JP2022505816A

JP2022505816A - 小型化ジストロフィンおよびそれらの使用

Info

Publication number: JP2022505816A
Application number: JP2021522489A
Authority: JP
Inventors: バンクス，グレン; ハリーデイビス，ジョナサン; チャールズレベスク，ポール
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2022-01-14
Also published as: KR20210082193A; AU2019368307A1; WO2020086844A1; IL282547A; BR112021007480A2; CO2021005083A2; PE20211110A1; MX2021004688A; CA3117738A1; SG11202104051VA; EP3870202A1; CL2021000994A1; EA202191123A1; US20210403947A1; EP3870202B1; CN113613668A

Abstract

ここに開示されるのは、小型化ジストロフィンに関連する核酸分子、ポリペプチド、細胞、ベクターおよび医薬組成物である。該小型化ジストロフィンの製造方法および治療的使用の方法も開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２４日出願の米国仮出願６２／７４９９８２に基づく優先権の利益を主張し、それは引用により全体として本明細書に包含させる。

分野
ここに開示する主題は、一般に小型化ジストロフィンに関連するポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、ベクター、使用およびキットに関する。

発明の背景
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)は、男性３,５００名中約１名が罹患する劣性遺伝性筋肉消耗性障害である。ＤＭＤは、Ｘ染色体に位置するジストロフィン遺伝子の変異が原因である。この遺伝子の変異は、ジストロフィンタンパク質の発現異常または欠失に至る。

ジストロフィンは、筋細胞完全性および機能の制御を担うタンパク質複合体の重要な成分である。ＤＭＤ患者は、一般に小児期に自分で体を支える能力を失い、時間と共に進行性に弱化する。骨格筋のこの進行性消耗および心機能不全は、一般に歩行運動の喪失と、主に、心臓または呼吸器不全による早期死亡に至る。

ＤＭＤを処置するいくつかの試みは過去になされている。しかしながら、利用可能な処置選択肢は、約４.９kbを超える異種ＤＮＡを伝達できないアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を含む、標準ウイルスベクターを使用してＤＭＤ患者に投与し、発現させることが不可能である、野生型ジストロフィンｃＤＮＡの大きなサイズ(約１３.９kb)により顕著に制限された。それ故に、遺伝子治療のためにベクターに効率的に包括され得る組み換えジストロフィン遺伝子を開発する必要性がある。

アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターは、タンパク質発現レベルの低減または完全な欠如をもたらす遺伝的欠損の矯正を目的とした遺伝子治療アプローチに有用であることが示されており(Nathwani et al to A.M Keeler et al.)、遺伝子ノックダウン、ゲノム編集または修飾および非コードＲＮＡ調節に有用である可能性がある(Valdmanis et al., 2017)。

ジストロフィンの筋肉特異的アイソフォームのｃＤＮＡ全体の、単一ｒＡＡＶカプシドへの包括は、ジストロフィンｃＤＮＡの大きなサイズのため、容易に達成され得ない。先の研究は、ジストロフィンの特定のドメインのみを発現する小さな遺伝的構築物の開発に焦点が絞られていた。各々引用により本明細書に包含させる米国特許,８６９,７７７および８,５０１,９２０参照。しかしながら、これらのアプローチの成功は限定的でしかなかった。

ジストロフィン遺伝子に変異を有する患者の処置のためのより精密かつ効率的遺伝子治療ツールの必要性があり、特に、遺伝子治療のためにベクターに効率的に包括され得る組み換えジストロフィン遺伝子の開発の必要性がある。

発明の概要
本発明は、Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドがジストロフィンのスペクトリン反復２を含まない核酸分子を提供する。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、スペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメイン、スペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインまたはスペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメインまたはこれらの何れかの組み合わせを含まない。ある実施態様において、Ｒ１ドメインはペプチド結合にＲ３ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬ(ＲＶ)により融合されている。ある実施態様において、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカーにより融合されている。

ある実施態様において、リンカーは配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列はｎＮＯＳシグナル伝達の改善ができる。

ある実施態様において、ここに開示されるのは、配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であり、ここで、該核酸分子は配列番号１００(ATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGACATGCCCCTGGAAATC)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であり、ここで、該アミノ酸配列はｎＮＯＳシグナル伝達の改善ができる。ある実施態様において、アミノ酸配列は、ジストロフィンの第一ドメインをジストロフィンの第二ドメインに結合するリンカーである。ある実施態様において、ジストロフィンの第一ドメインはＨ２ドメインであり、ジストロフィンの第二ドメインはＲ１６ドメインである。ある実施態様において、アミノ酸配列は、Ｎ末端に配列番号７４の配列をさらに含む。

ある実施態様において、核酸分子は、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む。ある実施態様において、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬ(ＲＶ)により融合されており、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインは、配列番号７４～７５に示されるアミノ酸配列の組み合わせにより融合されている。ある実施態様において、(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインは直接融合されている、(ii)Ｒ３ドメインおよびＨ２ドメインは直接融合されている、(iii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインは直接融合されている、(iv)Ｒ１７およびＲ２４ドメインは直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインは直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドはＡＢＤ１ドメインおよび／またはＣＲドメインをさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、アミノ酸ＲＶ、Ｒ３ドメイン、Ｈ２ドメイン、配列番号７４～７５に示すアミノ酸配列、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインから本質的になるまたはそれからなる。

ある実施態様において、Ｈ１ドメインは、配列番号６９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１ドメインは、配列番号７０に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ３ドメインは、配列番号７２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ２ドメインは、配列番号７３に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１６ドメインは、配列番号７６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１７ドメインは、配列番号７７に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ２４ドメインは、配列番号７８に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ４ドメインは、配列番号７９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端に、配列番号６８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｃ末端に、配列番号８０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１１８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号１３３のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一の配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、(ｉ)ＢＸＡ－０２７７４１と比較してより低いＣＤ４増殖、(ii)ＢＸＡ－０２７７４１と比較してより低いＣＤ８増殖、(iii)ＢＸＡ－０２７７４１より高い小型化ジストロフィンポリペプチドの発現および(iv)これらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の性質を示す。

ある実施態様において、核酸分子は、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインは、配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)を含むリンカーにより融合されている。

ある実施態様において、核酸分子は、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、ヒンジ３(Ｈ３)ドメイン、スペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインは、配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)により融合されている。

ある実施態様において、(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインは直接融合されている、(ii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインは直接融合されている、(iii)Ｒ１７およびＨ３ドメインは直接融合されている、(iv)Ｒ２３およびＲ２４ドメインは直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインは直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせである。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、スペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメインおよび／またはスペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインを含まない。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＡＢＤ１ドメインおよび／またはＣＲドメインをさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、配列番号８４に示すアミノ酸配列、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｈ３ドメイン、Ｒ２３ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインから本質的になるまたはそれからなる。ある実施態様において、Ｈ１ドメインは、配列番号８２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１ドメインは、配列番号８３に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１６ドメインは、配列番号８５に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１７ドメインは、配列番号８６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ３ドメインは、配列番号８７に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ２３ドメインは、配列番号８８に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ２４ドメインは、配列番号８９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ４ドメインは、配列番号９０に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端に、配列番号８１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｃ末端に、配列番号９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１３２またはＣ末端ドメインが欠失されている配列番号１３２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号１４７または配列番号１４８または配列番号１４９のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＢＸＡ－１９６４８１より高い小型化ジストロフィンポリペプチドの発現を示す。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチド発現は、ＢＸＡ－１９６４８１ポリペプチド発現より少なくとも約１.５倍、少なくとも約１.６倍、少なくとも約１.７倍、少なくとも約１.８倍、少なくとも約１.９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.１倍、少なくとも約２.２倍、少なくとも約２.３倍、少なくとも約２.４倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約２.６倍、少なくとも約２.７倍、少なくとも約２.８倍、少なくとも約２.９倍または少なくとも約３倍高い。

ある実施態様において、核酸分子はプロモーターをさらに含む。ある実施態様において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。ある実施態様において、プロモーターは、肝細胞、筋細胞、内皮細胞、神経細胞、類洞細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおける治療タンパク質の発現を駆動する。ある実施態様において、プロモーターは、マウスサイレチンプロモーター(ｍＴＴＲ)、内因性ヒト第VIII因子プロモーター(Ｆ８)、ヒトアルファ－１－抗トリプシンプロモーター(ｈＡＡＴ)、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン(ＴＴＰ)プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、シナプシン１遺伝子プロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、α１－抗トリプシン(ＡＡＴ)、筋肉クレアチンキナーゼ(ＭＣＫ)、ミオシン重鎖アルファ(αＭＨＣ)、ミオグロビン(ＭＢ)、デスミン(ＤＥＳ)、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、ｔＭＣＫおよびホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターからなる群から選択される。

ある実施態様において、核酸分子はイントロン配列をさらに含む。ある実施態様において、イントロン配列は、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する。ある実施態様において、イントロン配列は、プロモーターの３’に位置する。ある実施態様において、イントロン配列は合成イントロン配列を含む。

ある実施態様において、核酸分子は転写後調節エレメントをさらに含む。ある実施態様において、転写後調節エレメントは、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する。ある実施態様において、転写後調節エレメントは、変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(ＷＰＲＥ)、マイクロＲＮＡ結合部位またはＤＮＡ核ターゲティング配列またはこれらの何れかの組み合わせを含む。

ある実施態様において、核酸分子は、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列をさらに含む。ある実施態様において、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列は、ｂＧＨポリ(Ａ)、アクチンポリ(Ａ)、ヘモグロビンポリ(Ａ)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列は、ｂＧＨポリ(Ａ)を含む。

ある実施態様において、核酸分子はエンハンサー配列をさらに含む。

ある実施態様において、核酸分子は第一ＩＴＲおよび／または第二ＩＴＲをさらに含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲは同一である。ある実施態様において、第一ＩＴＲおよび／または第二ＩＴＲはアデノ随伴ウイルス由来である。

ある実施態様において、核酸分子は、異種部分を含む。ある実施態様において、異種部分は、アルブミンまたはそのフラグメント、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはそのフラグメント、アルブミン結合部分またはその誘導体およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する核酸分子を含むベクターである。ある実施態様において、ベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターである。ある実施態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１から選択される。ある実施態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９である。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子またはベクターは、送達剤と製剤化される。ある実施態様において、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。ある実施態様において、送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソームおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子またはベクターは、静脈内、経皮、皮内、皮下、肺または経口送達またはこれらの何れかの組み合わせのために製剤化される。ある実施態様において、ここに開示する核酸分子またはベクターは、静脈内送達のために製剤化される。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する核酸分子またはベクターによりコードされるポリペプチドである。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する核酸分子を含む宿主細胞である。ある実施態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞である。

ある実施態様において、提供されるのは、(ａ)ここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示するポリペプチドまたはここに開示する宿主細胞；および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物および核酸分子をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する宿主細胞を適当な条件下で培養し、小型化ジストロフィンポリペプチドを回収することを含む、小型化ジストロフィンポリペプチドの製造方法である。

ある実施態様において、提供されるのは、ここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物を投与することを含む、小型化ジストロフィンポリペプチドをそれを必要とする対象で発現させる方法である。

ある実施態様において、提供されるのは、対象にここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物を投与することを含む、疾患または状態を有する対象を処置する方法である。ある実施態様において、疾患または状態はジストロフィン欠損が原因の疾患である。ある実施態様において、疾患は、サルコペニア、心疾患、カヘキシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、ベッカー型筋ジストロフィー(ＢＭＤ)、Ｘ染色体拡張型心筋症(ＸＬＤＣ)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィーおよび／または先天性筋ジストロフィーである。ある実施態様において、該核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物は静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される。ある実施態様において、核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物は静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される。

ある実施態様において、方法は対象に第二剤を投与することをさらに含む。

ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、対象への核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物の投与は、投与前の対象におけるジストロフィンタンパク質発現と比較してジストロフィンタンパク質発現を増加させ、ここで、ジストロフィンタンパク質発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍増加する。

ある実施態様において、ここに開示されるのは、ヒンジ２(Ｈ２)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であり、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインは、配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)を含むリンカーにより融合されている。

完全長ヒトジストロフィンタンパク質の模式図を示す。ＡＢＤ１：アクチン結合ドメイン－１；Ｈ＃(例えば、Ｈ１)：ヒンジ領域；Ｒ＃(例えば、Ｒ１)：スペクトリン様反復ドメイン；ＡＢＤ２：アクチン結合ドメイン－２；ＣＲ：システインリッチドメイン；Ｃ－ｔｅｒｍ：タンパク質のＣ末端ドメイン。

小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－０２７７４１、ＢＸＡ－０２７７４２、ＢＸＡ－０２７７４３、ＢＸＡ－０２７７４４、ＢＸＡ－１９６４８０およびＢＸＡ－１９６４８１、ならびに、参照として、図１の完全長ヒトジストロフィンタンパク質の模式図を示す。

示す小型化ジストロフィンポリペプチドを発現するプラスミドのトランスフェクション後、ヒト同質遺伝子的誘導多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)由来心臓筋細胞(ｉＣＭ)(内因性ジストロフィン発現を阻止するＥ２０３５Ｘ中途停止コドンをジストロフィン遺伝子内に担持)における小型化ジストロフィンポリペプチド発現対小型化ジストロフィンｍＲＮＡ発現の比を示す。

示されるとおり、比較的低い免疫原性を有するＢＸＡ－０２７７４３の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１３２)、ならびにその接合部Ｊ１およびＪ７のアミノ酸配列の模式図を示す。

ＢＸＡ－０２７７４１の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２９)の模式図を示し、矢印はその接合部Ｊ１０、Ｊ１１およびＪ９を指す。

試験した４０サンプル細胞パネル中、示すとおり種々の接合部ペプチドでパルスされ、ＣＤ４＋増殖細胞を有したサンプルの比率を示すヒストグラムを示す(各着色された四角は１患者サンプルを表す)。

試験した４０サンプル細胞パネル中、示すとおり種々の接合部ペプチドでパルスされ、ＣＤ８＋増殖細胞を有したサンプルの比率を示すヒストグラムを示す(各着色された四角は１患者サンプルを表す)。

ＢＸＡ－１９６４７３の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１１９)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７７の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１１８)の模式図を示す。ＲＶ：Ｒ１とＲ３間のアルギニン－バリンジペプチド；ＳＥＡＱ：セリン－グルタミン酸－アラニン－グルタミンペプチド。

小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－０２７７４１(配列番号１２９)のＲ１とＲ３の間の元の接合部１０周囲の三次元折り畳み(左)および小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－１９６４７７(配列番号１１８)の接合部１０のバージョン３周囲の三次元折り畳み(右)を示す。

示す小型化ジストロフィンポリペプチドを発現するプラスミドでトランスフェクション後のヒト同質遺伝子的誘導多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)由来心臓筋細胞(ｉＣＭ)(内因性ジストロフィン発現を阻止するＥ２０３５Ｘ中途停止コドンをジストロフィン遺伝子内に担持)における小型化ジストロフィンポリペプチド発現対小型化ジストロフィンｍＲＮＡの比を示す。

ＢＸＡ－１９６４７４の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２０)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７５の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２１)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７６の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２２)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７８の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２４)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７９の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号１２５)の模式図を示す。

ＢＸＡ－１９６４７７およびＢＸＡ－２１３７８８の小型化ジストロフィンポリペプチドを発現するＡＡＶ９構築物で感染させたヒトＤＭＤｈｉＰＳＣＣＭの伝導速度。図１５Ａは、実験で使用した多電極アレイ(ＭＥＡ)の写真(左)およびＭＥＡの個々の電極の写真(右)を示す。図１５Ｂは、実験条件下ＭＥＡの２８電極からのシグナルを示す。図１５Ｃは、アレイにわたる興奮伝導を説明する図を示す。図１５Ｄは、ＢＸＡ－１９６４７７(配列番号１１８)およびＢＸＡ－２１３７８８(配列番号１５２)の小型化ジストロフィンポリペプチドの模式図を示す。図１５Ｅは、ＢＸＡ－１９６４７７(配列番号１１８)およびＢＸＡ－２１３７８８の小型化ジストロフィンポリペプチドを発現するヒトＤＭＤｈｉＰＳＣＣＭの伝導速度がトランスフェクション後の時間の関数としてプロットされる、グラフを示す。図１５Ｆは、伝導速度を測定した細胞内の小型化ジストロフィンポリペプチドの発現を示すヒストグラムを示す。

実施したインビボ試験の実験設定を要約する模式図を示す。

ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８の標的結合。図１７Ｂは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したマウスの筋肉組織における小型化ジストロフィンポリペプチドおよび小麦胚芽凝集素(ＷＧＡ)の発現の免疫蛍光可視化を示す。図１７Ａは、種々の筋肉における小型化ジストロフィンに陽性な細胞の相対数を示すヒストグラムを示す。斜め線が入ったバー＝ＷＧＡ陽性細胞の割合としてのＢＸＡ－１９６４７７小型化ジストロフィン陽性細胞％；縦線の入ったバー＝ＷＧＡ陽性細胞の割合としてのＢＸＡ－２１３７８８小型化ジストロフィン％。

