JP2022120380A

JP2022120380A - ｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体及びその利用

Info

Publication number: JP2022120380A
Application number: JP2021017235A
Authority: JP
Inventors: 幸博赤尾; Yukihiro Akao
Original assignee: Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2022-08-18

Abstract

【課題】実用的なｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を提供する。【解決手段】実用的なｍｉＲ１３３－ｂ誘導体として、ある特定の配列で表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第１の一本鎖と、それぞれ異なる１１種の特定の塩基配列のいずれかで表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第２の一本鎖と、を備えている、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体とする。さらに、前記第１の一本鎖のオリゴリボヌクレトチドと第２の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドとは、ヌクレオシド誘導体を含んでよい。【選択図】なし

Description

本明細書は、ｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体及びその利用等に関する。

種々の目的から、特定の遺伝子の発現を抑制する種々の核酸製剤が開発されている。なかでも、ＲＮＡを有効成分とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡは、特定の疾患に関連する遺伝子の発現を抑制することができるというメリットがある。なかでもmiＲＮＡ医薬は、疾患に関連する複数のmessenger RNA (mRNA)を標的とし、増殖に関わるカスケード全体を破綻させる、さらに薬剤への抵抗性（耐性）が生じにくいというメリットがある。

がん細胞は、解糖系に偏ったエネルギー代謝により増殖していることがわかっており、こうした現象は、ワーバーグ効果と称されている。がん細胞では、ＰＫＭ２（protein Kinase Muscle 2）の発現が亢進しており、それにより、解糖系を活性化している、このＰＫＭ２タンパク質の発現を上昇させているのがＰＴＢＰ１（Polypyrimidine Tract-binding Protein 1）であることが報告されている（非特許文献１、２、３、４）。

本発明者らは、ＰＴＢＰ１を標的とするｍｉｃｒｏＲＮＡｓ（ＰＴＢＰ１関連ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ）に着目し、臨床サンプルや細胞株を確認した結果、ＰＴＢＰ１は腫瘍で高発現するがん遺伝子であることを明らかにしてきた（非特許文献２、４）。そして、ＰＴＢＰ１を標的とするｍｉｃｒｏＲＮＡ１３３－ｂがＰＴＢＰ１遺伝子の発現を抑制することで、ＰＫＭの発現をＰＫＭ２からＰＫＭ１にシフトさせ、その結果、がん細胞のエネルギー代謝機構（ワーバーグ効果）が崩壊し、細胞死が誘導されることも報告してきた（非特許文献２、４）。

Scientific Reports, 5:8647, DOI: 10.1038/step08647、 2015 Oncotarget, Vol.7, No.14, 18940-18952, 2016 Int, J. Mol. Sci. 2018, 19, 1276 Cancer science, DOI: 10.1111/cas.14694, 2020

本発明者らは、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現をより一層効果的に抑制するｍｉＲＮＡ医薬の開発を試みているが、ＲＩＳＣへの取り込みの効率を向上させるようにｍｉＲＮＡをデザインすることについては、明確な手法があるわけではなかった。

本明細書は、ＰＴＢＰ１遺伝子をターゲットとするｍｉＲＮＡを有効成分とする発現抑制剤を提供する

本発明者らは、ＰＴＢＰ１遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ１３３－ｂの塩基配列について種々の検討を行ったところ、特定の配列を備えるｍｉＲＮＡがスプライサーであるＰＴＢＰ１遺伝子の発現を効果的に抑制できることがわかった。また、ＰＫＭ２からＰＫＭ１へ発現をシフトさせることができることも見出した。本明細書はこの知見に基づき以下の手段を提供する。

［１］配列番号１で表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第１の一本鎖と、
配列番号３～１３のいずれかで表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第２の一本鎖と、
を備えている、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［２］さらに、前記第１の一本鎖のオリゴリボヌクレトチドと第２の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドとは、それぞれ以下の修飾（１）～（３）；
（１）ヌクレオシド誘導体を含む、
（２）修飾されたヌクレオシド間結合を備える
（３）その３’末端に、以下の式で表される、修飾されていてもよいベンゼン－ピリジン骨格の少なくとも１個を備える

から選択される１種又は２種以上を備える、［１］に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［３］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、少なくともその３’末端に１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、［２］に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［４］前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、少なくともその３’末端に１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、［２］又は［３］に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［５］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を有する、［２］～［４］のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［６］前記第１の一本鎖と第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、それぞれその３’末端に、１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、［２］～［５］のいずれかに記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［７］前記第１の一本鎖と第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、それぞれその３’末端に、１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備える、［２］～［６］のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［８］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに前記ホスホロチオエート結合を、５個以上１０個以下備える、［７］に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［９］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、
前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、ＧＧをさらに備え、
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から少なくとも１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間に、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備える、［２］～［６］のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［１０］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３末端から連続して１２個以上の前記ホスホロチオエート結合を備える、［９］に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［１１］前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに前記ホスホロチオエート結合を、５個以上１０個以下備える、［９］に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［１２］前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列を有する、［６］～［１１］のいずれかに記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
［１３］さらに、前記第１の一本鎖と前記第２の一本鎖は、それぞれ、前記オリゴリボヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドの２’位の炭素原子にハロゲン原子又はアルコキシ基が連結されている、［１］～［１２］のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
［１４］［１］～［１３］のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体を有効成分とする医薬組成物。

ｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体のガイド鎖とパッセンジャー鎖との概要を示す図である。Ｒｈ３０細胞及びＤＬＤ－１細胞によるｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体の評価結果（生細胞率％）を示す図である。Ｒｈ３０細胞及びＤＬＤ－１細胞によるｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体の評価結果（生細胞率％）を示す他の図である。Ｒｈ３０細胞及びＤＬＤ－１細胞によるｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体の評価結果（生細胞率％）を示す他の図である。Ｒｈ３０細胞によるｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体の評価結果（生細胞率％）を示す他の図である。Ｒｈ３０細胞によるｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体のウェスタンブロッティングによる評価結果（ＰＴＢＰ１タンパク質量、ＰＫＭ１、ＰＫＭ２タンパク質量）を示す図である。

