JP2022512657A - 二機能性融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、補体および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を同時に標的とする二機能性融合タンパク質を提供する。二機能性融合タンパク質は、ヒトタンパク質の２つ以上のドメインを含み、全てヒト配列のものであり、したがって非免疫原性であると予期され、補体およびＶＥＧＦ関連疾患を標的とするヒトにおいて治療的に使用することができる可能性がある。

Description

発明の分野
本発明は、抗Ｃ５抗体の重鎖がＶＥＧＦトラップと融合されるか、または抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂの重鎖が抗Ｃ５抗体ＳｃＦｖフラグメントと融合される、二機能性融合タンパク質に関する。

本発明の背景
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、米国および他の先進国において高齢者（＞５０歳）中の失明および視覚障害の主な原因である（１）。ＡＭＤの８５％は、ドルーゼン（ｄｒｕｓｅｎ）と呼ばれる細胞残屑が網膜と脈絡膜の間に蓄積する乾燥した（滲出性ではない）形態である。進行性乾性ＡＭＤにおいて、中心の地理的萎縮が起こり、眼の中心の視力が失われる。湿性（滲出性または新生血管）型のＡＭＤは、異常な血管（脈絡膜血管新生、ＣＮＶ）が脈絡膜から黄斑の後ろのブルッフ（Ｂｒｕｃｈ）膜を通って成長し、急速な視力喪失をもたらす、より重症の型である。近年、補体活性化がＡＭＤの病因に主要な役割を果たすことを示す証拠が増えている（２）。ドルーゼンにおいて高レベルの補体タンパク質が検出されている。遺伝学的研究により、Ｈ因子（ＣＦＨ）、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ３、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｂ因子、Ｉ因子を含む補体タンパク質の遺伝子におけるＡＭＤリスクと多型の関連が確認されている。特にＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ対立遺伝子はＡＭＤリスクと高い相関がある。補体活性化産物のレベルの上昇は、ＡＭＤ患者の血漿においても見られる。その結果、いくつかの補体阻害剤が現在、ＡＭＤの処置のために臨床試験中である。

補体系は、多くの血漿タンパク質および細胞膜タンパク質からなる先天性免疫系の機能的エフェクターである。補体の活性化は、サイトカインの放出および活性化カスケードの増幅を誘発する一連のプロテアーゼ活性化カスケードにつながる。補体活性化の最終結果は、細胞殺傷性の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａによって引き起こされる炎症、および病原体のオプソニン作用である。Ｃ５開裂によって開始されるＭＡＣは、侵入性病原体および損傷した、壊死性、およびアポトーシス性の細胞を排除するために不可欠である。

病原体に対する防御および過剰な炎症の回避との間の微妙なバランスが、補体系についてなし遂げられる必要がある（３）。多くの炎症性、自己免疫性、神経変性および感染症は、過剰な補体活性と関連していることが示されている。虚血／再灌流障害の病因は、補体活性化が、急性心筋梗塞、卒中、出血性および敗血症性ショック、および冠状動脈バイパス移植手術の合併症を含む多くの疾患において炎症誘発性損傷をもたらすことを示している（４）。補体経路は、全身性エリテマトーデス（５）、リウマチ性関節炎、乾癬、および喘息（６）を含む多くの自己免疫疾患の主な原因のようである。補体活性化は、アルツハイマー病（７）および、ハンチントン病、パーキンソン病、およびＡＭＤ（８）などの他の神経変性疾患の病態とも相関している。

補体系は、古典的経路、代替経路、およびレクチン経路の３つの異なる経路を介して活性化することができる（９）。３つの経路はすべて、補体成分Ｃ３およびＣ５をそれぞれ開裂するＣ３－転換酵素およびＣ５－転換酵素の重要なプロテアーゼ複合体を通過する。古典的経路は、Ｃ１ｑが抗体ＩｇＭまたはＩｇＧに結合することによって開始され、補体成分Ｃ２およびＣ４を開裂して、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ、およびＣ４ｂを生成するＣ１複合体の活性化をもたらす。次に、Ｃ４ｂおよびＣ２ｂは、古典的経路Ｃ３－転換酵素を形成し、Ｃ３のＣ３ａとＣ３ｂへの開裂を促進する。次に、Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂＣ２ｂ（Ｃ３－転換酵素）に結合することによってＣ５－転換酵素を形成する。レクチン経路は、Ｃ３－転換酵素の下流の古典的経路と同一であり、病原体表面上のマンノース残基へのマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の結合によって活性化される。次に、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼＭＡＳＰ－１およびＭＡＳＰ－２は、Ｃ４およびＣ２を開裂して、古典的経路と同じＣ３－転換酵素を形成することができる。抗原を必要とする特異的免疫応答である古典的およびレクチン経路とは異なり、代替経路は、低レベルで継続的に活性である非特異的免疫応答である。Ｃ３の自発的な加水分解は、Ｃ３ａとＣ３ｂにつながる。Ｃ３ｂはＢ因子に結合し、Ｄ因子を促進してＢ因子をＢａとＢｂに開裂する。Ｐ因子（プロペルジン）の結合によって安定化することができるＣ３ｂＢｂ複合体は、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに開裂する代替経路のＣ３－転換酵素である。Ｃ３ｂはＣ３ｂＢｂ複合体に結合して、代替経路のＣ５－転換酵素であるＣ３ｂＢｂＣ３ｂ複合体を形成することができる。３つの経路すべてからのＣ５－転換酵素は、Ｃ５をＣ５ａおよびＣ５ｂに開裂することができる。次に、Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ７、Ｃ８、および複数のＣ９分子を動員して組み立て、ＭＡＣを組み立てる。これにより、病原体または細胞を殺すまたは損傷する可能性のある穴や細孔が膜に作成される。