４週齢のｍｄｘ^４ｃｖマウスで決定したＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８の標的結合。図１８Ａは、ＢＸＡ－１９６４７７(配列番号１１８)およびＢＸＡ－２１３７８８(配列番号１５２)の小型化ジストロフィンポリペプチドの模式図を示す。図１８Ｂは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウスの筋肉組織におけるウイルスゲノムの相対量を示すヒストグラムを示す。図１８Ｃは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウスの心臓における小型化ジストロフィンｍＲＮＡの相対量を示すヒストグラムを示す。図１８Ｄは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したマウスの筋肉組織における小型化ジストロフィンタンパク質の相対量を示すヒストグラムを示す。Ｄｉａ＝横隔膜；Ｇａｓ＝腓腹筋；ＴＡ＝前脛骨筋。処置マウスを野生型およびｍｄｘ^４ｃｖ非処置マウスと比較した。

ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウス(４週)の血清におけるクレアチンキナーゼの量を示すヒストグラムを示す。

ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウス(１２週)の血清におけるクレアチンキナーゼの量を示すヒストグラムを示す。処置マウスを野生型およびｍｄｘ^４ｃｖ非処置マウスと比較した。

２カ月齢のピーク強縮。図２０Ａは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウスにおける収縮性性質(ニュートンメートルでの力；Ｎｍ)を示すグラフを示す。図２０Ｂは、処置マウスにおけるピーク強縮を示すヒストグラムを示す。図２０Ｃは、処置マウスにおけるＴＡ質量を示すヒストグラムを示す。図２０Ｄは、処置マウスにおける力／ＴＡ質量を示すヒストグラムを示す。処置マウスを野生型およびｍｄｘ^４ｃｖ非処置マウスと比較した。

収縮誘導傷害からの保護。図２１Ａは、実験設定を概説するグラフを示す。図２１Ｂは、ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置したマウスにおける筋肉の収縮性性質(最大等尺性トルク)を示すグラフを示す。処置マウスを野生型およびｍｄｘ^４ｃｖ非処置マウスと比較した。

ＢＸＡ－０２７７４１の小型化ジストロフィンポリペプチド(配列番号配列番号１２９)の模式図を示す。

接合部ペプチド１～１２の免疫原性を示すヒストグラムを示す。

接合部ペプチドに対するＭＨＣＩ／ＣＤ８＋免疫応答を示すヒストグラムを示す。ペプチドＪ１１ｖ３は、図２２Ｂのペプチド番号３と同じペプチドである。

接合部ペプチドに対するＭＨＣＩＩ／ＣＤ４＋免疫応答を示すヒストグラムを示す。ここでのペプチドＪ１１ｖ３は、図２２Ｂにおけるペプチド番号３と同じペプチドである。

発明の詳細な記載
概要
本発明は、新規小型化ジストロフィンまたはそれをコードする遺伝子に関する。小型化ジストロフィンは調節カセットに操作可能に連結され得る。本発明はまた筋ジストロフィー、サルコペニア、心不全またはカヘキシーを有する対象を処置する方法に関する。さらに、本発明は、筋ジストロフィー、サルコペニア、心不全またはカヘキシーを発症するリスクのある対象を予防的に処置する方法にも関する。筋ジストロフィー、サルコペニア、心不全またはカヘキシーを有するまたは発症するリスクのある対象を処置する方法は、小型化ジストロフィン遺伝子および送達媒体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み得る。

定義
本発明がより容易に理解され得るように、一部用語をまず定義する。本明細書で使用される限り、ここで異なる意味が明示的に示される場合の除き、次の用語の各々は、次に示す意味を有する。さらなる定義は、本明細書において逐次示される。

用語「および／または」は、ここで使用されるとき、二つの特定の性質の各々の、他方を伴うまたは伴わない特定の開示として解釈されるべきである。故に、「Ａおよび／またはＢ」などの表現で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの言い回しで使用される用語「および／または」は、次の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。

態様がここで用語「含む」を用いて記載されているとき、「からなる」および／または「から本質的になる」の用語で記載される他の点で類似する態様もまた提供されることは理解される。

特に異なって定義されない限り、ここで使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に本開示で使用される用語の多くの一般的辞典を提供する。

単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)により受け入れられた形態で使用する。数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。ここに提供する各文節の表題は開示の種々の態様を限定するのではなく、それは、全体として本明細書を参酌して捉えられるべきである。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として引用してより完全に定義される。

ジストロフィン(ＤＭＤ)は、ジストロフィンをコードする大きなヒトＸ染色体遺伝子である。タンパク質ジストロフィンは、筋鞘の細胞質面に局在化し、筋線維におけるコスタメアで豊富な４２７kDa細胞骨格タンパク質である。ジストロフィンタンパク質は、アクチン結合アミノ末端ドメイン(ＡＢＤ１)；「スペクトリン反復ドメイン」と称される一連のロッドおよびヒンジを含む中央ロッドドメイン；システインリッチドメイン；およびカルボキシル末端の４つの主な機能的ドメインを有する。

ここで使用する用語「小型化ジストロフィンポリペプチド」または「小型化ジストロフィンペプチド」は、完全長野生型ジストロフィンポリペプチドより小さなサイズのポリペプチドをいう。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＤＭＤ動物モデルにおいて、野生型値の少なくとも約１０％または２０％まで筋肉生理学または解剖所見の測定可能な値を変え(場合に応じて増加させるかまたは減少させる)、該値を野生型値に近づけるようにする(例えば、ｍｄｘマウスは、野生型値の５０％である筋肉生理学または解剖所見の測定可能な値を有し、この値は、野生型値の少なくとも６０％まで増加する；またはｍｄｘマウスは野生型値の１５０％である筋肉生理学または解剖所見の測定可能な値を有し、この値が野生型値の最大１４０％までに減少する)。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＤＭＤ動物モデルにおける筋肉生理学または解剖所見の測定可能な値を。野生型値の少なくとも約３０％まで変えることができる。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＤＭＤ動物モデルにおける筋肉生理学または解剖所見の測定可能な値を、野生型値に類似するレベル(例えば、±４％)まで変えることができる。

ここで使用する用語「スペクトリン反復」または「スペクトリン様反復」は、スペクトリン反復が一般に複数コピーで存在する、ジストロフィンを含む、多くの構造タンパク質の棒様形態を担う約１００アミノ酸からなるペプチドをいう。スペクトリン反復は、アミノ酸配列における保存的および／または非保存的変化などの天然ペプチド配列の変異ならびにスペクトリン反復末端またはスペクトリン反復内への／からの最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の付加または欠失を含み得る。ある実施態様において、各スペクトリン反復(Ｒ１～Ｒ２４の各々)は、天然に存在するスペクトリン反復(天然に存在するＲ１～Ｒ２４の各々)に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有する。

ここで使用する用語「スペクトリン反復コード化配列」は、スペクトリン反復ペプチドをコードする核酸配列をいう。この用語は、スペクトリン反復(例えば、天然に存在するおよび変異両者のスペクトリン反復ペプチド)をコードする天然および合成核酸配列を含む。

ここで使用する用語「スペクトリン反復ドメイン」は小型化ジストロフィンポリペプチドのスペクトリン反復を含む小型化ジストロフィンポリペプチドにおける領域をいう。

用語「融合した」は、通常天然では結合していない第二アミノ酸配列にインフレームで結合し、「融合」タンパク質／ポリペプチドを形成する第一アミノ酸配列をいう。これらの通常別々のタンパク質に存在する融合したアミノ酸配列はまとまって融合ポリペプチドとなり得るかまたは通常同じタンパク質に存在するアミノ酸配列は融合ポリペプチドにおいて新しい配置で配置され得る。融合タンパク質は、例えば、化学ペプチド合成により製造されるか、組み換えＤＮＡテクノロジーによって、それにより、ペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドが製造され、次いで翻訳される。融合タンパク質はまた共有、非ペプチド結合または非共有結合により第一アミノ酸配列に結合した第二アミノ酸配列も含み得る。ある実施態様において、２ポリペプチド間の「融合」は、リンカーにより達成される。リンカーはアミノ酸でも他の化学構造でもよい。ある実施態様において、リンカーは合成され得る。

ある実施態様において、２ポリペプチド間の「融合」は直接融合である、すなわち、介在するリンカーがない。用語「直接的に融合」または「直接融合」は、ペプチド結合による２ポリペプチド鎖間の結合である。例えば、第一アミノ酸は、該第一アミノ酸が第二アミノ酸にペプチド結合により「融合」されるとき、第二アミノ酸に「直接的に融合」される。

それぞれ大きなポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるポリペプチド部分またはポリヌクレオチド部分に関する「異種」および「異種部分」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の残りと異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのさらなる異種成分は、ここに記載する残りのポリペプチドまたはポリヌクレオチドとそれぞれ同じ生物に由来するかまたはさらなる成分は異なる生物に由来し得る。例えば、異種ポリペプチドは合成物であっても、異なる種、個体の異なる細胞型または別の個体の同じもしくは異なるタイプの細胞に由来してもよい。ある態様において、異種部分は、ポリペプチドを産生するように他のポリペプチドに融合したポリペプチドである。他の態様において、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートしたＰＥＧなどの非ポリペプチドである。

ここで使用する用語「筋細胞」は、骨格筋、平滑筋(例えば消化管、膀胱および血管)および心筋由来細胞を含むが、これらに限定されない、筋肉組織由来の細胞をいう。本用語は、インビトロ、エクスビボおよびインビボでの筋細胞を含む。故に、例えば、単離された心筋細胞は、インビボで対象内に存在する筋肉組織に存在する細胞と同様、筋細胞を構成する。この用語はまた末期的に分化したおよび分化していない両方の筋細胞、例えば、ミオサイト、筋管、筋芽細胞、心筋細胞および心筋芽細胞も包含する。

遺伝子調節エレメント(例えば、エンハンサー配列、プロモーター配列)に対比してここで使用する用語「筋肉特異的」は、他の組織において該調節エレメントにより駆動される転写活性と比較して、主に筋細胞または組織で転写活性を駆動する(例えば、２０：１)調節エレメントをいう。調節エレメントの筋肉特異性を決定するアッセイは当分野で知られる(例えば、ベータ－ガラクトシドレポーターの発現を駆動する試験する調節エレメントを含む発現ベクターでトランスフェクトしたマウス筋細胞および肝細胞を使用するインビトロアッセイ)。

ここで使用する用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３(タイプ３Ａおよび３Ｂを含む)、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶおよびヒツジＡＡＶ、Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004))およびMoris et al. (Virol. 33:375 (2004))により開示されるＡＡＶ血清型およびクレードのものおよび現在知られるもしくは今後発見されるあらゆる他のＡＡＶを含むが、これらに限定されない。例えば、Fields et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)参照。ＡＡＶは、パルボウイルス科のウイルス内のディペンドパルボウイルスである。例えば、ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルス由来のＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によりコードされたカプシドタンパク質由来のカプシドに封入された組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)ゲノム由来のＡＡＶおよび／または非天然カプシドｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質由来のカプシドに封入されたｒＡＡＶゲノムであり得る。ここで使用する「ＡＡＶ」は、ウイルス自体またはその誘導体をいうように使用され得る。本用語は、特に断らない限り、全サブタイプおよび天然に存在するおよび組み換え両者の形態を包含する。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶをいい、「非霊長類ＡＡＶ」は霊長類以外の動物に感染するＡＡＶをいい、「ウシＡＡＶ」はウシ科哺乳動物に感染するＡＡＶをいうなどである。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3 d ed., Lippincott-Raven Publishers)参照。

用語「ｒＡＡＶ」は、「組み換えＡＡＶ」をいう。ある実施態様において、組み換えＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種ポリヌクレオチド配列で置き換えられているＡＡＶゲノムをいう。

ここで使用する「ＡＡＶベクター」または「アデノ随伴ウイルスベクター」は、ＡＡＶ起源(すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド)ではないポリヌクレオチド配列、一般に細胞の遺伝子形質転換のために目的の配列を含む、ｒＡＡＶをいう。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ末端逆位配列(ＩＴＲ)により隣接される。

「無カプシド」または「カプシドレス」(またはこれらの変形)ウイルス(例えば、ＡＡＶ)ゲノムまたは核酸分子は、カプシドがないゲノムまたは核酸分子をいう。ある実施態様において、カプシドレスゲノムまたは核酸分子は、例えば、ＡＡＶＲｅｐタンパク質をコードする配列を含まない。

「ＡＡＶ」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質(一般に野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全て)およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子をいう。粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達すべき導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド)を含むならば、一般に「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ(例えば、野生型ＡＡＶ)が哺乳動物細胞で複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスをいう。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶのための多様なこのようなヘルパーウイルスが当分野で知られる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを含むが、サブグループＣのアデノウイルスタイプ５が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られ、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)およびエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、ならびにサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)および仮性狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)を含み、その全て同様にＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。

ここで使用する用語「末端逆位配列」(または「ＩＴＲ」)は、下流にその逆相補が続く、ヌクレオチドの一本鎖配列をいう。最初の配列と逆相補の間のヌクレオチドの介在配列は、０を含み、如何なる長さでもよい。ＡＡＶゲノムは、一般に末端逆位配列(ＩＴＲ)を両端に含み、ここで、各末端は、一般に回文式であり、ヘアピンを形成し得る。

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」はここでは相互交換可能に使用され、鎖内で共有結合された複数のヌクレオチドモノマーからなるバイオポリマーをいう。

ここで使用する用語「向性」は、ウイルスの(例えば、ＡＡＶの)１以上の特定の細胞型のみに感染する能力および細胞侵入を達成するために特定の細胞表面部分のみと相互作用し、所望によりおよび好ましくは続いて該ウイルス(例えば、ＡＡＶ)により細胞内に運搬された配列の発現(例えば、転写および所望により、翻訳)(例えば、組み換えウイルスについて、異種ヌクレオチド配列の発現)をする能力をいう。

ここで使用する用語「形質導入」は、細胞へのウイルス(例えば、ＡＡＶ)の侵入およびウイルスゲノムから発現させるための該ウイルス内に含まれた遺伝物質の細胞への伝達をいう。一般に、ウイルス(例えば、ＡＡＶ)は、その向性に従い細胞に侵入する。

「投与」は、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用する、対象への治療剤の物理的導入をいう。例えば、ＡＡＶ治療に関する投与経路の例は、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内、経口、直腸、局所、上皮、粘膜、鼻腔内、膣、直腸および舌下投与を含む。投与は、例えば、１回、複数回および／またはそれ以上の長期にわたり実施され得る。

対象の「処置」または「治療」は、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の発症、進行、進展、重症度または再発の回復、軽減、改善、阻止、原則または予防を目的として実施される、対象へのあらゆるタイプの介入または過程または活性剤の投与をいう。

ここで使用する「治療有効量」、「治療用量」、「有効用量」または「有効投与量」は、ここに記載する治療目標を達成する量または用量をいう。治療有効量などは単回用量で投与できまたは複数用量(すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の用量)投与により達成され得ることを当業者はさらに理解する。治療剤が疾患退行を促進するまたは疾患進展もしくは再発を阻止する能力は、臨床治験中のヒト対象、ヒトにおける有効性の予測となる動物モデル系またはインビトロアッセイでの該薬剤の活性のアッセイ結果によるなど、当業者に知られる多様な方法を使用して、評価され得る。

「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌならびにマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類などの脊椎動物を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」はここでは相互交換可能に使用される。

ここで使用する用語「ug」および「uM」は、それぞれ「μg」および「μM」と相互交換可能に使用される。

選択肢(例えば、「または」)の使用は、選択肢の何れか一つ、両方またはこれらの何らかの組み合わせを意味すると理解されるべきである。ここで使用する単数表現は、何らかの言及されるまたは挙げられる成分または実体の「１またはそれ以上」をいうと解釈されるべきである。

凡そまたは約：ここで使用する用語「凡そ」または「約」は、１以上の問題の値に付されるとき、特に断らない限りまたは文脈から他のことが明らかでない限り、記載される参照値に類似し、記載される参照値と何れかの方向で(多いまたは少ない)２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の範囲内に入る値をいう(このような数値が、可能な値の１００％を超えるとき以外)。用語「凡そ」または「約」がここで特定の値に付されるとき、用語「凡そ」または「約」を伴わない値もここに開示される。

ここに記載する、あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に断らない限り、記載する範囲内のあらゆる整数値および、適切であれば、その分数(例えば整数の１／１０および１／１００)を含むと解釈されるべきである。

本発明の種々の態様を、次のサブセクションにさらに詳述する。

ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
小型化ジストロフィン
本発明は、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ジストロフィンの少なくとも３つのヒンジドメインおよび少なくとも５つのスペクトリン反復ドメインを含む。

ジストロフィンは、細胞膜を介して筋線維の細胞骨格を周囲の細胞外マトリクスに結合させる棒状細胞質タンパク質である。このタンパク質は、主に運動に使用される筋肉(骨格筋)および心臓の筋肉(心筋)に存在する。脳の神経細胞に小量のジストロフィンが存在する。骨格および心筋において、ジストロフィンは、一体となって筋線維を強くし、筋肉の収縮および弛緩の際に傷害から保護する、一群のタンパク質(タンパク質複合体)の一部である。ジストロフィン複合体はアンカーとして働き、各筋細胞の構造フレームワーク(細胞骨格)と細胞外のタンパク質および他の分子の格子(細胞外マトリクス)を結合させる。ジストロフィン複合体は、化学シグナルを送るおよび受け取るタンパク質と相互作用することにより、細胞シグナル伝達にも役割を有する。

完全長ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子は、知られている最長ヒト遺伝子の一つであり、Ｘｐ２１座位で２.３メガベース(ヒトゲノムの０.０８％)を占める。一次転写物は筋肉で約２,１００キロベースとなり、転写に１６時間かかる；成熟ｍＲＮＡは１４.０キロベースとなる。７９エクソン筋肉転写物は、３６８５アミノ酸残基のタンパク質をコードする。

