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JP2021533834A - 標的特異的細胞外小胞 - Google Patents

標的特異的細胞外小胞 Download PDF

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JP2021533834A
JP2021533834A JP2021532519A JP2021532519A JP2021533834A JP 2021533834 A JP2021533834 A JP 2021533834A JP 2021532519 A JP2021532519 A JP 2021532519A JP 2021532519 A JP2021532519 A JP 2021532519A JP 2021533834 A JP2021533834 A JP 2021533834A
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ボッビリ，マドゥスダン・レディ
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エバーサイト・ゲーエムベーハー
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Abstract

改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する、ＥＤアミノ酸配列内の少なくとも１つの改変領域内で、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質のＥＤをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを変異導入法によって改変して、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れ、それによって、それぞれが異なる標的結合部位を含む多様な標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生するステップ、ならびに所定の標的を特異的に認識するＴＥＤを選択するステップ、ならびに選択されたＴＥＤを含むタンパク質を産生するステップを含む、ＥＶ表面タンパク質のＴＥＤを含むタンパク質を産生する方法が提供される。

Description

本発明は、標的特異的細胞外小胞を操作する分野に関する。本発明は、さらに、前記標的特異的細胞外小胞の産生の方法に関する。
過去１０年間で、エクソソームに関する研究は、それらが細胞−細胞間コミュニケーションの重大な媒介因子として認識されていることから高まっている［１］。エクソソームは、原形質膜とのそれらの融合が起きると多小胞体から放出され、放出された小胞は、機能的ＲＮＡ、エクソソームＤＮＡ、および受容体を含めた膜貫通タンパク質を、周辺環境における細胞に移行させる送達ビヒクルとして機能する［２］。低い免疫原性および低い細胞毒性等の望ましい特性を含めた、潜在的な治療用部分としてのそれらの利点に関して、それらの適用への関心は、カプセル化、エクソソーム内容物の細胞質放出の向上、細胞取込みの増強、およびより特異的な細胞標的化のための新たな方法等、さらなる開発を誘発している［３］。
エクソソームの小胞取込みは、細胞タイプ特異的であり、膜融合またはエンドサイトーシスを伴い得、発がん性がん受容体の刺激によって誘導されることすらある［４］。組織特異的送達を達成するために、テトラスパニン等のエクソーム膜タンパク質を過剰発現するように供給源細胞を操作し、受容体特異的リガンドペプチドを認識単位として持つことによって、エクソソームの標的化は最適化され得る［５］。テトラスパニンは、インテグリンおよび共受容体分子等の他のタンパク質ファミリーのメンバーも伴うテトラスパン網として知られる大型細胞シグナル伝達複合体において会合する、分子促進因子として知られる。さらに、そのような大型膜タンパク質アセンブリは、脂質ラフトと会合し得る［６〜７］。エクソームのエンドサイトーシスに対するテトラスパニンＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１リガンドの機能が報告されており［８〜１０］、しかしながら取込みのメカニズムはまだ明確にされていない。
そのほぼ偏在的な分布にもかかわらず、テトラスパンタンパク質ＣＤ８１は、多小胞体のエクソーム画分において富化された主要タンパク質である［１１］。トポロジー的に膜貫通ドメイン３と４の間に配置されるＣＤ８１の大きな細胞外ループ（ＬＥＬ）は、２対のシステインによって安定化された、マッシュルーム様構造を形成する５つのヘリックス要素によって特徴付けられる［１２〜１３］。このモチーフは、テトラスパニンファミリーのタンパク質メンバーの間で保存され［１４］、システイン結合の酸化は、ＣＤ８１の天然リガンドであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＥ２エンベロープタンパク質の高親和性結合の必須条件である［１５］。システインの正しい対合は、抗体Ｍ３８による認識に関して記載されており［１６］、それは、変性したまたは還元されたタンパク質には結合しないが、膜に結合したｈＣＤ８１ならびに精製された可溶性ｈＣＤ８１の天然型と反応し得る。
１．６Åで解かれたｈＣＤ８１ ＬＥＬの結晶構造は、新たなタイプのタンパク質フォールドを明らかにし［１２］、１６０個のテトラスパニンファミリーメンバーについての後続の配列解析は、それらのフォールドおよび重要な構造特質が保存されていることを示した［１７］。システイン架橋とは別に、ｈＣＤ８１ ＬＥＬは、システイン接続を収容するように配置される不変残基Ｇｌｙ１５７およびＰｒｏ１７６、ならびに完全に埋もれかつＨｉｓ１５１およびＣｙｓ１９０と一緒に水素結合ネットワークに寄与するＴｙｒ１２７によって安定化されている。可溶性ｈＣＤ８１ ＬＥＬは、２回軸を囲む二量体にアセンブリし、プロトマー間の接点は、各相互作用パートナーのヘリックス間およびヘリックスＢと反対側のプロトマーのＣ末端残基との間の低極性領域である。プロトマーのＮおよびＣ末端は、細胞表面での二量体アセンブリと同様に、アセンブリした二量体の反対側の面の中心領域に収まり、そこには膜貫通セグメントも存在する。第２の低極性領域は、ヘリックスＣおよびＤの溶媒曝露表面を含み、それはエネルギー的に望ましくない。溶液調査によれば、ヘリックスＤはほとんど構造化されておらず、ある特定の抗原と結合したときのみヘリックス立体構造をとる［１８］。テトラスパニンファミリーメンバーについての配列アラインメントは、実際に、挿入および欠失を含めた、この領域における変動性の増加を示す［１９］。この表面エリアは、種またはテトラスパニン特異的認識過程に関与し得［２０］、それは、ヘテロ二量体テトラスパニン種アセンブリの可能性にヒントを与え得る［２１］。特に、ＣＤ８１のセグメントＤは、特異的ホモマークラスター化を導き得るはずである［２２］。
ＷＯ２０１４／１６８５４８は、例えばエクソームまたは微小胞であり得る治療用送達小胞であって、シグナル伝達能力がないデコイ受容体に融合した担体ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をその膜に付着させている治療用送達小胞を開示する。
ＷＯ２０１６／０７３８６４は、ナノ粒子、脂質に基づく担体分子、または細胞外小胞に共役したＣＤ１９またはＣＤ２１標的抗体を含むＢ細胞標的剤を開示する。
ＷＯ２０１８／０７５８２５は、がん幹細胞標的ペプチドに融合したエクソームタンパク質のセグメントを含む融合タンパク質を含む、生物工学により作られたエクソソームを開示する。
ＷＯ２０１８／０１５５３５Ａ１は、Ｆｃ結合ドメインを含有するタンパク質でコートされたＥＶを開示する。例示的なＥＶは、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡのＺドメインまたはＺＺドメイン等のＦｃ結合因子に融合したエクソームタンパク質を含む融合構築物を運搬する。
ＵＳ２０１８／００１５１８２Ａ１は、タンパク質との融合体を含むテトラスパニンを操作することによって、または末端もしくはループペプチド付着部位を含めることでエクソソームにタンパク質を付着させることによって、生物活性カーゴを送達するエクソソームを開示する。
Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１３、６５：３９１〜３９７）は、標的化ｓｉＲＮＡ送達のためのエクソームを記載する。例示的な標的化エクソソームは、Ｌａｍｐ２ｂ脳特異的ペプチド（ＲＶＧ、２９ｍｅｒペプチド）融合タンパク質を含む。
Ｄｒｕｍｍｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００２、７６（２１）：１１１４３〜１１１４７）は、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質へのＣＤ８１結合についてのＬＥＬ上の結合部位を記載する。
次世代治療用担体としてのそれらの潜在性を増強するために、エクソーム媒介性送達システムは、さらに開発され、とりわけそれらの本質的に低い細胞取込みの効率を向上させる必要がある。安定性の増加および標的特異性の向上を有する、エクソーム膜タンパク質を含むエクソソーム媒介性送達システムの具体的な必要性がある。
標的特異的細胞外小胞に向上した標的結合特徴を提供することが本発明の目的である。標的特異的ＥＶ表面タンパク質およびその結合ドメインに向上した標的結合特徴を提供することがさらなる目的である。
問題は本発明によって解決される。
本発明によれば、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する、ＥＤアミノ酸配列内の少なくとも１つの改変領域内で、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質のＥＤをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを変異導入法によって改変して、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れ、それによって、それぞれが異なる標的結合部位を含む多様な標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生するステップ、ならびに所定の標的を特異的に認識するＴＥＤを選択するステップ、ならびに選択されたＴＥＤを含むタンパク質を産生するステップを含む、ＥＶ表面タンパク質のＴＥＤを含むタンパク質を産生する方法が提供される。
タンパク質の全ての特質、特に本明細書で記載される標的結合分子（「結合因子」、「標的特異的分子」）は、本発明の方法を特徴付ける特質であり、逆もまた同様であることが具体的に理解される。
具体的には、ＴＥＤを含むタンパク質は、ＴＥＤ、またはＴＥＤおよび１つもしくは複数のさらなる領域、例えば別のＥＤおよび／もしくは膜貫通ドメインを含むタンパク質、または特に異種配列を含む組換え融合タンパク質からなり得る。
具体的には、ポリヌクレオチドのレパートリーは、外表面に多様なＴＥＤを呈示し、好ましくは、酵母、ファージ、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する遺伝子パッケージに含まれる。
具体的には、改変領域は、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有する。
具体的には、標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にあるまたは野生型ＥＤ配列内にある、少なくとも１つのさらなる結合領域を含む。前記少なくとも１つのさらなる結合領域は、好ましくは同じＥＤのものであり、かつ／または本明細書でさらに記載されるある特定の距離で同じＴＥＤ内に位置する。
具体的には、ＴＥＤは、野生型ＥＤとの少なくとも７０％の配列同一性を含む。
具体的には、野生型ＥＤは、テトラスパン様タンパク質、インテグリンファミリーのタンパク質、プロテオグリカン、５回膜貫通ドメインタンパク質、Ｉ型膜貫通タンパク質、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質、酵素膜タンパク質、免疫調節表面タンパク質、間葉系幹細胞の表面マーカー、糖タンパク質、またはチャネリングタンパク質からなる群から選択されるＥＶ表面タンパク質を起源とする（または、それのものである）。
具体的には、テトラスパン様タンパク質は、好ましくは、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ１５１；および
ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＣＤ３７
からなる群から選択されるテトラスパニンである、
またはテトラスパン様タンパク質は、リソソーム関連膜タンパク質、好ましくは配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるＬＡＭＰ２である。
具体的には、野生型ＥＤは、
ａ）ＥＤが、配列番号１３０もしくは配列番号１３１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８１；
ｂ）ＥＤが、配列番号１３２、配列番号１８２、もしくは配列番号１３３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ９；
ｃ）ＥＤが、配列番号１３４もしくは配列番号１３５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ５３；
ｄ）ＥＤが、配列番号１３６もしくは配列番号１３７として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）ＥＤが、配列番号１３８もしくは配列番号１３９として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８２；
ｆ）ＥＤが、配列番号１４０もしくは配列番号１４１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ６３；
ｇ）ＥＤが、配列番号１４２もしくは配列番号１４３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ１５１；
ｈ）ＥＤが、配列番号１４４もしくは配列番号１４５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ３７；または
ｉ）ＥＤが、配列番号１４６として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、ＬＡＭＰ２
のうちのいずれか１つのものである。
具体的には、タンパク質はＥＤアミノ酸配列にループ構造を含み、ループ構造は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）の１つまたは複数のシステイン（複数可）によって安定化されている。
具体的には、改変領域はＥＤのループ領域内に位置する。
具体的には、ＥＤは、
ａ）ＣＤ８１のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは１３４と１４４位および／もしくは１３０と１４６位および／もしくは１３５と１６８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、または
ｂ）ＣＤ９のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは２０と２８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、位置の番号付けは、ＣＤ９の大きな細胞外ループ（ＬＥＬ、配列番号１１８）のものである。
具体的には、ＥＤはＣＤ８１のものであり、改変領域は１６０と１７２位の範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである。
具体的には、ＴＥＤは、１３２と１４１位の間または１８０と１８９位の間に位置する少なくとも１つのさらなる結合領域を含み、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである。
具体的には、ＥＤはＣＤ９のものであり、改変領域は、１５５〜１６６位、１２８〜１４２位、１３０〜１４０位、または１６９〜１８０位のうちのいずれか１つの範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８９として特定されたヒトＣＤ９のものである。
具体的には、標的は、細胞標的、好ましくはマイトジェン受容体、サイトカイン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、膜輸送体、リポタンパク質、リポサッカライド、糖タンパク質、プロテオグリカン、または無細胞標的、好ましくはサイトカイン、人工タンパク質、もしくは人工表面構造からなる群から選択される。
具体的には、ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）である。
具体的には、膜貫通ドメインは、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質を起源とする膜貫通ドメインとの少なくとも７０％の配列同一性を含む。
具体的には、膜貫通ドメインは、
ａ）膜貫通ドメインが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、もしくは配列番号１５０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８１；
ｂ）膜貫通ドメインが、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、もしくは配列番号１５４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ９；
ｃ）膜貫通ドメインが、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、もしくは配列番号１５８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ５３；
ｄ）膜貫通ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、もしくは配列番号１６２として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）膜貫通ドメインが、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、もしくは配列番号１６６として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８２；
ｆ）膜貫通ドメインが、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、もしくは配列番号１７０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ６３；
ｇ）膜貫通ドメインが、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、もしくは配列番号１７４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ１５１；
ｈ）膜貫通ドメインが、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、もしくは配列番号１７８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ３７；または
ｉ）膜貫通ドメインが、配列番号１７９として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、ＬＡＭＰ２
のうちのいずれか１つのものである。
具体的には、ＥＤおよび膜貫通ドメインの両方とも、同じＥＶ表面タンパク質を起源とし（または、それのものであり）、好ましくは、ＥＶ表面タンパク質は、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ１５１；
ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ３７；および
ｉ）配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬＡＭＰ２
からなる群から選択される。
本発明は、
ａ）本明細書で記載される方法によって得ることが可能なＴＥＤを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し；
ｂ）前記ポリヌクレオチドを供給源細胞または供給源細胞混合物に導入し；
ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記細胞（複数可）を培養し；
ｃ）ＴＥＤの標的結合部位を含む標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含む画分を単離し；かつ
ｄ）前記画分に含まれるＴＥＶの調製物を産生する
ことによって、ＴＥＶ調製物を産生する方法をさらに提供する。
具体的には、ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であり、ＴＥＶは、その膜の外表面に標的結合部位を呈示している。
具体的には、本明細書で記載される方法は、ＴＥＶに小胞内担持物を担持するステップをさらに含み、担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物は、真核生物または原核生物供給源を起源としており（または、それのものであり）、好ましくは身体組織、体液、または細胞培養物のものである。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は自家使用のために製剤化される。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書で記載される方法によって得ることが可能なまたは得られるＴＥＶ調製物を提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書で記載される方法によって得ることが可能なまたは得られる自家ＴＥＶ調製物であって、供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は同じ対象に投与される、自家ＴＥＶ調製物を提供する。
本発明は、特に、それを必要とする対象を処置することにおける使用のための、そのような自家ＴＥＶ調製物の医学的使用であって、供給源細胞または供給源細胞混合物は前記対象から得られる、医学的使用をさらに提供する。
具体的には、対象は、患者、特に障害または疾患に罹患しているヒト患者である。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書で記載される方法によって得ることが可能なまたは得られる、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）を含むタンパク質を提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、哺乳動物細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）との少なくとも７０％の配列同一性、ならびに改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含む、ＥＶ表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）であって、改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、改変領域は、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にもしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、ＴＥＤを提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型ＥＤとの少なくとも７０％の配列同一性、ならびに改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含むＥＤとを含む、標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であって、改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、改変領域は、ＴＳＰから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にもしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、ＴＳＰを提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書で記載される標的特異的分子のいずれか、特に本明細書で記載されるＴＥＤを含むタンパク質、本明細書で記載されるＴＥＤ、または本明細書で記載されるＴＳＰのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的には、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡ分子である。
具体的な態様によれば、本発明は、膜を含みかつ膜の外表面に標的特異的分子を呈示する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）であって、標的特異的分子は、本明細書で記載される標的特異的分子のいずれか、特に本明細書で記載されるＴＥＤを含むタンパク質、本明細書で記載されるＴＥＤ、または本明細書で記載されるＴＳＰのうちのいずれか１つである、ＴＥＶを提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、好ましくは皮内、皮下、静脈内、局所的、または経口使用のための製剤において、本明細書で記載される標的特異的分子のいずれか１つ、特に本明細書で記載されるＴＥＤを含むタンパク質、本明細書で記載されるＴＥＤ、もしくは本明細書で記載されるＴＳＰのうちのいずれか１つを含み、または本明細書で記載されるＴＥＶを含み、および薬学的に許容される担体を含む医薬調製物を提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書で記載される多様な少なくとも１０２個の標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含むＴＥＶライブラリーであって、多様性は、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有するＴＥＶを含むまたはそれからなる、ＴＥＶライブラリーを提供する。
具体的には、ＴＥＶライブラリーは、本明細書で記載される標的特異的分子を含むＴＥＶのレパートリーを含み、レパートリーは、少なくとも１０２個の異なる改変領域または標的結合部位を網羅する。
具体的な態様によれば、本発明は、
ａ）それぞれが異なる標的結合部位を含む、多様な標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを提供するステップ；
ｂ）前記レパートリーを前記供給源細胞（複数可）に導入するステップ；および
ｂ）異なる標的結合特異性を有する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のレパートリーを含む画分を単離して、ＴＥＶのライブラリーを産生するステップ
を含む、標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のライブラリーを産生する方法であって、ＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入法によって変異導入して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域内に前記ＥＶ表面タンパク質のＥＤの突然変異を得て、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れることによって、ポリヌクレオチドのレパートリーは産生される、ＴＥＶのライブラリーを産生する方法を提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、異なる標的特異性を有する少なくとも１０２個のＴＥＶを好ましくは含む、本明細書で記載される方法によって得ることが可能なまたは得られるＴＥＶライブラリーを提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、哺乳動物細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）との少なくとも７０％の配列同一性、ならびに改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含む、ＥＶ表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）であって、改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、ＴＥＤは本明細書でさらに記載されるように特徴付けられる、ＥＶ表面タンパク質のＴＥＤを提供する。
具体的には、改変領域は、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有する。
具体的には、ＴＥＤは、それぞれの野生型ＥＤ配列との７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含む。
具体的には、野生型ＥＤは、本明細書でさらに記載されるＥＶ表面タンパク質を起源とする。
具体的なＥＶ表面タンパク質は、
ａ）テトラスパン様タンパク質、
ｂ）インテグリンファミリーのタンパク質、
ｃ）プロテオグリカン、
ｄ）５回膜貫通ドメインタンパク質、
ｅ）Ｉ型膜貫通タンパク質、
ｆ）Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質、
ｇ）膜タンパク質、特に酵素活性を有するもの（酵素ＴＭタンパク質）、
ｈ）免疫調節表面タンパク質、
ｉ）間葉系幹細胞の表面マーカー、
ｊ）糖タンパク質、
ｋ）チャネリングタンパク質、または
ｌ）多岐にわたるエクソソーム（小胞）表面タンパク質
のうちのいずれか１つ（または、その組合せ）である。
具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質は、テトラスパン様タンパク質、特にテトラスパニンまたはリソソーム関連膜タンパク質である。
具体的には、テトラスパン様タンパク質は、好ましくは、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ１５１；および
ｈ）配列番号９として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ３７
からなる群から選択される、クラスＩまたはＩＩのテトラスパニン等のテトラスパン接合部複合体スーパーファミリーのものである。
具体的には、リソソーム関連膜タンパク質は、配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬＡＭＰ２である。
具体的には、起源となるタンパク質は、ヒト野生型ＥＶ表面タンパク質、またはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を含む人工タンパク質（または、非ヒト動物の野生型タンパク質）である。
具体的には、起源となるＥＤは、ヒト野生型ＥＶ表面タンパク質、またはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を含む人工タンパク質（または、非ヒト動物の野生型タンパク質）を起源とする野生型ＥＤである。
具体的には、野生型ＥＤは、ヒトまたは非ヒト動物アミノ酸配列を含むまたはそれからなるもの等、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質のものである。
具体的には、野生型ＥＤは、特にヒトＥＶ表面タンパク質の、野生型ＥＣ配列に含まれるまたはそれから構成されるＥＤアミノ酸配列のいずれか１つとの、９０、９５、９８、９９％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含み、または１００％の配列同一性を含み、それは、
ａ）ＥＤが、配列番号１３０もしくは配列番号１３１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８１のもの；
ｂ）ＥＤが、配列番号１３２、配列番号１８２、もしくは配列番号１３３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ９のもの；
ｃ）ＥＤが、配列番号１３４もしくは配列番号１３５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ５３のもの；
ｄ）ＥＤが、配列番号１３６もしくは配列番号１３７として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＴＳＰＡＮ３２のもの；
ｅ）ＥＤが、配列番号１３８もしくは配列番号１３９として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８２のもの；
ｆ）ＥＤが、配列番号１４０もしくは配列番号１４１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ６３のもの；
ｇ）ＥＤが、配列番号１４２もしくは配列番号１４３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ１５１のもの；
ｈ）ＥＤが、配列番号１４４もしくは配列番号１４５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ３７のもの；または
ｉ）ＥＤが、配列番号１４６として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、ＬＡＭＰ２のもの
のいずれか１つである。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質を呈示するＥＶまたはＥＤの領域を決定する方法に応じて、ＥＤがいくつかのアミノ酸分、例えば１、２、３、４、または５個のアミノ酸分長くなるまたは短くなるように、ＥＤの配列は一方または両方の末端で変わり得る。
具体的には、ＥＤは、それぞれのＥＣ、またはそれぞれの非ヒトホモログの血管外（ｅｘｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ）ループ配列を含むまたはそれからなるもの等、任意の非ヒト哺乳動物起源のものであり得る。
具体的には、哺乳動物野生型テトラスパン様タンパク質は、哺乳動物野生型テトラスパン様タンパク質との９０、９５、９８、もしくは９９％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含む、または１００％の配列同一性を含む。
具体的な例によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ８１であり、改変領域は１６０と１７２位の範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである。好ましくは、前記改変領域を含むそのようなＴＥＤは、１３２と１４１位の間または１８０と１８９位の間に位置する少なくとも１つのさらなる結合領域を含み、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである。
別の具体的な例によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ９であり、改変領域は、１５５〜１６６位、１２８〜１４２位、１３０〜１４０位、または１６９〜１８０位のうちのいずれか１つの範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８９として特定されたヒトＣＤ９のものである。
具体的な実施形態によれば、ＴＥＤ内（特に、少なくとも２つの離れた領域内、または標的結合部位に含まれるＥＤ内）の前記少なくとも１つの改変領域は、溶媒曝露残基を含み、好ましくは、前記少なくとも１つの改変領域は、ＥＤのループおよび／またはヘリックス領域に配置される。位置の溶媒曝露は、典型的に、標的結合のための望ましい接近可能性を指し示す。溶媒への曝露を判定する検査法は、溶媒接近可能表面エリアおよび相対接近可能表面エリアである。具体的には、溶媒曝露残基は、２０％を上回る相対接近可能表面エリアを有するものである。
さらなる具体的な実施形態によれば、前記少なくとも１つの改変領域は、溶媒曝露残基を含む、ＥＤのアルファ−ヘリックス領域に配置される。具体的には、アルファ−ヘリックス領域は、一連のコイル、例えばコイルアミノ酸配列、特に疎水性および荷電アミノ酸残基の反復パターンを含むコイル反復配列を含み、それによってペプチド性アルファ−ヘリックスを形成する。具体的には、ＥＤのヘリックス領域は、５〜３０個、好ましくは７〜１８個のアミノ酸に及ぶ長さを有する。具体的には、ヘリックス領域の少なくとも１つは、標的結合部位の一部である。ヘリックス領域は、典型的には二量体化するまたは多量体化する傾向があることから、標的結合部位がＥＤ単量体に含まれる場合、前記標的結合部位はそれぞれ二量体化および多量体化を適切に防ぐ。
具体的には、ＥＤは、ＣＤ８１またはＣＤ９等のテトラスパニンのものであり、標的結合部位は、特にそれぞれＣＤ８１およびＣＤ９のＬＥＬ内の、テトラスパニンの少なくとも１つのヘリックスおよび／またはループ構造を含むまたは伴う。具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、ＣＤ８１またはＣＤ９、特にヒトＣＤ８１またはＣＤ９である。具体的には、表面タンパク質は、単量体ＣＤ８１または単量体ＣＤ９である。
しかし、一部の場合には、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、二量体または多量体として存在する場合のみ、標的結合部位を組み入れる。そのような場合、非ヘリックス領域内に標的結合部位を操作して、それぞれ二量体化および多量体化、ならびに有効な標的結合を確実にすることが好ましい。
具体的には、標的結合部位の配置は、種々のタイプのＥＤまたはＥＶ表面タンパク質で変わる。ある特定のモチーフは保存され、一方で他のものは、タンパク質ファミリー内でまたは異なる種の類似配列で変わり得る。例えば、テトラスパニンタンパク質ファミリーにおけるヘリックスＤはほとんど構造化されておらず、ある特定の抗原と結合したときのみヘリックス立体構造をとる。テトラスパニンファミリーメンバーについての配列アラインメントは、挿入および欠失を含めた、この領域における天然の変動性の増加を示す。具体的には、そのような天然の変動性は、部位指向性変異導入の良好な許容性を示す。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤの改変領域は、野生型ＥＤ配列のループ領域、特に大きな細胞外ループ領域内に位置する。ＥＶ表面タンパク質は、ループ構造を含むＥＶに付着した場合に三次構造を有し得、小胞周辺にループを曝露する。そのようなループ領域は、ＥＤ内に標的結合部位を操作するのに特に適している。
例えば、テトラスパン様分子は、１つもしくは複数の小さな小胞外ループおよび／または１つもしくは複数の大きな小胞外ループ（ＬＥＬ）を有し得る。ＣＤ８１およびＣＤ９の例示的なＬＥＬ配列が本明細書でさらに開示される。ヒトＣＤ８１の場合、ＬＥＬ配列は配列番号７として特定され、ヒトＣＤ９の場合、ＬＥＬ配列は配列番号１１８として特定される。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、アミノ酸配列にループ構造を含み、ループ構造は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）の１つまたは複数のシステイン（複数可）によって安定化されている。具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤまたは前記ＴＥＤを含むＥＶ表面タンパク質は、少なくとも１つのループ領域を含み、それは、少なくとも２本のアミノ酸側鎖を接続する少なくとも１つの分子内結合、例えばジスルフィド結合によって安定化されている。
ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質のループの長さは変わり得る。具体的には、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、少なくとも１つの大きな小胞外ループ、およびより小さなサイズのループを含む。大きな小胞外ループは、典型的に、７５〜１４０個のアミノ酸、好ましくは７８〜１３２個のアミノ酸に及ぶ長さを有する。具体的には、小さなループは、２５〜３５個のアミノ酸、好ましくは２６〜３２個のアミノ酸に及ぶ長さを有する。
具体的には、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、少なくとも１つのヘリックス領域またはドメイン、例えば１、２、３、または４つのヘリックス領域を含む。具体的には、ヘリックス領域は、ループ領域内または表面タンパク質の末端領域内にある。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤまたはＴＥＤを含むＥＶ表面タンパク質は、ＥＶの表面に単量体として存在する。細胞外または小胞外表面タンパク質は、生物学的機能のために二量体化するまたはオリゴマー化する傾向があるが、表面タンパク質は、単量体として標的結合性であるように操作される。
具体的には、ループおよび／またはヘリックス領域のうちの少なくとも１つは、標的結合部位の少なくとも一部になるように、ＥＤ内の改変領域を産生するために変異導入される。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤは、ＥＶ、典型的には膜貫通ドメインに固定された少なくとも１つのループおよび／またはヘリックス構造を含む標的特異的ＥＶ（ＴＥＶ）表面タンパク質に含まれる。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤ内の改変領域は、３〜２０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、最高で例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、または１２個の長さを有する。改変は、典型的に、任意のそのような改変領域内に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個、または最高で２０個の点突然変異をもたらす。
具体的には、前記改変は、１つの位置における１個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失、好ましくはアミノ酸置換を含めた、いくつかの点突然変異、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のうちの少なくとも（または、多くとも）いずれか１つを導入する。
具体的には、第１の改変領域内の連続した位置でのいくつかの点突然変異、例えば３〜２０個に及ぶ数、特に３、４、５、６、７、８、９、または１０個；および必要に応じて、前記第１の改変領域と離れた連続した位置での第２の改変領域内のいくつかの点突然変異、例えば３〜２０個に及ぶ数、特に３、４、５、６、７、８、９、または１０個が好ましく、前記第１および第２の改変領域の両方とも標的結合部位に含まれる。前記第１および第２の改変領域間の距離は、典型的に、野生型ＥＤを起源とする隣接配列から構成される。
具体的には、改変領域は、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接し、それにより隣接領域は、改変領域のそれぞれの末端に近接する。典型的に、隣接領域は、野生型ＥＤ長の野生型アミノ酸配列によって特徴付けられ、野生型隣接配列は、野生型ＥＤのそれぞれの（非改変）配列と同一である少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続アミノ酸の長さを有する。
しかし、具体的な実施形態によれば、隣接領域の一方（しかし、両方ではない）は非存在であり得る。例えば、改変領域は、ＥＤのＣ末端を含む末端領域であり得る。そのような場合、改変領域は、改変領域のＮ末端でのみ野生型ＥＤ配列の領域が隣接し、改変領域は、ＥＤのＣ末端領域である。
具体的には、改変領域は、ＴＥＤ内に位置する場合、標的に結合しており、ゆえに、標的を特異的に認識するためのＴＥＤの周辺の二次または三次構造を伴う。
具体的な実施形態によれば、標的結合部位は、少なくとも前記改変領域、ならびにＴＥＤの野生型領域、ならびに／あるいはＴＥＤ内にある、ＴＳＰ内にある、またはＴＥＤおよび／もしくはＴＳＰを含むＥＶの表面にある別の改変領域を含む。
ＴＥＤから単離された場合、または改変領域と同じアミノ酸配列からなる別個のペプチドとして産生された場合、典型的に、そのような単離された改変領域は、より低い標的結合親和性を有する、または標的に結合する特異性もしくは選択性を欠如さえする。ＴＥＤ内の改変領域の標的結合と比較して、単離された改変領域は、具体的には、同じアッセイを用いてまたは比較可能な設定において判定される少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍異なる結合定数または結合動力学を有して、より低い親和性またはより低い選択的結合を有する。
本明細書で記載されるＴＥＤの、および前記ＴＥＤから単離された改変領域の標的結合特性を比較する適切なアッセイは、以下のアッセイ：ＥＬＩＳＡ、例えばＢｉａｃｏｒｅ、バイオレイヤー干渉法、コグネート抗原とインキュベートされたＴＥＤを呈示する細胞の蛍光測定、等温滴定微小熱量測定、蛍光相関分光法を使用した親和性判定のいずれかを採用し得る。
具体的には、標的結合部位は、ＥＶ表面タンパク質の少なくとも１つの膜貫通ドメインによって分離されたＥＤ等、同じＥＶ表面タンパク質の少なくとも２つの異なるＥＤ内にある、少なくとも２つの領域（それらのうちの少なくとも１つまたは２つは、本明細書でさらに記載される改変領域である）を含む。
ＴＥＤ内に組み入れられ、かつ同じＥＤ内または少なくとも２つのＥＤ内に前記少なくとも１つの改変領域を含むまたは代わりに伴うそのような標的結合部位は、結合特性の向上という特定の利点を有する。そのような結合特性の向上は、典型的に、ＥＤ内に埋め込まれた結合特性を有する改変領域になるようにＥＤ内の所定の領域に変異導入し、かつそれらの結合特異性および／または親和性に従って適切な結合因子を選択した場合に得られる。
結合特性は、具体的には、ＥＤへの特異的（ペプチド）結合因子の比較可能な融合体よりも向上し、それによって融合タンパク質を産生する。この理由は、融合により結合特性が典型的に変化し、その結果、比較可能な融合タンパク質は、単離された結合因子と比較して、ＥＤへの結合因子の融合により、より低い親和性またはより低い選択的結合を有するためである。
具体的には、改変領域は、標的結合部位の少なくとも一部である、または標的結合部位からなる。具体的な実施形態によれば、改変領域は、結合部位の全ての接触アミノ酸残基を含む。
具体的な実施形態によれば、標的結合部位は、１つを上回る数の改変結合領域を含み、少なくとも第１の改変領域は、第２の改変領域からある特定の距離に位置する。
具体的には、標的結合部位は、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続アミノ酸のうちの少なくともいずれか１つ離れたさらなる改変領域内にまたは野生型ＥＤ配列内に、少なくとも１つのさらなる結合領域を含む。具体的には、前記少なくとも２つの離れた改変領域間の領域は、改変領域のＮ末端またはＣ末端で本明細書で記載される改変領域に隣接する領域の１つを含み、それは野生型ＥＤ配列の領域である。
具体的には、標的結合部位は、前記ＴＥＤの少なくとも２つの離れた領域内に結合残基を含む。具体的には、ＴＥＤを、前記少なくとも２つの離れた領域内で改変または変異導入して、前記標的結合部位を組み入れる。
具体的な実施形態によれば、標的結合部位は、ＥＤ内であるが改変領域の外側に、接触アミノ酸残基を含む。そのようなさらなる接触アミノ酸は、ＥＤの１つまたは複数のさらなる領域に位置し得、１つまたは複数のさらなる領域は、例えば１つもしくは複数の点突然変異を含む改変された（変異した）アミノ酸配列を含み得る、またはＥＤの野生型配列を含み得る。
具体的な実施形態によれば、ＥＤまたは標的結合部位は、前記少なくとも１つの改変領域、および１つもしくは複数のさらなる点突然変異、または具体的にはある特定の距離にある、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸離れたアミノ酸配列内に一連の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続した点突然変異を含む。
具体的な実施形態によれば、ＥＤまたは標的結合部位は、前記改変領域のうちの少なくとも２つまたは３つを含む。
具体的に好ましい実施形態では、標的結合部位は、それぞれがある特定の距離にある、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、典型的には最高で１００または８０個のアミノ酸離れた少なくとも２つの領域にわたって伸びる結合表面を伴う等、同じＥＤまたは少なくとも２つの異なるＥＤ内に２つ以上の非連続領域を含む立体構造結合部位である。具体的には、離れた結合領域は、互いに近接していない。具体的には、離れた結合領域は、それぞれのＥＶ表面タンパク質の配列において連続していない。
具体的には、結合部位は、離れた結合領域のそれぞれ、および必要に応じて１つもしくは複数のさらなる接触点、またはＴＥＤの領域を含む。具体的には、標的結合部位は、少なくとも２つの改変（例えば、合成のまたは変異導入された）領域内に接触点、および必要に応じて、合成でも変異導入されておらず、ＥＤの天然（野生型）領域である少なくとも１つのさらなる領域を含む。
具体的には、標的には、ＥＶ表面タンパク質の小胞外部分（特に、本明細書で記載されるＴＥＤを含む部分）内に組み入れられる結合部位の立体構造パラトープが結合し、パラトープは、ＴＥＤの離れた領域に接触エリア、例えばループおよび／またはヘリックス領域（複数可）を含む。適切なＴＥＤおよびそれぞれのＥＶ表面タンパク質は、個別の領域内の選択エリアに変異導入することによって好都合に産生される。例えば、本明細書で記載されるＴＥＤは、１つ、２つ、または３つの離れた領域内で変異導入される。
具体的には、標的結合部位は、本明細書で「人工」結合部位とも称される、野生型ＥＤまたは野生型ＥＶ表面タンパク質に天然に存在しない特異的な所定の標的を認識する新規の結合部位である。
