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JP2022130540A - Ｋｌｋ５阻害剤及びその製造方法 - Google Patents

Ｋｌｋ５阻害剤及びその製造方法 Download PDF

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JP2022130540A JP2022101377A JP2022101377A JP2022130540A JP 2022130540 A JP2022130540 A JP 2022130540A JP 2022101377 A JP2022101377 A JP 2022101377A JP 2022101377 A JP2022101377 A JP 2022101377A JP 2022130540 A JP2022130540 A JP 2022130540A
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acid sequence
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秀法 矢野
Hidenori YANO
秀典 高橋
Shusuke Takahashi
真司 山口
Shinji Yamaguchi
志保 大渕
Shiho Obuchi
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

【課題】新規なカリクレイン５（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ５；ＫＬＫ５）阻害ペプチドを提供する。
【解決手段】ある特定のアミノ酸配列又は別のある特定のアミノ酸配列を含み、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性及びヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである。前記ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドは、３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有してよい。
【選択図】なし

Description

本発明は、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドの製造方法、かかる方法により得られるペプチド、ペプチドを含むコンジュゲート、ペプチド又はコンジュゲートを含む組成物、医薬組成物、各種疾患の治療又は予防のための医薬組成物、各種疾患の治療又は予防のためのペプチド又はコンジュゲートの使用、ペプチド又はコンジュゲートを投与する工程を含む各種疾患の治療方法、ペプチド又はコンジュゲートを含む各種疾患の診断又は検査のための組成物等に関する。
カリクレイン５（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ５；ＫＬＫ５）はトリプシン様セリンプロテアーゼ（Ｃｌａｎ ＰＡ， ｆａｍｉｌｙ Ｓ１）であり、ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｔｒｙｐｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＣＴＥ）とも呼ばれる。カリクレイン７（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ７；ＫＬＫ７）はキモトリプシン様プロテアーゼ（Ｃｌａｎ ＰＡ， ｆａｍｉｌｙ Ｓ１）であり、ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ（ＳＣＣＥ）とも呼ばれる。また、カリクレイン１４（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ１４；ＫＬＫ１４）はトリプシン様プロテアーゼ（Ｃｌａｎ ＰＡ， ｆａｍｉｌｙ Ｓ１）である。ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４は、１５種の非常に保存されたトリプシン又はキモトリプシン様セリンプロテアーゼから成る組織カリクレインファミリーに属している。ＫＬＫ５は細胞で発現した後、自己活性化により活性型ＫＬＫ５へと変換されるのに対し、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４は、不活性型であるプレプロ酵素として発現し、ＫＬＫ５に代表されるプロテアーゼによってプレプロ配列が切断され、活性型へと変換される（非特許文献１）。ＫＬＫ５は皮膚において発現が認められており、ＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎやＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎなどの細胞接着に関わる因子を分解することが報告されている（非特許文献２）。ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４は皮膚落屑に重要とされており、さらにプロテアーゼ受容体２（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２；ＰＡＲ－２）の活性化に関与する（非特許文献３）。ＰＡＲ－２の活性化によりサイトカインやケモカインが誘導され、免疫や炎症反応などが増強される。
ネザートン症候群（Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は常染色体劣性遺伝により、重度の皮膚炎症や落屑、毛髪異常、また喘息やアレルギー性皮膚炎などのアレルギー症状を伴う魚鱗癬症候群の１つで、希少疾患である（ＯＭＩＭ２５６５００）（非特許文献４）。出生時から剥脱性皮膚炎を発症するため、皮膚バリア機能の著しい損傷に起因する脱水や感染症などを示し、発育遅延を伴うこともある。詳細な疫学データは無いが、高い生後死亡率を示すとされている。ネザートン症候群は、皮膚上皮細胞に発現するセリンプロテアーゼインヒビター（ＬＥＫＴＩ）をコードする遺伝子（ＳＰＩＮＫ５）変異に伴うＬＥＫＴＩの機能欠損（ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）により発症する。ＬＥＫＴＩは１５個のＫａｚａｌ様インヒビタードメインから成るが、ネザートン症候群患者では各ドメインをコードするＳＰＩＮＫ５において複数の変異箇所が見つかっており、変異箇所に関連して症状や重篤度が変化する（非特許文献４、５）。
ＳＰＩＮＫ５欠損マウス（Ｓｐｉｎｋ５－／－）はネザートン症候群様の皮膚症状を示し、皮膚上皮においてＫＬＫ５やＫＬＫ７の高いプロテアーゼ活性が認められる（非特許文献１）。ＳＰＩＮＫ５欠損マウスは生後数時間で致死になるが、ＳＰＩＮＫ５欠損マウスにＫＬＫ５欠損マウスを交配させたマウス（Ｓｐｉｎｋ５－／－Ｋｌｋ５－／－）では新生児致死率の改善が報告されている（非特許文献６）。また、Ｓｐｉｎｋ５－／－Ｋｌｋ５－／－マウスでは、Ｓｐｉｎｋ５－／－で認められた重篤な皮膚バリアの欠損や上皮構造の欠陥、皮膚炎症などが回復している。同様に、ネザートン症候群の患者で認められ
たＳＰＩＮＫ５変異Ｓｐｉｎｋ５Ａ１３５Ｘ／Ａ１３５Ｘを持つマウスはネザートン症候群様の皮膚症状を示し、生後１２時間以内に死亡が観察されるのに対し、ＫＬＫ５欠損マウスを掛け合わせたＫｌｋ５－／－Ｓｐｉｎｋ５Ａ１３５Ｘ／Ａ１３５Ｘでは皮膚バリア及び重篤な皮膚症状が改善している（非特許文献７）。さらに、ＫＬＫ７欠損マウスを掛け合わせることで（Ｋｌｋ５－／－Ｋｌｋ７－／－Ｓｐｉｎｋ５Ａ１３５Ｘ／Ａ１３５Ｘ）、皮膚症状の異常は認められなくなる。ＫＬＫ５トランスジェニックマウスもネザートン症候群様の皮膚症状を示すことが報告されている（非特許文献８）。ネザートン症候群の患者及びネザートン症候群モデルマウスの角質層においては、トリプシン様及びキモトリプシン様の高いプロテアーゼ活性が認められており、ＫＬＫ５に加え、ＫＬＫ７やＫＬＫ１４など下流に位置するカリクレインファミリーが角質層のプロテアーゼ活性に関わることが示唆される。以上のことから、ネザートン症候群はＳＰＩＮＫ５の遺伝子変異を原因として、角質において異常に亢進したＫＬＫ５又はＫＬＫ７、ＫＬＫ１４プロテアーゼ活性を伴うことで発症すると考えられる。現在は保湿剤の塗布をはじめとする対症療法しか存在せず、根本的治療薬は存在しない。
ＫＬＫ５は顔面の慢性炎症性疾患である酒さとの関連も示唆されている。酒さ患者では、ＫＬＫ５及び抗菌ペプチドＣａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎの発現上昇が報告されている。その病因の詳細は不明であるが、発現亢進したＫＬＫ５がＣａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎを分解することにより、酒さの原因となるペプチドを産生すると考えられている（非特許文献９）。
ＳＰＩＮＫ５の多型は、アトピー性皮膚炎の重症度と関連するという複数の報告がある（非特許文献１０～１４）。４２０番目のアミノ酸残基がリジンであるＬＥＫＴＩをコードするＳＰＩＮＫ５遺伝子を両アレルに有するアトピー性皮膚炎患者の皮膚では、グルタミン酸を両アレルにコードする場合に比べ、Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１のタンパクレベルでの発現低下や、ＫＬＫ５やＫＬＫ７をはじめとするプロテアーゼ活性が高くなっていることが報告されている（非特許文献１５）。これらのプロテアーゼの活性化は、皮膚バリア機能の低下によるアレルゲンの侵入を容易にし、また、炎症反応が生じやすい状態を作り出すと考えられる。
ＳＰＩＮＫ２（Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２）は、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインであり、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する（非特許文献１６）が、ＳＰＩＮＫ２及びその変異体と、ネザートン症候群や酒さ、アトピー性皮膚炎等の疾患との関係は明らかにされていない。
オバエア ピー他（Ｏｖａｅｒｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ．）（２００９年刊） トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．）３４巻（９号）：４５３－４６３頁 デスカルガス ピー他（Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ．）（２００５年刊） ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．）３７巻（１号）：５６－６５頁 ラッテンホール エイ他（Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．）（２００８年刊） ドラッグ・ニュース・アンド・パースペクティブズ（Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．）２１巻（７号）：３６９－３８１頁 ホフナニアン エー（Ｈｏｖｎａｎｉａｎ Ａ．）（２０１３年刊） セル・ティッシュ・リサーチ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．）３５１巻（２号）：２８９－３００頁 サリ シーエー他（Ｓａｒｒｉ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７年刊） モレキュラー・ダイアグノシス・アンド・セラピー（Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ．）２１巻（２号）：１３７－１５２頁 フリオ エル他（Ｆｕｒｉｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．）（２０１５年刊） プロス・ジェネティックス（ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．）１１巻（９号）：ｅ１００５３８９ カスパレク ピー他（Ｋａｓｐａｒｅｋ Ｐ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７年刊） プロス・ジェネティクス（ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．）１３巻（１号）：ｅ１００６５６６ フリオ エル他（Ｆｕｒｉｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．）（２０１４年刊） ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）２１１巻（３号）：４９９－５１３頁 ヤマサキ ケイ他（Ｙａｍａｓａｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．）（２００７年刊） ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ Ｍｅｄ．）１３巻（８号）：９７５－９８０頁 ニシオ ワイ他（Ｎｉｓｈｉｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．）（２００３年刊） ジーンズ・アンド・イムニティ（Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．）４巻（７号）：５１５－５１７頁 クスノキ ティー他（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．）（２００５年刊） ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカルイムノロジー（Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）４巻（７号）：５１５－５１７頁 ラン シーシー他（Ｌａｎ ＣＣ，ｅｔ ａｌ．）（２０１１年刊） エクスペリメンタル・ダーマトロジー（Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）２０巻（１２号）：９７５－９７９頁 カトウ エイ他（Ｋａｔｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．）（２００３年刊） ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ダーマトロジー（Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）１４８巻（４号）：６６５－６６９頁 ツァオ エルピー他（Ｚｈａｏ ＬＰ，ｅｔ ａｌ．）（２０１２年刊） ジャーナル・オブ・ヨーロピアン・アカデミー・オブ・ダーマトロジー・アンド・ヴァニアリアラジー（Ｊ Ｅｕｒ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．）２６巻（５号）：５７２－５７７頁 フォルツノ ピー他（Ｆｏｒｔｕｇｎｏ Ｐ，ｅｔ ａｌ．）（２０１２年刊） ヒューマン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．）２１巻（１９号）：４１８７－４２００頁 チェン ティー他（Ｃｈｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．）（２００９年刊）プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）７７巻（１号）：２０９－２１９頁
新規なＫＬＫ５阻害ペプチド、該ペプチドを含有するコンジュゲート、該ペプチド又は該コンジュゲートを含有する医薬組成物等を提供すること。
本発明は
（１）
配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性を阻害する、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２）
ヒトＫＬＫ７又はヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害する、（１）記載のペプチド、
（３）
該阻害がヒトＫＬＫ５及び任意でヒトＫＬＫ７又はＫＬＫ１４選択的である、（１）記載のペプチド、
（４）
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＳｅｒである、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒである、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（７）
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ又はＴｈｒである、（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（８）
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒである、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（９）
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ又はＴｙｒである、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｙ又はＴｙｒである、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１１）
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１２）
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｒｇ又はＬｙｓである、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１３）
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌである、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１４）
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＰｈｅ又はＴｙｒである、（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐ又はＧｌｕである、（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３を含む、（１）乃至（１５）記載のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＧｌｙ、Ｍｅｔ又はＴｙｒである、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＴｈｒである、（１）乃至（３）及び（１７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１９）
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｍｅｔ又はＴｙｒである、（１）乃至（３）、（１７）及び（１８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２０）
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＧｌｎである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２１）
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＧｌｙ、Ａｒｇ又はＳｅｒである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２２）
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ又はＳｅｒである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２３）
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＧｌｙである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２４）
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＨｉｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２５）
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＨｉｓ又はＴｙｒである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２６）
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＨｉｓである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２７）
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＴｙｒである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２８）
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐ又はＧｌｕである、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（２９）
配列番号２２、２４、２６及び２８（図３０、３２、３４及び３６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３を含む、（１）乃至（３）及び（１７）乃至（２８）記載のいずれか一つに記載のペプチド、
（３０）
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＴｙｒである、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３１）
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｓｐ又はＧｌｎである、（１）乃至（３）及び（３０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３２）
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＴｈｒ又はＶａｌである、（１）乃至（３）、（３０）及び（３１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３３）
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＴｈｒ又はＶａｌである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３４）
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＧｌｕ又はＴｈｒである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３５）
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＨｉｓ又はＴｈｒである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至
（３４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３６）
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＴｙｒである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３７）
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｓｎ又はＳｅｒである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３８）
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｒｇである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（３９）
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ又はＧｌｕである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（４０）
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＴｙｒである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（３９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（４１）
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐである、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（４０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（４２）
配列番号３０及び３２（図３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３を含む、（１）乃至（３）及び（３０）乃至（４１）記載のいずれか一つに記載のペプチド、
（４３）
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、（１）乃至（４２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（４４）
（１）乃至（４３）のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（４５）
（４４）記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（４６）
（４４）記載のポリヌクレオチド若しくは（４５）記載のベクターを含むか又は（１）乃至（４３）のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
（４７）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
（ｉ）（４６）記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程、
（４８）
（１）乃至（４３）のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
（４９）
（４７）又は（４８）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（５０）
（１）乃至（４３）及び（４９）のいずれか一つに記載のペプチドに１つ又は２つ以上の任意の部分が結合してなるコンジュゲート、
（５１）
１つの任意の部分が、ＳＰＩＮＫ２変異体ではない第２ペプチドを含む、（５０）記載のコンジュゲート、
（５２）
第２ペプチドが、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ末端側に位置する、（５１）記載のコンジュゲート、
（５３）
第２ペプチドが、ＳＰＩＮＫ２変異体のカルボキシル末端側に位置する、（５１）記載のコンジュゲート、
（５４）
第２ペプチドが抗体又はその断片であり、且つ１つ又は２つ以上のＦｃ領域を含む、（５１）乃至（５３）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（５５）
Ｆｃ領域がヒト免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片である、（５４）記載のコンジュゲート、
（５６）
Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（５４）又は（５５）記載のコンジュゲート、
（５７）
Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域又はその断片である、（５４）乃至（５６）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（５８）
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が、配列番号８７（図９５）で示されるアミノ酸配列を含む、（５７）記載のコンジュゲート、
（５９）
Ｆｃ領域が野生型又は変異型である、（５４）乃至（５７）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（６０）
アミノ末端に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が付加してなる、（５１）乃至（５９）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（６１）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列を含む、（５０）乃至（６０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート：
（ｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０及び９６（図４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び１０６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；（ｉｉ）上記（ｉ）記載のアミノ酸配列と９０％以上同一であり、且つＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性を阻害するコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列、
（６２）
ＳＰＩＮＫ２変異体及び第２ペプチドが、リンカーを介して結合している、（５１）乃至（６１）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（６３）
リンカーが、ＳＰＩＮＫ２変異体及び第２ペプチドではない第３ペプチドである、（６２）記載のコンジュゲート、
（６４）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、（５０）乃至（６３）のいずれか一つに記載のコンジュゲートの製造方法：
（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
（６５）
（５０）乃至（６３）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
（６６）
（６４）又は（６５）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート、
（６７）
（１）乃至（４３）及び（４９）のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片、
（６８）
（１）乃至（４３）及び（４９）のいずれか一つに記載のペプチド、（４４）記載のポリヌクレオチド、（４５）記載のベクター、（４６）記載の細胞、（５０）乃至（６３）及び（６６）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（６７）記載の抗体若しくはその結合断片を含む組成物、
（６９）
（１）乃至（４３）及び（４９）のいずれか一つに記載のペプチド、（４４）記載のポリヌクレオチド、（４５）記載のベクター、（４６）記載の細胞、並びに／又は、（５０）乃至（６３）及び（６６）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物、
（７０）
ＫＬＫ５関連疾患の治療又は予防のための、（６９）記載の医薬組成物、
（７１）
ＫＬＫ５関連疾患がネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はＢａｒｒｅｔｔ食道である、（７０）記載の医薬組成物、
（７２）
他の医薬品と組み合わせて使用される、（６９）乃至（７１）記載のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（７３）
（１）乃至（４３）及び（４９）のいずれか一つに記載のペプチド、（４４）記載のポリヌクレオチド、（４５）記載のベクター、（４６）記載の細胞、（５０）乃至（６３）及び（６６）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（６７）記載の抗体又はその結合断片を含む、検査用又は診断用組成物、