ここに開示されるのは、ジストロフィンのアミノ酸およびヌクレオチド配列である。ヒト野生型ジストロフィン、アイソフォームＤｐ４２７ｍを構成するアミノ酸配列はUniProt識別番号NP_003997.1として知られ、表１に示す。

選択的スプライシングに起因する種々の他のジストロフィンアイソフォームは当分野で知られる。ある実施態様において、構築物は表２に示すヌクレオチド配列を含む。

またここに開示されるのは、完全長ジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。

野生型、完全長ジストロフィンタンパク質(アイソフォームＤｐ４２７ｍ)は、２４のスペクトリン様反復、少なくとも４つのヒンジ領域、アクチン結合ドメイン(ＡＢＤ１)、システインリッチドメイン(ＣＲ)およびＣ末端ドメイン(Ｃ－ｔｅｒｍ)を含む。各ドメインのポリペプチド配列を表３に示し、各ドメインのヌクレオチド配列を表４に示す。

本発明は、完全長ジストロフィンタンパク質、すなわち、アイソフォームＤｐ４２７ｍより小さく、天然に存在するジストロフィンタンパク質アイソフォームと同一ではない小型化ジストロフィンポリペプチドまたは小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本明細書が小型化ジストロフィンポリペプチドを開示するとき、本発明は、対応する開示される小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も開示し、その逆もそうである。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸分子は遺伝子治療に適する。従って、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子治療ベクター、例えば、ＡＡＶベクターに適合するまたは組み換え発現に適するだけでなく、インビボで投与したときまたは発現されたとき、該小型化ジストロフィンポリペプチドに対するあらゆる望まない免疫応答(例えば、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答、例えば、ＣＤ４および／またはＣＤ８)を低減するように構築される。ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ジストロフィンのスペクトリン反復２(Ｒ２)ドメインを含まない。他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、スペクトリン反復２(Ｒ２)ドメインおよび(１)スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、(２)スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、(３)スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、(４)スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、(５)スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、(６)スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、(７)スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、(８)スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、(９)スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、(１０)スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、(１１)スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、(１２)スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、(１３)スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、(１４)スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、(１５)スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、(１６)スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメイン、(１７)スペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインまたは(１８)スペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメインまたは(１９)これらの何れかの組み合わせを含まない。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、スペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメイン、スペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインおよびスペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメインを含まない。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｒ１ドメインはペプチド結合によりＲ３ドメインに直接融合されている。例えば、小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－０２７７４１参照。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬ(ＲＶ)により融合されている。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカーにより融合されている。リンカーは当分野で知られる何れかのリンカーであり得る。他の実施態様において、リンカーは、ここに開示するリンカーの何れかから選択され得る。他の実施態様において、リンカーはセクション５.３.２のリンカーであり得る。ある実施態様において、リンカーは、配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカーにより融合されている。ある実施態様において、リンカーは、配列番号７４～７５の組み合わせ(SEAQ IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカーにより融合されている。ある実施態様において、リンカーは、配列番号７４(SEAQ)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

他の実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬにより融合されており、そしてＨ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカー、例えば、配列番号７４～７５の組み合わせにより融合されている。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬにより融合されており、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカー、例えば、配列番号７４～７５の組み合わせにより融合されており、ここで、(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインは直接融合されている、(ii)Ｒ３ドメインおよびＨ２ドメインは直接融合されている、(iii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインは直接融合されている、(iv)Ｒ１７およびＲ２４ドメインは直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインは直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせによりにより融合されている。ある実施態様において、本発明に有用な小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含み、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインはアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬにより融合されており、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインはリンカー、例えば、配列番号７４～７５の組み合わせにより融合されており、ここで、(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインは直接融合されている、(ii)Ｒ３ドメインおよびＨ２ドメインは直接融合されている、(iii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインは直接融合されている、(iv)Ｒ１７およびＲ２４ドメインは直接融合されているおよび(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインは直接融合されている。ある実施態様において、本発明に有用な小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＡＢＤ１ドメイン(所望によりＮ末端に)および／またはＣＲドメイン(所望によりＮ末端に)をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、アミノ酸ＲＶ、Ｒ３ドメイン、Ｈ２ドメイン、配列番号７４～７５に示されるアミノ酸配列の組み合わせ、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインから本質的になるまたはそれらからなる。

小型化ジストロフィンポリペプチドの各ドメインは、対応する野生型ドメインから１以上の変化を有し得る。

例えば、小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７７は、順に次のタンパク質ドメインからなる。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドにおけるＨ１ドメインは、配列番号６９に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１ドメインは、配列番号７０に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ３ドメインは、配列番号７２に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ２ドメインは、配列番号７３に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１６ドメインは、配列番号７６に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ１７ドメインは、配列番号７７に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｒ２４ドメインは、配列番号７８に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、Ｈ４ドメインは、配列番号７９に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端に、配列番号６８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるポリペプチド配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｃ末端に、配列番号８０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるポリペプチド配列をさらに含む。

ある実施態様において、本発明は、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドであって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)に示すアミノ酸配列を含むリンカーにより融合されているものを提供する。ある実施態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、ヒンジ３(Ｈ３)ドメイン、スペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドであって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)により融合されているものを提供する。

ある実施態様において、本発明は、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)を含むリンカーにより融合されているものを含む。ある実施態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、ヒンジ３(Ｈ３)ドメイン、スペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)により融合されているものを提供する。

ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、次の特徴を有する：(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインは直接融合されている、(ii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインは直接融合されている、(iii)Ｒ１７およびＨ３ドメインは直接融合されている、(iv)Ｒ２３およびＲ２４ドメインは直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインは直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせである。ある実施態様において、本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドは、スペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメインおよび／またはスペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインを含まない。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＡＢＤ１ドメインおよび／またはＣＲドメインをさらに含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｈ３ドメイン、Ｒ２３ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＨ１ドメインは、配列番号８２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＲ１ドメインは、配列番号８３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＲ１６ドメインは、配列番号８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＲ１７ドメインは、配列番号８６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＨ３ドメインは、配列番号８７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＲ２３ドメインは、配列番号８８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＲ２４ドメインは、配列番号８９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドに有用なＨ４ドメインは、配列番号９０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｎ末端に、配列番号８１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、Ｃ末端に、配列番号９１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。

ある実施態様において、各ドメインをコードする核酸配列は次のとおりであり得る。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドにおけるＨ１ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｒ１ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｒ３ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｈ２ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｒ１６ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１０１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｒ１７ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１０２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｒ２４ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１０３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、Ｈ４ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１０４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドにおけるＡＢＤ１ドメインをコードする核酸配列は、配列番号９３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。ある実施態様において、ＣＲ／Ｃ－ｔｅｒｍポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１０５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列である。

種々の本発明の小型化ジストロフィンポリペプチドを表７に示す。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１１８～１３２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１１８(ＢＸＡ－１９６４７７)、配列番号１１９(ＢＸＡ－１９６４７３)、配列番号１２０(ＢＸＡ－１９６４７４)、配列番号１２１(ＢＸＡ－１９６４７５)、配列番号１２２(ＢＸＡ－１９６４７６)、配列番号１２４(ＢＸＡ－１９６４７８)または配列番号１２５(ＢＸＡ－１９６４７９)の一つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１１８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１１９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２０と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチは、配列番号１２５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２６と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１２９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１３２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。

ある実施態様において、核酸分子によりコードされる小型化ジストロフィンポリペプチドは、式(Ｉ)
Ｈ１－Ｒ１－Ｌ１－Ｒ３－Ｈ２－Ｌ２－Ｌ３－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４ (Ｉ)
〔式中、Ｈ１はジストロフィンのヒンジ１ドメインであり；Ｒ１はジストロフィンのスペクトリン反復１ドメインであり；Ｌ１はアミノ酸Ａｒｇ－Ｖａｌ(ＲＶ)であり；Ｒ３はジストロフィンのスペクトリン反復３ドメインであり；Ｈ２はジストロフィンのヒンジ２ドメインであり；Ｌ２は配列番号７４に示すアミノ酸配列(SEAQ)であり；Ｌ３は配列番号７５に示すアミノ酸配列(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)であり；Ｒ１６はジストロフィンのスペクトリン反復１６であり；Ｒ１７はジストロフィンのスペクトリン反復１７であり；Ｒ２４はジストロフィンのスペクトリン反復２４であり；Ｈ４はジストロフィンのヒンジ４ドメインであり；そして(－)はペプチド結合である。〕
を有する。

ある実施態様において、核酸分子によりコードされる小型化ジストロフィンポリペプチドは、(ｉ)ＢＸＡ－０２７７４１と比較して低いＣＤ４増殖、(ii)ＢＸＡ－０２７７４１と比較して低いＣＤ８増殖および(iv)これらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の性質を示す。

ある実施態様において、核酸分子によりコードされる小型化ジストロフィンポリペプチドは、式(II)
Ｈ１－Ｒ１－Ｌ－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４ (II)
〔式中、Ｈ１はジストロフィンのヒンジ１ドメインであり；Ｒ１はジストロフィンのスペクトリン反復１ドメインであり；Ｌはアミノ酸配列番号８４(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)であり；Ｒ１６はジストロフィンのスペクトリン反復１６であり；Ｒ１７はジストロフィンのスペクトリン反復１７であり；Ｈ３はジストロフィンのヒンジ３ドメインであり；Ｒ２３はジストロフィンのスペクトリン反復２３であり；Ｒ２４はジストロフィンのスペクトリン反復２４であり；Ｈ４はジストロフィンのヒンジ４ドメインであり；そして(－)はペプチド結合であり。〕
を有する。

ある実施態様において、核酸分子によりコードされる小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１３２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号１４７のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一の配列を含む。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ＢＸＡ－１９６４８１より高い小型化ジストロフィンポリペプチドの発現を示す。ある他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチド発現は、ＢＸＡ－１９６４８１ポリペプチド発現より少なくとも約１.５倍、少なくとも約１.６倍、少なくとも約１.７倍、少なくとも約１.８倍、少なくとも約１.９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.１倍、少なくとも約２.２倍、少なくとも約２.３倍、少なくとも約２.４倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約２.６倍、少なくとも約２.７倍、少なくとも約２.８倍、少なくとも約２.９倍または少なくとも約３倍高い。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドはヌクレオチド配列によりコードされ得る。ヌクレオチド配列のいくつかの例を表８に示す。

配列番号１４８は、Ｃ末端が欠失される以外構築物ＢＸＡ－０２７７４３と同じである構築物ＢＸＡ－２１２３７１をコードする。

配列番号１４９は、３’ＵＴＲが短い以外ＢＸＡ－２１２３７１と同じである構築物ＢＸＡ－２１２３７２をコードする。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、表９に示す構築物を含むまたはそれである。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１５２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、表１０に示す構築物を含むまたはそれである。

配列番号１５３は、内部SEAQリンカー(配列番号７４)のアミノ酸ＡおよびＱならびにＣ末端の３アミノ酸がＢＸＡ－２１３７８０Ｊ１１Ｖ３で欠失している以外、構築物ＢＸＡ－１９６４７７と同じである構築物ＢＸＡ－２１３７８０Ｊ１１Ｖ３をコードする。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、配列番号１５３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンＢＸＡ－２１３７８０Ｊ１１Ｖ３は、表１１に示すヌクレオチド配列によりコードされ得る。

ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドは、ヒンジ２(Ｈ２)ドメインとＲ１６スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメインの間に接合部を有し、それは表１２に列記するアミノ酸配列を含む。

他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３３～１４９と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。他の実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３３(ＢＸＡ－１９６４７７)、配列番号１３４(ＢＸＡ－１９６４７３)、配列番号１３５(ＢＸＡ－１９６４７４)、配列番号１３６(ＢＸＡ－１９６４７５)、配列番号１３７(ＢＸＡ－１９６４７６)、配列番号１３９(ＢＸＡ－１９６４７８)、配列番号１４０(ＢＸＡ－１９６４７９)、配列番号１４８(ＢＸＡ－２１２３７１)または配列番号１４９(ＢＸＡ－２１２３７２)と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３６と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含む。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４０と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４１と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４２と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４３と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４４と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４５と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４６と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４７と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４８と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。ある実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４９と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である核酸配列を含み、ここで、該小型化ジストロフィンポリペプチドは、該ヌクレオチド配列から発現されたとき、少なくとも１つのジストロフィン活性を有する。

リンカー
またここに提供されるのは、アミノ酸配列または該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。ある実施態様において、本発明は、配列番号１００と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に関し、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)を含む。ある実施態様において、本発明は、配列番号９９～１００の組み合わせと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列によりコードされるアミノ酸配列に関し、ここで、該アミノ酸配列は、配列番号７４～７５の組み合わせ(SEAQIHTVREE TMMVMTEDMP LEI)を含む。

ある実施態様において、核酸分子は、配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該核酸分子は、配列番号１００(ATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGACATGCCCCTGGAAATC)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である。

ある実施態様において、アミノ酸配列は、ジストロフィンの１以上のドメインを結合するリンカーとして使用され得る。ある実施態様において、リンカーは、ジストロフィンの第一ドメインおよびジストロフィンの第二ドメインを結合する。ある実施態様において、結合され得るジストロフィンの第一ドメインおよび第二ドメインは、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインである。他の実施態様において、結合され得るジストロフィンの第一ドメインおよび第二ドメインは、Ｒ３ドメインおよびＲ１６ドメインである。他の実施態様において、結合され得るジストロフィンの第一ドメインおよび第二ドメインは、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインである。

ある実施態様において、本発明は、配列番号９９(AGTGAAGCTCAG)と少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

ある実施態様において、本発明は、配列番号１００(ATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGACATGCCCCTGGAAATC)と少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

ある実施態様において、本発明は、配列番号９９および１００の組み合わせ(AGTGAAGCTCAGATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGACATGCCCCTGGAAATC)と少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

ある実施態様において、リンカーは、小型化ジストロフィンポリペプチドの２ドメイン(例えば、Ｈ２およびＲ１６ドメイン)を結合することにより、ここに開示する小型化ジストロフィンポリペプチドに位置づけされる。ある実施態様において、リンカーは、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ３－Ｈ２－Ｌ－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－Ｃ－ｔｅｒｍを含む小型化ジストロフィンポリペプチドのＨ２ドメインとＲ１６ドメインの間に位置し、ここで、ＡＢＤ１はアクチン結合ドメイン１であり、Ｈ１はヒンジ１ドメインであり、Ｒ１はスペクトリン反復１ドメインであり、Ｒ３はスペクトリン反復３ドメインであり、Ｈ２はヒンジ２ドメインであり、Ｌはリンカー、例えば、配列番号７４または配列番号７５(または組み合わさった両者)(またこれらの配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列)であり、Ｒ１６はスペクトリン反復１６ドメインであり、Ｒ１７はスペクトリン反復１７ドメインであり、Ｒ２４はスペクトリン２４ドメインであり、Ｈ４はヒンジ４ドメインであり、ＣＲはシステインリッチドメインであり、Ｃ－ｔｅｒｍは、任意のＣ末端ドメイン(またはその一部)である。

本発明はまたIHTVREETMMVMTEDMPLEI(配列番号８４)を含むリンカーを提供する。ある実施態様において、配列番号７５に示す配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)(または配列番号８４に示す配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列)を含むリンカーは、小型化ジストロフィンポリペプチドの２ドメイン(例えば、Ｒ１およびＲ１６ドメイン)を結合することにより、ここに開示する小型化ジストロフィンポリペプチドに位置づけられる。ある実施態様において、リンカーは、ＡＢＤ１－Ｈ１－Ｒ１－Ｌ－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－Ｃ－ｔｅｒｍを含む小型化ジストロフィンポリペプチドのＲ１ドメインとＲ１６ドメインの間に位置し、ここで、ＡＢＤ１はアクチン結合ドメイン１であり、Ｈ１はヒンジ１ドメインであり、Ｒ１はスペクトリン反復１ドメインであり、Ｌはリンカー、例えば、配列番号８４であり、Ｒ１６はスペクトリン反復１６ドメインであり、Ｒ１７はスペクトリン反復１７ドメインであり、Ｈ３はヒンジ３ドメインであり、Ｒ２３はスペクトリン２３ドメインであり、Ｒ２４はスペクトリン２４ドメインであり、Ｈ４はヒンジ４ドメインであり、ＣＲはシステインリッチドメインであり、Ｃ－ｔｅｒｍはＣ末端ドメイン(またはその一部)である。

非コードポリヌクレオチド
ある態様において、ここに提供されるのは、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、非コード成分を含む。ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、プロモーターを含む。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の特定の例は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列が使用され得る。なおさらに、ＳＶ４０早期プロモーターの配列とヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１の末端反復配列を含むＳＲプロモーター系などの、種々の供給源からの配列からなる調節エレメントも使用され得る(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。ある実施態様において、調節配列は、組織特異的プロモーターを含む。ある実施態様において、組織特異的プロモーターは、心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、中枢神経系、神経細胞、筋肉および幹細胞からなる群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を駆動する。

