は、共投与された場合に、対象における癌の治療に用途が見出され、化学療法に対する癌細胞の化学療法感受性を増加させる。
図1 Aは、本明細書に記載される本開示の多特異性抗体の実施形態の概略図を提供する。図1 Bは、多特異性抗体が標的化する標的の一方または両方を発現する細胞に対する、図1 Aに示される多特異性抗体の実施形態の結合を示す概略図を提供する。 図2は、本明細書中に記載される二重特異性モノクローナル抗体の概略図を提供する。 図3 A～図3 Fは、示された標的を発現するナイーブ（naive）および組換え細胞株を含む様々な細胞株上のPgpおよびCD47（いくつかの例では「KT14」とも呼ばれる）に対する標識化モノクローナル抗体の結合のFACS分析を提供する。 図4 A～図4 Bは、様々な試薬細胞株に結合する二重特異性抗体（HC-15D3:HC-5F9:LC-MRK16）の結合のFACS分析を提供し、両方の標的が共発現される場合（例えば、293Tナイーブ（naive）細胞）の特異的結合、および標的のうちの一方のみが存在する場合（例えば293 KT14-KOおよびKPB1-KD（Pgpは本明細書のいくつかの例では「KPB1」とも呼ばれる））の有意に減少した結合を示している。 図5は、本明細書に記載した種々の一価Fabおよび二重特異性（Bispecific）抗体分子の存在下でのナイーブ（naive）293TおよびN6ADR細胞株のパクリタキセルに対する感受性を示す化学療法感受性分析を提供する。細胞（ナイーブ293T細胞 (左図) およびN6ADR細胞 (右図)）は、例えば化学療法単独（「Chemo only」）または化学療法と他の抗体（15D3:MRK16 Fab；a15D3:MRK16抗体；aCD47:MRK16抗体；aCD47:MRK16 Fab；および15D3:9F11 Fab）との併用による処置と比較して、15D3.aCD47:MRK16二重特異性の存在下で増強された感受性を示した。図5は、各々の個別標的に対する二重特異性抗体の親和性の低下にもかかわらず、二重特異性抗体がナイーブ293T細胞およびアドリアマイシン耐性N6ADR細胞の化学療法感受性を増強させることを示している。 図6 A～図6 Cは、図5に提供されたデータの再表示を提供し、ナイーブ（naive）293T細胞とN6ADR細胞のデータのサイドバイサイドのあてはめ曲線（図6 A）、ならびにナイーブ293T細胞（図6 B）およびN6ADR細胞（図6 C）についての生データ（左）とあてはめデータ（右）のサイドバイサイド表示を含む。 図7は、抗体をビンクリスチン（vincristine）と組み合わせて使用した場合の15D3.aCD47:MRK16抗体の薬物増感効果を示す。 図8は、実施例のセクションで記述した、試験された抗体軽鎖と重鎖の組み合わせの結合および標的細胞殺傷を示す表を提供する。 図9は、MES-SA-DX5 (子宮肉腫) の腫瘍体積（Tumor Volume）に対する、化学療法を伴わない示された抗体の効果を示す。 図10は、NALM6細胞の腫瘍増殖の阻害に対するパクリタキセルの効果を示す。 図11は、パクリタキセル耐性NALM6ADR細胞の腫瘍増殖の阻害に対するBisP1.1の効果を示す。 図12は、パクリタキセル耐性NALM6ADR細胞の腫瘍増殖の阻害に対するバルスポダールの効果を示す。 図13は、パクリタキセル耐性NALM6ADR細胞を移植したマウスの体重（Body weight）に対するBisP1.1の効果を示す。 図14は、パクリタキセル耐性NALM6ADR細胞を移植したマウスの体重（Body weight）に対するバルスポダールの効果を示す。 図15は、パクリタキセル耐性NALM6ADR細胞を移植したマウスの生存（survival）に対するKBisP1.1の効果を示す。 図16は、A2780ADR細胞の表面上のCD47およびABCB1の発現を示す。 図17は、HeyT30細胞の表面上のCD47およびABCB1の発現を示す。 図18は、パクリタキセル（Paclitaxel）を伴うまたは伴わないKBisP1.1の投与後のインビボでのA2780ADR腫瘍体積（Tumor Volume）の減少を示す。 図19は、パクリタキセル（Paclitaxel）を伴うまたは伴わないKBisP1.1の投与後のインビボでのHeyT30腫瘍体積（Tumor Volume）の減少を示す。 図20は、インビボでN6ADR細胞腫瘍に対してKBisP1.1が15D3抗体よりも有効であることを示す。 図21は、インビボでパクリタキセル（Pac）に対する多剤耐性N6ADR腫瘍のKBisP1.1化学療法増感が用量依存性であることを示している。 図22 A～22 Bは、KBisP1.1抗体が、抗CD47 5F9抗体とは対照的に、ヒト赤血球 (RBC) (図22 A)およびカニクイザル赤血球(図22 B)に対して有意な結合を示さず、5F9 HCおよびMRK16 LCを含む抗CD47抗体（「KT14_MRK16」）が、抗CD47 5F9抗体（「KT14」）とは対照的に、RBCに対して有意に結合しないことを示す。 図23は、ヒト化15D3 VH鎖配列のアラインメントを示す。 図24は、ヒト化MRKK16鎖配列のアラインメントを示す。 図25は、多剤耐性MES-SA-DX5腫瘍を化学療法増感させるヒト化ミュート化Fc二重特異性抗体を示す。 図26は、ヒト化KBisP1.1抗体が、マウスにおいて多剤耐性A2780ADR細胞により生成された腫瘍を化学療法増感させることを示す。 図27 Aは、N297A置換を有するKBisP1.1二重特異性抗体が、マウスにおいて多剤耐性MES-SA/Dx5細胞腫瘍をパクリタキセル（Paclitaxel）に化学療法増感させることを示す。図27 Bは、KBisP1.1 N297A抗体（「N297A」と標識されている）が、インビボで多剤耐性A2780ADR細胞をパクリタキセルに対して化学療法増感させることを示す。 図28は、KBisP1.1抗体が、インビボで多剤耐性A2780ADR細胞をパクリタキセル（Paclitaxel）に対して化学療法増感させることを示す。 図29は、KBisP1.1抗体が、インビボで多剤耐性MES-SA/Dx5細胞をパクリタキセル（Paclitaxel）に対して化学療法増感させることを示す。 図30は、KBisP1.1二重特異性抗体が、インビボでパクリタキセル耐性CTG-2616患者由来乳房腫瘍を化学療法増感させ、腫瘍増殖阻害をもたらしたことを示す。 図31は、示された抗体の、ELISAによって測定されたCD47に対する結合、FACSによって測定されたMDR1に対する結合、ELISAによって測定されたPD-L1に対する結合、およびELISAまたはFACSによって測定されたEGFRに対する結合の要約を提供する。 図32 Aは、MDR1を過剰発現（overexpressed）する293T細胞を用いて測定された、列挙された抗体についてのMFIを示す。図32 Bは、EGFRを過剰発現する293T細胞を用いて測定された、列挙された抗体についてのMFIを示す。図32 Cは、図32 Bに示す抗体のサブセットについて、EGFRを過剰発現する293T細胞を用いて測定された、列挙された抗体についてのMFIを示す。
［定義］
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、いずれかのアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原に対する特異的結合を維持する抗体の断片（Fab、Fv、scFv、およびFdフラグメントを含むがこれらに限定されない）、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（重鎖のみを含む抗体（例えばVHHラクダ抗体）を含む）、二重特異性抗体、ならびに抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などによって、検出可能に標識され得る。抗体は、例えばビオチン（ビオチン-アビジン特異的結合対の構成員）など、特異的結合対の構成員のような他の部分にさらにコンジュゲートされ得る。抗体はまた固体支持体に結合され得、それにはポリスチレンプレートまたはビーズ等が含まれるがそれに限定されない。またこの用語には、Fab'、Fv、F(ab')2、および抗原への特異的結合を維持する他の抗体断片、ならびにモノクローナル抗体も包含される。抗体は、一価であっても二価であってもよい。本明細書で使用される抗体は、例えば患者由来の細胞試料または組織試料において、細胞表面上の標的抗原（複数可）の発現をアッセイするために使用され得る。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、例えば、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント；ジアボディー（diabodies）、直線状抗体（linear antibodies）（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)）、単鎖抗体分子（重鎖のみを含む抗体（例えばVHHラクダ抗体）を含む）、および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、および残渣「Fc」フラグメント（容易に結晶化（crystallize）する能力を反映する呼称である）を産生する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し依然として抗原を架橋することができるF(ab')2フラグメントを生じる。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインとが緊密に非共有結合した二量体からなる。この配置では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を規定する。まとまりとして、これら6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、抗原を認識して結合する能力を有し、抗原結合部位を形成することができるが、ただし各可変ドメインの3つのCDRを含む完全な結合部位よりも親和性が低くくなる。
「Fab」フラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）も含有する。Fabフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の追加によって、Fab'フラグメントと異なる。Fab'-SHとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するFab'についての本明細書における呼称である。F(ab')2抗体断片は、もともと、間にヒンジシステインを有するFab'フラグメントの対として産生されたものである。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる2つの明確に異なる型の1つに割り当てることができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに分類され得る。免疫グロブリンにはIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMという5つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2に分けられ得る。
「単鎖Fv」、「sFv」またはscFv抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの実施形態において、Fvポリペプチドは、VHおよびVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これが抗原結合のための望ましい構造をsFvが形成することを可能にする、VHおよびVLドメイン。sFvのレビューについてはPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
用語「ジアボディー」は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表し、その断片は、同じポリペプチド鎖（VH-VL）中に、軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同一鎖上の2つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いられて2つの抗原結合部位を創出する。ジアボディーは、例えばEP 404,097；WO 93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)においてさらに詳細に記述されている。
本明細書中で使用される、用語「親和性」とは、2つの物質の可逆的結合についての平衡定数を指し、解離定数 (Kd) として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも少なくとも1倍以上、少なくとも2倍、少なくとも3倍以上、少なくとも4倍以上、少なくとも5倍以上、少なくとも6倍以上、少なくとも7倍以上、少なくとも8倍以上、少なくとも9倍以上、少なくとも10倍以上、少なくとも20倍以上、少なくとも30倍以上、少なくとも40倍以上、少なくとも50倍以上、少なくとも60倍以上、少なくとも70倍以上、少なくとも80倍以上、少なくとも90倍以上、少なくとも100倍以上、もしくは少なくとも1000倍以上、またはそれ超であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約100ナノモーラー (nM) ～約0.1 nM、約100 nM～約1ピコモーラー (pM) 、もしくは約100 nM～約1フェムトモーラー (fM) またはそれ超であり得る。本明細書で使用される「結合活性（avidity）」という用語は、2つ以上の作用物質の複合体の、希釈後の解離に対する抵抗性を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、本明細書において、抗体および/または抗原結合断片に関して互換的に使用される。
用語「結合」は、例えば共有結合、静電結合、疎水結合、およびイオン結合および/または水素結合性相互作用による、2つの分子間の直接的な会合を意味し、塩橋および水橋などの相互作用も含む。MDR1特異的抗体は、MDR1ポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。非特異的結合とは、約10-7M未満の親和性（例えば10-6 M、10-5 M、10-4M等での親和性）での結合を意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「CDR」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接的な抗原結合部位を意味することを意図する。CDRは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest”(1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) によって記述されており、そこでの定義は、互いに比較した場合に重複する又はサブセットのアミノ酸残基を含んでいる。それにもかかわらず、抗体もしくはグラフト化抗体またはそれらのバリアントのCDRを表すためのいずれかの定義の適用は、本明細書中に定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上記引用された参考文献の各々によって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基は、比較として以下の表1に示される。
Figure 2022527860000002
抗体可変領域に関して使用される場合の、本明細書中で使用する用語「フレームワーク」は、抗体の可変領域内のCDR領域の外のすべてのアミノ酸残基を意味することを意図する。可変領域フレームワークは、一般に、長さが約100～120アミノ酸の非連続的なアミノ酸配列であるが、CDRの外側のアミノ酸のみを指すことを意図している。本明細書で使用される「フレームワーク領域（framework region）」という用語は、CDRによって分離されたフレームワークの各ドメインを意味することを意図している。VH鎖は、3つのCDRと4つのFRとが以下の順序でN末端からC末端へと配列されたものを含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、VL鎖は、3つのCDRと4つのFRとがN末端からC末端へと以下の順序で配列されたものを含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本明細書中で使用される場合、抗体という用語は、2つの重鎖および2つの軽鎖の四量体を包含し、ここで、重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3という3つのドメインから構成される。軽鎖定常領域はCLという1つのドメインから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主の組織および因子（免疫系の種々の細胞および補体系の第1成分を含む）への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgMおよびそれらのサブタイプの免疫グロブリンを含む。ある態様において、対象抗体は、IgGアイソタイプ、例えば、IgG1である。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（IgA1およびIgA2）、ガンマ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子；および多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約25 kDまたは214アミノ酸）は、N末端（約110アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端においてカッパまたはラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約50 kDまたは446アミノ酸）は、N末端（約116アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端において前記他の定常領域遺伝子の一つ、例えばガンマ（約330アミノ酸をコードする）によってコードされる。ある態様において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含む完全な免疫グロブリンを含む。
用語「抗原結合断片」は、全長抗体の1つ以上の断片であって抗原に特異的に結合することができるものを指す。結合断片の例としては、以下のものが挙げられる：(i) Fabフラグメント（例えばVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる、一価フラグメント）；(ii) F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；(iii) Fdフラグメント（VHおよびCH1ドメインを含むもの、例えば、それらからなるもの）；(iv) Fvフラグメント（例えば、抗体の単一アームのVHおよびVLドメインを含むもの、例えば、それらからなるもの）；(v) dAbフラグメント（VHドメインを含むもの、例えばVHドメインからなるもの）；(vi) 単離されたCDR；(vii) 単鎖Fv（scFv）（抗体の単一アームのVHおよびVLドメインが組換え手段を用いた合成リンカーによって連結されてVHおよびVLドメインが対になって一価分子を形成するようにしたものを含むもの、例えばそれからなるもの）；(viii) ジアボディー（それらが対をなさないようにVHドメインおよびVLドメインを連結して一価分子を形成した、2つのscFvを含むもの、例えば2つのそのようなscFvからなるもの；scFv対のそれぞれのVHはもう一方のscFvのVLドメインと対を形成し、二価分子を形成する）。
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および/または軽鎖のある部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体をいう。
「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞によって産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリン可変軽鎖 (VL) または可変重鎖 (VH) フレームワーク配列の選択において最も一般的に起こるアミノ酸残基を表すフレームワーク (FR) である。一般に、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから起こる。一般に、配列のこのサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3におけるもののようなサブグループである。一実施形態では、VLについて、このサブグループは、上記Kabat et al.におけるサブグループカッパIである。一実施形態では、VHについて、このサブグループは、上記Kabat et al.におけるサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトCDR由来のアミノ酸残基およびヒトフレームワーク (FR) 由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。ヒト化抗体定常領域の少なくとも一部はヒト抗体に由来する。本明細書に開示される抗体分子の好ましい態様において、定常領域は、ヒトIgG1などのヒトIgG抗体からのものである。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変重鎖領域と、UniProt: P01857-1バージョン1に提供されるアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域とを含む重鎖を含む。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変軽鎖領域とヒト軽鎖定常領域とを含む軽鎖を含む。好ましい実施形態において、ヒト軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。特定の態様において、対象抗体に存在するヒトIgG1重鎖定常領域は、例えばFc機能を調節するための置換などの、突然変異を含み得る。例えば、LALAPGエフェクター機能突然変異（L234A、L235A、およびP329G）またはN297A突然変異を導入して、抗体依存性細胞傷害（ADCC）を低下させることができる。置換の番号付けはEU番号付けシステムに基づく。「EU番号付けシステム」または「EUインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に使用される（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) で報告されているEUインデックス）。「KabatにおけるEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。
抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体をいう。
用語「エピトープ」は、免疫系（例えば抗体、B細胞、またはT細胞）によって認識される抗原の領域を指す。例えば、エピトープは、抗体が結合する抗原の特定の領域である。
「単離された」抗体とは、同定されてその自然の環境における成分から分離および/または回収された抗体である。その自然の環境のコンタミナント成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、(1) Lowry法によって測定される抗体の重量として90%超、95%超、または98%超、例えば、99重量%超、(2) スピニングカップシークエネーターの使用により、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度、または (3) クーマシーブルーまたは銀染色を使用した、還元または非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換え細胞内のin situでの抗体を含む。いくつかの例では、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
本明細書で使用される用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞機能を阻害または防止し、および/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。「化学療法剤」は、「抗腫瘍剤」とも呼ばれ、癌または他の疾患もしくは障害を治療するために使用される細胞毒性剤であり得る。
本明細書中で使用される、「治療」「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという意味で予防的であり得、および/または、疾患および/またはそれに起因する有害作用の部分的または完全な治癒という意味で治療的であり得る。本明細書中で使用される「治療」とは、ヒトを含む哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含し、以下のことを含む：(a) 疾患の素因を有し得るがまだ疾患を有するとは診断されていない対象において疾患が起こるのを予防すること；(b) 疾患を抑制すること、すなわちその発達を阻止すること；(c) 疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。
本明細書で互換的に使用される用語「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は、限定されるものではないが、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指す。
「治療的有効量」または「有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与された場合に、その疾患に関してそのような治療をもたらすために十分な標的特異的抗体の量をいう。「治療的有効量」は、抗体、疾患およびその重症度、ならびに治療対象の年齢、体重等に応じて変化する。
本明細書で使用される用語「治療抵抗性（refractory）」は、治療に応答しない疾患または状態を指す。癌に関して、本明細書において使用される「治療抵抗性癌」は、治療に応答しない癌を指す。治療抵抗性のがんは、治療開始時に抵抗性を示すこともあれば、治療のあいだに抵抗性となることもある。治療抵抗性の癌は、耐性癌とも呼ばれる。
「生物学的試料」は、個体から得られる種々の試料タイプを包含し、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。その定義は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、生検試料もしくは組織培養物のような固形組織試料、又はそれらから誘導された細胞及びそれらの子孫を包含する。また、その定義は、試薬による処理、可溶化、または、例えばポリヌクレオチドのような特定の成分についての濃縮のような、その調達後に何らかの態様で操作された試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床試料を包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織試料も包含する。
一対の配列間のパーセント同一性は、その対における一致の数に100を掛け、アラインメントされた領域の長さ（ギャップを含む）で割ることによって計算することができる。同一性スコアリングでは完全一致のみがカウントされ、アミノ酸同士の類似性の程度は考慮されない。長さには内部ギャップのみが含まれ、配列終端におけるギャップは含まれない。パーセント同一性＝（一致x 100）／アラインメントされた領域の長さ(ギャップを含める)
「保存的アミノ酸置換」という語句は、以下のグループ内のアミノ酸残基の置換を指す：1) L、I、M、V、F；2) R、K；3) F、Y、H、W、R；4) G、A、T、S；5) Q、N；6) D、E。保存的アミノ酸置換は、タンパク質中のアミノ酸（複数可）を、類似した酸性、塩基性、電荷、極性、またはサイズを有する側鎖を有するアミノ酸で置き換えることによって、タンパク質の活性を保存し得る。
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に伝達するために使用される任意の分子または実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
用語「発現ベクター」または「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に適したものであって、作動可能に連結された1つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）誘導および/または制御する核酸配列を含有する、ベクターを指す。発現構築物は、作動可能に連結されたコード領域の転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合にはRNAスプライシングに影響を及ぼすまたはそれを制御する配列を含み得るが、これらに限定されない。
用語「刺激」は、刺激分子（例えばTCR/CD3複合体またはCAR）とその同族リガンド（あるいはCARの場合は腫瘍抗原）との結合によって誘導される一次応答であって、それによって例えばTCR/CD3複合体を介するシグナル伝達または適切なNK受容体もしくはCARのシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達であるがそれに限定されないシグナル伝達イベントを媒介するものを指す。刺激は特定の分子の発現変化を媒介し得る。
「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一態様について刺激性の態様で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞（例えばT細胞、NK細胞、B細胞）によって発現される分子を指す。1つの態様において、シグナルは、例えば、ペプチドを積載したMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、T細胞応答（増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない）の媒介をもたらす。刺激性態様で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）またはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明において特に有用な細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例としては、CD3ゼータ、共通FcRガンマ（FCER1G）、FcガンマRIIa、FcRベータ（FcイプシロンR1b）、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10、およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってT細胞による共刺激応答（例えば増殖であるがこれに限定されない）を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、限定されるものではないが、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）、および4-1BB（CD137）を含む。
用語「自家性（autologous）」は、後にその物質が再導入されるその同じ個体に由来する物質を指す。
本明細書で使用される用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞（例えばCAR-T細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばCAR-T細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびヘルパー活性が含まれ、これはサイトカインの分泌を含む。
本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」という用語は、例えば免疫エフェクター応答の促進において、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、T細胞、例えばアルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、ナチュラルキラーT (NKT) 細胞、マスト細胞、および骨髄由来食細胞が含まれる。
置換、挿入または欠失についてのガイダンスは、異なる種由来のタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくか、または同一もしくは類似の機能を有する複数のタンパク質に基づくコンセンサス配列に由来し得る。
［詳細説明］
MDR1と腫瘍関連抗原 (TAA) との両方を標的とする多特異性抗体として使用することができる抗MDR1抗体、ならびにそのような多特異性抗体を含むかまたはコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、およびキットが提供される。多特異性抗体は、MDR1のための抗原結合部位を含む共通の可変軽（VL：variable light）鎖、MDR1のための抗原結合部位を含む第1の可変重（VH：variable heavy）鎖、およびTAAのための抗原結合部位を含む第2のVH鎖を含む。MDR1とTAAとの両方を標的とする多特異性抗体を対象に投与することを含む、癌について対象を治療する方法も提供される。治療することは、多特異性抗体を単独で投与すること、または多特異性抗体および化学療法剤を投与することを含むことができる。また、記載された多特異性抗体を作製する方法およびそれに関連する試薬も提供され、それには本発明の方法において有用な遺伝子組換え細胞株およびそのような遺伝子組換え細胞株を作製する方法も含まれる。
本明細書で提供される二重特異性抗体は、MDR1およびTAAの両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/またはTAAを発現する非癌細胞への結合は低減していることを示す。換言すると、本明細書で提供される二重特異性抗体は、(1) TAAを発現するがMDR1発現は低いかまたは不在である細胞、および (2) MDR1を発現するがTAA発現は低いかまたは不在である細胞に対しては低い親和性で結合し、MDR1およびCD47の少なくとも一方または両方を比較的高いレベル（すなわち、正常細胞より高いレベル）で発現する癌細胞に対しては高い親和性で結合する。
また、本明細書では、抗MDR1抗体15D3と比較してMDR1に対する親和性が低減された抗MDR1抗体、および抗CD47抗体5F9と比較してCD47に対する親和性が低減された抗CD47抗体も開示される。これらの抗体は、化学療法と共投与（co-administered）され化学療法に対する癌細胞の化学療法感受性を増加させる場合において、対象における癌の治療に用途を見出す。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記述される特定の実施形態に限定されるものではなく、そのような実施形態は当然ながら変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるのであり、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
数値範囲が提供される場合、各介在値は、文脈が別に明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限と、その記載された範囲内の他の記載された又は介在する値との間で、下限の単位の10分の1まで、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が上下限値の一方又は両方を含む場合、それらのいずれか又は両方を含まない範囲も本発明に含まれる。
特定の範囲は、「約」という用語に続く数値により提示されている。「約」という用語は、本明細書では、その用語の後にくるその正確な数、ならびにその用語の後にくる数に近いかまたはその近似値である数に対する文言的根拠を提供するために使用される。ある数が具体的に記載された数に近い又は近似しているかを決定することにおいて、近い又は近似しているが具体的に記載されてはいない数とは、それが提示されている文脈において、具体的に記載された数と実質的に等価な数とすることができる。
別段の定義がされない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、代表的な例示的方法および材料について説明する。
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されているところに関連する方法および/または材料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は本出願日前の開示についてのものであり、本発明がそのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は、独立して確認する必要がある実際の公表日とは異なる場合がある。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、クレームは任意選択要素を除外するように作成することができることに留意されたい。したがって、この陳述は、クレーム要素の記載に関連して「もっぱら」、「のみ」等の排他的用語の使用、又は「除く」限定の使用についての文言的根拠としての役割を果たすことを意図している。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載され図示された個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されまたは組み合わせられ得る別個の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
方法及び組成物は、文法的な流れのために機能的な説明を伴って記載されているか又は記載されるであろうが、クレームは、明示的に35 U.S.C.§112(f)に基づいて定式化されていない限り、「手段」又は「ステップ」限定の構成により必ずしも限定されるものと解釈されるべきではなく、均等論の法理下のクレームにより提供される定義の意味及び均等物の完全な範囲を付与されるべきであり、また、クレームが35 U.S.C.§112(f)に基づいて明示的に定式化されている場合は、35 U.S.C.§112(f)に基づく完全な法定均等物を付与されるべきであることが明確に理解されるべきである。
抗体
［二重特異性抗体］
本開示は、多剤耐性タンパク質1（MDR1：multidrug resistance protein 1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子を提供し、この抗体分子は、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、ここで、各VL鎖は、MDR1のための抗原結合部位を含み、第1のVH鎖は、MDR1のための抗原結合部位を含み、第2のVH鎖は、TAAのための抗原結合部位を含み、第2のVH鎖は、軽鎖の1つと対合した場合にTAAに結合する。該二重特異性抗体分子は、MDR1およびTAAの両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/またはTAAを発現する非癌細胞への低減された結合を示す。換言すると、本明細書で提供される二重特異性抗体は、(1) MDR1発現が低いかまたは不在のTAA発現細胞、および (2) TAA発現が低いかまたは不在のMDR1発現細胞に対しては低い親和性で結合し、MDR1およびCD47の少なくとも1つまたは両方を比較的高いレベルで、すなわち、正常細胞より高いレベルで発現する癌細胞に対しては、高い親和性で結合する。
比較的高いレベルとは、その癌細胞と同じタイプの正常細胞における発現レベルの少なくとも1.5倍（例えば少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、またはそれ以上）である発現を指す。低減された親和性とは、その癌細胞と同じタイプの正常細胞への抗体分子の結合と比較して、少なくとも10%（例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、またはそれ以上）低減した結合親和性を指す。低減された親和性には、検出可能な結合の欠如も包含される。
「抗体分子」という用語は、本明細書に定義されるような抗体を包含し、その抗原結合断片を含む。ある態様において、抗体分子は、2つの可変軽(VL)鎖および2つの可変重(VH)鎖を含む。ある態様において、抗体分子は、重鎖および軽鎖の定常領域も含む。重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、ヒト抗体、例えばヒトIgG1抗体に由来し得る。ヒトIgG1重鎖 (HC) 定常領域は、抗体依存性細胞傷害性 (ADCC) を低減させる突然変異を含むように改変され得る。それに加えて、またはそれに代えて、2つのVH鎖は、各々、異なるヒトIgG1 HC定常領域に結合されて、個々のヒトIgG1 HC定常領域が、異なるヒトIgG1 HC定常領域間で二量体を形成するのに有利となる置換を有するようにし得る。そのようなHC領域は、本明細書でさらに詳細に説明される。抗体分子が二重特異性抗体分子である特定の態様において、ヒトIgG1 HC定常領域の一方は、正に荷電した側鎖を有する1つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み、他方のヒトIgG1 HC定常領域は、負に荷電した側鎖を有する1つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み、この2つの異なるHC間の二量体の形成を促進させ得る。
特定の態様において、2つのVL鎖の抗原結合部位は、以下の配列を有するVL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含み、
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
ここでX1はN、Q、またはSである。
ある態様において、2つのVL鎖は、以下の配列を有するVL鎖のLCDR 1～3を含む：
(i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK;
(ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; または
(iii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK。
いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体は、(i) 以下の配列を有するVL鎖のLCDRを含む2つのVL鎖：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
および以下配列を有するVH鎖のHCDRを含む第1のVH鎖：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を含まない。
ある態様において、VLおよびVH軽鎖のCDRは、Kabat命名法に基づいて定義され得る。
ある態様において、i) LCDR1は、配列RSSQSIVHSTGX1TYLEを含み、(ii) LCDR2は、配列KISNRFSをみ、(iii) LCDR3は、配列FQASHFPRTを含み、ここでX1はN、Q、またはSである。これらのLCDRはKabatの命名法に基づいている。
ある態様では、2つのVL鎖はヒト化される。ある態様において、2つのVL鎖は、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含むようにヒト化される。
特定の態様において、2つのVL鎖は、以下の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性である配列を含む：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK;
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; または
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、各々が以下の配列：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
を含む2つのVL鎖を含む。
ある態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるVL鎖を含む軽鎖および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、UniProtKB/Swiss-Prot: P01834.2に記載されるアミノ酸配列を有するヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常領域であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、第1のVH鎖を含み、該VH鎖は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3 (HCDR 1～3) を含み、ここでX2は、N、QまたはSである。
ある態様において、第1のVH鎖は、以下の配列を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む。
(i)EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, または(ii)EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS, または(iii)EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
ある態様において、VH鎖のHCDR 1～3は、Kabat命名法に基づいて定義される。
ある態様において、第1のVH鎖は、(i) 配列RYTMSを含むHCDR1；(ii) 配列TISSGGGX2TYYPDSVKGを含むHCDR2；および(iii) 配列YGAGDAWFAYを含むHCDR3を含み、ここで、X2はN、QまたはSである。これらのHCDRはKabat命名法に基づいている。
ある態様において、第1および/または第2のVH鎖はヒト化される。ある態様において、VH鎖は、ヒト抗体からのフレームワーク領域を含むようにヒト化される。
ある態様において、第1のVH鎖は、以下の配列を含む：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; または EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS。
ある態様において、第1のVH鎖は、以下の配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の同一性である配列を含む：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; または
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS。
特定の態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるような第1のVH鎖を含む第1の重鎖、およびヒトIgG1重鎖定常領域を含む。
ある態様において、二重特異性抗体の第2のVH鎖は、TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、ここで、TAAに対する二重特異性抗体分子の親和性は、そのVH鎖が由来する単一特異性抗体分子のTAAに対する親和性よりも少なくとも2倍低い（例えば、少なくとも3倍の低い、少なくとも4倍の低い、少なくとも5倍の低い）。二重特異性抗体および単一特異性抗体の親和性は、同じアッセイを用いて測定される。抗体親和性を測定するための任意の適切な方法を利用することができる。ある態様において、親和性は、抗原に対する抗体の可逆的結合についての平衡定数を計算することによって測定され得、解離定数 (Kd) として表される。ある態様において、KdはELISAによって測定され得る。
特定の態様において、二重特異性抗体の第2のVH鎖は、TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、ここで、TAAに対する二重特異性抗体分子の半最大有効濃度 (EC50) は、そのVH鎖が由来する単一特異性抗体分子のTAAに対するEC50よりも少なくとも2倍高い（例えば少なくとも3倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも5倍高い）。二重特異性抗体及び単一特異性抗体のEC50は同じアッセイを用いて測定される。抗体のEC50を測定するための任意の適切な方法を利用することができる。最大反応の半分（例えば、最大蛍光強度の半分）を示す濃度をEC50として測定する。
試験抗体のEC50は、フローサイトメトリーまたはELISAによって測定され得る。例えば、フローサイトメトリーは、フローサイトメトリー緩衝液中で、抗原（例えばヒト野生型MDR1または突然変異型MDR1）を発現する細胞を抗体と接触させること（ここで、抗体は段階的に希釈されり）、および、抗体が細胞に結合するのに十分な時間（例えば10分～1時間）に渡り室温または4℃でインキュベートすることを含み得る。インキュベーション後、任意で細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去してもよく、および/または、試験抗体に特異的に結合する蛍光標識二次抗体と細胞を接触させてもよい。インキュベーション後、蛍光標識二次抗体を除去して細胞を洗浄してもよい。洗浄された細胞は、フローサイトメトリーによって選別され得、蛍光標識二次抗体に結合された細胞の数が計数され得る。最大反応の半分（例えば、最大蛍光強度の半分）を提供する濃度がEC50として測定される。フローサイトメトリーアッセイのバリエーションにおいて、細胞は、MDR1を過剰発現する293T細胞であり得る。
TAAは、癌細胞において過剰発現されることが知られている任意の抗原であり得る。例えば、TAAは、正常細胞においては検出可能なレベルで発現されず、癌細胞において発現される抗原であり得、ここで、正常細胞および癌細胞は同じ細胞型、例えば上皮細胞である。例えば、TAAは、未変異タンパク質のアミノ酸配列と比較して、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる腫瘍特異的変異（複数可）から生じる腫瘍抗原の一分類であるネオアンチゲンであり得る。他の態様において、TAAは、正常細胞で発現されるが、癌細胞ではより高いレベルで発現される抗原である。特定の態様において、TAAはCD47であり得る。
［抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体］
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、CD47に結合し、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を含むVH鎖のHCDRを含む。
ある態様において、第2のVH鎖は、配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列GGYRAMDYを含むHCDR3を含む。HCDR 1～3はKabatの命名法に基づいて定義される。
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
に対して少なくとも80%の同一性（例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、または少なくとも95%の同一性）である配列を含む。
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を含む。
特定の態様において、MDR1およびCD47に結合する二重特異性抗体は、以下の配列を有するCD47に対する抗原結合部位を含むヒト化VH鎖を含み得る：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS;
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS;または
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS。
二重特異性抗体のさらなる態様は、本出願の別の箇所に記載されており、本明細書に開示されている配列のバリエーション、ヒト化バージョン、および/または、第1および第2のVH鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するFc領域中の置換を含む。
［抗MDR1および抗PD-L1二重特異性抗体］
特定の態様において、TAAは、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）であり得る。PD-L1は、cluster of differentiation 274（CD 274）またはB7ホモログ1（B7-H1）としても知られている。ある態様において、MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体分子は、前のセクションに記載されたように、共通の軽鎖および第1のVH鎖を含み、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む。
Kabatの命名法に従って定義されるHCDR 1～3は以下のとおりである。
HCDR1: DSWIH
HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG
HCDR3: RHWPGGFDY
MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性のアミノ酸配列を有し得る。
MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖中に存在し得る。
本明細書の別の箇所に記載されているように、VL鎖、第1のVH鎖、および第2のVHのうちの少なくとも1つ、2つ、またはすべてをヒト化することができる。さらに、VH鎖のFc領域は、第1および第2のVH鎖の間のヘテロ二量体化を増大させる置換を含んでもよい。ある態様において、第1の重鎖がヒト化されて荷電対置換K392DおよびK409Dを含み得、そして第2の重鎖が荷電対置換E356KおよびD399Kを含み得る。
［抗MDR1および抗EGFR二重特異性抗体］
特定の態様において、TAAは上皮成長因子受容体 (EGFR) であり得る。EGFRのための抗原結合部位を含む第2のVH鎖のHCDR 1～3は、抗EGFR抗体ネシツムマブまたはセツキシマブのVH鎖に由来し得る。ネシツムマブの重鎖は以下の配列を有する。
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
セツキシマブの重鎖は以下の配列を有する。
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