補体タンパク質に対するいくつかのモノクローナル抗体が治療薬として使用されている（１０）。Ｃ５タンパク質に対するヒト化抗体であるエクリズマブは、２００７年に発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の処置に承認されている（特許は２０２１年３月１６日に米国で、２０２０年５月１日にヨーロッパで失効する）。エクリズマブは、臨床でＡＭＤを処置するために全身的に試験された。試験において忍容性は良好であったが、エクリズマブは臨床においてＧＡ（ＡＭＤの進行型）の成長率を有意に低下させなかった。考えられる説明は、使用されたエクリズマブの投与量が少ないためか、エクリズマブが機能するのに十分なレベルを達成するために直接的な硝子体内注射が必要である可能性がある。ペキセリズマブおよびテシドルマブなどのいくつかの抗Ｃ５抗体は、現在、地図状萎縮、非感染性全ブドウ膜炎、滲出性黄斑変性症、非感染性後部ブドウ膜炎、および／または加齢黄斑変性症を処置するための試験においてテストされる。Ｃ５ａ（ＴＮＸ－５５８）、Ｄ因子（ＴＮＸ－２３４）、Ｐ因子、およびＣ３ｂに対する抗体が開発され、さまざまな疾患モデルで評価されている。さらに、ヒトＣ５のアプタマーインヒビター（ＡＲＣ１９０５）およびＣ３に対する１３アミノ酸の環状ペプチド（コンパスタチン）が、ＡＭＤ疾患を処置するための臨床試験で評価されている。

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成を促進する最も重要なタンパク質の１つであり、既存の血管ネットワークから新しい血管を発達させる厳密に制御されたプロセスである（１１）。ヒトＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、５つのメンバーを含む：ＶＥＧＦ－Ａ ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄおよび胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）。加えて、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、およびＰｌＧＦの複数のアイソフォームは、選択的ＲＮＡスプライシングによって生成される（１２）。ＶＥＧＦ－Ａは、ファミリーの典型的なメンバーであり、最も研究されているメンバーでもある。ＶＥＧＦ－Ａは、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し、細胞の生存および増殖を促進し、細胞の遊走を誘発し、微小血管の透過性を高めることが示されている。ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合することにより、細胞性応答を刺激する。ＶＥＧＦＲ受容体は、７つの免疫グロブリン（ＩＧ）様ドメインからなる細胞外領域を有するチロシンキナーゼ受容体である。ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）は、ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、およびＰＩＧＦに結合し、ＶＥＧＦのデコイ受容体またはＶＥＧＦＲ－２の調節因子として機能することができる。ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）は、すべてのＶＥＧＦアイソフォームに結合し、ＶＥＧＦが誘導する血管形成シグナル伝達の優勢なメディエーターである。ＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ－４）は、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに結合するが、ＶＥＧＦ－Ａには結合せず、リンパ管新生の主要なメディエーターとして機能する。

血管形成は、創傷治癒および月経周期などの発達および通常の生理学的プロセス中に必要であり、ＡＭＤ、ＲＡ、糖尿病性網膜症、腫瘍増殖および転移を含む多くの疾患の病因に関与していることが証明されている。血管形成の阻害は、治療への適用に効果的であることが示されている。ＶＥＧＦ－Ａに対するいくつかの阻害剤がＦＤＡによって承認されている。例えば、ＶＥＧＦ－Ａに対するヒト化抗体（Ａｖａｓｔｉｎ）、ＶＥＧＦ－Ａに対する抗体Ｆａｂフラグメント（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、およびＶＥＧＦトラップ（Ｅｙｌｅａ）。Ａｖａｓｔｉｎは、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、グリア芽腫（ＧＢＭ）、および転移性腎臓癌（ｍＲＣＣ）の処置に承認されている。ＬｕｃｅｎｔｉｓおよびＥｙｌｅａは湿性ＡＭＤの処置に承認されている。Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ、Ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ、Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔなど、他の多くの抗ＶＥＧＦ分子が現在臨床開発中である。

発明の簡潔な概要
本発明の目的は、上記問題を解決するために補体およびＶＥＧＦ経路をより有効におよび同時に阻害することによって、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの種々の補体およびＶＥＧＦ関連疾患を処置することができる治療剤を開発すること、および結果として、補体およびＶＥＧＦを同時に標的とする二機能性融合タンパク質が、抗補体および抗ＶＥＧＦ有効性を有効に示すことを見出すことである。

本発明は、補体シグナル伝達経路およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する融合タンパク質であって、融合タンパク質が、補体結合ドメインおよびＶＥＧＦ結合ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。

１つの局面において、本発明は、短いフレキシブルな(flexible)リンカーで融合される、１つ以上のＣ５結合モチーフ含有フラグメントおよび１つ以上のＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントを含み、それにより補体および血管形成の阻害において、同時に、有意に改善された有効性を提供する、二機能性融合タンパク質を提供する。

１つの態様において、本発明は、補体およびＶＥＧＦを同時に標的とし、および補体Ｃ５開裂ブロッキング活性および抗血管形成有効性を同時に提供する、Ｃ５Ｖである二機能性融合タンパク質であって、Ｃ５は、エクリズマブの重鎖のような補体Ｃ５結合モチーフであり；Ｖは、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ Ｄ３、またはそのキメラドメインのようなＶＥＧＦ結合モチーフであり；および短いフレキシブルなＧＳリンカーは、各ドメインの正しい折りたたみおよび最小限の立体障害を保証するように間に挿入される、二機能性融合タンパク質を提供する。