ある実施態様において、ここに開示されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。ある実施態様において、プロモーターは、肝細胞、筋細胞、内皮細胞、類洞細胞または神経細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおける治療タンパク質の発現を駆動する。ある実施態様において、プロモーターは、シナプシン１遺伝子プロモーター、マウスサイレチンプロモーター(ｍＴＴＲ)、内因性ヒト第VIII因子プロモーター(Ｆ８)、ヒトアルファ－１－抗トリプシンプロモーター(ｈＡＡＴ)、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン(ＴＴＰ)プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、α１－抗トリプシン(ＡＡＴ)プロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(ＭＣＫ)プロモーター、ミオシン重鎖アルファ(αＭＨＣ)プロモーター、ミオグロビン(ＭＢ)プロモーター、デスミン(ＤＥＳ)プロモーター、ＳＰｃ５－１２プロモーター、２Ｒ５Ｓｃ５－１２プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、α－シヌクレインプロモーターおよびホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターからなる群から選択される。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、イントロン配列を含む。ある実施態様において、イントロン配列は、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する。ある実施態様において、イントロン配列は、プロモーターの３’に位置する。ある実施態様において、イントロン配列は合成イントロン配列を含む。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、転写後調節エレメントを含む。ある実施態様において、転写後調節エレメントは、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する。ある実施態様において、転写後調節エレメントは、変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(ＷＰＲＥ)、マイクロＲＮＡ結合部位またはＤＮＡ核ターゲティング配列またはこれらの何らかの組み合わせを含む。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列を含む。ある実施態様において、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列は、ｂＧＨポリ(Ａ)、アクチンポリ(Ａ)、ヘモグロビンポリ(Ａ)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列は、ｂＧＨポリ(Ａ)を含む。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、エンハンサー配列を含む。ある実施態様において、ここに開示する核酸分子は、第一末端逆位配列(ＩＴＲ)および／または第二ＩＴＲを含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲは同一である。ある実施態様において、第一ＩＴＲおよび／または第二ＩＴＲはアデノ随伴ウイルス由来である。ある実施態様において、第一ＩＴＲはアデノ随伴ウイルスに由来し、第二ＩＴＲはアデノ随伴ウイルスに由来する。

核酸分子はポリペプチドの翻訳を助けるさらなる要素を含み得ることはさらに認識される。このような配列は、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に結合したコザック配列を含む。コザックコンセンサス配列は、翻訳過程の開始に役割を有し、コンセンサス(gee)gccRccAUGG(配列番号１５０)を有する真核生物ｍＲＮＡで生じる配列であり、ここで、(１)小文字は、塩基がそれにも関わらず変わり得る位置で最も一般的塩基を示す；(２)大文字は、プリン(アデニンまたはグアニン)が通常その位置で観察されることを示すＩＵＰＡＣ曖昧コード‘Ｒ’以外、高度に保存された塩基を示し、すなわち‘ＡＵＧＧ’配列は一定であるかまたは、仮に変化するとしても稀であり；そして(３)括弧内の配列((gee))は意義不明のものである。

ある非限定的実施態様において、核酸分子は、コザック配列の機能的バリアントまたはそのフラグメントを含む。コザック配列の機能的バリアントまたはそのフラグメントは、リーダーを欠く配列の翻訳レベルと比較したとき、タンパク質の翻訳を増加させる能力を保持する。このような機能的フラグメントは、コザック配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０連続ヌクレオチドまたは配列番号１５０もしくは配列番号１５１に示す配列(gccaccATGG)を含み得る。あるいは、機能的バリアントは、コザック配列または配列番号１５０もしくは配列番号１５１に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含み得る。

異種部分
ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、さらなる要素、例えば、異種部分をさらに含み得る。このような要素は、ポリペプチドの発現を助ける、ポリペプチドの分泌を助ける、ポリペプチドの安定性を改善する、ポリペプチドのより効率的精製を可能とするおよび／またはポリペプチドの活性を調節することができる。ある実施態様において、異種部分はポリペプチド部分である。他の実施態様において、異種部分は非ポリペプチド部分である。

ある実施態様において、ポリペプチドは、ポリペプチドに融合した異種部分を含む。

ある実施態様において、ここに開示するポリペプチドは、１以上のさらなる異種部分を含む。ある実施態様において、異種部分は半減期延長部分である。ある実施態様において、異種部分は、アルブミンまたはそのフラグメント、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはそのフラグメントまたはアルブミン結合部分またはその誘導体またはこれらの何れかの組み合わせを含む。

ある実施態様において、ここに開示するポリペプチドは、１以上のさらなる異種部分を含む。ある実施態様において、異種部分は半減期延長部分である。ある実施態様において、異種部分は、アルブミン、免疫グロブリン定常領域またはその一部、免疫グロブリン結合ポリペプチド、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)、アルブミン結合ポリペプチド(ＡＢＰ)、PASylation部分、HESylation部分、ＸＴＥＮ、ペグ化部分またはＦｃ領域またはこれらの何れかの組み合わせを含む。

細胞
ある態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するタンパク質を発現(例えば、組み換えにより)する細胞(例えば、宿主細胞)およびここに記載するタンパク質をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターである。

ある実施態様において、宿主細胞は、ここに記載する核酸分子を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ここに記載するベクターを含む。

ある実施態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、トランスジェニック哺乳動物細胞および植物細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。ある実施態様において、原核生物細胞は細菌細胞である。

ある実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０(内因性に何ら免疫グロブリン鎖を産生しないマウス骨髄腫細胞株)、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ(例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ)、ＰＥＲ.Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１.１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、ＨＢＫ、ＮＳＯ、ＨＴ１０８０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、これらに限定されない。

ベクター
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)
概要
ここに提供されるのは、宿主細胞および治療的介入のために標的とされる細胞における組み換え発現のための小型化ジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター(例えば、発現ベクター)である。ここで使用する用語「ベクター」は、それが結合している他の核酸を輸送できる核酸分子；または他の核酸を輸送できるこのような核酸分子を含むエンティティをいう。ベクターの１タイプは「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る。他のタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。あるベクターまたはベクターの一部であるポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で自律複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、あるベクターは、それが操作可能に結合している遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、ここでは「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態であるため、文脈により相互交換可能に使用できることがある。しかしながら、またここに開示されるのは、等価な機能を発揮するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの他の形態の発現ベクターである。

ある実施態様において、ここに開示されるポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を使用して発現される。ＡＡＶは、パルボウイルス科のエンベロープの無い、一本鎖ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科の大部分の他のメンバーと対照的に、ＡＡＶは複製欠損であり、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ効率的に複製できる。

ＡＡＶは、アデノウイルスのウイルス調製物の夾雑物として１９６０年代半ばに最初に発見された。Atchison R W, Casto B C, HAMMON W M. Science. 149(3685), 754-756 (1965)参照。それ以降、組み換えＤＮＡベクターとしてＡＡＶをより安全かつより効率的に使用する方法の開発が進んでいる。例えば、Hermonat P.L. およびMuzyczka N. Proc Natl Acad Sci USA. 81(20), 6466-6470 (1984). 3. Laughlin C.A., et al. Gene, 23(1), 65-73 (1983). Matsushita T., et al. Gene Ther. 5(7), 938-945 (1998). Xiao X., et al. Journal of Virology. 72(3), 2224-2232 (1998)参照。少数のＡＡＶゲノムが宿主染色体に統合されることが示されている。Cheung AK, Hoggan MD, Hauswirth WW, et al. Integration of the adeno-associated virus genome into cellular DNA in latently infected human detroit 6 cells. J Virol 1980;33:739-748参照。ＡＡＶは、あらゆる既知アデノウイルス抗原と免疫学的に異なる。ＡＡＶカプシドは、一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)ゲノムを含む。Rose JA, Berns KI, Hoggan MD, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1969;64:863-869参照。

ＡＡＶは、２つの末端逆位配列(ＩＴＲ)が隣接する複製(ｒｅｐ)遺伝子およびカプシド(ｃａｐ)遺伝子をコードする一本鎖、４.７kb ＤＮＡゲノムである。優勢に非統合性であり、非分裂組織で安定なエピソームを形成する。成人集団におけるその高い血清有病率にも関わらず、ＡＡＶは、どのヒト疾患とも関連付けられていない。Goncalves, M. Virol. J. 2, 43 (2005)参照。組織におけるＡＡＶの安定な発現、病原性欠如および高力価産生の容易さにより、極めて魅力的なベクターかつ人気の高い遺伝子伝達プラットフォームとなっている。

組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)は、一般にｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種導入遺伝子配列で置き換えられている、遺伝子操作されたＡＡＶである。組み換えＡＡＶは有糸分裂後細胞における長期導入遺伝子発現を誘発でき、これは組み換えＡＡＶゲノムが核内の大型環状エピソームとして持続するためである可能性が最も高い。ｒＡＡＶの産生に必要であるｒＡＡＶのＤＮＡｃｉｓ要素のみがＡＡＶ末端逆位配列(ＩＴＲ)であり、一方、ｒｅｐ、ｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー遺伝子はｔｒａｎｓで提供される。故に、ここに開示するある実施態様において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲが隣接する異種導入遺伝子ＤＮＡのみを含み、このゲノムは血清型特異的ＡＡＶカプシド内でカプシドに包まれている。

ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターシステムとして魅力的となる、特有の特性を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は一般に非細胞病原性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は無症状かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの異なるタイプの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織をターゲティングする可能性が認められる。ＡＡＶはまた他の形態の遺伝子送達と比較して比較的穏やかである免疫応答の促進ならびに非統合性の、エピソームベクターＤＮＡに基づく分裂および静止細胞両者における永続性発現を含む、遺伝子送達のための特に魅力的なウイルス系となるさらなる利点も有する。また、ＡＡＶは、アデノウイルス不活化に使用する条件(５６°～６５℃で数時間)に耐え、ｒＡＡＶベースのワクチンの低温保存の重要を減らす。

ウイルスＤＮＡの複製は、宿主細胞ゲノムに組込まれる必要はなく、故にヘルパーウイルスがこの過程に不要である。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにおけるクローン化ＤＮＡと同様感染性であり、組み換えゲノムの構築を実行可能とする。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、内部の約４.７kbのゲノム(複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコード)が、こうして、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットなどの外来ＤＮＡと共に複製され得る。

ＡＡＶベクターは、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓで機能するさらなる要素を含み得る。具体的実施態様において、ベクターゲノムを含むＡＡＶベクターはまたドナー配列の５’または３’末端に隣接する１以上の末端逆位配列(ＩＴＲ)配列；構成的または制御可能制御要素または組織特異的発現制御要素などのドナー配列の転写を駆動する発現制御要素(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)；イントロン配列、スタッファーまたはフィラーポリヌクレオチド配列；および／またはドナー配列の３’に位置するポリアデニン配列を含む。

ある実施態様において、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスを使用して複製される。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶのための多様なこのようなヘルパーウイルスは当分野で知られる。アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルスタイプ５が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが知られ、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)およびエプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)、ならびにサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)および仮性狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)を含み、その全て同様にＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。

ＡＡＶベクターの例は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８の何れかのカプシド配列またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８のカプシドバリアントを含む。本発明の組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８およびそのバリアントを含む。特定のカプシドバリアントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８のカプシドバリアント、例えば、アミノ酸置換、欠失または挿入／付加を有するカプシド配列を含む。ある実施態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９である。

ある態様において、本発明は別個の組織ターゲティング能(例えば、組織向性)を有するＡＡＶに関する。ある実施態様において、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、さらに非バリアント親カプシドポリペプチドと比較して１以上のヒト幹細胞型における形質導入または向性増加を示す。ある実施態様において、ヒト幹細胞型は、胚幹細胞、成体組織幹細胞(すなわち、体性幹細胞)、骨髄幹細胞、前駆細胞、誘導型多能性幹細胞および初期化幹細胞を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、成体幹細胞はオルガノイド幹細胞(すなわち、体内の興味ある臓器または臓器系の何れか由来の幹細胞)を含み得る。ある実施態様において、ＡＡＶの標的組織は、生殖腺、横隔膜、心臓、胃、肝臓、脾臓、膵臓、筋肉または腎臓である。ある実施態様において、ＡＡＶは、皮膚、毛髪、爪、感覚受容体、汗腺、腺鱗、骨、筋肉、脳、脊髄、神経、下垂体、松果腺、視床下部、甲状腺、副甲状腺、胸腺、副腎、膵臓(島組織)、心臓、血管、リンパ節、リンパ管、胸腺、脾臓、扁桃、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門管、歯、唾液腺、舌、肝臓、胆嚢、膵臓、盲腸、腎臓、輸尿管、膀胱、尿道、精巣、(輸)精管、尿道、前立腺、陰茎、陰嚢、卵巣、子宮、子宮(卵)管、膣、外陰および乳腺(乳房)を含むが、これらに限定されない体の臓器を標的とする。体の臓器系は、外皮系、骨格系、筋肉系、神経系、内分泌系、心血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系および生殖器系を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、バリアントカプシドポリペプチドを有するＡＡＶの形質導入および／または向性は、非バリアントカプシドポリペプチドを有するＡＡＶと比較して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、６５％、約７０％％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％増加する。ある実施態様において、形質導入および／または向性は、約５％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％または約３０％～約６０％増加する。

ＡＡＶ遺伝子の複製、カプシドおよび集合
ＡＡＶの一本鎖ゲノムは、ｒｅｐ(複製)、ｃａｐ(カプシド)およびａａｐ(集合)の３遺伝子を含む。これら３遺伝子は、３プロモーター、選択的翻訳開始部位および選択的スプライシングの使用により少なくとも９つの遺伝子産物を生じる。

ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノム複製およびパッケージングに必要な４つのタンパク質(Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０)をコードする。

ｃａｐ遺伝子発現は、ウイルスゲノムを保護し、同時に細胞結合および内在化に積極的に関与する外面カプシド殻を形成するウイルスカプシドタンパク質(ＶＰ１；ＶＰ２；ＶＰ３)を生じる。ウイルス外被は、二十面体構造に配置された６０タンパク質を含む。

ａａｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子と重複する代替リーディングフレームで集合活性化タンパク質(ＡＡＰ)をコードする。この核タンパク質は、あるＡＡＶ血清型でカプシド集合のための足場機能を提供し、ＶＰタンパク質の核小体局在化に役割を有すると考えられる。

ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の１以上は天然に存在する、例えばｒｅｐ、ｃａｐまたはａｐｐ遺伝子はパルボウイルスｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の全てまたは一部を含む。ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐ遺伝子の１以上は合成配列を含む。

ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐおよびａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ｃａｐおよびａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。ある実施態様において、ｒｅｐ、ｃａｐおよびａａｐ遺伝子は、合成配列を含む。

ある実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｒｅｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。

ある実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ｃａｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。

ある実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ２ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ３ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ４ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ５ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ６ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ７ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ８ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ９ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１０ゲノム由来である。特定の実施態様において、ａａｐはＡＡＶ１１ゲノム由来である。

ここに記載する特定のＡＡＶゲノムは、異なるＡＡＶゲノム(例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１からのゲノム)由来の遺伝子を含み得ることは理解される。故に、ここに開示されるのは、ｒｅｐ、ｃａｐまたはａａｐの何れかの可能な並べ替え／組み合わせを含むＡＡＶである。

ここに開示するある実施態様において、ＡＡＶは組み換えＡＡＶ(ｒＡＡＶ)である。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子の１以上を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｃａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠き、かつｃａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子を欠き、かつａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｃａｐ遺伝子を欠き、かつａａｐ遺伝子を欠く。ある実施態様において、ｒＡＡＶはｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子を欠く。

ここに開示するある実施態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ遺伝子の１以上の発現が修飾されるように、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子の１以上が変異されるように、修飾される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ａａｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ｒｅｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子は変異される。ある実施態様において、ｃａｐ遺伝子、ｒｅｐ遺伝子およびａａｐ遺伝子は変異される。

末端逆位配列
ある実施態様において、ＡＡＶは、第一ＩＴＲ、例えば、５’ＩＴＲおよび第二ＩＴＲ、例えば、３’ＩＴＲを含む。一般に、ＩＴＲはパルボウイルス(例えば、ＡＡＶ)ＤＮＡ複製およびレスキューまたは原核生物プラスミドからの切除に関する(Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988)。さらに、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルス組込みおよびＡＡＶＤＮＡのビリオンへのパッケージングに必要な最小配列であると報告されている(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989)。これらの要素は、パルボウイルスゲノムの効率的増殖に必須である。

ある実施態様において、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲ、例えば、パルボウイルスＩＴＲの全てまたは一部を含むＩＴＲを含む。ある実施態様において、ＩＴＲは、合成配列を含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲまたは第二ＩＴＲは、合成配列を含む。他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲの各々は、合成配列を含む。ある実施態様において、第一ＩＴＲまたは第二ＩＴＲは、天然に存在する配列を含む。他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲの各々は、天然に存在する配列を含む。

ある実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムからのＩＴＲを含む。ある実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびこれらの何れかの組み合わせから選択されるＡＡＶゲノムのＩＴＲである。特定の実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲである。他の実施態様において、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの１以上由来のＩＴＲをその５’および３’末端に含むよう遺伝子操作された合成配列である。ある実施態様において、ＩＴＲは同じゲノム、例えば、同じウイルスのゲノムまたは異なるゲノム、例えば、２以上の異なるＡＡＶゲノムのゲノム由来である。ある実施態様において、ＩＴＲは、同じＡＡＶゲノム由来である。特定の実施態様において、本発明の核酸分子に存在する２つのＩＴＲは同じであり、特にＡＡＶ２ＩＴＲであり得る。ある特定の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲは同一である。

ある実施態様において、ＩＴＲはヘアピンループ構造を形成する。ある実施態様において、第一ＩＴＲはヘアピン構造を形成する。他の実施態様において、第二ＩＴＲはヘアピン構造を形成する。さらに他の実施態様において、第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲ両者はヘアピン構造を形成する。

