JP2022520791A - マンノースの酵素的生産 - Google Patents

Abstract

マンノースを生産する製法にて以前に使用されるＭ６ＰＰと比較した場合、より高い活性を有する酵素を使用して、Ｍ６ＰＰによって触媒され、Ｍ６Ｐをマンノースに変換する工程を含む、マンノースを作製するための向上した製法を本明細書において開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月１２日に出願された米国特許出願番号第６２／８０４，４２６号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、Ｄ－マンノース生産に生物学的に関係する分野に関する。より詳細には、本発明は、糖類（例えば、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、スクロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース）をＤ－マンノースに酵素的に変換可能である、向上したＤ－マンノース調製方法を提供する。

Ｄ－マンノース（以後、マンノースとする）は、多くの果物、野菜、植物、さらには人体に見られる、ほのかに甘く天然に存在する単糖である。マンノースは、複数の健康上の恩恵および医薬用途を有する。例えば、マンノースは１ｂ型先天性グリコシル化異常症、さらに一般には尿路感染症を処置するのに使用され得る。さらには、マンノースは実証済みのプレバイオティクスであり、これは血糖値を上昇させず、抗炎症性を示す。加えて、マンノースはブタにおける屠体収量を増加させることを示し、スキンケア製品用に広範に使用される補助的な保湿剤である。同様に、マンノースは医薬製品、化粧品、消費物（飲料、食品、日用品、菓子など）および畜産にて様々な用途を有する。ただし、マンノースは価格が高いことから、日用品でのその使用が限定されている。

現在、マンノースは植物からの抽出物から主に生産される。一般的な方法としては、酸加水分解、熱加水分解、酵素的加水分解、微生物発酵加水分解およびそれらの混合が挙げられる。あまり一般的ではない方法としては、化学的転換および生物学的転換が挙げられる。概して、これらの方法は厳しい条件、高額な初期費用、さらに高額な原料コスト、異性化反応からのマンノースの分離の高額さおよび比較的低い生成物の収率（１５～３５％）に悩まされている。

製法の少なくとも１つの工程がエネルギー的に有利な化学反応に関わる、高収率のマンノース生産を目的としたコスト的に有効な合成経路を開発する必要がある。さらには、製法の工程を１つのタンクまたはバイオリアクタ内で実行可能である生産製法の必要がある。リン酸が再利用可能であり、かつ／または製法がリン酸源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を用いる必要がない場合、比較的低濃度のリン酸で実行可能であるマンノース生産製法の必要もある。反応工程のいずれかにおいて、高価なニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））補酵素を使用する必要がないマンノース生産経路の必要もある。

国際特許出願公開第２０１８／１６９９５７号は、マンノース６－リン酸ホスファターゼによって触媒され、マンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）をマンノースに変換することを含む製法におけるＤ－マンノースの酵素的合成について記述している。ただし、酵素的マンノース生産において向上していても、例えば酵素の量を低下させた状態でより高収率をもたらすことが可能である、さらに向上したマンノース生産製法を提供するための要求および必要が未だ存在する。マンノース生産コストの減少といった点における産業的かつ商業的な強い関心が存在しているが、この減少は酵素量を減らしての使用およびより効果的な酵素の組合せの使用に関与している。

一態様において、本発明は、糖類（例えば、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、スクロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース）をＤ－マンノースに酵素的に変換可能である、向上したＤ－マンノース調製方法を提供する。糖からマンノースを生産するための本発明の向上した製法は、マンノース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）によって触媒され、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）をマンノースに変換する工程を含む。このＭ６ＰＰは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明のいくつかの製法において、マンノースは、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、マンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に変換する工程を有する製法において調製され、この場合、この工程はマンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）によって触媒される。いくつかの態様において、この製法はグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換することを含み、この場合、この工程はホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。さらなる態様において、Ｇ６Ｐは、二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）といった１つの酵素により、Ｆ６Ｐ、次いでＭ６Ｐに変換される。他の態様において、マンノース合成の製法は、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換する工程も含み、この変換工程はホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。

該製法のうちいずれかで使用される糖類は、デンプンまたはその誘導体、セルロースまたはその誘導体、およびスクロースからなる群から選択され得る。デンプンまたはその誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトースまたはグルコースであり得る。本発明の向上したいくつかの製法において、マンノースを調製する製法は、デンプンの酵素的加水分解によって、またはデンプンの酸加水分解によって、デンプンをデンプン誘導体に変換することに関与する。他の製法において、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼ、またはこれらの酵素のうち２つまたは複数の組合せによって触媒される、デンプンの酵素的加水分解によって調製される。本発明のいくつかの製法は、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を加えることに追加で関与し得る。

マンノースを調製するための本発明の他の製法は、少なくとも１種類の酵素によって触媒される、フルクトースをＦ６Ｐに変換する工程をさらに含む。本発明の他の製法は、少なくとも１種類の酵素によって触媒される、スクロースをフルクトースに変換する工程を含む。マンノースを調製する製法で使用されることになるＧ６Ｐはまた、少なくとも１種類の酵素によって触媒される、グルコースをＧ６Ｐに変換することにより生成され得る。続いてグルコースは、スクロースをグルコースに変換することにより生産され得、これは少なくとも１種類の酵素によって触媒される。