具体的な実施形態によれば、標的結合部位は、１つまたは複数のＥＤ内に新たなまたは付加的な結合部位を含み、それによりＥＤ（複数可）は、標的に結合する新規のまたは付加的な特異性を有する。そのような新たな標的結合部位は、ＥＤ（複数可）の任意の天然に存在する結合部位と同じ標的に結合する特異性を有し得る、または例えば異なる標的を認識する異なる特異性を有し得る。
別の具体的な実施形態によれば、標的結合部位は、ＥＤ（複数可）の改変された天然に存在する結合部位であり得、それによりＥＤ（複数可）は、天然に存在する結合部位と同じ標的に結合する特異性を有する（とはいえ、微細な特異性または親和性は変化し得る）。
具体的な態様によれば、別個の分子として提供されるＴＥＤ、またはそのようなＴＥＤを含むタンパク質（ＥＶ表面タンパク質またはＴＳＰ等）は、同じ標的または異なる標的を特異的に認識する少なくとも１つまたは２つの異なる標的結合部位を含み得る。
本明細書で記載されるＴＥＤを、具体的には医学的目的のために使用して、例えば、本明細書で記載されるＴＥＤを含むタンパク質、または特にＥＶに付着した場合にそのようなＴＥＤを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）の治療有効量を送達し、それによって本明細書でさらに記載される標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を提供する。
具体的には、標的は、細胞標的、好ましくはマイトジェン受容体、サイトカイン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、膜輸送体、リポタンパク質、リポサッカライド、糖タンパク質、プロテオグリカン、または無細胞標的、好ましくはサイトカイン、人工タンパク質、もしくは人工表面構造からなる群から選択される。
具体的な態様によれば、標的は、ヒト細胞、例えば健常なもしくは罹患した対象を起源とする細胞、またはそれぞれの細胞溶解物である。罹患した表現型のヒト細胞が、好ましくは標的として使用される。
ある特定の態様によれば、標的結合部位は、新規の標的、すなわち標的結合部位がない、天然に存在するＥＤまたはＥＶ表面タンパク質であったなら結合しないであろう標的を特異的に認識する。
別の態様によれば、標的結合部位は、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質の天然リガンドである標的を、しかし、例えば標的結合の向上のために、選択性、微細な特異性、親和性、および／またはアビディティー等の改変された結合特性で特異的に認識する。例えば、テトラスパニンの天然リガンドは、例えば、細胞性病原体またはウイルス等の病原体の抗原または病原体である。本明細書で記載されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶによって表面タンパク質として提示されるテトラスパニンの三次構造を改変することによって、結合特性を向上させて、例えばそれぞれの病原体を標的にする結合の選択性および／または親和性の増加を達成し得る。
具体的には、標的は、抗原または抗原の抗原性構造、特に標的特異的抗体によって代わりに認識されるエピトープからなる。
具体的には、標的は細胞受容体である。具体的な例によれば、細胞受容体を標的にしている本明細書で記載されるＴＥＤまたはＴＳＰを含むＥＶは、レシピエント細胞膜と直接融合し得、ゆえにその膜タンパク質を原形質膜に組み入れ、それらのカーゴをレシピエント細胞の細胞質に送達する。
具体的には、標的は、抗原、例えば天然に存在する抗原または合成抗原である。ある特定の実施形態では、標的抗原は、罹患した患者の血液に存在し、抗原は、ＥＶの表面タンパク質による結合を受け、ゆえに患者の心血管系および／またはリンパ系から取り除かれる。具体的な例は、病原体、毒素、罹患したもしくはがん細胞、サイトカイン、または代謝産物等、非所望の天然作用物質である。ある特定のさらなる実施形態では、標的抗原は、例えば移植片もしくは埋込み物等の固体表面の合成抗原、または化学物質もしくは合成化合物等の可溶性化合物であり、それは、本明細書で記載される特異的結合因子（例えば、ＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶ）による有効な結合が起きると取り除かれ得る。
特異的標的は、野生型ＥＶによって典型的に認識される天然標的であり得る。しかしながら、本明細書で記載される結合因子に含まれる標的結合部位は、それを持たない野生型ＥＶによっては認識されない新規の標的を特異的に認識し得る。天然標的の中には、ウイルス抗原等の病原体がある。本明細書で記載される特異的結合因子（例えば、ＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶ）は、結合親和性、アビディティー、または特異性等の結合特徴の向上を有し得る新規の結合部位を通じてそのような天然標的に結合し得る。
具体的な態様によれば、本発明は、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）との少なくとも７０％の配列同一性、ならびに改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含む少なくとも１つのＥＤとを含む、標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であって、改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、ＴＳＰは本明細書でさらに記載されるように特徴付けられる、ＴＳＰを提供する。
具体的には、改変領域は、ＴＳＰから単離された場合により低い標的結合親和性を有する。
具体的には、本明細書で記載されるＴＳＰは、１つまたは複数の小胞外ドメインによって特徴付けられ、それらの少なくとも１つは標的結合性（「標的特異的」）である。具体的には、記載されるＴＳＰのＥＤは、本明細書で記載されるＴＥＤである。
具体的には、前記少なくとも１つの膜貫通ドメインは、小胞膜タンパク質のもの、または例えば野生型膜貫通ドメインの変異導入によってもしくは適切なアミノ酸配列のｄｅ ｎｏｖｏ合成によって産生される人工膜貫通ドメインである。
具体的には、膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質、例えば本明細書でさらに記載されるＥＶ表面タンパク質のいずれかを起源とするそれぞれの野生型膜貫通ドメイン配列との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７７％、９８％、９９％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つ、または１００％の配列同一性を含む。
具体的には、野生型ＴＭは、ヒトまたは非ヒト動物アミノ酸配列を含むまたはそれからなるもの等、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質のものである。
具体的には、ＴＭは、エクソソーム、微小胞、またはアポトーシス小体起源のもの、特に野生型エクソソーム、微小胞、アポトーシス小体タンパク質、または例えば小胞外領域に改変を含むそのような野生型タンパク質のものである小胞膜タンパク質のものである。
具体的には、野生型ＴＭは、それぞれの細胞または小胞にＥＶ表面タンパク質、特にヒトＥＶ表面タンパク質を結合させた場合に、細胞のまたは小胞の膜内に組み込まれ得るＥＶ表面タンパク質の野生型配列に含まれるまたはそれから構成されるＴＭアミノ酸配列のいずれか１つとの、９０、９５、９８、９９％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つを含む、または１００％の配列同一性を含む。
具体的には、膜貫通ドメインは、
ａ）膜貫通ドメインが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、もしくは配列番号１５０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８１；
ｂ）膜貫通ドメインが、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、もしくは配列番号１５４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ９；
ｃ）膜貫通ドメインが、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、もしくは配列番号１５８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ５３；
ｄ）膜貫通ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、もしくは配列番号１６２として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）膜貫通ドメインが、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、もしくは配列番号１６６として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ８２；
ｆ）膜貫通ドメインが、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、もしくは配列番号１７０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ６３；
ｇ）膜貫通ドメインが、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、もしくは配列番号１７４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ１５１；
ｈ）膜貫通ドメインが、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、もしくは配列番号１７８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含むもしくはそれからなる、ＣＤ３７；または
ｉ）膜貫通ドメインが、配列番号１７９として特定されたアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる、ＬＡＭＰ２
のうちのいずれか１つのものである。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質を呈示するＥＶまたは膜貫通ドメインの領域を決定する方法に応じて、ＴＭがいくつかのアミノ酸分、例えば１、２、３、４、または５個のアミノ酸分長くなるまたは短くなるように、ＴＭの配列は一方または両方の末端で変わり得る。
具体的な実施形態によれば、野生型ＥＤおよび前記少なくとも１つの膜貫通ドメインの両方とも、好ましくは、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ１５１；
ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤ３７；および
ｉ）配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬＡＭＰ２
からなる群から選択される、同じ哺乳動物ＥＶ表面タンパク質を起源とする。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、エクソソーム、微小胞、またはアポトーシス小体起源のもの、特に野生型エクソソーム、微小胞、アポトーシス小体タンパク質、または例えば小胞外領域に改変を含むそのような野生型タンパク質のものである小胞膜タンパク質である。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、細胞エクソソームを起源とするタンパク質、すなわちエクソソームタンパク質である。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、細胞微小胞を起源とするタンパク質、すなわち微小胞タンパク質である。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、アポトーシス小体を起源とするタンパク質、すなわちアポトーシス小体タンパク質である。
改変目的のために本明細書で使用されるエクソソームタンパク質、微小胞タンパク質、またはアポトーシス小体タンパク質は、細胞起源のものである、すなわちそれはそれぞれの細胞によって産生され得る、またはそれは人工であり、ｄｅ ｎｏｖｏ合成によって産生され得ることが十分に理解される。
具体的には、前記ＥＶ表面タンパク質は、人工標的結合部位を組み入れる構造を有するポリペプチド、タンパク質ドメイン、またはタンパク質である。そのようなポリペプチド、タンパク質ドメイン、またはタンパク質は、天然に存在し得る、または部分的にもしくは完全に合成であり得る。
具体的には、膜貫通ドメインの１つまたは２つは、表面タンパク質のＥＤに融合され、ＥＶの膜にＥＤを付着させ得る。
具体的な態様によれば、本発明は、脂質二重層膜の外表面に標的結合部位を呈示する、脂質二重層膜および本明細書で記載されるＴＥＤまたは本明細書で記載されるＴＳＰを含む標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を提供する。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤは、本明細書で記載されるＴＳＰまたは他の任意の適切な手段を通じて、例えばコンジュゲーション、融合、または親和性結合によって、ＥＶに結合され得る。
具体的には、本明細書で記載されるＴＳＰは、ＴＳＰに含まれる前記少なくとも１つの膜貫通ドメインを通じてＥＶに結合され得、特に前記膜貫通ドメイン（複数可）は小胞膜内にあり、それによりＴＳＰは、ＥＶの外表面にＴＥＤおよび必要に応じて少なくとも１つのさらなるＥＤ（標的結合性であってもなくてもよい）を提示している。
具体的には、前記少なくとも１つの膜貫通ドメインは、本明細書で記載されるＴＥＤ、例えば本明細書で記載されるＴＳＰを組み入れた任意の種類の標的結合分子に融合され得るアンカーとして働く。
具体的には、ＴＳＰは、同じ野生型ＥＶ表面タンパク質の少なくとも２つ、３つ、または４つの膜貫通ドメイン、好ましくは全ての膜貫通膜を含む。
具体的には、１つもしくは複数の（例えば、同じタイプまたは異なる）タンパク質の一連の１つを上回る数の膜貫通ドメイン、または人工膜貫通ドメインが使用され得、それによって小胞外ループ領域、すなわちＥＶの外側のループ構造を創出する。具体的には、少なくとも１つのループ構造を固定するために使用される膜貫通ドメインの数は、２、３、または４つである。具体的には、表面タンパク質は、１つまたは複数のループ、例えば少なくとも１、２、３、または４つのループを含む。しかし、ある特定の場合には、表面タンパク質は、ループなしの三次構造を含む。
具体的には、２つの膜貫通ドメインを使用して、本明細書で記載されるＴＳＰを含むＥＶの表面に１つの小胞外ループ構造を提示する。具体的な実施形態によれば、３つまたは４つの膜貫通ドメインを使用して、２つの小胞外ループ構造を提示し、４つまたは５つの膜貫通ドメインを使用して、３つの小胞外ループ構造を提示する。具体的には、本明細書で記載される１つのＴＳＰ内で、１つの膜貫通ドメインの後に、前記膜貫通ドメインから別の膜貫通ドメインにまたがる、またはループもしくはステム構造を安定化するもの等の１つもしくは複数の分子内結合を含むループ構造を小胞表面に接続するアミノ酸配列等、ループ構造が続く。ループ構造は、例えばペプチドループ配列のＮ末端またはＣ末端融合のいずれかによって小胞膜に結合するように、少なくとも１つの膜貫通ドメインが隣接し得ることが理解される。１つのみの膜貫通ドメインが隣接する場合、反対側の末端（膜貫通ドメインとの融合とは反対側にあるループ配列のＮまたはＣ末端）は、典型的には膜に固定されない、例えば解放された末端である。２つの膜貫通ドメインが、例えば膜貫通ドメインへのペプチドループ配列のＮ末端およびＣ末端融合の両方が隣接する場合、ループ構造は両側でＥＶ膜に固定される。
具体的には、ＴＳＰは、１つまたは複数のループ配列にまたがるいくつかの膜貫通ドメイン、特にＥＶの表面にテトラスパニンタンパク質の野生型ループ構造を提示し得る４つの膜貫通ドメイン、特に４つの膜貫通ドメインによって固定された２つの血管外ループを含むテトラスパン様タンパク質である。
具体的には、ＴＥＶは、身体組織、体液、または細胞培養物の真核生物または原核生物供給源細胞を起源としている。
具体的な実施形態によれば、ＴＥＶは小胞内担持物を運搬しており、例えば担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
ＥＶは、エクソソーム、微小胞、またはアポトーシス小体の膜等の脂質二重層膜を含む超微視的小胞である膜小胞であり得る。具体的には、ＥＶは、細胞によって産生されるまたは合成によって産生される。細胞によって産生された場合、ＥＶは、生物学的過程によって細胞外空間に細胞によって放出され得、表面タンパク質は、細胞放出の前または後に操作される。ＥＶは、例えば炭水化物構造を用いておよび／またはアミノ酸もしくはアミノ酸配列との融合によっておよび／または薬物、標識、もしくはタグ等の化学的化合物と共役させることによって、表面装飾され得る。
具体的には、脂質二重層膜は、膜表面タンパク質の前記少なくとも１つの膜貫通ドメイン、それぞれのコード配列の融合を通じて、あるいは化学的および／または親和性結合によって、ＴＥＤまたはＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）に固定されている。ある特定の場合には、表面タンパク質は、膜貫通ドメイン以外の手段によって、細胞外小胞の脂質二重層膜に固定される。そのようなアンカーは、例えばストレプトアビジン−ビオチンもしくはプロテインＡ−Ｆｃ相互作用等の親和性に基づく相互作用、または例えばマレイミド不含システイン等の共有結合に基づく相互作用を伴い得る。固定は、例えばクリックケミストリー共役により達成され得る。
膜に表面タンパク質を結合させるための例示的な技法は、Ｓ−Ｓ連結（ジスルフィド架橋）、バイオコンジュゲーションによる、例えばクリックケミストリーによる結合、またはそうでなければ共有結合等、アミノ酸側鎖の原子を連結させることを含む。代替的な技法は、ビオチンおよびアビジン等の親和性結合因子を採用して、膜に表面タンパク質を連結させる。
ある特定の場合には、１つまたは複数の（人工）標的結合部位が、本明細書で記載されるＴＥＶの１つまたは２つの表面タンパク質（同じタンパク質または異なる）に含まれる。具体的には、２つの異なる表面タンパク質を使用して、少なくとも２つの異なる結合部位を産生し得る、例えば同じまたは異なる抗原の異なるエピトープを認識し得る。具体的には、本明細書で記載されるＴＥＶは、単一もしくは二重特異性、またはさらにオリゴ特異性であり得る。
ある特定の場合には、本明細書で記載されるＴＥＶの付加的な標的結合部位は、抗体および抗体断片を含めたタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドに由来するもの、または結合部分を有する複合分子等、任意の結合構造を起源とし得る。具体的には、結合部位は、抗体の抗原結合性部分のもの、または酵素、接着タンパク質、リガンド、もしくは受容体のリガンド結合部分のうちのいずれか１つの結合部位であり得、結合部位は、結合パートナーのコグネート構造に結合し得る。ＥＶ表面タンパク質は、特に、抗体もしくは抗体断片のタンパク質ドメイン、または１つ、２つ、もしくはそれを上回る数の可変抗体ドメイン、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ＶＨ／ＶＬ二量体、ｓｃＦｃ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ）２を含むもの等、それぞれの抗体ドメインもしくは断片、または可溶性Ｔ細胞受容体、ダーピン（Ｄａｒｐｉｎ）等の他の生物学的結合因子の１つまたは複数の結合部位を含み得る。
ＣＤ８１の場合には配列番号７として特定されたＬＥＬ、またはＣＤ９の場合には配列番号１１８として特定されたＬＥＬ等、野生型ヒトテトラスパニンタンパク質ＬＥＬのアミノ酸配列との、好ましくは８０〜９０％の配列同一性に及ぶ、７５、８０、８５、または９０％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つによって特徴付けられる新規の標的結合部位を含む、改変テトラスパニンタンパク質が本明細書で具体的に記載される。
新規の標的結合部位を含む改変テトラスパニンタンパク質の具体的な例は、ＣＤ８１の場合には配列番号８７として特定されたアミノ酸配列、またはＣＤ９の場合には配列番号８９として特定されたアミノ酸配列等、全長野生型ヒトテトラスパニンタンパク質のアミノ酸配列との、好ましくは９０〜９８％の配列同一性に及ぶ、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、または９８％の配列同一性のうちの少なくともいずれか１つによって特徴付けられる。
具体的な例によれば、新規の標的結合部位は、配列番号７として特定されたＣＤ８１のＬＥＬ内、特に配列番号８７として特定された全長タンパク質のａａ１１３〜２０１領域内に改変領域（結合領域）を含む。具体的な実施形態は、ａａ１３０〜２０１内の新規の標的結合部位を指す。
具体的な例は、１６０〜１６２位および１８１〜１８９位で少なくとも１個のアミノ酸を置換する、ＣＤ８１のアミノ酸配列（配列番号８７）における改変を指す。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ９であり、結合残基は、以下の領域：１５５〜１６６；１２８〜１４２；１３０〜１４０；１６９〜１８０から選択される少なくとも１つまたは２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ９は、配列番号８９によって特定されたヒトＣＤ９である。ジスルフィド架橋のための好ましいＣｙｓ残基は１３２および１４０であり、番号付けは配列番号８９に従っている。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ５３であり、結合残基は、以下の領域：１４７〜１６０；１２１〜１３４；１２３〜１２９；１６４〜１６９から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ５３は、配列番号９０によって特定されたヒトＣＤ５３である。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＴＳＰＡＮ３２であり、結合残基は、以下の領域：１５８〜１７１；１３０〜１４４；１３２〜１３９；１７４〜１８３から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＴＳＰＡＮ３２は、配列番号９１によって特定されたヒトＴＳＰＡＮ３２である。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ８２であり、結合残基は、以下の領域：１５３〜１７２；１７８〜１８８；１２８〜１３７；１９４〜２１５から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ８２は、配列番号９２によって特定されたヒトＣＤ８２である。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ６３であり、結合残基は、以下の領域：１４９〜１６５；１７１〜１７６；１２７〜１３５；１７９〜１８９から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ６３は、配列番号９３によって特定されたヒトＣＤ６３である。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ１５１であり、結合残基は、以下の領域：１５９〜１７７；１８６〜１９１；１３５〜１４５；１９４〜２０６から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ１５１は、配列番号９４によって特定されたヒトＣＤ１５１である。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ３７であり、結合残基は、以下の領域：１５６〜１７７；１８３〜２０６；１３１〜１４１；２１８〜２２９から選択される少なくとも２つの異なる領域内に配置される。具体的には、ＣＤ３７は、配列番号９５によって特定されたヒトＣＤ３７である。
ＥＶ表面タンパク質またはそれぞれのＥＤ（または、ＥＶ表面タンパク質に含まれる膜貫通ドメイン以外の任意のドメイン）を所定の領域における変異導入に使用して、本明細書で記載される１つまたは複数の新規の標的結合部位を導入し得る。
新規の標的結合部位を含むさらなるＥＶ表面タンパク質は、それぞれの領域に変異導入することによって産生され得る。適切な領域を特定するために、テトラスパニンクラスＩ（例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、およびＴＳＰＡＮ３２）の大きな細胞外ループの配列は、ＣＤ８１等の鋳型を用いてＳｗｉｓｓｍｏｄｅｌモデリングサーバーを使用して解析されている。テトラスパニンクラスＩＩの代表であるＣＤ８２の大きな細胞外ループの配列は、タンパク質構造および機能予測のためのプログラム（ｉ−Ｔａｓｓｅｒモデリングサーバー）を使用してモデル化されている。テトラスパニンクラスＩＩ（ＣＤ６３、ＣＤ１５１、およびＣＤ３７）の配列は、ＣＤ８２モデル座標を使用してモデル化されている。
具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質（例えば、ＣＤ８１または他の任意のテトラスパニン）は、タンパク質の小胞外ループ構造を安定化する１つまたは複数の付加的なジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）に１つまたは複数のシステイン（複数可）を導入することによって安定化されているまたは熱安定化されている。具体的には、少なくとも１つの付加的なシステインが、表面タンパク質の小胞外ドメインの少なくとも１つの領域に導入される。具体的には、システインが、表面タンパク質の少なくとも２つの異なる領域に導入される。新規のシステイン（複数可）を導入することは、新規の（人工の）ジスルフィド結合を介した領域の接続を可能にし、それは通常ではシステインのスルフヒドリル（−ＳＨ）基の酸化により形成される。
特に、表面タンパク質の三次構造は、１つまたは複数の付加的な分子内結合により生じる１つまたは複数の付加的な小さなループ（複数可）によって改変され得る。そのような付加的な小さなループ（複数可）を使用して、人工結合部位のさらなる接触点を創出し得る。
１つまたは複数の付加的な分子内ジスルフィド結合（複数可）は、標準的方法によるタンパク質の熱安定性を判定する方法によって測定される、表面タンパク質の安定性を増加させることに成功した。安定化されたＥＶ表面タンパク質を足場として好都合に使用して、ＥＶ表面タンパク質内の所定の領域の変異導入によって、それぞれが異なる標的結合性または異なる標的結合特性を有する、ＥＶ表面タンパク質のレパートリーを産生し得る。そのようなレパートリーをライブラリーとして適切に使用して、目的の標的への結合因子を選択する。
具体的には、エンドースされた残基の数は、変異していないタンパク質に対する自由エネルギー変化にとって理論上決定的であることから、システインの対への変異導入の候補位置およびその後のシステイン結合の形成は、結晶構造の目視点検によって第１のステップで事前に選択され得る。具体的には、少なくとも１つの新規のシステイン結合が、事前に選択された候補に導入され、好ましくは新たなシステイン結合が、変異導入によるシステインの少なくとも１つまたは１つの対の導入によって創出される。
具体的に好ましい例は、還元された場合にＣｙｓ残基を接続する新規のジスルフィド結合を含む改変テトラスパニンを指し、Ｃｙｓ残基は、例えばループのＮおよびＣ末端にある２つの離れた部位でテトラスパニン配列（例えば、ＥＣの１つ、特にテトラスパニンのＬＥＬ）を変異させることによって導入され、それによってループ構造を安定化する。少なくとも１つのジスルフィド結合によって安定化された任意のそのようなループ構造を好ましくは使用して、そのようなループ構造内に新規の標的結合部位を操作するためにテトラスパニンに変異導入する。
具体的には、少なくとも２つのシステインが、挿入または置換のいずれかによって導入される。具体的な例によれば、付加的なシステインをＣＤ８１に導入して、ＬＥＬの三次構造を安定化しおよび／または改変する。
具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質はＣＤ８１であり、アミノ酸配列は、好ましくは１３４と１４４位および／または１３０と１４６位および／または１３５と１６８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つまたは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変される。
具体的には、ＣＤ８１はヒトＣＤ８１であり、第１のシステインは、アミノ酸１２０と２００の範囲内の位置に導入され、少なくとも第２のシステインは、アミノ酸１４３と２０１の範囲内の位置に導入され、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである。
具体的には、第１のシステインは、アミノ酸１３０と１４０の範囲内の位置に導入され、第２のシステインは、アミノ酸１４４と１７０の範囲内の位置に導入される。
具体的には、システインは、１３４および１４４位でヒトＣＤ８１配列（特に、ＬＥＬ等、ＣＤ８１のＥＤ）に導入され、それぞれＡ１３４ＣおよびＬ１４４Ｃに置換し、それによって、付加的な分子内ジスルフィド結合によりＣＤ８１のＬＥＬのヘリックスＡおよびヘリックスＢを接続する。あるいは、付加的なシステインはそれぞれ１３５および１６８位に導入され、それぞれＶ１３４ＣおよびＳ１４４Ｃに置換し、それによって、付加的な分子内ジスルフィド結合によりＣＤ８１の大きな細胞外ループのヘリックスＡおよびヘリックスＣを接続する。
具体的な実施形態によれば、Ｃｙｓ残基は、例えばＡｌａ１３４ＣｙｓおよびＬｙｓ１４４Ｃｙｓ突然変異によって、配列番号８７として特定されたＣＤ８１配列（特に、ＬＥＬ等、ＣＤ８１のＥＤ）に導入され、それによって、１３４および１４４位におけるシステインにまたがる新規のジスルフィド結合を導入する。
さらなる実施形態によれば、（付加的なまたは代替的な）Ｃｙｓ残基は、Ｖａｌ１３５ＣｙｓおよびＳｅｒ１６８Ｃｙｓ突然変異によって、配列番号８７として特定されたＣＤ８１配列に導入され、それによって、１３５および１６８位におけるシステインにまたがる新規のジスルフィド結合を導入する。さらなる実施形態によれば、（付加的なまたは代替的な）Ｃｙｓ残基は、Ａｌａ１３０ＣｙｓおよびＡｌａ１４６Ｃｙｓ突然変異によって、配列番号８７として特定されたＣＤ８１配列に導入され、それによって、１３０および１４６位におけるシステインにまたがる新規のジスルフィド結合を導入する。
さらなる実施形態によれば、（付加的なまたは代替的な）Ｃｙｓ残基は、Ｖａｌ１３５ＣｙｓおよびＳｅｒ１６８Ｃｙｓ突然変異によって、配列番号８７として特定されたＣＤ８１配列に導入され、それによって、１３５および１６８位におけるシステインにまたがる新規のジスルフィド結合を導入する。
具体的には、ヒトＣＤ８１のＥＤの少なくとも１つ、特にＬＥＬは、１３４と１４４位でおよび１３５と１６８位で付加的なシステインを導入するように改変され、それによって、ヘリックスＡをヘリックスＢにおよびヘリックスＡをヘリックスＣに接続する。そのＬＥＬにおいて強力に安定化する新規のジスルフィド結合Ａｌａ１３４Ｃｙｓ／Ｌｙｓ１４４ＣｙｓおよびＶａｌ１３５Ｃｙｓ／Ｓｅｒ１６８Ｃｙｓの組合せを有するそのようなＣＤ８１変異体は、少なくとも２０℃の融解温度の正のシフトの増加を示す。
具体的には、ヒトＣＤ９のＥＤの少なくとも１つ、特にＬＥＬは、付加的なシステインを導入するように改変され、それによって、１つまたは複数の新たな（付加的な）ジスルフィド架橋を得る。好ましくは、ジスルフィド架橋は、Ｌｙｓ２０ＣｙｓおよびＡｒｇ２８Ｃｙｓに変異させる等によって得ることが可能な、２０と２８位を連結しており、位置の番号付けはＣＤ９ ＬＥＬ（配列番号１１８）のものである。安定化されたバリアントの結果として生じた配列は、配列番号１２５を特異的に含むまたはそれからなる。
具体的には、変異した事前に選択された候補の熱安定性の増加は、野生型タンパク質と比較して、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５５℃分、熱アンフォールディングが生じる温度の増加によって示される。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶのいずれか１つは、１０−５Ｍ未満、好ましくは１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、もしくは１０−８Ｍ未満、またはさらに１０−９Ｍ未満のＫＤで前記標的に結合する親和性を有する。
通常、結合因子は、ＫＤ＜１０ｎＭを有する高親和性結合因子と見なされ、一部の場合には、例えば治療目的のためには、より高い親和性、例えばＫＤ＜１ｎＭまたはＫＤ＜０．１ｎＭまたはＫＤ＜０．０１ｎＭまたはＫＤ＜ｐＭ（ピコモル＝１０−１２Ｍ）を有するＥＶが提供される。
選択されたＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶが目的の標的に結合することが証明されると、選択された結合性ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、親和性成熟の標準的方法、例えば親和性成熟した抗体を産生するために典型的に使用されるそうした方法によって親和性成熟を受け得る。この目的のために、ほんの数個の点突然変異、例えば１、２、３、４、または５個、最高で１０個の点突然変異を、分子の１つの領域内にまたは分子全体内に導入して、増加した結合親和性を有する結合因子を単離するために選択され得る標的結合因子の新たなレパートリーを産生し得る。そのような親和性成熟した結合因子は、少なくとも１または２対数のＫＤ差を有する増加した結合親和性を呈し得る。
特異的結合は、従来のイムノアッセイ等の適切な結合アッセイにおいて判定され得る。イムノアッセイにおいて結合を検出するための、当技術分野において公知の数多くの方法がある。ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット、ＢＩＡｃｏｒｅ等の技法を使用した競合および非競合アッセイシステムを含めた、当技術分野において公知の様々なイムノアッセイが使用され得る。
好ましい実施形態によれば、本明細書で記載されるＴＥＶは、真核生物または原核生物供給源細胞を起源としている。供給源細胞は、本明細書で記載されるＥＶを産生し得るドナー細胞として本明細書で理解される。しかしながら、供給源細胞は単に、例えば、別の場合であれば供給源細胞によって産生されるであろう１つまたは複数の構成要素（膜貫通ドメインおよび／または表面タンパク質等）を使用し、かつ細胞輸送メカニズムに依存することなく本明細書で記載される特質を有するＴＥＶを構築して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれの合成ＥＶを産生するための鋳型としても働き得る。
例示的な真核生物は、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、または酵母である。具体的な例は、ヒトまたは非ヒト動物起源、特にＣＨＯ細胞等のチャイニーズハムスター由来細胞を含めた哺乳動物、植物、特にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａもしくはＺｅａ ｍａｙｓ、または真菌、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの細胞である。
例示的な原核生物は細菌である。グラム陰性細菌由来のＥＶは、外膜小胞（ＯＭＶ）として知られる。具体的な例は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓもしくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ病原体、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＥＶである。
具体的には、供給源細胞は、身体組織、体液、または細胞培養物のもの、好ましくは動物もしくは植物細胞のもの；または哺乳動物の体液もしくは組織のもの、好ましくは血液、尿、羊水、腹水、脳脊髄液、唾液、滑液、もしくは骨髄のものである。具体的には、本明細書で記載されるＥＶは、供給源細胞の細胞培養によって産生される。
具体的には、組織は、腎臓、脳、または胎盤等の臓器のものである。具体的には、組織は、腫瘍もしくは転移組織、または良性組織である。
具体的には、供給源細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、羊膜幹細胞、もしくは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞等の幹細胞、樹状細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、血液細胞、または免疫細胞である。具体的には、ＥＶの供給源細胞は、羊膜由来複能性前駆細胞、絨毛膜由来間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、胚性幹細胞、外胚葉間質細胞、内胚葉間質細胞、嗅神経鞘細胞、歯髄幹細胞、または不死化間葉系幹細胞であり得る。
具体的には、供給源細胞は、人工多能性幹細胞または成体幹細胞、上皮細胞、およびがん細胞等、正常なまたは不死化されたヒト細胞からなる群から選択される。
具体的には、供給源細胞は、哺乳動物宿主細胞等の組換え宿主細胞の細胞系、例えばヒト初代細胞、テロメラーゼ不死化細胞系、またはアデノウイルスＥ１Ａ、ＨＰＶ由来Ｅ６、ＥＢＶ由来がん遺伝子を含めたウイルスがん遺伝子、ＳＶ４０、もしくは転写因子の組合せによって不死化された細胞系等、細胞工場として使用される細胞系である。具体的には、テロメラーゼ不死化内皮細胞もしくは間葉系幹細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ、またはＣＡＰを含めた細胞系。
大規模なＥＶ産生において適切に採用される細胞は、間葉系幹細胞、樹状細胞、およびＨＥＫ細胞または２９３Ｔ細胞を含む。
具体的には、供給源細胞は、哺乳動物幹細胞または樹状細胞、好ましくはヒト起源のものである。
具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質は、供給源細胞に対して内因性である。しかし、内因性ＥＶ表面タンパク質は、典型的に、本明細書で記載されるＴＥＶによって改変表面タンパク質として提示される。
さらなる具体的な実施形態によれば、ＥＶ表面タンパク質は、供給源細胞に対して異種である。異種ＥＶ表面タンパク質は、異なるタイプの供給源細胞を起源とし得る、または天然に存在しない合成表面タンパク質であり得る。合成表面タンパク質を使用する場合、新規の標的結合部位は、いかなるさらなる改変もなく、分子内で合成され得る。改変された天然表面タンパク質とは異なり、合成表面タンパク質は、典型的に、天然（野生型）表面タンパク質との配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性）を有しない。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＶは、１０〜１０００ｎｍ、好ましくは３０〜１５０ｎｍに及ぶサイズを有する。
具体的には、本明細書で記載されるＴＥＶは、密度勾配超遠心分離等によって測定される、１．０〜１．４に及ぶ、好ましくは１．１〜１．２（ｇ／ｃｍ３）の浮遊密度を有する。
具体的な実施形態によれば、本明細書で記載されるＴＥＶは小胞内担持物を運搬している。具体的には、担持物は、１０−１４〜１０−１０μｌの体積（１つのＥＶあたりの体積）の範囲内にある。具体的には、担持物は、例えば５〜９０％の担持効率で、活性物質または活性物質の混合物を含む。
具体的な実施形態によれば、本明細書で記載される結合因子（特に、本明細書で記載されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶ）は、それを必要とする対象を処置することにおける医学的使用のために提供される。医学的使用は、本明細書で記載されるＴＥＶを投与することによる、または例えば体液から非所望の物質を除去する等のための試薬もしくは親和性基質としてのｅｘ ｖｉｖｏ使用による、疾患状態の治療のための処置を包含する。さらなる医学的使用は、能動免疫療法等のための、例えば対象の免疫系に抗原を提示するために、免疫応答を誘発するためのものである。
ＥＶは、それ自体で治療剤として、または特異的担持物を送達する送達システムとして使用され得る。具体的な例によれば、小胞内担持物は、小胞膜内にカプセル化された活性物質または薬物である。具体的には、ＥＶに天然に存在する要素と共同で作用する活性物質が使用される。別の具体的な例によれば、ＥＶは、従来の投与経路から高度に保護されることもある、特異的標的に到達するためのビヒクルとしてのみ働く。
具体的には、本明細書で記載される結合因子は、任意の化粧品、食品、または産業目的のために提供される。具体的な実施形態は、例えば化粧品または食品目的のために、脂質もしくは油性組成物の状態で提供される、またはカプセル化されるそのようなＴＥＶを指す。産業目的は、それぞれ特異的結合因子を解析するまたは準備する（産業規模で）等のための、解析または準備目的を包含する。
具体的には、ＴＥＶは、化合物を用いた標的療法を必要とする対象を処置することにおける標的化ベクターとしての医学的使用のための、自家または異種活性物質、特に異種化合物を含む担持物を運搬している。
具体的な態様によれば、本発明は、治療または診断目的のために、本明細書で記載される結合因子、特に本明細書で記載されるＴＥＶまたはＴＥＶ調製物の有効量を対象に投与して、ある特定の状態、特に疾患状態を好転させるまたは検出する等による、それを必要とする対象を処置する方法を提供する。
具体的には、有効量のＴＥＶが使用され、投薬量は、投与される小胞内担持物に従って測定される。
具体的には、担持物は、少なくとも１つの自家または異種化合物を含む。具体的には、担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
小分子薬物は、生物学的過程を調節し得る低分子量（＜９００Ｄ）有機化合物として本明細書で理解される。小分子は、多様な生物学的機能または適用を有し得、細胞シグナル伝達分子、医学における薬物、農業における殺虫剤として、および他の多くの役割において働く。これらの化合物は、天然（二次代謝産物等）または人工（抗ウイルスまたは化学療法薬物等）であり得；それらは、疾患に対して有益な効果を有し得る（薬物等）または有害であり得る（奇形性物質および発がん物質等）。
具体的な態様によれば、ＴＥＶは、前記対象に対して自家である供給源細胞を起源としている。具体的には、対象の必要に応じて、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のためにｉｎ ｖｉｔｒｏ（対象の身体の外側）で改変されおよび／または担持される、自家起源のＴＥＶが使用される。
具体的な態様によれば、本発明は、単離されたＴＥＶを含むＴＥＶ調製物を提供する。ＴＥＶ調製物は、同じ標的特異性を有する、少なくとも５０％、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のうちの少なくともいずれか１つのＥＶからなる均質なＥＶ集団によって具体的に特徴付けられる。
具体的な態様によれば、ＴＥＶ調製物は、１００〜１５０ｎｍまたは１２０〜１４０ｎｍのメジアン径を有する均質な調製物である。具体的な産出量は、好ましくは供給源細胞あたり少なくとも１０００個のＥＶ、より好ましくは供給源細胞あたり少なくとも１５００個または少なくとも１６００個のＥＶである。
具体的には、ＴＥＶ調製物は、保管に安定した水溶液でまたは凍結乾燥調製物として提供される。
本発明は、好ましくは皮内、皮下、静脈内、局所的、または経口使用のための製剤において、本明細書で記載されるＴＥＤまたはＴＳＰまたはＴＥＶのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む医薬調製物をさらに提供する。
具体的な態様によれば、本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の小胞外ドメイン（ＥＤ）をコードするコード配列を含むポリヌクレオチドを変異導入法によって改変して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域内にＥＤアミノ酸配列の突然変異を得て、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れ、それによって、それぞれが異なる標的結合部位を含む多様な標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生するステップ、ならびに所定の標的を特異的に認識するＴＥＤを含むタンパク質を選択するステップ、ならびに選択されたタンパク質を産生するステップを含む、ＥＶ表面タンパク質のＴＥＤを含むタンパク質を産生する方法を提供する。
具体的には、ポリヌクレオチドのレパートリーは、外表面に多様なＴＥＤを呈示し、好ましくは、酵母、ファージ、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する遺伝子パッケージに含まれる。
具体的には、選択されたＴＥＤを含むタンパク質は、本明細書で記載されるＴＳＰである。
具体的には、選択されたＴＥＤは、本明細書でさらに記載されるように特徴付けられる。
本発明は、
ａ）本明細書で記載されるＴＳＰをコードするポリヌクレオチドを供給源細胞または供給源細胞混合物に導入するステップ；
ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記細胞（複数可）を培養するステップ；
ｃ）ＴＳＰの標的結合部位を含むＴＥＶを含む画分を単離するステップ；および
ｄ）前記画分に含まれるＴＥＶの調製物を産生するステップ
を含む、本明細書で記載されるＴＥＶ調製物を産生する方法をさらに提供する。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物は、対象の生体試料から得られる。
具体的には、前記対象の生体試料は、血液、尿、羊水、腹水、脳脊髄液、唾液、滑液、または骨髄からなる群から選択される。
具体的には、供給源細胞は、細胞培養で培養する前に単離される、または生体試料内で培養される。
具体的には、対象は、人間または非ヒト動物を含めた哺乳動物等の動物である。
さらなる具体的な実施形態によれば、
ａ）ＴＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子を幹細胞に導入するステップ；
ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記幹細胞を培養するステップ；
ｃ）例えば標的結合特異性に従って、ＴＥＶを含む画分を単離するステップ；および
ｄ）ＴＥＶ調製物を産生するステップ
を含む、対象の幹細胞を起源としている本明細書で記載されるＴＥＶの調製物を産生する方法が提供される。
具体的には、幹細胞は、細胞培養で培養する前に単離される、または生体試料内で培養される。
具体的な実施形態によれば、ＥＶは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られる。ＭＳＣは、細胞培養物のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖によって、例えば胚性幹細胞コロニーを分散させることによって調製され得る。ＭＳＣからのＥＶ、特にエクソソームの単離は、間葉系幹細胞馴化培地中で行われ得る。培地は、ＭＳＣ、その子孫、またはそれに由来する細胞系を細胞培養培地中で培養し、かつ細胞培養培地を単離することによって得られ得る。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は自家使用のために製剤化される。
具体的には、本明細書で記載される方法によって産生される自家ＴＥＶ調製物であって、供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は同一の対象に投与される、自家ＴＥＶ調製物が本明細書で提供される。
具体的な実施形態によれば、ＴＥＶは腫瘍に標的化され得、前記腫瘍から直接得られた抗原を担持すると、担持したＴＥＶが産生され得る。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物に導入されるポリヌクレオチドまたは遺伝子はＴＳＰをコードし、ＴＳＰのＥＤは、ＴＳＰの膜貫通ドメインの少なくとも１つを介してＥＶの表面に結合される。
具体的な実施形態によれば、供給源細胞へのＴＳＰをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の導入は、トランスフェクションにより達成され得る。具体的には、培養する前に、細胞（複数可）に前記遺伝子をトランスフェクトする。具体的には、電気穿孔、またはｓｉＲＮＡ等のアポトーシス誘導剤を用いたトランスフェクション、特にリポソームに基づくトランスフェクション等、一般に使用されるトランスフェクション法のいずれかによって、コード遺伝子が細胞に導入される。
具体的な実施形態によれば、供給源細胞または供給源細胞混合物は、膜小胞を産生するおよびＴＥＶを放出する条件下で細胞培養で培養され、それによって培養上清にＴＥＶを得る。
具体的には、細胞培養条件は、種々の供給源細胞、または供給源細胞を含む種々の生体試料に適応される。具体的な態様によれば、生体試料は、対象由来の生物学的流体（骨髄、末梢血等）、培養上清、細胞溶解物、事前に精製された溶液、または膜小胞を含む他の任意の組成物からなる。ＴＥＶの産生のための具体的な細胞培養法は、酸化ストレスを誘導するステップをさらに伴い得る。酸化ストレスは、外部から添加されたサイトカインによって、または過酸化水素等の酸化剤によって誘導され得る。
エクソソームは合成もされ得るまたは人工的に製造もされ得る、すなわちヒトまたは非ヒト細胞から単離されるわけではない。単離される代わりに、エクソソームは、様々な脂質形成技術によって合成され得る。
具体的には、供給源細胞または供給源細胞混合物は、好ましくは前記小胞に小胞内担持させることによって、化合物を運搬する細胞外小胞を産生する条件下で、活性物質、例えば異種化合物を含む細胞培養で培養される。
具体的には、前記小胞内担持は、インキュベーション、必要に応じて膜を分断することによる、または膜の構成要素に担持物を結合させることによるものである。特に、ＴＥＶは、試薬に基づく方法（リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ−デキストラン、活性化デンドリマー、磁気ビーズ）、または装置に基づく方法（電気穿孔、超音波処理、バイオリスティック技術、マイクロインジェクション、レーザーフェクション（ｌａｓｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）、オプトインジェクション（ｏｐｔｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ））を含めた、任意の適切なトランスフェクション技法によって担持される。あるいは、ＴＥＶは、膜に化合物を結合させるまたは融合させることによって、例えば膜リポタンパク質に結合させるまたはそれとの融合によって担持され得る。