他の態様において、本発明は、補体およびＶＥＧＦを同時に標的とし、および補体Ｃ５開裂ブロッキング活性および抗血管形成有効性を同時に提供する、ＶＣ５である二機能性融合タンパク質であって、Ｖは、ラニビズマブＦａｂの重鎖のようなＶＥＧＦ結合モチーフであり；Ｃ５は、エクリズマブのＳｃｆｖのような補体Ｃ５結合モチーフであり；および、短いフレキシブルなＧＳリンカーは、重鎖およびＳｃｆｖ間に置かれる、二機能性融合タンパク質を提供する。

さらに他の態様において、本発明は、補体およびＶＥＧＦ関連疾患の処置のために有用である二機能性融合タンパク質を提供する。

したがって、本発明はまた、本開示の二機能性融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

１つの態様において、医薬組成物が、補体およびＶＥＧＦ関連疾患の処置のために有用である。

さらに、本発明は、処置を必要とする対象において補体およびＶＥＧＦ関連疾患を処置するための方法であって、本明細書に記載されている二機能性融合タンパク質の治療有効量を該対象に投与することを含む、方法を提供する。

１つの態様において、本明細書に記載されている補体およびＶＥＧＦ関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、加齢黄斑変性症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、糸球体腎炎、喘息、血栓症、深部静脈血栓症、多発性硬化症、アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性疾患、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症、動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、自然胎児喪失、再発性胎児喪失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術のような手術による合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の合併症、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、多臓器不全および癌からなる群から選択される。優先的には、補体およびＶＥＧＦ関連疾患は、加齢黄斑変性症および癌である。より優先的には、補体およびＶＥＧＦ関連疾患は、加齢黄斑変性症である。

本発明の１つ以上の態様の詳細は、以下の説明に示されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、およびまた特許請求の範囲から明らかである。

図面のいくつかの図の簡単な説明
前述の要約、ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、現在好ましい態様が図面に示されている。

図において：

図１は、補体Ｃ５開裂ブロッキング活性およびＶＥＧＦ阻害活性を同時に有する二機能性融合タンパク質の概略図である。二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖは、エクリズマブの重鎖をそのＣ－末端でＶＥＧＦ阻害モチーフと融合させることによって生成された。このコンストラクトで使用されるＶＥＧＦ結合モチーフは、ＶＥＧＦＲ１ Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２ Ｄ３キメラドメイン（特許は２０２０年に米国で、ヨーロッパでは２０２１年に失効する）を含む。二機能性融合タンパク質ＶＣ５は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ由来のＦａｂの重鎖Ｆｄ鎖（Ｌｕｃｅｎｔｉｓの特許は２０２０年６月に米国で、２０２２年にヨーロッパで失効する［１］）をそのＣ－末端でエクリズマブ（Ｓｃｆｖ）と融合させることによって生成された。両方の融合タンパク質は、柔軟性および折りたたみを保証するために、機能的エンティティ間に短いＧＳリンカーを含む。

図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ精製された二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析である。２μｇのタンパク質を各レーンにロードした。レーン１は非還元状態である。レーン２は還元状態である。

図３は、精製された二機能性融合タンパク質を使用する補体Ｃ５の直接的なインビトロ結合である。結合したタンパク質は、洗浄後、Ｃ５Ｖ用のＨＲＰ－コンジュゲートされたヤギ抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、またはＶＣ５用のＨＲＰ－コンジュゲートされたヤギ抗－ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。

図４は、ＶＥＧＦと精製された二機能性融合タンパク質との直接的なインビトロ結合を示す。結合したタンパク質は、洗浄後、Ｃ５Ｖ用のＨＲＰ－コンジュゲートされたヤギ抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体、およびＶＣ５用のＨＲＰ－コンジュゲートされたヤギ抗－ヒトＦａｂ特異的抗体で検出された。

図５は、溶液中のＶＥＧＦ－Ａに対する二機能性融合タンパク質のアフィニティー評価である。二機能性融合タンパク質およびＶＥＧＦを溶液中で一晩インキュベートした後、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって遊離ＶＥＧＦ濃度を決定した。

図６は、精製された二機能性融合タンパク質による代替補体経路の阻害である。正常ヒト血清を、まず二機能性融合タンパク質の種々の濃度でインキュベートし、次に５ｍＭのＭｇ^２＋および５ｍＭのＥＧＴＡの存在下でウサギ赤血球を溶解するために使用した。溶血は、ＯＤ ４１２ｎｍでの吸収によって検出された。

図７はＨＵＶＥＣ細胞増殖阻害アッセイの結果である。ＨＵＶＥＣは、２％ＦＢＳを有する内皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、Ｉｎｃ．）で維持された。９６ウェル平底マイクロタイタープレートをコラーゲンでコーティングし、次に５０μｌの１ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）とさまざまな濃度の融合タンパク質とともにインキュベートした。５％ ＣＯ_２を有する３７℃で７２時間インキュベート後、１０μｌのＭＴＳ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、次に４５０／６５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定することによって細胞増殖をアッセイした。

図８は、ＶＥＧＦ誘導性のＨＵＶＥＣ細胞の管形成に対する二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖの阻害効果を示す。内皮ネットワーク形成の定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｊ血管形成システム（５画像／サンプル）によって実行され、ＶＥＧＦ処置と比較した倍率変化として表される。