第1の態様において、抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体は、前のセクションで説明したようなVL鎖および第1のVH鎖を含み、第2のVH鎖は、ネシツムマブのVH領域由来のHCDRを含み得る。Kabat命名法に従って定義されるHCDRは、以下の配列を有することができる。
HCDR1: SGDYYWS
HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS
HCDR3: VSIFGVGTFDY
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
MDR1およびEGFRに結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖中に存在し得る。
第2の態様において、抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体は、前のセクションで説明したようなVL鎖および第1のVH鎖を含み、第2のVH鎖は、セツキシマブのVH領域由来のHCDRを含み得る。Kabat命名法に従って定義されるHCDRは、以下の配列を有することができる。
HCDR1: NYGVH
HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS
HCDR3: ALTYYDYEFAY
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
MDR1およびEGFRに結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖中に存在し得る。
上記の抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体は、上記の抗MDR1抗CD47二重特異性抗体および抗MDR1抗PD-L1二重特異性抗体と同じVH鎖およびVL鎖の組み合わせを含み、15D3 HC::MRK16 LC::ネシツムマブHCおよび15D3 HC::MRK16 LC::セツキシマブHC抗体と称され得る。
本明細書では、MDR1のための抗原結合部位を含む共通VL鎖と、MDR1のための抗原結合部位を含む第1のVH鎖との異なる組み合わせを含むが、上述のようなMRK16 LCおよび/または15D3 HCに基づかない二重特異性抗体分子も提供される。
特定の態様において、抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体は、重鎖および軽鎖の以下の組み合わせを有し得る: (i) 15D3 HC::セツキシマブHC::15D3 LC；(ii) MRK16 HC::セツキシマブHC:15D3 LC；又は (iii) MRK16 HC::セツキシマブHC::MRK16 LC。
HCDRおよびLCDR、VLおよびVH領域、ならびに重鎖および軽鎖は、本明細書で提供されるのと同じ配列を有してもよい。
第1のHCは荷電対置換K392DおよびK409Dを含み、第2の重鎖は荷電対置換E356KおよびD399Kを含み得、またはその逆であり得る。
ある態様において、本開示の二重特異性抗体は、二重特異性抗体UIC2 DD HC::セツキシマブKK HC::MRK16 LCを包含しない。この二重特異性抗体は、抗MDR1抗体UIC2のHCDR 1～3を含むVH鎖を含む二重特異性抗体。しかしながら、この抗体は、MDR1を過剰発現する293T細胞を用いたFACSにより測定されるように、MDR1への結合を保持しない。図31参照。UIC2 HCのVH鎖は、本明細書の別の箇所で提供される通りである。
ある態様において、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるような第2のVH鎖および重鎖定常領域を含む第2の重鎖を含む。重鎖は、ヒトIgG1重鎖定常領域配列を含み得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、MDR1およびTAAの両方を発現する細胞に特異的に結合し、MDR1またはTAAのいずれかを発現する細胞と比較してMDR1およびTAAの両方を発現する細胞に対して2倍超の親和性を有する。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させることができ、ここで、該抗体と共投与された場合の化学療法剤の半最大阻害濃度 (IC50) は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA
を有するVH鎖；および以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK
を有するVL鎖を含む抗MDR1抗体と共投与された場合の化学療法剤のIC50より少なくとも2倍低い（例えば、少なくとも3倍低い、少なくとも4倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも20倍低い、または少なくとも30倍低い）。ある態様において、該抗MDR1抗体は、米国特許第5,959,084号に記載された15D3抗体であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA
を有するVH鎖および以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK
を有するVL鎖を含む抗MDR1抗体よりも少なくとも2倍低い親和性（例えば少なくとも3倍低い、少なくとも4倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも20倍低い、または少なくとも30倍低い親和性）でMDR1に結合する。ある態様において、該抗MDR1抗体は、米国特許第5,959,084号に記載された15D3抗体であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、MDR1を発現する細胞に結合した場合に、MDR1による排出を阻害する。阻害は、二重特異性抗体の非存在下でのMDR1による排出と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも50%、またはそれ以上の排出の減少であり得る。
特定の態様において、二重特異性抗体分子は、1つ以上のFcγ受容体への抗体の結合を減少または消失させるように改変されたFcドメインを含む。ある態様において、IgG1 Fcドメインは、置換L234A、L235A、P329GおよびN297A/Q/Gのうちの1つ以上を有し得る。
上述のように、本開示は、細胞排出ポンプを標的とするドメインおよび癌関連抗原を標的とするドメインを有する多特異性抗体を提供する。多剤耐性タンパク質1 (MDR1) 結合ドメインおよび白血球表面抗原CD47結合ドメインを含む多特異性抗体が含まれる。本開示の多特異性抗体は、MDR1およびCD47の両方を発現する細胞に特異的に結合する。
従って、本開示の多特異性抗体は、MDR1およびCD47の両方を標的とする。P糖蛋白質1（Pgp）としても知られるMDR1は、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1（ABCB1）から発現される、多剤耐性細胞における薬物蓄積の減少に関与するエネルギー依存性排出ポンプである。インテグリン関連蛋白質（IAP）としても知られるCD47は、膜インテグリンに結合する免疫グロブリンスーパーファミリー膜貫通蛋白質であり、リガンドであるトロンボスポンジン-1（TSP-1）およびシグナル調節蛋白質アルファ（SIRPα）の受容体としても機能し、CD47遺伝子によってコードされる。CD47リガンド結合は、食作用の阻害をもたらすことができ、したがって、免疫療法における標的として、CD47細胞外ドメインのマスキングは、CD47発現癌細胞の免疫媒介性殺傷の阻害を妨げる。
本開示の多特異性抗体の一実施形態の概略図を図1 Aに示す。図示されるように、多特異性抗体100は、MDR1結合ドメイン101およびCD47結合ドメイン102、ならびに任意で、Fcドメイン103の全てまたは一部を含む。図1 Bに示すように、MDR1 107を発現するがCD47発現は低いかまたは不在である細胞104の存在下では、多特異性抗体100は、細胞に対して低い親和性を有する。同様に、CD47 108を発現するがMDR1発現は低いかまたは不在である細胞105の存在下では、多特異性抗体100は、細胞に対して低い親和性を有する。しかしながら、MDR1 107およびCD47 108の両方を発現する細胞106の存在下では、多特異性抗体100は、細胞に対して高い親和性を有する。
したがって、本開示の多特異性抗体は、MDR1またはCD47のみを発現する細胞よりも高い親和性で、MDR1およびCD47の両方を発現する細胞に結合する。対応して、本開示の多特異性抗体は、例えば第1および第2の標的の両方が低いレベルより高く存在する場合（例えば、平均レベル、正常レベルおよび/または高レベル）と比較して、それぞれの第2の標的が低いレベルで存在する場合にははるかに低減された親和性で結合する。いくつかの実施形態において、対象の多特異性抗体がMDR1およびCD47の両方を発現する細胞に結合する親和性は、対象の多特異性抗体がMDR1またはCD47のどちらかを発現する（または低いレベルのMDR1またはCD47のどちらかを発現する）細胞に結合する親和性と比較して、2倍よりも大きく、例えば、2.5倍よりも大きい、3倍よりも大きい、4倍よりも大きい、5倍よりも大きい、6倍よりも大きい、7倍よりも大きい、8倍よりも大きい、9倍よりも大きい、10倍よりも大きい、またはそれ以上である。
いくつかの態様において、対象の多特異性抗体は、MDR1を発現する細胞に結合した場合、細胞MDR1タンパク質の機能を妨げることができる。従って、本開示の多特異性抗体は、MDR1タンパク質による排出を阻害することができ、これには、例えば、対象の多特異性抗体の不在下のMDR1による排出と比較して、排出が5%以上、例えば、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、または90%以上減少する場合が含まれる。
いくつかの実施形態において、対象の多特異性抗体は、CD47を発現する細胞に結合した場合、細胞性CD47タンパク質の機能を妨げることができる。従って、本開示の多特異性抗体は、CD47に対するCD47リガンドまたはCD47結合パートナーの結合を阻害することができ、これには、例えば、例えば、対象の多特異性抗体の不在下のCD47による結合と比較して、リガンド/結合パートナーの結合が5%以上、例えば、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、または90%以上低減される場合が含まれる。
本開示の多特異性抗体は、MDR1およびCD47に対して少なくとも二重特異性であり、ここで、抗体の構成は変化し得る。用語「抗体」は、1つ以上の（例えば1つまたは2つの）重鎖可変領域 (VH) および/または1つ以上の（例えば1つまたは2つの）軽鎖可変領域 (VL) を含むタンパク質、またはエピトープに結合することができるその断片を指す。本明細書に記載の多特異性抗体に関して、そのような抗体は、2つの異なる標的タンパク質上に存在する少なくとも2つの異なるエピトープに結合することができる。対象の多特異性抗体によって結合される、異なる標的タンパク質の数、すなわち異なるエピトープの数は、様々であり得、2つ（すなわち、二重特異的）、3つ（三重特異的）、4つ、またはそれ以上であり得る。
ある実施形態において、本開示の多特異性抗体は、共通の軽鎖を含み得る。本明細書で使用される場合、「共通の軽鎖」という用語は、一般的に、多特異性抗体における同じ軽鎖の2つのコピーの使用および組み込みを指す。別の言い方をすれば、構築された多特異性抗体において軽鎖は、MDR1特異的重鎖と会合し、その同じ軽鎖の第2のコピーが、CD47特異的重鎖と会合する。
VHおよびVL領域は、「相補性決定領域 (CDR)」と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これらの間には「フレームワーク領域 (FR)」と呼ばれるより保存された領域が散在する。FRおよびCDRの範囲は正確に定義されている（Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917参照）。VHは、3つのCDRと4つのFRとを、N末端からC末端へと次の順序で配置して含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、VLは、3つのCDRと4つのFRとを、N末端からC末端へと次の順序で配置して含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体のVHまたはVL鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部をさらに含み得、それにより、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成する。1つの実施形態において、抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖の四量体であり、ここで重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって相互接続されている。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3という3つのドメインで構成される。軽鎖定常領域は1つのドメインCLから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞および補体系の第一成分を含む宿主組織および因子への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型の免疫グロブリンおよびそれらのサブタイプを含む。ある態様において、対象抗体は、IgGアイソタイプである。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（IgA1およびIgA2）、ガンマ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子；および多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約25 kDまたは214アミノ酸）は、N末端（約110アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端においてカッパまたはラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約50 kDまたは446アミノ酸）は、N末端（約116アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端において前記他の定常領域遺伝子の一つ、例えばガンマ（約330アミノ酸をコードする）によってコードされる。ある実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含む。
ある実施形態において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含まず、代わりに、1つ以上の全長免疫グロブリン重鎖の抗原結合断片および/または全長免疫グロブリン軽鎖の1つ以上の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、これらの抗原結合断片は、別個のポリペプチド鎖上に含まれる。他の実施形態では、これらの抗原結合断片は、単一のポリペプチド鎖内に含まれる。
用語「抗原結合断片」は、上記のようにMDR1またはCD47に特異的に結合することができる、全長抗体の1つ以上の断片を指す。結合断片の例としては、 (i) Fabフラグメント（例えばVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる、一価フラグメント）；(ii) F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；(iii) Fdフラグメント（VHおよびCH1ドメインを含み、例えばそれらからなる）；(iv) Fvフラグメント（抗体の単一アームのVHおよびVLドメインを含み、例えばそれらからなる）；(v) dAbフラグメント（VHドメインを含み、例えばVHドメインからなる）；(vi) 単離されたCDR；(vii) 単鎖Fv（scFv）（抗体の単一アームのVHおよびVLドメインが組換え手段を用いた合成リンカーによって接続され、VHおよびVLドメインが対になって一価分子を形成するようにされたものを含み、例えばそれからなる）；(viii) ジアボディー（それらが対をなさないようにVHドメインおよびVLドメインを連結して一価分子を形成した、2つのscFvを含むもの、例えば2つのそのようなscFvからなるもの；scFv対のそれぞれのVHはもう一方のscFvのVLドメインと対を形成し、二価分子を形成する）。
ある実施形態において、対象抗体は、組換えまたは改変された抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫（deimmunized）またはインビトロ生成抗体である。本明細書で使用される用語「組換え」または「改変」抗体は、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された全ての抗体を含むことが意図され、例えば (i) 宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体；(ii) 組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；(iii) ヒトの免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックとなった動物（例えばマウス）から単離された抗体；又は (iv) ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列に繋ぎ合わせることを含む他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体を含む。そのような組換え抗体には、ヒト化抗体、CDRグラフト化抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、およびインビトロ生成抗体が含まれ、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の定常領域を任意で含み得る。
改変された抗体は、改変されたドメインを含み得、いずれかの抗体ドメインが天然に存在する形態から改変され得る場合を含む。ある実施形態において、改変された抗体は、改変されたCH2および/または改変されたCH3ドメインを含み、改変されたFcドメインを含み、改変された重鎖を含み得る。いくつかの例では、改変されたFcドメインは、静電ステアリング効果を利用し得、これは、例えばGunasekeran et al, (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 19637-19646（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている手順の使用を通じたものを含むがこれに限定されない。いくつかの例において、二重特異性抗体は、CH3ドメインにおける電荷対置換を介してアセンブルされ、これには例えば、1つの重鎖がK392DおよびK409D置換を含むように改変され、他方の重鎖がE356KおよびD399K置換を含むように改変されたものを含むが、これに限定されない。電荷対置換鎖は優先的に、互いにヘテロ二量体を形成する。アミノ酸置換の番号付けはHCについてのEU番号付けシステムによる。
いくつかの例では、本開示の抗体は、電荷対置換を含む。いくつかの例では、本開示の抗体は、電荷対置換を含まない。いくつかの例では、所望の鎖の優先的ヘテロダイマー形成を促進する代替手段が使用され得る。
ある場合には、改変された重鎖は、ノブ-イントゥ-ホール（knob-into-hole）改変を含み得る。「ノブ-イントゥ-ホール」アミノ酸改変は、抗体工学における合理的設計戦略であり、重鎖のヘテロ二量体化、多特異性抗体（二重特異性IgG抗体を含む）の産生に使用される。例えば、異なる特異性を有する2つのモノクローナル抗体から作製される二重特異性抗体にノブ-イントゥ-ホール戦略を組み込む際に、モノクローナル抗体1（mAb1）の重鎖のCH3上に「ノブ」を形成し、モノクローナル抗体2（mAb2）の重鎖のCH3上に「ホール」を形成するために、アミノ酸変化を操作する。ノブは、例えばチロシン (Y) のような大きなアミノ酸で表され得、ホールは、スレオニン (T) のような小さなアミノ酸で表され得る。例えば、ノブ-イントゥ-ホール対改変は、第1のCH3ドメインにおけるT22Y置換およびパートナーCH3ドメインにおけるY86T置換により生成することができる。ノブ-イントゥ-ホール改変の例はCarter, J. Immunol. Methods, 248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. Protein Eng. 9(7):617-2 (1996); and Merchant, A. M. et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998) に記載されており、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。対になったノブ-イントゥ-ホール改変ドメインから生成された抗体では、二重特異性ヘテロ二量体が概して主要な画分を表すことになる。
上記で要約されたように、本開示の多特異性抗体は、MDR1結合ドメインおよびCD47結合ドメインを含む。そのようなドメインは、ドメインによって結合されるエピトープ、可変領域の配置および配列などを含め、変化し得る。
本発明のMDR1結合ドメインは、MDR1の1以上のエピトープに特異的に結合する。したがって、エピトープはMDR1エピトープである。MDR1結合ドメインによって結合されるMDR1エピトープのサイズは変動し得、MDR1エピトープが、例えば4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、4 aa～10 aa、5 aa～10 aa、6 aa～10 aa、4 aa～8 aa、5 aa～8 aa、6 aa～8 aaなどを含むがこれらに限定されない、4 aa以下から12 aa以上の範囲であり得るMDR1配列の連続したストレッチを有するポリペプチドによって形成される場合を含む。
いくつかの実施形態において、MDR1エピトープは、例えば以下のものを含むがこれに限定されないMDR1配列の隣接するストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成され得る：
ヒトMDR1配列
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLALGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGSGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLMPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTKVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ；
またはげっ歯類のMDR1配列、例えば以下のマウスMDR1配列：
MEFEENLKGRADKNFSKMGKKSKKEKKEKKPAVGVFGMFRYADWLDKLCMILGTLAAIIHGTLLPLLMLVFGNMTDSFTKAEASILPSITNQSGPNSTLIISNSSLEEEMAIYAYYYTGIGAGVLIVAYIQVSLWCLAAGRQIHKIRQKFFHAIMNQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINDGIGDKIGMFFQSITTFLAGFIIGFISGWKLTLVILAVSPLIGLSSALWAKVLTSFTNKELQAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQQKELERYNKNLEEAKNVGIKKAITASISIGIAYLLVYASYALAFWYGTSLVLSNEYSIGEVLTVFFSILLGTFSIGHLAPNIEAFANARGAAFEIFKIIDNEPSIDSFSTKGYKPDSIMGNLEFKNVHFNYPSRSEVQILKGLNLKVKSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPLEGVVSIDGQDIRTINVRYLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHQFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQAALDKAREGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDGGVIVEQGNHDELMREKGIYFKLVMTQTRGNEIEPGNNAYGSQSDTDASELTSEESKSPLIRRSIYRSVHRKQDQERRLSMKEAVDEDVPLVSFWRILNLNLSEWPYLLVGVLCAVINGCIQPVFAIVFSRIVGVFSRDDDHETKRQNCNLFSLFFLVMGLISFVTYFFQGFTFGKAGEILTKRVRYMVFKSMLRQDISWFDDHKNSTGSLTTRLASDASSVKGAMGARLAVVTQNVANLGTGVILSLVYGWQLTLLLVVIIPLIVLGGIIEMKLLSGQALKDKKQLEISGKIATEAIENFRTIVSLTREQKFETMYAQSLQVPYRNAMKKAHVFGITFSFTQAMMYFSYAACFRFGAYLVAQQLMTFENVMLVFSAVVFGAMAAGNTSSFAPDYAKAKVSASHIIRIIEKTPEIDSYSTEGLKPTLLEGNVKFNGVQFNYPTRPNIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPMAGSVFLDGKEIKQLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRAVSHEEIVRAAKEANIHQFIDSLPDKYNTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVIENGKVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVQAGAKRS；
またはヒト以外の霊長類の配列、例えば以下のPan troglodytes（チンパンジー）配列：
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKQVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLVLGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIASEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLTPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ；
または以下のMacaca fascicularis（カニクイザル）配列：
MDLEGDRNGGAEKKNFFKLNNKSKKDKKERKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGDMTDTFANAGNLGDLGALLFNNTNSSNITDTVPVMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSKEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAFEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPQKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEIELENAADESKSEIDTLEMSSHDSGSSLIRKRSTRRSVRGSQGQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAVIFSKIIGIFTRNDDAETKRQNSNLFSLLFLVLGIVSFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAIITQNIANLGTGIIISLIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYDQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHSLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKVSAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLKPNTLEGNVTFNEVVFNYPTRLDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKQLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSISENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGAKRQ
など。
本発明のMDR1結合ドメインは、MDR1への高親和性結合を示す。例えば、本発明のMDR1結合ドメインは、少なくとも約10-7 M、少なくとも約10-8 M、少なくとも約10-9M、少なくとも約10-10 M、少なくとも約10-11 M、または少なくとも約10-12M、または10-12 Mより大きい親和性でMDR1に結合する。本発明のMDR1結合ドメインは、MDR1上に存在するエピトープに、約10-7M～約10-8 M、約10-8 M～約10-9M、約10-9 M～約10-10 M、約10-10M～約10-11 M、または約10-11 M～約10-12M、または10-12 Mより大きい親和性で結合する。
本発明のMDR1結合ドメインは、関連するが配列が異なる他のタンパク質、例えば関連するが配列が異なるEP内のアミノ酸によって形成されるエピトープには実質的に結合しない。関連するが配列が異なるタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープへの当該MDR1結合ドメインの結合は、一般に、MDR1上のエピトープへの該MDR1結合ドメインの特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的により低い親和性は、一般に、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍低い親和性である。
本発明のMDR1結合ドメインは、MDR1トランスポーターを介する分子の輸送を減少させることができる。例えば、本発明のMDR1結合ドメインは、MDR1結合ドメインの非存在下での輸送の程度と比較して、輸送を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上減少させることができる。
ある実施形態において、本発明の抗体は、以下のものを含む：
a) i. RYTMSの重鎖CDR1領域とアミノ酸配列において同一であるかまたはそれを含む、CDR1領域；ii. TISSGGGNTYYPDSVKGの重鎖CDR2領域とアミノ酸配列において同一であるかまたはそれを含む、CDR2領域；およびiii. YGAGDAWFAYの重鎖CDR3領域とアミノ酸配列において同一であるかまたはそれを含む、CDR3領域
を含む重鎖可変ドメイン。これらのCDR 1-3領域は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA
を有する15D3抗体のVH鎖、または以下の配列：
evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfsrytmswvrqapgkglewvatissgggX2tyypdsvkgrftvsrdnsknslylqmnslrtedtalyycarygagdawfaywgqgtlvtvss
を有するこのVH鎖のヒト化バージョンに存在するものであり、ここでX2はN、QまたはSである。これらのCDRは、Kabatの命名法に基づいている。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、CDR1（RYTMS）、CDR2（TISSGGGX2TYYPDSVKG、ここでX2はN, QまたはS）、およびCDR3（YGAGDAWFAY）のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を有する1つ、2つ、または3つの重鎖CDRと、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類及びヒト配列（例えば、それぞれの重鎖FRコード化配列によってコードされるもの）を含む哺乳動物配列であるFR領域とを含む重鎖可変領域を含む。例えば、いくつかの態様において、対象抗体は、N末端からC末端への順に、ヒト重鎖FR1、アミノ酸配列RYTMSを含むCDR1；ヒト重鎖FR2；TISSGGGNTYYPDSVKGを含むCDR2；ヒト重鎖FR3；アミノ酸配列YGAGDAWFAYを含むCDR3；およびヒト重鎖FR4を含む、重鎖可変領域を含む。
対象抗体は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。本発明の抗体は、CDR1 (RYTMS) 、CDR2 (TISSGGGNTYYPDSVKG) 、およびCDR3 (YGAGDAWFAY) の1つ以上から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域 (CDR) の1つ、2つ、または3つを含む重鎖可変領域を含むことができる。特定の態様において、VH鎖は、ヒトフレームワーク領域を含むようにヒト化され、ヒト化VH鎖は、以下の配列：
evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfsrytmswvrqapgkglewvatissgggX2tyypdsvkgrftvsrdnsknslylqmnslrtedtalyycarygagdawfaywgqgtlvtvs
に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含み得、ここで、X2はN、QまたはSである。
対象CD47結合ドメインは、CD47の1以上のエピトープに特異的に結合する。したがって、エピトープはCD47エピトープである。CD47結合ドメインによって結合されるCD47エピトープのサイズは変動し得、これは、CD47エピトープが、例えば4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、4 aa～10 aa、5 aa～10 aa、6 aa～10 aa、4 aa～8 aa、5 aa～8 aa、6 aa～8 aaなどを含むがこれらに限定されない、4 aa以下から12 aa以上の範囲のCD47配列の連続したストレッチを有するポリペプチドによって形成される場合を含む。
いくつかの実施形態において、CD47エピトープは、例えば以下のものであるがこれに限定されないCD47配列の連続したストレッチに対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成され得る：
ヒトCD47配列：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE；
またはげっ歯類のCD47配列、例えば以下のマウスCD47配列：
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR；
非ヒト霊長類の配列、例えば以下のPongo abelii (スマトラオランウータン) 配列：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLIITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLNSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE
またはMacaca mulatta (アカゲザル) 配列：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTAPANFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLMITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE
など。
本発明のCD47結合ドメインは、CD47に対して高い親和性の結合を示す。例えば、対象CD47結合ドメインは、少なくとも約10-7 M、少なくとも約10-8 M、少なくとも約10-9M、少なくとも約10-10 M、少なくとも約10-11 M、または少なくとも約10-12M、または10-12 Mより大きい親和性でCD47に結合する。対象CD47結合ドメインは、CD47上に存在するエピトープに、約10-7M～約10-8 M、約10-8 M～約10-9M、約10-9 M～約10-10 M、約10-10M～約10-11 M、もしくは約10-11 M～約10-12M、または10-12 Mより大きい親和性で結合する。
本発明のCD47結合ドメインは、関連するが配列が異なる他のタンパク質、例えば関連するが配列が異なる免疫チェックポイントマーカー内のアミノ酸によって形成されるエピトープに対して実質的に結合を示さない。関連するが配列が異なるタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープに対する対象CD47結合ドメインの結合は、一般に、CD47上のエピトープへの該CD47結合ドメインの特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的により低い親和性は、一般に、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍低い親和性である。
対象CD47結合ドメインは、例えば、トロンボスポンジン-1（TSP-1）、シグナル調節タンパク質α（SIRPα）およびインテグリン（例えばインテグリンavb3）を含む、CD47に対するCD47結合パートナーの結合を減少させ得る。例えば、対象CD47結合ドメインは、該CD47結合ドメインの非存在下での結合の程度と比較して、CD47結合パートナー結合を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上減少させることができる。
ある態様において、対象抗体は、以下のものを含む可変ドメインを含む：a) i. NYNMHの重鎖CDR1領域とアミノ酸配列においてと同一であるかまたはそれを含む、CDR1領域と；ii. TIYPGNDDTSYNQKFKDの重鎖CDR2領域とアミノ酸配列において同一であるかまたはそれを含む、CDR2領域と；iii. GGYRAMDYの重鎖CDR3領域とアミノ酸配列において同一であるかまたはそれを含むCDR3領域とを含む重鎖可変ドメイン。これらのCDR 1～3領域は、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を有する5F9抗体のVH鎖に存在するものである。これらのCDRは、Kabatの命名法に基づいている。
対象抗体は、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。本発明の抗体は、CDR1 (NYNMH) 、CDR2 (TIYPGNDDTSYNQKFKD) 、およびCDR3 (GGYRAMDY) のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域 (CDR) の1つ、2つ、または3つを含む重鎖可変領域を含むことができる。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、CDR1 (NYNMH) 、CDR2 (TIYPGNDDTSYNQKFKD) 、およびCDR3 (GGYRAMDY) のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を有する1つ、2つ、または3つの重鎖CDRと、哺乳類、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類またはヒトの配列である（例えば、それぞれの重鎖FRコード化配列によってコードされる）FR領域とを含む重鎖可変領域を含む。例えば、いくつかの態様において、対象抗体は、N末端からC末端への順に、ヒト重鎖FR1；アミノ酸配列NYNMHを含むCDR1；ヒト重鎖FR2；アミノ酸配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むCDR2；ヒト重鎖FR3；アミノ酸配列GGYRAMDYを含むCDR3；ヒト重鎖FR4を含む重鎖可変領域を含む。
対象抗体は、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
または以下の配列を有するこの配列のヒト化バージョン：
divmtqtplsspvtlgqpasiscrssqsivhstgX1tylewyqqrpgqpprlliykisnrfsgvpdrfsgsgagtdftlkisrveaedvgvyycfqashfprtfgggtkleik
に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができ、ここでX1は、N、QまたはSである。
対象抗体は、CDR1（RSSQSIVHSTG X1TYLEW；ここでX1は、N、QまたはSである）、CDR2（KISNRFSG）、およびCDR3（FQASHFPRTF）、またはCDR1（RSSQSLLHSDGFDYLNW）、CDR2（ALSNRASG）およびCDR3（MZALQAPITF）で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域を含むことができる。いくつかの例では、そのような軽鎖可変領域は、対象の多特異性抗体の共通軽鎖において使用され得る。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、CDR1（RSSQSIVHSTG X1TYLEW；ここでX1は、N、QまたはSである）、CDR2（KISNRFSG）、およびCDR3（FQASHFPRTF）、またはCDR1（RSSQSLLHSDGFDYLNW）、CDR2（ALSNRASG）およびCDR3（MZALQAPITF）で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖CDRを含む軽鎖可変領域と、哺乳類、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類またはヒトの配列である（例えば、それぞれの軽鎖FRコード化配列によってコードされる）FR領域とを含む軽鎖可変領域を含む。例えば、いくつかの態様において、対象抗体は、N末端からC末端への順に、ヒト軽鎖FR1；アミノ酸配列RSSQSIVHSTG X1TYLEW（ここでX1は、N、QまたはSである）を含むCDR1；ヒト軽鎖FR2；アミノ酸配列KISNRFSGを含むCDR2；ヒト軽鎖FR3；FQASHFPRTFで表されるアミノ酸配列を含むCDR3；およびヒト軽鎖FR4を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様において、対象抗体は、任意で重鎖FR1領域；アミノ酸配列RYTMSを含むCDR1；重鎖FR2領域；アミノ酸配列TISSGGG(N/S/Q)TYYPDSVKGを含むCDR2；重鎖FR3領域；アミノ酸配列YGAGDAWFAYを含むCDR3；および重鎖FR4領域；ならびに、任意で重鎖FR1領域；アミノ酸配列NYNMHを含むCDR1；重鎖FR2領域；アミノ酸配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むCDR2；重鎖FR3領域；アミノ酸配列GGYRAMDYを含むCDR3；および重鎖FR4領域を含む。これらの態様のいくつかにおいて、FR領域の各々は、例えばヒトFR領域を含む、哺乳動物FR領域である。
いくつかの態様において、対象抗体は、以下のものを含む：前段落に記載された重鎖配列、およびさらに：軽鎖FR1領域；アミノ酸配列RSSQSIVHSTGNTYLEWまたはRSSQSLLHSDGFDYLNWを含むCDR1；軽鎖FR2領域；アミノ酸配列KISNRFSGまたはALSNRASGを含むCDR2；軽鎖FR3領域；アミノ酸配列FQASHFPRTFまたはMZALQAPITFを含むCDR3；任意で軽鎖FR4領域。
ある態様において、対象抗体は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
を有する電荷-電荷スワップ (KK) 改変を含む抗MDR1重鎖配列と、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
を有する電荷-電荷スワップ (DD) 改変を含む抗CD47重鎖配列と、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を有する抗MDR1軽鎖配列とを含む。いくつかの例では、対象抗体は、代替のヘテロ二量体Fc対合戦略を含み得る。
電荷-電荷スワップ改変とは、一方の重鎖がK392DおよびK409D置換を含むように改変され、他方の重鎖がE356KおよびD399K置換を含むように改変された置換を指す。電荷対置換された鎖は互いとヘテロ二量体を形成することを好む。アミノ酸置換の番号付けは、Ig HCについてのEU番号付けシステムによる。
［単特異性二価抗体および二重特異性抗体］
単特異性二価抗体またはそれから誘導される二重特異性抗体であり得る抗体も本明細書で提供される。
特定の態様において、本開示の抗体は、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
（ここで、X1はN、QまたはSである）を有するVL鎖の軽鎖CDR (LCDR) を含む可変軽（VL）鎖と、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
（ここで、X2は、N、QまたはSである）を有するVH鎖の重鎖CDR (HCDR) を含む可変重（VH）鎖とを含む。
ある態様において、VL鎖は、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDRを含み、VH鎖は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDRを含むか、又は、VL鎖は、以下の配列：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDRを含み、VH鎖は、以下の配列：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDRを含むか、又は、VL鎖は、以下の配列：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDRを含み、VH鎖は、以下の配列：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のLCDRを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE、RSSQSIVHSTGQTYLE、またはRSSQSIVHSTGSTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含む。
ある態様において、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG、TISSGGGQTYYPDSVKG、またはTISSGGGSTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様において、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、またはLCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様において、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
ある態様では、LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、LCDR2は配列KISNRFSを含み、LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、HCDR1は配列RYTMSを含み、HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む。
特定の態様において、抗体は、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体である。特定の態様において、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体は、以下のアミノ酸配列を有するVL鎖に対して少なくとも80%の同一性（例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、または100%の同一性）であるアミノ酸配列を有するヒト化VL鎖を含む：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK;
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK; または
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK。
ある態様において、VL鎖配列またはVH鎖配列とは異なるアミノ酸残基が、フレームワーク領域に位置する。
特定の態様において、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体は、以下のアミノ酸配列を有するVH鎖に対して少なくとも80%の同一性（例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、または100%の同一性）であるアミノ酸配列を有するヒト化VH鎖を含む：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS;
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS; または
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS。
特定の態様において、抗体は、共通の軽鎖としてVL鎖を含む二重特異性抗体である。
特定の態様において、二重特異性抗体は、MDR-1結合ドメインおよび腫瘍関連抗原 (TAA) 結合ドメインを含み、ここで、MDR-1結合ドメインおよびTAA結合ドメインの各々は、VL鎖のLCDR 1-3を含む。
ある態様において、TAAはCD47であり、TAA結合ドメインは、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDRを含む。
ある態様において、CD47結合ドメインのVH鎖は、配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列GGYRAMDYを含むHCDR3を含む。
特定の態様において、本開示の抗体は、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
（ここでX1はN、QまたはSである）を有するVL鎖の軽鎖CDR (LCDR) を含む可変軽（VL）鎖と、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖の重鎖CDR (HCDR) を含む可変重（VH）鎖とを含む。
ある態様において、VH鎖は配列NYNMHを含むHCDR1と、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2と、配列GGYRAMDYを含むHCDR3とを含む。
特定の態様において、抗体は、CD47に特異的に結合する単特異性二価抗体である。他の態様において、抗体は、CD47およびMRD-1に結合する二重特異性抗体である。
特定の態様において、本明細書中に記載される、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体およびCD47に特異的に結合する単特異性二価抗体は、対象において癌を治療するための方法において使用され得、この方法は、癌を治療するための有効量で該2つの抗体を対象に共投与することを含み得る。特定の態様において、本方法は、化学療法剤を対象に投与することをさらに含み得る。
対象抗体の領域および/または鎖は、1以上のリンカー領域によって連結されていても、連結されていなくてもよい。存在する場合、リンカー領域は、長さが約5アミノ酸から約50アミノ酸までであり得、例えば、約5 aa～約10 aa、約10 aa～約15 aa、約15 aa～約20 aa、約20 aa～約25 aa、約25 aa～約30 aa、約30 aa～約35 aa、約35 aa～約40 aa、約40 aa～約45 aa、または約45 aa～約50 aaの長さであり得る。
対象抗体における使用に適したリンカーは、「フレキシブルリンカー」を含む。存在する場合、リンカー分子は、一般に、連結領域間のある程度の柔軟な運動を可能にするのに十分な長さである。リンカー分子は一般に約6～50原子の長さである。リンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、2～10モノマー単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジ酸（diacids）、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。本開示に照らして、ポリペプチドに結合させることができる他のリンカー分子が使用され得る。
適切なリンカーは容易に選択することができ、種々の長さのうちの適切ないずれのものであってもよく、例えば、1個のアミノ酸（例えばGly）から20個のアミノ酸、2個のアミノ酸から15個のアミノ酸、3個のアミノ酸から12個のアミノ酸、例えば、4個のアミノ酸から10個のアミノ酸、5個のアミノ酸から9個のアミノ酸、6個のアミノ酸から8個のアミノ酸、または7個のアミノ酸から8個のアミノ酸を含み、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のアミノ酸であってもよい。
例示的なフレキシブルリンカーとしては、グリシンポリマー (G)n、グリシン-セリンポリマー（例えば、(GS)n、GSGGSn（配列番号//）およびGGGSn（配列番号//）、ここでnは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および当技術分野で知られる他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン-セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的非構造性であり、したがって成分間のニュートラルな連結（tether）として作用し得るため、関心を引く。グリシンは、アラニンすらよりもさらに著しくphi-psi空間にアクセスし、より長い側鎖をもつ残基よりもはるかに制限が少ないので、グリシンポリマーは特に関心を引く（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)）。例示的なフレキシブルリンカーは、限定されるものではないが、GGSG (SEQ ID NO://)、GGSGG (SEQ ID NO://)、GSGSG (SEQ ID NO: //)、GSGGG (SEQ ID NO: //)、GGGSG (SEQ ID NO: //)、GSSSG (SEQ ID NO: //)等を含む。当業者であれば、上述のいずれかの要素に結合されたペプチドの設計は、すべてまたは部分的にフレキシブルであるリンカーを含み得、したがってリンカーは、フレキシブルリンカーと、より柔軟性の低い構造を付与する1つ以上の部分とを含むことができることを認識するであろう。
