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JP2021533794A - 修飾植物メッセンジャーパック及びその使用 - Google Patents

修飾植物メッセンジャーパック及びその使用 Download PDF

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バリー アンドリュー マーティン，
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ナターシャ ウラジーミロヴナ ヌコロバ，
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Abstract

本明細書では、例えば、種々の農業又は治療方法における使用のための、亢進した細胞取込み（例えば、動植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）を有するように修飾されている複数の植物メッセンジャーパック（例えば、植物細胞外小胞（ＥＶ）又はそのセグメント、一部分若しくは抽出物を含む）を含む組成物が開示される。【選択図】図１

Description

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、且つその全体が参照によって本明細書に組込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年８月２３日に作成され、５１２９６−００５ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿０８．２３．１９＿ＳＴ２５という名称であり、サイズが１０，１７１バイトである。
農業用又は治療用薬剤の送達は、その薬剤が細胞障壁を通過し、それによって生物に効果的に作用することができる程度によって制限される可能性がある。例えば、植物細胞壁、細菌の細胞壁若しくは真菌の細胞壁又は動物細胞の細胞膜及び／若しくは細胞外マトリックスによって形成される障壁は、農業又は治療用途に有用な薬剤の細胞取込みの障害となる。従って、薬剤の細胞取込みを促進する方法及び組成物に対する必要性が当技術分野において存在する。
本明細書では、亢進した細胞（例えば、植物細胞、真菌細胞又は細菌細胞）取込みを有する修飾植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）である。本明細書の修飾ＰＭＰは、様々な農業用又は治療用組成物方法において有用である。
第１の態様では、本明細書で提供されるのは、植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外来性カチオン性脂質を含むＰＭＰを標的細胞に導入することを含み、外来性カチオン性脂質を含むＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて、標的細胞による増加した取込みを有する、方法である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）由来の脂質を含む。
一部の実施形態では、増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加した細胞取込みである。
一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、異種機能性薬剤を含む。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入されるか、又は複数のＰＭＰの各々の表面に包埋されるか、又は複数のＰＭＰの各々の表面に共役される。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、細菌細胞又は真菌細胞である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、非修飾ＰＭＰと比べて増加した細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物である。一部の例では、細胞は、植物細胞である。一部の例では、細胞は、真菌細胞である。一部の例では、細胞は、細菌細胞である。
一部の実施形態では、増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加した細胞取込みである。一部の実施形態では、増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍又は１０００倍の増加した細胞取込みである
一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、細胞透過性薬剤を含む。
一部の実施形態では、細胞透過性薬剤は、酵素又はその機能性ドメイン（例えば、植物細胞壁分解ドメイン、細菌の細胞壁分解ドメイン又は真菌の細胞壁分解ドメイン）である。
一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の実施形態では、細胞壁分解酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の実施形態では、酵素は、セルラーゼである。一部の実施形態では、セルラーゼは、細菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、セルラーゼは、真菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、セルラーゼは、原生動物のセルラーゼの全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の実施形態では、細胞透過性薬剤は、洗剤である。一部の実施形態では、洗剤は、サポニンである。
一部の実施形態では、細胞透過性薬剤は、カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２４時間（例えば、少なくとも２４時間、３０時間又は４０時間）、少なくとも４８時間（例えば、少なくとも４８時間（＝２日）、３日、４日、５日又は６日）、少なくとも７日（例えば、少なくとも７日（＝１週）、少なくとも２週、少なくとも３週又は少なくとも４週）又は少なくとも３０日（例えば、少なくとも３０日、少なくとも６０日又は少なくとも９０日）安定である。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３７℃、４２℃又は４２℃超）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃又は２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃又は１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃又は０℃）又は少なくとも−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃又は−３０℃）の温度で安定である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、液体窒素（約−１９５．８℃）中で安定である。一部の実施形態では、組成物は、室温で少なくとも１日安定及び／又は４℃で少なくとも１週間安定である。一部の実施形態では、組成物は、ＵＶ照射下で安定である。一部の実施形態では、組成物は、植物の自然生息場所の温度下で、本明細書で定義された期間、安定である。
本明細書に記載される組成物のいずれかの一部の実施形態では、ＰＭＰは、複数のタンパク質（即ちＰＭＰタンパク質）を含む可能性があり、ＰＭＰの濃度は、その中のＰＭＰタンパク質の濃度として測定することができる。一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも０．０２５μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも０．０２５、０．０５、０．１又は０．５μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）、少なくとも１μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）、少なくとも１０μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は４５μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）、少なくとも５０μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）、少なくとも１００μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００又は２２５μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）、少なくとも２５０μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）又は少なくとも５００μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも５００、６００、７００、８００又は９００μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）の濃度である。一部の実施形態では、組成物中の複数のＰＭＰは、少なくとも１ｍｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）又は少なくとも１０ｍｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌ）の濃度である。
本明細書の組成物の一部の実施形態では、ＰＭＰは、精製植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片若しくは抽出物を含む。一部の実施形態では、植物ＥＶは、修飾された植物細胞外小胞（ＥＶ）である。ある種の実施形態では、植物ＥＶは、植物エキソソーム又は植物微小小胞体である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、付表に概説されたものなどの植物ＥＶマーカーを含む。
本明細書の組成物の一部の実施形態では、複数のＰＭＰは、純粋であり得る。例えば、この組成物は、植物葉緑体、ミトコンドリア又は核などのオルガネラを実質的に含まない（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％未満のオルガネラを有する）可能性がある。
一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、異種機能性薬剤を含む。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、２種以上の異なる異種機能性薬剤を含む。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入される。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に包埋される。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に共役される。
一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、異種農業用薬剤である。一部の実施形態では、異種農業用薬剤は、農薬用薬剤である。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、施肥剤である。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、農薬用薬剤である。一部の実施形態では、農薬用薬剤は、抗真菌剤、抗菌剤、殺虫薬剤、軟体動物駆除薬剤、殺線虫薬剤又は除草剤である。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、忌避剤である。一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、植物改質剤である。
一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、異種治療薬である。一部の実施形態では、異種治療薬は、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤を含む。
一部の実施形態では、異種機能性薬剤は、異種ポリペプチド、異種核酸又は異種小分子である。一部の実施形態では、異種核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は阻害性ＲＮＡである。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子発現を阻害する。一部の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、植物共生体における遺伝子発現を阻害する。
一部の実施形態では、核酸は、植物において酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンの発現を増加させるｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。
一部の実施形態では、核酸は、植物において酵素、転写因子、分泌タンパク質、構造因子、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド又は輸送体の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマー、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。
一部の実施形態では、組成物は、植物への送達のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、農業的に許容可能な担体を含む。
一部の実施形態では、組成物は、動物（例えば、ヒト）への送達のために製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。
一部の実施形態では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される。
一部の実施形態では、植物は、農業又は園芸植物である。一部の実施形態では、農業植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である。
一部の実施形態では、組成物中のＰＭＰは、植物（例えば、農業又は園芸植物）の適応度を増加させるのに有効な濃度である。
一部の実施形態では、農業植物は、雑草である。
一部の実施形態では、組成物中のＰＭＰは、植物（例えば、雑草）の適応度を減少させるのに有効な濃度である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した動物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；（ｄ）純粋なＰＭＰに細胞透過性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した動物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップ；及び（ｅ）動物への送達のためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分を提供するステップ；（ｂ）植物又はその部分から複数の細胞外小胞（ＥＶ）を放出させ、初期サンプル中のＥＶを収集するステップ；（ｃ）複数のＥＶを粗ＥＶ画分に分離するステップであって、粗ＥＶ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物細胞又は細胞残屑の低下したレベルを有する、ステップ；（ｄ）粗ＥＶ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物オルガネラ、細胞壁構成成分又は植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質−核酸凝集体、リポタンパク質凝集体又は脂質−タンパク質構造）の低下したレベルを有する、ステップ；及び（ｅ）純粋なＰＭＰに、植物細胞取込みを増加させる異種機能性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した植物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した細菌細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分を提供するステップ；（ｂ）植物又はその部分から複数の細胞外小胞（ＥＶ）を放出させ、初期サンプル中のＥＶを収集するステップ；（ｃ）複数のＥＶを粗ＥＶ画分に分離するステップであって、粗ＥＶ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物細胞又は細胞残屑の低下したレベルを有する、ステップ；（ｄ）粗ＥＶ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物オルガネラ、細胞壁構成成分又は植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質−核酸凝集体、リポタンパク質凝集体又は脂質−タンパク質構造）低下したレベルを有する、ステップ；及び（ｅ）純粋なＰＭＰに、細菌細胞取込みを増加させる異種機能性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した細菌細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した真菌細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；（ｄ）純粋なＰＭＰに植物細胞透過性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した植物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップ；及び（ｅ）植物への送達のためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書のいずれかのＰＭＰ組成物を含む植物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書のいずれかのＰＭＰ組成物を含む細菌である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書のいずれかのＰＭＰ組成物を含む真菌である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＰＭＰ組成物を植物に送達する方法であって、植物を本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかと接触させることを含む方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳動物の適応度を増加させる方法であって、本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかの有効量の組成物を哺乳動物に送達することを含み、哺乳動物の適応度を、治療されていない哺乳動物に対して増加させる方法である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種治療薬を含む。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、有効量の本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかを植物に送達することを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して増加させる方法である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種施肥剤を含む。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種植物改質剤を含む。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種農薬用薬剤を含む。一部の実施形態では、植物は、農業又は園芸植物である。一部の実施形態では、植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を減少させる方法であって、本明細書に記載される有効量のいずれかのＰＭＰ組成物を植物に送達することを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して減少させる方法である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種除草薬を含む。一部の実施形態では、植物は、雑草である。
本明細書の方法の一部の実施形態では、ＰＭＰ組成物は、植物の葉、種子、根、果実、新芽又は花に送達される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＰＭＰ組成物を細菌に送達する方法であって、細菌を本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかと接触させることを含む方法である。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、細菌の適応度を減少させる方法であって、有効量の本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかを細菌に送達することを含み、細菌の適応度を、処理されていない細菌に対して減少させる方法である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種抗菌剤を含む。一部の実施形態では、細菌は、植物病原体である。一部の実施形態では、細菌は、動物（例えば、ヒト）病原体である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＰＭＰ組成物を真菌に送達する方法であって、真菌を本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかと接触させることを含む方法である。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、真菌の適応度を減少させる方法であって、有効量の本明細書のＰＭＰ組成物のいずれかを真菌に送達することを含み、真菌の適応度を、処理されていない真菌に対して減少させる方法である。一部の実施形態では、ＰＭＰは、異種抗真菌剤を含む。一部の実施形態では、真菌は、植物病原体である。一部の実施形態では、真菌は、動物（例えば、ヒト）病原体である。本明細書の方法の一部の実施形態では、ＰＭＰ組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるいずれかのＰＭＰ組成物と、農業用使用に適した担体又は賦形剤とを含む農業用コントロール製剤である。この製剤は、液体、固体（例えば、顆粒、ペレット、粉末、ドライフロアブル若しくは水和剤粉末）、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体形態であり得る。製剤は、希釈される（例えば、組成物は、可溶性固体又は水分散性固体である）か、植物、土壌若しくは種子に噴霧されるか、塗布されるか、注入されるか又は適用されるように構成する（及び／又は指示書と組み合わせる）ことができる。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるいずれかのＰＭＰ組成物と、農業用組成物（例えば、雑草コントロール組成物、施肥組成物又は植物改質組成物）において見られるような使用のための指示書とを含むキットである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外来性のイオン化可能な脂質を含むＰＭＰを標的細胞に導入することを含み、外来性のイオン化可能な脂質を含むＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて増加した、標的細胞による取込みを有する、方法である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のイオン化可能な脂質を含む。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）由来の脂質を含む。一部の実施形態では、外来性のイオン化可能な脂質は、１，１’−（（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン−２−オール）（Ｃ１２−２００）である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外来性双性イオン性脂質を含むＰＭＰを標的細胞に導入することを含み、外来性双性イオン性脂質を含むＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて増加した、標的細胞による取込みを有する、方法である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の双性イオン性脂質を含む。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）由来の脂質を含む。一部の実施形態では、外来性双性イオン性脂質は、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、外来性カチオン性脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、外来性のイオン化可能な脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のイオン化可能な脂質を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、Ｃ１２−２００である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、外来性双性イオン性脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物である。一部の実施形態では、修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の双性イオン性脂質を含む。一部の実施形態では、双性イオン性脂質は、ＤＥＰＣ又はＤＯＰＣである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び（ｃ）外来性カチオン性脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性カチオン性脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び（ｃ）外来性のイオン化可能な脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性のイオン化可能な脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び（ｃ）外来性双性イオン性脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性双性イオン性脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップを含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物である。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
定義
本明細書で使用される場合、「農業的に許容可能な」担体又は賦形剤は、農業における使用に、例えば、植物に対する使用に適しているものである。ある種の実施形態では、農業的に許容可能な担体又は賦形剤は、妥当なベネフィット／リスク比に見合い、植物、環境に対する又はそこから得られるもたらされる農産物を摂取するヒト若しくは動物に対する過度の有害な副作用を有しない。
本明細書で使用される場合、「送達すること」又は「接触させること」は、ＰＭＰ組成物を、植物、動物、真菌又は細菌に、組成物が植物、動物、真菌又は細菌の適応度を変化させるのに有効である領域内に、植物、動物、真菌又は細菌に直接的に又は植物、動物、真菌又は細菌に隣接して適用することを指す。組成物が植物、動物、真菌又は細菌と直接的に接触される方法では、組成物を、植物、動物、真菌又は細菌全体と接触させることも、植物、動物、真菌又は細菌の一部分のみと接触させることもできる。
本明細書で使用される場合、「植物の適応度を減少させること」は、本明細書に記載される組成物（例えば、異種機能性薬剤を任意選択で含む、修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物）の投与の結果としての、限定はされないが、植物（例えば、雑草）の集団を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超えて減少させることを含めた、植物（例えば、雑草）の生理機能のあらゆる破壊を指す。植物の適応度の減少は、組成物が投与されていない植物と比較して決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」、「有効な濃度」又は「〜するのに有効な濃度」は、標的生物内又は標的生物上で挙げられた結果をもたらす又は目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達するのに十分な、修飾ＰＭＰ又はその中の異種機能性薬剤の量を指す。
本明細書で使用される場合、「植物の適応度を増加させること」は、本明細書に記載される組成物（例えば、異種機能性薬剤を任意選択で含む、修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物）の投与の結果としての、植物の生産の増加、例えば、収穫高の向上、植物の活力の向上又は植物からの収穫産物の質の増加を指す。植物の収量の改善は、同じ条件下で生産したが、本組成物を適用していない植物の同じ産物の収量に対して又は従来の農薬の適用と比較して、測定可能な量による植物の産物の収量（例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収量、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積によって測定される）の増加に関する。例えば、収量は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％若しくは約１００％超増加し得る。収量は、何らかの基準で植物又は植物の産物の重量若しくは体積当たりの量に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産された植物の重量又は使用した原材料の量に関して表すことができる。植物の適応度の増加は、本組成物の投与を伴わない又は従来の農業用薬剤の適用を伴う以外は同じ条件下で産生された植物の同じ因子と比較した測定可能な又は認識可能な量により、活力評価の増加若しくは改善、株立本数（単位面積当たりの植物の数）の増加、植物丈の増加、茎外周の増加、植物群落の増加、外観の改善（視覚によって測定された場合の、より緑色の葉色など）、根評価の改善、実生発生の増加、タンパク質含量、葉の大きさの増加、葉の数の増加、より少ない枯れた根出葉、分げつ強度の増加、栄養分又は肥料の必要性の減少、種子発芽の増加、分げつ産生力の増加、開花の増加、種子若しくは子実成熟又は種子成熟度の増加、より少ない植物転倒（倒伏）、新芽成長増加又はこれらの因子のあらゆる組み合わせなどの他の手段によって測定することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「異種」は、（１）植物に対して外来性である（例えば、ＰＭＰがそこから生成された植物ではない起源に由来する）、又は（２）ＰＭＰがそこから生成された植物に対して内在性であるが、（例えば、ローディング、遺伝子操作、インビトロ又はインビボ手法を使用して）、天然に見られる（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞に見られる）濃度よりも高い濃度でＰＭＰ中に存在する薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「機能性薬剤」は、ＰＭＰと関連する又は関連する可能性があり（例えば、ＰＭＰに又はＰＭＰ上にロードされる（例えば、インビボ又はインビトロ方法を使用して、ＰＭＰによって封入されるか、ＰＭＰに包埋されるか、又はＰＭＰに結合され）、且つ本組成物又は方法に従って、挙げられた結果をもたらす（例えば、植物、植物有害生物、植物共生体、動物（例えば、ヒト）病原体又は動物病原体ベクターの適応度を増加又は減少させる）ことが可能である薬剤（例えば、農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））を指す。
本明細書で使用される場合、用語「農業用薬剤」は、農薬用薬剤、有害生物忌避剤、施肥剤、植物改質剤又は植物−共生体修飾剤など、植物、植物有害生物又は植物共生体に作用することができる薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「施肥剤」は、植物（例えば、植物栄養素又は植物成長調節因子）又は植物共生体（例えば、核酸又はペプチド）の適応度を増加させることが可能である薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「農薬用薬剤」は、昆虫、軟体動物、線虫、真菌、細菌、雑草又はウイルスなど、農業、環境又は家庭／住居有害生物の、適応度を制御又は減少させる（例えば、死滅させるか又は成長、増殖、分裂、生殖若しくは拡大を阻害する）、薬剤、組成物又はその中の物質を指す。農薬は、天然に存在する又は合成の殺虫剤（幼虫駆除剤又は成虫駆除剤）、昆虫成長調節因子、殺ダニ剤（ダニ駆除剤）、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、外部寄生虫撲滅薬、殺菌剤、殺真菌剤又は除草薬を含むものと理解される。用語「農薬用薬剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬、農薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、栄養素及び／又は昆虫の運動を不全にする又は遅くする薬剤などの他の生物活性分子を更に包含することができる。
本明細書で使用される場合、用語「植物改質剤」は、植物適応度の増加をもたらす方式で、植物の遺伝特性（例えば、遺伝子発現を増加させる、遺伝子発現を減少させるか、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列を他の点で変化させる）又は生化学的特性を変化させることができる薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療薬」は、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤など、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）、動物病原体又は病原体ベクターに作用することができる薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、用語「植物への送達のために製剤化される」は、農業的に許容可能な担体を含むＰＭＰ組成物を指す。本明細書で使用される場合、「農業的に許容可能な」担体又は賦形剤は、妥当なベネフィット／リスク比に見合い、植物、環境に対する又はそこから得られるもたらされる農産物を摂取するヒト若しくは動物に対する過度の有害な副作用を伴わず、農業における使用に適しているものである。
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、置き換え可能であり、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００又はそれを超える核酸）とは関係なく、直鎖状若しくは分岐、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらのハイブリッドを指す。この用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ヌクレオチドは、典型的に、リン酸ジエステル結合により核酸中で連結されるが、用語「核酸」は、他のタイプの結合又は骨格（例えば、中でも、ホスホロアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）結合又は骨格）を有する核酸類似体も包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖であり得るか、又は一本鎖及び二本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ並びに例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル及び修飾若しくは非標準塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン及び５ヒドロキシメチルシトシンシトシンを含む）をはじめとする塩基の任意の組合せを含み得る。
本明細書で使用されるとき、用語「有害生物」は、植物若しくは他の生物に対して被害をもたらし、不要な場所に存在するか、又はそうでなければ例えばヒトの農業方法若しくは農産物に影響を及ぼすことにより、ヒトに対して有害である生物を指す。有害生物として、例えば無脊椎動物（例えば、昆虫、線虫若しくは軟体動物）、細菌、真菌若しくはウイルスなどの微生物（例えば、植物病原体、内生植物、偏性寄生生物、条件的寄生生物若しくは条件的腐生菌）；又は雑草が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「農薬用薬剤」又は「農薬」は、農業、環境又は家庭／住居の有害生物、例えば昆虫、軟体動物、線虫、真菌、細菌、雑草若しくはウイルスを防除するか、又はその適応度を低減させる（例えば、殺傷するか、又は成長、繁殖、分裂、生殖若しくは拡大を阻害する）薬剤、組成物、又はそれらに含まれる物質を指す。農薬は、天然に存在する又は合成の殺虫剤（幼虫駆除剤又は成虫駆除剤）、昆虫成長調節物質、殺ダニ剤（ダニ駆除剤）、軟体動物駆除剤、殺線虫剤、外部寄生生物撲滅薬、殺菌剤、殺真菌剤又は除草剤を包含するものと理解される。用語「農薬用薬剤」は、更に、抗生物質、抗ウイルス薬、農薬、抗真菌剤、駆虫剤、栄養素及び／又は昆虫の運動を停止若しくは緩徐にする薬剤などの他の生物活性分子を含み得る。
農業用薬剤は、異種であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「異種」は、（１）植物に対して外来性である（例えば、ＰＭＰが産生される植物若しくは植物部分ではない起源に由来する）（例えば、本明細書に記載のロード手法を用いてＰＭＰに添加される）か、又は（２）ＰＭＰが産生される植物細胞若しくは組織に対して外来性であるが、天然に存在するより高い（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞中に存在する濃度より高い）濃度でＰＭＰ中に存在する（例えば、本明細書に記載のロード手法、遺伝子操作、インビトロ若しくはインビボ手法を用いてＰＭＰに添加される）かのいずれかである薬剤（例えば、農業用薬剤）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「忌避剤」は、有害生物が植物に接近又はそこに残留することを防ぐ薬剤、組成物又はそれらに含まれる物質を指す。忌避剤は、例えば、植物上又はその近傍の有害生物の数を減少させ得るが、必ずしも有害生物を殺傷又はその適応度を低減させるわけではない。
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００アミノ酸又はそれを超える）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）の有無又は例えばペプチドに共有結合的に連結した１つ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質等）の存在に関わらず、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸鎖（Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれも）を包含し、例えば天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド又はペプチドミメティクスが含まれる。
本明細書で使用されるとき、２つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に利用可能である。
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及びその子孫を指す。植物細胞には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉又は小胞子の細胞が含まれる。植物部位には、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、果実、収穫物、腫瘍組織、樹液（例えば、木部汁液及び師管液）及び様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚及びカルス組織）を含めた、分化した及び未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物のものであるか、又は植物器官、組織若しくは細胞培養物のものであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「植物メッセンジャーパック」又は「ＰＭＰ」は、あらゆる脂質又は非脂質構成成分（例えば、ペプチド、核酸又はそれと関連する小分子を含めた、植物細胞外小胞又はその断片、部分若しくは抽出物を含む又はこれらに由来する、直径が約５〜２０００ｎｍである脂質構造（例えば、脂質二重層、単層又は多層構造）（例えば、小胞脂質構造）を指す。ＰＭＰは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子を含めた、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））などの追加の薬剤を任意選択で含むことができる。ＰＭＰは、例えば追加の薬剤を封入することによる標的植物への追加の薬剤の送達、脂質二重層構造への構成成分の組込み又は脂質二重層構造の表面との構成成分の（例えば共役による）結合を可能にする様々な手段により、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））などの追加の薬剤を担持させる又は結合させることができる。追加の薬剤は、インビボで（例えば、植物に）又はインビトロで（例えば、組織培養物に、細胞培養物に又は合成によって組込まれる）、ＰＭＰに組込むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「修飾ＰＭＰ」は、ＰＭＰ又はその部分若しくは構成成分（例えば、ＰＭＰによって担持される異種機能性薬剤）の細胞取込み（例えば、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）を非修飾ＰＭＰと比べて増加させることが可能な異種薬剤（例えば、細胞透過性薬剤）を含む複数のＰＭＰを含む組成物を指す。ＰＭＰは、インビトロ又はインビボで修飾することができる。
本明細書で使用される場合、用語「非修飾ＰＭＰ」は、ＰＭＰの細胞取込み（例えば、動物細胞取込み、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）を増加させることが可能な異種細胞取込み剤を欠く複数のＰＭＰを含む組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞取込み」は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞又は真菌細胞などの細胞による、ＰＭＰ又はその部分若しくは構成成分（例えば、ＰＭＰによって担持される異種機能性薬剤）の取込みを指す。例えば、取込みは、ＰＭＰ又はその部分若しくは構成成分の、細胞外環境から、細胞膜、細胞壁、細胞外マトリックスへの若しくはこれらを横切るか又は細胞の細胞内環境への移動を含むことができる。ＰＭＰの細胞取込みは、能動的又は受動的な細胞機構を介して起こり得る。
本明細書で使用される場合、用語「細胞透過性薬剤」は、細胞取込みの増加を、薬剤と接触されていない細胞に対して促進する方式で、細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、細菌細胞又は真菌細胞）の細胞壁、細胞外マトリックス又は細胞膜の特性（例えば、透過性）を変化させる薬剤を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞外小胞」、「植物ＥＶ」又は「ＥＶ」は、植物中に天然に存在する内包脂質二重層構造を指す。任意選択で、植物ＥＶは、１つ又は複数の植物ＥＶマーカーを含む。本明細書で使用されるとき、用語「植物ＥＶマーカー」は、植物タンパク質、タンパク質核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなどの天然に植物に付随する成分を指し、限定されないが、付録に列挙する植物ＥＶマーカーのいずれかを含む。一部の例では、植物ＥＶマーカーは、植物ＥＶマーカーの識別マーカーであるが、農業用薬剤ではない。一部の例では、植物ＥＶマーカーは、植物ＥＶマーカーの識別マーカーであり、且つ農業用薬剤でもある（例えば、複数のＰＭＰと結合しているか若しくはそれらに封入されているか、又は複数のＰＭＰと直接結合していないか若しくはそれらに封入されていない）。
本明細書で使用されるとき、用語「植物メッセンジャーパック」又は「ＰＭＰ」は、直径が約５〜２０００ｎｍ（例えば、少なくとも５〜１０００ｎｍ、少なくとも５〜５００ｎｍ、少なくとも４００〜５００ｎｍ、少なくとも２５〜２５０ｎｍ、少なくとも５０〜１５０ｎｍ又は少なくとも７０〜１２０ｎｍ）の脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造；例えば、小胞脂質構造）を指し、これは、それらに結合した脂質若しくは非脂質成分（例えば、ペプチド、核酸若しくは小分子）を含め、植物起源又はその断片、部分若しくは抽出物から得られ（例えば、濃縮、単離若しくは精製され）、植物、植物部分又は植物細胞から濃縮、単離若しくは精製されており、この場合、濃縮又は単離は、起源植物から１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素を除去することである。ＰＭＰは、天然に存在するＥＶの高度に精製された調製物であり得る。好ましくは、起源植物からの混入物又は不要な要素、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素、例えば植物細胞壁要素；ペクチン；植物オルガネラ（例えば、ミトコンドリア；葉緑体、白色体若しくはアミロプラストなどの色素体；及び核）；植物クロマチン（例えば、植物染色体）；又は植物分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、タンパク質−核酸凝集体、リポタンパク質凝集体若しくは脂質−タンパク質構造）の少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％）が除去される。好ましくは、ＰＭＰは、重量（ｗ／ｗ）、スペクトルイメージング（％透過率）又は伝導率（Ｓ／ｍ）により測定した場合、起源植物からの１つ若しくは複数の混入物又は不要な要素に対して、少なくとも３０％純粋（例えば、少なくとも４０％純粋、少なくとも５０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも７０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９９％純粋若しくは少なくとも１００％純粋）である。
一部の例では、ＰＭＰは、脂質抽出されたＰＭＰ（ＬＰＭＰ）である。本明細書で使用される場合、用語「脂質抽出されたＰＭＰ」及び「ＬＰＭＰ」は、植物起源由来の（例えば、濃縮、単離又は精製された）脂質構造（例えば、脂質二重層、単層、多層構造；例えば、小胞脂質構造）から得られたＰＭＰを指し、ここで、脂質構造は、破壊され（例えば、脂質抽出によって破壊され）、標準の方法を使用して液相（例えば、カーゴを含有する液相）中で再集合又は再構成される、例えば、脂質薄膜水和及び／又は溶媒注入を含む方法によって再構成されて、本明細書に記載されているＬＰＭＰが生成される。この方法は、所望される場合、例えば、再構成されたＰＭＰのサイズを減少させるために、超音波処理、凍結／融解処理及び／又は脂質押出しを更に含むことができる。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源からの脂質構造由来の１０％から１００％の脂質を含むことができ、例えば、植物起源からの脂質構造由来の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の脂質を含有することができる。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源からの脂質構造中に存在する脂質種の全て又は一部を構成することができ、例えば、これは、植物起源からの脂質構造中に存在する脂質種の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を含有することができる。ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、植物起源からの脂質構造中に存在するタンパク質種を少しも構成しないか、又は一部若しくは全てを構成することができ、例えば、植物起源からの脂質構造中に存在するタンパク質種の０％、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満又は１００％を含有することができる。一部の例では、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）の脂質二重層は、タンパク質を含有しない。一部の例では、ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）の脂質構造は、植物起源からの脂質構造に対して減少した量のタンパク質を含有する。
ＰＭＰ（例えば、ＬＰＭＰ）は、外来性脂質、例えば、（１）植物に対して外来性である（例えば、ＰＭＰがそこから生成された植物又は植物部分ではない起源に由来する）（例えば、本明細書に記載される方法を使用してＰＭＰが添加される）、又は（２）ＰＭＰがそこから生成された植物細胞又は組織に対して内在性であるが、天然に見られるよりも高い（例えば、天然に存在する植物細胞外小胞に見られる濃度よりも高い）濃度でＰＭＰ中に存在する（例えば、本明細書に記載される方法、遺伝子操作、インビトロ又はインビボ手法を使用してＰＭＰに添加される）脂質を任意選択で含むことができる。ＰＭＰの脂質組成物は、０％、１％未満又は少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９５％超の外来性脂質を含むことができる。例示的な外来性脂質には、カチオン性脂質、イオン化可能な脂質及び双性イオン性脂質が含まれる。外来性脂質は、細胞透過性薬剤であり得る。
ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、細胞透過性薬剤、農薬用薬剤、施肥剤、植物改質剤、治療薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子などの追加の薬剤を任意選択で含むことができる。ＰＭＰは、薬剤を標的植物に送達することを可能にする様々な方法において、例えば薬剤の封入、脂質二重層構造内への薬剤の組込み又は脂質二重層構造の表面と薬剤の結合（例えば、共役）により、追加薬剤（例えば異種機能性薬剤）を担持させるか又はそれらと結合させることができる。異種機能性薬剤は、インビボ（例えば、植物中に）又はインビトロ（例えば、組織細胞中、細胞培養物中に若しくは合成により組み込んで）のいずれかでＰＭＰに組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、カチオン基（例えば、カチオン頭部基）を含有する両親媒性分子（例えば、脂質又はリピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ））を指す。
本明細書で使用される場合、用語「リピドイド」は、脂質の１つ以上の特性を有する分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「イオン化可能な脂質」は、イオン化する、例えば、所与の条件（例えば、ｐＨ）下で解離して１つ以上の帯電した種を生じることができる基（例えば、頭部基）を含有する両親媒性分子（例えば、脂質又はリピドイド）を指す。
本明細書で使用される場合、用語「双性イオン性脂質」は、正電荷を有する少なくとも１つの種と負電荷を有する少なくとも１つの種とを有する（ここで、基の正味電荷はゼロである）基（例えば、頭部基）を含有する両親媒性分子（例えば、脂質又はリピドイド）を指す。
本明細書で使用される場合、用語「安定なＰＭＰ組成物」（例えば、ロードを受けた又はロードを受けていないＰＭＰを含む組成物）は、任意選択で規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃又は３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃又は２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃又は１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃又は０℃）又は−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃又は−３０℃）の温度）で、（例えば、生成又は製剤時の）ＰＭＰ組成物中のＰＭＰの数に対して、ＰＭＰの最初の数（例えば、溶液の１ｍＬ当たりのＰＭＰ）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）を、ある期間（例えば、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも３０日、少なくとも６０日又は少なくとも９０日）にわたって保持するか；又は任意選択で規定の温度範囲（例えば、少なくとも２４℃（例えば、少なくとも２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃又は３０℃）、少なくとも２０℃（例えば、少なくとも２０℃、２１℃、２２℃又は２３℃）、少なくとも４℃（例えば、少なくとも５℃、１０℃又は１５℃）、少なくとも−２０℃（例えば、少なくとも−２０℃、−１５℃、−１０℃、−５℃又は０℃）又は−８０℃（例えば、少なくとも−８０℃、−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃又は−３０℃）の温度）で、（例えば、生成又は製剤時の）ＰＭＰの最初の活性に対して、その活性（例えば、細胞壁透過活性及び／又は農薬及び／又は忌避剤活性）の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）を保持するＰＭＰ組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「動物への送達のために製剤化される」は、薬学的に許容可能な担体を含むＰＭＰ組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」担体又は賦形剤は、例えば、動物（例えば、ヒト）に対する過度の有害な副作用を伴わずに、動物（例えば、ヒト）への投与に適しているものである。
本明細書で使用される場合、用語「治療されていない」は、ＰＭＰ組成物を送達されていない別の植物、動物、真菌若しくは細菌又はＰＭＰ組成物の送達の前の時点で評価される、治療を受けている同じ植物、動物、真菌若しくは細菌又は植物、動物、真菌又は細菌の治療されていない部分で評価される、治療を受けている同じ植物、動物、真菌又は細菌を含めて、本明細書のＰＭＰ組成物と接触又は送達されていない植物、動物、真菌若しくは細菌を指す。
グレープフルーツ及びレモンＰＭＰからの脂質再構成されたＰＭＰ（ＬＰＭＰ）の調製のためのワークフローを示す概略図である。 ＬＰＭＰ；ＤＣ−コレステロールが添加されたＬＰＭＰ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；及びＤＯＴＡＰが添加されたＬＰＭＰ（ＤＯＴＡＰ）中の、所与のサイズ（ｎｍ）の粒子の相対頻度を示すグラフである。データは、製造者によって提供される濃度及びサイズ標準を使用して、ＮａｎｏＦＣＭによって得られた。 抽出されたレモンＰＭＰ脂質から再構築されたＬＰＭＰを示す低温電子顕微鏡像である。スケールバー：５００ｎｍ。 低温電子顕微鏡法を使用して測定される、抽出されたレモン脂質から再構築されたＬＰＭＰ中の所与の等比換算球体直径（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（ｎｍ）の粒子の相対頻度を示すグラフである。 動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して測定される、添加される脂質（ＬＰＭＰ）を含まないＬＰＭＰ及び２５％又は４０％ ＤＯＴＡＰ又はＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰのゼータ電位（ｍＶ）を示すグラフである。データは、平均値±ＳＤとして示される。 添加される脂質を含まないグレープフルーツ脂質からのＬＰＭＰ（ＬＰＭＰ）及び２０％ ＤＯＴＡＰを含むグレープフルーツ脂質からのＬＰＭＰのローディングの後にＬＰＭＰから回収されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識されたｓｉＲＮＡインプットのパーセントを示す棒グラフである。 添加される脂質を含まないレモン脂質からのＬＰＭＰ（ＬＰＭＰ）及び４０％ ＤＣ−コレステロールを含むレモン脂質からのＬＰＭＰ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）のローディングの後にＬＰＭＰから回収されたＡＴＴＯ標識されたＴｒａｃｒＲＮＡインプットのパーセントを示す棒グラフである。 Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）分析を使用して測定される、処理されていない又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びヘパリンを使用して溶解されている（＋ＴＸ＋ヘパリン）、４０％ ＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰ中のＴｒａｃｒＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す棒グラフである。 添加される脂質を含まないグレープフルーツ脂質からのＰＫＨ６７標識されたＬＰＭＰ（中央列）及び２０％ ＤＯＴＡＰを含有するＬＰＭＰ（右列）で処理されたＣＯＬＯ６９７細胞における、ＤＡＰＩ（上行）及びＰＫＨ６７（中央行）蛍光を示す一連の顕微鏡写真である。ＤＡＰＩシグナルとＰＫＨ６７シグナルとを含む重ね合わせ画像は、パネルの下の行に示される。ＰＫＨ６７色素で処理した細胞を、対照として示す。スケールバー：５０μｍ。 添加される脂質を含まないＬＰＭＰ（中央行）及び４０％ ＤＣ−コレステロールを含むＬＰＭＰ（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）で処理されたトウモロコシ：ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞の、位相差（左列）、ＡＴＴＯ ５５０蛍光（中央列）及び重ね合わせ図を示す一連の顕微鏡写真である。Ｈ２Ｏのみで処理された細胞を、陰性対照（上パネル）として提供する。ＬＰＭＰ又はＤＣ−コレステロールで修飾されたＬＰＭＰの、細胞による取込みは、細胞中のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０シグナルの存在によって示される。スケールバー：１００μｍ。 修飾されていないＬＰＭＰ；ＭＣ３が添加されたＬＰＭＰ；及びＣ１２−２００が添加されたＬＰＭＰ中の、所与のサイズ（ｎｍ）の粒子の相対頻度を示すグラフである。データは、製造者によって提供される濃度及びサイズ標準を使用して、ＮａｎｏＦＣＭによって得られた。 添加される脂質を含まないｐＨ７のＬＰＭＰ（ＬＰＭＰ）、４０％ ＭＣ３を含むｐＨ４及びｐＨ７のＬＰＭＰ及び２５％ Ｃ１２−２００を含むｐＨ４及びｐＨ７のＬＰＭＰのゼータ電位（ｍＶ）を示すグラフである。データは、平均値±ＳＤとして示される。 添加される脂質を含まないレモン脂質からのｐＨ７のＬＰＭＰ（ＬＰＭＰ）、４０％ ＭＣ３を含むｐＨ４及びｐＨ９のＬＰＭＰ及び２５％ Ｃ１２−２００を含むｐＨ４及びｐＨ９のＬＰＭＰのローディングの後にＬＰＭＰから回収されたＡＴＴＯ ５５０標識されたＴｒａｃｒＲＮＡインプットのパーセントを示す棒グラフである。データは、平均値±ＳＤとして示される。図８Ｃは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）分析を使用して測定される、処理されていない又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びヘパリンを使用して溶解されている（＋ＴＸ＋ヘパリン）、２５％ Ｃ１２−２００を含むＬＰＭＰ中のｓｇＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を示す棒グラフである。 添加される脂質を含まないレモン脂質からのＬＰＭＰ（中央行）及び２５％ Ｃ１２−２００を含むＬＰＭＰ（下行）で処理されたトウモロコシ：ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞の、位相差（左列）、ＡＴＴＯ ５５０蛍光（中央列）及び重ね合わせ図を示す一連の顕微鏡写真である。Ｈ２Ｏのみで処理された細胞を、陰性対照（上パネル）として提供する。ＬＰＭＰ又はＣ１２−２００で修飾されたＬＰＭＰの、細胞による取込みは、細胞中のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０シグナルの存在によって示される。スケールバー：１００μｍ。 添加されるセルラーゼを含まないグレープフルーツ脂質からのＬＰＭＰ（第４列）で処理されたトウモロコシ：ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）細胞の、位相差（上行）、標識されたセルラーゼを示すＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光（第２行）、標識されたＰＭＰ膜を示すＰＫＨ２６蛍光（第３行）及び重ね合わせ図（下行）を示す一連の顕微鏡写真である。ＬＰＭＰ又は修飾プロトコルｃ．１（ＰＭＰを、ＥＤＣクロスリンカーを使用してカルボジイミド化学を通してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−セルラーゼと結合させる）、ｂ．３（ＰＭＰを、ＮＨ２−ＤＢＣＯリンカーを使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−セルラーゼ−アジドと結合させる）、ｂ．２（ＰＭＰを、ＮＨ２−ＤＢＣＯリンカーを使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−セルラーゼ−アジドと結合させる）又はｂ．１（ＰＭＰを、ＮＨＳ−ホスフィンを使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−セルラーゼ−アジドと結合させる）を使用してセルラーゼで修飾されたＬＰＭＰの取込み。セルラーゼ−修飾ＰＭＰの取込みは、細胞中のＰＫＨ２６蛍光シグナルの存在によって示される。スケールバー：１００μｍ。
本明細書の特徴とされるのは、例えば動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）、植物細胞、細菌細胞又は真菌細胞による、亢進した細胞取込みを有する修飾植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）である。ＰＭＰは、植物細胞外小胞（ＥＶ）又はその断片、部分若しくは抽出物から全体的に又は部分的に生成される脂質集合体である。ＰＭＰは、追加の薬剤（例えば、異種機能性薬剤、（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））を任意選択で含むことができる。本明細書に記載される修飾ＰＭＰ並びに関連組成物及び方法は、様々な農業的及び治療的方法に使用することができる。
Ｉ．修飾植物メッセンジャーパック組成物
本明細書に記載のＰＭＰ組成物は、複数の修飾植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を含む。ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）を含む脂質（例えば、脂質二重層、単層若しくは多層構造）構造である。植物ＥＶとは、植物中に天然に存在し、直径が約５〜２０００ｎｍである内包脂質二重層構造を指す。植物ＥＶは、多様な植物生合成経路を起源とし得る。天然では、植物ＥＶは、植物アポプラストなどの植物の細胞内及び細胞外コンパートメント、原形質膜の外側に位置して、一連の細胞壁と細胞外空間により形成されるコンパートメント内に見られ得る。代わりに、ＰＭＰは、植物細胞からの分泌時に細胞培地中見られる濃縮された植物ＥＶであり得る。植物ＥＶは、本明細書により詳細に記載される様々な方法により、植物から分離し、これによりＰＭＰをもたらすことができる。更に、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、細胞透過性薬剤、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））を任意選択で含むことができ、これらは、インビボ又はインビトロで導入することができる。
ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含むことができる。任意選択で、ＰＭＰは、植物ＥＶ由来の脂質の他に、外来性脂質（例えば、ステロール（例えば、コレステロール）、カチオン性脂質、双性イオン性脂質又はイオン化可能な脂質）も含むことができる。一部の実施形態では、植物ＥＶは、直径が約５〜１０００ｎｍである。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２５０ｎｍ、約１２５０〜１５００ｎｍ、約１５００〜１７５０ｎｍ又は約１７５０〜２０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、約５〜９５０ｎｍ、約５〜９００ｎｍ、約５〜８５０ｎｍ、約５〜８００ｎｍ、約５〜７５０ｎｍ、約５〜７００ｎｍ、約５〜６５０ｎｍ、約５〜６００ｎｍ、約５〜５５０ｎｍ、約５〜５００ｎｍ、約５〜４５０ｎｍ、約５〜４００ｎｍ、約５〜３５０ｎｍ、約５〜３００ｎｍ、約５〜２５０ｎｍ、約５〜２００ｎｍ、約５〜１５０ｎｍ、約５〜１００ｎｍ、約５〜５０ｎｍ又は約５〜２５ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約５０〜３００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約２００〜５００ｎｍの平均直径を有する。特定の例では、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物は、約３０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。
一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ若しくは少なくとも１０００ｎｍの平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、１０００ｎｍ未満、９５０ｎｍ未満、９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満若しくは５０ｎｍ未満の平均直径を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有する。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物の粒径を測定することができる。
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜３．２×１０６ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜３．２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜５．３×１０８ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜５．３×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２若しくは少なくとも２×１０６ｎｍ２）の平均表面積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも２×１０８ｎｍ３、少なくとも３×１０８ｎｍ３、少なくとも４×１０８ｎｍ３若しくは少なくとも５×１０８ｎｍ３）の平均体積を有する、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
一部の例では、ＰＭＰは、植物ＥＶ又はその断片、抽出物若しくは部分と同じ大きさを有し得る。代わりに、ＰＭＰは、ＰＭＰが産生される初期植物ＥＶと異なる大きさを有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜２０００ｎｍの直径を有し得る。例えば、ＰＭＰは、約５〜５０ｎｍ、約５０〜１００ｎｍ、約１００〜１５０ｎｍ、約１５０〜２００ｎｍ、約２００〜２５０ｎｍ、約２５０〜３００ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約４００〜４５０ｎｍ、約４５０〜５００ｎｍ、約５００〜５５０ｎｍ、約５５０〜６００ｎｍ、約６００〜６５０ｎｍ、約６５０〜７００ｎｍ、約７００〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ、約９５０〜１０００ｎｍ、約１０００〜１２００ｎｍ、約１２００〜１４００ｎｍ、約１４００〜１６００ｎｍ、約１６００〜１８００ｎｍ又は約１８００〜２０００ｎｍの平均直径を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも８５０ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも９５０ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ又は少なくとも２０００ｎｍの平均直径を有し得る。当技術分野で標準的な様々な方法（例えば、動的光散乱法）を使用して、ＰＭＰの粒径を測定することができる。一部の例では、ＰＭＰの大きさは、異種機能性薬剤のローディング後又はＰＭＰに対する他の修飾後に決定する。
一部の例では、ＰＭＰは、７７ｎｍ２〜１．３×１０７ｎｍ２（例えば、７７〜１００ｎｍ２、１００〜１０００ｎｍ２、１０００〜１×１０４ｎｍ２、１×１０４〜１×１０５ｎｍ２、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２又は１×１０６〜１．３×１０７ｎｍ２）の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、６５ｎｍ３〜４．２×１０９ｎｍ３（例えば、６５〜１００ｎｍ３、１００〜１０００ｎｍ３、１０００〜１×１０４ｎｍ３、１×１０４〜１×１０５ｎｍ３、１×１０５〜１×１０６ｎｍ２、１×１０６〜１×１０７ｎｍ３、１×１０７〜１×１０８ｎｍ３、１×１０８〜１×１０９ｎｍ３又は１×１０９〜４．２×１０９ｎｍ３）の平均体積を有し得る。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも７７ｎｍ２（例えば、少なくとも７７ｎｍ２、少なくとも１００ｎｍ２、少なくとも１０００ｎｍ２、少なくとも１×１０４ｎｍ２、少なくとも１×１０５ｎｍ２、少なくとも１×１０６ｎｍ２又は１×１０７ｎｍ３）の平均表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも６５ｎｍ３（例えば、少なくとも６５ｎｍ３、少なくとも１００ｎｍ３、少なくとも１０００ｎｍ３、少なくとも１×１０４ｎｍ３、少なくとも１×１０５ｎｍ３、少なくとも１×１０６ｎｍ３、少なくとも１×１０７ｎｍ３、少なくとも１×１０８ｎｍ３、少なくとも１×１０９ｎｍ３、少なくとも２×１０９ｎｍ３、少なくとも３×１０９ｎｍ３又は少なくとも４×１０９ｎｍ３）の平均体積を有する。
一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな植物ＥＶを含有し得る。代わりに、ＰＭＰは、植物ＥＶの小胞の全表面積の断片、部分又は抽出物（例えば、小胞の全表面積の１００％未満（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満若しくは１％未満）を含む断片、部分又は抽出物）を含有し得る。断片、部分又は抽出物は、円周方向断片、球状断片（例えば、半球）、曲線断片、線状断片又は平板型断片など、任意の形状であり得る。断片が、小胞の球状断片である場合、球状断片は、平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたもの又は非平行線の対に沿った球状小胞の分割から生じたものを呈示し得る。従って、複数のＰＭＰは、複数のインタクトな植物ＥＶ、複数の植物ＥＶ断片、部分若しくは抽出物又はインタクトな植物ＥＶ及びその断片の混合物を含み得る。当業者は、インタクト及び断片化植物ＥＶの比が、使用した具体的な単離方法によって変動することは理解されるであろう。例えば、植物若しくはその部分の粉砕又はブレンドにより、真空浸潤法などの非破壊抽出方法よりも高い比率の植物ＥＶ断片、部分又は抽出物を含有するＰＭＰを生成することができる。
ＰＭＰが、植物ＥＶの断片、部分又は抽出物を含有する例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、インタクトな小胞のそれより小さい平均表面積、例えば７７ｎｍ２、１００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、１×１０４ｎｍ２、１×１０５ｎｍ２、１×１０６ｎｍ２又は３．２×１０６ｎｍ２）未満の平均表面積を有し得る。一部の例では、ＥＶ断片、部分又は抽出物は、７０ｎｍ２、６０ｎｍ２、５０ｎｍ２、４０ｎｍ２、３０ｎｍ２、２０ｎｍ２又は１０ｎｍ２）未満の表面積を有する。一部の例では、ＰＭＰは、インタクトな小胞のそれより小さい平均体積、例えば６５ｎｍ３、１００ｎｍ３、１０００ｎｍ３、１×１０４ｎｍ３、１×１０５ｎｍ３、１×１０６ｎｍ３、１×１０７ｎｍ３、１×１０８ｎｍ３又は５．３×１０８ｎｍ３）未満の平均体積を有する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含有し得る。
ＰＭＰが、植物ＥＶの抽出物を含む例、例えばＰＭＰが、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質を含む例では、ＰＭＰは、植物ＥＶから抽出された（例えば、クロロホルムで）脂質の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は９９％超を含有し得る。多数のＰＭＰは、植物ＥＶ断片及び／又は植物ＥＶ抽出脂質又はそれらの混合物を含有し得る。
本明細書では、修飾ＰＭＰの生成方法、ＰＭＰと結合させることができる植物ＥＶマーカー及びＰＭＰを含む組成物の製剤についての詳細を更に概説する。
Ａ．生成方法
ＰＭＰは、植物又は植物組織若しくは植物細胞を含むその部分に天然に存在する植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物（例えば、脂質抽出物）から生成することができる。ＰＭＰを生成する例示的な方法は、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；及び（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップを含む。この方法は、粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成する追加的なステップ（ｃ）であって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＰＭＰ画分のレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、追加的なステップ（ｃ）を更に含み得る。各生成ステップについては、以下に更に詳細に論じる。ＰＭＰの単離及び精製に関する例示的な方法は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ Ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７；Ｒｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７；Ｍｕ ｅｔ Ａｌ，Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．，５８，１５６１−１５７３，２０１４並びにＲｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９に見出され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込む。
一部の例では、（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％低下したレベル）を有する、ステップ；及び（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分と比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベル（例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％若しくは１００％低下したレベル）を有する、ステップを含むプロセスによって複数のＰＭＰを植物から単離され得る。
本明細書で提供されるＰＭＰは、様々な植物から生成された、植物ＥＶ又はその断片、部分若しくは抽出物を含むことができる。ＰＭＰは、限定はされないが、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、イワヒバ（ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ）、トクサ、裸茎植物（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅｓ）、ヒカゲノカズラ（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅ）、藻類（例えば、単細胞若しくは多細胞、例えばアーケプラスチダ（ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ））又はコケ類を含めた、あらゆる属の（維管束又は非維管束）植物から生成することができる。特定の例では、ＰＭＰは、維管束植物、例えば単子葉植物又は双子葉植物又は裸子植物を使用して生成することができる。例えば、ＰＭＰは、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、アブラナ種（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）又はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ））、カノーラ、トウゴマ、チコリー、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランベ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ウシノケグサ属、亜麻、グラジオラス、ユリ科、亜麻仁、雑穀、マスクメロン、カラシ、オーツムギ、アブラヤシ、ナタネ、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ属、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギ又は野菜作物、例えばレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物など；果実及び堅果樹、例えばリンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなど；つる植物（ｖｉｎｅ）、例えばブドウ、キウイ、ホップなど；果実低木及びキイチゴ、例えばラズベリー、ブラックベリー、セイヨウスグリなど；森林樹、例えばトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クルミ、ポプラなど；アルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、クランベ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、イネ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト又はコムギを使用して生成することができる。
ＰＭＰは、全植物（例えば、全ロゼット若しくは苗）又は代替的に１つ若しくは複数の植物部分（例えば、葉、種子、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）を使用して生成することができる。例えば、ＰＭＰは、新芽植物器官／構造（例えば、葉、茎若しくは塊茎）、根、花及び花器／構造（例えば、花粉、包葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯若しくは胚珠）、種子（胚、胚乳若しくは種皮を含む）、果実（成熟した子房）、樹液（例えば、師部若しくは木部樹液）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織、腫瘍組織など）並びに細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、カルス組織、孔辺細胞、卵細胞など）又はこれらの子孫を使用して生成することができる。例えば、単離ステップは、（ａ）植物又はその一部を用意することを含み得る。一部の例では、植物部分は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉である。植物は、任意の発育段階のものであり得る。例えば、ＰＭＰは、苗、例えば１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週又は８週齢の苗（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の苗）を使用して生成することができる。他の例示的ＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師部液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の師部液）又は木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）を使用して生成されたＰＭＰを含み得る。
ＰＭＰは、様々な方法により、植物又はその部分を使用して生成することができる。植物のＥＶ含有アポプラスト画分又はそうでなければ分泌されたＥＶを含むＰＭＰを含有する細胞外画分（例えば、細胞培地）の放出を可能にするいずれの方法も本方法において好適である。ＥＶは、破壊的（例えば、植物若しくは任意の植物部分の粉砕若しくはブレンド）又は非破壊的（植物若しくは任意の植物部分の洗浄若しくは真空浸潤法）方法のいずれかによって植物若しくは植物部分から分離することができる。例えば、植物又はその部分を真空浸潤、粉砕、ブレンド又はこれらの組合せに付して、植物又は植物部分からＥＶを単離し、これによりＰＭＰを生成することができる。例えば、単離ステップは、植物（例えば、小胞単離バッファーと一緒に）を真空浸潤して、アポプラスト画分を放出させ、収集することを含む。代わりに、単離ステップは、植物を粉砕又はブレンドして、ＥＶを放出させ、これによりＰＭＰを生成することを含む。
植物ＥＶを単離することにより、ＰＭＰを生成したら、ＰＭＰを粗ＰＭＰ画分（例えば、アポプラスト画分）に分離又は収集することができる。例えば、分離ステップは、植物組織残屑若しくは植物細胞をはじめとする大きい混入物から、植物ＰＭＰ含量画分を分離するための遠心分離（例えば、分画遠心分離若しくは超遠心分離）及び／又は濾過を用いて、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離することを含み得る。従って、粗ＰＭＰ画分は、植物又は植物部分からの初期サンプルと比較して減少した数の、植物組織残屑又は植物細胞を含めた大きい混入物を有することとなる。使用される方法に応じて、粗ＰＭＰ画分は、植物又は植物部分からの初期サンプルと比較して低下したレベルの植物細胞オルガネラ（例えば、核、ミトコンドリア又は葉緑体）を更に含むことができる。
一部の例では、単離ステップは、植物細胞又は植物組織残屑からＰＭＰ含有画分を分離するための遠心分離（例えば、分画遠心分離若しくは超遠心分離）及び／又は濾過を用いて、複数のＰＭＰを粗ＰＭＰ画分に分離することを含み得る。従って、粗ＰＭＰ画分は、起源植物又は植物部分からの初期サンプルと比較して、植物細胞又は植物組織残屑の数が減少することになる。
複数の純粋なＰＭＰを生成するために、追加の精製方法により粗ＰＭＰ画分を更に精製することもできる。例えば、超遠心分離により、例えば密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）の使用及び／又は凝集要素を除去するための他の手法（例えば、沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィー）の使用により、粗ＰＭＰ画分を他の植物要素から分離することができる。得られた純粋なＰＭＰは、より早期の分離ステップ中に生成された１つ若しくは複数の画分と比較して又は所定の閾値レベル、例えば商業的公開仕様と比較して、起源植物からの混入物又は他の不要な要素（例えば、１つ若しくは複数の非ＰＭＰ要素、例えばタンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁要素、細胞オルガネラ又はこれらの組合せ）の低下したレベルを有し得る。例えば、純粋なＰＭＰは、初期サンプルのレベルと比べて、植物オルガネラ又は細胞壁要素の低下したレベル（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２×、４×、５×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×若しくは１００×超）を有し得る。一部の例では、純粋なＰＭＰは、タンパク質凝集体、核酸凝集体、タンパク質−核酸凝集体、遊離リポタンパク質、脂質−タンパク質構造）、核、細胞壁要素、細胞オルガネラ又はこれらの組合せなどの１つ若しくは複数の非ＰＭＰ要素を実質的に含有しない（例えば、それらの検出不能レベルを有する）。放出及び分離ステップの更に別の例を実施例１に見出すことができる。ＰＭＰは、例えば、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３又は１×１０１３ＰＭＰｓ／ｍＬ超の濃度であり得る。
例えば、ＰＭＰから、タンパク質凝集体を除去することができる。例えば、ＰＭＰを様々なｐＨ（例えば、ｐＨプローブを用いて測定されるように）に付して、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させることができる。ｐＨは、例えば、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により、例えばｐＨ３、ｐＨ５、ｐＨ７、ｐＨ９又はｐＨ１１に調節することができる。溶液が指定ｐＨに達したら、これを濾過して微粒子を除去することができる。代わりに、ＰＭＰを、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０などの荷電ポリマーの添加により、凝集させることもできる。手短には、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して微粒子を除去する。代わりに、塩濃度を増加させることにより凝集体を可溶化することもできる。例えば、ＰＭＰにＮａＣｌを、それが例えば、１ｍｏｌ／Ｌになるまで添加することができる。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、昇温によって凝集体を可溶化することもできる。例えば、ＰＭＰを混合しながら、溶液が例えば、約５０℃の均一温度に達するまで５分間加熱することができる。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離することができる。代わりに、標準的手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＰＭＰ溶液から可溶性混入物を分離することができ、この場合、最初の画分中にＰＭＰを溶出させる一方、タンパク質及びリボ核タンパク質並びに一部のリポタンパク質をのちに溶出させる。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量を用いて、タンパク質凝集体の除去前後のタンパク質濃度を測定及び比較することにより決定することができる。
生成方法の任意のステップでＰＭＰを特性決定又は同定するために、本明細書に記載される生成方法のいずれにも、当技術分野で公知のいかなる定量的又は定性的方法も追加し得る。ＰＭＰは、ＰＭＰ収率、ＰＭＰ濃度、ＰＭＰ純度、ＰＭＰ組成又はＰＭＰサイズを推定するための多様な分析方法によって特性決定され得る。ＰＭＰは、ＰＭＰの視覚化、定量又は定性的特性決定（例えば、組成物の同定）を可能にする、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば顕微鏡検査（例えば、透過電子顕微鏡）、動的光散乱法、ナノ粒子追跡、分光法（例えば、フーリエ変換赤外分光法）若しくは質量分析法（タンパク質及び脂質分析）により評価することができる。特定の例では、方法（例えば、質量分析法）を用いて、ＰＭＰに存在する植物ＥＶマーカー、例えば付録に開示されるマーカーを同定することができる。ＰＭＰ画分の分析及び特性決定を補助するために、ＰＭＰを更に標識又は染色することができる。例えば、３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（ＤＩＯＣ６）、蛍光親油性色素、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ（登録商標）４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、ＰＭＰを染色することができる。高度な形態のナノ粒子追跡の非存在下でも、この比較的単純な手法は、総膜含量を定量することから、ＰＭＰの濃度を間接的に測定するために使用することができる（Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（１７）：ｅ２５３３，２０１７）。より正確な測定のため、またＰＭＰの粒度分布を評価するためには、ナノ粒子追跡を使用することができる。
生成工程中に、任意選択で、ＰＭＰが対照又は初期サンプル中のＥＶレベルに対して高い濃度（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％若しくは１００％超；又は約２倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍若しくは１００倍超）であるように、ＰＭＰを調製することができる。ＰＭＰは、ＰＭＰ組成物の約０．１％〜約１００％、例えば約０．０１％〜約１００％、約１％〜約９９．９％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約２５％、約１０％〜約５０％、約５０％〜約９９％又は約７５〜約１００％のいずれか１つを占め得る。一部の例では、組成物は、例えば、ｗｔ／ｖｏｌ、パーセントＰＭＰタンパク質組成物及び／又はパーセント脂質組成物により測定して（例えば、蛍光標識脂質の測定により）；例えば、実施例３を参照されたい）、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれを超えるＰＭＰのいずれかを含む。一部の例では、市販の製品のような濃縮薬剤を使用し、例えば、最終ユーザは、希釈された薬剤を使用し得、これは、実質的に低い濃度の有効成分を有する。一部の実施形態では、組成物は、農業用濃縮製剤、例えば高濃度少量製剤として製剤化する。
実施例１に説明されるように、多様な植物又はその部分（例えば、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液若しくは木部樹液）を使用してＰＭＰを生成することができる。例えば、ＰＭＰは、植物のアポプラスト画分、例えば葉のアポプラスト（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラスト）又は種子のアポプラスト（例えば、ヒマワリ種子のアポプラスト）から放出させることができる。他の例示的なＰＭＰは、根（例えば、根生姜）、果汁（例えば、グレープフルーツ果汁）、野菜（例えば、ブロッコリー）、花粉（例えば、オリーブ花粉）、師管液（例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液）、木部樹液（例えば、トマト植物木部樹液）又は細胞培養上清（例えば、ＢＹ２タバコ細胞培養上清）を使用して生成される。この実施例は、これらの種々の植物供給源からＰＭＰの生成を更に示す。
実施例２に説明されるように、様々な方法により、例えば超遠心分離及び／又は凝集混入物を除去する方法、例えば沈殿若しくはサイズ排除クロマトグラフィーと一緒に密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）を使用することにより、ＰＭＰを精製することができる。例えば、実施例２では、実施例１で概説される分離ステップによって得られたＰＭＰの精製を説明する。更に、ＰＭＰは、実施例３に説明される方法に従って特性決定することができる。
ＰＭＰは、本明細書で更に概説する通り、使用前に修飾することができる。
Ｂ．修飾ＰＭＰ及びＰＭＰ組成物
ＰＭＰの生成後、細胞取込み（例えば、動物細胞取込み（例えば、哺乳動物細胞取込み、例えば、ヒト細胞取込み）、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）を非修飾ＰＭＰと比べて対して増加させることが可能である異種薬剤（例えば、植物細胞透過性薬剤）をロードする又は共に製剤化することによってＰＭＰを修飾することができる。例えば、修飾ＰＭＰは、酵素、洗剤、イオン性、フルオラス若しくは双性イオン性の液体又は脂質などの細胞透過性薬剤を含む（例えば、ロードする、例えば封入するか若しくは結合させる）か又は共に製剤化する（例えば、細胞透過性薬剤を含む溶液に懸濁する若しくは再懸濁する）ことができる。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、酵素である。例えば、酵素は、細胞壁（例えば、動物細胞壁、植物細胞壁、細菌の細胞壁又は真菌の細胞壁）を分解することが可能である、動物、細菌、真菌、原生動物、哺乳動物又は植物酵素であり得る。
一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、植物細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、細菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素である。一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素である。一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素である。一部の例では、細胞壁分解酵素は、真菌の細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の例では、酵素は、動物細胞外マトリックス（例えば、哺乳動物細胞外マトリックス、例えば、ヒト細胞外マトリックス）を分解することが可能な動物酵素である。
一部の例では、酵素は、セルラーゼである。例えば、セルラーゼは、細菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有することができる。一部の例では、セルラーゼは、真菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。一部の例では、セルラーゼは、原生動物のセルラーゼの全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、洗剤である。一部の実施形態では、洗剤は、サポニン又は３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）である。