ＴＥＶを担持するステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで行われ得る。
ＴＥＶは、細胞外小胞を産生する前または産生した後に担持され得る。
具体的には、改変を含むＴＥＶを産生する等のための、生物学的、酵素的、および／または化学的反応を採用する、例えば表面タンパク質グリコシル化を改変するステップ（例えば、シアリル化、フコシル化、または非グリコシル化による）、翻訳後修飾、および／あるいは化学的化合物、薬物、標識、タグ、または酵素的（例えば、酵素基質）もしくは化学的反応基を共役させるステップを採用する任意の適切な方法によって、供給源細胞はさらに表面装飾され得る。
ＴＥＶ、特に微小胞またはエクソソームの単離に関しては、供給源細胞の細胞培養の培地を回収し、細胞およびデブリを事前に浄化し、一連の（超）遠心分離ステップに供する。その後、結果として生じたＴＥＶペレットを、通常では、ショ糖密度勾配遠心分離に供して、均質なＥＶ集団を分離する。具体的には、培養上清を、膜小胞で富化されるように処置する。特に、膜小胞産生細胞の集団の培養上清からまたは生体試料から得られた事前に精製された溶液を、遠心分離、浄化、限外濾過、ナノ濾過、および／または親和性クロマトグラフィ等の処置に供する。
細胞培養培地または上清は、特にタンジェンシャル力による濾過または限外濾過を採用した、例えば特定の多孔質サイズまたは特定の分子量カットオフを有する膜を通じて濾過され得る。
具体的には、ＴＥＶ含有画分を単離し、必要に応じて、親和性リガンドへの結合、遠心分離、クロマトグラフィ、浄化、限外濾過、またはナノ濾過のうちのいずれか１つまたは複数によって濃縮する。
具体的な態様によれば、ＴＥＶを調製する、特に生体試料から精製する方法は、少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィステップを含む。セルロース、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）、アガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、エチレングリコール−メタクリレート共重合体、またはその混合物、例えばアガロース−デキストラン混合物等を含めた、種々のタイプのアニオン交換材料を使用して、アニオン交換クロマトグラフィを実施し得る。カラムに保持されたＥＶは、種々のやり方で、特に増加する濃度の生理食塩水勾配の通過を使用して溶出され得る。典型的に、このやり方で精製された種々の画分は、連続的な分光光度の読み取りを使用して、カラム出口でそれらの光学密度を測定することによって検出される。
代替手段として、またはアニオン交換クロマトグラフィステップに加えて、ゲル浸透クロマトグラフィが使用され得る。典型的に、シリカ、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、エチレングリコール−メタクリレート共重合体、またはその混合物、例えばアガロース−デキストラン混合物から選択される材料を使用して、ゲル浸透クロマトグラフィステップを実施する。
本発明は、それぞれが、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有する、本明細書で記載される多様な、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＥＤうちの少なくともいずれかを含むＴＥＤライブラリーをさらに提供する。
好ましくは、ＴＥＤのライブラリーは、それぞれが異なる改変領域および／または標的特異性を有する、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＥＤのうちの少なくともいずれかを含む。具体的には、ＴＥＤのライブラリーのレパートリーは、異なる標的特異性を有する少なくとも２×１０６、１０７、２×１０７、１０８、または２×１０８個のＴＥＤを含む。
本発明は、それぞれが、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有する、本明細書で記載される多様な、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＳＤうちの少なくともいずれかを含むＴＳＰライブラリーをさらに提供する。
好ましくは、ＴＳＤのライブラリーは、それぞれが異なる改変領域および／または標的特異性を有する、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＳＤのうちの少なくともいずれかを含む。具体的には、ＴＳＤのライブラリーのレパートリーは、異なる標的特異性を有する少なくとも２×１０６、１０７、２×１０７、１０８、または２×１０８個のＴＳＤを含む。
本発明は、それぞれが、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有する、本明細書で記載される多様な、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＥＶうちの少なくともいずれかを含むＴＥＶライブラリーをさらに提供する。
好ましくは、ＴＥＶのライブラリーは、それぞれが異なる改変領域および／または標的特異性を有する、１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＴＥＶのうちの少なくともいずれかを含む。具体的には、ＴＥＶのライブラリーのレパートリーは、異なる標的特異性を有する少なくとも２×１０６、１０７、２×１０７、１０８、または２×１０８個のＴＥＶを含む。
具体的な態様によれば、本発明は、本明細書でさらに記載される方法によって産生される、本明細書で記載されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶ等の結合因子のライブラリーをさらに提供する。具体的には、任意のそのようなライブラリーを産生する方法は、ＥＶ表面タンパク質のＥＤをコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列に変異導入法によって変異導入して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型ＥＤ配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの所定の改変領域内に前記ＥＤの突然変異を得て、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質内に新規の標的結合部位を組み入れるステップを含む。
本発明は、
ａ）それぞれが異なる標的結合部位を含む、多様な標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを提供するステップ；
ｂ）前記レパートリーを前記供給源細胞（複数可）に導入するステップ；および
ｂ）異なる標的結合特異性を有する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のレパートリーを含む画分を単離して、ＴＥＶのライブラリーを産生するステップ
を含む、標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のライブラリーを産生する方法であって、ＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入法によって変異導入して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域内に前記ＥＶ表面タンパク質のＥＤの突然変異を得て、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れることによって、ポリヌクレオチドのレパートリーは産生される、ＴＥＶのライブラリーを産生する方法をさらに提供する。
具体的には、ＥＤの少なくとも所定の領域内の前記ポリヌクレオチドまたは遺伝子を改変して、本明細書で記載される改変領域を産生する変異導入法によって、レパートリーは産生され得る。具体的には、前記変異導入法を適用して、改変領域内にランダム化アミノ酸配列を得る。具体的には、前記変異導入法は、本明細書で記載される前記ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質の少なくとも１つまたは２つの離れた領域の変異導入を採用し、それによって、それぞれが異なる結合特異性を有する、多様なＥＤまたはＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生し、標的を特異的に認識するＴＥＤまたはＴＥＶをコードするポリヌクレオチドを選択する。具体的には、ポリヌクレオチドのレパートリーは、細胞外小胞の外表面に多様な表面タンパク質を呈示する遺伝子パッケージに含まれる。
具体的には、本明細書でさらに記載されるディスプレイパッケージ、例えば本明細書で記載される表面タンパク質をコードする複製可能な遺伝子パッケージが使用され、ディスプレイパッケージは、好ましくはエクソソーム、微小胞、ナノ粒子、およびリポソームからなる群から選択される、天然または人工起源の細胞外小胞上に呈示される。
必要に応じて、細胞培養においてそれぞれのＴＥＤもしくはＴＳＰを産生するためにおよび／または前記ＴＥＤもしくはＴＳＰを含むそれぞれのＴＥＶを産生するために、ＴＥＤまたはＴＳＰをコードするポリヌクレオチドが選択される。
表面タンパク質またはそれぞれのコード配列の変異導入を、ＥＶを使用してまたは使用せずに実施して、ＥＶ表面タンパク質の所定の領域内に、特にＥＶまたは細胞の外表面に提示され得るそうした領域内（すなわち、表面タンパク質の小胞外または細胞外部分）に、１つまたは複数の点突然変異（複数可）を導入等し得る。
具体的には、外表面に多様な表面タンパク質を呈示する遺伝子パッケージに含まれる、ポリヌクレオチドのレパートリーが産生される。
具体的には、ディスプレイパッケージは、バクテリオファージ、ファージミド、および細胞ディスプレイパッケージ、好ましくは細菌、哺乳動物、もしくは昆虫細胞、もしくは酵母、またはリボソームディスプレイシステム等のｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイシステムからなる群から選択されるもの等、本明細書で記載される表面タンパク質をコードする複製可能な遺伝子パッケージである。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイシステムは、関連した結合特異性および親和性を呈する対応するタンパク質配列に核酸情報を特異的に翻訳する。具体的に好ましい方法は、ファージ、酵母、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する。
具体的な例によれば、本明細書で記載されるＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、遺伝子ＩＩＩ、遺伝子ＶＩ、遺伝子ＶＩＩ、遺伝子ＶＩＩＩ、または遺伝子ＩＸのタンパク質産物からなる群から選択されるアンカータンパク質を介して、バクテリオファージまたはファージミドによって呈示され得、遺伝子ＩＩＩは、それがファージミドまたはファージのＮ末端に配置されることからしばしば望ましい。
別の具体的な例によれば、本明細書で記載されるＥＤまたはＥＶ表面タンパク質は、タンパク質をルーチン的に呈示する酵母によって、例えばＡｇａ２酵母表面タンパク質への融合によって呈示され得る。これは、酵母ディスプレイライブラリーにルーチン的に使用される。酵母細胞に固定することは、例えばプロテインＡ等のアンカータンパク質の共発現によっても達成され得る。あるいは、可溶性表面タンパク質は、酵母細胞から分泌され得、酵母細胞表面の誘導体化後に、プロテインＡまたは所望の標的配列を特異的に認識する抗体の外部からの添加によって捕捉され得る。
例えば種々の結合特性を有する、種々の表面タンパク質を呈示する一連のディスプレイパッケージが提供され得る。特に、同じ表面タンパク質の種々の改変、例えば表面タンパク質の人工結合部位内の種々の改変を呈示する一連のディスプレイパッケージを提供して、種々の結合特性を有するそうしたタンパク質を呈示し得る。
本明細書で記載される方法では、ディスプレイライブラリーの一連のメンバーが、それらの標的結合特性に応じて選択されるように、ディスプレイライブラリーを標的と特異的に接触させる。標的を認識するディスプレイライブラリーのメンバーの中で、１つまたは複数のライブラリーメンバーが、高い標的特異性および／または親和性を有するとして特定され得る。そのような特定は、任意の種類の結合因子を選択するステップ、すなわち結合特異性に従った選択として具体的に理解され得る。
具体的な方法は、以下の方法および手段のいずれかを使用して、結合および機能性の両方に従った同時選択を可能にする：蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、任意の検出抗体、結合剤タンパク質、またはアポトーシス等の結合もしくは表現型変化を記録するアネキシンＶ等の色素と合わせて任意の適当な標的細胞を用いて、これらの調査にルーチン的に利用される。任意の同様の高感度システムは、微視的感度の進化したイメージングまたは光検出システムによって、標的細胞への結合事象を追跡し得および特徴付け得る。ＦＡＣＳは、結合因子を分画し、細胞におけるそれらの対応する表現型変化を特徴付けるための主な技法でもある。
加えて、ハイスループットプロテオミクスおよび細胞生物学においても使用される広範な技術があり、その高度に自動化された微視的解析は、本目的に最も有用なものの１つである。向上は、試料中の個々の細胞をロボットで解析する自動高情報含有量デジタル顕微鏡法を用いて達成され得る。
適切な結合因子が選択されると、そのコード配列を使用して、表面タンパク質を産生し得、または前記ＴＳＰを含む融合タンパク質、例えば膜貫通ドメインと前記ＴＥＤとの融合体を操作し得、小胞膜および／もしくは細胞膜の表面にそのようなタンパク質を発現する組換え細胞を産生し得る、または代わりに、ＴＳＰを含むおよび／もしくはその外表面にＴＥＤを提示する本明細書で記載されるＴＥＶを産生し得る。
特異的標的結合を可能にする条件下でレパートリーと標的とを接触させることによって、本明細書で記載されるライブラリーから、所定の標的を特異的に認識する候補結合因子を選択し、証明された標的結合特異性を有する候補結合因子を選択しおよび単離する方法が本明細書でさらに提供される。
本明細書で記載される方法では、標的にライブラリーのメンバーが結合するように、ライブラリーを標的と、例えば標的抗原または標的細胞と特異的に接触させる。標的を認識するライブラリーのメンバーの中で、１つまたは複数のライブラリーメンバーが、高い標的特異性および／または親和性を有するとして特定され得る。そのような特定は、任意の種類の結合因子を選択するステップ、すなわち結合特異性に従った選択として具体的に理解され得る。
本明細書において使用される配列。配列番号７、野生型ヒトＣＤ８１ ＬＥＬのアミノ酸配列配列番号８、野生型ヒトＣＤ８１ ＬＥＬのヌクレオチド配列配列番号８７、ヒトＣＤ８１のアミノ酸配列配列番号８８、ヒトＣＤ８１のヌクレオチド配列配列番号８９、ヒトＣＤ９のアミノ酸配列配列番号９０、ヒトＣＤ５３のアミノ酸配列配列番号９１、ヒトＴＳＰＡＮ３２のアミノ酸配列配列番号９２、ヒトＣＤ８２のアミノ酸配列配列番号９３、ヒトＣＤ６３のアミノ酸配列配列番号９４、ヒトＣＤ１５１のアミノ酸配列配列番号９５、ヒトＣＤ３７のアミノ酸配列配列番号９６、ヒトＬＡＭＰ２のアミノ酸配列ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＴＳＰＡＮ３２、ＣＤ８２、ＣＤ６３、ＣＤ１５１、ＣＤ３７、ＬＡＭＰ２の血管外ドメイン：配列番号１３０、ヒトＣＤ８１のＥＣ１配列番号１３１、ヒトＣＤ８１のＥＣ２配列番号１３２、ヒトＣＤ９のＥＣ１配列番号１８２、ヒトＣＤ９のＥＣ１配列番号１３３、ヒトＣＤ９のＥＣ２配列番号１３４、ヒトＣＤ５３のＥＣ１配列番号１３５、ヒトＣＤ５３のＥＣ２配列番号１３６、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＥＣ１配列番号１３７、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＥＣ２配列番号１３８、ヒトＣＤ８２のＥＣ１配列番号１３９、ヒトＣＤ８２のＥＣ２配列番号１４０、ヒトＣＤ６３のＥＣ１配列番号１４１、ヒトＣＤ６３のＥＣ２配列番号１４２、ヒトＣＤ１５１のＥＣ１配列番号１４３、ヒトＣＤ１５１のＥＣ２配列番号１４４、ヒトＣＤ３７のＥＣ１配列番号１４５、ヒトＣＤ３７のＥＣ２配列番号１４６、ヒトＬＡＭＰ２のＥＤ（ＥＣ）ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＴＳＰＡＮ３２、ＣＤ８２、ＣＤ６３、ＣＤ１５１、ＣＤ３７の４つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１〜４）；ＬＡＭＰ２の１つのＴＭ：配列番号１４７、ヒトＣＤ８１のＴＭ１配列番号１４８、ヒトＣＤ８１のＴＭ２配列番号１４９、ヒトＣＤ８１のＴＭ３配列番号１５０、ヒトＣＤ８１のＴＭ４配列番号１５１、ヒトＣＤ９のＴＭ１配列番号１５２、ヒトＣＤ９のＴＭ２配列番号１５３、ヒトＣＤ９のＴＭ３配列番号１５４、ヒトＣＤ９のＴＭ４配列番号１５５、ヒトＣＤ５３のＴＭ１配列番号１５６、ヒトＣＤ５３のＴＭ２配列番号１５７、ヒトＣＤ５３のＴＭ３配列番号１５８、ヒトＣＤ５３のＴＭ４配列番号１５９、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＴＭ１配列番号１６０、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＴＭ２配列番号１６１、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＴＭ３配列番号１６２、ヒトＴＳＰＡＮ３２のＴＭ４配列番号１６３、ヒトＣＤ８２のＴＭ１配列番号１６４、ヒトＣＤ８２のＴＭ２配列番号１６５、ヒトＣＤ８２のＴＭ３配列番号１６６、ヒトＣＤ８２のＴＭ４配列番号１６７、ヒトＣＤ６３のＴＭ１配列番号１６８、ヒトＣＤ６３のＴＭ２配列番号１６９、ヒトＣＤ６３のＴＭ３配列番号１７０、ヒトＣＤ６３のＴＭ４配列番号１７１、ヒトＣＤ１５１のＴＭ１配列番号１７２、ヒトＣＤ１５１のＴＭ２配列番号１７３、ヒトＣＤ１５１のＴＭ３配列番号１７４、ヒトＣＤ１５１のＴＭ４配列番号１７５、ヒトＣＤ３７のＴＭ１配列番号１７６、ヒトＣＤ３７のＴＭ２配列番号１７７、ヒトＣＤ３７のＴＭ３配列番号１７８、ヒトＣＤ３７のＴＭ４配列番号１７９、ヒトＬＡＭＰ２のＴＭさらなる例示的テトラスパニン：ＴＳＰＡＮ８、ＮＰ＿００１３５６６８９、配列番号１８４ＴＳＰＡＮ１４、ＮＰ＿００１１２１７８１、配列番号１８５ＣＤ２３１（ＴＳＰＡＮ７）、ＮＰ＿００４６０６、配列番号１８６タンパク質のインテグリンファミリーＣＤ４９ｄ、ＮＰ＿０００８７６、配列番号１８７ＩＴＧＢ５、ＮＰ＿００１３４１６９４．１、配列番号１８８ＩＴＧＢ６、ＮＰ＿０００８７９．２、配列番号１８９ＩＴＧＢ７、ＮＰ＿０００８８０．１、配列番号１９０ＣＤ７１、ＮＰ＿００３２２５、配列番号１９１プロテオグリカンＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＮＰ＿００１００６９４７、配列番号１９２シンデカン−２、ＮＰ＿００２９８９、配列番号１９３シンデカン−３、ＮＰ＿０５５４６９、配列番号１９４シンデカン−４、ＮＰ＿００２９９０、配列番号１９５ＨＳＰＧ２、ＮＰ＿００１２７８７８９．１、配列番号１９６５つの膜貫通ドメインタンパク質ファミリーＣＤ１３３、ＸＰ＿０１１５１２１９５、配列番号１９５Ｉ型膜貫通タンパク質ＣＤ５０、ＮＰ＿００１３０７５３４、配列番号１９６ＣＤ１０２、ＮＰ＿００１０９３２５９、配列番号１９７ＮｏｔｃｈファミリーＮＯＴＣＨ１、ＮＰ＿０６００８７、配列番号１９８ＮＯＴＣＨ２、ＮＰ＿００１１８６９３０、配列番号１９９ＮＯＴＣＨ３、ＮＰ＿０００４２６、配列番号２００ＮＯＴＣＨ４、ＮＰ＿００４５４８、配列番号２０１ＤＬＬ１、ＮＰ＿００５６０９、配列番号２０２ＤＬＬ４、ＮＰ＿０６１９４７．１、配列番号２０３ＪＡＧ１、ＮＰ＿０００２０５．１、配列番号２０４ＪＡＧ２、ＮＰ＿００２２１７．３、配列番号２０５ＣＤ１１ａ、ＸＰ＿０１１５４４１５１．１、配列番号２０６ＣＤ１１ｂ、ＮＰ＿００１１３９２８０．１、配列番号２０７ＣＤ１１ｃ、ＮＰ＿００１１３９２８０．１、配列番号２０８ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＮＰ＿００１１２０９６３．２、配列番号２０９ＣＤ４１、ＮＰ＿０００４１０．２、配列番号２１０ＣＤ５１、ＮＰ＿００１１３８４７２．１、配列番号２１１ＣＤ６１、ＮＰ＿０００２０３．２、配列番号２１２ＣＤ１０４、ＮＰ＿００１３０８０５２．１、配列番号２１３酵素活性を有する膜タンパク質（酵素ＴＭタンパク質）ＣＤ１３、ＮＰ＿００１１４１．２、配列番号２１４Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、補体受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ成分を含む免疫調節表面タンパク質ＣＤ２、ＮＰ＿００１７５８．２、配列番号２１５ＣＤ３イプシロン、ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号２１６ＣＤ３ゼータ、ＮＰ＿９３２１７０．１、配列番号２１７ＣＤ１８、ＮＰ＿００１１２０９６３．２、配列番号２１８ＣＤ１９、ＮＰ＿００１７６１．３、配列番号２１９ＣＤ３０、ＮＰ＿００１２６８３５９．２、配列番号２２０ＣＤ３４、ＮＰ＿００１７６４．１、配列番号２２１ＣＤ３６、ＮＰ＿００１１２０９１５．１、配列番号２２２ＣＤ４０、ＮＰ＿００１２８９６８２．１、配列番号２２３ＣＤ４０Ｌ、ＮＰ＿００００６５．１、配列番号２２４ＣＤ４４、ＮＰ＿００１００１３９１．１、配列番号２２５ＣＤ４５、ＮＰ＿００１２５４７２７．１、配列番号２２６ＣＤ４７、ＮＰ＿００１７６８．１、配列番号２２７ＣＤ８６、ＮＰ＿７８７０５８、配列番号２２８ＣＤ１１０、ＮＰ＿００５３６４．１、配列番号２２９ＣＤ１１１、ＮＰ＿９７６０３１．１、配列番号２３０ＣＤ１１５、ＮＰ＿００１３３６６６５．１、配列番号２３１ＣＤ１１７、ＸＰ＿０１６８６３６６７．１、配列番号２３２ＣＤ１２５、ＸＰ＿０１１５３１９７９．１、配列番号２３３ＣＤ１３５、ＸＰ＿０１１５３３３１９．１、配列番号２３４ＣＤ１８４、ＮＰ＿００１３３４９８５．１、配列番号２３５ＣＤ２００、ＮＰ＿００１３５２７８０．１、配列番号２３６ＣＤ２７９、ＮＰ＿００５００９．２、配列番号２３７ＣＤ２７３、ＮＰ＿０７９５１５．２、配列番号２３８ＣＤ２７４、ＮＰ＿０５４８６２．１、配列番号２３９ＣＤ３６２＝シンデカン−２（配列番号１９３を参照されたい）ＥＧＦＲ、ＮＰ＿９５８４４１．１、配列番号２４０Ｌ１ＣＡＭ、ＮＰ＿００１１３７４３５．１、配列番号２４１ＬＦＡ−１、ＮＰ＿００１１２０９６３．２、配列番号２４２ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＮＰ＿００５５５８．１、配列番号２４３ＭＦＧＥ８、ＮＰ＿００１２９７２４８．１、配列番号２４４ＳＬｌＴ２、ＮＰ＿００１２７６０６４．１、配列番号２４５ＳＴＸ３、ＮＰ＿００４１６８．１、配列番号２４６間葉系幹細胞の表面マーカーＣＤ４４（配列番号２２５、上記の通り）ＣＤ４５（配列番号２２６、上記の通り）ＣＤ７１（配列番号１９１、上記の通り）ＣＤ７３（酵素ＴＭタンパク質の群にも含まれる）、ＮＰ＿００１１９１７４２．１、配列番号２４７ＣＤ９０、ＮＰ＿００１２９８０９１．１、配列番号２４８ＣＤ２９（インテグリンファミリーの群にも含まれる）、ＮＰ＿５９６８６７．１、配列番号２４９ＣＤ１０５、ＮＰ＿００１２６５０６７．１、配列番号２５０ＣＤ１０６（シアロ糖タンパク質の群にも含まれる）、ＮＰ＿００１０６９．１、配列番号２５１ＣＤ１４６、ＮＰ＿００６４９１．２、配列番号２５２ＣＤ１６４、ＮＰ＿００１１３５８７４．１、配列番号２５３ＣＤ１６６、ＮＰ＿００１６１８．２、配列番号２５４ＳＴＲＯ−１、ＮＰ＿００４９５８．２、配列番号２５５糖タンパク質ＣＤ５４、ＮＰ＿０００１９２．２、配列番号２５６シアロ糖タンパク質ＣＤ２３５ａ、ＮＰ＿００１２９５１１６、配列番号２５７Ｃａチャネルタンパク質を含む、チャネリングタンパク質ＧＬＵＲ２、ＮＰ＿０００８１７．３、配列番号２５８ＧＬＵＲ３、ＮＰ＿０００８１９．３、配列番号２５９ＨＬＡ−ＤＭ、ＮＰ＿００６１１１．２、配列番号２６０その他：ＦＬＯＴ２、ＮＰ＿００４４６６、配列番号２６１ ＥＶ表面タンパク質配列は、本明細書において、シグナル配列を含む場合または含まない場合のアミノ酸配列として提供される。本明細書において説明されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶなどのバインダーを遺伝子操作する目的のために使用されるＥＶタンパク質配列は、もしあるとしても、それぞれの配列情報のシグナル配列を有さないものであることは理解されたい。当業者は、本明細書において特定された配列のＮ末端部分として含まれるシグナル配列であるかどうかを、容易に特定することができる。本明細書において参照されるタンパク質参照番号は、それぞれのＮＣＢＩレファレンスである（全米バイオテクノロジー情報センター、米国国立医学図書館８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ， ２０８９４ ＵＳＡ）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ヒトＣＤ８１（配列番号８７）の二次元モデルの概略図。当該細胞外ドメインは、２つのループ、すなわち、アミノ酸Ｔｒｐ３４からＴｙｒ６３までの小さい小胞外ループ（ＳＥＬ）と、Ｐｈｅ１１３からＬｙｓ２０１までの大きい小胞外ループ（ＬＥＬ）、を含む。それは、４つの膜貫通ドメイン（ＴＭ）、すなわち、Ｖａｌ１２からＬｅｕ３３までのＴＭ１、Ｔｙｒ６４からＧｌｎ８５までのＴＭ２、Ｌｅｕ９０からＧｌｙ１１２までのＴＭ３、およびＬｅｕ２０２からＭｅｔ２２８までのＴＭ４、を含む。 野生型テトラスパニンＣＤ８１の構造の異なる２つの構図。膜貫通領域ＴＭ１〜ＴＭ４、小さい小胞外ループ（矢印によって示される）、大きな小胞外ループにおける構造的に保存されたドメイン（ヘリックスＡ、Ｂ、およびＥ）、およびこれらのドメインの可変領域（ヘリックスＣおよびＤ）が示される。ＬＥＬのジスルフィド結合（ＤＢ）が示されており、パルミテート付加の可能性のある部位である小胞内システイン残基が、アスタリスクによってマークされている。ＬＥＬの可変領域は、システイン残基によって分離される、２つ（ここに示されるような野生型ＣＤ８１の場合のように）、３つ、または４つのセグメントを含む。 ＨｅＬａ細胞膜における組換えＣＤ８１の局在化。 当該膜における組換えシュノーケルタグ。（Ａ）：シュノーケルタグ付けされたＣＤ８１。（Ｂ）：一時的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞において抗ＨＡ抗体を使用して視覚化されたシュノーケルタグ付けされたＣＤ６３。（Ｃ）：組換えＥＶのＣＤ８１およびＨＡ陽性を確認するための電子顕微鏡における免疫金標識。 同上。 ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを使用したシュノーケルタグを有する組換えＥＶの溶離。 組換えＣＤ８１−ＧＦＰ融合タンパク質を運ぶＥＶのサイズ、量、および比率による組換えＥＶの特徴付け。 同上。 ＣａＣｏ−２におけるＥＶ取込み。（Ａ）蛍光顕微鏡によって視覚化された取込み。（Ｂ）フローサイトメトリーによる取込み陽性細胞の定量化。 同上。 毒性ｓｉＲＮＡを含む組換えＥＶによるＣａｃｏ−２細胞の処理。 同上。
詳細な説明
別段の指定または定義がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者に明白であろう、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。参照は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ ＩＶ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９０）、およびＪａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（第５版、またはより最近の版）、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１等の標準的手引書に対してなされる。
特許請求の範囲の主題は、天然（野生型）産物のバリアントであり得る、人工産物またはそのような人工産物を採用するもしくは産生する方法を具体的に指す。天然構造とのある特定の程度の配列同一性があり得るものの、例えば単離された核酸配列、アミノ酸配列、発現構築物、形質転換された宿主細胞、および組換えタンパク質を具体的に指す、本発明の材料、方法、および使用は、「人造」または合成であり、それゆえ「自然の法則」の結果としては見なされない。
ＥＤまたは膜貫通ドメイン等のタンパク質ドメインに関する「ドメイン」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくともある特定の部分（または全長）である連続したアミノ酸配列のポリペプチドまたはタンパク質として本明細書で理解される。ドメインは、より大きなタンパク質に含まれ得る。しかし、タンパク質ドメインはドメインとも呼ばれ、一方でドメインよりも大きいタンパク質から単離される。
「発現」という用語は、以下のように理解される。例えば本明細書で記載される抗体等の発現産物の所望のコード配列を含有する核酸分子、および例えば作動可能な連結におけるプロモータ等の制御配列は、発現目的のために使用され得る。これらの配列を用いて形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を産生し得る。形質転換を生じさせるために、発現系がベクターに含まれ得；しかしながら、関連ＤＮＡも宿主染色体に組み込まれ得る。具体的には、前記用語は、例えばベクターによって運搬されかつ宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下での宿主細胞および適合ベクターを指す。
コードＤＮＡとは、例えば抗体等、特定のポリペプチドまたはタンパク質に対する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモータＤＮＡとは、コードＤＮＡの発現を開始する、調節する、または代わりに媒介するもしくは制御するＤＮＡ配列である。プロモータＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来または異なる遺伝子由来であり得、同じまたは異なる生物由来であり得る。組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製システム、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットを含むことが多い。
本明細書で使用される「発現ベクター」または「ベクター」は、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、および適切な宿主生物におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳に要されるＤＮＡ配列として定義される。
「発現カセット」とは、規定の制限部位でベクターに挿入され得る、発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを指す。カセット制限部位は、適正なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を確実にするように設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位に挿入され、次いで、伝達性ベクターＤＮＡとともに宿主細胞内にベクターによって運搬される。発現ベクター等、挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれ得る。
発現ベクターは発現カセットを含み、通常、宿主細胞における自律的複製のための起源またはゲノム組込み部位、１つまたは複数の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子、またはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８、もしくはハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモータ配列、および転写終結因子を付加的に含み、構成要素は一緒に作動可能に連結される。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、自律的に複製するヌクレオチド配列ならびにゲノム組込み型ヌクレオチド配列を含む。よく見られるタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは一般的に、付加的な（外来の）ＤＮＡを容易に受け入れ得および適切な宿主細胞に容易に導入され得る、二本鎖ＤＮＡの自己完結型の分子である。プラスミドベクターは、コードＤＮＡおよびプロモータＤＮＡを含有することが多く、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１つまたは複数の制限部位を有する。具体的には、「ベクター」または「プラスミド」という用語は、それによってＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、宿主を形質転換し得、および導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進し得るビヒクルを指す。
本明細書で記載されるＴＥＶ等、標的結合特異性を有するそうしたＥＶを含めた、「ＥＶ」と略される「細胞外小胞」という用語は、細胞小胞、または細胞の外側に提供される、細胞を起源とするそうした小胞として本明細書で理解される。ＥＶは、それぞれの供給源またはドナー細胞によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで産生され得るだけでなく、細胞を使用することなく、例えば本明細書で記載されるＥＶ特質を含む合成ＥＶを産生するためのリポソームまたはナノ粒子を操作するｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって、人工的にも産生され得る。
ＥＶは、典型的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、血小板、肥満細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、がん性細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、胚細胞、およびＭＳＣを含めた多様な細胞タイプによって分泌される、膜にパックされた小胞である。ＥＶは、正常な尿、血液、気管支肺胞洗浄液、母乳、唾液、脳脊髄液、羊水、滑液、および悪性腹水等の生理学的流体にも天然に存在する。ＥＶは、細胞−細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たすことが実証されている。それらは細胞間コミュニケーションを媒介し、起源の細胞からレシピエント細胞への機能的核酸の移行を可能にする。それらは、免疫応答、恒常性維持、凝固、炎症、がんの進行、血管新生、および抗原提示等の過程に関わっている。ゆえに、ＥＶは、多くの生理学的および病理学的状態に参加する。
ＥＶは、本明細書で「担持物」と称される生体分子のまたは合成のカーゴを含有し得る。ゆえに、それらは、循環におけるそれらの安定性、生体適合性、低い免疫原性、および毒性プロファイルのおかげで、標的化治療法または診断法のための魅力的な送達ビヒクルを作り出す。ＥＶは、具体的には、ニューロンを含めた細胞の間で化合物を輸送することができる。有利には、それらは、血液脳関門を越えることができる。この天然のトラフィッキング能は、様々な自家または異種化合物に対する送達ビヒクルとして使用される可能性を細胞外小胞に与える。
本明細書で記載される例示的なＥＶは、エクソソームまたは微小胞である。
エクソソームは、細胞外膜に封入された小胞の１タイプであり、それは、それを分泌した細胞の分子成分を含有する。
エクソソームは、ＥＶの主要なサブクラスの１つをなし、エンドソーム起源を有する。エクソソームＥＶは、多小胞エンドソーム（ＭＶＥ）の境界膜の内側への出芽によって形成される、エンドサイトーシス起源のナノメートルサイズの小胞である。ゆえに、それらのサイズは、ＭＶＥ内の腔内小胞のものと同等であり、それは一般的に３０ｎｍ〜１２０ｎｍ、好ましくは５０〜１００ｎｍに及ぶ。
エクソソームＥＶの生合成は、細胞が特異的膜領域において少量の細胞内液を吸収し、初期エンドソームを形成する場合に、エンドサイトーシス−エクソサイトーシス経路を介して生じる。初期エンドソームは成熟し始め、後期エンドソームに拡大する；次いで、腔内小胞または多小胞体（ＭＶＢ）が、エンドソーム膜の内部出芽によって形成される。次いで、ＭＶＢは細胞膜に融合し、細胞外環境に放出される。この時点で小胞はエクソソームと名付けられ、それは、ｐ５３によっておよび細胞骨格活性化経路の制御下で調節されるがカルシウムによって影響を受けないエクソサイトーシスを介して放出される。エクソソームＥＶは、ショ糖勾配において３０〜１００ｎｍの直径および１．１３〜１．１９ｇ／ｍＬの密度を有し得る；それらは、遠心分離によって、例えば１００，０００ｇで回収され得る。単離後、それらは凍結乾燥物としてもしくは水溶液中に、例えば室温でもしくは冷蔵庫温度（２°〜８℃）で保管され得る、またはそれらの機能を維持しながら６ヶ月を上回る期間、いかなる有毒な抗凍結剤もなしで（−８０℃またはより高い最高で−１８℃で）冷凍され得る。
エクソソームＥＶは、アネキシン、テトラスパニン、例えばＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ９、ならびにＨｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、およびＨｓｐ９０を含めたヒートショックタンパク質等の大量の表面タンパク質を含有し得る。それらは、Ａｌｉｘ、腫瘍感受性遺伝子１０１（Ｔｓｇ１０１）、およびクラスリンも発現する。エクソソームＥＶは、それらの内容物を保護し、それらが組織において長距離を移動することを可能にする脂質二重層膜を特異的に含む。膜は、典型的に、少量のホスファチジルセリンならびに大量のコレステロール、セラミド、およびスフィンゴ脂質を所有する。
微小胞は、原形質膜の断片に由来する、膜に封入された小胞の１タイプである。微小胞ＥＶは、典型的に細胞表面から出芽し、それらのサイズは５０ｎｍ〜１０００ｎｍで変わり得る。半合成ＥＶおよび完全合成ＥＶ等の人工微小胞小胞は、１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜５００ｎｍ、さらにより好ましくは１０〜１００ｎｍに及ぶサイズを有し得る。
微小胞ＥＶは、典型的に、ショ糖勾配において１．０４〜１．０７ｇ／ｍＬの密度を有して、超遠心分離によって単離される。微小胞ＥＶは、典型的に、脂質ラフトと会合した多量のホスファチジルセリン含有タンパク質を含有し、表面マーカーＣＤ４０ならびにコレステロール、スフィンゴミエリン、およびセラミドに富む。具体的には、それらは脂質二重層膜にカプセル化もされ、テトラスパニン等の膜貫通タンパク質を含む。
典型的に、アポトーシス小体ＥＶは、外側へのブレブおよびアポトーシス細胞の細胞膜の断片化により放出され、直径が５０〜２，０００ｎｍの広いサイズ域を有する。
ＥＶは、典型的に、表面リガンドおよび接着分子を介して標的と、例えば標的細胞と相互作用する。一部の場合には、それらは、エンドサイトーシス取込みを介してまたは細胞膜への小胞の直接融合によって、細胞に入り得る。それらは、脂質−リガンド受容体の相互作用によって媒介される細胞表面への接着を通じても、それらの内容物を伝達し得る。これらの相互作用は、ＥＶが、種々の生理学的および病理学的状態における細胞−細胞間コミュニケーションおよび免疫モジュレーションにおいて中心的役割を所有し得ることを示す。
ナノサイズのＥＶは、薬物送達のための優れた代替手段である。ＥＶ膜の組成は、典型的に供給源またはドナー細胞（例えば、幹細胞）由来であることから、これらの粒子は、本来非免疫原性であり、それらが循環からの急速なクリアランスに抵抗するのを可能にし、それによって標的組織への薬物送達効率を増加させる。それらは、標的化薬物送達の重要な必要条件の１つである、細胞タイプ特異的タンパク質による（それらの表面リガンドおよび接着分子を用いた）特異的な細胞指向性またはホーミング能を天然に所有することが知られる。しかしながら、天然標的は限定され、親和性および特異性に関する問題はよく見られる。本明細書で記載される表面タンパク質を含むＥＶを操作することによって、大きな特異性および親和性を有して任意の所望の標的または細胞タイプに標的化され得る標的特異的ＥＶが提供される。
本明細書で記載されるＥＶは、医学的目的のために、例えば疾患または疾患状態、特に標的療法が疾患状態を改善することが証明されているそうした疾患を診断するまたは処置するのに特に有用である。
間葉系幹細胞由来のＥＶ、とりわけエクソソームＥＶは、再生療法としてのそれらの使用に関して特に有用であり得る。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を起源とするＥＶは、標的細胞に移行し得る生物活性分子を運搬して、免疫系をモジュレートする炎症応答を抑制する組織傷害を再生する等のそれらの治療効果および他の多くの有益な効果を発揮し得る。したがって、ＥＶは、無細胞再生医学における有効な安全でかつ安価な治療的手法であり得る。
ＥＶは、特に生物学的障壁（例えば、血液脳関門）を越え、そうすることなしには接近不能な部位にそれらの担持物を送達するための、適切な薬物送達システムであり得る。
ＥＶは、生物学的、化学的、および物理的手段を含めた様々な手法により、意図される薬物運搬活性を呈するように製剤化され得る。ＥＶ内への活性物質または薬物（例えば、化学物質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、または脂質）のカプセル化は、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの完全性および生物活性を保つことによって、それらの生体利用性を大幅に増加させ得る。ドナー細胞由来の脂質膜は、宿主循環におけるファゴサイトーシス、分解、および改変を回避するのに向いている。特に、自家だけでなく異種ＥＶも、典型的には、細網内皮系（単核細胞貪食系としても知られる）における捕捉を回避し、全てではないとしてもほとんどのパラメータにおいて非免疫原性である。
様々な手法が、ＥＶ内に活性物質作用物質を担持させるために利用され得る。これらは、（１）精製されたＥＶにｅｘ ｖｉｖｏで担持させるステップ、または（２）ＥＶ産生前にドナー（供給源）細胞に事前に担持させるステップを含み、それぞれの後に、単離および必要に応じて精製が続く。
ｅｘ ｖｉｖｏ担持ストラテジーは、単純なインキュベーションからより洗練された化学的および／または物理的方法に及ぶ、治療用分子の受動パッケージングをほとんどが利用する。抗酸化物質、抗がん薬物、親油性色素等の疎水性（すなわち、親油性）分子は、周囲条件下でＥＶ内に自然発生的にパッケージされ得る。実際、ＥＶ内へのクルクミン、ドキソルビシン、およびパクリタキセルの担持の成功が実証されている。ホスファチジルコリンおよびコレステロールから構成される標準的リポソームと比較して、ＥＶは、疎水性の化学的薬物に対してより高い担持効率および担持能を呈する。
多くの活性物質は、ＥＶの膜に自由に浸透し得ず、それゆえＥＶの担持は、典型的に、例えば電気穿孔、超音波処理、透過処理、融合性リポソーム、ポリマー担体、および／または他の物理的損傷の手段によって生じる。超音波処理および押出、またはサポニンを用いた透過処理は、高い担持効率で安定なＥＶ再形成をもたらすことが示されている。
電気穿孔は、電場を特異的に適用して、ＥＶの膜に一時的に細孔を創出し、それによってＥＶの内腔への活性物質の移動を可能にする。電気穿孔は、小胞凝集を誘導し、それによって小胞の完全性に影響を及ぼすことも知られる。当業者であれば、ＥＶ供給源および濃度、カーゴ分子（担持物）、ならびにカーゴの最適な担持のための時間を用いた適用電圧を含めた、いくつかのパラメータを選定し得る。
ＥＶは、電気穿孔により、好都合に担持が行われる。調査は、ＥＶ不含薬物または薬物担持リポソームのいずれかと比較した場合、典型的に化学療法薬物と関連する有害効果の減少を伴った有効性の増強を実証した。
ＥＶは、様々な核酸分子、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および様々なノンコーディングＲＮＡ、またはＤＮＡ分子の天然担体であり、ゆえに、核酸移行のための適切なビヒクルである。核酸分子は、目的の遺伝子の調節のための有効な手段であるが、循環におけるそれらの低い安定性および形質転換能は、これらの治療用分子を保護し得ならびに標的細胞および組織に送達し得るビヒクルの必要性を決定付ける。やはり、電気穿孔を実施して、ＥＶ内に材料を担持させ得る。
超音波処理は、最小限の凝集および分解を有する、分子の能動的な担持のための適切な代替手段であり得る。
ＥＶの放出前の、ドナー（供給源）細胞への薬物の事前担持の種々の方法が、当技術分野に存在する。例えば、活性物質は、宿主細胞、特に目的のタンパク質または細胞代謝産物を過剰発現する組換え宿主細胞由来のＥＶに組み入れられ得る。本明細書で記載されるように、ＥＶは、標的結合部位を組み入れた表面タンパク質をコードする遺伝子に加えて異種遺伝子をトランスフェクトされたドナー細胞から単離され得る。担持物はタンパク質を含み得ることから、宿主細胞によって発現される組換えタンパク質の担持は、担持したＥＶによるタンパク質送達の魅力的な様式であり得る。オボアルブミン、カタラーゼ、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含めたいくつかのモデルタンパク質が、遺伝子修飾された宿主細胞由来のＥＶへの担持にすでに成功している。
本明細書で記載される標的特異的ＥＶの使用は、血液脳関門等の複雑な生物学的障壁を横断する能力を有する次世代薬物送達システムであり、一方で、細胞毒性、短い生体内分布、および標的送達の低い効率等、薬物またはビヒクルに関するいくつかの安全性懸念を回避するまたは克服する。循環における低い安定性および／または標的細胞への低い形質転換能を有する化学的薬物および生物学的分子は、エンドソームおよびリソソーム分解を受けることなく、標的細胞の細胞質に効率的に移行し得る。
本明細書で記載されるように、ＥＶは、人工標的結合部位によって、ある特定の組織、細胞、人工表面、または可溶性化合物を標的にするように産生され得る。ＥＶは、結合部位を組み入れた適切な表面タンパク質および構造を発現する目的のために操作され得る。例えば、表面タンパク質は、供給源細胞における適切な組換え発現系を採用して、ＥＶの表面に発現されるように供給源細胞において過剰発現され得る。
人工標的結合部位は、小胞形成の前または後に操作される。例えば、結合部位は、例えばループ、ヘリックス、および／または線形（ペプチド）構造を含むように、所定の領域で本明細書で記載される表面タンパク質内に組み入れられ得る。前記表面タンパク質の前記少なくとも２つの離れた領域内の特異的標的接触表面または結合残基は、ｉｎ ｓｉｔｕで、すなわち、例えばそれぞれの表面タンパク質において点突然変異を産生する供給源細胞に変異導入する方法を採用する等の核酸分子を組み換える方法によって、ならびに／または生物学的、酵素的、および／もしくは化学的反応を伴うＥＶのさらなる改変によってＥＶを産生する場合に産生され得る。
本明細書で記載されるＥＶは、単離されたＥＶを含むＥＶ調製物の状態で適切に提供される。ＥＶは、担持物のサイズ、密度、量、および組成、標的結合親和性および／または選択性、純度等を判定するもの等、適切な品質管理測定によって判定され得るある特定の特質によって特徴付けられ得る。
品質管理の例示的な方法は、実施例の節でさらに記載される。
本明細書で記載される、ＥＤと略される「小胞外ドメイン」という用語は、ＥＶに付着したまたは結合した場合に、ＥＶの外表面（小胞外表面）に位置するタンパク質ドメインを包含すると理解される。しかし、タンパク質ドメインはＥＤとも呼ばれ、一方でＥＶから単離されるまたはＥＶ表面タンパク質から単離される。
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のエレメントに関して本明細書で使用される「隣接している」または「隣接される」という用語は、本明細書で以下のように理解される：第１の配列エレメントが、第２の配列エレメントとすぐ近接して配置され、それによって前記第１および第２の配列の連続配列を提供する場合、第１の配列エレメントは第２の配列エレメントによって「隣接される」と言われる。線形の第１の配列エレメントは、その末端の一方のみでまたは両末端で、すなわち一方または両方の側で、別のエレメントによって隣接され得る。
本明細書で記載されるＴＥＤにおいて、改変領域は、１つは改変領域のＮ末端でおよび１つはそのＣ末端で、２つの隣接配列によって特異的に隣接される。ゆえに、そのような改変領域は、隣接配列の間に位置し、「埋め込まれた」とも呼ばれる。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本明細書で記載される表面タンパク質等の特定の組換えタンパク質を産生するように、または本明細書で記載されるＥＶおよびその任意の子孫を産生するように形質転換された初代対象細胞を指すものとする。全ての子孫が親細胞と正確に同一であるとは限らないが（環境における意図的なまたは不注意の突然変異または相違に起因して）、しかしながら、子孫が、最初に形質転換された細胞のものと同じ機能性を保持する限りにおいて、そのような変更した子孫はこれらの用語に含まれる。「宿主細胞系」という用語は、組換え遺伝子を発現させて組換えポリペプチドまたはタンパク質を産生するために使用される宿主細胞の細胞系を指す。本明細書で使用される「細胞系」という用語は、長期間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞タイプの確立されたクローンを指す。そのような宿主細胞または宿主細胞系は、細胞培養下で維持され得および／または組換えポリペプチドを産生するために培養され得る。
ＥＤの改変領域に関して本明細書で使用される「単離された」または「単離」という用語は、「実質的に純粋な」形態で存在する限りにおいて、ＥＤの隣接配列から十分に分離されている改変領域のアミノ酸配列からなるペプチドを指すものとする。「単離された」とは、人工のもしくは合成のペプチド、またはそのようなペプチドと他の化合物もしくは材料との混合物、または基本的な結合活性を妨げず、例えば不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在、の排除を必ずしも意味するわけではない。「単離された」という用語は、化学的に合成されたものを含むことも意図される。