ある態様において、対象抗体は、「ヒト化」される。用語「ヒト化抗体」は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリンまたはアクセプター抗体と呼ばれる）に由来する可変領域フレームワーク残基と、実質的に非ヒト抗体（例えばげっ歯類（例えばマウス抗体）、ヒト以外の霊長類など）（ドナー免疫グロブリンまたはドナー抗体と呼ばれる）に由来する少なくとも1つのCDRとを含む少なくとも1つの鎖を含む抗体を指す。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029 10033 (1989)、U.S. Pat. No. 5,530,101、U.S. Pat. No. 5,585,089、U.S. Pat. No. 5,693,761、WO 90/07861、およびU.S. Pat. No. 5,225,539参照。定常領域（複数可）は、存在する場合、実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンに由来するものであり得る。いくつかの実施形態において、対象抗体は、ヒト抗体由来の1以上のMDR1 CDR、および1以上のCD47 CDR、および1以上のFR領域を含む。ヒト化抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第7,256,273号参照。
マウスCDRをヒト可変ドメインフレームワーク中に置き換えることは、それらの正しい空間的配向の保持をもたらし得、そこでは例えば、ヒト可変ドメインフレームワークが、そのCDRが由来するマウス可変ドメインフレームワークと同一または類似のコンフォメーションを採用する。これは、そのCDRが由来するマウス可変フレームワークドメインと高度な配列同一性を示すフレームワーク配列を有するヒト抗体からヒト可変ドメインを得ることによって達成することができる。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)参照。
マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンを同定したら、次のステップは、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために、これらの成分から置換されるべき残基があるか、いずれの残基であるか、を決定することである。一般に、マウス残基の導入はヒトにおいてその抗体がヒト抗マウス抗体 (HAMA) 反応を誘導するリスクを増加させるので、ヒトアミノ酸残基をマウス残基に置換することは最小限にすべきである。免疫応答を測定するための当技術分野で認識されている方法を実施して、特定の患者においてまたは臨床試験の際にHAMA応答をモニターすることができる。ヒト化抗体を投与された患者は、前記治療の開始時および投与期間中に免疫原性評価を受けることができる。HAMA応答は、例えば表面プラズモン共鳴技術 (BIACORE) および/または固相ELISA分析を含む当業者に公知の方法を用いて、患者からの血清試料中のヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態において、対象ヒト化抗体は、ヒト対象においてHAMA応答を実質的に誘導しない。
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、CDRのコンフォメーションおよび/または抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づいて、置換のために選択される。マウスCDR領域とヒト可変フレームワーク領域との不自然な並置は、不自然なコンフォメーション制限をもたらし得、これは、特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り、結合親和性の損失につながる。
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的にはコンピュータモデリングによって決定され得る。免疫グロブリン分子の三次元画像を作成するためのコンピュータハードウェアおよびソフトウェアは当技術分野で公知である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解明された（solved）構造から出発して作成される。モデル化する鎖と、解明済み三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列類似性を比較し、配列類似性が最も大きい鎖またはドメインを分子モデル構築の出発点として選択する。少なくとも50%の配列同一性を共有する鎖またはドメインがモデリングのために選択され、好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%の配列同一性またはそれ以上を共有するものがモデリングのために選択される。解明された出発構造は、モデル化される免疫グロブリン鎖またはドメイン中の実際のアミノ酸と出発構造中のアミノ酸との間の差異を許容するように改変される。改変された構造は複合免疫グロブリンへと組み立てられる。最後に、エネルギー最小化により、および、すべての原子が互いから適切な距離にあることと、結合の長さと角度が化学的に許容される範囲内にあることとを検証することにより、モデルを洗練する。
CDRおよびフレームワーク領域は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)によって定義されるとおりである。代替的な構造的定義がChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); およびJ. Mol. Biol. 186:651 (1989)（あわせて「Chothia」と呼ばれる）によって提案されている。上記Kabatにより規定されるフレームワーク残基が上記Chothiaにより規定される構造ループ残基を構成する場合、マウス抗体中に存在するそのアミノ酸をヒト化抗体への置換のために選択することができる。「CDR領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のCDRの1つ以上に直接隣接する位置、例えば、Kabatによって規定されるCDRまたはChothiaによって規定されるCDR（例えばChothia and Lesk JMB 196:901 (1987) 参照）に直接隣接する位置のアミノ酸残基を含む。これらのアミノ酸は、特にCDR中のアミノ酸と相互作用する可能性が高く、これらがアクセプターから選択された場合には、ドナーCDRを変形させ親和性を低下させる可能性が高い。さらに、隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用し得（Amit et al., Science, 233:747 (1986)）、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体において親和性を提供するすべての抗原接触を維持するために望ましいことがあり得る。
ある態様において、対象抗体は、scFv多量体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、scFv二量体（例えば2つのタンデムscFv（scFv2）を含むもの）、scFv三量体（例えば3つのタンデムscFv（scFv3）を含むもの）、scFv四量体（例えば4つのタンデムscFv（scFv4）を含むもの）、または4より多いscFvの（例えばタンデムでの）多量体である。scFvモノマーは、長さが約2アミノ酸～約10アミノ酸、例えば、長さが2 aa、3 aa、4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、または10 aaのリンカーを介してタンデムに連結され得る。適切なリンカーは、例えば、(Gly)xを含み、ここでxは2～10の整数である。他の適切なリンカーは、上述のものである。いくつかの実施形態において、対象scFV多量体中のscFvモノマーの各々は、上述のようにヒト化される。
ある態様において、対象抗体は、免疫グロブリンの定常領域（例えばFc領域）を含む。Fc領域は、存在する場合、ヒトFc領域であり得る。定常領域が存在する場合、抗体は、軽鎖および重鎖の両方の定常領域を含み得る。適当な重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含む。本明細書に記載される抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む全てのタイプの定常領域、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むあらゆるアイソタイプを有する抗体を含む。適当な重鎖Fc領域の例は、ヒトのアイソタイプIgG1 Fcである。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。対象抗体（例えば、対象ヒト化抗体）は、複数のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。抗体は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含有する四量体として、別個の重鎖として、軽鎖として、Fab、Fab'F(ab')2、およびFvとして、または、重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結されている単鎖抗体として発現され得る。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール (-SH) 基を含み、この遊離チオール基は、抗体を第2のポリペプチド（例えば、本発明の抗体を含む別の抗体）、足場、担体などに結合させるために使用され得る。
対象抗体は、例えばグルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、またはヘテロ二官能性架橋剤を用いて、第2の部分（例えば脂質、対象抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、炭水化物など）に共有結合され得る。グルタルアルデヒドはそのアミノ部分を介してポリペプチドを架橋する。ホモ二官能性架橋剤（例えば、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミジル (NHS) エステル、またはホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤）は、2つ以上の同一の反応性部分を含み、架橋されるポリペプチドの混合物を含有する溶液に架橋剤を添加する一段階反応手順において使用することができる。ホモ二官能性NHSエステルおよびイミドエステルは、アミン含有ポリペプチドを架橋する。弱アルカリ性のpHでは、イミドエステルは第一級アミンとのみ反応してイミドアミドを生成し、架橋されたポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤はビスマレイミドヘキサン (BMH)、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン (DFDNB)、及び1,4-ジ-(3',2'-ピリジルジチオ)プロピノアミドブタン (DPDPB) を含む。
［組成物および製剤］
本開示は、対象抗体を含む組成物を提供する。対象抗体組成物は、対象抗体に加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；緩衝剤、例えばトリス緩衝剤、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)（HEPES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩（MES）、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）等；可溶化剤；洗剤、例えばTween-20等のような非イオン性洗剤；プロテアーゼ阻害剤；グリセロール；などの1つ以上を含むことができる。
本開示の組成物はまた、本明細書に記載の多特異性抗体を含む医薬組成物を含む。一般に、製剤は有効量の対象抗体を含む。「有効量」とは、所望の結果、例えば対象の癌の減少、対象の癌の増殖速度の減少、癌の症状の改善などを生じるのに十分な用量を意味する。一般に、所望の結果は、対照と比較して、少なくとも、癌の症状の減少、癌の増殖の減少、癌の大きさの減少などである。対象抗体は、血液脳関門を回避するような態様で送達され得、または製剤化され得る。いくつかの例では、抗体は、送達エンハンサーを含み得、それはそのようなエンハンサーが血液脳関門の通過、透過性の増加、例えば効率的な経皮送達を可能にすること等を促進し得る場合を含む。有用な送達エンハンサーとしては、限定されるものではないが、例えば、セロポート、レガデノソン、ボルネオール、プエラリン、プロピレングリコール、オレイン酸、アゾン、N-メチルピロリドン、Tween 80、リモネン、脂質ベースのナノ粒子（NP）、リポソーム、ニオソーム、トランスフェソーム、エトソーム、デンドリマー、ミセルNP、高分子ナノ構造、金属ナノ構造、磁気ナノ構造、組換えヒトヒアルロニダーゼなどが挙げられる。
本方法において、本抗体は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便宜的な手段を用いて宿主に投与され得る。したがって、薬剤は、治療的投与のための種々の製剤に組み込まれ得る。より詳細には、対象抗体は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に製剤化することができ、固体、半固体、液体または気体の形態、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルの調製物に製剤化することができる。
薬学的投薬形態において、対象抗体は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に投与され得、または、それらは単独で、または他の薬学的に活性な化合物と適切に関連付けられて、および組み合わせられて、使用され得る。以下の方法および賦形剤は単に例示的なものであり、決して限定的なものではない。
経口製剤については、対象抗体を単独で、または適切な添加剤と組み合わせて使用して、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤と共に；例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤と共に；例えばコーンスターチ、ポテトスターチまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤と共に；例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤と共に；そしてもし望まれれば希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び香味料と共に、錠剤、粉末、顆粒またはカプセルを製造することができる。いくつかの例では、抗体の経口送達は、適切なヒドロゲルと抗体との複合体化を介して増強され得る。
対象抗体は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような水性または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することにより、そしてもし望まれれば可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤を伴わせて、注射用調製物中に製剤化され得る。
対象抗体を含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤および/または張性剤と混合することによって調製される。許容される担体、賦形剤および/または安定化剤は、使用される用量および濃度においてレシピエントに対して毒性がなく、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤；保存剤（例えばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組合せなど）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組合せのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、その他の炭水化物；低分子量 (約10残基未満) ポリペプチド；ゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質；EDTA等のキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、N-メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖；および／またはTween、Brij Pluronic、Triton-X、ポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン性界面活性剤を含む。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、ここで、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌溶液で再構成される。凍結乾燥された組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水 (典型的には、凍結乾燥中に除去された体積に等しい) を加え戻すことである。しかしながら、非経口投与のための医薬組成物の製造のためには抗細菌剤を含む溶液が使用され得る；Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54も参照のこと。
本医薬組成物中の例示的な抗体濃度は、約1 mg/mL～約200 mg/mL、または約50 mg/mL～約200 mg/mL、または約150 mg/mL～約200 mg/mLの範囲であり得る。
抗体の水性製剤は、pH緩衝液中で、例えば、約4.0～約7.0、約5.0～約6.0、あるい約5.5の範囲のpHで調製され得る。この範囲内のpHに適した緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張度に応じて、約1 mM～約100 mM、または約5 mM～約50 mMであり得る。
製剤の張性を調節するために張性剤が抗体製剤に含まれ得る。典型的な張性剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、ならびに、アミノ酸、糖、およびにそれらの組み合わせの群からの任意の成分を含む。いくつかの態様において、水性製剤は等張であるが、高張または低張溶液も適切であり得る。「等張の」という用語は、それが比較される他の溶液（例えば生理的塩溶液または血清）と同じ張性を有する溶液を意味する。張性剤は、約5 mM～約350 mMの量、例えば100 mM～350 nMの量で使用され得る。
製剤化された抗体の凝集を低減し、および/または製剤中の粒子の形成を最小限化し、および/または吸着を低減させるために、界面活性剤も抗体処方に添加され得る。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 、ポリオキシエチレンアルキルエーテル (Brij) 、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル (Triton-X) 、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体（ポロキサマー、プルロニック）、およびドデシル硫酸ナトリウム (SDS) が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート20 (商標Tween 20のもと販売されている) およびポリソルベート80 (商標Tween 80のもとで販売されている) である。適当なポリエチレン-ポリプロピレンコポリマーの例は、Pluronic（登録商標）F68またはPoloxamer 188（商標）という名称で販売されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、商標BrijTMのもとで販売されるものである。界面活性剤の例示的濃度は、約0.001%～約1% w/vの範囲であり得る。
凍結乾燥工程中の不安定化条件から不安定な活性成分（例えばタンパク質）を保護するために、凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）を添加してもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）；ポリオール類（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）；およびアミノ酸（アラニン、グリシン、グルタミン酸を含む）が含まれる。凍結乾燥保護剤は、約10 mM～500 nMの量で含まれ得る。
ある態様において、対象製剤は、対象抗体、および1種以上の上記同定された物質（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、張性剤）を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組み合わせのような1種以上の保存剤を本質的に含まない。他の態様では、保存剤が、例えば、約0.001～約2% (w/v) の範囲の濃度で製剤中に含まれる。
例えば、対象の製剤は、非経口投与に適した液体または凍結乾燥製剤であり得、約1 mg/mL～約200 mg/mLの対象抗体；約0.001%～約1%の少なくとも1つの界面活性剤；約1 mM～約100 mMの緩衝剤；任意で約10 mM～約500 mMの安定化剤；および約5 mM～約305 mMの張性剤を含むことができ、約4.0から約7.0のpHを有する。
別の例として、対象非経口製剤は、約1 mg/mL～約200 mg/mLの対象抗体；0.04% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMスクロースを含む液体または凍結乾燥製剤であり、5.5のpHを有する。
別の例として、対象非経口製剤は、以下のものを含む凍結乾燥製剤を含む：1) 15 mg/mLの対象抗体；0.04% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMスクロース、pHは5.5；または2) 75 mg/mL対象抗体；0.04% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMスクロース、pHは5.5；または3) 対象抗体75 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMスクロース；pHは5.5；または4) 対象抗体75 mg/mL；0.04% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMトレハロース、pHは5.5；または6) 対象抗体75 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMトレハロース、pHは5.5
別の例として、対象非経口製剤は、以下のものを含む液体製剤である：1) 7.5 mg/mLの対象抗体；0.022% Tween 20 w/v；120 mM L-ヒスチジン；および250 125 mMスクロース、pHは5.5；又は2) 対象抗体37.5 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；10 mM L-ヒスチジン；および125 mMスクロース、pHは5.5；又は3) 対象抗体37.5 mg/mL；0.01% Tween 20 w/v；10 mM L-ヒスチジン；および125 mMスクロース、pHは5.5；又は4) 対象抗体37.5 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；10 mM L-ヒスチジン；および125 mMトレハロース、pHは5.5；又は5) 対象抗体37.5 mg/mL；0.01% Tween 20 w/v；10 mM L-ヒスチジン；および125 mMトレハロース、pHは5.5；又は6) 対象抗体5 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMトレハロース、pHは5.5；又は7) 対象抗体75 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMマンニトール、pHは5.5；又は8) 対象抗体75 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM Lヒスチジン；および140 mM塩化ナトリウム、pHは5.5；又は9) 対象抗体150 mg/mL;0.02%トゥイーン20 w/v;20 mM L-ヒスチジン;250 mMトレハロース;pHは5.5で;又は10) 対象抗体150 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および250 mMマンニトール、pHは5.5；又は11) 対象抗体150 mg/mL；0.02% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および140 mM塩化ナトリウム、pHは5.5；又は12) 対象抗体10 mg/mL；0.01% Tween 20 w/v；20 mM L-ヒスチジン；および40 mM塩化ナトリウム、pHは5.5。
本発明の抗体は、吸入により投与されるエアロゾル製剤に利用することができる。対象抗体は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に製剤化することができる。
さらに、本発明の抗体は、乳化基材または水溶性基材のような種々の基材と混合することによって座薬にすることができる。対象抗体は、座薬を介して直腸に投与することができる。坐剤は、ココアバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールのような、体温で融解するが室温では凝固するビヒクルを含み得る。
シロップ、エリキシル、および懸濁液のような経口または直腸投与のための単位投与形態を提供することができ、ここで、各投与単位、例えば、茶さじ1杯、テーブルスプーン1杯、錠剤または坐剤は、1つ以上の阻害剤を含有する組成物の所定量を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与形態は、無菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液としての、組成物中の対象抗体を含み得る。
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単一用量として適した物理的に別個な単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルを伴う、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の所定量の化合物を含む。対象抗体の仕様は、使用される特定の抗体、達成される効果、および宿主における各抗体に関連する薬物動態に依存し得る。
他の投与モードもまた、本発明と共に使用を見出す。例えば、対象抗体は、坐剤に製剤化することができ、場合によっては、エアロゾルおよび鼻腔内組成物に製剤化することができる。坐剤については、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を含む。そのような坐剤は、約0.5%～約10% (w/w) 、例えば約1%～約2%の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
鼻腔内製剤には通常、鼻粘膜への刺激を引き起こすことも毛様体機能を著しく妨害することもないビヒクルが含まれる。水、生理食塩水または他の既知の物質のような希釈剤を本発明と共に用いることができる。鼻用製剤はまた、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有してもよいが、これらに限定されない。界面活性剤は、鼻粘膜による対象タンパク質の吸収を増強するために存在し得る。
対象抗体は、注射製剤として投与することができる。典型的には、注射用組成物は、液体溶液または懸濁液として調製される；注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁することに適した固体形態を調製することもできる。調製物はまた、乳化されてもよく、またはリポソーム担体に抗体を封入しもよい。
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤などの少量の補助物質を含有してもよい。このような投薬形態を調製する実際の方法は、当業者には公知であるか、または明らかであろう。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985を参照されたい。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療される対象において所望の状態を達成するのに十分な量の対象抗体を含有する。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も一般に容易に入手可能である。
いくつかの態様において、対象抗体は、放出制御製剤に製剤化される。徐放性調製物は、当技術分野でよく知られた方法を用いて調製することができる。徐放性調製物の適切な例としては、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが抗体を含有したものが挙げられ、そこではマトリックスが成形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、L－グルタミン酸とL－グルタミン酸エチルとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸－グリコール酸コポリマーおよびポリ-D-(－)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放性調製物に含まれる抗体の生物学的活性の損失の可能性および免疫原性の変化の可能性は、適切な添加剤を使用すること、水分含有量を制御すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって防ぐことができる。
本発明の範囲内の制御放出は、多くの延長放出剤形のいずれかを意味すると解釈することができる。以下の用語は、本発明の目的のために、制御放出と実質的に同等であると考えられ得る：連続放出、制御放出、遅延放出、デポー、徐放、長期放出、プログラム放出、延長放出、比例的放出、遅延性放出、持続性、遅延、遅い放出、間隔を置いた放出、持続された放出、タイムコート、時間放出、遅延作用、延長作用、層化時間作用、長時間作用、延長作用、反復作用、遅い作用、持続された作用、持続作用薬物、および延長性放出。これらの用語の更なる議論はLesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.)に記載されている。
［用法・用量］
適切な投与量は、様々な臨床的因子に基づいて、主治医または他の資格のある医療従事者によって決定され得る。医学分野でよく知られているように、1人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、患者の性別、時間および投与経路、全般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。対象抗体は、1 ng/kg体重から20 mg/kg体重/回、例えば0.1 mg/kg体重から10 mg/kg体重、例えば0.5 mg/kg体重から5 mg/kg体重の間の量で投与され得る；しかし、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量も想定される。レジメンが連続的注入である場合、1μg～10 mg/kg体重/分の範囲であってもよい。
当業者は、用量レベルが、特定の抗体、症状の重篤度、および副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物の好ましい投与量は、様々な手段によって当業者によって容易に決定され得る。
［投与経路］
対象抗体は、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与され、それは例えばin vivoおよびex vivoの方法、ならびに全身経路および局所経路の投与を含む。
従来型の投与経路および薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、鼻、経口、ならびに他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、所望であれば組み合わせてもよく、または抗体および/または所望の効果に応じて調節され得る。対象抗体組成物は、単回投与または複数回投与され得る。ある態様において、対象抗体組成物は経口投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、吸入経路を介して投与される。ある態様において、対象抗体組成物は鼻腔内投与される。ある態様において、対象抗体組成物を局所的に投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、頭蓋内に投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、静脈内投与される。
薬剤は、全身経路または局所経路を含む、従来の薬剤の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を用いて、宿主に投与され得る。一般に、本発明により意図される投与経路は、必ずしも限定されないが、経腸、非経口、または吸入経路を含む。
吸入投与以外の非経口投与経路には、必ずしも限定されるものではないが、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、および静脈内経路、すなわち、消化管を介する以外の任意の投与経路が含まれる。非経口投与は、対象抗体の全身的または局所的送達を行うために行われ得る。全身送達が望まれる場合、投与は、典型的には、侵襲的であるかまたは全身的に吸収される医薬調製物の局所または粘膜投与を含む。
対象抗体はまた、経腸投与によって対象に送達され得る。経腸投与経路には、必ずしも限定されないが、経口および直腸（例えば坐薬を使用をした）送達が含まれる。
治療とは、宿主を苦しめる病理学的状態に関連する症状の少なくとも改善を意味し、ここで改善とは、癌および/または癌の増殖ならびにそれらに伴う痛みなど、治療される病理学的状態に関連するパラメータ（例えば症状）の大きさの少なくとも減少を表すために広義に使用される。このようなものとして、治療は、宿主がもはや病理学的状態または少なくともそれを特徴づける症状を患わないように、その病理学的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制され、例えば起こることが防止され、または停止され、例えば終結される状況を含む。
種々の宿主（ここで、用語「宿主」は、本明細書において用語「対象」、「個体」、および「患者」と交換可能に使用される）が、本発明の方法に従って治療可能である。一般に、そのような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここで、これらの用語は、肉食動物目（例えば犬や猫）、げっ歯目（例えばマウス、モルモット、ラット）、および霊長類（例えばヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳綱に属する生物を記述するために広く使用される。ある態様において、宿主はヒトである。
対象抗体の単位用量 (例えば経口または注射用量) を有するキットが提供される。いくつかの態様において、単位用量を含有する容器に加えて、関心のある病理学的状態を治療することにおける抗体の使用および付随する利点を記載する情報添付文書がある。
［核酸］
本開示は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、意図された標的細胞（例えば、コードされた抗体を合成および/または分泌するように遺伝子組換えされた細胞）において該ヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーなどの1以上の調節エレメントに作動可能に連結され得る。
適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、当技術分野において公知である。細菌細胞における発現のための適切なプロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPおよびtrcが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞における発現のためには、適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、軽鎖および/または重鎖免疫グロブリン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期および後期のSV40プロモーター；レトロウイルスの長い末端反復配列に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン-Iプロモーター；および当技術分野で知られている種々の組織特異的プロモーターが挙げられる。
対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび/またはクローニングベクター中に存在し得る。対象抗体が2つ以上の別個のポリペプチドを含む場合、その2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同一または別個のベクター中にクローニングすることができる。別個のポリペプチドは、様々な戦略を用いて単一の核酸または単一のベクターから発現され得、それらの戦略としては、別個のプロモーター、1つまたは複数の内部リボソーム進入部位 (IRES) 、1つまたは複数の自己切断配列（例えば2A切断配列、例えば、P2A、T2A、E2A、およびF2A）、それらの組合せなどがある。発現ベクターは、選択マーカー、複製起点、およびベクターの複製および/または維持を提供する他の特徴を含むことができる。
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られている；その多くは、対象の組換え構築物を作製するために市販されている。例として以下のベクターを提供する。細菌：pbs、ファージスクリプト、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL (Pharmacia) 。
発現ベクターは、一般に、異種性タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において作用する選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターは、限定されるものではないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えばLi et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 およびWO 95/00655参照）；アデノ随伴ウイルス（例えばAli et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822 3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613 10617参照）；SV40；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えばMiyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999参照）；レトロウイルスベクター（例えばマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、および、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）；などが含まれる。
上述のように、対象核酸は、対象の多特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。対象核酸は、MDR1 CDRおよびCD47 CDRを含め、重鎖および軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、対象核酸は、重鎖および/または軽鎖MDR1 CDRをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、CDRをコードする配列は、FRをコードするヌクレオチド配列を伴って散在している。いくつかの実施形態において、対象核酸は、重鎖および/または軽鎖CD47 CDRをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、CDRをコードする配列は、FRをコードするヌクレオチド配列を伴って散在している。ある態様において、FRをコードするヌクレオチド配列は、ヒトFRをコードするヌクレオチド配列である。
ある態様において、対象核酸は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する。
ある態様において、対象核酸は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する。
ある態様において、対象核酸は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%の配列同一性を有する。
例えば本明細書に記載されるような核酸は、いくつかの例において、例えば細胞をその核酸と接触させることによって、細胞に導入され得る。導入された核酸を有する細胞は、本明細書中では一般に遺伝子組換え細胞と称される。核酸送達の種々の方法を使用することができ、これには、例えば、裸の核酸送達、ウイルス送達、化学的トランスフェクション、遺伝子銃的方法などが含まれるが、これらに限定されない。
［細胞］
本開示は、対象核酸で遺伝子改変された、単離された遺伝子組換え細胞（例えばin vitro細胞、ex vivo細胞、培養細胞など）を提供する。ある態様において、該単離遺伝子組換え細胞は、対象抗体を産生し得る。場合によっては、遺伝子組換え細胞は、例えば、それを必要とする対象に抗体を送達することができる。場合によっては、遺伝子組換え細胞は、多特異性抗体の産生、スクリーニング、および/または発見において使用され得る。遺伝子組換え細胞はまた、いくつかの例において、内因性遺伝子発現が低減（例えば、抑制、ノックダウン等、または消滅、例えば、ノックアウト）された細胞を含み得る。遺伝子組換え細胞はまた、いくつかの例において、遺伝子の発現が増強された細胞、例えば、内因性遺伝子の発現または異種遺伝子の発現が増加された細胞を含み得る。
適切な細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核細胞、および細菌細胞のような原核細胞も含まれる。宿主細胞への対象核酸の導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の公知の方法によって行うことができる。
適切な哺乳動物細胞には、一次細胞および不死化細胞株が含まれる。適切な哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えばマウス、ラット）細胞株などが含まれる。適切な哺乳動物細胞株としては、HeLa細胞（例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2）、CHO細胞（例えばATCC No. CRL 9618、CCL 61、CRL 9096）、293細胞（例えばATCC No. CRL-1573）、Vero細胞、NIH 3T3細胞（例えばATCC No. CRL-1658）、Huh-7細胞、BHK細胞（例えばATCC No. CCL10）、PC12細胞（ATCC No. CRL 1721）、COS細胞、COS-7細胞（ATCC No. CRL 1651）、RAT1細胞、マウスL細胞（ATCC No. CCLI.3）、ヒト胚腎臓 (HEK) 細胞（ATCC No. CRL 1573）、HLHepG2細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例において、有用な哺乳動物細胞は、哺乳動物の組織または器官に由来する細胞を含み得る。いくつかの例において、使用される細胞は、例えば、HEK 293T細胞のような確立された腎臓細胞株の腎臓細胞を含む、腎臓細胞である。
適切な酵母細胞または真菌または藻類細胞としては、Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtiiなどが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な原核細胞は、限定されるものではないが、Escherichia coli、Lactobacillus sp.、Salmonella sp.、Shigella sp.等の実験室株のいずれかを含むがこれらに限定されない。例えばCarrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; U.S. Patent No. 6,447,784; およびSizemore et al. (1995) Science 270:299-302参照。本発明で用いることができるSalmonella株の例としては、Salmonella typhiおよびS. typhimuriumが挙げられるが、これらに限定されない。適切なShigella株としては、Shigella flexneri、Shigella sonneiおよびShigella disenteriaeが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、実験室株は非病原性株である。他の適切な細菌の非限定的な例としては、Bacillus subtilis、Pseudomonas pudita、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas mevalonii、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter capsulatus、Rhodospirillum rubrum、Rhodococcus sp.などが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、宿主細胞はEscherichia coliである。
いくつかの例では、本開示の細胞は免疫細胞であり得る。本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、一般的に、骨髄で産生される造血幹細胞 (HSC) に由来する白血球細胞（leukocytes）を含む。「免疫細胞」には、例えば、リンパ球（T細胞、B細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「T細胞」は、ヘルパーT細胞 (CD4+細胞) 、細胞傷害性T細胞 (CD8+細胞) 、制御性T細胞 (Treg) およびガンマ-デルタT細胞を含む、CD3を発現する全てのタイプの免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害性応答を媒介することができるCD8+T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球を含む。
いくつかの例において、本開示の多特異性抗体を発現する有用な細胞は、産生（producer）T細胞を含み得る。産生T細胞の非限定的な例としては、Tsai & Davila Oncoimmunology. (2016) 5(5): e1122158に記載されたものが挙げられ、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の多特異性抗体をコードする核酸配列を含むように操作された産生T細胞は、いくつかの例において、それを必要とする対象に抗体を送達するために使用され得る。
本開示の細胞はまた、細胞におけるMDR1およびCD47のうちの1つ以上の発現を変化および/または修正するように遺伝子改変された細胞を含む。そのような改変された細胞は、本明細書中に提供される記載および方法に従って産生されるものを含むがこれらに限定されない多特異性抗体の結合をアッセイすることを含む、様々な目的に有用である。場合によっては、対象細胞株においてMDR1がノックアウトまたはノックダウンされ得る。場合によっては、対象細胞株においてCD47がノックアウトまたはノックダウンされ得る。いくつかの例において、対象細胞株においてMDR1が構成的にまたは誘導的に過剰発現され得る。いくつかの例において、対象細胞株においてCD47が構成的にまたは誘導的に過剰発現され得る。いくつかの例において、対象細胞株においてMDR1およびCD47の両方がノックダウン、ノックアウト、または構成的もしくは誘導的に過剰発現され得る。ノックダウン、ノックアウトおよび/または過剰発現のための任意の便利で適切な方法を使用することができる。導入された核酸は、安定的に組み入れられるか、または一時的に存在し得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、CD47を発現しMDR1の過剰発現のためのMDR1をコードする配列を含む外因性核酸を含む、遺伝子組み換えヒト細胞株を含む。このような細胞では、CD47発現は、内因性であるかまたは外因由来であり（すなわち、導入され）、MDR1発現は、安定であっても一過性であってもよい。いくつかの例では、CD47を発現する本開示の細胞株は、CD47を発現しMDR1を安定的に過剰発現する遺伝子組み換えヒト細胞を産生するように構成され得る。
本開示の細胞および細胞株は、例えば、本明細書に記載の培養方法の使用を介して、培養され得る。場合によっては、核酸を導入して遺伝的に改変された細胞を培養して、細胞株を作製することができる。有用な細胞株としては、限定されるものではないが、例えば、CD47を発現しMDR1を安定的に過剰発現するヒト細胞株を含む、遺伝子組換え細胞株が挙げられ得る。
本開示の細胞およびその細胞株は、本開示の種々の方法において、例えば試験試料、対照等として利用され得る。例えば、いくつかの例では、MDR1および/またはCD47がノックアウトおよび/またはノックダウンされた細胞が参照細胞として使用され得、例えばそれに対して、本開示の多特異性抗体の結合が比較され得る。他の有用な参照細胞としては、例えば、非癌性細胞、ならびに正常細胞および様々なタンパク質の正常なレベル（MDR1および/またはCD47の正常なレベルを含む）を発現する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
［方法］
上記で要約されたように、本開示の方法は、本開示の抗体に細胞を接触させる方法、本開示の抗体を対象に投与することを含む方法に従って対象を治療する方法、本出願に記載の要素（例えば多特異性抗体、組成物および製剤、核酸、発現ベクター、細胞などを含む）を作製する方法を含む。
上記で要約されたように、本開示の方法は、例えば癌細胞の殺傷を促進および/または増強するために、本開示の多特異性抗体に癌細胞を接触させることを含む。いくつかの例では、癌細胞の殺傷は、当該2つの標的が癌細胞上で共発現される場合の二重特異的標的化による癌細胞のオプソニン化の結果として癌細胞に作用する免疫応答または免疫細胞によって媒介される。いくつかの例では、癌細胞の殺傷は、例えば多特異性抗体によって癌細胞の表面上に存在するCD47エピトープをマスキングまたはアンタゴナイズする結果として起こる、癌細胞に作用する免疫応答または免疫細胞によって媒介される。いくつかの例において、癌細胞の殺傷は、例えば多特異性抗体による癌細胞上のMDR1アンタゴナイズ作用の結果として起こる、癌細胞の細胞排出の阻害によって媒介される。場合によっては、多特異性抗体と接触される細胞は、多剤耐性癌細胞であり得る。癌細胞を本開示の多特異性抗体と接触させることを含む方法は、例えば、化学療法、免疫療法、放射線療法などを含む追加の療法または活性剤と癌細胞とを接触させることを含んでもよいし含まなくてもよい。
癌細胞を本開示の多特異性抗体と接触させることは、一般に、癌細胞の殺傷を増強する（例えば、多特異性抗体の非存在下での癌細胞の殺傷レベルと比較して）。いくつかの例では、追加の活性剤が使用される場合において、その追加の活性剤単独を使用して観察される殺傷のレベルと比較して、癌細胞の殺傷の増強が見られ得る。多特異性抗体に起因する癌細胞殺傷の増強の量は様々であり、癌細胞殺傷における少なくとも5%の増加から少なくとも90%以上の増加までの範囲であり得、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%等を含むがこれらに限定されない。このような増加は、1つ以上の追加の活性剤との単独接触と比較したものであり得る。
癌細胞の増強された殺傷は、例えば、観察研究、インビトロ細胞に基づく細胞毒性アッセイ、フローサイトメトリー、細胞生存性標識（例えば、1つ以上の細胞生存性染色を用いるもの）などを含むがこれらに限定されない種々の手段によって評価され得る。
［治療方法］
本開示は、癌を治療する方法を提供し、その方法は一般的に、それを必要とする個体（例えば、癌を有する個人）に、対象多特異性抗体の有効量を、単独で（例えば単剤療法で）、または1つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与することを含む。本開示の多特異性抗体の投与は、任意の簡便かつ適切な送達経路によって行うことができる。
本開示の態様は、対象における癌を治療する方法において使用するための、本明細書の先行セクションに従った二重特異性抗体分子を含み、その方法は、該抗体を対象に投与することを含む。この方法は、該抗体を少なくとも1つの追加の活性剤と組み合わせて投与することを含み、ここで、少なくとも1つの追加の活性剤は、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、少なくとも1つの追加の活性剤は、化学療法剤であり、任意で化学療法剤は、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである。MDR1ポンプの基質であるいくつかの化学療法剤には、パクリタキセル、コルヒチン、ベラパミル、ビンブラスチン、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびニロチニブが含まれる。