一部の例では、細胞壁透過薬剤は、イオン性の液体である。一部の実施形態では、イオン性の液体は、酢酸１−エチル−３−メチルイミダゾリウム（ＥＭＩＭ酢酸塩）である。他の実施形態では、イオン性液体は、ＢＭＩＭ酢酸塩、ＨＭＩＭ酢酸塩、ＭＭＩＭ酢酸塩又はＡｌｌｙｌＭＩＭ酢酸塩である。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、フルオラス液体である。一部の実施形態では、フルオラス液体は、パーフルオロオクタンである。他の実施形態では、フルオラス液体は、パーフルオロヘキサン又はパーフルオロ（メチルデカリン）である。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、カチオン性脂質である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール又はジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、イオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、１，１’−（（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン−２−オール）（Ｃ１２−２００）又は４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）である。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のイオン化可能な脂質（例えば、Ｃ１２−２００又はＭＣ３）を含む。
一部の例では、細胞透過性薬剤は、双性イオン性脂質である。一部の実施形態では、双性イオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）又は１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である。一部の例では、ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の双性イオン性脂質（例えば、ＤＯＰＣ又はＤＥＰＣ）を含む。
この薬剤は、全体としてのＰＭＰの取込みを増加させることができるか、又はＰＭＰの一部又は構成成分（ＰＭＰによって担持される、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤若しくは昆虫忌避剤））など）の取込みを増加させることができる。細胞取込み（例えば、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）が増加される程度は、組成物が送達される植物又は植物部分、ＰＭＰ製剤及びＰＭＰに施される他の修飾に応じて変動し得る。例えば、修飾ＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加した細胞取込み（例えば、動物細胞取込み、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）を有することができる。一部の例では、増加した細胞取込み（例えば、動物細胞取込み、植物細胞取込み、細菌細胞取込み又は真菌細胞取込み）は、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍又は１０００倍の増加した細胞取込みである。
別の態様では、ＰＭＰは、ＰＭＰの機能的及び構造的特性を更に変化させるための、他の構成成分（例えば、脂質、例えば、ステロール、例えば、コレステロール；又は小分子）で修飾することができる。例えば、ＰＭＰは、ＰＭＰの安定性を増加させる（例えば、室温で少なくとも１日間及び／又は４℃で少なくとも１週間安定）安定化分子で更に修飾することができる。
修飾ＰＭＰの細胞取込みは、当技術分野で公知の様々な方法によって測定することができる。例えば、ＰＭＰ又はその構成成分は、取込みを確認するために、単離された細胞において検出することができるマーカー（例えば、蛍光マーカー）で標識することができる。例えば、細胞取込みは、適応度、例えば、処理された細胞を含む動物、植物、細菌又は真菌の適応度の尺度に基づいて検出することができる。例えば、本組成物及び方法の有効性は、修飾ＰＭＰを欠く組成物の治療に対する本修飾ＰＭＰで治療された生物の適応度変化を比較することによって決定することができる。
Ｃ．植物ＥＶマーカー
本組成物及び方法のＰＭＰは、植物ＥＶ（及び／又はその断片、部分若しくは抽出物を含む）を使用して生成されるものとしてＰＭＰを同定する多様なマーカーを有し得る。本明細書で使用される場合、用語「植物ＥＶマーカー」は、天然に植物に付随し、植物タンパク質、植物核酸、植物小分子、植物脂質又はそれらの組合せなど、インプランタで植物ＥＶ中若しくは上に組み込まれる要素を指す。植物ＥＶマーカーの例は、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７；Ｒａｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（２３）：１９５１４，２０１５；Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ．２１（７）：１３４５−１３５７，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４；及びＲｅｇｅｎｔｅ ｅｔ Ａｌ，Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６８（２０）：５４８５−５４９６，２０１７に見出すことができ；これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。植物ＥＶマーカーの更に別の例は付録に列挙されており、これらについては、本明細書において更に概説する。
一部の例では、植物ＥＶマーカーは、植物脂質を含み得る。ＰＭＰに見られ得る植物脂質マーカーの例としては、フィトステロール、カンペステロール、β−シトステロール、シグマステロール、アベナステロール、グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）、糖脂質（例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）若しくはジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、ＰＭＰは、ＧＩＰＣを含み得、これは、植物の主要スフィンゴ脂質クラスの代表であり、植物において最も豊富な膜脂質の１つである。他の植物ＥＶマーカーは、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物中に蓄積する脂質、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）又はホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ４Ｐ）を挙げることができる。
代わりに、植物ＥＶマーカーは、植物タンパク質を含み得る。一部の例では、タンパク質植物ＥＶマーカーは、植物により天然に産生される抗微生物タンパク質であり得、そうしたものとして、非生物的又は生物的ストレッサー（例えば、細菌若しくは真菌感染）に応答して植物が分泌する防御タンパク質がある。植物病原体防御タンパク質としては、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子結合タンパク質受容体タンパク質（ＳＮＡＲＥ）タンパク質（例えば、Ｓｙｎｔａｘｉｎ−１２１（ＳＹＰ１２１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１８７７８８．１若しくはＮＰ＿９７４２８８．１）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ１（ＰＥＮ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１））又はＡＢＣ輸送体Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ３（ＰＥＮ３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９１２８３．２）がある。植物ＥＶマーカーの他の例としては、植物中のＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質があり、こうしたものとして、師部タンパク質（例えば、師部タンパク質２−Ａ１（ＰＰ２−Ａ１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１９３７１９．１）、カルシウム依存性脂質結合タンパク質又はレクチン（例えば、ジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）関連レクチン、例えばヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）ジャカリン（Ｈｅｌｊａ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨＺ８６９７８．１）が挙げられる。例えば、ＲＮＡ結合タンパク質は、グリシンリッチＲＮＡ結合タンパク質−７（ＧＲＰ７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１７９７６０．１）であり得る。加えて、プラスモデスマータ機能を調節するタンパク質が、一部の例で、植物ＥＶ中に見られ得るが、こうしたものとして、Ｓｙｎａｐ−Ｔｏｔｇａｍｉｎ Ａ Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６５４９５．１）がある。一部の例では、植物ＥＶマーカーは、ホスホリパーゼＣ又はホスホリパーゼＤなど、脂質機序に関与するタンパク質を含み得る。一部の例では、植物タンパク質ＥＶマーカーは、植物の細胞トラフィッキングタンパク質である。植物ＥＶマーカーがタンパク質である特定の例では、タンパク質マーカーは、分泌タンパク質と典型的に結合するシグナルペプチドが欠失している場合がある。非古典的分泌タンパク質は、（ｉ）リーダ配列の欠失、（ｉｉ）ＥＲ又はゴルジ装置に特異的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の非存在、及び／又は（ｉｉｉ）古典的ＥＲ／ゴルジ依存性分泌経路を遮断するブレフェルディンＡによる影響を受けない分泌のような、いくつかの共通の特徴を有すると思われる。当業者は、一般に自由に利用可能な様々な手段（例えば、ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ Ｄａｔａｂａｓｅ；ＳＵＢＡ３（ＳＵＢｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ））を使用して、シグナル配列又はその欠失についてタンパク質を評価することができる。
植物ＥＶマーカーがタンパク質である例では、タンパク質は、植物ＥＶマーカー、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカーのいずれかと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。例えば、タンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＰＥＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６７４６２．１）と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
一部の例では、植物ＥＶマーカーは、植物によりコードされる核酸、例えば植物ＲＮＡ、植物ＤＮＡ又は植物ＰＮＡを含む。例えば、ＰＭＰは、植物によりコードされるｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。一部の例では、核酸は、本明細書で論じるように、植物においてＲＮＡの長距離輸送を促進するタンパク質に関連するものであり得る。一部の例では、核酸植物ＥＶマーカーは、宿主誘導遺伝子サイレンシング（ＨＩＧＳ）に関与するものであり得、これは、植物が、植物有害生物（例えば、真菌などの病原体）の外来転写物を抑制するプロセスである。例えば、核酸は、細菌又は真菌遺伝子を抑制するものであり得る。一部の例では、核酸は、真菌病原体（例えば、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ））中の遺伝子をターゲティングする、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６などのマイクロＲＮＡであり得る。一部の例では、タンパク質は、植物防御化合物の運搬に関与するもの、例えばグルコシノレート（ＧＳＬ）輸送及び代謝に関与するタンパク質であり得、こうしたものとして、グルコシノレートトランスポータ−１−１（ＧＴＲ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５６６８９６．２）、グルコシノレートトランスポータ−２（ＧＴＲ２；ＮＰ＿２０１０７４．１）又はエピチオ特異的修飾因子１（ＥＳＭ１；ＮＰ＿１８８０３７．１）が挙げられる。
植物ＥＶマーカーが核酸である例では、核酸は、植物ＥＶマーカー、例えば付録に列挙される植物ＥＶマーカーをコードするものなどと、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。例えば、核酸は、ｍｉＲ１５９又はｍｉＲ１６６と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。
一部の例では、植物ＥＶマーカーは、植物により産生される化合物を含む。例えば、化合物は、非生物的又は生物的ストレッサーに応答して産生される防御化合物、例えば二次代謝物などであり得る。ＰＭＰ中に見られ得るこうした二次代謝物の１つは、グルコシノレート（ＧＳＬ）であり、これは、主にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物に見られる窒素及びイオウ含有二次代謝物である。他の二次代謝物は、アレロケミカルを含み得る。
一部の例では、ＰＭＰは、典型的には植物によって産生されないが、一般に他の生物（例えば、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶのマーカー）に関連する特定のマーカー（例えば、脂質、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド）の欠失に基づいて植物ＥＶを使用して産生されるものとしても同定され得る。例えば、一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶ、細菌ＥＶ若しくは真菌ＥＶに典型的に見られる脂質を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、動物ＥＶに典型的な脂質（例えば、スフィンゴミエリン）を欠失している。一部の例では、ＰＭＰは、細菌ＥＶ又は細菌膜に典型的な脂質（例えば、ＬＰＳ）を含有しない。一部の例では、ＰＭＰは、真菌膜に典型的な脂質（例えば、エルゴステロール）を欠失している。
小分子（例えば、質量分光法、質量分析法）、脂質（例えば、質量分光法、質量分析法）、タンパク質（例えば、質量分光法、イムノブロッティング）又は核酸（例えば、ＰＣＲ分析）の同定を可能にする、当技術分野で公知の任意の手法を用いて、植物ＥＶマーカーを同定することができる。一部の例では、本明細書に記載のＰＭＰ組成物は、検出可能な量、例えば所定閾値量の本明細書に記載の植物ＥＶマーカーを含有する。
Ｄ．薬剤のローディング
ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、細胞透過性薬剤及び／又は異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）、異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））、例えば本明細書に記載されるものなどを含むように修飾することができる。ＰＭＰは、標的生物（例えば、標的動物、植物、細菌又は真菌）への薬剤の送達を可能にするための様々な手段により、例えば薬剤を封入すること、脂質二重層構造への構成成分の組込み又はＰＭＰの脂質二重層構造の表面との構成成分の（例えば共役による）結合により、こうした薬剤を担持又は結合することができる。一部の例では、異種機能性薬剤（例えば、細胞透過性薬剤）は、本明細書のセクションＩＢに記載した通りにＰＭＰ製剤に含められる。
異種機能性薬剤は、ＰＭＰと薬剤同士の結合を直接若しくは間接的に可能にする、当技術分野で公知の任意の方法により、ＰＭＰ中若しくは上に組み込むか又はロードすることができる。異種機能性薬剤は、インビボ法（例えば、インプランタ、例えば異種薬剤を含むトランスジェニック植物からのＰＭＰの産生により）若しくはインビトロで（例えば、組織培養若しくは細胞培養で）又はインビボ及びインビトロ法の両方によってＰＭＰに組み込むことができる。
ＰＭＰに、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））がインビボでロードされる場合、ＰＭＰは、インプランタでロードされているＥＶ又はその断片若しくは部分又はＥＶを含有する抽出物を使用して生成することができる。インプランタ方法は、ＥＶへのローディングのための異種機能性薬剤を発現するように遺伝的に改変されている植物における、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））の発現を含む。一部の例では、異種機能性薬剤は、植物に対して外来性である。代わりに、異種機能性薬剤は、植物中に自然に見られるものであり得るが、遺伝的に改変されていない植物において見られるレベルに対して上昇されたレベルで発現するように遺伝子操作することもできる。
一部の例では、ＰＭＰは、インビトロでロードを受けることができる。物質は、限定はされないが、（例えば、組織培養又は細胞培養中に）物理的、化学的及び／又は生物学的方法を使用して、ＰＭＰ上に又はＰＭＰ内にロードする（例えば、ＰＭＰによって封入する）ことができる。例えば、異種機能性薬剤は、電気穿孔、超音波処理、受動拡散、撹拌、脂質抽出又は押出しの１つ以上によってＰＭＰに導入することができる。ロードを受けたＰＭＰは、ＨＰＬＣ（例えば、小分子を評価するために）、免疫ブロット法（例えば、タンパク質を評価するために）；及び／又は定量ＰＣＲ（例えば、ヌクレオチドを評価するために）などの様々な方法を使用して、ロードされた薬剤の存在又はレベルを確認するために評価することができる。しかし、対象となる物質のＰＭＰへのローディングが、上に説明した方法に限定されないことが、当業者によって理解されるべきである。
一部の例では、異種機能性薬剤をＰＭＰに共役させることができ、この場合、異種機能性薬剤は、ＰＭＰに間接的又は直接結合若しくは連結される。例えば、１つ又は複数の異種機能性薬剤が、ＰＭＰの脂質二重層に直接連結される（例えば、共有結合若しくはイオン結合により）ように、１つ又は複数の異種機能性薬剤をＰＭＰに化学的連結させることができる。一部の例では、ＰＭＰに対する種々の異種機能性薬剤の共役は、最初に、好適な溶媒中で１つ又は複数の異種機能性薬剤を適切な架橋剤（例えば、Ｎ−エチルカルボ−ジイミド（「ＥＤＣ」）；これは、一般に、１級アミンとアミド結合のためのカルボキシル活性化剤として使用され、リン酸基とも反応する）と混合することによって達成することができる。異種機能性薬剤と架橋剤の結合を可能にするのに十分なインキュベーション時間後、架橋剤／異種機能性薬剤混合物をＰＭＰと合わせて、更なるインキュベーション時間後、ショ糖勾配（例えば、８、３０、４５及び６０％ショ糖勾配）に付して、ＰＭＰに共役した異種機能性薬剤から遊離異種機能性薬剤及び遊離ＰＭＰを分離することができる。混合物をショ糖勾配と合わせるステップ及び付随の遠心分離ステップの一環として、異種機能性薬剤に共役させたＰＭＰは、この時点で、ショ糖勾配中のバンドとして認められ、従って、次に、共役ＰＭＰを収集し、洗浄し、本明細書に記載の使用のために好適な溶液に溶解させることができる。
一部の例では、ＰＭＰは、ＰＭＰの送達前及び後に、例えば植物に対する異種機能性薬剤と安定的に結合される。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤が、例えば植物へのＰＭＰの送達後にＰＭＰから解離するようになるように、異種機能性薬剤と結合される。
ＰＭＰは、ロードを受けることができるか、又はＰＭＰ組成物は、特定の薬剤又は用途に応じて、様々な濃度の異種機能性薬剤と共に製剤化することができる。例えば、一部の例では、ＰＭＰは、ロードを受けるか、又はＰＭＰ組成物は、本明細書に開示されるＰＭＰ組成物が約０．００１、０．０１、０．１、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５（又は約０．００１と９５の間のあらゆる範囲）又はそれを超える重量％の異種機能性薬剤を含むように製剤化される。一部の例では、ＰＭＰは、ロードを受けるか、又はＰＭＰ組成物は、約９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１．０、０．１、０．０１、０．００１（又は約９５と０．００１の間のあらゆる範囲）又はそれ未満の重量％の異種機能性薬剤を含むように製剤化される。例えば、ＰＭＰ組成物は、約０．００１から約０．０１重量％、約０．０１から約０．１重量％、約０．１から約１重量％、約１から約５重量％又は約５から約１０重量％、約１０から約２０重量％の異種機能性薬剤を含むことができる。一部の例では、ＰＭＰは、ロードを受けることができるか、又はＰＭＰ組成物は、約１、５、１０、５０、１００、２００又は５００、１，０００、２，０００（又は約１と２，０００の間のあらゆる範囲）又はそれを超えるμｇ／ｍｌの異種機能性薬剤と共に製剤化される。本発明のＰＭＰは、ロードを受けることもできるか、又はＰＭＰ組成物は、約２，０００、１，０００、５００、２００、１００、５０、１０、５、１（又は約２，０００と１の間のあらゆる範囲）又はそれ未満のμｇ／ｍｌの異種機能性薬剤と共に製剤化することもできる。
一部の例では、ＰＭＰは、ロードを受けるか、又はＰＭＰ組成物は、本明細書に開示されるＰＭＰ組成物が、少なくとも０．００１重量％、少なくとも０．０１重量％、少なくとも０．１重量％、少なくとも１．０重量％、少なくとも２重量％、少なくとも３重量％、少なくとも４重量％、少なくとも５重量％、少なくとも６重量％、少なくとも７重量％、少なくとも８重量％、少なくとも９重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％又は少なくとも９５重量％の異種機能性薬剤を含むように製剤化される。一部の例では、ＰＭＰは、ロードを受けることができるか、又はＰＭＰ組成物は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、少なくとも１，０００μｇ／ｍｌ、少なくとも２，０００μｇ／ｍｌの異種機能性薬剤と共に製剤化することができる。
一部の例では、ＰＭＰ組成物は、ＰＭＰを、異種機能性薬剤を含む又は異種機能性薬剤からなる溶液に懸濁させることにより、例えば激しい混合によってＰＭＰを懸濁又は再懸濁させることにより、異種機能性薬剤と共に製剤化される。異種機能性薬剤（例えば、細胞透過性薬剤、例えば、酵素、洗剤、イオン性、フルオラス又は双性イオン性液体又は脂質）は、例えば、１％未満又は少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の溶液を含むことができる。
ＰＭＰにロードすることができる特定の異種機能性薬剤の例は、「異種機能性薬剤」とタイトルを付けたセクションで更に概説する。
Ｅ．ゼータ電位
ＰＭＰ組成物は、例えば、カーゴの非存在の場合、−３０ｍＶよりも大きい、カーゴの非存在の場合、−２０ｍＶよりも大きい、−５ｍＶよりも大きい、０ｍＶよりも大きい又は約３０ｍｖのゼータ電位を有することができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、カーゴの非存在の場合、負のゼータ電位、例えば、０ｍＶ未満、−１０ｍＶ未満、−２０ｍＶ未満、−３０ｍＶ未満、−４０ｍＶ未満又は−５０ｍＶ未満のゼータ電位を有する。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、カーゴの非存在の場合、正のゼータ電位、例えば、０ｍＶよりも大きい、１０ｍＶよりも大きい、２０ｍＶよりも大きい、３０ｍＶよりも大きい、４０ｍＶよりも大きい又は５０ｍＶよりも大きいゼータ電位を有する。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、約０のゼータ電位を有する。
ＰＭＰ組成物のゼータ電位は、当技術分野で公知のあらゆる方法を使用して測定することができる。ゼータ電位は、一般に、間接的に測定される。例えば、当技術分野で公知の方法及び技術、例えば、電気泳動移動度又は動的電気泳動移動度を使用して得られたデータから理論モデルを使用して算出される。電気泳動移動度は、典型的には、マイクロ電気泳動、電気泳動光散乱又は調整可能な抵抗パルス検出（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）を使用して測定される。電気泳動光散乱は、動的光散乱法に基づいている。典型的には、ゼータ電位は、光子相関分光法又は準弾性光散乱法としても公知の動的光散乱法（ＤＬＳ）測定から入手することができる。
Ｆ．製剤
ｉ．農業用製剤
適用、取扱い、輸送、保管及び有効な活性を容易にするために、ＰＭＰ（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰ）は、他の物質と共に製剤化することができる。ＰＭＰは、例えば、ベイト、濃縮エマルジョン、粉剤、乳剤、燻蒸剤、ゲル、顆粒、マイクロカプセル封入剤、種子処理剤、懸濁剤、サスポエマルジョン剤、錠剤、水溶性液体、水分散性顆粒若しくはドライフロワブル（ｄｒｙ ｆｌｏｗａｂｌｅ）、水和剤及び極微量溶液に製剤化することができる。製剤の種類に関する更に詳細な情報については、“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ”Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ｎ°２，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ ＣｒｏｐＬｉｆｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）を参照されたい。
ＰＭＰ組成物は、このような物質の濃縮製剤から調製される水性懸濁液又はエマルジョンとして適用することができる。こうした水溶性、水懸濁性又は乳化性製剤は、固体（通常、水和剤として知られる）、又は水分散性顆粒、又は通常、乳剤として知られる液体、又は水性懸濁液のいずれでもあり得る。圧縮して、水分散性顆粒を形成することができる水和剤は、ＰＭＰ組成物、担体及び界面活性剤の均質混合物を含む。担体は、通常、アタパルジャイト（ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ）クレイ、モンモリロナイト粘土、珪藻土又は精製ケイ酸から選択される。約０．５％〜約１０％の水和剤を含む、有効な界面活性剤としては、スルホン化リグニン、濃縮ナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホネート、アルキルベンゼンスルホネート、スルホン酸アルキル及びアルキルフェノールのエチレンオキシド付加物などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
乳剤は、水溶性溶媒又は水溶性有機溶媒と乳化剤との混合物のいずれかである担体に溶解させた液体１リットル当たり約５０〜約５００グラムといった好適な濃度のＰＭＰを含有し得る。有用な有機溶媒としては、芳香油、特にキシレン及び石油留分、特に石油の高沸点ナフタレン及びオレフィン部分、例えば重質芳香族ナフサが挙げられる。また、他の有機溶媒、例えばロジン誘導体を含むテルペン溶媒、シクロヘキサノンなどの脂肪族ケトン及び２−エトキシエタノールなどの錯体アルコールを使用し得る。乳剤に好適な乳化剤は、一般的な陰イオン及び非イオン界面活性剤から選択される。
水性懸濁液は、約５％〜約５０重量％の範囲の濃度で水性担体中に分散される水不溶性ＰＭＰ組成物の懸濁液を含む。懸濁液は、組成物を微粉砕し、これを、水及び界面活性剤を含む担体中に激しく混合することにより調製される。また、水性担体の密度及び粘性を増加するために、無機塩及び合成又は天然ゴムなどの材料を添加し得る。
ＰＭＰ組成物は、顆粒状組成物として適用され得、これは、特に土壌への適用に有用である。顆粒状組成物は、通常、粘土又は類似の物質を含む担体に分散させた約０．５％〜約１０重量％のＰＭＰ組成物を含有する。こうした組成物は、通常、好適な溶媒に製剤を溶解させた後、約０．５〜約３ｍｍの範囲の適切な粒径に事前に形成された顆粒状担体に適用することにより調製される。こうした組成物は、担体と化合物のダフ又はペーストを作製し、粉砕した後、乾燥させて、所望の顆粒粒径を得ることによって製剤化され得る。
本ＰＭＰ製剤を含有する粉剤は、好適な粉末状の担体、例えばカオリンクレイ、摩砕した火山岩などと一緒に粉末状のＰＭＰを均質混合することにより調製される。粉剤は、好適には、パケットの約１％〜約１０％を占め得る。粉剤は、ダストブロワー機で、種子粉衣又は葉適用として適用することができる。
同様に、好適な有機溶媒、通常、農業化学で広く使用されている石油、例えばスプレーオイル中の溶液の形態の本製剤を適用するのも実用的である。
ＰＭＰは、エアゾール組成物の形態で適用することもできる。こうした組成物では、パケットを、圧力発生噴霧剤混合物である担体に溶解又は分散させる。エアゾール組成物を容器内にパッケージし、この容器から霧状化弁を介して混合物を投与する。
別の実施形態は、水中油形エマルジョンであり、ここで、エマルジョンは、油滴を含み、これらは各々、ラメラ液晶コーティングを備え、水相に分散されており、ここで、各油滴は、農業的に有効な少なくとも１つの化合物を含み、（１）少なくとも１つの非イオン親油性界面活性剤、（２）少なくとも１つの非イオン親水性界面活性剤、及び（３）少なくとも１つのイオン界面活性剤を含むモノラメラ又はオリゴラメラ層で個別にコーティングされており、この場合、油滴は、８００ナノメートル未満の平均粒径を有する。上記実施形態に関する更に詳細な情報は、２００７年２月１日に公開された米国特許出願公開第２００７００２７０３４号明細書に開示されている。使用しやすいように、この実施形態は、「ＯＩＷＥ」と呼ぶ。
加えて、一般に、上に開示した分子を製剤に使用する場合、こうした製剤は、他の成分も含有することができる。これらの成分として、限定されないが、（これは、非排他的且つ非相互排他的リストである）湿潤剤、展着剤、粘着剤、浸透剤、緩衝剤、金属イオン封鎖剤、ドリフト制御添加剤、適合性薬剤、消泡剤、洗浄剤及び乳化剤が挙げられる。いくつかの成分を以降に記載する。
湿潤剤は、液体に添加されると、液体と、それが展着される表面との間の界面張力を低減することにより、液体の展着又は浸透力を高める物質である。湿潤剤は、農業化学製剤の２つの主要な機能：処理及び製造工程中、水による粉末の湿潤速度を高めて、可溶性液体のための濃縮物又は懸濁剤を製造し；スプレータンク中で水と製品の混合工程中、水和剤の湿潤時間を短縮して、水分散性顆粒への水の浸透を改善するために使用される。水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒製剤に使用される湿潤剤の例は、ラウリル硫酸ナトリウム；ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム；アルキルフェノールエトキシレート；及び脂肪族アルコールエトキシレートである。
分散剤は、粒子の表面に吸着して、粒子の分散状態を保存することを促進すると共に、粒子が再凝集することを防ぐ物質である。分散剤は、製造工程中の分散及び懸濁を促進するため、且つスプレータンク内の水中に粒子を確実に再分散させるために農薬製剤に添加される。分散剤は、水和剤、懸濁剤及び水分散性顆粒剤に広く使用されている。分散剤として使用される界面活性剤は、粒子表面に強力に吸着して、粒子の再凝集に対する荷電又は立体障害をもたらす能力がある。最も一般的に使用される界面活性剤は、陰イオン、非イオン又はこれら２種類の混合物である。水和剤の場合、最も一般的な分散剤は、リグノスルホン酸ナトリウムである。懸濁剤の場合、高分子電解質、例えばナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物を使用して、非常に優れた吸着及び安定化が達成される。トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステルも使用される。アルキルアリールエチレンオキシド縮合物及びＥＯ−ＰＯブロックコポリマーなどの非イオン界面活性剤は、懸濁剤濃縮物として陰イオン界面活性剤と組み合わせる場合もある。近年、新たなタイプの非常に高分子量のポリマー界面活性剤が分散剤として開発されている。これらは、非常に長い疎水性「骨格」と、「コーム」界面活性剤の「歯」を形成する多数のエチレンオキシド鎖を有する。これらの高分子量ポリマーは、疎水性骨格が、粒子表面に多くの固定点を有することから、懸濁剤に対して非常に良好な長期安定性を付与することができる。農薬製剤に使用される分散剤の例は、リグノスルホン酸ナトリウム；ナトリウムナフタレンスルホン酸ホルムアルデヒド縮合物；トリスチリルフェノールエトキシレートリン酸エステル；脂肪族アルコールエトキシレート；アルキルエトキシレート；ＥＯ−ＰＯ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；及びグラフトコポリマーである。
乳化剤は、別の液相中の１つの液相の液滴の懸濁を安定化させる物質である。乳化剤がなければ、２つの液体は、２つの非混和性液相中に分離するであろう。最も一般的に使用される乳化剤ブレンドは、１２以上のエチレンオキシド単位を有するアルキルフェノール又は脂肪族アルコールと、ドデシルベンゼンスルホン酸の油溶性カルシウム塩を含有する。８から１８までの親水性−親油性バランス（「ＨＬＢ」）値の範囲が、通常、優れた安定エマルジョンを提供する。エマルジョンの安定性は、時として、少量のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー界面活性剤の添加により改善することができる。
可溶化剤は、臨界ミセル濃度を超える濃度のミセル水溶液を形成する界面活性剤である。そのため、ミセルは、ミセルの疎水性部分内で水不溶性材料を溶解又は可溶化させることができる。可溶化のために通常使用される界面活性剤のタイプは、非イオン界面活性剤、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノオレートエトキシレート及びオレイン酸メチルエステルである。
標的に対するＰＭＰ組成物の生物学的性能を改善するために、界面活性剤が、単独で又はスプレータンクミックスへの補助剤としての鉱油若しくは植物油などの他の添加剤と一緒に使用される場合もある。バイオエンハンスメントのために使用される界面活性剤のタイプは、一般に、ＰＭＰ組成物の性質及び作用モードに応じて変わる。しかし、これらは、多くの場合、アルキルエトキシレート；直鎖脂肪族アルコールエトキシレート；脂肪族アミンエトキシレートといった非イオン界面活性剤である。
農薬製剤中の担体又は希釈剤は、必要な強度の製剤を提供するためにＰＭＰ組成物に添加される材料である。担体は、通常、高い吸収力を備える材料であるのに対し、希釈剤は、通常、低い吸収力を備える材料である。担体及び希釈剤は、粉剤、水和剤、顆粒及び水分散性顆粒の製剤に使用される。
有機溶媒は、主として、乳剤、水中油形エマルジョン、サスポエマルション及び極少量製剤、また程度は低いが顆粒剤の製剤に使用される。溶媒の混合物が使用される場合もある。溶媒の第１主要グループは、ケロセン又は精製パラフィンなどの脂肪族パラフィン油である。第２の主要グループ（及び最も一般的）は、キシレン及びＣ９及びＣ１０芳香族溶媒のより高分子量の画分などの芳香族溶媒を含む。塩素化炭化水素は、製剤を水に乳化する場合にＰＭＰ組成物の結晶化を防止するための共溶媒として有用である。溶解力を高めるための共溶媒として、アルコールが使用される場合もある。他の溶媒としては、植物油、種子油及び植物及び種子油のエステルが挙げられ得る。
増粘剤又はゲル化剤は、主として、液体のレオロジー又は流動性を変化させるため、且つ分散した粒子又は液滴の分離及び沈殿を防止するために、懸濁剤、エマルジョン及びサスポエマルジョンの製剤に使用される。増粘剤、ゲル化剤及び沈殿防止剤は、概して２つのカテゴリー、即ち水不溶性粒子及び水溶性ポリマーに属する。粘土及びシリカを用いて、懸濁製剤を製造することが可能である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、モンモリロナイト粘土、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム及びアタプルガイトが挙げられる。水溶性多糖が、増粘−ゲル化剤として長年使用されている。最も一般的に使用されている多糖のタイプは、種子及び海藻の天然抽出物であるか又はセルロースの合成誘導体である。これらのタイプの材料の例として、限定されないが、グアーガム；ローカストビーンガム；カラギーナン；アルギン酸塩；メチルセルロース；ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ）；ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が挙げられる。他のタイプの沈殿防止剤は、加工デンプン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール及びポリエチレンオキシドを基材とする。別の優れた沈殿防止剤は、キサンタンガムである。
微生物は、製剤化した製品の腐敗を引き起こし得る。そのため、微生物の作用を排除又は抑制するために、防腐剤が用いられる。こうした薬剤の例として、限定されないが、以下のものが挙げられる：プロピオン酸及びその塩；ソルビン酸及びそのナトリウム又はカリウム塩；安息香酸及びその塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩；ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル；並びに１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）。
界面活性剤の存在は、往々にして、生成及びスプレータンクからの適用での混合工程中に、水性製剤を泡立たせる。泡立つ傾向を軽減するために、生産段階中又は瓶詰め前に消泡剤を添加することが多い。一般に、２種類の消泡剤、即ちシリコーン及び非シリコーンがある。シリコーンは、通常、ジメチルポリシロキサンの水性エマルジョンであり、非シリコーン消泡剤は、水不溶性油、例えばオクタノール及びノナノール又はシリカである。いずれの場合にも、消泡剤の機能は、界面活性剤を空気−水界面から移すことである。
「グリーン（Ｇｒｅｅｎ）剤」（例えば、助剤、界面活性剤、溶媒）は、作物保護製剤の環境フットプリント全体を低減することができる。グリーン剤は、生分解性であり、一般に、天然及び／又は持続可能な供給源、例えば植物及び動物源由来である。具体的な例は、植物油、種子油及びそれらのエステル、更にはアルコキシル化アルキルフェノールポリグルコシドである。
一部の例では、ＰＭＰをフリーズドライ又は凍結乾燥することができる。米国特許第４，３１１，７１２号明細書を参照されたい。ＰＭＰは、後に水又は別の液体と接触させて再構成することができる。凍結乾燥若しくは再構成したＰＭＰに、他の成分、例えば他の異種機能性薬剤、農業的に許容可能な担体又は本明細書に記載の製剤に従う他の物質を添加することができる。
本組成物の他の任意の特徴は、ＵＶ及び／又は酸性条件からＰＭＰ組成物を保護する担体又は送達ビヒクルを含む。一部の例では、送達ビヒクルは、ｐＨバッファーを含有する。一部の例では、組成物は、約４．５〜約９．０の範囲内のｐＨを有するように製剤化され、例えば約５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５又は約６．５〜約７．０のいずれか１つのｐＨ範囲を含む。
農薬製剤に関する更に詳細な情報については、以下を参照されたい：“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８ ｂｙ Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。また、以下も参照されたい：“Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”ｂｙ Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｒｙ，Ｉ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｉ．Ｉｓｈａａｙａ，ａｎｄ Ｒ．Ｐｅｒｒｙ，ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９８ ｂｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。
ｉｉ．医薬製剤
本明細書に記載される修飾ＰＭＰは、例えば動物（例えば、ヒト）への投与のために、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は賦形剤と共に、動物（例えば、ヒト）に投与することができる。投与様式及び投薬量に応じて、本明細書に記載される方法の医薬組成物は、容易な送達を可能にするのに適した医薬組成物に製剤化されることとなる。単一用量は、必要に応じて単位用量形態であり得る。
ＰＭＰ組成物は、例えば、例えば、動物への経口投与、静脈内投与（例えば、注射若しくは注入）又は皮下投与のために製剤化することができる。注射用製剤については、様々な有効な薬剤担体が、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．，（２０１２）及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，（２０１４）を参照のこと）。
本組成物中の薬学的に許容可能な担体及び賦形剤は、用いられる投薬量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性である。許容可能な担体及び賦形剤としては、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ及びＴＡＥなど、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニンなど、保存剤、例えば塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール及び塩化ベンザルコニウムなど、タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン及び免疫グロブリンなど、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、ヒスチジン及びリジンなど、並びに炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース及びソルビトールなどが含まれ得る。組成物は、従来の医薬的慣例に従って製剤化することができる。製剤中の化合物の濃度は、投与されることとなる活性な薬剤（例えば、ＰＭＰ）の投薬量及び投与経路を含めたいくつかの因子に応じて変動することとなる。
動物への経口投与については、ＰＭＰ組成物は、経口用製剤の形態で調製することができる。経口使用のための製剤としては、非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物中に活性成分を含有する、錠剤、カプレット、カプセル、シロップ又は経口用液体剤形が含まれ得る。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤又は充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含めたデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム又はリン酸ナトリウム）；造粒剤及び崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含めたセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含めたデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩又はアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール）；並びに滑沢剤、流動化剤及び抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素添加植物油又はタルク）であり得る。他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色料、着香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。経口使用のための製剤は、咀嚼錠、非咀嚼錠、カプレット、カプセルとしての（例えば、活性成分が不活性な固体希釈剤と混合されるゼラチンカプセルとしての又は活性成分が水又は油媒体と混合されるソフトゼラチンカプセルとしての）単位剤形で提供することもできる。本明細書に開示される組成物には、即時放出、持続放出又は遅延放出製剤も更に含まれ得る。
動物への非経口投与については、ＰＭＰ組成物は、液体の溶液又は懸濁液の形態で製剤化し、非経口経路（例えば、皮下、静脈内又は筋肉内）によって投与することができる。医薬組成物は、注射又は注入のために製剤化することができる。非経口投与のための医薬組成物は、賦形剤として、無菌溶液又はあらゆる薬学的に許容可能な液体を使用して製剤化することができる。薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定はされないが、滅菌水、生理食塩水又は細胞培養培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変型イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が含まれる。製剤方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ（ｅｄ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（２ｎｄ ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００９）を参照のこと。
ＩＩ．異種機能性薬剤
本明細書で製造されるＰＭＰは、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））などの異種機能性薬剤を更に含むことができる。例えば、ＰＭＰは、異種機能性薬剤を封入することができる。代わりに、異種機能性薬剤は、ＰＭＰの表面に埋め込む又は結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰは、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる異種機能性薬剤を含む。異種機能性薬剤は、製造されたＰＭＰに薬剤を導入するのに有効な製造プロセス中の任意のステップで添加することができる。
特定の例では、異種機能性薬剤（例えば、異種農業用薬剤（例えば、農薬用薬剤、施肥剤、除草剤、植物改質剤、異種核酸、異種ポリペプチド又は異種小分子）又は異種治療薬（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤））は、修飾することができる。例えば、修飾は、化学的修飾、例えば、マーカー、例えば、蛍光マーカー又は放射性マーカーへの結合であり得る。他の例では、修飾は、薬剤、例えば、脂質、グリカン、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、カチオン部分の、安定性、送達、ターゲティング、バイオアベイラビリティ又は半減期を増強する部分への結合又は動作可能な連結を含むことができる。
本明細書で製造されたＰＭＰにロードすることができる異種機能性薬剤の例を、下に概説する。
Ａ．異種農業用薬剤
本明細書で製造されたＰＭＰは、異種農業用薬剤（例えば、植物又は植物と関連する生物に作用し、且つＰＭＰにロードすることができる薬剤）、例えば農薬用薬剤、除草剤、施肥剤又は植物改質剤などを含むことができる。
例えば、一部の例では、ＰＭＰは、農薬用薬剤を含むことができる。農薬用薬剤は、抗真菌剤、抗菌剤、殺虫薬剤、軟体動物駆除薬剤、殺線虫薬剤、殺ウイルス剤又はその組み合わせであり得る。農薬用薬剤は、当技術分野で周知のものなどの化学薬剤であり得る。代わりに又は更に、農薬用薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド又は小分子であり得る。農薬用薬剤は、様々な植物有害生物の適応度を減少させることができる薬剤であり得るか、又は１種以上の特定の標的植物有害生物（例えば、特定の種又は属の植物有害生物）を標的にするものであり得る。
一部の例では、ＰＭＰは、１種以上の異種施肥剤を含むことができる。異種施肥剤の例としては、当技術分野で周知のものなどの植物栄養素又は植物成長調節因子が挙げられる。代わりに又は更に、施肥剤は、植物共生体の適応度を増加させることができるペプチド、ポリペプチド、核酸又はポリヌクレオチドであり得る。施肥剤は、様々な植物又は植物共生体の適応度を増加させることができる薬剤であり得るか、又は１種以上の特定の標的植物又は植物共生体（例えば、特定の種又は属の植物又は植物共生体）を標的にするものであり得る。
他の例では、ＰＭＰは、１種以上の異種植物改質剤を含むことができる。一部の例では、植物改質剤は、ペプチド又は核酸を含むことができる。
ｉ．抗菌剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗菌剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗菌剤を含む。例えば、抗菌剤は、細菌性植物有害生物（例えば、細菌性植物病原体）の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される抗生物質を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的有害生物の内部又は表面の抗生物質濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的有害生物の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的有害生物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される抗菌剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「抗菌剤」は、植物病原細菌などの細菌を死滅させるか、又はその成長、増殖、分裂、生殖若しくは拡大を阻害する材料を指し、殺菌性薬剤（例えば、消毒用化合物、防腐性化合物若しくは抗生物質）又は静菌性薬剤（例えば、化合物若しくは抗生物質）が含まれる。殺菌性抗生物質は、細菌を死滅させるが、静菌性抗生物質は、その成長又は生殖を遅くするにすぎない。
殺菌剤には、消毒剤、防腐剤又は抗生物質が含まれ得る。最もよく使用される消毒剤は、活性塩素（即ち次亜塩素酸塩（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）、クロラミン、ジクロロイソシアヌル酸塩及びトリクロロイソシアヌル酸塩、液体塩素、二酸化塩素など）、活性酸素（過酸化物、例えば過酢酸、過硫酸カリウム、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム及び尿素過水和物、ヨウ素（ヨードポビドン（ポビドンヨウ化物、Ｂｅｔａｄｉｎｅ）、ルゴール溶液、ヨードチンキ、ヨウ素化非イオン性界面活性剤）、濃縮アルコール（主に、エタノール、ｎ−プロパノールとも呼ばれる１−プロパノール及びイソプロパノールと呼ばれる２−プロパノール並びにそれらの混合物；更に、２−フェノキシエタノール並びに１−フェノキシプロパノール及び２−フェノキシプロパノールが使用される）、フェノール物質（フェノール（石炭酸とも呼ばれる）、クレゾール（液体カリウムセッケンと組み合わせてＬｙｓｏｌｅと呼ばれる）、ハロゲン化（塩素化、臭素化）フェノール、例えばヘキサクロロフェン、トリクロサン、トリクロロフェノール、トリブロモフェノール、ペンタクロロフェノール、ジブロモール（Ｄｉｂｒｏｍｏｌ）及びそれらの塩など）、陽イオン性界面活性剤、例えばいくつかの四級アンモニウムカチオン（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化又は塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム）及びその他のものなど、非四級化合物、例えばクロルヘキシジン、グルコプロタミン、二塩酸オクテニジンなど）、強力な酸化剤、例えばオゾン及び過マンガン酸溶液；重金属及びその塩、例えばコロイド性の銀、硝酸銀、塩化水銀、フェニル水銀塩、硫酸銅、酸化−塩化銅、水酸化銅、オクタン酸銅、オキシ塩化硫酸銅、硫酸銅、硫酸銅五水和物などを含むことができる。重金属及びその塩は、最も毒性が高く、環境に有害な殺菌剤であるため、その使用は、強く抑制又は取り止められ；更に、濃強酸（リン酸、硝酸、硫酸、アミド硫酸、トルエンスルホン酸）及びアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム）も適切である。
防腐剤（即ちヒト又は動物の身体、皮膚、粘膜、創傷などに使用することができる殺菌剤）として、上に挙げた消毒剤のいくつかを、適切な条件（主に、濃度、ｐＨ、温度及びヒト／動物に対する毒性）下で使用することができる。その中で重要なものは、適切に希釈された塩素調製物（即ちデーキン液、ｐＨ７〜８に調節された０．５％次亜塩素酸ナトリウム若しくはカリウム溶液又はベンゼンスルホクロラミドナトリウムの０．５〜１％溶液（クロラミンＢ））、いくつかのヨウ素調製物、例えば様々なガレヌス製剤（軟膏、溶液、創傷プラスター）中のヨードポビドン、過去にはルゴール液、尿素過水和物溶液及びｐＨ緩衝０．１〜０．２５％過酢酸溶液としての過酸化物、主に皮膚消毒のために使用される防腐性添加物を含む又は含まないアルコール、ソルビン酸、安息香酸、乳酸及びサリチル酸などの弱有機酸、一部のフェノール化合物、例えばヘキサクロロフェン、トリクロサン及びジブロモールなど、並びに陽イオン活性化合物、例えば０．０５〜０．５％ベンザルコニウム、０．５〜４％クロルヘキシジン、０．１〜２％オクテニジン溶液である。
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗生物質を含むことができる。当技術分野で公知のあらゆる抗生物質を使用することができる。抗生物質は、一般に、その作用機序、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
本明細書に記載される抗生物質は、細菌のあらゆる機能又は成長プロセスを標的にすることができ、静菌性（例えば、細菌成長を遅くする若しくは予防する）又は殺菌性（例えば、細菌を死滅させる）であり得る。一部の例では、抗生物質は、殺菌性抗生物質である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、細菌の細胞壁を標的にするもの（例えば、ペニシリン及びセファロスポリン）；細胞膜を標的にするもの（例えば、ポリミキシン）；又は基本的な細菌酵素を阻害するもの（例えば、リファマイシン、リピアルマイシン（ｌｉｐｉａｒｍｙｃｉｎ）、キノロン及びスルホンアミド）である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、アミノグリコシド（例えば、カスガマイシン）である。一部の例では、抗生物質は、静菌性抗生物質である。一部の例では、静菌性抗生物質は、タンパク質合成を標的にする（例えば、マクロライド、リンコサミド及びテトラサイクリン）。本明細書で使用することができる追加のクラスの抗生物質としては、環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）又はリピアルマイシン（フィダキソマイシンなど）が挙げられる。抗生物質の例としては、リファンピシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン及びポリミキシンＢが挙げられる。本明細書に記載される抗生物質は、あらゆるレベルの標的特異性（例えば、狭い又は広いスペクトル）を有することができる。一部の例では、抗生物質は、狭いスペクトルの抗生物質であり、従ってグラム陰性菌又はグラム陽性菌などの特定の種類の細菌を標的にする。代わりに、抗生物質は、幅広い細菌を標的にするする広スペクトルの抗生物質であり得る。
抗生物質の他の非限定的な例は、表１において参照される。当業者は、組成物中の各抗生物質の好適な濃度が、有効性、抗生物質の安定性、個別の抗生物質の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
Figure 2021533794
ｉｉ．抗真菌剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗真菌剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗真菌剤を含む。例えば、抗真菌剤は、真菌性植物有害生物の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される抗真菌薬を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的真菌の内部又は表面の抗生物質濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的真菌の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的真菌有害生物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される抗真菌薬を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「殺真菌剤」又は「抗真菌剤」は、植物病原真菌などの真菌を死滅させるか、又はその成長、増殖、分裂、生殖又は拡大を阻害する物質を指す。多くの異なる種類の抗真菌剤が商業的に製造されている。抗真菌剤の非限定的な例として、アゾキシストロビン、マンコゼブ、プロチオコナゾール、フォルペット、テブコナゾール、ジフェノコナゾール、カプタン、ブピリメート又はホセチル−Ａｌが挙げられる。更なる例示的な殺真菌剤としては、限定はされないが、ストロビルリン、アゾキシストロビン、ジモキシストロビン、エネストロブリン、フルオキサストロビン、クレソキシム−メチル、メトミノストロビン、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、トリフロキシストロビン、オリサストロビン、カルボキサミド、カルボキサニリド、ベナラキシル、ベナラキシル−Ｍ、ベノダニル、カルボキシン、メベニル、メプロニル、フェンフラン、フェンヘキサミド、フルトラニル、フララキシル、フルカルバニル、フラメトピル、メタラキシル、メタラキシル−Ｍ（メフェノキサム）、メトフロキサム、メトスルホバクス、オフラセ、オキサジキシル、オキシカルボキシン、ペンチオピラド、ピラカルボリド、サリチルアニリド、テクロフタラム、チフルザミド、チアジニル、Ｎ−ビフェニルアミド、ビキサフェン、ボスカリド、カルボン酸モルホリド、ジメトモルフ、フルモルフ、ベンズアミド、フルメトベル、フルオピコリド（ピコベンズアミド）、ゾキサミド、カルボキサミド、カルプロパミド、ジクロシメット、マンジプロパミド、シルチオファム、アゾール、トリアゾール、ビテタノール、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、エニルコナゾール、エポキシコナゾール、フェンブコナゾール、フルシラゾール、フルキンコナゾール、フルトリアフォール、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、シメコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリアジメノール、トリアジメホン、トリチコナゾール、イミダゾール、シアゾファミド、イマザリル、ペフラゾエート、プロクロラズ、トリフルミゾール、ベンズイミダゾール、ベノミル、カルベンダジム、フベリダゾール、チアベンダゾール、エタボキサム、エトリジアゾール、ヒメキサゾール、窒素含有ヘテロシクリル化合物、ピリジン、フアジナム、ピリフェノックス、ピリミジン、ブピリメート、シプロジニル、フェリムゾン、フェナリモル、メパニピリム、ヌアリモル、ピリメタニル、ピペラジン、トリホリン、ピロール、フルジオキソニル、フェンピクロニル、モルホリン、アルジモルフ、ドデモルフ、フェンプロピモルフ、トリデモルフ、ジカルボキシミド、イプロジオン、プロシミドン、ビンクロゾリン、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アニラジン、キャプタン、カプタホール、ダゾメット、ジクロメジン、フェノキサニル、フォルペット、フェンプロピジン、ファモキサドン、フェナミドン、オクチリノン、プロベナゾール、プロキナジド、ピロキロン、キノキシフェン、トリシクラゾール、カルバメート、ジチオカルバメート、ファーバム、マンコゼブ、マネブ、メチラム、メタム、プロピネブ、チラム、ジネブ、ジラム、ジエトフェンカルブ、フルベンチアバリカルブ、イプロバリカルブ、プロパモカルブ、グアニジン、ドジン、イミノクタジン、グアザチン、カスガマイシン、ポリオキシン、ストレプトマイシン、バリダマイシンＡ、有機金属化合物、フェンチン塩、硫黄含有ヘテロシクリル化合物、イソプロチオラン、ジチアノン、有機リン化合物、エディフェンホス、ホセチル、ホセチル−アルミニウム、イプロベンホス、ピラゾホス、トルクロホス−メチル、有機塩素化合物、チオファネート−メチル、クロロタロニル、ジクロフルアニド、トリルフルアニド、フルスルファミド、フタリド、ヘキサクロロベンゼン、ペンシクロン、キントゼン、ニトロフェニル誘導体、ビナパクリル、ジノカップ、ジノブトン、スピロキサミン、シフルフェナミド、シモキサニル、メトラフェノン、Ｎ−２−シアノフェニル−３，４−ジクロロイソチアゾール−５−カルボキサミド（イソチアニル）、Ｎ−（３’，４’，５’−トリフルオロビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、３−［５−（４−クロロフェニル）−２，３−ジメチルイソキサゾリジン−３−イル］−ピリジン、Ｎ−（３’，４’−ジクロロ−４−フルオロビフェニル−２−イル）−３−ジフルオロメチル−１−メチルピラゾール−４−カルボキサミド、５−クロロ−７−（４−メチルピペリジン−１−イル）−６−（２，４，６−トリフルオロフェニル）−［１，２，４］トリア−ゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、２−ブトキシ−６−ヨード−３−プロピルクロメン−４−オン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（３−ブロモ−６−フルオロ−２−メチルインドール−１−スルホニル）−［１，２，４］トリアゾ−ル−１−スルホンアミド、メチル−（２−クロロ−５−［１−（３−メチルベンジルオキシイミノ）−エチル］ベンジル）カルバメート、カルボン酸メチル−（２−クロロ−５−［１−（６−メチルピリジン−２−イルメトキシ−イミノ）エチル］ベンジル）、３−（４−クロロフェニル）−３−（２−イソプロポキシカルボニルアミノ−３−メチルブチリル−アミノ）プロピオン酸メチル、Ｎ−（１−（１−（４−シアノフェニル）エタンスルホニル）ブト−２−イル）カルバミン酸４−フルオロフェニル、Ｎ−（２−（４−［３−（４−クロロフェニル）プロプ−２−イニルオキシ］−３−メトキシフェニル）エチル）−２−メタン−スルホニルアミノ−３−メチルブチルアミド、Ｎ−（２−（４−［３−（４−クロロフェニル）プロプ−２−イニルオキシ］−３−メトキシフェニル）エチル）−２−エタン−スルホニルアミノ−３−メチルブチルアミド、Ｎ−（４’−ブロモビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチルチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチルチアゾール−５−カルボキサミド、Ｎ−（４’−クロロ−３’−フルオロビフェニル−２−イル）−４−ジフルオロメチル−２−メチル−チアゾール−５−カルボキサミド又は２−（オルト−（（２，５−ジメチルフェニルオキシ−メチレン）フェニル）−３−メトキシアクリル酸メチルが挙げられる。当業者は、組成物中の各抗真菌薬の好適な濃度が、有効性、抗真菌薬の安定性、個別の抗真菌薬の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｉｉｉ．殺虫剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、殺虫剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる殺虫薬剤を含む。例えば、殺虫剤は、昆虫の植物有害生物の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される殺虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的昆虫の内部又は表面の殺虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的昆虫の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的昆虫有害生物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される殺虫剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「殺虫剤」又は「殺虫薬剤」は、農業昆虫有害生物などの昆虫を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺虫剤の非限定的な例を、表２に示す。好適な殺虫剤の追加の非限定的な例としては、生物剤、ホルモン又はフェロモン、例えばアザジラクチン、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ボーベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）種、コドレモン、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ）種、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）種、チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）及びバーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種など、並びに燻蒸剤などの作用機構が不明若しくは特定されていない活性な化合物（リン化アルミニウム、臭化メチル及びフッ化スルフリルなど）及び選択的摂食阻害剤（氷晶石、フロニカミド及びピメトロジンなど）が挙げられる。当業者は、組成物中の各殺虫剤の好適な濃度が、有効性、殺虫剤の安定性、個別の殺虫剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
Figure 2021533794
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ｉｖ．殺線虫剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、殺線虫剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる殺線虫剤を含む。例えば、殺線虫剤は、線虫の植物有害生物の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される殺線虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的線虫の内部又は表面の殺線虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的線虫の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的線虫有害生物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される殺線虫剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「殺線虫剤」又は「殺線虫薬剤」は、農業線虫有害生物などの線虫を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺線虫剤の非限定的な例を、表３に示す。当業者は、組成物中の各殺線虫剤の好適な濃度が、有効性、殺線虫剤の安定性、個別の殺線虫剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
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ｖ．軟体動物駆除剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、軟体動物駆除剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる軟体動物駆除剤を含む。例えば、軟体動物駆除剤は、軟体動物の植物有害生物の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される軟体動物駆除剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的軟体動物の内部又は表面の軟体動物駆除剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的軟体動物の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的軟体動物有害生物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される軟体動物駆除剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「軟体動物駆除剤」又は「軟体動物駆除薬剤」は、農業有害軟体動物などの軟体動物を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。金属塩、例えばリン酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸アルミニウム及びＥＤＴＡ鉄ナトリウム（［３］、［４］）など、メタアルデヒド、メチオカルブ又はアセチルコリンステラーゼ阻害剤を含めた、いくつかの化学物質を、軟体動物駆除剤として用いることができる。当業者は、組成物中の各軟体動物駆除剤の好適な濃度が、有効性、軟体動物駆除剤の安定性、個別の軟体動物駆除剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｖｉ．殺ウイルス剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、殺ウイルス剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる殺ウイルス剤を含む。例えば、殺ウイルス剤は、ウイルス性植物病原体の適応度を減少させる（例えば、減少させる又は排除する）ことができる。本明細書に記載される殺ウイルス剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）殺ウイルス剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的ウイルスを減少させる又は排除するのに十分な量且つ時間、標的ウイルス又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される殺ウイルス剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「殺ウイルス剤」又は「抗ウイルス剤」は、農業ウイルス病原体などのウイルスを死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖、発達若しくは拡大を阻害する物質を指す。化学物質又は生物学的薬剤（例えば、核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ）を含めた、いくつかの薬剤を、殺ウイルス剤として用いることができる。当業者は、組成物中の各殺ウイルス剤の好適な濃度が、有効性、殺ウイルス剤の安定性、個別の殺ウイルス剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｖｉｉ．除草薬
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、１種以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）除草薬を更に含むことができる。例えば、除草薬は、雑草の適応度を減少させる（例えば、減少させる又は排除する）ことができる。本明細書に記載される除草薬を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）植物上の除草薬濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）雑草の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的雑草と接触させることができる。本明細書に記載される除草薬を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「除草薬」は、雑草を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。グルホシネート、プロパキザホップ、メタミトロン、メタザクロル、ペンジメタリン、フルフェナセト、ジフルフェニカン、クロマゾン、ニコスルフロン、メソトリオン、ピノキサデン、スルコトリオン、プロスルホカルブ、スルフェントラゾン、ビフェノクス、キンメラック、トリアレート、テルブチラジン、アトラジン、オキシフルオルフェン、ジウロン、トリフルラリン又はクロロトルロンを含めた、いくつかの薬剤を、除草薬として用いることができる。除草薬の更なる例としては、限定はされないが、安息香酸除草剤、例えばジカンバエステルなど、フェノキシアルカン酸除草剤、例えば２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ及び２，４−ＤＢエステルなど、アリールオキシフェノキシプロピオン酸除草剤、例えばクロジナホップ、シハロホップ、フェノキサプロプ、フルアジホップ、ハロキシホップ及びキザロホップエステルなど、ピリジンカルボン酸除草剤、例えばアミノピラリド、ピクロラム及びクロピラリドエステルなど、ピリミジンカルボン酸除草剤、例えばアミノシクロピラクロルエステルなど、ピリジルオキシアルカン酸除草剤、例えばフルオロキシピル及びトリクロピルエステルなど、及びヒドロキシベンゾニトリル除草剤、例えばブロモキシニル及びアイオキシニルエステルなど、アリールピリジンカルボン酸及びそれぞれその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，３１４，８４９号明細書、米国特許第７，３００，９０７号明細書及び米国特許第７，６４２，２２０号明細書に開示されている一般構造のアリールピリミジンカルボン酸のエステルが挙げられる。ある種の実施形態では、除草薬は、２，４−Ｄ、２，４−ＤＢ、アセトクロル、アシフルオルフェン、アラクロル、アメトリン、アミトロール、アスラム、アトラジン、アザフェニジン、ベネフィン、ベンスルフロン、ベンスリド、ベンタゾン、ブロマシル、ブロモキシニル、ブチレート、カルフェントラゾン、クロラムベン、クロリムロン、クロルプロハム、クロルスルフロン、クレトジム、クロマゾン、クロピラリド、クロランスラム、シアナジン、シクロエート、ＤＣＰＡ、デスメジファム、ジクロベニル、ジクロホップ、ジクロスラム、ジエタチル、ジフェンゾコート、ジフルフェンゾピル、ジメテナミド−ｐ、ジクワット、ジウロン、ＤＳＭＡ、エンドサル、ＥＰＴＣ、エタルフルラリン、エタメトスルフロン、エトフメセート、フェノキサプロプ、フルアジホップ−Ｐ、フルカルバゾン、フルフェナセト、フルメトスラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルオメツロン、フルオキシピル、フルチアセット、ホメサフェン、ホラムスルフロン、グルホシネート、グリホセート、ハロスルフロン、ハロキシホップ、ヘキサジノン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザキン、イマゼタピル、イソキサベン、イソキサフルトール、ラクトフェン、リヌロン、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メソトリオン、メタゾール、メトラクロル−ｓ、メトリブジン、メトスルフロン、モリネート、ＭＳＭＡ、ナプロパミド、ナプタラム、ニコスルフロン、ノルフラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペブレート、ペラルゴン酸、ペンジメタリン、フェンメジファム、ピクロラム、プリミスルフロン、プロジアミン、プロメトリン、プロナミド、プロパクロル、プロパニル、プロスルフロン、ピラゾン、ピリデート、ピリチオバック、キンクロラック、キザロホップ、リムスルフロン、セトキシジム、シデュロン、シマジン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホスルフロン、テブチウロン、テルバシル、チアゾピル、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トラルコキシジム、トリアレート、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリクロピル、トリフラリン、トリフルスルフロン、ベルノレートからなる群から選択することができる。当業者は、組成物中の各除草薬の好適な濃度が、有効性、除草薬の安定性、個別の除草薬の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｖｉｉｉ．忌避剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、忌避剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる忌避剤を含む。例えば、忌避剤は、本明細書に記載される有害生物（例えば、昆虫、線虫若しくは軟体動物）；微生物（例えば、植物病原体若しくは内部寄生菌、例えば細菌、真菌若しくはウイルスなど）；又は雑草のいずれかを忌避することができる。本明細書に記載される忌避剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）忌避剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）植物上の有害生物のレベルを、治療されていない植物に対して低下させるのに十分な量且つ時間、標的植物又はその寄生植物と接触させることができる。本明細書に記載される忌避剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
一部の例では、忌避剤は、昆虫忌避剤である。周知の昆虫忌避剤のいくつかの例としては、ベンジル；安息香酸ベンジル；２，３，４，５−ビス（ブチル−２−エン）テトラヒドロフルフラル（ＭＧＫ Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ １１）；ブトキシポリプロピレングリコール；Ｎ−ブチルアセトアニリド；ノルマル−ブチル−６，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−１，４−ピロン−２−カルボキシレート（Ｉｎｄａｌｏｎｅ）；アジピン酸ジブチル；フタル酸ジブチル；コハク酸ジ−ノルマル−ブチル（Ｔａｂａｔｒｅｘ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタ−トルアミド（ＤＥＥＴ）；ジメチルカルバート（エンド，エンド）−ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２，３−ジカルボキシレート）；フタル酸ジメチル；２−エチル−２−ブチル−１，３−プロパンジオール；２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（Ｒｕｔｇｅｒｓ ６１２）；イソシンコメロン酸ジ−ノルマル−プロピル（ＭＧＫ Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ ３２６）；２−フェニルシクロヘキサノール；ｐ−メタン−３，８−ジオール及びＮ，Ｎ−ジエチルスクシンアミド酸ノルマル−プロピルが挙げられる。他の忌避剤としては、シトロネラ油、フタル酸ジメチル、シュウ酸ノルマル−ブチルメシチルオキシド及び２−エチルヘキサンジオール−１，３が挙げられる（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１１：７２４−７２８；及びＴｈｅ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，ｐ７５６を参照されたい）。
昆虫忌避剤は、合成又は非合成の昆虫忌避剤であり得る。合成の昆虫忌避剤の例としては、メチルアントラニレート及び他のアントラニレート系の昆虫忌避剤、ベンズアルデヒド、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）、ジメチルカルバート、フタル酸ジメチル、イカリジン（即ちピカリジン、Ｂａｙｒｅｐｅｌ及びＫＢＲ３０２３）、インダロン（例えば、「６−２−２」混合物（６０％フタル酸ジメチル、２０％インダロン、２０％エチルヘキサンジオール）中で使用される）、ＩＲ３５３５（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル）、メトフルトリン、ペルメトリン、ＳＳ２２０又はトリシクロデセニルアリルエーテルが挙げられる。天然の昆虫忌避剤の例としては、ビューティーベリー（ｂｅａｕｔｙｂｅｒｒｙ）（ムラサキシキブ属（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ））葉、カバノキ樹皮、セイヨウヤチヤナギ（ｂｏｇ ｍｙｒｔｌｅ）（ヤチヤナギ（Ｍｙｒｉｃａ Ｇａｌｅ））、イヌハッカ（ｃａｔｎｉｐ）油（例えば、ネペタラクトン）、シトロネラ油、レモンユーカリ（ユーカリシトリオドラ（Ｃｏｒｙｍｂｉａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）；例えば、ｐ−メンタン−３，８−ジオール（ＰＭＤ））の精油、ニーム油、レモングラス、ティーツリー（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）の葉由来のティーツリーオイル、タバコ又はそれらの抽出物が挙げられる。
ｉｘ．施肥剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、異種施肥剤を更に含むことができる。一部の例では、異種施肥剤は、ＰＭＰと結合される。例えば、ＰＭＰは、異種施肥剤を封入することができる。更に又は代わりに、異種施肥剤は、ＰＭＰの表面に埋め込む又は結合させることができる。
異種施肥剤の例としては、当技術分野で周知のものなどの植物栄養素又は植物成長調節因子が挙げられる。代わりに又は更に、施肥剤は、植物共生体の適応度を増加させることができるペプチド、ポリペプチド、核酸又はポリヌクレオチドであり得る。施肥剤は、様々な植物又は植物共生体の適応度を増加させることができる薬剤であり得るか、又は１種以上の特定の標的植物又は植物共生体（例えば、特定の種又は属の植物又は植物共生体）を標的にするものであり得る。
一部の例では、異種施肥剤は、修飾することができる。例えば、修飾は、化学的修飾、例えば、マーカー、例えば、蛍光マーカー又は放射性マーカーへの結合であり得る。他の例では、修飾は、薬剤、例えば、脂質、グリカン、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、カチオン部分の、安定性、送達、ターゲティング、バイオアベイラビリティ又は半減期を増強する部分への結合又は動作可能な連結を含むことができる。
本明細書によって開示されるＰＭＰ組成物及び方法に使用することができる異種施肥剤の例を、下に概説する。
一部の例では、異種施肥剤は、植物の成長に必須の１種以上の植物栄養素を供給するために土壌又は植物組織に適用される、天然又は合成起源のいずれかの材料を含む。植物栄養素は、多量養素、微量養素又はその組み合わせを含むことができる。植物多量養素には、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び／又は硫黄が含まれる。植物微量養素には、銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛、ホウ素、ケイ素、コバルト及び／又はバナジウムが含まれる。植物栄養素肥料の例としては、窒素肥料（限定はされないが、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、非圧力窒素溶液、アンモニア水溶液、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素−ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、ウレアホルム又はメチレン尿素が含まれる）、リン肥料、例えばリン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃厚過リン酸（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び重過リン酸石灰（ｔｒｉｐｌｅ ｓｕｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ）など、又はカリウム肥料、例えば塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸カリウム−マグネシウム、硝酸カリウムが挙げられる。こうした組成物は、組成物内で遊離の塩又はイオンとして存在することができる。肥料は、窒素、リン又はカリウムなどの１種以上のその構成成分の含量によって名付けることができる。肥料中のこれらの元素の含量は、Ｎ−Ｐ−Ｋ値（ここで、Ｎ＝窒素含量（重量百分率による）、Ｐ＝リン含量（重量百分率による）及びＫ＝カリウム含量（重量百分率による））によって示すことができる。
また一方で、無機肥料は、非生物材料から製造され、例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、塩化カリウム、カリ（ｐｏｔａｓｈ）、リン酸アンモニウム、無水アンモニア及び他のリン酸塩が含まれる。無機肥料は、市販品として容易に入手可能であり、植物に対してすぐに利用可能である可溶性形態の栄養を含有する。無機肥料は、一般に安価であり、所望される元素について単価が低い。当業者は、施肥剤中の所与の元素の正確な量を算出し、植物又は土壌に投与することができることを理解するであろう。
肥料は、更に有機肥料又は無機肥料に分類することができる。有機肥料には、例えば生物由来の組成物中の、炭素主鎖をもつ分子骨格を有する肥料が含まれる。有機肥料は、生物由来の材料から製造される。動物堆肥、コンポスト、骨粉、フェザーミール及び血粉が、一般的な有機肥料の例である。有機肥料は、また一方で、典型的には、植物に対してすぐに利用可能ではなく、植物による使用の前に、土壌微生物が、肥料構成成分を、より単純な構造に分解する必要がある。更に、有機肥料は、一般的な無機肥料で観察される通りの植物成長反応を誘発することができるだけでなく、天然の有機肥料は、土壌微生物集団の成長及び活動を刺激することもできる。土壌微生物集団（例えば、植物共生体）の増加は、土壌の物理的及び化学的特性並びに疾患及び有害生物抵抗性を増加させることに対してかなりの有益な効果をもたらすことができる。
一態様では、本明細書に記載される植物栄養素を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）植物栄養素濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）植物の適応度を、治療されていない植物に対して増加させるのに十分な量且つ時間、植物と接触させることができる。
別の態様では、本明細書に記載される植物栄養素を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）植物共生体（例えば、細菌又は真菌の内部共生体）の内部又は表面の植物栄養素濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）植物共生体の適応度を、治療されていない植物共生体に対して増加させるのに十分な量且つ時間、植物共生体と接触させることができる。
異種施肥剤は、植物成長調節因子を含むことができる。例示的な植物成長調節因子としては、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン及びアブシジン酸が挙げられる。一部の例では、植物成長調節因子は、アブシジン酸、アミドクロル（ａｍｉｄｏｃｈｌｏｒ）、アンシミドール、６−ベンジルアミノプリン、ブラシノライド、ブトラリン、クロルメコート（塩化クロルメコート、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジド、ジケグラック、ジメチピン、２，６−ジメチルプリジン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｄｉｎｅ）、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセット、ホルクロルフェヌロン（ｆｏｒｃｈｌｏｒｆｅｎｕｒｏｎ）、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール−３−酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピコート（塩化メピコート）、ナフタレン酢酸、Ｎ−６−ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオン（プロヘキサジオン−カルシウム）、プロヒドロジャスモン、チジアズロン、トリアペンテノール、トリブチルホスホロトリチオエート、２，３，５−トリ−ヨード安息香酸、トリネキサパック−エチル及びウニコナゾールである。種子コーティング組成物を組込むことができる他の植物成長調節因子は、参照によってその全体が組込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１０８４３１号明細書に記載されている。
ｘ．植物改質剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、１種又は複数の異種植物改質剤を含む。例えば、ＰＭＰは、異種植物改質剤を封入することができる。代わりに又は更に、異種植物改質剤は、ＰＭＰの表面に埋め込む又は結合させることができる。
一部の例では、植物改質剤は、ペプチド又は核酸を含むことができる。植物改質剤は、様々な植物の適応度を増加させる薬剤であり得るか、又は１種以上の特定の植物（例えば、特定の種又は属の植物）を標的にするものであり得る。更に、一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる植物改質剤を含む。
更に、一部の例では、異種植物改質剤（例えば、核酸分子又はペプチドを含む薬剤）は、修飾することができる。例えば、修飾は、化学的修飾、例えば、マーカー、例えば、蛍光マーカー又は放射性マーカーへの結合であり得る。他の例では、修飾は、薬剤、例えば、脂質、グリカン、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、カチオン部分の、安定性、送達、ターゲティング、バイオアベイラビリティ又は半減期を増強する部分への結合又は動作可能な連結を含むことができる。
本明細書によって開示されるＰＭＰ組成物及び方法に使用することができる異種植物改質剤（例えば、ペプチド又は核酸）の例を、下に概説する。
Ａ．ポリペプチド
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物（例えば、ＰＭＰ）は、異種ポリペプチドを含むことができる。一部の例では、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、植物を改変する（例えば、例えば、植物の適応度を増加させる）ポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を含む。例えば、このポリペプチドは、植物の適応度を増加させることができる。本明細書に記載されるポリペプチドを含むＰＭＰ組成物を、（ａ）ポリペプチド濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）のに十分な量且つ時間、植物と接触させることができる。
本発明で使用することができるポリペプチドの例として、酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ若しくはユビキチン化タンパク質）、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンが含まれ得る。
本発明に含まれるポリペプチドには、天然に存在するポリペプチド又は組換えにより作製された変異体が含まれ得る。一部の例では、ポリペプチドは、その機能性断片又は変異体（例えば、酵素として活性なその断片又は変異体）であり得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたって又は配列全体にわたって、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列との少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかの機能的に活性な変異体であり得る。一部の例では、ポリペプチドは、そのタンパク質との少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超える）同一性を有することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載される使用のいずれかのために組成物に配合することができる。本明細書に開示される組成物は、あらゆる数又は種類（例えば、クラス）のポリペプチド、例えばいずれかの少なくとも約１つのポリペプチド、２、３、４、５、１０、１５、２０若しくはそれを超えるポリペプチドなどを含むことができる。組成物中の各ポリペプチドの好適な濃度は、ポリペプチドの有効性、安定性、組成物中の個別のポリペプチドの数、製剤及び組成物の適用の方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ポリペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。
ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野で慣例的である。一般に、Ｓｍａｌｅｓ＆Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ＆Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
ポリペプチドを作製する方法は、植物細胞での発現を含むが、適切なプロモーターの制御下で、昆虫細胞、酵母、細菌、哺乳動物細胞又は他の細胞を使用して、組換えタンパク質を作製することもできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモーター及びエンハンサー及び他の５’若しくは３’隣接非転写配列及び不可欠なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含むことができる。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えポリペプチド薬剤を発現及び製造することができる。哺乳動物発現系の例としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬の生産のための宿主細胞培養のプロセスは、例えば、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。タンパク質の精製については、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。タンパク質治療薬の製剤化については、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
一部の例では、ＰＭＰ組成物は、抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、本明細書に記載される薬剤は、植物のある構成要素の活動及び／又は機能を遮断又は増強する抗体であり得る。抗体は、植物中のポリペプチド（例えば、酵素若しくは細胞受容体）のアンタゴニスト又はアゴニストとして作用することができる。標的抗原に対する抗体の作製及び使用は、当技術分野で公知である。抗体操作、変性オリゴヌクレオチドの使用、５’−ＲＡＣＥ、ファージディスプレイ及び突然変異誘発；抗体試験及び特性決定；抗体薬物動態及び薬物力学；抗体精製及び保存；並びにスクリーニング及び標識技術を含めた、組換え抗体を作製する方法については、例えば、Ｚｈｉｑｉａｎｇ Ａｎ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００９、更にはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照されたい。
Ｂ．核酸
一部の例では、本明細書に記載されるＰＭＰは、異種核酸を含む。本明細書に記載されるＰＭＰ組成物及び方法では、多数の核酸が有用である。本明細書に開示されるＰＭＰは、任意の数又は種類（例えば、クラス）の異種核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ）、又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子）、例えば少なくとも約１つのクラス又は変異体の核酸、２、３、４、５、１０、１５、２０個若しくはそれを超えるクラス又は変異体の核酸を含むことができる。組成物中の各核酸の好適な濃度は、核酸の有効性、安定性、個別の核酸の数、製剤、組成物の適用の方法などの因子に依存する。本明細書で有用な核酸の例としては、ダイサー基質低分子干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、（非対称干渉ＲＮＡ）ａｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ｐｉｗｉ−干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム、デオキシリボザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はＤＮＡ分子が挙げられる。