ある実施態様において、ここに記載する核酸分子におけるＩＴＲは、転写活性化ＩＴＲである。転写活性化ＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性のある要素の包含により転写活性化されている野生型ＩＴＲの全てまたは一部を含み得る。種々のタイプの転写活性のある要素がこの状況での使用に適する。ある実施態様において、転写活性のある要素は構成的な転写活性のある要素である。構成的な転写活性のある要素は、進行中のレベルでの遺伝子転写を提供し、導入遺伝子が進行中ベースで発現されることが望まれるとき、使用され得る。他の実施態様において、転写活性のある要素は、誘導型の転写活性のある要素である。誘導型の転写活性のある要素は、一般にインデューサー(または誘導条件)非存在下では、低活性を示し、インデューサー(または誘導条件への転換)存在下で上方制御される。誘導型の転写活性のある要素は、発現が特定の時間または特定の位置でのみ望まれるときまたは誘導剤を使用して発現レベルをタイトレーションすることが望まれるとき、使用され得る。転写活性のある要素はまた組織特異的；すなわち、特定の組織または細胞型でのみ活性を示すものであってもよい。

転写活性のある要素は、多様な方法でＩＴＲに組み込ませ得る。ある実施態様において、転写活性のある要素は、ＩＴＲの何れかの部分に対して５’またはＩＴＲの何れかの部分に対して３’に組み込まれる。他の実施態様において、転写活性化ＩＴＲの転写活性のある要素は、２つのＩＴＲ配列の間にある。転写活性のある要素が空間的に離れていなければならない２以上の要素を含むならば、これらの要素をＩＴＲの位置と交互にし得る。ある実施態様において、ＩＴＲのヘアピン構造を欠失させ、転写要素の逆方向反復で置き換える。この後者の配置は、構造における欠失部分を模倣するヘアピンを作る。複数のタンデムの転写活性のある要素も転写活性化ＩＴＲに存在でき、これらは隣接していても、空間的に離れていてもよい。さらに、タンパク質結合部位(例えば、Ｒｅｐ結合部位)は、転写活性化ＩＴＲの転写活性のある要素に導入され得る。転写活性のある要素は、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを形成するＤＮＡ転写を制御できるあらゆる配列を含み得て、例えば、下に定義する転写活性のある要素を含み得る。

転写活性化ＩＴＲは、運搬され、核酸分子により発現され得る導入遺伝子の長さを効率的に最大化する、比較的限定的なヌクレオチド配列長に核酸分子の転写活性化およびＩＴＲ機能両者を提供する。ＩＴＲへの転写活性のある要素の組み込みは、多様な方法で達成され得る。ＩＴＲ配列および転写活性のある要素の配列要件の比較により、ＩＴＲ内で該要素をコードさせる方法についての見識が提供される。例えば、転写活性をＩＴＲ配列における転写活性のある要素の機能的要素を複製する特定の変化の導入により、ＩＴＲに加え得る。特定のヌクレオチド配列の特定の部位で効率的に付加、欠失および／または変化させる多数の技術が当分野で存在する(例えば、Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88参照)。転写活性化ＩＴＲを作る他の方法は、ＩＴＲの所望の位置への制限部位の導入を含む。さらに、複数の転写活性要素を、当分野で知られる方法を使用して、転写活性化ＩＴＲに組み込み得る。

例として、転写活性化ＩＴＲは、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ(ｃＡＭＰ調節エレメント)部位、ＡＴＦ－１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβボックス、ＡＰＢαボックス、ＣＡｒＧボックス、ＣＣＡＣボックスまたは当分野で知られる転写に関与する何れかの他の要素などの１以上の転写活性のある要素の包含により産生され得る。

目的の遺伝子および他の配列
本発明のある態様は、対象にＡＡＶ治療を投与する方法に関する。ある実施態様において、ＡＡＶは、目的の遺伝子(ＧＯＩ)を含む。ある実施態様において、ＧＯＩは、ここに開示する小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするここに開示するヌクレオチド配列を含む核酸分子である。

発現されるＧＯＩは、使用者が望むあらゆる必要な制御要素(例えば、プロモーター、オペレーター)を伴うタンパク質をコードするＤＮＡセグメントまたは転写がリボザイムまたは抗感覚分子などのいくつかのＲＮＡ含有分子の全てまたは一部を産生する非コードＤＮＡセグメントであり得る。

ある実施態様において、ＡＡＶは、１を超えるＧＯＩを含む。１を超えるＧＯＩを有するＡＡＶにおいて、ある実施態様は、１プロモーターからそれらを共発現させるためのＩＲＥＳまたは２Ａなどの要素を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、ＩＲＥＳ要素により離された２つの目的の遺伝子を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、２Ａ要素により離された２つの目的の遺伝子を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、目的の遺伝子間をＩＲＥＳ要素により離された３つの目的の遺伝子を含む(例えば、ＧＯＩ－ＩＲＥＳ－ＧＯＩ－ＩＲＥＳ－ＧＯＩ)。ある実施態様において、ＡＡＶは、目的の遺伝子間を２Ａ要素により離された３つの目的の遺伝子を含む。

ある実施態様において、ＡＡＶは、調節配列を含む。ある実施態様において、ＡＡＶは、非コード調節ＤＮＡを含む。ある実施態様において、ＡＡＶゲノムは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を調節する調節配列を含む。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載される。調節配列の選択を含むＡＡＶの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子により得ることは、当業者には認識される。ある実施態様において、ＡＡＶゲノムは、ｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター部位を含み得る。哺乳動物宿主細胞発現のためのある調節配列は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。なおさらに、ＳＶ４０早期プロモーターの配列とヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１の末端反復配列を含むＳＲプロモーター系などの、種々の供給源からの配列からなる調節エレメントも使用され得る(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。ある実施態様において、調節配列は、組織特異的プロモーターを含む。ある実施態様において、組織特異的プロモーターは、心臓、肝臓、肺、眼、神経系、リンパ系、筋肉および幹細胞からな群から選択される組織における目的の遺伝子の発現を駆動する。

ＡＡＶ製剤
ある実施態様において、ＡＡＶベクターは送達剤と製剤化される。ある実施態様において、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。ある実施態様において、送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソームおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。

非ＡＡＶベクター
プロモーターに操作可能に結合した上記ポリヌクレオチドを含むベクターもここで提供される。ヌクレオチド配列は、発現調節配列(例えば、プロモーター)の発現が、その配列の転写および翻訳を調節および制御するならば、調節配列に「操作可能に結合」させている。ヌクレオチド配列を参照するときの用語「操作可能に結合」は、発現されるヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル(例えば、ＡＴＧ)を含み、調節配列の制御下の該配列の発現および該配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にする正確なリーディングフレームを維持するものを含む。組み換え核酸分子に挿入することが望まれる遺伝子が適切な開始シグナルを含まないならば、このような開始シグナルを遺伝子の前に入れてよい。「ベクター」は、結合したセグメントの複製がされるように、他の核酸セグメントが結合できるレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドである。プロモーターは、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物プロモーターであり得るまたはそれと同一であり得る。

ある実施態様において、ベクターはプラスミド、コスミド、酵母人工染色体(ＹＡＣ)、バクテリオファージまたは真核生物ウイルスＤＮＡであり得る。タンパク質発現に有用であることが知られる他の多数のベクター主鎖が用いられ得る。このようなベクターは、次のものを含むが、これらに限定されない。
アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)およびモロニーマウス白血病ウイルス。さらに、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルスなどのウイルス由来のＤＮＡ要素を含む。このようなベクターは、商業的に得ることができまたは当業者に周知の方法により記載の配列から集合させ得る。

ある実施態様において、ここに記載するベクターは、送達剤と製剤化される。ある実施態様において、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。ある実施態様において、送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソームおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される。

医薬組成物
多様なここに開示するポリペプチドおよびポリヌクレオチド(ここでは「活性化合物」とも称する)を、投与に適する医薬組成物に取り込み得る。このような組成物は、一般にポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む。ここで使用する用語「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合性の任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的活性化合物のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。何れかの慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合でない限り、組成物におけるその使用が意図される。補助的活性化合物も組成物に取り込み得る。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するポリペプチドおよび(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するポリペプチドを含む組成物および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物である。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するポリヌクレオチドおよび(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物である。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するベクター(例えば、ｒＡＡＶ)および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物である。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する宿主細胞および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物である。

本発明の医薬組成物は、意図する投与経路と適合性であるように製剤化する。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、経皮(局所)および経粘膜およびこれらの何れかの組み合わせを含む。他の投与経路は、肺投与を含む。さらに、治療有効量の医薬組成物を、処置が必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る。これは、例えば、手術中の局所または領域性点滴または灌流、局所適用、注射、カテーテル、坐薬またはインプラント(例えば、サイラスティック膜または繊維などの膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状物質製のインプラント)などにより達成され得る。他の実施態様において、治療有効量の医薬組成物は、リポソームなどの媒体で送達される(例えば、Langer, Science 249:1527-33, 1990 and Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989参照)。

さらに他の実施態様において、治療有効量の医薬組成物を制御放出系で送達できる。一例として、ポンプが使用できる(例えば、Langer, Science 249:1527-33, 1990; Sefton, Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-40, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507-16, 1980; Saudek et al., N Engl. J Med. 321:574-79, 1989参照)。他の例において、ポリマー物質が使用できる(例えば、Levy et al., Science 228:190-92, 1985; During et al., Ann. Neural. 25:351-56, 1989; Howard et al., J Neurosurg. 71:105-12, 1989参照)。Langer (Science 249:1527-33, 1990)記載されたもののような他の制御放出系も使用できる。

許容される担体、添加物または安定化剤は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体)；および／またはTWEEN^TM、PLURONICS^TMまたはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含む。

非経腸製剤で使用する薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、無菌水注射液、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射液を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびピーナツ油を含む。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む静菌または静真菌濃度の抗微生物剤を、複数回容器に充填された非経腸製剤に添加してよい。等張剤は、塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝液は、リン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤は、Polysorbate 80(TWEEN^{(登録商標)}80)を含む。金属イオンの封鎖またはキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体は、水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；およびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含む。

非経腸、皮内または皮下に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含む。注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節用薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調節し得る。非経腸製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回バイアルに封入され得る。

注射用使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水可溶性であるとき)または分散体および無菌注射用溶液または分散体の即時の調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与のために、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor ELS(BASF;Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。全ての場合、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジに吸引され得る程度に流動性でなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染化に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なそれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのコーティングの使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを入れることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを入れることによりもたらされ得る。

無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌濾過することにより調製され得る。一般に、分散体は、活性化合物を基本的分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含む、無菌媒体に取り込むことにより製造される。無菌注射用溶液の製剤のための無菌粉末の場合、製剤の方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液からの活性成分とさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライであり得る。

吸入投与のために、化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素またはネブライザーなどのガスを含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形で送達される。全身投与は経粘膜または経皮手段にもより得る。

経粘膜または経皮投与のために、浸透すべき障壁に適する浸透剤が製剤で使用される。このような浸透剤は一般に同分野で知られ、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐薬の使用により達成される。経皮投与のために、活性化合物を、当分野で一般に知られるとおり、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化する。化合物をまた直腸送達用の坐薬(例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤と共に)または停留浣腸の形にも製剤し得る。

ある実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体と製剤する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を製剤する方法は、当業者には明らかである。本物質はまたAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から購入できる。リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として使用し得る。これらは、例えば、米国特許４,５２２,８１１に記載のとおり、当業者に知られる方法により調製され得る。

投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口または非経腸組成物を投与量単位形態に製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置する対象への単位の投与量に適合した物理的に別の単位であり、各々の単位は所望の治療効果をもたらすよう計算された予め決定した量の活性化合物と必要な医薬担体を含む。本発明の投与量単位形態の明細は、活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに個体の処置のためのこのような機能的化合物の製造の分野に固有の制限により決定されかつ直接依存する。医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに投与指示と共に入れられ得る。

使用および方法
小型化ジストロフィンを製造する方法
またここに開示されるのは、ここに記載する宿主細胞を適当な条件下で培養し、小型化ジストロフィンポリペプチドを回収することを含む、小型化ジストロフィンポリペプチドを製造する方法である。

ここで使用する「単離」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然源(例えば、マウスまたはヒト)に存在する他の核酸分子から分離されたものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組み換え技術により産生されたとき他の細胞物質または培養培地が実質的になく、または化学合成されたとき化学前駆体または他の化学物質が実質的にない。例えば、用語「実質的にない」は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０.５％または０.１％未満(特に約１０％未満)の他の物質、例えば、細胞物質、培養培地、他の核酸分子、化学前駆体および／または他の化学物質を有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の製剤をいう。特定の実施態様において、ここに記載するポリペプチドをコードする核酸分子は単離または精製される。

ポリヌクレオチドを得て、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、当分野で知られる何れかの方法により決定し得る。ここに記載するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、ポリペプチドは、表３および４に記載し、これらのポリペプチドの修飾バージョンは当分野で周知の方法を使用して決定でき、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られるヌクレオチドコドンを、該ポリペプチドをコードする核酸を産生するような方法で集合させる。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから集合でき(例えば、Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-6に記載)、これは、簡潔には、ポリペプチドをコードする配列の部分を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで、ＰＣＲによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を含む。

あるいは、ここに記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当分野で周知の方法(例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング方法)を使用して、適当な源(例えば、ハイブリドーマ)からの核酸から産生し得る。例えば、既知配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅を、目的のポリペプチドを産生するハイブリドーマ細胞から得られたゲノムＤＮＡを使用して実施できる。このようなＰＣＲ増幅方法が、例えば、ＩＬ２、リンカー配列またはＩＬ２－Ｒαをコードする配列を含む核酸を得るために使用できる。増幅核酸を、宿主細胞における発現のために、および、例えば、ポリペプチドを産生するためのさらなるクローニングのためにベクターにクローン化し得る。

特定のポリペプチドをコードする核酸を含むクローンが入手可能でないが、ポリペプチド分子の配列が知られているならば、ポリペプチドをコードする核酸を化学合成できまたは適当な起源(例えば、ここに記載するポリペプチドを発現するように選択したハイブリドーマ細胞などの目的のタンパク質を発現する何れかの組織または細胞から産生したｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー遺伝子またはそこから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ)から配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によりまたは、例えば、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、得ることができる。次いで、ＰＣＲにより産生される増幅核酸を当分野で周知の方法の何れかを使用して、複製可能クローニングベクターにクローン化し得る。

ここに記載するポリペプチドをコードするＤＮＡは、慣用法を使用して、容易に単離および配列決定され得る(例えば、ここに開示するポリペプチドをコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用する)。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの起源として役立ち得る。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いでこれを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えば、CHO GS SYSTEM^TM(Lonza)からのＣＨＯ細胞)または免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞でポリペプチドを合成させ得る。

治療的使用および方法
ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチド、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを担持するベクター(例えば、ｒＡＡＶ)および方法は、多数のインビトロおよびインビボでの有用性がある。例えば、ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、ベクター、例えば、ＡＡＶベクターまたはポリペプチドを、インビトロまたはエクスビボで培養中の細胞にまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与して、疾患を処置し得る。

従って、ここに開示されるのは、ここに開示する小型化ジストロフィン核酸分子、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞、ここに開示するベクターまたはここに開示する医薬組成物またはこれらの何れかの組み合わせの何れかを使用する、治療方法である。

ある実施態様において、ここに開示されるのは、小型化ジストロフィンポリペプチドをそれを必要とする対象で発現させる方法であって、対象にここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物を投与することを含む、方法である。

ある実施態様において、ここに開示されるのは、疾患または状態を有する対象を処置する方法であって、対象にここに開示する核酸、ここに開示するベクター、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、疾患または状態はジストロフィン欠損が原因である。ある実施態様において、疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、ベッカー型筋ジストロフィー(ＢＭＤ)、Ｘ染色体拡張型心筋症(ＸＬＤＣ)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィーおよび／または先天性筋ジストロフィーである。他の実施態様において、処置される疾患は、サルコペニア、心疾患、カヘキシーである。

ある実施態様において、ここに開示する核酸分子、ここに開示するポリペプチド、ここに開示するベクター(例えば、ｒＡＡＶ)、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物は静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される。ある実施態様において、ここに開示する核酸分子、ここに開示するポリペプチド、ここに開示するベクター、ここに開示する宿主細胞またはここに開示する医薬組成物は、局所、上皮粘膜、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外または胸骨内経路により投与される。ある実施態様において、核酸分子、ベクター(例えば、ｒＡＡＶ)、ここに開示する宿主細胞またはポリペプチドは静脈内投与される。

ある実施態様において、処置方法は対象に第二剤を投与することをさらに含む。

ここで使用する用語「対象」は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、ここに記載する方法および組成物は、癌を有する対象の処置に使用できる。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。ある実施態様において、対象はヒトである。

ある実施態様において、対象への核酸分子、ベクター(例えば、ｒＡＡＶ)、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物の投与は、投与前の該対象におけるジストロフィンタンパク質発現に対してジストロフィンタンパク質発現を増加させ、ここで、ジストロフィンタンパク質発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍増加する。

本発明のある態様において、方法は、対象にＡＡＶ治療を施用することを含むまたはそれをさらに含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、組み換えＡＡＶの投与を含む。当分野で知られるおよび／またはここに開示するあらゆる組み換えＡＡＶが本発明方法において使用できる。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３(タイプ３Ａおよび３Ｂを含む)、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択されるＡＡＶの投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ２の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ３の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ４の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ５の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ６の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ７の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ８の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ９の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１０の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１１の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１２の投与を含む。ある実施態様において、ＡＡＶ治療は、ＡＡＶタイプ１３の投与を含む。