（７４）
（６７）記載の抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、（４７）、（４８）、（６４）及び（６５）のいずれか一つに記載の方法、
（７５）
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの同定方法：
（ｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下で、ＫＬＫ５プロテアーゼ及び基質を保温する工程；
（ｉｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下におけるＫＬＫ５プロテアーゼ活性を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）該ペプチド存在下でのＫＬＫ５プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのＫＬＫ５プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程、
（７６）
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含み、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートが参照化合物として使用される、ＫＬＫ５阻害化合物の同定方法：
（ｉ）被験化合物存在下及び非存在下で、ＫＬＫ５プロテアーゼ及び基質を保温する工程；
（ｉｉ）該化合物存在下及び非存在下におけるＫＬＫ５プロテアーゼ活性を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）該化合物存在下でのＫＬＫ５プロテアーゼ活性が、該化合物非存在下でのＫＬＫ５プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該化合物を陽性と判定する工程、
（７７）
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ＫＬＫ５阻害化合物の同定方法：
（ｉ）被験化合物のＫＬＫ５プロテアーゼ阻害活性を測定する工程；
（ｉｉ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートである参照化合物のＫＬＫ５プロテアーゼ阻害活性を測定する工程；及び、
（ｉｉｉ）被験化合物のＫＬＫ５プロテアーゼ阻害活性が、参照化合物のＫＬＫ５プロテアーゼ阻害活性と同等又はより強い場合、該化合物を陽性と判定する工程、
（７８）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含み、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチド又該ペプチドを含むコンジュゲートが参照化合物として使用される、ＫＬＫ５プロテアーゼ活性を測定する方法：
（ｉ）ＫＬＫ５プロテアーゼ、基質及び任意で他の成分を保温する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、基質量及び／又は生成物量を測定する工程、
（７９）
ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド又はＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートであって、表面プラズモン共鳴分析において、該ペプチド又はコンジュゲートを固定化し、ＫＬＫ５を添加することにより測定されたＫＬＫ５に対する解離定数（ＫＤ）が１×１０－９Ｍ以下である、該ペプチド又はコンジュゲート、
（８０）
配列番号３４（図４２）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８１）
配列番号３６（図４４）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８２）
配列番号３８（図４６）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８３）
配列番号４０（図４８）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８４）
配列番号４２（図５０）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８５）
配列番号４４（図５２）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８６）
配列番号４６（図５４）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８７）
配列番号４８（図５６）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８８）
配列番号５０（図５８）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（８９）
配列番号５２（図６０）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（９０）
配列番号５４（図６２）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（９１）
配列番号５６（図６４）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（９２）
配列番号５８（図６６）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
（９３）
配列番号６０（図６８）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
及び、
（９４）
配列番号９６（図１０６）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲート、
等に関する。
本発明の提供するペプチド、該ペプチドを含有するコンジュゲート、及び、該ペプチド又は該コンジュゲートを含有する医薬組成物は、ＫＬＫ５阻害活性を有し、ＫＬＫ５関連疾患（後述）の治療又は予防等に有用である。
ヒトＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４のアミノ酸配列類似性を比較した図。 ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドのＫＬＫ５阻害活性（５０％阻害濃度：ＩＣ５０）を示した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度１０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｂｏｖｉｎｅ ｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価には、終濃度５ｎＭ ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ；２０２３３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価には、終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６４２４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。Ｂｏｖｉｎｅ α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価には、終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＬＳ００１４３４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価には、終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８９４６）、終濃度１０μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｔａｓｅ阻害活性評価には、終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ７０６３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０７－ｖ）を使用した。Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍａｓｅ阻害活性評価には、終濃度１００ｎＭ ｃｈｙｍａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８１１８）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎ阻害活性評価には、終濃度５０ｎＭ Ｐｌａｓｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１８６７）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０４－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性評価には、終濃度１ｎＭ ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６８８４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ阻害活性評価には、終濃度０．００００１Ｕ／μＬ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ－ＳＥ２８４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ（ＯＭｅ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１５３－ｖ）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ阻害活性評価には、終濃度１ｎＭ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３９４６－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１４）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ阻害活性評価には、終濃度１００ｎＭ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ２２００）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１１２－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔＰＡ阻害活性評価には、終濃度１０ｎＭ ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ阻害活性評価には、終濃度２ｎＭ ｕＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｕ０６３３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ阻害活性評価には、終濃度０．１２５μｇ／ｍＬ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２４９７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＺ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９５－ｖ）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１阻害活性評価には、終濃度０．１μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２３３７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９６－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ２阻害活性評価には、終濃度２μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２３３７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９６－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ４阻害活性評価には、終濃度１μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１７１９－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ７阻害活性評価には、終濃度１μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ７、終濃度２０μＭ 基質ペプチドＭｃａ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｎｖａｌ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ００２）を用いた。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ８阻害活性評価には、終濃度５ｎＭ ｈＫＬＫ８（ＵｎｉＰｒｏｔ: Ｏ６０２５９，発明者らが調製）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１２阻害活性評価には、終濃度０．１μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３０９５－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１３阻害活性評価では、終濃度０．５μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２６２５－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍを用いた。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１４阻害活性評価には、終濃度０．２μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１４、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。 Ｘ線結晶構造解析により得られたＫＬＫ５／ＫＬＫ５阻害ペプチド複合体を示した図。該阻害ペプチドＫ５１０３４はＫＬＫ５活性中心を含む領域に結合していた。 ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性（ＩＣ５０）を示した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度１０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｂｏｖｉｎｅ ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｂｏｖｉｎｅ α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎの阻害活性評価では図３（Ａ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｔａｓｅ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍａｓｅの阻害活性評価では図３（Ｂ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎ、Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅの阻害活性評価では図３（Ｃ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ、Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ、Ｈｕｍａｎ ｔＰＡの阻害活性評価では図３（Ｄ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ、Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎの阻害活性評価では図３（Ｅ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１、Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ２、Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ４の阻害活性評価では図３（Ｆ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ７、Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ８、Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１２の阻害活性評価では図３（Ｇ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１３、Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１４の阻害活性評価では図３（Ｈ）と同様の条件を用いた。 Ｃｒｕｓｔｙ２モデルマウスにおいて、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の投与群が皮膚水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を抑制することを示した図。ＳＰＩＮＫ５変異がヘテロ（＋／－）な場合、皮膚炎症は発症していないが、ＳＰＩＮＫ５変異がホモ（＋／＋）であるとき、皮膚炎症が強く発症し、ＴＥＷＬが亢進した。ＳＰＩＮＫ５変異がホモ（＋／＋）であるＣｒｕｓｔｙ２マウスに当該ペプチドＦｃ融合体を投与することで、皮膚炎が改善し、ＴＥＷＬが減少した。尚、ＰＢＳ投与群又はＤ１－Ｋ５００５５－Ｆｃ投与群に問わず、Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／－）マウスの例数は９、Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／＋）マウスの例数は１２であった。図中のエラーバーは標準誤差を示す。 ヒトＳＰＩＮＫ２、ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ８及びＤ９、並びに、ヒトＳＰＩＮＫ９の配列同一性を比較した図。ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ８及びＤ９並びにヒトＳＰＩＮＫ９は、ヒトＫＬＫ５阻害活性を有することが知られているが、ヒトＫＬＫ５阻害活性について報告されていないヒトＳＰＩＮＫ２とのアミノ配列同一性は、いずれも低いことが判る。 ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１） ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列（配列番号２） ヒトＫＬＫ７のアミノ酸配列（配列番号３） ヒトＫＬＫ１４のアミノ酸配列（配列番号４） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００３２のヌクレオチド配列（配列番号５） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００３２のアミノ酸配列（配列番号６） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のヌクレオチド配列（配列番号７） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のアミノ酸配列（配列番号８） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０７２のヌクレオチド配列（配列番号９） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０７２のアミノ酸配列（配列番号１０） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００１６のヌクレオチド配列（配列番号１１） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００１６のアミノ酸配列（配列番号１２） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４のヌクレオチド配列（配列番号１３） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４のアミノ酸配列（配列番号１４） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００６２のヌクレオチド配列（配列番号１５） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００６２のアミノ酸配列（配列番号１６） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０９０のヌクレオチド配列（配列番号１７） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０９０のアミノ酸配列（配列番号１８） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００９８のヌクレオチド配列（配列番号１９） ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００９８のアミノ酸配列（配列番号２０） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０２８のヌクレオチド配列（配列番号２１） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０２８のアミノ酸配列（配列番号２２） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１００５のヌクレオチド配列（配列番号２３） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１００５のアミノ酸配列（配列番号２４） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５００３１のヌクレオチド配列（配列番号２５） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５００３１のアミノ酸配列（配列番号２６） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０５７のヌクレオチド配列（配列番号２７） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０５７のアミノ酸配列（配列番号２８） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５１０６９のヌクレオチド配列（配列番号２９） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５１０６９のアミノ酸配列（配列番号３０） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５００１５のヌクレオチド配列（配列番号３１） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５００１５のアミノ酸配列（配列番号３２） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３２ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号３３） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３２ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３４） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００５５－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号３５） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３６） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０７２－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号３７） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０７２－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号３８） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１６ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号３９） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１６ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４０） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０３４－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号４１） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０３４－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４２） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００６２－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号４３） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００６２－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４４） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０９０－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号４５） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０９０－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４６） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００９８ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号４７） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００９８ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号４８） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号４９） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５０） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１００５－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号５１） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１００５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５２） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３１－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号５３） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３１－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５４） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０５７－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号５５） ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０５７－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５６） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０６９ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号５７） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０６９ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号５８） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１５－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号５９） ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号６０） ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの一般式（配列番号６１） プライマー１のヌクレオチド配列（配列番号６２） プライマー２のヌクレオチド配列（配列番号６３） プライマー３のヌクレオチド配列（配列番号６４） プライマー４のヌクレオチド配列（配列番号６５） プライマー５のヌクレオチド配列（配列番号６６） プライマー６のヌクレオチド配列（配列番号６７） プライマー７のヌクレオチド配列（配列番号６８） プライマー８のヌクレオチド配列（配列番号６９） プライマー９のヌクレオチド配列（配列番号７０） プライマー１０のヌクレオチド配列（配列番号７１） プライマー１１のヌクレオチド配列（配列番号７２） プライマー１２のヌクレオチド配列（配列番号７３） プライマー１３のヌクレオチド配列（配列番号７４） プライマー１４のヌクレオチド配列（配列番号７５） プライマー１５のヌクレオチド配列（配列番号７６） ＫＬＫ７基質ペプチド（アミノ酸配列は配列番号７７） ウシα－キモトリプシン基質ペプチド（アミノ酸配列は配列番号７８） ニュートロフィル・エラスターゼ基質ペプチド（アミノ酸配列は配列番号７９） ヒトプロテインＣ基質ペプチド（アミノ酸配列は配列番号８０） プライマー１６のヌクレオチド配列（配列番号８１） プライマー１７のヌクレオチド配列（配列番号８２） プライマー１８のヌクレオチド配列（配列番号８３） プライマー１９のヌクレオチド配列（配列番号８４） プライマー２０のヌクレオチド配列（配列番号８５） プライマー２１のヌクレオチド配列（配列番号８６） ヒトＩｇＧ１のＦｃのアミノ酸配列（配列番号８７） ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ８のアミノ酸配列（配列番号８８） ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ９のアミノ酸配列（配列番号８９） ヒトＳＰＩＮＫ９のアミノ酸配列（配列番号９０） マウスＫＬＫ５のアミノ酸配列（配列番号９１） マウスＫＬＫ７のアミノ酸配列（配列番号９２） マウスＫＬＫ１４のアミノ酸配列（配列番号９３） 阻害定数Ｋｉ算出のため、ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度１０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。 ヒトＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１の分解を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性を評価した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度１μＭのＫＬＫ５及び終濃度１μＭのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；９４４－ＤＭ－１００）を使用した。Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａａ４７１－４９９）（ＬＳＢｉｏ；ＬＳ－Ｃ１６７５４２）及びＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅｙ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＮＡ９３４０Ｖ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより解析した。 ヒトＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１の分解を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性を評価した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度０．２μＭのＫＬＫ５及び終濃度２μＭのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ－１ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ ｔａｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；４９５５－ＤＣ－０５０）を使用した。Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ；３４４６０）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより解析した。 プライマー２２のヌクレオチド配列（配列番号９４） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのヌクレオチド配列（配列番号９５） ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号９６） ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－ＦｃのＫＬＫ５阻害活性（ＩＣ５０）を示した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度１０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。 ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ７に対するＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃの交差性を評価した図。図３（Ｇ）と同様の条件を用いた。 ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ１４に対するＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃの交差性を評価した図。図３（Ｈ）と同様の条件を用いた。