本明細書に記載される核酸を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）核酸濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）植物を改変する（例えば、植物の適応度を増加させる）のに十分な量且つ時間、植物と接触させることができる。
（ａ）ペプチドをコードする核酸
一部の例では、ＰＭＰは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。ポリペプチドをコードする核酸は、約１０〜約５０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）、約２５〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、約５０００〜約６０００ｎｔ、約６０００〜約７０００ｎｔ、約７０００〜約８０００ｎｔ、約８０００〜約９０００ｎｔ、約９０００〜約１０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約１５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約２５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約３０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４０，０００ｎｔ、約１０，０００〜約４５，０００ｎｔ、約１０，０００〜約５０，０００ｎｔ又はこれらの間のあらゆる範囲の長さを有することができる。
ＰＭＰ組成物は、その核酸配列の機能的に活性な変異体も含むことができる。一部の例では、核酸の変異体は、例えば、特定の領域にわたって又は配列全体にわたって、その核酸の配列との、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。一部の例では、本発明は、本明細書に記載される通りの核酸変異体によってコードされる機能的に活性なポリペプチドを含む。一部の例では、核酸変異体によってコードされる機能的に活性なポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたって又はアミノ酸配列全体にわたって、そのポリペプチドの配列又は天然由来のポリペプチド配列との、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
タンパク質をコードする核酸を発現させるある種の方法は、適切なプロモーターの制御下での、昆虫、酵母、細菌又は他の細胞を含めた細胞における発現を含むことができる。発現ベクターは、複製起点などの非転写エレメント、好適なプロモーター及びエンハンサー及び他の５’若しくは３’隣接非転写配列及び不可欠なリボソーム結合部位などの５’若しくは３’非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含むことができる。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、早期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを提供することもできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載されている。
組換え方法を使用する遺伝子改変は、一般に、当技術分野で公知である。所望される遺伝子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からのライブラリをスクリーニングするか、又はその遺伝子を含むことが分かっているベクターから遺伝子を得るか、又はその遺伝子を含有する細胞及び組織から直接的に単離することにより、標準の技術を使用して入手することができる。代わりに、その遺伝子を、クローニングされるのではなく、合成によって作製することができる。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には、その遺伝子をコードする核酸をプロモーターと作動可能に連結させて、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。発現ベクターは、細菌内での複製及び発現にとって好適であり得る。発現ベクターは、真核生物内での複製及び組込みにとっても好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列並びに所望される核酸配列の発現に有用なプロモーターを含有する。
更なるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０塩基対（ｂｐ）上流の領域に位置するが、近年、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント同士の間隔は、多くの場合、フレキシブルであり、その結果、エレメントが互いに逆転又は移動した場合も、プロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント同士の間隔は、活性が低下し始めるまで、５０ｂｐまで増加させることができる。個別のエレメントは、プロモーターに応じて、協同的に又は独立して機能して転写を活性化することができると思われる。
好適なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかし、限定はされないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定はされないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターを含めた、他の構成的プロモーター配列も使用することができる。
代わりに、プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの使用は、こうした発現が所望される場合に作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が所望されない場合には発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定はされないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
導入されることとなる発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の特定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子又はその両方を含有することもできる。他の態様では、選択可能マーカーを、ＤＮＡの別々のピースに担持させ、同時トランスフェクション手順に使用することができる。宿主細胞での発現を可能にするために、選択可能マーカーとリポーター遺伝子の両方を、適切な調節配列と隣接させることができる。有用な選択可能マーカーには、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
リポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を特定するために、また、調節配列の機能性を評価するために用いることができる。一般に、リポーター遺伝子は、レシピエント源に存在しない又はレシピエント源によって発現されない、且つその発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって呈示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。リポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、好適な時点で検定される。好適なリポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含むことができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９−８２，２０００）。好適な発現系は、周知であり、公知の技術を用いて調製することができるか、又は市販品として入手することができる。一般に、リポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターと特定される。こうしたプロモーター領域を、リポーター遺伝子に連結させ、プロモーターによって駆動される転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
一部の例では、生物を遺伝子改変して、１つ以上のタンパク質の発現を変化させることができる。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時点、例えば生物の発達又は分化状態について改変することができる。一例では、本発明は、１つ以上のタンパク質、例えば活性、構造又は機能に影響を与えるタンパク質の発現を変化させるための組成物を含む。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の位置に限定され得るか、又は生物全体を通して広範囲であり得る。
（ｂ）合成ｍＲＮＡ
ＰＭＰ組成物は、合成ｍＲＮＡ分子、例えばポリペプチドをコードする合成ｍＲＮＡ分子を含むことができる。合成ｍＲＮＡ分子は、例えば化学的に改変することができる。ｍＲＮＡ分子は、化学的に合成する又はインビトロで転写させることができる。ｍＲＮＡ分子は、プラスミド、例えばウイルスベクター、細菌ベクター又は真核生物発現ベクター上に配置することができる。一部の例では、ｍＲＮＡ分子は、トランスフェクション、電気穿孔又は形質導入（例えば、アデノウイルス若しくはレンチウイルス形質導入）によって細胞に送達することができる。
一部の例では、本明細書に記載されるその改変ＲＮＡ薬剤は、改変ヌクレオシド又はヌクレオチドを有する。こうした改変は、公知であり、例えば、国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレットに記載されている。更なる改変は、例えば国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０３８８９２号パンフレット；同第２０１５／０８９５１１号パンフレット；同第２０１５／１９６１３０号パンフレット；同第２０１５／１９６１１８号パンフレット及び同第２０１５／１９６１２８Ａ２号パンフレットに記載されている。
一部の例では、そのポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、１つ以上の末端修飾、例えば５’キャップ構造及び／又はポリＡテール（例えば、長さ１００〜２００ヌクレオチド）を有する。５’キャップ構造は、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎｌ−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン及び２−アジド−グアノシンからなる群から選択することができる。ある場合には、改変ＲＮＡは、少なくとも１つのコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲも含有する。こうした改変は、公知であり、例えば、国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット及び同第２０１３／０５２５２３号パンフレットに記載されている。更なる末端修飾は、例えば、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット及び同第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット及び同第２０１４／０９３９２４号パンフレットに記載されている。少なくとも１つの化学的改変を含むことができるキャップＲＮＡ分子（例えば、改変ｍＲＮＡ）を合成するためのキメラ酵素は、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレットに記載されている。
一部の例では、改変ｍＲＮＡを環化又はコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を補助する翻訳コンピテント分子を産生することができる。環化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学、２）酵素、及び３）リボザイム触媒を通して起こり得る。新たに形成される５’／３’結合は、分子内又は分子間であり得る。こうした改変は、例えば、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレットに記載されている。
改変ＲＮＡを作製及び精製する方法は、当技術分野で公知であり、開示されている。例えば、改変ＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成のみを使用して作製される。ＩＶＴポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野で公知であり、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１６７１号パンフレット、同第２０１３／１５１６７２号パンフレット、同第２０１３／１５１６６７号パンフレット及び同第２０１３／１５１７３６．Ｓ号パンフレットに記載されている。精製の方法には、サンプルを、複数のチミジン若しくはその誘導体及び／又は複数のウラシル若しくはその誘導体（ポリＴ／Ｕ）に連結させた表面と、ＲＮＡ転写物が表面に結合するような条件下で接触させ、その表面から精製ＲＮＡ転写物を溶出させることにより、ポリＡテールを含むＲＮＡ転写物を精製すること（国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット）；拡張可能な方法を介して１０，０００ヌクレオチド長までの長いＲＮＡの分離を可能にするイオン（例えば、アニオン）交換クロマトグラフィーを使用すること（国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット）；並びに改変ｍＲＮＡサンプルをＤＮＡｓｅ処理にかけること（国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット）が含まれる。
改変ＲＮＡの製剤は公知であり、例えば国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレットに記載されている。例えば、製剤は、限定はされないが、ナノ粒子、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖が含まれる）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、フィブリングルー、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速排出脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）及びこれらの組み合わせであり得る。
ヒトの疾患、抗体、ウイルス及び様々なインビボ状況の分野におけるポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、公知であり、例えば国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、同第２０１３／１５１６６８号パンフレット、同第２０１３／１５１６６３号パンフレット、同第２０１３／１５１６６９号パンフレット、同第２０１３／１５１６７０号パンフレット、同第２０１３／１５１６６４号パンフレット、同第２０１３／１５１６６５号パンフレット、同第２０１３／１５１７３６号パンフレットの表６；国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレットの表６及び表７；国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレットの表６、表１７８及び表１７９；国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレットの表６、表１８５及び表１８６に開示されている。前述のもののいずれかを、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド又は環状ポリヌクレオチドとして合成することができ、それぞれが、１つ以上の改変ヌクレオチド又は末端修飾を含むことができる。
（ｃ）阻害性ＲＮＡ
一部の例では、ＰＭＰ組成物は、阻害性ＲＮＡ分子、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用する阻害性ＲＮＡ分子を含む。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物における遺伝子発現のレベルを低下させ、且つ／又は植物におけるタンパク質のレベルを低下させる。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、植物遺伝子の発現を阻害する。例えば、阻害性ＲＮＡ分子は、植物の遺伝子を標的にする低分子干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡを含むことができる。ある種のＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的には１５〜５０塩基対（例えば、約１８〜２５塩基対）を含有し、且つ細胞内の発現される標的遺伝子中のコード配列と同一（相補的）又はほぼ同一（実質的に相補的）な核酸塩基配列を有する、ＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子には、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、部分二重鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、ダイサー基質及び多価ＲＮＡ干渉（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書、同第８，５１３，２０７号明細書及び同第９，２００，２７６号明細書）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを介して標的遺伝子の発現を減少させるヘアピンターンを含むＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、例えばトランスフェクション、電気穿孔又は形質導入により、プラスミド、例えばウイルス若しくは細菌ベクターの形態で、細胞に送達することができる。マイクロＲＮＡは、典型的には約２２ヌクレオチドの長さを有する非翻訳ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子上の標的部位に結合し、例えばｍＲＮＡの切断、ｍＲＮＡの不安定化又はｍＲＮＡの翻訳の阻害を引き起こすことによってｍＲＮＡを抑制する。一部の例では、阻害性ＲＮＡ分子は、機能の負の調節因子のレベル及び／又は活性を低減させる。他の例では、阻害剤ＲＮＡ分子は、機能の正の調節因子のレベル及び／又は活性を低下させる。阻害性ＲＮＡ分子は、化学的に合成する又はインビトロで転写させることができる。
一部の例では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡである。一部の例では、ＲＮＡは、阻害性ＲＮＡである。一部の例では、阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子発現を阻害する。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、改変ｍＲＮＡ又は植物において酵素（例えば、代謝リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、ＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ又はユビキチン化タンパク質）の発現を増加させるＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、核酸は、ｍＲＮＡ、改変ｍＲＮＡ又は酵素（例えば、代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素又はユビキチン化タンパク質）の発現を増加させるＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、ＴＡＬＥＮ若しくはジンクフィンガー）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである。一部の例では、植物における発現の増加は、参照レベル（例えば、治療されていない植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現の増加である。一部の例では、植物における発現の増加は、参照レベル（例えば、治療されていない植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍若しくは１００倍又はそれを超える発現の増加である。
一部の例では、核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマー（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は植物において酵素（代謝酵素、リコンビナーゼ酵素、ヘリカーゼ酵素、インテグラーゼ酵素、ＲＮＡｓｅ酵素、ＤＮＡｓｅ酵素、ポリメラーゼ酵素、ユビキチン化タンパク質、スーパーオキシド管理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）酵素若しくはエネルギー産生酵素）の発現を減少させるように作用するＤＮＡ分子（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）、転写因子、分泌タンパク質、構造因子（アクチン、キネシン若しくはチューブリン）、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド又は輸送体である。一部の例では、植物における発現の減少は、参照レベル（例えば、治療されていない植物における発現）に対して約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の発現の減少である。一部の例では、植物における発現の減少は、参照レベル（例えば、治療されていない植物における発現）に対して約２倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約２５倍、約５０倍、約７５倍若しくは約１００倍又はそれを超える発現の減少である。
ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の全部又は断片と実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含む。ＲＮＡｉ分子は、イントロンとエキソンとの境界で配列を補完して、特定の遺伝子の新たに産生された核内ＲＮＡ転写物の、転写のためのｍＲＮＡへの成熟を阻止することができる。特定の遺伝子と相補的なＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリッド形成し、その翻訳を阻止することができる。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくはハイブリッドであり得る。こうした誘導体分子の例としては、限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びホスホロチオエートベースの分子、例えばデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）又はリボ核酸グアニジン（ＲＮＧ）などが挙げられる。
ＲＮＡｉ分子は、インビトロで合成された直ちに使用可能なＲＮＡとして又は転写時にＲＮＡｉ分子を産生することとなる細胞にトランスフェクトされるアンチセンス遺伝子として提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ＲＮＡｓｅ Ｈによるハイブリッド形成された分子の分解及び／又は翻訳複合体の形成の阻害が起こる。どちらによっても、元の遺伝子の産物を産生できなくなる。
対象となる転写物とハイブリッド形成ＲＮＡｉ分子の長さは、およそ１０ヌクレオチド、約１５若しくは３０ヌクレオチド又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド又はそれを超えるヌクレオチド長であり得る。標的とされる転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５であり得る。
ＲＮＡｉ分子は、オーバーハング、即ち本明細書で定義するセンス鎖及びアンチセンス鎖の対のコア配列によって通常形成される二重らせん構造に直接的に関与しない、典型的には非対の突出したヌクレオチドも含むことができる。ＲＮＡｉ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々とは無関係に、約１〜５塩基の３’及び／又は５’オーバーハングを含有することができる。一部の例では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が、３’及び５’オーバーハングを含有する。一部の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合する。他の例では、一方の鎖塩基の１つ以上の３’オーバーハングヌクレオチドは、他方の鎖の１つ以上の５’オーバーハングヌクレオチドと対合しない。ＲＮＡｉ分子のセンス及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチド塩基を含有しても又はしなくてもよい。アンチセンス及びセンス鎖は、５’末端のみが平滑末端を有するか、３’末端のみが平滑末端を有するか、５’及び３’末端の両方が平滑末端であるか、又は５’及び３’末端のいずれも平滑末端ではない二重鎖を形成することができる。別の例では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、チオリン酸エステル、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド逆位（３’−３’結合）ヌクレオチドを含有するか、又は改変されたリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドである。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１５〜約２５の連続的ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。一部の例では、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％又は約４５〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準のＢＬＡＳＴ検索により決定された場合、それが導入されることとなるゲノム中の標的以外のいずれのヌクレオチド配列に対しても高いパーセンテージの同一性を有しない。
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路における中間体と類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ １１６：２８１−２９７，２００４）。一部の例では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：１３２７−１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。外来性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対するシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：１９９−２０４，２００６）。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強力な下方制御をもたらす（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：４３８−４４２，２００３）。
既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種の結合部位も、関連文献に十分に示されている。ＲＮＡｉ分子は、当技術分野で公知の技術によって容易に設計及び作製される。更に、有効且つ特異的な配列モチーフを見出す可能性を高める計算ツールも存在する（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（９）：６７０−６７６，２００６；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（３）：３２６−３３０，２００４；Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０（９）：７０８−７１２，２００３；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５（２）：１９９−２０８，２００３；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（３）：９３６−９４８，２００４；Ｈｅａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（３）：ｅ３０，２００５；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１９（１）：２６４−２７４，２００４；及びＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１６（４）：１０５０−１０５８，２００４）。
ＲＮＡｉ分子は、遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節する。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有できることから、一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、十分な配列相同性を有する、あるクラスの遺伝子を標的にするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、異なる遺伝子標的の間で共有されるか、又は特定の遺伝子標的について特有である配列に対する相補性を有する配列を含有することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、いくつかの遺伝子同士で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的とし、それによって遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異体、突然変異遺伝子など）を標的とするように設計することができる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に対して特有である配列を標的とするように設計することができる。
阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、改変ヌクレオチド、例えば２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−デオキシ、アンロックド核酸、２’−ヒドロキシ、ホスホロチオエート、２’−チオウリジン、４’−チオウリジン、２’−デオキシウリジンを含有するように改変することができる。理論に拘泥されないが、こうした改変は、ヌクレアーゼ抵抗性及び／又は血清安定性を増加することができるか又は免疫原性を低下させることができると考えられる。
一部の例では、ＲＮＡｉ分子は、生理的に不安定な結合又はリンカーを介して送達ポリマーに連結される。生理的に不安定なリンカーは、それが特定の生理的条件下に存在するとき、化学変換（例えば、切断）を受けるように選択される（例えば、ジスルフィド結合は、細胞質の還元性環境で切断される）。生理的に不安定な結合の切断による、ポリマーからの分子の放出は、その分子と、活動のための適切な細胞構成成分との相互作用を促進する。
ＲＮＡｉ分子−ポリマーコンジュゲートは、分子をポリマーと共有結合させることによって形成することができる。ポリマーは、反応性の基Ａを含有するように重合又は改変される。ＲＮＡｉ分子は、反応性の基Ｂを含有するようにも重合又は改変される。反応性の基Ａ及びＢは、当技術分野で公知の方法を使用して、これらが可逆的共有結合を介して連結できるように選択される。
ＲＮＡｉ分子とポリマーの共役は、過剰のポリマーの存在下で実施することができる。ＲＮＡｉ分子とポリマーは、共役中に反対電荷となり得るため、過剰ポリマーの存在により、コンジュゲートの凝集を減少又は排除することができる。代わりに、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを使用することもできる。過剰ポリマーは、コンジュゲートの投与前に、共役されたポリマーから除去することができる。代わりに、過剰ポリマーを、コンジュゲートと同時投与することもできる。
リボザイム、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡに基づく阻害剤の作製及び使用も、例えば、Ｓｉｏｕｄ，ＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている通り、当技術分野で公知である。
（ｄ）遺伝子編集
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、遺伝子編集系の、ある構成要素を含むことができる。例えば、薬剤は、植物における遺伝子に変更（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異）を導入することができる。例示的な遺伝子編集系として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５，２０１３に記載されている。
典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、エンドヌクレアーゼは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ配列を標的とする配列特異的な非翻訳ガイドＲＮＡにより、標的ヌクレオチド配列（例えば、配列編集されることとなるゲノム内の部位）に誘導される。３つのクラス（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、（複数のＣａｓタンパク質ではなく）単一のＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する。あるクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス−活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、即ち典型的には標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列を含有する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する領域も含有して、部分的二本鎖構造を形成し、これがＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドがもたらされる。ＲＮＡは、スペーサ配列に応じて、特定のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を抑制するようにＣａｓタンパク質を誘導するガイドとしての役割を果たす。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０，２０１０；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ １：７，２００６；Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３−８３６，２０１３を参照されたい。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに対して特異的なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接していなければならない。しかし、ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体を通して出現する。種々の原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、特有のＰＡＭ配列要件を有する；ＰＡＭ配列の例としては、５’−ＮＧＧ（配列番号１）（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’−ＮＮＡＧＡＡ（配列番号２）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’−ＮＧＧＮＧ（配列番号３）（ストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）及び５’−ＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号４）（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰＡＭ部位、例えば５’−ＮＧＧ（配列番号１）と結合して、ＰＡＭ部位（の５’側）から３ヌクレオチド上流の位置で、標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含む；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）種由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１結合ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに成熟型ｃｒＲＮＡにプロセシングされる；言い換えれば、Ｃｐｆ１系は、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡのみを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば５’−ＴＴＮ（配列番号５）と結合している。Ｃｐｆ１は、５’−ＣＴＡ（配列番号６）ＰＡＭモチーフも認識することができる。Ｃｐｆ１は、４−若しくは５−ヌクレオチド５’オーバーハングを含むオフセット又はスタッガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）二本鎖切断を導入することによってＤＮＡを切断する、例えば、コーディング鎖のＰＡＭ部位（の３’側）から１８ヌクレオチド下流及び相補鎖のＰＡＭ部位から２３ヌクレオチド下流に位置する５−ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断で標的ＤＮＡを切断する；こうしたオフセット切断から生じる５−ヌクレオチドオーバーハングは、相同組換えによるＤＮＡ挿入により、平滑末端切断されたＤＮＡでの挿入によるものよりも正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９−７７１，２０１５を参照されたい。
遺伝子編集の目的で、ＣＲＩＳＰＲアレイを、所望される標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含有するように設計することができる；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１−２３０８，２０１３を参照されたい。ＤＮＡ切断が起こるためには、Ｃａｓ９により、少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要とされる；Ｃｐｆ１については、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために、少なくとも約１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要である。実際、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さ及び標的とされる遺伝子又は核酸配列との相補性を有するように設計される。有効なガイドＲＮＡの設計に使用するためのカスタムｇＲＮＡ作製装置及びアルゴリズムは、市販品として入手可能である。遺伝子編集は、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、即ち天然に存在するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、（ヌクレアーゼと結合するための）ｔｒａｃｒＲＮＡと（編集のための標的となる配列にヌクレアーゼを誘導するための）少なくとも１つのｃｒＲＮＡとの両方を含有する遺伝子改変された（合成の）単一ＲＮＡ分子を使用しても達成されている。化学的に改変されたｓｇＲＮＡも、ゲノム編集において有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８５−９９１，２０１５を参照されたい。
野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって標的とされる特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすが、改変された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば：Ｃａｓ９のニッカーゼバージョンは、一本鎖切断のみをもたらし；触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、標的ＤＮＡを切断しないが、立体障害によって転写を妨害する。ｄＣａｓ９は、更に、エフェクターと融合して、標的遺伝子の発現を抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）することができる。例えば、Ｃａｓ９を転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢドメイン）又は転写アクチベーター（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合体）と融合させることができる。Ｆｏｋｌヌクレアーゼと融合した触媒として不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（ｄＣａｓ９−Ｆｏｋｌ）を使用して、２つのｇＲＮＡと相同の標的配列でＤＳＢをもたらすことができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリ（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ．，Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示されて公的に入手可能な多数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。それぞれが別のガイドＲＮＡによって誘導される２つの別の二本鎖切断を導入するダブルニッカーゼＣａｓ９は、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０−１３８９，２０１３により、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２Ａ１号明細書並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ並びに対応するガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３Ａ１号明細書に開示されている。
一部の例では、所望されるゲノム改変は、相同組換えを含み、ここでは、標的ヌクレオチド配列内の１つ以上の二本鎖ＤＮＡ切断が、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡによってもたらされ、それに続いて、相同組換え機構を使用する切断の修復（相同組換え修復）が起こる。こうした例では、二本鎖切断時に挿入又はノックインされることとなる所望されるヌクレオチド配列をコードするドナー鋳型が、細胞又は対象に提供され；好適な鋳型の例としては、一本鎖ＤＮＡ鋳型及び二本鎖ＤＮＡ鋳型（例えば、明細書に記載されるポリペプチドに連結される）が挙げられる。一般に、約５０ヌクレオチド未満の領域にわたるヌクレオチド変化をコードするドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡの形態で提供され；より大きいドナー鋳型（例えば、１００ヌクレオチド超）は、多くの場合、二本鎖ＤＮＡプラスミドとして提供される。一部の例では、ドナー鋳型は、所望される相同組換え修復を達成するのに十分であるが、所与の期間後（例えば、１つ以上の細胞分裂周期後）に細胞又は対象において持続しない量で、細胞又は対象に提供される。一部の例では、ドナー鋳型は、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個又はそれを超えるヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列と異なるコアヌクレオチド配列（例えば、相同的内在性ゲノム領域）を有する。このコア配列は、標的ヌクレオチド配列と高い配列同一性の相同性アーム又は領域によって隣接され；一部の例では、高い配列同一性の領域は、コア配列の両側に、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７５０個又は少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む。ドナー鋳型が一本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側に、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個又は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む相同性アームによって隣接される。ドナー鋳型が二本鎖ＤＮＡの形態である一部の例では、コア配列は、コア配列の両側に、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個又は少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む相同性アームって隣接される。一例では、ダブルニッカーゼＣａｓ９を用いて、２つの別の二本鎖切断が、細胞又は対象の標的ヌクレオチド配列に導入され（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０−１３８９，２０１３を参照されたい）、ドナー鋳型の送達がそれに続く。
一部の例では、組成物は、ｇＲＮＡと、標的ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、例えば野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１若しくはＣ２Ｃ３又はこうしたヌクレアーゼをコードする核酸を含む。ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの選択は、標的突然変異が、ヌクレオチドの欠失、置換又は付加、例えば標的配列に対するヌクレオチドの欠失、置換又は付加であるかどうかによって決定される。（１つ以上の）エフェクタードメインの全部又は一部（例えば、生物学的に活性の部分）とテザリングした、触媒として不活性なエンドヌクレアーゼ、例えば不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えばＤ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合により、キメラタンパク質を作出し、これをポリペプチドと連結させて、１つ以上のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）によって組成物を特定のＤＮＡ部位に誘導し、１つ以上の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節することができる。
例では、薬剤は、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ系に使用するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の例では、薬剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は植物における遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を標的にする（例えば、切断する）ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを含む。一部の例では、薬剤は、ＴＡＬＥＮ又は植物における遺伝子の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を標的にする（例えば、切断する）ＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡを含む。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ系にｇＲＮＡを使用して、植物における遺伝子の変更を操作することができる。他の例では、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮを使用して、植物における遺伝子の変更を操作することができる。例示的な変更として、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、反転、単一点突然変異又は他の突然変異が挙げられる。変更は、細胞の遺伝子に、例えばインビトロ、エクスビボ又はインビボで導入することができる。一部の例では、変更は、植物における遺伝子のレベル及び／又は活性を増加させる。他の例では、変更は、植物における遺伝子のレベル及び／又は活性を低下させる（例えば、ノックダウン若しくはノックアウトする）。更に別の例では、変更は、植物における遺伝子の欠陥（例えば、欠陥を引き起こす突然変異）を修正する。
一部の例では、植物における標的遺伝子を編集する（例えば、塩基対を付加するか又は欠失させる）ために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。他の例では、未成熟終止コドンを導入し、例えば、それによって標的遺伝子の発現を減少させるために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。更に他の例では、例えば、ＲＮＡ干渉と同様に、可逆的方法で標的遺伝子をオフにするために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。一部の例では、Ｃａｓを遺伝子のプロモーターに誘導し、それによってＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断するために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。
一部の例では、例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書、Ｃｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３，２０１３；Ｔｓａｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：６ ５６９−５７６，２０１４；米国特許第８，８７１，４４５号明細書；同第８，８６５，４０６号明細書；同第８，７９５，９６５号明細書；同第８，７７１，９４５号明細書；及び同第８，６９７，３５９号明細書に記載される技術を使用して、植物における遺伝子を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ系を作製することができる。
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）技術は、植物の特定の遺伝子の転写抑制のために使用することができる。ＣＲＩＳＰＲｉでは、操作されたＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ−ヌルｄＣａｓ９又はｄＣａｓ９融合タンパク質、例えばｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ若しくはｄＣａｓ９−ＳＩＤ４Ｘ融合体）を配列特異的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と対合させることができる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＲＮＡポリメラーゼを遮断することができ、それにより転写伸長を妨害する。この複合体は、転写因子結合を妨害することによって転写開始も遮断することができる。ＣＲＩＳＰＲｉ方法は、最小オフターゲット効果を固有に有し、且つマルチプレクサブル（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ）であり、例えば、（例えば、複数のｇＲＮＡを使用して）同時に２つ以上の遺伝子を抑制することができる。また、ＣＲＩＳＰＲｉ方法は、可逆的遺伝子抑制も可能にする。
一部の例では、植物における遺伝子の転写活性化のために、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲａ技術では、ｄＣａｓ９融合タンパク質が、転写アクチベーターを動員する。例えば、ｄＣａｓ９を、ＶＰ６４又はｐ６５活性化ドメイン（ｐ６５Ｄ）などのポリペプチド（例えば、活性化ドメイン）と融合させ、ｓｇＲＮＡ（例えば、単一のｓｇＲＮＡ又は複数のｓｇＲＮＡ）と共に使用して、有害生物の１つ又は複数の遺伝子を活性化することができる。複数のｓｇＲＮＡを使用することによって複数のアクチベーターを動員することができ、これは、活性化効率を高めることができる。様々な活性化ドメイン及び単一又は複数の活性化ドメインを使用することができる。ｄＣａｓ９を、アクチベーターを動員するように操作することに加えて、ｓｇＲＮＡも、アクチベーターを動員するように操作することができる。例えば、ＲＮＡアプタマーをｓｇＲＮＡに組込むことにより、ＶＰ６４などのタンパク質（例えば、活性化ドメイン）を導入することができる。一部の例では、転写活性化のために、相乗的な活性化メディエーター（ＳＡＭ）系を用いることができる。ＳＡＭでは、ＭＳ２アプタマーが、ｓｇＲＮＡに付加される。ＭＳ２は、ｐ６５ＡＤ及びヒートショック因子１（ＨＳＦ１）と融合したＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）を動員する。
ＣＲＩＳＰＲｉ及びＣＲＩＳＰＲａ技術は、参照により本明細書に組み込まれるＤｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７：５−１５，２０１６に、より詳細に記載されている。更に、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．に記載されている通り、ＣＲＩＳＰＲ系を使用するｄＣａｓ９媒介性のエピジェネティクス改変及び同時活性化及び抑制を使用して、植物における遺伝子を調節することができる。
Ｂ．異種治療薬
本明細書で製造されるＰＭＰは、治療用ペプチド、治療用核酸（例えば、治療用ＲＮＡ）、治療用小分子又は病原体制御剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、殺ウイルス剤、抗ウイルス剤、殺虫薬剤、殺線虫薬剤、抗寄生虫薬剤又は昆虫忌避剤）などの異種治療薬（例えば、動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）、動物病原体又はその病原体ベクターに影響を与える、且つＰＭＰにロードすることができる薬剤）を含むことができる。こうした薬剤がロードされたＰＭＰを、動物、動物病原体又はその病原体ベクターへの送達のために、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化することができる。
ｉ．抗菌剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗菌剤を更に含むことができる。例えば、本明細書に記載される抗生物質を含むＰＭＰ組成物を、動物の内部又は表面の抗生物質濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び／又は動物における細菌感染を治療又は予防するのに十分な量且つ時間、動物に投与することができる。本明細書に記載される抗菌剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗菌剤を含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗菌剤」は、植物病原細菌などの細菌を死滅させる又はその成長、増殖、分裂、生殖又は拡大を阻害する材料を指し、殺菌性薬剤（例えば、消毒用化合物、防腐性化合物若しくは抗生物質）又は静菌性薬剤（例えば、化合物若しくは抗生物質）が含まれる。殺菌性抗生物質は、細菌を死滅させるが、静菌性抗生物質は、その成長又は生殖を遅くするにすぎない。
殺菌剤には、消毒剤、防腐剤又は抗生物質が含まれ得る。最もよく使用される消毒剤は、活性塩素（即ち次亜塩素酸塩（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）、クロラミン、ジクロロイソシアヌル酸塩及びトリクロロイソシアヌル酸塩、液体塩素、二酸化塩素など）、活性酸素（過酸化物、例えば過酢酸、過硫酸カリウム、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム及び尿素過水和物、ヨウ素（ヨードポビドン（ポビドンヨウ化物、Ｂｅｔａｄｉｎｅ）、ルゴール溶液、ヨードチンキ、ヨウ素化非イオン性界面活性剤）、濃縮アルコール（主に、エタノール、ｎ−プロパノールとも呼ばれる１−プロパノール及びイソプロパノールと呼ばれる２−プロパノール並びにそれらの混合物；更に、２−フェノキシエタノール並びに１−フェノキシプロパノール及び２−フェノキシプロパノールが使用される）、フェノール物質（フェノール（石炭酸とも呼ばれる）、クレゾール（液体カリウムセッケンと組み合わせてＬｙｓｏｌｅと呼ばれる）、ハロゲン化（塩素化、臭素化）フェノール、例えばヘキサクロロフェン、トリクロサン、トリクロロフェノール、トリブロモフェノール、ペンタクロロフェノール、ジブロモール及びそれらの塩など）、陽イオン性界面活性剤、例えばいくつかの四級アンモニウムカチオン（例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化又は塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム）及びその他のものなど、非四級化合物、例えばクロルヘキシジン、グルコプロタミン、二塩酸オクテニジンなど）、強力な酸化剤、例えばオゾン及び過マンガン酸溶液；重金属及びその塩、例えばコロイド性の銀、硝酸銀、塩化水銀、フェニル水銀塩、硫酸銅、酸化−塩化銅、水酸化銅、オクタン酸銅、オキシ塩化硫酸銅、硫酸銅、硫酸銅五水和物などを含むことができる。重金属及びその塩は、最も毒性が高く、環境に有害な殺菌剤であるため、その使用は、強く抑制又は取り止められ；更に、濃強酸（リン酸、硝酸、硫酸、アミド硫酸、トルエンスルホン酸）及びアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム）も適切である。
防腐剤（即ちヒト又は動物の身体、皮膚、粘膜、創傷などに使用することができる殺菌剤）として、上に挙げた消毒剤のいくつかを、適切な条件（主に、濃度、ｐＨ、温度及びヒト／動物に対する毒性）下で使用することができる。その中で重要なものは、適切に希釈された塩素調製物（即ちデーキン液、ｐＨ７〜８に調節された０．５％次亜塩素酸ナトリウム若しくはカリウム溶液又はベンゼンスルホクロラミドナトリウムの０．５〜１％溶液（クロラミンＢ））、いくつかのヨウ素調製物、例えば様々なガレヌス製剤（軟膏、溶液、創傷プラスター）中のヨードポビドン、過去にはルゴール液、尿素過水和物溶液及びｐＨ緩衝０．１〜０．２５％過酢酸溶液としての過酸化物、主に皮膚消毒のために使用される防腐性添加物を含む又は含まないアルコール、ソルビン酸、安息香酸、乳酸及びサリチル酸などの弱有機酸、一部のフェノール化合物、例えばヘキクサクロロフェン、トリクロサン及びジブロモールなど、並びに陽イオン活性化合物、例えば０．０５〜０．５％ベンザルコニウム、０．５〜４％クロルヘキシジン、０．１〜２％オクテニジン溶液である。
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗生物質を含むことができる。当技術分野で公知のあらゆる抗生物質を使用することができる。抗生物質は、一般に、その作用機序、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
本明細書に記載される抗生物質は、細菌のあらゆる機能又は成長プロセスを標的にすることができ、静菌性（例えば、細菌成長を遅くする若しくは予防する）又は殺菌性（例えば、細菌を死滅させる）であり得る。一部の例では、抗生物質は、殺菌性抗生物質である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、細菌の細胞壁を標的にするもの（例えば、ペニシリン及びセファロスポリン）；細胞膜を標的にするもの（例えば、ポリミキシン）；又は基本的な細菌酵素を阻害するもの（例えば、リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン及びスルホンアミド）である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、アミノグリコシド（例えば、カスガマイシン）である。一部の例では、抗生物質は、静菌性抗生物質である。一部の例では、静菌性抗生物質は、タンパク質合成を標的にする（例えば、マクロライド、リンコサミド及びテトラサイクリン）。本明細書で使用することができる追加のクラスの抗生物質としては、環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）又はリピアルマイシン（フィダキソマイシンなど）が挙げられる。抗生物質の例としては、リファンピシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン及びポリミキシンＢが挙げられる。本明細書に記載される抗生物質は、あらゆるレベルの標的特異性（例えば、狭い又は広いスペクトル）を有することができる。一部の例では、抗生物質は、狭いスペクトルの抗生物質であり、従ってグラム陰性菌又はグラム陽性菌などの特定の種類の細菌を標的にする。代わりに、抗生物質は、幅広い細菌を標的にするする広スペクトルの抗生物質であり得る。
動物の治療に適した抗菌剤の例としては、ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、クリスチシリン（Ｃｒｙｓｔｉｃｉｌｌｉｎ）３００ Ａ．Ｓ．、ペンティズ（Ｐｅｎｔｉｄｓ）、パーマペン（Ｐｅｒｍａｐｅｎ）、ファイザーペン（Ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ）、ファイザーペン（Ｐｆｉｚｅｒｐｅｎ）−ＡＳ、ウィシリン（Ｗｙｃｉｌｌｉｎ）、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピバンピシリン、ピブメシリナム、チカルシリン）、セファロスポリン（セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル（セフプロキシル）、セフロキシム、セフゾナム、セフカペン、セフダロキシム（Ｃｅｆｄａｌｏｘｉｍｅ）、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフポドキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン（Ｃｅｆｔｉｏｌｅｎｅ）、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、セフクリジン（Ｃｅｆｃｌｉｄｉｎｅ）、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン、セファクロメジン（Ｃｅｆａｃｌｏｍｅｚｉｎｅ）、セファロラム（Ｃｅｆａｌｏｒａｍ）、セファパロール（Ｃｅｆａｐａｒｏｌｅ）、セフカネル（Ｃｅｆｃａｎｅｌ）、セフェドロロール（Ｃｅｆｅｄｒｏｌｏｒ）、セフェムピドン（Ｃｅｆｅｍｐｉｄｏｎｅ）、セフェトリゾール（Ｃｅｆｅｔｒｉｚｏｌｅ）、セフィビトリル（Ｃｅｆｉｖｉｔｒｉｌ）、セフマチレン、セフメピジウム（Ｃｅｆｍｅｐｉｄｉｕｍ）、セフォベシン、セホキサゾール（Ｃｅｆｏｘａｚｏｌ）、セフロチル（Ｃｅｆｒｏｔｉｌ）、セフスミド（Ｃｅｆｓｕｍｉｄｅ）、セフラセタイム（Ｃｅｆｕｒａｃｅｔｉｍｅ）、セフチオキシド（Ｃｅｆｔｉｏｘｉｄｅ）、組み合わせ、即ちセフタジジム／アビバクタム、セフトロザン／タゾバクタム）、モノバクタム（アズトレオナム）、カルバペネム（イミペネム、イミペネム／シラスタチン、ドリペネム、エルタペネム、メロペネム、メロペネム／バボルバクタム）、マクロライド（アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン）、リンコサミド（クリンダマイシン、リンコマイシン）、ストレプトグラミン（プリスチナマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン）、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、キノロン（フルメキン、ナリジクス酸、オキソリニン酸、ピロミド酸、ピペミド酸、ロソクサシン、第２世代、即ちシプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、ベシフロキサシン、デラフロキサシン、クリナフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルリフロキサシン、シタフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド（スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）、テトラサイクリン（デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン）、他の（リポペプチド、フルオロキノロン、脂質化グリコペプチド、セファロスポリン、大環状化合物（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、チニダゾール、ニトロフラントイン、糖ペプチド、バンコマイシン、テイコプラニン、糖脂質ペプチド、テラバンシン、オキサゾリジノン、リネゾリド、シクロセリン２、リファマイシン、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、ポリペプチド、バシトラシン、ポリミキシンＢ、ツベラクチノマイシン、バイオマイシン、カプレオマイシン）が挙げられる。
当業者は、組成物中の各抗生物質の好適な濃度が、有効性、抗生物質の安定性、個別の抗生物質の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｉｉ．抗真菌剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗真菌剤を更に含むことができる。例えば、本明細書に記載される抗真菌剤を含むＰＭＰ組成物を、動物の内部又は表面の抗真菌剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び／又は動物における真菌感染を治療又は予防するのに十分な量且つ時間、動物に投与することができる。本明細書に記載される抗真菌剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗真菌剤を含む。
本明細書で使用される場合、用語「殺真菌剤」又は「抗真菌剤」は、動物に対して病原性である真菌などの真菌を死滅させるか、又はその成長、増殖、分裂、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。多くの異なる種類の抗真菌剤が商業的に製造されている。抗真菌剤の非限定的な例として、アリルアミン（アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール（（ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、テルコナゾール）；トリアゾール（アルバコナゾール、エフィナコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール）、チアゾール（アバファンギン）、ポリエン（アンホテリシンＢ、ニスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン）、エキノキャンディン（アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、その他（トルナフタート、フルシトシン、ブテナフィン、グリセオフルビン、シクロピロクス、硫化セレン、タバボロール）が挙げられる。当業者は、組成物中の各抗真菌薬の好適な濃度が、有効性、抗真菌薬の安定性、個別の抗真菌薬の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｉｉｉ．殺虫剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、殺虫剤を更に含むことができる。例えば、殺虫剤は、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される殺虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）昆虫の内部又は表面の殺虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）昆虫の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、昆虫と接触させることができる。一部の例では、殺虫剤は、寄生昆虫の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される殺虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）寄生昆虫の内部又は表面の殺虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）寄生昆虫の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、寄生昆虫又はその感染動物と接触させることができる。本明細書に記載される殺虫剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる殺虫薬剤を含む。
本明細書で使用される場合、用語「殺虫剤」又は「殺虫薬剤」は、動物病原体の昆虫ベクター又は寄生昆虫などの昆虫を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺虫剤の非限定的な例を、表４に示す。好適な殺虫剤の追加の非限定的な例としては、生物剤、ホルモン又はフェロモン、例えばアザジラクチン、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ボーベリア属（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）種、コドレモン、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ）種、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）種、チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）及びバーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種など、並びに燻蒸剤などの作用機構が不明若しくは特定されていない活性な化合物（リン化アルミニウム、臭化メチル及びフッ化スルフリルなど）及び選択的摂食阻害剤（氷晶石、フロニカミド及びピメトロジンなど）が挙げられる。当業者は、組成物中の各殺虫剤の好適な濃度が、有効性、殺虫剤の安定性、個別の殺虫剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
Figure 2021533794
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ｉｖ．殺線虫剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、殺線虫剤を更に含むことができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる殺線虫剤を含む。例えば、殺線虫剤は、寄生線虫の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される殺線虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）標的線虫の内部又は表面の殺線虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）標的線虫の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、標的線虫又はその感染動物と接触させることができる。本明細書に記載される殺線虫剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「殺線虫剤」又は「殺線虫薬剤」は、寄生線虫などの線虫を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。殺線虫剤の非限定的な例を、表５に示す。当業者は、組成物中の各殺線虫剤の好適な濃度が、有効性、殺線虫剤の安定性、個別の殺線虫剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
Figure 2021533794
ｖ．抗寄生虫薬剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗寄生虫薬剤を更に含むことができる。例えば、抗寄生虫剤は、寄生原生動物の適応度を減少させる（例えば、成長を低下させる又は死滅させる）ことができる。本明細書に記載される抗寄生虫剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）原生動物又はその感染動物の内部又は表面の抗寄生虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）原生動物の適応度を減少させるのに十分な量且つ時間、原生動物と接触させることができる。これは、動物における寄生虫の治療又は予防において有用であり得る。例えば、本明細書に記載される抗寄生虫薬剤を含むＰＭＰ組成物を、動物の内部又は表面の抗寄生虫剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び／又は動物における寄生虫（例えば、寄生線虫、寄生昆虫又は原生動物）感染を治療又は予防するのに十分な量且つ時間、動物に投与することができる。本明細書に記載される抗寄生虫剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗寄生虫薬剤を含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗寄生虫剤」又は「抗寄生虫薬剤」は、寄生原生動物、寄生線虫又は寄生昆虫などの寄生虫を死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖若しくは拡大を阻害する物質を指す。抗寄生虫薬剤の例としては、抗ぜん虫薬（Ａｎｔｉｈｅｌｍｉｎｔｉｃｓ）（ベフェニウム、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、ニクロサミド、ピペラジン、プラジカンテル、ピランテル、ピルビニウム、ベンズイミダゾール、アルベンダゾール、フルベンダゾール、メベンダゾール、チアベンダゾール、レバミソール、ニタゾキサニド、モノパンテル（Ｍｏｎｏｐａｎｔｅｌ）、エモデプシド、スピロインドール）、殺疥癬虫薬（安息香酸ベンジル、安息香酸ベンジル／ジスルフィラム、リンデン、マラチオン、ペルメトリン）、殺シラミ薬（ピペロニルブトキシド／ピレトリン、スピノサド、モキシデクチン）、殺疥癬虫薬（クロタミトン）、抗条虫薬（Ａｎｔｉｃｅｓｔｏｄｅ）（ニクロサミド、プランジカンテル（Ｐｒａｎｚｉｑｕａｎｔｅｌ）、アルベンダゾール）、抗アメーバ薬（Ａｎｔｉａｍｏｅｂｉｃｓ）（リファンピン、アムホテリシン（Ａｐｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ）；又は抗原虫薬（メラルソプロール、エフロルニチン、メトロニダゾール、チニダゾール、ミルテホシン、アルテミシニン）が挙げられる。特定の例では、抗寄生虫薬剤は、家畜動物における感染症を治療又は予防するために使用することができる（例えば、レバミソール、フェンベンダゾール、オキシフェンダゾール、アルベンダゾール、モキシデクチン、エプリノメクチン、ドラメクチン、イベルメクチン又はクロルスロン）。当業者は、組成物中の各抗寄生虫剤の好適な濃度が、有効性、抗寄生虫剤の安定性、個別の抗寄生虫剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｖｉ．抗ウイルス剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、抗ウイルス剤を更に含むことができる。例えば、本明細書に記載される抗ウイルス剤を含むＰＭＰ組成物を、動物の内部又は表面の抗ウイルス濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び／又は動物におけるウイルス感染を治療又は予防するのに十分な量且つ時間、動物に投与することができる。本明細書に記載される抗ウイルス剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる抗ウイルス剤を含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗ウイルス剤」又は「殺ウイルス剤」は、動物を感染させるウイルス性病原体などのウイルスを死滅させるか、又はその成長、増殖、生殖、発達若しくは拡大を阻害する物質を指す。化学物質又は生物学的薬剤（例えば、核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ）を含めた、いくつかの薬剤を、抗ウイルス剤として用いることができる。本明細書で有用な抗ウイルス剤の例としては、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル（アジェネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ））、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、バラビル、シドホビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エコリエベル（Ｅｃｏｌｉｅｖｅｒ）、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（Ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド（Ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（Ｎｅｘａｖｉｒ）、ニタゾキサニド、ヌクレオシド類似体、ノービア、オセルタミビル（タミフル）、ペグインターフェロンα−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピリミジン、サキナビル、ソホスブビル、スタブジン、相乗的エンハンサー（抗レトロウイルス剤）、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ）又はジドブジンが挙げられる。当業者は、組成物中の各抗ウイルス剤の好適な濃度が、有効性、抗ウイルス剤の安定性、個別の抗ウイルス剤の数、製剤及び組成物の適用の方法などの因子に依存することを理解するであろう。
ｖｉｉ．忌避剤
本明細書に記載されるＰＭＰ組成物は、忌避剤を更に含むことができる。例えば、忌避剤は、昆虫などの動物病原体のベクターを忌避することができる。本明細書に記載される忌避剤を、本明細書に記載される方法のいずれかのために、ＰＭＰ組成物に製剤化することができ、特定の例では、そのＰＭＰと結合させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、２種以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０種よりも多い）異なる忌避剤を含む。
例えば、本明細書に記載される忌避剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）忌避剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）動物の近くの又は動物に隣接する昆虫のレベルを、対照に対して低下させるのに十分な量且つ時間、昆虫ベクター又はベクターの生息場所と接触させることができる。代わりに、本明細書に記載される忌避剤を含むＰＭＰ組成物を、（ａ）忌避剤濃度の目標レベル（例えば、あらかじめ決定されたレベル又は閾値レベル）に到達する；及び（ｂ）動物の近くの又は表面の昆虫のレベルを、治療されていない動物に対して低下させるのに十分な量且つ時間、動物と接触させることができる。
周知の昆虫忌避剤のいくつかの例としては、ベンジル；安息香酸ベンジル；２，３，４，５−ビス（ブチル−２−エン）テトラヒドロフルフラル（ＭＧＫ Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ １１）；ブトキシポリプロピレングリコール；Ｎ−ブチルアセトアニリド；ノルマル−ブチル−６，６−ジメチル−５，６−ジヒドロ−１，４−ピロン−２−カルボキシレート（Ｉｎｄａｌｏｎｅ）；アジピン酸ジブチル；フタル酸ジブチル；コハク酸ジ−ノルマル−ブチル（Ｔａｂａｔｒｅｘ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタ−トルアミド（ＤＥＥＴ）；ジメチルカルバート（エンド，エンド）−ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２，３−ジカルボキシレート）；フタル酸ジメチル；２−エチル−２−ブチル−１，３−プロパンジオール；２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（Ｒｕｔｇｅｒｓ ６１２）；イソシンコメロン酸ジ−ノルマル−プロピル（ＭＧＫ Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ ３２６）；２−フェニルシクロヘキサノール；ｐ−メタン−３，８−ジオール及びＮ，Ｎ−ジエチルスクシンアミド酸ノルマル−プロピルが挙げられる。他の忌避剤としては、シトロネラ油、フタル酸ジメチル、シュウ酸ノルマル−ブチルメシチルオキシド及び２−エチルヘキサンジオール−１，３が挙げられる（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１１：７２４−７２８；及びＴｈｅ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，８ｔｈ Ｅｄ．，ｐ７５６を参照されたい）。
一部の例では、忌避剤は、合成又は非合成の昆虫忌避剤を含めた昆虫忌避剤である。合成の昆虫忌避剤の例としては、メチルアントラニレート及び他のアントラニレート系の昆虫忌避剤、ベンズアルデヒド、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）、ジメチルカルバート、フタル酸ジメチル、イカリジン（即ちピカリジン、Ｂａｙｒｅｐｅｌ及びＫＢＲ３０２３）、インダロン（例えば、「６−２−２」混合物（６０％フタル酸ジメチル、２０％インダロン、２０％エチルヘキサンジオール）中で使用される）、ＩＲ３５３５（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル）、メトフルトリン、ペルメトリン、ＳＳ２２０又はトリシクロデセニルアリルエーテルが挙げられる。天然の昆虫忌避剤の例としては、ビューティーベリー（ｂｅａｕｔｙｂｅｒｒｙ）（ムラサキシキブ属（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ））葉、カバノキ樹皮、セイヨウヤチヤナギ（ｂｏｇ ｍｙｒｔｌｅ）（ヤチヤナギ（Ｍｙｒｉｃａ Ｇａｌｅ））、イヌハッカ（ｃａｔｎｉｐ）油（例えば、ネペタラクトン）、シトロネラ油、レモンユーカリ（ユーカリシトリオドラ（Ｃｏｒｙｍｂｉａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）；例えば、ｐ−メンタン−３，８−ジオール（ＰＭＤ））の精油、ニーム油、レモングラス、ティーツリー（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ ａｌｔｅｒｎｉｆｏｌｉａ）の葉由来のティーツリーオイル、タバコ又はそれらの抽出物が挙げられる。
ＩＩＩ．使用の方法
本明細書のＰＭＰは、様々な農業的及び治療的方法に有用である。ＰＭＰ（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を使用する方法の例を、以下に更に記載する。
Ａ．植物への送達
本明細書で提供されるのは、例えば植物又はその部分をＰＭＰ組成物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を植物に送達する方法である。一部の例では、植物は、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで治療することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、農薬用薬剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、殺ウイルス剤、除草薬）、有害生物制御剤（例えば、忌避剤）、施肥剤又は植物改質剤を含む。
一態様では、植物の適応度を増加する方法が本明細書に提供され、この方法は、非処理植物（例えば、ＰＭＰ組成物が送達されていない植物）と比較して、植物の適応度を増加するために、本明細書に記載のＰＭＰ組成物を（例えば、有効量及び有効期間で）植物に送達することを含む。
ＰＭＰ組成物送達の結果としての植物の適応度増加は、いくつかの様式で現れ得るが、例えばそれによって植物の良好な生産、例えば収量の改善、植物の活力又は植物から収穫される産物の質の改善がもたらされる。植物の収量改善は、同じ条件下で生産したが、本組成物を適用していない植物の同じ産物の収量又は従来の農薬の適用と比較して、測定可能な量による植物の産物の収量の増加（例えば、植物バイオマス、穀粒、種子若しくは果実収量、タンパク質含量、炭水化物若しくは油含量又は葉面積により測定されるような）に関する。例えば、収量は、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％若しくは約１００％超増加し得る。収量は、何らかの基準で、植物又は植物の産物の重量若しくは体積当たりの量に関して表すことができる。基準は、時間、栽培面積、生産された植物の重量又は使用した原材料の量に関して表すことができる。例えば、こうした方法は、限定されないが、種子、果汁、穀粒、実、塊茎、根及び葉をはじめとする植物組織の収量を増加し得る。
ＰＭＰ組成物送達の結果としての植物の適応度の増加は、同じ条件下であるが、本組成物を投与していないか、又は従来の農薬を適用して生産された植物の同じ要因と比較して、測定可能な若しくは認識可能な量による、以下の項目の増加若しくは改善：活力評価、作物（単位面積当たりの植物の数）、植物の高さ、茎外周、茎長さ、葉の数、葉の大きさ、植物キャノピー、外観（より緑色の葉色など）、根評価、出芽、タンパク質含量、分げつの増加、より大きい葉、より多くの葉、枯れた根出葉の減少、より強い分げつ力、必要な肥料の減少、必要な種子の減少、より高生産性の分げつ、より早期の開花、早期の穀粒若しくは種子成熟、より少ない植物倒伏（倒伏）、新芽生育増加、早期の発芽又はこれらの任意の組合せなどの他の方法により測定することもできる。
本明細書で提供されるのは、植物の適応度を改変又は増加させる方法であって、本明細書で提供される有効量のＰＭＰ組成物を植物に送達することを含む方法であり、植物を改変し、それにより植物における有益な形質を導入するか、又は治療されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる。特に、この方法は、植物の適応度を、治療されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させることができる、方法である。
一部の例では、植物適応度の増加は、耐病性、乾燥耐性、耐暑性、耐寒性、耐塩性、金属耐性、除草薬耐性、薬剤耐性、水使用効率、窒素利用、窒素ストレスに対する抵抗性、窒素固定、有害生物抵抗性、草食動物抵抗性、病原体抵抗性、収量、水制限条件下での収量、活力、成長、光合成能力、栄養、タンパク質含有量、炭水化物含有量、油含有量、バイオマス、新芽長、根の長さ、根の構造、種子重量又は収穫可能産物の量の、（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
一部の例では、適応度の増加は、発達、成長、収量、非生物的ストレス要因に対する抵抗性又は生物的ストレス要因に対する抵抗性の、（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。非生物的ストレスは、例えば乾燥ストレス、塩類ストレス、熱ストレス、寒冷ストレス及び低栄養ストレスが含まれる、植物又は植物部分が受ける環境的ストレス条件を指す。生物的ストレスは、例えば線虫ストレス、昆虫食害ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス又はウイルス病原体ストレスが含まれる、植物又は植物部分が受ける環境的ストレス条件を指す。このストレスは、一時的、例えば数時間、数日、数か月又は永久的、例えば植物の生涯の間であり得る。
一部の例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の品質の、（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。例えば、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の商業的に好都合な特徴（例えば、味又は外観）の向上であり得る。他の例では、植物適応度の増加は、植物から収穫される産物の貯蔵寿命の、（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加である。
代わりに、適応度の増加は、アレルゲン産生の減少など、ヒト又は動物の健康にとって有益である、形質の変化であり得る。例えば、適応度の増加は、動物（例えば、ヒト）における免疫応答を刺激するアレルゲン（例えば、花粉）の産生の、（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）減少であり得る。
植物の改変（例えば、適応度の増加）は、１つ以上の植物部分の改変に起因し得る。例えば、植物は、植物の葉、種子、花粉、根、果実、新芽、花、細胞、プロトプラスト又は組織（例えば、分裂組織）を接触させることによって改変することができる。従って、別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の花粉を本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の種子を、本明細書に開示される有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物のプロトプラストを本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含む方法であって、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
更なる態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の植物細胞を本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
更なる態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の分裂組織を本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、植物の適応度を増加させる方法であって、植物の胚を本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含み、植物の適応度を、処理されていない植物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増加させる方法である。
ＰＭＰ又はその組成物に除草薬が含まれる場合、この方法は、更に、雑草の適応度を減少させる又は雑草を死滅させるために使用することができる。こうした場合、この方法は、雑草の適応度を、処理されていない雑草（例えば、ＰＭＰ組成物が施されていない雑草）と比較して、約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて減少させるのに有効であり得る。例えば、この方法は、雑草を死滅させ、それにより、雑草の集団を、処理されていない雑草と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて減少させるのに有効であり得る。一部の例では、この方法は、雑草を実質的に排除する。本方法に従って処理することができる雑草の例を、本明細書に更に記載する。
ｉ．植物
様々な植物が、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を送達されるか、又は本明細書に記載されるＰＭＰ組成物で治療することができる。本方法に従ってＰＭＰ組成物を送達する（即ち「治療される」）ことができる植物には、植物全体又はその部分が含まれ、これには、限定はされないが、新芽植物器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、包葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯及び胚珠）、種子（胚、胚乳、子葉及び種皮が含まれる）及び果実（成熟した子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）及び細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）並びにこれらのものの子孫が含まれる。植物部分は、更に、新芽、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、包葉、枝、葉柄、節間部、樹皮、軟毛、分げつ、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄蕊などの植物の部分を指すことができる。
本明細書に開示される方法において治療することができる植物のクラスには、被子植物（単子葉及び双子葉植物）、裸子植物、シダ、トクサ、裸茎植物（ｐｓｉｌｏｐｈｙｔｅｓ）、小葉類（ｌｙｃｏｐｈｙｔｅｓ）、コケ類及び藻類（例えば、多細胞若しくは単細胞藻類）を含めた、高等植物及び下等植物のクラスが含まれる。本方法に従って治療することができる植物には、更に、あらゆる維管束植物、例えば単子葉植物又は双子葉植物又は裸子植物が含まれ、これには、限定はされないが、アルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、バナナ、オオムギ、カノーラ、トウゴマ、キク、クローバー、カカオ、コーヒー、綿、綿実、トウモロコシ、クランベ、クランベリー、アブラナ科植物、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ウシノケグサ属、亜麻、グラジオラス、ユリ科、亜麻仁、雑穀、マスクメロン、カラシ、オーツムギ、アブラヤシ、ナタネ、パパイヤ、ピーナッツ、パイナップル、観賞植物、インゲンマメ属、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギ及び野菜作物、例えばレタス、セロリ、ブロッコリー、カリフラワー、ウリ科植物など；果実及び堅果樹、例えばリンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ペカン、クルミ、ヘーゼルなど；つる植物（ｖｉｎｅ）、例えばブドウ（例えば、ワイン製造用ブドウ園）、キウイ、ホップなど；果実低木及びキイチゴ、例えばラズベリー、ブラックベリー、セイヨウスグリなど；森林樹、例えばトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クルミ、ポプラなど；アルファルファ、カノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿、クランベ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、ジャガイモ、イネ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト又はコムギが含まれる。本発明の方法に従って治療することができる植物には、あらゆる作物植物、例えば、飼料作物、油料種子作物、穀類作物、果実作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、堅果作物、芝作物、砂糖作物、飲料作物及び森林作物が含まれる。特定の例では、この方法において治療される作物植物は、ダイズ植物である。他の特定の例では、作物植物は、コムギである。特定の例では、作物植物は、トウモロコシである。特定の例では、作物植物は、綿である。特定の例では、作物植物は、アルファルファである。特定の例では、作物植物は、テンサイである。特定の例では、作物植物は、イネである。特定の例では、作物植物は、ジャガイモである。特定の例では、作物植物は、トマトである。