同じく本明細書に開示されているのは、対象において癌を治療する方法において使用するための化学療法剤であり、該方法は、本明細書に記載されている抗体と組み合わせて該対象に該化学療法剤を投与することを含み、場合により、該化学療法剤は、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである。
したがって、投与することは、例えば、注射による抗体の送達、注入による抗体の送達、多特異性抗体をコードする核酸または発現ベクターの送達、多特異性抗体を発現し分泌する細胞を対象に投与することによる抗体の送達などを含むが、これらに限定されない。薬剤、薬剤をコードする核酸、薬剤を発現する細胞などの投与は、薬剤と接触させること、核酸と接触させること、細胞と接触させることなどを含み得る。
いくつかの実施形態において、対象多特異性抗体の有効量は、1つまたは複数の用量で単独で（例えば単剤療法で）または1つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与された場合に、該抗体による治療の非存在下での有害症状の重症度と比較して、癌の有害症状を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上減少させるのに有効な量である。
ある態様において、対象多特異性抗体の有効量は、1つまたは複数の用量で単独で（例えば単剤療法で）または1以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与された場合に、治療される個体において癌を改善すること（例えば癌の成長を遅らせること、癌の成長を止めること、癌の成長を逆転させること、癌細胞（腫瘍細胞等を含む）を殺すこと）のために有効な量である。例えば、対象抗体の有効量は、多特異性抗体による治療の非存在下と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、またはそれ以上、個体における癌増殖速度を低下させるか、または癌の大きさを減少させることができる。
いくつかの例において、対象は、1つ以上の追加の試薬を伴って、または伴わずに、対象多特異性抗体を用いることを含めて全身的に処置され得る。本明細書で使用される「全身的処置」とは、特定の腫瘍（例えば、原発腫瘍または規定された二次腫瘍など）または特定の癌含有組織（例えば、肝臓がんの場合は肝臓、血液がんの場合は血液、等）のみを標的とするものではない処置を意味する。全身的処置は、一般に、対象の身体全体に向けられ、例えば、全身放射線療法、全身化学療法、全身免疫療法、これらの組み合わせなどを含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの例において、対象は、1つ以上のさらなる試薬を伴って、または伴わずに、対象多特異性抗体を用いることを含めて局所的に処置され得る。本明細書で使用される「局所的処置」とは、腫瘍（例えば、原発腫瘍または規定された二次腫瘍など）の位置に特異的に向けられた処置、または癌含有組織（例えば、肝臓がんの場合は肝臓、血液がんの場合は血液、等）に特異的に向けられた処置を意味する。いくつかの例では、局所的処置はまた、腫瘍を取り囲む環境（例えば腫瘍を取り囲む組織、例えば腫瘍にすぐ隣接する組織）に影響を及ぼすような態様で投与され得る。局所的処置は、一般に、腫瘍（例えば原発腫瘍）の部位を含む癌の部位から離れた組織には影響を及ぼさないか、またはそこには標的化されない。対象多特異性抗体に加えて、またはそれと組み合わせて投与され得る有用な局所的処置としては、例えば、手術、局所放射線療法、局所凍結療法、局所レーザー療法、局所外用療法、それらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、対象治療方法は、対象多特異性抗体および1つ以上のさらなる治療剤を投与することを含む。適切な追加の治療剤としては、化学療法剤、放射線療法試薬、免疫療法試薬、他の抗体または多特異性抗体剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の多特異性抗体を投与する前、あいだ、または後に対象に投与され得るさらなる処置は、例えば、癌のタイプ、対象の病歴、全般的な健康状態および/または共存症などを含む多数の因子に応じて変化する。有用な癌治療には、例えば、放射線療法、化学療法、免疫療法などが含まれるが、これらに限定されない。
放射線療法は、限定されるものではないが、ビームのような外部から適用される線源から、または小さな放射性線源の移植によって送達されるX線またはガンマ線を含む。
癌治療に使用するのに適した抗体としては、裸の抗体、例えば、トラスツズマブ (ハーセプチン) 、ベバシズマブ(Avastin（商標）) 、セツキシマブ (Erbitux（商標）) 、パニツムマブ (Vectibix（商標）) 、イピリムマブ (Yervoy（商標）) 、リツキシマブ (Rituxan) 、アレムツズマブ(Lemtrada（商標）) 、オファツムマブ (Arzerra（商標）) 、オレゴボマブ (OvaRex（商標）) 、ランブロリズマブ (MK-3475) 、ペルツズマブ(Perjeta（商標）) 、ラニビズマブ (Lucentis（商標）) およびコンジュゲート化抗体、例えばゲムツズマブオゾガマイシン（Mylortarg（商標））、ブレンツキシマブベドチン（Adcetris（商標））、90Y-標識イブリツモマブチウキセタン（(Zevalin（商標））、131I-標識トシツモマ（Bexxar（商標））等が含まれるが、これらに限定されない。癌治療に使用するのに適した抗体には、腫瘍関連抗原に対して産生された抗体も含まれるが、これらに限定されない。そのような抗原としては、CD20、CD30、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えばGD2、GD3、GM2など）、Le y、VEGF、VEGFR、インテグリンアルファ-V-ベータ-3、インテグリンアルファ-5-ベータ-1、EGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、テネイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
従来型の癌療法には、癌についての標的化療法も含まれ、それには例えば以下のものが含まれるがこれらに限定されない：HER 2 (ERBB2/neu) を標的とするAdo-トラスツズマブエムタンシン (カドサイラ) (乳癌への使用が認可されている) ；EGFR (HER1/ERBB1) 、HER 2 (ERBB 2/neu)を標的とするアファチニブ(Gilotrif) (非小細胞肺癌への使用が認可されている)；標的化するアルデスロイキン（Proleukin）（腎細胞がん、メラノーマへの使用が認可されている)；ALKを標的とするアレクチニブ (アレセンサ) (非小細胞肺癌への使用が認可されている)；CD52を標的とするアレムツズマブ (キャンパス) (B細胞慢性リンパ性白血病への使用が認可されている)；PD-L1を標的とするアテゾリズマブ（テセントリク）(尿路上皮がん、非小細胞肺がんへの使用が認可されている)；PD-L1を標的とするアベルマブ (バベンシオ) (メルケル細胞癌への使用について認可されている)；KIT、PDGFRβ、VEGFR1/2/3を標的とするアキシチニブ (インライタ) (腎細胞癌への使用が認可されている)；BAFFを標的とするベリムマブ（ベンリスタ）（紅斑性狼瘡における使用が認可されている）；HDACを標的とするベリノスタット（Beleodaq）（末梢性T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；VEGFリガンドを標的とするベバシズマブ（アバスチン）（子宮頸癌、結腸直腸癌、卵管癌、神経膠芽腫、非小細胞肺癌；卵巣癌、腹膜癌、腎細胞癌における使用が認可されている）；CD19/CD3を標的とするブリナツモマブ（ビーリンサイト）（急性リンパ芽球性白血病（前駆B細胞）における使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするボルテゾミブ（ベルケイド）（多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫における使用が認可されている）；ABLを標的とするボスチニブ（ボシュリフ）（慢性骨髄性白血病における使用が認可されている）；CD30を標的とするブレンツキシマブベドチン（アドセトリス）（ホジキンリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫における使用が認可されている）；ALKを標的とするブリグチニブ（アルンブリグ）（非小細胞肺癌(ALK+)における使用が認可されている）；FLT3、KIT、MET、RET、VEGFR2を標的とするカボザンチニブ（カボメティクス、Cometriq）（甲状腺髄様癌、腎細胞癌における使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするカルフィルゾミブ（カイプロリス）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；ALKを標的とするセリチニブ（ジカディア）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするセツキシマブ（アービタックス）（結腸直腸癌、頭および首の扁平上皮癌における使用が認可されている）；MEKを標的とするコビメチニブ（Cotellic）（メラノーマにおける使用が認可されている）；ALK、MET、ROS1を標的とするクリゾチニブ（ザーコリ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；BRAFを標的とするダブラフェニブ（タフィンラー）（メラノーマ、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CD38を標的とするダラツムマブ（ダラザレックス）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；ABLを標的とするダサチニブ（スプリセル）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病における使用が認可されている）；RANKLを標的とするデノスマブ（Xgeva）（骨の巨細胞腫瘍における使用が認可されている）；B4GALNT1 (GD2) を標的とするジヌツキシマブ（Unituxin）（小児神経芽細胞腫における使用が認可されている）；PD-L1を標的とするデュルバルマブ（イミフィンジ）（尿路上皮癌における使用が認可されている）；SLAMF7 (CS1/CD319/CRACC) を標的とするエロツズマブ（エムプリシティ）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；IDH2を標的とするエナシデニブ（Idhifa）（急性骨髄性白血病における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするエルロチニブ（タルセバ）（非小細胞肺癌、膵臓癌における使用が認可されている）；mTORを標的とするエベロリムス（アフィニトール）（膵臓、胃腸管または肺起源の神経内分泌腫瘍、腎細胞癌、切除不能上衣下巨細胞性星状細胞腫、乳癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするゲフィチニブ（イレッサ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするイブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン）（非ホジキンリンパ腫における使用が認可されている）；BTKを標的とするイブルチニブ（イムブルビカ）（マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症における使用が認可されている）；PI3Kδを標的とするイデラリシブ（Zydelig）（慢性リンパ性白血病、濾胞B細胞非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫における使用が認可されている）；KIT、PDGFR、ABLを標的とするイマチニブ（グリベック（GI間質性腫瘍(KIT+)、隆起性皮膚線維肉腫、多発性血液系腫瘍における使用が認可されている）；CTLA-4を標的とするイピリムマブ（ヤーボイ）（メラノーマにおける使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするイキサゾミブ（ニンラーロ）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）； HER2 (ERBB2/neu)、EGFR (HER1/ERBB1)を標的とするラパチニブ（タイケルブ）（乳癌(HER2+)における使用が認可されている）；VEGFR2を標的とするレンバチニブ（レンビマ）（腎細胞癌、甲状腺癌における使用が認可されている）；FLT3を標的とするミドスタウリン（Rydapt）（急性骨髄性白血病(FLT3+)における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするネシツムマブ（ポートラーザ）（扁平上皮非小細胞肺癌における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするネラチニブ（Nerlynx）（乳癌における使用が認可されている）；ABLを標的とするニロチニブ（タシグナ）（慢性骨髄性白血病における使用が認可されている）；PARPを標的とするニラパリブ（ゼジューラ）（卵巣癌、卵管癌、腹膜癌における使用が認可されている）；PD-1を標的とするニボルマブ（オプジーボ）（結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌、尿路上皮癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするオビヌツズマブ（ガザイバ）（慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫における使用が認可されている）；CD20を標的とするオファツムマブ（アーゼラ、HuMax-CD20）（慢性リンパ性白血病における使用が認可されている）；PARPを標的とするオラパリブ（リムパーザ）（卵巣癌における使用が認可されている）；PDGFRαを標的とするオララツマブ（Lartruvo）（軟部組織肉腫における使用が認可されている）；EGFRを標的とするオシメルチニブ（タグリッソ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CDK4、CDK6を標的とするパルボシクリブ（イブランス）（乳癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするパニツムマブ（ベクティビックス）（結腸直腸癌における使用が認可されている）；HDACを標的とするパノビノスタット（ファリーダック）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；VEGFR、PDGFR、KITを標的とするパゾパニブ（ヴォトリエント）（腎細胞癌における使用が認可されている）；PD-1を標的とするペムブロリズマブ（キイトルーダ）（古典的ホジキンリンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌(PD-L1+)、頭頸部扁平上皮癌、充実性腫瘍(MSI-H) における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするペルツズマブ（パージェタ）（乳癌(HER2+)における使用が認可されている）；ABL、FGFR1-3、FLT3、VEGFR2を標的とするポナチニブ（アイクルシグ）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病における使用が認可されている）；VEGFR2を標的とするラムシルマブ（サイラムザ）（結腸直腸癌、胃癌または食道胃接合部(GEJ) 腺癌、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；KIT、PDGFRβ、RAF、RET、VEGFR1/2/3を標的とするレゴラフェニブ（スチバーガ）（結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、肝細胞癌における使用が認可されている）；CDK4、CDK6を標的とするリボシクリブ（Kisqali）（乳癌(HR+, HER2-)における使用が認可されている）；CD20を標的とするリツキシマブ（リツキサン、マブセラ）（非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、多発血管炎性肉芽腫症における使用が認可されている）；CD20を標的とするリツキシマブ／ヒアルロニダーゼ、ヒト（リツキサンHycela）（慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫における使用が認可されている）；HDACを標的とするロミデプシン（イストダックス）（皮膚T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；PARPを標的とするルカパリブ（Rubraca）（卵巣癌における使用が認可されている）；JAK1/2を標的とするルキソリチニブ（Jakafi）（骨髄線維症における使用が認可されている）；IL-6を標的とするシルツキシマブ（Sylvant）（多中心性キャッスルマン病における使用が認可されている）；標的化シプロイセルT（プロベンジ）（前立腺癌における使用が認可されている）；スムーズンドを標的とするソニデギブ（Odomzo）（基底細胞癌における使用が認可されている）；VEGFR、PDGFR、KIT、RAFを標的とするソラフェニブ（ネクサバール）（肝細胞癌、腎細胞癌、甲状腺癌における使用が認可されている）；mTORを標的とするテムシロリムス（トーリセル）（腎細胞癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするトシツモマブ（ベキサール）（非ホジキンリンパ腫における使用が認可されている）；MEKを標的とするトラメチニブ（メキニスト）（メラノーマ、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするトラスツズマブ（ハーセプチン）（乳癌(HER2+)、胃癌(HER2+)における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1)、RET、VEGFR2を標的とするバンデタニブ（カプレルサ）（甲状腺髄様癌における使用が認可されている）；BRAFを標的とするベムラフェニブ（ゼルボラフ）（メラノーマにおける使用が認可されている）；BCL2を標的とするベネトクラクス（ベネクレクスタ）（慢性リンパ性白血病における使用が認可されている）；PTCH、スムーズンドを標的とするビスモデギブ（エリベッジ）（基底細胞癌における使用が認可されている）；HDACを標的とするボリノスタット（ゾリンザ）（皮膚T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；PIGF、VEGFA/Bを標的とするZiv-アフリベルセプト（ザルトラップ）（結腸直腸癌における使用が認可されている）；等。
本開示の方法に関連して使用するのに適した生物学的応答調節剤は、限定されるものではないが、 (1) チロシンキナーゼ (RTK) 活性の阻害剤；(2) セリン/トレオニンキナーゼ活性阻害剤；(3) 腫瘍抗原に特異的に結合する抗体などの、腫瘍関連抗原アンタゴニスト；(4) アポトーシス受容体アゴニスト；(5) インターロイキン-2；(6) インターフェロン-α；(7) インターフェロン-γ；(8) コロニー刺激因子；(9) 血管新生阻害剤；および (10) 腫瘍壊死因子のアンタゴニストを含む。
化学療法剤は、癌細胞の増殖を低減させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であり、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソ尿素、抗代謝薬、抗腫瘍抗生物質、植物 (ビンカ) アルカロイド、およびステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を減少させるように作用する薬剤は当技術分野で公知であり、広く使用されている。そのような薬剤としては、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、およびトリアゼンなどのアルキル化剤が挙げられ、これらに限定されるものではないが、メクロレタミン、シクロホスファミド (シトキサン (商標) ) 、メルファラン (L-サルコリシン) 、カルムスチン (BCNU) 、ロムスチン (CCNU) 、セムスチン (メチル-CCNU) 、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドが挙げられる。
抗代謝薬には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、これらに限定されるわけではないが、シタラビン(CYTOSAR-U) 、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル (5-FU) 、フロクスウリジン (FudR) 、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン (6-MP) 、ペントスタチン、5-フルオロウラシル (5-FU) 、メトトレキサート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザホレート（PDDF、CB3717）、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸 (DDATHF) 、ロイコボリン、フルダラビンリン酸、ペントスタチン、およびゲムシタビンが挙げられる。
適切な天然産物およびその誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、エピポドフィロトキシン）としては、Ara-C、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなどのアルカロイド；ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシドなど；抗生物質、例えばアントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビシクロペプチド、例えばダクチノマイシン；ブレオマイシンなどの塩基性糖ペプチド；アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン（ミスラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；マイトマイシンなどのアジリノピロロインドールジオン；シクロスポリン、FK-506 (タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシン等の大環状免疫抑制剤；等が挙げられるがこれらに限定されない。。
他の抗増殖性の細胞毒性剤は、ナベルベン、CPT-11、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する微小管作用剤も使用に適しており、これらに限定されるものではないが、アロコルヒチン (NSC 406042) 、ハリコンドリンB (NSC 609395) 、コルヒチン (NSC 757) 、コルヒチン誘導体（例えばNSC 33410）、ドルスタチン10 (NSC 376128) 、メイタンシン (NSC 153858) 、リゾキシン (NSC 332598) 、パクリタキセル (タキソール（登録商標）) 、タキソール（登録商標）誘導体、ドセタキセル (タキソテール（登録商標）) 、チオコルヒチン (NSC 361792) 、トリチルシステリン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、例えばエオプチロンA、エポチロンB、ジスコデルモリドを含むがこれらに限定されない、天然および合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾール等を含む。
使用に適したホルモン調節剤およびステロイド (合成アナログを含む) としては、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン；エストロゲンおよびプレゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェンなど；および副腎皮質抑制薬、例えばアミノグルテチミド；17α-エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド (ドロゲニル) 、トレミフェン (ファレストン) 、およびゾラデックスなどが挙げられるが、これらに限定されない。エストロゲンは増殖と分化を刺激するため、エストロゲン受容体に結合する化合物がこの活性を遮断するために用いられる。コルチコステロイドはT細胞の増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤には、金属錯体、例えばシスプラチン (シス-DDP) 、カルボプラチンなど；尿素、例えばヒドロキシ尿素；およびN-メチルヒドラジンなどのヒドラジン；エピドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害薬；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフール等が含まれる。その他の増殖抑制剤には、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デオキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン (SKF 105685) 等；イレッサ（登録商標）（ZD 1839, 4-(3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(3-(4-モルホリニル)プロポキシ)キナゾリン)；等が含まれる。
「タキサン」には、パクリタキセルのほか、活性なタキサンの誘導体またはプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（例えば、ドセタキセル、タキソール (商標)、タキソテール (商標)（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの10-デスアセチル類似体およびパクリタキセルの3'N-デスベンゾイル-3'N-t-ブトキシカルボニル類似体などの類似体、製剤および誘導体を含むと本明細書では理解されるべきである）は、当業者に知られた技術を使用して容易に調製することができ（WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；米国特許第5,294,637号；5,283,253号；5,279,949号；5,274,137号；5,202,448号；5,200,534号；5,229,529号；およびEP 590,267も参照）、または、例えば、ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical社のような様々な販売会社から入手することができる（Taxus brevifolia由来のT7402；またはTaxus yannanensis由来のT-1912）。
パクリタキセルとは、パクリタキセルの一般的な化学的に利用可能な形態だけでなく、類似体および誘導体（例えば上記のタキソテール(商標)ドセタキセル）およびパクリタキセルコンジュゲート（例えばパクリタキセル-PEG、パクリタキセル-デキストラン、パクリタキセル-キシロース、またはパクリタキセル-アルブミン）も指すものと理解されるべきである。
また、用語「タキサン」には、親水性誘導体および疎水性誘導体の両方を含む種々の公知の誘導体が含まれる。タキサン誘導体としては、国際特許出願WO 99/18113に記載されているガラクトースおよびマンノース誘導体；WO 99/14209に記載されているピペラジノおよび他の誘導体；WO 99/09021、WO 98/22451および米国特許第5,869,680号に記載されているタキサン誘導体；WO 98/28288に記載されている6-チオ誘導体；米国特許第5,821,263号に記載のスルフェンアミド誘導体；および米国特許第5,415,869号に記載されたタキソール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、WO 98/58927；WO 98/13059；および米国特許第5,824,701号に記載されているものを含むパクリタキセルのプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。
有用な免疫療法としては、以下のものが挙げられる：抗PD-1/PD-L1免疫療法、および/または治療方法において標的化され得る他の免疫療法標的、例えば、CTLA-4、LAG-3およびTIM-3などの免疫チェックポイントマーカーなど。抗PD-1/PD-L1免疫療法には、例えば、限定されるものではないが、有効量の1つ以上の抗PD-1/PD-L1治療アンタゴニストを被験者に投与することを含む療法が含まれ、そのようなアンタゴニストには例えばオプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、キイトルーダ（登録商標） (ペムブロリズマブ) 、テセントリック（商標） (アテゾリズマブ) 、デュルバルマブ (MEDI4736) 、アベルマブ (MSB0010718 C) 、BMS-936559 (MDX-1105) 、CA-170、BMS-202、BMS-8、BMS-37、BMS-242などが含まれるが、これらに限定されない、。
CTLA-4はCD152としても知られており、CD80とCD86に結合する。CTLA-4に対する抗体は、一部の種類のがんに対する治療薬として承認されている。CTLA-4と他の免疫療法との共阻害効果により、CTLA-4は、特定の癌を治療するために他の免疫療法と組み合わせて使用するための良好な候補となる。TIM-3もまた、いくつかの癌タイプに対する免疫療法のために標的化され得る。
LAG-3は癌治療について臨床治験中である。抗LAG-3免疫療法には、（LAG-3を下方調節して、事前活性化されたLAG-3+細胞にするシグナルを阻害することによって）Tエフェクター細胞を活性化すると同時に、誘導された（すなわち抗原特異的な）Treg抑制性活性を阻害し得る、アンタゴニストLAG-3抗体を用いるものが含まれる。有用なLAG-3アンタゴニスト抗体としては、relatlimab（BMS-986016；Bristol-Myers Squibbによって開発された）、IMP701（Immutepによって開発された）、TSR-033（抗LAG-3 mAb；TESARO, Inc.によって開発された）などが挙げられる。
免疫療法には、例えば養子細胞療法 (ACT) やキメラ抗原受容体 (CAR) T細胞療法などのT細胞ベースの免疫療法も含まれる。例えば、対象には、その対象の癌によって発現される抗原を標的とするように操作されたCAR T細胞の集団が投与され得る。T細胞ベースの療法は、いくつかの例では、血液試料または腫瘍生検などの細胞試料を対象から得て、その試料からの免疫細胞をex vivoで培養すること（培養免疫細胞の遺伝子改変を伴うまたは伴わない）を含むことができる。一例として、免疫細胞は、対象から得られ、ex vivoで培養され、癌によって発現される抗原に特異的なCARを用いて改変されて、CAR T細胞集団を産生し得る。次に、CAR T細胞を対象に再導入して、癌を標的とすることができる。T細胞に基づく免疫療法は、治療される特定の癌に応じて、種々の方法、例えば、種々の抗原を標的とすること、種々の細胞型を収集/培養することなどによって構成され得る。さらに、T細胞に基づく免疫療法は、全身的に（例えば静脈内注射によって）、または局所的に（例えば注入（例えば、腹腔内注入、胸腔カテーテル注入など）、直接注射など）に投与され得る。
いくつかの例では、本明細書に記載される治療方法は、多剤耐性トランスポーターの1つ以上の阻害剤を対象に投与することを含み得、それは、限定されるものではないが、例えば、MDR1以外の多剤耐性トランスポーターを含む。多剤耐性トランスポーターの有用な阻害剤としては、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、天然産物、マイクロRNA、および低分子阻害剤が含まれる。多剤耐性トランスポーターの阻害剤には、ABCトランスポーター阻害剤が含まれる。このようなMDR調節剤または逆転化剤の要約は、Choi (2005), Cancer Cell Int, 5:30に提供されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の方法を用いた治療に適した個体には、癌を有する個体；癌と診断された個体；化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等による癌治療を受けている個体；癌治療（例えば化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等のうちの1つ以上によるもの）を受けてきたが治療に応答しなかった個体；癌治療（例えば化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等のうちの1つ以上によるもの）を受け、最初は治療に応答したが、その後再発した、すなわち癌が再発した個体が含まれる。
本開示の方法は、例えば、原発癌、二次癌、再増殖癌、再発癌、難治性癌などを含む種々の癌を標的化し、治療するために使用され得る。例えば、いくつかの例において、本開示の方法は、対象において同定された原発癌の初期治療として使用され得る。いくつかの例において、本開示の方法は、非一次（例えば二次またはそれ以降の）治療として、例えば、前の治療に応答しない癌を有する対象において、前の治療後に再増殖している癌を有する対象において、前の治療に対する混合反応（例えば、対象における少なくとも1つの腫瘍に対するポジティブな反応および対象における少なくとも1つの第2の腫瘍に対するネガティブまたはニュートラルな反応）を有する対象において、使用され得る。
いくつかの例において、本開示の方法は、多剤耐性癌などの薬剤耐性癌を有する対象を治療するために使用され得る。多剤耐性 (MDR) は、多くの癌が化学療法薬に対する耐性を発生させる機序であり、細胞死を最小限に抑え、薬剤耐性腫瘍を拡大させる。MDR癌には、限定されるものではないが、例えば、排出ポンプの発現の増加、薬物の吸収の減少、細胞死またはアポトーシスの阻害、薬物代謝の調節などを含む、1つ以上の耐性機序が関わり得る。いくつかの例では、本開示の方法は、MDRを防止し、逆転させ、または回避することができる。
いくつかの例では、本開示の方法は、第1の薬剤に耐性である癌を有する対象を、有効量の本明細書に記載の多特異性抗体で、第1の薬剤とは異なる第2の薬剤と組み合わせて治療することを含み得る。例えば、いくつかの例では、対象の癌は、第1の化学療法に抵抗性であり得、対象は、本明細書に記載される有効量の多特異性抗体を、第1のものとは異なる第2の化学療法剤と併用して投与することによって治療され得る。例えば、治療される癌のタイプ、抵抗性を発生する可能性の高さ等に応じて、様々な第1および第2の化学療法剤の組合せが使用され得る。
多数の癌が、薬剤耐性を発生させることが知られている。このことおよび他の理由のために、本開示の方法は、以下のものを含むがこれらに限定されない様々な癌を治療することに用途を見出し得る：例えば、
急性リンパ性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、副腎皮質細胞腫、AIDS関連癌 (例えばカポジ肉腫、リンパ腫等)、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、基底細胞腫、胆管癌 (肝外)、膀胱癌、骨癌 (例えばEwing肉腫、骨肉腫および悪性線維性組織球腫等)、脳幹神経膠腫、脳腫瘍 (例えば星状細胞腫、中枢神経系胚性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、等)、乳癌 (例えば女性乳癌、男性乳癌、小児乳癌、等)、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍 (例えば小児期、胃腸管系、等)、原発不明細胞腫、心（心臓）腫瘍、中枢神経系 (例えば非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、胚性腫瘍、生殖細胞腫瘍、リンパ腫、等)、頸部癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性骨髄性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚性T細胞リンパ腫、管 (例えば胆管、肝外、等)、非浸潤性乳管癌 (DCIS)、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、Ewing肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌 (例えば眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、等)、骨の線維性組織球腫(例えば悪性、骨肉腫、等)、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍 (GIST)、生殖細胞腫瘍 (例えば頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣、等)、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞性 (肝臓) 癌、組織球症 (例えばランゲルハンス細胞、等)、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内メラノーマ、島細胞腫瘍 (例えば膵神経内分泌腫瘍、等)、カポジ肉腫、腎臓癌 (例えば腎細胞、Wilms腫瘍、小児期腎腫瘍、等)、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病 (例えば急性リンパ性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、有毛細胞、等)、口唇・口腔癌、肝臓癌 (原発)、非浸潤性小葉癌 (LCIS)、肺癌 (例えば非小細胞、小細胞、等)、リンパ腫 (例えば AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系 (CNS)、等)、マクログロブリン血症 (例えばワルデンストレーム、等)、男性乳癌、悪性の骨線維性組織球腫および骨肉腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頸部癌、NUT遺伝子が関わる正中線癌、口癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病 (例えば慢性 (CML)、等)、骨髄球性白血病 (例えば急性 (AML)、等)、骨髄増殖性腫瘍 (例えば慢性、等)、鼻腔および副鼻洞癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口部癌、口腔癌 (例えば唇部等)、口咽頭癌、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌 (例えば上皮性、生殖細胞腫瘍、低悪性度腫瘍、等)、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍 (島細胞腫瘍)、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻洞および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系(CNS) リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞 (腎臓) 癌、腎盂・尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫 (例えばEwing、Kaposi、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮、等)、セザリー症候群、皮膚癌 (例えば小児期、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、非メラノーマ、等)、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織、扁平上皮細胞癌腫、扁平上皮頸部癌 (例えば原発不明性、転移性、等)、胃癌、T-細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺細胞腫、甲状腺癌、腎盂・尿管の移行細胞癌、尿管・腎盂癌、尿道癌、子宮癌 (例えば子宮内膜、等)、子宮肉腫、腟癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクロマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、等。
本明細書に記載される治療方法は、いくつかの例において、1つ以上の従来型治療を以前に受けた対象において実施され得る。例えば、腫瘍科の場合、ここに記載される方法は、いくつかの例において、従来型の癌治療（例えば、限定されるものではないが、従来型の化学療法、従来型の放射線療法、従来型の免疫療法、手術等を含む）の後に実施され得る。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、対象が従来型の治療に応答しなかったか、または難治性である場合に使用され得る。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、対象が従来型の治療に応答した場合に使用され得る。
いくつかの例では、本開示の方法は、先行する癌治療後に残存する微小残存病変 (MRD) について対象を標的化し、治療し、または一掃するために使用され得る。MRDの標的化、治療および/またはクリアランスは、MRDが前治療に対して不応性であるかまたは不応性と判定されたか否かにかかわらず、本方法を用いて追求することができる。いくつかの例では、本開示の方法は、先行治療、または本明細書に記載の多特異性抗体を使用するもの以外の1つ以上の利用可能な治療選択肢に対してMRDが難治性であるという決定の後、MRDについて対象を標的化し、治療し、および/または一掃するために使用され得る。
いくつかの例において、本発明の方法は、監視のために予防的に使用することができる。例えば、それを必要とする対象は、検出可能な疾患を有していないが再発癌（例えば薬剤耐性癌を含む）を発症するリスクがある場合に、本明細書に記載の多特異性抗体の1つ以上を含む治療の投与を受け得る。いくつかの例では、対象が、薬剤耐性であると予測されるかまたは薬剤耐性になると予測される原発癌を発症する特に高いリスクを有する場合に、予防的アプローチが使用され得る。場合によっては、対象が以前に癌の治療を受けており、再発または薬剤耐性の発現のリスクがある場合に、予防的アプローチが採用され得る。
いくつかの例では、本開示の方法は、1以上のマーカーまたは治療標的の発現について癌を分析することを含み得る。例えば、いくつかの例において、方法は、対象からの癌の試料を分析して、癌が所定の閾値を超えるMDR1、所定の閾値を超えるTAA（例えばCD47、PD-L1、またはEGFR）、またはその両方を発現するか否かを決定することを含み得る。
いくつかの例において、対象が本開示の多特異性抗体で治療されるかどうかは、TAAおよび/またはMDR1試験の結果に依存し得る。例えば、いくつかの例では、癌が所定の閾値以上でTAAを発現する場合には対象が本開示の多特異性抗体で処置され、癌が所定の閾値未満でTAAを発現する場合には、対象は該多特異性抗体で処理されないようにしてもよく、例えばその対象は、該多特異性抗体を伴わずに、関連する癌についての従来型の治療で処置され得る。場合によっては、癌が所定の閾値以上でMDR1を発現する場合に対象は本開示の多特異性抗体で処置され、癌が所定の閾値未満でMDR1を発現する場合には、対象は該多特異性抗体で処置されないようにしてもよく、例えば、その対象は、該多特異性抗体を伴わずに、関連する癌についての従来型の治療で処置され得る。場合によっては、癌が所定の閾値以上でTAAおよびMDR1の両方を発現する場合に、対象は本開示の多特異性抗体で処置され、癌が所定の閾値未満でTAAおよびMDR1を発現する場合には、対象は該多特異性抗体で処置されないようにしてもよく、例えば、その対象は、該多特異性抗体を伴わずに、関連する癌についての従来型の治療で処置され得る。
MDR1および/またはTAAのレベルを分析するために、任意の簡便なアッセイを使用することができ、これには、例えば、フローサイトメトリー、核酸に基づくアッセイ（例えば増幅、配列決定等）、細胞サイトメトリー、免疫組織化学などが含まれるが、これらに限定されない。任意の簡便な生物学的試料を使用することができ、これには、例えば、癌生検試料が含まれるが、これに限定されない。1つ以上のマーカーおよび/または標的の発現を評価するための有用な所定の閾値は、測定された発現レベルと対応する対照との比較を含め、任意の簡便かつ適切な方法によって決定することができる。例えば、いくつかの例において、試料においてアッセイされるMDR1および/またはTAAのレベルについての有用な所定の閾値は、健常/正常細胞などの参照細胞において測定されるMDR1および/またはTAAのレベルに対応し得る。TAAは、CD47、PD-L1、またはEGFRであり得る。
［製造の方法］
上記に要約されたように、本開示の方法は、本明細書に記載された多特異性抗体を作製および/または同定するための方法も含む。対象抗体は、公知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法；組換えDNA法；等によって作製され得る。
対象抗体が単鎖ポリペプチドである場合、それは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は液相または固相を介して進行し得る。固相ポリペプチド合成 (SPPS) は、対象抗体の化学合成のための適切な方法の一例であり、そこでは配列のC末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列中の残りのアミノ酸が連続的に付加される。FmocおよびBocなどの様々な形態のSPPSが、対象抗体を合成するために利用可能である。固相合成のための技術は、Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); および Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 およびCamarero JA et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8によって記載されている。簡単に述べれば、小さな不溶性の多孔質ビーズが、ペプチド鎖が構築されるところの機能単位で処理される。カップリング/脱保護の繰り返しサイクル後、固相に結合した遊離N末端アミンを単一のN保護アミノ酸ユニットにカップリングする。次いで、このユニットを脱保護し、さらなるアミノ酸が結合し得る新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドは固相に固定化されたままであり、濾過プロセスを受けた後に切断される。
対象抗体の産生には、標準的な組換え方法を用いることができる。例えば、（場合により定常領域に連結された）軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。軽鎖および重鎖は、同一または異なる発現ベクター中にクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）中の制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、限定されるものではないが、プロモーター（例えば、自然界で付随するプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転写終結配列を含む。発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、COSまたはCHO細胞）を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系であり得る。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、そのヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。
コードの縮重のために、種々の核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は、デノボの固相DNA合成によって、または所望のポリヌクレオチドの以前に調製されたバリアントのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 突然変異誘発によって生成され得る。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、標的ポリペプチドDNAの置換、欠失および挿入バリアントを調製するための適切な方法の一例である。Adelman et al., DNA 2:183 (1983) を参照されたい。簡単に説明すると、標的ポリペプチドDNAは、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖DNA鋳型にハイブリダイズさせることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み標的ポリペプチドDNAにおいて選択された改変をコードする、鋳型の第2の相補鎖全体を合成する。
適切な発現ベクターは、典型的には、宿主生物においてエピソームとして、または宿主染色体DNAの一体化部分として複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含む。
Escherichia coliは、対象抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使用することができる原核生物宿主細胞の例である。使用に適した他の微生物宿主には、Bacillus subtilisのような桿菌、およびSalmonella、Serratia、および様々なPseudomonas種のような他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主において、発現ベクターを作製することもでき、これは典型的には、宿主細胞と適合する発現制御配列を含む（例えば複製起点）。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン (trp) プロモーター系、ベータ-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系など、任意の数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意でオペレーター配列を伴って発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためにリボソーム結合部位配列等を有する。
酵母のような他の微生物も発現に有用である。Saccharomyces（例えばS. cerevisiae）およびPichiaは、適切な酵母宿主細胞の例であり、適切なベクターは、発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列などを必要に応じて有する。典型的なプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導可能な酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムC、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、in vitro細胞培養で増殖させた哺乳動物細胞）を用いて本発明のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）を発現および生産することもできる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987) 参照。適切な哺乳動物宿主細胞としては、CHO細胞株、種々のCos細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞株、および癌化B細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)）、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。適切な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)参照。
（化学的にまたは組み換え技術によって）一旦合成されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または対象抗体の他の形態（例えばscFv等）は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 精製、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的にはScopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)参照）。対象抗体は、実質的に純粋であり得、例えば、少なくとも約80%～85%純粋、少なくとも約85%～90%純粋、少なくとも約90%～95%純粋、もしくは98%～99%、またはそれ以上純粋であり得、例えば、細胞残渣、対象抗体以外の巨大分子などの混入物を含まない。
いくつかの態様において、本開示の多特異性抗体を作製する方法は、候補抗体の作製および活性についてのスクリーニングを含み得る。このような方法は、一連の工程の使用を通じて、MDR1およびCD47の両方を発現する細胞に特異的に結合する多特異性抗体を生成し得る。このような方法の工程は、多特異性抗体、あるいはそれぞれがMDR1結合ドメインとCD47結合ドメインとを含むかまたは含むと予想される複数の抗体を産生すること；MDR1およびCD47を発現する第1の試験細胞を上記多特異性抗体あるいは複数の抗体と接触させること；MDR1またはCD47のいずれかを発現する第2の細胞を上記多特異性抗体あるいは複数の抗体と接触させること；第1の細胞への上記多特異性抗体あるいは複数の抗体の結合を、第2の細胞への多特異性抗体の結合と比較して、結合特異性比を決定すること；そしてその比が所定の閾値を超える場合に、上記多特異性抗体あるいは複数の抗体のうちの1つまたは複数を、MDR1およびCD47の両方を発現する細胞に対して特異的であるとして同定することを含む。比較結合のためのそのような閾値が使用される場合において、閾値は変動し得、1.5:1以上の範囲であり得、例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、50:1、100:1等を含むが、これらに限定されない。
このような方法では、例えば本明細書に記載された細胞を含むがこれに限定されない種々の細胞を使用することができる。いくつかの例では、MDR1のみを発現する細胞およびCD47のみを発現する細胞の両方に対して抗体の結合が実施され得る。例えば、いくつかの例では、この方法は、上述した工程に関連して、第2の細胞がMDR1を発現するがCD47を発現しない場合において、さらに、CD47を発現するがMDR1を発現しない第3の細胞に多特異性抗体を接触させることを含む。