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのような鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
本発明において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は同義であり、それらの構成単位であるリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド等の個数によっては何ら限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等もその範囲に含まれる。「核酸分子」は略して「核酸」と呼ばれる場合がある。
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
本発明において、標的分子Ｘを認識する、又は標的分子Ｘに結合する（以下、その認識又は結合作用をまとめて「Ｘ結合活性」という）ペプチドを、「Ｘ結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Ｘを認識し、又は標的分子Ｘに結合し、且標的分子Ｘの有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する（以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「Ｘ阻害活性」という）ペプチドを、「Ｘ阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２」は、Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２を意味し、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインから成る７ｋＤａの蛋白質である。好適なＳＰＩＮＫ２はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１：図９）を単に「ＳＰＩＮＫ２」という。
本発明において、「ＫＬＫ５」はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性ドメインからなり、３箇所のＮ型糖鎖が付加したトリプシン様及びキモトリプシン様のプロテアーゼ活性を示す蛋白質である。好適なＫＬＫ５はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ５（配列番号２：図１０）を単に「ＫＬＫ５」ということがある。
本発明において、「ＫＬＫ７」はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加した蛋白質である。好適なＫＬＫ７はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ７（配列番号３：図１１）を単に「ＫＬＫ７」ということがある。
本発明において、「ＫＬＫ１４」はニューロプシンともよばれ、Ｎ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加した蛋白質である。好適なＫＬＫ１４はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ１４（配列番号４：図１２）を単に「ＫＬＫ１４」ということがある。
本発明において、「前駆型ＫＬＫ５」はｐｒｏ－ＫＬＫ５を意味し、プロペプチド及びプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ５」はａｃｔｉｖｅ
ＫＬＫ５を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ５はヒト由来である。
本発明において、「前駆型ＫＬＫ７」はｐｒｏ－ＫＬＫ７を意味し、プロペプチド及びプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ７」はａｃｔｉｖｅ
ＫＬＫ７を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ７はヒト由来である。
本発明において、「前駆型ＫＬＫ１４」はｐｒｏ－ＫＬＫ１４を意味し、プロペプチド及びプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ１４」はａｃｔｉｖｅ ＫＬＫ１４を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ１４はヒト由来である。
本発明において、「ＫＬＫ５阻害ペプチド」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド」は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制するペプチドをそれぞれ意味する。
「ＫＬＫ５阻害ペプチド」、「ＫＬＫ５／７阻害ペプチド」及び「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）が当該ペプチド又はその断片に付加又は結合してなるコンジュゲートのうち、ＫＬＫ５阻害（結合）活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害（結合）活性を維持しているものがそれぞれ含まれる。すなわち、ＫＬＫ５阻害（結合）活性、ＫＬＫ５阻害（結合）活性及びＫＬＫ７阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ５阻害（結合）活性及びＫＬＫ１４阻害（結合）活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体（コンジュゲート）も「ＫＬＫ５阻害ペプチド」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド」にそれぞれ含まれる。
本発明において、ペプチドが結合する「部位」、すなわちペプチドが認識する「部位」とは、ペプチドが結合又は認識する標的分子上の連続的若しくは断続的な部分アミノ酸配列又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことを標的分子上のエピトープ又は結合部位と呼ぶことができる。
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞、酵母、微生物等も含まれる。
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２変異体」とは、野生型ＳＰＩＮＫ２の有するアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸で置換され、１個又は２個以上の野生型のアミノ酸が欠失し、１個又は２個以上の野生型には無いアミノ酸が挿入されて（以下、「変異」と総称する）なるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。「ＳＰＩＮＫ２変異体」のうち、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５阻害活性及びＫＬＫ７阻害活性（ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性）、又は、ＫＬＫ５阻害活性及びＫＬＫ１４阻害活性（ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性）を有するものは、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに包含される。なお、本発明においては「挿入」も「付加」の範囲に含まれ得る。
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、並びに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
本発明において「特異的」及び「特異性」なる語は「選択的」及び「選択性」とそれぞれ同義であり、互換性がある。例えば、ＫＬＫ５特異的な阻害ペプチドは、ＫＬＫ５選択的な阻害ペプチドと、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７特異的な阻害ペプチドは、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７選択的な阻害ペプチドと、それぞれ同義である。
２．ペプチド
２－１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα－アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
本発明においては「アミノ酸残基」は「アミノ酸」と略記される場合がある。
また、本発明において、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はその混合物（ＤＬ－アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ－アミノ酸を意味する。
天然アミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、次のグループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
本発明においては、天然アミノ酸は保存的アミノ酸置換を受け得る。
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価又は類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つ又は二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造及び機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的及び機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン－芳香族相互作用又は陽イオン－パイ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性又は非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的及び機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ７３－７５， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））及び典型的置換を含む。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等を挙げることができ、ノルロイシン、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等を挙げることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
２－２．ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド
本発明のペプチドは、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有する。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの標的である、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４は、好適には脊椎動物、より好適には哺乳類、より一層好適には霊長類、最適にはヒトに由来する。ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、及び、ＫＬＫ１４は組織や細胞から精製するか、又は、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳、ペプチド合成等の蛋白質の調製方法として当業者に公知の方法により、調製することができる。ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、及び、ＫＬＫ１４には、シグナル配列、免疫グロブリンのＦｃ領域、タグ、標識等が連結されてもよい。ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、並びに、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を指標として評価することができる。例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７若しくはＫＬＫ５及びＫＬＫ１４、又はそれらの機能断片、基質及び本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド、又はその候補を共存させた場合に、対照の存在下又は該阻害剤若しくはその候補の非存在下と比較して、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４のプロテアーゼ活性が７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下又は０％である場合、ＫＬＫ５阻害、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害又はＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害が生じており、その阻害活性はそれぞれ３０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上又は１００％である。ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性は、反応条件、基質の種類や濃度等により異なり得る。反応条件については、実施例に記載のものを例示することができるが、それに限定されない。一定濃度のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に基質ペプチド又は基質蛋白質を添加し、一定時間反応させた後、基質ペプチドの蛍光を検出する、又は基質蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法、液体クロマトグラフィー等により検出することで、酵素活性は評価できる。緩衝液としては、例えば、ホスフェート・バッファー・セイライン(ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ：以下「ＰＢＳ」という)、トリスバッファー（５０ｍＭ トリス，ｐＨ７乃至８．５、例えばｐＨ７．５）等を用いることができ、ＮａＣｌ（０乃至２００ｍＭ、例えば２００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０乃至１０ｍＭ、例えば２ｍＭ）、ＺｎＣｌ２、Ｂｒｉｊ－３５等の塩を添加することもできるが、それらに限定されない。
ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活
性は、阻害定数Ｋｉで示すことができる。一定濃度の酵素に基質ペプチドを添加し、一定時間反応させた後、基質ペプチドの蛍光を検出してプロテアーゼ活性を測定する。各基質濃度におけるプロテアーゼ活性から、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎの式（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ．（２０１１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５０巻３９号，８２６４－８２６９頁）に従い、最大反応速度Ｖｍａｘ及びミカエリス定数Ｋｍを算出する。さらに、一定濃度の酵素に阻害剤を添加したときのプロテアーゼ活性から、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの式（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＪＦ．（１９６９年）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ. １８５巻２号，２６９－２８６頁）に従い、阻害定数Ｋｉを算出す
る。算出に用いるソフトウェアにはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）等を例示することができる。
ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ５、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の有するプロテアーゼの基質は、内在性の基質、外因性の基質、合成基質等、特に限定されるものではない。ＫＬＫ５のヒトの内在性の基質としては、低分子キニノーゲンやカリスタチン、コラーゲン、Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ、Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ、Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ等を例示することができる。ＫＬＫ７のヒトの内在性の基質としては、Ｐｒｏ－ＫＬＫ３やフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。ＫＬＫ１４のヒトの内在性の基質としては、ｔＰＡやフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。コラーゲンを熱変性して得られるゼラチンも基質として用いることができる。合成基質としては、特に限定されないが、ＰＦＲ－ＡＭＣやＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ等を例示することができる。本発明のＫＬＫ５阻害ペプチドのＫＬＫ５阻害活性（ＩＣ５０又はＫｉ）、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのＫＬＫ５阻害活性、並びに、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのＫＬＫ５阻害活性及びＫＬＫ１４阻害活性は、それぞれ１μＭ以下、好適には３００ｎＭ以下、より好適には１００ｎＭ以下、より一層好適には３０ｎＭ、さらにより一層好適には１０ｎＭ以下である。ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのＫＬＫ７阻害活性は、好適には１０００ｎＭ以下、より好適には３００ｎＭ以下、より一層好適には１００ｎＭ、さらにより一層好適には３０ｎＭ以下である。また、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド又はＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、ＫＬＫ５阻害活性とＫＬＫ７阻害活性又はＫＬＫ１４阻害活性（いずれもＩＣ５０又はＫｉ）の相対的な大小により分類することができ、好適には、（ｉ）ＫＬＫ５阻害活性がＫＬＫ７阻害活性又はＫＬＫ１４阻害活性の０．５倍未満、（ｉｉ）ＫＬＫ５阻害活性がＫＬＫ７阻害活性又はＫＬＫ１４阻害活性の０．５倍以上２倍未満、（ｉｉｉ）ＫＬＫ５阻害活性がＫＬＫ７阻害活性又はＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性の２倍以上、の３群に分類され、治療等の用途に応じてそれらの群から所望のペプチドが選択され得る。
また、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、それぞれＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４以外のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱いことが好ましい。言い換えれば、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのプロテアーゼ阻害活性は、好適には、ＫＬＫ５特異性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７特異性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４特異性が高い。好適な本発明のペプチドは、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ８、ＫＬＫ９乃至ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１５、キモトリプシン、トリプターゼ、キマーゼ、プラスミン、トロンビン、エラスターゼ、マトリプターゼ、プロテインＣ、組織（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、血漿カリクレイン等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。そのような本発明の好適なペプチドは、他のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制することに起因する副作用を示さず、ＫＬＫ５関連疾患（後述）の治療薬又は予防薬として好適に使用され得る。さらに、本発明の好適なＫＬＫ５特異的阻害ペプチドは、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い；本発明の好適なＫＬＫ５／ＫＬＫ７特異的阻害ペプチドは、ＫＬＫ１４のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い；本発明の好適なＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、ＫＬＫ７のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。
ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に対する特異性が低く、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に加えて、他のＫＬＫが有するプロテアーゼ活性も阻害するような阻害剤、すなわち非選択的阻害剤は、ヒトに投与した場合に副作用を生じ得る（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，ＬＭ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻（５５６４号）、２３８７－２３９２頁（２００２年）：Ｂｉｓｓｅｔｔ，Ｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３巻（４号）、８４２－８４９頁（２００５年））。一方、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４に対する特異性が高い阻害剤、すなわちＫＬＫ５特異的阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７特異的阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４特異的阻害ペプチドは、前述のような副作用を回避し得るため、ＫＬＫ５関連疾患（後述）の治療又は予防のためにそれぞれ好適に使用することができる。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ５阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４へのプロテアーゼ基質の結合において、競合的であってもよい。
前述の通り、本発明のペプチドの標的であるＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適には霊長類、より一層好適にはヒトに由来するが、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス等のげっ歯類、カニクイザル、コモンマーモセット、アカゲザル等の霊長類に由来してもよい。非ヒト動物由来のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に対して阻害活性を有するペプチドは、かかる非ヒト動物におけるＫＬＫ５に関わる疾患の診断、検査、治療又は予防等に使用することができる。また、そのようなペプチドが、ヒトＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４も阻害する場合、ＫＬＫ５関連疾患（後述）の治療薬又は予防薬としての該ペプチドの非臨床研究開発において、かかる非ヒト動物を動物病態モデルとして使用した薬効薬理試験や薬物動態試験、健常動物として使用した安全性試験や毒性試験等を行うことができる。
また、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及びＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、医薬及び診断薬として当該分野で使用される抗体等の他の生体高分子と比較して分子量が小さく、その製造（後述）が比較的容易であり、保存安定性や熱安定性等の物性の面で優れており、医薬組成物（後述）として使用される場合の投与経路、投与方法、製剤等の選択の幅が広い等の長所を有する。また、生体高分子やポリマーの付加等、公知の方法を適用して本発明のペプチドの分子量を大きくすることにより、医薬組成物として使用された場合の血中半減期をより長く調節することもできる。そのような本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及びＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの分子量は１０，０００未満、好適には８，０００未満、より好適には約７，０００～７，２００である。また、配列番号６１（図６９）の１５番Ｃｙｓ～３１番Ｃｙｓからなる可変ループ部分又は１５番Ｃｙｓ～６３番Ｃｙｓからなる部分（以下「６つのＣｙｓを含む部分」という）のうち、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するものも、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペ
プチドにそれぞれ包含され、可変ループ部分の分子量は２，５００未満、好適には約１，８００～２，０００であり、６つのＣｙｓを含む部分の分子量は６，０００未満、好適には約５，３００～５，５００である。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２の有する骨格が少なくとも部分的に維持されたＳＰＩＮＫ２変異体（以下、「ＳＰＩＮＫ２変異体」と略記する）であり、好適には、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の部分ペプチド、部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合する（以下、かかる認識又は結合作用をまとめて「標的結合活性」という）。
本発明におけるＳＰＩＮＫ２変異体とＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４の結合は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、「ＳＰＲ」という）解析法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ:以下、「ＢＬＩ」という）法、等温滴定熱量測定（Ｉｓｏｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：以下、「ＩＴＣ」という）、フローサイトメトリー、免疫沈降法等により、当業者に公知の方法を用いて、測定又は判定することができる。
ＥＬＩＳＡ法としては、プレート上に固相化されたＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４を認識して結合したＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドを検出する方法が挙げられる。ＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４の固相化には、ビオチン－ストレプトアビジンの他、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４、又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４に融合したタグを認識する固相用抗体等を利用することができる。ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの検出には、標識されたストレプトアビジンの他、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３'，５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の蛍光基質、及び化学発光基質を用いることができる。検出シグナルの測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等を利用することができる。