本発明の製法は、約３７℃～約８５℃の範囲である温度で、約５．０～約９．０の範囲であるｐＨで、かつ／または約１時間～約４８時間にわたって、または連続反応として実行される。いくつかの実施形態において、マンノースを調製する製法の工程は、１つのバイオリアクタで実行される。他の態様において、該工程は連続して配置された複数のバイオリアクタで実行される。

本発明のいくつかの製法において、マンノースを調製する工程は、ＡＴＰなしで、ＮＡＤ（Ｈ）なしで、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で実行され、リン酸は再利用され、かつ／またはＭ６Ｐをマンノースに変換する工程は、エネルギー的に有利な化学反応に関与する。

デンプンまたはその誘導された生成物をマンノースに変換する酵素的経路を示す概略図である。以下の略語が使用される。すなわち、αＧＰはα－グルカンホスホリラーゼまたはデンプンホスホリラーゼ；ＰＧＭはホスホグルコムターゼ；ＰＧＩはホスホグルコイソメラーゼ；ＰＧＰＭＩは二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ；Ｍ６ＰＩはマンノース６－リン酸イソメラーゼ；Ｍ６ＰＰはマンノース６－リン酸ホスファターゼ；ＩＡはイソアミラーゼ；ＰＡはプルラナーゼ；ＭＰはマルトースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫはポリリン酸グルコキナーゼ；およびＰ_ｉはリン酸である。本発明による製法においては、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

セルロースまたはその誘導された生成物をマンノースに変換する酵素的経路を示す。以下の略語が使用される。すなわち、ＣＤＰはセロデキストリンホスホリラーゼ；ＣＢＰはセロビオースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫはポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＭはホスホグルコムターゼ；ＰＧＩはホスホグルコイソメラーゼ；ＰＧＰＭＩは二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ；Ｍ６ＰＩはマンノース６－リン酸イソメラーゼ；Ｍ６ＰＰはマンノース６－リン酸ホスファターゼ；およびＰ_ｉはリン酸である。本発明による製法においては、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

フルクトースをマンノースに変換する酵素的経路を示す概略図である。ＰＰＦＫはポリリン酸フルクトキナーゼ；Ｍ６ＰＩはマンノース６－リン酸イソメラーゼ、Ｍ６ＰＰはマンノース６－リン酸ホスファターゼ；およびＰ_ｉはリン酸である。本発明による製法においては、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

グルコースをマンノースに変換する酵素的経路を示す概略図である。ＰＰＧＫはポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＩはホスホグルコイソメラーゼ；ＰＧＰＭＩは二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ；Ｍ６ＰＩはマンノース６－リン酸イソメラーゼ；Ｍ６ＰＰはマンノース６－リン酸ホスファターゼ；およびＰ_ｉはリン酸である。本発明による製法においては、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

スクロースまたはその誘導された生成物をマンノースに変換する酵素的経路を示す。ＳＰはスクロースホスホリラーゼ；ＰＰＦＫはポリリン酸フルクトキナーゼ；ＰＧＭはホスホグルコムターゼ；ＰＧＩはホスホグルコイソメラーゼ；ＰＧＰＭＩは二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ；Ｍ６ＰＩはマンノース６－リン酸イソメラーゼ；Ｍ６ＰＰはマンノース６－リン酸ホスファターゼ；およびＰ_ｉはリン酸である。本発明による製法においては、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

グルコース１－リン酸をマンノースに変換するためのギブズエネルギーの形成に基づく中間体間の反応ギブズエネルギーを示す。

例１に記載されるようにＨＰＬＣクロマトグラムにより計測されるＧ１Ｐのマンノースへの変換を示す。１＝ボイドピーク、２＝リン酸化された糖（Ｇ１Ｐ＋Ｇ６Ｐ＋Ｆ６Ｐ）、３＝無機リン酸、４＝マンノースである。

本発明は、例えばデンプン、セルロース、スクロース、グルコースおよびフルクトースといった糖類ならびにそれらの誘導された生成物を、細胞を含まない酵素カクテルを使用してマンノースに変換する製法に一般には関する。細胞ベースの製造方法とは対照的に、本発明は細胞を含まないマンノースの調製に関与し、多くの場合には基質／生成物の細胞への輸送および細胞から外への輸送を減速させる細胞膜を除去することで比較的高い反応速度を有する。これは、栄養に富んだ発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終生成物もまた有する。

本発明は、マンノースを生産する製法にて以前に使用されるＭ６ＰＰと比較して向上した活性を有するＭ６ＰＰによって触媒され、Ｍ６Ｐをマンノースに変換する工程を含む、マンノースを作製する向上した製法に関する。例えば、テピディモナス・フォンティカルディ（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ ｆｏｎｔｉｃａｌｄｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ａ６ＤＳＩ３）由来のＭ６ＰＰ、サーモモナス・ハイドロサーマリス（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｍ４ＵＮ０８）由来のＭ６ＰＰ、およびスルフリヴァルガ・カルジキュラリイ（Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）由来のＭ６ＰＰを開示している国際特許出願公開第２０１８／１６９９５７号を参照されたい。より高い活性を有する酵素を使用することで、より低量の酵素を使用し、それにより全体の製法のコストを低減することが可能となる。