特定の例では、植物は、作物である。こうした作物植物の例としては、単子葉及び双子葉植物が挙げられ、これには、限定はされないが、カエデ属（Ａｃｅｒ）種、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）種、アマランサス属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）種、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、セロリ（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）種、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）種（カノーラ、ナタネ、アブラナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ））、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ ｉｎｄｉｃａ）、大麻サライバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）種、クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）種、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）、シトルラス・ラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、カンキツ属（Ｃｉｔｒｕｓ）種、ココヤシ属（Ｃｏｃｏｓ）種、コーヒー属（Ｃｏｆｆｅａ）種、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、ハシバミ属（Ｃｏｒｙｌｕｓ）種、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）種、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）種、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）種、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ブナ属（Ｆａｇｕｓ）種、フィクス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）種、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、グリシン属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種（例えば、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソーヤ・ヒスピダ（Ｓｏｊａ ｈｉｓｐｉｄａ）若しくはソーヤ・マックス（Ｓｏｊａ ｍａｘ））、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）種（例えば、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ハイビスカス属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）種、ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、ジュグランス属（Ｊｕｇｌａｎｓ）種、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、リッチ・チネンシス（Ｌｉｔｃｈｉ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）種、ルッファ・アクタングラ（Ｌｕｆｆａ ａｃｕｔａｎｇｕｌａ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）種、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）種（例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）、リコペルシコン・リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｙｒｉｆｏｒｍｅ））、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ハッカ属（Ｍｅｎｔｈａ）種、ミスカンサス・シネンシス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、モルス・ニグラ（Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）種、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種、オリーブ属（Ｏｌｅａ）種、イネ属（Ｏｒｙｚａ）種（例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、オリザ・ラチフォリア（Ｏｒｙｚａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））、パニカム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、パニカム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パッシフロラ・エドゥリス（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、ペトローズリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）種、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種、ピスタシア・ヴェラ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｖｅｒａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）種、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）種、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）種、ピルス・コムニス（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）種、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、レウム・ラバルバルム（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）種、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）種、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種、ニワトコ属（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）種、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ゴマ属（Ｓｅｓａｍｕｍ）種、シロガラシ属（Ｓｉｎａｐｉｓ）種、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）種（例えば、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ソラナム・インテグリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｍ）又はトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）種、タマリンヅス・インディカ（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ ｉｎｄｉｃａ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、ジャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）種、トリチコセケル・リンパウイ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ ｒｉｍｐａｕｉ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、デュラムコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、リベットコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、トリチカム・ハイベルナム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｈｙｂｅｒｎｕｍ）、トリチカム・マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍａｃｈａ）、トリチカム・サティヴァム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）若しくはトリチカム・バルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）種、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）種、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）種、ビオラ・オドラータ（Ｖｉｏｌａ ｏｄｏｒａｔａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）種及びトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）から選択される飼料若しくはマメ科牧草、観賞植物、食用作物、樹木又は低木が含まれる。ある種の実施形態では、作物植物は、イネ、ナタネ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（トウモロコシ）、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ又はコムギである。
特定の例では、本組成物及び方法を使用して、収穫後の植物若しくは植物部分、食品又は飼料製品を処理することができる。一部の例では、食品又は飼料製品は、非植物食品又は飼料製品（例えば、ヒト、動物又は家畜が摂食可能な製品（例えば、キノコ））である。
本発明で使用するための植物又は植物部分には、あらゆる植物発生段階の植物を含む。特定の例では、送達は、発芽、苗木成長、栄養成長及び生殖成長の段階で行うことができる。特定の例では、植物への送達は、栄養成長及び生殖成長段階で行う。代わりに、送達は、種子に対して行うことができる。栄養成長及び生殖成長の段階は、本明細書では「成体」又は「成熟」植物とも称される。
ｉｉ．雑草
ＰＭＰ又はその組成物に除草薬が含まれる場合、本方法は、更に、雑草の適応度を減少させる又は雑草を死滅させるために使用することができる。こうした場合、この方法は、雑草の適応度を、処理されていない雑草（例えば、ＰＭＰ組成物が施されていない雑草）と比較して、約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて減少させるのに有効であり得る。例えば、この方法は、雑草を死滅させ、それにより、雑草の集団を、処理されていない雑草と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて減少させるのに有効であり得る。一部の例では、この方法は、雑草を実質的に排除する。本方法に従って処理することができる雑草の例を、本明細書に更に記載する。
本明細書で使用される場合、用語「雑草」は、それが望まれない場所に成長する植物を指す。こうした植物は、典型的には侵襲性であり、ときに有害であるか又は有害となるリスクがある。雑草を本ＰＭＰ組成物で処理して、その植物の存在、生存能力若しくは生殖を減少又は排除することができる。例えば、限定はされないが、この方法を用いて、植物を損傷させることがわかっている雑草を標的にすることができる。例えば、限定はされないが、雑草は、以下の科の群のあらゆるメンバーであり得る：イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）、蝶形花亜科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｆｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｆｕｍａｒｉａｃｅａｅ）、カリオフィラセアエ科（Ｃｈａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）、イグサ科（Ｊｕｎｃａｃｅａｅ）、カヤツリグサ科（Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅ）、ハマミズナ科（Ａｉｚｏａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）、スベリヒユ科（Ｐｏｒｔｕｌａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）、アケビ科（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、ヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ガガイモ科（Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ）、ニシキギ科（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、ツユクサ科（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、マツムシソウ科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）、トクサ科（Ｅｑｕｉｓｅｔａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、オトギリソウ科（Ｈｙｐｅｒｉａｃａｃｅａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、ミゾカクシ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、オシロイバナ科（Ｎｙｃｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、カタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、イラクサ科（Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ）、ウラボシ科（Ｐｏｌｙｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、サルトリイバラ科（Ｓｍｉｌａｃａｃｅａｅ）、サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ）、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ）、ガマ科（Ｔｙｐｈａｃｅａｅ）、オミナエシ科（Ｖａｌｅｒｉａｎａｃｅａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）。例えば、限定はされないが、雑草は、ロリウム・リジヅム（Ｌｏｌｉｕｍ Ｒｉｇｉｄｕｍ）、アマランサス・パルメリ（Ａｍａｒａｍｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ）、アブチロン・テオプラツィ（Ａｂｕｔｉｌｏｎ ｔｈｅｏｐｒａｔｓｉ）、ソルガム・ハレペンセ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、コニザ・カナデンシス（Ｃｏｎｙｚａ Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、セタリア・ベルチシラタ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）、カプセラ・パストリス（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びシペルス・ロツンダス（Ｃｙｐｅｒｕｓ ｒｏｔｕｎｄａｓ）からなる群のあらゆるメンバーであり得る。追加の雑草として、例えばミモサピグラ（Ｍｉｍｏｓａｐｉｇｒａ）、サンショウモ（ｓａｌｖｉｎｉａ）、イガニガクサ（ｈｙｐｔｉｓ）、センナ（ｓｅｎｎａ）、大オナモミ（ｎｏｏｇｏｏｒａ）、バー（ｂｕｒｒ）、ジャトロファ・ゴシピフォルフリア（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｇｏｓｓｙｐｉｆｏｌｉａ）、パーキンソニア・アクレアタ（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａ ａｃｕｌｅａｔｅ）、ヒマワリヒヨドリ（Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ ｏｄｏｒａｔａ）、オオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｌｅｇｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）又はアンドロポゴン・ガヤヌス（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇａｙａｎｕｓ）が含まれる。雑草には、単子葉植物（例えば、ヌカボ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、スズメノテッポウ属（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、スズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）、カヤツリグサ属（Ｃｙｐｅｒｕｓ）、メヒシバ属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、ヒエ属（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ミズアオイ属（Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ）、ツノアイアシ属（Ｒｏｔｔｂｏｅｌｌｉａ）、オモダカ属（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）、ホタルイ属（Ｓｃｉｒｐｕｓ）、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）、シダ属（Ｓｉｄａ）若しくはモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ））又は双子葉植物（アブチロン属（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、アマランサス属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、イズハハコ属（Ｃｏｎｙｚａ）、カエムグラ属（Ｇａｌｉｕｍ）、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｅａ）、キンレンカ属（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ）、シナピス属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ハコベ属（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ）、ベロニカ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）、ビオラ属（Ｖｉｏｌａ）若しくはオナモミ属（Ｘａｎｔｈｉｕｍ））が含まれ得る。
本組成物及び関連方法を使用して、土壌、水の内部又は表面の、病原体又は病原体ベクターが存在する任意の生息場所（例えば、動物の外側、例えば、植物、植物部分（例えば、根、果実及び種子）上又は別の病原体若しくは病原体ベクター生息場所上の、病原体又は病原体ベクターによる侵入を予防する又は病原体又は病原体ベクターの数を減少させることができる。従って、この組成物及び方法は、例えば、ベクターを死滅させるか、損傷を与えるか又はベクターの活動を遅くすることによって病原体ベクターの損傷の影響を減少させることができ、それによって動物への病原体の拡大を制御することができる。本明細書に開示される組成物を使用して、あらゆる発達段階、例えば、その卵、若虫、齢、幼生、生体、幼若体又は弱った（ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）形態のあらゆる病原体又は病原体ベクターの１つ以上を制御するか、死滅させるか、損傷を与えるか、麻痺させるか又は病原体又は病原体ベクターの活性を低下させることができる。これらの方法のそれぞれの詳細を、以下に更に記載する。
Ｂ．植物有害生物への送達
本明細書で提供されるのは、例えば植物有害生物をＰＭＰ組成物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を植物有害生物に送達する方法である。一部の例では、植物有害生物は、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで処理することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、農薬用薬剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、殺ウイルス剤、除草薬）、有害生物制御剤（例えば、忌避剤）を含む。例えば、この方法は、ＰＭＰ組成物の送達の結果として、有害生物の適応度を減少させるのに、例えば、有害生物侵入を予防又は治療するために有用であり得る。
一態様では、本明細書で提供されるのは、有害生物の適応度を減少させる方法であって、有害生物の適応度を、処理されていない有害生物（例えば、ＰＭＰ組成物を送達されていない有害生物）に対して減少させるために、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を、（例えば、有効量で且つ有効な期間）有害生物に送達することを含む方法である。
一態様では、本明細書には、真菌感染を有する植物における真菌感染を低減させる（例えば、処置する）方法が提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害生物に送達することを含む。
別の態様では、本明細書には、真菌感染を有する植物における真菌感染を低減させる（例えば、処置する）方法が提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害生物に送達することを含み、複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む。一部の例では、抗真菌剤は、真菌感染を引き起こす真菌中の遺伝子（例えば、ｄｃｌ１及びｄｃｌ２（例えば、ｄｃｌ１／２）の発現を阻害する核酸である。一部の例では、真菌感染は、スクレロチニア属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｐ．）（例えば、スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ．）（例えば、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ））、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）又はアオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）に属する真菌に起因する。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＥＶから産生されるＰＭＰを含む。一部の例では、本方法は、真菌感染を低減させるか又は実質的に排除する。
別の態様では、細菌感染を有する植物における細菌感染を低減させる（例えば、処置する）方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害生物に送達することを含む。
別の態様では、細菌感染を有する植物における細菌感染を低減させる（例えば、処置する）方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物を植物有害生物に送達することを含み、複数のＰＭＰは、抗菌剤を含む。一部の例では、抗菌剤は、ストレプトマイシンである。一部の例では、細菌感染は、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）に属する細菌（例えば、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ））に起因する。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＥＶから産生されるＰＭＰを含む。一部の例では、本方法は、細菌感染を低減させるか又は実質的に排除する。
別の態様では、植物有害昆虫の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害昆虫に送達することを含む。
別の態様では、植物有害昆虫の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害昆虫に送達することを含み、複数のＰＭＰは、殺虫剤を含む。一部の例では、殺虫剤は、ペプチド核酸である。一部の例では、植物有害昆虫は、アブラムシである。一部の例では、植物有害昆虫は、鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）（例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））である。一部の例では、本方法は、非処理植物有害昆虫に対して植物有害昆虫の適応度を低減させる。
別の態様では、植物有害線虫の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害線虫に送達することを含む。
別の態様では、植物有害線虫の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を植物有害線虫に送達することを含み、複数のＰＭＰは、殺線虫剤を含む。一部の例では、殺線虫剤は、神経ペプチド（例えば、Ｍｉ−ＮＬＰ−１５ｂ）である。一部の例では、植物有害線虫は、トウモロコシネコブセンチュウ（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ）である。一部の例では、本方法は、非処理植物有害線虫に対して植物有害線虫の適応度を低減させる。
別の態様では、雑草の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物のいずれか）を雑草に送達することを含む。
別の態様では、雑草の適応度を低減させる方法が本明細書に提供され、この方法は、複数のＰＭＰを含有するＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物のいずれか）を雑草に送達することを含み、複数のＰＭＰは、除草剤（例えば、グルホシネート）を含む。一部の例では、雑草は、オヒシバ（Ｉｎｄｉａｎ ｇｏｏｓｅｇｒａｓｓ）（オヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｉｎｄｉｃａ））である。一部の例では、本方法は、非処理雑草に対して雑草の適応度を低減させる。
ＰＭＰ組成物送達の結果としての有害生物の適応度低減は、いくつかの様式で現れ得る。一部の例では、有害生物の適応度の低減は、ＰＭＰ組成物の送達の結果としての有害生物の生理の劣化又は低減（例えば、健康又は生存の低減）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、生殖能力、寿命、生存能力、移動性、繁殖力、有害生物成長、体重、代謝率若しくは活動又は生存を含む１つ以上のパラメータにより、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物との比較で測定され得る。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、有害生物の全般的な健康を低減させるか又は有害生物の全生存を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、有害生物の生存の減少は、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超高い。一部の例では、本方法及び組成物は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物に対して有害生物の繁殖（例えば、繁殖率、生殖能力）を減少させるのに有効である。一部の例では、本方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、生殖能力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超減少させるのに有効である。
一部の例では、有害生物適応度の低減は、ＰＭＰ組成物が投与されていない有害生物と比較した有害生物内の１つ以上の栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の産生の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、有害生物における栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の産生量を参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効であり得る。
一部の例では、有害生物適応度の低減は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物と比較した、農薬用薬剤に対する有害生物の感受性の上昇及び／又は農薬用薬剤に対する有害生物の抵抗性の減少として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤に対する有害生物の感度を参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超上昇させるのに有効であり得る。農薬用薬剤は、殺虫性薬剤を含め、当技術分野において公知の任意の農薬用薬剤であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、ＰＭＰ組成物が投与されていない有害生物に対して、農薬用薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する有害生物の能力を低減させることにより、農薬用薬剤に対する有害生物の感受性を高めることができる。
一部の例では、有害生物適応度の低減は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物と比較した、アレロケミカル薬剤に対する有害生物の感受性の増加及び／又はアレロケミカル薬剤に対する有害生物の抵抗性の低減として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、アレロケミカル薬剤に対する有害生物の抵抗性を参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効であり得る。一部の例では、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチン、フェニトロチオン、モノテルペン類、ジテルペン酸又はフェノール化合物（例えば、タンニン、フラボノイド）である。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物に対して、有害生物のアレロケミカル薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する能力を低減させることにより、アレロケミカル薬剤に対する有害生物の感受性を増加させることができる。
一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物に対して、寄生虫又は病原体（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体又は寄生虫）に対する有害生物の抵抗性を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、病原体又は寄生虫（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ）に対する有害生物の抵抗性を参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効であり得る。
一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、ＰＭＰ組成物が投与されていない有害生物に対して、植物病原体（例えば、植物ウイルス（例えば、ＴＹＬＣＶ）又は植物細菌（例えば、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）））を担持又は伝播する有害生物の能力を低減させるのに有効であり得る。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、植物病原体（例えば、植物ウイルス（例えば、ＴＹＬＣＶ）又は植物細菌（例えば、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）））を担持又は伝播する有害生物の能力を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない有害生物に見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低減させるのに有効であり得る。
上記に加えて又はその代わり、ＰＭＰ若しくはその組成物に除草剤が含まれる場合、本方法は更に、雑草の適応度を低減させるか又は雑草を枯れさせるために使用することもできる。こうした例では、本方法は、雑草の適応度を非処理雑草（例えば、ＰＭＰ組成物を投与されていない雑草）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて低減させるのに有効であり得る。例えば、本方法は、雑草を枯れさせる上で有効であり、これにより非処理雑草と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて雑草の個体群を減少させ得る。一部の例では、本方法は、雑草を実質的に排除する。本方法に従って処理することができる雑草の例については、本明細書に更に記載する。
一部の例では、有害生物適応度の低減は、ＰＭＰ組成物を投与されていない有害生物と比較した、特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の低減、特定の生息場所で生き延びる能力の低減又は特定の食餌を持続する能力の低減など、他の適応上の不利点として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の複数の方法で有害生物適応度を低減させるのに有効であり得る。更に、ＰＭＰ組成物は、任意の数の有害生物綱、目、科、属又は種（例えば、１つの有害生物種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００若しくはそれを超える有害生物種）における有害生物適応度を低減させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、単一の有害生物綱、目、科、属又は種に作用する。
有害生物適応度は、当技術分野における任意の標準方法を用いて判定され得る。一部の例では、有害生物適応度は、個々の有害生物を評価することにより判定され得る。代わりに、有害生物適応度は、有害生物個体群を評価することにより判定され得る。例えば、有害生物適応度の低減は、他の昆虫との競合の成功の低減として現れ、それが有害生物個体群サイズの減少につながり得る。
ｉ．真菌
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、真菌の適応度を低減させる、例えば植物への真菌感染を予防又は処置する上で有用であり得る。ＰＭＰ組成物を真菌と接触させることにより、ＰＭＰ組成物を真菌に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、ＰＭＰ組成物を植物と接触させることにより、真菌感染のリスクがあるか、又は真菌感染を有する植物にＰＭＰ組成物を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、植物に、以下に挙げる真菌性病害を引き起こす真菌への送達に好適である：
例えば、以下のようなうどんこ病（ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ）病原体に起因する病害：ブルメリア属（Ｂｌｕｍｅｒｉａ）種、例えばブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）；ポドスファエラ属（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）種、例えばポドスファエラ・レウコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）；スファエロテカ属（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）種、例えばスファエロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）；ウンシヌラ属（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）種、例えばウンシヌラ・ネカトル（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）；
例えば、以下のようなさび病（ｒｕｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）病原体に起因する病害：ギムノスポランギウム属（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）種、例えばギムノスポランギウム・サビナエ（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓａｂｉｎａｅ）；ヘミレイア属（Ｈｅｍｉｌｅｉａ）種、例えばヘミレイア・バスタトリクス（Ｈｅｍｉｌｅｉａ ｖａｓｔａｔｒｉｘ）；ファコプソラ属（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ）種、例えばファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）及びファコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｍｅｉｂｏｍｉａｅ）；プッシニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、例えばプッシニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、Ｐ．トリシチナ（Ｐ．ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、Ｐ．グラミニス（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）又はＰ．ストリフォルミス（Ｐ．ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）若しくはＰ．ホルデイ（Ｐ．ｈｏｒｄｅｉ）；ウロミセス属（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ）種）、例えばウロミセス・アペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）；
例えば、以下のような卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する病原体に起因する病害：アルブゴ属（Ａｌｂｕｇｏ）種、例えばアルグゴ・カンジダ（Ａｌｇｕｂｏ ｃａｎｄｉｄａ；ブレミア属（Ｂｒｅｍｉａ）種、例えばブレミア・ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）；ペロノスポラ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｉｓｉ）、Ｐ．パラシチカ（Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）又はＰ．ブラシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；プラスモパラ属（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）種、例えばプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）；プセウドペロノスポラ属（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばプセウドペロノスポラ・フムリ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｕｍｕｌｉ）又はプセウドペロノスポラ・クベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）；ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種、例えばピシウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）；
例えば以下のものに起因する斑点病（ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）及び萎凋病（ｌｅａｆ ｗｉｌｔ）：アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、例えばアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）；セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）種、例えばセルコスポラ・ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｂｅｔｉｃｏｌａ）；クラジオスポルム属（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｕｍ）種、例えばクラジオスポリウム・ククメリヌム（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）；コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例えばコクリオボルス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（分生子形態：ドレクスレラ属（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、同義：ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、コクリオボルス・ミヤベアヌス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）；コレトトリクム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）種、例えばコレトトリクム・リンデムタニウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈａｎｉｕｍ）；シクロコニウム属（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ）種、例えばシクロコニウム・オレアギヌム（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ ｏｌｅａｇｉｎｕｍ）；ジアポルテ属（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ）種、例えばジアポルテ・シトリ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ）；エルシノエ属（Ｅｌｓｉｎｏｅ）種、例えばエルシノエ・ファウセッチイ（Ｅｌｓｉｎｏｅ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ）；グロエオスポリウム属（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、例えばグロエオスポリウム・ラエチコロル（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌａｅｔｉｃｏｌｏｒ）；グロメレラ属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）種、例えばグロメレラ・シングラタ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）；グイグナルジア属（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ）種、例えばグイグナルジア・ビドウェリ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ ｂｉｄｗｅｌｌｉ）；レプトスファエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、例えばレプトスファエリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）、レプトスファエリア・ノドルム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）種、例えばマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）；ミクロドキウム属（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）種、例えばミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）；ミコスファエレラ属（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）種、例えばミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｍ．アラキジコラ（Ｍ．ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）及びＭ．フィフィエンシス（Ｍ．ｆｉｆｉｅｎｓｉｓ）；ファエオスファエリア属（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、例えばファエオスファエリア・ノドルム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；ピレノホラ属（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例えばピレノホラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）、ピレノホラ・トリチシ・レペンチス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｒｉｔｉｃｉ ｒｅｐｅｎｔｉｓ）；ラムラリア属（Ｒａｍｕｌａｒｉａ）種、例えばラルムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、ラルムラリア・アレオラ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ ａｒｅｏｌａ）；リンコスポリウム属（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、例えばリンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓ）；セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）種、例えばセプトリア・アピイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ａｐｉｉ）、セプトリア・リコペルシイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｉ）；チフラ属（Ｔｙｐｈｕｌａ）種、例えばチフラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔａ）；ベンツリア属（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）種、例えばベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）；
例えば、以下のものに起因する、根及び茎の病害（ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅｓ）：コルチシウム属（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ）種、例えばコルチシウム・グラミネアルム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えばフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；ガエウマンノミセス属（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）種、例えばガエウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）；ガエウマンノミセス属（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）種、例えばガエウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）；リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）；
サロクラジウム病（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばサロクラジウム・オリゼ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；
スクレロチウム病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばスクレロチウム・オリゼ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；
タペシア属（Ｔａｐｅｓｉａ）種、例えばタペシア・アクホルミス（Ｔａｐｅｓｉａ ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）；チエラビオプシス属（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）種、例えばチエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）；
例えば、以下のものに起因する穂（ｅａｒ ａｎｄ ｐａｎｉｃｌｅ）（コーン穂軸を包含する）の病害：アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、例えばアルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ．）；アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）；クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、例えばクラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）；クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）種、例えばクラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）；フザリウム属種、例えばフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）種、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）；モノグラフェラ属（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ）種、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ ｎｉｖａｌｉｓ）；セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）種、例えばセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；
例えば、以下の黒穂菌類（ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ）に起因する病害：スファセロテカ属（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ）種、例えばスファセロテカ・レイリアナ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ ｒｅｉｌｉａｎａ）；チレチア属種（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）種、例えばチレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）、Ｔ．コントロベルサ（Ｔ．ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）；ウロシスチス属（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ）種、例えばウロシスチス・オクルタ（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ ｏｃｃｕｌｔａ）；ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種、例えばウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ）、Ｕ．ヌダ・トリチシ（Ｕ．ｎｕｄａ ｔｒｉｔｉｃｉ）；
例えば、以下のものに起因する果実の腐敗：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）；ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、例えばボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、例えばペニシリウム・エキスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）及びＰ．プルプロゲナム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）；スクレロチニア属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）種、例えばスクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ）種、例えばベルチシリウム・アルボアトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ）；
例えば、以下のものに起因する種子及び土壌が媒介する腐食、カビ、萎凋、腐敗及び立枯れ性の病害（ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ ｄｉｓｅａｓｅ）：アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、例えばアルテルナリア・ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）に起因するもの；アファノミセス属（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ）種、例えばアファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）に起因するもの；アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）種、例えばアスコキタ・レンチス（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｌｅｎｔｉｓ）に起因するもの；アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、例えばア、スペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）に起因するもの；クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、例えばクラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ）に起因するもの；コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例えばコクリオボルス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）；（分生子形態：ドレクスレラ属（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）：ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）と同義）に起因するもの；コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）種、例えばコレトトリカム・コッコデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｄｅｓ）に起因するもの；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えばフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）に起因するもの；ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）種、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）に起因するもの；マクロフォミナ属（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）種、例えばマクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）に起因するもの；モノグラフェラ属（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ）種）、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ ｎｉｖａｌｉｓ）に起因するもの；ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、例えばペニシリウム・エキスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）に起因するもの；フォーマ属（Ｐｈｏｍａ）種、例えばフォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ）に起因するもの；フォモプシス属（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ）種、例えばフォモプシス・ソジャエ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｏｊａｅ）に起因するもの；フィトフトラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種、例えばフィトフトラ・カクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）に起因するもの；ピレノホラ属（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例えばピレノフォラ・グラミネア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ）に起因するもの；ピリクラリア属（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）種、例えばピリクラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；フィチウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種、例えばフィチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）に起因するもの；リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）に起因するもの；リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、例えばリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；スクレロチウム属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）種、例えばスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ）に起因するもの；セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）種、例えばセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）に起因するもの；チフラ属（Ｔｙｐｈｕｌａ）種、例えばチフラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ ｉｎｃａｒｎａｔａ）に起因するもの；ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、例えばベルチシリウム・ダーリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）に起因するもの；
例えば、以下のものに起因する癌腫病、虫こぶ及び天狗巣病（ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ）：ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）種、例えばネクトリア・ガリゲナ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｇａｌｌｉｇｅｎａ）に起因するもの；
例えば、以下のものに起因する萎凋病（ｗｉｌｔ ｄｉｓｅａｓｅ）：モニリニア属（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ）種、例えばモニリニア・ラキサ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｌａｘａ）に起因するもの；
例えば、以下のものに起因する葉ぶくれ病（ｌｅａｆ ｂｌｉｓｔｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）又は葉巻病（ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｄｉｓｅａｓｅ）：エクソバシジウム属（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ）種、例えばエクソバシジウム・ベキサンス（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｖｅｘａｎｓ）に起因するもの；
タフリナ属（Ｔａｐｈｒｉｎａ）種、例えばタフリナ・デフォルマンス（Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）；
例えば、以下のものに起因する木本植物の変性病害：例えば、ファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｍｏｎｉｅｌｌａ ｃｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエオアクレモニウム・アレオフィラム（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｅｏｐｈｉｌｕｍ）及びフォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）に起因するエスカ病（Ｅｓｃａ ｄｉｓｅａｓｅ）；例えば、ユータイパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ ｌａｔａ）に起因するユータイパ・ダイバック（Ｅｕｔｙｐａ ｄｙｅｂａｃｋ）；例えば、ガノデルマ・ボニネンセ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）に起因するガノデルマ病（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｄｉｓｅａｓｅ）；例えば、リギドポルス・リグノサス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ ｌｉｇｎｏｓｕｓ）に起因するリギドポルス病（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）；
例えば、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、例えばボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）に起因する花及び種子の病害；
例えば、以下のものに起因する植物塊茎の病害：例えば、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）；ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）種、例えばヘルミントスポリウム・ソラニ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）；
例えば、プラスモディオフォラ属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ）種、例えばプラスモディオフォラ・ブラシカエ（Ｐｌａｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に起因する根こぶ；
例えば、以下の細菌性病原体に起因する病害：キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種、例えばキサントモナス・カムペストリス ｐｖ．オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えばシュードモナス・シリンガエ ｐｖ．ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）；エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）種、例えばエルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）。
例えば、以下のものなどに起因する、葉、茎、鞘及び種子に対する真菌性病害である：アルテルナリア斑点病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（アルテルナリア属種アトランス・テニュイッシマ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｅｃ．ａｔｒａｎｓ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ））、炭疽病（コレトトリクム・グロエオスポロイデス・デマティウム ｖａｒ．トランケイタム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｏｉｄｅｓ ｄｅｍａｔｉｕｍ ｖａｒ．ｔｒｕｎｃａｔｕｍ））、褐紋病（ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ）（セプトリア・グリシネス（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、紫斑病（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ａｎｄ ｂｌｉｇｈｔ）（セクロスポラ・キクチイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ））、コアネホラ葉枯病（ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ）（コアネフォラ・インファンディブリフェラ・トリスポラ（（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｉｆｅｒａ ｔｒｉｓｐｏｒａ（同義）））、ダクチュリオフォラ斑点病（ｄａｃｔｕｌｉｏｐｈｏｒａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（ダクチュリオフォラ・グリシネス（（Ｄａｃｔｕｌｉｏｐｈｏｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、べと病（ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ）（ペロノスポラ・マンシュリカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ））、ドレクスレラ胴枯病（ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｂｌｉｇｈｔ）（ドレクスレラ・グリシニ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｉ））、斑点病（ｆｒｏｇｅｙｅ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（セルコスポラ・ソジナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ））、そばかす病（ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（レプトスファエルリナ・トリフォリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ））、灰星病（ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（フィロスティカ・ソジャエコラ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ ｓｏｊａｅｃｏｌａ））、さや及び茎焼枯病、うどんこ病（ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ）（ミクロスファエラ・ディフューザ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ ｄｉｆｆｕｓａ））、ピレノカエタ斑点病（ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ）（ピレノカエタ・グリシネス（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、リゾクトニア・エリアル（ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ａｅｒｉａｌ）、葉腐病（ｆｏｌｉａｇｅ）及びくもの巣焼枯れ病（ｗｅｂ ｂｌｉｇｈｔ）（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ））、さび病（ファコプソラ・パチライジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、ファコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｍｅｉｂｏｍｉａｅ））、黒とう病（ｓｃａｂ）（（スファセロマ・グリシネス（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、ステムフィリウム葉枯病（ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ）（（ステムフィリウム・ボトリオサム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ））、紫斑点病（コリネスポラ・カッシイコラ（（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ））。
例えば、以下のものに起因する、根及び茎基部に対する真菌性病害：黒根腐病（ｂｌａｃｋ ｒｏｏｔ ｒｏｔ）（カロネクトリア・クロタラリアエ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ ｃｒｏｔａｌａｒｉａｅ））、炭腐病（マクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ））、フザリウム焼枯病又は萎凋病、根腐並びにさや及び頸領腐れ（フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オルトセラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｒｔｈｏｃｅｒａｓ）、フザリウム・セミテクタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）、フザリウム・エクイセチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ）、マイコレプトディスカス根腐（マイコレプトディスカス・テレストリス（Ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ））、ネオコスモスポラ（ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）（ネオコスモスポラ・バスインフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ））、さや及び茎焼枯病（ディアポルセ・ファセオロラム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ））、茎胴枯れ（ディアポルセ・ファセオロラムｖａｒ．カウリボラ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ ｖａｒ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ））、フィトフソラ（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）腐れ（フィトフソラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ））、褐色茎腐れ（フィアロフォラ・グレガータ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｇｒｅｇａｔａ））、ピチウム（ｐｙｔｈｉｕｍ）腐れ（ピチウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、ピチウム・イレギュラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ピチウム・デバリアナム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、ピチウム・ミリオチラム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ）、ピチウム・ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ））、リゾクトニア根腐れ、茎腐敗及び立枯病（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ））、スクレロチニア（ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）茎腐敗（スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、スクレロチニア（ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）白絹病（スクレロチニア・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｒｏｌｆｓｉｉ））、チエラビオプシス（ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）根腐れ（チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ））。
特定の例では、真菌は、スクレロチニア属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｐ）である。特定の例では、真菌は、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐｐ）である。特定の例では、真菌は、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓｐｐ）である。特定の例では、真菌は、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ）である。特定の例では、真菌は、アオカビ属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ）である。
本発明の組成物は、様々な真菌防除用途において有用である。前述した組成物を使用して、収穫前の真菌性植物病原体又は収穫後の真菌病原体を防除することができる。一実施形態では、前述した組成物のいずれかを用いて、植物、植物周辺区域又は食用の栽培キノコ、キノコ菌糸又はキノコ堆肥に組成物を適用することにより、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）種、バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種又はピチウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種などの標的病原体を防除する。別の実施形態では、本発明の組成物を用いて、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）種、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はコレトトリクム属（（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）種などの収穫後病原体を防除する。
表６は、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物及び関連方法を用いて処置又は予防することができる真菌、それに関連する植物病害の更なる例を記載する。
Figure 2021533794
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ｉｉ．細菌
例えば、植物における細菌感染を予防又は処置するために、ＰＭＰ組成物及び関連方法は、細菌の適応度を低減させる上で有用であり得る。ＰＭＰ組成物を細菌と接触させることにより、ＰＭＰ組成物を細菌に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、ＰＭＰ組成物を植物と接触させることにより、細菌感染のリスクがあるか、又は細菌感染を有する植物にバイオ農薬を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、以下に更に記載する任意の細菌を含め、細菌又はそれに感染した植物への送達に適している。例えば、細菌は、アクチバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）又はプロテバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属するもの、例えばブルクホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ミクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）及びリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に属する細菌であり得る。
一部の例では、細菌は、アシドボラキス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．）であり、以下を含む：例えば、アシドボラキス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．ａｖｅｎａｅ）（＝シュードモナス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．アベナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．ａｖｅｎａｅ）、アシドボラキス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．カトレイアエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃａｔｔｌｅｙａｅ）（＝シュードモナス・カトレイアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｔｔｌｅｙａｅ））又はアシドボラキス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．シトルリ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｌｉ）（＝シュードモナス・シュードアルカリゲネス ｓｕｂｓｐ．シトルリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｌｉ）、シュードモナス・アベナエ ｓｕｂｓｐ．シトルリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ．Ｃｉｔｒｕｌｌｉ）。
一部の例では、細菌は、ブルクホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｅｃ．）であり、以下を含む：例えば、ブルクホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）（＝シュードモナス・アンドロポゴニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、シュードモナス・ウッドシイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｏｏｄｓｉｉ））、ブルクホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）（＝シュードモナス・カリオフィリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ））、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）（＝シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ））、ブルクホルデリア・グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ）（＝シュードモナス・グラジオリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉｏｌｉ））、ブルクホルデリア・グラジオリ ｐｖ．アガリシコラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ａｇａｒｉｃｉｃｏｌａ）（＝シュードモナス・グラジオリ ｐｖ．アガリシコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ａｇａｒｉｃｉｃｏｌａ））、ブルクホルデリア・グラジオリ ｐｖ．アリイコラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ａｌｌｉｉｃｏｌａ）（＝シュードモナス・グラジオリ ｐｖ．アリイコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ａｌｌｉｉｃｏｌａ）、ブルクホルデリア・グラジオリ ｐｖ．グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ｇｌａｄｉｏｌｉ）（即ちシュードモナス・グラジオリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉｏｌｉ）、シュードモナス・グラジオリ ｐｖ．グラジオリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌａｄｉｏｌｉ ｐｖ．ｇｌａｄｉｏｌｉ））、ブルクホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）（即ちシュードモナス・グルマエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ））、ブルクホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）（即ちシュードモナス・プランタリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉ））、ブルクホルデリア・ソラナセアルム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（即ちラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）又はラルストニア属種（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐｐ．）。
一部の例では、細菌は、カンジダツス・リベリバクテル属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃ．）をはじめとするリベリバクテル属種（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）であり、これは以下を含む：例えば、カンジダツス・リベリバクテル・アシアチクス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、リベリバクテル・アフリカヌス（Ｌａｆ）（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｆｒｉｃａｎｕｓ（Ｌａｆ））、リベリバクテル・アメリカヌス（Ｌａｍ）（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ（Ｌａｍ））、リベリバクテル・アシアチクス（Ｌａｓ）（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ（Ｌａｓ））、リベリバクテル・エウロパエウス（Ｌｅｕ）（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（Ｌｅｕ））、リベリバクテル・プシラウロウス（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｐｓｙｌｌａｕｒｏｕｓ）又はリベリバクテル・ソラナセアルム（Ｌｓｏ）（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｌｓｏ））。
一部の例では、細菌は、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）であり、これは以下を含む：例えば、コリネバクテリウム・ファシアンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｓｃｉａｎｓ）、コリネバクテリウム・フラクムファシエンス ｐｖ．フラクムファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｐｖ．ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ミチガネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・ミチガネンシス ｐｖ．トリシチ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｐｖ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、コリネバクテリウム・ミチガネンシス ｐｖ．ネブラスケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｐｖ．ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ）又はコリネバクテリウム・セペドニクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｍ）。
一部の例では、細菌は、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐｐ．）であり、これは以下のものを包含する：例えば、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルウィニア・アナナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）（即ちペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ））、エルウィニア・カロトボラ ｓｕｂｓｐ．アトロセプチカ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、エルウィニア・カロトボラ ｓｕｂｓｐ．カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・クリサンテミ ｐｖ．ゼアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐｖ．ｚｅａｅ）、エルウィニア・ジソルベンス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルウィニア・ラポンチク（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃ）、エルウィニア・ステワルチイイ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉｉ）、エルウィニア・トラケイフィラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ）又はエルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）。
一部の例では、細菌は、シュードモナス・シリンガエ ｓｕｂｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｓｕｂｓｐ．）であり、これは以下を含む：例えば、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．アクチニジアエ（Ｐｓａ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ａｃｔｉｎｉｄｉａｅ（Ｐｓａ））、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．アトロファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．グリシネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．マクリコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．パプランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｐａｐｕｌａｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．ストリアファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｔｒｉａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・シリンガエ ｐｖ．トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）又はシュードモナス・シリンガエ ｐｖ．タバシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔａｂａｃｉ）。
一部の例では、細菌は、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）であり、これは以下を含む：例えば、ストレプトミセス・アシジスカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ）、ストレプトミセス・アルビドフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトミセス・カンジズス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）（即ちアクチノミセス・カンジズス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ））、ストレプトミセス・カビスカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｖｉｓｃａｂｉｅｓ）、ストレプトミセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトミセス・エウロパエイスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｏｐａｅｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・インテルメジウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ストレプトミセス・イポモエアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａｅ）、ストレプトミセス・ルリジスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｕｒｉｄｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・ニベイスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｉｖｅｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・プニシスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕｎｉｃｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・レツクリスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｔｕｃｕｌｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・スカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ）、ストレプトミセス・セトニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔｏｎｉｉ）、ストレプトミセス・ステリイスカビエイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｔｅｌｉｉｓｃａｂｉｅｉ）、ストレプトミセス・ツルギジスカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ）又はストレプトミセス・ウェドモレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｗｅｄｍｏｒｅｎｓｉｓ）。