いくつかの例では、そのような方法は、例えば、対照細胞、対照試薬等を含むがこれらに限定されない、1つ以上の対照を使用し得る。有用な対照細胞としては、1つ以上の関連遺伝子またはタンパク質の発現が既知であるか、またはその発現欠如が既知であるものが挙げられる。有用な対照試薬は、限定されるものではないが、例えば、既知の標的に対する単一特異性抗体などの対照抗体を含み得る。例えば、いくつかの例では、本開示のそのような方法は、第1の細胞、第2の細胞、および/または第3の細胞を、単一特異性抗MDR1抗体および単一特異性抗CD47抗体から選択される対照抗体と接触させることをさらに含み得る。使用される特定の方法に応じて、必要に応じて、種々の他の又は追加の対照が使用され得る。
［キット］
本開示の態様は、キットも含む。キットは、例えば、本明細書に記載の多特異性抗体、試薬、組成物、製剤、細胞、核酸、発現ベクター等の任意の組み合わせを含み得る。対象キットは、当該多特異性抗体、それをコードする核酸、または当該多特異的核酸を含む細胞のうちの1つ以上を含むことができる。キットは、例えば、治療キット（例えば、キットが多特異性抗体および例えば化学療法剤等の1つ以上のさらなる活性剤を含み得る場合）、抗体を産生するためのキット、抗体をスクリーニングするためのキット等を含む、様々な目的のために構成され得る。
キットのオプション的構成要素は様々であり、例えば以下のものを含むことができる：緩衝液；プロテアーゼ阻害剤；等。例えば、対象キットが対象核酸を含む場合、その核酸は制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位等を有していてもよい。キットの種々の構成要素は、別々の容器に存在していてもよいし、あるいは特定の適合する構成要素は、所望により、単一の容器中に予め組み合わされていてもよい。
上記の構成要素に加えて、本キットは、本方法を実施するためにキットの構成要素を使用することについての指示書を含むことができる。対象方法を実施するための指示書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。そのようなものとして、指示書は、パッケージインサートとして、キットまたはその構成要素の容器のラベルにおいて（すなわち、包装又は小分け包装に付随して）存在してもよい。他の実施形態では、指示書は、適切なコンピュータ読み取り可能記憶媒体、例えばコンパクトディスク読み取り専用メモリ(CD-ROM) 、デジタル多用途ディスク (DVD) 、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔ソースから指示書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、指示書を見ることおよび/またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書の場合と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基材上に記録される。
［本開示の非限定的な態様の例］
上述した本主題の態様 (実施形態を含む) は、単独で、または1つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益となり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかなように、個々に番号付けされた態様の各々は、先行または後続の個々に番号付けされた態様のいずれかと一緒に使用または組み合わせられ得る。これは、複数の態様のそのようなすべての組合せについてのサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組合せに限定されない。本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
１． 多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子であって、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、
ここで、前記VL鎖は、それぞれMDR1のための抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖は、MDR1のための抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記TAAのための抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記VL鎖の1つと対になった際に前記TAAに結合し、
前記二重特異性抗体は、MDR1と前記TAAの両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/または前記TAAを発現する非癌細胞には低減された結合を示す、
二重特異性抗体分子。
２． 前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号１）
を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含み、ここでX1はN、QまたはSである、態様１に記載の二重特異性抗体分子。
３． 前記2つのVL鎖が、以下の配列：
(i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号2）；
(ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK（配列番号3）；または
(iii)
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK（配列番号4）
を有するVL鎖のLCDR 1～3を含む、態様２に記載の二重特異性抗体分子。
４． (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGX1TYLE（配列番号5）を含み；
(ii) LCDR2は配列KISNRFS（配列番号6）を含み；
(iii) LCDR 3は配列FQASHFPRT（配列番号7）を含み、
ここでX1はN、QまたはSである、
態様２または３に記載の二重特異性抗体分子であって、
５． 前記2つのVL鎖がヒト化されている、態様１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
６． 前記2つのVL鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、態様２～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (配列番号8)；
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (配列番号3)；または
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (配列番号4)。
７． 前記2つのVL鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一である配列を含む、態様６に記載の二重特異性抗体分子：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (配列番号8)。
８． 第1のVH鎖の前記抗原結合部位が、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号9)
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3 (HCDR 1～3) を含み、ここでX2はN、QまたはSである、態様１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
９． 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
(i) EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号10)、または
(ii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)、または
(iii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
１０． (i) HCDR1は配列RYTMS (配列番号13)を含み；
(ii) HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKG (配列番号14)を含み；
(iii) HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含み；
ここでX2はN、QまたはSである、態様８または９に記載の二重特異性抗体分子。
１１． 前記第1および/または第2のVH鎖がヒト化されている、態様１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
１２． 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、態様８～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号16)；
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)；または
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
１３． (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含みか、または
(ii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLE (配列番号27) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(iii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKG (配列番号31) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(iv) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(v) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKG (配列番号31) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(vi) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLE (配列番号27) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(vii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(viii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
(ix) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含む、
態様２～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
１４． 前記第2のVH鎖が、前記TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、前記軽鎖の1つと対になったときの前記二重特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性が、前記VH鎖が由来する前記単一特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性よりも少なくとも2倍低い、態様１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
１５． 前記TAAがCD47である、態様１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
１６． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様15に記載の二重特異性抗体分子。
１７． 前記第2のVH鎖が、配列NYNMH (配列番号18)を含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKD (配列番号19)を含むHCDR2、および配列GGYRAMDY (配列番号20)を含むHCDR3を含む、態様１５または１６に記載の二重特異性抗体分子。
１８． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様１５または１６に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)、
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号21)、
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号22)、または
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号)。
１９． 前記TAAがPD-L1である、態様１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
２０． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様19に記載の二重特異性抗体分子。
２１． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列DSWIH（配列番号33）を含むHCDR1と、配列WISPYGGSTYYADSVKG（配列番号34）を含むHCDR2と、配列RHWPGGFDY（配列番号35）を含むHCDR3とを含む、態様１９または２０に記載の二重特異性抗体分子。
２２． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様１９～２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)。
２３． 前記TAAがEGFRである、態様１～１４のいずれか一項記載の二重特異性抗体分子。
２４． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様２３に記載の二重特異性抗体分子。
２５． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、態様２３または２４に記載の二重特異性抗体分子。
２６． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様２４または２５に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)。
２７． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様２３に記載の二重特異性抗体分子。
２８． 前記第2のVH鎖が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、態様２６または２７に記載の二重特異性抗体分子。
２９． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様２６～２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)。
３０． 前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む、態様1に記載の二重特異性抗体分子。
３１． (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44)を含み；
(ii) LCDR2は配列KISRLEA (配列番号45)を含み；
(iii) LCDR3は配列FQGSHFPRT (配列番号46)を含む、
態様３０に記載の二重特異性抗体分子。
３２． 前記VL鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様３０または３１に記載の二重特異性抗体分子：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)。
３３． 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含む、態様３０～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
３４． (i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
(ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
(iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む、
態様33に記載の二重特異性抗体分子。
３５． 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、態様３０～３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA。
３６． 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号9)
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含み、ここでX2はN、Q、またはSである、態様３０～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
３７． (i) HCDR1は配列RYTMS (配列番号13)を含み；
(ii) HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKG (配列番号14)を含み；
(iii) HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含み；
ここでX2はN、Q、またはSである、態様36に記載の二重特異性抗体分子。
３８． 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、態様３６または３７に記載の二重特異性抗体分子：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号16)；
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)；または
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
３９． 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含む、態様１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
４０． (i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
(ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
(iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む；
態様39に記載の二重特異性抗体分子。
４１． 前記第1のVH鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、態様３９または４０に記載の二重特異性抗体分子：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA。
４２． 前記第2のVH鎖が、前記TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、前記軽鎖の1つと対になった場合の前記二重特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性が、前記VH鎖が由来する前記単一特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性よりも少なくとも2倍低い、態様３０～４１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
４３． 前記TAAがCD47である、態様３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
４４． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様４３に記載の二重特異性抗体分子。
４５． 前記第2のVH鎖が、配列NYNMH (配列番号18)を含むHCDR1と、配列TIYPGNDDTSYNQKFKD (配列番号19)を含むHCDR2と、配列GGYRAMDY (配列番号20)を含むHCDR3とを含む、態様４４に記載の二重特異性抗体分子。
４６． 前記第2のVH鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様４４または４５に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)、
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号21)、
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号22)、または
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号23)。
４７． 前記TAAがPD-L1である、態様３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
４８． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様４７に記載の二重特異性抗体分子。
４９． 前記第2のVH鎖が、配列DSWIH (配列番号33)を含むHCDR1と、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34)を含むHCDR2と、配列RHWPGGFDY (配列番号35)を含むHCDR3とを含む、態様４７または４８に記載の二重特異性抗体分子。
５０． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様４８または４９に記載の二重特異性抗体分子：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)。
５１． 前記TAAがEGFRである、態様３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
５２． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様５１に記載の二重特異性抗体分子。
５３． 前記第2のVH鎖が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、態様52に記載の二重特異性抗体分子。
５４． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様５２または５３に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)。
５５． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様５１に記載の二重特異性抗体分子。
５６． 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、態様５２に記載の二重特異性抗体分子。
５７． 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、態様５２または５３に記載の二重特異性抗体分子：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)。
５８． 前記抗体が、MDR1またはTAAのいずれかを発現する細胞と比較して、MDR1およびTAAの両方を発現する細胞に対して2倍超の親和性を有する、態様１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
５９． 前記抗体が、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させることができ、ここで、前記抗体と共投与された場合の前記化学療法剤の半値最大阻害濃度（IC50）は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (配列番号24)
を有するVH鎖と；
以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有するVL鎖と
を含む抗MDR1抗体15D3と共投与された場合の前記化学療法剤のIC50より少なくとも2倍低い、態様１～５８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
６０． 前記癌細胞がNALM6 ADR細胞であり、任意で、前記化学療法剤がパクリタキセル、コルヒチン、ベラパミル、ビンブラスチン、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドまたはニロチニブを含む、態様59に記載の二重特異性抗体分子。
６１． 前記抗体が、MDR1を発現する細胞に結合した場合に、MDR1による排出を阻害する、態様１～６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
６２． 前記抗体が、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (配列番号24)
を有するVH鎖と；
以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有するVL鎖と
を含む抗MDR1抗体15D3よりも少なくとも2倍低い親和性でMDR1に結合する、態様１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
６３． 前記抗体が、1つ以上のFcγ受容体への抗体の結合を低減または消失させるように改変されたFcドメインを含む、態様１～６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
６４． 対象における癌を治療する方法における使用するための、態様１～６３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子であって、前記方法は前記抗体を前記対象に投与することを含む、二重特異性抗体分子。
６５． 前記方法が、前記抗体を少なくとも一つのさらなる活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも一つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、態様６４に記載の二重特異性抗体分子。
６６． 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様６５に記載の二重特異性抗体分子。
６７． 対象において癌を治療する方法で使用するための化学療法剤であって、前記方法は、態様１～６３のいずれか一項に記載の抗体と組み合わせて前記化学療法剤を対象に投与することを含み、任意で、前記化学療法剤はタキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、化学療法剤。
６８． 治療される対象が、前記化学療法剤に対して耐性であると決定された癌を有する対象である、態様６７に記載の使用のための二重特異性抗体分子。
６９． 癌について対象を治療する方法であって、態様１～６３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
７０． 前記方法が、前記二重特異性抗体分子を、少なくとも一つのさらなる活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも一つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、態様６９に記載の方法。
７１． 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様７０に記載の方法。
７２． 治療される対象が、前記化学療法剤による治療に対して抵抗性であると決定された癌を有する対象であり、任意で、前記化学療法剤は、パクリタキセル、コルヒチン、ベラパミル、ビンブラスチン、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドまたはニロチニブを含む、態様７１に記載の方法。
７３． 以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
を有するVL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含み、ここでX1はN、QまたはSである、可変軽（VL）鎖と、
以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含み、ここでX2はN、QまたはSである、可変重（VH）鎖と
を含むか、または、
以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有するVL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と、
以下の配列：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
を含む、
抗体。
７４． 前記VL鎖は、以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
前記VH鎖は、以下の配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDR 1～3を含むか、または、
前記VL鎖は、以下の配列：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
前記VH鎖は、以下の配列：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDR 1～3を含むか、または、
前記VL鎖は、以下の配列：
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
前記VH鎖は、以下の配列：
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
を有するVH鎖のLCDR 1～3を含む、
態様７３に記載の抗体。
７５． 前記LCDR1は、配列RSSQSIVHSTGNTYLE、RSSQSIVHSTGQTYLE、またはRSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
前記LCDR2は配列KISNRFSを含み、
前記LCDR3は配列FQASHFPRTを含む、
態様７４に記載の抗体。
７６． (i) 前記HCDR1は配列RYTMSを含み；
(ii) 前記HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKGを含み；
(iii) 前記HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含み;
ここでX2はN、QまたはSである、
態様７５に記載の抗体。
７７． (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(ii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(iii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(iv) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(v) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(vi) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(vii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(viii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
(ix) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
LCDR2は配列KISNRFSを含み、
LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
HCDR1は配列RYTMSを含み、
HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む、
態様７４または７５に記載の抗体。
７８． 前記抗体のVL鎖は、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
前記抗体のVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
態様７３～７７のいずれか一項に記載の抗体。
７９． 前記抗体が、以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と；
以下の配列：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
を含む、態様７３に記載の抗体。
８０． (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44) を含み；
(ii) LCDR2は配列KISRLEA (配列番号45) を含み；
(iii) LCDR3は配列FQGSHFPRT (配列番号46) を含み；
(i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
(ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
(iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む、
態様７９に記載の抗体。
８１． 前記抗体のVL鎖が、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)；
前記抗体のVH鎖が、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む：
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA；
態様７９または８０に記載の抗体。
８２． 前記抗体は、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体である、態様７３～８１のいずれか一項に記載の抗体。
８３． 前記抗体は、共通の軽鎖として前記VL鎖を含む二重特異性抗体である、態様７３～８１のいずれか一項に記載の抗体。
８４． 前記二重特異性抗体が、MDR-1結合ドメインおよび腫瘍関連抗原（TAA）結合ドメインを含み、ここで、MDR-1結合ドメインおよびTAA結合ドメインのそれぞれが、前記VL鎖のLCDR 1～3を含む、態様８３に記載の抗体。
８５． 前記TAAがCD47であり、前記TAA結合ドメインが、以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様８４に記載の抗体。
８６． 前記CD47結合ドメインのVH鎖が、配列NYNMHを含むHCDR1と、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2と、配列GGYRAMDYを含むHCDR3とを含む、態様８５に記載の抗体。
８７． 前記TAAがPD-L1であり、PD-L1結合ドメインが、以下の配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様８４に記載の抗体。
８８． 前記PD-L1結合ドメインのVH鎖が、配列DSWIH (配列番号33)を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34)を含むHCDR2、および配列RHWPGGFDY (配列番号35)を含むHCDR3を含む、態様８７に記載の抗体。
８９． 前記TAAがEGFRであり、EGFR結合ドメインが、以下の配列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
を有するVH鎖のHCDRを含む、態様８４に記載の抗体。
９０． 前記EGFR結合ドメインのVH鎖が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、態様８９に記載の抗体。
９１．
前記TAAがEGFRであり、EGFR結合ドメインが、以下の配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
を有するVH鎖のHCDRを含む、態様８４に記載の抗体。
９２． 前記EGFR結合ドメインのVH鎖が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、態様９１に記載の抗体。
９３．
以下の配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
を有し、ここでX1はN、QまたはSであるか、または以下の配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
を有する、VL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と；
以下の配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS；または
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)；または
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)；または
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
を含む、抗体。
９４． 前記VL鎖が、 (i) 配列RSSQSIVHSTGX1TYLE (配列番号5)を含むLCDR1と；(ii) 配列KISNRFS (配列番号6)を含むLCDR2と；(iii) 配列FQASHFPRT (配列番号7)を含むLCDR3とを含み、ここでX1はN、QまたはSであり、
前記VH鎖が、
(i) 配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列GGYRAMDYを含むHCDR3；または
(ii) 配列DSWIH (配列番号33) を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34) を含むHCDR2、および配列RHWPGGFDY (配列番号35) を含むHCDR3；または
(iii) 配列SGDYYWS (配列番号37) を含むHCDR1、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2、および配列VSIFGVGTFDY (配列番号39) を含むHCDR3；または
(iv) 配列NYGVH (配列番号41) を含むHCDR1、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42) を含むHCDR2、および配列ALTYYDYEFAY (配列番号43) を含むHCDR3
を含む、態様９３に記載の抗体。
９５． 前記VL鎖が、(i)配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44)を含むLCDR1と；(ii)配列KISRLEA (配列番号45) を含むLCDR2と；(iii)配列FQGSHFPRT (配列番号46) を含むLCDR3とを含み；
前記VH鎖が、
配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列 GGYRAMDYを含むHCDR3；または
配列DSWIH (配列番号33) を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34) を含むHCDR2、および配列RHWPGGFDY (配列番号35) を含むHCDR3；または
配列SGDYYWS (配列番号37) を含むHCDR1、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38) を含むHCDR2、および配列VSIFGVGTFDY (配列番号39) を含むHCDR3；または
配列 NYGVH (配列番号41) を含むHCDR1、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42) を含むHCDR2、および配列 ALTYYDYEFAY (配列番号43) を含むHCDR3
を含む、態様９３に記載の抗体。
９６． 前記抗体が二重特異性抗体である、態様９３～９５のいずれか一項記載の抗体。
９７． 前記抗体が、ヒト化抗体、またはヒトFcドメインを含むキメラ抗体である、態様１～９６のいずれか一項に記載の抗体。
９８． 免疫グロブリンG1（IgG1）Fcドメインを含む、態様９７に記載の抗体。
９９． 第1のVH鎖が第1のFcドメインに融合され、第2のVH鎖が第2のFcドメインに融合されている、態様１～９８のいずれか一項に記載の抗体。
１００． 前記Fcドメインが、前記第1および第2のVH鎖を含むヘテロ二量体を優先的に形成する改変CH3ドメインを含む、態様９９に記載の抗体。
１０１． 前記第1および第2のFcドメインが、ヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fcドメインである、態様１００に記載の抗体。
１０２． 態様１～１０１のいずれか一項に記載の抗体と、
薬学的に許容される賦形剤と
を含む、医薬組成物。
１０３． 少なくとも一つのさらなる活性剤をさらに含む、態様１０２に記載の医薬組成物。
１０４． 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、態様１０３に記載の医薬組成物。
１０５． 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様１０４に記載の医薬組成物。
１０６． 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、態様１０３～１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１０７． 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が免疫療法剤を含む、態様１０３に記載の医薬組成物。
１０８． 前記態様のいずれかに記載の抗体をコードする1つまたは複数の配列を含む、1つまたは複数の核酸。
１０９． 前記1つまたは複数の配列がプロモーターに動作可能に連結されている、態様１０８に記載の一以上の核酸。
１１０． 態様１０８または１０９に記載の1つまたは複数の核酸を含む、1つまたは複数の組換え発現ベクター。
１１１． 態様１１０に記載の1つまたは複数の組換え発現ベクターで遺伝子組換えされた、哺乳動物細胞。
１１２． 前記細胞が免疫細胞である、態様１１１に記載の細胞。
１１３． 態様１～６３および７３～１０１のいずれかに記載の抗体またはそれをコードする核酸と、
少なくとも1つのさらなる活性剤と
を含むキット。
１１４． 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、態様１１３に記載のキット。
１１５． 癌細胞を殺傷する方法であって、態様１～６３および７３～１０１のいずれか一項に記載の抗体に癌細胞を接触させることを含む、方法。
１１６． 少なくとも1つのさらなる活性剤を投与することを含む、態様１１５に記載の方法。
１１７． 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、態様１１６に記載の方法。
１１８． 前記方法が、前記少なくとも1つのさらなる活性剤単独と接触させることと比較して、前記癌細胞の殺傷を少なくとも5%増加させる、態様１１６または１１７に記載の方法。
１１９． 前記癌細胞が薬剤耐性癌細胞である、態様１１５～１１８のいずれか一項に記載の方法。
１２０． 癌について対象を治療する方法であって、前記方法は、態様１～６３および７３～１０１のいずれか一項に記載の抗体または態様１０２～１０７のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
１２１． 前記対象が、前記癌について以前に治療されている対象である、態様１２０に記載の方法。
１２２． 前記癌が薬物耐性または多剤耐性である、態様１２０または１２１に記載の方法。
１２３． 前記癌が化学療法剤に対して耐性である、態様１２２に記載の方法。
１２４． 前記癌が免疫療法剤に対して耐性である、態様１２２に記載の方法。
１２５． 前記癌が多剤耐性トランスポーターの阻害剤に対して耐性である、態様１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
１２６． 少なくとも1つのさらなる活性剤を前記対象に投与することをさらに含む、態様１２０～１２５のいずれか一項に記載の方法。
１２７． 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、態様１２６に記載の方法。
１２８． 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様１２７に記載の方法。
１２９． 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、態様１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３０． 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が免疫療法剤を含む、態様１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３１． 前記方法が、前記少なくとも1つのさらなる活性剤単独での処置と比較して、前記少なくとも1つのさらなる活性剤の有効性を増加させる、態様１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３２． 前記増加した有効性が、癌細胞殺傷における少なくとも5%の増加を含む、態様１３１に記載の方法。
１３３． 前記癌が、所定の閾値を超えるMDR1、所定の閾値を超える腫瘍関連抗原 (TAA) 、またはその両方を発現するか否かを決定するために、前記癌の試料を分析することをさらに含み、ここで、任意で前記TAAはCD47を含む、態様１２０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
１３４． 前記所定の閾値は、参照細胞によって発現されるMDR1および/またはTAAのレベルに対応する、態様１３３に記載の方法。
１３５． 前記参照細胞においてMDR1および/またはTAAはノックアウトまたはノックダウンされている、態様１３４に記載の方法。
１３６． 前記参照細胞が非癌性細胞である、態様１３４または１３５に記載の方法。
１３７． 前記非癌性細胞が、正常レベルのMDR1および/またはTAAを発現する、態様１３４に記載の方法。
１３８． 癌が所定の閾値以上でMDR1およびTAAを発現する場合は、前記対象に前記多特異性抗体を投与し、癌が前記所定の閾値未満でMDR1またはTAAを発現する場合は、前記対象に前記多特異性抗体を投与せずに従来の治療を行う、態様１２０～１３７のいずれか一項に記載の方法。
１３９． 多剤耐性タンパク質1 (MDR1) および腫瘍関連抗原 (TAA) の両方を発現する細胞に特異的に結合する多特異性抗体を作製する方法であって、任意で前記TAAはCD47、PD-L1、またはEGFRを含み、前記方法は、
MDR1結合ドメインおよびTAA結合ドメインを含む多特異性抗体を産生すること；
MDR1およびTAAを発現する第1の細胞を多特異性抗体に接触させること；
MDR1またはTAAのいずれかを発現する第2の細胞に多特異性抗体を接触させること；
前記第1の細胞への多特異性抗体の結合を、前記第2の細胞への多特異性抗体の結合と比較して、結合特異性比を決定すること；および
前記比が所定の閾値を超える場合に、その多特異性抗体がMDR1およびTAAの両方を発現する細胞に対して特異的であるとして同定すること
を含む、方法。
１４０． 前記所定の閾値は、2:1より大きい、態様１３９に記載の方法。
１４１． 前記第2の細胞はMDR1を発現してTAAを発現せず、前記方法は、TAAを発現するがMDR1を発現しない第3の細胞を多重特異性抗体に接触させることをさらに含む、態様１３９または１４０に記載の方法。
１４２． 前記方法が、前記第1の細胞、前記第2の細胞、および/または前記第3の細胞を、単一特異性抗MDR1抗体および単一特異性抗TAA抗体から選択される対照抗体に接触させることをさらに含む、態様１３９または１４０に記載の方法。
１４３． 遺伝子組換えヒト細胞株であって、前記細胞株は腫瘍関連抗原 (TAA) を発現し、任意で前記TAAは白血球表面抗原CD47を含み、MDR1の過剰発現のために多剤耐性タンパク質1 (MDR1) をコードする配列を含む外因性核酸を含む、細胞株。
１４４． 前記細胞株が腎臓細胞株である、態様１４３に記載の細胞系。
１４５． 前記細胞株がHEK 293T細胞株である、態様１４４に記載の細胞株。
１４６． 態様１４３～１４５のいずれか一項に記載の細胞株を作製する方法であって、
前記TAAを発現するヒト細胞を、外因性核酸を細胞に導入するのに十分な条件下で前記外因性核酸と接触させて、前記TAAを発現しかつMDR1を安定して過剰発現する遺伝子組換えヒト細胞を産生すること；および
前記TAAを発現しかつMDR1を安定して過剰発現する遺伝子組換えヒト細胞株を産生するのに十分な条件下で、前記遺伝子組換えヒト細胞を培養すること
を含む、方法。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供されるものである。
以下の実施例は、当業者に本発明をいかに製造し使用するかについての完全な開示および説明を提供するために提示されており、発明者が発明とみなす範囲を限定することは意図しておらず、また下記の実験が実施された全てのあるいは唯一の実験であることを表すことは意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験的誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に明記されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い気圧である。
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. （Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001）、Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996) 、Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999) 、Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995) 、Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997) 、およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998) などの標準的な教科書に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示で言及または関係する方法のための試薬、クローニングベクター、細胞、およびキットは、BioRad、Agilent Technologies、Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、New England Biolabs (NEB)、Takara Bio USA, Inc.などの販売会社、ならびにAddgene, Inc.、American Type Culture Collection (ATCC) などのレポジトリから入手可能である。
［実施例１：Pgp（MDR1）とCD47を同時に発現する細胞に特異的に結合し再感作させるが、どちらかのタンパク質の発現が減少または欠如している細胞には結合しない、二重特異性mAbの生成］
この実施例は、癌細胞によって発現される抗原を特異的に標的化しながら選択的な様式でEPの細胞外ドメインに結合することによって排出を効果的に遮断できる、抗体フォーマットに基づく分子の開発を示す。EP遮断は、化学療法剤に対して耐性であるまたは耐性になった細胞の再感作および殺傷をもたらす。この実施例では、癌免疫チェックポイントタンパク質を標的としながらEPの細胞外ドメイン (ECD) に結合し排出を遮断する二重特異性抗体分子が構築された。以下に記述される二重特異性抗体の適用は、EPが標的免疫チェックポイントタンパク質と共発現される場合、選択的な様式で細胞を化学療法剤に対して再感作させる。
材料と方法
［細胞株と細胞生存実験］
Pgpを発現するHEK 293T、MCF-7、N6ADRおよびSKNF7細胞株は、American Type Culture Collectionから入手した。N6/ADR細胞は、NALM6/ADR細胞とも呼ばれる。全ての細胞株およびそれらに由来する株は、最大10%までのウシ胎仔血清 (Sigma) 、非必須アミノ酸、および2 mmol/LのL-グルタミンを添加したRPMI 1640またはDMEM中で、37℃および5% CO2の加湿インキュベーターにおいて維持した（別段の表示がない限り）。細胞は、供給されたままの状態で使用したか、またはPgpを過剰発現（Ox）するように改変したか、またはレンチウイルス媒介ショートヘアピンRNAによりPgp発現をノックダウン（KD）したか、または本質的に記述されたとおりに（Cong, L. et al. (2013) Science 339, 819-823）CRISPR/Cas媒介ノックアウト技術によって機能性CD47遺伝子をノックアウト（KO）した。ビンクリスチンおよびパクリタキセルのIC50を測定するために、細胞を通常の培地で平板培養し、一晩接着させた。パクリタキセルまたはビンクリスチン(Sigma) を希釈シリーズで添加し、いずれかのモジュレーターを0～500μM/Lの範囲内で添加した。72時間後にCelltiter-Glo発光細胞生存性アッセイ (Promega) を用いて細胞生存性を測定した。細胞生存性の50%阻害を生じる薬剤濃度 (IC50) を、マルチパラメータ曲線分析（GraphPad PrismソフトウェアGraphPad Software, Inc.）から計算し、最小2反復実験から決定した。実施された実験の大部分において、薬物および/またはモジュレーター処理に応答して細胞生存率の50%低下を示さなかった細胞株は、定義によりIC50に達しなかったとみなされ、研究に係るパクリタキセルまたは薬物/モジュレーターの組合せに対して>1000 nmol/LのIC50を有するとしてリストされた。