本発明の向上された製法において、Ｍ６ＰＰは、以前に開示される、スルフリヴァルガ・カルジキュラリイ（Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）由来のＭ６ＰＰの活性と比較した場合、より高い活性を有する。好ましくは、本発明の製法で使用されるＭ６ＰＰは、スルフリヴァルガ・カルジキュラリイ（Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）由来のＭ６ＰＰの活性に対し、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも３００％または少なくとも４００％向上した酵素活性を有する。例えば、例１に示されるように、サーモビフィダ・セルロジリティカＴＢ１００（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ ＴＢ１００）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１４７ＫＩＩ８）由来のＭ６ＰＰは、スルフリヴァルガ・カルジキュラリイ（Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）由来のＭ６ＰＰの活性に対し、約２１５％向上した酵素活性を有する。以下の例は、Ｍ６ＰＰの活性を決定するための当業者へのプロトコルを提供する。これは基質と共に酵素をインキュベートすること、次にＨＰＬＣにより反応物質および生成物の量を測定することに関わる。比較的活性任意の２つの酵素の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度など同一の反応条件の下で行われる。

本発明の製法で使用されるＭ６ＰＰは、Ｍ６Ｐにとって特異的である。Ｍ６ＰＰにとって特異的とは、製法中他のリン酸化された単糖類よりも、Ｍ６Ｐにてより高い脱リン酸化活性を有することを意味する。例えばＭ６ＰＰは、例えばＧ１Ｐ、Ｇ６ＰおよびＦ６ＰよりもＭ６Ｐにてより高い脱リン酸化活性を有する。

本発明の製法で使用するためのＭ６ＰＰの例としては、配列番号１に規定されるようなアミノ酸配列のサーモビフィダ・セルロジリティカＴＢ１００（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ ＴＢ１００）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１４７ＫＩＩ８）由来のＭ６ＰＰが挙げられる。Ｍ６ＰＰは配列番号１に対し、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列の配列番号１は以下、ＭＩＳＤＳＤＰＱＩＰＱＡＶＬＦＤＭＤＧＴＬＩＤＴＥＰＭＷＭＤＴＥＡＥＶＡＡＡＦＧＹＴＷＴＡＥＤＱＱＲＣＬＧＧＳＡＡＡＶＡＤＬＩＡＥＲＳＧＴＲＴＰＱＳＥＩＶＡＭＬＹＡＡＶＥＲＲＭＡＥＧＶＰＶＲＰＧＡＫＥＬＬＴＥＬＥＡＱＧＶＰＭＡＬＶＴＳＴＹＲＳＬＬＴＶＡＬＲＡＩＧＥＨＹＦＡＶＳＶＡＧＤＥＶＴＲＮＫＰＨＰＥＰＹＬＲＡＡＲＬＬＧＶＤＰＲＲＣＶＡＶＥＤＳＰＴＧＶＡＳＡＱＡＡＧＣＴＶＶＡＶＰＨＭＡＳＶＰＡＡＥＲＲＹＶＶＧＳＬＥＥＶＤＬＡＷＬＲＲＶＳＰＡのとおりである。

糖からのマンノース生産を向上させるための本発明による製法は、マンノース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）を使用してＭ６Ｐをマンノースに変換する工程を含む。この場合、Ｍ６ＰＰは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい製法において、Ｍ６ＰＰは配列番号１に規定されるようなアミノ酸配列を有する。

好ましくは、Ｍ６Ｐをマンノースに変換するためのＭ６ＰＰは、触媒のためのロスマンフォールドドメイン、Ｃ１キャッピングドメイン、ロスマンフォールドの１番目のβストランドにおけるＤ×Ｄシグネチャ、ロスマンフォールドの２番目のβストランドの端部におけるＴｈｒまたはＳｅｒ、ロスマンフォールドの３番目のβストランドに対しＣ末端のα－ヘリックスのＮ末端におけるＬｙｓ、およびロスマンフォールドの４番目のβストランドの端部におけるＧＤＸＸＸＤ（配列番号２）シグネチャを含有する。

一実施形態において、本発明に従い糖からマンノースを調製する製法としては、マンノース６－リン酸イソメラーゼ、いわゆるＭ６ＰＩによって触媒され、Ｆ６ＰをＭ６Ｐに酵素的に変換する工程も挙げられる。使用され得る例示的なＭ６ＰＩとしては、シュードノカルジア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｍ６ＴＬＹ７）由来のＭ６ＰＩ、カルジトリクス・アビッシ（Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｈ１ＸＱＳ６）由来のＭ６ＰＩ、マイスリオフホラ・サーモフィア（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ２Ｑ９８２）由来のＭ６ＰＩ、およびトレポネマ・カルダリウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ８Ｆ１Ｚ８）由来のＭ６ＰＩが挙げられる。例えば国際特許出願公開第２０１８／１６９９５７号を参照されたい。

本発明による糖からマンノースを調製するいくつかの製法には、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに酵素的に変換する工程が追加的に挙げられ、この場合、該工程はホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される。使用され得る例示的なＰＧＩには、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されたものである、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）由来のＰＧＩおよびサームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）由来のＰＧＩといったものが挙げられる。

他の実施形態において、マンノースを調製する製法には、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換する工程が追加的に挙げられ、この場合、該工程は例えば、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されている、サーモコクス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）由来のＰＧＭであるホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される。