本明細書の開示は、ｍｉＲＮＡ１３３０ｂ（ｍｉＲ１３３－ｂ）誘導体及びその利用等に関する。本明細書に開示される、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体（以下、単に、本誘導体という。）は、特定の塩基配列等を有するパッセンジャー鎖（第２の一本鎖）を備えるため、効果的にＰＴＢＰ１遺伝子の発現を抑制し、がん細胞の主たるエネルギー代謝を遮断してアポトーシスに導くことができる。

本誘導体は、ｍｉＲ１３３－ｂのパッセンジャー鎖の配列を少なくとも改変し、さらに、ガイド鎖（第１の一本鎖）及びパッセンジャー鎖（第２の一本鎖）に対して必要に応じて化学修飾を加えることで、生体（体液）におけるＲＮＡ分解システムを回避し、また、ＲＩＳＣへの取り込み性を改善などすることにより、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。

本誘導体は、後述する医療用途のほか、非医療用途として、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現やＰＫＭ２の発現抑制などの研究用試薬としても有用である。

本誘導体は、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現を抑制することができる。本誘導体によれば、がん細胞が主として利用する解糖系によるエネルギー代謝を遮断することができるため、がん細胞の増殖をより選択的にあるいは効果的に抑制することができ、腫瘍を予防又は治療するための医薬組成物として有用である。また、本誘導体は、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現によるＰＫＭ２の発現亢進に関連した疾患を治療又は予防するための医薬組成物として有用である。

以下、本誘導体及びその利用に関し、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。

（本誘導体）
図１に、本誘導体の二次構造の概略を示す。なお、ｍｉＲＮＡにおける、塩基ミスマッチによるループ構造は、便宜的にパッセンジャー鎖においてのみ表示するが、本誘導体の二次構造はこうした表示に拘束されるものではない。

本誘導体は、ガイド鎖がｍＲＮＡと結合してＲＮＡ干渉により蛋白発現を抑制するためガイド鎖の塩基配列は変えず、ｍｉＲ１３３－ｂのパッセンジャー鎖の塩基配列の一部を少なくとも改変しているｍｉＲ１３３－ｂ誘導体である。これらは２本鎖構造が変わることで抗がん活性、ＲＮａｓｅ耐性が変わる可能性がある。ここで、ｍｉＲＮＡ１３３－ｂは、公知のｍｉＲＮＡであり、天然型のヒトｍｉＲ１３３－ｂとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列（５’－ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＴＡ－３’）を有する一本鎖ＲＮＡであるか、又は当該一本鎖ＲＮＡと配列番号２（５’－ＵＧＧＣＵＧＧＵＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧ－３’）で表される塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡとが互いに相補塩基でハイブリダイズした二本鎖ＲＮＡなどが少なくとも挙げられる。なお、ヒトｍｉＲ１３３－ｂのガイド鎖は、３’末端に、５’末端側から３’末端に、ＣＡの塩基配列からなる突出末端を有し、パッセンジャー鎖は、その３’末端に、５’末端側から３’末端に、ＵＣの塩基配列からなる突出末端を有している。

本誘導体は、第１の態様として、ｍｉＲＮＡを構成するＲＮＡ二本鎖のうち、ガイド鎖である第１の一本鎖と、パッセンジャー鎖である第２の一本鎖と、を備えることができる。以下、第１の一本鎖を、ガイド鎖とも称し、第２の一本鎖を、パッセンジャー鎖とも称する。

（ガイド鎖）
ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を有している。ガイド鎖が有する配列番号１で表される塩基配列は、ヒトｍｉＲ１３３－ｂのガイド鎖の塩基配列に対応している。ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドが有する塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列のほか、当該塩基配列において１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は追加を有する塩基配列であってもよい。このような塩基の置換等は、例えば、１～４個であり、また例えば、１～３個であり、また例えば、１又は２個であり、また例えば、１個である。

ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドが有する塩基配列は、少なくともヒトＰＴＢＰ１遺伝子の発現抑制のために必要であると考えられ、かかる塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列ほか、当該塩基配列を改変した配列であっても、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体としての活性を有し、がん細胞の増殖抑制に貢献できる。ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体の活性の有無や程度については、後述する実施例に開示する方法にて評価することができ、当該評価に基づいて、ガイド鎖が有するべき塩基配列を決定することができる。

ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を有するが、前記塩基配列の３’末端側には、さらに、適宜、適数個のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどの天然塩基を備えるヌクレチド、ヌクレオシド誘導体、及び後段にて説明するベンゼン－ピリジン骨格を備えることができる。こうした突出末端は、二本鎖形態の本誘導体において、一本鎖領域を形成することができ、典型的には、例えば、１～４個、また例えば、１～３個、また例えば、２個である。こうした３’末端については、後段で説明する。

本誘導体のガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドとしての長さは、パッセンジャー鎖と同じであっても異なっていてもよい。例えば、ガイド鎖の長さは、３０塩基以下である。例えば、１５～３０塩基、２０～２５塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基又は２５塩基である。

（パッセンジャー鎖）
パッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドは、配列番号３～１３のいずれかの配列番号で表される塩基配列を有する。配列番号３～１３で表される塩基配列は、いずれも、本発明者らが新たに見出した、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現抑制効果等により、がん細胞の増殖抑制に有効であったパッセンジャー鎖が有する塩基配列である。パッセンジャー鎖が有する塩基配列は、配列番号３～１３で表される塩基配列のほか、当該各塩基配列において１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は追加を有する塩基配列であってもよい。このような塩基の置換等は、例えば、１～４個であり、また例えば、１～３個であり、また例えば、１又は２個であり、また例えば、１個である。

パッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドは、例えば、配列番号１で表される塩基配列（３’末端のダングリングエンドに対応する塩基配列を含まず。）からなるガイド鎖とハイブリダイズしたときに、１個又は数個のミスマッチを備えることができる。天然のｍｉＲ１３３－ｂのパッセンジャー鎖（配列番号２）（３’末端のダングリングエンドに対応する塩基配列を含まず。）は、配列番号１で表されるガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドに対して５つのミスマッチ（配列番号１で表される塩基配列の５’末端から１位，７位、１０位，１３位及び１４位に対応する位置）を備えている。パッセンジャー鎖のミスマッチ数は、例えば、１～３個であり、また例えば、１～２個である。配列番号３～１３で表される塩基配列におけるミスマッチ数は、２個（配列番号３，配列番号４，配列番号１１）、３個（配列番号５～７、１２～１３）、４個（配列番号９～１０）である。なお、これらのミスマッチ数は、配列番号１で表される塩基配列の５’末端から第１位の塩基に対するミスマッチを含んでいる。

パッセンジャー鎖が備えるミスマッチは、ガイド鎖が有する配列番号１で表される塩基配列の５’末端から例えば１０位以内に備えることができ、また例えば、８位以内、また例えば、７位以内、また例えば、５位以内、また例えば、３位以内において備えることができる。この場合のミスマッチ数は、１～２個または１個とすることができる。

パッセンジャー鎖が有する塩基配列は、ガイド鎖が少なくともヒトＰＴＢＰ１遺伝子の発現抑制のために必要であると考えられる。パッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドのかかる塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列ほか、当該塩基配列を改変した配列であっても、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体としての活性を有し、がん細胞の増殖抑制に貢献できる。ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体の活性の有無や程度については、後述する実施例に開示する方法にて評価することができ、当該評価に基づいて、パッセンジャー鎖が有するべき塩基配列を決定することができる。

なお、上記表においては、上段がガイド鎖（第１の鎖）、下段がパッセンジャー鎖（第２の鎖）の配列を示すとともに、末端構造（ダングリングエンド）も示す。また、Ｎ（大文字）はＲＮＡを、Ｎ（小文字）はＤＮＡを、Ｎ_mは２’－ＯＭｅＲＮＡを示す。

また、＊は、以下のホスホロチオエート結合を表し、

を表し、

また、ＢｕＰ（ベンゼン－ウレア－ピリジン）及びＰｕＢは、いずれも、以下の構造：

を表す（いずれも、ピリジン（Ｐ）が、３’末端（上記式中右側）に配置され、５’側（上記式中左側）にベンゼン（Ｂ）が配置され、ベンゼン側にガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端側に連結される）。なお、ベンゼン環及びピリジン環の炭素原子に結合した水素原子は、炭素数１～４のアルキル基などによって置換されて修飾されていてもよい。

パッセンジャー鎖も、ガイド鎖と同様、特定された塩基配列の３’末端側には、さらに、、適宜、適数個のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどの天然塩基を備えるヌクレチド、ヌクレオシド誘導体、後段にて説明する、ベンゼン－ピリジン骨格を備えることができる。こうした突出末端は、二本鎖形態の本誘導体において、一本鎖領域を形成することができ、典型的には、例えば、１～４個、また例えば、１～３個、また例えば、２個である。

本誘導体のパッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドとしての長さは、ガイド鎖と同じであっても異なっていてもよい。例えば、パッセンジャー鎖の長さは、３０塩基以下である。例えば、１５～３０塩基、２０～２５塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基又は２５塩基である。

（本誘導体が備えることができる修飾）
本誘導体のガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、それぞれ上記した塩基配列を有する一本鎖オリゴリボヌクレオチドを備えているが、それぞれのオリゴリボヌクレオチドは、ＲＩＳＣへの取り込みやすさ、生体内におけるＲＮＡａｓｅ抵抗性などに影響されることとなる標的遺伝子の発現抑制能の向上のために以下の修飾（１）～（３）から選択されるいずれか又は２種以上を備えることができる。

オリゴヌクレオチドは、
（１）ヌクレオシド誘導体を含むことができる
（２）修飾されたヌクレオシド間結合を備えることができる
（３）その３’末端側に、少なくとも１個のベンゼン－ピリジン誘導体をさらに備えている

（ヌクレオシド誘導体）
「ヌクレオシド誘導体」は、ヌクレオシドの核酸塩基部分及び／又は糖部分（リボース）において、人工的な修飾がなされたヌクレオシドを意味している。本誘導体に適用できるヌクレオシド誘導体は、当該分野において当業者に知られている修飾であれば、適宜適用可能である。

なお、当該分野で公知のヌクレオチドの修飾及び修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第２０００／０５６７４８号、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開第２０１４／１１２４６３号、国際公開第２０１４／１２６２２９号等。

核酸塩基の修飾としては、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－プロピニルシトシン等が挙げられる。

また、「ヌクレオシド誘導体」には、式：

（式中、Ｘは水素又はＯＨである）
で示される核酸塩基が欠失した誘導体（Ａｂａｓｉｃ）も含まれる。

さらに、糖部位に修飾を有する「ヌクレオシド誘導体」としては、式：

（式中、Ｂ_X3は、修飾されていてもよい核酸塩基である。）
で示される糖が開環した基も含まれる。その他、２’，５’－ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８，３７，７４７８－７４８６）も含まれる。

糖部分の修飾としては、例えば、糖の２’位の置換が挙げられる。具体的には、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ₃（２’－ＯＭｅ）、２’－ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃（２’－ＭＯＥ）等である。

（修飾されたヌクレオシド間結合）
「修飾されたヌクレオシド間結合」とは、天然のオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間の結合（糖と糖の間の結合）であるホスホジエステル（Ｄ－オリゴ）結合が、人工的に修飾された結合又はリン原子を有していない結合を意味する。ヌクレオシド間結合として当該分野で公知の結合であれば、いずれも利用可能である。人工的に修飾がなされた結合としては、ホスホロチオエート（Ｓ－オリゴ）結合、メチルホスホネート（Ｍ－オリゴ）結合、ボラノホスホネート結合等が挙げられる。