図９は、ＶＥＧＦ誘導性の内皮細胞浸潤に対する二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖの阻害効果を示す。

図１０Ａおよび１０Ｂは、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖによるマウスにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の阻害を示す。図１０Ａは、レーザー誘発性ＣＮＶモデルにおける血管漏出を表す。図１０Ｂは、レーザー誘発性ＣＮＶ病変の定量化を表す。

発明の詳細な説明
この開示は、記載された特定の方法および実験条件は変化し得るため、記載された特定の方法および実験条件に限定されないことを理解されたい。

本開示の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図しないことも理解されたい。

本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。

本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、それらが使用される文脈が明らかに他のことを示さない限り、単数形および複数形の両方を含むことを意図する。

ある局面において、本発明は、補体Ｃ５およびＶＥＧＦ経路を同時に標的とする二機能性融合タンパク質に関する。補体およびＶＥＧＦ経路が加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を含む多くの疾患に関与するため、補体およびＶＥＧＦに対する二重特異性阻害活性を有するタンパク質は、補体またはＶＥＧＦのいずれかを個々に阻害するタンパク質よりも有意に優れた治療的有効性を提供する可能性がある。本発明において、該二機能性融合タンパク質は、そのＣ－末端で抗Ｃ５抗体の重鎖を、ＶＥＧＦＲ１細胞外ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２細胞外ドメイン３を含むＶＥＧＦ阻害モチーフと融合することによって作成される二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖであってよい。他方、該二機能性融合タンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体ＦａｂのＦｄ鎖をそのＣ－末端で抗Ｃ５抗体Ｓｃｆｖフラグメントと融合することによって生成される二機能性融合タンパク質ＶＣ５であってよい。二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５は、補体Ｃ５タンパク質およびＶＥＧＦに高いアフィニティーで結合でき、および細胞ベースのアッセイにおいて補体およびＶＥＧＦ経路の機能をそれぞれ阻害することができることも示されている。二機能性融合タンパク質は、ヒトタンパク質のドメインを含み、およびすべてヒト起源であり、および非免疫原性であると予期され、およびしたがって、補体および血管形成関連疾患を処置するための治療法としてさらに開発することができる可能性がある。

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の結合タンパク質、またはモチーフ、または異なる遺伝子をコードするペプチド／アミノ酸フラグメントの接続によって作成されたタンパク質を指し、それらの遺伝子の翻訳は元のタンパク質のそれぞれに由来する多機能特性を有する単一または複数のポリペプチドをもたらす。融合タンパク質は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質、異なる抗体にコンジュゲートされた抗体、またはＦａｂフラグメントにコンジュゲートされた抗体を含むことができる。

本明細書で使用される場合、「補体」という用語は、補体カスケードの任意の小さなタンパク質を指し、文献では補体系または補体カスケードとときどき呼ばれる。補体の活性化は、サイトカインの放出および活性化カスケードの増幅を引き起こす一連のプロテアーゼ活性化カスケードにつながり、細胞殺傷性の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａによって引き起こされる炎症、および病原体のオプソニン作用に至る。Ｃ５開裂によって開始されるＭＡＣは、侵入性病原体および損傷した、壊死性、およびアポトーシス性の細胞を排除するために不可欠である。

本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」という用語は、抗原に結合する抗体上の領域を指す。これは、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、および重鎖抗体の可変ドメインおよび第１の定常ドメインで構成される。

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を連結するために使用されるペプチド結合によって結合される、アミノ酸残基またはフラグメント、または２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。リンカーは、任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、またはアロタイプの野生型または変異体の免疫グロブリンＦｃ領域である、Ｆｃフラグメントであってよい。

本明細書で使用される場合、「Ｓｃｆｖ」という用語は、重（Ｖ_Ｈ）鎖および軽（Ｖ_Ｌ）鎖の可変領域からなる一本鎖フラグメント可変領域を指し、これらは、大腸菌で機能的形態において容易に発現することができるフレキシブルなペプチドリンカーによって一緒に結合され、アフィニティーの増加および特異性の変化などのＳｃｆｖの特性を改善するタンパク質操作を可能にする。

本発明において、ＶＥＧＦブロッキング活性を有する任意のモチーフ、ペプチド、タンパク質、またはフラグメント、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦトラップ、またはＤ１－Ｄ７のような、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）細胞外Ｉｇドメイン、特にＶＥＧＦＲ１細胞外Ｉｇドメイン２（ＥＣＤ、Ｄ２）、ＶＥＧＦＲ２細胞外Ｉｇドメイン３（ＥＣＤ、Ｄ３）を使用してよい。

本発明において、補体Ｃ５に結合する任意のモチーフ、ペプチド、タンパク質、またはフラグメント、例えば、エクリズマブの重鎖またはＳｃｆｖを使用してよい。

補体およびＶＥＧＦは、いくつかの疾患、例えばＡＭＤに関与するため、補体Ｃ５の開裂およびＶＥＧＦ活性を同時にブロックするために、補体Ｃ５およびＶＥＧＦに対する二機能性融合タンパク質が、その処置のために本発明において作成される。

本発明の１つの態様において、エクリズマブの重鎖を有するフラグメントは、Ｃ－末端でＶＥＧＦトラップを有する二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖ（配列番号：１）であって、短いフレキシブルなＧＳリンカー（配列番号：３）が各ドメインの正しい折りたたみおよび最小限の立体障害を保証するように間に挿入される、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖを生成するために使用される。関連する態様において、Ｃ５Ｖ融合タンパク質は、配列番号１と少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％同一のアミノ酸配列を含む。