さらなる実施形態において、マンノースを調製する製法は、Ｇ６ＰのＦ６Ｐ、さらにＭ６Ｐへの変換を含み、この場合、本工程は二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）によって触媒される。ＰＧＰＭＩの例としては、シントロサームス・リポカリダス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ７ＣＰＨ７）由来のＰＧＰＭＩ、シュレイフェリア・サーモフィリア（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０８５Ｌ１７０）由来のＰＧＰＭＩ、およびサーモデスルホビウム・ナルゲンセ（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉｕｍ ｎａｒｕｇｅｎｓｅ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｍ１Ｅ６Ｚ３）由来のＰＧＰＭＩが挙げられるがこれらに限定されない。

加えて、本発明による製法は、糖をＧ１Ｐに変換する工程をさらに含み得る。この場合、該工程は少なくとも１種類の酵素によって触媒され、糖はデンプンまたはその誘導体（図１）、セルロースまたはその誘導体（図２）、フルクトース（図３）、グルコース（図４）およびスクロース（図５）からなる群から選択される。本発明による製法において糖をＧ１Ｐに変換する工程で使用される１つまたは複数の酵素は、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼおよび／またはセルロースホスホリラーゼならびにそれらの混合物であり得る。酵素または酵素の組合せの選択は、該製法にて使用される糖によって変化する。

セルロースは最も豊富な生物学的な供給源であり、植物細胞壁の主要な構成成分である。非食品であるリグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンならびに他の少数の構成成分を含有する。アビセル（微結晶セルロース）、再生非晶質セルロース、細菌性セルロース、ろ紙などを含む純セルロースは、一連の処理により調製され得る。部分的に加水分解されたセルロース基質は、重合度が７を超える水不溶性セロデキストリン、重合度３～６である水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコースおよびフルクトースを含む。

本発明による特定の製法において、セルロースおよびその誘導された生成物は、一連の工程によりマンノースに変換され得る。図２を参照されたい。該製法は、それぞれ、セロデキストリンおよびセロビオースならびにセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）およびセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によって触媒される遊離リン酸からＧ１Ｐを生成する工程、ＰＧＭによって触媒され、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換する工程、ＰＧＩによって触媒され、Ｇ６ＰをＦ６Ｐに変換する工程、Ｍ６ＰＩによって触媒され、Ｆ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、ならびにＭ６ＰＰによって触媒され、Ｍ６Ｐをマンノースに変換する工程に関わるインビトロでの合成経路を提供する。代替的には、前述の経路において、Ｇ６ＰのＦ６Ｐ、さらにＭ６Ｐへの変換は、ＰＧＰＭＩによって触媒され得る。この製法において、リン酸イオンは、セロデキストリンおよびセロビオースをＧ１Ｐに変換する工程によって再利用され得る。いくつかの実施形態において、ポリリン酸およびポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）は該製法に加えられ、これにより、分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによってマンノースの収率を増加させる。

複数の酵素を使用し、固体セルロースを水溶性セロデキストリンおよびセロビオースに加水分解させることができる。こうした酵素はエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドロラーゼを含むが、β－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まない。セルロースの加水分解およびＧ１Ｐ生成の前に、セルロースおよびバイオマスが前処理されてそれらの反応性を増加させ、セルロース鎖の重合度を減少させる。セルロースおよびバイオマスの前処理方法としては、希酸前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画、アンモニア繊維膨張、アンモニア水性浸漬、イオン性液体処理、および塩酸、硫酸、リン酸およびそれらの組合せを含む濃酸を使用することによる部分的な加水分解が挙げられる。

糖類がセロビオースを含み、酵素がセロビオースホスホリラーゼを含有する時には、Ｇ１Ｐはセロビオースホスホリラーゼによってセロビオースから生成される。糖類がセロデキストリンを含有し、酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む時には、Ｇ１Ｐはセロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリンから生成される。糖類がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含有する時には、Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロースから生成される。

糖類がマルトースを含み、酵素がマルトースホスホリラーゼを含有する時には、Ｇ１Ｐはマルトースホスホリラーゼによってマルトースから生成される。糖類がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含有する時には、Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロースから生成される。

糖がデンプンまたはデンプン誘導体である時には、誘導体はアミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトースおよびグルコース、ならびにそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の特定の製法において、糖をＧ１Ｐに変換するために使用される酵素はαＧＰを含有する。この工程において、糖類がデンプンを含む時には、Ｇ１ＰはαＧＰによってデンプンから生成され、糖類が可溶性デンプン、アミロデキストリンまたはマルトデキストリンを含有する時には、Ｇ１ＰはαＧＰによって可溶性デンプン、アミロデキストリンまたはマルトデキストリンから生産される。αＧＰの一例は、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示される、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）由来のαＧＰである。

本発明によるいくつかの製法は、デンプンをデンプン誘導体に変換する工程をさらに含み得る。この場合、このデンプン誘導体はデンプンの酵素的加水分解またはデンプンの酸加水分解によって調製される。本発明の特定の製法において、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）は、分解生成物であるマルトースをＧ１Ｐおよびグルコースに加リン酸分解的に切断することによってマンノースの収率を増加させるために使用され得る。代替的には、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）は、分解生成物であるグルコース、マルトースおよびマルトトリオースを再利用し、より長いマルトオリゴ糖類とすることによってマンノースの収率を増加させるために使用され得る。このマルトオリゴ糖類は、αＧＰによって加リン酸分解的に切断され、Ｇ１Ｐを得ることができる。４ＧＴの一例は、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示される、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）由来の４ＧＴである。本発明のいくつかの製法において、ポリリン酸およびポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）はこの製法に追加され、これにより、分解生成物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによってマンノースの収率を増加させる。