記載したモノクローナル抗体 (mAb) を安定に発現する組換え細胞株も作製した。
［組換えDNA技術］
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されているように、DNAを操作するために標準的な方法が使用された。試薬はメーカーの説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242に記載されている。抗体鎖のアミノ酸は、Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1991)に従って番号付けされ参照される。
［DNA配列決定］
DNA配列は二本鎖配列決定により決定した。
［DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理］
Vector NTI (ThermoFisher) ソフトウェアパッケージを、配列マッピング、分析、アノテーションおよび図解のために使用した。
［細胞培養技術と抗体産生］
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J. B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K. M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. に記載されているように標準的な細胞培養技術が使用される。
mAb、Fab’2、Fabおよび二重特異性mAbを一過性産生のために293およびCHO細胞を用いた。Expi293細胞（A14527、ThermoFisher）の、ポリマーに基づく共トランスフェクションを用いて、異なる抗体構築物を発現させた。製造業者の推奨に従って、哺乳動物発現ベクターを有する細胞を懸濁培養した。
二重特異性構築物を調製するためには、1:1:4比（重鎖KK:重鎖DD:軽鎖）における対応発現ベクターで細胞をトランスフェクトした。標準的な抗体発現のためには、1:2比（H鎖:L鎖）を使用した。
トランスフェクションの6日後、細胞を遠心分離によって回収した。詳細には、トランスフェクトされる培養物1 ml当たり全1μgのコードDNAを、OptiMEM（登録商標）培地 (Life Technologies) 中に希釈し、同じ培地中のExpifectamine試薬 (Life Technologies) と20分間インキュベートした。次いで、この混合物を、250万細胞/ml、37°Cで、空気中に8%のCO2を重層して、Expi 293（登録商標）発現培地 (Life Technologies) 中で懸濁増殖しているExpi 293（登録商標）細胞に添加した。6日後、抗体構築物を含有する培地を遠心分離によって回収した。
［結合、排出遮断、化学療法剤への細胞感作を試験するために用いた試薬細胞株］
10%ウシ胎仔血清 (HyClone)、2 mM GlutaMAX (Life Technologies)、100 U/mLペニシリン、および100 g/mLストレプトマイシンを添加したDulbecco改変Eagle培地 (DMEM) 中、37℃で5% CO2インキュベーションを伴わせて、ヒト胚性腎臓 (HEK) 細胞株HEK 293 FT (Life Technologies) を維持した。
最適化されたPEIPro（商標）トランスフェクションプロトコール (Polyplus) を用いて、pLentic-C-Myc-DDK-P2A-Puroプラスミド中のヒトP糖タンパク質タグ付きORFクローンで293T細胞を一時的にトランスフェクトした。DNAおよびJetPEI（登録商標）をそれぞれ培養培地で希釈してから、約10分間穏やかに混合した。この混合によりトランスフェクション複合体が形成され、これを細胞培養物に直接添加した。排出遮断は、製造業者のプロトコールに従ってMultidrug Resistance Direct Dye Effluxアッセイ（Chemicon）を用いて測定した。
［標的配列、抗体配列および特異的抗標的抗体配列の供給源］
多剤耐性タンパク質1（MDR1）としても知られるP糖タンパク質（Pgp）、（遺伝子ABCB1）（NM_000927）のpLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro中ヒトタグ化ORFクローンはOrigeneから入手し、CD47抗体（CC2C6, Seiffert M, et al. (1999) Blood 94:3633）はBiolegendから、抗ABCB1 JSB-1（MAB4120）はMilliporeから入手した。
［安定的ABCB1過剰発現 (Ox) 細胞株の作製］
結合とin vitro効力との両方の特徴解析をするために、ABCB1を安定に過剰発現する細胞株を開発した。American Type Culture Collection (ATCC) から得られた接着性293Tナイーブ細胞を利用した。市販のABCB1抗体（バイオレジェンド、クローン4E3.16）を用いたフローサイトメトリーによって特徴づけられるように、この細胞株は、細胞表面上に低度から中度でABCB1を内因的に発現する。Polyplus PEIpro試薬を用いて、293Tナイーブ細胞をABCB1でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、ハイグロマイシンB溶液(Millipore Sigma) を用いて細胞を選択下に置いた。継続的なハイグロマイシンB選択の14日後に、ABCB1細胞表面発現について293T細胞を評価した。非トランスフェクト細胞がその後の培養で拡大しないことを保証するために、FACSAriaI (BDバイオサイエンス) を使用して、ABCB1陽性293T細胞の蛍光活性化細胞選別 (FACS) を用いたバルク選別を行った。バルク選別された293T ABCB1過剰発現細胞を拡張させ、続いてABCB1過剰発現を再確認した。同様の方法を用いて、本明細書に記載するように生成した293T-CD47ノックアウト細胞からABCB1過剰発現細胞を生成した。
［安定なABCB1 KD 293T細胞株の作製］
結合とin vitro効力との両方の特徴解析をするために、ABCB1発現の安定したノックダウンを有する細胞株が開発された。R8.74ヘルパープラスミド、VSVGエンベローププラスミド、およびABCB1に対するshRNAを含有するGE Dharmacon GIPZレンチウイルスベクターを用いたトランスフェクションにより、293Tナイーブ細胞においてレンチウイルスを産生した。次いで、採取されたレンチウイルスを用いて、接着性293Tナイーブ細胞に形質導入した。形質導入3日後に、293T形質導入細胞を、フローサイトメトリー（バイオレジェンド、クローン4E3.16）によりABCB1細胞表面発現について評価した。低いレベルで内因的にABCB1を発現する293Tナイーブ細胞と比較して、形質導入293T細胞はABCB1発現を示さなかった。これに加えて、GIPZレンチウイルスベクターはGFPを含有する。形質導入293T細胞はすべてGFP+であり、このことが、発現の減少と共に、形質導入が成功したことを示した。ABCB1発現の欠如はその後の継代でのフローサイトメトリーにより再確認された。
［KO細胞株の作製］
ABCB1およびCD47遺伝子のノックアウトHEK293細胞株を構築するために、HEK293宿主細胞を最初に、10% (v/v) FBSおよびグルタミンを添加したDMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium Gibco, Grand Island, N.Y., USA) 中で接着培養を介して培養した。細胞を飽和湿度で5% CO2、37℃において培養した。
gRNAのデザインは、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1またはTALEN誘導型変異誘発のための標的部位を選択するためのオンラインCHOPCHOPウェブツールを用いて行った（Kornel Labun et al., (2016). Nucleic Acids Research; およびTessa G. Montague et at., (2014) Nucleic Acids Res. 42:W401-W407参照）。設計したすべてのgRNAを化学的に合成した(ThermoFisher) 。
293T細胞のトランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従ってCRISPRMax試薬 (ThermoFisher) を用いた脂質ベースのトランスフェクションにより行った。簡単に述べると、トランスフェクションの1日前に、接着性細胞を96ウェルプレート上に0.2×105細胞/ウェルで平板培養した。トランスフェクションの日に、GeneArt Platinum Cas9タンパク質、gRNAおよびトランスフェクション試薬の溶液を細胞に加えた。トランスフェクションの72時間後、限界希釈法によって単一細胞を選択した後、細胞培養を96ウェルプレートフォーマットで2週間続けた。次いで、選択されたクローンを24ウェルプレートに継代し、製造業者のプロトコールに従ってGuide-itキット (タカラ) を用いた遺伝子型確認により試験した。各遺伝子のCRISPR標的部位を囲むゲノム領域をPCR増幅して、単一単離クローンにおいて遺伝子編集が一方の対立遺伝子 (単一対立遺伝子) または両方の対立遺伝子 (両対立遺伝子) 上にインデルを生じたかどうかを決定した。両方の対立遺伝子に突然変異を有するクローン上の目的タンパク質の発現をFACSによって試験した。
［試験された分子のヒト-マウス配列の構築（ヒトFc、マウスFv）］
発現ベクター：抗体発現ベクターの作製のために、重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、哺乳動物細胞株における発現のために最適化されたそれぞれの一般的レシピエント発現ベクターに予め挿入されたヒトIgG1定常重鎖またはヒトIgG1カッパ定常軽鎖のいずれかにインフレームでサブクローニングした。高レベル遺伝子発現のための完全長ヒトサイトメガロウイルス (CMV) 前初期プロモーターを用いるpCI-neo哺乳動物発現ベクター(Promega) に、発現させる遺伝子をクローン化した。2つの抗体鎖を2つの異なるベクターにクローニングした。
マウスのIgG重鎖およびカッパ軽鎖からのN末端シグナル配列を、それぞれ重鎖および軽鎖の分泌発現に用いた。シグナルペプチドは発現中に切断され、無傷のN末端を残した。Fab構築物では、精製を容易にするために、CH1 IgG1定常領域のC末端を6×Hisタグに融合させた。
二重特異性抗体ベクターの生成のために、IgG1由来の二重特異性分子は、2つの異なる標的すなわちPgp (ABCB1) およびCD47に特異的に結合することができる少なくとも2つの抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、それぞれ可変領域および定常領域を含む重鎖と軽鎖から構成されるFab断片である。対合し、かつFab抗Pgp（aPgp）およびFab抗CD47（aCD47）の両方として受容可能な結合をもたらすことができる共通の軽鎖が同定された；その使用によりLC誤対合を回避することができた（例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,765,412号参照）。静電ステアリング効果（例えばGunasekeran et al., (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 19637-19646参照；その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づいて二重特異性構築物を作製した。簡単に述べれば、標的に対するポリペプチド鎖または半抗体が、CH3ドメインにおける電荷対置換を介して二重特異性抗体としてアセンブルされる：一方の重鎖はK392DおよびK409D置換を含み、他方はE356KおよびD399K置換を含んだ。
図2は、二重特異性mAbの概略図を提供し、これは、どちらもヒトIgG1Fc上のA、15D3；B、5F9由来の配列を含有するセクションを、MRK16由来の共通軽鎖カッパ配列であるCと共に含むものである。
Pgpに対して以前に産生されたモノクローナル抗体15D3（例えば米国特許第5,959,084号を参照；その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）およびMRK16（Iwahashi et al., Cancer Research 53, 1993；その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）モノクローナル抗体を、ヒトIgG1/カッパ発現ベクター中に組換え工学的抗体としてクローン化した。
マウスハイブリドーマ配列からの可変重鎖および軽鎖断片が利用可能であり、リーダー配列および定常領域の同じバックグラウンドにクローン化した。
抗CD47（5F9；例えば米国特許第9,017,675号参照；その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）抗体の可変重および軽フラグメントを、2つの別個のベクターにおいてリーダー配列および定常領域の同じバックグラウンドにクローニングした。
これらおよび他の重鎖および軽鎖断片の多数の組み合わせを作製し、試験した。試験した構築物の大部分は、受容可能な結合または活性を生じなかった。構築および試験された抗体の例、ならびにそれらの結合および細胞殺傷特性は、図8に提供される。
図8は、異なる二重特異性抗体 (種々のヒト化またはキメラ化された重鎖または軽鎖の組み合わせを有する) による結合および増強された細胞殺傷の比較を提供する。具体的には、図8のカラム1（「Ab」）は、試験された種々の二重特異性フォーマットを提供し、例えば、行1において、15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16は、i) 本明細書に記載されるDD CH3突然変異を有する15D3重鎖配列（ヒトIgG1フレームワークにおいてキメラ化されている）、ii) 本明細書に記載されるKK CH3突然変異を有する5F9重鎖配列、およびiii) MRK16軽鎖（ヒトIgGカッパフレームワークにおいてキメラ化されている）を示す。示されたすべての軽鎖はヒトカッパ型であった。結合（図8、列2～3；「Kd (nM)」および「Bmax」）ならびに殺傷（図8、列3；「killing」）は以下のように決定した：「Kd (nM)」、ELISAによる結合（捕捉層としてプレート上にFcタグCD47を有する固相）；「Bmax」、「Kd (nM)」について記載されたプレートへのBmax結合；「Killing」、パクリタキセルタイトレーション（20μM～10-8μMの範囲）の存在下での増強された293ナイーブ細胞殺傷（増感）；「-」＝ゼロ、「±」＝0～0.5 Logシフト（50%細胞殺傷曲線にて）：「+」＝1～2 Logシフト、「++」≧2 Logシフト。列5～8（「Binding (293)」、「Binding (293 KO CD47)」、「Binding (293 KO CD47, OX ABCB1)」、および「Binding (293 OX ABCB1)」）は、非結合対照抗体と比較した、示された細胞株に結合する抗体のFACS平均蛍光強度を提供する：「-」＝～0、「±」＝0から～0.5のLogシフト、「+」＝～1 Logシフト、「++」＝1～>2 Logシフト（非結合コントロールおよび結合抗体の例については図3Aを参照）。
構築および試験された抗体のうち、（特にリード候補と比較して）許容できない結合特性またはMDR1とCD47の両方を発現する標的細胞の殺傷の非効率性を示したものは言及に値する。
例えば、図8に示すように、15D3および5F9の重鎖電荷交換Fc領域および共通MRK16由来軽鎖を含有する抗体（「15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16」）を試験したところ、所望の結合特性を示し、MDR1とCD47の両方を発現する標的細胞の増強された殺傷 (++) を生じた。従ってこの抗体をリード候補として選択した。それと比較して、「UIC2」（例えば「15D3 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/UIC2」参照）あるいは「9F11」（例えば「15D3 IgG1 KK/5F9 IgG1 DD/9F11」参照）のように、リード候補の共通軽鎖（すなわち「MRK16」）を代替の共通軽鎖で置換した場合、CD47とMDR1の両方を発現する細胞の特異的殺傷は本質的に観察されなかった。加えて、「15D3」重鎖の代わりに「MM4.17 2」または「UIC2」重鎖などの代替抗MDR1重鎖を置換することも、CD47とMDR1の両方を発現する細胞の特異的殺傷を有意に低下させた（例えば図8の、例えば「MM4.17 2 IgG1 DD/5F9 IgG1 KK/MRK16」および「UIC2 IgG1 KK/5F9 IgG1 DD/MRK16」参照）。
抗原を発現する細胞に結合する抗体に対する、使用される軽鎖を交換すること（すなわち「LCシャッフル」）の効果を、ELISAおよびFACS結合アッセイにより評価した。CD47特異的重鎖を用いたLCシャッフリングの試験では、改変抗CD47重鎖（5F9）をM89、15D3、MRK16またはUIC2軽鎖と組み合わせ、結合を評価した。ELISAによるCD47-Fc被覆プレートへの、種々の抗MDR1分子の二重特異性抗体の結合に対するLCシャッフルの効果を示す結果を表2に提供する。
Figure 2022527860000003
上の表で注目すべきは、非交換5F9対照と比べて、5F9/MRK16の組合せで見られる親和性の100倍の低下である。CD47に対して5F9/MRK16の組合せと同様のKdを有する抗体が好ましく、それは、二重特異性抗体が正常細胞に対してはより低い結合を有し、正常細胞よりも高いレベルでCD47を発現する癌細胞に対して増加された特異性を有するように、二重特異性フォーマットで使用される場合に必要な程度の特異性を提供するためである。
ELISAにより測定した、15D3重鎖とUIC2、MRK16または5F9軽鎖とを組み合わせることのCD47結合に対する影響を示すLCシャッフル試験の結果を表3に提供する。
Figure 2022527860000004
上の表で注目すべきは、非交換の15D3対照と比較して、15D3 HCとMRK16 LCの組合せ後に約20倍減少した、CD47に対する15D3の驚くべき親和性である。
共通のMRK16軽鎖と共に15D3および5F9重鎖の組合せを有する候補構築物は、受容可能な結合および標的アンタゴナイズ特性を有する。それと比較して、他の試験された重鎖および軽鎖の組合せは、試験された際に、許容できない結合および/または標的細胞殺傷結果を示した。図8参照。
［mAbの精製］
Fcを含有する抗体フォーマットを精製するために、上清1 ml当たり10μlのMabSelect（商標）SuRe（商標）（GE Healthcare）を、収穫した培地に添加し、4℃で一晩撹拌し続けた。翌日、真空マニホールドユニット（Pallライフサイエンス、米国）を用いてプロテインA樹脂を24ウェルフィルタープレートに適用した。樹脂をPBSで洗浄し、抗体を50 mMリン酸pH 3で溶出し、10×PBS pH 13で中和した。
ヒスチジンタグ化Fabは、Niセファロース6 Fast Flowヒスチジンタグ化タンパク質精製樹脂 (GE Healthcare) を用いた同じ手順に従って精製した。ビーズをPBSで洗浄し、次いで20 mMイミダゾール添加の25 mMリン酸バッファーpH 7.4、150 mM NaClで洗浄した。2倍体積の500 mMイミダゾール添加25 mMリン酸バッファーpH 7.4、150 mM NaClで複合体を溶出した。最後に、精製FabをPBSにバッファー交換した。
配列
Pgp/MDR1は、以下のアミノ酸配列を有する。
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMRLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLALGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGSGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLMPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAATEANIHAFIESLPNKYSTKVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ
Pgp/MDR1をコードする核酸配列が利用可能である：P糖タンパク質（ABCB1）（NM_000927）ヒトゲノムDNAホモサピエンスATP結合カセットサブファミリーBメンバー1（ABCB1）、第7染色体上のRef Seq遺伝子（NG_011513 gen）
CD47をコードする核酸配列が利用可能である：ヒトCD47分子 (CD47) 、転写産物バリアント1、mRNA NCBI参照配列：NM_001777.3
抗CD47 5F9抗体の可変重鎖配列は以下の通りである。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS.
抗CD47 5F9抗体の可変軽鎖配列は以下の通りである。
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK.
抗MDR1 MRK16抗体の可変重鎖配列は以下の通りである。
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
MRK16抗体の可変軽鎖の配列は以下の通りである。
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK.
抗体15D3の配列は、米国特許第5849877号から入手可能であり、ここで、抗体15D3の重鎖配列は以下の通りである。
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA
そして抗体15D3の軽鎖配列は以下の通りである。
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 UIC2抗体の軽鎖の配列は、以下の通りである。
DVVMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPPWTFGGGTKLDIK.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 UIC2抗体の重鎖の配列は、以下の通りである。
AVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFSNYYIHWVKQSHGKSLEWIGFISCYNGATFYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMKFNSLTFEDSAVYYCARLPIQFGNFYPMDYWGQGTSVTVSS.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 9F11抗体の軽鎖の配列は、以下の通りである。
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 9F11抗体の重鎖の配列は、以下の通りである。
EVKLVESGGGLVKFGGSLKLSCAASGFTLSSYYMSWVRQSPEKRLELVAVINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARPFYYSNSPFAYWGQGTLVTVSS.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 MM4.17抗体の重鎖の配列は、以下の通りである。
QVQLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGSYTYFPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQVSSLKSEDTAMYYCARPAEFRGYSWFAYWGQGTTVTVSS.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 M89抗体の軽鎖の配列は、以下の通りである。
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGGSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQTNTFPLTFGGGTKVEIK.
本明細書に記載されるように使用される抗MDR1 M 89抗体の重鎖の配列は、以下の通りである。
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQDPGKGLMWVSSISTDGSATKYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLRAEDTAVYYCVGGFLGWWGQGTLVTVSS.
結果
［精製mAbの生物物理学的分析試験（GXII装置、還元および非還元タンパク質）］
最終タンパク質調製物の純度およびモノマー含量は、製造業者によって記述されているようにProtein Express LabChip Kit (Perkin-Elmer) を用いてCaliper LabChip GXII上でハイスループット分析によって測定した。チップは、0.2% SDSおよび蛍光染色染料を含有するポリマー溶液を用いて装置上で自動的にプライミングされた。脱染色チャネルはSDSと染料を含まないポリマー溶液で充填された。簡単に述べれば、DDTを伴うまたは伴わないキャリパーサンプルバッファーと少量（2～5μL）の試料を混合することによって還元条件および非還元条件におけるタンパク質を調製した。試料を75℃で5分間変性し、2000 gで3分間遠心分離し、次いで泳動した。LabChip GXII Touchソフトウェア(Perkin Elmer) によりエレクトロフェログラムを生成した。
［CD47およびABCB1の特異的結合の検出］
CD47を標的とするモノクローナル抗体、Fabおよび二重特異性IgG1の結合特異性を、ヒトCD47-Fc融合タンパク質を用いたELISA（R&D systems）により試験した。簡単に述べると、マイクロタイタープレートを、PBS中0.5μg/mlの精製ヒトCD47-Fc融合タンパク質50μlで被覆し、次いでPBS中0.4% BSAの100μlでブロッキングした。種々の抗体フォーマットの希釈物を1/3順次希釈で各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。陽性対照として既知の5F9抗CD47抗体を用い、アイソタイプ（Isotype）対照としてヒトIgG1を用いた。その後、プレートをPBS/Tweenで3回洗浄し、次いでHRP結合ロバ抗ヒト定常領域特異的二次試薬と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄後、HRP基質でプレートを発色させた。反応を2 M H2SO4で停止させ、ODを520 nMにおいて測定した。
mAb、Fabおよび二重特異性IgG1の結合特異性は、CD47を自然に発現する293T細胞株、ヒトABCB1標的を過剰発現する293Tナイーブ細胞、レンチウイルスRNAベクターを用いてABCB1がノックダウンされた293Tナイーブ細胞、CD47ノックアウト293T細胞、およびヒトABCB1を過剰発現するCD47ノックアウト293T細胞を用いたFACSによって試験された。簡単に述べれば、異なる細胞株を、種々の量のmAbもしくは二重特異性mAbまたはヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と氷上で1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液 (0.5% BSA含有PBS) で3回洗浄した。Alexa647標識ヤギ抗ヒト抗体を二次抗体として添加し、サンプルを氷上でさらに1時間インキュベートした。サンプルを洗浄し、BD FACS Canto (BD Biosciences) を用いて分析した。
この実施例は、その一方のアームが排出ポンプMDR1/Pgpに結合し他方のアームが癌チェックポイントタンパク質CD47に結合する二重特異性ヘテロ二価抗体分子の構築を示す。両方の標的が細胞表面に同時に存在する場合、この二重特異性抗体は比較的高い親和性/結合性で細胞に結合する。比較して、MDR1/PgpまたはCD47のいずれかが存在しないか、または実質的に減少している場合、二重特異性抗体の結合は有意に減少するか、または検出不能である。(図4) 。
構築された二重特異性抗体は、図2に示されており、トランスポータータンパク質 (排出ポンプPgp) に結合してアンタゴナイズする1つのアーム (アームA) を含み、細胞を化学療法剤に対してより感受性にする。同時に、もう一方のアーム (アームB) は、細胞表面上の「免疫-Don't eat me（私を食べるな）」シグナル（CD47）に結合し、これが、IgG1 Fcと共に、細胞に対するより強固な免疫応答を可能にする。
図3A～3Fは、候補分子を試験するために使用された様々な試薬細胞株のFACS結合の図を提供する。これらの試薬細胞株のいくつかは、方法および材料のセクションに記載されているように、関与する標的、それの存在または欠如、および種々の抗腫瘍薬に対する細胞の感受性の正確かつ明確な理解を可能にするために、標的タンパク質のノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現によって操作された。具体的には、図3Aはナイーブ（naive）293T細胞への結合を示し、図3Bは293T CD47-KO（Knock-out（ノックアウト））細胞への結合を示し、図3Cは293T Pgp-KD（Knock-down（ノックダウン））細胞への結合を示し、図3Dは293T Pgp-ox（「over-expressors（過剰発現体）」）への結合を示し、図3EはN6ADR（NALM6 Adriamycin resistant（アドリアマイシン耐性））細胞への結合を示し、図3Fは293T CD47-KO+Pgp-ox細胞への結合を示す。
図4 A～4 Bでは、種々の細胞株に対するFACS分析によって二重特異性抗体の結合が示されている。最初の走査（図4 Aおよび図4 Bの左パネル）は、両方の標的 (PgpおよびCD47) を共発現する細胞への抗体の結合を示す。次の2つの走査（図4 Aおよび図4 Bの中央パネルおよび右側パネル）は、細胞株のPgp（「KBP1」、右パネル）またはCD47（「KT14」、中央パネル）のいずれかがノックダウン (KD) またはノックアウト (KO) された場合の結合の非存在または有意な減少を示す。図4 A～4 Bは、さらに、600 nM、200 nM、66 nM、7.4 nMおよび2 nMのタイトレーションされた抗体濃度での結合を示し、アイソタイプおよび抗体無し対照から測定されたシグナルも提供されている。それぞれの抗体濃度は、図4 Aおよび図4 Bの左側のパネルに示され、これらの異なる濃度からの測定されたシグナルは、図4 Aおよび図4 Bの中央および右側のパネルにおいて概してオーバーラップしている。図4 Aおよび図4 Bは、2つの異なるバッチの抗体から得られた結果を示す。
図5および図6 A～図6 Cは、細胞が15D3.aCD47:MRK16二重特異性抗体 (矢印で強調表示) によって結合された場合の、抗腫瘍剤パクリタキセルによる増強された細胞殺傷を示す。図5に提供されたデータは、化学療法に対するナイーブ293T細胞およびN6ADR細胞の感受性が、例えば化学療法のみによる処置（「Chemo only」）または他の抗体と組み合わせた化学療法（15D3:MRK16 Fab；a15D3:MRK16抗体；aCD47:MRK16抗体；aCD47:MRK16 Fab；および15D3:9F11 Fab）と比較して、15D3.aCD47:MRK16二重特異性抗体によって増強されたことを示す。
図6 Aは、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, Inc.) を用いて生成された、図5に提供されたデータのフォーム適合プロットを提供する。図6 Bは、図5および図6 Aに示されたデータの再表示を提供し、ナイーブ293T細胞についての適合データ (右) と生データ (左) との並列比較を示す。図6 Cは、図5および図6 Aに示されたデータの再表示を提供し、N6ADR細胞についての生データ (左) と適合データ (右) との並列比較を示す。まとめると、これらのデータは、15D3.aCD47:MRK16二重特異性抗体の存在下で、標的PgpおよびCD47を共発現する2つの異なる薬剤耐性細胞株 (293TおよびN6ADR) の化学療法剤に対する感受性増強および/または薬剤増感効果を示す。対照的に、同じ標的に向けられた種々の他の試験された抗体は、有意な増感作用を有さない。
図7は、例えば、ビンクリスチン単独で処置された細胞（Vincristine only）と比較して、15D3.aCD47:MRK16二重特異性（Bispecific）抗体 (25 nM) および化学療法剤ビンクリスチン（vincristine）の存在下でのナイーブ293Tの増強されたインビトロ殺傷を示す。これらのデータは、薬物増感作用がパクリタキセルによる処置に限定されないこと、および15D3.aCD47:MRK16二重特異性抗体は複数の異なる薬物と組み合わせて使用される場合に薬物感受性を広く増強することを実証している。
これらの結果で明らかにされた特異的かつ同時的ターゲティングのこの組合せは、正常組織がこれらのアンタゴニスト作用を免れながら癌細胞（化学療法耐性であり得るものを含む）に対する抗腫瘍剤による治療効果の増強を示している。同時に、第2のタンパク質（例えばこの例における「don't eat me」シグナル）への結合およびそれをアンタゴナイズまたはマスキングする可能性は、この標的をトランスポータータンパク質（排出ポンプ）とともに共過剰発現する癌細胞に限定され、それによって、この第2のタンパク質の同時的、特異的かつ有益な標的化を可能にする。
このように、標的の組合せが細胞表面に提示される場合に、優先的結合によって特異性が達成される。この結合自体でも細胞に対する免疫応答に焦点が当たるかもしれないが（例えば二重特異性分子へのIgG1 Fcの組み入れによって）、特異的結合に関わる一対の標的タンパク質の一方または両方の活性を二重特異性分子が打ち消す場合には（この例に示されているように）、付加的な利益がある。別の言い方をすれば、二重特異性抗体が提供する望ましい程度の組織 (腫瘍) 特異性に加えて、本開示の抗体は、2つの異なる細胞機序を同時に標的化する利益も提供し、従って結果が相加的、相乗的、またはその他の点で有利となり得る。抗体分子によるこの「直交性（orthogonal）標的化」の効果は、抗体のFc領域を調節または適合させて結合した分子または細胞に対する付随する免疫応答を増強または低減することによって、さらに増強され得る。
したがって、このアプローチは、薬剤耐性、多剤耐性、免疫マスキング、または標的化可能な細胞表面タンパク質の他の組み合わせが関与する（例えば、TK活性化因子、シグナル伝達タンパク質、異常に過剰発現したタンパク質などを含む）癌治療の分野において多くの潜在的な適用を有し、関与するタンパク質の1つがトランスポータータンパク質である場合は特にそうである。さらに、2つより多い異なる標的が癌細胞上で同時に過剰発現され得る場合、このアプローチは、そのような細胞の特異的かつ積極的な標的化を可能にする適切な三価または他の多価の分子の使用に適用可能である。
多くの場合、正常細胞と比較して、特定のタンパク質の同時過剰発現は、癌細胞、特に多剤耐性である癌細胞上で起こる。本明細書に記載される二重特異性分子は、2つの異なる標的タンパク質（すなわち、トランスポータータンパク質および第2のタンパク質）が存在する場合には強く細胞に結合するが、この1対のタンパク質の一方または他方の濃度が存在しないかまたは低下している場合には（例えば正常細胞で見られるように）より弱く結合する。結合すると、二重特異性抗体は、標的とされた表面タンパク質のアンタゴナイズ化、活性化、またはマスキング（またはこれらの効果の組み合わせ）をすることによって、結合された細胞の生存率、活性または感受性を調節する。
有利な形式では、それぞれが別々の標的に結合する2つの異なる重鎖（Heavy Chains）が、標準的な方法を用いて一緒にされる（従ってヘテロ二価対を形成する）。これらの異なる重鎖は、いくつかの実施形態では適切な単一の軽鎖と組み合わされて使用されるが、これは各々のHCがその同族標的に別個に結合することを許容するだけでなく、組み合わされて二重特異性抗体フォーマットをもたらした場合に各アームがそれぞれの標的に結合することも許容するものである。もし（どちらか片方だけでなく）両方の標的が細胞表面に同時に存在するならば、二重特異性抗体の結合は有意に増強され、組織特異性がもたらされる。
この場合、二重特異性抗体は、記述された標的の組み合わせを提示する癌細胞に強くかつ特異的に結合しながらこれらの標的の一方または両方をアンタゴナイズし、および/またはそれらの正常な機能を阻害し、例えばさらなる化学療法剤および/または対象の免疫系に対して細胞をより感受性にするかまたは増感させ得る。
［実施例２：低下した親和性の一特異性二価抗MDR1抗体および抗CD47抗体の抗癌活性、ならびに二重特異性抗体との比較］
この実施例は、低下した親和性の抗MDR1抗体および抗CD47抗体が、単独で投与された場合には癌を治療することにおいて無効であるが、同時投与された場合には腫瘍体積を減少させることを示す。二重特異性抗体（15D3 HC:MRK16 LC::5F9 HC:MRK16 LC）は、化学療法剤の非存在下で抗MDR1抗体と抗CD47抗体の同時投与よりも効力があった。15D3 HC:MRK16 LC::5F9 HC:MRK16 LCは、ここでは15D3 HC::MRK16 LC::5F9 HCとも呼ばれる。
抗MDR1抗体は15D3抗体の2つの重鎖とMRK16抗体の2つの軽鎖を含んでいた。この抗体は、図9において15D3/MRK16 monoclonal（モノクローナル）と呼ばれている。抗CD47抗体は5F9抗体の2つの重鎖とMRK16抗体の2つの軽鎖を含んでいた。この抗体は、図9においてKT14/MRK16モノクローナルと呼ばれている。二重特異性抗体は、15D3 HC:MRK16 LC::5F9 HC:MRK16 LCを含み、図9においてKbisP1.1と称されている。
図9は、多剤耐性N6ADR細胞を含有する腫瘍の体積（Tumor Volume）に対する、示された抗体の投与の効果を示す。示された抗体を投与する前に、試験群当たり6匹のマウスのコホートにN6ADR細胞を注射した。抗体は、触知可能な腫瘍が約100～150 mm3の大きさに達した時点（腫瘍細胞の注入後約7日（Days））で投与された。抗体は0日目、4日目、7日目、および11日目に投与した。腫瘍体積が測定され、それをプロットしている。パネルA：15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体。パネルB：KT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体。パネルC：15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体との同時投与。パネルD：KBisP1.1抗体。
示された抗体は、化学療法剤パクリタキセル（Pac）と併用または非併用で投与された。抗体は、パクリタキセルの約1～4時間前に投与した。
15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体およびKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体単独は、腫瘍体積に有意な影響を示さなかった。15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体は、化学療法抵抗性N6ADR細胞をパクリタキセルに感受性にした。この化学療法増感効果は15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体に特異的であり、KT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体では認められなかった。パネルAおよびB参照。
15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体との同時投与は、15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とパクリタキセルとを同時投与した場合に見られたのと同様の程度に腫瘍体積を減少させた。腫瘍に対する15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体の同時投与の効力は、パクリタキセルも投与された場合にさらに増加した。これらのデータは、15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体との同時投与を、化学療法剤の存在下または非存在下で癌を治療するために使用できることを示す。パネルC参照。
パネルDは、二重特異性抗体が、15D3/MRK16モノクローナル抗MDR1抗体とKT14/MRK16モノクローナル抗CD47抗体との同時投与よりも有効であることを示す。
この実施例の材料および方法は、実施例1について説明したものと同様である。
［実施例３：二重特異性抗体はN6ADR細胞ベースの異種移植片に対して有効である］
材料：
細胞：NALM6 (ATCC) およびNALM6ADR (ATCC)、本研究で用いたB細胞前駆リンパ芽球性白血病細胞株。NALM6ADRは、NALM6細胞由来の多剤耐性細胞株である。
マウス：65匹の5～6週齢雌SCID-Biegeマウス (Charles River) を本研究に用いた。
試薬：BisP1.1（15D3重鎖/KT14重鎖/MRK16軽鎖）、ヒトアイソタイプ（Isotype）IgG1 (Bioxcell) 、パクリタキセル（Paclitaxel）(Sigma) 、バルスポダール（Valspodar）(Sigma) 。
方法：
細胞培養：NALM6およびNALM6ADR細胞の両方を、10% FBS、1%ペニシリンおよび1%ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で37℃、5% CO2にて維持した。使用した細胞株は真正であり、マイコプラズマ陰性であることが確認された。
接種－PBS:マトリゲル（1:1）で希釈した2X106細胞を、無菌条件下で麻酔した5～6週齢の雌SCID-Biegeマウス50匹に27 Gインスリンシリンジを用いて皮下注射した。
投薬－
NALM6皮下腫瘍：マウスを、各群5匹の (i) 対照ビヒクル（Control vehicle）、 (ii) 5 mg/kgおよび (iii) 20 mg/kgのパクリタキセルという3群にランダム化した。
NALM6ADR皮下腫瘍：マウスを、各群5匹の (i) 対照アイソタイプIgG1 15 mg/kg、(ii) 対照アイソタイプIgG1 15 mg/kgとパクリタキセル5 mg/kg、(iii) 対照アイソタイプIgG1 15 mg/kgとパクリタキセル20 mg/kg、(iv) BisP1.1 15 mg/kg、(v) BisP1.1 15 mg/kgとパクリタキセル5 mg/kg、(vi) BisP1.1 15 mg/kgとパクリタキセル20 mg/kg、(vii) バルスポダール 20 mg/kg、(viii) バルスポダール 20 mg/kgとパクリタキセル5 mg/kg、および(ix) バルスポダール 20 mg/kgとパクリタキセル5 mg/kgという9群にランダム化した。抗体、バルスポダール、およびパクリタキセルを週2回、連続4週間にわたり腹腔内投与した。抗体/バルスポダールは、パクリタキセル注射の少なくとも4時間前にを注射した。パクリタキセル製剤：パクリタキセルは難溶性であるため、50 mg/mLのマスターストックを無水エタノール:Kolliphor（1:1）中で調製した。注射前に、ストックをPBSで5 mg/kgまたは20 mg/kgの推奨用量に希釈し、(1:16) の比を維持した。
測定：腫瘍測定は、較正されたバーニアキャリパーおよび式1/2*L*S*S（式中、Lは腫瘍の長軸であり、sは腫瘍の短軸である）に従って計算される腫瘍体積（Volume）を用いて、1週間に3回行われた。体重は処置開始前に記録され、試験期間中継続的にモニターされた。動物の生存率は処置初日から死亡まで評価された。苦痛を避けるために、上記の予め定められた基準（急速な体重減少、歩行能力の喪失、呼吸困難、または飲水もしくは摂食不能）に従って瀕死状態になった場合にはマウスを安楽死させた。
統計：腫瘍体積と体重を、正確一元配置分散分析(ANOVA) を用いて異なる実験群間で比較した。ログランク（Mantel-Cox）試験を用いてKaplan-Meier生存曲線を異なる処置群間で比較した。統計解析はGraphPad Prism（GraphPad、米国カリフォルニア州サンディエゴ）ソフトウェアを用いて行った。有意水準は、全ての分析についてp<0.05とした。
［結果］
NALM6細胞は多剤耐性NALM6ADR細胞と比較してパクリタキセルに対する感受性の増加を示した。NALM6細胞は、5 mg/kgおよび20 mg/kgの用量でのパクリタキセルに対して有意な (p<0.0001) 腫瘍増殖阻害を示した。対照的に、NALM6ADR細胞は、5 mg/kgで有意に少ない腫瘍増殖阻害を示し、20 mg/kgで中程度の阻害を示した (図11) 。これは、インビボでのNALM6ADR細胞のパクリタキセル耐性を確証するものである（図10、図11）。
さらに、NALM6ADRモデルでは、BisP1.1を15 mg/kgの用量で注射すると、腫瘍増殖が強く阻害された (図11) 。同様に、パクリタキセル5 mg/kgおよびパクリタキセル20 mg/kgと組み合わされた15 mg/kgのBisP1.1は、腫瘍増殖を有意に低下させた (図11) 。このことと一致して、ABCB1の低分子阻害剤であるバルスポダールは、NALM6ADR腫瘍を化学療法に増感させた (図12) 。しかし、BisP1.1+パクリタキセル併用群とは対照的に、バルスポダールとパクリタキセル20 mg/kgの併用で処置したマウスは体重の有意な減少を示した（図13および図14）。
バルスポダールとパクリタキセル20 mg/kgで処置したマウスは、対照と比較して最低の生存率を示した。BisP1.1またはBisP1.1+パクリタキセルで処置したマウスは、対照またはパクリタキセル処置マウスと比べて生存が延長した (図15) 。
結論：BisP1.1は、単独およびパクリタキセルとの併用の両方の場合において、NALM6ADR細胞の腫瘍増殖を有意に阻害した。BisP1.1はマウス体重の減少を誘発しなかった。BisP1.1およびBis1.1+パクリタキセル併用で処置したマウスは、対照およびパクリタキセル処置コホートと比較して、マウスの生存期間の延長を示した。
［実施例４：二重特異性抗体は、複数の異なる癌モデルに対して有効である］
BisP1.1二重特異性抗体は、異種移植研究において2つのさらなる多剤耐性 (MDR) 癌細胞株に対して有効であった。A2780ADR MDR癌細胞株は、CD47およびABCB1の両方を発現する。HeyT30 MDR癌細胞株もCD47およびABCB1の両方を発現するが、A2780ADR細胞と比べるとより低いレベルである（図16および17）。A2780ADRおよびHeyT30細胞株はいずれも卵巣由来である。PEコンジュゲートの市販の抗MDR1および抗CD47試薬抗体を使用した；MDR1についてはBiolegendカタログ番号348606、CD47についてはBiolegendカタログ番号323108番である。
A2780ADR MDR癌細胞株およびHeyT30 MDR癌細胞株を、実施例3に記載のプロトコールに従ってマウスに注射した。マウスを、パクリタキセルを併用または非併用のBisP1.1二重特異性抗体で処置した。図18に見られるように、BisP1.1二重特異性抗体は、パクリタキセル併用または非併用において、A2780ADR MDR癌細胞腫瘍体積の減少に有効である。BisP1.1二重特異性抗体はまた、より低濃度の抗体が使用される場合、パクリタキセルによるHeyT30 MDR癌細胞腫瘍体積の減少に有効である。より高濃度では、BisP1.1二重特異性抗体はパクリタキセルの存在下および非存在下で有効であった (図19) 。
［実施例５：KBisP1.1二重特異性抗体は、MDR細胞に対する抗MDR1 15D3抗体よりも効力があり、MDR癌細胞を用量依存的に化学療法増感させる］
多剤耐性N6ADR細胞をマウスに注射することにより形成された腫瘍を、抗MDR1抗体15D3をパクリタキセルと併用または非併用で投与するか、あるいはKBisP1.1をパクリタキセルと併用または非併用で投与することによって処置した。
図20に見られるように、KBisP1.1は、インビボのN6ADR細胞腫瘍に対して15D3抗体よりも効果的である。
図21は、インビボで、パクリタキセルに対する多剤耐性N6ADR腫瘍のKBisP1.1化学療法増感が用量依存的であることを示している。
［実施例６：ヒトおよびカニクイザルの赤血球に対するKBisP1.1二重特異性抗体の結合の有意な減少］
KBisP1.1抗体は、抗CD47 5F9抗体とは対照的に、ヒトおよびカニクイザルの赤血球に有意な結合を示さないため、一般的な細胞毒性を引き起こしたり赤血球の「抗原シンク」の対象となったりするとは予想されない。ヒトおよびカニクイザルのRBC結合データをそれぞれ図22 Aおよび22 Bに示す。図22 Aおよび22 Bはまた、5F9 HCおよびMRK16 LCを含む抗CD47抗体（「KT14_MRK16」）が、抗CD47 5F9抗体（「KT14」）とは対照的に、ヒトおよびカニクイザル赤血球 (RBC) に有意に結合しないことを示す。
カニクイザルにおけるKBisP1.1抗体のその後の試験では、この抗体は体重の有意な減少、溶血性貧血をもたらさず、病的状態の増加は伴わないことが示された。さらに、KBisP1.1のクリアランスは正常に見え、明らかな「抗原シンク」効果は観察されなかった。
カニクイザルに10 mg/kgの用量でKBisP1.1抗体を投与した。抗体の半減期は114～148時間であった。
［実施例７：KBisP1.1二重特異性抗体のカニクイザル毒性試験］
15匹のカニクイザル（macaca fascicularis）が、KBisP1.1毒性を評価する単一用量試験に関わった。サルを5つのコホート (n=3動物/コホート) に分けた。
Figure 2022527860000005
全動物が抗体および/またはパクリタキセルの完全用量を受けた。注入反応の徴候を示した動物はいなかった。パクリタキセルの注入後、注入部位に予想される量の最小紅斑が認められた。抗体単独の注入部位に紅斑はなかった。
KBisP1.1は全てのコホートで良好な忍容性を示し、活動性や食欲に変化はなかった。体重は安定しており、詳細な臨床検査は正常であった。
15匹中11匹の動物でヘマトクリットのわずかな減少が投与後7日目に観察されたが、これはKBisP1.1用量またはパクリタキセルの投与と相関しなかった。他のすべての臨床化学的および血液学的所見は正常であった。
［実施例８：免疫原性を低下させる又はADCCを改変するように改変されたKBisP1.1二重特異性抗体］
材料と方法
細胞：MES-SA/Dx5細胞株（シグマ、カタログ番号95051031）は親MES-SA細胞株（シグマ、カタログ番号95051030）由来の子宮肉腫であり、本研究に使用された。MES-SA/Dx5細胞株は、その親細胞と比較して約100倍の、ドキソルビシンに対する耐性を示す。
マウス：5～6週齢の雌ヌードマウス (Charles River) を本研究で用いた。
ヒトアイソタイプ（Isotype）IgG1 (Bioxcell) を対照とした。
細胞培養―MES-SA/Dx5細胞を、10% FBS、1%ペニシリンおよび1%ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で37℃、5% CO2にて維持した。10E-7 Mアドリアマイシンによる少なくとも週1回の処置。使用した細胞株は真正であり、マイコプラズマ陰性であることが確認された。
接種―PBS:マトリゲル (1:1) で希釈した0.5 X 106細胞を、27 Gインスリンシリンジを用いて、無菌条件下の麻酔した5～6週齢雌ヌードマウス30匹に皮下注射した。すべての動物の維持、取り扱い、サーベイランス、動物手順は、APLACプロトコールに従い認可されて行われた。
用量―
MES-SA/Dx5皮下腫瘍：腫瘍が100～150 mm3に達すると、マウスを、各5匹の6群にランダム化した: (i) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kg、(ii) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg、(iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(v) KNJYBisP1.1 LALAPG 3 mg/kg、ならびに (vi) KNJYBisP1.1 LALAPG 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル。抗体とパクリタキセルを週2回、連続2週間腹腔内投与した。抗体はパクリタキセル注射の少なくとも4時間前に注射した。
パクリタキセル製剤：パクリタキセルは難溶性であるため、50 mg/mLのマスターストックを無水エタノール:Kolliphor (1:1) 中に調製した。注射前に、このストックをPBSで (1:16) の比率を維持しながら推奨用量の20 mg/kgに希釈した。
測定―腫瘍測定は、較正されたバーニアキャリパーおよび式1/2*L*S*S（式中、Lは腫瘍の長軸であり、sは腫瘍の短軸である）に従って計算される腫瘍体積（Tumor volume）を用いて、1週間に3回行われた。体重は処置開始前に記録され、試験期間中継続的にモニターされた。動物の生存率は処置初日から死亡まで評価された。動物の苦痛を避けるために、上記の予め定められた基準（急速な体重減少、歩行能力の喪失、呼吸困難、または飲水もしくは摂食不能）に従って瀕死状態になった場合には動物を安楽死させた。
KBisP1.1抗体は、本明細書ではKNJYBisP1.1とも呼ばれる。KNJYBisP1.1 N297A抗体についても同じプロトコールに従った。
［KBisP1.1ヒト化抗体］
KBisP1.1抗体（本明細書ではKNJYBisP1.1とも呼ばれる）は、KBisP1.1抗体のキメラ化（chimera）およびヒト化（humanized）バージョンを作製することによって免疫原性を低下させるように改変した。KBisP1.1キメラ抗体は、荷電対置換K392DおよびK409Dを有するヒトIgG1 Fc領域に融合された15D3可変重鎖領域と、荷電対置換E356KおよびD399Kを有するヒトIgG1 Fc領域に融合された5F9可変重鎖領域とを含んだ。
CDR移植のテンプレートとして使用するヒト抗体フレームワーク領域 (FR) を選択するために、マウスの15D3 VHおよびMRK16 VL領域をヒト生殖細胞系配列のそれらと比較した。マウス15D3 VH領域のFRはヒトIGHV3サブグループと最も高い相同性を有することが見出された。マウスMRK16 VL領域のFRはヒトIGKV2サブグループと最も高い相同性を示した。潜在的な翻訳後修飾を減少させ抗体の安定性を改善するために、15D3 CDR H2にN56Q/N56Sを導入し、MRK16 CDR L1にN30Q/N30Sを導入した。各々3つのバージョンのヒト化VH（15D3 Hz0、15D3 Hz1、および15D3 Hz2）およびVL（MRK16 Hz0、MRK16 Hz1、およびMRK16 Hz2）を設計した。可変領域配列は以下の通りである。
15D3 Hz0:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS

15D3 Hz1:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS

15D3 Hz2:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS

MRK16 Hz0:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK

MRK16 Hz1:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK

MRK16 Hz2:
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
各バージョンの配列アラインメントを図23～24に示す。
図25に示されるように、ヒト化抗体は、マウスにおいて多剤耐性MES-SA-DX5細胞生成腫瘍を化学療法増感させた。図26に示すように、ヒト化抗体は、マウスにおいて多剤耐性A2780ADR細胞生成腫瘍を化学療法増感させた。図26において、KBisP1.1抗体は「KNJYBisP1.1」と称され、ヒト化KBisP1.1抗体は「ヒト化（Humanized）」と称される。
ヒト化KBisP1.1抗体は結合タイトレーション及び化学毒性アッセイにより特徴解析した。
細胞結合アッセイ。細胞への抗体結合はフローサイトメトリーにより評価した。ヒトABCB1を発現するように安定にトランスフェクトされた293T細胞（293T_ABCB1_OX）を、フローサイトメトリー緩衝液(PBS+2% FBS+0.02%アジ化ナトリウム) 中で1回洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液中で2×10^6細胞/mLで再懸濁し、96ウェルマイクロタイタープレートに0.1 mL/ウェルで分注した。組換え抗体を、最初の結合確認のために5 ug/mLで細胞に添加し、またはフローサイトメトリー緩衝液中で100 ug/mLから段階希釈した。細胞を氷上で30分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で二回洗浄した。結合した抗体をPE標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG（Jackson ImmunoResearch）で検出し、Attune NxTフローサイトメーターで評価した。EC50は最大応答の半分を示す抗体濃度として計算される。
細胞毒性試験。ヒト急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞株であるNALM6のドキソルビシン選択B1陽性バリアント、N6/ADRにおいて、ビンクリスチン細胞毒性に対する抗体の効果を評価した。細胞を0.05 mLのアッセイ培地 (RPMI-1640+10% FBS) 中5000細胞/ウェルで、白色平坦底96ウェル組織培養プレート中に播種した。ビンクリスチンは、アッセイ培地中で200μMからの段階希釈で、100μg/mL (2X最終濃度) の試験抗体もしくは対照抗体または7μM (2X最終濃度) の小分子B1インヒビターであるバルスポダールを含有する2X最終アッセイ濃度で調製された。96ウェルプレート中で、等体積 (0.05 mL) のビンクリスチン/抗体混合物をN6/ADR細胞に添加した。次いで、プレートを37℃、5% CO2中でインキュベートした。72時間後、プレートを室温に平衡化し、製造業者の推奨プロトコールに従ってPromega（登録商標）CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存性アッセイを用いて細胞生存率を評価した。ルミネセンスをMolecular Devices（登録商標）FlexStation（登録商標）3マルチモードマイクロプレートリーダーで測定し、データをGraphPad Prism 8.0ソフトウェアで解析した。IC50は、応答 (細胞増殖) が50%低下した薬物 (ビンクリスチンまたはその他の化学療法細胞傷害性薬剤) の濃度である。
293T_ABCB1_OX細胞に対する二重特異性抗体の細胞結合を表4に要約する。
Figure 2022527860000006
ビンクリスチン細胞毒性に対する抗体の作用を表5にまとめる。
Figure 2022527860000007
［KBisP1.1 LALAPG Fcミュート化抗体］
キメラ抗体のIgG1 Fc領域を改変して、LALAPGエフェクター機能突然変異（L234A、L235A、およびP329G）または抗体依存性細胞傷害性 (ADCC) を低下させるN297A突然変異を含めさせた。そのような抗体は、本明細書中ではミュート化抗体と呼ばれる。置換の位置は、ヒトIg G1のアミノ酸配列を参照したものである。
図25に示されるように、ミュート化Fc LALAPG二重特異性抗体は、マウスにおいて多剤耐性MES-SA-DX5細胞が生成した腫瘍を化学療法増感させた。ミュート化Fc LALAPG二重特異性抗体についてのデータは、KNJYBisP1.1のFcエフェクター機能が、パクリタキセルに対する多剤耐性腫瘍の化学療法増感にとって不可欠ではないことを示唆している。KNJYBisP1.1のFcエフェクター機能は、化学療法の非存在下での抗体単独の抗腫瘍効果に部分的に関与すると見られる。
［KBisP1.1 N297A Fcミュート化抗体］
キメラ抗体のIgG1 Fc領域を、N297A突然変異を含むように改変して、抗体依存性細胞傷害性 (ADCC) を減少させた。そのような抗体は、本明細書中ではミュート化抗体と呼ばれる。置換の位置はヒトIg G1のアミノ酸配列を参照したものである。
図27 Aは、N297A置換 (図においてKNJY N297Aとして標識される) を有するKBisP1.1二重特異性抗体が、インビボで多剤耐性MES-SA/Dx5細胞腫瘍をパクリタキセルに対して化学療法増感させることを示す。KBisP1.1のFcエフェクター機能は、パクリタキセルに対する多剤耐性腫瘍の化学療法増感には不可欠ではないと見られる。KBisP1.1のFcエフェクター機能は、化学療法の非存在下での抗体単独の抗腫瘍効果に部分的に関与すると見られる。
［KBisP1.1 N297A Fcミュート化抗体は、異なる癌細胞株であるA2780ADR細胞株に対しても試験された］
材料と方法
細胞：A2780ADR細胞系（シグマ、カタログ番号93112520）は、親A2780細胞株（シグマ、カタログ番号93112519）由来の上皮性卵巣細胞腫であり、本研究で使用された。
マウス：5～6週齢の雌ヌードマウス (Charles River) を本研究で用いた。処置を受けなかったマウスを10%多く考慮に入れた。
ヒトアイソタイプIgG1 (Bioxcell) を対照とした。
細胞培養―A2780ADR細胞を、10% FBS、1%ペニシリンおよび1%ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で37℃、5% CO2にて維持した。10E-7 Mアドリアマイシンによる少なくとも週1回の処置。使用した細胞株は真正であり、マイコプラズマ陰性であることが確認された。
接種―PBS:マトリゲル (1:1) で希釈した0.5 X 106細胞を、27 Gインスリンシリンジを用いて、無菌条件下の麻酔した5～6週齢雌ヌードマウス30匹に皮下注射した。すべての動物の維持、取り扱い、サーベイランス、動物手順は、APLACプロトコールに従い認可されて行われた。
用量―
A2780ADR皮下腫瘍：マウスを、各5匹の6群にランダム化した: (i) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kg、(ii) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg、(iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(v) KNJYBisP1.1 N297A 3 mg/kg、ならびに (vi) KNJYBisP1.1 N297A 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル。抗体とパクリタキセルを週2回、連続2週間腹腔内投与した。抗体はパクリタキセル注射の少なくとも4時間前に注射した。パクリタキセル製剤：パクリタキセルは難溶性であるため、50 mg/mLのマスターストックを無水エタノール:Kolliphor (1:1) 中に調製した。注射前に、このストックをPBSで (1:16) の比率を維持しながら推奨用量の20 mg/kgに希釈した。
測定―腫瘍測定は、較正されたバーニアキャリパーおよび式1/2*L*S*S（式中、Lは腫瘍の長軸であり、sは腫瘍の短軸である）に従って計算される腫瘍体積を用いて、1週間に3回行われた。体重は処置開始前に記録され、試験期間中継続的にモニターされた。動物の生存率は処置初日から死亡まで評価された。動物の苦痛を避けるために、上記の予め定められた基準（急速な体重減少、歩行能力の喪失、呼吸困難、または飲水もしくは摂食不能）に従って瀕死状態になった場合には動物を安楽死させた。
図27 Bは、KBisP1.1 N297A抗体 (図においてN297Aとして標識されている) が、インビボで多剤耐性A2780ADR細胞をパクリタキセルに対して化学療法増感させることを示す。このモデルでは、KBisP1.1のFcエフェクター機能はパクリタキセルに対する多剤耐性腫瘍の化学療法増感には不可欠ではない。KBisP1.1のFcエフェクター機能は、化学療法の非存在下での抗体単独の抗腫瘍効果に部分的に関与する。
［実施例９：同じ標的に結合する単一特異性抗体と比較したKBisP1.1二重特異性抗体］
抗MDR1モノクローナル抗体である15D3および抗CD47 KT14モノクローナル抗体と比較したKNJYBisP1.1抗体の抗腫瘍効果を、A2780ADRおよびMES-SA/Dx5インビボ多剤耐性モデルを用いて評価した。
［材料と方法］
細胞株および腫瘍モデルは、実施例7に記載の通りである。
用量―
A2780ADR皮下腫瘍：腫瘍が100～150 mm3に達すると、マウスを、各5匹の10群にランダム化した: (i) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kg、(ii) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg、(iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(v) 15D3ハイブリドーマモノクローナルAb 3 mg/kg、(vi) 15D3ハイブリドーマ3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(vii) KT14/KT14モノクローナルAb 3 mg/kg、(viii) KT14/KT14モノクローナルAb 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(ix) 15D3ハイブリドーマ+ KT14/KT14、各1.5 mg、ならびに (x) 15D3ハイブリドーマ+ KT14/KT14、各1.5 mgおよび20 mg/kgパクリタキセル。抗体とパクリタキセルを週2回、連続2週間腹腔内投与した。抗体はパクリタキセル注射の少なくとも4時間前に注射した。パクリタキセル製剤：パクリタキセルは難溶性であるため、50 mg/mLのマスターストックを無水エタノール:Kolliphor (1:1) 中に調製した。注射前に、このストックをPBSで (1:16) の比率を維持しながら推奨用量の20 mg/kgに希釈した。
MES-SA/Dx5皮下腫瘍：腫瘍が100～150 mm3に達すると、マウスを、各5匹の10群にランダム化した: (i) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kg、(ii) 対照アイソタイプIgG1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(iii) KNJYBisP1.1 3 mg/kg、(iv) KNJYBisP1.1 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(v) 15D3ハイブリドーマモノクローナルAb 3 mg/kg、(vi) 15D3ハイブリドーマ3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(vii) KT14モノクローナルAb 3 mg/kg、(viii) KT14モノクローナルAb 3 mg/kgおよび20 mg/kgパクリタキセル、(ix) 15D3ハイブリドーマ+ KT14、各1.5 mg、ならびに (x) 15D3ハイブリドーマ+ KT14、各1.5 mgおよび20 mg/kgパクリタキセル。抗体とパクリタキセルを週2回、連続2週間腹腔内投与した。抗体はパクリタキセル注射の少なくとも4時間前に注射した。パクリタキセル製剤：パクリタキセルは難溶性であるため、50 mg/mLのマスターストックを無水エタノール:Kolliphor (1:1) 中に調製した。注射前に、このストックをPBSで (1:16) の比率を維持しながら推奨用量の20 mg/kgに希釈した。
図28は、KBisP1.1抗体が、インビボでパクリタキセルに対して多剤耐性A2780ADR細胞を化学療法増感させることを示す。KBisP1.1の化学療法増感効果は、抗MDR1 15D3ハイブリドーマ抗体（hybridoma）または抗CD47 KT14モノクローナル抗体のいずれと比較しても強かった。KNJYBisP1.1の化学療法増感効果は、15D3ハイブリドーマ+KT14モノクローナル抗体の同時注射に匹敵した。15D3ハイブリドーマおよびKT14モノクローナル抗体は両方とも、ex vivoでそれらそれぞれの標的への強い結合を示すが、KNJYBisP1.1は、15D3またはKT14モノクローナル抗体のいずれよりも効力が高い。
図29に示すように、KBisP1.1抗体は、in vivoで多剤耐性MES-SA/Dx5細胞をパクリタキセルに対して化学療法増感させる。KBisP1.1の化学療法増感効果は、15D3ハイブリドーマ（hybridoma）またはKT14モノクローナル抗体のいずれよりも強かった。パクリタキセルとの併用で、単一のKBisP1.1二重特異性抗体の化学療法増感効果は、15D3ハイブリドーマ+KT14モノクローナル抗体の同時注入併用に匹敵した。
図28～29、KBisP1.1抗体=KNJYBisP1.1；15D3ハイブリドーマ=抗MDR1モノクローナル抗体15D3；KT14/KT14=抗CD47モノクローナル抗体5F9。
単一の二重特異性抗体としてのKBisP1.1処置+パクリタキセルの効果は、2つの標的の高濃度を共発現する、通常なら抵抗性の腫瘍に、有効なパクリタキセルの荷重が蓄積することを示す、図6 Bに示されたin vitroの結果と合致する。KBisP1.1抗体は、両方の標的抗原を発現していない細胞には有意な結合を示さず（図4A参照）、したがって、個々のモノクローナル抗体と比較して、両方の標的抗原を発現する癌細胞を標的化することにおいてより高い特異性を提供する。
［実施例１０：インビボでの患者由来乳癌モデルCTG-2616におけるKBisP1.1の抗腫瘍効果］
材料と方法
細胞：CTG-2616は、ER+/Her2+原発性乳癌であり、乳房の再発性乳管腺癌を呈する患者に由来する。
マウス：5～6週齢の無胸腺ヌードFoxn 1 nu雌ヌードマウス (Envigo) を本研究に用いた。
接種―患者由来腫瘍の瞬間凍結片を解凍し、5x5x5 mmに切断し、麻酔した5～6週齢雌ヌードマウスに無菌状態で皮下注射した。腫瘍移植手順のために、移植部位に1～1.5 cmの切開を行い、鉗子を用いて腫瘍断片を移植した。十分なストック動物が1000~1500 mm3に達したら、事前試験動物への再移植のために腫瘍を採取した。事前試験動物の左側腹部に、ストック動物から採取した腫瘍断片を片側移植した。各動物は、特定の継代ロットから移植され、記録された。移植後7～10日から始めて、各実験について、事前試験腫瘍体積を記録した。腫瘍が平均腫瘍体積150～300 mm3に達した時点で、腫瘍体積により動物を投薬に使用するための処置群と対照群に割り付けて、第0日目から投与を開始した。すべての外科的処置は無菌状態で行われた。
用量―
CTG-2616皮下腫瘍：腫瘍が150～300 mm3の範囲内になったら、マウスを各3匹の3群にランダム化した― (i) 対照アイソタイプIgG1 (Bioxcell) 6 mg/kg+ビヒクル、(ii) 対照アイソタイプIgG1 6 mg/kgおよびパクリタキセル5 mg/kg、ならびに(iii) KNJYBisP1.1 6 mg/kgおよびパクリタキセル5 mg/kg。抗体とパクリタキセルを週2回、連続4週間にわたり腹腔内投与した。抗体は、パクリタキセル注射の少なくとも4時間前に注射した。パクリタキセル製剤：注射前に、ストックをPBSで推奨用量の5 mg/kgに希釈した。
前の実施例で記述されたように、腫瘍体積の測定が行われた。
図30は、インビボでKBisP1.1二重特異性抗体がパクリタキセル耐性CTG-2616患者由来乳房腫瘍を化学療法増感させ、腫瘍増殖阻害をもたらしたことを示す。KNJYBisP1.1はCTG-2616を有する動物で体重の変化を誘導しなかった。このように、KNJYBisP1.1二重特異性抗体は、パクリタキセルとの併用で、in vivoでパクリタキセル耐性Her2+ CTG-2616患者由来乳房腫瘍を化学療法増感させることにおいて有効である。
［実施例１１：PD-L1およびMDR-1に結合する二重特異性mAbの産生］
実施例1～8に記載したKBis1.1抗体の作製に用いた戦略を用いて、MDR-1およびPD-L1に同時に結合する二重特異性抗体を作製した。この抗体を本明細書中ではKBis2.1と称する。MDR1への抗原結合部位を有するMRK16抗体からの共通可変軽鎖 (VL) 、MDR1への抗原結合部位を有する15D3抗体からの第1の可変重鎖 (VH) 、およびPD-L1への抗原結合部位を有する第2のVH鎖を利用して、二重特異性抗体を作製した。MRK16 VL鎖および15D3 VH鎖は、KBis1.1抗体に用いたものと同じである。抗PD-L1抗体アテゾリズマブ（Atezolizumab）のVH鎖は、PD-L1に対する抗原結合部位を有する第2のVH鎖として機能した。この抗体は、15D3 HC::PD-L1 HC::MRK16 LCと呼ばれる。15D3 HCとMRK16 LCのヒト化（hmz）バージョンを用いたこの抗体のバリアントも構築した。この抗体は、15D3 HC Hz::PD-L1 HC::MRK16 LC Hzと称され得る。15D3 Hz0 VH鎖およびMRK16 Hz0 VL鎖を用いた。アテゾリズマブVH鎖は、MRK16 VL鎖と対合した場合、ELISAにより測定されるように、PD-L1への結合を維持する（データは示していない）。ELISAは、実施例1のCD47について記述した態様で実施した。さらに、KBisP1.1抗体からのデータから予想されたように、KBisP 2.1抗体の15D3 HC::MRK16 LCアームは、MDR1を過剰発現する293 T細胞を用いたFACSによって測定されるように、MDR1への結合を維持した（データは示していない）。MDR1結合のFACS測定は実施例1において記述したように実施した。このデータを図31にまとめた。
共通軽鎖の使用は、正確に対合した抗体の収率を増加させるだけでなく、例えば15D3モノクローナル抗体および抗PD-L1抗体アテゾリズマブにおけるように元々の対合したVH-VL抗体と比較して、抗体の各アームの標的に対する親和性を減少させる。この親和性の低下は、比較的低レベルで標的の1つのみを発現する正常細胞または低レベルで両方の標的を発現する正常細胞と比較して、MDR1およびPD-L1の少なくとも1つを高レベルで発現する癌細胞に対してKBis2.1抗体の特異性を増加させる。
KBis2.1抗体における15D3 VH鎖およびMRK16 VL鎖の配列は、前の実施例中にある。15D3重鎖およびMRK16軽鎖のキメラ化およびヒト化バージョンの両方を用いた。アテゾリズマブの重鎖は以下の配列を有する：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
重鎖のFc領域を変異させて電荷対置換「KK」を導入し、「DD」置換を有する15D3重鎖との対形成を促進した。DD置換はK392DおよびK409D置換を表し、KK置換はE356KおよびD399K置換を表す。アミノ酸置換の番号付けはHCについてのEU番号付けシステムによる。
Kabatの命名法に従って定義された抗PD-L1抗体アテゾリズマブのHCDR 1～3は以下のとおりである。
HCDR1: DSWIH
HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG
HCDR3: RHWPGGFDY
抗PD-L1抗体であるアテゾリズマブの軽鎖は、当該二重特異性抗体では使用されなかったが、完全性のために以下に配列を示す：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Kabatの命名法に従って定義されたLCDR 1～3は以下のとおりである。
LCDR1: RASQDVSTAVA
LCDR2: SASFLYS
LCDR3: QQYLYHPAT
PD-L1を過剰発現する293T細胞を用いて測定された抗PD-L1抗体アテゾリズマブのEC50は0.29 nMである。
［実施例１２：EGFRおよびMDR-1に結合する二重特異性mAbの生成］
［抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体バージョン1］
上述の実施例に記載されたKBis1.1抗体の生成に使用された戦略が、MDR-1およびEGFRに同時に結合する二重特異性抗体を生成するために利用された。
MDR1への抗原結合部位を有するMRK16抗体からの共通可変軽鎖 (VL) 、MDR1への抗原結合部位を有する15D3抗体からの第1の可変重鎖 (VH) 、およびEGFRへの抗原結合部位を有する第2のVH鎖を利用して、二重特異性抗体を作製した。MRK16 VL鎖および15D3 VH鎖は、本出願で記述されたものと同じである。抗EGFR抗体セツキシマブ（Cetuximab）またはネシツムマブ（Necitumumab）のVH鎖が、EGFRに対する抗原結合部位を有する第2のVH鎖として機能した。
本明細書に記載のELISAによって測定されたセツキシマブのKdは、0.05 nM～0.1 nMの範囲内である。EGFRを過剰発現する293T細胞を用いたFACSにより測定されたネシツムマブのEC 50は0.044 nMである。
二重特異性抗体には、重鎖および軽鎖の以下の組み合わせが含まれた：
i. 15D3 DD HC::セツキシマブKK HC::MRK16 LC
ii. 15D3 DD HC::ネシツムマブKK HC::MRK16 LC
略語「DD」および「KK」は、荷電対置換を表す。
15D3 DD HC::セツキシマブ KK HC::MRK16 LC抗体は、MDR1（MDR1を過剰発現する293T細胞を用いたFACSにより測定）およびEGFR（ELISAにより測定）への結合を維持していた。
15D3 DD HC::ネシツムマブ KK HC::MRK16 LC抗体は、MDR1（MDR1を過剰発現する293T細胞を用いたFACSにより測定）およびEGFR（EGFRを過剰発現する293T細胞を用いたFACSにより測定）への結合を維持していた。この抗体はELISAアッセイにおいて有意な結合を示さなかった。
VH鎖とVL鎖のさらなる組み合わせも試験した。抗MDR1抗体UIC2のVH鎖を15D3の代わりに用いて、二重特異性抗体を作製した。
UIC2 DD HC::セツキシマブKK HC::MRK16 LC。UIC2 VH配列は、本願の詳細な説明に提供されている。しかし、この抗体はMDR1に対して有意な結合を示さなかった。
これらのデータを図31にまとめた。
［抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体バージョン2］
抗MDR1 MRK16抗体のVH鎖および抗MDR1抗体15D3のVL鎖を、抗EGFR抗体セツキシマブのVH領域と組み合わせて試験し、抗体MRK16 DD HC::セツキシマブKK HC:15D3 LCを作製した。この抗体もまた、MDR1（MDR1を過剰発現する293T細胞を用いたFACSによって測定される）およびEGFR（ELISAによって測定される）への結合を維持した。
［抗MDR1抗EGFR二重特異性抗体バージョン3］
同じ抗MDR1抗体からのVHおよびVL領域を保持しながらセツキシマブVH領域と組み合わされた二重特異性抗体を作製した。
i. MRK16 DD HC::セツキシマブKK HC::MRK16 LC
ii. 15D3 DD HC::セツキシマブKK HC:15D3 LC
図31に要約されているように、15D3 DD HC::セツキシマブKK HC::15D3 LC抗体はMDR-1とEGFRの両方に結合する。MRK16 DD HC::セツキシマブKK HC::MRK16 LCもMDR-1とEGFRの両方に結合するが、EGFRへの結合は15D3 DD HC::セツキシマブKK HC::15D3 LC抗体と比べて親和性が低い。
UIC2 HC DD::EGFR HC KK::15D3 LC抗体も構築した。MRK16 LCをUIC HCと組み合わせた場合と同様に、この抗体もMDR1に結合することができなかった。図31参照。
二重特異性抗体における15D3 VH/VL鎖およびMRK16 VL/VH鎖の配列は、本願の詳細な説明中に提供されている。セツキシマブおよびネシツムマブの重鎖領域および軽鎖領域のアミノ酸配列を以下に示す。
セツキシマブ重鎖
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

HCDR1: NYGVH
HCDR2: VIWSGGNTDYNTPFTS
HCDR3: ALTYYDYEFAY
セツキシマブ軽鎖
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

LCDR1: RASQSIGTNIH
LCDR2: YASESIS
LCDR3: QQNNNWPTT
ネシツムマブ重鎖
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

HCDR1: SGDYYWS
HCDR2: YIYYSGSTDYNPSLKS
HCDR3: VSIFGVGTFDY
ネシツムマブ軽鎖
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