ＳＰＲ解析による測定方法は、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドをセンサーチップ上に固定化し、ＫＬＫ５等の標的分子を添加することにより両者の結合を測定する方法、及び、ＫＬＫ５等の標的分子をセンサーチップ上に固定化し、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを添加することにより両者の結合を測定する方法、のいずれであってもよく、好適には前者である。本発明のペプチド又はコンジュゲートに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体の固定化には直
接法又は捕捉法を利用することができ、好適には後者である。直接法ではＳＰＩＮＫ２変異体の疎水性や、ＳＰＩＮＫ２の持つアミノ基やカルボキシル基等を利用して直接固定化することができる。捕捉法ではビオチン－ストレプトアビジンの他、該コンジュゲート又は該コンジュゲートに融合したタグを認識する抗体、プロテインＡ又はプロテインＧ等を利用して固定化することができる。ＳＰＩＮＫ２変異体を固定化したセンサーチップに、測定用緩衝液を用いて希釈したＫＬＫ５等の標的分子を添加し、ＳＰＲシグナルを経時的に観察して結合のセンサーグラムを取得する。続いてＫＬＫ５等の標的分子を含まない測定用緩衝液を添加し、ＳＰＲシグナルを経時的に観察して解離のセンサーグラムを取得する。取得したセンサーグラムを用いて結合親和性を解析し、解離定数ＫＤを算出する。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ）、ＳＰＲ－Ｎａｖｉ（登録商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓＯｙ）、Ｓｐｒｅｅｔａ（登録商標）（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩ（登録商標）（ホリバ）、Ａｕｔｏｌａｂ ＳＰＲ（登録商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ）等を例示することができる。ＢＬＩ法に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ）を例示することができる。
免疫沈降法としては、ビーズ上に固相化されたＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドによって認識され、結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を検出する方法が挙げられる。ビーズには磁気ビーズやアガロースビーズ等を利用することができる。ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの固相化には、ビオチン－ストレプトアビジンの他、該ペプチド又は該ペプチドに融合したタグを認識する抗体、プロテインＡ又はプロテインＧ等を利用することができる。磁石や遠心分離等によってビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で検出する。ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の検出には、標識されたストレプトアビジンの他、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７若しくはＫＬＫ１４、又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７若しくはＫＬＫ１４に融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＥＬＩＳＡ法と同様の基質を利用することができる。検出シグナルの測定にはＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ）やＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ（ＡＴＴＯ）等を利用することができる。
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法における結合活性ＥＣ５０を挙げることができる。他の判定基準としては、例えば、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤ」という）を挙げることができる。本発明におけるＫＬＫ５阻害ペプチドのＫＬＫ５に対するＫＤ値、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのＫＬＫ５及びＫＬＫ７に対するＫＤ値、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に対するＫＤ値は１×１０－５Ｍ以下、５×１０－６Ｍ以下、２×１０－６Ｍ以下又は１×１０－６Ｍ以下、より好適には５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下又は１×１０－７Ｍ以下、より一層好適には５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下又は１×１０－８Ｍ以下、さらにより一層好適には５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下又は１×１０－９Ｍ以下である。他の判定基準としては、例えば、免疫沈降法での解析結果を挙げることができる。本発明における好適なＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをビーズに固相化し、それぞれＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を検出した場合、ＫＬＫ５、
ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４のシグナルが検出される。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又はＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体は、上記のようなプロテアーゼ阻害活性、標的結合活性、その他の性質、機能、特徴等を有し得る一方で、その全長アミノ酸配列はヒト野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に対して高い配列同一性を有する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図７）と６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する。
「同一性」とは、２つの配列の間の、類似性又は関係の程度を示す性質を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）は、同一であるアミノ酸又はアミノ酸残基の数をアミノ酸又はアミノ酸残基の総数で割って得られる数値に、１００を掛けることにより、算出される。
「ギャップ」とは、２つ以上の配列のうち少なくとも１つにおける欠失及び／又は付加の結果である、当該配列間のアライメントにおける隙間を意味する。
完全に同一なアミノ酸配列を有する２つのアミノ酸配列の間の同一性は１００％であるが、一方のアミノ酸配列を他方と比較して１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基の置換、欠失又は付加があれば、両者の同一性は１００％未満となる。ギャップをも考慮して２つの配列間の同一性を決定するためのアルゴリズムやプログラムとしては、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻、３３８９－３４０２頁、１９９７年）、ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５巻、４０３－４１０頁、１９９０年）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １４７巻、１９５－１９７頁、１９８１年）等の当業者に公知のものを例示することができる。
本発明において、「変異した」とは、天然に存在する核酸分子又はペプチドと比較のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド残基又はアミノ酸若しくはアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入がなされていることを意味する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列と比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基が変異されている。
本発明のある態様において、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図９）の：
１６番Ｓｅｒ～２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ～２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体うち一部の好適なＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドにおいては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ－４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ－４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ－６３番Ｃｙｓが、それぞれ
ジスルフィド結合を形成している。
そのようなＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列がＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに含まれる場合、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、４１番Ｇｌｕ乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似しているか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を発揮し得る程度に、維持されていることが好ましい。
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のうち、一部のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの有するアミノ酸配列について以下に述べる。上述の通り、本発明において「アミノ酸残基」は単に「アミノ酸」と表記されることがある。
配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列（一般式）において、Ｘ１乃至Ｘ１２は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を阻害する限りにおいてそれぞれ任意のアミノ酸であれば特に限定されない。以下、Ｘ１乃至Ｘ１２の好適なアミノ酸について記載するが、それらのアミノ酸の中には天然型、すなわち野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列中と同一のアミノ酸が含まれている場合がある。
ＫＬＫ５阻害ペプチドに含まれる配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＳｅｒ；
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ又はＴｈｒ；
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ；
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｙ又はＴｙｒ；
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｒｇ又はＬｙｓ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＰｈｅ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐ又はＧｌｕ
である。
ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドに含まれる配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＧｌｙ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＴｈｒ；
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＧｌｎ；
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＧｌｙ、Ａｒｇ又はＳｅｒ；
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ又はＳｅｒ；
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＧｌｙ；
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＨｉｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ；
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＨｉｓ又はＴｙｒ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＨｉｓ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐ又はＧｌｕ
である。
ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに含まれる配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１６番Ｘａａ（Ｘ１）はＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｓｐ又はＧｌｎ；
１８番Ｘａａ（Ｘ３）はＴｈｒ又はＶａｌ；
１９番Ｘａａ（Ｘ４）はＴｈｒ又はＶａｌ；
２０番Ｘａａ（Ｘ５）はＧｌｕ又はＴｈｒ；
２１番Ｘａａ（Ｘ６）はＨｉｓ又はＴｈｒ；
２２番Ｘａａ（Ｘ７）はＴｙｒ；
２４番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｓｎ又はＳｅｒ；
２５番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｒｇ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１０）はＡｓｐ又はＧｌｕ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１１）はＴｙｒ；
２８番Ｘａａ（Ｘ１２）はＡｓｐ
である。
なお、野生型の１６乃至２２番及び２４乃至２８番Ｘａａ（Ｘ１乃至Ｘ１２）は、それぞれＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ及びＡｓｎである。
本発明においては、１番アミノ酸のＮ末側に、さらに１つ乃至数個又はそれ以上、好適には１乃至５個のアミノ酸が付加していてもよい。そのようなアミノ酸の付加としては、好適にはＡｓｐ及び／又はＧｌｕが１乃至５個付加したもの（ＡｓｐとＧｌｕの両方を含んでいてもよい）、より好適にはＡｓｐが１乃至５個付加したもの又はＧｌｕが１乃至５個付加したものを挙げることができる。
本発明においては、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのＮ末及び／又はＣ末付加体（以下、「親ペプチド」と呼ぶ）の付加部分において、１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失されてなり、且つ該ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの活性の一部又は全部を維持しているペプチドを「親ペプチドの誘導体」又は「親ペプチド誘導体」と呼ぶことがある。かかる「誘導体」も本発明の「ペプチド」の範囲に含まれる。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの範囲に含まれるＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列においては、Ｘ１乃至Ｘ１２以外の部分、すなわち、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図９）中の、２番Ｐｒｏ～１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ及び２９番Ｐｒｏ～６３番Ｃｙｓの位置において、天然型のアミノ酸若しくは変異したアミノ酸又はアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＳＰＩＮＫ２変異体は、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上の位置において変異してよい。そのような変異は、当業者に公知の標準的な方法を使用することによりなし得る。アミノ酸配列中の典型的な変異としては、１つ又は２つ以上のアミノ酸の
置換、欠失又は挿入を挙げることができ、置換としては、保存的置換を例示することができる。保存的置換により、あるアミノ酸残基は、嵩高さのみならず、極性の面についても化学的特徴が類似しているアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、本明細書の他の部分に記載されている。一方で、Ｘ１乃至Ｘ１２以外の部分は、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上のアミノ酸の非保存的置換も許容し得る。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列は、Ｘ１乃至Ｘ１２が、好適には、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８）、配列番号２２、２４、２６及び２８（図３０、３２、３４及び３６）、又は、配列番号３０及び３２（図３８及び４０）のいずれか一つにおけるＸ１乃至Ｘ１２の各アミノ酸であり、且つ、Ｘ１乃至Ｘ１２以外の部分がＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしないアミノ酸又はアミノ酸配列を有することができる。
また、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列の例として、次の（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列をそれぞれ挙げることができる：
（ａ１）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号２２、２４、２６及び２８（図３０、３２、３４及び３６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
（ｃ１）配列番号３０及び３２（図３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配
列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
なお、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０）のアミノ酸番号６４及び６５は、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１、図９：６３アミノ酸からなる）に対応するアミノ酸ではなく、本発明のある態様において本発明のペプチドを発現させるために付加されたものである。
本発明のペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、血中半減期、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド又は蛋白質等の他の物質にコンジュゲートさせるため、Ｃｙｓのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
本発明において、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは他の部分に連結又は付加していてもよく、そのようなコンジュゲート体を「ＫＬＫ５阻害ペプチドのコンジュゲート」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのコンジュゲート」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのコンジュゲート」とそれぞれ総称する。本発明において「コンジュゲート」とは、本発明のペプチド又はその断片に他の部分が結合してなる分子を意味する。「コンジュゲート」又は「コンジュゲーション」には、ある部分が架橋剤等の化学物質を介して、ある部分をアミノ酸の側鎖に連結するのに適した作用物質等を介して、本発明のペプチドのＮ末及び／又はＣ末に合成化学的手法や遺伝子工学的手法等により、本発明のペプチドに連結又は結合される形態が含まれる。そのような「部分」には、血中半減期を改善するものとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、パルミチン酸等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ領域：そのアミノ酸配列を配列番号８７、図９５に示す）、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はその断片、アルブミン結合ペプチド、連鎖球菌プロテインＧ等のアルブミン結合蛋白質、トランスフェリンを、例示することができる。その他の「部分」としては、かかる「部分」はペプチドリンカー等のリンカーを介して本発明のペプチドが連結され得る。
本発明のある態様において、コンジュゲートは、本発明のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドと、抗体のＦｃ領域又はその断片との融合体である。抗体の起源は、ヒト、及び、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、ウシ、ブタ、イヌ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル等その他の哺乳類、ニワトリ等の鳥類を上げることができ、好適にはヒトである。抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥを例示することができ、好適にはＩｇＧ１である。より好適には、コンジュゲートは、本発明のペプチドと、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域又はその断片との融合体である。本発明のペプチドと抗体のＦｃ領域又はその断片の融合体を「Ｆｃ融合体」又は「コンジュゲート」と記載することがあるが、いずれも同義である。
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域としては、例えば、配列番号８７（図９５）で示されるアミノ酸配列を含むか該配列からなるものを挙げることができるが、それに限定されない。抗体のＦｃ領域は、野生型、変異型のいずれであってもよい。
また、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドには、薬理活性を発揮するか又は増強するために、他の薬物がコンジュゲートされていてもよい。抗体分野において抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）として当業者に公知の技術や態様は、抗体を本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明の一部の態様となり得る。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、それぞれＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４以外の標的分子に対する結合親和性、阻害活性、拮抗活性、作動活性等を発揮する１つ又は２つ以上の部分をさらに含むか、そのような部分にコンジュゲートされていてもよい。かかる「部分」としては、抗体又はその断片、ＳＰＩＮＫ２変異体のような抗体以外の骨格を有する蛋白質又はその断片を例示することができる。抗体分野において多重特異的抗体及び二重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）として当業者に公知の技術や態様は、それらに含まれる２つ以上の「抗体」のうち少なくとも１つを本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明のコンジュゲートの一部の態様となる。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド又はその前駆体は、シグナル配列を含み得る。あるポリペプチド若しくはその前駆体のＮ末に存在するか又は付加されたシグナル配列は、当該ポリペプチドを細胞の特定の区画、例えば、大腸菌であれば周辺質、真核細胞であれば小胞体に送達するために有用であり、多くのシグナル配列が当業者に公知であり、宿主細胞に応じて選択され得る。大腸菌の周辺質中に所望のペプチドを分泌させるためのシグナル配列としては、ＯｍｐＡを例示することができる、シグナル配列を含む形態も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
また、本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに予めタグを付加させることにより、アフィニティー・クロマトグラフィーによって該ペプチドを精製することができることができる。
本発明のペプチドは、例えば、そのＣ末に、ビオチン、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（登録商標）、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、ＦＬＡＧ（登録商標）等のエピトープタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ等（以下まとめて「アフィ二ティー・タグ」と呼ぶ）を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。本発明のコンジュゲートは、全体としてペプチド（ポリペプチド）であってもよい。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又はＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、標識のための部分を含むことができ、具体的には、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビ
オチン、金属複合体、金属、コロイド金等の標識部分がコンジュゲートされ得る。標識のための部分を含む態様も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチドのコンジュゲート、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのコンジュゲート、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのコンジュゲートのアミノ酸配列の例として、次の（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列をそれぞれ挙げることができる：
（ａ１）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８及び９６（図４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６及び１０６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号５０、５２、５４及び５６（図５８、６０、６２及び６４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
（ｃ１）配列番号５８及び６０（図６６及び６８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又はＫＬＫ５／Ｋ
ＬＫ１４阻害ペプチド（のアミノ酸配列）には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸のいずれをも含むことができる。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又はＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体として存在し得る。２量体、３量体以上のオリゴマー及び多量体は、単一の単量体から構成されるホモ、及び、２つ以上の異なる単量体から構成されるヘテロ、のいずれでもよい。単量体は、例えば、速やかに拡散し組織への浸透に優れている場合がある。２量体、オリゴマー及び多量体は、例えば、局所において標的分子に対して高い親和性若しくは結合活性を有するか、遅い解離速度を有するか、又は、高いＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を示す等の優れた側面を有し得る。自発的な２量体化、オリゴマー化及び多量体化に加え、意図した２量体化、オリゴマー化及び多量体化も、ｊｕｎ－ｆｏｓドメイン、ロイシンジッパー等を本発明のペプチドに導入することにより、なし得る。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体で、１つ又は２つ以上の標的分子に結合するか又は標的分子の活性を阻害することができる。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドがとり得る形態としては、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、上述のコンジュゲート体、他の分子に結合した形態（固相化された形態、異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）等を挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、発現、精製、使用、保存等に適合した形態を任意に選択することができる。
３．ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの同定
ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列又は本発明のＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの有するアミノ酸配列（例えば、上記（ａ１）、（ｂ１）又は（ｃ１）に記載のアミノ酸配列）、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーより、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を指標としてそれぞれ同定することができ、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４に対する結合活性もそれぞれ指標として組み合わせてもよい。