特に、改変領域は、それぞれＴＥＤおよびＴＳＰに含まれる（それから単離されていない）同じ改変領域と比較して、標的結合親和性および／または特異性等のその結合特性を比較する目的のために、本明細書で記載されるＴＥＤから単離され得る、または本明細書で記載されるＴＳＰから単離され得る、またはそれぞれの単離されたペプチドとして提供され得る。
本明細書で記載されるＥＶに関して本明細書で使用される「単離された」または「単離」という用語は、それが天然では結び付いているであろう環境から十分に分離されて、「実質的に純粋な」形態で存在しているそのような小胞を指すものとする。「単離された」とは、他の化合物もしくは材料との人工のもしくは合成の混合物、または基本的な活性を妨げず、例えば不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在、の排除を必ずしも意味するわけではない。特に、本明細書で記載される単離されたＥＶは、化学的に合成されたものを含むことも意図される。
本明細書で記載されるＥＶ表面タンパク質等のポリペプチドまたはタンパク質に関して、「単離された」という用語は、それらの天然環境において、またはそのような調製物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで実践される組換えＤＮＡ技術によるものである場合にそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）において、それらがともに見い出される他の化合物等、それらが天然に結び付いている材料を含んでいないまたは実質的に含んでいない化合物を具体的に指すものとする。
本明細書で記載される結合因子、特に本明細書で記載されるＴＥＤ、ＴＳＰ、またはＴＥＶに関して本明細書で記載される「ライブラリー」は、ある特定の程度多様な結合因子を含むいくつかの異なる標的結合種（ライブラリーメンバー）を含む、結合因子のレパートリーを含むと理解される。ライブラリーは、典型的に、それらの機能的結合によって区別され得、ゆえに所望の結合特性に従って選択され得るライブラリーメンバーを含む。
本明細書で記載されるＴＥＤライブラリーは、それぞれが同じ野生型ＥＤの同じ野生型配列に埋め込まれた異なる改変領域を有する、ＴＥＤ、特に本明細書で記載されるＴＥＶのセットまたはコレクションを特異的に含む。
本明細書で記載されるＴＳＰライブラリーは、それぞれが同じ野生型ＥＶ表面タンパク質の同じ野生型配列に埋め込まれた異なるＴＥＤを有する、ＴＳＰ、特に本明細書で記載されるＴＳＰのセットまたはコレクションを特異的に含む。ＴＳＰライブラリーは、ＴＥＤライブラリー等、ＥＤのライブラリーを含み得る。ＴＥＤライブラリーは、ＥＤまたはＥＶ表面タンパク質に変異導入することによって適切に産生され、それによって、可溶性タンパク質としてまたはＥＶの表面に、それぞれＥＤおよびＥＶ表面タンパク質変異体のレパートリーを産生する。
本明細書で記載されるＴＥＶライブラリーは、それぞれが、小胞の膜に結合した同じ野生型ＥＶ表面タンパク質の同じ野生型配列に埋め込まれた異なるＴＥＤを有する、ＴＥＶ、特に本明細書で記載されるＴＥＶのセットまたはコレクションを特異的に含む。ＴＥＶライブラリーは、ＴＳＰライブラリー等、表面タンパク質のライブラリーを含み得る。
ライブラリーは、変異導入、例えば表面タンパク質の小胞外ドメインの部位指向性変異導入の適切な方法を伴う、周知の技法によって構築され得る。
本明細書で記載されるライブラリーは、好ましくは少なくとも１０２個のライブラリーメンバー、より好ましくは少なくとも１０３個、より好ましくは少なくとも１０４個、より好ましくは少なくとも１０５個、より好ましくは少なくとも１０６個のライブラリーメンバー、より好ましくは少なくとも１０７個、より好ましくは少なくとも１０８個、より好ましくは少なくとも１０９個、より好ましくは少なくとも１０１０個、より好ましくは少なくとも１０１１個、最高で１０１２個のライブラリーのメンバーを含む。
具体的には、ライブラリーは、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のライブラリーメンバーを含み、各ライブラリーメンバーは、改変された表面タンパク質の配列において少なくとも１個のヌクレオチドが異なる。具体的には、ライブラリーは、少なくとも１０６個のライブラリーメンバーを含み、各ライブラリーメンバーは、異なる標的結合部位または特異性を有する。
例えば多数の個々のライブラリーメンバーを含む、任意のタンパク質または遺伝子多様性ライブラリーを本明細書で記載される目的のために使用して、多様な配列を創出し得る、または例えば安定化されたもしくは機能的に活性なライブラリーメンバーに富む事前に選択されたライブラリーを採用する。
例えば、ディスプレイシステムは、所与のタンパク質、ここでは本明細書で記載される表面タンパク質と、そのコード核酸、例えばそのコードｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または遺伝子とを共役させ得る。ゆえに、ライブラリーの各メンバーは、その上に呈示される、改変された表面タンパク質をコードする核酸を含む。ディスプレイシステムは、限定されることなく、細胞、ファージ等のウイルス、リボソーム、酵母等の真核細胞、プラスミドを含めたＤＮＡ、およびｍＲＮＡディスプレイを包含する。
当技術分野において周知であるように、例えば細胞および非細胞方法等のディスプレイ技術、特に動員ディスプレイシステムを含めた、ある特定の結合特徴および親和性を有するタンパク質の特定および単離に使用され得る多様なディスプレイおよび選択技術がある。細胞システムの中では、ファージディスプレイ、ウイルスディスプレイ、酵母、または哺乳動物もしくは昆虫細胞ディスプレイ等の他の真核細胞ディスプレイが使用され得る。動員システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイシステム等の可溶性形態にあるディスプレイシステム、それらの中でもリボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、または核酸ディスプレイに関係している。
多様な表面タンパク質および／またはＥＶもしくは細胞に固定された多様な表面タンパク質を呈示する、特異的なライブラリーが本明細書で提供される。好ましくは、ライブラリーは、ファージディスプレイまたは酵母ライブラリーである。具体的には、酵母宿主細胞は、酵母細胞の表面に本明細書で記載される表面タンパク質を呈する。ファージおよびファージミドディスプレイシステムは、それらの多用途性および選択工程を合理化する潜在的能力で周知である。酵母ディスプレイは、いくつかの魅力的な特質を付与する：真核生物の転写および翻訳機構はタンパク質の発現に非常によく適しており、フローサイトメトリーの使用は、足場リガンドを使用して、リアルタイムでの個々のクローンのハイスループット定量解析を可能にする。
酵母宿主細胞は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｃｈｉｚｉｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、およびＣａｎｄｉｄａ属から選択される。最も好ましい宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
ある特定の場合には、ＲＮＡまたはＤＮＡディスプレイライブラリーにあるように、本明細書で記載される表面タンパク質のレパートリーは、本明細書で記載される表面タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含む実体が、それがコードする表面タンパク質に直接接続され得るように呈示される。そのような場合、表面タンパク質バリアントは、無細胞タンパク質合成の方法の改変によって作出される。
ライブラリーにおける結合活性（または、他の任意の所望の活性）についてのスクリーニングは、例えばファージディスプレイ技術からの、当技術分野において周知の方法に従って行われる。例えば、固相に固定化された標的を使用して、レパートリーの結合メンバーを特定し得および単離し得る。スクリーニングは、所望の特徴に従って、レパートリーのメンバーの選択を可能にする。
標的の適切な結合因子を選択する方法では、ライブラリーメンバーのレパートリーにおいて各結合因子の超多重性、例えば少なくとも１０コピーを提供して、１つまたは複数の候補結合配列を選択する機会を増加させることが有利であり、それは、標的特異的細胞外小胞構築物を操作する適性についてさらに特徴付けられ得る。
標的結合構造を含むライブラリーメンバーについてライブラリーをスクリーニングするステップは、任意の適切な選択方法によって行われ得る。スクリーニングステップは、１回または数回のラウンドの選択（パニングとも称される）を含み得る。
１回または数回のラウンドの選択は、例えば１、２、または好ましくは３回を包含し、４、５、６、７、８、９、または１０回のラウンドの選択を包含し得る。特に、選択のラウンドは、前記標的の存在下でライブラリーをインキュベートして、前記標的またはそのエピトープに結合するタンパク質を選択するステップを含み得る。
本明細書で使用される「変異導入」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を変更するための当技術分野において認められた任意の技法を指す。好ましいタイプの変異導入は、エラープローンＰＣＲ変異導入、飽和変異導入、または他の部位指向性変異導入を含む。公知の変異導入法のいずれかを採用して、例えばランダム化技法によって、所望の位置に点突然変異を導入し得る。一部の場合には、例えば考え得るアミノ酸のいずれかまたは好ましいアミノ酸の選択を用いて、位置をランダムに選定して、抗体配列をランダム化する。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、「遺伝子操作によって調製されることまたはその結果」を意味するものとする。あるいは、「操作された」という用語が使用される。例えば、それぞれの親配列を操作して親配列のバリアントを産生することによって、表面タンパク質を、バリアントを産生するように変異させ得る。組換え宿主は、組換え発現ベクターもしくはクローニングベクターを特異的に含む、またはそれは、特に宿主に対して外来のヌクレオチド配列を採用して、組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって産生される。
「点突然変異」とは、特に、アミノ酸配列のある特定の位置で（１つの位置で）、種々のアミノ酸に対する１つまたは複数のアミノ酸の置換もしくは交換、欠失、または挿入の点で、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として本明細書で理解される。具体的には、１つもしくは複数の単一の（不連続の）または二重のアミノ酸残基が点突然変異に供され得る。具体的に好ましい変異導入の方法は、選択された位置での点突然変異、好ましくは、１つの（所定の）アミノ酸位置での別のものによる１つのアミノ酸の置換、または所定のアミノ酸位置でのみの複数のアミノ酸の置換を提供する。１つまたは複数の点突然変異は、改変領域内にあり得る、特に領域内の不連続または連続した位置での点突然変異であり得る。
本明細書で使用される「レパートリー」という用語は、高い親和性で標的に結合する多様な特異性を有する、改変された表面タンパク質のバリアント等、バリアントのコレクションを指すものとする。典型的に、ヘリックスおよびループ領域を有する細胞外ドメインを含む表面タンパク質の構造は、そのようなレパートリーにおいて同じである。多様性は、改変される対象となる１つまたは複数の所定の位置または領域内、例えば標的を特異的に認識しおよび結合する同じ標的結合部位の一部である少なくとも２つの離れた領域内に結合残基を含む結合部位の多様性を特異的に反映するであろう。
本明細書で記載されるレパートリーは、異種表面タンパク質、標的特異的細胞外小胞構築物、または標的の混合物であるライブラリー内に特異的に提供される。ライブラリーは、タンパク質もしくはＥＶの単純な混合物の形態を取り得、あるいは単離されたポリペプチドもしくはタンパク質として、またはそのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸として、そのような改変された表面タンパク質のそれぞれの結合領域の形態にあり得、またはさらに、核酸を発現する生物もしくは細胞、例えば、核酸のライブラリーで形質転換された、例えば細菌、ウイルス、動物、もしくは植物細胞等であり得、前記レパートリーの標的特異的結合因子の多様性を反映する。
本明細書で使用される「対象」という用語は、温血哺乳動物、特に人間または非ヒト動物を指すものとする。ゆえに、「対象」という用語は、特に、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、およびトリを含めた動物も指し得る。特に、本明細書で記載される抗体は、疾患状態の予防または処置を必要とする対象または患者を処置する医学的使用のために提供される。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。「処置」という用語は、ゆえに、予防的および治療的処置の両方を含むことを意図される。
本明細書で使用される「ＥＶ表面タンパク質」を含めた「表面タンパク質」という用語は、ＥＶの脂質二重層膜内に固定される、ＥＶの表面上にまたは表面に配置されるタンパク質を指す。この目標に向けて、「固定」とは、膜内に配置されるタンパク質ドメインへの融合によって細胞表面に結合することと本明細書で理解される。表面タンパク質は、少なくとも１つのＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むと本明細書で理解される。そのような表面タンパク質は、ＥＶの膜への前記少なくとも１つの膜貫通タンパク質ドメインの組込みを通じてＥＶに結合され得る。膜貫通ドメイン（複数可）は、表面タンパク質の一部であり得る、または例えばＥＶに表面タンパク質を固定する目的のために、表面タンパク質に融合され得る。
「ＥＶ表面タンパク質」という用語は、適切な小胞構造またはＥＶにポリペプチドまたはタンパク質構築物を輸送するために利用され得る「エクソームタンパク質」およびＥＶのそうしたタンパク質を特異的に含む。具体的には、用語は、ＥＶ等の小胞構造へのポリペプチドまたはタンパク質構築物の輸送、トラフィッキング、または往復を可能にする任意のタンパク質を含む。そのようなＥＶ表面タンパク質の例は、本明細書で提供される配列によって特定されるもの（特に、図１における）（たとえあったとしてもシグナル配列を除く）、またはクローン化されたアイソフォームを含めたそのアイソフォーム等、本明細書で記載されるＥＶ表面タンパク質の１つまたは複数のタイプを全体でまたは一部として（断片として）含む、例えば単離された、合成の、および／または組換えのアミノ酸配列である。
例示的なＥＶ表面タンパク質は、
ａ）
ｉ）テトラスパニン、例えばＣＤ８１（ヒトＣＤ８１、配列番号８７等）、ＣＤ９（ヒトＣＤ９、配列番号８９等）、ＣＤ５３（ヒトＣＤ５３、配列番号９０等）、ＴＳＰＡＮ３２（ヒトＴＳＰＡＮ３２、配列番号９１等）、ＣＤ８２（ヒトＣＤ８２、配列番号９２等）、ＣＤ６３（ヒトＣＤ６３、配列番号９３等）、ＣＤ１５１（ヒトＣＤ１５１、配列番号９４等）、ＣＤ３７（ヒトＣＤ３７、配列番号９５等）、ＴＳＰＡＮ８（ヒトＴＳＰＡＮ８、配列番号１８４等）、ＴＳＰＡＮ１４（ヒトＴＳＰＡＮ１４、配列番号１８５等）、もしくはＣＤ２３１（ＴＳＰＡＮ７）（ヒトＣＤ２３１（ＴＳＰＡＮ７）、配列番号１８６等）からなる群のいずれか１つ；または
ｉｉ）リソソーム関連膜タンパク質、例えばＬＡＭＰ２（ヒトＬＡＭＰ２、配列番号９６等）
を含めた、テトラスパン様タンパク質；
ｂ）インテグリンファミリーのタンパク質、例えばＣＤ４９ｄ（ヒトＣＤ４９ｄ、配列番号１８７等）、ＩＴＧＢ５（ヒトＩＴＧＢ５、配列番号１８８等）、ＩＴＧＢ６（ヒトＩＴＧＢ６、配列番号１８９等）、ＩＴＧＢ７（ヒトＩＴＧＢ７、配列番号１９０等）、ＣＤ７１（ヒトＣＤ７１、配列番号１９１等）、ＣＤ２９（ヒトＣＤ２９、配列番号２４９等）；
ｃ）プロテオグリカン、例えばＣＤ１３８（シンデカン−１）（ヒトＣＤ１３８（シンデカン−１）、配列番号１９２等）、シンデカン−２（ヒトシンデカン−２、配列番号１９３等）、シンデカン−３（ヒトシンデカン−３、配列番号１９４等）、シンデカン−４（ヒトシンデカン−４、配列番号１９５等）、ＨＳＰＧ２（ヒトＨＳＰＧ２、配列番号１９６等）；
ｄ）５回膜貫通ドメインタンパク質のファミリー、例えばＣＤ１３３（ヒトＣＤ１３３、配列番号１９５等）；
ｅ）Ｉ型膜貫通タンパク質、例えば（ヒトＣＤ５０、配列番号１９６等）、ＣＤ１０２（ヒトＣＤ１０２、配列番号１９７等）；
ｆ）Ｎｏｔｃｈファミリー、例えばＮＯＴＣＨ１（ヒトＮＯＴＣＨ１、配列番号１９８等）、ＮＯＴＣＨ２（ヒトＮＯＴＣＨ２、配列番号１９９等）、ＮＯＴＣＨ３（ヒトＮＯＴＣＨ３、配列番号２００等）、ＮＯＴＣＨ４（ヒトＮＯＴＣＨ４、配列番号２０１等）、ＤＬＬ１（ヒトＤＬＬ１、配列番号２０２等）、ＤＬＬ４（ヒトＤＬＬ４、配列番号２０３等）、ＪＡＧ１（ヒトＪＡＧ１、配列番号２０４等）、ＪＡＧ２（ヒトＪＡＧ２、配列番号２０５等）、ＣＤ１１ａ（ヒトＣＤ１１ａ、配列番号２０６等）、ＣＤ１１ｂ（ヒトＣＤ１１ｂ、配列番号２０７等）、ＣＤ１１ｃ（ヒトＣＤ１１ｃ、配列番号２０８等）、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２（ヒトＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、配列番号２０９等）、ＣＤ４１（ヒトＣＤ４１、配列番号２１０等）、ＣＤ５１（ヒトＣＤ５１、配列番号２１１等）、ＣＤ６１（ヒトＣＤ６１、配列番号２１２等）、ＣＤ１０４（ヒトＣＤ１０４、配列番号２１３等）；
ｇ）酵素活性を有する膜タンパク質（酵素的ＴＭタンパク質）、例えばＣＤ１３（ヒトＣＤ１３、配列番号２１４等）、ＣＤ７３（ヒトＣＤ７３、配列番号２４７等）；
ｈ）例えばＦｃ受容体、Ｔ細胞受容体、補体受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣＩ、もしくはＭＨＣ−ＩＩ構成要素を含めた、免疫調節表面タンパク質；例示的なタンパク質は、ＣＤ２（ヒトＣＤ２、配列番号２１５等）、ＣＤ３イプシロン（ヒトＣＤ３イプシロン、配列番号２１６等）、ＣＤ３ゼータ（ヒトＣＤ３ゼータ、配列番号２１７等）、ＣＤ１８（ヒトＣＤ１８、配列番号２１８等）、ＣＤ１９（ヒトＣＤ１９、配列番号２１９等）、ＣＤ３０（ヒトＣＤ３０、配列番号２２０等）、ＣＤ３４（ヒトＣＤ３４、配列番号２２１等）、ＣＤ３６（ヒトＣＤ３６、配列番号２２２等）、ＣＤ４０（ヒトＣＤ４０、配列番号２２３等）、ＣＤ４０Ｌ（ヒトＣＤ４０Ｌ、配列番号２２４等）、ＣＤ４４（ヒトＣＤ４４、配列番号２２５等）、ＣＤ４５（ヒトＣＤ４５、配列番号２２６等）、ＣＤ４７（ヒトＣＤ４７、配列番号２２７等）、ＣＤ８６（ヒトＣＤ８６、配列番号２２８等）、ＣＤ１１０（ヒトＣＤ１１０、配列番号２２９等）、ＣＤ１１１（ヒトＣＤ１１１、配列番号２３０等）、ＣＤ１１５（ヒトＣＤ１１５、配列番号２３１等）、ＣＤ１１７（ヒトＣＤ１１７、配列番号２３２等）、ＣＤ１２５（ヒトＣＤ１２５、配列番号２３３等）、ＣＤ１３５（ヒトＣＤ１３５、配列番号２３４等）、ＣＤ１８４（ヒトＣＤ１８４、配列番号２３５等）、ＣＤ２００（ヒトＣＤ２００、配列番号２３６等）、ＣＤ２７９（ヒトＣＤ２７９、配列番号２３７等）、ＣＤ２７３（ヒトＣＤ２７３、配列番号２３８等）、ＣＤ２７４（ヒトＣＤ２７４、配列番号２３９等）、ＣＤ３６２＝シンデカン−２（ヒト、配列番号１９３等）、ＥＧＦＲ（ヒトＥＧＦＲ、配列番号２４０等）、Ｌ１ＣＡＭ（ヒトＬ１ＣＡＭ、配列番号２４１等）、ＬＦＡ−１（ヒトＬＦＡ−１、配列番号２４２等）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（ヒトＬＧＡＬＳ３ＢＰ、配列番号２４３等）、ＭＦＧＥ８（ヒトＭＦＧＥ８、配列番号２４４等）、ＳＬｌＴ２（ヒトＳＬｌＴ２、配列番号２４５等）、ＳＴＸ３（ヒトＳＴＸ３、配列番号２４６等）；
ｉ）間葉系幹細胞の表面マーカー、例えばＣＤ４４（ヒトＣＤ４４、配列番号２２５等）、ＣＤ４５（ヒトＣＤ４５、配列番号２２６等）、ＣＤ７１（ヒトＣＤ７１、配列番号１９１等）、ＣＤ７３（ヒトＣＤ７３、配列番号２４７等）、ＣＤ９０（ヒトＣＤ９０、配列番号２４８等）、ＣＤ２９（ヒトＣＤ２９、配列番号２４９等）、ＣＤ１０５（ヒトＣＤ１０５、配列番号２５０等）、ＣＤ１０６（ヒトＣＤ１０６、配列番号２５１等）、ＣＤ１４６（ヒトＣＤ１４６、配列番号２５２等）、ＣＤ１６４（ヒトＣＤ１６４、配列番号２５３等）、ＣＤ１６６（ヒトＣＤ１６６、配列番号２５４等）、ＳＴＲＯ−１（ヒトＳＴＲＯ−１、配列番号２５５等）；
ｊ）糖タンパク質、例えばＣＤ５４（ヒトＣＤ５４、配列番号２５６等）、ＣＤ２３５ａ（ヒトＣＤ２３５ａ、配列番号２５７等）、ＣＤ１０６（ヒトＣＤ１０６、配列番号２５１等）；
ｋ）Ｃａ−チャネルタンパク質を含めたチャネリングタンパク質、例えばＧＬＵＲ２（ヒトＧＬＵＲ２、配列番号２５８等）、ＧＬＵＲ３（ヒトＧＬＵＲ３、配列番号２５９等）、ＨＬＡ−ＤＭ（ヒトＨＬＡ−ＤＭ、配列番号２６０等）；あるいは
ｌ）多岐にわたるエクソソーム（小胞）表面タンパク質、例えばＦＬＯＴ２（ヒトＦＬＯＴ２、配列番号２６１等）
である。
さらなる多岐にわたるＥＶ表面タンパク質は、可変のアミノ酸配列を有する、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、およびＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体遺伝子座）から選択される。当業者であれば、本明細書で提供される情報に基づいて、あるいはそれぞれのデータベース、例えばヒトＥＶ表面タンパク質（少なくとも１つのＥＤもしくはＴＭを含む断片、またはそのようなＥＶ表面タンパク質のアイソフォームを含む）、または非ヒト動物由来のホモログもしくはアナログのゲノム遺伝子座およびアミノ酸配列を提供するデータベースから、適切なＥＶ表面タンパク質を容易に特定し得る。
具体的には、ＥＶ表面タンパク質は、ループ、ヘリックス、および／または線形（ペプチド）構造を有する領域を含む三次構造、特に、少なくとも１つの大きなループおよび１つまたは複数のヘリックス領域を含む、ＣＤ８１に関して記載されるもの等のテトラスパン様三次構造を含む。そのような三次構造を適切に操作して、三次構造の離れた領域に接触点を含む人工結合部位を組み入れ得る。
ある特定の場合には、表面タンパク質は、リンカーを介して細胞外小胞の脂質二重層膜に固定される。そのようなリンカーは、例えばアミノ酸リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および多糖等の親水性でかつ非荷電のポリマーに基づくリンカーであり得る、またはカチオンおよびアニオン基の両方を含有する双性イオンポリマーから構成され得る。
具体的な表面タンパク質は、哺乳動物起源のもの、特に、温血動物、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、およびトリ等、人間または非ヒト哺乳動物を含めた種に天然に存在するものである。
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」という用語は、典型的には疎水性である脂質膜にまたがるタンパク質ドメインを指す。具体的には、表面タンパク質は、ＥＶに小胞外ループを固定する少なくとも２つの膜貫通ドメインを含む。テトラスパニンタンパク質は、典型的に、４つの膜にまたがるドメインを含む。膜貫通ドメインは、典型的に、ＥＶに付着したまたは結合した場合に、ＥＶの膜内に位置する。しかし、タンパク質ドメインは膜貫通ドメインとも呼ばれ、一方でＥＶから単離されるまたはＥＶ表面タンパク質から単離される。
「テトラスパン」または「テトラスパンタンパク質」とも称される「テトラスパニン」とは、クラスターを形成しかつ多種多様な膜貫通および細胞質シグナル伝達タンパク質と相互作用することによって、テトラスパニンに富むマイクロドメインと称される膜マイクロドメインを組織化するタンパク質スーパーファミリーである膜貫通４スーパーファミリーのタンパク質として本明細書で理解される（「テトラスパニンスーパーファミリー」とも称される）。テトラスパニンは、典型的に、４つの疎水性膜貫通ドメインの存在によって特徴付けられる細胞表面タンパク質である。天然に存在するテトラスパニンタンパク質は、細胞の発生、活性化、成長、および運動性の調節において役割を果たすシグナル伝達事象を媒介する。
本明細書で理解されるテトラスパニンは、典型的に、血管外ドメイン（小胞外ドメインＥＤとも称される）、膜貫通ドメイン、および血管内ドメインから構成される。例えば、テトラスパニンのＮおよびＣ末端は典型的にＥＶ内に配置され、一方で膜貫通ドメインは脂質二重層膜内に配置され、血管外ドメインはＥＶの外表面に置かれる。テトラスパニンの具体的な例はグリコシル化される。
小胞外ドメインＥＤとも称される細胞外（血管外）ドメインは、テトラスパニンにおける最も可変の領域であり、それは標的に結合することに関与し得る。ＥＣ１（第１の細胞外ループ）は、小さな細胞外ループ（ＳＥＬ）とも称される。テトラスパニンのＥＣ２（「大きな細胞外ループ」、ＬＥＬ）は、全てのテトラスパニンに対するモデルタンパク質としてのＣＤ８１ＬＥＬを使用して調査されている。ＬＥＬドメインは、疎水性表面を通じたホモ二量体化を媒介することが示唆される、保存されたＡ、Ｂ、およびＥヘリックスを有する定常領域、ならびにタンパク質−タンパク質相互作用に関与するそうした配列に隣接するヘリックスＣおよびＤを有する可変領域に分けられる。具体的には、ＥＣ２は、全てのテトラスパニンに４回存在する膜貫通の近位にある１つのシステイン残基、およびテトラスパニンの大多数におけるＰｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ（ＰＸＸＣ、配列番号１８３、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）モチーフという、ＥＣ２フォールディング（ＣＣＧモチーフ）のための、ジスルフィド結合を形成する少なくとも２つの保存されたシステイン残基を含む。
テトラスパニンの中で、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、およびＣＤ１５１は広い組織分布を有し、一方で、造血細胞におけるＴｓｓｃ６、ＣＤ３７、およびＣＤ５３等、他のものは特定の組織に制限される。免疫電子顕微鏡法調査は、テトラスパニンが、様々なタイプのエンドサイトーシス膜に豊富であり、エクソソームマーカーとして広く使用されていることを示している。
テトラスパンタンパク質ＣＤ８１は、多小胞体のエクソソーム画分において富化された主要タンパク質である。ヒトＣＤ８１は、配列番号８７として特定されたアミノ酸配列（配列番号８８として特定されたコード配列）を含むまたはそれからなる。
トポロジー的に膜貫通ドメイン３と４の間に配置されるＣＤ８１の大きな細胞外ループは、２対のシステインによって安定化された、マッシュルーム様構造を形成する５つのヘリックス要素によって特徴付けられる。このモチーフは、テトラスパニンファミリーのタンパク質メンバーの間で保存され、システイン結合の酸化は、例えば、ＣＤ８１の天然リガンドであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＥ２エンベロープタンパク質の高親和性結合に関与する。
テトラスパンタンパク質は、可溶性タンパク質として発現され得る、またはテトラスパニン発現細胞またはそれぞれのＥＶの表面に呈示され得る。
１．６Åで解かれたｈＣＤ８１ ＬＥＬの結晶構造は、新たなタイプのタンパク質フォールドを明らかにし、１６０個のテトラスパニンファミリーメンバーについての後続の配列解析は、それらのフォールドおよび重要な構造特質が保存されていることを示した。システイン架橋とは別に、ｈＣＤ８１ ＬＥＬは、システイン接続を収容するように配置される不変残基Ｇｌｙ１５７およびＰｒｏ１７６、ならびに完全に埋もれかつＨｉｓ１５１およびＣｙｓ１９０と一緒に水素結合ネットワークに寄与するＴｙｒ１２７によって安定化され得る。可溶性ｈＣＤ８１ ＬＥＬは、２回軸を囲む二量体にアセンブリし得、プロトマー間の接点は、各相互作用パートナーのヘリックス間およびヘリックスＢと反対側のプロトマーのＣ末端残基との間の低極性領域である。プロトマーのＮおよびＣ末端は、細胞表面での二量体アセンブリと同様に、アセンブリした二量体の反対側の面の中心領域に収まり、そこには膜貫通セグメントも存在する。第２の低極性領域は、ヘリックスＣおよびＤの溶媒曝露表面を含む。溶液調査によれば、ヘリックスＤはほとんど構造化されておらず、ある特定の抗原と結合したときのみヘリックス立体構造をとる。テトラスパニンファミリーメンバーについての配列アラインメントは、実際に、挿入および欠失を含めた、この領域における変動性の増加を示す。この表面エリアは、種またはテトラスパニン特異的認識過程に関与し得、それは、ヘテロ二量体テトラスパニン種アセンブリの可能性にヒントを与え得る。特に、ＣＤ８１のセグメントＤは、特異的ホモマークラスター化を導き得る。
具体的な実施形態によれば、ＣＤ８１のようなテトラスパニンの生物物理学的特性は、タンパク質を安定化する新規のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基のｄｅ ｎｏｖｏ対の導入によって向上する。具体的には、新規のジスルフィド架橋の形成は、ＣＤ８１のようなテトラスパニンの安定性を増加させ、それは、より高い安定性を有する変異体、例えば１つもしくは複数の改変領域、または前記１つもしくは複数の改変領域内に結合残基を含む新規の標的特異的結合部位を組み入れる変異体の産生を可能にする。具体的には、アミノ酸配列を標的もしくはランダム変異導入によって改変して、結合部位を作り上げる所定の位置もしくは領域（複数可）で結合残基を（特に、その置換によって）組み入れ得る、または結合残基を含む多様な結合部位を含むライブラリーを作出し得る。
ＣＤ８１と同様に、テトラスパニンＣＤ９は、４つの疎水性膜貫通ドメインおよび２つの細胞外ドメインＥＤ（ＥＣ１およびＥＣ２を含むまたはそれからなる等）を含有する細胞表面タンパク質である。
天然に存在するＣＤ９は、２２８個のアミノ酸からなり、２４〜２７ｋＤａの重量がある。４つの小さくかつ高度に保存された疎水性膜貫通ドメインはそれぞれ、２４〜２７個のアミノ酸を含む。それは、小さなＮ末端（１１個のアミノ酸）およびＣ末端細胞質（７個のアミノ酸）テール、ならびに非常に小さな細胞内ドメイン（４個のアミノ酸）を有する。タンパク質の残りの部分は、２つの細胞外ドメイン（２０個のアミノ酸の小さなものＥＣ１、および８３個のアミノ酸の大きなものＥＣ２）から構成される。４個のよく保存されたシステイン残基（Ｃ）によって作出される２つのジスルフィド結合は、大きな細胞外ドメイン（ＥＣ２）を安定化する。ＣＤ９は、テトラスパニンシグネチャー（アミノ酸６５〜８９）およびＣＣＧモチーフ（アミノ酸１５２〜１５４）も含有する。ＣＤ９は、エクソソームの表面にある最も偏在的に発現されるタンパク質の１つであり、それゆえエクソソームマーカーと見なされる。細胞外ループにおけるアミノ酸配列に変動があるものの、ＣＤ９タンパク質配列は、種間で非常によく保存されている（ヒト、マウス、およびラット間で９０％）。ＣＤ９は、特に膜貫通ドメインにおいて、他のテトラスパニンといくらかの相同性も共有する。
野生型ＣＤ９は、他のテトラスパニン、インテグリン、ＥＷＩ分子、ＴＧＦ−ａ、ジフテリア毒素受容体、またはチロシンキナーゼ、妊娠特異的糖タンパク質、ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｇスーパーファミリーのメンバー等の免疫系のタンパク質を含めた、多くの他のタンパク質と相互作用し得るまたは複合体を形成し得る。さらには、ＣＤ９は、血小板活性化および凝集に、ならびに細胞接着、拡散、細胞運動性、および腫瘍転移に関与する。ＣＤ９は、傍絞輪（ｐａｒａｎｏｄａｌ）接合部形成も調節し、配偶子融合に要される。さらに、ＣＤ９は、筋細胞融合を促進し、筋管維持を支援する。
本明細書で記載されるように、テトラスパニンＣＤ６３は、４つの膜貫通ドメインおよび３つの推定上のＮ−グリコシル化部位を含有する、高度にグリコシル化されたタンパク質細胞表面タンパク質である。
野生型ＣＤ６３は、典型的に、後期エンドソーム、リソソーム、分泌小胞、および原形質膜に存在し、それはこれらのコンパートメント間を移動する。ＣＤ６３は、広範囲にかつ可変的にグリコシル化され、そのＥＣ２領域は、３つの潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位（Ｎ１３０、Ｎ１５０、およびＮ１７２）を含有する。それは、ＣＤ６３で富化されている多小胞体に対するマーカーとしてしばしば使用される。それは、ＣＤ８２；ＭＨＣクラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＭ、およびＨＬＡ−ＤＯ；いくつかのインテグリン；ならびにホスファチジルイノシトール４キナーゼ等、他のテトラスパニンを含めた数多くの天然の相互作用パートナーを有する。ＣＤ６３は、その最遠のＣ末端にチロシンに基づくモチーフも含有する。膜タンパク質の細胞質ドメインにおけるチロシンに基づくモチーフは、クラスリンアダプター複合体によって認識され、エンドサイトーシス、リソソーム標的化、および側底部標的化において重要な役割を担う。ＣＤ６３におけるチロシンに基づくモチーフは、アダプタータンパク質複合体２および３（ＡＰ−２およびＡＰ−３）のμサブユニットとのその相互作用を媒介する。
本明細書で記載されるように、テトラスパニンＣＤ１５１は、テトラスパニンの特徴的構造を有する。それは、そのＬＥＬにおいて単一のＮ−グリコシル化部位を有する２５３アミノ酸のタンパク質であり、いくつかのシステイン残基でパルミトイル化される。免疫ブロットは、ＣＤ１５１の非グリコシル化およびグリコシル化形態を表す、見掛け上２８および３２ｋＤａの二重のバンドを明らかにする。ヒトＣＤ１５１は、配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
野生型ＣＤ１５１は、上皮、内皮、筋肉、腎糸球体および近位と遠位尿細管、シュワン細胞、ならびに樹状細胞を含めた広い細胞および組織分布を有し、ほとんどのヒト成人組織において単一のＲＮＡ種が観察される。ＣＤ１５１は、血小板および巨核球で高レベルに発現される。他のテトラスパニンと同様に、ＣＤ１５１は細胞膜においていくつかのインテグリンと関連する。
全ての免疫細胞はテトラスパニンを発現するものの、これらのほとんどは多様な他の細胞タイプに存在する。造血系に見い出される、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＴＳＰＡＮ３２（Ｔｓｓｃ６）、およびＴＳＰＡＮ３３等、いくつかのものがある。
本明細書で記載されるように、テトラスパニンＣＤ３７は、インテグリンおよび他の膜貫通４スーパーファミリータンパク質と複合することが知られるテトラスパニンの典型的な構造を有する細胞表面糖タンパク質である。選択的スプライシングは、種々のアイソフォームをコードする複数の転写バリアントをもたらす。ヒトＣＤ３７は、配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
ＣＤ３７は、免疫系の細胞によって発現されることが知られ、成熟Ｂ細胞で最も高い存在量を有し、Ｔ細胞および骨髄性細胞ではより低い発現が見い出される。野生型ＣＤ３７は、体液性および細胞性免疫応答の両方を制御する。マウスにおけるＣＤ３７欠損は、Ｂ細胞リンパ腫の自然発生的発症につながり、ＣＤ３７陰性リンパ腫を有する患者は、悪い臨床転帰を有する。
本明細書で記載されるように、テトラスパニンＣＤ５３は、原形質膜を４回またがり、膜貫通４スーパーファミリーのメンバーである全白血球表面糖タンパク質である。マウスＣＤ５３（Ｃｄ５３）のタンパク質配列および遺伝子構造は、ゲノムおよびｃＤＮＡクローンの両方の単離によって決定された。マウスＣｄ５３はラットＣＤ５３と９１％同一であり、ヒトＣＤ５３と８２％同一であったように、ＣＤ５３は進化において高度に保存されている。テトラスパニンＣＤ５３は４つの膜貫通ドメインを有し、それはその第２の細胞外ループで２回グリコシル化される。それは２１９個のアミノ酸の長さを有し、細胞膜、エンドソームに、およびエクソソームの脂質二重層膜に配置される。ヒトＣＤ５３は、配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
野生型ＣＤ５３は、事実上全ての免疫細胞、造血幹細胞のサブセットによって、および多様な血液悪性腫瘍において発現される。
ＣＤ９、ＣＤ１５１、Ｔｓｓｃ６、およびＣＤ６３を含めた、血小板に存在するいくつかのテトラスパニンがある。ノックアウトマウスモデルにおける最近の調査は、ＣＤ１５１およびＴｓｓｃ６が、大多数の血小板インテグリン、インテグリンアルファ（ＩＩｂ）ベータ（３）の「外側から内側」のシグナル伝達特性、およびｉｎ ｖｉｖｏでの血栓安定性の調節に物理的および機能的に関与することを明らかにしている。
本明細書で使用される場合、ＴＳＰＡＮ３２とも呼ばれるテトラスパニンＴｓｓｃ６は、テトラスパニンスーパーファミリーのメンバーである。タンパク質は、３２０個のアミノ酸のサイズを有し、低いレベルで偏在的に発現される。高レベルのＴＳＰＡＮ３２発現は、典型的に、末梢血白血球、胸腺、および脾臓を含めた造血組織に限られる。
ヒトＴＳＰＡＮ３２は、配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本明細書で使用される場合、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）は、リソソームに関連する膜糖タンパク質である。ＬＡＭＰ２は、２つの保存された内腔ドメイン（タンパク質全体の９０％をなす）、単一の膜貫通（ＴＭ）ドメイン（約２０個のアミノ酸）、および短い（１０〜１２個のアミノ酸）Ｃ末端細胞質テールを有する不可欠な膜タンパク質である。グリコシル化はその内腔ドメインに見い出される。ヒトＬＡＭＰ２は、配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。本明細書で使用されるＬＡＭＰ２は、好ましくは、人工結合部位を組み入れるように、小胞外ループ領域に改変を含む。
野生型ＬＡＭＰ２は、様々なストレスに応答しておよび長い生物学的半減期を有するタンパク質の通常の代謝回転の一部として、タンパク質のリソソーム分解を媒介する過程であるシャペロン媒介性オートファジーにおいて重要な役割を担う。
本明細書で使用される「テトラスパン様タンパク質」（テトラスパニン様と呼ばれることもある）という用語は、少なくとも２つの膜貫通ドメインと、前記少なくとも２つの膜貫通ドメインの間に位置する少なくとも１つのＥＤとを含むＥＶ表面タンパク質を指すものとし、好ましくは前記少なくとも２つの膜貫通ドメインの間の領域は１つのＥＤを含むまたはそれからなる。
テトラスパン様タンパク質の具体的な例は、リソソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）等、天然に存在するもしくは改変されたテトラスパニンタンパク質および他のもの、または組換えのもしくは合成のタンパク質、例えば一方のタンパク質の１つもしくは複数の膜貫通ドメインおよびもう一方のタンパク質の１つもしくは複数のＥＤを含み、それによって組換えテトラスパン様タンパク質を得るキメラタンパク質である。
タンパク質配列およびその変異体に関する「配列同一性」または「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインしおよび必要な場合にはギャップを導入して配列同一性最大パーセントを達成した後の、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として見なさない、比較される対象となる特異的ポリペプチド配列（「親配列」）におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定し得る。
本明細書で使用される場合、「特異性」、「標的特異的」、または「特異的結合」という用語は、分子の異種集団における目的のコグネートリガンドを決定する結合反応を指す。ゆえに、指定の条件（例えば、イムノアッセイ条件）下で、改変された表面タンパク質は、その特定の標的に結合し、試料に存在する他の分子には有意な量で結合しない。特異的結合とは、選択される標的同一性、高い、中間の、または低い結合親和性またはアビディティーの観点において、結合が選択的であることを意味する。選択的結合は、通常、結合定数または結合動力学が少なくとも１０倍異なる、好ましくは差が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成される。
特異的結合は、同様の抗原、または異なる種の同じ抗原（アナログ）とのある特定の交差反応性を除外しない。例えば、結合実体は、好ましくは、ヒト標的に類似の齧歯類標的とも交差反応して、前臨床動物調査を容易にし得る。
本明細書で使用される「標的」という用語は、特に、抗体の結合部位によって認識され得る全ての抗原および標的分子を含むものとする。本明細書で記載される表面タンパク質は、抗体のように抗原構造またはエピトープを特異的に認識している人工標的結合部位を含むように操作される。
具体的な標的は、細胞標的または可溶性標的である。多くの場合、標的は、腫瘍細胞の表面に配置された受容体、または対象もしくは患者の循環に存在し得るサイトカインもしくは増殖因子等の自己抗原である。さらなる標的は、病原体起源、例えば微生物またはウイルス病原体のものであり得る。
標的抗原は、標的分子全体として、または免疫学的に関連している、すなわち天然もしくはモノクローナル抗体によっても認識可能である、そのような分子の断片、とりわけ下部構造、例えば、「エピトープ」（例えば、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と一般的に称される、標的のポリペプチドもしくは炭水化物構造として認識される。
具体的には、標的抗原は、受容体を含めた細胞標的抗原から、特にｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２ｎｅｕを含めたＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４等、特にそのような受容体の細胞外ドメインのそうしたエピトープ、例えば４Ｄ５エピトープ）からなる群から選択される。加えて、さらなる抗原が標的化され得、例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの分子、それは例えばＡｐｏ−１受容体、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、神経増殖因子受容体ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ受容体、Ｔ細胞表面分子、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞抗原、Ａｐｏ−３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、デコイ受容体、例えばＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１、ＴＮＦＬ１、ＩＧＦＲ−１、ｃ−Ｍｅｔであるが、しかしこれらの分子に限定されるわけではなく、Ｂ細胞表面抗原、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＤＣ−ＳＩＧＮ、固形腫瘍または血液がん細胞の抗原またはマーカー、リンパ腫または白血病の細胞、血液血小板を含めた他の血液細胞であるが、しかしこれらの分子に限定されるわけではない。
化合物、例えば本明細書で記載される結合因子、特に本明細書で記載されるＴＥＶの「有効量」または「十分量」という用語のいずれかと本明細書で互換可能に使用される「治療有効量」という用語は、対象に投与された場合に、臨床結果を含めた有益なまたは所望の結果を生じさせるのに十分な分量または活性であり、そのため、有効量またはその同義語は、それが適用されている文脈に依存する。
有効量は、疾患または障害を処置する、防ぐ、または阻止するのに十分である化合物の量を意味することを意図される。疾患の文脈において、本明細書で記載される結合因子またはＴＥＶの治療有効量を特異的に使用して、結合因子またはＴＥＶとその標的抗原、例えば腫瘍細胞との相互作用から恩恵を受ける疾患または状態を処置する、モジュレートする、軽減する、好転させる、または影響を及ぼす。
そのような有効量に相当するであろう化合物の量は、所与の薬物または化合物、医薬製剤、投与の経路、疾患または障害のタイプ、処置されている対象または宿主の素性等の様々な因子に依存して変わるであろうが、それにもかかわらず当業者によってルーチン的に決定され得る。
本明細書で記載される結合因子は、医薬組成物において特異的に使用され得る。それゆえ、本明細書で記載される結合因子および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。これらの医薬組成物は、ボーラス注射もしくは注入として、または連続注入によって適切に投与され得る。非経口投与を除いて、局所または経口投与が好まれ得る。投与のそのような手段を容易にするのに適した薬学的担体は、当技術分野において周知である。
薬学的に許容される担体は、一般的に、本明細書で提供される結合因子と生理学的に適合する、ありとあらゆる適切な溶媒、アジュバント、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容される担体のさらなる例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそのいずれかの組合せを含む。
適切な薬学的に許容される担体または賦形剤は、ありとあらゆる従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング、局所投与に適したビヒクル、他の抗微生物剤、等張および吸収増強もしくは遅延剤、または薬学的に活性な物質に対する活性増強もしくは遅延剤のうちの１つまたは複数を特異的に含む。よく見られる薬学的に許容される添加物は、例として、Ａｌｆｏｎｓｏ ＧｅｎｎａｒｏによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、（２０００）に開示される。
１つの実施形態では、適切な薬学的に許容される担体は、不活性固体充填剤または希釈剤、および滅菌水溶液または有機溶液（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、エタノール、ベンジルアルコール等）を含むが、それらに限定されるわけではない。ある特定のそのような実施形態では、適切な薬学的に許容される賦形剤は、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、充填剤、例えば糖類（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール）、およびセルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンＰＶＰ）を含むが、それらに限定されるわけではない。
１つのそのような態様では、結合因子は、投与の所望の経路に適当な１つまたは複数の担体と組み合わせられ得、例えばラクトース、スクロース、デンプン、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールのうちのいずれかと混和され得、および必要に応じて、従来の投与のためにさらに錠剤化され得るまたはカプセル化され得る。他の担体、アジュバント、および投与の様式は、医薬技術分野において周知である。担体は、単独でまたはワックスもしくは当技術分野において周知の他の材料とともに、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリル等の制御放出材料または時間遅延材料を含み得る。
付加的な薬学的に許容される担体は当技術分野において公知であり、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載される。液体製剤は、溶液、乳濁液、または懸濁液であり得、懸濁化剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤、およびキレート剤等の賦形剤を含み得る。
本明細書で記載される結合因子および１つまたは複数の治療活性剤が製剤化されている、医薬組成物が企図される。本明細書で記載される結合因子の安定な製剤は、所望の程度の純度を有する前記構築物と、必要に応じた薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保管のために調製される。ｉｎ ｖｉｖｏ投与のための製剤は、好ましくは滅菌であり、例えば滅菌水溶液の形態にある。これは、滅菌濾過膜を通した濾過または他の適切な滅菌法によって容易に実現される。
本明細書で記載される結合因子を含む医薬組成物の投与は、経口で、皮下に、静脈内に、鼻腔内に、ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ、経皮的に、粘膜に、局所的に、例えば錠剤、ゲル、軟膏、膏薬、座薬、パッチ、ローション、クリーム等、腹腔内に、筋肉内に、肺内に、経膣的に、非経口的に、直腸に、または眼内に、を含めた多様なやり方で行われ得る。
１つの実施形態では、医薬組成物は、経口で、静脈内に、または吸入で投与される。具体的な実施形態では、結合因子は、固体剤形、クリーム、水性混合物、凍結乾燥された水性混合物、およびエアロゾルからなる群から選択される剤形で投与される。
非経口投与に使用される例示的な製剤は、例えば滅菌溶液、乳濁液、または懸濁液のような、皮下、筋肉内、または静脈内注射に適したものを含む。
本明細書で記載される結合因子は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ使用のための、診断用組成物において特異的に使用され得る。それゆえ、組成物または部品のキットの状態での、本明細書で記載される結合因子および必要に応じて診断用試薬を含む診断用組成物が提供される。
診断用キットは、必要に応じて水、緩衝液、または賦形剤等のよく使用されるまたは非特異的な物質または構成要素なしで、好ましくは、生体試料中の標的を定性的にまたは定量的に判定するための全ての必須の構成要素を含む。好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも１または２年間の貯蔵寿命を有する、保管安定なキットが提供され得る。それは、乾燥（例えば、凍結乾燥された）構成要素から構成され得、かつ／または防腐剤を含み得る。
好ましい診断用キットは、ルーチン実験を容易にする、例えば構成要素が１つのみのパッケージに含有される、パッケージされたまたはプレパッケージされた単位として提供される。そのようなパッケージは、例えば一連の生体試料の検査を実施するのに適した、１つまたは複数の検査に必要な試薬を含み得る。キットは、標準物質または参照対照をさらに適切に含有し得る。