好ましくは、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖの該ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ Ｄ３を含む。

本発明の別の態様において、ラニビズマブＦａｂの重鎖を含むフラグメントは、補体Ｃ５結合モチーフのＣ－末端で融合され、折りたたみが正しく、および立体障害が最小限にされることを保証するように間に短いフレキシブルなＧＳリンカー（配列番号３）を有する二機能性融合タンパク質ＶＣ５（配列番号２）を構築する。関連する態様において、二機能性融合タンパク質ＶＣ５は、配列番号２と少なくとも約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％同一のアミノ酸配列を含む。

特に、二機能性融合タンパク質ＶＣ５の該補体Ｃ５結合モチーフは、エクリズマブのＳｃＦｖフラグメントを含む。

さらなる態様において、本発明に記載されている全ての融合タンパク質は、発現されたタンパク質の細胞外分泌のためのシグナルペプチド（配列番号４）によって導かれる。

二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５の得られる配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示される。

本発明において、上記の二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖおよび／またはＶＣ５は、ＨＥＫ２９３細胞によって一過性に発現され、およびプロテインＧクロマトグラフィーを介してトランスフェクトされた細胞培養上清から精製される。９０％を超える純度を有する生成物が単一ステップの精製プロセスで得られ、すべての融合タンパク質が適切に形成および発現されることが見いだされる。

本発明の１つの態様において、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５の補体Ｃ５への結合能力は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用することによって検証される。１つの態様において、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５は、それぞれＥＣ_５０ ３．５７ｎＭおよび２．７７ｎＭで補体Ｃ５タンパク質への強い結合を示す。

本発明の別の態様において、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５のＶＥＧＦへの結合能力は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用することによって検証される。１つの態様において、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５は、それぞれＥＣ_５０ ０．２８８ｎＭおよび１．６７５ｎＭでＶＥＧＦ－Ａタンパク質への強い結合を示す。

本発明のさらに他の態様において、溶液中の二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶのＶＥＧＦへの結合親和性は、競合結合アッセイによって決定される。本発明において、Ｃ５Ｖ融合タンパク質は、高親和性でＶＥＧＦ－Ａタンパク質に結合し、および、Ｃ５Ｖは、ＥｙｌｅａよりもＶＥＧＦ－Ａタンパク質に対してより高い結合親和性を有する。

当分野で知られており、本明細書に記載されている（例えば、実施例２－７）アッセイは、本開示の二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５の生物学的活性を同定および試験するために使用することができる。いくつかの態様において、補体経路およびＶＥＧＦ－依存性ＨＵＶＥＣ増殖を阻害するための二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５の能力を試験するためのアッセイが提供される。

本開示のある局面は、代替補体経路に対する二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５の阻害活性に関する。具体的には、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５は、Ｍｇ^２＋およびＥＧＴＡの存在下でウサギ赤血球の溶解を阻害するために、正常なヒト血清とインキュベートする。本発明の１つの態様において、Ｃ５ＶおよびＶＣ５による赤血球溶血のＩＣ_５０は、それぞれ２５．３１ｎＭおよび３６．６５ｎＭである。

加えて、ＶＥＧＦ活性は、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ細胞増殖を測定することによって特徴付けてよい。ある態様によれば、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５およびＶＥＧＦＡは、コラーゲンでプレコートされたウェルにロードされ、次に、ＨＵＶＥＣ細胞は、ここで培養されることができる。インキュベーション後、細胞増殖をＭＴＳアッセイによって分析され、Ｃ５ＶおよびＶＣ５のＩＣ_５０は、それぞれ０．１９５ｎＭおよび０．３１３ｎＭである。

したがって、１つの局面において、本発明は、本開示の二機能性融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、補体経路を阻害することにおける使用のための医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害することにおける使用のための医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害するための有効量の融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象において補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害することにおける使用のための医薬組成物を提供する。

いくつかの態様において、医薬組成物は、限定はしないが、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、糸球体腎炎、喘息、血栓症、深部静脈血栓症、多発性硬化症、アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性疾患、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症、動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、自然胎児喪失、再発性胎児喪失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術のような手術による合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の合併症、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、多臓器不全および癌を含む補体および／またはＶＥＧＦ関連疾患の処置のために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載されている融合タンパク質によって処置または予防することができる癌は、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、非小細胞性肺癌、リンパ腫、白血病、腺癌、グリア芽腫、腎臓癌、転移性腎臓癌、胃癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮内膜癌、および乳癌を含む。

いくつかの態様において、医薬組成物は、限定はしないが、湿性加齢黄斑変性症、乾性加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、後水晶体繊維増殖症、網膜中心閉塞、網膜静脈閉塞、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、ブドウ膜炎（例えば、前部、中部、後部、または全ブドウ膜炎）、ベーチェット病、ビエット（Ｂｉｅｔｔ）のクリスタリンジストロフィー、眼瞼炎、緑内障（例えば、開放隅角緑内障）、血管新生緑内障、角膜の新血管形成、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、網膜下新血管形成、角膜炎症、および角膜移植による合併症を含む眼疾患の処置のために使用することができる。