例えば、出発材料としての核酸分子は、変異誘発に供され、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な細菌宿主又は真核性宿主中に導入され得る。ＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーは、標的分子のバインダーや阻害剤を同定するための技術として公知であり、例えば、ＷＯ２０１４／０２４９１４公報における開示も、その全体を参照することにより本発明の開示に含まれる。適切な宿主において変異誘発に供されたヌクレオチド配列を発現させた後、所望の性質、活性、機能等を有するＳＰＩＮＫ２変異体がその遺伝形質とリンクしてなるクローンを、前記のライブラリーから濃縮及び／又は選抜し、同定することができる。クローンの濃縮及び／又は選抜には、細菌ディスプレイ法（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０巻，１０４４４－１０４４８頁）、酵母ディスプレイ法（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５巻，５５３－５５７頁）、哺乳動物細胞ディスプレイ法（Ｈｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５２５巻，３３７－３５２頁）、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２２８巻，１３１５－１３１７頁）、リボソームディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ＬＣ， ｅｔ ａｌ． （１９９４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９1巻１９号，９０２２－９０２９頁）、ｍＲＮＡディスプレイ等の核酸ディスプレイ法（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ， ｅｔ ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１４巻２号，４０５－４０８頁）、コロニースクリーニング法（Ｐｉｎｉ，Ａ． ｅｔ ａｌ．（２００２年）Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ． Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ． ５巻，５０３－５１０頁）等、当業者に公知の方法を使用することにより、選抜され同定されたクローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体のヌクレオチド配列を決定することにより、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を、当該クローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体すなわちＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドの有するアミノ酸配列として決定することができる。
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、例えば、天然型のＳＰＩＮＫ２に変異を誘発することにより得ることができる。「変異の誘発」とは、あるアミノ酸配列の各位置に存在する１つ又は２つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するか若しくは欠失させるか、又は当該アミノ酸配列中には存在しないアミノ酸を挿入することができるようにすることを意味する。かかる欠失又は挿入により、配列長が変わり得る。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体において、変異の誘発は、好適には、配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列中の、Ｘ１乃至Ｘ１２の１つ又は２つ以上の位置において生じ得る。
但し、そのような好適な変異の誘発の後に、Ｘ１乃至Ｘ１２の１つ又は２つ以上の位置において、天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。同様に、本発明のある態様において、Ｘ１乃至Ｘ１２以外の部分の１つ以上の位置に変異を誘発した後に、当該位置に天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。
「ランダム変異の誘発」とは、配列上の特定の位置について、１つ又は２つ以上の異なるアミノ酸が、変異の誘発により、当該位置に一定の確率で導入させることを意味するが、少なくとも２つの異なるアミノ酸の導入される確率が全て同じではなくてもよい。また、本発明においては、少なくとも２つの異なるアミノ酸に、天然型のアミノ酸（１種）が含まれることを妨げるものではなく、そのような場合も「ランダム変異の誘発」の範囲に含まれる。
特定の位置にランダム変異を誘発する方法としては、当業者に公知の標準的方法を使用することができる。例えば、配列中の特定の位置に、縮重ヌクレオチド組成物を含む合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により変異を誘発することができる。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（Ｎ＝アデニン、グアニン、シトシン又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、天然アミノ酸２０種全てに加え、停止コドンが導入される変異の誘発されるのに対し、コドンＶＶＳ（Ｖ＝アデニン、グアニン又はシトシン）を使用すれば、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１２の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。また、例えば、コドンＮＭＳ（Ｍ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１１の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。非天然アミノ酸の導入を変異誘発するために、特殊なコドン、人工的なコドン等を用いることができる。
部位特異的な変異誘発は、高次構造を含む標的及び／又は該標的に対するペプチド若しくはペプチドが由来する野生型ペプチドの構造情報を利用しても行うことができる。本発明においては、標的であるＫＬＫ５、ＫＬＫ７、若しくは、ＫＬＫ１４、及び／又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、若しくは、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に対するＳＰＩＮＫ２変異体若しくは野生型ＳＰＩＮＫ２の、又は両者の複合体の、高次情報を含む構造情報を利用して、部位特異的な変異を導入することができる。例えば、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体を同定し、次いでＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４及び当該ＳＰＩＮＫ２変異体の複合体の結晶を取得してＸ線結晶構造解析を行い、その解析結果に基づいて該ＳＰＩＮＫ２変異体が結合するＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４分子上のエピトープ及び該エピトープに対応する該ＳＰＩＮＫ２変異体上のパラトープを特定すること等を通じて得られる構造情報と、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性との相関を見出すことができる場合がある。そのような構造活性相関に基づいて、特定の位置において特定のアミノ酸への置換、特定の位置におけるアミノ酸の挿入又は欠失等をデザインし、実際にＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を確認することができる。
また、例えば、イノシン等の塩基対の特異性が改変されたヌクレオチド構成単位を用いて、変異を誘発することができる。
さらに、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等の、校正機能を欠き、エラー率の高いＤＮＡポリメラーゼを用いたエラー・プローンＰＣＲ法、化学変異誘発等により、ランダムな位置への変異誘発が可能である。
ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳細胞ディスプレイ、ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ、核酸ディスプレイ、コロニースクリーニング等を利用して、ファージライブラリー、コロニーライブラリー等それぞれのスクリーニング方法に適した当業者に公知のライブラリーより濃縮及び／又は選抜することができる。それらのライブラリーのうち、ファージライブラリーにはファージミド、コロニースクリーニングにはコスミド等、それぞれのライブラリーに適した当業者に公知のベクター及び方法により構築することができる。そのかかるベクターは、原核細胞又は真核細胞に感染するウイルス又はウイルス性ベクターであってもよい。それらの組換えベクターは、遺伝子操作等当業者に公知の方法により調製することができる。
細菌ディスプレイは、例えば、大腸菌の外膜リポ蛋白質（Ｌｐｐ）の一部及び外膜蛋白質ＯｍｐＡと所望の蛋白質を融合させ、大腸菌表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を細菌ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで細菌細胞を形質転換すれば、形質転換細菌細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０巻，１０４４４－１０４４８頁）。
酵母ディスプレイは、酵母の細胞表面の外殻にあるα－アグルチニン等の蛋白質に所望
の蛋白質を融合させ、酵母表面上に提示させる技術である。α－アグルチニンには、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ)アンカー付着シグナルと推定されるＣ末疎
水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作することにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、１８巻、１２１頁～、２０００年刊：Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９０巻、１２５頁～、２０００年刊等）。
動物細胞ディスプレイは、例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に代表される膜蛋白質の膜貫通領域と所望の蛋白質を融合させ、ＨＥＫ２９３やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を動物細胞ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで動物細胞を形質転換すれば、形質転換動物細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｈｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ５２５巻，３３７－３５２頁）。
酵母、細菌、動物細胞等の細胞上に提示された所望のライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ビオチン等で修飾されたＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４とライブラリーを含む細胞を一定時間保温した後、磁性ビーズ等の担体を添加し、細胞を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。同様に、磁性ビーズ添加後に磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）をする、又は、抗ＫＬＫ５抗体、抗ＫＬＫ７抗体又は抗ＫＬＫ１４抗体を用いた細胞染色後にＦＡＣＳを実施することで、担体（に結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ７若しくはＫＬＫ１４）又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７若しくはＫＬＫ１４と結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
ファージディスプレイの場合、例えば、ファージミドは、プラスミド複製起点の他に、一本鎖バクテリオファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドである。ファージミドを有する細胞は、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すなわち、バクテリオファージ被覆蛋白質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖ファージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリオファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
被検ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含んで構成される融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上又はファージ様粒子上に発現若しくは提示（ディスプレイと同義）させるか、又は、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中若しくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
例えば、該ポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチド及び該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させることができる。
ファージミドの代わりに、環状又は非環状の各種ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いる場合、当業者に公知の方法に従って、該ベクターに挿入された該ポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有するペプチドを、該ベクターが導入された細胞若しくはウイルス様粒子上に発現又は提示させるか、又は該細胞の培養上清中に産生することができる。
そのようにして得られる、ペプチドを発現しているライブラリーを、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
リボゾームディスプレイは、例えば、終始コドンを持たない所望の蛋白質をコードするｍＲＮＡと無細胞蛋白質合成系を用いることで、試験管内で所望の蛋白質とそれに対応するｍＲＮＡ、及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群と無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ＬＣ， ｅｔ ａｌ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９1巻１９号，９０２２－９０２９頁）。
核酸ディスプレイは、ｍＲＮＡディスプレイともよばれ、例えば、チロシルｔＲＮＡの
３’末端に類似の構造をもつピューロマイシン等のリンカーを用いることで、所望の蛋白質、それをコードするｍＲＮＡ及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。当該技術は生細胞ではなく、無細胞蛋白質合成系を利用するため、試験管内で合成することが可能である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群とピューロマイシン等のリンカー、及び、無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１４巻２号，４０５－４０８頁）。
リボゾームディスプレイや核酸ディスプレイ等の無細胞合成系を介して得られる、ペプチドを発現しているライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現している核酸を回収し、ｍＲＮＡの場合はｃＤＮＡに逆転写反応後にヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、回収した核酸からｍＲＮＡを転写し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
ペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物に予めアフィ二ティー・タグをコンジュゲートさせておけば、効率的に当該ペプチド又はそれらの集合物を精製することができる。例えば、プロテアーゼの基質をタグとして予めペプチド集合物にコンジュゲートさせておけば、該プロテアーゼ活性により切断することにより、ペプチドを溶出することができる。
得られた配列情報及びペプチドの機能等に基づき、得られたクローン又はライブラリーにさらなる変異を誘発させ、変異が導入されたライブラリーから、その機能（例えば、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性）、物性（熱安定性、保存安定性等）、体内動態（分布、血中半減期）等が改善されたペプチドを取得することも可能である。
得られたペプチドが、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有しているか否かを決定することにより、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをそれぞれ同定することができる。
また、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドは、好適には、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６
番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、並びに、４１Ｇｌｕ番アミノ酸乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似するか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性をそれぞれ発揮し得る程度に、維持され得る。かかる立体構造（全体の構造又は部分構造）を指標の一部として、より好適なＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドを同定することも可能である。
さらに、本発明は、ＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーを使用して、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドを同定する方法に関し、上記（７５）記載の方法を例示することができる。また、本発明は、各種化合物ライブラリーを使用して、ＫＬＫ５阻害化合物、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害化合物、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害化合物を同定する方法に関し、かかる方法においては本発明のペプチド又はコンジュゲートを参照化合物、コントロール等として使用することができ、そのような方法として上記（７６）を例示することができる。かかる方法においては、被験化合物の酵素阻害活性が参照化合物又はコントロールの酵素阻害活性と同等又はより強い場合、当該化合物を陽性と判定し、より弱い場合、当該化合物を陰性と判定してもよく、そのような比較を伴う方法としては、上記（７７）を例示することができる。一方、ＫＬＫ５及び任意でＫＬＫ７又はＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を測定する工程を伴う任意の試験において、本発明のペプチド又はコンジュゲートを参照化合物、コントロール等として使用することができ、そのような試験方法も本発明に包含される。かかる試験には、特に限定はなく、上記（７８）を例示することができるが、本発明の診断方法、検査方法、検出方法、及び、医薬組成物を投与する個体の同定方法（いずれも後述）も好適な例として挙げることができる。
４．本発明ペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸分子、それを含むベクター、それらを含む細胞、並びに、組換え型ペプチド又はコンジュゲートの製造方法
本発明は、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害ペプチドをコードする核酸分子」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドをコードする核酸分子」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子若しくはベクターが導入された細胞（以下、「ＫＬＫ５阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」という）、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドを産生する細胞（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害ペプチド産生細胞」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド産生細胞」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド産生細胞」という）をも提供する。
本発明のＫＬＫ５阻害ペプチドをコードする核酸分子、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子の好適な例として、それぞれ次の（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害ペプチドのヌクレオチド配列」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのヌクレオチド配列」若しくは「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのヌクレオチド配列」という）を含んでなるか、ＫＬＫ５阻害ペプチドのヌクレオチド配列、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるか、又は、ＫＬＫ５阻害ペプチドのヌクレオチド配列、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのヌクレオチド配列からなるものを挙げることができる：
（ａ１）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１乃至１８９からなるヌクレオチド配列、又は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９（図１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｂ１）配列番号２２、２４、２６及び２８（図３０、３２、３４及び３６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号２１、２３、２５及び２７（図２９、３１、３３及び３５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１乃至１８９からなるヌクレオチド配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｃ１）配列番号３０及び３２（図３８及び４０）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１乃至６３からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号２９又は３１（図３７又は３９）記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号１乃至１８９からなるヌクレオチド配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％
、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
上記（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか又は該アミノ酸配列を含むＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドは、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害し、好適には該プロテアーゼ活性を特異的に阻害する。
なお、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１（図１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９）のヌクレオチド番号１９０乃至１９５は、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１、図９：６３アミノ酸からなる）をコードするヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドではなく、本発明のある態様において本発明のペプチドを発現させるために付加されたものである。
しかしながら、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子は（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）に限定されるものではなく、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体に含まれるアミノ酸配列、好適には配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は遍くＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子の範囲に包含される。
また、本発明は、ＫＬＫ５阻害ペプチドのコンジュゲート、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのコンジュゲート、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害コンジュゲートをコードする核酸分子」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートをコードする核酸分子」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートをコードする核酸分子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子若しくはベクターが導入された細胞（以下、「ＫＬＫ５阻害コンジュゲートをコードする核酸分子含有細胞」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートをコードする核酸分子含有細胞」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートをコードする核酸分子含有細胞」という）、ＫＬＫ５阻害ペプチドのコンジュゲート、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドのコンジュゲート、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのコンジュゲートを産生する細胞（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害コンジュゲート産生細胞」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲート産生細胞」又は「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲート産生細胞」という）をも提供する。
本発明のＫＬＫ５阻害コンジュゲートをコードする核酸分子、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートをコードする核酸分子の好適な例として、それぞれ次の（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、それぞれ「ＫＬＫ５阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列」、「ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列」若しくは「ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列」という）を含んでなるか、ＫＬＫ５阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるか、又は、ＫＬＫ５阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドのヌクレオチド配列からなるものを挙げることができる：
（ａ１）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８及び９６（図４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６及び１０６）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７及び９５（図４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び１０５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｂ１）配列番号５０、５２、５４及び５６（図５８、６０、６２及び６４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号４９、５１、５３及び５５（図５７、５９、６１及び６３）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｃ１）配列番号５８及び６０（図６６及び６８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は、配列番号５７又は５９（図６５又は６７）記載のヌクレオチド配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
上記（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか又は該アミノ酸配列を含むＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドは、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害し、好適には該プロテアーゼ活性を特異的に阻害する。
しかしながら、ＫＬＫ５阻害ペプチド、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドをコードする核酸分子は（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）に限定されるものではなく、ＫＬＫ５阻害活性、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害活性、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体に含まれるアミノ酸配列、好適には配列番号６１（図６９）で示されるアミノ酸配列を含むコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は遍くＫＬＫ５阻害コンジュゲートをコードする核酸分子、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲートをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲートをコードする核酸分子の範囲に包含される。
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を設計するには、各アミノ酸に対応するコドンを１種又は２種以上使用することができる。そのため、あるペプチドが有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入される、発現用の宿主細胞のコドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度若しくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用してヌクレオチド配列を設計してもよい。
本発明のペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸分子は、１つ又は２つ以上の調節配列に機能的に連結されていてもよい。「機能的に連結される」とは、連結された核酸分子を発現させることができる、又は、該分子に含まれるヌクレオチド配列の発現を可能にする、ことを意味する。調節配列は、転写調節及び／又は翻訳調節に関する情報を含む配列エレメントを含む。調節配列は、種により様々であるが、一般に、プロモーターを含み、原核生物の－３５／－１０ボックス及びシャイン・ダルガノ配列、真核生物のＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列等で例示される、転写及び翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。かかる配列は、エンハンサーエレメント及び／又はリプレッサーエレメント、並びに宿主細胞内外の特定の区画へと天然型又は成熟型のペプチドを送達するための、翻訳され得るシグナル配列、リーダー配列等を含んでもよい。さらに、調節配列は３’非コード配列を含んでよく、かかる配列には、転写終結又はポリアデニル化等に関与するエレメントを含み得る。ただし、転写終結に関する配列が、特定の宿主細胞において充分に機能しない場合は、当該細胞に適した配列で置換され得る。