修飾されたヌクレオシド間結合としては、また、国際公開第２０１３／０２２９６６号、国際公開第２０１１／００５７６１号、国際公開第２０１４／０１２０８１号、国際公開第２０１５／１２５８４５号等に記載の結合も利用可能である。リン原子を有していない結合としては、アルキル、非芳香族炭素環式基、ハロアルキル、ハロゲンで置換された非芳香族炭素環式基等から誘導される二価の置換基が挙げられる。例えば、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、メチレンギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、アルケニル、スルファマート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホナート、スルホンアミド、アミド等から誘導される二価の置換基である。オリゴヌクレオチド中、全て同じ結合でもよいし、異なる結合を含んでいてもよい。

こうした「修飾されたヌクレオシド間結合」は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のいずれの部位において備えられていてもよい。例えば、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの全ヌクレオシド間が修飾されていてもよい。また、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端から１２個のヌクレオシド（３’末端修飾としてＧＧやＢｕＰを備える場合には、当該ＧやＢもここに含めるものとする。）に関し、これらヌクレオシド又はその誘導体間の結合である１１個のヌクレオシド間結合のうち、例えば、５個以上、また例えば、６個以上、また例えば、７個以上、また例えば、８個以上、また例えば、９個以上、また例えば、１０個以上、また例えば、１１個のヌクレオシド結合を備えるようにしてもよい。これらのヌクレオシド間結合は、ガイド鎖の３’末端側から連続していてもよいし不連続であってもよいが、例えば５個以上、また例えば、６個以上、また例えば、７個以上、また例えば、１０個以上、また例えば１１個を連続して備えることもできる。こうすることで、エキソヌクレアーゼ抵抗性を向上させることができる場合がある。

さらに、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端から１２個（３’末端修飾としてＧＧやＢｕＰを備える場合には、当該ＧやＢも含めるものとする。）のヌクレオシド又はその誘導体以降の５’末端側においても、修飾されたヌクレオシド間結合を備えていてもよい。かかる領域において、例えば、１個以上、また例えば、２個以上、また例えば、３個以上、また例えば、５個以上、また例えば、６個以上、また例えば、７個以上、また例えば、８個以上、また例えば、９個以上、また例えば、１０個以上、また例えば、１１個のヌクレオシド結合を備えるようにしてもよい。これらのヌクレオシド間結合は、連続していてもよいし不連続であってもよいが、例えば５個以上、また例えば、６個以上、また例えば、７個以上、また例えば、１０個以上、また例えば１１個を連続して備えることもできる。こうすることで、ヌクレアーゼ抵抗性を向上させることができる場合がある。

また、修飾されたヌクレオシド間結合は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の、例えば突出末端などとしての３’末端修飾にも適用される。修飾されたヌクレオシド間結合を備える３’末端は、１個又は２個以上の修飾されたヌクレオシド間結合で連結された、例えば１個～５個、また例えば、１個～４個、また例えば、１個～３個のデオキシリボヌクレオシドを備えることができる。こうした３’末端におけるヌクレオチドは、天然のデオキシリボヌクレオチド、天然のリボヌクレオチドのほか、既述のヌクレオシド誘導体であってもよいし、後述するベンゼン－ピリジン誘導体であってもよい。例えば、２個のデオキシリボヌクレオチドを備える突出末端は、以下の式（３）で表される。以下の式中の５’末端側のヌクレオシド間結合（Ｙ１を含む結合）は、例えば、配列番号１で表される塩基配列の３’末端のヌクレオシド又はその誘導体に連結される酸素原子に連結されることになる。

（式中、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。Ｙ¹及びＹ²は、それぞれ独立してＯ又はＳである。）

（ベンゼン－ピリジン骨格）
「ベンゼン‐ピリジン骨格」とは以下の式（４）で表される単位を意味する。ベンゼン－ピリジン骨格は、適宜修飾されていてもよい。ベンゼン－ピリジン骨格は、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端の少なくとも一部を構成することができる。以下の式（４）中の５’末端側（図中左側）の結合は、例えば、ガイド鎖やパッセンジャー鎖の特定塩基配列の３’末端のヌクレオシド又はその誘導体の５’位炭素原子に結合する酸素原子に連結されることになる。

（式中、Ｘ³及びＸ⁴は、それぞれ独立してＮ又はＣＨを表し、Ｚは、

を表し、Ｙ³及びＹ’は、それぞれ独立してＯ又はＳを表す。）

こうしたベンゼンーピリジン骨格の具体例及びその調製方法は、国際公開第２０１１／０７１０７８号等に記載されている。

ベンゼン－ピリジン骨格は、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端、パッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端のいずれに備えられていてもよい。例えば、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端にのみ備えられていてもよいし、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端に備えられていてもよい。また、ベンゼン－ピリジン骨格は、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端において、少なくとも１個（単位）を備えるが、さらに、ホスホロチオエート結合やホスホジエステル結合などで２個以上が連結されていてもよい。

以下に、本誘導体における好適なガイド鎖及びパッセンジャー鎖について、さらに説明する。

（ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端にのみベンゼン－ピリジン骨格を備える本誘導体）
本誘導体は、例えば、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、パッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、ＧＧをさらに備え、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から少なくとも１１個のヌクレオシドにおけるヌクレオシド間において、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備えることが好適である。こうした本誘導体は、上皮細胞から発生するがん細胞や骨や筋肉などの非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から連続するヌクレオシド間に、例えば、連続又は不連続で、１２個以上のホスホロチオエート結合、また例えば、３’末端から連続するヌクレオシド間の全てにホスホロチオエート結合を備えることができる。かかる本誘導体は、上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

また、この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個以内のヌクレオシド間にのみにホスホロチオエート結合を、例えば、連続して又は不連続で５個以上１０個以下、また例えば、６個以上９個以下、また例えば、６個以上８個以下、また例えば、７個備えることができる。かかる誘導体は、上皮細胞及び非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。なかでも、非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