ある実施態様において、ここに開示する小型化ジストロフィン核酸分子、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞、ここに開示するベクターまたはここに開示する医薬組成物またはこれらの何れかの組み合わせでの対象の処置は、顕著な炎症性反応、例えば、免疫介在肺炎、免疫介在大腸炎、免疫在肝炎、免疫介在腎炎または腎機能不全、免疫介在下垂体炎、免疫介在甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫介在有害反応をもたらさない。ある実施態様において、ここに開示する小型化ジストロフィン核酸分子、ここに開示するポリペプチド、ここに開示する宿主細胞、ここに開示するベクター、ここに開示する医薬組成物またはこれらの何れかの組み合わせでの対象の処置は、顕著な心臓障害、例えば、心室性不整脈；眼障害、例えば、虹彩毛様体炎；点滴関連反応；アミラーゼ上昇、リパーゼ上昇；神経系障害、例えば、めまい、末梢および感覚ニューロパチー；皮膚および皮下組織障害、例えば、発疹、掻痒、剥脱性皮膚炎、多形性紅斑、白斑症または乾癬；呼吸器、胸郭および縦隔障害、例えば、咳嗽；疲労；悪心；食欲減退；便秘；関節痛；または下痢をもたらさない。

キット
またここに開示されるのは、１以上のここに開示する核酸分子、ここに開示する１以上のベクター(例えば、ｒＡＡＶ)、１以上のここに開示するポリペプチドまたは１以上のここに開示する宿主細胞またはこれらの何れかの組み合わせを含む、キットである。ある実施態様において、キットはまた、前記またはそれらの組み合わせの何れかを、それを必要とする対象に投与するための指示を含む。

ここで使用する用語「キット」および「システム」は、少なくとも１以上のここに開示する核酸分子、ここに開示する１以上のベクター(例えば、ｒＡＡＶ)、１以上のここに開示するポリペプチドまたは１以上のここに開示する宿主細胞またはこれらの何れかの組み合わせをいうことを意図し、特定の実施態様において、１以上の他のタイプの要素または成分(例えば、他のタイプの生化学的試薬、容器、パッケージ、例えば、商業的販売を意図したパッケージング、使用指示など)との組み合わせである。

ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチド、ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドを含む組成物、ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸、ベクター(例えば、ｒＡＡＶ)および／または宿主細胞の１以上；および(ｂ)前記の何れかをそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドおよび(ｂ)および小型化ジストロフィンポリペプチドをそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドを含む組成物および(ｂ)および組成物をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸および(ｂ)および核酸をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するベクターおよび(ｂ)およびベクターをそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載するＡＡＶベクターおよび(ｂ)およびベクターをそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。ある実施態様において、開示されるのは、(ａ)ここに記載する宿主細胞および(ｂ)および宿主細胞をそれを必要とする対象に投与するための指示を含む、キットである。

特定の実施態様において、ここに提供されるのは、ここに提供される１以上の小型化ジストロフィンペプチドなどのここに記載する医薬組成物の成分の１以上が充填された１以上の容器を含む、医薬パックまたはキットである。ある実施態様において、キットは、ここに記載する医薬組成物および何れかの予防または治療剤、例えばここに記載するものを含む。ある実施態様において、キットは、例えば、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)および／またはホルボールミリステートアセテート(ＰＭＡ)または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などのＴＣＲ複合体刺激抗体などの、Ｔ細胞有糸分裂促進因子を含み得る。所望により、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形の通知をこのような容器と組み合わせてよく、この通知は、該機関によるヒト投与のための製造、使用または販売のための承認を反映する。

またここに提供されるのは、上記方法で使用できるキットである。ある実施態様において、キットは、ここに記載する小型化ジストロフィンポリペプチド、好ましくは精製小型化ジストロフィンポリペプチドを１以上の容器に含む。特定の実施態様において、ここに記載するキットは、実質的に単離された小型化ジストロフィンポリペプチドを対照として含む。他の特定の実施態様において、ここに記載するキットは、さらに小型化ジストロフィンポリペプチド抗原と反応しない対照タンパク質を含む。他の特定の実施態様において、ここに記載するキットは、小型化ジストロフィンポリペプチドのジストロフィン抗原への結合を検出する１以上の要素を含む(例えば、小型化ジストロフィンポリペプチドを蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物などの検出可能基質にコンジュゲートできまたは検出可能基質にコンジュゲートされ得る第一抗体を認識する第二抗体)。特定の実施態様において、ここに提供されるキットは、組み換え産生または化学合成された小型化ジストロフィンポリペプチドを含む。キットに提供されるここに開示する小型化ジストロフィンポリペプチドに対する抗原は、固体支持体にも結合できる。より具体的な実施態様において、上記キットの検出手段は、小型化ジストロフィンポリペプチドの抗原が結合する固体支持体を含む。このようなキットはまた、非結合レポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体も含み得る。この実施態様において、小型化ジストロフィンポリペプチドの抗原への結合は、該レポーター標識抗体の結合により検出され得る。

本発明の実施は、特に断らない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の技術を用い、これらは当業者の技術の範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照のこと。

上に引用する文献の引用全てならびにここで引用する全ての引用文献およびアミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、GenBank番号および/またはUniprot番号)は、引用により全体として本明細書に包含させる。

次の実施例は例として提供され、限定ではない。

実施例１：低減された免疫原性および増加した安定性を有する新規小型化ジストロフィン
ジストロフィン遺伝子における変異は、しばしば対応するジストロフィンタンパク質の安定性の機能障害をもたらし、次いで、これが不安定ジストロフィンタンパク質のプロテアソーム分解およびジストロフィーの病理生理学の問題に至る。同様に、限定的なＡＡＶのパッケージング容積に収容するためのジストロフィンコード化ＤＮＡの小型化は、対応する小型化ジストロフィンタンパク質の安定性を障害し得る。
種々の小型化ジストロフィンタンパク質の安定性を、対応するジストロフィン発現ベクターでトランスフェクトした細胞におけるジストロフィンタンパク質：ｍＲＮＡ比の比較により試験した。ジストロフィン遺伝子に内因性ジストロフィン発現を阻止するＥ２０３５Ｘ中途停止コドンを担持する雄ヒト同質遺伝子的誘導多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)由来心臓筋細胞(ｉＣＭ)を産生した。これら細胞を、種々の小型化ジストロフィンタンパク質を発現する小型化カセットでトランスフェクトし、ジストロフィンタンパク質：ｍＲＮＡ比を、トランスフェクト細胞がインビトロで２４日間培養して、試験した。タンパク質レベルをMeso Scale Discovery(MSD)ELISAアッセイでおよびｍＲＮＡレベルをｑｒｔＰＣＲで試験した。
試験した小型化ジストロフィンおよび試験結果をそれぞれ図２および図３に示す。データは、小型化ジストロフィンペプチドＢＸＡ－０２７７４１(配列番号１２９)およびＢＸＡ－０２７７４３(配列番号１３２)が最良のタンパク質安定性を提供することを示す。

続いて、これら２つの最も安定な設計内に作製した新規接合部の免疫原性を、インシリコ免疫原性予測ツールを使用して試験した。ＢＸＡ－０２７７４３設計(Ｒ１／リンカーＲ１６(接合部Ｊ１)、Ｒ１７／Ｈ３およびＨ３／Ｒ２３(接合部Ｊ７))(図４参照および示していない)の新規接合部は、前記インシリコアプローチに基づき、免疫原性リスクが最小であることが決定された。
ＢＸＡ－０２７７４１設計(Ｒ１／Ｒ３(接合部Ｊ１０)、Ｈ２／リンカーＲ１６(接合部Ｊ１１)およびＲ１７／Ｒ２４(接合部Ｊ９))(図５参照)の新規接合部を、類似の方法で分析した。接合部Ｊ９は免疫原性リスクが最小であることが決定され、一方接合部Ｊ１０およびＪ１１は改善された。
ＢＸＡ－０２７７４１設計およびその接合部バリアントの前記接合部の免疫原性能を、下記インビトロＴ細胞増殖アッセイを使用して、試験した。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)サンプルを、健常ボランティアヒト対象からFicoll(GE Healthcare)勾配遠心分離により単離し、ヒトリンパ球抗原(ＨＬＡ)クラスＩおよびII発現について、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅およびオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションの組み合わせを使用して特徴づけした(ProImmune, Sarasota, FL)。

世界集団頻度とよく合うＨＬＡ発現プロファイルを有する４０ドナーからのＰＢＭＣサンプルのパネルを、さらなる分析に使用した。ＰＢＭＣサンプルをＣＦＳＥ(Invitrogen, Carlsbad, CA)で標識して、増殖をモニターし、９６ウェルプレートに、１０％ヒトＡＢ(Bioreclamation, Westbury, NY)、非必須アミノ酸およびｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ(何れもGibco/Fisher Scientific)を含むＲＰＭＩ(Lonza, Basel, Switzerland)中、ウェルあたり２００,０００細胞で６反復で播種した。
ＢＸＡ－０２７７４１接合部ペプチド、そのバリアントおよび対照ペプチドを、１μMで７日間、４０ＰＢＭＣサンプルのパネルと各々培養し、その後培地を洗い流し、細胞を抗ＣＤ４および抗ＣＤ８ＡＰＣモノクローナル抗体(BD Biosciences, Franklin Lake, NJ)で標識した。非結合抗体を洗浄により除去後、細胞をＰＢＳ中３.７％ホルマリン(Sigma, St. Louis, MO)で固定し、フローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の増殖パーセンテージを決定した。
異なるＢＸＡ－０２７７４１接合部ペプチドおよびそのバリアントと７日間培養後陽性応答－接合部ペプチド非添加または対照ペプチドの培地でインキュベートしたＰＢＭＣと比較して、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ増殖細胞数の有意な増加として定義－を示したサンプルのパーセンテージ(４０ドナーサンプル中)を図６Ａ(ＣＤ４＋)および図６Ｂ(ＣＤ８＋)に示す。使用した対照ペプチドは、(１)アバスチンフレームワークペプチド；(２)ＶＬ６－ＶＬＣＤＲ３ペプチド；および(３)ＰＡＤＲＥペプチド－６１３０９であった。
接合部Ｊ１０のバージョン３(Ｊ１０ｖ３)が接合部Ｊ１０および他のその試験したバージョンより優れ、接合部Ｊ１１のバージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)が接合部Ｊ１１に対する免疫原性リスクに関して全体に優れたことが判明した。

次いで、小型化ジストロフィンＢＸＡ－０２７７４１のＣ末端ドメインを欠失させて、限定的なＡＡＶのパッケージング容積への収容を改善するため小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７３(配列番号１１９)(図７)を産生した。次いで小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７３においてＪ１０ｖ３を使用してＪ１０を置き換え、Ｊ１１ｖ１２を使用してＪ１１を置き換え、小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７７(配列番号１１８)をもたらした(図８Ａおよび８Ｂ)。Ｊ１０ｖ３およびＪ１１ｖ１２を作製するために、それぞれＢＸＡ－１９６４７３において、アミノ酸ＲＶをアミノ酸４４６と４４７の間に挿入し、アミノ酸ＳＥＡＱをアミノ酸６０６と６０７の間に挿入した(配列番号１１９)(図８Ａおよび８Ｂ)。

ＢＸＡ－１９６４７３(配列番号１１９)を次のとおり試験した他の接合部バージョンでさらに修飾した。
ＢＸＡ－１９６４７４(配列番号１２０)：接合部９バージョン２(Ｊ９ｖ２)および接合部１１バージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)
ＢＸＡ－１９６４７５(配列番号１２１)：接合部９バージョン５(Ｊ９ｖ５)および接合部１１バージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)
ＢＸＡ－１９６４７６(配列番号１２２)：接合部９バージョン６(Ｊ９ｖ６)および接合部１１バージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)
ＢＸＡ－１９６４７８(配列番号１２４)：接合部１０バージョン６(Ｊ１０ｖ６)および接合部１１バージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)
ＢＸＡ－１９６４７９(配列番号１２５)：接合部１１バージョン１２(Ｊ１１ｖ１２)
Ｊ９ｖ２は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＲ１７ドメインとＲ２４ドメイン、すなわち、アミノ酸８４３と８４５の間のアミノ酸ＬＥＲからＫＮＩへの置換である。
Ｊ９ｖ５は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＲ１７ドメインとＲ２４ドメイン、すなわち、アミノ酸８４２と８４３の間のＫの挿入である。
Ｊ９ｖ６は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＲ１７ドメインとＲ２４ドメイン、すなわち、アミノ酸８４２と８４３の間のＫＮＩの挿入である。
Ｊ１０ｖ３は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＲ１とＲ３ドメイン、すなわち、アミノ酸４４６と４４７の間のＲＶの挿入である。
Ｊ１０ｖ６は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＲ１とＲ３ドメイン、すなわち、アミノ酸４４６と４４７の間のＲＶＬＬＱＤＩの挿入である。
Ｊ１１ｖ１２は、ＢＸＡ－１９６４７３におけるＨ２ドメインとＲ１６ドメイン前のリンカー、すなわち、アミノ酸６０６と６０７の間のＳＥＡＱの挿入である。

次いで、得られた小型化ジストロフィンを安定性について前記のとおり試験した(図９)。結果は、ＢＸＡ－１９６４７７小型化ジストロフィン設計(Ｊ１０Ｖ３およびＪ１１Ｖ１２を含む)が最低免疫原性リスクを有するだけでなく、最も安定であることが判明した。
さらに、小型化ジストロフィンポリペプチド設計ＢＸＡ－２１２３７１を、最後のＣ末端の３アミノ酸の欠失およびＢＸＡ－２１２３７１のアミノ酸６８２位後のアミノ酸接合部バリアント配列ＫＮＤＬ(Ｊ２Ｖ１０；スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメインとヒンジ３(Ｈ３)ドメインの間)の挿入により修飾し(小型化ジストロフィンＢＸＡ－２１３７８８、配列番号１５２となる)、これはより低い免疫原性リスクを有することが判明した。

実施例２：インビトロ生理学
ＤＭＤｉＣＭは、多電極アレイを使用して同質遺伝子的野生型ｉＣＭと比較したとき、Ｎａ^＋チャネル振幅が低く、ｃＦＰＤ(Ｑ－Ｔ間隔)が長く、拍動数変動性が大きい。ＤＭＤｉＣＭは、また、野生型ｉＣＭよりＣａ^２＋伝達が高く、インピーダンスが低く、各方法は、ペース調整されていない細胞における拍動数変動性を確認する。
Ｅ２０３５Ｘ変異を担持するＤＭＤｉＣＭにおける小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７７の発現が、ＤＭＤ表現型を軽減でき、細胞の生理学的特性を改善するかを試験する。多電極アレイ、インピーダンス収縮アッセイおよびＣａ^２＋過渡応答を、小型化ジストロフィン発現の効果の測定に使用する。限定的なＡＡＶのパッケージング容積によりよく収容されるＢＸＡ－２１２３７１を製造するために、ＢＸＡ－０２７７４３のＣ末端ドメインも欠失される。ＤＭＤ表現型を軽減し、同細胞の生理学的特性を改善するＢＸＡ－２１２３７１の機能的容量を、ＢＸＡ１９６４７７について提案されるのと同じアッセイを使用して試験する。

本試験で使用したｈｉＰＳＣＣＭは、Cellular Dynamics International, Madison, Wisconsinから購入したＤＭＤ(E2035X)ｉＣｅｌｌであった。ヒト心室線維芽細胞をLonza, Walkersville, Marylandから購入した。ｉＣｅｌｌｈｉＰＳＣＣＭは、一次成体心筋細胞に近い電気生理学的性質を有し、広範な心臓イオンチャネル阻害剤ならびにアドレナリンおよびムスカリン受容体アゴニストおよびアンタゴニストに同様に応答することが報告されている。我々の研究は、ｈｉＰＳＣＣＭと線維芽細胞の共培養が、多電極アレイ(ＭＥＡ)上での電気生理学的試験のためのより安定な調製物を提供することを示した。ｈｉＰＳＣＣＭを０.１％ゼラチン処理６ウェル培養プレートで７％ＣＯ_２で７日間培養し、次いでトリプシン処理し、ヒト成体心線維芽細胞で約５：１比で希釈した。次いで、hiPSC CMおよび線維芽細胞の懸濁液を、ラミニン被覆９ウェル多電極アレイ(ＭＥＡ)プレート(256-9wellMEA300/30iR-ITO-mq; Multichannel Systems)で共培養した。hiPSC CMをＡＡＶ９－ｍＤｙｓ発現構築物(発現小型化ジストロフィンＢＸＡ－１９６４７７およびＢＸＡ－２１３７８８、図１５Ｄ)で、１×１０^６ＭＯＩで４８時間感染させ、次いで、hiPSC CMを感染７日および９日後、細胞外電場電位(ＦＰ)に対する影響について評価した。ＢＸＡ－１９６４７７およびＢＸＡ－２１３７８８両者は、ＤＭＤＣＭと比較して、約８０％伝導速度を有意に改善した(テューキー事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡで^＊＊＊Ｐ＜０.００１、ｎ＝６)(図１５Ｅ)。ジストロフィンＥＬＩＳＡは、細胞におけるジストロフィン発現を確認した(図１５Ｆ)。