プロモーター配列としては、原核生物ではｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等を、真核細胞ではＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等を例示することができる。
本発明のペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸分子は、単離された形態、ベクター若しくは他のクローニングビヒクル（以下、単に「ベクター」という：プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド等）中又は染色体中に含まれる形態であってよいが、それらの形態に限定されない。ベクターは、上記調節配列に加え、発現に使用される宿主細胞に適した複製配列及び制御配列、並びに形質転換等により核酸分
子が導入された細胞を選択可能な表現型を与える選択マーカーを含んでいてもよい。
本発明のペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸分子、及び、本発明のペプチド又はコンジュゲートのヌクレオチド配列を含むベクターは、当該ペプチド、コンジュゲート又はヌクレオチド配列を発現可能な宿主細胞に形質転換等の当業者に公知の方法により導入することができる。該核酸分子又はベクターを導入された宿主細胞は、当該ペプチド又はヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養され得る。宿主細胞は、原核及び真核のいずれでもよく、原核では大腸菌、枯草菌等、真核ではサッカロミセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス等の酵母、ＳＦ９、Ｈｉｇｈ５等の昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０等の動物細胞を例示することができる。真核細胞等を宿主細胞として用いることにより、発現した本発明のペプチドに所望の翻訳後修飾を施すことができる。翻訳後修飾としては、糖鎖等の官能基付加、ペプチド又は蛋白質の付加、アミノ酸の化学的性質の変換等を例示することができる。また、本発明のペプチド又はコンジュゲートへの所望の修飾を人工的に施すことも可能である。そのようなペプチド又はコンジュゲートの修飾体も、本発明の「ペプチド」又は「コンジュゲート」の範囲に包含される。
本発明はペプチド又はコンジュゲートの製造方法をも提供する。当該方法には、ＫＬＫ５阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５阻害コンジュゲート）をコードする核酸分子含有細胞若しくはＫＬＫ５阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５阻害コンジュゲート）産生細胞、ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲート）をコードする核酸分子含有細胞若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害コンジュゲート）産生細胞、又は、ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲート）をコードする核酸分子含有細胞若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチド（若しくはＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害コンジュゲート）産生細胞を培養する工程１、及び／又は、工程１で得られた培養物からＳＰＩＮＫ２変異体を回収する工程２が含まれる。工程２には、当業者に公知の分画、クロマトグラフィー、精製等の操作を適用することができ、例えば、後述する本発明の抗体又はその結合断片を利用したアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製が適用可能である。
本発明の一部の態様において、ペプチド又はコンジュゲートに含まれるペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有する。分子内ジスルフィド結合を有するペプチドは、シグナル配列等を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に送達させることが好ましい場合がある。酸化性環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質、グラム陽性細菌の細胞外環境、真核細胞の小胞体内腔等により提供することが可能であり、かかる環境下では、構造的なジスルフィド結合の形成が促進され得る。また、大腸菌等の宿主細胞の細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することも可能であり、その場合ペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得されるか、又は封入体の形態で回収され、次いでイン・ビトロで復元され得る。さらに、酸化性の細胞内環境を有する宿主細胞を選択し、その細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することもできる。一方、ペプチドが分子内ジスルフィド結合を有さない場合は、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。
本発明のペプチド又はコンジュゲート（に含まれるペプチド部分）は、メリフィールド他のペプチド固相合成法、並びに、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｂｏｃ）や９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）等を利用した有機合成化学的ペプチド合成法により例示される化学合成、イン・ビトロ翻訳等の、他の当業者に公知の方法によっても製造することができる。
本発明は、その一部の態様として、本発明のペプチド又はコンジュゲートに含まれるペプチドに結合する抗体及びその結合断片を提供する。抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体としては、免疫グロブリン又はそれに由来するものであれば特に限定されない。抗体の結合断片は、抗原結合活性すなわち該ペプチドへの結合活性を有している範囲において限定はなく、重鎖及び軽鎖の両方若しくは一方又はその断片、定常領域やＦｃ領域を欠くもの、他の蛋白質や標識用物質とのコンジュゲート体等も含まれる。かかる抗体及びその結合断片は、当業者に公知の方法により調製することができ、該ペプチドのアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製、該ペプチドを含む医薬組成物又はその使用に関連した臨床検査、診断等における該ペプチドの検出、イムノアッセイ等に有用である。本発明の抗体又はその結合断片は、該抗体又は断片が結合する本発明のペプチドを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製することができる。
５．医薬組成物
本発明は又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物は、ＫＬＫ５により惹起されるか又は増悪化され、ＫＬＫ５の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持若しくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患（以下、「ＫＬＫ５に関わる疾患」又は「ＫＬＫ５関連疾患」という）の治療及び／又は予防に有用である。ＫＬＫ５に関わる疾患としては、例えば、ネザートン症候群（Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ｆｕｒｉｏ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５年）ＰＬｏＳ． Ｇｅｎｅｔ． １１巻，ｅ１００５３８９頁）、アトピー性皮膚炎（Ｆｏｒｔｕｇｎｏ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２年）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２１巻，４１８７－４２００頁）、酒さ（Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００７年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １３巻，９７５－９８０頁）、紫外線による皮膚傷害（Ｎｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００９年）Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｃｉ． ５４巻，１７－２４頁）、乾癬（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００７年）Ｂｒ． Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １５６巻，８７５－８８３頁）、喘息（Ｇｒuｎｂｅｒｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４８巻，１５９２－１５９４頁）、脊髄損傷（Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３年）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７２巻，１０７２－１０８９頁）、がん（例えば、子宮癌、膀胱尿路上皮癌、大腸癌、口腔扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、メラノーマ、前立腺癌、グリオーマ等）（Ｅｍａｍｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００７年）Ｍｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． １巻，２６９－２８７頁）、Ｂａｒｒｅｔｔ食道（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ， ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＧＳＥ１３０８３に基づく）等を挙げることができるが、それらに限定されない。
ＫＬＫ５はネザートン症候群様の皮膚症状発症の主因子と考えられる。ＫＬＫ５は自己活性型のプロテアーゼで、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４の活性化にも関与する。一方、ネザートン症候群の患者及びネザートン症候群モデルマウスの角質層においては、トリプシン様及びキモトリプシン様の高いプロテアーゼ活性が認められており、ＫＬＫ５に加え、ＫＬＫ７やＫＬＫ１４など下流に位置するカリクレインファミリーが角質層のプロテアーゼ活性に関わることが示唆される。ＫＬＫ５の阻害に加え、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４をも阻害することにより、ネザートン症候群様の皮膚症状をより強く抑制することができる場合があることが期待される。ネザートン症候群と関連のあるＳＰＩＮＫ５の変異はＨｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）に７０以上挙げられており、ネザートン症候群の重症度と関連することが報告されている。ＳＰＩＮＫ５のエクソン１～９までに変異を持つ場合は、より重症化したネザートン症候群の病態と関連する。ＳＰＩＮＫ５の変異を調べることにより、ネザートン症候群の治療又は予防に本発明のペ
プチド又はコンジュゲートを含む医薬組成物を使用すべきか否かを判定することが可能となる。
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量のペプチド又はコンジュゲートと薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態及び投与経路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれるペプチド、コンジュゲート等の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
製剤用の物質として、例えば、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
これらの製剤用の物質の添加量は、本発明のペプチド、又はコンジュゲートに含まれるペプチドの重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
本発明のペプチド又はコンジュゲートをリポソーム中に含有せしめたもの、該ペプチドとリポソームとが結合してなる修飾体を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等を挙げることができる。
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。本発明の別の医薬組成物の例として、凍結乾燥製剤を挙げることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
本発明の医薬組成物の投与経路としては、点眼、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、結膜上への点眼、硝子体内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等を挙げることができる。
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、本発明のペプチド、又はコンジュゲートに含まれるペプチドの、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４に対する阻害活性、結合親和性等に応じて決定することができる。本発明の阻害ペプチドの標的に阻害活性が強い（ＩＣ５０値又はＫｉ値が小さい）か又は親和性が高い（ＫＤ値が小さい）ほど、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
本発明のペプチド又はコンジュゲートの投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該ペプチドの標的に対する阻害活性、結合親和性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
本発明のペプチド又はコンジュゲートを有効成分として含む医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に本発明のペプチド又はコンジュゲートを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、本発明のペプチド又はコンジュゲートと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤（複数の製剤）、のいずれに含有されてもよい。
それらの他の医薬は、１つの場合もあり、２つ、３つあるいはそれ以上を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートに加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の医薬組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。
例えば、ネザートン症候群には、保湿剤、ステロイド薬、抗菌剤、等を挙げることができる。アトピー性皮膚炎には、ステロイド薬、カルシニューリン阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、免疫抑制薬、ＩＬ－４／ＩＬ－１３阻害剤、光線療法、等を挙げることができる。酒さには、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、アゼライン酸、ブリモニジン、等を挙げることができる。乾癬には、ＴＮＦα阻害剤、ＩＬ－１２／２３阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、ＰＤＥ４、代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、フマル酸エステル、レチノイド製剤、ステロイド薬、ビタミンＤ３アナログ、光線療法、等を挙げることができる。喘息には、ステロイド薬、β２作動薬、等を挙げることができる。子宮癌、膀胱尿路上皮癌、大腸癌、口腔扁平上皮癌、乳癌、頭頸部癌、メラノーマ、前立腺癌、グリオーマ等のがんには、各種抗がん剤を挙げることができる。
本発明のペプチド又はコンジュゲートを投与する工程を含む、ＫＬＫ５に関わる疾患の治療方法又は予防方法、該疾患の治療用又は予防用医薬組成物を調製するための本発明のペプチド又はコンジュゲートの使用、該疾患の治療又は予防のための該ペプチド又はコンジュゲートの使用、をも本発明は提供する。該ペプチド又はコンジュゲートを含む治療用又は予防用キットも本発明に含まれる。
さらに、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートの有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、又は、該ポリヌクレオチド若しくは該ベクターを含む細胞か又は本発明のペプチド若しくはそのコンジュゲートを発現する細胞を含む医薬組成物をも提供する。例えば、かかるポリヌクレオチド及びベクターはＫＬＫ５に関わる疾患の遺伝子治療に、かかる細胞はＫＬＫ５に関わる疾患の細胞治療に、それぞれ公知の手法を用いて適用することができる。また、例えば、かかるポリヌクレオチド又はベクターを、自家細胞又は他家細胞（同種細胞）に導入することにより、細胞治療用の細胞を調製することができる。そのようなポリヌクレオチド及びベクターは、細胞治療薬調製用の組成物としても、本発明に包含される。しかしながら、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞等を含む医薬組成物の態様は上記のものに限定されない。
本発明の医薬組成物に有効成分として含有されるペプチド又はそのコンジュゲートのＫＬＫ５に関わる疾患の治療効果を評価する手段として、動物モデルを使用することができる。例えば、ネザートン症候群では、その原因遺伝子であるＳＰＩＮＫ５遺伝子に変異を有するモデルとして、ＳＰＩＮＫ５遺伝子欠損マウス（Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００４年）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３７巻，５６－６５頁）、ＳＰＩＮＫ５遺伝子コンディショナルノックアウトマウス（Ｐｅｔｒｏｖａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９年） ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ ａｎｄ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓにおける口頭発表演題：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｏｏｋ ２８頁）、Ｃｒｕｓｔｙ２マウス（Ｍｕｔａｇｅｎｅｔｉｘ ｄａｔａｂａｓｅ）等を挙げることができるが、それらに限定されない。
６．診断用組成物
本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。
本発明の診断用組成物は、ＫＬＫ５に関わる疾患、ＫＬＫ５発現、ＫＬＫ７発現、ＫＬＫ１４発現等の検査又は診断に有用である。本発明において検査又は診断には、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、本発明のペプチド又はコンジュゲートを含む医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査又は診断であればそれらに限定されるものではない。
本発明の診断用組成物は、本発明のペプチド又はそのコンジュゲート、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。
本発明はＫＬＫ５に関わる疾患の検査方法又は診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明のペプチドの使用、該疾患の検査又は診断のための本発明のペプチドの使用、をも提供する。本発明のペプチドを含む検査又は診断用キットも本発明に含まれる。
本発明のペプチドを含む検査又は診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）等の検出方法が利用可能である。検出には抗体又はその結合断片や本発明のペプチド若しくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
本発明のペプチドを含む検査又は診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、本発明のペプチド又はコンジュゲートの蛋白質標準液、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用蛋白質、検出用蛋白質、並びに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した蛋白質量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。
また、免疫沈降法を利用した方法でも検査又は診断が可能である。
また、本発明は被検サンプル中のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を検出又は測定する方法を提供する。これらの検出又は測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを被検試料と接触させ（工程１）、次いで該ペプチド又はコンジュゲートに結合したＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の量又は測定を測定する（工程２）ことにより、該試料中のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を検出することができる。工程１としては、例えば、本発明のペプチドに免疫グロブリンのＦｃ領域をコンジュゲーションしたものをプロテインＧを介して磁気ビーズに固相化し、そこに被検試料を添加する等、工程２としては、例えば、磁気ビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した可溶性蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で解析し、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４を検出する等を挙げることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
前記のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の検出は、イン・ビトロのみならず、イン・ビボでも実施することができる。画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体で標識された本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを利用することができる。工程１としては、例えば、被験者に、標識された該ペプチド若しくはそのコンジュゲートを投与する、工程２としては、例えば、ＰＥＴ／ＣＴ等の画像診断技術を使用して画像を取り、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４の存在を判定又は検査する等を挙げることができる。
本発明の診断用組成物に含まれるペプチド又はそのコンジュゲートはＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４結合し、好適にはＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４特異的結合活性を有する。
本発明の医薬組成物が投与される個体を同定する方法も本発明に包含される。かかる同定方法においては、該個体由来サンプル中のＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４を測定し、該サンプル中に、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４が検出されたか、又は、健常個体由来サンプル中に検出されたＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４の量と比較してより多くのＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４が検出された場合に、該個体を陽性と判定することができる。当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体はＫＬＫ５関連疾患に罹患しているか又はそのリスクがある。
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
７．ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ１４の分離法
本発明のペプチド又はコンジュゲートは、好適には、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４に特異的な結合活性を有する。したがって、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４と他のＫＬＫが混在した試料中から、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４を特異的に分離することができる。ペプチド又はコンジュゲートからのＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、ＫＬＫ５、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及び／若しくはＫＬＫ１４のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
以下の実施例において、本発明の一部の態様についてさらに詳述するが、本発明はそれらに限定されない。
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８２年発刊又は１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。
実施例１．ＫＬＫ５阻害ペプチドの調製
（１－１）ＫＬＫ５阻害ペプチド発現ベクターの構築
各阻害ペプチドのヌクレオチド配列（配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１）とＳＰＩＮＫ２のヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２０秒）×３０サイクル）により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー１：５’－ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧ－３’（配列番号６２：図７０）
プライマー２：５’－ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡ－３’（配列番号６３：図７１）
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片及びｐＥＴ ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、それぞれの精製断片を室温で１０分間反応させることでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで、ｐＥＴ ３２ａ＿Ｋｅｘ２＿ＫＬＫ５阻害ペプチドを構築した。
（１－２）ＫＬＫ５阻害ペプチドの調製
（１－１）で構築したベクターで大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴ培地を用いて３７℃で培養後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１６℃で一晩培養した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてｌｙｓａｔｅを調製し、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＨｉｓ ｔａｇ融合目的蛋白質を精製した。次に、Ｋｅｘ２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ９６１４３）を用いてｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｔａｇと所望の蛋白質とを切断し、ＴＡＬＯＮを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬ）又は逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－ＡＭ）に供することで、ＫＬＫ５阻害ペプチド１４種を調製した。該誘導体の有するアミノ酸配列は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４（図１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０）に記載されている。
実施例２．ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４の調製
（２－１）ヒトＫＬＫ５、ヒトＫＬＫ７及びヒトＫＬＫ１４発現ベクターの構築
ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ５、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ７及びヒトｐｒｏ－ＫＬＫ１４のクローニングに用いたプライマー並びにＰＣＲ条件は次の通り。下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃
１０秒）×３０サイクル）により断片Ａを増幅した。
プライマー３：５’－ＧＧＣＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣ－３’（配列番号６４：図７２）
プライマー４：５’－ＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴ－３’（配列番号６５：図７３）
次に、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｙ３３７）、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ７（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ４９８６２）、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ１４（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｐ０Ｇ３）をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ６０秒）×３０サイクル）により断片を増幅した。
ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ５増幅プライマー
プライマー５：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣＴ－３’（配列番号６６：図７４）
プライマー６：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号６７：図７５）
ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ７増幅プライマー
プライマー７：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣ－３’（配列番号６８：図７６）