また、この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から連続また例えば不連続でホスホロチオエート結合を、例えば、連続して又は不連続で１１個以上２１個以下、また例えば、１４個以上１８個以下備えることができる。かかる誘導体は、上皮細胞及び非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

（ガイド鎖及びパッセンジャー鎖のオリゴリボヌクレオチドの３’末端にベンゼン－ピリジン骨格を備える本誘導体）
本誘導体は、例えば、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、他の修飾を備えない構成とすることができる。こうした本誘導体は、上皮細胞から発生するがん細胞や骨や筋肉などの非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。なかでも、非上皮細胞から発生するがんに特に有効な場合がある。

また、本誘導体は、例えば、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各オリゴリボヌクレオチドの３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から少なくとも１１個のヌクレオシドにおけるヌクレオシド間において、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備えることが好適である。こうした本誘導体は、上皮細胞から発生するがん細胞や骨や筋肉などの非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から連続するヌクレオシド間に、例えば、連続又は不連続で１２個以上のホスホロチオエート結合、また例えば、３’末端から連続するヌクレオシド間の全てにホスホロチオエート結合を備えることができる。かかる本誘導体は、上皮細胞及び非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。

また、この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個以内のヌクレオシド間にのみにホスホロチオエート結合を、例えば、連続して又は不連続で５個以上１０個以下、また例えば、６個以上９個以下、また例えば、６個以上８個以下、また例えば、７個備えることができる。かかる誘導体は、上皮細胞及び非上皮細胞から発生するがん細胞にとても有効である場合がある。

また、この態様においては、ガイド鎖のオリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から連続又は不連続で、１１個以上２１個以下、また例えば、１４個以上１８個以下備えることができる。かかる誘導体は、上皮細胞及び非上皮細胞から発生するがん細胞に有効である場合がある。また、かかる誘導体は、非上皮細胞から発生するがん細胞により有効である場合がある。

本誘導体のパッセンジャー鎖は、例えば、配列番号３で表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを備えていることが好適である。本発明者らによれば、かかるオリゴリボヌクレオチドは、上皮細胞及び非上皮細胞に由来するがんに有効であろうと考えられる。また、他のオリゴリボヌクレオチドも、天然のｍｉＲ１３３－ｂに比較して、上皮細胞及び／又は非上皮細胞に由来するがんに有効である。

なお、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、特段、上記（ａ）の修飾を有していなくてもよく、また、それぞれの５’末端側（鎖全体のヌクレオシド又はその誘導体の全数のうち、５’末端から、前記全数の半数に相当するヌクレオシド又はその誘導体までの領域、以下、同じ。）には、上記（ａ）～（ｃ）の修飾備えていなくてもよい。

本発明のｍｉＲ－１４３誘導体中のガイド鎖及びパッセンジャー鎖のオリゴヌクレオチドは、当該分野の常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、下記実施例１、特許文献１、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２２，１８５９－１８６２（１９８１）等に開示されている。

合成されたガイド鎖及びパッセンジャー鎖は、例えば、後述する実施例１に開示されているような公知の方法でハイブリダイズさせることにより二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。

本明細書の開示は、本誘導体を含有する医薬組成物（以下、単に本医薬組成物ともいう。）も包含する。本医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知のｍｉＲＮＡの投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。ｍｉＲＮＡの投与方法及び製剤は、例えば、以下の文献にも開示されている。
ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，１３，６２２－６３８（２０１４）特許文献１、国際公開第２０１０／０５０３２８号、国際公開第２０１１／０６４１３０号、国際公開第２０１１／１５３５４２号、国際公開第２０１３／１６３２５８号、国際公開第２０１３／１９２４８６号等。

本医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、又は治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、又は、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射若しくは点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は皮下投与である。

本医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。

本医薬組成物は、本発明のｍｉＲ－１３３-b誘導体の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。

賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム又は結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。

本誘導体の標的細胞内への導入を促進するために、本医薬組成物は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることができる。

本医薬組成物の投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、又は、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における薬剤蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、及び、繰り返し頻度を定めることができる。最適用量は、個々の本誘導体の相対的効力に応じて変動するが、一般に、インビトロ及びインビボの動物実験におけるＩＣ₅₀又はＥＣ₅₀に基づいて計算することが可能である。例えば、本誘導体の分子量と、例えば、ＩＣ₅₀のような効果的用量（実験的に導かれる）が与えられたならば、ｍｇ／ｋｇで表される用量が通例にしたがって計算される。

本医薬組成物は、細胞増殖抑制効果を有するため、細胞増殖が関連する疾患の予防又は治療のために用いることができる。本発明の医薬組成物は、特に、癌の治療又は悪性化の抑制のために用いることができる。「癌」としては、ヒ卜、愛玩動物、家畜等が罹患する癌であれば特に限定されない。固形癌であっても浸潤癌であってもよく、上皮細胞から発生するがんや非上皮細胞から発生する肉腫であってもよい。例えば、乳癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮体癌、前立腺癌、子宮頸癌、脳腫瘍、胚細胞腫瘍（精巣腫瘍、卵巣腫瘍、性腺外腫瘍）、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫等が挙げられる。

以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明するが、以下の説明は、本明細書の開示を限定するものではない。
［オリゴヌクレオチドの合成及びｍｉＲＮＡの準備］

以下の実施例においては、天然のヒトｍｉＲ１３３－ｂのガイド鎖に対して種々の塩基配列のパッセンジャー鎖を合成してこのパッセンジャー鎖をハイブリダイズさせることで種々のｍｉＲＮＡを準備した。以下には、まず、オリゴヌクレオチドの合成について説明する。

＜オリゴヌクレオチドの合成＞
オリゴヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチド、デオキシリゴヌクレオチドのほか、人工修飾を有するリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオシド間結合及びベンゼン－ピリジン骨格を備える場合がある。実施例で用いるオリゴリボヌクレオチドのうち、天然のリボヌクレオチド、天然のデオキシリボヌクレオチドや、ヌクレオシド誘導体、修飾されたヌクレオシド間結合を備える場合には、常法に従い、こうした修飾を備えるアミダイト体を合成して、通常のアミダイト体と同様にして、こうしたオリゴヌクレオチド担体を用いる固相合成法により合成した。