一部の例では、細菌は、キサントモナス・アキソノポジス ｓｕｂｓｐ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｓｕｂｓｐ．）であり、これは以下を含む：例えば、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．アルファルファエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ａｌｆａｌｆａｅ）（＝キサントモナス・アルファルファエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．アウランチホリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉｉ）（＝キサントモナス・フスカンス ｓｕｂｓｐ．アウランチホリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．アリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ａｌｌｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリスｐｖ．アリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ａｌｌｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．アキソノポジス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．バウヒニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｂａｕｈｉｎｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．バウヒニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｂａｕｈｉｎｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ベゴニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｂｅｇｏｎｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ベゴニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｂｅｇｏｎｉａｅ）、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ベトリコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｂｅｔｌｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ベトリコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｂｅｔｌｉｃｏｌａ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ビオフィチ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｂｉｏｐｈｙｔｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ビオフィチ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｂｉｏｐｈｙｔｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．カジャニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃａｊａｎｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．カジャニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｊａｎｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．カサバエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃａｓｓａｖａｅ）（＝キサントモナス・カサバエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｓｓａｖａｅ））、キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．カサバエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｓｓａｖａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．カシアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃａｓｓｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．カシアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｓｓｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）（＝キサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．シトルメロ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｕｍｅｌｏ）（＝キサントモナス・アルファルファエ ｓｕｂｓｐ．シトルメロニス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｍｅｌｏｎｉｓ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．クリトリアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｌｉｔｏｒｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．クリトリアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃｌｉｔｏｒｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．コラカナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｏｒａｃａｎａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．コラカナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃｏｒａｃａｎａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．シアモプシジス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｙａｍｏｐｓｉｄｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．シアモプシジス））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．デスモジイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．デスモジイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．デスモジイガンゲチシ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｇａｎｇｅｔｉｃｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．デスモジイガンゲチシ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｇａｎｇｅｔｉｃｉ）、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．デスモジイラキシフロリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｌａｘｉｆｌｏｒｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．デスモジイラキシフロリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｌａｘｉｆｌｏｒｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．デスモジイロツンジホリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．デスモジイロツンジホリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｄｅｓｍｏｄｉｉｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ジエフェンバキアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ジエフェンバキアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．エリトリナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｅｒｙｔｈｒｉｎａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．エリトリナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｅｒｙｔｈｒｉｎａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ファシクラリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ファシクラリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．グリシネス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．グリシネス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．クハヤエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｋｈａｙａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．クハヤエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｋｈａｙａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．レスペデザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｌｅｓｐｅｄｅｚａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．レスペデザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｌｅｓｐｅｄｅｚａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．マクリホリイガルデニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｆｏｌｉｉｇａｒｄｅｎｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．マクリホリイガルデニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｆｏｌｉｉｇａｒｄｅｎｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．マルバセアルム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ）（＝キサントモナス・シトリ ｓｕｂｓｐ．マルバセアルム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ．ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．マニホチス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．マニホチス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．マルチニイコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｍａｒｔｙｎｉｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．マルチニイコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｍａｒｔｙｎｉｉｃｏｌａ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．メルフシイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｍｅｌｈｕｓｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．メルフシイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｍｅｌｈｕｓｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ナカタエコルコリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｎａｋａｔａｅｃｏｒｃｈｏｒｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ナカタエコルコリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｎａｋａｔａｅｃｏｒｃｈｏｒｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．パシフロラエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．パシフロラエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．パテリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐａｔｅｌｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．パテリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐａｔｅｌｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ペダリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｅｄａｌｉｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ペダリイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｅｄａｌｉｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ファセオリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）（＝キサントモナス・
カムペストリス ｐｖ．ファセオリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）、キサントモナス・ファセオリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｈａｓｅｏｌｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ファセオリ ｖａｒ．フスカンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ ｖａｒ．ｆｕｓｃａｎｓ）（＝キサントモナス・フスカンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃａｎｓ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．フィランチ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｈｙｌｌａｎｔｈｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．フィランチ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈｙｌｌａｎｔｈｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．フィサリジコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｈｙｓａｌｉｄｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．フィサリジコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈｙｓａｌｉｄｉｃｏｌａ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ポインセチイコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｏｉｎｓｅｔｔｉｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ポインセチイコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｏｉｎｓｅｔｔｉｉｃｏｌａ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．プニカエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｐｕｎｉｃａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．プニカエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｕｎｉｃａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．リンコシアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｒｈｙｎｃｈｏｓｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．リンコシアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒｈｙｎｃｈｏｓｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．リシニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｒｉｃｉｎｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．リシニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒｉｃｉｎｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．セスバニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｓｅｓｂａｎｉａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．セスバニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｓｅｓｂａｎｉａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．タマリンジ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｔａｍａｒｉｎｄｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．タマリンジ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｔａｍａｒｉｎｄｉ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．バスクロルム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．バスクロルム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、キサントモナス・ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ビグナエラジアタエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｉｇｎａｅｒａｄｉａｔａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ビグナエラジアタエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｉｇｎａｅｒａｄｉａｔａｅ））、キサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ビグニコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｉｇｎｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ビグニコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｉｇｎｉｃｏｌａ））又はキサントモナス・アキソノポジス ｐｖ．ビチアンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｖｉｔｉａｎｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ビチアンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｉｔｉａｎｓ））。
一部の例では、細菌は、キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ムサセアルム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｍｕｓａｃｅａｒｕｍ）、キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｒｕｎｉ）（＝キサントモナス・アルボリコラ ｐｖ．プルニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ ｐｖ．ｐｒｕｎｉ））又はキサントモナス・フラガリアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇａｒｉａｅ）である。
一部の例では、細菌は、キサントモナス・トランスルセンスｓｕｂｓｐ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ホルデイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｈｏｒｄｅｉ））であり、これは以下を含む：例えば、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．アレナテリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．アレナテリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｉ）、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．セレアリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．セレアリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃｅｒｅａｌｉｓ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖグラミニス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．グラミニス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｇｒａｍｉｎｉｓ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．フレイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｐｈｌｅｉ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．フレイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈｌｅｉ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．フレイプラテンシス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｐｈｌｅｉｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．フレイプラテンシス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈｌｅｉｐｒａｔｅｎｓｉｓ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．ポアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｐｏａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．ポアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｏａｅ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．セカリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｓｅｃａｌｉｓ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．セカリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｓｅｃａｌｉｓ））、キサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ））又はキサントモナス・トランスルセンス ｐｖ．ウンズロサ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ｐｖ．ｕｎｄｕｌｏｓａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ ウンズロサ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｕｎｄｕｌｏｓａ））。
一部の例では、細菌は、キサントモナス・オリザエｓｕｐｓｐ．（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｓｕｂｓｐ．）、キサントモナス・オリザエ ｐｖ．オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ．オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ））又はキサントモナス・オリザエ ｐｖ．オリジコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）（＝キサントモナス・カムペストリス ｐｖ オリジコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ））である。
一部の例では、細菌は、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）のキシレラ・ファスチジオサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）である。
表７は、本明細書に記載のＰＭＰ組成物及び関連方法を用いて処置又は予防することができる細菌及びそれに関連する病害を示す。
Figure 2021533794
ｉｉｉ．昆虫
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、植物における昆虫寄生を予防又は処置するために、昆虫の適応度を低減させる上で有用であり得る。用語「昆虫」には、任意の発育段階にある、即ち幼虫及び成虫の、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）及び昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）又は蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属するあらゆる生物が含まれる。ＰＭＰ組成物と昆虫を接触させることにより、ＰＭＰ組成物を昆虫に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、植物を、ＰＭＰ組成物と接触させることにより、昆虫寄生のリスクがあるか又は昆虫寄生を有する植物にバイオ農薬を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、昆虫による寄生の予防又はそれに寄生された植物の処置に好適であり、昆虫は、以下の目に属する：ダニ目（Ａｃａｒｉ）、クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）、シラミ亜目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、コウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、トビムシ目（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、網翅目（Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ）、コムシ目（Ｄｉｐｌｕｒａ）、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（例えば、オウトウショウジョウバエ（ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｎｇ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、シロアリモドキ目（Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ）、カゲロウ目（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ）、ガロアムシ目（Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｏｄｅａ）、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）（例えば、アブラムシ、オンシツコナジラミ（ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｈｉｔｅｆｌｙ））、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、シリアゲムシ目（Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ）、アミメカゲロウ目（Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ）、トンボ亜目（Ｏｄｏｎａｔａ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、ナナフシ目（Ｐｈａｓｍｉｄａ）、カワゲラ目（Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ）、カマアシムシ目（Ｐｒｏｔｕｒａ）、チャタテムシ目（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｓｉｐｈｕｎｃｕｌａｔａ、シミ目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）、ネジレバネ目（Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、トビケラ目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）又はジュズヒゲムシ目（Ｚｏｒａｐｔｅｒａ）。
一部の例では、昆虫は、クモ綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）、例えばアカルス属（Ａｃａｒｕｓ ｓｐｐ．）、アケリア・シェルドニ（Ａｃｅｒｉａ ｓｈｅｌｄｏｎｉ）、アクロプス属（Ａｃｕｌｏｐｓ ｓｐｐ．）、アクルス属（Ａｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、アンブリオンマ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｓｐｐ．）、アムフィテトラニクス・ビエネンシス（Ａｍｐｈｉｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｖｉｅｎｎｅｎｓｉｓ）、アルガス属（Ａｒｇａｓ ｓｐｐ．）、ボオフィルス属（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）、ブレビパルプス属（Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ ｓｐｐ．）、ブリオビア・グラミヌム（Ｂｒｙｏｂｉａ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ブリオビア・プラエチオサ（Ｂｒｙｏｂｉａ ｐｒａｅｔｉｏｓａ）、セントルロイデス属（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、コリオプテス属（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．）、デルマニスス・ガリナエ（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）、デルマセントル属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｓｐｐ．）、エオテトラニクス属（Ｅｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、エピトリメルス・ピリ（Ｅｐｉｔｒｉｍｅｒｕｓ ｐｙｒｉ）、エウテトラニクス属（Ｅｕｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、エリオフィエス属（Ｅｒｉｏｐｈｙｅｓ ｓｐｐ．）、グリシファグス・ドメスチクス（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ハロチデウス・デストルクトル（Ｈａｌｏｔｙｄｅｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ヘミタロソネムス属（Ｈｅｍｉｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、ヒアロンマ属（Ｈｙａｌｏｍｍａ ｓｐｐ．）、イキソデス属（Ｉｘｏｄｅｓ ｓｐｐ．）、ラトロデクツス属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｓｐｐ．）、ロキソスケレス属（Ｌｏｘｏｓｃｅｌｅｓ ｓｐｐ．）、メタテトラニクス属（Ｍｅｔａｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ネウトロムビクラ・アウツムナリス（Ｎｅｕｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ）、ヌフェルサ属（Ｎｕｐｈｅｒｓａ ｓｐｐ．）、オリゴニクス属（Ｏｌｉｇｏｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、オルニトドルス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）、オルニトニスス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、パノニクス属（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、フィロコプトルタ・オレイボラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ ｏｌｅｉｖｏｒａ）、ポリファゴタルソネムス・ラツス（Ｐｏｌｙｐｈａｇｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｌａｔｕｓ）、ソロプテス属（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．）、リピセファルス属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．）、リゾグリフス属（Ｒｈｉｚｏｇｌｙｐｈｕｓ ｓｐｐ．）、サルコプテス属（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．）、スコルピオ・マウルス（Ｓｃｏｒｐｉｏ ｍａｕｒｕｓ）、ステネオタルソネムス属（Ｓｔｅｎｅｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、ステネオタルソネムス・スピンキ（Ｓｔｅｎｅｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｉｎｋｉ）、タルソネムス属（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、テトラニクス属（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、トロムビクラ・アルフレズゲシ（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ ａｌｆｒｅｄｄｕｇｅｓｉ）、バエジョビス属（Ｖａｅｊｏｖｉｓ ｓｐｐ．）又はバサテス・リコペルシシ（Ｖａｓａｔｅｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）由来である。
一部の例では、昆虫は、ムカデ綱（Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）、例えばゲオフィルス属（Ｇｅｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）又はスクチゲラ属（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、トビムシ目（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）、例えばオニキウルス・アルマツス（Ｏｎｙｃｈｉｕｒｕｓ ａｒｍａｔｕｓ）由来である。
一部の例では、昆虫は、ヤスデ綱（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）に属するもの、例えばブラニウルス・グッツラツス（Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）；昆虫（Ｉｎｓｅｃｔａ）綱に属するもの、例えばゴキブリ目（Ｂｌａｔｔｏｄｅａ）に属するもの、例えばブラッテラ・アサヒナイ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ａｓａｈｉｎａｉ）、ブラッテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ブラッタ・オリエンタリス（Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、レウコファエア・マデラエ（Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ）、パンクロラ属（Ｐａｎｃｈｌｏｒａ ｓｐｐ．）、パルコブラッタ属（Ｐａｒｃｏｂｌａｔｔａ ｓｐｐ．）、ペリプラネタ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｓｐｐ．）又はスペラ・ロンギパルパ（Ｓｕｐｅｌｌａ ｌｏｎｇｉｐａｌｐａ）である。
一部の例では、昆虫は、コウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、例えばアカリンマ・ビタツム（Ａｃａｌｙｍｍａ ｖｉｔｔａｔｕｍ）、アカントセリデス・オブテクツス（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、アドレツス属（Ａｄｏｒｅｔｕｓ ｓｐｐ．）、アゲラスチカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ）、アグリオテス属（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｓｐｐ．）、アルフィトビウス・ジアペリヌス（Ａｌｐｈｉｔｏｂｉｕｓ ｄｉａｐｅｒｉｎｕｓ）、アムフィマロン・ソルスチチアリス（Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ）、アノビウム・プンクタツム（Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）、アノプロホラ属（Ａｎｏｐｌｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、アントノムス属（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．）、アントレヌス属（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ．）、アピオン属（Ａｐｉｏｎ ｓｐｐ．）、アポゴニア属（Ａｐｏｇｏｎｉａ ｓｐｐ．）、アトマリア属（Ａｔｏｍａｒｉａ ｓｐｐ．）、アタゲヌス属（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ．）、ブルキジウス・オブテクツス（Ｂｒｕｃｈｉｄｉｕｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ブルクス属（Ｂｒｕｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、カッシダ属（Ｃａｓｓｉｄａ ｓｐｐ．）、セロトマ・トリフルカタ（Ｃｅｒｏｔｏｍａ ｔｒｉｆｕｒｃａｔａ）、セウトリンクス属（Ｃｅｕｔｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、カエトクネマ属（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｓｐｐ．）、クレオヌス・メンジクス（Ｃｌｅｏｎｕｓ ｍｅｎｄｉｃｕｓ）、コノデルス属（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｓｐｐ．）、コスモポリテス属（Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｐｐ．）、コステリトラ・ゼアランジカ（Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ）、クテニセラ属（Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ ｓｐｐ．）、クルクリオ属（Ｃｕｒｃｕｌｉｏ ｓｐｐ．）、クリプトレステス・フェルギネウス（Ｃｒｙｐｔｏｌｅｓｔｅｓ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ）、クリプトリンクス・ラパチ（Ｃｒｙｐｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｌａｐａｔｈｉ）、シリンドロコプツルス属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ｓｐｐ．）、デルメステス属（Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ ｓｐｐ．）、ジアブロチカ属（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、トウモロコシの根切り虫）、ジコクロシス属（Ｄｉｃｈｏｃｒｏｃｉｓ ｓｐｐ．）、ジクラジスパ・アルミゲラ（Ｄｉｃｌａｄｉｓｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、ジロボデルス属（Ｄｉｌｏｂｏｄｅｒｕｓ ｓｐｐ．）、エピラクナ属（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｓｐｐ．）、エピトリキス属（Ｅｐｉｔｒｉｘ ｓｐｐ．）、ファウスチヌス属（Ｆａｕｓｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、ギビウム・プシロイデス（Ｇｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ）、グナトセルス・コルヌツス（Ｇｎａｔｈｏｃｅｒｕｓ ｃｏｒｎｕｔｕｓ）、ヘルラ・ウンダリス（Ｈｅｌｌｕｌａ ｕｎｄａｌｉｓ）、ヘテロニクス・アラトル（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｃｈｕｓ ａｒａｔｏｒ）、ヘテロニキス属（Ｈｅｔｅｒｏｎｙｘ ｓｐｐ．）、ヒラモルファ・エレガンス（Ｈｙｌａｍｏｒｐｈａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ヒロトルペス・バジュルス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ）、ヒペラ・ポスチカ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ）、ヒポメセス・スクアモスス（Ｈｙｐｏｍｅｃｅｓ ｓｑｕａｍｏｓｕｓ）、ヒポテネムス属（Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、ラクノステルナ・コンサングイネア（Ｌａｃｈｎｏｓｔｅｒｎａ ｃｏｎｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ラシドデルマ・セリコルネ（Ｌａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ）、ラテチクス・オリザエ（Ｌａｔｈｅｔｉｃｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ラトリジウス属（Ｌａｔｈｒｉｄｉｕｓ ｓｐｐ．）、レマ属（Ｌｅｍａ ｓｐｐ．）、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、レウコプテラ属（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、リッソロプトルス・オリゾフィルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、リキスス属（Ｌｉｘｕｓ ｓｐｐ．）、ルペロデス属（Ｌｕｐｅｒｏｄｅｓ ｓｐｐ．）、リクツス属（Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ．）、メガセリス属（Ｍｅｇａｓｃｅｌｉｓ ｓｐｐ．）、メラノツス属（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、メリゲテス・アエネウス（Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ）、メロロンタ属（Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｓｐｐ．）、ミグドルス属（Ｍｉｇｄｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、モノカムス属（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ ｓｐｐ．）、ナウパクツス・キサントグラフス（Ｎａｕｐａｃｔｕｓ ｘａｎｔｈｏｇｒａｐｈｕｓ）、ネクロビア属（Ｎｅｃｒｏｂｉａ ｓｐｐ．）、ニプツス・ホロレウクス（Ｎｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ）、オリクテス・リノセロス（Ｏｒｙｃｔｅｓ ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ）、オリザエフィルス・スリナメンシス（Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ）、オリザファグス・オリザエ（Ｏｒｙｚａｐｈａｇｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、オチオリンクス属（Ｏｔｉｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、オキシセトニア・ジュクンダ（Ｏｘｙｃｅｔｏｎｉａ ｊｕｃｕｎｄａ）、ファエドン・コクレアリアエ（Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）、フィロファガ属（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．）、フィロファガ・ヘレリ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｈｅｌｌｅｒｉ）、フィロトレタ属（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｐｐ．）、ポピリア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、プレムノトリペス属（Ｐｒｅｍｎｏｔｒｙｐｅｓ ｓｐｐ．）、プロステファヌス・トルンカツス（Ｐｒｏｓｔｅｐｈａｎｕｓ ｔｒｕｎｃａｔｕｓ）、プシリオデス属（Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｓｐｐ．）、プチヌス属（Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、リゾビウス・ベントラリス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｓ ｖｅｎｔｒａｌｉｓ）、リゾペルタ・ドミニカ（Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ）、シトフィルス属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）、シトフィルス・オリザエ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、スフェノホルス属（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｓｐｐ．）、ステゴビウム・パニセウム（Ｓｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ）、ステルネクス属（Ｓｔｅｒｎｅｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、シムフィレテス属（Ｓｙｍｐｈｙｌｅｔｅｓ ｓｐｐ．）、タニメクス属（Ｔａｎｙｍｅｃｕｓ ｓｐｐ．）、テネブリオ・モリトル（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）、テネブリオイデス・マウレタニクス（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｉｄｅｓ ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ）、トリボリウム属（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、トロゴデルマ属（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、チキウス属（Ｔｙｃｈｉｕｓ ｓｐｐ．）、キシロトレクス属（Ｘｙｌｏｔｒｅｃｈｕｓ ｓｐｐ．）又はザブルス属（Ｚａｂｒｕｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、例えばアエデス属種（Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．）、アグロミザ属（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｓｐｐ．）、アナストレファ属（Ａｎａｓｔｒｅｐｈａ ｓｐｐ．）、アノフェレス属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．）、アスホンジリア属（Ａｓｐｈｏｎｄｙｌｉａ ｓｐｐ．）、バクトロセラ属（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ ｓｐｐ．）、ビビオ・ホルツラヌス（Ｂｉｂｉｏ ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ）、カリホラ・エリトロセファラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ）、カリホラ・ビシナ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｖｉｃｉｎａ）、セラチチス・カピタタ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）、キロノムス属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．）、クリソミア属（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、クリソプス属（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．）、クリソゾナ・プルビアリス（Ｃｈｒｙｓｏｚｏｎａ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、コクリオミア属（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、コンタリニア属（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｐｐ．）、コルジロビア・アントロポファガ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、クリコトプス・シルベストリス（Ｃｒｉｃｏｔｏｐｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、クレキス属（Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．）、クリコイデス属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、クリセタ属（Ｃｕｌｉｓｅｔａ ｓｐｐ．）、クテレブラ属（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．）、ダクス・オレアエ（Ｄａｃｕｓ ｏｌｅａｅ）、ダシネウラ属（Ｄａｓｙｎｅｕｒａ ｓｐｐ．）、デリア属（Ｄｅｌｉａ ｓｐｐ．）、デルマトビア・ホミニス（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、エキノクネムス属（Ｅｃｈｉｎｏｃｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．）、ファンニア属（Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．）、ガステロフィルス属（Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）、グロッシナ属（Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．）、ハエマトポタ属（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．）、ヒドレリア属（Ｈｙｄｒｅｌｌｉａ ｓｐｐ．）、ヒドレリア・グリセオラ（Ｈｙｄｒｅｌｌｉａ ｇｒｉｓｅｏｌａ）、ヒレミア属（Ｈｙｌｅｍｙａ ｓｐｐ．）、ヒッポボスカ属（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃａ ｓｐｐ．）、ヒポデルマ属（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、リリオミザ属（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ ｓｐｐ．）、ルシリア属（Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．）、ルトゾミイア属（Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、マンソニア属種（Ｍａｎｓｏｎｉａ ｓｐｐ．）、ムスカ属（Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．）（例えば、ムスカ・ドメスチカ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、オエストルス属（Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、オシネラ・フリト（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ）、パラタニタルスス属（Ｐａｒａｔａｎｙｔａｒｓｕｓ ｓｐｐ．）、パララウテルボルニエラ・スブシンクタ（Ｐａｒａｌａｕｔｅｒｂｏｒｎｉｅｌｌａ ｓｕｂｃｉｎｃｔａ）、ペゴミイア属（Ｐｅｇｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、フレボトムス属（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．）、ホルビア属（Ｐｈｏｒｂｉａ ｓｐｐ．）、ホルミア属（Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．）、ピオフィラ・カセイ（Ｐｉｏｐｈｉｌａ ｃａｓｅｉ）、プロジプロシス属（Ｐｒｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｓｐｐ．）、プシラ・ロサエ（Ｐｓｉｌａ ｒｏｓａｅ）、ラゴレチス属（Ｒｈａｇｏｌｅｔｉｓ ｓｐｐ．）、サルコファガ属（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．）、シムリウム属（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ストモキス属（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．）、タバヌス属（Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．）、テタノプス属（Ｔｅｔａｎｏｐｓ ｓｐｐ．）又はチプラ属（Ｔｉｐｕｌａ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、カメムシ亜目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、例えばアナサ・トリスチス（Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ）、アンテスチオプシス属（Ａｎｔｅｓｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、ボイセア属（Ｂｏｉｓｅａ ｓｐｐ．）、ブリスス属（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｓｐｐ．）、カロコリス属（Ｃａｌｏｃｏｒｉｓ ｓｐｐ．）、カムピロンマ・リビダ（Ｃａｍｐｙｌｏｍｍａ ｌｉｖｉｄａ）、カベレリウス属（Ｃａｖｅｌｅｒｉｕｓ ｓｐｐ．）、シメキス属（Ｃｉｍｅｘ ｓｐｐ．）、コラリア属（Ｃｏｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、クレオンチアデス・ジルツス（Ｃｒｅｏｎｔｉａｄｅｓ ｄｉｌｕｔｕｓ）、ダシヌス・ピペリス（Ｄａｓｙｎｕｓ ｐｉｐｅｒｉｓ）、ジケロプス・フルカツス（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ）、ジコノコリス・ヘウェッチ（Ｄｉｃｏｎｏｃｏｒｉｓ ｈｅｗｅｔｔｉ）、ジスデルクス属（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．）、エウスキスツス属（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｐｐ．）、エウリガステル属（Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘリオペルチス属（Ｈｅｌｉｏｐｅｌｔｉｓ ｓｐｐ．）、ホルシアス・ノビレルス（Ｈｏｒｃｉａｓ ｎｏｂｉｌｅｌｌｕｓ）、レプトコリサ属（Ｌｅｐｔｏｃｏｒｉｓａ ｓｐｐ．）、レプトコリサ・バリコルニス（Ｌｅｐｔｏｃｏｒｉｓａ ｖａｒｉｃｏｒｎｉｓ）、レプトグロッスス・フィロプス（Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ ｐｈｙｌｌｏｐｕｓ）、リグス属（Ｌｙｇｕｓ ｓｐｐ．）、マクロペス・エキスカバツス（Ｍａｃｒｏｐｅｓ ｅｘｃａｖａｔｕｓ）、ミリダエ（Ｍｉｒｉｄａｅ）、モナロニオン・アトラツム（Ｍｏｎａｌｏｎｉｏｎ ａｔｒａｔｕｍ）、ナザラ属（Ｎｅｚａｒａ ｓｐｐ．）、オエバルス属（Ｏｅｂａｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペンタトミダエ（Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ）、ピエズマ・クアドラータ（Ｐｉｅｓｍａ ｑｕａｄｒａｔａ）、ピエゾドラス属（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）、サルス属（Ｐｓａｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、シューダシスタ・ぺルセア（Ｐｓｅｕｄａｃｙｓｔａ ｐｅｒｓｅａ）、ロドニウス属（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｓｐｐ．）、サールベルゲラ・シンギュラリス（Ｓａｈｌｂｅｒｇｅｌｌａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スカプトコリス・カスタネア（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ ｃａｓｔａｎｅａ）、スコチノフォラ属（Ｓｃｏｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ステファニティス・ナシ（Ｓｔｅｐｈａｎｉｔｉｓ ｎａｓｈｉ）、ティブラカ属（Ｔｉｂｒａｃａ ｓｐｐ．）又はトリアトマ属（Ｔｒｉａｔｏｍａ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、同翅亜目（Ｈｏｍｉｐｔｅｒａ）、例えばアシジア・アカシアエバイレイアナエ（Ａｃｉｚｚｉａ ａｃａｃｉａｅｂａｉｌｅｙａｎａｅ）、アシジア・ドドナエアエ（Ａｃｉｚｚｉａ ｄｏｄｏｎａｅａｅ）、アシジア・ウンカトイデス（Ａｃｉｚｚｉａ ｕｎｃａｔｏｉｄｅｓ）、アクリダ・ツリタ（Ａｃｒｉｄａ ｔｕｒｒｉｔａ）、アシルトシポン属（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｏｎ ｓｐｐ．）、アクロゴニア属（Ａｃｒｏｇｏｎｉａ ｓｐｐ．）、アエネオラミア属（Ａｅｎｅｏｌａｍｉａ ｓｐｐ．）、アゴノセナ属（Ａｇｏｎｏｓｃｅｎａ ｓｐｐ．）、アレイロデス・プロレテラ（Ａｌｅｙｒｏｄｅｓ ｐｒｏｌｅｔｅｌｌａ）、アレウロロブス・バロデンシス（Ａｌｅｕｒｏｌｏｂｕｓ ｂａｒｏｄｅｎｓｉｓ）、アレウロトリクス・フロコスス（Ａｌｅｕｒｏｔｈｒｉｘｕｓ ｆｌｏｃｃｏｓｕｓ）、アロカリダラ・マライエンシス（Ａｌｌｏｃａｒｉｄａｒａ ｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、アムラスカ属（Ａｍｒａｓｃａ ｓｐｐ．）、アヌラフィス・カルズイ（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｃａｒｄｕｉ）、アオニジエラ属（Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、アファノスチグマ・ピニ（Ａｐｈａｎｏｓｔｉｇｍａ ｐｉｎｉ）、アフィス属（Ａｐｈｉｓ ｓｐｐ．）（例えば、アピス・ゴシピイ（Ａｐｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））、アルボリジア・アピカリス（Ａｒｂｏｒｉｄｉａ ａｐｉｃａｌｉｓ）、アリタイニラ属（Ａｒｙｔａｉｎｉｌｌａ ｓｐｐ．）、アスピジエラ属（Ａｓｐｉｄｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、アスピジオツス属（Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、アタヌス属（Ａｔａｎｕｓ ｓｐｐ．）、アウラコルツム・ソラニ（Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、ベミシア・タバシ（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ）、ブラストプシラ・オッシデンタリス（Ｂｌａｓｔｏｐｓｙｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ボレイオグリカスピス・メラレウカエ（Ｂｏｒｅｉｏｇｌｙｃａｓｐｉｓ ｍｅｌａｌｅｕｃａｅ）、ブラキカウズス・ヘリクリシ（Ｂｒａｃｈｙｃａｕｄｕｓ ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｉ）、ブラキコルス属（Ｂｒａｃｈｙｃｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ブレビコリネ・ブラシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、カコプシラ属（Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ ｓｐｐ．）、カリギポナ・マルギナタ（Ｃａｌｌｉｇｙｐｏｎａ ｍａｒｇｉｎａｔａ）、カルネオセファラ・フルギダ（Ｃａｒｎｅｏｃｅｐｈａｌａ ｆｕｌｇｉｄａ）、セラトバクナ・ラニゲラ（Ｃｅｒａｔｏｖａｃｕｎａ ｌａｎｉｇｅｒａ）、セルコピダエ（Ｃｅｒｃｏｐｉｄａｅ）、セロプラステス属（Ｃｅｒｏｐｌａｓｔｅｓ ｓｐｐ．）、カエトシホン・フラガエホリイ（Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ）、キオナスピス・テガレンシス（Ｃｈｉｏｎａｓｐｉｓ ｔｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、クロリタ・オヌキイ（Ｃｈｌｏｒｉｔａ ｏｎｕｋｉｉ）、コンドラクリス・ロセア（Ｃｈｏｎｄｒａｃｒｉｓ ｒｏｓｅａ）、クロマフィス・ジュグランジコラ（Ｃｈｒｏｍａｐｈｉｓ ｊｕｇｌａｎｄｉｃｏｌａ）、クリソムファルス・フィクス（Ｃｈｒｙｓｏｍｐｈａｌｕｓ ｆｉｃｕｓ）、シカズリナ・ムビラ（Ｃｉｃａｄｕｌｉｎａ ｍｂｉｌａ）、コッコミチルス・ハリイ（Ｃｏｃｃｏｍｙｔｉｌｕｓ ｈａｌｌｉ）、コックス属（Ｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、クリプトミズス・リビス（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ）、クリプトネオサ属（Ｃｒｙｐｔｏｎｅｏｓｓａ ｓｐｐ．）、クテナリタイナ属（Ｃｔｅｎａｒｙｔａｉｎａ ｓｐｐ．）、ダルブルス属（Ｄａｌｂｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、ジアレウロデス・キテンデニ（Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｃｉｔｒｉ）、ジアレウロデス・シトリ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ）、ジアスピス属（Ｄｉａｓｐｉｓ ｓｐｐ．）、ドロシカ属（Ｄｒｏｓｉｃｈａ ｓｐｐ．）、ジサフィス属（Ｄｙｓａｐｈｉｓ ｓｐｐ．）、ジスミコックス属（Ｄｙｓｍｉｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、エムポアスカ属（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｓｐｐ．）、エリオソマ属（Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、エリトロネウラ属（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ ｓｐｐ．）、エウカリプトリマ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｏｌｙｍａ ｓｐｐ．）、エウフィルラ属（Ｅｕｐｈｙｌｌｕｒａ ｓｐｐ．）、エウセリス・ビロバツス（Ｅｕｓｃｅｌｉｓ ｂｉｌｏｂａｔｕｓ）、フェリシア属（Ｆｅｒｒｉｓｉａ ｓｐｐ．）、ゲオコックス・コフェアエ（Ｇｅｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、グリカスピス属（Ｇｌｙｃａｓｐｉｓ ｓｐｐ．）、ヘテロプシラ・クバナ（Ｈｅｔｅｒｏｐｓｙｌｌａ ｃｕｂａｎａ）、ヘテロプシラ・スピヌロサ（Ｈｅｔｅｒｏｐｓｙｌｌａ ｓｐｉｎｕｌｏｓａ）、ホマロジスカ・コアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）、ホマロジスカ・ビトリペンニス（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｖｉｔｒｉｐｅｎｎｉｓ）、ヒアロプテルス・アルンジニス（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、イセリア属（Ｉｃｅｒｙａ ｓｐｐ．）、イジオセルス属（Ｉｄｉｏｃｅｒｕｓ ｓｐｐ．）、イジオスコプス属（Ｉｄｉｏｓｃｏｐｕｓ ｓｐｐ．）、ラオデルファキス・ストリアテルス（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）、レカニウム属（Ｌｅｃａｎｉｕｍ ｓｐｐ．）、レピドサフェス属（Ｌｅｐｉｄｏｓａｐｈｅｓ ｓｐｐ．）、リパフィス・エリシミ（Ｌｉｐａｐｈｉｓ ｅｒｙｓｉｍｉ）、マクロシフム属（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｓｐｐ．）、マクロステレス・ファシフロンス（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ ｆａｃｉｆｒｏｎｓ）、マハナルバ属（Ｍａｈａｎａｒｖａ ｓｐｐ．）、メラナフィス・サッカリ（Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ）、メトカルフィエラ属（Ｍｅｔｃａｌｆｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、トポロフィウム・ジロズム（Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ ｄｉｒｈｏｄｕｍ）、モネリア・コスタリス（Ｍｏｎｅｌｌｉａ ｃｏｓｔａｌｉｓ）、モネリオプシス・ペカニス（Ｍｏｎｅｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｅｃａｎｉｓ）、ミズス属（Ｍｙｚｕｓ ｓｐｐ．）、ナソノビア・リビスニグリ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ）、ネホテッチキス属（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｓｐｐ．）、ネチゴニセラ・スペクトラ（Ｎｅｔｔｉｇｏｎｉｃｌｌａ ｓｐｅｃｔｒａ）、ニラパルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ）、オンコメトピア属（Ｏｎｃｏｍｅｔｏｐｉａ ｓｐｐ．）、オルテジア・プラエロンガ（Ｏｒｔｈｅｚｉａ ｐｒａｅｌｏｎｇａ）、オキシヤ・キネンシス（Ｏｘｙａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、パキプシラ属（Ｐａｃｈｙｐｓｙｌｌａ ｓｐｐ．）、パラベミシア・ミリカエ（Ｐａｒａｂｅｍｉｓｉａ ｍｙｒｉｃａｅ）、パラトリオザ属（Ｐａｒａｔｒｉｏｚａ ｓｐｐ．）、パルラトリア属（Ｐａｒｌａｔｏｒｉａ ｓｐｐ．）、ペムフィグス属（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．）、ペンタトミダエ属（Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ ｓｐｐ．）（例えば、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ））、ペレグリヌス・マイジス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、フェナコックス属（Ｐｈｅｎａｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、フロエオミズス・パッセリニイ（Ｐｈｌｏｅｏｍｙｚｕｓ ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ）、ホロドン・フムリ（Ｐｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ）、フィロキセラ属（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ ｓｐｐ．）、ピンナスピス・アスピジストラエ（Ｐｉｎｎａｓｐｉｓ ａｓｐｉｄｉｓｔｒａｅ）、プラノコックス属（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、プロソピドプシラ・フラバ（Ｐｒｏｓｏｐｉｄｏｐｓｙｌｌａ ｆｌａｖａ）、プロトプルビナリア・ピリホルミス（Ｐｒｏｔｏｐｕｌｖｉｎａｒｉａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プセウダウラカスピス・ペンタゴナ（Ｐｓｅｕｄａｕｌａｃａｓｐｉｓ ｐｅｎｔａｇｏｎａ）、プセウドコックス属（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、プシロプシス属（Ｐｓｙｌｌｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、プシラ属（Ｐｓｙｌｌａ ｓｐｐ．）、プテロマルス属（Ｐｔｅｒｏｍａｌｕｓ ｓｐｐ．）、ピリラ属（Ｐｙｒｉｌｌａ ｓｐｐ．）、クアドラスピジオツス属（Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、クエサダ・ギガス（Ｑｕｅｓａｄａ ｇｉｇａｓ）、ラストロコックス属（Ｒａｓｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ロパロシフム属（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｓｐｐ．）、サイセチア属（Ｓａｉｓｓｅｔｉａ ｓｐｐ．）、スカホイデウス・チタヌス（Ｓｃａｐｈｏｉｄｅｕｓ ｔｉｔａｎｕｓ）、スキザフィス・グラミヌム（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、セレナスピズス・アルチクラツス（Ｓｅｌｅｎａｓｐｉｄｕｓ ａｒｔｉｃｕｌａｔｕｓ）、ソガタ属（Ｓｏｇａｔａ ｓｐｐ．）、ソガテラ・フルシフェラ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、ソガトデス属（Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ ｓｐｐ．）、スチクトセファラ・フェスチナ（Ｓｔｉｃｔｏｃｅｐｈａｌａ ｆｅｓｔｉｎａ）、シホニヌス・フィリレアエ（Ｓｉｐｈｏｎｉｎｕｓ ｐｈｉｌｌｙｒｅａｅ）、テナラファラ・マライエンシス（Ｔｅｎａｌａｐｈａｒａ ｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、テトラゴノセフェラ属（Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｃｅｐｈｅｌａ ｓｐｐ．）、チノカリス・カリアエホリアエ（Ｔｉｎｏｃａｌｌｉｓ ｃａｒｙａｅｆｏｌｉａｅ）、トマスピス属（Ｔｏｍａｓｐｉｓ ｓｐｐ．）、トキソプテラ属（Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、トリアレウロデス・バポラリオルム（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ）、トリオザ属（Ｔｒｉｏｚａ ｓｐｐ．）、チフロシバ属種（Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ ｓｐｐ．）、ウナスピス属（Ｕｎａｓｐｉｓ ｓｐｐ．）、ビテウス・ビチホリイ（Ｖｉｔｅｕｓ ｖｉｔｉｆｏｌｉｉ）、ジギナ属（Ｚｙｇｉｎａ ｓｐｐ．）由来；
ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、例えばアクロミルメキス属（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ ｓｐｐ．）、アタリア属（Ａｔｈａｌｉａ ｓｐｐ．）、アッタ属（Ａｔｔａ ｓｐｐ．）、ジプリオン属（Ｄｉｐｒｉｏｎ ｓｐｐ．）、ホプロカムパ属（Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ ｓｐｐ．）、ラシウス属（Ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．）、モノモリウム・ファラオニス（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、シレキス属（Ｓｉｒｅｘ ｓｐｐ．）、ソレノプシス・インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）、タピノマ属（Ｔａｐｉｎｏｍａ ｓｐｐ．）、ウロセルス属（Ｕｒｏｃｅｒｕｓ ｓｐｐ．）、ベスパ属（Ｖｅｓｐａ ｓｐｐ．）又はキセリス属（Ｘｅｒｉｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、ワラジムシ目（Ｉｓｏｐｏｄａ）、例えばアルマジリジウム・ブルガレ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オニスクス・アセルス（Ｏｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓ）又はポルセリオ・スカベル（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ ｓｃａｂｅｒ）由来である。
一部の例では、昆虫は、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、例えばコプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）、コルニテルメス・クムランス（Ｃｏｒｎｉｔｅｒｍｅｓ ｃｕｍｕｌａｎｓ）、クリプトテルメス属（Ｃｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）、インシシテルメス属（Ｉｎｃｉｓｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）、ミクロテルメス・オベシ（Ｍｉｃｒｏｔｅｒｍｅｓ ｏｂｅｓｉ）、オドントテルメス属（Ｏｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）又はレチクリテルメス属（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、例えばアクロイア・グリセラ（Ａｃｈｒｏｉａ ｇｒｉｓｅｌｌａ）、アクロニクタ・マジョル（Ａｃｒｏｎｉｃｔａ ｍａｊｏｒ）、アドキソフィエス属（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｓｐｐ．）、アエジア・レウコメラス（Ａｅｄｉａ ｌｅｕｃｏｍｅｌａｓ）、アグロチス属（Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｐｐ．）、アラバマ属（Ａｌａｂａｍａ ｓｐｐ．）、アミエロイス・トランシテラ（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、アナルシア属（Ａｎａｒｓｉａ ｓｐｐ．）、アンチカルシア属（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｓｐｐ．）、アルギロプロセ属（Ａｒｇｙｒｏｐｌｏｃｅ ｓｐｐ．）、バラトラ・ブラシカエ（Ｂａｒａｔｈｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ボルボ・シンナラ（Ｂｏｒｂｏ ｃｉｎｎａｒａ）、ブックラトリキス・ツルベリエラ（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ）、ブパルス・ピニアリウス（Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ）、ブッセオラ属（Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｓｐｐ．）、カコエシア属（Ｃａｃｏｅｃｉａ ｓｐｐ．）、カロプチリア・テイボラ（Ｃａｌｏｐｔｉｌｉａ ｔｈｅｉｖｏｒａ）、カプア・レチクラナ（Ｃａｐｕａ ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ）、カルポカプサ・ポモネラ（Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、カルポシナ・ニポネンシス（Ｃａｒｐｏｓｉｎａ ｎｉｐｏｎｅｎｓｉｓ）、ケイマトビア・ブルマタ（Ｃｈｅｉｍａｔｏｂｉａ ｂｒｕｍａｔａ）、キロ属（Ｃｈｉｌｏ ｓｐｐ．）、コリストネウラ属（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｓｐｐ．）、クリシア・アムビグエラ（Ｃｌｙｓｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、クナファロセルス属（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ ｓｐｐ．）、クナファロクロシス・メジナリス（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、クネファシア属（Ｃｎｅｐｈａｓｉａ ｓｐｐ．）、コノポモルファ属（Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ ｓｐｐ．）、コノトラケルス属（Ｃｏｎｏｔｒａｃｈｅｌｕｓ ｓｐｐ．）、コピタルシア属（Ｃｏｐｉｔａｒｓｉａ ｓｐｐ．）、シジア属（Ｃｙｄｉａ ｓｐｐ．）、ダラカ・ノクツイデス（Ｄａｌａｃａ ｎｏｃｔｕｉｄｅｓ）、ジアファニア属（Ｄｉａｐｈａｎｉａ ｓｐｐ．）、ジアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、エアリアス属（Ｅａｒｉａｓ ｓｐｐ．）、エクジトロファ・アウランチウム（Ｅｃｄｙｔｏｌｏｐｈａ ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、エルダナ・サッカリナ（Ｅｌｄａｎａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、エフェスチア属（Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｓｐｐ．）、エピノチア属（Ｅｐｉｎｏｔｉａ ｓｐｐ．）、エピフィアス・ポストビッタナ（Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ）、エチエラ属（Ｅｔｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エウリア属（Ｅｕｌｉａ ｓｐｐ．）、エウポエシリア・アムビグエラ（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、エウプロクチス属（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｐｐ．）、エウキソア属（Ｅｕｘｏａ ｓｐｐ．）、フェルチア属（Ｆｅｌｔｉａ ｓｐｐ．）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、グラシラリア属（Ｇｒａｃｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、グラホリタ属（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔｈａ ｓｐｐ．）、ヘジレプタ属（Ｈｅｄｙｌｅｐｔａ ｓｐｐ．）、ヘリコベルパ属（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｓｐｐ．）、ヘリオチス属（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｐｐ．）、ホフマンノフィラ・プセウドスプレテラ（Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ）、ホモエオソマ属（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）、ホモナ属（Ｈｏｍｏｎａ ｓｐｐ．）、ヒポノメウタ・パデラ（Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ）、カキボリア・フラボファシアタ（Ｋａｋｉｖｏｒｉａ ｆｌａｖｏｆａｓｃｉａｔａ）、ラフィグマ属（Ｌａｐｈｙｇｍａ ｓｐｐ．）、ラスペイレシア・モレスタ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ ｍｏｌｅｓｔａ）、レウシノデス・オルボナリス（Ｌｅｕｃｉｎｏｄｅｓ ｏｒｂｏｎａｌｉｓ）、レウコプテラ属（Ｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、リトコレチス属（Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｓｐｐ．）、リトファネ・アンテンナタ（Ｌｉｔｈｏｐｈａｎｅ ａｎｔｅｎｎａｔａ）、ロベシア属（Ｌｏｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）、ロキサグロチス・アルビコスタ（Ｌｏｘａｇｒｏｔｉｓ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、リマントリア属（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｓｐｐ．）、リオネチア属（Ｌｙｏｎｅｔｉａ ｓｐｐ．）、マラコソマ・ネウストリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ）、マルカ・テスツラリス（Ｍａｒｕｃａ ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ）、マムストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、メラニチス・レダ（Ｍｅｌａｎｉｔｉｓ ｌｅｄａ）、モシス属（Ｍｏｃｉｓ ｓｐｐ．）、モノピス・オブビエラ（Ｍｏｎｏｐｉｓ ｏｂｖｉｅｌｌａ）、ミチムナ・セパラタ（Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｓｅｐａｒａｔａ）、ネマポゴン・クロアセルス（Ｎｅｍａｐｏｇｏｎ ｃｌｏａｃｅｌｌｕｓ）、ニムフラ属（Ｎｙｍｐｈｕｌａ ｓｐｐ．）、オイケチクス属（Ｏｉｋｅｔｉｃｕｓ ｓｐｐ．）、オリア属（Ｏｒｉａ ｓｐｐ．）、オルタガ属（Ｏｒｔｈａｇａ ｓｐｐ．）、オストリニア属（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｓｐｐ．）、オウレマ・オリザエ（Ｏｕｌｅｍａ ｏｒｙｚａｅ）、パノリス・フランメア（Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ）、パルナラ属種（Ｐａｒｎａｒａ ｓｐｐ．）、ペクチノホラ属（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ペリレウコプテラ属（Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、フトリマエア属（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ ｓｐｐ．）、フィロクニスチス・シトレラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ）、フィロノリクテル属（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ピエリス属（Ｐｉｅｒｉｓ ｓｐｐ．）、プラチノタ・スツルタナ（Ｐｌａｔｙｎｏｔａ ｓｔｕｌｔａｎａ）、プロジア・インテルプンクテラ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ）、プルシア属（Ｐｌｕｓｉａ ｓｐｐ．）、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、プライス属（Ｐｒａｙｓ ｓｐｐ．）、プロデニア属（Ｐｒｏｄｅｎｉａ ｓｐｐ．）、プロトパルセ属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｃｅ ｓｐｐ．）、プセウダレチア属（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｓｐｐ．）、プセウダレチア・ウニプンクタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、プセウドプルシア・インクルデンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ピラウスタ・ヌビラリス（Ｐｙｒａｕｓｔａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ラキプルシア・ヌ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、スコエノビウス属（Ｓｃｈｏｅｎｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．）、シルポファガ属（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．）、シルポファガ・インノタタ（Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ ｉｎｎｏｔａｔａ）、スコチア・セゲツム（Ｓｃｏｔｉａ ｓｅｇｅｔｕｍ）、セサミア属（Ｓｅｓａｍｉａ ｓｐｐ．）、セサミア・インフェレンス（Ｓｅｓａｍｉａ ｉｎｆｅｒｅｎｓ）、スパルガノチス属（Ｓｐａｒｇａｎｏｔｈｉｓ ｓｐｐ．）、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．）、スポドプテラ・プラエフィカ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ）、スタトモポダ属（Ｓｔａｔｈｍｏｐｏｄａ ｓｐｐ．）、ストモプテリキス・スブセシベラ（Ｓｔｏｍｏｐｔｅｒｙｘ ｓｕｂｓｅｃｉｖｅｌｌａ）、シナンテドン属（Ｓｙｎａｎｔｈｅｄｏｎ ｓｐｐ．）、テシア・ソラニボラ（Ｔｅｃｉａ ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ）、テルメシア・ゲンマタリス（Ｔｈｅｒｍｅｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、チネア・クロアセラ（Ｔｉｎｅａ ｃｌｏａｃｅｌｌａ）、チネア・ペリオネラ（Ｔｉｎｅａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ）、チネオラ・ビッセリエラ（Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ）、トルトリキス属（Ｔｏｒｔｒｉｘ ｓｐｐ．）、トリコファガ・タペトゼラ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｇａ ｔａｐｅｔｚｅｌｌａ）、トリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｓｐｐ．）、トリポリザ・インセルツラス（Ｔｒｙｐｏｒｙｚａ ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ）、ツタ・アブソルタ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ）又はビラコラ属（Ｖｉｒａｃｈｏｌａ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）又はサルタトリア（Ｓａｌｔａｔｏｒｉａ）、例えばアケタ・ドメスチクス（Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、ジクロプルス属（Ｄｉｃｈｒｏｐｌｕｓ ｓｐｐ．）、グリロタルパ属（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ ｓｐｐ．）、ヒエログリフス属（Ｈｉｅｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｓｐｐ．）、ロクスタ属（Ｌｏｃｕｓｔａ ｓｐｐ．）、メラノプルス属（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓｐｐ．）又はスキストセルカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａ）由来である。
一部の例では、昆虫は、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、例えばダマリニア属種（Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ハエマトピヌス属（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、リノグナツス属（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、ペジクルス属（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、プチルス・プビス（Ｐｔｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、トリコデクテス属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、チャタテムシ目（Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ）、例えばレピナツス属（Ｌｅｐｉｎａｔｕｓ ｓｐｐ．）又はリポセリス属（Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、例えばセラトフィルス属（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、クテノセファリデス属（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、プレキス・イリタンス（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）、ツンガ・ペネトランス（Ｔｕｎｇａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）又はキセノプシラ・ケオプシス（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｓｉｓ）由来である。
一部の例では、昆虫は、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、例えばアナホトリプス・オブスクルス（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）、バリオトリプス・ビホルミス（Ｂａｌｉｏｔｈｒｉｐｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ）、ドレパノトリプス・レウテリ（Ｄｒｅｐａｎｏｔｈｒｉｐｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、エンネオトリプス・フラベンス（Ｅｎｎｅｏｔｈｒｉｐｓ ｆｌａｖｅｎｓ）、フランクリニエラ属（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ヘリオトリプス属（Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｐｓ ｓｐｐ．）、ヘルシノトリプス・フェモラリス（Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、リピホロトリプス・クルエンタツス（Ｒｈｉｐｉｐｈｏｒｏｔｈｒｉｐｓ ｃｒｕｅｎｔａｔｕｓ）、シルトトリプス属（Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｓｐｐ．）、タエニノトリプス・カルダモミ（Ｔａｅｎｉｏｔｈｒｉｐｓ ｃａｒｄａｍｏｍｉ）又はトリプス属（Ｔｈｒｉｐｓ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、シミ目（Ｚｙｇｅｎｔｏｍａ）（＝シミ目（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ））、例えばクテノレピスマ属（Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｓｐｐ．）、レピスマ・サッカリナ（Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）、レスピモデス・インクイリヌス（Ｌｅｐｉｓｍｏｄｅｓ ｉｎｑｕｉｌｉｎｕｓ）又はテルモビア・ドメスチカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来である。