プライマー８：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＣＣＧＧＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＣＧＴＴ－３’（配列番号６９：図７７）
ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ１４増幅プライマー
プライマー９：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣ－３’（配列番号７０：図７８）
プライマー１０：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＣＧＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＡＴ－３’（配列番号７１：図７９）
上記で増幅した断片と断片Ａ、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅した。
プライマー５（配列番号６６：図７４）又はプライマー７（配列番号６８：図７６）又はプライマー９（配列番号７０：図７８）
プライマー１１：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴ－３’（配列番号７２：図８０）
次に、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ７（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９１ＶＥ３）、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ１４（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ８ＣＧＲ５）をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ６０秒）×３０サイクル）により断片を増幅した。
マウスｐｒｏ－ＫＬＫ７増幅プライマー
プライマー１２：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＴ
ＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧ－３’（配列番号７３：図８１）
プライマー１３：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧ－３’（配列番号７４：図８２）
マウスｐｒｏ－ＫＬＫ１４増幅プライマー
プライマー１４：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧ－３’（配列番号７５：図８３）
プライマー１５：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＧＣＴＧＡＡ－３’（配列番号７６：図８４）
増幅した所望のＤＮＡ断片、制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を用いたクローニングにより、各遺伝子のＣ末端にＨｉｓ ｔａｇが付加した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ｈＫＬＫ５、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ｈＫＬＫ７、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ｈＫＬＫ１４、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ｍＫＬＫ７、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ｍＫＬＫ１４を構築した。尚、操作は（１－１）に記載の方法に準じて行った。
（２－２）ヒトＫＬＫ５、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ７、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ１４、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ７、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ１４の発現精製
（２－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養３日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＨｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ７、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ１４、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ７、マウスｐｒｏ－ＫＬＫ１４をそれぞれ精製した。
（２－３）ヒトＫＬＫ５、ヒトＫＬＫ７、ヒトＫＬＫ１４、マウスＫＬＫ５、マウスＫＬＫ７、マウスＫＬＫ１４の調製
ＫＬＫ活性化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，０．０５%（ｗ／ｗ）Ｂｒｉｊ－３５，ｐＨ７．５）で調製した２０
０μｇ／ｍＬのｐｒｏ－ＫＬＫ７又は１４に等量の２０μｇ／ｍＬのｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを添加し、３７℃で一定時間反応後、１００ｍＭ ＥＤＴＡを等量混合することで活性化ヒトＫＬＫ７、活性化ヒトＫＬＫ１４、活性化マウスＫＬＫ７、活性化マウスＫＬＫ１４を調製した。
また、活性化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．００５%（ｗ／ｗ）Ｂｒ
ｉｊ－３５，ｐＨ８．０）で調製した２００μｇ／ｍＬのマウスＫＬＫ５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；７２３６－ＳＥ）と２μｇ／ｍＬのヒトＫＬＫ５を等量混ぜ、３７℃で２４時間反応することで活性化マウスＫＬＫ５を調製した。
実施例３．ＫＬＫ５阻害ペプチドの評価
（３－１）ＫＬＫ５阻害ペプチドのヒト／マウスＫＬＫ５、ヒト／マウスＫＬＫ７及びヒト／マウスＫＬＫ１４阻害活性評価
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したヒト／マウスＫＬＫ５、ヒト／マウスＫＬＫ７、又はヒト／マウスＫＬＫ１４と阻害ペプチドをそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各阻害ペプチドは終濃度０．０９８～１，０００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｈＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ７阻害活性評価；終濃度１μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ７、終濃度２０μＭ
基質ペプチドＭｃａ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｎｖａｌ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：図８５、アミノ酸配列は配列番号７７）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３２０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４０５ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１４阻害活性評価；終濃度０．２μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１４、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｍｏｕｓｅ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度０．２５μｇ／ｍＬ ｍｏｕｓｅＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｍｏｕｓｅ ＫＬＫ７阻害活性評価；終濃度０．５μｇ／ｍＬ ｍｏｕｓｅＫＬＫ７、終濃度７μＭ 基質ペプチドＭｃａ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｎｖａｌ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：図８５、アミノ酸配列は配列番号７７）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３２０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４０５ｎｍ
Ｍｏｕｓｅ ＫＬＫ１４阻害活性評価；終濃度０．１μｇ／ｍＬ ｍｏｕｓｅＫＬＫ１４、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
各濃度における各阻害ペプチドの基質ペプチド分解速度を算出し、阻害ペプチド濃度０ｎＭの分解速度を１００％としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、いずれの阻害ペプチドも低濃度でヒトＫＬＫ５酵素活性を阻害することが明らかとなった（表１、図２）。一部の阻害ペプチドはヒトＫＬＫ７又はヒトＫＬＫ１４酵素活性を低濃度で阻害し、また、一部の阻害ペプチドはこれらのプロテアーゼに対して弱く阻害活性を示した（表１）。当該阻害ペプチドは、マウスＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４に対しても同様の活性を示した（表２）。尚、ＩＣ５０値の算出には、独立した３回の実験の平均値を使用した。
Figure 2022130540000001
Figure 2022130540000002
（３－２）ＫＬＫ５阻害ペプチドの交差性評価
基質ペプチドの分解を指標に、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。（３－１）に記載の方法と同様、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したプロテアーゼとサンプル（終濃度１μＭ）をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。尚、プロテアーゼ活性評価にはＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を用い、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。
Ｂｏｖｉｎｅ ｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度５ｎＭ ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ；２０２３３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ
３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６４２４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｂｏｖｉｎｅ α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＬＳ００１４３４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ：図８６、アミノ酸配列は配列番号７８）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８９４６）、終濃度１０μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ：図８７、アミノ酸配列は配列番号７９）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ７０６３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０７－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍａｓｅ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ ｃｈｙｍａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８１１８）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ：図８７、アミノ酸配列は配列番号７９）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎ阻害活性評価；終濃度５０ｎＭ Ｐｌａｓｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１８６７）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０４－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６８８４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ
－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ阻害活性；終濃度０．００００１Ｕ／μＬ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ（ＯＭｅ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１５３－ｖ：図８８、アミノ酸配列は配列番号８０）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３９４６－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１４）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ２２００）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１１２－ｖ：図８９、アミノ酸配列は配列番号８１）蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｔＰＡ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ阻害活性評価；終濃度２ｎＭ ｕＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｕ０６３３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ阻害活性評価；終濃度０．１２５μｇ／ｍＬ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２４９７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＺ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９５－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１阻害活性評価；終濃度０．１μｇ／ｍＬ ＫＬＫ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２３３７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９６－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ２阻害活性評価；終濃度２μｇ／ｍＬ ＫＬＫ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２３３７－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９６－ｖ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ
３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ４阻害活性評価；終濃度１μｇ／ｍＬ ＫＬＫ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１７１９－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔ
ｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ７阻害活性評価；終濃度１μｇ／ｍＬ ＫＬＫ７、終濃度２０μＭ 基質ペプチドＭｃａ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｎｖａｌ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：図８５、アミノ酸配列は配列番号７７）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３２０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４０５ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ８阻害活性評価；終濃度５ｎＭ ＫＬＫ８（ＵｎｉＰｒｏｔ: Ｏ６０２５９，発明者らが調製）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１２阻害活性評価；終濃度０．１μｇ／ｍＬ ＫＬＫ１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；３０９５－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１３阻害活性評価；終濃度０．５μｇ／ｍＬ ＫＬＫ１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；２６２５－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ１４阻害活性評価；終濃度０．２μｇ／ｍＬ ｈＫＬＫ１４、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
（３－１）と同様、ペプチド基質の分解を指標に、ＫＬＫ５阻害ペプチドのＫＬＫ５以外のプロテアーゼに対する交差性を評価した。一部の阻害ペプチドはＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに対して阻害ペプチド終濃度１μＭで弱く交差性を示した（ＩＣ５０値は１μＭ未満）が、大半の阻害ペプチドはＫＬＫｎ（ｎ＝１、２、４、５、７、８、１２又は１４）以外のいずれのプロテアーゼに対しても阻害活性を示さなかった（図３）。一方、一部の阻害ペプチドはＫＬＫ４又はＫＬＫ１２に対して阻害ペプチド終濃度１μＭで阻害活性を示した（ＩＣ５０値は１μＭ未満）が、多くの阻害ペプチドはＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４を除くＫＬＫｎに対してもプロテアーゼ阻害活性を示さず、阻害ペプチドが高い特異性を有していることが明らかとなった。
（３－３）ＫＬＫ５阻害ペプチドのＫＬＫ５結合活性評価
ＫＬＫ５阻害ペプチドの結合親和性を測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。一本鎖ＤＮＡが固定化されたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ストレプトアビジンコンジュゲートの相補鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションでキャプチャーさせた。次に、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化したＫＬＫ５を流速１０μＬ／ｍｉｎでキャプチャーさせることで、約１０ＲＵを固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰで２倍段階希釈したＫＬＫ５阻害ペプチド（０．６２５～１０ｎＭ）をアナライトとして流速３０μＬ／ｍｉｎで添加した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）において、ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌでＳｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓを用いて解析し、ｋｏｎ及びｋｏｆｆを算出した。尚、解離定数ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出した。さらに、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）付属のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒでＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰを再生し、ビオチン化ＫＬＫ５を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のＫＬＫ５阻害ペプチドを測定した。
測定した１４種のＫＬＫ５阻害ペプチドはいずれも１ｎＭを下回るＫＤ値を示しており、非常に強い結合力であることが明らかとなった（表３（Ａ））。
Figure 2022130540000003
（３－４）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５結合活性評価
後述の（５－２）で調製したＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の結合親和性を測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。
抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体を流速２０μＬ／ｍｉｎでキャプチャーさせることで、約３０～５０ＲＵを固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰで２倍段階希釈したＫＬＫ５（０．６２５～１０ｎＭ）をアナライトとして流速３０μＬ／ｍｉｎで添加した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）において、ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌでＳｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓを用いて解析し、ｋｏｎ及びｋｏｆｆを算出した。尚、解離定数ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出した。さらに、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）付属のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５を再生し、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体へのＫＬＫ５の結合活性を測定した。
測定した１４種のＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体はいずれも１ｎＭを下回るＫＤ値を示しており、非常に強い結合力であることが明らかとなった（表３（Ｂ））。
Figure 2022130540000004
実施例４．Ｘ線結晶構造を用いたＫＬＫ５阻害ペプチドの解析
（４－１）ＫＬＫ５／ＫＬＫ５阻害ペプチド複合体の調製
（１－２）及び（２－２）に記載した方法に従って、配列番号で示されるアミノ酸配列を有するＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４、及びＫＬＫ５をそれぞれ調製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０の条件下で両者を混合後、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ）により複
合体を単離精製した。
（４－２）Ｘ線結晶構造解析
（４－１）で調製した複合体溶液を１２ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、リザーバー溶液（０．２Ｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ，２０％ＰＥＧ３３５０）と１対１で混合し、蒸気拡散法により結晶化した。得られた立方体状の単結晶を、２０％のグリセロールを含むリザーバー溶液に浸漬した後、液体窒素にて凍結した。凍結結晶をクライオ気流下でＸ線照射し、回折イメージを得た（Ｈｙｐｉｘｅｌ ６０００ＨＥ／ＭｉｃｒｏＭａｘ００７）。ＣｒｙｓＡｌｉｓＰｒｏを使用した解析により、最大分解能１．７Åのスケーリングデータを取得した。ＫＬＫ５単体（ＰＤＢ ＩＤ：２ＰＳＸ）、及びＳＰＩＮＫ２単体（ＰＤＢ ＩＤ：２ＪＸＤ）を鋳型とした分子置換法により位相を決定し、構造精密化後、分解能１．８ÅでＫＬＫ５／該ペプチドＫ５１０３４の複合体結晶を決定した。単位格子中にはＫＬＫ５とＳＰＩＮＫ２が各１分子ずつ含まれていた。ＳＰＩＮＫ２分子については、配列情報と観測された電子密度に基づき、ＫＬＫ５との相互作用部位を含む部分的な分子モデルを構築した。当該ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４はＫＬＫ５酵素活性中心を含む領域へ結合していることが認められた（図４）。
実施例５．ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の調製
（５－１）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体発現ベクターの構築
各阻害ペプチドのヌクレオチド配列（配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１）を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２０秒）×３０サイクル）により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー１６：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号８１：図８９）
プライマー１７：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴ－３’（配列番号８２：図９０）
下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃
１５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０秒）×３０サイクル）により断片Ｂを増幅した。
プライマー１８：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴ－３’（配列番号８３：図９１）
プライマー１９：５’－ＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣ－３’（配列番号８４：図９２）
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号８７）を鋳型として下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）によりヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む断片Ｃを増幅した。プライマー２０：５’－ＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣ－３’（配列番号８５：図９３）
プライマー２１：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号８６：図９４）
上記で増幅した阻害ペプチド断片と断片Ｂ、断片Ｃ、プライマー１８、プライマー２１及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅した。
さらに、制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を用いたクローニングにより、哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体を構築した。尚
、操作は（１－１）に記載の方法に準じて行った。
（５－２）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の調製
（５－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体を調製した。ＫＬＫ５阻害ペプチド内に糖鎖付加配列を有するクローンは、１残基置換により糖鎖付加配列を除去し、糖鎖除去体を示すＩＤとして「ｄＮ」を付加した。尚、糖鎖付加配列の改変はＫＬＫ５阻害活性や交差性など、何ら活性に影響は与えない。
（５－３）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃ発現ベクターの構築
ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のヌクレオチド配列（配列番号７）を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２０秒）×３０サイクル）により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー２２：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号９４：図１０４）
プライマー１７：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴ－３’（配列番号８２：図９０）
上記で増幅した阻害ペプチド断片と（５－１）で増幅した断片Ｂ、断片Ｃ、プライマー１８、プライマー２１及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅した。
さらに、制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を用いたクローニングにより、哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体を構築した。尚、操作は（１－１）に記載の方法に準じて行った。
（５－４）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃの調製
（５－３）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃを調製した。
実施例６．ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の評価
（６－１）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のヒト／マウスＫＬＫ５、ヒト／マウスＫＬＫ７及びヒト／マウスＫＬＫ１４阻害活性評価
実施例３－１に記載の方法に準じて、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の、ヒト／マウスＫＬＫ５、ヒト／マウスＫＬＫ７及びヒト／マウスＫＬＫ１４に対する阻害活性を評価した。各濃度における各阻害ペプチドＦｃ融合体の基質ペプチド分解速度を算出し、阻害ペプチドＦｃ融合体濃度０ｎＭの分解速度を１００％としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用い
て５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、いずれの阻害ペプチドＦｃ融合体も低濃度でヒトＫＬＫ５酵素活性を阻害することが明らかとなった（表４、図５、図１０７）。一部の阻害ペプチドＦｃ融合体はヒトＫＬＫ７又はヒトＫＬＫ１４酵素活性を低濃度で阻害し、また、一部の阻害ペプチドＦｃ融合体はこれらのプロテアーゼに対して弱く阻害活性を示した。阻害ペプチドＦｃ融合体は、マウスＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４に対しても同様の活性を示した（表５）。尚、ＩＣ５０値の算出には、独立した３回の実験の平均値を使用した。
Figure 2022130540000005
Figure 2022130540000006