また、修飾されたヌクレオシド間結合であるホスホロチオエート結合を有する場合には、０．０２ｍｏｌ／Ｌヨウ素（テトラヒドロフラン／水／ピリジン／ヨウ素＝９０．５４／９．０５／０．４１／０．４３（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）に替えて、０．０５ｍｏｌ／Ｌ［（ジメチルアミノ―メチリデン）アミノ］―３Ｈ－１，２，４―ジチアゾリン―３－チオン（ＤＤＴＴ）のアセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。

また、３’末端側にベンゼン（Ｂ）及びピリジン（Ｐ）をウレア結合させた骨格（ＢｕＰ）は、ＢやＰをカルボニルジイミダゾールを用いてカップリングすることにより極めて容易かつ定量的にＢｕＰ担体を形成させることによって合成した。

以下の表においては、上段がガイド鎖（第１の鎖）、下段がパッセンジャー鎖（第２の鎖）の配列を示すとともに、末端構造（ダングリングエンド）も示す。また、下線部は、ガイド鎖に対するミスマッチを示す。さらに、Ｎ（大文字）はＲＮＡを、Ｎ（小文字）はＤＮＡを、Ｎ_mは２’－ＯＭｅＲＮＡを示す。

＊は、

を表し、

また、ＢｕＰ及びＰｕＢは、それぞれ、以下の構造：

及び
を表す。

全てのオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機を用いた固相ホスホロアミダイト法により３´末端にダングリングエンドを有するＲＮＡ配列（この配列はマイクロRNA-133bのガイド鎖とパッセンジャー鎖に由来するものである）を合成した。オリゴヌクレオチドの合成法及び精製法の基本的な操作の詳細を以下の通りであった。

合成は、全て１μｍｏｌスケールで行った。３４００ＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシステムズ製）を用いてＡＧＣＵなどの各ホスホロアミダイトは０．１ＭになるようＭｅＣＮ溶液に溶解した。３’末端の連結基を介して支持固体であるＣＰＧ樹脂に固定したヌクレオシドの５’位保護基であるジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基を酸で除去した後、新たに遊離した５’位に、配列に従い、次のヌクレオシドに対応する３’－ホスホロアミダイト誘導体を連結した。アミダイト体活性化剤はテトラゾールを用いた。カップリングで生じた亜リン酸トリエステルを酸化し、リン酸トリエステルとした。さらに、５’位の脱保護と露出を行うとともに、配列に従い、次のヌクレオシドに対応するホスホロアミダイトを適用して鎖を延長し、延長されたオリゴヌクレオチド鎖の５’末端はＤＭＴｒ基を除去した状態で合成を終了した。Ａｒガスを通してＣＰＧ樹脂を乾燥させた。合成したダングリングエンド樹脂は０．１２ＭになるようＭｅＣＮ溶液に溶解させ調整した。

自動合成終了後、ＣＰＧ樹脂に結合したオリゴヌクレオチドをエッペンドルフチューブに移し、ＥｔＯＨ：ＮＨ₄ＯＨ＝３：１水溶液１．２ｍＬを加えて室温で１２時間振とうし、樹脂からの切り出し及びベンゾイル基などの脱保護処理を行った。その後、溶液を減圧下乾固した。残渣に１ＭＴＢＡＦｉｎＴＨＦ溶液１ｍＬを加え溶解させ、１２時間振とうし、シリル基の脱保護を行った。この反応液を０．１ＭＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒで希釈して３０ｍＬとし、平衡化したＣ－１８逆相カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ）に通し、カラムに吸着させた。カラムは、最初にコンディショニングとしてＣＨ₃ＣＮ１０ｍＬ、０．１ＭＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ１５ｍＬを流し、その後に濾液を流しておいた。ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き５０％ＣＨ₃ＣＮｉｎＨ₂Ｏ３ｍＬで溶出し、減圧下乾固した。残渣にｌｏａｄｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×ＴＢＥｉｎ９０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）２００μＬを加え２０％ＰＡＧＥ電気泳動（５００Ｖ，２０ｍＡ）を行った。目的のオリゴヌクレオチドのある部分のゲルを切り出し、溶出液（２ＮＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ１ｍＬ、０．１ｍＭＥＤＴＡ水溶液０．２ｍＬとＨ₂Ｏを加え２０ｍＬとした。）に浸し、一晩振とうした。この濾液をもう一度、当該濾液で平衡化したＣ－１８逆相カラム（Ｓｅｐ－Ｐａｋ）に通し、精製した。こうして得られた各サンプルをＨ₂Ｏ１ｍＬに溶解し、このものの希釈液の２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、その収量を求めた。

また、各サンプルの分子量をMALDI－TOF/MASSにより確認した。そして、さらにHPLCにて単離精製した。溶出液は以下の通り、Ａ液とＢ液とを用いて、Ａ液１００％からＢ液１００％にグラディエントをかけた。カラムはC-18逆相カラムを用いた。
Ａ液：５％ＭｅＣＮｉｎ０．１ＭＴＥＡＡ（トリエチルアミンアセテート）（ｐＨ７．０）
Ｂ液：５０％ＭｅＣＮｉｎ０．１ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）

得られた各オリゴヌクレオチド鎖の実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。

＜ｍｉＲＮＡの準備＞
実施例に示す表において規定するガイド鎖とパッセンジャー鎖との組み合わせに従い、二本鎖核酸を調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、蒸留水を加えて濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。その後９８℃下で１分間静置後、室温まで自然冷却させることで二二本鎖核酸であるｍｉＲＮＡを得た。

本実施例では、以下の表に示す、ｄ１と称する野生型ヒトｍｉＲ１３３－ｂ及びｄ５と称するヒトｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体を準備するほか、ｄ２～ｄ４及びｄ６～ｄ８と称するｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を準備した。ｄ５は、以下の表に示すように、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端がいずれもＧＧであるとともに、そのミスマッチ部位がガイド鎖の５’側と相補する３’末端から７個目の塩基のみとなっている。