種々の態様において、補体および血管形成に関与する疾患はＡＭＤであってよい。

本明細書で使用される「加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）」という用語は、読書、裁縫、および運転などの「直進（ｓｔｒａｉｇｈｔ－ａｈｅａｄ）」活動に必要な鋭い中心視力をぼかす深刻な眼の状態である。通常、ＡＭＤは目の一部である黄斑に影響を及ぼす。ほとんどのＡＭＤは、網膜および脈絡膜の間に蓄積している細胞残屑を有する乾燥型である。進行性乾性ＡＭＤにおいて、中心の地図状萎縮が起こり、眼の中心の視力が失われる。湿性型ＡＭＤは、異常な血管（脈絡膜新血管形成、ＣＮＶ）が脈絡膜から黄斑の後ろのブルッフ膜を通って成長する、より重症の型である。これらの血管は血液や体液を網膜に漏らし、視力の歪みを引き起こして直線を波打つように見せ、死角や中心視力の喪失を引き起こす。これらの異常な血管は最終的に瘢痕化し、中心視力が永久に失われる。

本発明による医薬組成物は、二機能性融合タンパク質を単独で、または薬学的に許容される担体と一緒に含む適切な形態に製剤でき、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。担体は、溶媒、分散媒体、等張剤などであってよい。担体は、液体、半固体、または固体の担体であってよい。いくつかの態様において、担体は、水、塩水または他のバッファー（血清アルブミンおよびゼラチンなど）、炭水化物（単糖類、二糖類、およびグルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、またはデキストリンを含む他の炭水化物など）、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、増量剤、コーティング剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、非イオン性界面活性剤［ＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など］、またはそれらの組み合わせであってよい。

本発明の医薬組成物は、任意の方法により、ヒトを含む哺乳動物に投与してよい。例えば、本発明の組成物は、経口または非経口（ｐａｒｉｅｔａｌｌｙ）に投与してよい。非経口（ｐａｒｉｅｔａｌ）投与は、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸投与であってよい。

医薬組成物は、補体および／またはＶＥＧＦ関連疾患を予防または処置するための２つ以上の追加の有益な化合物を含むことができる。

いくつかの態様において、医薬組成物は、処置される該疾患または障害を処置するための２つ以上の追加の治療薬を含むことができる。例えば、追加の薬剤は、抗－脂質異常症剤、ＰＰＡＲ－αアゴニスト、ＰＰＡＲ－βアゴニスト、ＰＰＡＲ－γアゴニスト、抗－アミロイド剤、リポフスチンのインヒビター、視覚光サイクルモジュレーター、抗酸化剤、神経保護剤、アポトーシスインヒビター、壊死インヒビター、Ｃ反応性タンパク質インヒビター、インフラマソームのインヒビター、抗炎症剤、免疫抑制剤、マトリクスメタロプロテイナーゼのモジュレーター、補体系または成分のインヒビター、および抗血管形成剤であってよい。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。

実施例１ 補体およびＶＥＧＦ経路の両方を阻害する二機能性融合タンパク質の発現および精製

補体Ｃ５開裂に結合および阻害する活性を有する抗体または抗体フラグメントは、補体活性化ブロッカーとして使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体フラグメントまたはＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦ阻害モチーフとして使用することができる。二機能性発現ベクターを生成するために、ｃＤＮＡを合成および使用した。補体Ｃ５開裂ブロッカーは、図１に示されるように、ＶＥＧＦ阻害モチーフのＮ－末端またはＣ－末端のいずれかの末端に配置することができる。融合タンパク質は、機能的エンティティ間にＧＳリンカーを含み、細胞からの分泌のためにＮ－末端にシグナルペプチドで誘導された。精製した発現ベクターを使用してＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトし、細胞培養培地を９６時間のインキュベーション後に回収し、プロテインＧクロマトグラフィーを介して精製した。２μｇの精製された二機能性融合タンパク質を、還元および非還元条件下でＰＡＧＥ分析した（図２Ａおよび２Ｂ）。１段階精製の純度は、どちらの場合も９０％を超えている。

実施例２ 二機能性融合タンパク質の補体Ｃ５およびＶＥＧＦへのインビトロ結合

ＥＬＩＳＡで補体Ｃ５またはＶＥＧＦに対する精製された融合タンパク質の直接結合をテストするために、Ｃ５またはＶＥＧＦ－Ａでプレコートされたウェル（１００ｎｇ／ウェル）を、０～３０ｎＭの精製されたタンパク質とともに１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ－コンジュゲートされた抗－ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）の１：２５００希釈を、さらに１時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。最終洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を添加し、４５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定し、Ｐｒｉｓｍ４を使用してシグモイドカーブフィッティングによってデータを分析した。図３に示されるように、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５は、それぞれＥＣ_５０ ３．５７ｎＭおよび２．７７ｎＭでＣ５への強い結合を示した。二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５はまた、それぞれ０．２８８ｎＭおよび１．６７５ｎＭのＥＣ_５０でＶＥＧＦ－Ａへの強い結合を示した（図４）。

溶液中のＶＥＧＦに対する融合タンパク質の結合親和性をよりよく評価するために、５ｐＭのＶＥＧＦ－Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を、０～１００ｐＭの精製されたタンパク質とともに一晩インキュベートした。翌日、ＤＥＶ００キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して遊離ＶＥＧＦ濃度を測定した。シグモイドカーブフィッティングによって分析されたデータ。図５に示されるように、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖは、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質に高親和性で結合し、Ｃ５ＶはＥｙｌｅａよりもＶＥＧＦ－Ａタンパク質に対して高い結合親和性を有する。