LCDR1: RASQSVSSYLA
LCDR2: DASNRAT
LCDR3: HQYGSTPLT
図31は、示された抗体のMDR1 (FACによって測定) またはTAA (ELISAまたはFACSによって測定) に対する結合を要約したものである。aCD47=抗CD47；aEGFR=抗EGFR；aPD-L1=抗PD-L1。
図31の「＋」はEC50が5 nM～700 nMの範囲にあったことを示し、図31の「±」はEC50が701 nM～900 nMの範囲にあったことを示し、図31の「－」はEC50が1000 nM超であったことを示している。
図32 A～32 Cは、列挙された抗体についてのMFI測定を示す：
ヒトIgG1抗体（「hIgG」）
抗EGFR抗体ネシツムマブ（「KT3-2」）
抗EGFR抗MDR1二重特異抗体：
15D3 KK HC ::セツキシマブDD HC :: 15D3 LC (“KT3QDD 15D3KK 15D3”);
MRK16 KK HC ::セツキシマブDD HC :: MRK16 LC (“KT3QDD MRK16KK MRK16”);
15D3 DD HC ::セツキシマブKK HC :: MRK16 LC (“KT3QKK 15D3DD MRK16”);
15D3 DD HC ::ネシツムマブKK HC :: MRK16 LC (“KT3-2KK 15D3DD 1MRK16”)
図32 Aは、MDR1を過剰発現する293T細胞に結合した各二重特異性抗体を示す。グラフ中KT3-2として示された抗EGFR抗体ネシツムマブは、陰性対照ヒトIgG1抗体と同様に、これらの細胞に対して有意な結合を示さなかった。
図32 Bは、各二重特異性抗体が、EGFRを過剰発現する293T細胞に、抗EGFR抗体ネシツムマブ「KT3-2」よりも有意に低い親和性で結合したことを示す。図32 Cは、≦400の範囲のMFIを示すY軸で、図32 Bに示された二重特異性抗体についての結合データを示す。293T細胞はEGFRを発現しない（図32 A参照）。EGFRを過剰発現する293T細胞は、検出可能なレベルまでEGFRを発現するが、そのEGFR発現は比較的低く、それは、これらの細胞に対する二重特異性抗体の低い親和性を説明する。対照的に、MDR1を過剰発現する293T細胞におけるMDR1の発現レベルは極めて高く、これは、EGFRの発現がない場合であっても二重特異性抗体が結合することを説明する。
二重特異性抗体について測定したEC50の要約を以下の表6～7に示す。これらの293細胞ベースのFACSアッセイにおいて、EC50は、最大応答(OD450) の半分を生じる抗体の濃度である。
表6：293T-B1OX細胞への抗MDR1抗EGFR二重特異性Ab結合
Figure 2022527860000008
表7：293T-EGFR OX細胞への抗MDR1抗EGFR二重特異性Ab結合
Figure 2022527860000009
［実施例１３：ヒト化5F9 VH領域を有する二重特異性抗MDR1抗CD47抗体の作製］
CDR移植のテンプレートとして使用するヒト抗体フレームワーク (FR) を選択するために、マウス5F9のVH領域をヒト生殖細胞系列配列のものと比較した。ヒト化5F9 VHを設計するための出発点として、ヒトVH5-51とVH7-4とVH3-23からのFRを最終的に選択した。
次に、ヒト化15D3 HC::5F9 HC::MRK16 LC二重特異的構築物を作製し、293T細胞および293T-CD47 KO細胞を用いたフローサイトメトリー分析によって調べた。5F9.huVH5および5F9.huVH3の両HCは、ヒト化MRK16 LCと対になって、CD47に結合することができる (データは図示せず) 。
前述の発明は、理解を明確にするために、図示および例によってある程度詳細に説明されてきたが、本発明の教示に照らして当業者には、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、一定の変更および修正を行うことができることは自ずと明らかである。
したがって、上記は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者は、本発明の原理を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を工夫することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載された全ての実施例および条件付き文言は、主に、本発明の原理および本技術を促進するために本発明者らによって貢献された概念を理解するうえで読者を助けることを意図しており、このような具体的に記載された実施例および条件への限定ではないものと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその特定の例を記載する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。さらに、このような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方を含み、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行するように開発されたあらゆる要素を含むことが意図される。さらに、本明細書に開示されているものには、そのような開示が特許請求の範囲に明示的に記載されているか否かにかかわらず、公衆に無条件供与されることを意図したものはない。
したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明される例示的実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。クレームにおいて、35 U.S.C.§112(f)又は35 U.S.C.§112(6)は、「～する手段」又は「～する工程」という正確な語句がクレームの限定において記載されている場合にのみ、クレームの限定のために援用されるものとして、明示的に定義する。そのような正確な語句がクレームの限定において使用されない場合は、35 U.S.C.§112(f)又は35 U.S.C.§112(6)は援用されない。

Claims (146)

  1. 多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子であって、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、
    ここで、前記VL鎖は、それぞれMDR1のための抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖は、MDR1のための抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記TAAのための抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記VL鎖の1つと対になった際に前記TAAに結合し、
    前記二重特異性抗体は、MDR1と前記TAAの両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/または前記TAAを発現する非癌細胞には低減された結合を示す、
    二重特異性抗体分子。
  2. 前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号１）
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含み、ここでX1はN、QまたはSである、請求項１に記載の二重特異性抗体分子。
  3. 前記2つのVL鎖が、以下の配列：
    (i) DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号2）；
    (ii) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK（配列番号3）；または
    (iii)
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK（配列番号4）
    を有するVL鎖のLCDR 1～3を含む、請求項２に記載の二重特異性抗体分子。
  4. (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGX1TYLE（配列番号5）を含み；
    (ii) LCDR2は配列KISNRFS（配列番号6）を含み；
    (iii) LCDR 3は配列FQASHFPRT（配列番号7）を含み、
    ここでX1はN、QまたはSである、
    請求項２または３に記載の二重特異性抗体分子であって、
  5. 前記2つのVL鎖がヒト化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  6. 前記2つのVL鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (配列番号8)；
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (配列番号3)；または
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK (配列番号4)。
  7. 前記2つのVL鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一である配列を含む、請求項６に記載の二重特異性抗体分子：
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (配列番号8)。
  8. 第1のVH鎖の前記抗原結合部位が、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号9)
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3 (HCDR 1～3) を含み、ここでX2はN、QまたはSである、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  9. 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    (i) EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号10)、または
    (ii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)、または
    (iii) EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
  10. (i) HCDR1は配列RYTMS (配列番号13)を含み；
    (ii) HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKG (配列番号14)を含み；
    (iii) HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含み；
    ここでX2はN、QまたはSである、請求項８または９に記載の二重特異性抗体分子。
  11. 前記第1および/または第2のVH鎖がヒト化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  12. 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号16)；
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)；または
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
  13. (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含みか、または
    (ii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLE (配列番号27) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (iii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKG (配列番号31) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (iv) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (v) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKG (配列番号31) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (vi) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLE (配列番号27) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (vii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKG (配列番号29) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (viii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLE (配列番号28) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含むか、または
    (ix) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号26) を含み、
    LCDR2は配列KISNRFS (配列番号6) を含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRT (配列番号7) を含み、
    HCDR1は配列RYTMS (配列番号13) を含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKG (配列番号30) を含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15) を含む、
    請求項２～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  14. 前記第2のVH鎖が、前記TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、前記軽鎖の1つと対になったときの前記二重特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性が、前記VH鎖が由来する前記単一特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性よりも少なくとも2倍低い、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  15. 前記TAAがCD47である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  16. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項15に記載の二重特異性抗体分子。
  17. 前記第2のVH鎖が、配列NYNMH (配列番号18)を含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKD (配列番号19)を含むHCDR2、および配列GGYRAMDY (配列番号20)を含むHCDR3を含む、請求項１５または１６に記載の二重特異性抗体分子。
  18. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５または１６に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)、
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号21)、
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号22)、または
    QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号)。
  19. 前記TAAがPD-L1である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  20. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項19に記載の二重特異性抗体分子。
  21. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列DSWIH（配列番号33）を含むHCDR1と、配列WISPYGGSTYYADSVKG（配列番号34）を含むHCDR2と、配列RHWPGGFDY（配列番号35）を含むHCDR3とを含む、請求項１９または２０に記載の二重特異性抗体分子。
  22. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)。
  23. 前記TAAがEGFRである、請求項１～１４のいずれか一項記載の二重特異性抗体分子。
  24. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項２３に記載の二重特異性抗体分子。
  25. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、請求項２３または２４に記載の二重特異性抗体分子。
  26. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)。
  27. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項２３に記載の二重特異性抗体分子。
  28. 前記第2のVH鎖が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、請求項２６または２７に記載の二重特異性抗体分子。
  29. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)。
  30. 前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む、請求項1に記載の二重特異性抗体分子。
  31. (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44)を含み；
    (ii) LCDR2は配列KISRLEA (配列番号45)を含み；
    (iii) LCDR3は配列FQGSHFPRT (配列番号46)を含む、
    請求項３０に記載の二重特異性抗体分子。
  32. 前記VL鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載の二重特異性抗体分子：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)。
  33. 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  34. (i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
    (ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
    (iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む、
    請求項33に記載の二重特異性抗体分子。
  35. 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA。
  36. 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号9)
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含み、ここでX2はN、Q、またはSである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  37. (i) HCDR1は配列RYTMS (配列番号13)を含み；
    (ii) HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKG (配列番号14)を含み；
    (iii) HCDR3は配列YGAGDAWFAY (配列番号15)を含み；
    ここでX2はN、Q、またはSである、請求項36に記載の二重特異性抗体分子。
  38. 前記第1のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、請求項３６または３７に記載の二重特異性抗体分子：
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号16)；
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号11)；または
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (配列番号12)。
  39. 前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA.
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  40. (i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
    (ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
    (iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む；
    請求項39に記載の二重特異性抗体分子。
  41. 前記第1のVH鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸を含む、請求項３９または４０に記載の二重特異性抗体分子：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA。
  42. 前記第2のVH鎖が、前記TAAに結合する単一特異性抗体分子に由来し、前記軽鎖の1つと対になった場合の前記二重特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性が、前記VH鎖が由来する前記単一特異性抗体分子の前記TAAに対する親和性よりも少なくとも2倍低い、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  43. 前記TAAがCD47である、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  44. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項４３に記載の二重特異性抗体分子。
  45. 前記第2のVH鎖が、配列NYNMH (配列番号18)を含むHCDR1と、配列TIYPGNDDTSYNQKFKD (配列番号19)を含むHCDR2と、配列GGYRAMDY (配列番号20)を含むHCDR3とを含む、請求項４４に記載の二重特異性抗体分子。
  46. 前記第2のVH鎖が、以下の配列、または以下の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４または４５に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号17)、
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYNMHWVRQAPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号21)、
    EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYNMHWVRQMPGKGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号22)、または
    QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTTVTVSS (配列番号23)。
  47. 前記TAAがPD-L1である、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  48. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項４７に記載の二重特異性抗体分子。
  49. 前記第2のVH鎖が、配列DSWIH (配列番号33)を含むHCDR1と、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34)を含むHCDR2と、配列RHWPGGFDY (配列番号35)を含むHCDR3とを含む、請求項４７または４８に記載の二重特異性抗体分子。
  50. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４８または４９に記載の二重特異性抗体分子：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)。
  51. 前記TAAがEGFRである、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  52. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項５１に記載の二重特異性抗体分子。
  53. 前記第2のVH鎖が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、請求項52に記載の二重特異性抗体分子。
  54. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５２または５３に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)。
  55. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項５１に記載の二重特異性抗体分子。
  56. 前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、請求項５２に記載の二重特異性抗体分子。
  57. 前記第2のVH鎖が、以下のアミノ酸配列、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５２または５３に記載の二重特異性抗体分子：
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)。
  58. 前記抗体が、MDR1またはTAAのいずれかを発現する細胞と比較して、MDR1およびTAAの両方を発現する細胞に対して2倍超の親和性を有する、請求項１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  59. 前記抗体が、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させることができ、ここで、前記抗体と共投与された場合の前記化学療法剤の半値最大阻害濃度（IC50）は、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (配列番号24)
    を有するVH鎖と；
    以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有するVL鎖と
    を含む抗MDR1抗体15D3と共投与された場合の前記化学療法剤のIC50より少なくとも2倍低い、請求項１～５８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  60. 前記癌細胞がNALM6 ADR細胞であり、任意で、前記化学療法剤がパクリタキセル、コルヒチン、ベラパミル、ビンブラスチン、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドまたはニロチニブを含む、請求項59に記載の二重特異性抗体分子。
  61. 前記抗体が、MDR1を発現する細胞に結合した場合に、MDR1による排出を阻害する、請求項１～６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  62. 前記抗体が、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (配列番号24)
    を有するVH鎖と；
    以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有するVL鎖と
    を含む抗MDR1抗体15D3よりも少なくとも2倍低い親和性でMDR1に結合する、請求項１～６１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  63. 前記抗体が、1つ以上のFcγ受容体への抗体の結合を低減または消失させるように改変されたFcドメインを含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
  64. 対象における癌を治療する方法における使用するための、請求項１～６３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子であって、前記方法は前記抗体を前記対象に投与することを含む、二重特異性抗体分子。
  65. 前記方法が、前記抗体を少なくとも一つのさらなる活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも一つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６４に記載の二重特異性抗体分子。
  66. 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、請求項６５に記載の二重特異性抗体分子。
  67. 対象において癌を治療する方法で使用するための化学療法剤であって、前記方法は、請求項１～６３のいずれか一項に記載の抗体と組み合わせて前記化学療法剤を対象に投与することを含み、任意で、前記化学療法剤はタキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、化学療法剤。
  68. 治療される対象が、前記化学療法剤に対して耐性であると決定された癌を有する対象である、請求項６７に記載の使用のための二重特異性抗体分子。
  69. 癌について対象を治療する方法であって、請求項１～６３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  70. 前記方法が、前記二重特異性抗体分子を、少なくとも一つのさらなる活性剤と組み合わせて投与することを含み、前記少なくとも一つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、請求項７０に記載の方法。
  72. 治療される対象が、前記化学療法剤による治療に対して抵抗性であると決定された癌を有する対象であり、任意で、前記化学療法剤は、パクリタキセル、コルヒチン、ベラパミル、ビンブラスチン、トポテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシドまたはニロチニブを含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有するVL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含み、ここでX1はN、QまたはSである、可変軽（VL）鎖と、
    以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含み、ここでX2はN、QまたはSである、可変重（VH）鎖と
    を含むか、または、
    以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有するVL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と、
    以下の配列：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
    を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
    を含む、
    抗体。
  74. 前記VL鎖は、以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
    前記VH鎖は、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖のHCDR 1～3を含むか、または、
    前記VL鎖は、以下の配列：
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGQTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
    を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
    前記VH鎖は、以下の配列：
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖のHCDR 1～3を含むか、または、
    前記VL鎖は、以下の配列：
    DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSTGSTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASHFPRTFGQGTKLEIK
    を有するVL鎖のLCDR 1～3を含み；
    前記VH鎖は、以下の配列：
    EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS.
    を有するVH鎖のLCDR 1～3を含む、
    請求項７３に記載の抗体。
  75. 前記LCDR1は、配列RSSQSIVHSTGNTYLE、RSSQSIVHSTGQTYLE、またはRSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
    前記LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    前記LCDR3は配列FQASHFPRTを含む、
    請求項７４に記載の抗体。
  76. (i) 前記HCDR1は配列RYTMSを含み；
    (ii) 前記HCDR2は配列TISSGGG X2TYYPDSVKGを含み；
    (iii) 前記HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含み;
    ここでX2はN、QまたはSである、
    請求項７５に記載の抗体。
  77. (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (ii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (iii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (iv) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (v) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGSTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (vi) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGQTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (vii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (viii) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGSTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含むか、または
    (ix) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLEを含み、
    LCDR2は配列KISNRFSを含み、
    LCDR3は配列FQASHFPRTを含み、
    HCDR1は配列RYTMSを含み、
    HCDR2は配列TISSGGGQTYYPDSVKGを含み、
    HCDR3は配列YGAGDAWFAYを含む、
    請求項７４または７５に記載の抗体。
  78. 前記抗体のVL鎖は、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    前記抗体のVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    請求項７３～７７のいずれか一項に記載の抗体。
  79. 前記抗体が、以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と；
    以下の配列：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
    を含む、請求項７３に記載の抗体。
  80. (i) LCDR1は配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44) を含み；
    (ii) LCDR2は配列KISRLEA (配列番号45) を含み；
    (iii) LCDR3は配列FQGSHFPRT (配列番号46) を含み；
    (i) HCDR1は配列SYTMSを含み；
    (ii) HCDR2は配列TISSGGGNTYYPDSVKGを含み；
    (iii) HCDR3は配列YYRYEAWFASを含む、
    請求項７９に記載の抗体。
  81. 前記抗体のVL鎖が、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)；
    前記抗体のVH鎖が、以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む：
    EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA；
    請求項７９または８０に記載の抗体。
  82. 前記抗体は、MDR-1に特異的に結合する単特異性二価抗体である、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の抗体。
  83. 前記抗体は、共通の軽鎖として前記VL鎖を含む二重特異性抗体である、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の抗体。
  84. 前記二重特異性抗体が、MDR-1結合ドメインおよび腫瘍関連抗原（TAA）結合ドメインを含み、ここで、MDR-1結合ドメインおよびTAA結合ドメインのそれぞれが、前記VL鎖のLCDR 1～3を含む、請求項８３に記載の抗体。
  85. 前記TAAがCD47であり、前記TAA結合ドメインが、以下の配列：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項８４に記載の抗体。
  86. 前記CD47結合ドメインのVH鎖が、配列NYNMHを含むHCDR1と、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2と、配列GGYRAMDYを含むHCDR3とを含む、請求項８５に記載の抗体。
  87. 前記TAAがPD-L1であり、PD-L1結合ドメインが、以下の配列：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)
    を有するVH鎖のHCDR 1～3を含む、請求項８４に記載の抗体。
  88. 前記PD-L1結合ドメインのVH鎖が、配列DSWIH (配列番号33)を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34)を含むHCDR2、および配列RHWPGGFDY (配列番号35)を含むHCDR3を含む、請求項８７に記載の抗体。
  89. 前記TAAがEGFRであり、EGFR結合ドメインが、以下の配列：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)
    を有するVH鎖のHCDRを含む、請求項８４に記載の抗体。
  90. 前記EGFR結合ドメインのVH鎖が、配列SGDYYWS (配列番号37)を含むHCDR1と、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2と、配列VSIFGVGTFDY (配列番号39)を含むHCDR3とを含む、請求項８９に記載の抗体。
  91. 前記TAAがEGFRであり、EGFR結合ドメインが、以下の配列：
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
    を有するVH鎖のHCDRを含む、請求項８４に記載の抗体。
  92. 前記EGFR結合ドメインのVH鎖が、配列NYGVH (配列番号41)を含むHCDR1と、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42)を含むHCDR2と、配列ALTYYDYEFAY (配列番号43)を含むHCDR3とを含む、請求項９１に記載の抗体。
  93. 以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有し、ここでX1はN、QまたはSであるか、または以下の配列：
    DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (配列番号25)
    を有する、VL鎖の軽鎖CDR（LCDR）を含む可変軽（VL）鎖と；
    以下の配列：
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS；または
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS (配列番号32)；または
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS (配列番号36)；または
    QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号40)
    を有するVH鎖の重鎖CDR（HCDR）を含む可変重（VH）鎖と
    を含む、抗体。
  94. 前記VL鎖が、 (i) 配列RSSQSIVHSTGX1TYLE (配列番号5)を含むLCDR1と；(ii) 配列KISNRFS (配列番号6)を含むLCDR2と；(iii) 配列FQASHFPRT (配列番号7)を含むLCDR3とを含み、ここでX1はN、QまたはSであり、
    前記VH鎖が、
    (i) 配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列GGYRAMDYを含むHCDR3；または
    (ii) 配列DSWIH (配列番号33) を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34) を含むHCDR2、および配列RHWPGGFDY (配列番号35) を含むHCDR3；または
    (iii) 配列SGDYYWS (配列番号37) を含むHCDR1、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38)を含むHCDR2、および配列VSIFGVGTFDY (配列番号39) を含むHCDR3；または
    (iv) 配列NYGVH (配列番号41) を含むHCDR1、配列VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42) を含むHCDR2、および配列ALTYYDYEFAY (配列番号43) を含むHCDR3
    を含む、請求項９３に記載の抗体。
  95. 前記VL鎖が、(i)配列RSSQSIVHSTGNTYLE (配列番号44)を含むLCDR1と；(ii)配列KISRLEA (配列番号45) を含むLCDR2と；(iii)配列FQGSHFPRT (配列番号46) を含むLCDR3とを含み；
    前記VH鎖が、
    配列NYNMHを含むHCDR1、配列TIYPGNDDTSYNQKFKDを含むHCDR2、および配列 GGYRAMDYを含むHCDR3；または
    配列DSWIH (配列番号33) を含むHCDR1、配列WISPYGGSTYYADSVKG (配列番号34) を含むHCDR2、および配列 RHWPGGFDY (配列番号35) を含むHCDR3；または
    配列SGDYYWS (配列番号37) を含むHCDR1、配列YIYYSGSTDYNPSLKS (配列番号38) を含むHCDR2、および配列 VSIFGVGTFDY (配列番号39) を含むHCDR3；または
    配列 NYGVH (配列番号41) を含むHCDR1、配列 VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号42) を含むHCDR2、および配列 ALTYYDYEFAY (配列番号43) を含むHCDR3
    を含む、請求項９３に記載の抗体。
  96. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項９３～９５のいずれか一項記載の抗体。
  97. 前記抗体が、ヒト化抗体、またはヒトFcドメインを含むキメラ抗体である、請求項１～９６のいずれか一項に記載の抗体。
  98. 免疫グロブリンG1（IgG1）Fcドメインを含む、請求項９７に記載の抗体。
  99. 第1のVH鎖が第1のFcドメインに融合され、第2のVH鎖が第2のFcドメインに融合されている、請求項１～９８のいずれか一項に記載の抗体。
  100. 前記Fcドメインが、前記第1および第2のVH鎖を含むヘテロ二量体を優先的に形成する改変CH3ドメインを含む、請求項９９に記載の抗体。
  101. 前記第1および第2のFcドメインが、ヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fcドメインである、請求項１００に記載の抗体。
  102. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載の抗体と、
    薬学的に許容される賦形剤と
    を含む、医薬組成物。
  103. 少なくとも一つのさらなる活性剤をさらに含む、請求項１０２に記載の医薬組成物。
  104. 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  105. 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、請求項１０４に記載の医薬組成物。
  106. 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  107. 前記少なくとも一つのさらなる活性剤が免疫療法剤を含む、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  108. 前記請求項のいずれかに記載の抗体をコードする1つまたは複数の配列を含む、1つまたは複数の核酸。
  109. 前記1つまたは複数の配列がプロモーターに動作可能に連結されている、請求項１０８に記載の一以上の核酸。
  110. 請求項１０８または１０９に記載の1つまたは複数の核酸を含む、1つまたは複数の組換え発現ベクター。
  111. 請求項１１０に記載の1つまたは複数の組換え発現ベクターで遺伝子組換えされた、哺乳動物細胞。
  112. 前記細胞が免疫細胞である、請求項１１１に記載の細胞。
  113. 請求項１～６３および７３～１０１のいずれかに記載の抗体またはそれをコードする核酸と、
    少なくとも1つのさらなる活性剤と
    を含むキット。
  114. 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１３に記載のキット。
  115. 癌細胞を殺傷する方法であって、請求項１～６３および７３～１０１のいずれか一項に記載の抗体に癌細胞を接触させることを含む、方法。
  116. 少なくとも1つのさらなる活性剤を投与することを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記方法が、前記少なくとも1つのさらなる活性剤単独と接触させることと比較して、前記癌細胞の殺傷を少なくとも5%増加させる、請求項１１６または１１７に記載の方法。
  119. 前記癌細胞が薬剤耐性癌細胞である、請求項１１５～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 癌について対象を治療する方法であって、前記方法は、請求項１～６３および７３～１０１のいずれか一項に記載の抗体または請求項１０２～１０７のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  121. 前記対象が、前記癌について以前に治療されている対象である、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記癌が薬物耐性または多剤耐性である、請求項１２０または１２１に記載の方法。
  123. 前記癌が化学療法剤に対して耐性である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記癌が免疫療法剤に対して耐性である、請求項１２２に記載の方法。
  125. 前記癌が多剤耐性トランスポーターの阻害剤に対して耐性である、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  126. 少なくとも1つのさらなる活性剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１２０～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が化学療法剤を含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記化学療法剤が、タキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が多剤耐性トランスポーターの阻害剤を含む、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記少なくとも1つのさらなる活性剤が免疫療法剤を含む、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記方法が、前記少なくとも1つのさらなる活性剤単独での処置と比較して、前記少なくとも1つのさらなる活性剤の有効性を増加させる、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記増加した有効性が、癌細胞殺傷における少なくとも5%の増加を含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記癌が、所定の閾値を超えるMDR1、所定の閾値を超える腫瘍関連抗原 (TAA) 、またはその両方を発現するか否かを決定するために、前記癌の試料を分析することをさらに含み、ここで、任意で前記TAAはCD47を含む、請求項１２０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記所定の閾値は、参照細胞によって発現されるMDR1および/またはTAAのレベルに対応する、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記参照細胞においてMDR1および/またはTAAはノックアウトまたはノックダウンされている、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記参照細胞が非癌性細胞である、請求項１３４または１３５に記載の方法。
  137. 前記非癌性細胞が、正常レベルのMDR1および/またはTAAを発現する、請求項１３４に記載の方法。
  138. 癌が所定の閾値以上でMDR1およびTAAを発現する場合は、前記対象に前記多特異性抗体を投与し、癌が前記所定の閾値未満でMDR1またはTAAを発現する場合は、前記対象に前記多特異性抗体を投与せずに従来の治療を行う、請求項１２０～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 多剤耐性タンパク質1 (MDR1) および腫瘍関連抗原 (TAA) の両方を発現する細胞に特異的に結合する多特異性抗体を作製する方法であって、任意で前記TAAはCD47、PD-L1、またはEGFRを含み、前記方法は、
    MDR1結合ドメインおよびTAA結合ドメインを含む多特異性抗体を産生すること；
    MDR1およびTAAを発現する第1の細胞を多特異性抗体に接触させること；
    MDR1またはTAAのいずれかを発現する第2の細胞に多特異性抗体を接触させること；
    前記第1の細胞への多特異性抗体の結合を、前記第2の細胞への多特異性抗体の結合と比較して、結合特異性比を決定すること；および
    前記比が所定の閾値を超える場合に、その多特異性抗体がMDR1およびTAAの両方を発現する細胞に対して特異的であるとして同定すること
    を含む、方法。
  140. 前記所定の閾値は、2:1より大きい、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記第2の細胞はMDR1を発現してTAAを発現せず、前記方法は、TAAを発現するがMDR1を発現しない第3の細胞を多重特異性抗体に接触させることをさらに含む、請求項１３９または１４０に記載の方法。
  142. 前記方法が、前記第1の細胞、前記第2の細胞、および/または前記第3の細胞を、単一特異性抗MDR1抗体および単一特異性抗TAA抗体から選択される対照抗体に接触させることをさらに含む、請求項１３９または１４０に記載の方法。
  143. 遺伝子組換えヒト細胞株であって、前記細胞株は腫瘍関連抗原 (TAA) を発現し、任意で前記TAAは白血球表面抗原CD47を含み、MDR1の過剰発現のために多剤耐性タンパク質1 (MDR1) をコードする配列を含む外因性核酸を含む、細胞株。
  144. 前記細胞株が腎臓細胞株である、請求項１４３に記載の細胞系。
  145. 前記細胞株がHEK 293T細胞株である、請求項１４４に記載の細胞株。
  146. 請求項１４３～１４５のいずれか一項に記載の細胞株を作製する方法であって、
    前記TAAを発現するヒト細胞を、外因性核酸を細胞に導入するのに十分な条件下で前記外因性核酸と接触させて、前記TAAを発現しかつMDR1を安定して過剰発現する遺伝子組換えヒト細胞を産生すること；および
    前記TAAを発現しかつMDR1を安定して過剰発現する遺伝子組換えヒト細胞株を産生するのに十分な条件下で、前記遺伝子組換えヒト細胞を培養すること
    を含む、方法。

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023512196A (ja) * 2020-01-29 2023-03-24 ケンジョッケティ バイオテクノロジー，インク． 抗ｍｄｒ１抗体およびその使用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112656941A (zh) * 2021-01-20 2021-04-16 福建医科大学附属协和医院 抗cd47单克隆抗体在制备抗阿霉素耐药的急性淋巴细胞白血病细胞的药物中应用
US20250051471A1 (en) * 2021-12-13 2025-02-13 William Robert Arathoon Living Trust Dated August 29, 2016 Anti-Abcb1 Antibodies
WO2023159220A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Kenjockety Biotechnology, Inc. Anti-cd47 antibodies
KR20250044267A (ko) * 2022-07-28 2025-03-31 선전 엔듀어링 바이오테크 리미티드 Peg 기반 항-cd47/항-pd-l1 이중특이적 항체-약물 접합체
WO2024130249A2 (en) * 2022-12-16 2024-06-20 Washington University Compositions and methods of treatment for neuroinflammation-related disorders

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03254691A (ja) * 1990-03-02 1991-11-13 Japan Found Cancer Res 薬剤耐性癌に対するキメラ抗体およびその製造
US5948647A (en) * 1990-10-29 1999-09-07 Chiron Corporation Nucleic acids encoding antigen-binding sites specific for cancer antigens
WO2006108070A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Cedars-Sinai Medical Center Inhibition of p-glycoprotein using act modulators and uic2 monoclonal antibody
JP2013534409A (ja) * 2010-05-14 2013-09-05 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ Ｃｄ４７に対するヒト化及びキメラモノクローナル抗体
EP3243840A1 (en) * 2015-01-08 2017-11-15 Suzhou Alphamab Co., Ltd Bispecific antibody or antibody mixture with common light chains

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
WO1992008802A1 (en) 1990-10-29 1992-05-29 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
US5849877A (en) 1990-10-29 1998-12-15 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
TW197439B (ja) 1991-04-04 1993-01-01 Ueno Pharmaceutics Applic Res Co Ltd
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
US5283253A (en) 1991-09-23 1994-02-01 Florida State University Furyl or thienyl carbonyl substituted taxanes and pharmaceutical compositions containing them
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
WO1993010076A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 The University Of Mississippi Synthesis and optical resolution of the taxol side chain and related compounds
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
EP0642586A4 (en) 1992-05-21 1995-11-29 Penn State Res Found CULTURAL -i (TAXUS) FABRIC AS A SOURCE OF TAXOL, RELATED TAXANS AND OTHER NEW ANTI-TUMOR / ANTI-VIRAL SUBSTANCES (01/20/94).
US5274137A (en) 1992-06-23 1993-12-28 Nicolaou K C Intermediates for preparation of taxols
US5294637A (en) 1992-07-01 1994-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Fluoro taxols
US5202448A (en) 1992-08-14 1993-04-13 Napro Biotherapeutics, Inc. Processes of converting taxanes into baccatin III
CA2100808A1 (en) 1992-10-01 1994-04-02 Vittorio Farina Deoxy paclitaxels
FR2696458B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation de dérivés du taxane.
FR2696461B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux dérivés d'analogues du taxol, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
FR2696462B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696464B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveau procédé d'estérification de la baccatine III et de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696463B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
US5279949A (en) 1992-12-07 1994-01-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from Taxus spp
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US5824701A (en) 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
ES2328585T3 (es) 1993-10-25 2009-11-16 Canji, Inc. Vector de adenovirus recombinante y metodo de utilizacion.
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
WO1998008833A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Bristol-Myers Squibb Company Sulfenamide taxane derivatives
CA2264227A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Raymond A. Firestone Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
WO1998022451A1 (fr) 1996-11-19 1998-05-28 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Derives taxol
US5977386A (en) 1996-12-24 1999-11-02 Bristol-Myers Squibb Company 6-thio-substituted paclitaxels
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
WO1998058927A1 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Baker Norton Pharmaceuticals, Inc. Soluble prodrugs of paclitaxel
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
JPH1192468A (ja) 1997-09-17 1999-04-06 Yakult Honsha Co Ltd 新規なタキサン誘導体
DE69729128T2 (de) 1997-10-08 2005-04-28 Bio Research Corporation Of Yokohama, Yokohama Taxoid-derivate und verfahren zu ihrer herstellung
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
HRP20201404T1 (hr) * 2013-07-16 2020-11-27 F. Hoffmann - La Roche Ag Postupci liječenja raka primjenom pd-1 osno vezujućeg antagonista i inhibitora tigita

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03254691A (ja) * 1990-03-02 1991-11-13 Japan Found Cancer Res 薬剤耐性癌に対するキメラ抗体およびその製造
US5948647A (en) * 1990-10-29 1999-09-07 Chiron Corporation Nucleic acids encoding antigen-binding sites specific for cancer antigens
WO2006108070A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Cedars-Sinai Medical Center Inhibition of p-glycoprotein using act modulators and uic2 monoclonal antibody
JP2013534409A (ja) * 2010-05-14 2013-09-05 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ Ｃｄ４７に対するヒト化及びキメラモノクローナル抗体
EP3243840A1 (en) * 2015-01-08 2017-11-15 Suzhou Alphamab Co., Ltd Bispecific antibody or antibody mixture with common light chains

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRONT ONCOL., vol. 8, JPN6024020196, 2018, pages 152 - 1, ISSN: 0005474391 *
HIROTAKE SHIRAIWA; ET AL: "ENGINEERING A BISPECIFIC ANTIBODY WITH A COMMON LIGHT CHAIN: IDENTIFICATION AND OPTIMIZATION OF AN A", METHODS, vol. 154, JPN5022007697, February 2019 (2019-02-01), NL, pages 10 - 20, XP055715064, ISSN: 0005474388, DOI: 10.1016/j.ymeth.2018.10.005 *
JANET JACKMAN; ET AL: "DEVELOPMENT OF A TWO-PART STRATEGY TO IDENTIFY A THERAPEUTIC HUMAN BISPECIFIC ANTIBODY THAT INHIBITS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. VOL:285, NR:27, JPN5022007696, 2 July 2010 (2010-07-02), pages 20850 - 20859, ISSN: 0005474387 *
MAURIZIO CIANFRIGLIA: "THE BIOLOGY OF MDR1-P-GLYCOPROTEIN (MDR1-PGP) IN DESIGNING FUNCTIONAL ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADCS", ANNALI DELL'ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA, vol. VOL:49, NR:2, JPN5022007695, 2013, pages 150 - 168, XP055715361, ISSN: 0005474392, DOI: 10.4415/ANN_13_02_07 *
SIMON KRAH; ET AL: "GENERATION OF HUMAN BISPECIFIC COMMON LIGHT CHAIN ANTIBODIES BY COMBINING ANIMAL IMMUNIZATION AND YE", PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION, vol. VOL:30, NR:4, JPN5022007698, 5 January 2017 (2017-01-05), GB, pages 291 - 301, ISSN: 0005474389 *
THOMAS VAN BLARCOM; ET AL: "PRODUCTIVE COMMON LIGHT CHAIN LIBRARIES YIELD DIVERSE PANELS OF HIGH AFFINITY BISPECIFIC ANTIBODIES", MABS, vol. VOL:10, NR:2, JPN5022007699, 14 December 2017 (2017-12-14), US, pages 256 - 268, ISSN: 0005474390 *
Y GAO; ET AL: "EFFICIENT INHIBITION OF MULTIDRUG-RESISTANT HUMAN TUMORS WITH A RECOMBINANT BISPECIFIC ANTI-P-GLYCOP", LEUKEMIA, vol. VOL:18, NR:3, JPN5022007694, March 2004 (2004-03-01), pages 513 - 520, ISSN: 0005474386 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023512196A (ja) * 2020-01-29 2023-03-24 ケンジョッケティ バイオテクノロジー，インク． 抗ｍｄｒ１抗体およびその使用

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