ＭＥＡテクノロジーは、細胞が培養されるか組織が位置づけられることができる、包埋基質統合細胞外電極のアレイからの興奮性細胞または組織の高含量時空間解析を可能とする。細胞外電場電位(ＦＰ)を各電極により記録し、細胞活動電位と相関させる。ＦＰ形態学、期間および伝導速度の評価は、処理のイオンチャネル活性の像ならびに再分極および伝導に対する影響を提供する。ＭＥＡプレートでhiPSC CMの７日培養後、細胞は、各ウェルに包埋した記録電極上に、自発的に拍動する単層を形成した。自発的ＦＰをUSB-MEA256-SYSTEMおよびMC Rack acquisition software(Multi Channel Systems)を使用して、１０kHzのサンプリング周波数で、２８電極／ウェル(３０μm直径、中心間距離３００μm)から記録した。一定５％ＣＯ_２および９５％Ｏ_２供給下、３７℃で加湿環境での２０分平衡化時間後、各ウェルを３００μl維持培地中、ＡＡＶ９－ｍＤｙｓ発現構築物でトランスフェクトした。ＦＰのパルス間間隔(ＩＰＩ)に対する小型化ジストロフィンの発現の影響をモニターし、記録した。データを、MatLab (Mathworks)で書かれたカスタムソフトウェアで分析した。心拍数の代用である拍動数(拍／分)を、ＢＲ＝６００００／ＩＰＩ(式中、ＩＰＩは各条件下、定常状態で記録された１００秒の平均ＩＰＩ(msec)である)を使用して計算した。測定すべき電気生理学的パラメータは、再分極の代用である細胞外電位持続時間および電場電位伝導速度である。細胞外電位持続時間を、拍動数変化(ＦＰＤｃ)に対して補正した。全処理を少なくとも３回繰り返した。

伝導速度を、同期された単一伝播拍動の間、ＭＥＡウェルに埋め込まれた各電極の電場電位活性化時間の測定により定量化した。各電極からの電場電位のデジタル化記録を、２.１msのウインドウで２１点最小二乗平滑化式(Savitsky & Golay, 1964)を使用して平滑化した。活性化時間は、各電場電位波形の負の導関数のピーク値である。最も早いおよび最も遅い活性化時間の２つの間の時間が、心筋細胞の単層をわたる電場電位伝播の伝導時間であり、これら２つの電極間の距離が伝導距離である。各伝播の伝導距離で除した伝導時間が、ＭＥＡウェルの単層心筋細胞の各拍動の伝導速度である(図１５)。
データは、両小型化ジストロフィン設計が伝導速度を有意に改善することを示す(図１５)。

実施例３：骨格筋生理学のインビボ回復
ジストロフィン欠損骨格筋はあまり比力(specific force)(単位面積あたりの力)を生み出さず、収縮誘導傷害に高度に感受性である。ジストロフィン発現の回復は、これら障害を軽減し得る。ジストロフィー性ｍｄｘマウスを、２週齢で、２ｅ１４vg／kg ＡＡＶ９－Ｃ５－１２－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－Ｃ５－１２－ＢＸＡ－２１２３７１で、後眼窩注射により全身処置する。肢筋肉生理学を８週齢で試験する。簡潔には、マウス膝を固定し、足を鐙に置き、鐙を針電極で筋肉を最大に収縮させながら動かす。このアッセイは、ピーク単収縮および強縮性筋力産生ならびに収縮誘導傷害を測定する。

実施例４：ジストロフィー病理のインビボ予防
ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルの骨格筋は、一般に約３～４週齢で壊死および再生を起こす。再生された筋肉は、一般にサイズがより変わりやすく、凍結横断切片で中央に位置する核を含む。また、線維症は、再生された筋肉でより多い。未処置ｍｄｘ筋肉およびＡＡＶ９－Ｃ５－１２－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－Ｃ５－１２－ＢＸＡ－２１２３７１で処置したｍｄｘ筋肉の筋線維サイズ、中央に位置する核の割合および線維症を測定する。小型化ジストロフィンを発現する筋線維の割合も定量化する。横隔膜、腓腹筋、前脛骨筋および心筋を、HALOおよびColumbus画像処理コンピュータープログラムを使用して試験する。

実施例５：インビボ検討
試験の概要
ｍｄｘ^４ｃｖマウスを、２週齢で２ｅ１４vg／kg ＡＡＶ９－ＢＸＡ－１９６４７７またはＡＡＶ９－ＢＸＡ－２１３７８８で処置した。投与２週間後、ｎ＝３マウスを、小型化ジストロフィンの標的結合(生体内分布および発現レベル)を試験するために終了させた。２カ月齢で、右前脛骨筋筋肉を、先の記載(Khairallah et. al., 2012)に類似して強度および収縮誘導傷害に対する抵抗性について試験した(ｎ＝１０)。マウスを３カ月齢で致死させ、標的結合およびジストロフィー予防について試験した(図１６)。

標的結合
免疫蛍光－筋肉を液体Ｎ_２の２－メチルブタンでＯＣＴに凍結させた。１０μm凍結切片をＡｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートしたジストロフィン(Mandys106; DSHB; 1:200)および小麦胚芽凝集素に対する抗体で免疫染色した。Ａｌｅｘａ－４８８ＩｇＧ２ａ抗体を使用して、ジストロフィン一次抗体を標識した。切片を、Phoenix Opera High Contentスクリーニング共焦点顕微鏡(Perkin-Elmer)を使用して造影し、Columbusソフトウェアを使用して定量化した。簡潔には、Ａｌｅｘａ－６４７画像を倒置し、Ｍ－ｍｏｄｅを使用して細胞を検出し、横断切片＜２０００um^２の細胞の選択集団を数値化した。次に、Ａｌｅｘａ－４８８の強度を計算し、ｍｄｘ^４ｃｖ対照筋肉より大きい強度の集団を選択した。９０％を超える筋肉が、４週および１２週マウスで小型化ジストロフィンについて陽性であった(図１７)。

ｍＲＮＡ－総ＲＮＡ単離のために、組織をQiagen Tissuelyzerで均質化し、ＲＮＡをQiagen RNeasy 96 Universal tissue kit(Qiagen catalog number 74881)を使用して単離した。組織(約１５)を、７５０μlのQiazol試薬および１個の５mmスチールビーズを含む
RNeasyキットコレクションマイクロチューブに入れ、３０hzで２分間Tissuelyzerを使用して均質化し、この工程を、均質化するまで繰り返し、続いて６０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。各チューブに１５０mlのクロロホルムを加え、サンプルを１５秒間激しくボルテックス処理した。室温で３分間インキュベーション後、サンプルを６０００×ｇで１５分間、４℃で遠心した。水相を除き(約３６０μl)、１体積のＲＮＡｓｅフリー７０％ＥｔＯＨを含む新しいチューブに移した。全サンプルを９６ウェルＲＮｅａｓｙ９６プレートに移し、プレートをAirPoreテープで封し、５６００×ｇで４分間、室温で遠心分離した。ウェルあたり４００μlのＲＷ１緩衝液を加え、プレートを再び封し、４分間、５６００×ｇで回転させた。この回転中、ＤＮａｓｅＩ原液を、ＤＮａｓｅバイアルあたり５５０μlの無ＲＮＡｓｅ水を加えることにより調製した。６７０μlのＤＮａｓｅＩ原液を７.３ml ＲＤＤ緩衝液で希釈し、混合し、４℃で保管した。遠心分離が完了したとき、フロースルーを廃棄し、８０μlのＤＮａｓｅＩ混合物を各ウェルの中心に直接加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、４００μlのＲＷ１を各ウェルに加え、プレートを封し、４分間、５６００×ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、ウェルあたり８００μlのＲＰＥ緩衝液を加え、プレートを再び封し、４分間、５６００×ｇで回転させた。この過程を繰り返し、プレートを１０分間、５６００×ｇで遠心分離した。次いで、各サンプルを、６０μlの無ＲＮＡｓｅ水を各ウェルの中心に加え、４分間、５６００×ｇで遠心分離することにより新鮮なチューブに溶出させた。回収率を改善するため、６０μLをプレートに再適用して戻し、さらに４分間、５６００×ｇで遠心分離した。ＲＮＡ収量をnanodrop 8000を使用して定量化した。

ＲＴ－ＰＣＲ－ｃＤＮＡ合成および続くＰＣＲのために、１μgのＲＮＡを、１０μl Ｈ_２Ｏ中９６ウェルプレートの１ウェルに加えた(Plate-Axygen, PCR-96-C-S)。各ウェルに、１０μlのマスターミックス(High Capacity cDNA Reverse Transcription kit, Applied Biosystem)を加え、プレートを１０００rpmで遠心分離した。ｃＤＮＡ合成を２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間実施し、続いて４℃で保持した。ｑＰＣＲのために、各サンプルを３８４ウェル透明反応プレート(applied biosystem; catalog number 4483285)でプライマー／プローブセット(フォワードプライマー5’-TGGAAGATTGCTACGAGCGC-3’；リバースプライマー5’-CAGGTCGCTGAACAGGTTCT-3’；プローブ－6FAM-GCAAGTTCGGCAAGCAGCACA-MGBNFG)を用いてデュプリケートで流した。各反応物に、２μlのｃＤＮＡおよび８μLのマスターミックス(５μl fast advanced master mix、０.５μl ２０×FAM primer probe mixおよび２.５μl水)を加え、プレートを１分間、１０００rpmで遠心分離した。サンプルを、ViiA7システムおよびデータ分析のためのQuant StudioリアルタイムＰＣＲソフトウェア(Applied Biosystem)を使用して、９５℃で２０秒間、続いて９５℃で１秒間および６０℃で２０秒間の４０サイクルでインキュベートした。

ベクターゲノム／ゲノムＤＮＡ単離およびｑＰＣＲ－ゲノムＤＮＡ単離のために、組織をQiagen Tissuelyzerを使用して均質化し、ゲノムＤＮＡをQiagen DNeasy 96 blood and tissue kit(Qiagen catalog number 69581)を使用して単離した。組織(約１０mg)を、２００μlのプロテイナーゼＫ－緩衝液ＡＴＬおよび１個の５mmスチールビーズを含む９６ウェルプレート(costar assay block １ml、catalog number 3958)に入れ、Tissuelyzerを３０hz、２分間使用して均質化し、これを均質化するまで繰り返した。ゲノムＤＮＡ単離は取扱い指示書に従った。ｑＰＣＲのために、各サンプルを、３８４ウェル透明反応プレート(applied biosystem; catalog number 4483285)中、プライマー／プローブセット(フォワードプライマー5’-TGGAAGATTGCTACGAGCGC-3’；リバースプライマー5’-CAGGTCGCTGAACAGGTTCT-3’；プローブ－６FAM-GCAAGTTCGGCAAGCAGCACA-MGBNFG)とデュプリケートで流した。各反応に、２μlのゲノムＤＮＡ(８０ng)および８μLのマスターミックス(５μl fast advanced master mix、０.５μl ２０×FAM primer probe mixおよび２.５μl水)を加え、プレートを１分間、１０００rpmで遠心分離した。サンプルを、ViiA7システムおよびデータ分析のためのQuant StudioリアルタイムＰＣＲソフトウェア(Applied Biosystem)を使用して、９５℃で２０秒間、続いて９５℃で１秒間および６０℃で２０秒間の４０サイクルでインキュベートした。

ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ－タンパク質発現をＥｌｉｓａアッセイにより決定した。多アッセイ３８４ウェルプレート(Meso Scale Discovery, catalog number L21XB-4)を、２μg／ml濃度で、重炭酸緩衝液中、一夜モノクローナル抗体Manex 1011bでプレコートした。次いで、プレートを遮断緩衝液(ＰＢＳ中５％ＢＳＡ)で４時間、室温で振盪しながら遮断した。組織(約２０mg)を、Qiagen Tissuelyzerを３０hzで５分間使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠(Roche, catalog number 04 693 159 001)含有１mg組織／１０μl溶解緩衝液(Sigma, catalog number R0278)濃度でｒｉｐａ緩衝液で均質化し、この工程を均質化するまで繰り返した。組織ｒｉｐａライセートを、結合緩衝液(ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、０.０５％ｔｗｅｅｎ２０、２０mM ＴｒｉｓｐＨ７.５)で１：３に希釈した。組織ライセートおよびスルホコンジュゲートMandys 106(０.２μg／ml)を、プレコートした３８４ウェルプレートに加え、４０℃で一夜、振盪しながらインキュベートした。プレートを、０.０５％ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄し、界面活性剤含有４０μl MSD read buffer T(catalog number R92TC-1)で洗浄した。次いで、プレートをMSD Sector 6000 machineで読んだ。
データは、４週齢で＞９０％横紋筋細胞における発現(ｍＲＮＡおよびタンパク質)を達成するのに十分なウイルスが投与されたことを示した(図１８)。

クレアチンキナーゼ－筋肉損傷の指標としてのクレアチンキナーゼを、市販キットを使用して血清で測定した。ＣＫを４週齢(送達２週後)で測定した。また、ＣＫを、収縮誘導傷害プロトコール１か月後である３カ月齢で測定した(下記参照)。^＊＊＊＊一元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定でＰ＜０.００１、ｎ＝１０、ｍｄｘ^４ｃｖと比較。データは、ＢＸＡ－１９６４７７またはＢＸＡ－２１３７８８で処置したマウスで、クレアチンキナーゼレベル、故に筋肉損傷が有意に減少したことを示した(図１９)。

機能試験
前脛骨筋(ＴＡ)筋肉収縮性性質を、製造者の指示(Aurora Scientific)に従い、インビボ(足プレート)装置で試験した。簡潔には、ピーク強縮を、力周波数曲線で１５０Hzで達成した(力を、ニュートンメートルとしてトルクで測定)。ピーク強縮は、野生型、ｍｄｘ^４ｃｖおよびＢＸＡ－１９６４７７またはＢＸＡ－２１３７８８で処置したｍｄｘ^４ｃｖマウスで同じであった。しかしながら、ＴＡ筋肉量はｍｄｘ^４ｃｖで大きく(^＊＊＊＊一元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定でＰ＜０.００１、ｎ＝１０)、ＴＡ質量に対するピーク強収縮力の正規化が、ｍｄｘ^４ｃｖマウスで減少し、処置マウスで野生型レベルであった(^＊＊＊ｍｄｘ^４ｃｖと比較してＰ＜０.００１；一元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定、ｎ＝１０)(図２０)。

前脛骨筋(ＴＡ)筋肉傷害を、製造者の指示(Aurora Scientific)に従い、インビボ(足プレート)装置で測定した。１５０Hz(最大等尺性トルク)でのピーク強縮中、足プレートを筋肉を引っ張るため９０°から１３５°に回転させた。この収縮を、先に記載のとおり(Khairallah et. al., 2012)、毎分２０収縮まで繰り返した。引っ張る直前の最大等尺性トルクは、ｍｄｘ^４ｃｖマウスで各収縮で有意に減少した(野生型と比較してＰ＜０.０００１；二元配置ＡＮＯＶＡ；ｎ＝９～１０)。対照的に、ＢＸＡ－１９６４７７およびＢＸＡ－２１３７８８両者は、野生型レベルに類似して収縮誘導傷害を予防した(ｍｄｘ^４ｃｖと比較して、テューキー事後検定を伴い、ＢＸＡ－２１３７８８で^＊＊＊＊Ｐ＜０.０００１およびＢＸＡ－１９６４７７で^＊＊Ｐ＜０.０１ｎ＝９～１０)。データは、両小型化ジストロフィン設計が、ＴＡ筋肉を収縮誘導傷害から保護することを示す(図２１)。
ここでの実施例に記載する小型化ジストロフィン構築物のインビトロおよびインビボ発現は、最初の７個および最後の１３ヌクレオチドが除去された、Ｃ５－１２プロモーター制御下にあった(ＵＳ２００４／０１７５７２７参照)。使用したＡＡＶはＡＡＶ９であり、ここで、ＩＴＲはＡＡＶ２であった。

実施例６：さらなる免疫原性試験
小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－０２７７４１内のヒンジ２(Ｈ２)ドメインとＲ１６スペクトリン反復１６(Ｒ１６)の間に作製した新規接合部(表１２参照：配列番号１５６～１６６；配列番号１５５は元の配列)の免疫原性を、インシリコ免疫原性予測ツールを使用して試験した。新規接合部配列番号１５７(図２２参照)は、前記インシリコアプローチに基づき、免疫原性リスクが最小であることが示された。試験した接合部配列は次のとおり、番号付けされる：配列番号１５５(１)、配列番号１５６(２)、配列番号１５７(３)、配列番号１５８(４)、配列番号１５９(５)、配列番号１６０(６)、配列番号１６１(７)、配列番号１６２(８)、配列番号１６３(９)、配列番号１６４(１０)、配列番号１６５(１１)、配列番号１６６(１２)(図２２Ｂ参照)。
ＢＸＡ－０２７７４１設計およびその接合部バリアントの前記接合部の免疫原性能を、上記インビトロＴ細胞増殖アッセイを使用して試験した。データは、接合部Ｊ１１ｖ３(配列番号１５７、図２２ＢのNo. 3)が他の試験した接合部と比較して、有意に少ないＣＤ８＋(図２３Ａ)およびＣＤ４＋Ｔ(図２３Ｂ)細胞増殖を誘発し、それ故に優れることを示す(図２３)。小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－１９６４７７を、接合部Ｊ１１ｖ３を担持し、Ｃ末端の最後の３アミノ酸が欠失され、３’ＵＴＲが短縮され、小型化ジストロフィンポリペプチドＢＸＡ－２１３７８０(配列番号１５３)およびヌクレオチド配列番号１５４がもたらされるよう修飾した。