（６－２）ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の交差性評価
（３－２）の結果と同様、一部の阻害ペプチドＦｃ融合体はｂｏｖｉｎｅ ｔｒｙｐｓｉｎ、キモトリプシン、ｐｌａｓｍｉｎに対して、阻害ペプチド終濃度１μＭで弱く交差性を示した（ＩＣ５０値は１μＭ未満）が、大半の阻害ペプチドはＫＬＫｓ以外のいずれのプロテアーゼに対しても阻害活性を示さなかった（図６）。一部の阻害ペプチドＦｃ融合体はＫＬＫ４又はＫＬＫ１２に対して終濃度１μＭで阻害活性を示した（ＩＣ５０値は１μＭ未満）が、多くの阻害ペプチドＦｃ融合体はＫＬＫ７又はＫＬＫ１４を除くＫＬＫｓに対してもプロテアーゼ阻害活性を示さなかった。よって、阻害ペプチドと同様、阻害ペプチドＦｃ融合体は高い特異性を有していることが明らかとなった。
（６－３）ペプチド基質を用いたＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性評価（阻害定数Ｋｉの算出）
ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の、ヒトＫＬＫ５に対する阻害活性を評価し、阻害定数Ｋｉを算出した。基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度２５～２００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したヒトＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅで蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ）を測定した。ヒトＫＬＫ５は終濃度１０ｎＭ、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体は終濃度０．５～２５ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート
（住友ベークライト株式会社）を使用した。
各濃度の各阻害ペプチドＦｃ融合体における基質ペプチド分解速度を算出し、阻害ペプチドＦｃ融合体濃度０ｎＭの分解速度を１００％として、各阻害ペプチドＦｃ融合体のヒトＫＬＫ５阻害活性を評価した（図１０２）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎの式に従い、酵素濃度１０ｎＭにおける最大反応速度Ｖｍａｘ及びミカエリス定数Ｋｍを算出した。さらにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの式に従い、基質濃度１００μＭにおける阻害定数Ｋｉを算出した結果、いずれのＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体も低濃度でヒトＫＬＫ５酵素活性を阻害することが明らかとなった（表６）。尚、Ｋｉ値の算出には、独立した３回の実験の平均値を使用した。
Figure 2022130540000007
（６－４）タンパク基質を用いたＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性評価
タンパク基質としてヒトＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１及びヒトＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１を用い、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性を評価した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したヒトＫＬＫ５と各ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体（Ｄ３－Ｋ５００３２ｄＮ－Ｆｃ，Ｄ３－Ｋ５００５５－Ｆｃ，Ｄ３－Ｋ５１０７２－Ｆｃ，又はＤ３－Ｋ５００１６ｄＮ－Ｆｃ）を混合し、３７℃で１時間反応させた。次に、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したタンパク基質を加えて３７℃で４時間反応させた後、還元剤を含むＳＤＳサンプルバッファーを添加し、９９℃で５分間処理することで酵素反応を停止した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元条件）及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析により、タンパク基質の分解を評価した。各基質と酵素、各阻害ペプチドＦｃ融合体、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析用抗体の組み合わせは以下の通り。
Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１を用いた評価；終濃度１μＭ ｈＫＬＫ５、終濃度０．００１～１０μＭ 阻害ペプチドＦｃ融合体、終濃度１μＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－１ Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａａ４７１－４９９）（ＬＳＢｉｏ）及びＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄｏｎｋｅｙ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１を用いた評価；終濃度０．２μＭ ｈＫＬＫ５、終濃度０．０００２～２μＭ 阻害ペプチドＦｃ融合体、終濃度２μＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ－１ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ ｔａｇ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）
ヒトＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１及びヒトＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１は、ヒトＫＬＫ５非存在下では分解されなかったが、ヒトＫＬＫ５存在下では完全に分解された。ヒトＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体をプレインキュベートして評価した結果、いずれの阻害ペプチドＦｃ融合体もヒトＫＬＫ５酵素によるヒトＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１及びヒトＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１分解活性を阻害することが明らかとなった。ヒトＫＬＫ５濃度と阻害ペプチドＦｃ融合体濃度が等しい条件において、ヒトＤｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１及びヒトＤｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ１の分解は完全に阻害された。（図１０３）。
実施例７．ネザートン症候群モデルマウスにおけるＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）上昇抑制効果
（７－１）ネザートン症候群モデルマウス
ネザートン症候群の原因遺伝子であるＳＰＩＮＫ５に変異を有するＣｒｕｓｔｙ２マウスは、ネザートン症候群のモデルマウスとして知られ、そのホモマウスＣｒｕｓｔｙ２（＋／＋）は皮膚症状を呈する（Ｍｕｔａｇｅｎｅｔｉｘ ｄａｔａｂａｓｅ）。
（７－２）ネザートン症候群モデルマウスにおけるＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＴＥＷＬ上昇抑制効果
Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／－）マウスとＣｒｕｓｔｙ２（＋／＋）マウスを人工授精で掛け合わせ、得られた産仔（Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／－）マウス又はＣｒｕｓｔｙ２（＋／＋）マウス）を用いて、（５－４）で作製したＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃを評価した。生後０又は１日後から、ＰＢＳ又は１００ｍｇ／ｋｇのＤ１－Ｋ５００５５－Ｆｃを１日おきに４週間皮下投与した。初回投与時のみローディングドーズとして３倍量のＤ１－Ｋ５００５５－Ｆｃを投与した。ＶＡＰＯ ＳＣＡＮ（ＡＳ－ＶＴ１００ＲＳ，株式会社アサヒテクノラボ）を用いて、投与２及び４週時点で、マウスの背中又は臀部の皮膚におけるＴＥＷＬを測定した（図７）。尚、ＰＢＳ投与群又はＤ１－Ｋ５００５５－Ｆｃ投与群に問わず、Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／－）マウスの例数は９、Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／＋）マウスの例数は１２であった。
Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／－）マウスに比べ、Ｃｒｕｓｔｙ２（＋／＋）マウスでは統計学的に有意なＴＥＷＬの上昇が確認され、２週齢に比べ４週齢の方がより顕著であった。投与４週後において、Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃ投与群ではＰＢＳ投与群に比し、背中及びよりシビアな臀部の両方において、統計学的に有意なＴＥＷＬの低下が見られた。以上のことから、マウスにおいてＳＰＩＮＫ５の変異に起因するＴＥＷＬ上昇が認められるのに対し、Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃが抑制作用を示すことが明らかとなり、Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃを含む本発明のペプチド及びコンジュゲートがネザートン症候群の皮膚症状の軽減に有用であることが示された。
本発明の提供するペプチド及びコンジュゲート、並びに、それを含む医薬組成物は、各種疾患の治療に有用である。
配列番号１：ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（図９）
配列番号２：ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列（図１０）
配列番号３：ヒトＫＬＫ７のアミノ酸配列（図１１）
配列番号４：ヒトＫＬＫ１４のアミノ酸配列（図１２）
配列番号５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００３２のヌクレオチド配列（図１３）
配列番号６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００３２のアミノ酸配列（図１４）
配列番号７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のヌクレオチド配列（図１５）
配列番号８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のアミノ酸配列（図１６）
配列番号９：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０７２のヌクレオチド配列（図１７）
配列番号１０：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０７２のアミノ酸配列（図１８）
配列番号１１：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００１６のヌクレオチド配列（図１９）
配列番号１２：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００１６のアミノ酸配列（図２０）
配列番号１３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４のヌクレオチド配列（図２１）
配列番号１４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０３４のアミノ酸配列（図２２）
配列番号１５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００６２のヌクレオチド配列（図２３）
配列番号１６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００６２のアミノ酸配列（図２４）
配列番号１７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０９０のヌクレオチド配列（図２５）
配列番号１８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０９０のアミノ酸配列（図２６）
配列番号１９：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００９８のヌクレオチド配列（図２７）
配列番号２０：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００９８のアミノ酸配列（図２８）
配列番号２１：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０２８のヌクレオチド配列（図２９）
配列番号２２：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０２８のアミノ酸配列（図３０）配列番号２３：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１００５のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２４：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１００５のアミノ酸配列（図３２）配列番号２５：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５００３１のヌクレオチド配列（図３３）
配列番号２６：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５００３１のアミノ酸配列（図３４）配列番号２７：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０５７のヌクレオチド配列（図３５）
配列番号２８：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＫ５１０５７のアミノ酸配列（図３６）配列番号２９：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５１０６９のヌクレオチド配列（図３７）
配列番号３０：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５１０６９のアミノ酸配列（図３８）
配列番号３１：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５００１５のヌクレオチド配列（図３９）
配列番号３２：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＫ５００１５のアミノ酸配列（図４０）
配列番号３３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３２ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（図４１）
配列番号３４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３２ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（図４２）
配列番号３５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００５５－Ｆｃのヌクレオチド配列（図４３）
配列番号３６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（図４４）
配列番号３７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０７２－Ｆｃのヌクレオチド配列（図４５）
配列番号３８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０７２－Ｆｃのアミノ酸配列（図４６）
配列番号３９：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１６ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（図４７）
配列番号４０：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１６ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（図４８）
配列番号４１：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０３４－Ｆｃのヌクレオチド配列（図４９）
配列番号４２：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０３４－Ｆｃのアミノ酸配列（図５０）
配列番号４３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００６２－Ｆｃのヌクレオチド配列（図５１）
配列番号４４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００６２－Ｆｃのアミノ酸配列（図５２）
配列番号４５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０９０－Ｆｃのヌクレオチド配列（図５３）
配列番号４６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０９０－Ｆｃのアミノ酸配列（図５４）
配列番号４７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００９８ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（図５５）
配列番号４８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００９８ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（図５６）
配列番号４９：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのヌクレオチド配列（図５７）
配列番号５０：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図５８）
配列番号５１：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１００５－Ｆｃのヌクレオチド配列（図５９）
配列番号５２：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１００５－Ｆｃのアミノ酸配列（図６０）
配列番号５３：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３１－Ｆｃのヌクレオチド配列（図６１）
配列番号５４：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００３１－Ｆｃのアミノ酸配列（図６２）
配列番号５５：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０５７－Ｆｃのヌクレオチド配列（図６３）
配列番号５６：ＫＬＫ５／ＫＬＫ７阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０５７－Ｆｃのアミノ酸配列（図６４）
配列番号５７：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０６９ｄＮ－Ｆｃのヌクレオチド配列（図６５）
配列番号５８：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０６９ｄＮ－Ｆｃのアミノ酸配列（図６６）
配列番号５９：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１５－Ｆｃのヌクレオチド配列（図６７）
配列番号６０：ＫＬＫ５／ＫＬＫ１４阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５００１５－Ｆｃのアミノ酸配列（図６８）
配列番号６１：ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの一般式（図６９）
配列番号６２：プライマー１のヌクレオチド配列（図７０）
配列番号６３：プライマー２のヌクレオチド配列（図７１）
配列番号６４：プライマー３のヌクレオチド配列（図７２）
配列番号６５：プライマー４のヌクレオチド配列（図７３）
配列番号６６：プライマー５のヌクレオチド配列（図７４）
配列番号６７：プライマー６のヌクレオチド配列（図７５）
配列番号６８：プライマー７のヌクレオチド配列（図７６）
配列番号６９：プライマー８のヌクレオチド配列（図７７）
配列番号７０：プライマー９のヌクレオチド配列（図７８）
配列番号７１：プライマー１０のヌクレオチド配列（図７９）
配列番号７２：プライマー１１のヌクレオチド配列（図８０）
配列番号７３：プライマー１２のヌクレオチド配列（図８１）
配列番号７４：プライマー１３のヌクレオチド配列（図８２）
配列番号７５：プライマー１４のヌクレオチド配列（図８３）
配列番号７６：プライマー１５のヌクレオチド配列（図８４）
配列番号７７：ＫＬＫ７基質ペプチド（図８５）中のアミノ酸配列
配列番号７８：ウシα－キモトリプシン基質ペプチド（図８６）中のアミノ酸配列
配列番号７９：ニュートロフィル・エラスターゼ基質ペプチド（図８７）中のアミノ酸配列
配列番号８０：ヒトプロテインＣ基質ペプチド（図８８）中のアミノ酸配列
配列番号８１：プライマー１６のヌクレオチド配列（図８９）
配列番号８２：プライマー１７のヌクレオチド配列（図９０）
配列番号８３：プライマー１８のヌクレオチド配列（図９１）
配列番号８４：プライマー１９のヌクレオチド配列（図９２）
配列番号８５：プライマー２０のヌクレオチド配列（図９３）
配列番号８６：プライマー２１のヌクレオチド配列（図９４）
配列番号８７：ヒトＩｇＧ１のＦｃのアミノ酸配列（図９５）
配列番号８８：ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ８のアミノ酸配列（図９６）
配列番号８９：ヒトＳＰＩＮＫ５のＤ９のアミノ酸配列（図９７）
配列番号９０：ヒトＳＰＩＮＫ９のアミノ酸配列（図９８）
配列番号９１：マウスＫＬＫ５のアミノ酸配列（図９９）
配列番号９２：マウスＫＬＫ７のアミノ酸配列（図１００）
配列番号９３：マウスＫＬＫ１４のアミノ酸配列（図１０１）
配列番号９４：プライマー２２のヌクレオチド配列（図１０４）
配列番号９５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのヌクレオチド配列（図１０５）
配列番号９６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（図１０６）

Claims (36)

  1. 配列番号３０又は３２（図３８又は４０）で示されるアミノ酸配列を含み、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性及びヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド。
  2. ３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項１記載のペプチド。
  3. 請求項１又は２記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  4. 請求項３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  5. 請求項３記載のポリヌクレオチド若しくは請求項４記載のベクターを含むか又は請求項１又は２記載のペプチドを産生する細胞。
  6. 下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、活性型ＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性を阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
    （ｉ）請求項５記載の細胞を培養する工程；
    （ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程。
  7. 請求項１又は２記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、活性型ＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性を阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法。
  8. 請求項６又は７記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド。
  9. 請求項１、２及び８のいずれか一つに記載の第１ペプチドに１つ又は２つ以上の任意の部分が結合してなるコンジュゲート。
  10. １つの任意の部分が、ＳＰＩＮＫ２変異体ではない第２ペプチドを含む、請求項９記載のコンジュゲート。
  11. 第２ペプチドが、第１ペプチドのアミノ末端側に位置する、請求項１０記載のコンジュゲート。
  12. 第２ペプチドが、第１ペプチドのカルボキシル末端側に位置する、請求項１０記載のコンジュゲート。
  13. 第２ペプチドが抗体又はその断片であり、且つ１つ又は２つ以上のＦｃ領域を含む、請求項１２記載のコンジュゲート。
  14. Ｆｃ領域がヒト免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片である、請求項１３記載のコンジュゲート。
  15. Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、請求項１３又は１４記載のコンジュゲート。
  16. Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域又はその断片である、請求項１３乃至１５のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
  17. ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が、配列番号８７（図９５）で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６記載のコンジュゲート。
  18. Ｆｃ領域が野生型又は変異型である、請求項１３乃至１５のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
  19. アミノ末端に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が付加してなる、請求項９乃至１８のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
  20. 下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含み、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性及びヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害する、請求項９、１０、１２乃至１９のいずれか一つに記載のコンジュゲート：
    （ｉ）配列番号５８又は６０（図６６又は６８）で示されるアミノ酸配列；
    （ｉｉ）配列番号５８又は６０（図６６又は６８）で示されるアミノ酸配列から１又は２アミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）配列番号５８又は６０（図６６又は６８）で示されるアミノ酸配列と９８％以上同一のアミノ酸配列。
  21. 第１ペプチド及び第２ペプチドが、リンカーを介して結合している、請求項１０及び１２乃至２０のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
  22. リンカーが、第１ペプチド及び第２ペプチドではない第３ペプチドである、請求項２１記載のコンジュゲート。
  23. 下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、請求項９、１０及び１２乃至２２のいずれか一つに記載のコンジュゲートの製造方法：
    （ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程；
    （ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートを回収する工程。
  24. 請求項９、１０及び１２乃至２２のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
  25. 請求項２３又は２４記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート。
  26. 請求項１、２又は８記載のペプチド、請求項３記載のポリヌクレオチド、請求項４記載のベクター、請求項５記載の細胞、及び／又は、請求項９、１０、１２乃至２２及び２５のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物。
  27. 請求項１、２又は８記載のペプチド、請求項３記載のポリヌクレオチド、請求項４記載のベクター、請求項５記載の細胞、並びに／又は、請求項９、１０、１２乃至２２及び２５のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
  28. ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊
    髄損傷、がん又はＢａｒｒｅｔｔ食道の治療又は予防のための、請求項２７記載の医薬組成物。
  29. 他の医薬品と組み合わせて使用される、請求項２７又は２８記載の医薬組成物。
  30. 請求項１記載のペプチドに特異的に結合する抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、請求項６、７、２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
  31. 配列番号５８（図６６）で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列から１もしくは２アミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含み、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性及びヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害するコンジュゲート。
  32. 配列番号６０（図６８）で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列から１もしくは２アミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含み、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性及びヒトＫＬＫ１４の有するプロテアーゼ活性を阻害するコンジュゲート。
  33. 請求項３１記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
  34. ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はＢａｒｒｅｔｔ食道の治療又は予防のための、請求項３３記載の医薬組成物。
  35. 請求項３２記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
  36. ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん又はＢａｒｒｅｔｔ食道の治療又は予防のための、請求項３５記載の医薬組成物。
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