実施例３ 二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５による代替補体経路の阻害

古典的およびレクチン補体経路はＣａ^２＋およびＭｇ^２＋イオンの両方を必要とするのに対し、補体の代替経路の活性化はＭｇ^２＋のみを必要とします。したがって、５ｍＭのＭｇ^２＋および５ｍＭのＥＧＴＡ（ＥＧＴＡはＣａ^２＋を優先的にキレートする）がアッセイに含まれているとき、代替補体活性は、古典的経路タンパク質の存在下でアッセイすることができる。溶血アッセイは、代替補体活性化に対する融合タンパク質の阻害を評価するために使用することができる。実験において、１．２５×１０^７ウサギ赤血球／ｍｌ（Ｅｒ， Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）の９０％溶解した正常なヒト血清（ＣｏｍｐＴｅｃｈ、ＵＳＡ）の希釈を、３７℃で３０分間インキュベート後に最初に測定した。アッセイは、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ｍＭのＥＧＴＡを含有するＧＶＢ^０バッファー（０．１％ ゼラチン、５ｍＭ Ｖｅｒｏｎａｌ、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ ＮａＮ_３、ｐＨ７．３）で行った。代替補体経路の阻害は、Ｅｒの９０％を溶解することができる正常なヒト血清の希釈を０～５００ｎＭの精製された融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５と３７℃で１時間混合することによって開始された。次に、血清およびＥｒの３０分間インキュベート後、Ｅｒの溶血をアッセイした。Ｐｒｉｓｍ４を使用してデータを分析した。図６の結果は、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５が補体代替経路について、それぞれ２５．３１ｎＭおよび３６．６５ｎＭのＩＣ_５０を有することを示す。

実施例４ 血管形成ブロッカーによるＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖アッセイの阻害

精製された二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶおよびＶＣ５を使用して、細胞ベースアッセイにおいてＶＥＧＦ活性を阻害した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ ｃｅｌｌｓ、Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）は、ＶＥＧＦブロッカーによって阻害することができるＶＥＧＦ依存性細胞増殖を実証するために一般的に使用される。実験において、ＨＵＶＥＣは２％ＦＢＳを含む内皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）で維持される。コラーゲンでプレコートされたウェルに、Ｍｅｄｉｕｍ－１９９（１０％ ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）における１×１０^５細胞／ｍｌで５０μｌのＨＵＶＥＣを各ウェルに追加する前に、１時間３７℃でウェルあたり５０μｌの１ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）および種々の濃度のＣ５ＶまたはＶＣ５をロードした。５％ ＣＯ_２を含む３７℃で７２時間インキュベート後、１０μｌのＭＴＳ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、次に４５０／６５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定することによって細胞増殖をアッセイした。図７に示されるとおり、二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶまたはＶＣ５の能力は、それぞれ、０．１９５ｎＭおよび０．３１３ｎＭのＩＣ_５０を有するＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖を阻害するための優れた能力を示した。

実施例５ 二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶによるＶＥＧＦ誘導性内皮細胞管形成の阻害

血管形成におけるＣ５Ｖの機能を調べるために、インビトロでＭａｔｒｉｇｅｌチューブ形成アッセイをヒト臍帯静脈内皮細胞で実施した。ＨＵＶＥＣ細胞を血清を含まない基本培地で２時間インキュベートし、次にアキュターゼによりトリプシン処理した。４ｘ１０^３ ＨＵＶＥＣ細胞を、ＶＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）とＥｙｌｅａ（１００μｇ／ｍｌ）またはＣ５Ｖタンパク質（１００μｇ／ｍｌ）を含むＭａｔｒｉｇｅｌプレコートウェルに３７℃で４．５時間播種した。内皮ネットワーク形成の定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｊ血管形成システム（５画像／サンプル）によって実行された。

ＶＥＧＦ処理下で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で４．５時間培養したとき、ＨＵＶＥＣ細胞は初期血管管状ネットワークを示した。しかし、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖは、管状構造の形成を妨害した（図８Ａおよび８Ｂ）。

実施例６ 二機能性融合タンパク質Ｃ５ＶによるＶＥＧＦ誘導性内皮細胞浸潤の阻害

ＶＥＧＦ刺激に対する二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖの浸潤効果をトランスウェル分析によって調べた。浸潤アッセイは、製造元の指示に従って、トランスウェルインサートをＭａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でプレコートすることによって実行された。Ｍｅｄｉｕｍ－１９９と共にＨＵＶＥＣ細胞（２ｘ１０^５）を上部ウェルに配置した。リガンドヒトＶＥＧＦ（０．２μｇ／ｍｌ）を下部チャンバーにおいてＥｙｌｅａ（２μｇ／ｍｌ）またはＣ５Ｖ（２μｇ／ｍｌ）と個々に混合した。トランスウェルプレートを５％インキュベーター内で２４時間インキュベートし、上部ウェルから下部チャンバーに向かって細胞を移動させた。次に、膜インサートを固定し、１％クリスタルバイオレットで染色した。膜インサートの下面に付着した細胞を顕微鏡で可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して移動した細胞の平均数を計算した。

図９Ａおよび９Ｂに示されるとおり、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖは、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の浸潤を有意に阻害した。