診断用組成物は、生体試料との反応混合物においてすぐに使用できる試薬、またはそのような試薬の保存形態、例えば凍結乾燥；急速冷凍（例えば、液体窒素中）、超低温保管（−７０℃および−８０℃）、冷蔵保管（−２０℃および５℃）、および制御された室温（１５℃〜２７℃）等の保管安定な形態；例えばグリセロールストック、組織パラフィンブロック、（口腔）スワブ、および他の標準的生体試料保管方法のような標準的な試料保管であり得、試薬の保存形態は、すぐに使用できる試薬を得るように再構成され得るまたは調製され得る。そのようなすぐに使用できる試薬は、典型的に、水溶液の形態、具体的には（生理学的）緩衝液状態（例えば、ＥＤＴＡ緩衝化、リン酸緩衝液、ＨＢＳＳ、クエン酸緩衝液等）にある。
具体的には、さらなる診断用試薬は、結合因子と、および／または結合因子のその標的への結合の反応産物と特異的に反応する試薬である。適当な診断用試薬は、溶媒、緩衝液、色素、抗凝固剤、本明細書で記載される結合因子および／または結合因子−標的複合体に特異的に結合するリガンドであり得る。
具体的には、本発明は、結合因子もしくは結合因子とそれぞれの標的との複合体を特異的に認識する試薬等、標識を有する結合因子および／もしくは標識を有するさらなる診断用試薬、ならびに／または結合因子および診断用試薬の少なくとも一方を固定化するための固相を必要に応じて含有する、本明細書で記載される結合因子の診断用調製物を提供する。
具体的には、さらなる診断用試薬は、診断用標識、または結合因子と、および／もしくは結合因子のその標的への結合の反応産物と特異的に反応する試薬である。
ＥＶまたは診断用試薬は、直接標識され得るまたは間接的に標識され得る。間接的標識は、標的に対する結合因子または診断用試薬と複合体を形成する標識された結合剤を含み得る。
標識は、典型的に、アッセイにおいて検出され得る分子または分子の一部である。例示的な標識は、発色団、蛍光色素、または放射性分子である。一部の実施形態では、ＥＶまたは診断用試薬は、検出可能な標識にコンジュゲートされ、それは、それら自体検出可能である分子（例えば、蛍光部分、電気化学的標識、金属キレート等）、ならびに検出可能な反応産物（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素）の産生によってまたはそれ自体が検出可能であり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、ヒ酸フェニル、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ等）によって間接的に検出され得る分子を含み得る。
好ましい診断用調製物またはアッセイは、固相、例えばラテックスビーズ、金粒子等に固定化された本明細書で記載されるＥＶを含む。
以下の項目は、本発明の具体的な実施形態と見なされる。
１．標的を特異的に認識する人工結合部位を含む表面タンパク質を固定する脂質二重層膜を含む標的特異的細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記結合部位は、前記表面タンパク質の少なくとも２つの離れた領域内に結合残基を含む、ＥＶ。
２．前記表面タンパク質は小胞膜タンパク質の膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインはＥＶに表面タンパク質を固定している、項目１に記載のＥＶ。
３．膜タンパク質はテトラスパンタンパク質であり、好ましくは、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、およびＣＤ８２、またはＬＡＭＰ２からなる群から選択される、項目２に記載のＥＶ。
４．表面タンパク質はＣＤ８１であり、結合残基は、１６０と１７２位の間の第１の領域内、および１３２と１３９位の間または１８０と１８９位の間に配置される少なくとも１つのさらなる領域内に配置され、番号付けは、配列番号８７として特定されたＣＤ８１のものである、項目１から３のいずれかに記載のＥＶ。
５．表面タンパク質はＣＤ８１であり、それは、タンパク質の小胞外ループ構造を安定化する１つまたは複数の付加的なジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）に１つまたは複数のシステイン（複数可）を導入することによって安定化されている、項目４に記載のＥＶ。
６．身体組織、体液、または細胞培養物の真核生物または原核生物供給源細胞を起源としている、項目１から５のいずれか一項に記載のＥＶ。
７．小胞内担持物を運搬しており、担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む、項目１から６のいずれか一項に記載のＥＶ。
８．標的は、マイトジェン受容体、サイトカイン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、膜輸送体、リポタンパク質、リポサッカライド、糖タンパク質、プロテオグリカン等の細胞標的、またはサイトカイン、人工タンパク質、もしくは人工表面構造等の無細胞標的からなる群から選択される、項目１から７のいずれか一項に記載のＥＶ。
９．好ましくは皮内、皮下、静脈内、局所的、または経口使用のための製剤において、項目１から８のいずれか一項に記載のＥＶ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬調製物。
１０．ａ）表面タンパク質をコードする遺伝子を供給源細胞または供給源細胞混合物に導入するステップ；
ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記細胞（複数可）を培養するステップ；
ｃ）標的結合特異性を有するＥＶを含む画分を単離するステップ；および
ｄ）ＥＶ調製物を産生するステップ
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載のＥＶの調製物を産生する方法。
１１．遺伝子を変異導入法によって改変して、標的を特異的に認識する人工結合部位を組み入れ、前記変異導入法は、前記表面タンパク質の少なくとも２つの離れた領域の変異導入を採用し、それによって、それぞれが異なる標的特異性を有する、多様な表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生し、標的を特異的に認識する表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択する、項目１０に記載の方法。
１２．ポリヌクレオチドのレパートリーは、外表面に多様な表面タンパク質を呈示し、好ましくは、ファージ、酵母、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する遺伝子パッケージに含まれる、項目１１に記載の方法。
１３．自家使用のための、項目１０から１２のいずれか一項に従って産生されるＥＶ調製物であって、供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＥＶ調製物は同じ対象に投与される、ＥＶ調製物。
１４．ａ）多様な表面タンパク質をコードする遺伝子のレパートリーを前記供給源細胞（複数可）に導入し；かつ
ｂ）それぞれが異なる標的結合特異性を有するＥＶのレパートリーを単離して、多様な標的結合特異性を有する標的結合性ＥＶのレパートリーを含むＥＶのライブラリーを産生し、
レパートリーは、前記遺伝子の少なくとも２つの所定の離れた領域内で前記遺伝子に変異導入することによって産生される、
ＥＶのライブラリーを産生するための、項目１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
１５．好ましくは、レパートリーは、異なる標的特異性を有する少なくとも１０２個のＥＶを含む、項目１４に記載の方法によって産生されるＥＶのライブラリー。
本明細書で記載される実施例は、本発明の例示であり、それに対する限定であることを意図されるわけではない。本発明の種々の実施形態が、本発明に従って記載されている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの改変および変形が、本明細書で記載されおよび例示される技法になされ得る。したがって、実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定していないことが理解されるべきである。
実施例１：ＣＤ８１ ＬＥＬの酵母ディスプレイ
野生型ヒトＣＤ８１ ＬＥＬ配列を、先にＸｐｒｅｓｓタグおよびＣ末端にｈｉｓタグおよびＶ５タグを付加させた、Ａｇａ２を伴うＣ末端融合タンパク質としてクローニングした。
ＣＤ８１ ＬＥＬのアミノ酸配列は、
Figure 2021533834
であった。
コードヌクレオチド配列は、
Figure 2021533834
であった。
ヒトＣＤ８１ ＬＥＬの増幅のためのプライマーは、
Figure 2021533834
であった。
ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、対応する切断ベクターｐＹＤ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でライゲートした。ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント大腸菌（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０に形質転換し、形質転換体をアンピシリンプレート上において選択した。プラスミドをミニプレパレーションによって単離し、化学的変換を用いて出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００に形質転換した。２０ｍｌのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）（Ｍｅｒｃｋ）におけるＥＢＹ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のスターター培養物を、３０℃および１８０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートした。次いで、当該培養物を、０．４のＯＤ６００まで希釈し、３０℃および１８０ｒｐｍにおいて約５時間インキュベートした。次いで、５０ｍｌの細胞培養物のアリコートを、室温において、１０００ｇで５分間かけてペレット化し、次いで、２５ｍｌのＡＤで洗浄し、再びペレット化した。当該細胞を、３ｍｌの１００ｍＭ Ｌｉ−アセテートに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で１５分間インキュベートした。次いで、０．３ｍｌの細胞懸濁液をペレット化し、上清を除去した。以下のように形質転換ミックスの成分を加えた；２４０μｌの５０％ＰＥＧ ３３５０、３６μｌの１．０Ｍ Ｌｉ−アセテート、５０μｌの２ｍｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ（サケ精子担体ＤＮＡ、事前に最高で９５℃までにおいて５分間加熱し、次いで、氷上に位置した）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１μｇのｐＹＤ１−ＣＤ８１ ＬＥＬプラスミド。細胞ペレットを形質転換ミックスに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で３０分間インキュベートし、次いで、４２℃で４５分間熱ショックを与えた。酵母細胞を、室温において、１０００ｇで５分間かけてペレット化し、ＡＤに再懸濁させ、形質転換体を、３０℃でＭＤＬ培地上において３日かけて選択した。
形質転換体を、ＳＤ−ＣＡＡ（１％カザミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１００ ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｍｅｒｃｋ）、１×ＹＮＢ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２％グルコース（Ｍｅｒｃｋ））中へと播種し、３０℃で一晩培養した。ＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地（１％カザミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１００ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｍｅｒｃｋ）、１×ＹＮＢ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２％ガラクトース（Ｍｅｒｃｋ）、１％ラフィノース（Ｍｅｒｃｋ））によって、３７℃で一晩または２０℃で２日間かけて誘導した。次いで、組換えタンパク質の発現について、酵母培養物を調べた。ＦＡＣＳ分析は、リポータータグのみをコードする未改変発現ベクターを用いて形質転換させた酵母と同様の呈示レベルを明らかにした。さらに、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬを呈示する酵母培養物を、構造リポート抗体Ｍ３８および１．３．３．２２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色したところ、結果は、調べたタグについて同じ発現レベルを示した。ＦＡＣＳ分析は、２０℃においてまたは３７℃のストレス条件下において誘導した培養物に対して同様の呈示レベルを明らかにした。タグの発現は、そのタグのみをコードするベクターを用いて形質転換させた酵母に対して見出されるのと同様のレベルであった。さらに、野生型ＣＤ８１を発現する当該酵母細胞を、２０℃で誘導した細胞と同様に、抗ＣＤ８１抗体によって染色した。
実施例２：ＣＤ８１ ＬＥＬのファージディスプレイ
ｃ−ｍｙｃタグからＮ末端に位置された組換えタンパク質およびｇ３ｐタンパク質によるファージ粒子の発現を可能にする発現ベクターｆｄｍｙｃの多重クローニング部位へと、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬをコードする配列をクローニングした。
増幅のためのプライマーは、
Figure 2021533834
であった。
ＰＣＲ産物を、制限酵素ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩによって切断し、対応する切断ベクターｆｄｍｙｃへとライゲートした。ライゲーション混合物を、大腸菌ＴＧ１細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換し、テトラサイクリン含有ＴＹＥプレート（１．５％寒天、１．６％ペプトン、１％酵母エキス（Ｍｅｒｃｋ））上において選択した。３０℃でのテトラサイクリン含有培地における一晩の培養の後、培養物１Ｌあたり１０１１〜１０１２ファージ粒子の高い力価を得ることができ、これは、発現されたタンパク質が、ファージ増殖に対して有害でないことを示している。当該融合タンパク質の発現レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によるファージ粒子の分析を用いて試験した。呈示されたタンパク質の検出を、抗ｇ３ｐ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって実施し、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬと５０％融合していることを見出した。ＣＤ８１特異的抗体Ｍ３８および１．３．３．２２の両方においてファージが有するＣＤ８１ ＬＥＬを検出することができ、これは、ファージ呈示分子の正しいフォールディングを示している。
実施例３：可溶性ＣＤ８１ ＬＥＬの発現
ＣＤ８１ ＬＥＬ配列をプライマーによって増幅した。
Figure 2021533834
ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同じ酵素で切断したベクターｐＴＴ２２ＳＳＰ４（ＣＮＲＣ）へとライゲートした。ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換し、形質転換体をアンピシリンプレート上において選択した。プラスミドをミニプレパレーションによって単離し、製造元の取扱説明書に正確に従ってＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞（ＣＮＲＣ）へとトランスフェクトした。０．５％の最終濃度までＴＮ−２０を加えて、タンパク質発現を５日間継続した。次いで、標準プロトコールを使用してＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによってｈＣＤ８１ ＬＥＬを精製した。上清を、ＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールならびに７．５に調節したｐＨによって緩衝した。Ｅｘｃｅｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ７．５においてＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化し、緩衝した上清をロードした。溶離は、ｐＨ７．５において、ＰＢＳ中における２０ｍＭから５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配により５カラム体積分において行った。タンパク質含有画分をプールし、１００倍体積のＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。
天然条件でのＳＥＣ分析は、可溶性野生型ＣＤ８１ ＬＥＬに類似する、タンパク質の二量体型に対応する単分散溶離プロファイルを明らかにした。
あるいは、タンパク質を、製造元の取扱説明書に正確に従ってＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールにより、ＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において発現させた。次いで、標準プロトコールを使用してＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによってｈＣＤ８１ ＬＥＬを精製した。上清を、同量のＡＤで希釈し、ＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールならびに７．５に調節したｐＨによって緩衝した。Ｅｘｃｅｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ７．５においてＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化し、緩衝した上清をロードした。溶離は、ｐＨ７．５において、ＰＢＳ中における２０ｍＭから５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配により５カラム体積分において行った。タンパク質含有画分をプールし、１００倍体積のＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。
実施例４：ＣＤ８１ライブラリー１の構築
ＣＤ８１ ＬＥＬのＣセグメントおよびＤセグメントにおける合計１２のアミノ酸残基においてランダム化したＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体の酵母ディスプレイライブラリーを構築した。ランダム化したのは、アミノ酸残基：１６０〜１６２および１８１〜１８９（１Ｇ８Ｑと同様に付番した）であった。酵母ディスプレイライブラリーを、７×１０７の非依存性メンバーのサイズにおいて調製した。組換えのためのＰＣＲ断片を、
Ｑ５ ＨｉＦｉポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｎｓ）を使用して、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つである］
Figure 2021533834
［式中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つであり、Ｍは、ＡまたはＣのうちのいずれか１つである］
を用いて調製し、ゲル電気泳動の後に精製した。ＰＣＲ断片の組換えを容易にするために、レシピエントベクターを改変した。全ての変異導入ステップを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、製造元の取扱説明書に正確に従って実施した。
ＢａｍＨＩ部位を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
によってｐＹＤ１＿ＣＤ８１ ＬＥＬ内に導入し、次いで、天然に存在するＢａｍＨＩ部位を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用して除去した。
ベクターをＢａｍＨＩおよびＣｌａＩにより線状化し、ベクター骨格をアガロースゲルから精製した。ＰＣＲ断片およびベクター骨格を出芽酵母ＥＢＹ１００内へと導入するために、化学変換を使用した。２０ｍｌのＹＰＤ培地におけるＥＢＹ１００のスターター培養物を、３０℃および１８０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートした。次いで、当該培養物を、ＯＤ６００＝０．４まで希釈し、３０℃および１８０ｒｐｍで約５時間インキュベートした。次いで、５０ｍｌの細胞培養物のアリコートを、室温において、１０００ｇで５分間かけてペレット化し、次いで、２５ｍｌのＡＤで洗浄し、再びペレット化した。当該細胞を、３ｍｌの１００ｍＭ Ｌｉ−アセテートに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で１５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、上清を除去した。以下のように形質転換ミックスの成分を加えた；２４００μｌの５０％ＰＥＧ ３３５０、３６０μｌの１．０Ｍ Ｌｉ−アセテート、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ（サケ精子担体ＤＮＡ、事前に最高で９５℃までにおいて５分間加熱し、次いで、氷上に位置した）、１０μｇの線状化されたレシピエントベクター、および７μｇのＤＮＡ断片。当該細胞ペレットを形質転換ミックスに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で３０分間インキュベートし、４２℃で４５分間熱ショックを与えた。
室温において５分間の１０００ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、上清を除去した後、ペレットを、１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地（１％カザミノ酸（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１００ｍＭ Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｍｅｒｃｋ）、１×ＹＮＢ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２％グルコース（Ｍｅｒｃｋ））に再懸濁させた。ライブラリーサイズを決定するため、希釈平板培養のためのアリコートを除去し、１０μｌの細胞懸濁液を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡ培地において希釈し、その１００μｌをＭＤＬプレート（１．５％寒天（Ｍｅｒｃｋ）、１×ＹＮＢ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、２％グルコース（Ｍｅｒｃｋ）、および０．０１％ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））上に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。酵母細胞を５０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地において希釈し、３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間インキュベートし、１：２０希釈において新鮮なＳＤ−ＣＡＡ培地へと継代し、同じ条件下においてさらに２４時間培養した。細胞を、４℃において１０００ｇで５分間かけて回収し、ペレットを同量の３０％グリセロールに再懸濁させ、その後、−８０℃で冷凍した。
実施例５：マウスＥＧＦＲ−ＦｃによるＣＤ８１ ＬＥＬライブラリー１の選択
マウスＥＧＦＲ−ＦｃをＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。ビオチン化のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標） Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬を３：１のモル比において使用した。抗原を、製造元の取扱説明書に正確に従って、０．２５μｇ／μｌの濃度へと再構成した。ビオチン化試薬を伴ったインキュベートを、振とうしながら室温において１時間継続した。非結合ビオチンを、１０．０００ＤａのＭＷＣＯによるＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、撹拌しながら４℃において一晩かけて、百倍量のＰＢＳに対する透析によって除去した。
選択のため、ライブラリーをＳＤ−ＣＡＡへと播種し、３０℃で一晩培養した。３７℃において一晩かけてＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地によって誘導した。誘導した細胞懸濁液を、１０％ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８細胞まで希釈し、２０℃において１０００ｇで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、１μＭのビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃを含有する２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において室温で３０分間インキュベートした後、細胞を、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞を洗浄するために、ペレットを１ｍｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、４℃において１０００ｇで５分間遠心分離処理した。次いで、当該細胞を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１：１００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴う２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、その後、それらを、１ｍｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、再び遠心分離処理した。最後に、細胞を２５０μｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）によって選別するまで、氷上に維持した。第１回の選別は、２．５倍のライブラリーサイズを網羅し、１％の偽陽性酵母細胞を収集し、第２回の選別では、第１の選別の２０倍のアウトプットを処理し、０．１％の偽陽性酵母細胞が繁殖した。続く２回の選別ラウンドでは、前の選別の少なくとも１００倍のアウトプットを処理し、再び、０．１％の酵母細胞を収集し、第４回の選別の後に、単一の酵母ディスプレイクローンをキャラクタライズするためにプレートアウトした。２３の選択されたクローンを、マウスＥＧＦＲ−Ｆｃを用いた染色を使用してスクリーニングし、クローン９、１０、および２３を除く全てが、抗原によって著しく染色されたが、二次試薬のストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７では染色されなかった。
Figure 2021533834
配列決定において、６つの異なる配列を特定した（表２）。
Figure 2021533834
実施例６：ヒトＥＧＦＲ−ＦｃによるＣＤ８１ライブラリー１の選択
ヒトＥＧＦＲ−ＦｃをＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。ビオチン化のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬を３：１のモル比において使用した。抗原を、製造元の取扱説明書に正確に従って、０．２５μｇ／μｌの濃度へと再構成した。ビオチン化試薬を伴ったインキュベートを、振とうしながら室温において１時間継続した。非結合ビオチンを、１０．０００ＤａのＭＷＣＯによるＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、撹拌しながら４℃において一晩かけて、百倍量のＰＢＳに対する透析によって除去した。
選別のため、最初に、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＤ−ＣＡＡ培地において、３０℃で一晩振とうしながらライブラリーを培養し、次いで、ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地に酵母細胞を再懸濁させることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、それを３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。
ＭＡＣＳのために、１０９の誘導した酵母細胞を２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化し、当該ペレットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．２５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させることによって洗浄し、再び、２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。洗浄した細胞を、０．２５μＭのビオチン化抗原を含有する２５ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁させ、穏やかにアジテートしながら室温において３０分間インキュベートし、さらに氷浴において１０分間インキュベートした。次いで、細胞および抗原溶液を、４℃において２５００ｇで５分間かけてペレット化し、５０ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し、各洗浄ステップの後にペレット化した。細胞を５ｍｌの洗浄緩衝液＋２５μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（μＭＡＣＳストレプトアビジンキット、ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁させ、氷上において１０分間インキュベートした。最後に、１５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。
ＬＳカラムを分離機に位置し、当該カラムを予備調整するために、３ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。次いで、細胞溶液を７ｍｌのバッチにおいてロードした。カラムの滴下を一度止め、カラム内のビーズの向きを変えるために、手短にカラムを磁石から外し、再び磁石に位置することで、捕捉された細胞を貫流させた。次の７ｍｌの細胞懸濁液をロードする前に、当該カラムに１ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。全ての細胞をロードするまで、これらのステップを繰り返した。次いで、カラムを３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、手短に磁石から外し、再び３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。結合している細胞を溶離させるため、カラムを磁石から外して５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。供給されたプランジャーを使用することにより、細胞をカラムから新しい管へと押し出した。結合している細胞の画分を２，５００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させ、３０℃において１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。１０μｌの溶離した細胞を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡにおいて希釈し、１００μｌをＭＤＬプレート上に播種し、３０℃において３日間インキュベートすることにより、ＭＡＣＳ手順のアウトプットを評価した。
続くＦＡＣＳ選択ラウンドにおいて、誘導した細胞懸濁液を、１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８の細胞まで希釈し、２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、１μＭのビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃを含有する２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において２０℃で３０分間インキュベートした後、細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞を洗浄するために、ペレットを１ｍｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。次いで、当該細胞を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１：１００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴う２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、その後、それらを、１ｍｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、再び遠心分離処理した。最後に、細胞を２５０μｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）によって選別するまで氷上に維持した。先の選別ラウンドの少なくとも２０倍のアウトプットを処理し、０．１％の上位抗Ｖ５抗体陽性酵母細胞を収集した。単一の酵母ディスプレイクローンをキャラクタライズするために、第５回の選別をプレートアウトした。
以下のバインダーの配列を特定した（表３）。
Figure 2021533834
実施例７：ＣＤ８１ ＬＥＬライブラリー２の構築
抗原特異的ＣＤ８１ ＬＥＬバインダーにおける可能性のあるレパートリーを拡張するために、ＣＤ８１ ＬＥＬライブラリー１においてランダム化したものとは異なるアミノ酸残基が潜在的な抗原認識部位を形成することができるライブラリーを設計することを目的とした。この設計は、１１のアミノ酸残基：すなわち、ヘリックスＡにおけるアミノ酸残基１３２〜１３３、ＡＢループにおけるアミノ酸残基１３６〜１３９、ならびにヘリックスＣにおけるアミノ酸残基１６２〜１６５、１６７、および１７１〜１７２、のランダム化を伴う。ここで、足場は、新規のジスルフィド結合：１つはヘリックスＡとＢを接続するもの（Ｃ４）および１つはヘリックスＡおよびＣを接続するもの（Ｃ９）、を有するＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体である。次いで、新規のジスルフィド結合Ａｌａ１３４Ｃｙｓ／Ｌｙｓ１４４ＣｙｓおよびＶａｌ１３５Ｃｙｓ／Ｓｅｒ１６８Ｃｙｓの組合せを伴うこのＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（ＣＮＲＣ）において産生させ、その熱安定性を試験した。最高でも１３０℃までにおいて熱的アンフォールディングが記録され、それは、野生型ｈＣＤ８１ＬＥＬの４３℃より高い１０９．４０±０．２５℃のＴｍの単一イベントにおいて継続した。Ｃ４Ｃ９と呼ばれるこのタンパク質は、天然の条件下のＳＥＣにおいて、野生型タンパク質の時間特性における単一の鋭いピークとして泳動された。重要なことに、当該安定化された突然変異体は、野生型ｈＣＤ８１ ＬＥＬに対してと同じ程度に、構造−レポーター抗体Ｍ３８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合することができた。この突然変異体に対してＦａｒ−ＵＶ ＣＤスペクトルを調べたところ、野生型ｈＣＤ８１ ＬＥＬの場合に得られるものと同一であることが見出され、それは、以前に公表された結果と同様に、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍに２つの特徴的下限を有する高αヘリックス含有量のタンパク質の典型であった。
最初に、一連の変異導入ステップにおいて、酵母ディスプレイｐｙｄ１＿ＣＤ８１ＬＥＬのためのレシピエントベクターを、本来のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の欠失によって改変した。全ての変異導入ステップを、オリゴヌクレオチドを使用するＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施し、ＢａｍＨＩ部位を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより削除し、ならびにＨｉｎｄＩＩＩ部位を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより削除した。
線形化の後にライブラリー断片の組換えを促進するために、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより、新規のＢａｍＨＩ制限部位を導入し、ならびに、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより、新規のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入した。
Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用したミディプレパレーション（ｍｉｄｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって、レシピエントベクターＤＮＡを単離し、当該ベクターを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素処理を使用して線状化した。分取ゲル電気泳動法の後に精製を使用してベクター骨格を単離した。
さらに、断片をコードするライブラリーの正しい組換えを促進するために、新規ジスルフィド結合を形成する突然変異Ａｌａ１３４ＣｙｓおよびＬｙｓ１４４Ｃｙｓならびに別の新規ジスルフィド結合を形成するＶａｌ１３５ＣｙｓおよびＳｅｒ１６８ＣｙｓによるＣＤ８１のテンプレート挿入を改変することにより、制限部位を有する配列を導入した。改変のためのテンプレートは、ｐＴＴ２２ＳＳＰ４＿ＣＤ８１ ＬＥＬ Ｃ４Ｃ９突然変異体であった。オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、ならびに、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用することにより、ＢａｍＨＩ部位を導入した。
ランダム化されたヌクレオチド配列を伴うＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つである］、ならびに
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つであり；ならびにＭは、ＡまたはＣのうちのいずれか１つである］
によって作製した。
（ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従う）
ＰＣＲ反応において、Ｑ５ ＨｉＦｉポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ゲル電気泳動の後にライブラリー断片を精製した。
形質転換のために、２０ｍｌのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）（Ｍｅｒｃｋ）におけるＥＢＹ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のスターター培養物を、３０℃および１８０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートした。次いで、当該培養物を、０．４のＯＤ６００まで希釈し、３０℃および１８０ｒｐｍにおいて約５時間インキュベートした。次いで、５０ｍｌの細胞培養物のアリコートを、室温において、１０００ｇで５分間かけてペレット化し、次いで、２５ｍｌのＡＤで洗浄し、再びペレット化した。当該細胞を、３ｍｌの１００ｍＭ Ｌｉ−アセテートに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で１５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、上清を除去した。以下のように形質転換ミックスの成分を加えた：２４００μｌの５０％ ＰＥＧ ３３５０、３６０μｌの１．０Ｍ Ｌｉ−アセテート、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ（サケ精子担体ＤＮＡ、事前に最高で９５℃までにおいて５分間加熱し、次いで、氷上に位置した）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇの線状化されたレシピエントベクター、および７μｇのＤＮＡ断片。当該細胞ペレットを形質転換ミックスに再懸濁させ、振とうインキュベーターにおいて３０℃で３０分間インキュベートし、４２℃で４５分間熱ショックを与えた。
室温において１０００ｇで５分間の遠心分離処理によって細胞を収集し、上清を除去した後、ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させた。ライブラリーサイズを決定する希釈平板培養のためにアリコートを除去し、１０μｌの細胞懸濁液を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡ培地において希釈し、その１００μｌをＭＤＬプレート上に播種し、３０℃で３日間インキュベートした。酵母細胞を５０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地において希釈し、３０℃において１８０ｒｐｍで２４時間インキュベートし、１：２０希釈において新鮮なＳＤ−ＣＡＡ培地へと継代し、同じ条件下においてさらに２４時間培養した。細胞を、４℃において１０００ｇで５分間かけて回収し、ペレットを同量の３０％グリセロールに再懸濁させ、その後、−８０℃で冷凍した。
ＣＤ８１＿ＬＥＬライブラリー２の酵母ディスプレイ形質転換は、結果として：
ライブラリー２＿４：９．５×１０６の非依存性メンバー
ライブラリー２＿５：２．１×１０７の非依存性メンバー
ライブラリー２＿６：１．７×１０７の非依存性メンバー
を生じた。
実施例７：ヒトＥＧＦＲ−ＦｃによるＣＤ８１ ＬＥＬライブラリー２の選択
選別のため、最初に、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＤ−ＣＡＡ培地において、３０℃で一晩振とうしながらライブラリーを培養し、次いで、ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地に酵母細胞を再懸濁させることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、それを３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。
次に、１０９の細胞を２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化し、次いで、当該ペレットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））に再懸濁させることによって洗浄し、再び、２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。当該洗浄した細胞を、０．２５μＭのビオチン化抗原を含有する２５ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁させ、穏やかにアジテートしながら室温において３０分間インキュベートし、さらに氷浴において１０分間インキュベートした。次いで、細胞および抗原溶液を、４℃において２，５００ｇで５分間かけてペレット化し、５０ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し、各洗浄ステップの後にペレット化した。当該細胞を、５ｍｌの洗浄緩衝液＋２５μｌのストレプトアビジンミクロビーズに再懸濁させ、氷上において１０分間インキュベートした。最後に、１５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。
ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）を分離機に位置し、当該カラムを予備調整するために、３ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。次いで、細胞溶液を７ｍｌのバッチにおいてロードした。カラムの滴下を一度止め、カラム内のビーズの向きを変えるために、手短にカラムを磁石から外し、再び磁石に位置することで、捕捉された細胞を貫流させた。次の７ｍｌの細胞懸濁液をロードする前に、当該カラムに１ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。全ての細胞をロードするまで、これらのステップを繰り返した。次いで、カラムを３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、手短に磁石から外し、再び３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。結合している細胞を溶離させるため、カラムを磁石から外して５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。供給されたプランジャーを使用することにより、細胞をカラムから新しい管へと押し出した。結合している細胞の画分を２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させ、３０℃において１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。さらに、１００μｌの１０−２希釈物をＭＤＬプレートに播種し、３０℃でインキュベートした。
誘導した細胞懸濁液を、１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８の細胞まで希釈し、２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、１μＭのビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含有する２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において２０℃で３０分間インキュベートした後、細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞を洗浄するために、ペレットを１ｍｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。次いで、当該細胞を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１：１００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴う２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、その後、それらを、１ｍｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、再び遠心分離処理した。最後に、細胞を２５０μｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）によって選別するまで、氷上に維持した。
選別後、細胞を適切な量のＳＤ−ＣＡＡに再懸濁させ、３０℃および１８０ｒｐｍにおいてインキュベートした後、上記において説明したように誘導した。
Figure 2021533834
実施例８：可溶性形態における改変されたＣＤ８１ ＬＥＬの発現
ＣＤ８１をコードする配列を、オリゴヌクレオチド
Figure 2021533834
を使用して酵母ディスプレイクローンから増幅させた。
ＰＣＲ断片を制限酵素ＮｈｅＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、同じ酵素で切断したベクターｐＴＴ２８（ＣＮＲＣ）へとライゲートした。ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換し、形質転換体をアンピシリンプレート上において選択した。プラスミドをミニプレパレーションによって単離し、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へとトランスフェクトした。ＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における発現は、製造元の取扱説明書に正確に従ってＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールに基づいている。次いで、標準プロトコールを使用したＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィにより、ｈＣＤ８１ ＬＥＬバリアントを精製した。上清を、同量のＡＤで希釈し、ＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールならびに７．５に調節したｐＨによって緩衝した。Ｅｘｃｅｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ７．５においてＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化し、緩衝した上清をロードした。溶離は、ｐＨ７．５において、ＰＢＳ中における２０ｍＭから５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配により５カラム体積分において行った。タンパク質含有画分をプールし、１００倍体積のＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。