Claims

Ｎ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該小型化ジストロフィンポリペプチドがジストロフィンのスペクトリン反復２を含まない、核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがスペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメイン、スペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインまたはスペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメインまたはこれらの何れかの組み合わせを含まない、請求項１に記載の核酸分子。
Ｒ１ドメインがペプチド結合にＲ３ドメインに直接融合されている、請求項１または２に記載の核酸分子。
Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインがアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬ(ＲＶ)により融合されている、請求項１または２に記載の核酸分子。
Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインがリンカーにより融合されている、請求項１～４の何れかに記載の核酸分子。
リンカーが配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列がｎＮＯＳシグナル伝達の改善ができる、請求項５に記載の核酸分子。
配列番号７５(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI)を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、該核酸分子が配列番号１００(ATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGACATGCCCCTGGAAATC)と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であり、ここで、該アミノ酸配列がｎＮＯＳシグナル伝達の改善ができる、核酸分子。
アミノ酸配列がジストロフィンの第一ドメインをジストロフィンの第二ドメインに結合するリンカーである、請求項７に記載の核酸分子。
ジストロフィンの第一ドメインがＨ２ドメインであり、ジストロフィンの第二ドメインがＲ１６ドメインである、請求項８に記載の核酸分子。
アミノ酸配列がＮ末端に配列番号７４の配列をさらに含む、請求項６～９の何れかに記載の核酸分子。
核酸分子が小型化ジストロフィンポリペプチドをコードする、請求項７～１０の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＮ末端からＣ末端方向でジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、ヒンジ２(Ｈ２)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む、請求項１１に記載の核酸分子。
Ｒ１ドメインおよびＲ３ドメインがアミノ酸ＡＲＧ－ＶＡＬ(ＲＶ)により融合されており、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号７４～７５に示されるアミノ酸配列の組み合わせにより融合されている、請求項１～６および１２の何れかに核酸分子。
(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインが直接融合されている、(ii)Ｒ３ドメインおよびＨ２ドメインが直接融合されている、(iii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインが直接融合されている、(iv)Ｒ１７およびＲ２４ドメインが直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインが直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせである、請求項１～６、１２および１３の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＡＢＤ１ドメインおよび／またはＣＲドメインをさらに含む、請求項１～６および１２～１４の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＮ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、アミノ酸ＲＶ、Ｒ３ドメイン、Ｈ２ドメイン、配列番号７４～７５に示すアミノ酸配列、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインから本質的になるまたはそれからなる、請求項１～６および１２～１５の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ１ドメインが配列番号６９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～１６の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１ドメインが配列番号７０に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～１７の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ３ドメインが配列番号７２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～１８の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ２ドメインが配列番号７３に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～１９の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１６ドメインが配列番号７６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～２０の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１７ドメインが配列番号７７に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～２１の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ２４ドメインが配列番号７８に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～２２の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ４ドメインが配列番号７９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項１～６および１２～２３の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＮ末端に、配列番号６８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１～６および１２～２４の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＣ末端に、配列番号８０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１～６および１２～２５の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドが配列番号１１８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～６および１２～２６の何れかに記載の核酸分子。
ヌクレオチド配列が配列番号１３３のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一の配列を含む、請求項２７に記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドが(ｉ)ＢＸＡ－０２７７４１と比較して低いＣＤ４増殖、(ii)ＢＸＡ－０２７７４１と比較して低いＣＤ８増殖、(iii)ＢＸＡ－０２７７４１より高い小型化ジストロフィンポリペプチドの発現および(iv)これらの何れかの組み合わせからなる群から選択される１以上の性質を示す、請求項１～６および１２～２８の何れかに記載の核酸分子。
スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)を含むリンカーにより融合されている、核酸分子。
Ｎ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのヒンジ１(Ｈ１)ドメイン、スペクトリン反復１(Ｒ１)ドメイン、スペクトリン反復１６(Ｒ１６)ドメイン、スペクトリン反復１７(Ｒ１７)ドメイン、ヒンジ３(Ｈ３)ドメイン、スペクトリン反復２３(Ｒ２３)ドメイン、スペクトリン反復２４(Ｒ２４)ドメインおよびヒンジ４(Ｈ４)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、Ｒ１ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)により融合されている、核酸分子。
(ｉ)Ｈ１ドメインおよびＲ１ドメインが直接融合されている、(ii)Ｒ１６およびＲ１７ドメインが直接融合されている、(iii)Ｒ１７およびＨ３ドメインが直接融合されている、(iv)Ｒ２３およびＲ２４ドメインが直接融合されているまたは(ｖ)Ｒ２４およびＨ４ドメインが直接融合されているまたは(vi)これらの何れかの組み合わせである、請求項３１に記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがスペクトリン反復２(Ｒ２)ドメイン、スペクトリン反復３(Ｒ３)ドメイン、スペクトリン反復４(Ｒ４)ドメイン、スペクトリン反復５(Ｒ５)ドメイン、スペクトリン反復６(Ｒ６)ドメイン、スペクトリン反復７(Ｒ７)ドメイン、スペクトリン反復８(Ｒ８)ドメイン、スペクトリン反復９(Ｒ９)ドメイン、スペクトリン反復１０(Ｒ１０)ドメイン、スペクトリン反復１１(Ｒ１１)ドメイン、スペクトリン反復１２(Ｒ１２)ドメイン、スペクトリン反復１３(Ｒ１３)ドメイン、スペクトリン反復１４(Ｒ１４)ドメイン、スペクトリン反復１５(Ｒ１５)ドメイン、スペクトリン反復１８(Ｒ１８)ドメイン、スペクトリン反復１９(Ｒ１９)ドメイン、スペクトリン反復２０(Ｒ２０)ドメイン、スペクトリン反復２１(Ｒ２１)ドメインおよび／またはスペクトリン反復２２(Ｒ２２)ドメインを含まない、請求項３０～３２の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＡＢＤ１ドメインおよび／またはＣＲドメインをさらに含む、請求項３０～３３の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＮ末端からＣ末端方向で、ジストロフィンのＡＢＤ１ドメイン、Ｈ１ドメイン、Ｒ１ドメイン、配列番号８４に示すアミノ酸配列、Ｒ１６ドメイン、Ｒ１７ドメイン、Ｈ３ドメイン、Ｒ２３ドメイン、Ｒ２４ドメイン、Ｈ４ドメインおよびＣＲドメインから本質的になるまたはそれからなる、請求項３０～３４の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ１ドメインが配列番号８２に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～３５の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１ドメインが配列番号８３に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～３６の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１６ドメインが配列番号８５に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～３７の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ１７ドメインが配列番号８６に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～３８の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ３ドメインが配列番号８７に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～３９の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ２３ドメインが配列番号８８に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～４０の何れかに記載の核酸分子。
Ｒ２４ドメインが配列番号８９に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～４１の何れかに記載の核酸分子。
Ｈ４ドメインが配列番号９０に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列である、請求項３０～４２の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＮ末端に、配列番号８１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項３０～４３の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＣ末端に、配列番号９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列をさらに含む、請求項３０～４４の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドが配列番号１３２または配列番号１３２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｃ末端ドメインが欠失される、請求項３０～３５の何れかに記載の核酸分子。
ヌクレオチド配列が配列番号１４７または配列番号１４８または配列番号１４９のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一である配列を含む、請求項４６に記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドがＢＸＡ－１９６４８１より高い小型化ジストロフィンポリペプチドの発現を示す、請求項３８～４７の何れかに記載の核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチド発現がＢＸＡ－１９６４８１ポリペプチド発現より少なくとも約１.５倍、少なくとも約１.６倍、少なくとも約１.７倍、少なくとも約１.８倍、少なくとも約１.９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.１倍、少なくとも約２.２倍、少なくとも約２.３倍、少なくとも約２.４倍、少なくとも約２.５倍、少なくとも約２.６倍、少なくとも約２.７倍、少なくとも約２.８倍、少なくとも約２.９倍または少なくとも約３倍高い、請求項３８に記載の核酸分子。
プロモーターをさらに含む、請求項１～４９の何れかに記載の核酸分子。
プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項５０に記載の核酸分子。
プロモーターが肝細胞、筋細胞、内皮細胞、神経細胞、類洞細胞またはこれらの何れかの組み合わせにおける治療タンパク質の発現を駆動する、請求項５０または５１の核酸分子。
プロモーターがマウスサイレチンプロモーター(ｍＴＴＲ)、内因性ヒト第VIII因子プロモーター(Ｆ８)、ヒトアルファ－１－抗トリプシンプロモーター(ｈＡＡＴ)、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン(ＴＴＰ)プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、シナプシン１遺伝子プロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、α１－抗トリプシン(ＡＡＴ)、筋肉クレアチンキナーゼ(ＭＣＫ)、ミオシン重鎖アルファ(αＭＨＣ)、ミオグロビン(ＭＢ)、デスミン(ＤＥＳ)、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、ｔＭＣＫおよびホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターからなる群から選択される、請求項５０～５２の何れかに記載の核酸分子。
イントロン配列をさらに含む、請求項１～５３の何れかに記載の核酸分子。
イントロン配列が小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する、請求項５４に記載の核酸分子。
イントロン配列がプロモーターの３’に位置する、請求項５４または５５に記載の核酸分子。
イントロン配列が合成イントロン配列を含む、請求項５４～５６の何れかに記載の核酸分子。
転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１～５７の何れかに記載の核酸分子。
転写後調節エレメントが小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’に位置する、請求項５８に記載の核酸分子。
転写後調節エレメントが変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(ＷＰＲＥ)、マイクロＲＮＡ結合部位またはＤＮＡ核ターゲティング配列またはこれらの何らかの組み合わせを含む、請求項５８または５９に記載の核酸分子。
３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列をさらに含む、請求項１～６０の何れかに記載の核酸分子。
３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列がｂＧＨポリ(Ａ)、アクチンポリ(Ａ)、ヘモグロビンポリ(Ａ)およびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項６１に記載の核酸分子。
３’ＵＴＲポリ(Ａ)テイル配列がｂＧＨポリ(Ａ)を含む、請求項６１または６２に記載の核酸分子。
エンハンサー配列をさらに含む、請求項１～６３の何れかに記載の核酸分子。
第一ＩＴＲおよび／または第二ＩＴＲをさらに含む、請求項６４に記載の核酸分子。
第一ＩＴＲおよび第二ＩＴＲが同一である、請求項６５に記載の核酸分子。
第一ＩＴＲおよび／または第二ＩＴＲがアデノ随伴ウイルス由来である、請求項６５または６６に記載の核酸分子。
異種部分を含む、請求項１～６７の何れかに記載の核酸分子。
異種部分がアルブミンまたはそのフラグメント、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト絨毛膜性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはそのフラグメント、アルブミン結合部分またはその誘導体およびこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される、請求項６８に記載の核酸分子。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項７０に記載のベクター。
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターである、請求項７０に記載のベクター。
ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１から選択される、請求項７２に記載のベクター。
ＡＡＶベクターがＡＡＶ９である、請求項７２に記載のベクター。
核酸分子またはベクター送達剤と共に製剤化されている、請求項１～６９の何れかに記載の核酸分子または請求項７０～７４の何れかに記載のベクター。
送達剤が脂質ナノ粒子を含む、請求項７５に記載の核酸分子またはベクター。
送達剤がリポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソームおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項７５に記載の核酸分子またはベクター。
静脈内、経皮、皮内、皮下、肺または経口送達またはこれらの何れかの組み合わせのために製剤化されている、請求項１～６９の何れかに記載の核酸分子、請求項７０～７４の何れかに記載のベクターまたは請求項７５～７７の何れかに記載の核酸分子またはベクター。
静脈内送達のために製剤化されている、請求項７８に記載の核酸分子またはベクター。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸分子、請求項７０～７４の何れかに記載のベクターまたは請求項７５～７９の何れかに記載の核酸分子またはベクターによりコードされる、ポリペプチド。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸分子または請求項７０～７４の何れかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
細胞がＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞である、請求項８１に記載の宿主細胞。
(ａ)請求項１～６９の何れかに記載の核酸、請求項７０～７４の何れかに記載のベクター、請求項７５～７９の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項８０に記載のポリペプチドまたは請求項８１または８２に記載の宿主細胞；および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸、請求項７０～７４の何れかに記載のベクター、請求項７５～７９の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項８０に記載のポリペプチド、請求項８１または８２に記載の宿主細胞または請求項８３に記載の医薬組成物および核酸分子をそれらを必要とする対象に投与するための指示を含む、キット。
請求項８１または８２に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養し、小型化ジストロフィンポリペプチドを回収することを含む、小型化ジストロフィンポリペプチドの製造方法。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸、請求項７０～７４の何れかに記載のベクター、請求項７５～７９の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項８１または８２に記載の宿主細胞または請求項８３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象において小型化ジストロフィンポリペプチドを発現させる方法。
請求項１～６９の何れかに記載の核酸、請求項７０～７４の何れかに記載のベクター、請求項７５～７９の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項８０に記載のポリペプチド、請求項８１または８２に記載の宿主細胞または請求項８３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患または状態を有する対象を処置する方法。
疾患または状態がジストロフィン欠損が原因の疾患である、請求項８７に記載の方法。
疾患がサルコペニア、心疾患、カヘキシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、ベッカー型筋ジストロフィー(ＢＭＤ)、Ｘ染色体拡張型心筋症(ＸＬＤＣ)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィーおよび／または先天性筋ジストロフィーである、請求項８８に記載の方法。
核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物が静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される、請求項８６～８９の何れかに記載の方法。
核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物が静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される、請求項９０に記載の方法。
さらに対象に第二剤を投与することを含む、請求項８７～９１の何れかに記載の方法。
対象がヒトである、請求項８６～９２の何れかに記載の方法。
対象への核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物の投与が投与前の対象におけるジストロフィンタンパク質発現と比較してジストロフィンタンパク質発現を増加させ、ここで、ジストロフィンタンパク質発現が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍増加する、請求項８６～９３の何れかに記載の方法。
Ａヒンジ２(Ｈ２)ドメインおよびスペクトリン１６(Ｒ１６)ドメインを含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｈ２ドメインおよびＲ１６ドメインが配列番号８４に示すアミノ酸配列(IHTVREETMMVMTEDMPLEI)を含むリンカーにより融合されている核酸分子。
小型化ジストロフィンポリペプチドが配列番号１５３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の核酸分子。
配列番号１５２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む小型化ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
請求項９６または９７に記載の核酸分子を含む、ベクター。
アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９８に記載のベクター。
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターである、請求項９８に記載のベクター。
ＡＡＶベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１から選択される、請求項１００に記載のベクター。
ＡＡＶベクターがＡＡＶ９である、請求項１００に記載のベクター。
核酸分子またはベクター送達剤と共に製剤化されている、請求項９６または９７に記載の核酸分子または請求項９８～１０２の何れかに記載のベクター。
送達剤が脂質ナノ粒子を含む、請求項１０３に記載の核酸分子またはベクター。
送達剤がリポソーム、非脂質ポリマー分子、エンドソームおよびこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０３に記載の核酸分子またはベクター。
静脈内、経皮、皮内、皮下、肺または経口送達またはこれらの何れかの組み合わせのために製剤化されている、請求項９６または９７に記載の核酸分子、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクターまたは請求項１０３～１０５の何れかに記載の核酸分子またはベクター。
請求項９６または９７に記載の核酸分子、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクターまたは請求項１０３～１０６の何れかに記載の核酸分子またはベクターによりコードされる、ポリペプチド。
請求項９６または９７に記載の核酸分子または請求項９８～１０２の何れかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
細胞がＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞またはＨＴ１０８０細胞である、請求項１０８に記載の宿主細胞。
(ａ)請求項９６または９７に記載の核酸、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクター、請求項１０３～１０６の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項１０７に記載のポリペプチドまたは請求項１０８または１０９に記載の宿主細胞；および(ｂ)薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
請求項９６または９７に記載の核酸、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクター、請求項１０３～１０６の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項１０５に記載のポリペプチド、請求項１０８または１０９に記載の宿主細胞または請求項１１０に記載の医薬組成物および核酸分子をそれらを必要とする対象に投与するための指示を含む、キット。
請求項１０８または１０９に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養し、小型化ジストロフィンポリペプチドを回収することを含む、小型化ジストロフィンポリペプチドの製造方法。
請求項９６または９７に記載の核酸、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクター、請求項１０３～１０６の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項１０８または１０９に記載の宿主細胞または請求項１１０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象において小型化ジストロフィンポリペプチドを発現させる方法。
請求項９６または９７に記載の核酸、請求項９８～１０２の何れかに記載のベクター、請求項１０３～１０６の何れかに記載の核酸分子またはベクター、請求項１０７に記載のポリペプチド、請求項１０８または１０９に記載の宿主細胞または請求項１１０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患または状態を有する対象を処置する方法。
疾患がサルコペニア、心疾患、カヘキシー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、ベッカー型筋ジストロフィー(ＢＭＤ)、Ｘ染色体拡張型心筋症(ＸＬＤＣ)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼球咽頭型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィーおよび／または先天性筋ジストロフィーである、請求項１１４に記載の方法。
核酸分子、ベクター、ポリペプチド、宿主細胞または医薬組成物が静脈内、経皮、皮内、皮下、経口または肺またはこれらの何れかの組み合わせで投与される、請求項１１５に記載の方法。
さらに対象に第二剤を投与することを含む、請求項１１４～１１６の何れかに記載の方法。
対象がヒトである、請求項１１４～１１７の何れかに記載の方法。