実施例７ 二重特異性タンパク質Ｃ５Ｖは、レーザー誘発性ＣＮＶマウスモデルにおいて新血管形成を阻害する

ＶＥＧＦおよびＣ５は、眼の新血管新生疾患の特徴である病理学的新血管形成および血管透過性に強く関連しているようである。高レベルのＣ５は、ヒトの湿性加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および炎症における疾患重症度とも相関している。我々は、ＶＥＧＦおよびＣ５を共標的化する革新的なデザインを生成した。我々は、レーザー誘発性脈絡膜新血管形成マウスモデルによる血管形成に対する二重特異性タンパク質Ｃ５Ｖの効果をテストした。レーザー誘発性ＣＮＶモデルにおいて、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、ビヒクルコントロール、Ｅｙｌｅａ（４０μｇ）またはＣ５Ｖ（４０μｇ）を１日目に右眼に硝子体内注射した（ｎ＝５／グループ）。ブルッフ膜へのレーザー誘発損傷は、レーザー適用部位の気泡であることが確認された。眼底フルオレセイン血管造影（ＦＦＡ）分析のために、麻酔をかけた動物に５％フルオレセインナトリウムを腹腔内注射した。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して画像をキャプチャした。ＯＣＴ画像はレーザーの２１日後に取得され、新血管新生病変の体積は楕円体として測定された。楕円体の体積は、式 Ｖ＝４／３πａｂｃによって計算され、ここで、ａ（幅）、ｂ（深さ）、およびｃ（長さ）は、楕円体の水平面または垂直面の半径である。

図１０Ａに示されるとおり、二機能性融合タンパク質Ｃ５Ｖは、レーザー誘導性ＣＮＶモデルで血管漏出を減少させた（図１０Ａ）。光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）による楕円体としてのレーザーＣＮＶ病変の定量化は、二機能融合タンパク質Ｃ５Ｖ処置後の病変体積の有意な減少を示した（図１０Ｂ）。

本発明は、好ましい実施形態によって開示されてきたが、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、改変および修飾を行うことができるであろう。したがって、本発明の保護の範囲は、添付される特許請求の範囲によって定義されるものによって支配されるものとする。

参考文献

Claims (19)

1. 補体シグナル伝達経路および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路、または両方を阻害する二機能性融合タンパク質であって、融合タンパク質が、補体Ｃ５開裂ブロッカー、ＶＥＧＦ阻害モチーフ、および接合点でのＧＳリンカーを含む、二機能性融合タンパク質。
2. リンカーで融合される、１つ以上の補体Ｃ５結合モチーフ含有フラグメントおよび１つ以上のＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントを含み、それにより補体および血管形成の阻害において、同時に、有意に改善された有効性を提供する、二機能性融合タンパク質。
3. 補体Ｃ５結合モチーフが、Ｃ－末端でＶＥＧＦトラップを有する該二機能性融合タンパク質を生成するために使用され、および短いリンカーがその間に挿入される、請求項２に記載の二機能性融合タンパク質。
4. 補体Ｃ５結合モチーフが、エクリズマブの重鎖である、請求項３に記載の二機能性融合タンパク質。
5. ＶＥＧＦ結合モチーフが、ＶＥＧＦＲ１ ＥＣＤ Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２ ＥＣＤ Ｄ３ キメラドメインを含む、請求項３に記載の二機能性融合タンパク質。
6. 短いリンカーが、短いフレキシブルな(flexible)ＧＳリンカーである、請求項３に記載の二機能性融合タンパク質。
7. 短いフレキシブルなＧＳリンカーが、配列番号３に示されているアミノ酸を有する、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
8. 配列番号１に示されているアミノ酸を有する、請求項３に記載の二機能性融合タンパク質。
9. ＶＥＧＦ結合モチーフが、間に短いリンカーを有する該二機能性融合タンパク質を構築するように、補体Ｃ５結合モチーフのＣ－末端で融合される、請求項２に記載の二機能性融合タンパク質。
10. ＶＥＧＦ結合モチーフが、ラニビズマブＦａｂの重鎖を含有するフラグメントである、請求項９に記載の二機能性融合タンパク質。
11. 補体Ｃ５結合モチーフが、エクリズマブのＳｃＦｖフラグメントである、請求項９に記載の二機能性融合タンパク質。
12. 短いリンカーが、短いフレキシブルなＧＳリンカーである、請求項９に記載の二機能性融合タンパク質。
13. 短いフレキシブルなＧＳリンカーが、配列番号３に示されているアミノ酸を有する、請求項１２に記載の二機能性融合タンパク質。
14. 配列番号２に示されているアミノ酸を有する、請求項９に記載の二機能性融合タンパク質。
15. 請求項１－１４のいずれかに記載の融合タンパク質またはフラグメント、および薬学的に許容される担体を含む、補体およびＶＥＧＦ関連疾患の処置のための医薬組成物。
16. 補体およびＶＥＧＦ関連疾患が、アテローム性動脈硬化症、加齢黄斑変性症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、糸球体腎炎、喘息、血栓症、深部静脈血栓症、多発性硬化症、アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性疾患、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症、動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、自然胎児喪失、再発性胎児喪失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術のような手術による合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の合併症、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、多臓器不全および癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 補体およびＶＥＧＦ関連疾患が、加齢黄斑変性症である、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 処置を必要とする対象において補体およびＶＥＧＦ関連疾患を処置するための方法であって、方法は、請求項１－１４のいずれかに記載の二機能性融合タンパク質の治療有効量を該対象に投与することを含み、補体およびＶＥＧＦ関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、加齢黄斑変性症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、糸球体腎炎、喘息、血栓症、深部静脈血栓症、多発性硬化症、アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性疾患、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症、動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、自然胎児喪失、再発性胎児喪失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術のような手術による合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の合併症、虚血再灌流障害、臓器移植拒絶反応、多臓器不全および癌からなる群から選択される、方法。
19. 補体およびＶＥＧＦ関連疾患が、加齢黄斑変性症である、請求項１８に記載の方法。

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