天然条件でのＳＥＣ分析は、可溶性野生型ＣＤ８１ ＬＥＬに類似する、タンパク質の二量体型に対応する単分散溶離プロファイルを明らかにした。
あるいは、タンパク質を、製造元の取扱説明書に正確に従ってＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールにより、ＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において発現させた。次いで、標準プロトコールを使用してＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによってｈＣＤ８１ ＬＥＬを精製した。上清を、同量のＡＤで希釈し、ＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールならびに７．５に調節したｐＨによって緩衝した。Ｅｘｃｅｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ｐＨ７．５においてＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化し、緩衝した上清をロードした。溶離は、ｐＨ７．５において、ＰＢＳ中における２０ｍＭから５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配により５カラム体積分において行った。タンパク質含有画分をプールし、１００倍体積のＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。
実施例９：ＣＤ８１ ＬＥＬの熱安定化
ｈＣＤ８１ ＬＥＬをコードする断片（断片Ｐｈｅ１１３−Ｌｙｓ２０１）（配列番号８７を基にして付番）を、全長ＣＤ８１配列（Ｇｅｎｅａｒｔ）によって合成構築物から増幅させた。ドメイン内ジスルフィド結合の生成にとって好適なシステイン残基を有する可能性のある位置を特定するための予想ツールとして、ＤＳＤＢＡＳＥ（Ｖｉｎａｙａｇａｍら， ２００４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ３２， Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１， Ｄ２００〜Ｄ２０２頁， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ０２６）を使用した。隣接するアミノ酸残基のＣα原子とＣβ原子との間の距離、ならびに捻じれ角および結果として生じるＳ−Ｓ結合の長さに対してｈＣＤ８１ ＬＥＬ結晶構造１Ｇ８Ｑを解析するために、当該アルゴリズムを使用した。３６の予想された可能性のあるジスルフィド結合のうち、結晶構造の視覚検査によって判断した場合の最も成功する可能性の高い１１を選択した。これらのうちの５つを、ｈＣＤ８１ ＬＥＬのプロモータＡおよびプロモータＢの両方において、ＤＳＤＢＡＳＥプログラムによって予想した。
システインへの単一の選択されたアミノ酸残基の変異導入を、表５に一覧されるオリゴヌクレオチドを用いて製造元の取扱説明書に正確に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。
Figure 2021533834
ｈＣＤ８１ ＬＥＬバリアントを、ｐＴＴ２２ＳＳＰ４哺乳類発現ベクター（ＣＮＲＣ）へとクローニングし、２つの異なる発現系において発現させた。予備スクリーニングのために、当該構築物を、５％のＣＯ２下において３７℃で４日間にわたって、トランスフェクション後の２日目に０．８％の最終濃度までＴＮ−２０を供給して、１８０ｒｐｍのオービタルシェーカーにおいて、４ｍＭのグルタミンおよび５０μｇ／ｍＬのＧ−４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補ったＦ１７培地において、２ｍＬスケールでＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（ＣＮＲＣ）において発現させた。突然変異体Ｃ５は発現せず、Ｃ６の発現は不十分であり、Ｃ１０は、明確な二量体を形成したため、結果として、それらは、さらなる分析から省いた。さらなる特徴付けのために選択した突然変異体（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、およびＣ１１）を、製造元の取扱説明書に正確に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へとトランスフェクトした。ＭａｘＴｉｔｅｒプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、細胞の培養を継続した。１４日後に上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡ親和クロマトグラフィを使用して精製した。清澄化後、試料を、ｐＨ７．５の２０ｍＭイミダゾールを伴うリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩衝し、同じ緩衝液で平衡化したＥｘｃｅｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させた。Ｈｉｓタグ付けされたｈＣＤ８１ ＬＥＬを、カラムの５倍の体積の２０〜５００ｍＭの勾配のイミダゾールによって溶離させた。標的タンパク質を含む画分をプールし、４℃において一晩、１００倍量のＰＢＳに対して２回透析した。当該タンパク質を、使用まで−８０℃で貯蔵した。
ダイオードアレイ検出器および屈折率検出器を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステムを使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるＳＥＣ−ＨＰＬＣを実施した。使用した移動相緩衝液は、２００ｍＭのＮａＣｌを伴うＰＢＳであった。０．７５ｍＬ／分の一定流速においてクロマトグラフィを行った。約２ｍｇ／ｍＬにおいて合計で２００μｇのタンパク質を、分析のために当該カラムにロードした。１０〜５００ｋＤａの範囲の１セットの分子量標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、カラム較正を実施した。突然変異体Ｃ１およびＣ８は、よく分解されたピークを示さなかったが、他の全ての突然変異体は、野生型タンパク質と同様であった。
ｐＨ７．４においてＰＢＳで希釈された８０μＭのタンパク質溶液を使用し、自動化されたＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ−ＤＳＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、ＤＳＣ実験を実施した。１℃／分の昇温速度において、２０℃から１１０℃まで加熱を実施した。次いで、タンパク質溶液をｉｎ ｓｉｔｕにおいて冷却し、最初のスキャンから引き算するためのベースラインを得るために、同一の熱スキャンを行った。全ての測定をデュプリケートにおいて行った。非２状態転移メカニズム（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を使用して、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＰＥＡＱ−ＤＳＣソフトウェアにより近似を実施した。
野生型ＣＤ８１ ＬＥＬの熱安定性の測定は、６６．１５℃における単一の融点が明らかとなったが、２．４×１０４ｋｃａｌ／ｍｏｌの低エンタルピーを明らかにした。
Figure 2021533834
示差熱量分析スキャンを行い、さらに、バックグラウンドとして差し引かれるべき変性タンパク質溶液の再スキャンを行った。ここで、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬおよび他の安定化されたバリアントとは対照的に、突然変異体Ｃ２は、驚くべきことに、最高で１１０℃までにおいて可逆性アンフォールディングを示すことが発見された。
次いで、強力に安定化する新規のジスルフィド結合Ａｌａ１３４Ｃｙｓ／Ｌｙｓ１４４ＣｙｓおよびＶａｌ１３５Ｃｙｓ／Ｓｅｒ１６８Ｃｙｓの組合せを伴うｈＣＤ８１ＬＥＬ突然変異体を産生させ、その熱安定性を試験した。最高でも１３０℃までにおいて熱的アンフォールディングが記録され、それは、野生型ＣＤ８１ＬＥＬの４３℃より高い１０９．４０±０．２５℃のＴｍの単一イベントにおいて継続した。Ｃ４Ｃ９と呼ばれるこのタンパク質は、天然の条件下、ＳＥＣにおいて、野生型タンパク質の時間特性における単一の鋭いピークとして泳動された。
重要なことに、当該安定化された突然変異体は、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬと同じ程度に、構造−レポーター抗体Ｍ３８に結合することができた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ， ＮＵＮＣ）を、室温において１時間かけて、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの抗ｈＣＤ８１ Ｍ３８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングした。室温で１時間かけて５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳでブロックした後、２．５％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したｈＣＤ８１ ＬＥＬバリアントまたはｈＣＤ８１ ＬＥＬの精製バリアントでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の上清を、室温で１時間かけて結合させた。十分に洗浄した後、突然変異体タンパク質の結合を、２．５％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：２０００に希釈した抗ｈｉｓ−ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（ＱＩＡｇｅｎ）によって検出した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により、抗体結合を確認し、当量の３０％ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって当該反応を止め、吸光度を４５０／６２０ｎｍにおいて読み取った。
Figure 2021533834
突然変異体Ｃ４Ｃ９および野生型ＣＤ８１のＦａｒ−ＵＶ ＣＤスペクトルを調べた。ＣＤスペクトルは、Ｃｈｉｒａｓｃａｎ分光偏光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）において測定した。１ｍｍのクォーツキュベットを使用した。タンパク質調製物をＰＢＳにおいて１ｍｇ／ｍＬに希釈した。スペクトルは、野生型ｈＣＤ８１ ＬＥＬおよびＣ４Ｃ９において同一であることが見出された。観察したスペクトルは、以前に公開された結果と同様に、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍに２つの特徴的な最低値を有する、高αヘリックス含有量のタンパク質の典型であった。
Figure 2021533834
Figure 2021533834
実施例１０：細胞培養における標的特異的ＥＶの産生
１０．１ ＨｅＬａ細胞を使用した、標的特異的ＥＶドナー細胞系の一時的トランスフェクション
標的特異的ＣＤ８１−ＧＦＰ含有エキソソーム（ＣＤ８１−ＧＦＰ−エキソソーム）を分泌するためにＣ末端ＧＦＰ融合させた組換えＣＤ８１を発現するＨｅＬａ細胞を、電気穿孔を使用して一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２〜３日前に、ＨｅＬａ細胞（５×１０６細胞）を、Ｔ１７５細胞培養フラスコ（Ｓｉｇｍａ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）に播種した。ドナーＨｅＬａ細胞の定期的培養のために、１０％ＦＣＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有する、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用した。トランスフェクションの当日（０日目）、ＨｅＬａ細胞（最適には、７０〜８５％の培養密度において）を、０．１％Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液を使用して回収した（５分間の処理、完全ＲＰＭＩ−１６４０による中和）。ＲＰＭＩ−１６４０において剥離されたＨｅＬａ細胞を、ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して定量化した。３×１０６細胞をＣＤ８１−ＧＦＰプラスミド（ｐＴＴ５、ＮＲＣカナダ、オタワ、カナダ、４ μｇ）を用いてトランスフェクトし、１つのＴ１７５フラスコを満たした。内製した電気穿孔緩衝液（５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、１２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．２、５０ｍＭのマンニトール、０．００５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）を使用して、製造元の小冊子（ＨｅＬａ細胞のためのプログラムＩ−０１３）に従って、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｉデバイス（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）を使用して電気穿孔を実施した。電気穿孔した細胞を完全ＲＰＭＩ−１６４０に回収し、２４時間培養することで、当該細胞を培養フラスコ表面に付着させた。実際、組換えＣＤ８１を標的とするヒトトランスフェリン受容体の様々な形態が、原形質膜に局在化し、このことは、組換えテトラスパニンの機能的統合を示唆していた（図４）。
１０．２ 標的特異的ＥＶの単離および精製
１日目（トランスフェクションの２４時間後）に、培養培地を除去し、それぞれの量（１×Ｔ１７５に対して４５ｍＬ）のＥＶ枯渇分泌培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で交換した。超遠心分離（１４〜１８時間、４℃、１００，０００ｇ）した完全ＲＰＭＩ−１６４０（２０％のＦＣＳを含有する）から上清画分を収集し、ＲＰＭＩ−１６４０によって当該培地を１０％ＦＣＳに希釈し、４ｍＭの最終濃度までＬ−グルタミンを加えることによって、ＥＶ枯渇ＲＰＭＩ−１６４０を調製した。標的特異的ＥＶを分泌させるために、ＨｅＬａ細胞をＥＶ枯渇培地と共に７２時間（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）インキュベートした。
収集時間の７２時間後に、超遠心分離を用いることによってＥＶの単離を実施した。馴化された細胞培養培地を収集し、４℃で３０分間遠心分離処理（３，１００×ｇ）することにより、細胞および細胞破片を除去した。上清を、４５０ｎｍシリンジフィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）に通過させ、１００ｍＬの密封可能な超遠心分離管に移した。次いで、超遠心分離機（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ−６０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ブレア、米国）を使用して、上清を４℃で９０分間遠心分離処理（１００，０００×ｇ）した。上清を除去し、１ｍＬの残りの培地においてペレットを収集した。超遠心分離の第二ステップ（１００，０００×ｇ、９０分間、４℃）を実施することにより、より少ない量のＥＶを収集した。再び上清を除去し、残ったＥＶペレットを２００〜４００μｌのＨＥＰＥＳに基づく１×Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）に再懸濁させた。この方法を使用して、約１０１１ＥＶ／ｍｌをＨｅＬａ上清から精製した。
実施例１１：追跡可能で精製可能なタグを保持するＥＶの作製
１１．１ レトロウイルス系におけるＣＤ８１−シュノーケルタグの配列およびクローニング
野生型ヒトＣＤ８１配列（アミノ酸配列番号８７；核酸配列番号８８）を、Ｃ末端に融合させたＳＮＯＲＫＥＬタグを有するｐＢＭＮベクターへとクローニングした（Ｂｒｏｗｎら ２０１３， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（９）： ｅ７３２５５． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７３２５５）。ＳＮＯＲＫＥＬタグは、タグがベシクル膜の表面に呈示されるのを可能にする。ＣＤ８１のＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＡｇｅＩによって切断し、ＳＮＯＲＫＥＬタグのＰＣＲ産物をＡｇｅＩおよびＮｏｔＩによって切断した。ｐＢＭＮプラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによって切断した。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによってライゲートされた消化されたＰＣＲ産物は、ｐＢＭＮプラスミドを消化した。ライゲーション混合物を、コンピテント大腸菌（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、形質転換体をアンピシリンプレート上において選択した。エンドトキシン不含プラスミド調製物（Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ）によって、プラスミドを単離した。
１１．２ レトロウイルストランスフェクションを使用したＥＶドナー細胞におけるｃＤ８１−シュノーケルタグの安定的発現
Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞（５×１０６細胞）を、トランスフェクションの１日前（０日目）に、Ｔ７５プレート（Ｓｉｇｍａ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）に播種した。１０％ ＦＣＳおよび４ｍＭ Ｌ−グルタミンを伴うＤＭＥＭ ４．５ｇグルコースを用いた完全増殖培地において細胞を培養した。細胞が、コンフルエントの６０〜７０％になったら、培養培地を除去し、ＦＣＳを伴わない４ｍＭ Ｌ−グルタミンを伴うＤＭＥＭ ４．５ｇグルコースと取り換えた。ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、フランス）を使用して、１０μｇのｐＢＭＮ−ＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグ（ＣＤ８１のＣ末端に融合させたＳＮＯＲＫＥＬタグ）プラスミドによって、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後（１日目）、培地を７ｍｌの完全増殖培地へと変えた。標的細胞（ＨｅＬａ）を、６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、ドイツ）において、１０％ ＦＣＳおよび４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に、１×１０６細胞／ウェルにおいて播種した。播種の２４時間後（２日目）、ＨｅＬａ細胞（５０〜８０％のコンフルエンシー）を感染させることができる。Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞（ウイルス粒子を含有する）からの７ｍＬの上清を、０．４５μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して濾過し、ポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍＬ）をこの濾液に混合した。新鮮な増殖培地をＰｈｏｅｎｉｘ細胞上に加えた。標的細胞からの上清を除去し、最高で２ｍＬまでのウイルス含有上清を加えた。プレート全体をパラフィンで覆い、室温において８００×ｇで６０分間遠心分離処理した。次いで、ウイルス上清を捨て、新鮮な増殖培地をＨｅｌａ細胞に加えた。細胞がＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグを９５〜１００％発現するまで、次の３日間、ウイルス感染を行った。当該タグ付けされたＣＤ８１は、細胞膜に局在化し、これは、正しいフォールディングおよび局在化を示している（図５Ａ）。ＣＤ８１のＣ末端に融合したＳＮＯＲＫＥＬタグと共に、Ｈｅｌａ細胞におけるＣＤ６３融合タンパク質によっても当該方法を首尾良く実施した（図５Ｂ）。ヒト間葉系幹細胞（ＡＳＣ）において、同様の結果が観察された。ＥＶは、１０ｎｍ金粒子に結合させた抗ＨＡ抗体および１８ｎｍ金粒子に結合させた抗ＣＤ８１抗体による免疫金標識の後に電子顕微鏡法を行った場合、ＨＡタグおよびＣＤ８１に対して同時に陽性である。
１１．３ ＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグのサイズ、番号、組み入れのためのＥＶの特徴付け
ＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグを安定して発現するＨｅＬａ細胞を、培養培地において、３ Ｔ７５プレートに播種した（５×１０６細胞／フラスコ）。播種の２４時間後（１日目）、培養培地を除去し、それぞれの量（１×Ｔ７５に対して１２ｍＬ）のＥＶ枯渇分泌培地（ＲＰＭＩ−１６４０）と取り換えた。超遠心分離処理した（１４〜１８時間、４℃、１００，０００ｇ）完全ＲＰＭＩ−１６４０（２０％ ＦＣＳを含有する）から上清画分を収集し、１０％ ＦＣＳまでＲＰＭＩ−１６４０で培地を希釈し、４ｍＭの最終濃度までＬ−グルタミンを加えることにより、ＥＶ枯渇ＲＰＭＩ−１６４０を調製した。ＳＮＯＲＫＥＬタグを有するＥＶを分泌させるため、ＨｅＬａ細胞を、ＥＶ枯渇培地と共に４８時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）。
ＥＶ枯渇培地において４８時間にわたって細胞を培養した後に、ＳＮＯＲＫＥＬタグを保持するＥＶの単離を実施した。当該馴化培地を収集し、４℃において７００ｇで５分間遠心分離処理することにより、細胞破片を除去した。上清に対して４℃において２０００ｇで１０分間の遠心分離処理の第二ラウンドを行うことにより、アポトーシス体およびより大きい粒子を除去した。次に、当該上清を、０．２２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）に通すことによって、マイクロベシクルのようなより大きい粒子を除去した。処理した上清を、３００ｋＤａ孔径中空繊維（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ、オランダ）を備えるタンジェンシャルフロー濾過カラムを使用して、初期量の１／２０まで濃縮した。濃縮した馴化培地は、ＥＶをさらに特徴付けるために使用した。１０μｌの濃縮馴化培地を、濾過したＤＰＢＳ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）において１０００倍まで希釈し、ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ５００による散乱モードにおけるナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）のために使用した。全ての取得パラメータは、サイズおよび濃度測定と同一であった。全ての実験は、実験的トリプリケートにおいて測定した。様々な単離物からのＥＶのサイズは、約１１０〜１４０ｎｍである。
ＥＶへのＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグの組み入れを、ウエスタンブロット分析によって確認した。ｎａｎｏｓｉｇｈｔによって定量化された１Ｅ１０ ＥＶを、ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲルにおいてＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した５０μｇの細胞溶解物と一緒にウェルごとにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ゲル上のタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔターボ移動システム（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ｔｕｒｂｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＰＶＤＦ膜に転写した。定量化のためのＳＮＯＲＫＥＬタグを伴うＥＶ特異的マーカーに対する特異的抗体。実際に、ＥＶは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＴＳＧ１０１を含むウエスタンブロットにおける典型的なＥＶタンパク質のマーカー、ならびに細胞内タンパク質カルネキシンの不在を示した。
１１．４ 抗ＨＡマトリックスおよびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを使用した、ＳＮＯＲＫＥＬタグを排他的に保持するＥＶの単離
ＣＤ８１−ＳＮＯＲＫＥＬタグを発現するＨｅＬａ細胞からの馴化培地を、分画遠心分離法（７００ｇおよび２０００ｇ）によって処理し、０．２２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して濾過し、３００ｋＤａの孔径中空繊維（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ、オランダ）を備えるタンジェンシャルフロー濾過カラムを使用して１ｍｌまで濃縮した。３５０μｌの濃縮された馴化培地を、アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートされた抗ＨＡ抗体２００μｌと混合し、試験管回転器において４℃で一晩インキュベートした。１６〜１８時間のインキュベーション後、アガロースビーズを４℃において５００ｇで５分間回転し、フロースルー（結合していないＥＶ）を収集し、アガロースビーズを４℃において５００ｇで５分間回転することによって、ビーズを１ｍｌの濾過済みＤＰＢＳで洗浄した。次に、ＥＶ上のＳＮＯＲＫＥＬタグに結合している、抗ＨＡ抗体がコンジュゲートされたアガロースビーズに、試験管回転器において、４℃で１６〜１８時間、ｐＨ７〜７．４の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（シグマ）において８ユニットのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ処理（ｓｉｇｍａ）４μｌを施した。１６〜１８時間のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ処理の後、アガロースビーズを５００ｇで回転し、上清を収集した。精製されたＳＮＯＲＫＥＬタグを保持するＥＶの数を定量化するために、全ての試料（インプット、フロースルー、洗浄液、および溶離液）を１倍から１０００倍希釈においてＮＴＡ分析に使用した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ消化後、バンドは、切断されたＨＡタグを使用すると溶離画分において検出可能ではないが、残ったＣＬＩＰタグは、当該溶離画分において十分に可視的であるため、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを使用した精製は、親和マトリックスから穏やかに溶離された約８０〜９０％のベシクルをもたらした。溶離画分と、溶離せずにビーズ上に残った画分とを比較することにより、約８０〜９０％の収率が認められた（図６）。
ＳＮＯＲＫＥＬタグにおけるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ部位より前のＡＸＬ特異的標的化のための抗原特異的リガンド、例えば、Ｇａｓ６など、の挿入は、ＳＮＯＲＫＥＬタグを保持する特異的ＥＶの精製、および精製が実施された後のＥＶの標的化を可能にする。
実施例１２：標的特異的細胞外ＥＶの特徴付け
１２．１ ＥＶサイズおよび組換えタンパク質の組み入れ比の特徴付け
１０μｌのＥＶ単離物を、６ｍＬの濾過したＤＰＢＳ（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）で希釈し、ＺｅｔａＶｉｅｗ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ、イニング、ドイツ）による散乱および蛍光モードにおけるナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）のために使用し、続いて、ＮＴＡソフトウェア（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ、イニング、ドイツ）を使用して評価した。全ての取得パラメータは、サイズおよび濃度測定と同一であった。全ての実験は、実験的トリプリケートにおいて測定した。
散乱および蛍光モードにおいて測定した粒子の数の比率は、標的特異的ＣＤ８１−ＬＥＬ部分および蛍光ＧＦＰを有する組換えＥＶと、非組換えおよび非蛍光天然ＥＶとの間の比率に等しい。組換えＥＶ産生の様々なバッチにより、ＮＴＡ測定から得られる比率は、全ての単離されたＥＶのおよそ３０〜５０％が組換え体であることを示した。上記において言及した単離方法によって単離されたＥＶの一般的なサイズ中央値は、約１２０〜１４０ｎｍであり、標的特異的蛍光ＥＶの典型的な収量は、６０〜４００ｎｍのサイズ範囲においてＨｅＬａ細胞あたり１６００〜５０００の組換えＥＶに達し、粒子サイズの直径において１３０ｎｍにピークを有する（図７）。
１２．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特異的ＥＶ取込みの定性化および定量化
（ａ）蛍光顕微鏡による標的抗原陽性細胞におけるＥＶ取込みの定性化
レシピエント細胞（例えば、Ｃａｃｏ−２細胞）を、８ウェルのｉｂｉｄｉガラスボトムプレートに播種し（１ウェルあたり２．５×１０４細胞）、完全培養培地において２４時間付着させた（３７℃、５％のＣＯ２雰囲気）。インキュベーション時間の後、１０９の組換えＥＶを各ウェルに加えた。細胞をさらに２４時間培養して、レシピエント細胞に組換え粒子を取り込ませた。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、氷上において酸性グリシン緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５）によって処理することにより、表面に結合したＥＶを除去した。次いで、細胞を、蛍光顕微鏡（ＤＭＩ３０００Ｂ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェッツラー、ドイツ）を使用して、４０倍率において撮像した。顕微鏡撮像パラメータ（露光時間、コントラスト、および利得）は、全ての実験において同じであった。実際に、組換えＥＶは、レシピエント細胞によって容易に取り込まれた（図８Ａ）。
（ｂ）フローサイトメトリーによる標的抗原陽性細胞におけるＥＶ取込みの定量化
レシピエント細胞（例えば、Ｃａｃｏ−２細胞）を、２４ウェルのプラスチックボトムプレートに播種し（１ウェルあたり０．２５×１０６細胞）、完全培養培地において２４時間付着させた（３７℃、５％のＣＯ２雰囲気）。インキュベーション時間の後、５×１０９の決まった数の組換えＥＶを各ウェルに加えた。細胞をさらに２４時間培養して、レシピエント細胞に組換え粒子を取り込ませた。最後に、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．１％トリプシンで処理し（５分間、３７℃）、１０％ ＦＢＳを含有する完全培地で中和した。次いで、細胞を、３００ｇにおいて遠心分離処理し、ペレットを氷冷ＤＰＢＳに再懸濁させた。
試料を、氷上に維持し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ブレア、米国）によって測定した。データをＣｙｔｏｆｌｅｘソフトウェアで解析した。平均蛍光強度を、対照／未処理細胞試料に対して正規化した（ΔＭＦＩ）。ここで、ＣＤ８１を標的とする非Ｔｆｒ１を過剰発現する細胞のＥＶ（ＣＰ４ＥＶｓ）または野生型ＥＶ（ｗｔＥＶｓ）と比較した場合、組換えＣＤ８１構築物（Ｔｆｒ１ＥＶｓＰ１、Ｔｆｒ２ＥＶｓ Ｐ１、Ｔｆｒ２ＣＰ４ＥＶｓ Ｐ１）に応じて、トランスフェリン受容体を標的にする組換えＥＶの取込みの約３０〜６０％の増加が認められた（図８Ｂ）。
実施例１３：アポプトーシス誘導ｓｉＲＮＡを使用した、療法薬を担持された標的特異的ＥＶの作製
１３．１ ｓｉＲＮＡによる組換えＥＶのトランスフェクション
ヒトトランスフェリン受容体を標的とする非組換えＣＤ８１または組換えＣＤ８１のいずれかを保持する精製されたＥＶを、リポソームに基づくトランスフェクション試薬Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ラファイエット、米国）を使用することにより、アポプトーシス誘導ｓｉＲＮＡ（ＴＯＸトランスフェクション対照、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のどちらかによってトランスフェクトした。ＥＶを、製造元の小冊子に従って、それぞれの標的化または非標的化ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトした（２５ｎＭ ｓｉＲＮＡの最終濃度まで）。ｑＰＣＲを使用するために、ｓｉＲＮＡのローディングを制御した。
１３．２ 標的特異的細胞傷害性の判定のための細胞に基づくアッセイ
標的抗原発現細胞を、９６ウェルプレートに７．５×１０３細胞／ウェルの密度において完全培地に播種し、その後、ウェルあたり５×１０８の組換え／ｓｉＲＮＡトランスフェクトＥＶと共に７２時間インキュベートした。実験は、ＥＶ投与またはＥＶ対照あたり６回の反復において実施した。培地の除去およびＰＢＳの洗浄の後、細胞を、完全培地において、１×ＷＳＴ−１（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）と共に１時間、２時間、および４時間、または１×ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）と共に一晩インキュベートした。アッセイ読み出しを、それぞれの製造元の小冊子に従って、マイクロプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）において実施した。実際に、とりわけＴｆｒ１ＣＰ４組換えＣＤ８１構築物を使用することにより、対照と比較してトランスフェリン受容体を標的とするＥＶにおいて約３０％高い細胞傷害性が認められた（図１０）。
実施例１４：ライブラリーＣＤ８１ ＬＥＬ＿Ｌ３の設計
ＣＤ８１ ＬＥＬ＿Ｌ３ライブラリー設計は、可逆的リフォールディングＣＤ８１ ＬＥＬ安定化突然変異体（配列番号１８０）に基づいている。
Figure 2021533834
このライブラリーにおいて、安定化突然変異体Ａｌａ１３０Ｃｙｓ／Ａｌａ１４６ＣｙｓおよびＶａｌ１３５Ｃｙｓ／Ｓｅｒ１６８Ｃｙｓは、相加的に機能してＣＤ８１ ＬＥＬの熱転移の中間点を９３．４℃へと増加させ、この組み合わせ突然変異体は、最高で１１０℃までに加熱された場合に可逆的にリフォールディングすることができる。このライブラリーにおいて、位置１３２〜１３３、１３６〜１４１、１６２〜１６５、１６７、および１７１〜１７２のアミノ酸残基をランダム化することにより、抗原結合に利用することができる複合表面を形成させた（配列番号１におけるＸ）（配列番号９７）。
Figure 2021533834
この場合、Ｘは、任意のアミノ酸である。
実施例１５：酵母ディスプレイライブラリーＣＤ８１ ＬＥＬ＿Ｌ２およびＬ３の構築
酵母ディスプレイライブラリーＣＤ８１ ＬＥＬ＿Ｌ２のために、Ｑ５ ＨｉＦｉポリメラーゼＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｎｇ／μｌのテンプレート（ｐＴＴ２２ＳＳＰ４＿Ｃ４Ｃ９）、ならびに５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＬＩＢ２ＦＷＤ（配列番号９８）およびＥＦｒｅｖ（配列番号９９）を使用して、１００μｌのアリコートにおいて、ランダム化された挿入体をコードするＰＣＲ組換え産物を作製した。９８℃での３０秒間の初期変性の後、９８℃での各２０秒間の変性と、５５℃での２０秒間のアニール処理と、７２℃での２０秒間の拡張とによる３５サイクルを行い、７２℃において５分間のインキュベーションステップを行って完了した。ＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ精製キットによって精製し、ＡＤにおいて溶離させた。
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つである］。
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つであり；ならびにＭは、ＡまたはＣのうちのいずれか１つである］。
酵母ディスプレイライブラリーＣＤ８１ ＬＥＬ＿Ｌ３のために、Ｑ５ ＨｉＦｉポリメラーゼＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｎｇ／μｌのテンプレート（ｐＴＴ２２ＳＳＰ４＿Ｃ２Ｃ９）、ならびに５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＬＩＢ３ＦＷＤ（配列番号１００）およびＬＩＢ２ＲＥＶ２（配列番号９９）を使用して、１００μｌのアリコートにおいて、ランダム化された挿入体をコードするＰＣＲ組換え産物を作製した。９８℃での３０秒間の初期変性の後、９８℃での各２０秒間の変性と、５５℃での２０秒間のアニール処理と、７２℃での２０秒間の拡張とによる３５サイクルを行い、７２℃において５分間のインキュベーションステップを行って完了した。ＰＣＲ産物を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ精製キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製し、ＡＤにおいて溶離させた。
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つである］。
レシピエントベクターｐＹＤ１ ｄｅｌｂａｍｄｅｌｈｉｎｄ＿ｂａｍｈｉｎｄを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して線状化し、分取アガロースゲル電気泳動法およびＩｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ精製キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、ＡＤにおいて溶離させた。
酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００を、化学ＰＥＧ３３５０／Ｌｉ−アセテート／ｓｓＤＮＡ形質転換法を使用して、線状化されたレシピエントベクターおよびＰＣＲ組換え産物によって形質転換させた。２つのライブラリー、Ｌ２ＡおよびＬ２ＢならびにＬ３ＡおよびＬ３Ｂを、組換え断片のそれぞれによって作製した。各ライブラリーに対して、２５０ｍｌのＹＰＤ培地に播種し、０．４のＯＤ６００へと一晩培養した。３０℃での振とうインキュベーターにおける５時間のインキュベーション後、酵母細胞を５０ｍｌのアリコートにおいて回収した。上清を除去し、酵母細胞を、室温において３０００ｒｐｍで５分間、アリコートあたり２５ｍｌのＡＤで洗浄した。細胞ペレットを、アリコートあたり３ｍｌの１００ｍＭ Ｌｉ−アセテートに再懸濁させ、３０℃において２００ｒｐｍで１５分間振とうした。細胞を、室温において３０００ｒｐｍで５分間かけて収集した。各酵母細胞アリコートに、２７５０μｌの５０％ＰＥＧ３３５０溶液と、３６０μｌの１Ｍ Ｌｉ−アセテートと、５００μｌの熱ショックを与えたｓｓＤＮＡと、１０μｇの線状化されたレシピエントベクターと、１０μｇの組換えＰＣＲ断片とによるミックスを加えた。３０℃において２００ｒｐｍで３０分間のインキュベーションを実施し、その後、４２℃において４５分間、熱ショックを与えた。室温において３０００ｒｐｍで５分間かけて酵母細胞を収集し、ペニシリンおよびストレプトマイシンによって、２５０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地へと希釈した。３０℃において２００ｒｐｍで２４時間培養を続け、１２．５ｍｌの培養物を、３０℃で２４時間、ペニシリンおよびストレプトマイシンを伴う２５０ｍｌの新鮮なＳＤ−ＣＡＡ培地に移し、４℃において３０００ｒｐｍで１０分間かけてペレット化し、同量の３０％グリセロールと混合した後に冷凍した。希釈平板培養を使用してライブラリーのサイズを判定し、Ｌ２に対しては１．１×１０８の非依存性メンバー、およびＬ３に対しては１．２×１０８の非依存性メンバーであることを判定した。
ライブラリーの正当性のレベルを判定するために、プラスミドＤＮＡを、１０μｌのペレット化された酵母細胞から単離し、電気穿孔を使用して大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。ＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体の発現カセットを、プライマーｐｙｄｆｗｄ（配列番号１０１）およびｐｙｄｒｅｖ（配列番号１０２）を使用して増幅させ、これらのプライマーのうちの１つを使用して配列決定を行った。ライブラリーＬ２Ａの正当性は、６２．５％であり、Ｌ２Ｂは８７．５％であり、Ｌ３Ａは６２．５％であり、Ｌ３Ｂは１００％であることが見出された。
Figure 2021533834
品質管理のため、当該酵母細胞を、２０℃において４８時間または３７℃において２４時間のどちらかにおいて、ペニシリンおよびストレプトマイシンを伴うＳＧ／ＲＣＡＡ培地において誘導した。染色のため、酵母細胞を、１のＯＤ６００において、室温で３０分間、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液においてブロックした。次いで、それらを、１００μｌのアリコートに再懸濁させ、Ｎ末端に位置されたＸｐｒｅｓｓタグと反応する抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：１０００）、およびＭ３８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１μｇ／ｍｌ）で染色し、それらは、２％のＢＳＡ−ＰＢＳにおいて、室温において１時間かけて、適切にフォールディングされたＣＤ８１ ＬＥＬを検出する。細胞を、４℃において３０００ｒｐｍで５分間かけてペレット化し、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：２００に希釈された、ヤギ抗マウス（Ｆａｂ’）２−ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を伴う２％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。他の染色は、２％のＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：２００に希釈された抗ｈｉｓ−ｔａｇ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＱＩＡｇｅｎ）、および２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１００に希釈された抗Ｖ５−ｔａｇ−ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、それらをクローンの適切なリードスルーを判定するために、Ｃ末端ｈｉｓタグおよびＣ末端のＶタグを検出するために使用した。蛍光抗体を伴ったインキュベーションを、氷上において３０分間行った。最後に、当該細胞を、４℃において３０００ｒｐｍで５分間かけて収集し、２００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。染色された試料および染色されていない対照の蛍光を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーを使用して判定した。陽性細胞のパーセンテージを判定し、表９に提示する。
Figure 2021533834
実施例１６：ＣＤ８１ ＬＥＬに基づくＥＧＦＲ特異的結合
１６．１ ヒトＥＧＦＲ−ＦｃによるＣＤ８１ ＬＥＬライブラリーＬ２およびＬ３の選択
ヒトＥＧＦＲ−ＦｃをＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。ビオチン化のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標） Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３：１のビオチンとタンパク質のモル比において使用した。抗原を、製造元の取扱説明書に正確に従って、０．２５μｇ／μｌの濃度へと再構成した。ビオチン化試薬を伴ったインキュベーションを、振とうしながら室温において１時間継続した。非結合ビオチンを、１０．０００ＤａのＭＷＣＯによるＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、撹拌しながら４℃において一晩かけて、百倍量のＰＢＳに対する透析により除去した。
選別のため、最初に、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＤ−ＣＡＡ培地において、３０℃で一晩振とうしながらライブラリー２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂを培養し、次いで、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地に酵母細胞を再懸濁させることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、それを３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。
ＭＡＣＳのために、１０９の誘導した酵母細胞を１０００ｇにおいて５分間かけてペレット化し、当該ペレットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．２５％ ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させることによって洗浄し、再び、２５００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。洗浄した細胞を、０．５μＭのビオチン化抗原を含有する５ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁させ、穏やかにアジテートしながら室温において３０分間インキュベートした。１０ｍｌの氷冷した洗浄緩衝液を加えることによって抗原結合をクエンチし、当該細胞および抗原溶液を、４℃において１０００ｇで５分間かけてペレット化した。細胞を５ｍｌの洗浄緩衝液＋２５μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（μＭＡＣＳストレプトアビジンキット、ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁させ、氷上において１０分間インキュベートした。最後に、１５ｍｌの洗浄緩衝液を加え、当該細胞を４０μｌの細胞ストレーナーを通過させた。
ＬＳカラム（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を分離機に位置し、当該カラムを予備調整するために、３ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。次いで、細胞溶液を７ｍｌのバッチにおいてロードした。カラムの滴下を一度止め、カラム内のビーズの向きを変えるために、手短にカラムを磁石から外し、再び磁石に位置することで、捕捉された細胞を貫流させた。次の７ｍｌの細胞懸濁液をロードする前に、当該カラムに１ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。全ての細胞をロードするまで、これらのステップを繰り返した。次いで、カラムを３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、手短に磁石から外し、再び３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。結合している細胞を溶離させるため、カラムを磁石から外して５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。供給されたプランジャーを使用することにより、細胞をカラムから新しい管へと押し出した。結合している細胞の画分を２５００ｇにおいて１０分間かけてペレット化した。当該ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させ、１０μｌの溶離した細胞を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡにおいて希釈し、１００μｌをＭＤＬプレート上に播種し、３０℃において３日間インキュベートすることにより、ＭＡＣＳ手順のアウトプットを評価し、残りの細胞を、３０℃および１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