デンプンは、天然にて最も広範に使用されるエネルギー貯蔵化合物であり、植物の種に大半が貯蔵される。天然のデンプンは、直鎖状アミロースおよび分枝状アミロペクチンを含有する。デンプン誘導体の例としては、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトースおよびグルコースが挙げられる。セルロース誘導体の例としては、前処理されたバイオマス、再生非晶質セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトースおよびグルコースが挙げられる。スクロース誘導体はフルクトースおよびグルコースを含む。

該製法がデンプン誘導体を使用する場合、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼまたはそれらの組合せによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって調製され得る。トウモロコシデンプンは、αＧＰ反応を妨害する多くの分枝を含有する。イソアミラーゼはデンプンを脱分枝するために使用され、直鎖状アミロデキストリンを得ることができる。イソアミラーゼで前処理されたデンプンは、より高いＦ６Ｐ濃度をもたらし得る。イソアミラーゼおよびプルラナーゼはα－１，６－グリコシド結合を切断し、これによりα－グルカンホスホリラーゼによってデンプンをより完全に分解することができる。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を切断し、この結果、α－アミラーゼを使用し、より迅速なマンノースへの変換のためにデンプンを断片に分解する。

マンノースをフルクトースから生産することもできる。図３を参照されたい。本発明による製法は、フルクトースをＦ６Ｐに変換する工程であり、少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程と、任意選択で、スクロースをフルクトースに変換する工程であって少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程もまた含み得る。例えば、該製法は、フルクトースおよびポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）によって触媒されるポリリン酸からＦ６Ｐを生成することに関わる。Ｆ６Ｐのマンノースへの変換は上に記載される。フルクトースは例えば、スクロースの酵素的変換によって生産され得る。Ｍ６Ｐがマンノースに変換される時に生成されたリン酸イオンは、次にスクロースをＧ１Ｐに変換する工程において再利用され得る。

マンノースをグルコースから生産することもできる。図４を参照されたい。該製法は、グルコースおよびポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）によって触媒されるポリリン酸からＧ６Ｐを生成する工程、ＰＧＩによって触媒され、Ｇ６ＰをＦ６Ｐに変換する工程、Ｍ６ＰＩによって触媒され、Ｆ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、およびＭ６ＰＰによって触媒され、Ｍ６Ｐをマンノースに変換する工程に関する。代替的には、Ｇ６ＰのＦ６Ｐ、さらにＭ６Ｐへの変換は、ＰＧＰＭＩによって触媒され得る。グルコースは例えば、スクロースの酵素的変換によって生産され得る。図５を参照されたい。

Ｍ６Ｐがマンノースに変換される時に生成されるリン酸イオンは、特に単一の反応容器にて該製法を実行する場合には、スクロースをＧ１Ｐに変換する工程にて次に再利用され得る。図５を参照されたい。加えて、ＰＰＦＫおよびポリリン酸は、ＳＰによってスクロースを加リン酸分解切断することにより生成されるフルクトースからＦ６Ｐを生産することでマンノースの収率を増加させるために使用され得る。

糖からマンノースを調製する製法は、例えば（ｉ）１種類または複数の酵素を使用して、糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換する工程、（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換する工程、（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換する工程、（ｉｖ）マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ、ＥＣ５．３．１．８））によりＦ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、（ｖ）二機能性ホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ、ＥＣ５．３．１．８および５．３．１．９）によりＧ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、（ｖｉ）Ｍ６ＰＰによりＭ６Ｐをマンノースに変換する工程を含む。糖がデンプンである場合の製法の一例を図１に示す。こうした製法において、例えば工程（ｉ）における酵素はαＧＰであってよい。

通常、該製法で使用される酵素単位の比率は、１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｍ６ＰＩ：Ｍ６ＰＰ）である。酵素単位は、１分間で１ｕモルの基質を生成物に変換するのに必要とされる酵素の量である。したがって、より高い活性を有する酵素は、同じ反応を触媒するより低い活性を有する酵素と比較した場合、１酵素単位あたりｍｇの酵素という点では、より低量の酵素を有する。生成物の収率を最適化させるため、こうした比率は任意の数の組合せで調整され得る。例えば特定の酵素は、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍などの量で存在してよい。

本発明によるマンノースを調製する製法は、酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖類およびオリゴ糖類からグルコースを生成する工程、少なくとも１種類の酵素によって触媒される、グルコースをＧ６Ｐに変換する工程、酵素的加水分解または酸加水分解によって多糖類およびオリゴ糖類からフルクトースを生成する工程、および少なくとも１種類の酵素によって触媒される、フルクトースをＧ６Ｐに変換する工程を含む。多糖類およびオリゴ糖類の例は上にて列挙されている。

本発明によるマンノースを調製する製法は、単一のバイオリアクタまたは反応容器にて実行され得る。代替的には、該工程は複数のバイオリアクタまたは反応容器にて実行され得るが、これらは連続して配置される。好ましい製法において、マンノースを酵素的に生産することは、単一の反応容器にて実行される。