一部の例では、昆虫は、コムカデ綱（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）、例えばスクチゲレラ属（Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）由来である。
一部の例では、昆虫は、シクラメンホコリダニ（Ｐｈｙｔｏｎｅｍｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ）、チャノホコリダニ（Ｐｏｌｙｐｈａｇｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｌａｔｕｓ）、スジブトホコリダニ（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｂｉｌｏｂａｔｕｓ）等のホコリダニ（Ｔａｒｓｏｎｅｍｉｄ）；ハクサイダニ（Ｐｅｎｔｈａｌｅｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、ムギダニ（Ｐｅｎｔｈａｌｅｕｓ ｍａｊｏｒ）等のユーポジド（Ｅｕｐｏｄｉｄ）ダニ；イネハダニ（Ｏｌｉｇｏｎｙｃｈｕｓ ｓｈｉｎｋａｊｉｉ）、ミカンハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｃｉｔｒｉ）、クワオオハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｍｏｒｉ）、リンゴハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｕｌｍｉ）、カンザワハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｋａｎｚａｗａｉ）、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）等のハダニ；チャノナガサビダニ（Ａｃａｐｈｙｌｌａ ｔｈｅａｖａｇｒａｎｓ）、チューリップサビダニ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）、トマトサビダニ（Ａｃｕｌｏｐｓ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ミカンサビダニ（Ａｃｕｌｏｐｓ ｐｅｌｅｋａｓｓｉ）、リンゴサビダニ（Ａｃｕｌｕｓ ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉ）、ニセナシサビダニ（Ｅｒｉｏｐｈｙｅｓ ｃｈｉｂａｅｎｓｉｓ）、シトラスラストマイト（Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ ｏｌｅｉｖｏｒａ）等のフシダニ；ロビンネダニ（Ｒｈｉｚｏｇｌｙｐｈｕｓ ｒｏｂｉｎｉ）、ケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ）、ホウレンソウケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）等のコナダニ；ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｊａｃｏｂｓｏｎｉ）、ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）等の蜂幼虫（Ｂｅｅ ｂｒｏｏｄ）ダニ；オウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）、クリイロコイタマダニ（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、フタトゲチマダニ（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ）、カタダニ（Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ ｆｌａｖａ）、ツリガネチマダニ（Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ ｃａｍｐａｎｕｌａｔａ）、ヤマトマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、シュルツェマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ）、キララマダニ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｓｐｐ．）、カクマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｓｐｐ．）等のマダニ（Ｉｘｏｄｉｄｅｓ）；イヌツメダニ（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ ｙａｓｇｕｒｉ）、ネコツメダニ（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ ｂｌａｋｅｉ）等のツメダニ科（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｄａｅ）；イヌニキビダニ（Ｄｅｍｏｄｅｘ ｃａｎｉｓ）、ネコニキビダニ（Ｄｅｍｏｄｅｘ ｃａｔｉ）等のニキビダニ科（Ｄｅｍｏｄｉｃｉｄａｅ）；ヒツジキュウセンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｏｖｉｓ）等のキュウセンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）；ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ネコヒゼンダニ（Ｎｏｔｏｅｄｒｅｓ ｃａｔｉ）、クネミドコプテス属（Ｋｎｅｍｉｄｏｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．）等のスカルコプチダエ科（Ｓｃａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）を含むが、これらに限定されないダニである。
図８は、本明細書に記載のＰＭＰ組成物及び関連方法を用いて、処置又は予防することができる寄生を引き起こす昆虫の例を更に示す。
Figure 2021533794
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ｉｖ．軟体動物
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、植物における軟体動物寄生を予防又は処置するために、軟体動物の適応度を低減させる上で有用であり得る。用語「軟体動物」は、軟体動物（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）門に属するあらゆる生物を含む。ＰＭＰ組成物を軟体動物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物を軟体動物に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、ＰＭＰ組成物を植物と接触させることにより、軟体動物寄生のリスクがあるか、又は軟体動物寄生を有する植物にバイオ農薬を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、農業及び園芸において陸生腹足綱（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄｓ）（例えば、ナメクジ及びカタツムリ）寄生を予防又は処置する上で好適である。これらは、農業及び園芸作物において主に多食性害虫として発生する全ての陸生ナメクジ及びカタツムリを含む。例えば、軟体動物は、アフリカマイマイ科（Ａｃｈａｔｉｎｉｄａｅ）、ノハラナメクジ科（Ａｇｒｉｏｌｉｍａｃｉｄａｅ）、リンゴガイ科（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｉｄａｅ）、オオコウラナメクジ科（Ａｒｉｏｎｉｄａｅ）、オナジマイマイ科（Ｂｒａｄｙｂａｅｎｉｄａｅ）、マイマイ科（Ｈｅｌｉｃｉｄａｅ）、ミズツボ科（Ｈｙｄｒｏｍｉｉｄａｅ）、モノアラガイ科（Ｌｙｍｎａｅｉｄａｅ）、ニワコウラナメクジ科（Ｍｉｌａｃｉｄａｅ）、コウラナメクジ科（Ｕｒｏｃｙｃｌｉｄａｅ）又はアシヒダナメクジ科（Ｖｅｒｏｎｉｃｅｌｌｉｄａｅ）に属し得る。
例えば、一部の例では、軟体動物は、アフリカマイマイ属（Ａｃｈａｔｉｎａ ｓｐｐ．）、アルチャチャチーナ属（Ａｒｃｈａｃｈａｔｉｎａ ｓｐｐ．）（例えば、ベニアフリカマイマイ（Ａｒｃｈａｃｈａｔｉｎａ ｍａｒｇｉｎａｔａ））、アグリロリマックス属（Ａｇｒｉｏｌｉｍａｘ ｓｐｐ．）、アリオン属（Ａｒｉｏｎ ｓｐｐ．）（例えば、Ａ．アター（Ａ．ａｔｅｒ）、Ａ．サーカムクリプツス（Ａ．ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｐｔｕｓ）、Ａ．ジスチンクツス（Ａ．ｄｉｓｔｉｎｃｔｕｓ）、Ａ．ファシアツス（Ａ．ｆａｓｃｉａｔｕｓ）、Ａ．ホルテンシス（Ａ．ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）、Ａ．インテルメディウス（Ａ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ａ．ルーフス（Ａ．ｒｕｆｕｓ）、Ａ．サブフスカス（Ａ．ｓｕｂｆｕｓｃｕｓ）、Ａ．シルバチカス（Ａ．ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ）、Ａ．ルシタニカス（Ａ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ））、アルリオマックス（Ａｒｌｉｏｍａｘ ｓｐｐ．）（例えば、アリオリマックス・コルンビアヌス（Ａｒｉｏｌｉｍａｘ ｃｏｌｕｍｂｉａｕｓ）、ビオンファラリア属（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｓｐｐ．）、ブラジバエナ属（Ｂｒａｄｙｂａｅｎａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｂ．フルチクム（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｍ））、ブリヌス属（Ｂｕｌｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、カンタレウス属（Ｃａｎｔａｒｅｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、Ｃ．アスペルセス（Ｃ．ａｓｐｅｒｓｅｓ））、セパエア属（Ｃｅｐａｅａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｃ．ホルテンシス（Ｃ．ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ネモラリス（Ｃ．ｎｅｍｏｒａｌｉｓ）、Ｃ．ホルテンシス（Ｃ．ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ））、セルヌエラ属（Ｃｅｒｎｕｅｌｌａ ｓｐｐ．）、コクリセラ属（Ｃｏｃｈｌｉｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）、コクロディナ属（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｃ．ラミナタ（Ｃ．ｌａｍｉｎａｔａ））、デロセラス属（Ｄｅｒｏｃｅｒａｓ ｓｐｐ．）（例えば、Ｄ．アグレスティス（Ｄ．ａｇｒｅｓｔｉｓ）、Ｄ．エムピリコルム（Ｄ．ｅｍｐｉｒｉｃｏｒｕｍ）、Ｄ．リーブ（Ｄ．ｌａｅｖｅ）、Ｄ．パノルニマツム（Ｄ．ｐａｎｏｒｎｉｍａｔｕｍ）、Ｄ．レチキュラツム（Ｄ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ））、ディスカス属（Ｄｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、Ｄ．ロツンダツス（Ｄ．ｒｏｔｕｎｄａｔｕｓ））、ユーオムフアリア属（Ｅｕｏｍｐｈａｌｉａ ｓｐｐ．）、ガルバ属（Ｇａｌｂａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｇ．トランキュラタ（Ｇ．ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ））、ヘリセラ属（Ｈｅｌｉｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｈ．イタラ（Ｈ．ｉｔａｌａ）、Ｈ．オブビア（Ｈ．ｏｂｖｉａ））、ヘリシゴナ属（Ｈｅｌｉｃｉｇｏｎａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｈ．アルブストルム（Ｈ．ａｒｂｕｓｔｏｒｕｍ））、ヘリコジカス属（Ｈｅｌｉｃｏｄｉｓｃｕｓ ｓｐｐ．）、ヘリクス属（Ｈｅｌｉｘ ｓｐｐ．）（例えば、Ｈ．アペルタ（Ｈ．ａｐｅｒｔａ）、Ｈ．アスペルサ（Ｈ．ａｓｐｅｒｓａ）、Ｈ．ポマチア（Ｈ．ｐｏｍａｔｉａ））、リマクス属（Ｌｉｍａｘ ｓｐｐ．）（例えば、Ｌ．シネレオニガー（Ｌ．ｃｉｎｅｒｅｏｎｉｇｅｒ）、Ｌ．フラバス（Ｌ．ｆｌａｖｕｓ）、Ｌ．マルギナツス（Ｌ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、Ｌ．マキシムス（Ｌ．ｍａｘｉｍｕｓ）、Ｌ．テネルス（Ｌ．ｔｅｎｅｌｌｕｓ））、リミコラリア属（Ｌｉｍｉｃｏｌａｒｉａ ｓｐｐ．）（例えば、リミコラリア・アウロラ（Ｌｉｍｉｃｏｌａｒｉａ ａｕｒｏｒａ）、リムナエア属（Ｌｙｍｎａｅａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｌ．スタグリナス（Ｌ．ｓｔａｇｎａｌｉｓ））、メソドン属（Ｍｅｓｏｄｏｎ）（モシキカレハマイマイ（Ｍｅｓｏｎ ｔｈｙｒｏｉｄｕｓ）、モナデニア属（Ｍｏｎａｄｅｎｉａ ｓｐｐ．）（例えば、モナデニア・フィデリス（Ｍｏｎａｄｅｎｉａ ｆｉｄｅｌｉｓ），ミラクス属（Ｍｉｌａｘ ｓｐｐ．）（例えば、Ｍ．ガガテス（Ｍ．ｇａｇａｔｅｓ）、Ｍ．マルギナツス（Ｍ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ）、Ｍ．ソウェルビイ（Ｍ．ｓｏｗｅｒｂｙｉ）、Ｍ．ブダペンテンシス（Ｍ．ｂｕｄａｐｅｓｔｅｎｓｉｓ））、オンコメラニア属（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ ｓｐｐ．）、ネオヘリックス属（Ｎｅｏｈｅｌｉｘ ｓｐｐ．）（例えば、ネオヘリックス・アルボラブリス（Ｎｅｏｈｅｌｉｘ ａｌｂｏｌａｂｒｉｓ））、オペアス属（Ｏｐｅａｓ ｓｐｐ．）、オタラ属（Ｏｔａｌａ ｓｐｐ．）（例えば、オタラ・ラクテアル）（Ｏｔａｌａ ｌａｃｔｅａｌ））、オキシロマ属（Ｏｘｙｌｏｍａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｏ．フェイフェリ（Ｏ．ｐｆｅｉｆｆｅｒｉ））、ポマセア属（Ｐｏｍａｃｅａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｐ．カナリキュラタ（Ｐ．ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ））、スクシネア属（Ｓｕｃｃｉｎｅａ ｓｐｐ．）、タンドニア属（Ｔａｎｄｏｎｉａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｔ．ブダペンテンシス（Ｔ．ｂｕｄａｐｅｓｔｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ソウェルビイ（Ｔ．ｓｏｗｅｒｂｙｉ））、テーバ属（Ｔｈｅｂａ ｓｐｐ．）、バロニア属（Ｖａｌｌｏｎｉａ ｓｐｐ．）又はゾニトイデス属（Ｚｏｎｉｔｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）（例えば、Ｚ．ニチダス（Ｚ．ｎｉｔｉｄｕｓ））である。
ｖ．線虫
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、植物における線虫寄生を予防又は処置するために、線虫の適応度を低減させる上で有用であり得る。用語「線虫」は、線虫門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）に属するあらゆる生物を含む。ＰＭＰ組成物を線虫と接触させることにより、ＰＭＰ組成物を線虫に送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、ＰＭＰ組成物を植物と接触させることにより、線虫寄生のリスクがあるか、又は線虫寄生を有する植物にバイオ農薬を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、植物に被害をもたらす線虫による寄生を予防又は処置するのに好適であり、こうした線虫として、例えばメロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）（ネコブ（ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ））、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、グロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、プラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ヘリコチレンクス属（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ラドフォルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、ジチレンクス・ジプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、ロチレンクルス・レニホルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、キシフィネマ属（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｓｐｐ．）、アフェレンコイデス属（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）及びベロノライムス・ロンギカウダツス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）が挙げられる。一部の例では、線虫は、植物寄生線虫及び土壌中に生息する線虫である。植物寄生線虫としては、限定はされないが、キシフィネマ属（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｓｐｐ．）、ロンギドルス属（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）及びトリコドルス属（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）などの外部寄生虫；チレンクルス属（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｐｐ．）などの半寄生虫；プラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、ラドホルス属（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｐｐ．）及びスクテロネマ属（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）などの移動性内部寄生虫；ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、グロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）及びメロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）などの固着性寄生虫並びにジチレンクス属（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）、アフェレンコイデス属（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）及びヒルシュマニエラ属（Ｈｉｒｓｈｍａｎｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）などの茎葉内部寄生虫が挙げられる。特に有害な根寄生土壌線虫は、ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）若しくはグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）のシスト形成センチュウ及び／又はメロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）のネコブセンチュウなどである。これらの属の有害な種は、例えば、メロイドギネ・インゴグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシストセンチュウ）、グロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）及びグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ジャガイモシストセンチュウ）であり、これらの種は、ＰＭＰ組成物を用いて効果的に防除される。しかし、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物の使用は、これらの属又は種に何ら限定されるものではなく、同様に他の線虫にも拡張される。
本明細書に記載される方法及び組成物によって標的とされ得る線虫の他の例として、限定はされないが、例えば以下のものが挙げられる：アグレンクス・アグリコラ（Ａｇｌｅｎｃｈｕｓ ａｇｒｉｃｏｌａ）、アンギナ・トリチシ（Ａｎｇｕｉｎａ ｔｒｉｔｉｃｉ）、アフェレンコイデス・アラキディス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ａｒａｃｈｉｄｉｓ）、アフェレンコイデス・フラガリア（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｆｒａｇａｒｉａ）及び茎葉内部寄生虫であるアフェレンコイデス属（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）全般、ベロノライムス・グラシリス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ベロノライムス・ロンギカウダタス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔｕｓ）、ベロノライムス・ノルトニ（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ ｎｏｒｔｏｎｉ）、ブルサフェレンクス・ココフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｃｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルサフェレンクス・エレムス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｅｒｅｍｕｓ）、ブルサフェレンクス・キシロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルサフェレンクス・ムクロナツス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）及びブルサフェレンクス属（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、カコパウルス・ペスティス（Ｃａｃｏｐａｕｒｕｓ ｐｅｓｔｉｓ）、クリコネメラ・カルバタ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｃｕｒｖａｔａ）、クリコネメラ・オノエンシス（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｏｎｏｅｎｓｉｓ）、クリコネメラ・オルナタ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｏｒｎａｔａ）、クリコネメラ・ルシウム（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｒｕｓｉｕｍ）、クリコネメラ・キセノプラクス（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｘｅｎｏｐｌａｘ）（＝メソクリコネマ・キセノプラクス（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｏｎｅｍａ ｘｅｎｏｐｌａｘ））及びクリコネメラ属（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ ｓｐｐ．）全般、クリコネモイデス・フェルニエ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｆｅｍｉａｅ）、クリコネモイデス・オノエンス（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｏｎｏｅｎｓｅ）、クリコネモイデス・オルナタム（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｏｒｎａｔｕｍ）及びクリコネモイデス属（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）全般、ジチレンクス・デストラクター（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、ジチレンクス・ジプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、ジチレンクス・ミセリオファガス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｍｙｃｅｌｉｏｐｈａｇｕｓ）及び茎葉内部寄生虫であるジチレンクス属（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、ドリコドルス・ヘテロセファルス（Ｄｏｌｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、グロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）（＝ヘテロデラ・パリダ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ））、グロボデラ・ロストチエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ジャガイモシストセンチュウ）、グロボデラ・ソラナセルム（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、グロボデラ・タバクム（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｔａｂａｃｕｍ）、グロボデラ・バージニア（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｖｉｒｇｉｎｉａ）及び固着性シスト形成寄生虫であるグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）全般、ヘリコチレンクス・ジゴニクス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｇｏｎｉｃｕｓ）、ヘリコチレンクス・ジヒステラ（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｈｙｓｔｅｒａ）、ヘリコチレンクス・エリスリン（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｅｒｙｔｈｒｉｎｅ）、ヘリコチレンクス・マルチシンクタス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）、ヘリコチレンクス・ナヌス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｎａｎｎｕｓ）、ヘリコチレンクス・シュードロブスタス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｓｅｕｄｏｒｏｂｕｓｔｕｓ）及びヘリコチレンクス属（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、ヘミクリコネモイデス（Ｈｅｍｉｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ）、ヘミシクリオフォラ・アレナリア（Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ ａｒｅｎａｒｉａ）、ヘミシクリオフォラ・ヌダタ（Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ ｎｕｄａｔａ）、ヘミシクリオフォラ・パルバナ（Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ ｐａｒｖａｎａ）、ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）、ヘテロデラ・クルシフェラエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシストセンチュウ）、ヘテロデラ・オリゼー（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｏｒｙｚａｅ）、ヘテロデラ・シャクチ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、ヘテロデラ・ゼアエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｚｅａｅ）及び固着性シスト形成寄生虫であるヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）全般、ヒルシュマニエラ・グラシリス（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ヒルシュマニエラ・オリゼー（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ ｏｒｙｚａｅ）、ヒルシュマニエラ・スピニカウダタ（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ ｓｐｉｎｉｃａｕｄａｔａ）及び茎葉内部寄生虫であるヒルシュマニエラ属（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）全般、ホプロライムス・エジプチ（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｉ）、ホプロライムス・カリフォルニクス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｃａｌｉｆｏｍｉｃｕｓ）、ホプロライムス・コルンブス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｃｏｌｕｍｂｕｓ）、ホプロライムス・ガレアタス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｇａｌｅａｔｕｓ）、ホプロライムス・インディクス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）、ホプロライムス・マグニスチルス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｍａｇｎｉｓｔｙｌｕｓ）、ホプロライムス・パラロブスタス（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ ｐａｒａｒｏｂｕｓｔｕｓ）、ロンギドルス・アフリカヌス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、ロンギドルス・ブレビアヌラタス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｂｒｅｖｉａｎｎｕｌａｔｕｓ）、ロンギドルス・エロンガタス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ロンギドルス・ラエビカピタタス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｌａｅｖｉｃａｐｉｔａｔｕｓ）、ロンギドルス・ビネアコラ（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｖｉｎｅａｃｏｌａ）及び外部寄生虫であるロンギドルス属（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）全般、メロイドギネ・アクロネア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｃｒｏｎｅａ）、メロイドギネ・アフリカナ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｆｒｉｃａｎａ）、メロイドギネ・アレナリア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）、メロイドギネ・アレナリア・タメシ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ ｔｈａｍｅｓｉ）、メロイドギネ・アルチエラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｔｉｅｌｌａ）、メロイドギネ・チトウッディ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ）、メロイドギネ・コフェイコラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｃｏｆｆｅｉｃｏｌａ）、メロイドギネ・エチオピカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、メロイドギネ・エクシグア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｘｉｇｕａ）、メロイドギネ・ファラクス（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｆａｌｌａｘ）、メロイドギネ・グラミニコラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、メロイドギネ・グラミニス（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、メロイドギネ・ハプラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギネ・インコグニタ・アクリタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ａｃｒｉｔａ）、メロイドギネ・ジャバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、メロイドギネ・キクイエンシス（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｋｉｋｕｙｅｎｓｉｓ）、メロイドギネ・マイナー（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍｉｎｏｒ）、メロイドギネ・ナアシ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｎａａｓｉ）、メロイドギネ・パラナエンシス（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｐａｒａｎａｅｎｓｉｓ）、メロイドギネ・タメシ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｔｈａｍｅｓｉ）及び固着性寄生虫であるメロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）全般、メロイネマ属（Ｍｅｌｏｉｎｅｍａ ｓｐｐ．）、ナコブス・アベランス（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、ネオチレンクス・ビギシ（Ｎｅｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｖｉｇｉｓｓｉ）、パラフェレンクス・シュードパリエチヌス（Ｐａｒａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐａｒｉｅｔｉｎｕｓ）、パラトリコドルス・アリウス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ａｌｌｉｕｓ）、パラトリコドルス・ロバタス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｌｏｂａｔｕｓ）、パラトリコドルス・マイナー（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｍｉｎｏｒ）、パラトリコドルス・ナヌス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｎａｎｕｓ）、パラトリコドルス・ポロサス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｐｏｒｏｓｕｓ）、パラトリコドルス・テレス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｔｅｒｅｓ）及びパラトリコドルス属（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）全般、パラチレンクス・ハマタス（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｈａｍａｔｕｓ）、パラチレンクス・ミヌタス（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｍｉｎｕｔｕｓ）、パラチレンクス・プロジェクタス（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｒｏｊｅｃｔｕｓ）及びパラチレンクス属（Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、プラチレンクス・アギリス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ａｇｉｌｉｓ）、プラチレンクス・アレニ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ａｌｌｅｎｉ）、プラチレンクス・アンジヌス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ａｎｄｉｎｕｓ）、プラチレンクス・ブラキュルス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）、プラチレンクス・セレアリス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、プラチレンクス・コフェアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）、プラチレンクス・クレナタス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｒｅｎａｔｕｓ）、プラチレンクス・デラトレイ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｌａｔｔｒｅｉ）、プラチレンクス・ギイビカウダタス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｇｉｉｂｂｉｃａｕｄａｔｕｓ）、プラチレンクス・ゴーデイ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｇｏｏｄｅｙｉ）、プラチレンクス・ハマタス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｈａｍａｔｕｓ）、プラチレンクス・ヘキシンシサス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｈｅｘｉｎｃｉｓｕｓ）、プラチレンクス・ローシ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｌｏｏｓｉ）、プラチレンクス・ネグレクタス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｎｅｇｌｅｃｔｕｓ）、プラチレンクス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、プラチレンクス・プラテンシス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）、プラチレンクス・スクリブネリ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｃｒｉｂｎｅｒｉ）、プラチレンクス・テレス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｔｅｒｅｓ）、プラチレンクス・トルネイ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｔｈｏｒｎｅｉ）、プラチレンクス・バルヌス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｖｕｌｎｕｓ）、プラチレンクス・ゼアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｚｅａｅ）及び移動性内部寄生虫であるプラチレンクス属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、シュードハレンクス・ミヌタス（Ｐｓｅｕｄｏｈａｌｅｎｃｈｕｓ ｍｉｎｕｔｕｓ）、シレンクス・マグニデンス（Ｐｓｉｌｅｎｃｈｕｓ ｍａｇｎｉｄｅｎｓ）、シレンクス・ツミダス（Ｐｓｉｌｅｎｃｈｕｓ ｔｕｍｉｄｕｓ）、プンクトデラ・
チャコエンシス（Ｐｕｎｃｔｏｄｅｒａ ｃｈａｌｃｏｅｎｓｉｓ）、クイニスルシウス・アクタス（Ｑｕｉｎｉｓｕｌｃｉｕｓ ａｃｕｔｕｓ）、ラドフォルス・シトロフィルス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ラドフォルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、移動性内部寄生虫であるラドフォルス属（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｐｐ．）全般、ロチレンクルス・ボレアリス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ロチレンクルス・パルブス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｐａｒｖｕｓ）、ロチレンクルス・レニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びロチレンクルス属（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｐｐ．）全般、ロチレンクス・ラウレンチヌス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｎｕｓ）、ロチレンクス・マクロドラタス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｍａｃｒｏｄｏｒａｔｕｓ）、ロチレンクス・ロブスタス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）、ロチレンクス・ユニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びロチレンクス属（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、スクテロネマ・ブラキュルム（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ ｂｒａｃｈｙｕｒｕｍ）、スクテロネマ・ブラディス（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ ｂｒａｄｙｓ）、スクテロネマ・クラスリカウダタム（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ ｃｌａｔｈｒｉｃａｕｄａｔｕｍ）及び移動性内部寄生虫であるスクテロネマ属（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）全般、スバンギナ・ラジシオラ（Ｓｕｂａｎｇｕｉｎａ ｒａｄｉｃｉｏｌａ）、テチレンクス・ニコチアナエ（Ｔｅｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、トリコドルス・シリンドリクス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｓ）、トリコドルス・マイナー（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｍｉｎｏｒ）、トリコドルス・プリミチブス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｐｒｉｍｉｔｉｖｕｓ）、トリコドルス・プロキシムス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｐｒｏｘｉｍｕｓ）、トリコドルス・シミリス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）、トリコドルス・スパルサス（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐａｒｓｕｓ）及び外部寄生虫であるトリコドルス属（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．）全般、チレンコリンクス・アグリ（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｇｒｉ）、チレンコリンクス・ブラシカエ（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、チレンコリンクス・クラルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｃｌａｒｕｓ）、チレンコリンクス・クレイトニ（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｃｌａｙｔｏｎｉ）、チレンコリンクス・ジギタタス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｄｉｇｉｔａｔｕｓ）、チレンコリンクス・エブリエンシス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｅｂｒｉｅｎｓｉｓ）、チレンコリンクス・マキシムス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）、チレンコリンクス・ヌダス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｎｕｄｕｓ）、チレンコリンクス・ブルガリス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）及びチレンコリンクス属（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）全般、チレンクルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）及び半寄生虫であるチレンクルス属（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｐｐ．）全般、キシフィネマ・アメリカナム（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）、キシフィネマ・ブレビコレ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｂｒｅｖｉｃｏｌｌｅ）、キシフィネマ・ジモルフィカウダツム（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃａｕｄａｔｕｍ）、キシフィネマ・インデックス（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）及び外部寄生虫であるキシフィネマ属（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｓｐｐ．）全般。
有害線虫の他の例としては、ワセンチュウ科（Ｃｒｉｃｏｎｅｍａｔｉｄａｅ）、ベロノライムス科（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｉｄａｅ）、ホプロアイミダエ科（Ｈｏｐｌｏａｉｍｉｄａｅ）、ヘテロデラ科（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒｉｄａｅ）、ロンギドルス科（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｉｄａｅ）、プラティレンクス科（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｉｄａｅ）、トリコドルス科（Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｉｄａｅ）又はアシナシトカゲ科（Ａｎｇｕｉｎｉｄａｅ）に属宇する種が挙げられる。
表９は、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物及び関連方法を用いて処置又は予防することができる線虫及び関連する病害を更に示す。
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ｖｉ．ウイルス
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、植物におけるウイルス感染を予防又は処置するために、ウイルスの適応度を低減させる上で有用であり得る。ＰＭＰ組成物をウイルスと接触させることにより、ＰＭＰ組成物をウイルスに送達する方法が含まれる。加えて又は代わりに、本方法は、ＰＭＰ組成物をウイルスと接触させることにより、ウイルス感染のリスクがあるか、又はウイルス感染を有する植物にＰＭＰ組成物を送達することを含む。
ＰＭＰ組成物及び関連方法は、表１０に挙げるウイルス及び病害を含め、植物のウイルス性病害の原因となるウイルスへの送達に好適である。
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Ｃ．植物共生体への送達
本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を植物共生体に送達する方法である。含まれるのは、共生体（例えば、細菌の内部共生体、真菌の内部共生体又は昆虫）をＰＭＰ組成物と接触させることにより、共生体にＰＭＰ組成物を送達する方法である。この方法は、植物共生体、例えば、植物の適応度にとって有益である共生体の適応度を増加させるのに有用であり得る。一部の例では、植物共生体は、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで処理することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、施肥剤を含む。
従って、本方法を使用して、植物共生体の適応度を増加させることができる。一態様では、本明細書で提供されるのは、共生体の適応度を増加させる方法であって、共生体の適応度を、処理されていない共生体（例えば、ＰＭＰ組成物を送達されていない共生体）に対して増加させるために、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を、（例えば、有効量で且つ有効な期間）共生体に送達することを含む方法である。
一態様では、本明細書で提供されるのは、真菌（例えば、植物の真菌の内部共生体）の適応度を増加させる方法であって、複数のＰＭＰ（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を含むＰＭＰ組成物を、内部共生体に送達することを含む方法である。例えば、植物共生体は、内共生真菌、例えば、アスペルギルス科（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌａｃｅａｅ）、ツノタンシキン科（Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ）、コニオケータ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）、ノムシタケ科（Ｃｏｒｄｙｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）、コウヤクタケ科（Ｃｏｒｔｉｃｉａｃｅａｅ）、シストフィロバシディウム科（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ）、ダヴィディエラ科（Ｄａｖｉｄｉｅｌｌａｃｅａｅ）、デバリオマイセス科（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ドチオラ科（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ）、ウドンコカビ科（Ｅｒｙｓｉｐｈａｃｅａｅ）、フィロバシディウム科（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ）、グロメレラ科（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ハリタケ科（Ｈｙｄｎａｃｅａｅ）、ボタンタケ科（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）、レプトスフェリア科（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）、モンタニュラ科（Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ）、クサレケカビ科（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、コタマカビ科（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ベニアワツブタケ科（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）、オルビリアキン科（Ｏｒｂｉｌｉａｃｅａｅ）、ファエオスフェリア科（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）、プレオスポラ科（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シューデウロティウム科（Ｐｓｅｕｄｅｕｒｏｔｉａｃｅａｅ）、クモノスカビ科（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａｃｅａｅ）、キンカクキン科（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ）、ウロコタケ科（Ｓｔｅｒｅａｃｅａｅ）又はトリココマ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａ）の属の真菌であり得る。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、細菌（例えば、植物の細菌の内部共生体）の適応度を増加させる方法であって、複数のＰＭＰ（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を含むＰＭＰ組成物を、細菌に送達することを含む方法である。例えば、植物共生体は、内共生細菌、例えば、アセトバクター科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、アシドバクテリウム科（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アシドサーマス科（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ）、アエロコッカス科（Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アルカリゲネス科（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、アリシクロバチルス科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、アルテロモナス科（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アナエロリネア科（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｃｅａｅ）、アウランチモナス科（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バクテリオヴォラックス科（Ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒａｃａｃｅａｅ）、ブデロビブリオ科（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、ブラジリゾビウム科（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ブルセラ科（Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ）、バークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、カルボキシドセラ科（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａｃｅａｅ）、カウロバクター科（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、セルロモナダ科（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キチノファガ科（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ）、クロマチウム科（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）、クトニオバクター科（Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、クトノモナス科（Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、クロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、コマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コクシエラ科（Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ）、クリオモルファ科（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）、シクロバクテリア科（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、サイトファーガ科（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ）、ディノコッカス科（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デルマバクター（Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、デルマコッカス科（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロコッカス科（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリスロバクター科（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フィブロバクター科（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フラメオビルガ科（Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、フソバクテリア科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ガイエラ科（Ｇａｉｅｌｌａｃｅａｅ）、ゲマティモナス科（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ゲオデルマトフィラス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）、Ｇｌｙコルニ・セタセアエ（Ｇｌｙ ｃｏｒｎｙ ｃｅｔａｃｅａｅ）、ハリアンギウム科（Ｈａｌｉａｎｇｉａｃｅａｅ）、ハロモナス科（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ホロスポラ科（Ｈｏｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、ヒフォミクロビウム科（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、イアミア科（Ｉａｍｉａｃｅａｅ）、イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、キネオスポリア科（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ）、コリバクター科（Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ラクトバチルス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、レプトスピラ科（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）、メチロバクテリウム科（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）、メチロフィルス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）、マイクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、モラクセラ科（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）、マイコバクテリア科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコプラズマ科（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、ミクソコッカス科（Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ナカムラエラ科（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ニトロソモナス科（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ノカルジオイド科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オセアノスピリルム科（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、オピトゥトゥス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、オキサロバクター科（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、パエニバシラス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、パラクラミジア科（Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パトゥリバクテル科（Ｐａｔｕｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、フィロバクテリア科（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ピスキリケッチア科（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、プランクトミケス科（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、プラノコッカス科（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ポリアンギウム科（Ｐｏｌｙａｎｇｉａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、プロミクロモノスポラ科（Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、シュードノカルディア科（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ロドバクター科（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリラム科（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、ロセイフレクスス科（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘａｃｅａｅ）、ルブロバクター科（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、サンダラキナキヌス科（Ｓａｎｄａｒａｃｉｎａｃｅａｅ）、サングイバクター科（Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、サプロスピラ科（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、セグニリパルス科（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒａｃｅａｅ）、シェワネラ科（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｃｅａｅ）、シノバクター科（Ｓｉｎｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ソリバクター科（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ソリモナド科（Ｓｏｌｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ソリルブロバクター科（Ｓｏｌｉｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、スフィンゴバクテリウム科（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、スピロプラズマ科（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、スポリキシア科（Ｓｐｏｒｉｃｈｔｈｙａｃｅａｅ）、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、シントロフォバクター科（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビウム科（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、ウィークセラ科（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、キサントバクター科（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）又はキサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）の属の細菌であり得る。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、昆虫（例えば、植物の昆虫共生体）の適応度を増加させる方法であって、複数のＰＭＰ（例えば、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物）を含むＰＭＰ組成物を、昆虫に送達することを含む方法である。一部の例では、昆虫は、植物花粉媒介者である。例えば、昆虫は、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）又はハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の属のものであり得る。一部の例では、ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の属の昆虫は、ハチである。他の例では、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の属の昆虫は、ハエである。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物の投与の結果としての共生体の生理機能の向上（例えば、健康又は生存の向上）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、寿命、移動性、繁殖力、体重、代謝率若しくは活動又は生存を含めた１つ以上のパラメータにより、ＰＭＰ組成物を送達されていない共生体との比較で測定することができる。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、共生体の全般的健康を向上させるか、又は共生体の全生存を、ＰＭＰ組成物を投与されていない共生体生物と比較して向上させるのに有効であり得る。一部の例では、共生体の生存の向上は、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超高い。一部の例では、本方法及び組成物は、共生体生殖（例えば、繁殖率）を、ＰＭＰ組成物を投与されていない共生体生物と比較して増加させるのに有効である。一部の例では、この方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、繁殖力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効である。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物が投与されていない共生体生物と比較した、共生体によって行われる所望される活動（例えば、授粉、有害生物に対する捕食、種子散布又は廃棄物若しくは有機材料の分解）の頻度又は有効性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、共生体によって行われる所望される活動（例えば、授粉、有害生物に対する捕食、種子散布又は廃棄物若しくは有機材料の分解）の頻度又は有効性を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物が投与されていない共生体生物と比較した、共生体における１つ以上の栄養（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の産生の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、共生体における栄養（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の産生を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、共生体における１種以上の微生物（例えば、内部共生体）による栄養の産生又は代謝を増加させることにより、共生を受けている植物における栄養を増加させることができる。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物が投与されていない共生体生物と比較した、農薬用薬剤に対する共生体の感受性の低下及び／又は農薬用薬剤に対する共生体の抵抗性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤に対する共生体の感受性を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効であり得る。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物が投与されていない共生体生物と比較した、アレロケミカル薬剤に対する共生体の感受性の低下及び／又はアレロケミカル薬剤に対する共生体の抵抗性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、アレロケミカル薬剤に対する共生体の抵抗性を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。一部の例では、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン、ジテルペン酸又はフェノール類である。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、アレロケミカル薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する共生体の能力を増大させることにより、アレロケミカル薬剤に対する共生体の感受性を低下させることができる。
一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、ＰＭＰ組成物を投与されていない共生体生物有害生物と比較して、寄生虫又は病原体（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ（例えば、ミツバチにおけるミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ｍｉｔｅ）））に対する共生体の抵抗性を増加させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、病原体又は寄生虫（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ（例えば、ミツバチにおけるミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ｍｉｔｅ）））に対する共生体の抵抗性を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物の投与を受けない共生体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
一部の例では、共生体適応度の増加は、ＰＭＰ組成物が投与されていない共生体生物と比較した、特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の向上、特定の生息場所で生存する能力の向上又は特定の食餌に耐える能力の向上（例えば、トウモロコシに対してダイズを代謝する能力の向上）などの他の適応度の優位性として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載されるいずれかの複数の方法で共生体適応度を増加させるのに有効であり得る。更に、ＰＭＰ組成物は、共生体のいくつもの綱、目、科、属又は種（例えば、１つの共生体の種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれよりも多い共生体の種）における共生体適応度を増加させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、共生体の単一の綱、目、科、属又は種に作用する。
共生体適応度は、当技術分野におけるあらゆる標準の方法を用いて評価することができる。一部の例では、共生体適応度は、個々の共生体を評価することによって評価することができる。代わりに、共生体適応度は、共生体集団を評価することによって評価することができる。例えば、共生体適応度の増加は、他の昆虫との競合の成功の増加（それによって共生体集団の大きさの増加がもたらされる）として現れる。
本組成物又は関連方法で処理することができる植物共生体の例を、本明細書に更に記載する。
ｉ．真菌
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、真菌、例えば、植物の内部共生体である真菌（例えば、菌根菌）の適応度を増加させるために有用であり得る。
一部の例では、真菌は、アスペルギルス科（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌａｃｅａｅ）、ツノタンシキン科（Ｃｅｒａｔｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ）、コニオケータ科（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）、ノムシタケ科（Ｃｏｒｄｙｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）、コウヤクタケ科（Ｃｏｒｔｉｃｉａｃｅａｅ）、シストフィロバシディウム科（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ））、ダヴィディエラ科（Ｄａｖｉｄｉｅｌｌａｃｅａｅ）、デバリオマイセス科（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ドチオラ科（Ｄｏｔｈｉｏｒａｃｅａｅ）、ウドンコカビ科（Ｅｒｙｓｉｐｈａｃｅａｅ）、フィロバシディウム科（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉａｃｅａｅ）、グロメレラ科（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ハリタケ科（Ｈｙｄｎａｃｅａｅ）、ボタンタケ科（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）、レプトスフェリア科（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）、モンタニュラ科（Ｍｏｎｔａｇｎｕｌａｃｅａｅ）、クサレケカビ科（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、コタマカビ科（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ベニアワツブタケ科（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ）、オルビリアキン科（Ｏｒｂｉｌｉａｃｅａｅ）、ファエオスフェリア科（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）、プレオスポラ科（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シューデウロティウム科（Ｐｓｅｕｄｅｕｒｏｔｉａｃｅａｅ）、クモノスカビ科（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａｃｅａｅ）、キンカクキン科（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｃｅａｅ）、ウロコタケ科（Ｓｔｅｒｅａｃｅａｅ）又はトリココマ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａ）のものである。
一部の例では、真菌は、グロムス門（Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、子嚢菌門又は接合菌門に属する真菌を含めた、植物の根との菌根（例えば、外生菌根又は内生菌根）共生を有する真菌である。
ｉ．細菌
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、細菌、例えば、植物の内部共生体である細菌（例えば、窒素固定細菌）の適応度を増加させるために有用であり得る。
例えば、細菌は、アシドボラックス属（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルトバクテリウム属（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、サッカリバチルス属（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）又はステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）のものであり得る。
一部の例では、細菌は、アセトバクター科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、アシドバクテリウム科（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アシドサーマス科（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ）、アエロコッカス科（Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アルカリゲネス科（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、アリシクロバチルス科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、アルテロモナス科（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アナエロリネア科（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｃｅａｅ）、アウランチモナス科（Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バクテリオヴォラックス科（Ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒａｃａｃｅａｅ）、ブデロビブリオ科（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、ブラジリゾビウム科（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ブレビバクテリウム科（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ブルセラ科（Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ）、バークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、カルボキシドセラ科（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａバクター科（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、セルロモナダ科（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キチノファガ科（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ）、クロマチウム科（Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ）、クトニオバクター科（Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、クトノモナｃｅａｅ）、カウロス科（Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、クロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、コマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コクシエラ科（Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ）、クリオモルファ科（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）、シクロバクテリア科（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、サイトファーガ科（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ）、ディノコッカス科（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デルマバクター（Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、デルマコッカス科（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロコッカス科（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、エリスロバクター科（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フィブロバクター科（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フラメオビルガ科（Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、フソバクテリア科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ガイエラ科（Ｇａｉｅｌｌａｃｅａｅ）、ゲマティモナス科（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ゲオデルマトフィラス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）、Ｇｌｙコルニ・セタセアエ（Ｇｌｙ ｃｏｒｎｙ ｃｅｔａｃｅａｅ）、ハリアンギウム科（Ｈａｌｉａｎｇｉａｃｅａｅ）、ハロモナス科（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ホロスポラ科（Ｈｏｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、ヒフォミクロビウム科（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、イアミア科（Ｉａｍｉａｃｅａｅ）、イントラスポランギウム科（Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、キネオスポリア科（Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ）、コリバクター科（Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ラクトバチルス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、レプトスピラ科（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）、メチロバクテリウム科（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ）、メチロフィルス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｃｅａｅ）、マイクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、モラクセラ科（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ）、マイコバクテリア科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコプラズマ科（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、ミクソコッカス科（Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ナカムラエラ科（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ニトロソモナス科（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ノカルジオイド科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オセアノスピリルム科（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、オピトゥトゥス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、オキサロバクター科（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、パエニバシラス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、パラクラミジア科（Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パトゥリバクテル科（Ｐａｔｕｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、フィロバクテリア科（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ピスキリケッチア科（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、プランクトミケス科（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、プラノコッカス科（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ポリアンギウム科（Ｐｏｌｙａｎｇｉａｃｅａｅ）、ポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、プロミクロモノスポラ科（Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、シュードノカルディア科（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ロドバクター科（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリラム科（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、ロセイフレクスス科（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘａｃｅａｅ）、ルブロバクター科（Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、サンダラキナキヌス科（Ｓａｎｄａｒａｃｉｎａｃｅａｅ）、サングイバクター科（Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、サプロスピラ科（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、セグニリパルス科（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒａｃｅａｅ）、シェワネラ科（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｃｅａｅ）、シノバクター科（Ｓｉｎｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ソリバクター科（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ソリモナド科（Ｓｏｌｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ソリルブロバクター科（Ｓｏｌｉｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、スフィンゴバクテリウム科（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、スピロプラズマ科（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）、スポリキシア科（Ｓｐｏｒｉｃｈｔｈｙａｃｅａｅ）、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、シントロフォバクター科（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビウム科（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、ウィークセラ科（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａｃｅａｅ）、キサントバクター科（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）又はキサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）のものである。
一部の例では、内共生細菌は、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、コマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチロバクテリウム科（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パエニバシラス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）及びキサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）からなる群から選択される科のものである。
一部の例では、内共生細菌は、アシドボラックス属（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クルトバクテリウム属（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、サッカリバチルス属（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される属のものである。
ｉｉ．昆虫
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、昆虫、例えば、植物にとって有益である昆虫の適応度を増加させるために有用であり得る。用語「昆虫」には、あらゆる発育段階にある、即ち幼虫及び成虫の、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）門に、また昆虫（Ｉｎｓｅｃｔａ）綱又は蛛形（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）綱に属するあらゆる生物が含まれる。例えば、宿主には、作物の授粉、種子の拡大又は有害生物制御に役立つ昆虫を含めた、農業用途で使用される昆虫が含まれ得る。
一部の例では、宿主は、植物の授粉に役立つ（例えば、ハチ、甲虫、スズメバチ、ハエ、チョウ又はガ）。一部の例では、植物の授粉に役立つ宿主は、ハチである。一部の例では、ハチは、ヒメハナバチ科（Ａｎｄｒｅｎｉｄａｅ）、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）、ムカシハナバチ科（Ｃｏｌｌｅｔｉｄａｅ）、コハナバチ科（Ｈａｌｉｃｔｉｄａｅ）又はハキリバチ科（Ｍｅｇａｃｈｉｌｉｄａｅ）のものである。一部の例では、植物の授粉に役立つ宿主は、甲虫である。特定の場合、ＰＭＰ組成物は、ミツバチの適応度を増加させるために使用することができる。
一部の例では、植物の授粉に役立つ宿主は、甲虫、例えば、タマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）、ジョウカイボン科（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）、カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）、ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）、カッコウムシ科（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）、コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）、ナガクチキムシ科（Ｍｅｌａｎｄｒｙｉｄａｅ）、ツチハンミョウ科（Ｍｅｌｏｉｄａｅ）、ジョウカイモドキ科（Ｍｅｌｙｒｉｄａｅ）、ハナノミ科（Ｍｏｒｄｅｌｌｉｄａｅ）、ケシキスイ科（Ｎｉｔｉｄｕｌｉｄａｅ）、カミキリモドキ科（Ｏｅｄｅｍｅｒｉｄａｅ）、コガネムシ科（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）又はハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｌｉｎｉｄａｅ）の種である。
一部の例では、植物の授粉に役立つ宿主は、チョウ又はガ（例えば、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ））である。一部の例では、チョウ又はガは、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）又はスズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）の種である。
一部の例では、植物の授粉に役立つ宿主は、ハエ（例えば、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ））である。一部の例では、ハエは、ハナバエ科（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、ケバエ科（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、ツリアブ科（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、タマバエ科（Ｃｅｃｉｄｏｍｉｉｄａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ユスリカ科（Ｃｈｒｉｏｎｏｍｉｄａｅ）、メバエ科（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）、カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、アシナガバエ科（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）、オドリバエ科（Ｅｍｐｉｄｉｄａｅ）、ミギワバエ科（Ｅｐｈｙｄｒｉｄａｅ）、ヤリバエ科（Ｌｏｎｃｈｏｐｔｅｒｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、キノコバエ科（Ｍｙｃｅｔｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）又はハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）のものである。
一部の例では、授粉に役立つ宿主は、アリ（例えば、アリ科）、ハバチ（例えば、ハバチ科）又はスズメバチ（例えば、ジガバチ（Ｓｐｈｅｃｉｄａｅ）又はスズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄａｅ））である。
Ｄ．動物病原体への送達
本明細書で提供されるのは、病原体をＰＭＰ組成物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を、本明細書に開示するものなど、動物（例えば、ヒト）病原体に送達する方法である。本明細書で使用される場合、用語「病原体」は、例えば、（ｉ）動物を直接的に感染させること、（ｉｉ）動物において疾患又は疾患症状を引き起こす原因物質を産生すること（例えば、病原性毒素などを産生する細菌）、及び／又は（ｉｉｉ）動物において免疫（例えば、炎症反応）を誘発すること（例えば、噛みつく昆虫、例えば、トコジラミ）により、動物において疾患又は疾患症状を引き起こす、微生物又は無脊椎動物などの生物を指す。本明細書で使用される場合、病原体には、限定はされないが、細菌、原生動物、寄生虫、真菌、線虫、昆虫、ウイロイド及びウイルス又はそのあらゆる組み合わせが含まれ、ここで、各病原体は、それ自体で又は別の病原体と協力して、ヒトなどの動物において疾患又は疾患症状を誘発することが可能である。
一部の例では、動物（例えば、ヒト）病原体は、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで治療することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、異種治療薬（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫薬剤、抗ウイルス剤又は忌避剤）を含む。この方法は、ＰＭＰ組成物の送達の結果として、動物病原体の適応度を減少させるのに、例えば、病原体感染を予防若しくは治療するか又は病原体の拡大を制御するために有用であり得る。
本明細書に記載される方法に従って標的にすることができる病原体の例としては、細菌（例えば、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種又は大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種）、真菌（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種）、寄生昆虫（例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種）、寄生線虫（例えば、ヘリグモソモイデス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ）種）又は寄生原生動物（例えば、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎｉａｓｉｓ）種）が挙げられる。
例えば、本明細書で提供されるのは、病原体の適応度を減少させる方法であって、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を、病原体に送達することを含み、病原体の適応度を、治療されていない病原体に対して減少させる方法である。一部の実施形態では、この方法は、病原体が成長、生存、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に、組成物を送達することを含む。本明細書に記載される方法の一部の例では、組成物は、病原体による摂取のための、病原体が摂取可能な組成物として送達される。本明細書に記載される方法の一部の例では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として（例えば、病原体に）送達される。
本明細書で提供されるのは、寄生昆虫の適応度を減少させる方法であって、複数のＰＭＰを含むＰＭＰ組成物を、寄生昆虫に送達することを含む方法でもある。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（ここで、複数のＰＭＰは、殺虫薬剤を含む）を含むＰＭＰ組成物を、寄生昆虫に送達することを含む。例えば、寄生昆虫は、トコジラミであり得る。寄生昆虫の他の非限定的な例は、本明細書に提供される。一部の例では、この方法は、寄生昆虫の適応度を、治療されていない寄生昆虫に対して減少させる。
本明細書で更に提供されるのは、寄生線虫の適応度を減少させる方法であって、複数のＰＭＰを含むＰＭＰ組成物を、寄生線虫に送達することを含む方法である。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（ここで、複数のＰＭＰは、殺線虫薬剤を含む）を含むＰＭＰ組成物を、寄生線虫に送達することを含む。例えば、寄生線虫は、ヘリグモソモイデス・ポリギルス（Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ）である。寄生線虫の他の非限定的な例は、本明細書に提供される。一部の例では、この方法は、寄生線虫の適応度を、治療されていない寄生線虫に対して減少させる。
本明細書で更に提供されるのは、寄生原生動物の適応度を減少させる方法であって、複数のＰＭＰを含むＰＭＰ組成物を、寄生原生動物に送達することを含む方法である。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（ここで、複数のＰＭＰは、抗寄生虫薬剤を含む）を含むＰＭＰ組成物を、寄生原生動物に送達することを含む。例えば、寄生原生動物は、腟トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）であり得る。寄生原生動物の他の非限定的な例は、本明細書に提供される。一部の例では、この方法は、寄生原生動物の適応度を、治療されていない寄生原生動物に対して減少させる。
ＰＭＰ組成物の送達の結果としての病原体の適応度の減少は、いくつかの様式で現れ得る。一部の例では、病原体の適応度の減少は、ＰＭＰ組成物の投与の結果としての病原体の生理機能の悪化又は減退（例えば、健康又は生存の低下）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、生殖能力、寿命、生存能力、移動性、繁殖力、病原体発達、体重、代謝率若しくは活動又は生存を含めた１つ以上のパラメータにより、ＰＭＰ組成物を投与されていない病原体との比較で測定することができる。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、病原体の全般的健康を低下させる又は病原体の全生存を低下させるのに有効であり得る。一部の例では、病原体の生存の低下は、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない病原体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超高い。一部の例では、本方法及び組成物は、病原体生殖（例えば、繁殖率、生殖能力）を、ＰＭＰ組成物を投与されていない病原体と比較して低下させるのに有効である。一部の例では、この方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、繁殖力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない病原体において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効である。
一部の例では、有害生物適応度の減少は、ＰＭＰ組成物が送達されていない病原体と比較した、抗病原体薬剤に対する病原体の感受性の増加及び／又は抗病原体薬剤に対する病原体の抵抗性の減少として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤に対する病原体の感受性を、参照レベル（例えば、ＰＭＰ組成物を受けない有害生物において見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
一部の例では、病原体適応度の減少は、ＰＭＰ組成物が投与されていない有害生物と比較した、特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の低下、特定の生息場所で生存する能力の低下又は特定の食餌に耐える能力の低下など、他の適応度の不利点として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の複数の方法で有害生物適応度を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載されるいずれかの複数の方法で病原体適応度を減少させるのに有効であり得る。更に、ＰＭＰ組成物は、病原体のいくつもの綱、目、科、属又は種（例えば、１つの病原体の種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれよりも多い病原体の種）における病原体適応度を減少させることができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、有害生物の単一の綱、目、科、属又は種に作用する。
病原体適応度は、当技術分野におけるあらゆる標準の方法を用いて評価することができる。一部の例では、有害生物適応度は、個々の病原体を評価することによって評価することができる。代わりに、有害生物適応度は、病原体集団を評価することによって評価することができる。例えば、病原体適応度の減少は、他の昆虫との競合の成功の減少（それによって共生体集団の大きさの減少がもたらされる）として現れる。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、動物病原体の適応度を減少させ、それによって動物における感染症を治療又は予防するために有用である。本組成物又は関連方法で治療することができる動物病原体又はそのベクターの例を、本明細書に更に記載する。
ｉ．真菌
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、真菌の適応度を減少させる、例えば、動物における真菌感染症を予防又は治療するために有用であり得る。含まれるのは、真菌をＰＭＰ組成物と接触させることにより、真菌にＰＭＰ組成物を送達する方法である。更に又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載される真菌によって引き起こされる）真菌感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）／ポサダシ（ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ））、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）（エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ））、ケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リクテイミア・コリムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ））に属する真菌によって引き起こされる真菌感染症を含めた、動物における真菌感染症の治療又は予防に適している。
一部の例では、真菌感染症は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）又は接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）に属するものによって引き起こされるものである。真菌の感染症又は異常増殖には、１種以上の真菌種、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．アウリス（Ｃ．ａｕｒｉｓ）、Ｃ．クルーセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マラセチア・グロボセ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓｅ）、マラセチア・レストリクタ（Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）又はデバリオマイセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ジベレラ・モニリフォルミス（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、アルテルナリア・ブラッシコーラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、Ｐ．イロベチイ（Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｐ．ムリナ（Ｐ．ｍｕｒｉｎａ）、Ｐ．オリクトラジ（Ｐ．ｏｒｙｃｔｏｌａｇｉ）、Ｐ．ウェークフィールディアエ（Ｐ．ｗａｋｅｆｉｅｌｄｉａｅ）及びアスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）が含まれ得る。真菌種は、病原体又は日和見性病原体であると考えることができる。
一部の例では、真菌感染症は、カンジダ属の真菌によって引き起こされる（即ち、カンジダ感染症）。例えば、カンジダ感染症は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．クルーセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．アウリス（Ｃ．ａｕｒｉｓ）、Ｃ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．オルトプローシス（Ｃ．ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ルゴセ（Ｃ．ｒｕｇｏｓｅ）及びＣ．ルシタニア（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）からなる群から選択されるカンジダ属の真菌によって引き起こされ得る。本明細書に開示する方法によって治療することができるカンジダ感染症には、限定はされないが、カンジダ血症、中咽頭カンジダ症、食道カンジダ症、粘膜カンジダ、性器、外陰部カンジダ症、直腸カンジダ症、肝カンジダ症、腎カンジダ症、肺カンジダ症、脾カンジダ症、外耳道真菌症、骨髄炎、化膿性関節炎、心臓カンジダ症（例えば、心内膜炎）及び侵襲性カンジダ症が含まれる。
ｉｉ．細菌
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、細菌の適応度を低下させる、例えば、動物における細菌感染症を予防又は治療するために有用であり得る。含まれるのは、細菌をＰＭＰ組成物と接触させることによって細菌にＰＭＰ組成物を投与するための方法である。さらに又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載される細菌によって引き起こされる）細菌感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、下にさらに記載するいずれかの細菌によって引き起こされる、動物における細菌感染症の治療又は予防に適している。例えば、細菌は、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、ラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）（ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ））、スピロヘータ目（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）（ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ））、クラミジア目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）（ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ））、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）（発疹チフスリケッチア（Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、Ｒ．リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、Ａ．ファゴサイトフィルム（Ａ．ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｅ．シャフェンシス（Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）（ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ））、バークホルデリア目（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）（淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、カンピロバクター目（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）（カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）（レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、シュードモナス目（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）（Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、アエロモナス目（Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）（アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）種）、ビブリオ目（Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ）（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、チオスリックス目（Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、エンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｅｓ）（肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、Ｅ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｅｇｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））に属するものであり得る。
ｉｉｉ．寄生昆虫
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、動物における寄生昆虫感染症を予防又は治療するために、寄生昆虫の適応度を低下させるために有用であり得る。用語「昆虫」には、あらゆる発育段階にある、即ち幼虫及び成虫の、節足動物（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）門に、また昆虫（Ｉｎｓｅｃｔａ）綱又は蛛形（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）綱に属するあらゆる生物が含まれる。含まれるのは、昆虫をＰＭＰ組成物と接触させることによって昆虫にＰＭＰ組成物を送達するための方法である。さらに又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載される寄生昆虫によって引き起こされる）寄生昆虫感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）：シラミ亜目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（吸血シラミ）、ホソツノハジラミ亜目（Ｉｓｃｈｎｏｃｅｒａ）（噛むシラミ）、マルツノハジラミ亜目（Ａｍｂｌｙｃｅｒａ）（噛むシラミ）．ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）：ヒトノミ科（ネコノミ）、ナガノミ科（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｉｄａｅ）（ニワトリのノミ（Ｃｈｉｋｅｎ−ｆｌｅａｓ））．ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）：カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）（蚊）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）（ユスリカ、チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）（スナバエ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）（ブユ（Ｂｌａｃｋｆｌｙ））、アブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）（アブ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）（アブなど）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）（ホホアカクロバエ（Ｂｌｏｗｆｌｙ））、ツェツェバエ科（Ｇｌｏｓｓｉｎｉｄａｅ）（ツェツェバエ）、ヒツジバエ科（Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ）（ウマバエ（Ｂｏｔ−ｆｌｙ））、シラミバエ科（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）（シラミバエ）．半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）：サシガメ科（Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ）（サシガメ）、トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）（トコジラミ）．蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）：ヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）（ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｉｃ ｍｉｔｅ））、キュウセンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）（キュウセンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｃ ｍｉｔｅ））、サイトジチ科（Ｃｙｔｏｄｉｔｉｄａｅ）（気嚢ダニ）、ラミノシオプテス（Ｌａｍｉｎｏｓｉｏｐｔｅｓ）（シストダニ（Ｃｙｓｔ−ｍｉｔｅ））、ウモウダニ科（Ａｎａｌｇｉｄａｅ）（ウモウダニ）、コナダニ科（Ａｃａｒｉｄａｅ）（穀物ダニ）、ニキビダニ科（Ｄｅｍｏｄｉｃｉｄａｅ）（毛包ダニ）、ツメダニ科（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌｉｄａｅ）（柔皮ダニ）、ツツガムシ科（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌｉｄａｅ）（ツツガムシ）、サシダニ科（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｉｄａｅ）（トリサシダニ（Ｂｉｒｄ ｍｉｔｅ））、オオサシダニ科（Ｍａｃｒｏｎｙｓｓｉｄａｅ）（トリサシダニ（Ｂｉｒｄ ｍｉｔｅ））、ヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）（軟ダニ）、マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ）（硬ダニ）に属する昆虫による感染症を含めた、寄生昆虫による動物における感染症を予防又は治療するのに適している。
ｉｖ．原生動物
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、動物における寄生原生動物感染症を予防又は治療するために、寄生原生動物の適応度を低下させるために有用であり得る。用語「原生動物」には、原生動物門に属するあらゆる生物が含まれる。含まれるのは、寄生原生動物をＰＭＰ組成物と接触させることによって寄生原生動物にＰＭＰ組成物を送達するための方法である。さらに又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載される原生動物によって引き起こされる）原生動物感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、ミドリムシ門（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ブルセイトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種）、ヘテロロボサ綱（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｂｏｓｅａ）（フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ））、ディプロモナス目（Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｉｄａ）（ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ））、アメーバ動物門（Ａｍｏｅｂｏｚｏａ）（カステラーニアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）、バラムチア・マンドリルリス（Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、ブラストシスチス属（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）（ヒトブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ））、アピコンプレックス門（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）（ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、シクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）に属する原生動物を含めた、動物における寄生原生動物による感染症を予防又は治療するのに適している。
ｖ．線虫
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、動物における寄生線虫感染症を予防又は治療するために、寄生線虫の適応度を低下させるために有用であり得る。含まれるのは、寄生線虫をＰＭＰ組成物と接触させることによって寄生線虫にＰＭＰ組成物を送達するための方法である。さらに又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載される寄生線虫によって引き起こされる）寄生線虫感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）（回虫）：広東住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ）（ラット肺線虫）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）（ヒト回虫）、バイリサカリス・プロキオニス（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ）（アライグマ回虫）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）（ヒト鞭虫）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）及びアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）（ヒト鉤虫）、条虫綱（Ｃｅｓｔｏｄａ）（サナダムシ）：単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）（有鉤条虫（ｐｏｒｋ ｔａｐｅｗｏｒｍ））に属する線虫を含めた、動物における寄生線虫による感染症を予防又は治療するのに適している。
ｖｉ．ウイルス
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、例えば、動物におけるウイルス感染症を予防又は治療するために、ウイルスの適応度を低下させるために有用であり得る。含まれるのは、ウイルスをＰＭＰ組成物と接触させることによってウイルスにＰＭＰ組成物を送達するための方法である。さらに又は代わりに、この方法は、ＰＭＰ組成物を動物に投与することにより、リスクがある又はそれを必要とする動物において、（例えば、本明細書に記載されるウイルスによって引き起こされる）ウイルス感染症を予防又は治療することを含む。
本ＰＭＰ組成物及び関連方法は、ＤＮＡウイルス：パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）；一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス：アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（ルブラウイルス、レスピロウイルス、ニューモウイルス、モリビリウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（マールブルグウイルス、エボラウイルス）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ナイロウイルス、ハンタウイルス、オルソブニヤウイルス、フレボウイルス．一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス：アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（ルビウイルス、アルファウイルス）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（ヘパシウイルス、フラビウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（ヘパトウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス）；又はｄｓＲＮＡ及びレトロ転写（Ｒｅｔｒｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ウイルス：レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（ロタウイルス、コルティウイルス、セドナウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（デルタレトロウイルス、レンチウイルス）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（オルトヘパドナウイルス）に属するウイルスによる感染症を含めた、動物におけるウイルス感染症を予防又は治療するのに適している。
Ｅ．病原体ベクターへの送達
本明細書で提供されるのは、病原体ベクターをＰＭＰ組成物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を、本明細書に開示するものなどの、病原体ベクターに送達する方法である。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、動物病原体を担持するか又は動物病原体を保有者から動物に伝達することができる昆虫を指す。例示的なベクターとしては、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）及びいくつかのハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）及びハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、例えば蚊、ミツバチ、スズメバチ、ユスリカ、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリ並びにマダニ及びダニなどのクモ綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａｅ）のメンバーに見られるような、突き刺して吸引する口器をもつものなどの昆虫が挙げられる。
一部の例では、動物（例えば、ヒト）病原体のベクターは、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで処置することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、異種治療薬（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫薬剤、抗ウイルス剤又は忌避剤）を含む。この方法は、ＰＭＰ組成物の送達の結果として、病原体ベクターの適応度を低下させるのに、例えば、病原体の拡大を制御するために有用であり得る。本方法に従って標的にすることができる病原体ベクターの例としては、本明細書に記載されるものなどの昆虫が挙げられる。
例えば、本明細書で提供されるのは、動物病原体ベクターの適応度を低下させる方法であって、本明細書に記載される有効量のＰＭＰ組成物を、ベクターに送達することを含む方法であり、ここで、この方法は、ベクターの適応度を、処置されていないベクターに対して低下させる。一部の例では、この方法は、ベクターが成長、生存、繁殖、摂食又は寄生する少なくとも１つの生息場所に、組成物を送達することを含む。一部の例では、組成物は、ベクターによる摂取のための、摂取可能な組成物として送達される。一部の例では、ベクターは、昆虫である。一部の例では、昆虫は、蚊、マダニ、ダニ又はシラミである。一部の例では、組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として（例えば、病原体ベクターに）送達される。
例えば、本明細書で提供されるのは、動物病原体の昆虫ベクターの適応度を低下させる方法であって、複数のＰＭＰを含むＰＭＰ組成物を、ベクターに送達することを含む方法である。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（ここで、複数のＰＭＰは、殺虫薬剤を含む）を含むＰＭＰ組成物を、ベクターに送達することを含む。例えば、昆虫ベクターは、蚊、マダニ、ダニ又はシラミであり得る。病原体ベクターの他の非限定的な例は、本明細書に提供される。一部の例では、この方法は、ベクターの適応度を、処置されていないベクターに対して低下させる。
一部の例では、ベクター適応度の低下は、組成物の投与の結果としてのベクターの生理機能の悪化又は減退（例えば、健康又は生存の低下）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、寿命、移動性、繁殖力、体重、代謝率若しくは活動又は生存を含めた１つ以上のパラメータにより、ＰＭＰ組成物が送達されていないベクター生物との比較で測定することができる。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、ベクターの全般的健康を低下させるか又はベクターの全生存を低下させるのに有効であり得る。一部の例では、ベクターの生存の低下は、参照レベル（例えば、組成物を受けないベクターにおいて見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超、高い。一部の例では、本方法及び組成物は、ベクター生殖（例えば、繁殖率）を、組成物が送達されていないベクター生物と比較して低下させるのに有効である。一部の例では、この方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、繁殖力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを、参照レベル（例えば、組成物が送達されないベクターにおいて見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超、低下させるのに有効である。
一部の例では、ベクター適応度の低下は、組成物が送達されていないベクター生物と比較した、農薬用薬剤に対するベクターの感受性の増大及び／又は農薬用薬剤に対するベクターの抵抗性の低下として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤に対するベクターの感受性を、参照レベル（例えば、組成物を受けないベクターにおいて見られるレベル）に対して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超、増大させるのに有効であり得る。農薬用薬剤は、殺虫薬剤を含めた、当技術分野で公知の任意の農薬用薬剤であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解するベクターの能力を低下させることにより、組成物が送達されていないベクターと比較して、農薬用薬剤に対するベクターの感受性を増大させることができる。
一部の例では、ベクター適応度の低下は、組成物が投与されていないベクター生物と比較した、特定の環境因子に対する耐性（例えば、高温若しくは低温耐性）の低下、特定の生息場所で生存する能力の低下又は特定の食餌に耐える能力の低下など、他の適応度の不利点として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の複数の方法で有害生物適応度を低減させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載されるいずれかの複数の方法でベクター適応度を低下させるのに有効であり得る。さらに、この組成物は、ベクターのいくつもの綱、目、科、属又は種（例えば、１つのベクターの種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれよりも多いベクターの種）におけるベクター適応度を低下させることができる。一部の例では、組成物は、ベクターの単一の綱、目、科、属又は種に作用する。
ベクター適応度は、当技術分野におけるあらゆる標準の方法を使用して評価することができる。一部の例では、ベクター適応度は、個々のベクターを評価することによって評価することができる。代わりに、ベクター適応度は、ベクター集団を評価することによって評価することができる。例えば、ベクター適応度の低下は、他のベクターとの競合の成功の低下（それによってベクター集団の大きさの低下がもたらされる）として現れる。
本明細書で提供される組成物は、動物病原体を担持するベクターの適応度を低下させることにより、ベクター媒介性疾患の拡大を低下させるのに有効である。この組成物は、疾患の伝播を低下させる、例えば、ベクター間の垂直若しくは水平伝播を低下させる及び／又は動物への伝播を低下させるのに有効な量且つ期間、本明細書に記載される製剤及び送達方法のいずれかを使用して、昆虫に送達することができる。例えば、本明細書に記載される組成物は、ベクター媒介性病原体の垂直若しくは水平伝播を、組成物が送達されていないベクター生物と比較して、約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて低下させることができる。別の例では、本明細書に記載される組成物は、昆虫ベクターのベクター能力を、組成物が送達されていないベクター生物と比較して、約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて低下させることができる。
本明細書で提供される組成物及び方法によって制御することができる疾患の非限定的な例としては、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、チクングニア熱、ロスリバー熱、マヤロ熱、オニョンニョン熱、シンドビス熱、東部馬脳炎、西部馬脳炎、ベネズエラ馬脳炎又はバーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ ｆｏｒｅｓｔ））；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、デング熱、黄熱、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、日本脳炎、マレー渓谷脳炎、ロシオ（Ｒｏｃｉｏ）、セントルイス脳炎、ウエストナイル脳炎又はダニ媒介脳炎）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、サシチョウバエ熱、リフトバレー熱、ラクロス脳炎（Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、カリフォルニア脳炎、クリミア・コンゴ出血熱又は口嚢熱（Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ ｆｅｖｅｒ））；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、水疱性口内炎）；オルビウイルス科（Ｏｒｂｉｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる疾患（例えば、ブルータング）；細菌によって引き起こされる疾患（例えば、ペスト（Ｐｌａｇｕｅ）、野兎病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱、発疹熱、ボタン熱、クイーンズランドマダニチフス（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ ｔｉｃｋ ｔｙｐｈｕｓ）、シベリアマダニチフス（Ｓｉｂｅｒｉａｎ ｔｉｃｋ ｔｙｐｈｕｓ）、ツツガムシ病、回帰熱又はライム病；又は原生動物によって引き起こされる疾患（例えば、マラリア、アフリカトリパノソーマ症、ナガナ病、シャーガス病、リーシュマニア症、ピロプラズマ病、バンクロフト糸状虫症又はマレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａｎ）フィラリア症）が挙げられる。
ｉ．病原体ベクター
本明細書で提供される方法及び組成物は、動物病原体に対するベクターの適応度を低下させるために有用であり得る。一部の例では、ベクターは、昆虫であり得る。例えば、昆虫ベクターには、限定はされないが、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）及びいくつかのハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）及びハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、例えば蚊、ミツバチ、スズメバチ、ユスリカ、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリ並びにマダニ及びダニなどのクモ綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａｅ）のメンバーに見られるような、突き刺して吸引する口器をもつもの；ダニ目（Ａｃａｒｉｎａ）（マダニ及びダニ）の目、綱又は科；例えば、ヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）、ワクモ科（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｉｄａｅ）、マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ）、キュウセンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）又はヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）を代表するもの及びキララマダニ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ）種、アノセントン（Ａｎｏｃｅｎｔｏｎ）種、ナガヒメダニ属（Ａｒｇａｓ）種、オウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、ツメダニ（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ）種、ショクヒヒゼンダニ属（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ）種、ニキビダニ属（Ｄｅｍｏｄｅｘ）種、カクマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）種、デルマニサス（Ｄｅｎｍａｎｙｓｓｕｓ）種、チマダニ属（Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ）種、イボマダニ属（Ｈｙａｌｏｍｍａ）種、マダニ属（Ｉｘｏｄｅｓ）種、リンクサカルス（Ｌｙｎｘａｃａｒｕｓ）種、トゲダニ亜目（Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａｔａ）種、ショウセンコウヒゼンダニ属（Ｎｏｔｏｅｄｎｅｓ）種、ヒメダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ）種、イエダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ）種、オトビウス属（Ｏｔｏｂｉｕｓ）種、ミミヒゼンダニ属（ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ）種、ニューモニサス（Ｐｎｅｕｍｏｎｙｓｓｕｓ）種、キュウセンヒゼンダニ属（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ）種、コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ）種、ヒゼンダニ属（Ｓａｎｃｏｐｔｅｓ）種又はツツガムシ属（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ）種を代表するもの；シラミ亜目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（吸血する及び噛むシラミ）、例えば、ボビコーラ属（Ｂｏｖｉｃｏｌａ）種、ブタジラミ属（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ）種、ケモノホソジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａ ｔｈｕｓ）種、メノポン属（Ｍｅｎｏｐｏｎ）種、シラミ属（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ）種、ペンフィガス（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）種、ネアブラムシ（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ）種又はソレノポテス（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ）種を代表するもの；ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハエ）、例えば、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種、オオクロバエ属（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ）種、オビキンバエ属（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ）種、メクラアブ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ）種、コクリオミイヤ属（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）種、Ｃｗ／ｅｘ種、サシバエ属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）種、ウサギヒフバエ属（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ）種、ヒフバエ属（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ）種、ウマバエ属（Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）種、ツェツェバエ属（Ｇｌｏｓｓｉｎａ）種、ノサシバエ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ）種、ゴマフアブ（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ）種、シラミバエ属（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃａ）種、ヒフバエ属（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）種、キンバエ属（Ｌｕｃｉｌｉａ）種、リペロシア（Ｌｙｐｅｒｏｓｉａ）種、ヒツジシラミバエ属（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ）種、ヒツジバエ属（Ｏｅｓｔｒｕｓ）種、ファエニシア（Ｐｈａｅｎｉｃｉａ）種、サシチョウバエ属（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ）種、クロキンバエ属（Ｐｈｏｒｍｉａ）種、ダニ目（Ａｃａｒｉ）（疥癬）、例えば、ヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）種、肉バエ属（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ）種、ブユ属（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ）種、サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ）種、アブ属（Ｔａｂａｎｕｓ）種、タンニア（Ｔａｎｎｉａ）種又はＺｚｐｕ／アルファ種を代表するもの；ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）（噛むシラミ）、例えば、ダマリナ（Ｄａｍａｌｉｎａ）種、フェリコラ（Ｆｅｌｉｃｏｌａ）種、ヘテロドキサス（ｈｅｔｅｒｏｄｏｘｕｓ）種又はケモノハジラミ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ）種を代表するもの；又はノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）（無翅昆虫）、例えば、ナガノミ属（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ）種、ネズミノミ属（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ）種を代表するもの；トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）（ナンキンムシ）、例えば、キメクス属（Ｃｉｍｅｘ）種、オオサシガメ亜科（Ｔｒｉｔｏｍｉｎａｅ）種、ロドニウス属（Ｒｈｏｄｉｎｉｕｓ）種又はサシガメ属（Ｔｒｉａｔｏｍａ）種を代表するものが含まれ得る。
一部の例では、昆虫は、ハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の血液を吸う昆虫（例えば、カ亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、例えば、カ科（Ｃｏｌｉｃｉｄａｅ））である。一部の例では、昆虫は、カ亜科（Ｃｕｌｉｃｉｎａｅ）、コレトリ亜科（Ｃｏｒｅｔｈｒｉｎａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）又はブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）のものである。一部の例では、昆虫は、イエカ属（Ｃｕｌｅｘ）種、ミスジハボシカ（Ｔｈｅｏｂａｌｄｉａ）種、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）種、ブユモドキ亜属（Ｆｏｒｃｉｐｏｎｉｙｉａ）種、サシバエ属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ）種又はゴミムシダマシ（Ｈｅｌｅａ）種のものである。
特定の例では、昆虫は、蚊である。特定の例では、昆虫は、マダニである。特定の例では、昆虫は、ダニである。特定の例では、昆虫は、噛むシラミである。
Ｆ．動物への送達
本明細書で提供されるのは、例えば、動物細胞、組織、対象又はその部分を、ＰＭＰ組成物と接触させることにより、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）を、動物細胞、組織、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に送達する方法である。一部の例では、動物は、異種機能性薬剤を含まないＰＭＰで治療することができる。他の例では、ＰＭＰは、異種機能性薬剤、例えば、異種治療薬（例えば、治療用タンパク質又はペプチド核酸又は小分子、抗菌剤、抗真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、抗寄生虫薬剤、抗ウイルス剤又は忌避剤）を含む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、動物の適応度を増大させる方法であって、動物の適応度を、治療されていない動物（例えば、ＰＭＰ組成物を送達されていない動物）に対して増大させるために、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を、（例えば、有効量で且つ有効な期間）動物に送達することを含む方法である。
ＰＭＰ組成物の送達の結果としての動物の適応度の増大は、動物適応度（例えば、哺乳動物の適応度、例えば、ヒトの適応度（例えば、健康））を評価するあらゆる方法によって決定することができる。
本明細書で提供されるのは、動物の適応度を改変又は増大させる方法であって、本明細書で提供される有効量のＰＭＰ組成物を、動物に送達することを含む方法であり、ここで、この方法は、動物を改変し、それにより動物における有益な形質を導入するか、又は治療されていない動物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増大させる。特に、この方法は、動物の適応度を、治療されていない動物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増大させることができる。
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、動物の適応度を増大させる方法であって、動物の細胞を、本明細書の有効量のＰＭＰ組成物と接触させることを含む方法であり、ここで、この方法は、植物の適応度を、治療されていない動物に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超）増大させる。
特定の例では、動物は、哺乳動物、例えば、ヒトである。特定の例では、動物は、家畜動物又は獣医学的動物である。特定の例では、動物は、マウスである。
Ｇ．適用方法
本明細書に記載される植物を、組成物の植物への送達又は投与を可能にする任意の好適な方式で、ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）に曝露することができる。ＰＭＰ組成物は、単独で又は他の活性物質（例えば、施肥剤）又は非活性物質と組み合わせて送達することができ、例えば有効濃度のＰＭＰ組成物を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布剤、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で、例えば噴霧、インジェクション（マイクロインジェクション）、植物経由、注入、浸漬によって適用することができる。本明細書に記載される組成物の適用の量及び場所は、概して、植物の生息場所、植物をＰＭＰ組成物によって標的とすることができる生活環ステージ、適用が行われることとなる部位及びＰＭＰ組成物の物理的及び機能的特性によって決定される。
一部の例では、本組成物は、例えば、背負式散布、空中散布、作物散布／散粉などによって植物、例えば作物の上に直接的に噴霧される。ＰＭＰ組成物が植物に送達される場合、ＰＭＰ組成物を受ける植物は、植物のいずれの成長段階でもあり得る。例えば、製剤化されたＰＭＰ組成物を、植物成長の初期段階で種子コーティング又は根処理として又は作物サイクルの後期段階で植物全体の処理として適用することができる。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、局所的薬剤として植物に適用することができる。
さらに、ＰＭＰ組成物は、植物の組織を通じて吸収且つ分配される浸透移行性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌中又は植物に水やりをするために使用される水中に）適用することができる。一部の例では、植物又は飼料生物を、ＰＭＰ組成物を発現するように遺伝的に形質転換することができる。
ＰＭＰ組成物又はＰＭＰ組成物（１種又は複数）を含む組成物を、ゼラチンなどの溶解性又は生体内分解性コーティング層で被覆することによって（このコーティングが使用環境において溶解又は分解された後にＰＭＰ組成物が利用可能になる）又は薬剤を溶解可能又は分解可能マトリックス中に分散させることによって遅延放出又は持続的放出も達成することができる。好都合には、こうした継続的放出及び／又は分配装置を使用して、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物の１つ以上の有効濃度を常に維持することができる。
一部の例では、ＰＭＰ組成物は、植物、例えば、葉、種子、花粉、根、果実、新芽若しくは花又はその組織、細胞或いはプロトプラストの一部に送達される。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、植物の細胞に送達される。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、植物のプロトプラストに送達される。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、植物の組織に送達される。例えば、組成物は、植物の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、側生分裂組織又は節間分裂組織）に送達される。一部の例では、組成物は、植物の永久組織（例えば、単組織）（例えば、実質、厚角組織又は厚壁組織）又は複合永久組織（例えば、木部又は師部）に送達される。一部の例では、組成物は、植物の胚に送達される。
一部の例では、ＰＭＰ組成物は、多くの場合、野外適用について、１ヘクタール当たりのＰＭＰの量（ｇ／ｈａ若しくはｋｇ／ｈａ）又は１ヘクタール当たりの活性成分（例えば、異種機能性薬剤を含む又は含まないＰＭＰ）又は酸等価物の量（ｋｇ ａ．ｉ．／ｈａ若しくはａ．ｉ．／ｈａ）として推奨され得る。一部の例では、異種機能性薬剤が、ＰＭＰを含まない組成物中に適用される場合と同じ結果を達成するために、より少ない量の、本組成物中の異種機能性薬剤が、土壌、植物培地、種子植物組織又は植物に適用されることが必要となる可能性がある。例えば、異種機能性薬剤の量は、非ＰＭＰ組成物中に適用される同じ異種機能性薬剤、例えば、ＰＭＰを含まない同じ異種機能性薬剤の直接適用よりも、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０若しくは１００倍（又は約２から約１００倍までの任意の範囲、例えば約２〜１０倍；約５〜１５倍、約１０〜２０倍；約１０〜５０倍）低いレベルで適用することができる。本発明のＰＭＰ組成物は、１ヘクタール当たりの様々な量で、例えば約０．０００１、０．００１、０．００５、０．０１、０．１、１、２、１０、１００、１，０００、２，０００、５，０００（又は約０．０００１〜５，０００の任意の範囲）ｋｇ／ｈａで適用することができる。例えば、約０．０００１〜約０．０１、約０．０１〜約１０、約１０〜約１，０００、約１，０００〜約５，０００ｋｇ／ｈａである。
Ｈ．治療方法
ＰＭＰ組成物（例えば、本明細書に記載される修飾ＰＭＰが含まれる）は、様々な治療方法において有用でもあり得る。例えば、本方法及び組成物を、動物（例えば、ヒト）における病原体感染の予防又は治療のために使用することができる。本明細書で使用される場合、用語「治療」は、予防及び／又は治療目的で、動物に医薬組成物を投与することを指す。「感染を予防する」ことは、まだ病気ではないが、特定の疾患にかかりやすいか又は他にリスクがある動物の予防的治療を指す。「感染症を治療すること」は、既に疾患を患っている動物に、動物の状態を改善又は安定化させるために治療を施すことを指す。本方法は、ヒトなどの動物に、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を送達することを含む。
例えば、本明細書で提供されるのは、真菌感染を有する動物を治療する方法であって、複数のＰＭＰを含む有効量のＰＭＰ組成物を、動物に投与することを含む方法である。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（ここで、複数のＰＭＰは、抗真菌剤を含む）を含む有効量のＰＭＰ組成物を、動物に投与することを含む。一部の例では、抗真菌剤は、真菌感染症を引き起こす真菌における遺伝子（例えば、増強された線維成長タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＦＧ１））の発現を阻害する核酸である。一部の例では、真菌感染症は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナのアポプラストＥＶから産生されたＰＭＰを含む。一部の例では、この方法は、真菌感染症を減少させる又は実質的に排除する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、細菌感染を有する動物を治療する方法であって、複数のＰＭＰを含む有効量のＰＭＰ組成物を、動物に投与することを含む方法である。一部の例では、この方法は、複数のＰＭＰ（を含む有効量のＰＭＰ組成物を、動物に投与することを含み、ここで、複数のＰＭＰは、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）を含む。一部の例では、細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種又は大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種）である。一部の例では、組成物は、シロイヌナズナのアポプラストＥＶから産生されたＰＭＰを含む。一部の例では、この方法は、細菌感染症を減少させる又は実質的に排除する。動物は、ヒト、獣医学的動物又は家畜動物である。
本方法は、（例えば、動物における動物病原体によって引き起こされる場合の）感染症を治療するために有用であり、これは、動物の状態を改善又は安定化させるために、疾患を既に患っているへの治療を施すことを意味する。これは、１種以上の病原体による動物の内部、表面又は周囲の病原体のコロニー形成を、開始量に対して（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）低下させ、且つ／又は個人に利益を与えること（例えば、症状を回復させるのに十分な量のコロニー形成の低下）を含むことができる。こうした場合、治療された感染症は、症状の（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の）低減として現れ得る。一部の例では、治療された感染症は、個人の生存の可能性を増大させる（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の生存の可能性の増大）又は集団の全生存を増大させる（例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の生存の可能性の増大）に有効である。例えば、組成物及び方法は、感染症を「実質的に排除する」のに有効であり得、これは、動物における症状を持続的に（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２か月の間）回復させるのに十分な量の感染の低減を意味する。
本方法は、（例えば、動物病原体によって引き起こされる場合の）感染症を予防するために有用であり、これは、最初の病原体集団を維持するのに十分な量（例えば、概ね、健康な個人において見られる量）で、１種以上の病原体による動物の内部、表面又は周囲のコロニー形成の（例えば、治療されていない動物に対する、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超の）増加を予防し、感染症の発症を予防し、且つ／又は感染症に伴う症状又は状態を予防することを意味する。例えば、個人は、免疫無防備状態の個人（例えば、癌を有する、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを有するか又は免疫抑制剤を受けている個人）において又は長期の抗生物質療法を受けている個人において、侵襲的な医療処置のために準備している（例えば、移植、幹細胞療法、グラフト、補綴などの手術を受けること、長期の又は高頻度の静脈内カテーテル留置を受けること又は集中治療室で治療を受けることのために準備している）間、真菌の感染を予防するために、予防的処置を受けることができる。
ＰＭＰ組成物は、任意の好適な方法により、投与のために製剤化するか又は投与することができ、これには、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、くも膜下腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、腹膜内、結膜下、小胞内、粘膜に、心膜内、臍下、眼内、眼窩内、経口的、局所的、経皮的、硝子体内（例えば、硝子体内注射によって）、点眼による、吸入による、注射による、移植による、注入による、持続的注入による、直接的に標的細胞を浸す限局的な灌流による、カテーテルによる、潅注による、クリーム内又は脂質組成物内が含まれる。本明細書に記載される方法において利用される組成物は、全身的又は局所的に投与することもできる。投与の方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物又は組成物及び治療される状態、疾患又は障害の重症度）に応じて変わり得る。一部の例では、ＰＭＰ組成物は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、くも膜下腔内に、脳室内に又は鼻腔内に投与される。投薬は、あらゆる好適な経路による、例えば、投与が短時間か慢性的であるかということにある程度依存する静脈内又は皮下注射などの注射によるものであり得る。限定はされないが、様々な時点での単回又は反復投与、ボーラス投与及びパルス注入を含めて、様々な投薬スケジュールが企図される。
本明細書に記載される感染症の予防又は治療については（単独で又は１種以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用される場合）、治療されることとなる疾患の種類、疾患の重症度及び経過、予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴及びＰＭＰ組成物に対する反応に依存することとなる。ＰＭＰ組成物は、例えば、一度に又は一連の治療を通して患者に投与することができる。数日又はそれを超える反復投与については、状態に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるか又は感染が検出可能ではなくなるまで維持されるであろう。こうした用量は、例えば、患者が、例えば、ＰＭＰ組成物の約２〜約２０回の投与を受けるように、断続的に、例えば、毎週又は２週ごとに投与することができる。より高い初回の負荷用量、それに続いて、より低い１回以上の用量を投与することができる。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療法の進展は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
一部の例では、個人（例えば、ヒト）に投与されるＰＭＰ組成物の量は、個人の体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ又は約１ｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇ）の範囲内であり得る。一部の例では、個人（例えば、ヒト）に投与されるＰＭＰ組成物の量は、個人の体重の、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ（例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｇ／ｋｇ又は少なくとも５ｇ／ｋｇ）である。この用量は、単回投与として又は反復投与（例えば、２、３、４、５、６、７又は７回よりも多い投与）として投与することができる。一部の例では、動物に投与されるＰＭＰ組成物は、単独で又は追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。組み合わせ治療において投与される抗体の用量は、単剤治療と比較した場合に低下させることができる。この治療法の進展は、従来の技術によって容易にモニタリングされる。
ＩＶ．キット
本発明は、本明細書に記載されるＰＭＰ組成物を有する容器を含むキットも提供する。このキットは、本発明の方法に従ってＰＭＰ組成物を植物に適用又は送達するための説明資料をさらに含むことができる。当業者は、本発明の方法においてＰＭＰ組成物を適用するための説明が、あらゆる形態の説明であり得ることを理解するであろう。こうした説明としては、限定はされないが、書面での説明資料（例えば、ラベル、冊子、パンフレット）、口述による説明資料（例えば、カセットテープ若しくはＣＤ）又はビデオによる説明（例えば、ビデオテープ若しくはＤＶＤ）が挙げられる。
以下は、本発明の方法の例である。上に提供した概説を考慮して、他の様々な実施形態を実施し得ることが理解される。
Figure 2021533794
実施例１：植物からの植物メッセンジャーパックの単離
この実施例は、葉アポプラスト、種子アポプラスト、根、果実、野菜、花粉、師管液、木部樹液及び植物細胞培地を含めた様々な植物起源からの粗植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の単離を説明する。
実験計画：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）葉のアポプラストからのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼットのアポプラスト洗浄液からＰＭＰを単離する。手短には、全ロゼットを根から収穫し、小胞単離バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）と一緒に真空浸潤する。浸潤した植物を注意深くブロットして、余剰の液体を除去し、３０ｍＬシリンジ内に導入してから、５０ｍＬ円錐チューブにおいて２℃で２０分間遠心分離することにより、ＥＶを含有するアポプラスト細胞外液を収集する。次に、アポプラスト細胞外液を０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｂ）ヒマワリ種子のアポプラストからのＰＭＰ単離
インタクトなヒマワリ種子（ヒマワリ（Ｈ．ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）に水を２時間吸収させ、皮を剥いで、果皮を除去した後、Ｒｅｇｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８３：３３６３−３３６６，２００９から改変した修正真空浸潤−遠心分離手順によりアポプラスト細胞外液を抽出する。手短には、種子を小胞単離バッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）に浸潤させてから、３回の１０秒の真空パルスに付し、３０秒間隔の４５ｋＰａの圧力により分離する。浸潤した種子を回収し、濾紙上で乾燥させ、フリットガラス濾過器に配置し、４℃、４００ｇで２０分間遠心分離する。アポプラスト細胞外液を回収し、０．８５μｍフィルタで濾過することにより、大きい粒子を除去した後、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｃ）根生姜からのＰＭＰ単離
新鮮な生姜（ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ））根茎根を現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄する。計２００グラムの洗浄済の根をミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕した後、Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．４（１）：２８７１３，２０１５に記載されているように、ＰＭＰを単離する。手短には、生姜汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｄ）グレープフルーツ果汁からのＰＭＰ単離
新鮮なグレープフルーツ（グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ×ｐａｒａｄｉｓｉ））を現地の供給者から購入し、その皮を除去し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２（３）：５２２−５３４，２０１４に記載されているように（若干の修正を加えた）、果実を手で圧搾するか、又はミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕することにより、果汁を収集する。手短には、果汁／果汁パルプを１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｅ）ブロッコリーヘッドからのＰＭＰ単離
ブロッコリー（ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ））ＰＭＰは、以前記載されている（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２５（７）：１６４１−１６５４，２０１７）ように単離する。手短には、新鮮なブロッコリーを現地の供給者から購入し、ＰＢＳで３回洗浄してから、ミキサー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ １２速ブレンダ）により最大速で１０分間（ブレンド１分毎に１分の休止）粉砕する。次に、ブロッコリー汁を１，０００ｇで１０分、３，０００ｇで２０分及び１０，０００ｇで４０分と順次遠心分離することにより、ＰＭＰ含有上清から大きい粒子を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｆ）オリーブ花粉からのＰＭＰ単離
オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））花粉ＰＭＰは、Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ．７（３）：５７３−５７７，２０１４に以前記載されているように単離する。手短には、オリーブ花粉（０．１ｇ）を室温の加湿チャンバー内で３０分間水和した後、２０ｍｌの発芽培地：１０％ショ糖、０．０３％Ｃａ（ＮＯ３）２、０．０１％ＫＮＯ３、０．０２％ＭｇＳＯ４及び０．０３％Ｈ３ＢＯ３を含有するペトリ皿（直径１５ｃｍ）に移す。花粉を３０℃の暗所において１６ｈ発芽させる。花粉粒は、チューブが花粉粒の直径より長くなったときに初めて発芽したとみなされる。ＰＭＰを含有する培地を収集し、遠心分離による０．８５ｕｍフィルタでの２回の連続濾過によって花粉残屑を除去する。実施例２に記載のように、ＰＭＰを精製する。
ｇ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）師管液からのＰＭＰ単離
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｏｌ−０））種子を５０％漂白剤で表面滅菌した後、０．８％寒天を含有する０．５３ムラシゲスクーグ培地上に平板培養する。これらの種子を４℃で２日間春化処置した後、短日条件（明期９ｈ、２２℃、１５０μＥｍ−２）に移す。１週間後、苗をＰｒｏ−Ｍｉｘ ＰＧＸに移す。植物を４〜６週間成長させた後、収穫する。
Ｔｅｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．，により、ＪｏＶＥ．８０，２０１３に記載されているように、４〜６週齢のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ロゼット葉からの師管液を収集する。手短には、葉柄の基部から葉を切断し、重ねてから、創傷の封止を防ぐために、２０ｍＭ Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する反応チューブ内に暗所で１時間配置する。葉を容器から穏やかに取り出し、蒸留水で入念に洗浄し、全てのＥＤＴＡを除去して、清浄なチューブ内に配置した後、暗所において師管液を５〜８時間かけて収集する。葉を廃棄し、師管液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｈ）トマト植物木部樹液からのＰＭＰ単離
トマト（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））種子をＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇａｗａｍ，ＭＡ）などの有機質土壌の入った単一ポットに植え、２２℃〜２８℃の温室内に維持する。発芽から約２週間後、即ち２本葉期（ｔｗｏ ｔｒｕｅ−ｌｅａｆ ｓｔａｇｅ）に、９０％砂及び１０％有機物ミックスを含む滅菌砂質土を充填したポット（直径１０ｃｍ、深さ１７ｃｍ）に苗を個別に移植する。２２℃〜２８℃の温室内に植物を４週間維持する。
Ｋｏｈｌｅｎ ｅｔ Ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１５５（２）：７２１−７３４，２０１１に記載されているように、４週齢のトマト植物からの木部樹液を収集する。手短には、トマト植物の胚軸から上を切断し、プラスチックリングを茎の周りに取り付ける。切断から９０分にわたって蓄積する木部樹液を収集する。木部樹液を０．８５μｍフィルタで濾過して、大きい粒子を除去してから、実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
ｉ）タバコＢＹ−２細胞培地からのＰＭＰ単離
３０ｇ／Ｌショ糖、２．０ｍｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．１ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、０．２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及び１ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌを補充したＭＳ塩（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、♯Ｍ０２２１）を含むＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）ＢＹ−２培地（ｐＨ５．８）中で、１８０ｒｐｍのシェーカに載せ、タバコＢＹ−２（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ ｃｖ．）ブライトイエロー２）細胞を２６℃の暗所において培養する。７日齢細胞培養物の５％（ｖ／ｖ）を１００ｍＬの新鮮な液体培地に移すことにより、ＢＹ−２細胞を毎週二次培養する。７２〜９６時間後、ＢＹ−２培地を収集し、４℃、３００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を除去する。ＰＭＰを含有する上清を収集し、０．８５ｕｍフィルタでの濾過により、残屑を除去する。実施例２に記載するように、ＰＭＰを精製する。
実施例２：精製植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）の生成
この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配（イオジキサノール若しくはショ糖）と組み合わせて限外濾過及び沈殿又はサイズ排除クロマトグラフィーによる凝集体の除去を用いた、実施例１に記載の粗ＰＭＰ画分から精製ＰＭＰの生成を説明する。
実験計画：
ａ）サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせて限外濾過を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
１００−ｋＤＡ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、実施例１ａからの粗グレープフルーツＰＭＰ画分を濃縮する。次に、濃縮した粗ＰＭＰ溶液をＰＵＲＥ−ＥＶサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）にロードし、製造者の指示に従って単離する。精製済ＰＭＰ含有画分を、溶出後プールする。任意選択で、１００−ｋＤＡ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタを用いて又はタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、ＰＭＰを更に濃縮することもできる。実施例３に記載のように、精製ＰＭＰを分析する。
ｂ）イオジキサノール勾配を用いた精製シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アポプラストＰＭＰの生成
実施例１ａに記載のように、粗シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）葉アポプラストＰＭＰを単離し、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載されているように、精製ＰＭＰを生成する。不連続イオジキサノール勾配（ＯｐｔｉＰｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を調製するために、小胞単離バッファー（ＶＩＢ；２０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）で水性６０％ＯｐｔｉＰｒｅｐストック溶液を希釈することにより、４０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）及び５％（ｖ／ｖ）イオジキサノールの溶液を作製する。勾配は、３ｍｌの４０％溶液、３ｍＬの２０％溶液、３ｍＬの１０％溶液、２ｍＬの５％溶液を積層することにより形成する。実施例１ａからの粗アポプラストＰＭＰ溶液を４℃、４０，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを０．５ｍｌのＶＩＢに再懸濁させてから、勾配の上部に重ねる。４℃、１００，０００ｇで１７ｈ遠心分離を実施する。勾配の上部の最初の４．５ｍｌを廃棄した後、アポプラストＰＭＰを含有する０．７ｍｌの３容量を収集し、ＶＩＢを用いて３．５ｍＬにして、４℃、１００，０００ｇで６０分間遠心分離する。ペレットを３．５ｍｌのＶＩＢで洗浄した後、同じ遠心分離条件を用いて再ペレット化する。実施例３に記載の通り、次の分析のために精製ＰＭＰペレットを合わせる。
ｃ）ショ糖勾配を用いた精製グレープフルーツＰＭＰの生成
実施例１ｄに記載のように粗グレープフルーツ果汁ＰＭＰを単離し、１５０，０００ｇで９０分間遠心分離した後、記載されている（Ｍｕ ｅｔ Ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５８（７）：１５６１−１５７３，２０１４）ように、ＰＭＰ含有ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。再懸濁させたペレットをショ糖ステップ勾配（８％／１５％／３０％／４５％／６０％）に移し、１５０，０００ｇで１２０分間遠心分離して、精製ＰＭＰを生成する。３０％／４５％界面から精製グレープフルーツＰＭＰを収集し、後に実施例３に記載のように分析する。
ｄ）グレープフルーツＰＭＰからの凝集体の除去
実施例１ｄに記載の通り生成したグレープフルーツＰＭＰ又は実施例２ａ〜ｃからの精製ＰＭＰからタンパク質凝集体を除去するために、追加の精製ステップを加えることができる。生成したＰＭＰ溶液を様々なｐＨに通過させて、溶液中にタンパク質凝集体を沈殿させる。ｐＨは、水酸化ナトリウム又は塩酸の添加により３、５、７、９若しくは１１に調節する。較正ｐＨプローブを用いてｐＨを測定する。溶液が指定のｐＨに達したら、濾過して粒子を除去する。代わりに、単離したＰＭＰ溶液を、Ｐｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０などの荷電ポリマーの添加により、凝結させることもできる。手短には、１Ｌ当たり２〜５ｇのＰｏｌｙｍｉｎ−Ｐ又はＰｒａｅｓｔｏｌ ２６４０を溶液に添加し、インペラで混合する。次に、溶液を濾過して、粒子を除去する。代わりに、塩濃度を高めることにより、凝集体を可溶化する。ＮａＣｌを、１ｍｏｌ／Ｌに達するまでＰＭＰ溶液に添加する。次に、溶液を濾過して、ＰＭＰを精製する。代わりに、温度を上昇させることにより、凝集体を可溶化する。単離したＰＭＰ混合物を、５０℃の均質温度に達するまで混合しながら５分加熱する。次に、ＰＭＰ混合物を濾過して、ＰＭＰを単離する。代わりに、ＰＭＰ溶液からの可溶性混入物は、標準的方法に従うサイズ排除クロマトグラフィーカラムにより分離するが、その場合、ＰＭＰは、第１画分に溶出するのに対して、タンパク質及びリボ核タンパク質及び一部のリポタンパク質は、遅れて溶出される。タンパク質凝集体除去の効率は、ＢＣＡ／Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量により、タンパク質凝集体の除去前及び後のタンパク質濃度を測定し、比較することにより決定される。生成したＰＭＰは、実施例３に記載のように分析する。
実施例３：植物メッセンジャーパックの特性決定
この実施例は、実施例１又は実施例２に記載の通りに生成されたＰＭＰの特性決定を説明する。
実験計画：
ａ）ＰＭＰ濃度の決定
ＰＭＰ粒子濃度は、Ｍａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いるナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＮＴＡ）又はｉＺｏｎ ｑＮａｎｏを用いる調整可能抵抗パルスセンシング（Ｔｕｎａｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ）（ＴＲＰＳ）により、製造者の指示に従って決定する。精製ＰＭＰのタンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により決定する。精製ＰＭＰの脂質濃度は、Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ ＩｎｎｅｓによりＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のように、ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）などの蛍光親油性色素を用いて決定する。手短には、実施例２からの精製ＰＭＰペレットをＭＥＳバッファー（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６）で希釈した１００ｍｌの１０ｍＭ ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）並びに１％植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び２ｍＭ ２，２９−ジピリジルジスルフィドに再懸濁させる。再懸濁ＰＭＰを３７℃で１０分間インキュベートし、３ｍＬのＭＥＳバッファーで洗浄し、再ペレット化し（４℃で、４００，０００ｇ、６０分）、新鮮なＭＥＳバッファーに再懸濁させる。ＤｉＯＣ６蛍光強度を４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光で測定する。
ｂ）ＰＭＰの生物物理学的及び分子特性決定
Ｗｕ ｅｔ Ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．１４０（２）：３８６−４０６，２０１５のプロトコルに従って、ＪＥＯＬ １０１０透過型電子顕微鏡での電子及び低温電子顕微鏡法によりＰＭＰを特性決定する。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ又はｉＺｏｎ ｑＮａｎｏを用い、製造者の指示に従ってＰＭＰのサイズ及びゼータ電位も測定する。クロロホルム抽出を用いて、ＰＭＰから脂質を単離し、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ．２２（１０）：３１９３−３２０５，２０１０に説明されているように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特性決定する。グリコシルイノシトールホスホリルセラミド（ＧＩＰＣ）脂質を抽出し、Ｃａｃａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１７０：３６７−３８４，２０１６に記載のように精製した後、前述したようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＱｕａｎｔ−Ｉｔキットを用いて、指示に従い、全ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を特性決定する。Ｒｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｎｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７３（１）：７２８−７４１，２０１７に記載のプロトコルに従い、ＰＭＰのタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特性決定する。トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いて、ＲＮＡ及びＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ Ｐｌａｎｔキット及びＮｅｘｔｅｒａ Ｍａｔｅ Ｐａｉｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、ＴｒｕＳｅｑ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを含むライブラリに調製した後、製造者の指示に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングする。
実施例４：植物メッセンジャーパック安定性の特性決定
この実施例は、様々な保存及び生理学的条件下でのＰＭＰの安定性の測定を説明する。
実験計画：
実施例１及び２に記載通りに生成したＰＭＰを様々な条件に付す。水、５％ショ糖若しくはＰＢＳにＰＭＰを懸濁させ、−２０℃、４℃、２０℃及び３７℃で１、７、３０及び１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水に懸濁させ、ロータリエバポレータ装置を用いて乾燥させ、４℃、２０℃及び３７℃で１、７及び３０並びに１８０日間放置する。また、ＰＭＰを水又は５％ショ糖溶液に懸濁させ、液体窒素で急速冷凍後、凍結乾燥させた。１、７、３０及び１８０日後、乾燥及び凍結乾燥ＰＭＰを水に再懸濁させる。０℃を超える温度での条件を含む３つの先行実験物は、模擬屋外ＵＶ条件での満足な安全性を決定するために、人工太陽光シミュレータにも曝露する。更には、１単位のトリプシンが添加された若しくは添加されていないｐＨ１、３、５、７及び９の緩衝溶液又は他の人工胃液中で３７℃、４０℃、４５℃、５０℃及び５５℃の温度に１、６及び２４時間ＰＭＰを曝露する。
これら各々の処理後、ＰＭＰを２０℃に戻し、ｐＨ７．４に中和した後、実施例３に記載の方法の一部又は全部を用いて特性決定する。
実施例５．ＰＭＰへのカーゴのローディング
この実施例は、植物のＰＭＰ取込み効率を決定する際のプローブとして使用するため、ＰＭＰに小分子、タンパク質及び核酸をロードする方法を説明する。
ａ）ＰＭＰへの小分子のローディング
実施例１及び実施例２に記載のように、ＰＭＰを生成する。ＰＭＰに小分子をロードするため、ＰＭＰを、固形であるか又は可溶化しているかのいずれかの小分子と共にＰＢＳ溶液中に入れる。Ｓｕｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１０のプロトコルに従ってこの溶液を２２℃で１時間放置する。代わりに、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、溶液を超音波処理してエキソソームへのポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートする。
代わりに、３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３をＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに添加することによりＰＭＰ脂質を単離し、ボルテックスする。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、この混合物をガラスチューブ内で２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機相サンプルを窒素下（２ｐｓｉ）で加熱することにより乾燥させる。小分子がロードされたＰＭＰを生成するため、Ｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、単離されたＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、ロードしたＰＭＰを実施例２に記載するような方法を用いて精製して、未結合の小分子を除去する。ロードしたＰＭＰを実施例３に記載のように特性決定し、その安定性を実施例４に記載のように試験する。
ｂ）ＰＭＰへのタンパク質又はペプチドのローディング
実施例１及び実施例２に記載のように、ＰＭＰを生成する。ＰＭＰにタンパク質又はペプチドをロードするため、ＰＭＰをタンパク質又はペプチドと共にＰＢＳの溶液中に入れる。タンパク質又はペプチドが不溶性の場合、それが可溶性になるまでｐＨを調整する。タンパク質又はペプチドがなおも不溶性の場合、その不溶性タンパク質又はペプチドを使用する。次に、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、この溶液を超音波処理してＰＭＰへのポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートする。