続くＦＡＣＳ選択ラウンドにおいて、誘導した細胞懸濁液を、１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８の細胞まで希釈し、２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、０．５μＭのビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃを含有する２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において２０℃で１時間インキュベートした後、細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞を洗浄するために、ペレットを１ｍｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。次いで、当該細胞を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１：１００）を伴う２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。当該細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、２５０μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、ＳｏｎｙセルソーターＳＨ８０００によって選別するまで氷上に維持した。先の選別ラウンドの少なくとも２０倍のアウトプットを処理し、０．１％の上位抗Ｖ５抗体陽性酵母細胞を収集した。可視的富化の後、単一の酵母ディスプレイクローンを特徴付けるために、当該選別をプレートアウトした。いくつかの富化された選別に対して、１００ｎＭの抗原濃度を使用した追加の選択ラウンドを実施した。
スクリーニングのため、誘導した酵母細胞を、室温において３０分かけて、１のＯＤ６００において２％ ＢＳＡ−ＰＢＳを使用してブロックした。次いで、それらを、室温において３０分かけて、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて、１００ｎＭで開始する２倍の段階希釈のビオチン化ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃと共にインキュベートした。氷上において３０分間かけて、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００希釈のストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７によって、結合を検出した。最後に、細胞を２００μｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、当該試料の蛍光をＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーにおいて記録した。抗原結合細胞の割合を評価し（表１０）、ＥＧＦＲ特異的バインダーＬ２Ｂ＿ＥＵ１＿１を、配列番号１０３のアミノ酸配列によって特定した。親クローンとは異なる残留物は、ボールド文字で表されている。
Figure 2021533834
Figure 2021533834
１６．２ ＥＧＦＲ特異的クローンの抗原結合の確認のための哺乳類ディスプレイシステム
野生型ＣＤ８１ ＬＥＬおよびＥＧＦＲ特異的クローンＬ２ＢＥＵ１＿１の配列を、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＳｆｉＩおよびＳａｌＩ制限部位の間においてクローニングした。このディスプレイシステムは、Ｎ末端ＨＡタグとＣ末端ｃ−ｍｙｃタグとの間での、目的のＣ末端に据え付けられたタンパク質の発現を可能にする。構築物を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（ＣＮＲＣ）へとトランスフェクトした。４８時間または７２時間後に細胞を回収し、氷上において４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて３０分間かけてブロックし、氷上において３０分間かけて、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中における１０μｇ／ｍｌにおいてＣＤ８１に対する抗体（Ｍ３８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および４％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中における１０μｇ／ｍｌにおいて抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、ｓｃ７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色した。インキュベーション後に、それらの結合を、氷上において３０分間かけて、二次試薬である、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈した抗マウスＦ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１００に希釈した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にコンジュゲートした抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体によって検出した。次いで、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析するまで氷上に維持した。３００ｎＭでのビオチン化ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃを伴うインキュベーションと４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００でのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７による検出の後に、抗原反応性を判定した。野生型ＣＤ８１ ＬＥＬおよびＥＧＦＲ結合突然変異体の両方は、抗ｃ−ｍｙｃ抗体との反応性から判断して、哺乳類細胞表面において良好なレベルの呈示を示した（表１１）。野生型ＣＤ８１ ＬＥＬは、抗ＣＤ８１抗体とよく反応したが、その一方で、おそらく、ライブラリー変異導入による関連エピトープの改変に起因して、当該突然変異体は、反応性を示さなかった（表１１）。哺乳類細胞ディスプレイフォーマットにおける抗原結合を、抗原結合性ＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体において確認することができた（表１１）。
Figure 2021533834
１６．３ ＥＧＦＲバインダーの特異性、種交差反応性、およびエピトープマッピングの特徴付け
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬおよび抗ＥＧＦＲ突然変異体ＣＤ８１ ＬＥＬ Ｌ２Ｂ＿ＥＵ１＿１をコードするｐＤｉｓｐｌａｙ構築物によってトランスフェクトした。１×１０５の細胞を、氷上において３０分間かけて２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいてブロックし、次いで、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて氷上で３０分間かけて、各５００ｎＭのビオチン化ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ、ビオチン化ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ−Ｆｃおよびビオチン化マウスＥＧＦＲ−Ｆｃによって染色した。４℃において３００ｇで５分間の遠心分離処理の後、抗原の結合を、氷上において３０分間かけて、１：１０００に希釈したストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で脱離させた。次いで、細胞を、４℃において３００ｇで５分間遠心分離処理し、２００μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させた。当該誘導された培養物を、氷上において３０分間かけて、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１０μｇ／ｍｌの抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、ｓｃ７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈された、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にコンジュゲートした抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体とによって染色することにより、当該ディスプレイを測定した。蛍光を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーによって判定した。抗ＥＧＦＲクローンは、そのコグネート抗原のみに対して結合を示したが、ヒトＦｃおよびＨｅｒ２／ｎｅｕ Ｆｃタンパク質に対しては示さなかった（表１２）。ＥＧＦＲ反応性クローンは、マウスＥＧＦＲと交差反応性であることが示された（表１２）。
Figure 2021533834
エピトープのマッピング実験において、３００ｎＭの抗原溶液を、３倍モル過剰の有効性が確認された抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（Ｌｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７ （４）， ３０１〜３１１ （２００５）． ＤＯＩ： １０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００５．０３．００３）およびマツズマブ（Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌら， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １３ （４）， ３６５〜３７３ （２００８）． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２００８．０２．０１９．２００５）、あるいは市販のヒトＩｇＧカッパアイソタイプ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にインキュベートし、次いで、突然変異体ＣＤ８１ ＬＥＬ呈示細胞の染色のために使用した。当該抗原に対する、有効性が確認された抗体の結合を、室温で、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて３０分間進行させ、次いで、当該溶液をＣＤ８１ ＬＥＬ突然変異体呈示細胞を染色するために使用した。氷上において３０分間、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈したストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７によって検出を継続した。呈示細胞のＭＦＩ値を記録した。データは、Ｌ２Ｂ＿ＥＵ１＿１クローンの結合部位が、セツキシマブ抗体における結合部位と重なっていることを示している（表１３）。依然として、Ｌ２Ｂ＿ＥＵ１＿１は、過剰なマツズマブ抗体の存在下において当該抗原に結合することができた。
Figure 2021533834
１６．４ ＣＤ８１ ＬＥＬに基づくＥＧＦＲ−バインダーの改変ループの再ランダム化
この実験の目的は、ＥＧＦＲ結合突然変異体の残基における突然変異した伸長を再ランダム化し、クローンの結合が、抗原結合部位を導入するために親クローンにおいてランダム化されたポリペプチド鎖の両方の伸長におけるアミノ酸残基に依存することを示すことである。
ライブラリーＬ２ＢＥ１＿ＡにおいてヘリックスＡにおける突然変異した残基とＡＢループとをランダム化した変異プライマーＬＩＢ２ＦＷＤ（配列番号９８）を一度使用し、ライブラリーＬ２ＢＥ１＿ＢにおいてヘリックスＣにおける突然変異した残基をランダム化した変異プライマーＬＩＢ２ＲＥＶ２（配列番号９９）を一度使用することにより、組換えのためのＰＣＲ断片を作製した。Ｑ５ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＰＣＲ断片を作製した。組換え断片のために、ライブラリーＬ２ＢＥ１＿Ａに対して、プライマーＬＩＢ２ＦＷＤをプライマーＡＰ２（配列番号１０４）と一緒に使用し、ライブラリーＬ２ＢＥ１＿Ｂに対しては、プライマーＬＩＢ２ＲＥＶ２（配列番号９９）をプライマーＡＰ１（配列番号１０５）と一緒に使用した。
Figure 2021533834
各組換え断片を、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００への化学変換を使用して、クローニングされたＣＤ８１ ＬＥＬ＿ｄｅｌｌｂａｍｄｅｌｈｉｎｄ＿ｂａｍｈｉｎｄ配列を伴うＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ線状化レシピエントベクターｐＹＤ１と一緒に形質転換した。ライブラリー構築のために、３５μｇの線状化ベクターおよび２５μｇのＰＣＲ断片を使用した。当該ライブラリーのサイズは、ライブラリーＬ２ＢＥ１＿Ａに対しては８．４×１０６の非依存性メンバー、ライブラリーＬ２ＢＥ１＿Ｂに対しては１．１８×１０７の非依存性メンバーであった。当該ライブラリーの品質管理は、ストレス温度としてのライブラリーメンバーの誘導と、その後の、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体によって検出されるＮ末端タグによる酵母表面に呈示されるタンパク質の測定と、その後の、ヤギ抗マウス（Ｆａｂ’）２−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を伴うインキュベーション、および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＣ末端Ｖ５タグの検出による当該呈示されるタンパク質の正しい読み枠の判定とを含んだ。各ライブラリーにおける抗原結合細胞のパーセンテージは、５００ｎＭでのヒトＥＧＦＲ−Ｆｃによる染色およびヤギ抗ヒトガンマ鎖−ＰＥコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による検出の後に判定した。当該ライブラリーにおける陽性細胞のパーセンテージは、親クローンに対して特徴的な値と共に表１４に提示される。両方の標的領域における突然変異された残基の再ランダム化は、抗原陽性クローンの数を減少させ、それは、両方のランダム化された伸長におけるアミノ酸残基が抗原結合に貢献することを示唆している。
Figure 2021533834
実施例１７：ヒト胎盤ラミニンに対するＣＤ８１ ＬＥＬに基づくバインダー
１７．１ ヒトラミニンによるＣＤ８１ ＬＥＬライブラリーＬ２およびＬ３の選択
ヒトラミニンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。４℃において一晩、１００倍量のＰＢＳに対する抗原の透析の後に、ビオチン化のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３：１のモル比において使用した。ビオチン化試薬を伴ったインキュベーションを、振とうしながら室温において１時間継続した。非結合ビオチンを、１０．０００ＤａのＭＷＣＯによるＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、撹拌しながら４℃で一晩かけて百倍量のＰＢＳに対する透析により除去した。
選別のため、最初に、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＤ−ＣＡＡ培地において、３０℃で一晩振とうしながらライブラリー２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂを培養し、次いで、ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地に酵母細胞を再懸濁させることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、それを３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。
ＭＡＣＳのために、１０９の誘導した酵母細胞を１０００ｇにおいて５分間かけてペレット化し、当該ペレットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．２５％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させることによって洗浄し、再び、１０００ｇにおいて５分間かけてペレット化した。洗浄した細胞を、１μＭのビオチン化抗原を含有する５ｍｌの洗浄緩衝液に再懸濁させ、穏やかにアジテートしながら室温において３０分間インキュベートした。１０ｍｌの氷冷した洗浄緩衝液を加えることによって抗原結合をクエンチし、当該細胞および抗原溶液を、４℃において１０００ｇで５分間かけてペレット化した。細胞を５ｍｌの洗浄緩衝液＋２５μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（μＭＡＣＳストレプトアビジンキット、ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁させ、氷上において１０分間インキュベートした。最後に、１５ｍｌの洗浄緩衝液を加え、細胞懸濁液を、４０μｍのストレーナーによって濾過した。
ＬＳカラム（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を分離機に位置し、当該カラムを予備調整するために、３ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。次いで、細胞溶液を７ｍｌのバッチにおいてロードした。カラムの滴下を一度止め、カラム内のビーズの向きを変えるために、手短にカラムを磁石から外し、再び磁石に位置することで、捕捉された細胞を貫流させた。次の７ｍｌの細胞懸濁液をロードする前に、当該カラムに１ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。全ての細胞をロードするまで、これらのステップを繰り返した。次いで、カラムを３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、手短に磁石から外し、再び３ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。結合している細胞を溶離させるため、カラムを磁石から外して５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。供給されたプランジャーを使用することにより、細胞をカラムから新しい管へと押し出した。結合している細胞の画分を２５００ｇにおいて１０分間かけてペレット化した。当該ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させ、１０μｌの溶離した細胞を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡにおいて希釈し、１００μｌをＭＤＬプレート上に播種し、３０℃において３日間インキュベートすることにより、ＭＡＣＳ手順のアウトプットを評価し、残りの細胞を、３０℃および１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
続くＦＡＣＳ選択ラウンドにおいて、誘導した細胞懸濁液を、１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８の細胞まで希釈し、２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、１μＭのビオチン化されたラミニンを含有する２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において２０℃で１時間インキュベートした後、細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞を洗浄するために、ペレットを１ｍｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させ、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。次いで、当該細胞を、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（１：１００）を伴う２５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。当該細胞を、４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、２５０μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、Ｓｏｎｙセルソーターによって選別するまで氷上に維持した。先の選別ラウンドの少なくとも２０倍のアウトプットを処理し、０．１％の上位抗Ｖ５抗体陽性酵母細胞を収集した。可視的富化の後、単一の酵母ディスプレイクローンを特徴付けるために、当該選別をプレートアウトした。いくつかの富化された選別に対して、１００ｎＭの抗原を使用した追加の選択ラウンドを実施した。
１７．２ 哺乳類細胞における発現
オリゴヌクレオチド配列ＣＤ８１ｈｎｈｅ１（配列番号１０６）およびＬＥＬｐ２８＿ｂｓｔｅ２（配列番号１０７）を使用して増幅され、哺乳類発現ベクターｐＴＴ２８のＮｈｅＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位と当該構築物の配列との間においてクローニングされたユニークバインダー配列を、サンガー配列決定法を使用して検証した。
Figure 2021533834
製造元の取扱説明書に正確に従って、組換えタンパク質をＨＥＫ２９３−６Ｅにおいて発現させた。２５ｍｌの培養物の上清を、４℃において３５００ｒｐｍで１５分間の遠心分離処理によって回収し、ＰＢＳおよび２０ｍＭイミダゾールで緩衝し、０．４５μｍフィルターによって濾過した後、１ｍｌのＨｉｓ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードして、ｐＨ７．５においてＰＢＳ／２０ｍＭイミダゾールで平衡化した。次いで、カラムを同じ緩衝液で洗浄し、ｈｉｓタグ付けされたタンパク質を、ｐＨ７．５において、カラムの５倍量の、ＰＢＳ中における２０〜５００ｍＭの勾配のイミダゾールで溶離させた。溶離したタンパク質の存在について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで画分４〜６を分析し、その後、クマシーで染色した。以下の突然変異体：Ｌ２Ａ＿ＬＵ１（配列番号１０８）、Ｌ２Ａ＿ＬＵ１＿１（配列番号１０９）、Ｌ２Ｂ＿ＬＵ１（配列番号１１０）、Ｌ３Ｂ＿ＬＵ１＿２（配列番号１１１）に対して、発現が確認された。親クローンとは異なる残留物は、ボールド文字で表されている。
Figure 2021533834
１７．３ 可溶性形式での抗原結合
正味の溶離したタンパク質を、それらのコグネート抗原と、対照抗原としてのＢＳＡとに対する結合について試験した。ストレプトアビジン活性化プレート（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ、ＮＵＮＣ）を、室温において３０分間かけて、ＰＢＳ中における５μｇ／ｍｌのビオチン化ラミニンでコーティングし、室温で１時間かけて４％ ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックした。溶離したタンパク質を２％ ＢＳＡ−ＰＢＳに加え、室温で１時間かけて結合させた。ＰＢＳによる３回の洗浄ステップの後、３０分間、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける抗ｐｅｎｔａＨｉｓ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＱＩＡｇｅｎ）の１：３０００の希釈によって結合を検出し、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の付加について明らかとなった。Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、４５０／６２０ｎｍにおいて吸光度を読み取った（表１５）。３つのラミニン特異的クローン：Ｌ２Ａ＿ＬＵ１、Ｌ２Ｂ＿ＬＵ１およびＬ３Ｂ＿ＬＵ１＿２において、標的タンパク質との特異的反応性を確認することができた。
Figure 2021533834
１７．４ 哺乳類細胞ディスプレイシステムにおけるラミニンバインダーの発現
ラミニン結合クローンの配列を、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＳｆｉＩおよびＳａｌＩ制限部位の間においてクローニングした。このディスプレイシステムは、Ｎ末端ＨＡタグとＣ末端ｃ−ｍｙｃタグとの間での、目的のＣ末端に据え付けられたタンパク質の発現を可能にする。構築物を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（ＣＮＲＣ）へとトランスフェクトした。４８時間または７２時間後に細胞を回収し、氷上において４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて３０分間かけてブロックし、氷上において３０分間かけて、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中における１０μｇ／ｍｌにおいて、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、ｓｃ７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色した。インキュベーション後、それらの結合を、氷上において３０分間かけて、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３４）にコンジュゲートした二次抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体によって検出した。５００ｎＭでのビオチン化ヒトラミニンを伴うインキュベーションと４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００でのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７による検出の後に、抗原反応性を判定した。次いで、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析するまで氷上に維持した。全ての試験したクローンに関して、哺乳類細胞表面の呈示を検出することができた（表１６）。９つのクローンに関して、組換え抗原との反応性を確立することができた（表１６）。
Figure 2021533834
Ｌ３Ａ＿ＬＵ１（配列番号１１２）、Ｌ２Ｂ＿ＬＵ１＿１（配列番号１１３）、８１Ｌ１（配列番号１１０、Ｌ２Ｂ＿ＬＵ１と同じ）、８１Ｌ＿１３（配列番号１１４）、８１Ｌ＿１７（配列番号１１５）、８１Ｌ＿２１（配列番号１１６）に対して、発見されたクローンの配列を判定した。親クローンとは異なる残留物は、ボールド文字で表されている。
Figure 2021533834
実施例１８：ＥＶの表面上に発現した抗ラミニンＣＤ８１突然変異体
１８．１ ＥＶの調製
野生型ＣＤ８１または、ｅＧＦＰを伴うフレームにおいてｐＢＭＮ発現ベクターへとクローニングされた、Ｌ２Ａ＿ＬＵ１（配列番号１２）またはＬ３Ｂ＿ＬＵ１＿２（配列番号１５）の配列に対応する、改変されたＬＥＬを有するＣＤ８１によって、ＨｅＬａ細胞を形質導入した。ＲＰＭＩ（１０％ ＦＣＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミン）において８０％のコンフルエンスまで培養した形質導入されたＨｅＬａ細胞から、細胞外ベシクル（ＥＶ）を調製した。その後、培地を変え、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭにおいて７２〜９６時間かけてＥＶ収集を実施した。細胞および細胞破片を除去するために、細胞培養上清を、３０分間、３０００ｇにおいて遠心分離処理した。より大きい粒子は、０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターによって上清を濾過することによって排除した。最終的に、１２００００ｇで９０分間かけて超遠心分離処理することによってＥＶをペレット化し、Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌイメージング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁させた。ＣＤ８１−ｅＧＦＰ融合物を有する組換えＥＶを、フローサイトメトリーに基づく検出（ＩｍｍｕｎｏＳｔｅｐ）のためにヒトＣＤ９キャプチャービーズを使用して検証した。
１８．２ ＥＶの表面に発現した抗ラミニンＣＤ８１突然変異体の特異的抗原結合を示す競合アッセイ
５×１０９の野生型ＣＤ８１−ｅＧＦＰを有する組換えＥＶおよびバリアントＬ２Ａ＿ＬＵ１およびＬ３Ｂ＿ＬＵ１＿２を標的とするそれぞれのラミニンを、６×１０３のＣＤ９＋キャプチャービーズと共に一晩インキュベートした。５μｇ／ｍＬのビオチン化されたヒト胎盤ラミニンを当該ビーズに加え、いくつかの並行試料においては、競合のために１５μｇ／ｍＬの非標識化ラミニンを加えた。ＥＶ結合ラミニンを検出するために、ニュートラアビジン−ＰＥ（１：８００）を使用した。ニュートラアビジン−ＰＥのみによって染色することにより、バックグラウンド（ＢＧ）蛍光を判定した。ｅＧＦＰの蛍光を４８８ｎｍにおいて測定し、ＰＥ−蛍光を５６１ｎｍにおいて測定した。両方のラミニン結合ＣＤ８１突然変異体では、標的抗原に対する特異的結合が示され、その一方で、これは、野生型ＣＤ８１では認められなかった。さらに、非標識ラミニンによって標識されたものに勝つことは、結果として、特異的結合を示すシグナルの減少を生じた（表１７）。
Figure 2021533834
１８．３ モデル肝癌細胞系Ｈｕｈ７へのラミニン標的化ＥＶの取込み
２．４×１０１０、１．６×１０１０、および０．８×１０１０の、ＣＤ８１−ｅＧＦＰを有する組換えＥＶおよびその標的化バリアントを、０．４×１０６のＨｕｈ７細胞と共に３時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、中和して、１００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。フローサイトメトリーを使用して、ｅＧＦＰ陽性ＥＶを組み込んだ細胞の取込みレベルを測定し、主要集団のＭＦＩ値（ＦＳＣ／ＳＳＣによってゲートした）を判定した。表１８には、ＣＤ８１野生型ｅＧＦＰのＭＦＩｍａｘに対して正規化された、ＥＶの単一バッチの結果として得られた生物学的トリプリケートが示されており、それは、ラミニン標的化ＥＶの取込みの２倍から３倍の増加を示している。
Figure 2021533834
別の実験において、肝癌細胞系Ｈｕｈ７へのラミニン標的化ＥＶの様々なバッチの取込みの反復を実施した。３つの独立したＥＶバッチを、デュプリケートにおいて試験し、ＭＦＩｍａｘに対して正規化した。２．４×１０１０のＣＤ８１−ｅＧＦＰを有する組換えＥＶまたはそれぞれの標的化バリアントを、０．４×１０６のＨｕｈ７細胞と共に３時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、中和して、１２０μｌのＰＢＳに再懸濁させた。フローサイトメトリーを使用して、ｅＧＦＰ陽性ＥＶを組み込んだ細胞の取込みレベルを測定し、主要集団のＭＦＩ値（ＦＳＣ／ＳＳＣによってゲートした）を判定した。値をＭＦＩ ｍａｘに対して正規化した。デュプリケートの平均および標準偏差を表１９に提示する。過剰発現したラミニン結合ＣＤ８１を有するＥＶは、Ｈｕｈ７細胞へのより高い取込みを示した。
Figure 2021533834
実施例１９：ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕに対するＣＤ８１− ＬＥＬに基づくバインダー
１９．１ ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕによるＣＤ８１−ＬＥＬライブラリーＬ２ＡおよびＬ２Ｂの選択
ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌからヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ−Ｆｃを購入した。ビオチン化のために、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ビオチンとタンパク質の３：１のモル比において使用した。ビオチン化試薬を伴ったインキュベーションを、振とうしながら室温において１時間継続した。非結合ビオチンを、１０．０００ＤａのＭＷＣＯによるＳｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、撹拌しながら４℃において一晩かけて、百倍量のＰＢＳに対する透析により除去し、標識された抗原のアリコートを、さらなる使用まで、−８０℃で貯蔵した。
選別のため、最初に、ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＳＤ−ＣＡＡ培地において、３０℃で一晩振とうしながらライブラリー２Ａおよび２Ｂを培養し、次いで、ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＳＧ／Ｒ−ＣＡＡ培地に酵母細胞を再懸濁させることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、それを３７℃で一晩振とうしながらインキュベートした。
ＭＡＣＳのため、４×１０９の誘導された酵母細胞を、１０００ｇで５分間かけてペレット化し、回転ホイールにおいて、室温で３０分間かけて１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいてブロックした。細胞をペレット化し、０．５μＭのビオチン化抗原を伴う１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転ホイールにおいて、室温で３０分間インキュベートした。１０倍量の氷冷したＰＢＳを加えることによって抗原結合をクエンチし、細胞を４℃において１０００ｇで５分間かけてペレット化した。細胞を、５ｍｌの洗浄緩衝液＋２００μｌのストレプトアビジンミクロビーズ（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に再懸濁させ、氷上において１５分間インキュベートした。最後に、１５ｍｌのＭＡＣＳ洗浄緩衝液（０．５％ ＢＳＡ、ＰＢＳ中における２ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）を加えた。細胞懸濁液を４０μｍの細胞ストレーナーによって濾した。
ＬＳカラム（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を分離機に位置し、当該カラムを予備調整するために、３ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。次いで、細胞溶液を７ｍｌのバッチにおいてロードした。カラムの滴下を一度止め、カラム内のビーズの向きを変えるために、手短にカラムを磁石から外し、再び磁石に位置することで、捕捉された細胞を貫流させた。次の７ｍｌの細胞懸濁液をロードする前に、当該カラムに１ｍｌの洗浄緩衝液を適用した。全ての細胞をロードするまで、これらのステップを繰り返した。次いで、カラムを５ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。結合している細胞を溶離させるため、カラムを磁石から外して５ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。供給されたプランジャーを使用することにより、細胞をカラムから新しい管へと押し出した。結合している細胞の画分を２５００ｇにおいて１０分間かけてペレット化した。当該ペレットを１０ｍｌのＳＤ−ＣＡＡ培地に再懸濁させ、１０μｌの溶離した細胞を９９０μｌのＳＤ−ＣＡＡにおいて希釈し、１００μｌをＭＤＬプレート上に播種し、３０℃において３日間インキュベートすることにより、ＭＡＣＳ手順のアウトプットを評価し、残りの細胞を、３０℃および１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
続くＦＡＣＳ選択ラウンドにおいて、誘導した細胞懸濁液を、１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳの１ｍｌあたり１０８の細胞まで希釈し、２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理した。細胞をブロックするために、ペレットを１ｍｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、回転台において２０℃で３０分間インキュベートした。当該細胞を２０℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、０．５μＭのビオチン化Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−Ｆｃを含有する１５０μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させた。回転台において室温での１時間のインキュベーションの後、１ｍｌの氷冷したＰＢＳを加えることによって抗原結合をクエンチした。当該細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：８００）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：１００）を伴う８００μｌの１０％ ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁させ、氷上において３０分間インキュベートした。当該細胞を４℃において３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理し、２５０μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、Ｓｏｎｙ ＳＨ８０００選別機器によって選別するまで氷上に維持した。先の選別ラウンドの少なくとも２０倍のアウトプットを処理し、０．１％の上位抗Ｖ５抗体陽性酵母細胞を収集した。富化されたプールに対して５つの選別ラウンドを行い、単一の酵母クローンをスクリーニングのためにプレートアウトした。５つの特定された配列をｐＤｉｓｐｌａｙ発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において発現させ、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕに対する結合について試験した。４８時間または７２時間後に細胞を回収し、氷上において４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて３０分間かけてブロックし、氷上において３０分間かけて、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳ中における１０μｇ／ｍｌにおいて、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、ｓｃ７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で染色した。インキュベーション後、それらの結合を、氷上において３０分間かけて、４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３４）にコンジュゲートした二次抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体によって検出した。３００ｎＭから開始する２倍希釈シリーズでのビオチン化ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ／Ｆｃを伴うインキュベーションおよび４％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける１：１０００でのストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７による検出の後に、抗原反応性を判定した。次いで、細胞をＰＢＳに再懸濁させ、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析するまで氷上に維持した。
クローン８１＿Ｈ２＿１１（配列番号１１７）は、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に特異的に結合することができた（表２０）。親クローンとは異なる残留物は、ボールド文字で表されている。
Figure 2021533834
Figure 2021533834
１９．２ ＣＤ８１ ＬＥＬに基づくＨｅｒ２／ｎｅｕバインダーの特異性の特徴付け
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、野生型ＣＤ８１ ＬＥＬをコードするｐＤｉｓｐｌａｙ構築物およびＣＤ８１ ＬＥＬ ８１Ｈ２−１１を対象とする抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕによってトランスフェクトした。１×１０５の細胞を、氷上において３０分間かけて２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいてブロックし、次いで、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて氷上で３０分間かけて、各５００ｎＭのビオチン化ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ、ビオチン化ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ−Ｆｃおよびビオチン化マウスＥＧＦＲ−Ｆｃによって染色した。４℃において３００ｇで５分間の遠心分離処理の後、抗原の結合を、氷上において３０分間かけて、１：１０００に希釈したストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で脱離させた。次いで、細胞を、４℃において３００ｇで５分間遠心分離処理し、２００μｌの氷冷したＰＢＳに再懸濁させた。当該誘導された培養物を、氷上において３０分間かけて、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１０μｇ／ｍｌの抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、ｓｃ７８９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：１０００に希釈された、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３４）にコンジュゲートした抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体とによって染色することによって、呈示を測定した。蛍光を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーによって判定した。当該抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕクローンは、そのコグネート抗原のみに対して結合を示した（表２１）。
Figure 2021533834
実施例２０：ヒトＣＤ９ ＬＥＬの安定化
２０．１ 安定化されたＣＤ９ ＬＥＬ突然変異体の設計および構築
全長ヒトＣＤ９配列を伴うＧｅｎｂａｎｋエントリーを特定し、ＬＥＬ領域の境界を画定するために、ＢＬＡＳＴ比較を実施した。提案される最も近いモデルとしてＣＤ８１ ＬＥＬ ＰＤＢ：１ｉｖ５によるＳｗｉｓｓｍｏｄｅｌ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら， ２０１８）を使用して、Ｓｅｉｇｎｅｕｒｅｔ、２００６において定義されるような、ＣＤ９ ＬＥＬ領域のホモロジーモデル化を実施した。結果として得られる構造は、０．４１３ÅのＲＭＳＤによってＣＤ８１ ＬＥＬ結晶構造１ｇ８ｑにアラインすることができる。ＣＤ９ ＬＥＬ（配列番号１１８）の配列を、ｐＴＴ２８ベクター（ＣＮＲＣ）のＮｈｅＩおよびＢｓｔＥＩＩクローニング部位の間において、オリゴヌクレオチドＣＤ９ｈｎｈｅ１（配列番号１１９）およびＣＤ９ｐ２８＿ｂｓｔｅ２（配列番号１２０）を使用してクローニングした。
Figure 2021533834
（配列番号１２５）においてと同様にアミノ酸配列を有する安定化されたバリアントＣＤ９ ＬＥＬ＿２０＿２８を作製するために、オリゴヌクレオチドＣＤ９＿Ｌ２０Ｃ（配列番号１２１）およびＣＤ９＿２０Ｃａ（配列番号１２２）ならびにＣＤ９＿２８Ｃ（配列番号１２３）およびＣＤ９＿２８Ｃａ（配列番号１２４）を使用して、製造元の取扱説明書に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって位置２０および２８のアミノ酸をシステイン残基で置き換えるため、変異導入反応を実施した。
Figure 2021533834
製造元の取扱説明書に正確に従って、ＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールに従ってＣＤ９ ＬＥＬおよびＣＤ９ ＬＥＬ＿２０＿２８を、ＥｘｐｉＣＨＯ系において発現させ、それぞれ、３５ｍｇ／Ｌおよび７０ｍｇ／Ｌの上清において一段階Ｎｉ−ＮＴＡ親和クロマトグラフィによって精製した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、両方とも単量体であった。示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用して熱安定性を判定した。野生型タンパク質の融点は、５２．７℃であり、安定化バリアント２０〜２８は８１．９℃であることが判定され、それは、安定化が首尾よく達成されたことを示している。
２０．２ バインダー選択のためのＣＤ９ ＬＥＬに基づく酵母ディスプレイライブラリー構築
２０．２．１ 野生型ＣＤ９ ＬＥＬの酵母ディスプレイ
ｐＹＤ１ベクターのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩクローニング部位の間において、オリゴヌクレオチドＣＤ９ＹＤｂａｍ１（配列番号１２６）およびＣＤ９ＹＤｎｏｔ２（配列番号１２７）を使用して、ＣＤ９ ＬＥＬの配列をクローニングし、当該構築物を、化学変換を使用してＳ．セレビシエに形質転換した。
Figure 2021533834
ＭＤＬプレートにおいて形質転換体を選択し、ＳＤ−ＣＡＡにおいて３０℃で培養し、２０℃で４８時間および３７℃で２４時間かけて誘導した。Ｎ末端タグによる酵母表面に呈示されたタンパク質の事後測定を、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：２０００希釈による検出によって実施し、続いて、ヤギ抗マウス（Ｆａｂ’）２−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるインキュベーションを１：１０００で実施し、呈示されたタンパク質の正しい読み枠の判定は、全て２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける、１：２００での抗ｈｉｓ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（ＱＩＡｇｅｎ）によるＣ末端ｈｉｓタグの検出および１：１００での抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＣ末端Ｖ５タグの検出によってであった。さらに、最初に２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける１０μｇ／ｍｌの抗体と共に酵母細胞をインキュベートし、２％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおける１：１０００のヤギ抗マウス（Ｆａｂ’）２−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との結合を検出した後に、抗ＣＤ９特異的抗体ＭＥＭ−６１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との反応性を判定した。２００μｌの氷冷されたＰＢＳに再懸濁させたのち、陽性酵母細胞のパーセンテージを、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって判定した（表２２）。
Figure 2021533834
２０．２．２ 結合クローンの設計のためのＣＤ９ ＬＥＬの変異導入
ＰＣＲ組換え断片を作製するためにオリゴヌクレオチドＣＤ９ＮＯＴＲＥＣ２（配列番号１２９）と組み合わせたオリゴヌクレオチドＣＤ９ＰＦＯＲＥＣ１（配列番号１２８）を使用してＣＤ９ ＬＥＬ＿２０＿２８配列の残基１８〜１９、２１〜２５、および２７を変異導入した。
Figure 2021533834
［式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのうちのいずれか１つである］。
Figure 2021533834
この断片を、ベクターｐＹＤ１ＣＤ９と一緒に使用し、Ｓ．セレビシエＥＢＹ１００に形質転換するために、酵素ＰｆｏＩおよびＮｏｔＩによって線状化した。結果として得られる、１×１０８非依存性メンバーのサイズのライブラリーを、結合クローンの富化が達成されるまで１回のＭＡＣＳに基づく選択ラウンドおよび数回のＦＡＣＳに基づく選択ラウンドにより、ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃによってバインダーのために選択した。バインダーの配列を、哺乳類ｐＤｉｓｐｌａｙベクターへと再クローニングし、結果として得られるプラスミドを、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞をトランスフェクトするために使用した。４８〜７２時間後、細胞を回収し、特異的に結合するクローンを検出するために、抗原および二次試薬によって染色した。
参考文献
1. Kalra, H.; Drummen, G.P.; Mathivanan, S. Focus on Extracellular Vesicles: Introducing the Next Small Big Thing. Int J Mol Sci 2016, 17 (2), 170, 10.3390/ijms17020170.