本発明に使用される酵素は、可溶であり、固定化され、会合するかまたは凝集したタンパク質の形態をとってよい。こうした酵素は、当該技術分野にて公知であるように、機能性を向上させるために一般に使用される不溶性の有機担体または無機担体上で吸着されることがある。これらは、アガロース、メタクリラート、ポリスチレンまたはデキストランなどのポリマー担体ならびにガラス、金属または炭素ベースの材料などの無機担体を含む。これらの材料は多くの場合、表面と体積との大きな比率を有し、ならびに固定化された酵素の付着および活性を促進させる特殊化された表面を有して生産される。酵素は、共有結合性相互作用、イオン性相互作用または疎水性相互作用により前述の固体担体に付着されてよい。酵素はまた、別のタンパク質または大半の場合にはポリヒスチジン配列といった固体担体への付着性を有するペプチド配列への共有結合などの遺伝子改変された相互作用により、付着され得る。酵素は、表面または表面コーティングへのいずれかに直接付着され得るか、または表面または表面コーティングに既に存在する他のタンパク質に付着され得る。酵素は、１つの担体もしくは個別の担体、または２つの担体の組合せ（例えば、担体あたり２種類の酵素をそれらの担体と続いて混合する）上に全て固定化され得る。これらのバリエーションは均等に、または限定された層にて混合され、連続リアクタ内での回転率を最適化することが可能である。例えば、最初のリアクタはαＧＰの層を有し、初期Ｇ１Ｐ濃度を確実に高いものとすることができる。酵素は１種類の担体上に、個別の担体上に、またはまとめて全て固定化されてよい。これらの酵素は均等に、または限定された層もしくはゾーンにて混合され、回転率を最適化することができる。

当該技術分野にて公知である任意の好適な生物学的緩衝液は、本発明の製法にて使用されることができる。これは例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＣＯ、トリズマなどである。全ての実施形態の反応緩衝液は、５．０～９．０の範囲のｐＨを有し得る。より好ましくは、反応緩衝液のｐＨは約６．０～約７．３の範囲であり得る。例えば、反応緩衝液のｐＨは６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２または７．３であり得る。

反応緩衝液はまた、二価の金属カチオンも含有し得る。金属イオンの例としては、Ｍｇ^２＋およびＺｎ^２＋が挙げられる。二価の金属イオンの濃度は、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、反応金属カチオン濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであり得る。

製法の工程が実行される反応温度は、３７～８５℃の範囲であり得る。より好ましくは、工程は約３７℃～約８５℃の範囲である温度にて実行され得る。温度は例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、または約６０℃であり得る。好ましくは、反応温度は約５０℃である。本発明のいくつかの製法において、反応温度は一定であり、製法中変更されることはない。

開示された製法の反応時間は、必要に応じて調整され、約１時間～約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、または約４８時間であり得る。より好ましくは、反応時間は約２４時間である。

反応は、充填床リアクタまたは同様の装置を使用し、バッチにて、または連続製法にて実施され得る。連続製法では、溶液であるマルトデキストリンは例えば、下流での加工のために溶液がカラムに残っている場合には、マンノースへの変換が完了する速度で固定化された酵素の床を通ってくみ出される。例えば、２００ｇ／Ｌのマルトデキストリンは、マルトデキストリンがカラムに残っている場合には最大のマンノース収率が得られるように、固定化された酵素で充填されたカラム（例えば、５０℃に維持）を通ってくみ出される。この方法論により、バッチ法よりも大きい容量での生産性が提供される。これにより、マンノース生成物がカラムと接触している時間および生成物の分解する機会を減少させる反応条件（例えば、潜在的なヒドロキシメチルフルフラール形成）を制限する。

Ｍ６ＰのＭ６ＰＰによる脱リン酸化によって生産されたリン酸イオン（Ｐ_ｉ）は、全製法の工程が単一のバイオリアクタまたは反応容器にて実行される場合には特に、糖をＧ１Ｐに変換する製法の工程にて次いで再利用され得る。開示された製法にてリン酸を再利用する能力により、非化学量論的なリン酸の量を使用することが可能となり、これにより反応リン酸濃度は低く保たれる。これは該製法の全体的な経路および全体的な速度に影響するが個別の酵素の活性を制限するものではなく、これによりマンノース作製製法を全体的に効率的なものとする。

例えば反応リン酸濃度は、約０ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、またはより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、反応リン酸濃度は約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約５５ｍＭであり得る。

したがって、低いリン酸濃度により、総リン酸が低下し、それによりリン酸除去のコストが低下することに起因して生産コストの減少がもたらされる。これはまた、高濃度の遊離リン酸によるＭ６ＰＰの阻害を防止し、リン酸汚染の可能性を減少させる。

さらには、本明細書において開示される製法は、リン酸源としてＡＴＰ添加なしで、すなわちＡＴＰを含まないで実行され得る。該製法はまた、ＮＡＤ（Ｈ）を添加される必要なく、すなわちＮＡＤ（Ｈ）を含まないで実行され得る。他の利点はまた、マンノースを作製するための開示された製法のうち少なくとも１つの工程が、エネルギー的に有利な化学反応に関するという事実を含む。図６。より高い活性を有する酵素の使用が全体的なエネルギー性には影響しないが、向上した製法においてより少ない酵素を使用する能力は有利である。利点は、生成物の総生産コストにおいて、酵素の全体的なコストを減少させる点である。

本発明による製法は、全体的な反応にとって非常に有利な平衡定数に起因する高い収率を得ることができる。図６。理論的には、出発物質が完全に中間体に変換される場合には、最大９９％の収率を得ることができる。また、本発明によるＭ６Ｐをマンノースに変換する工程は、原料に関わらず不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、マンノースは非常に高い収率で生産される。