ｄ２は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端を野生型のｍｉＲ１３３－ｂからＧＧ変更しただけの誘導体、ｄ３～ｄ４は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端がＧＧとなっているほか、野生型のｍｉＲ１３３－ｂのミスマッチ部位（７，１０，１３，１４）のうち、２個しか有しない誘導体、ｄ６～ｄ８は、野生型のミスマッチ部位のうち、１個、互いに異なる３個の組み合わせを有する誘導体であった。

本実施例では、実施例１で調製した各種二本鎖核酸につき、ヒト横紋筋肉腫細胞であるＲｈ３０細胞株及びヒト結腸腺がん細胞株であるＤＬＤ－１細胞株を用いて、これらの増殖抑制能につき評価した。なお、これらの細胞は、いずれも、ＰＴＢＰ１遺伝子の発現の促進が細胞増殖を促進することが報告されている分離されたがん細胞である。評価は、以下の操作に従い行った。

（細胞培養）
Ｒｈ３０，ＤＬＤ－１を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０中、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で培養した。

（細胞生存評価）
生細胞数は、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。細胞溶液をトリパンブルー（Life technologies）と等量混合し、血球計算盤にて生細胞数を計数した。コントロール細胞に対する割合(%)を細胞生存率とした。培養した細胞をトリプシンにて遊離させ、計数した。

（ｍｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクション）
６－ｗｅｌｌプレートに０．５×１０⁵ずつ前記細胞を、トランスフェクションの前日にまいた。トランスフェクションには、陽イオン性のリポソームである、Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA)をプロトコールにしたがって行った。

（細胞生存評価結果）
二本鎖ＲＮＡであるｄ１（野生型のｍｉＲ１３３－ｂ）～ｄ８についての細胞生存評価結果を、図２に示す。

図２に示すように、天然のヒトｍｉＲ１３３－ｂであるｄ１に対して、ｄ５の誘導体は、よりすなわち、優れた細胞増殖抑制能を示した。すなわち、ｄ５は、野生型ｍｉＲ１３３－ｂであるｄ１よりも、Ｒｈ３０及びＤＬＤ－１の生細胞数をより大きく減少させた。以上のことから、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体としては、天然のヒトｍｉＲ１３３－ｂと対比したとき、７位にのみミスマッチを有し、かつ、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端が、いずれもＧＧであることが好適であることがわかった。

本実施例では、以下の表に示す、実施例１で特定したｄ５と称するヒトｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を準備するほか、ｄ９～ｄ２８と称するｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を準備した。ｄ９～ｄ１１、ｄ１４、ｄ１７、ｄ１９、ｄ２３、ｄ２６～ｄ２８の誘導体の仕様を表３に示す。これらの仕様は、好適なミスマッチ部位及びその組み合わせをさらに探索しようというものである。以下の表においては、ミスマッチ部位は、下線が施されている。

他の誘導体は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の３’末端はいずれもＧＧであるほか、ミスマッチ部位として、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位から選択される１種（４種類）、２種（２種類）、３種（３種類）及び４種（１種類）のミスマッチ部位を表３に規定されるのとは異なる仕様を備える誘導体であった。

（細胞生存評価結果）
これらのｍｉＲ１３３－ｂ誘導体につき、実施例１と同様にして、細胞生存評価試験を行った。結果を、図３に示す。

図３に示すように、ｄ９，ｄ１０，ｄ１１，ｄ１４，ｄ１７、ｄ１９，ｄ２３、ｄ２６～ｄ２８は、野生型ｍｉＲ１３３－ｂであるｄ１や他の天然のミスマッチ部位の組み合わせの誘導体よりも生細胞減少効果に優れていたｄ５と同程度かそれ以上に、Ｒｈ３０及びＤＬＤ－１の生細胞数を減少させた。なかでも、優れた生細胞減少効果を発揮しているｄ２３は、パッセンジャー鎖における唯一のミスマッチを、ガイド鎖の５’末端側から３位に対する相補塩基に有していた。したがって、意外にも、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体として有利なミスマッチ部位は「３位」であることがわかった。

本実施例では、以下の表に示す、実施例２で特定したｄ２３と称するヒトｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を準備するほか、ｄ２９～ｄ３６と称するｍｉＲ１３３－ｂ誘導体を準備した。ｄ２９～ｄ３６の誘導体の仕様を表４に示す。これらの仕様は、優れた生細胞数抑制効果を示したｄ２３のミスマッチ部位（３位）及びｄ２３の３’末端以外の配列を維持しつつｄ２３に種々の修飾を加えたものである。

（細胞生存評価結果）
これらのｍｉＲ１３３－ｂ誘導体につき、実施例１と同様にして、細胞生存評価試験を行った。結果を、図４に示す。

図４に示すように、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各３’末端にそれぞれＢｕＰを備えるｄ３３及びｄ３６が優れた効果を示すことがわかった。

本実施例では、実施例３で特定した、ｄ３３、ｄ３６の誘導体のガイド鎖の３’末端側にホスホロチオエート結合や２’－ＯＭｅの導入、同５’末端側及び３’末端側に２’－ＯＭｅの導入を行い、ｄ３７～ｄ３８の誘導体を準備した。ｄ３７～ｄ３８の仕様を表５に示す。

（細胞生存評価結果）
これらのｍｉＲ１３３－ｂ誘導体につき、実施例１と同様にして、Ｒｈ３０細胞に対する細胞生存評価試験を行った。結果を、図５に示す。

図５に示すように、ガイド鎖に２－ＯＭｅ修飾を導入したｄ３７及びｄ３８よりも、かかる修飾を有しないｄ３３及びｄ３６がより生細胞数を減少させたこと、なかでも、ガイド鎖の３’末端側にホスホロチオエート結合を有するｄ３６が最も生細胞数の減少に有効であることがわかった。すなわち、ガイド鎖の３’末端側へのホスホロチオエート結合の導入修飾が有効であることがわかった。一方、ガイド鎖に対する２－ＯＭｅの導入修飾は、有効とはいえない場合があることが判明し、かかる修飾を有しないことが好ましい場合があることがわかった。