2. Iraci, N.; Leonardi, T.; Gessler, F.; Vega, B.; Pluchino, S. Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles. Int J Mol Sci 2016, 17 (2), 171, 10.3390/ijms17020171.
3. Luan, X.; Sansanaphongpricha, K.; Myers, I.; Chen, H.; Yuan, H.; Sun, D. Engineering exosomes as refined biological nanoplatforms for drug delivery. Acta Pharmacol Sin 2017, 38 (6), 754-763, 10.1038/aps.2017.12.
4. Tian, T.; Zhu, Y.L.; Zhou, Y.Y.; Liang, G.F.; Wang, Y.Y.; Hu, F.H.; Xiao, Z.D. Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem 2014, 289 (32), 22258-67, 10.1074/jbc.M114.588046.
5. El Andaloussi, S.; Lakhal, S.; Mager, I.; Wood, M.J. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv Drug Deliv Rev 2013, 65 (3), 391-7, 10.1016/j.addr.2012.08.008.
6. Rubinstein, E.; Le Naour, F.; Lagaudriere-Gesbert, C.; Billard, M.; Conjeaud, H.; Boucheix, C. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol 1996, 26 (11), 2657-65, 10.1002/eji.1830261117.
7. Levy, S.; Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology (Bethesda) 2005, 20, 218-24, 10.1152/physiol.00015.2005.
8. Morelli, A.E.; Larregina, A.T.; Shufesky, W.J.; Sullivan, M.L.; Stolz, D.B.; Papworth, G.D.; Zahorchak, A.F.; Logar, A.J.; Wang, Z.; Watkins, S.C.; Falo, L.D., Jr.; Thomson, A.W. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood 2004, 104 (10), 3257-66, 10.1182/blood-2004-03-0824.
9. Svensson, K.J.; Christianson, H.C.; Wittrup, A.; Bourseau-Guilmain, E.; Lindqvist, E.; Svensson, L.M.; Morgelin, M.; Belting, M. Exosome uptake depends on ERK1/2-heat shock protein 27 signaling and lipid Raft-mediated endocytosis negatively regulated by caveolin-1. J Biol Chem 2013, 288 (24), 17713-24, 10.1074/jbc.M112.445403.
10. Berditchevski, F.; Odintsova, E. Tetraspanins as regulators of protein trafficking. Traffic 2007, 8 (2), 89-96, 10.1111/j.1600-0854.2006.00515.x.
11. Escola, J.M.; Kleijmeer, M.J.; Stoorvogel, W.; Griffith, J.M.; Yoshie, O.; Geuze, H.J. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273 (32), 20121-7,
12. Kitadokoro, K.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Grandi, G.; Bolognesi, M. Crystallization and preliminary crystallographic studies on the large extracellular domain of human CD81, a tetraspanin receptor for hepatitis C virus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2001, 57 (Pt 1), 156-8,
13. Kitadokoro, K.; Ponassi, M.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Grandi, G.; Bolognesi, M. Subunit association and conformational flexibility in the head subdomain of human CD81 large extracellular loop. Biol Chem 2002, 383 (9), 1447-52, 10.1515/BC.2002.164.
14. Kitadokoro, K.; Bordo, D.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Abrignani, S.; Grandi, G.; Bolognesi, M. CD81 extracellular domain 3D structure: insight into the tetraspanin superfamily structural motifs. EMBO J 2001, 20 (1-2), 12-8, 10.1093/emboj/20.1.12.
15. Higginbottom, A.; Quinn, E.R.; Kuo, C.C.; Flint, M.; Wilson, L.H.; Bianchi, E.; Nicosia, A.; Monk, P.N.; McKeating, J.A.; Levy, S. Identification of amino acid residues in CD81 critical for interaction with hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. J Virol 2000, 74 (8), 3642-9,
16. Imai, T.; Yoshie, O. C33 antigen and M38 antigen recognized by monoclonal antibodies inhibitory to syncytium formation by human T cell leukemia virus type 1 are both members of the transmembrane 4 superfamily and associate with each other and with CD4 or CD8 in T cells. J Immunol 1993, 151 (11), 6470-81,
17. Seigneuret, M. Complete predicted three-dimensional structure of the facilitator transmembrane protein and hepatitis C virus receptor CD81: conserved and variable structural domains in the tetraspanin superfamily. Biophys J 2006, 90 (1), 212-27, 10.1529/biophysj.105.069666.
18. Rajesh, S.; Sridhar, P.; Tews, B.A.; Feneant, L.; Cocquerel, L.; Ward, D.G.; Berditchevski, F.; Overduin, M. Structural basis of ligand interactions of the large extracellular domain of tetraspanin CD81. J Virol 2012, 86 (18), 9606-16, 10.1128/JVI.00559-12.
19. Seigneuret, M.; Delaguillaumie, A.; Lagaudriere-Gesbert, C.; Conjeaud, H. Structure of the tetraspanin main extracellular domain. A partially conserved fold with a structurally variable domain insertion. J Biol Chem 2001, 276 (43), 40055-64, 10.1074/jbc.M105557200.
20. Homsi, Y.; Schloetel, J.G.; Scheffer, K.D.; Schmidt, T.H.; Destainville, N.; Florin, L.; Lang, T. The extracellular delta-domain is essential for the formation of CD81 tetraspanin webs. Biophys J 2014, 107 (1), 100-13, 10.1016/j.bpj.2014.05.028.
21. Schmidt, T.H.; Homsi, Y.; Lang, T. Oligomerization of the Tetraspanin CD81 via the Flexibility of Its delta-Loop. Biophys J 2016, 110 (11), 2463-74, 10.1016/j.bpj.2016.05.003.
22. Homsi, Y.; Lang, T. The specificity of homomeric clustering of CD81 is mediated by its delta-loop. FEBS Open Bio 2017, 7 (2), 274-283, 10.1002/2211-5463.12187.
23. Michel Seigneuret: Complete Predicted Three-Dimensional Structure of the Facilitator Transmembrane Protein and Hepatitis C Virus Receptor CD81: Conserved and Variable Structural Domains in the Tetraspanin Superfamily. Biophys J. 2006 Jan 1; 90(1): 212-227. doi: 10.1529/biophysj.105.069666
24. Andrew Waterhouse, Martino Bertoni, Stefan Bienert, Gabriel Studer, Gerardo Tauriello, Rafal Gumienny, Florian T Heer, Tjaart A P de Beer, Christine Rempfer, Lorenza Bordoli, Rosalba Lepore, Torsten Schwede: SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018 Jul 2; 46(Web Server issue): W296-W303. Published online 2018 May 21. doi: 10.1093/nar/gky427
この断片を、ベクターｐＹＤ１ＣＤ９と一緒に使用し、Ｓ．セレビシエＥＢＹ１００に形質転換するために、酵素ＰｆｏＩおよびＮｏｔＩによって線状化した。結果として得られる、１×１０８非依存性メンバーのサイズのライブラリーを、結合クローンの富化が達成されるまで１回のＭＡＣＳに基づく選択ラウンドおよび数回のＦＡＣＳに基づく選択ラウンドにより、ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃによってバインダーのために選択した。バインダーの配列を、哺乳類ｐＤｉｓｐｌａｙベクターへと再クローニングし、結果として得られるプラスミドを、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞をトランスフェクトするために使用した。４８〜７２時間後、細胞を回収し、特異的に結合するクローンを検出するために、抗原および二次試薬によって染色した。
参考文献
1. Kalra, H.; Drummen, G.P.; Mathivanan, S. Focus on Extracellular Vesicles: Introducing the Next Small Big Thing. Int J Mol Sci 2016, 17 (2), 170, 10.3390/ijms17020170.
2. Iraci, N.; Leonardi, T.; Gessler, F.; Vega, B.; Pluchino, S. Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles. Int J Mol Sci 2016, 17 (2), 171, 10.3390/ijms17020171.
3. Luan, X.; Sansanaphongpricha, K.; Myers, I.; Chen, H.; Yuan, H.; Sun, D. Engineering exosomes as refined biological nanoplatforms for drug delivery. Acta Pharmacol Sin 2017, 38 (6), 754-763, 10.1038/aps.2017.12.
4. Tian, T.; Zhu, Y.L.; Zhou, Y.Y.; Liang, G.F.; Wang, Y.Y.; Hu, F.H.; Xiao, Z.D. Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and
mediating miR-21 delivery. J Biol Chem 2014, 289 (32), 22258-67, 10.1074/jbc.M114.588046.
5. El Andaloussi, S.; Lakhal, S.; Mager, I.; Wood, M.J. Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv Drug Deliv Rev 2013, 65 (3), 391-7, 10.1016/j.addr.2012.08.008.
6. Rubinstein, E.; Le Naour, F.; Lagaudriere-Gesbert, C.; Billard, M.; Conjeaud, H.; Boucheix, C. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol 1996, 26 (11), 2657-65, 10.1002/eji.1830261117.
7. Levy, S.; Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology (Bethesda) 2005, 20, 218-24, 10.1152/physiol.00015.2005.
8. Morelli, A.E.; Larregina, A.T.; Shufesky, W.J.; Sullivan, M.L.; Stolz, D.B.;
Papworth, G.D.; Zahorchak, A.F.; Logar, A.J.; Wang, Z.; Watkins, S.C.; Falo, L.D., Jr.; Thomson, A.W. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood 2004, 104 (10), 3257-66, 10.1182/blood-2004-03-0824.
9. Svensson, K.J.; Christianson, H.C.; Wittrup, A.; Bourseau-Guilmain, E.; Lindqvist, E.; Svensson, L.M.; Morgelin, M.; Belting, M. Exosome uptake depends on ERK1/2-heat shock protein 27 signaling and lipid Raft-mediated endocytosis negatively regulated by caveolin-1. J Biol Chem 2013, 288 (24), 17713-24, 10.1074/jbc.M112.445403.
10. Berditchevski, F.; Odintsova, E. Tetraspanins as regulators of protein trafficking. Traffic 2007, 8 (2), 89-96, 10.1111/j.1600-0854.2006.00515.x.
11. Escola, J.M.; Kleijmeer, M.J.; Stoorvogel, W.; Griffith, J.M.; Yoshie, O.; Geuze, H.J. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273 (32), 20121-7,
12. Kitadokoro, K.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Grandi, G.; Bolognesi,
M. Crystallization and preliminary crystallographic studies on the large extracellular domain of human CD81, a tetraspanin receptor for hepatitis C virus. Acta
Crystallogr D Biol Crystallogr 2001, 57 (Pt 1), 156-8,
13. Kitadokoro, K.; Ponassi, M.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Grandi, G.; Bolognesi, M. Subunit association and conformational flexibility in the head subdomain of human CD81 large extracellular loop. Biol Chem 2002, 383 (9), 1447-52, 10.1515/BC.2002.164.
14. Kitadokoro, K.; Bordo, D.; Galli, G.; Petracca, R.; Falugi, F.; Abrignani, S.; Grandi, G.; Bolognesi, M. CD81 extracellular domain 3D structure: insight into the tetraspanin superfamily structural motifs. EMBO J 2001, 20 (1-2), 12-8, 10.1093/emboj/20.1.12.
15. Higginbottom, A.; Quinn, E.R.; Kuo, C.C.; Flint, M.; Wilson, L.H.; Bianchi,
E.; Nicosia, A.; Monk, P.N.; McKeating, J.A.; Levy, S. Identification of amino acid residues in CD81 critical for interaction with hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. J Virol 2000, 74 (8), 3642-9,
16. Imai, T.; Yoshie, O. C33 antigen and M38 antigen recognized by monoclonal antibodies inhibitory to syncytium formation by human T cell leukemia virus type 1 are both members of the transmembrane 4 superfamily and associate with each other and with CD4 or CD8 in T cells. J Immunol 1993, 151 (11), 6470-81,
17. Seigneuret, M. Complete predicted three-dimensional structure of the facilitator transmembrane protein and hepatitis C virus receptor CD81: conserved and variable structural domains in the tetraspanin superfamily. Biophys J 2006, 90 (1), 212-27, 10.1529/biophysj.105.069666.
18. Rajesh, S.; Sridhar, P.; Tews, B.A.; Feneant, L.; Cocquerel, L.; Ward, D.G.; Berditchevski, F.; Overduin, M. Structural basis of ligand interactions of the
large extracellular domain of tetraspanin CD81. J Virol 2012, 86 (18), 9606-16,
10.1128/JVI.00559-12.
19. Seigneuret, M.; Delaguillaumie, A.; Lagaudriere-Gesbert, C.; Conjeaud, H. Structure of the tetraspanin main extracellular domain. A partially conserved fold with a structurally variable domain insertion. J Biol Chem 2001, 276 (43), 40055-64, 10.1074/jbc.M105557200.
20. Homsi, Y.; Schloetel, J.G.; Scheffer, K.D.; Schmidt, T.H.; Destainville, N.; Florin, L.; Lang, T. The extracellular delta-domain is essential for the formation of CD81 tetraspanin webs. Biophys J 2014, 107 (1), 100-13, 10.1016/j.bpj.2014.05.028.
21. Schmidt, T.H.; Homsi, Y.; Lang, T. Oligomerization of the Tetraspanin CD81 via the Flexibility of Its delta-Loop. Biophys J 2016, 110 (11), 2463-74, 10.1016/j.bpj.2016.05.003.
22. Homsi, Y.; Lang, T. The specificity of homomeric clustering of CD81 is mediated by its delta-loop. FEBS Open Bio 2017, 7 (2), 274-283, 10.1002/2211-5463.12187.
23. Michel Seigneuret: Complete Predicted Three-Dimensional Structure of the Facilitator Transmembrane Protein and Hepatitis C Virus Receptor CD81: Conserved and Variable Structural Domains in the Tetraspanin Superfamily. Biophys J. 2006 Jan 1; 90(1): 212-227. doi: 10.1529/biophysj.105.069666
24. Andrew Waterhouse, Martino Bertoni, Stefan Bienert, Gabriel Studer, Gerardo
Tauriello, Rafal Gumienny, Florian T Heer, Tjaart A P de Beer, Christine Rempfer, Lorenza Bordoli, Rosalba Lepore, Torsten Schwede: SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018 Jul 2; 46(Web Server issue): W296-W303. Published online 2018 May 21. doi: 10.1093/nar/gky427
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）を含むタンパク質を産生する方法であって、
ＥＶ表面タンパク質の小胞外ドメイン（ＥＤ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、変異導入法によって、野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有するＥＤアミノ酸配列内の少なくとも１つの改変領域内で改変して、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れ、それによって、それぞれが異なる標的結合部位を含む多様なＴＥＤをコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生するステップ、ならびに
所定の標的を特異的に認識するＴＥＤを選択するステップ、ならびに
選択されたＴＥＤを含むタンパク質を産生するステップ、
を含む、上記方法。
［態様２］ポリヌクレオチドのレパートリーが、
外表面に多様なＴＥＤを呈示し、好ましくは、酵母、ファージ、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する遺伝子パッケージに含まれる、態様１に記載の方法。
［態様３］改変領域が、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有する、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］標的結合部位が、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にある、または野生型ＥＤ配列内にある少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、態様１〜３のいずれか１に記載の方法。
［態様５］ＴＥＤが、野生型ＥＤと少なくとも７０％の配列同一性を含む、態様１〜４のいずれか１に記載の方法。
［態様６］野生型ＥＤは、テトラスパン様タンパク質、インテグリンファミリーのタンパク質、プロテオグリカン、５回膜貫通ドメインタンパク質、Ｉ型膜貫通タンパク質、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質、酵素膜タンパク質、免疫調節表面タンパク質、間葉系幹細胞の表面マーカー、糖タンパク質、またはチャネリングタンパク質からなる群から選択されるＥＶ表面タンパク質を起源とする、態様１〜５のいずれか１に記載の方法。
［態様７］テトラスパン様タンパク質は、好ましくは、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ１５１；および
ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ３７
からなる群から選択されるテトラスパニンである、
またはテトラスパン様タンパク質は、リソソーム関連膜タンパク質、好ましくは配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むＬＡＭＰ２である、態様６に記載の方法。
［態様８］野生型ＥＤは、
ａ）ＥＤが、配列番号１３０もしくは配列番号１３１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８１；
ｂ）ＥＤが、配列番号１３２、配列番号１８２、もしくは配列番号１３３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ９；
ｃ）ＥＤが、配列番号１３４もしくは配列番号１３５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ５３；
ｄ）ＥＤが、配列番号１３６もしくは配列番号１３７として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）ＥＤが、配列番号１３８もしくは配列番号１３９として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８２；
ｆ）ＥＤが、配列番号１４０もしくは配列番号１４１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ６３；
ｇ）ＥＤが、配列番号１４２もしくは配列番号１４３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ１５１；
ｈ）ＥＤが、配列番号１４４もしくは配列番号１４５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ３７；または
ｉ）ＥＤが、配列番号１４６として特定されたアミノ酸配列を含む、ＬＡＭＰ２
のうちのいずれか１つのものである、態様１〜７のいずれか１に記載の方法。
［態様９］タンパク質はＥＤアミノ酸配列にループ構造を含み、ループ構造は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）の１つまたは複数のシステイン（複数可）によって安定化されている、態様１〜８のいずれか１に記載の方法。
［態様１０］改変領域はＥＤのループ領域内に位置する、態様１〜９のいずれか１に記載の方法。
［態様１１］ＥＤは、
ａ）ＣＤ８１のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは１３４と１４４位および／もしくは１３０と１４６位および／もしくは１３５と１６８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、または
ｂ）ＣＤ９のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは２０と２８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、位置の番号付けは、ＣＤ９の大きな細胞外ループ（ＬＥＬ、配列番号１１８）のものである、
態様１〜１０のいずれか１に記載の方法。
［態様１２］ＥＤはＣＤ８１のものであり、改変領域は１６０と１７２位の範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、態様１〜１１のいずれか１に記載の方法。
［態様１３］ＴＥＤは、１３２と１４１位の間または１８０と１８９位の間に位置する少なくとも１つのさらなる結合領域を含み、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、態様１２に記載の方法。
［態様１４］ＥＤはＣＤ９のものであり、改変領域は、１５５〜１６６位、１２８〜１４２位、１３０〜１４０位、または１６９〜１８０位のうちのいずれか１つの範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８９として特定されたヒトＣＤ９のものである、態様１〜１１のいずれか１に記載の方法。
［態様１５］標的が、細胞標的、好ましくはマイトジェン受容体、サイトカイン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、膜輸送体、リポタンパク質、リポサッカライド、糖タンパク質、プロテオグリカン、または無細胞標的、好ましくはサイトカイン、人工タンパク質、もしくは人工表面構造からなる群から選択される、態様１〜１４のいずれか１に記載の方法。
［態様１６］ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）である、態様１〜１５のいずれか１に記載の方法。
［態様１７］膜貫通ドメインが、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質を起源とする膜貫通ドメインと少なくとも７０％の配列同一性を含む、態様１６に記載の方法。
［態様１８］膜貫通ドメインは、
ａ）膜貫通ドメインが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、もしくは配列番号１５０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８１；
ｂ）膜貫通ドメインが、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、もしくは配列番号１５４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ９；
ｃ）膜貫通ドメインが、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、もしくは配列番号１５８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ５３；
ｄ）膜貫通ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、もしくは配列番号１６２として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）膜貫通ドメインが、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、もしくは配列番号１６６として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８２；
ｆ）膜貫通ドメインが、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、もしくは配列番号１７０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ６３；
ｇ）膜貫通ドメインが、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、もしくは配列番号１７４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ１５１；
ｈ）膜貫通ドメインが、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、もしくは配列番号１７８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ３７；または
ｉ）膜貫通ドメインが、配列番号１７９として特定されたアミノ酸配列を含む、ＬＡＭＰ２
のうちのいずれか１つのものである、態様１６又は１７に記載の方法。
［態様１９］ＥＤおよび膜貫通ドメインの両方とも、同じＥＶ表面タンパク質を起源とし、好ましくは、ＥＶ表面タンパク質は、
ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８１；
ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ９；
ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ５３；
ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むＴＳＰＡＮ３２；
ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８２；
ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ６３；
ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ１５１；
ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ３７；および
ｉ）配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むＬＡＭＰ２
からなる群から選択される、態様１６〜１８のいずれか１に記載の方法。
［態様２０］ａ）態様１〜１９のいずれか１に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＤを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し；
ｂ）前記ポリヌクレオチドを供給源細胞または供給源細胞混合物に導入し；
ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記細胞（複数可）を培養し；
ｃ）ＴＥＤの標的結合部位を含む標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含む画分を単離し；かつ
ｄ）前記画分に含まれるＴＥＶの調製物を産生する
ことによって、ＴＥＶ調製物を産生する方法。
［態様２１］ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であり、ＴＥＶは、その膜の外表面に標的結合部位を呈示している、態様２０に記載の方法。
［態様２２］ＴＥＶに小胞内担持物を担持するステップをさらに含み、担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む、態様２０又は２１に記載の方法。
［態様２３］供給源細胞または供給源細胞混合物は、真核生物または原核生物供給源を起源としており、好ましくは身体組織、体液、または細胞培養物のものである、態様２０〜２２のいずれか１に記載の方法。
［態様２４］供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は自家使用のために製剤化される、態様２０〜２３のいずれか１に記載の方法。
［態様２５］態様２０〜２４のいずれか１に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＶ調製物。
［態様２６］供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は同じ対象への自家使用のために製剤化される、態様２４に記載の方法によって産生される自家ＴＥＶ調製物。
［態様２７］態様１〜１９のいずれか１に記載の方法によって得ることが可能な、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）を含むタンパク質。
［態様２８］哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）と少なくとも７０％の配列同一性、ならびに野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含む、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）であって、該改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、該改変領域は、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または該標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内に、もしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、上記標的特異的小胞外ドメイン。
［態様２９］少なくとも１つの膜貫通ドメインと、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）と少なくとも７０％の配列同一性、ならびに野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含むＥＤとを含む、標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であって、該改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、該改変領域は、ＴＳＰから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または該標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にもしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、上記標的特異的ＥＶ表面タンパク質。
［態様３０］態様２７に記載のタンパク質、態様２８に記載のＴＥＤ、または態様２９に記載のＴＳＰのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド。
［態様３１］膜を含みかつ膜の外表面に標的特異的分子を呈示する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）であって、標的特異的分子は、態様２７に記載のタンパク質、態様２８に記載のＴＥＤ、または態様２９に記載のＴＳＰのうちのいずれか１つである、上記標的特異的細胞外小胞。
［態様３２］好ましくは皮内、皮下、静脈内、局所的、または経口使用のための製剤において、態様２７に記載のタンパク質、態様２８に記載のＴＥＤ、態様２９に記載のＴＳＰ、または態様２５、２６、もしくは３１のいずれか一に記載のＴＥＶのうちのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬調製物。
［態様３３］態様３１に記載の多様な少なくとも１０２個の標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含むＴＥＶライブラリーであって、それぞれが、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有する、ＴＥＶライブラリー。
［態様３４］ａ）それぞれが異なる標的結合部位を含む、多様な標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを提供するステップ；
ｂ）前記レパートリーを前記供給源細胞（複数可）に導入するステップ；および
ｂ）異なる標的結合特異性を有する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のレパートリーを含む画分を単離して、ＴＥＶのライブラリーを産生するステップ
を含む、標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のライブラリーを産生する方法であって、ＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入法によって変異導入して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域内に前記ＥＶ表面タンパク質のＥＤの突然変異を得て、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れることによって、ポリヌクレオチドのレパートリーは産生される、ＴＥＶのライブラリーを産生する方法。
［態様３５］異なる標的特異性を有する少なくとも１０２個のＴＥＶを好ましくは含む、態様３４に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＶライブラリー。

Claims (35)

  1. 細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）を含むタンパク質を産生する方法であって、
    ＥＶ表面タンパク質の小胞外ドメイン（ＥＤ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、変異導入法によって、野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有するＥＤアミノ酸配列内の少なくとも１つの改変領域内で改変して、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れ、それによって、それぞれが異なる標的結合部位を含む多様なＴＥＤをコードするポリヌクレオチドのレパートリーを産生するステップ、ならびに
    所定の標的を特異的に認識するＴＥＤを選択するステップ、ならびに
    選択されたＴＥＤを含むタンパク質を産生するステップ、
    を含む、上記方法。
  2. ポリヌクレオチドのレパートリーが、
    外表面に多様なＴＥＤを呈示し、好ましくは、酵母、ファージ、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ、または哺乳動物細胞ディスプレイからなる群から選択されるディスプレイシステムを採用する遺伝子パッケージに含まれる、請求項１に記載の方法。
  3. 改変領域が、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 標的結合部位が、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にある、または野生型ＥＤ配列内にある少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ＴＥＤが、野生型ＥＤと少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 野生型ＥＤは、テトラスパン様タンパク質、インテグリンファミリーのタンパク質、プロテオグリカン、５回膜貫通ドメインタンパク質、Ｉ型膜貫通タンパク質、Ｎｏｔｃｈファミリータンパク質、酵素膜タンパク質、免疫調節表面タンパク質、間葉系幹細胞の表面マーカー、糖タンパク質、またはチャネリングタンパク質からなる群から選択されるＥＶ表面タンパク質を起源とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. テトラスパン様タンパク質は、好ましくは、
    ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８１；
    ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ９；
    ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ５３；
    ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むＴＳＰＡＮ３２；
    ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８２；
    ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ６３；
    ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ１５１；および
    ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ３７
    からなる群から選択されるテトラスパニンである、
    またはテトラスパン様タンパク質は、リソソーム関連膜タンパク質、好ましくは配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むＬＡＭＰ２である、請求項６に記載の方法。
  8. 野生型ＥＤは、
    ａ）ＥＤが、配列番号１３０もしくは配列番号１３１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８１；
    ｂ）ＥＤが、配列番号１３２、配列番号１８２、もしくは配列番号１３３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ９；
    ｃ）ＥＤが、配列番号１３４もしくは配列番号１３５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ５３；
    ｄ）ＥＤが、配列番号１３６もしくは配列番号１３７として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＴＳＰＡＮ３２；
    ｅ）ＥＤが、配列番号１３８もしくは配列番号１３９として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８２；
    ｆ）ＥＤが、配列番号１４０もしくは配列番号１４１として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ６３；
    ｇ）ＥＤが、配列番号１４２もしくは配列番号１４３として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ１５１；
    ｈ）ＥＤが、配列番号１４４もしくは配列番号１４５として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ３７；または
    ｉ）ＥＤが、配列番号１４６として特定されたアミノ酸配列を含む、ＬＡＭＰ２
    のうちのいずれか１つのものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. タンパク質はＥＤアミノ酸配列にループ構造を含み、ループ構造は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成を可能にする位置（複数可）の１つまたは複数のシステイン（複数可）によって安定化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 改変領域はＥＤのループ領域内に位置する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ＥＤは、
    ａ）ＣＤ８１のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは１３４と１４４位および／もしくは１３０と１４６位および／もしくは１３５と１６８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、または
    ｂ）ＣＤ９のものであり、アミノ酸配列は、好ましくは２０と２８位の間で、野生型ＥＤ配列に天然に存在しない１つもしくは複数のジスルフィド結合の形成を可能にするシステインを導入するように改変され、位置の番号付けは、ＣＤ９の大きな細胞外ループ（ＬＥＬ、配列番号１１８）のものである、
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＥＤはＣＤ８１のものであり、改変領域は１６０と１７２位の範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ＴＥＤは、１３２と１４１位の間または１８０と１８９位の間に位置する少なくとも１つのさらなる結合領域を含み、番号付けは、配列番号８７として特定されたヒトＣＤ８１のものである、請求項１２に記載の方法。
  14. ＥＤはＣＤ９のものであり、改変領域は、１５５〜１６６位、１２８〜１４２位、１３０〜１４０位、または１６９〜１８０位のうちのいずれか１つの範囲内に位置し、番号付けは、配列番号８９として特定されたヒトＣＤ９のものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  15. 標的が、細胞標的、好ましくはマイトジェン受容体、サイトカイン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、膜輸送体、リポタンパク質、リポサッカライド、糖タンパク質、プロテオグリカン、または無細胞標的、好ましくはサイトカイン、人工タンパク質、もしくは人工表面構造からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 膜貫通ドメインが、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質を起源とする膜貫通ドメインと少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 膜貫通ドメインは、
    ａ）膜貫通ドメインが、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、もしくは配列番号１５０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８１；
    ｂ）膜貫通ドメインが、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、もしくは配列番号１５４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ９；
    ｃ）膜貫通ドメインが、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、もしくは配列番号１５８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ５３；
    ｄ）膜貫通ドメインが、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、もしくは配列番号１６２として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＴＳＰＡＮ３２；
    ｅ）膜貫通ドメインが、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、もしくは配列番号１６６として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ８２；
    ｆ）膜貫通ドメインが、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、もしくは配列番号１７０として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ６３；
    ｇ）膜貫通ドメインが、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、もしくは配列番号１７４として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ１５１；
    ｈ）膜貫通ドメインが、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、もしくは配列番号１７８として特定されたアミノ酸配列のいずれか１つを含む、ＣＤ３７；または
    ｉ）膜貫通ドメインが、配列番号１７９として特定されたアミノ酸配列を含む、ＬＡＭＰ２
    のうちのいずれか１つのものである、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. ＥＤおよび膜貫通ドメインの両方とも、同じＥＶ表面タンパク質を起源とし、好ましくは、ＥＶ表面タンパク質は、
    ａ）配列番号８７として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８１；
    ｂ）配列番号８９として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ９；
    ｃ）配列番号９０として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ５３；
    ｄ）配列番号９１として特定されたアミノ酸配列を含むＴＳＰＡＮ３２；
    ｅ）配列番号９２として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ８２；
    ｆ）配列番号９３として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ６３；
    ｇ）配列番号９４として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ１５１；
    ｈ）配列番号９５として特定されたアミノ酸配列を含むＣＤ３７；および
    ｉ）配列番号９６として特定されたアミノ酸配列を含むＬＡＭＰ２
    からなる群から選択される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ａ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＤを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し；
    ｂ）前記ポリヌクレオチドを供給源細胞または供給源細胞混合物に導入し；
    ｂ）細胞外小胞を産生する条件下で前記細胞（複数可）を培養し；
    ｃ）ＴＥＤの標的結合部位を含む標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含む画分を単離し；かつ
    ｄ）前記画分に含まれるＴＥＶの調製物を産生する
    ことによって、ＴＥＶ調製物を産生する方法。
  21. ＴＥＤを含むタンパク質は、前記ＴＥＤおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であり、ＴＥＶは、その膜の外表面に標的結合部位を呈示している、請求項２０に記載の方法。
  22. ＴＥＶに小胞内担持物を担持するステップをさらに含み、担持物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質、脂質、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ媒介分子等の核酸、特にロック核酸、またはホスホロチオエート、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ミニサークルＤＮＡ等のプラスミド、小分子等の薬物、特に化学療法薬もしくはセノリティクス薬のうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 供給源細胞または供給源細胞混合物は、真核生物または原核生物供給源を起源としており、好ましくは身体組織、体液、または細胞培養物のものである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は自家使用のために製剤化される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＶ調製物。
  26. 供給源細胞または供給源細胞混合物は対象から得られ、ＴＥＶ調製物は同じ対象への自家使用のために製剤化される、請求項２４に記載の方法によって産生される自家ＴＥＶ調製物。
  27. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）を含むタンパク質。
  28. 哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）と少なくとも７０％の配列同一性、ならびに野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含む、細胞外小胞（ＥＶ）表面タンパク質の標的特異的小胞外ドメイン（ＴＥＤ）であって、該改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、該改変領域は、ＴＥＤから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または該標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内に、もしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、上記標的特異的小胞外ドメイン。
  29. 少なくとも１つの膜貫通ドメインと、哺乳動物ＥＶ表面タンパク質配列の野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）と少なくとも７０％の配列同一性、ならびに野生型ＥＤ配列の領域にＮ末端及びＣ末端で隣接する３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域を含むＥＤとを含む、標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）であって、該改変領域は、野生型ＥＤに天然に存在しない標的結合部位の少なくとも一部であり、該改変領域は、ＴＳＰから単離された場合により低い標的結合親和性を有し、かつ／または該標的結合部位は、少なくとも２個のアミノ酸離れたさらなる改変領域内にもしくは野生型ＥＤ配列内に少なくとも１つのさらなる結合領域を含む、上記標的特異的ＥＶ表面タンパク質。
  30. 請求項２７に記載のタンパク質、請求項２８に記載のＴＥＤ、または請求項２９に記載のＴＳＰのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド。
  31. 膜を含みかつ膜の外表面に標的特異的分子を呈示する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）であって、標的特異的分子は、請求項２７に記載のタンパク質、請求項２８に記載のＴＥＤ、または請求項２９に記載のＴＳＰのうちのいずれか１つである、上記標的特異的細胞外小胞。
  32. 好ましくは皮内、皮下、静脈内、局所的、または経口使用のための製剤において、請求項２７に記載のタンパク質、請求項２８に記載のＴＥＤ、請求項２９に記載のＴＳＰ、または請求項２５、２６、もしくは３１のいずれか一項に記載のＴＥＶのうちのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬調製物。
  33. 請求項３１に記載の多様な少なくとも１０２個の標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）を含むＴＥＶライブラリーであって、それぞれが、改変領域のＮ末端およびＣ末端で同じ野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）の同じ領域が隣接する異なる改変領域を有する、ＴＥＶライブラリー。
  34. ａ）それぞれが異なる標的結合部位を含む、多様な標的特異的ＥＶ表面タンパク質（ＴＳＰ）をコードするポリヌクレオチドのレパートリーを提供するステップ；
    ｂ）前記レパートリーを前記供給源細胞（複数可）に導入するステップ；および
    ｂ）異なる標的結合特異性を有する標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のレパートリーを含む画分を単離して、ＴＥＶのライブラリーを産生するステップ
    を含む、標的特異的細胞外小胞（ＴＥＶ）のライブラリーを産生する方法であって、ＥＶ表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入法によって変異導入して、改変領域のＮ末端およびＣ末端で野生型小胞外ドメイン（ＥＤ）配列の領域が隣接する、３〜２０個の連続アミノ酸の長さを有する少なくとも１つの改変領域内に前記ＥＶ表面タンパク質のＥＤの突然変異を得て、ＥＤ内に標的結合部位を組み入れることによって、ポリヌクレオチドのレパートリーは産生される、ＴＥＶのライブラリーを産生する方法。
  35. 異なる標的特異性を有する少なくとも１０２個のＴＥＶを好ましくは含む、請求項３４に記載の方法によって得ることが可能なＴＥＶライブラリー。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111575310B (zh) * 2020-05-14 2022-12-13 江南大学 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用
CN117126886A (zh) * 2022-05-20 2023-11-28 谛邈生物科技(北京)有限公司 一种实现工程化EVs功能蛋白模块化装载的核酸构建体及其应用
WO2024107831A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 Board Of Trustees Of Michigan State University Use of extracellular vesicles as a molecular screening platform

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5727361B2 (ja) * 2008-03-18 2015-06-03 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） エキソソームに結合して目的のポリペプチドの分泌を可能にするキメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びに免疫原性組成物の産生におけるこれらの使用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201716A (nl) * 1992-10-02 1994-05-02 Nederlanden Staat Buitenmembraanvesikel dat voorzien is van een groep polypeptiden welke ten minste de immuunwerking van aan membraan gebonden buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk buitenmembraanvesikel omvat.
GB0016362D0 (en) 2000-07-03 2000-08-23 Chiron Spa Tetraspanin modulation
CN110872587A (zh) 2007-05-22 2020-03-10 康乃尔研究基金会有限公司 蛋白质在细菌及其衍生小泡表面展示的组合物和方法及其用途
GB201121069D0 (en) 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation Delivery system
ES2662326T5 (es) 2013-04-12 2021-08-04 Evox Therapeutics Ltd Vesículas de suministro terapéutico
JP2017535599A (ja) 2014-11-07 2017-11-30 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション Ｂ細胞標的ｄｎａワクチン
KR102458219B1 (ko) 2015-03-05 2022-10-24 피터 운드 트라우들 앵겔호른-스티프텅 주르 푀르데룽 데르 레벤스위센샤프텐 세포 표면 상에 펩타이드를 제시하기 위한 시스템
CN106324244A (zh) 2015-06-30 2017-01-11 崔胜� Cd81介导丙型肝炎病毒种属特异性入侵的关键分子特征
US10624849B2 (en) * 2015-09-28 2020-04-21 Northwestern University Targeted extracellular vesicles comprising membrane proteins with engineered glycosylation sites
EP3377538B1 (en) * 2015-11-16 2021-03-17 Bridgestone Corporation Functional initiator for anionic polymerization
US10845367B2 (en) 2016-05-04 2020-11-24 Abilita Bio, Inc. Modified multispanning membrane polypeptides and methods of use thereof to screen therapeutic agents
US10617768B2 (en) 2016-07-12 2020-04-14 Santa Clara University Engineered exosomes for the delivery of bioactive cargo using transmembrane tetraspanins
GB2552774A (en) * 2016-07-12 2018-02-14 Evox Therapeutics Ltd EV-Mediated delivery of binding protein-small molecule conjugates
GB2552473A (en) 2016-07-21 2018-01-31 Evox Therapeutics Ltd Surface decoration of extracellular vesicles
US10874610B2 (en) 2016-10-19 2020-12-29 Northwestern University Extracellular vesicle-based diagnostics and engineered exosomes for targeted therapeutics against cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5727361B2 (ja) * 2008-03-18 2015-06-03 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） エキソソームに結合して目的のポリペプチドの分泌を可能にするキメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びに免疫原性組成物の産生におけるこれらの使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANYUKTA RANA; ET AL: "EXOSOME TARGET CELL SELECTION AND THE IMPORTANCE OF EXOSOMAL TETRASPANINS: A HYPOTHESIS", BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSACTIONS, vol. VOL:39,NR:2, JPN5021012136, April 2011 (2011-04-01), GB, pages 559 - 562, ISSN: 0005142769 *
STEFAN VOGT; ET AL: "ENGINEERING OF SURFACE PROTEINS IN EXTRACELLULAR VESICLES FOR TISSUE-SPECIFIC TARGETING", CURRENT TOPICS IN BIOCHEMICAL ENGINEERING, JPN5021012137, 28 January 2019 (2019-01-28), pages 1 - 21, XP002795408, ISSN: 0005142770, DOI: 10.5772/intechopen.83537 *
STEFAN VOGT; ET AL: "STABILIZATION OF THE CD81 LARGE EXTRACELLULAR LOOP WITH DE NOVO DISULFIDE BONDS 以下備考", PHARMACEUTICS, vol. VOL:10,NR:3, JPN5021012138, 27 September 2018 (2018-09-27), pages 1 - 14, ISSN: 0005142771 *

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