本発明の製法は低コストの出発物質を使用し、原料および生成物の分離に関連するコストを減少させることで生産コストを減少させる。デンプン、セルロース、スクロースおよびそれらの誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。マンノースがラクトースから生産される時には、グルコースおよびガラクトースおよびマンノースはクロマトグラフィーによって分離され、これが生産コストをより高いものとする。

本発明による製法により、マンノースを容易に回収することが可能となり、分離コストは最小となる。好ましくは、本発明の製法において、マンノースの回収はクロマトグラフィー分離によるものではない。連続反応でのマンノースの生産に続き、生成物は代わりに精密濾過、イオン交換（カチオン、次いでアニオン、混合床ではない）、濃縮、結晶化、結晶単離および乾燥に通される。マンノースの収率の高さから、結晶化工程はマンノースを精製するのに必要とされる全てである。結晶化の前にマンノースをさらに精製するためにナノろ過を使用し、結晶化製法において酵素が存在しているというリスクを排除し、マンノースと共結晶化することがあるか、または母液の再利用を限定することがある、任意の未変換デキストリン（マルトデキストリン、マルトテトラオース、マルトトリオース、マルトースなど）を除去することができる。

以下の例に示されるように、本発明によるマンノースを調製する製法は、（ｉ）１種類または複数の酵素を使用して糖をＧ１Ｐに変換する工程、（ｉｉ）ＰＧＭを使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換する工程、（ｉｉｉ）ＰＧＩを使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換する工程、（ｉｖ）Ｍ６ＰＩを使用してＦ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、および（ｖ）Ｍ６ＰＰを使用してＭ６Ｐをマンノースに変換する工程であって、この場合、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工程を含む。この製法は好ましくは、単一のバイオリアクタまたは反応容器にて実行される。

本発明のマンノースを生産するいくつかの製法において、（ｉ）Ｍ６ＰＩを使用してＦ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、および（ｉｉ）Ｍ６ＰＰを使用してＭ６Ｐをマンノースに変換する工程であって、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工程は、単一のバイオリアクタまたは反応容器にて実行される。好ましくは、本発明によるマンノースを調製する向上した製法は、（ｉ）１種類または複数の酵素を使用して糖をＧ１Ｐに変換する工程、（ｉｉ）ＰＧＭを使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換する工程、（ｉｉｉ）ＰＧＩを使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換する工程、（ｉｖ）Ｍ６ＰＩを使用してＦ６ＰをＭ６Ｐに変換する工程、および（ｖ）Ｍ６ＰＰを使用してＭ６Ｐをマンノースに変換する工程であって、Ｍ６ＰＰは配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、製法の工程（ｉ）～（ｖ）が単一のバイオリアクタまたは反応容器にて実行される工程を含む。該製法は、上に記載された１つまたは複数の種々の製法条件を組み入れてよい。

材料および方法

グルコース１－リン酸、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム（一塩基性および二塩基性）を含む全ての化学物質は、試薬グレード以上の高いグレードであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）またはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入され、特に記載がない限り、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）であるＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を組換えタンパク質の発現用の宿主細胞として使用した。５０ｍｇのＬ－１カナマイシンを含むＺＹＭ－５０５２培地を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞の成長および組換えタンパク質の発現のために使用した。

組換え酵素の生産および精製

タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ）を内部に持つ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）であるＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０ｍｇのＬ^－１カナマイシンを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地を有する１Ｌのエルレンマイヤーフラスコにてインキュベートした。細胞を、３７℃で１６～２４時間、２２０ｒｐｍで回転振盪させながら成長させた。細胞を１２℃にて遠心分離法により回収し、５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ_２（熱沈殿）を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）または３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾール（Ｎｉ精製）を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）のいずれかを用いて１度洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液に再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を精製した。Ｈｉｓタグがついたタンパク質を、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｎｉ充填樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）により精製した。５０～８０℃で５～３０分間の熱沈殿を使用し、熱安定性のある酵素を精製した。組換えタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により調べた。

例１：国際公開第２０１８／１６９９５７（Ａ１）号のＭ６ＰＰの相対的活性

ＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）、ＰＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ８Ｆ１Ｚ８）およびＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ａ６ＤＳＩ３、Ａ０Ａ１Ｍ４ＵＮ０８およびＡ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）といった酵素を使用するＧ６Ｐのマンノースへの変換を、相対的なＭ６ＰＰ比率を決定するために比較した。３８．５ｍＭのＧ６Ｐ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５ｇ／ＬのＰＧＩ、０．０６ｇ／ＬのＰＭＩおよび０．３ｇ／ＬのＭ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で３時間インキュベートした。Ｍ６ＰＰは、このカスケード反応における律速酵素である。

この反応を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）で酵素をろ過することで停止させ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ－カラムを使用するＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ）および屈折率検知器により分析した。０．６ｍＬ／分で１５．５分間、６５℃にて５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４中でサンプルを流した。結果は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３が国際公開第２０１８／１６９９５７（Ａ１）号からの最も有効なＭ６ＰＰであることを示す（表１）。