本実施例では、実施例４で特定したｄ３６のほか、ｄ３３、ｄ３７～ｄ３８の誘導体についてのタンパク質の発現抑制効果の評価をウェスタンブロッティングにより行った。方法を以下に示す。なお、評価は、実施例４と同様に、Ｒｈ３０細胞にこれらのｍｉＲ１３３－ｂ誘導体をトランスフェクションした細胞について行った。

（タンパク質抽出及びウェスタンブロッティング）
トランスフェクションを行ったＲｈ３０細胞を、スクレーパーではがし回収した後、PBSで洗浄した。タンパク質抽出液として、「Protein lysis buffer<１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１％ＳＤＳ，１％ＮＰ－４０，０．１％デオキシコール酸ナトリウム,１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ>: Protease Inhibitor Cocktail (nacalai tesque): Phosphatase Inhibitor Cocktail solution II: solution III (Sigma-Aldrich Co.)=５０：１：１：１」を調製し、回収した細胞ペレットに加え、ボルテックスで完全に溶解させ、氷上で２０分静置した。その後、１３０００ｒｐｍ，２０分，４℃で遠心し、上清を回収し、タンパク質サンプルとした。タンパク質の濃度測定は、DC Protein Assay Kit (BIO-RAD)を用いて行った。濃度測定したタンパク質を５×ＳＤＳ sample buffer＜６２．５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，５０ｍＭＤＴＴ，０．０１％ブロモフェノールブルー>と混和して10μg/10μLに調製し、98℃で5分加熱処理した後、氷上で5分静置した。

タンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により１０、１２．５％のポリアクリルアミドゲルであるSuper Sep Ace (Wako)を用いて分離し、Transfer membrane (MILLIPURE)にエレクトロブロットした。その後、PVDF blocking buffer(TOYOBO)でブロッキングを行い、各特異的な一次抗体に浸し一晩反応させた。この研究で使用した抗体は、抗ヒトＬＣ３Ｂ抗体、抗ヒトＰＴＢＰ１抗体（ＣＳＴ）、抗ヒトＰＫＭ１抗体、抗ヒトＰＫＭ２抗体 (Novus)である。翌日、二次抗体(Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody (CST))で反応させた。タンパク質発現量は、Luminata Forte Western HRP Substrate (MILLIPORE)を使用し蛍光発光させ、Luminescent image analyzer LAS-4000 UV mini (Fujifilm)にて検出した。タンパク質発現量のcontrolには、抗ヒトGAPDH 抗体 (CST)を同じ膜で反応させ検出した。

（ウェスタンブロッティングによる評価結果）
図６に、ｄ３３、ｄ３６～ｄ３８についてのウェスタンブロッティングによる、タンパク質の発現抑制効果の評価結果を示す。図６に示すように、ｄ３６によれば、ＰＴＢＰ１の発現を抑制し、ＰＫＭ２量を低減し、ＰＫＭ１量を増大させていることがわかった。

すなわち、ｄ３６は、ガン細胞において、ＰＴＢＰ１の発現を抑制する結果、ＰＫＭ１とＰＫＭ２のスプライシングを変化させて、結果として、ＰＫＭ２のタンパク質の発現を抑制し、ＰＫＭ１の発現を促進することがわかった。ＰＫＭ２は、がん細胞特有のエネルギー代謝を担うタンパク質である。ｄ３６は、このタンパク質量を抑制することで、がん細胞の増殖を抑制することができたと考えられた。

また、ｄ３６と同様の修飾を備える、他の有効なｍｉＲ１３３－ｂ誘導体も、同様の作用を奏するものと考えられた。

配列番号３～１３：ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体

Claims

配列番号１で表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第１の一本鎖と、
配列番号３～１３のいずれかで表される塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む第２の一本鎖と、
を備えている、ｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
さらに、前記第１の一本鎖のオリゴリボヌクレトチドと第２の一本鎖のオリゴリボヌクレオチドとは、それぞれ以下の修飾（１）～（３）；
（１）ヌクレオシド誘導体を含む、
（２）修飾されたヌクレオシド間結合を備える
（３）その３’末端に、以下の式で表される、修飾されていてもよいベンゼン－ピリジン骨格の少なくとも１個をさらに備える、

からなる群から選択される１種又は２種以上の修飾を備える、請求項１に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、少なくともその３’末端に１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、請求項２に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、少なくともその３’末端に１個の前記ベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、請求項２又は３に記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を有する、請求項２～４のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖と第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、それぞれその３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備える、請求項２～５のいずれかに記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖と第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、それぞれその３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備える、請求項２～６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに前記ホスホロチオエート結合を、５個以上１０個以下備える、請求項７に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、１個のベンゼンーピリジン骨格をさらに備え、
前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端に、ＧＧをさらに備え、
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から少なくとも１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間に、ホスホロチオエート結合である前記修飾されたヌクレオシド間結合を少なくとも１個備える、請求項２～６のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３末端から連続してヌクレオシド間に１２個以上の前記ホスホロチオエート結合を備える、請求項９に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
前記第１の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、その３’末端から１１個のヌクレオシドのヌクレオシド間のみに前記ホスホロチオエート結合を、５個以上１０個以下備える、請求項９に記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
前記第２の一本鎖の前記オリゴリボヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列を有する、請求項６～１１のいずれかに記載のｍｉＲ１３３－ｂ誘導体。
さらに、前記第１の一本鎖と前記第２の一本鎖は、それぞれ、前記オリゴリボヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオシドの２’位の炭素原子にハロゲン原子又はアルコキシ基が連結されている、請求項１～１２のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１１３－ｂ誘導体。
請求項１～１３のいずれかに記載のｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体を有効成分とする医薬組成物。