例２：より高い活性を有するＭ６ＰＰ

ＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）、ＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）、ＰＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｈ１ＸＱＳ６）およびＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）といった酵素を使用するＧ１Ｐのマンノースへの変換を、本発明の向上した製法にて有用な酵素であるＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１４７ＫＩＩ８）を用いるＧ１Ｐのマンノースへの変換と比較した。３８．５ｍＭのＧ１Ｐ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５ｇ／ＬのＰＧＭ、０．０５ｇ／ＬのＰＧＩ、０．０５ｇ／ＬのＰＭＩおよび０．０５ｇ／ＬのＭ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で０．５時間インキュベートした。Ｍ６ＰＰは、このカスケード反応における律速酵素である。

この反応を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）で酵素をろ過することで停止させ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ－カラムを使用するＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ）および屈折率検知器により分析した。０．６ｍＬ／分で１５．５分間、６５℃にて５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４中でサンプルを流した。結果は、以前に開示される酵素よりも向上した製法の酵素を用いたマンノース生産において、３．２倍向上していることを示している（図７および表２）。表３は、以前に開示されるＭ６ＰＰとＭ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１４７ＫＩＩ８）とを比較している正規化された相対的活性を示す。

Claims (22)

1. 糖からマンノースを生産するための向上した製法であって、前記向上が、マンノース－６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）を使用してＭ６Ｐをマンノースに変換することを含み、前記Ｍ６ＰＰが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、製法。
2. マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）を使用して、フルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に変換する工程をさらに含む、請求項１に記載の製法。
3. グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに変換し、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される工程をさらに含む、請求項２に記載の製法。
4. グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに変換し、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される工程をさらに含む、請求項３に記載の製法。
5. 糖を前記Ｇ１Ｐに変換し、少なくとも１種類の酵素によって触媒され、前記糖がデンプンまたはその誘導体、セルロースまたはその誘導体およびスクロースからなる群から選択される工程をさらに含む、請求項４に記載の製法。
6. 前記少なくとも１種類の酵素が、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼおよびセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の製法。
7. 前記糖が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトースおよびグルコースからなる群から選択されるデンプンまたはその誘導体である、請求項５に記載の製法。
8. デンプンをデンプン誘導体に変換し、前記デンプン誘導体がデンプンの酵素的加水分解またはデンプンの酸加水分解によって調製される工程をさらに含む、請求項７に記載の製法。
9. ４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が前記製法に加えられる、請求項８に記載の製法。
10. 前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼまたはそれらの組合せによって触媒されるデンプンの酵素的加水分解によって調製される、請求項９に記載の製法。
11. フルクトースを前記Ｆ６Ｐに変換し、少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程と、
    任意選択で、スクロースを前記フルクトースに変換し、少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程と、
    をさらに含む、請求項１に記載の製法。
12. グルコースを前記Ｇ６Ｐに変換し、少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程と、
    任意選択で、スクロースを前記グルコースに変換し、少なくとも１種類の酵素によって触媒される工程と、
    をさらに含む、請求項３に記載の製法。
13. 前記製法が、
    （ｉ）１種類または複数の酵素を使用し、糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換し、前記糖がデンプン、１種類もしくは複数のデンプンの誘導体、またはそれらの組合せからなる群から選択される工程、
    （ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を使用してＧ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換する工程、
    （ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）を使用してＧ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換する工程、
    （ｉｖ）マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）を使用して前記Ｆ６Ｐをマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に変換する工程、および
    （ｖ）マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）を使用して前記Ｍ６Ｐをマンノースに変換し、前記Ｍ６ＰＰが配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工程を含む、マンノースを生産するための酵素的製法であり、
    製法の工程（ｉ）～（ｖ）が、単一の反応容器内で実行される、請求項１に記載の製法。
14. 前記製法の工程が、
    約３７℃～約８５℃の範囲の温度にて、
    約５．０～約９．０の範囲のｐＨにて、
    または約１時間～約４８時間にわたって、といった製法条件のうち少なくとも１つの下で実行される、請求項１３に記載の製法。
15. 前記製法の工程が、リン酸が再利用される場合、および
    リン酸源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なしで、
    ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなしで、
    約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で、
    約０．１ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇ^２＋濃度で、といった製法条件のうち、前記製法のうち少なくとも１つの工程がエネルギー的に有利な化学反応に関する場合、
    前記製法の工程が、これらの製法条件のうち少なくとも１つの下で実行される、
    請求項１３または１４に記載の製法。
16. リン酸が再利用され、Ｍ６ＰのＭ６ＰＰによる脱リン酸化によって生産されるリン酸イオンが、糖をＧ１Ｐに変換する前記製法の工程で使用される、請求項１５に記載の製法。
17. Ｍ６Ｐをマンノースに変換する前記工程が、エネルギー的に有利であり、不可逆的なホスファターゼ反応である、請求項１５に記載の製法。
18. 生産される前記マンノースを分離回収する工程をさらに含み、前記分離回収がクロマトグラフィー分離によるものではない、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の製法。
19. デンプンの前記誘導体が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースからなる群から選択される、請求項１３に記載の製法。
20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の製法から生産されるマンノース。
21. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の製法から生産されるマンノースを含有する消費可能な生成物。
22. スルフリヴァルガ・カルジキュラリイ（Ｓｕｌｆｕｒｉｖｉｒｇａ ｃａｌｄｉｃｕｒａｌｉｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｎ６ＦＣＷ３）由来のＭ６ＰＰの活性と比較した場合、前記Ｍ６ＰＰがより高い活性を有する、請求項２に記載の製法。

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