代わりに、３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３をＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに添加することによりＰＭＰ脂質を単離し、ボルテックスする。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、この混合物をガラスチューブ内で２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機相サンプルを窒素下（２ｐｓｉ）で加熱することにより乾燥させる。小分子がロードされたＰＭＰを生成するため、Ｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、単離されたＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、ロードしたＰＭＰを実施例２に記載するような方法を用いて精製して、未結合のペプチド及びタンパク質を除去する。ロードしたＰＭＰを実施例３に記載のように特性決定し、その安定性を実施例４に記載のように試験する。タンパク質又はペプチドのローディングの測定には、ロードした及びロードしていないＰＭＰの少量のサンプルにＰｉｅｒｃｅ定量的比色ペプチドアッセイを用いる。
ｃ）ＰＭＰへの核酸のローディング
実施例１及び実施例２に記載のように、ＰＭＰを生成する。ＰＭＰに核酸をロードするため、ＰＭＰを核酸と共にＰＢＳの溶液中に入れる。次に、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１３からのプロトコルに従い、この溶液を超音波処理してＰＭＰへのポレーション及び拡散を誘導する。代わりに、Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０１２からのプロトコルに従ってＰＭＰをエレクトロポレートする。
代わりに、３．７５ｍｌの２：１（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３をＰＢＳ中の１ｍｌのＰＭＰに添加することによりＰＭＰ脂質を単離し、ボルテックスする。ＣＨＣｌ３（１．２５ｍｌ）及びｄｄＨ２Ｏ（１．２５ｍｌ）を順次添加し、ボルテックスする。次に、この混合物をガラスチューブ内で２２℃において２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、混合物を２相（水相及び有機相）に分離する。ＰＭＰ脂質を含有する有機相サンプルを窒素下（２ｐｓｉ）で加熱することにより乾燥させる。小分子がロードされたＰＭＰを生成するため、Ｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従い、単離されたＰＭＰ脂質を小分子溶液と混合し、脂質エキストルーダに通過させる。
使用前に、ＰＭＰを実施例２に記載するような方法を用いて精製して、未結合の核酸を除去する。ロードしたＰＭＰを実施例３に記載のように特性決定し、その安定性を実施例４に記載のように試験する。ＰＭＰにロードされた核酸は、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒからのＱｕａｎｔ−Ｉｔアッセイを用いて製造者の指示に従って定量化するか、又は核酸が蛍光標識されている場合、プレートリーダーで蛍光を定量化する。
実施例６．ＰＭＰを細胞壁透過性タンパク質で修飾することによりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、細胞壁構成成分の分解を促進するためセルラーゼでＰＭＰを修飾することにより、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることについて説明する。この例では、モデル細胞壁分解酵素としてセルラーゼ、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドの合成
製造者の指示に従ってセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させる。手短には、タンパク質を５ｍｇ／ｍＬより高い濃度でＰＢＳに溶解させ、このタンパク質の容積の１０％に等しい容積のＤＭＦにＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドをタンパク質に対して１０倍モル過剰で溶解させる。次に、これらの２つの溶液を混合し、氷上に２時間維持する。次に、１００ｍＭの最終濃度となるように１Ｍトリス−ＨＣｌを添加することにより反応を停止させる。チューブを氷上に１５分間置いて完全にクエンチし、次にＺｅｂａスピン脱塩カラムを使用してバッファー交換を実施する。
ｂ）セルラーゼによるＰＭＰの修飾
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＤＢＣＯをクロロホルムに溶解させて、試験管に注入し、真空乾燥させることにより、薄膜を形成させる。次に、それをＰＢＳに１％、５％、１０％、２０％及び５０％溶液ｗ／ｖで再懸濁して小ミセルを生じさせる。この溶液に等モル量のセルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドを添加する。この溶液を４℃で１６時間反応させておく。次に、溶液を実施例１及び２で生成したＰＭＰと合わせ、Ｈａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．，２０１５からのプロトコルに従ってエキストルーダに通して混合する。このようにして十分な量のセルラーゼをＰＭＰに取り付けることにより、毒性が増加することなく細胞壁透過が増加する。代わりに、Ｓｐａｎｅｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏ，２０１６に記載のように、ＰＭＰの外側を修飾する他の方法を用いる。
得られたＰＭＰは、実施例２に記載のように超遠心分離又はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製し、実施例３及び実施例４の方法を用いて特性決定及び安定性試験を行う。蛍光定量的セルラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）を用いて製造者のプロトコルに従ってセルラーゼ活性を測定する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたセルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）ＧＦＰタンパク質をロードしたセルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードセルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたセルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識セルラーゼ修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０ｕＬの１ｍＬ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びセルラーゼ修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）及び非修飾ＰＭＰの存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識セルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識セルラーゼ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのセルラーゼ修飾により、非修飾ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたセルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
セルラーゼ修飾ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６））を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。非修飾と比べたセルラーゼ修飾ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。次に、ロードしたＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードセルラーゼ修飾ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中に製剤化する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードセルラーゼ修飾ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。ＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードセルラーゼ修飾及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、セルラーゼ修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現を非修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。処理済み及び未処理の綿植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、非修飾と比べたセルラーゼ修飾ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
セルラーゼ修飾ＰＭＰは非修飾ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
Figure 2021533794
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実施例７：イオン液体とのＰＭＰの製剤化によりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、細胞透過の改善を通じてＰＭＰ取込みを改善するためのイオン液体とのＰＭＰの製剤化を説明する。イオン液体は、植物細胞壁の主要な構成成分であるセルロースを可溶化する可能性のある薬剤として記載されており、真菌又は細菌の細胞壁及び／又は動物細胞の細胞膜又は細胞外マトリックスの透過も改善し得る。この例では、モデルイオン液体として酢酸ＥＭＩＭを使用し、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）イオン液体中へのＰＭＰの製剤化
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。１％、５％、１０％、２０％、５０％又は１００％の酢酸ＥＭＩＭ溶液にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。代わりに、酢酸ＢＭＩＭ、酢酸ＨＭＩＭ、酢酸ＭＭＩＭ、酢酸アリルＭＩＭを使用する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。イオン液体中のＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードした酢酸ＥＭＩＭ製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、実施例８ａに記載のように標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳ（対照）又は酢酸ＥＭＩＭ溶液に再懸濁する。ＧＦＰロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＰＢＳ中のＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、ＰＢＳ又は酢酸ＥＭＩＭ中の０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。ＰＢＳ製剤化ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率をＰＢＳ製剤化ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードした酢酸ＥＭＩＭ製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロード＋酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、酢酸ＥＭＩＭに製剤化した０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロードＰＭＰ又はＰＢＳに製剤化したＰＭＰと共に１０，０００個の子嚢胞子をスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。ＰＢＳに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、酢酸ＥＭＩＭに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰ−製剤化ＰＭＰの取込み効率を、ＰＢＳに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードした酢酸ＥＭＩＭ製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰと比べたＰＢＳに製剤化したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００ｕＬ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、細胞をＰＢＳに製剤化し、且つ酢酸ＥＭＩＭに製剤化した０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＭＰと共にウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／又は緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。ＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率をＧＦＰロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードした酢酸ＥＭＩＭ製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾してＰＢＳに製剤化したＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、実施例８ａに記載のように、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳ（対照）又は酢酸ＥＭＩＭ溶液に再懸濁する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰと比べたＰＢＳに製剤化したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０μｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＢＳ製剤化ＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＭＰ及びＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰの取込み効率をＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰの酢酸ＥＭＩＭ製剤化により、ＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードした酢酸ＥＭＩＭ製剤化グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。ロードしたＰＭＰの一部はＰＢＳに製剤化し、残りの一部は実施例８ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。
滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中（ｄｄＨ２Ｏ）に製剤化する。
ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ｄｓＲＮＡロードＶＩＢ（実施例１）製剤化ＰＭＰを含むＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード酢酸ＥＭＩＭ製剤化及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現をＰＢＳ製剤化ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰ及びＰＢＳ製剤化ＰＭＰで処理した植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、ＰＢＳ製剤化と比べた酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
酢酸ＥＭＩＭ製剤化ＰＭＰは、ＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例８：フルオラス液体とのＰＭＰの製剤化によりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、細胞透過の改善を通じてＰＭＰ取込みを改善するためのフルオラス液体とのＰＭＰの製剤化を説明する。フルオラス液体は、細胞壁の主要な構成成分であるセルロースを可溶化する可能性のある薬剤として記載されており、真菌又は細菌の細胞壁及び／又は動物細胞の細胞膜又は細胞外マトリックスの透過も改善し得る。この例では、モデルフルオラス液体としてペルフルオロオクタンを使用し、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）フルオラス液体中へのＰＭＰの製剤化
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。１％、５％、１０％、２０％、５０％又は１００％のペルフルオロオクタン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。代わりに、ペルフルオロヘキサン又はペルフルオロ（メチルデカリン）を使用する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。フルオラス液体中のＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードしたペルフルオロオクタン製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、実施例８ａに記載のように、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳ（対照）又はペルフルオロオクタン溶液に再懸濁する。ＧＦＰロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＰＢＳ中のＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、ＰＢＳ又はペルフルオロオクタン中の０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。ＰＢＳ製剤化ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率をＰＢＳ製剤化ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたペルフルオロオクタン製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰをロードしたペルフルオロオクタン製剤化ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬの、ペルフルオロオクタンに製剤化したＰＫＨ２６標識ＧＦＰロードＰＭＰ又はＰＢＳに製剤化したＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。ＰＢＳに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ペルフルオロオクタンに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰ−製剤化ＰＭＰの取込み効率を、ＰＢＳに製剤化したＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードしたペルフルオロオクタン製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰと比べた、ＰＢＳに製剤化したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００ｕＬ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、ＰＢＳに製剤化し、且つペルフルオロオクタンに製剤化した０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＭＰと共に細胞をウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。ＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率をＧＦＰロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたペルフルオロオクタン製剤化グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾してＰＢＳに製剤化したＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、実施例８ａに記載のように、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳ（対照）又はペルフルオロオクタン溶液に再懸濁する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰと比べた、ＰＢＳに製剤化したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０ｕｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＢＳ製剤化ＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＭＰ及びＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰの取込み効率をＰＢＳ製剤化カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのペルフルオロオクタン製剤化により、ＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたペルフルオロオクタン製剤化グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。ロードしたＰＭＰの一部はＰＢＳに製剤化し、残りの一部は実施例８ｂに記載のようにセルラーゼで修飾する。
滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中（ｄｄＨ２Ｏ）に製剤化する。
ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＶＩＢ（実施例１）製剤化ＰＭＰを含むＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードペルフルオロオクタン製剤化及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＢＳ製剤化ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現をＰＢＳ製剤化ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰ及びＰＢＳ製剤化ＰＭＰで処理した植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、ＰＢＳ製剤化と比べたペルフルオロオクタン製剤化ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
ペルフルオロオクタン製剤化ＰＭＰは、ＰＢＳ製剤化ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例９：デタージェントとのＰＭＰの製剤化によって細胞透過を改善することによりＰＭＰ取込みを増加させる
この実施例は、デタージェントでＰＭＰを修飾して細胞膜の透過を促進することにより、動物、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることについて説明する。この例では、モデルデタージェントとしてサポニン、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）サポニンによるＰＭＰの修飾
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。０．００１％、０．０１％ ０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％ｗ／ｖのサポニン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の溶液にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。代わりに、ＣＨＡＰＳを使用する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。サポニン修飾ＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードしたサポニン修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例９ａに記載のようにサポニンで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードサポニン修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたサポニン修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにサポニンで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードサポニン修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードしたサポニン修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにサポニンで修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識サポニン修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００ｕｌ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、細胞を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びサポニン修飾ＰＭＰと共にウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。非修飾カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードサポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたサポニン修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例９ｂに記載のようにサポニンで修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識サポニン修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０μｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びサポニン修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識サポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識サポニン修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのサポニン修飾により、非修飾ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたサポニン修飾グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
サポニン修飾ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。非修飾と比べたサポニン修飾ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。次に、ロードしたＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例９ｂに記載のようにサポニンで修飾する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードサポニン修飾ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中に製剤化する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードサポニン修飾ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。ＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードサポニン修飾及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、サポニン修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現を非修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。処理済み及び未処理の綿植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、非修飾と比べたサポニン修飾ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
サポニン修飾ＰＭＰは非修飾ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例１０：双性イオン脂質とのＰＭＰの製剤化によりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、ＰＭＰを双性イオン脂質で修飾して細胞壁及び／又は細胞膜の透過を促進することにより、動物、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることについて説明する。この例では、モデル双性イオン脂質として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）ＤＯＰＣによるＰＭＰの修飾
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。０．００１％、０．０１％ ０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％ｗ／ｖのＤＯＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の溶液にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。代わりに、ＤＥＰＣを使用する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードしたＤＯＰＣ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１０ｂに記載のようにＤＯＰＣで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたＤＯＰＣ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにＤＯＰＣで修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードしたＤＯＰＣ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにＤＯＰＣで修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００ｕｌ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、細胞を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びＤＯＰＣ修飾ＰＭＰと共にウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。非修飾カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロードＤＡＢ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたＤＯＰＣ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１０ｂに記載のようにＤＯＰＣで修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０ｕｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びＤＯＰＣ修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのＤＯＰＣ修飾により、非修飾ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたＤＯＰＣ修飾グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。非修飾と比べたＤＯＰＣ修飾ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。次に、ロードしたＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１０ｂに記載のようにＤＯＰＣで修飾する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中に製剤化する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＤＯＰＣ修飾ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。ＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＤＯＰＣ修飾及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現を非修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。処理済み及び未処理の綿植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、非修飾と比べたＤＯＰＣ修飾ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
ＤＯＰＣ修飾ＰＭＰは非修飾ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例１１：イオン化脂質とのＰＭＰの製剤化によりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、ＰＭＰをイオン化脂質で修飾して細胞壁及び／又は細胞膜の透過を促進することにより、動物、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることについて説明する。この例では、モデルイオン化脂質として１，１’−（（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン−２−オール）（Ｃ１２−２００）、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）Ｃ１２−２００によるＰＭＰの修飾
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。Ｌｏｖｅ ＰＮＡＳ ２０１０の合成プロトコルに従ってＣ１２−２００（イオン化脂質）を入手する。０．００１％、０．０１％ ０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％ｗ／ｖのＣ１２−２００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の溶液にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードしたＣ１２−２００修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１１ｂに記載のようにＣ１２−２００で修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたＣ１２−２００修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにＣ１２−２００で修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードしたＣ１２−２００修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにＣ１２−２００で修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００ｕｌ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、細胞を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びＣ１２−２００修飾ＰＭＰと共にウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍＬ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。非修飾カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたＣ１２−２００修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１１ｂに記載のようにＣ１２−２００で修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０ｕｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びＣ１２−２００修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのＣ１２−２００修飾により、非修飾ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたＣ１２−２００修飾グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。非修飾と比べたＣ１２−２００修飾ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。次に、ロードしたＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１１ｂに記載のようにＣ１２−２００で修飾する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中に製剤化する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードＣ１２−２００修飾ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。ＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＣ１２−２００修飾及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現を非修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。処理済み及び未処理の綿植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、非修飾と比べたＣ１２−２００修飾ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
Ｃ１２−２００修飾ＰＭＰは非修飾ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例１２：カチオン性脂質とのＰＭＰの製剤化によりＰＭＰ細胞取込みを増加させる
この実施例は、ＰＭＰをカチオン性脂質で修飾して細胞壁及び／又は細胞膜の透過を促進することにより、動物、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることについて説明する。この例では、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰ、モデル植物として綿、モデル酵母としてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、モデルヒト細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１、モデル真菌としてＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）及びモデル細菌としてシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）カチオン性脂質によるＰＭＰの修飾
グレープフルーツＰＭＰの濃縮溶液を実施例１及び実施例２に記載のように単離する。０．００１％、０．０１％ ０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％ｗ／ｖのカチオン性脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の溶液にＰＭＰを激しく混合しながら再懸濁する。懸濁液からの回収率を１００％と仮定して製剤化前の濃度に容積の比率を乗じることにより、ＰＭＰ濃度を決定する。カチオン性脂質修飾ＰＭＰの特性及び安定性を実施例３及び実施例４に記載のように評価する。
ｂ）ＧＦＰタンパク質をロードしたカチオン性脂質修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１２ｂに記載のようにカチオン性脂質で修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇ ＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（＃９７６３）からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を入手し、製造者の指示どおり酵母エキスペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）に３０℃で維持する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、酵母細胞を選択培地で０．４〜０．６のＯＤ６００になるまで増殖させて、０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する酵母細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｃ）ＧＦＰタンパク質をロードしたカチオン性脂質修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成し、実施例５に記載のようにＧＦＰタンパク質をロードする。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにカチオン性脂質で修飾する。ウエスタンブロット又は蛍光によりＰＭＰのＧＦＰ封入を測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇＰＭＰを２ｍＬの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載する方法により全ての非標識色素を洗い流し、標識されたＰＭＰペレットをＰＢＳに再懸濁する。ＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比べたＧＦＰロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）真菌細胞を処理する。
Ｓ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ、＃１８６８７）子嚢胞子によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０，０００個の子嚢胞子を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識ＧＦＰロード修飾ＰＭＰ又は非修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートし、インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下でＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のＧＦＰロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は酵母細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは酵母細胞によって取り込まれている。非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較したＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有するＳ．スクレロチオラム（Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｄ）カルセインＡＭをロードしたカチオン性脂質修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例６ｂに記載のようにカチオン性脂質で修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識カチオン性脂質修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、ヒト乳癌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−２６）からＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を入手し、供給業者の指示に従って増殖させて維持する。７０〜８０％コンフルエンシーの細胞を回収し、カウントし、９６ウェル培養処理済みウェルプレート内の２００μｌ細胞培地に１ウェル当たり１０，０００細胞の播種密度で播種する。細胞を３時間接着させておき、次に培地を除去し、細胞をダルベッコＰＢＳで１回洗浄し、ＦＣＳ不含の培地を添加して細胞を処理前に３時間血清飢餓状態にする。乳癌細胞によるＰＭＰ取込みを決定するため、細胞を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びカチオン性脂質修飾ＰＭＰと共にウェル内で直接インキュベートする。ＰＢＳ対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下で細胞をインキュベートする。３７℃で３０分間、１時間、２時間及び４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで４×１０分間洗浄して培地中のＰＭＰを取り出す。次に、高解像度蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ２ ＦＬ）で４０倍の画像を取得して取込み効率を決定する。ＰＫＨ２６色素による細胞膜の排他的な染色との対比で赤色の膜及び緑色のカルセインＡＭロードＰＭＰが細胞質に観察されるとき又は細胞の細胞質が赤色及び／若しくは緑色に変わった場合、ＰＭＰは乳癌細胞によって取り込まれている。非修飾カルセインＡＭロードＰＭＰと比較したカルセイン−ＡＭロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有する／細胞質に緑色のＰＭＰを有する細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、ＧＦＰロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾ＧＦＰロードＰＭＰと比較する。
ｅ）カルセインＡＭをロードしたカチオン性脂質修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みの増加
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。ＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１２ｂに記載のようにカチオン性脂質で修飾する。実施例５及びＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＸ ２０１５に記載のように、修飾及び非修飾ＰＭＰにカルセインＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をロードする。カルセインＡＭはＰＭＰに封入されたときに限り蛍光を発し、封入を蛍光によって測定する。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従って全てのＰＭＰ製剤を赤色ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）親油性膜色素で標識する。手短には、ＰＫＨ２６標識キットの１ｍＬ希釈剤Ｃ中の５０ｍｇカルセインＡＭロードＰＭＰを２ｍｌの１ｍＭ ＰＫＨ２６と混合し、３７℃で５分間インキュベートする。１ｍＬの１％ＢＳＡを添加することにより標識を停止させる。実施例２に記載のように全ての非標識色素を洗い流し、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎフィルタを使用してＰＭＰを濃縮する。カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識カチオン性脂質修飾ＰＭＰと比べたカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）細菌細胞を処理する。
ＡＴＣＣ（ＢＡＡ−８７１）からシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌を入手し、製造者の指示に従ってキングＢ寒天培地で増殖させる。Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）によるＰＭＰ取込みを決定するため、１０ｕｌの１ｍｌ一晩細菌懸濁液を０（陰性対照）、１、１０又は５０、１００及び２５０μｇ／ｍｌのＰＫＨ２６標識カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識非修飾及びカチオン性脂質修飾ＰＭＰと共にスライドガラス上で直接インキュベートする。水対照に加えて、カルセインＡＭ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＰＫＨ２６色素（最終濃度５μｇ／ｍｌ）及び非修飾ＰＭＰの存在下でＰ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）菌をインキュベートする。室温で５分間、３０分間及び１時間インキュベートした後、高解像度蛍光顕微鏡で画像を取得する。非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較したカルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識カチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を評価するため、膜のみの染色との対比における、緑色の細胞質を有するか又は細胞質に緑色及び赤色ＰＭＰを有する細菌細胞の割合をＰＭＰ処理細胞とＰＢＳ及びＰＫＨ２６色素のみの対照との間で比較する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞からの赤色及び緑色蛍光シグナル中央値を測定することにより各細胞の取込み量を定量化し、カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識カチオン性脂質修飾ＰＭＰの取込み効率を非修飾カルセインＡＭロードＰＫＨ２６標識ＰＭＰと比較する。ＰＭＰのカチオン性脂質修飾により、非修飾ＰＭＰと比較して細胞取込みが効率的に改善される。
ｆ）綿植物のＣＬＡ１をターゲティングするｄｓＲＮＡをロードしたカチオン性脂質修飾グレープフルーツＰＭＰのＰＭＰ取込みの増加
カチオン性脂質修飾ＰＭＰによる細胞取込みの増加を実証するため、グレープフルーツＰＭＰに、綿光合成遺伝子ＧｒＣＬＡ１（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ）をターゲティングする人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ、Ｐｌａｎｔ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｍａｋｅｒ Ｓｉｔｅ（Ｐ−ＳＡＭＳ；Ｆａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．３２（１）：１５７−１５８，２０１６）を用いて設計される）又はカスタムのダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ、ＩＤＴにより設計される）をロードする。ＧｒＣＬＡ１は、アラビドプシス・クロロプラストス・アルテラドス１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｓ ａｌｔｅｒａｄｏｓ １）遺伝子（ＡｔＣＬＡ１）の相同遺伝子であり、これは機能喪失型であるため本葉がアルビノ表現型となり、サイレンシング効率の視覚的なマーカを提供する。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手する。
実施例１及び実施例２に記載のようにグレープフルーツからＰＭＰを生成する。非修飾と比べたカチオン性脂質修飾ＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、実施例５に記載のように、グレープフルーツＰＭＰにＧｒＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ又はＧｒＣＬＡ１−ＤｓｉＲＮＡ二重鎖（表１２）をロードする。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットを用いるか、又は対照蛍光色素標識ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を用いてＰＭＰのａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ封入を測定する。次に、ロードしたＰＭＰの一部を対照として取り除けておき、残りは実施例１２ｂに記載のようにカチオン性脂質で修飾する。ＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰと比べたＣＬＡ１−ａｍｉＲＮＡ／ＤｓｉＲＮＡロードＰＭＰのＰＭＰ取込み効率を決定するため、綿苗を処理し、ＣＬＡ１遺伝子サイレンシングに関して分析する。滅菌水中０、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌの有効ｄｓＲＮＡ用量に相当する量を送達する濃度となるように、ａｍｉＲＮＡ又はＤｓｉＲＮＡ（まとめてｄｓＲＮＡと称される）をロードしたＰＭＰを水中に製剤化する。
米国国立植物遺伝資源システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｓｙｓｔｅｍ）から綿の種子（ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）及びゴシピウム・ライモンディイ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ））を入手する。滅菌した種子を湿らせた脱脂綿に包み、ペトリ皿に置き、２５℃、１５０μＥｍ−２Ｓ−１光強度のグロースチャンバーに１４時間明期／１０時間暗期の光周期で３日間置いて発芽させる。この苗を、ホーグランド栄養液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が入った滅菌培養ベッセルにおいて長日条件下（１６／８時間明期／暗期の光周期）に２６／２０℃昼／夜温度で生育させる。４日後、子葉が完全に開いた（最初の本葉が現れる前の）苗をＰＭＰ処理に使用する。
７日齢の綿苗を、１×ＭＳビタミン類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有、ｐＨ５．６〜５．８、０．８％（ｗ／ｖ）アガロース含有の０．５×ムラシゲスクーグ（ＭＳ）無機塩類（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に移し、有効用量０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロードカチオン性脂質修飾ＰＭＰ並びに０（ｄｄＨ２Ｏ）、１、５、１０及び２０ｎｇ／μｌのＧｒＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰにより、各群３植物として各植物につき１ｍｌ溶液を苗全体に噴霧することによって処理する。代わりに、ＰＭＰ処理前に、綿植物の子葉の裏面を、子葉を貫通しないようにして２５Ｇ針で突く。ＰＭＰ溶液を子葉の裏面の傷を付けた部位から１ｍＬ無針シリンジを使用して手作業で浸透させる。植物をグロースチャンバーに移し、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の光強度及び２６／２０℃昼／夜温度で長日条件下（１６時間／８時間明期／暗期の光周期）に維持する。
２、５、８及び１４日後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて内因性ＣＬＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルによりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇの新鮮な綿葉から全ＲＮＡを抽出し、十分なＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって処理する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２μｇの全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ＣＬＡ１転写物レベルを推定するため、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプライマー：ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｆ ５’−ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号７）、ＧｒＣＬＡ１ｑ１＿Ｒ ５’−ＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８）及びＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｆ ５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号９）、ＧｒＣＬＡ１ｑ２＿Ｒ ５’−ＣＧＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１０）及び１８ｓ ＲＮＡ＿Ｆ ５’−ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１１）、１８ｓ ＲＮＡ＿Ｒ ５’−ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）と共に使用したｑＲＴ−ＰＣＲを、以下のプログラム：（ａ）９５℃で５分；（ｂ）９４℃で３０秒、５５℃で３０秒を４０サイクル；及び７２℃で３０秒を用いて実施する。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として使用して結果を正規化する。ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードカチオン性脂質修飾及びＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロード非修飾ＰＭＰによる処理後の綿におけるＣＬＡ１ノックダウン効率を、ΔΔＣｔ値を計算し、カチオン性脂質修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現を非修飾ＰＭＰによる処理後の正規化したＣＬＡ１発現と比較することにより決定する。
加えて、表現型光退色分析によりＣＬＡ１ ｄｓＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率を調べる。処理済み及び未処理の綿植物の葉を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、対照葉の緑色と比べた葉の白色の光退色に反映される遺伝子サイレンシングの割合を決定する。各植物につき３葉をアッセイして光退色効果を定量化し、非修飾と比べたカチオン性脂質修飾ＣＬＡ１−ｄｓＲＮＡロードＰＭＰの遺伝子サイレンシング効率を評価する。
カチオン性脂質修飾ＰＭＰは非修飾ＰＭＰと比較して植物細胞による取込み効率がより高く、一層のＣＬＡ１遺伝子サイレンシングを誘導する。
実施例１３：カチオン性脂質を用いたＰＭＰの修飾
この実施例は、ＰＭＰをカチオン性脂質で修飾することにより、表面電荷を修飾し、カーゴローディング容量を増加させ、且つヒト及び植物細胞におけるＰＭＰの細胞取込みを増加させることが可能であると実証する。この例では、モデルカチオン性脂質としてＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）及びＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツ及びレモンＰＭＰ、モデル負電荷ペイロードとしてｓｉＲＮＡ／トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ＴｒａｃｒＲＮＡ）、モデルヒト細胞株としてＣＯＬＯ６７９及びモデル植物細胞株としてゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ）ブラック・メキシカン・スイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ ｓｗｅｅｔ：ＢＭＳ）を使用する。
実験プロトコル：
ａ）レモン／グレープフルーツＰＭＰの生成
レッドオーガニックグレープフルーツ又はイエローオーガニックレモンは、現地の食料品店から入手した。果汁絞り機を使用して６リットルのグレープフルーツ果汁を収集し、ｐＨをＮａＯＨでｐＨ４に調整し、１Ｕ／ｍＬペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１７３８９）とインキュベートしてペクチン混入物を除去し、続いて３，０００ｇで２０分間、その後１０，０００ｇで４０分間遠心分離して大きい残屑を除去した。次に、この加工した果汁を５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．６と５０ｍＭ ＥＤＴＡの最終濃度、ｐＨ７．７となるまで３０分間インキュベートしてカルシウムをキレート化し、ペクチン高分子の形成を防止した。続いて、ＥＤＴＡ処理した果汁を１１μｍ、１μｍ及び０．４５μｍフィルタに通して大きい粒子を除去した。濾過した果汁を洗浄し、３００ｋＤａ ＴＦＦを使用したタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮した。果汁を１０倍濃縮し、続いて１０透析濾過容量のＰＢＳでのダイアフィルトレーションにかけ、最終濃度１２０ｍＬ（５０倍）に更に濃縮した。次に、本発明者らはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてＰＭＰ含有画分を溶出させて、これを２８０の吸光度（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））及びタンパク質濃度（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイ）により分析して、ＰＭＰ含有画分及び混入物を含有する後期画分を確認した。ＳＥＣ画分３〜７が精製ＰＭＰを含有し（画分９〜１２は混入物を含有した）、これらを合わせてプールし、０．８μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍシリンジフィルタを使用した連続濾過によって濾過滅菌し、ＰＭＰを４０，０００×ｇで１．５時間ペレット化して、且つペレットを４ｍＬ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１０９７７０２３）に再懸濁することにより更に濃縮した。ＮａｎｏＦＣＭにより、製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて最終ＰＭＰ濃度（７．５６×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）及びＰＭＰ粒径（７０．３ｎｍ±１２．４ｎｍ ＳＤ）を決定した。生成されたグレープフルーツ（ＧＦ）又はレモン（ＬＭ）ＰＭＰは、以下に記載するとおりのブライ・ダイアー（Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ）法を用いた脂質抽出に使用した。
ｂ）カチオン性脂質によるＰＭＰの修飾
脂質再構成ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）を調製するため、ブライ・ダイアー法（Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，３７：９１１−９１７，１９５９）を用いてグレープフルーツ又はレモンＰＭＰの濃縮溶液からの全脂質抽出を実施した。手短には、１ｍＬの濃縮ＰＭＰ（１０１２〜１０１３ＰＭＰ／ｍＬ）を３．５ｍＬクロロホルム：メタノール混合物（１：２、ｖ／ｖ）と混合し、十分にボルテックスした。次に、１．２５ｍＬクロロホルムを添加してボルテックスし、続いて１．２５ｍＬ滅菌水と共に攪拌した。最後に、この混合物をＲＴにおいて３００ｇで５分間遠心分離した。脂質を含有する底の有機相を回収し、ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）システム（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標））を使用して乾燥させた。天然ＬＰＭＰの脂質組成を修飾するため、合成カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−コレステロール）をクロロホルム：メタノール（９：１）に溶解させて、２５％又は４０％（ｗ／ｗ）の総脂質に達するようにＰＭＰ抽出脂質に添加し、続いて激しく混合した。不活性ガス流（例えば、窒素流）で溶媒を蒸発させることによるか、又はＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）システムを使用して蒸発させることにより、乾燥脂質薄膜を調製した（図１）。抽出脂質から再構成ＰＭＰを調製するため、乾燥脂質薄膜に水又はバッファー（例えば、ＰＢＳ）を添加し、ＲＴで１時間放置して水和させた。形成された脂質粒子を１０回の凍結融解サイクル又は超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ ２８００超音波処理浴、１０分、ＲＴ）に供した。次に、脂質二重層の数及び全体的な粒径を低減するため、Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍポリカーボネートフィルタで脂質ＰＭＰを抽出した（図１）。濃縮ＬＰＭＰが必要な場合、４℃における１００，０００×ｇで３０分間の超遠心分離によってサンプルを濃縮した。最終的なペレットは滅菌超純水又はＰＢＳに再懸濁し、以降の使用時まで４℃で維持した。ＮａｎｏＦＣＭにより、製造者によって提供される濃度及び粒径標準を用いて最終的なＬＰＭＰ濃度及びメジアンＬＰＭＰ粒径（８９〜１０４ｎｍの範囲）を決定した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して動的光散乱法により表面電荷（ゼータ電位）を測定した（図４Ａ）。ＬＰＭＰ粒径及び濃度の範囲は、ＬＭ ＬＰＭＰについて８３±１９ｎｍ及び１．７×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ、ＤＯＴＡＰ修飾ＬＰＭＰについて１０６±２５ｎｍ及び６．５４×１０１０ＬＰＭＰ／ｍＬ及びＤＣ−コレステロール修飾ＰＭＰについて９１±１７ｎｍ及び３．０８×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであった（図２）。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ及びＤＣ−コレステロールによるＬＰＭＰの修飾により、ＬＰＭＰの表面電荷が変化した：カチオン性脂質含量の増加に伴い、ＬＰＭＰの表面電荷は増加した（図４Ａ）。抽出レモン脂質から再構成したＬＰＭＰのＣｒｙｏ−ＥＭ画像の分析により、ＬＰＭＰの真球度及び粒径分布を確認した（６８．７±２３ｎｍ（ＳＤ））（図３Ａ及び図３Ｂ）。
ｃ）カチオン性脂質修飾ＰＭＰへの負電荷カーゴのローディング
ｓｉＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡをロードするため、ＧＦ又はＬＭ抽出脂質にカチオン性脂質を補足し、前述したように乾燥させた。ヌクレアーゼフリー水又は二重鎖バッファー（ＩＤＴ（登録商標））に溶解させたｓｉＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡを１ｍｇのＰＭＰ脂質につき１．５ｎｍｏｌで乾燥脂質薄膜に添加し、ＲＴで１時間放置して水和させた。形成された脂質粒子を１０回の凍結融解サイクルに供し、Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍポリカーボネートフィルタに通して押し出した（図１）。ロードしたＰＭＰを１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を備えた透析装置（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標））でＰＢＳに対して一晩透析し、次に０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを使用して滅菌した。加えて、サンプルを精製し、超遠心分離を用いて濃縮した。ロードしたＰＭＰを４℃において１００，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１ｍＬ ＰＢＳに再懸濁して、１００，０００×ｇで３０分間濃縮した。得られたペレットをＰＢＳ（ヒト細胞による細胞取込み用）又は水（植物細胞による細胞取込み用）のいずれかに再懸濁した。ＲＮＡロードＬＰＭＰの粒径及び粒子の数をＮａｎｏＦＣＭによって評価した：平均粒径及び粒子濃度は、非修飾ＬＰＭＰについて８９±１５ｎｍ及び１．５４×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ、ＤＣ−Ｃｈｏｌについて１０４±２５ｎｍ及び２．５４×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬ及びＤＯＴＡＰについて１００±３０ｎｍ及び９．７×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであった。ＲＮＡローディングは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによるか、又は標識したカーゴ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識したｓｉＲＮＡ又はＡＴＴＯ ５５０で標識したＴｒａｃｒＲＮＡ）の蛍光強度の測定により決定した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイを製造者のプロトコルに従ってヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下で実施することによりＰＭＰを溶解させて、封入されたカーゴを放出させた。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ及びＤＣ−コレステロールによるＬＰＭＰの修飾により、カチオン性脂質のないＬＰＭＰと比較したときＬＰＭＰの表面電荷が変化し、負電荷カーゴ（例えばＲＮＡ）のローディングが増加した（図４Ａ〜図４Ｄ）。
ｄ）ヒト細胞（ＣＯＬＯ６７９）によるＤＯＴＡＰ修飾ＰＭＰの取込みの増加
ＤＯＴＡＰ（２０％、ｗ／ｗ）を補足したグレープフルーツからの脂質修飾ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）を前述したように調製した。次に、一部を変更した製造者のプロトコルに従ってＰＭＰ製剤を緑色ＰＫＨ６７親油性膜色素（Ｓｉｇｍａ）で標識した。手短には、３００μＬのＬＰＭＰ（約１×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）を希釈剤Ｃと１：１混合し、続いて希釈剤Ｃで希釈したＰＫＨ６７色素と混合し（最終的な色素：サンプル比は１：５００、ｖ／ｖであった）、１００ｒｐｍで振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳと平衡化させたＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（４０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＬＰＭＰを精製することにより、遊離色素を除去した。標識したＬＰＭＰを０．２μｍ滅菌フィルタを使用して滅菌し、超遠心分離（３０分、１００，０００ｇ、４℃）によって濃縮し、滅菌ＰＢＳに再懸濁した。最終的なＬＰＭＰ濃度及び平均粒径（ＬＰＭＰについて１．１×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ及び８３±１９ｎｍ；ＤＯＴＡＰについて８．９５×１０１１及び１００±３０ｎｍ）をＮａｎｏＦＣＭにより決定した。分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標））を使用してＥｘ／Ｅｍ＝４８５／５１０ｎｍで蛍光強度を確認した。同じ手法を用いて同じ濃度（１：５００、ｖ／ｖ）の遊離ＰＫＨ６７色素を精製した。
１０％の熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＣＯＬＯ６７９細胞を培養した。実験の前日、細胞を９６ウェルプレートに６０００細胞／ウェルで播種した。ＰＫＨ６７標識ＬＰＭＰの取込みを決定するため、ＣＯＬＯ６７９細胞をＬＰＭＰと１ウェル当たり２×１０１０粒子の濃度で３７℃において３時間インキュベートした。遊離ＰＫＨ６７色素を対照として使用した。インキュベーション時間の終わりに細胞を氷冷ＰＢＳ １×で２回洗浄し、ＰＢＳ中１００μＬの４％ホルムアルデヒドで１５〜３０分間固定した。ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で細胞核を染色した。４０倍率対物レンズの蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３）を使用して画像を取得した。ＤＯＴＡＰで修飾すると、カチオン性脂質のないＬＰＭＰと比較してＣＯＬＯ６７９細胞によるＬＰＭＰの取込み／会合が増加した（図５）。本発明者らのデータは、ＤＯＴＡＰ修飾ＬＰＭＰが、更なるカチオン性脂質のないＬＰＭＰと比較してＣＯＬＯ６７９細胞での媒体の取込み及び／又は会合を亢進させたことを示唆している。
ｅ）ＤＣ−コレステロール修飾ＰＭＰによる植物細胞へのＲＮＡの送達の増加
シロイヌナズナ生物資源センター（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ：ＡＢＲＣ）からゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）細胞を購入した。ムラシゲスクーグ基本培地、ｐＨ５．８、４．３ｇ／Ｌムラシゲスクーグ基本塩類混合物（Ｓｉｇｍａ Ｍ５５２４）、２％スクロース（Ｓ０３８９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（Ｄ７２９９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、２５０μｇ／ＬチアミンＨＣＬ（Ｖ−０１４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及び１×ＭＳビタミンミックス溶液含有、ｄｄＨ２Ｏ中においてＢＭＳ細胞を増殖させた。１×ビタミンミックス溶液は、ナイアシン（Ｎ０７６１−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、塩酸ピロキシジン（Ｐ６２８０−２５Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム塩（Ｐ５１５５−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−アスパラギン（Ａ４１５９−２５Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）及びミオイノシトール（Ｉ７５０８−１００Ｇ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ１．３ｍｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、１３０ｍｇ／Ｌ及び２００ｍｇ／Ｌの最終濃度で含有した。１Ｌベント付き滅菌三角フラスコにおいて、暗所条件下、２４℃で攪拌しながら（１１０ｒｐｍ）細胞を増殖させた。
ＢＭＳ細胞の処理のため、１０ｍＬの細胞懸濁液を採取して％パック細胞容積（ＰＣＶ）を決定した。ＰＣＶは、細胞の容積を細胞培養物アリコートの総容積で除したものとして定義され、パーセンテージとして表される。細胞を３９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットの容積を決定した。ＢＭＳの％ＰＣＶは２０％であった。この取込み実験について、培養物の％ＰＣＶは、前述したように細胞を培地に希釈することにより４％に調整した。ＬＰＭＰ及びＤＣ−コレステロールで修飾されたＬＰＭＰに、前述したように、ＡＴＴＯ ５５０で標識したＴｒａｃｒＲＮＡをロードし、滅菌し、滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＦＣＭにより粒子の平均粒径及び濃度を分析し、ＤＣ−Ｃｈｏｌについて１０４±２５ｎｍ及び２．５４×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬ及び非修飾ＬＰＭＰについて８９±１５ｎｍ及び１．５４×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬであった。サンプル中のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０（ＩＤＴ）の量をＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）により定量化した。４３３ｎｇのＴｒａｃｒＲＮＡを含有する５０μＬのＬＰＭＰ及びＤＣ−コレステロールで修飾されたＬＰＭＰの両方を２４ウェルプレート内の４５０μＬの植物細胞懸濁液のアリコートにデュプリケートで添加した。細胞に５０μｌの滅菌超純水を添加し、陰性対照として使用した。細胞を暗所下２４℃で３時間インキュベートし、１ｍＬ滅菌超純水で３回洗浄して、細胞によって取り込まれなかった粒子を除去した。細胞を５００μＬの滅菌超純水に再懸濁して落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３）でイメージングした。検出可能な蛍光がなかった陰性対照（滅菌超純水）と比較して、ＬＰＭＰ及びＤＣ−コレステロールで修飾したＬＰＭＰによって処理した植物細胞では、様々な蛍光シグナルを検出することができた（図６）。ＤＣ−コレステロールで修飾したＬＰＭＰが最も強力な蛍光シグナルを示したことから、このＰＭＰ修飾がＴｒａｃｒＲＮＡを植物細胞に最も多く送達したことが指摘される。本発明者らのデータは、ＬＰＭＰをカチオン性脂質ＤＣ−コレステロールで修飾すると、インビトロで植物細胞によるレモンＬＰＭＰ取込みが改善されたことを示している。
実施例１４：イオン化脂質を用いたＰＭＰの修飾
この実施例は、ＰＭＰをイオン化脂質で修飾することにより、ｐＨ依存的に表面電荷を修飾してカーゴローディング容量及び植物細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることが可能であると実証する。この例では、イオン化脂質としてＣ１２−２００（１，１’−（（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン−２−オール））及びＭＣ３（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）を使用し、モデルＰＭＰとしてレモンＰＭＰ及びモデル負電荷ペイロードとしてトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ＴｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用する。モデル植物細胞株としてブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）トウモロコシ細胞を使用する。
ａ）イオン化脂質によるＰＭＰの修飾
脂質修飾ＰＭＰ（ＬＰＭＰ）を調製するため、ブライ・ダイアー法（Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，１９５９，Ｊ Ｂｉｏｌｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３７：９１１−９１７）を用いて、実施例１３に記載のように単離したレモンＰＭＰの濃縮溶液から脂質を抽出した。クロロホルム：メタノール（９：１）中のＰＭＰ抽出脂質ストック溶液にイオン化脂質を２５％又は４０％（ｗ／ｗ）の総脂質に達するように添加し、激しく混合することにより脂質を再懸濁した。抽出脂質から乾燥脂質薄膜及び再構成ＰＭＰを実施例１３に記載のように調製した。ＮａｎｏＦＣＭによりＬＰＭＰの粒径及び粒子数を評価した。ＬＰＭＰ粒径及び濃度の範囲は、ＬＭ ＬＰＭＰについて８３±１９ｎｍ及び１．７×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ、ＭＣ３修飾ＬＰＭＰについて８８±２２ｎｍ及び１．３５×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ及びＣ１２−２００修飾ＰＭＰについて８６±１６ｎｍ及び１．１９×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬであった（図７）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して動的光散乱法により表面電荷（ゼータ電位）を測定した。脂質再構成ＰＭＰをイオン化脂質Ｃ１２−２００及びＭＣ３で修飾すると、ＬＰＭＰの表面電荷をｐＨ依存的に変化させることが可能であった：ｐＨの低下に伴い、ＬＰＭＰの表面電荷が増加した（図８Ａ）。
ｂ）イオン化脂質修飾ＰＭＰへの負電荷カーゴのローディング
ヌクレアーゼフリー水又は二重鎖バッファー（ＩＤＴ（登録商標））に溶解させたＴｒａｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡを１ｍｇのＰＭＰ脂質につき１．５ｎｍｏｌで乾燥脂質薄膜に添加し、ＲＴで１時間放置して水和させた。０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．２（Ｔｅｋｎｏｖａ）を使用して再懸濁脂質溶液のｐＨを４．５に調整することにより、ＲＮＡ捕捉を増進させた。次に、脂質溶液を５回の凍結融解サイクルに供した。続いて、０．１Ｍ重炭酸塩バッファー（ｐＨ１０）を用いて脂質溶液のｐＨをｐＨ９に至らせ、次に脂質を更なる５回の凍結融解サイクルに供した。形成された脂質粒子をＭｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して０．８μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍポリカーボネートフィルタに通して押し出した。ロードしたＰＭＰを１００ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を備えた透析装置（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標））でＰＢＳに対して一晩透析し、次に０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを使用して滅菌した。加えて、サンプルを精製し、超遠心分離法を用いて濃縮した。ロードしたＰＭＰを４℃において１００，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１ｍＬ ＰＢＳに再懸濁して、１００，０００×ｇで３０分間濃縮した。得られたペレットを水に再懸濁した（植物細胞による細胞取込み用）。ＮａｎｏＦＣＭによりＲＮＡロードＬＰＭＰの粒径及び粒子数を評価した。平均粒径及び粒子濃度は、非修飾ＬＰＭＰについて８９±１５ｎｍ及び１．５４×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬ；Ｃ１２−２００修飾ＬＰＭＰについて８７±１６ｎｍ及び７．１５×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬ；及びＭＣ３修飾ＬＰＭＰについて９３±２７ｎｍ及び２．４×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬであった。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイによるか、又は標識したカーゴ（ＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０）の蛍光強度を測定することにより、ＲＮＡローディングを決定した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイを製造者のプロトコルに従ってヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下で実施してＰＭＰを溶解させ、封入されたカーゴを放出させた。脂質再構成ＰＭＰをイオン化脂質ＭＣ３及びＣ１２−２００で修飾すると、ＬＰＭＰの表面電荷をｐＨ依存的に変化させることが可能となり、イオン化脂質のないＬＰＭＰと比較したとき酸性ｐＨでの負電荷カーゴ（例えばＲＮＡ）のローディングが増加した（図８Ｂ及び図８Ｃ）。
ｃ）植物細胞（ＢＭＳ）によるＣ１２−２００修飾ＰＭＰの取込みの増加
ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）細胞を実施例１３（ｅ）に記載のように培養した。ＢＭＳ細胞処理のため、１０ｍＬの細胞懸濁液を採取して％パック細胞容積（ＰＣＶ）を決定した。ＰＣＶは、細胞の容積を細胞培養物アリコートの総容積で除したものとして定義され、パーセンテージとして表される。細胞を３９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットの容積を決定した。ＢＭＳの％ＰＣＶは２０％であった。取込み実験のため、前述したように細胞を培地に希釈することにより、培養物の％ＰＣＶを４％に調整した。ＬＰＭＰ及びＣ１２−２００で修飾したＬＰＭＰに、前述したようにＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０をロードし、滅菌し、滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＦＣＭにより分析した粒子の平均粒径及び濃度は、Ｃ１２−２００−ＬＰＭＰについて８７±１６ｎｍ及び７．１５×１０１１ＬＰＭＰ／ｍＬ及び非修飾ＬＰＭＰについて８９±１５ｎｍ及び７．１５Ｅ×１０１２ＬＰＭＰ／ｍＬであった。サンプル中のＴｒａｃｒＲＮＡ ＡＴＴＯ ５５０（ＩＤＴ）の量をＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）により定量化した。４３３ｎｇのＴｒａｃｒＲＮＡを含有する５０μＬのＬＰＭＰ又はＣ１２−２００で修飾したＬＰＭＰのいずれかを２４ウェルプレート内の４５０μＬの植物細胞懸濁液のアリコートにデュプリケートで添加した。細胞に５０μｌの滅菌超純水を添加し、陰性対照として使用した。細胞を暗所下２４℃で３時間インキュベートし、１ｍＬ滅菌超純水で３回洗浄して、細胞によって取り込まれなかった粒子を除去した。細胞を５００μＬの滅菌超純水に再懸濁して落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３）でイメージングした。検出可能な蛍光がなかった陰性対照（滅菌超純水）と比較して、ＬＰＭＰ及びＣ１２−２００で修飾したＬＰＭＰによって処理した植物細胞では様々な蛍光シグナルを検出することができた（図９）。Ｃ１２−２００で修飾したＬＰＭＰが最も強力な蛍光シグナルを示したことから、このＰＭＰ修飾がＴｒａｃｒＲＮＡを植物細胞に最も多く送達／会合したことが指摘される。本発明者らのデータは、ＬＰＭＰをＣ１２−２００イオン化脂質で修飾すると、インビトロで植物細胞によるレモンＬＰＭＰ取込みが改善されたことを示している。
実施例１５：細胞壁透過性タンパク質セルラーゼによるＰＭＰの修飾
この実施例は、ＰＭＰをセルラーゼで修飾して細胞壁構成成分の分解を促進することにより、植物、真菌又は細菌細胞へのＰＭＰの細胞取込みを増加させることが可能であると実証する。この例では、モデル細胞壁分解酵素としてセルラーゼを使用し、モデルＰＭＰとしてグレープフルーツＰＭＰを使用し、且つモデル植物細胞としてトウモロコシブラック・メキシカン・スイート細胞を使用する。
実験プロトコル：
ａ）セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドの合成
酵素を追跡するため、セルラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光標識（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造者の指示に従って標識した。手短には、２０ｍｇのセルラーゼを１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるように２ｍＬの重炭酸塩バッファー（ｐＨ８．３）に溶解させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）を無水ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解させて、溶解させたセルラーゼに３０μＬのＡＦ４８８を添加した。１５０ｒｐｍ、暗所下で室温（ＲＴ）において１時間インキュベートした後、混合物を４℃で一晩維持した。ＰＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムによって遊離色素を除去した。ＰＢＳ中の収集したＡＦ４８８標識セルラーゼ（ＢＣＡアッセイにより検出したとき０．４５ｍｇ／ｍＬ）を製造者の指示に従ってＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させた。手短には、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドを１００ｍＭの最終濃度となるように無水ＤＭＳＯに溶解させて、１０ｍＭの最終濃度となるように２ｍＬのＡＦ４８８標識セルラーゼに添加した。これらの２つの溶液を混合し、ＲＴ、１５０ｒｐｍで３０分間、暗所下においてインキュベートした。１００ｍＭの最終濃度となるようにトリス−ＨＣｌを添加することにより、反応を停止させた。チューブを４℃で２時間置いておくことにより反応を完全にクエンチし、次にＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製を実施した。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １０Ｋ装置（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、４ｍＬ）を使用してＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドを濃縮した。修飾されたセルラーゼは、ＢＣＡアッセイにより検出したときタンパク質濃度が０．３８ｍｇ／ｍＬであり、蛍光定量的セルラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）により検出したとき３２％の初期酵素活性を維持していた。
ｂ）セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドによるＰＭＰの修飾
幾つかの戦略を利用してグレープフルーツＰＭＰの表面をセルラーゼで修飾した。
修飾プロトコルｂ．１
ＰＭＰのアミノ基を製造者の指示に従ってＮＨＳ−ホスフィン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させて、次にホスフィン基とアジド基との間の無銅反応を通じてＰＭＰ−ホスフィンをＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと（実施例１５（ａ）に記載のように）共役した。手短には、ＮＨＳ−ホスフィンを１０ｍＭの最終濃度となるように無水ＤＭＳＯに溶解させて、ＰＢＳ中に再懸濁したＰＭＰに１ｍＭの最終ＮＨＳ−ホスフィン濃度となるように添加した（８．４×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）。これらの２つの溶液を混合し、ＲＴ、１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。トリス−ＨＣｌを１５０ｍＭの最終濃度となるように添加することにより、反応を停止させた。チューブを４℃で２時間置いておくことにより反応を完全にクエンチさせて、次にＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、０．５ｍＬ）、続いてＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製を実施した。次に、ＰＭＰ−ホスフィンを７００μＬのＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと混合し、暗所下３７℃で３時間インキュベートした。この混合物をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）バイオテクノロジーグレード透析チュービング３００ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してＰＢＳに対して４℃で２日間透析することにより、未結合のセルラーゼ並びに更なる化学物質及び副生成物を除去した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）を使用してセルラーゼ修飾ＰＭＰを濃縮した。最終生成物は、ＢＣＡアッセイにより検出したときタンパク質濃度が０．８ｍｇ／ｍＬ及び粒子濃度が５．３×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、ＮａｎｏＦＣＭにより検出したとき蛍光ゲーティングされた集団は４％であった。残りの初期酵素活性は９．３％であった。
修飾プロトコルｂ．２
ＰＭＰのカルボキシル基を製造者の指示に従ってＮＨ２−ＤＢＣＯ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と反応させて、次に無銅ケミストリー：ＤＢＣＯ基とアジド基との間の反応によってＰＭＰ−ＤＢＣＯをＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと共役させた（実施例１５（ａ））。初めに、製造者の指示に従ってＥＤＣ塩酸塩（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＭＰのカルボキシル基を活性化させた。手短には、０．２ｍＬのグレープフルーツＰＭＰ（３．８×１０１３ＰＭＰ／ｍＬ）を、酢酸塩バッファー（最終ｐＨ約５〜５．５）に溶解したての１ｍｇのＥＤＣと混合した。この混合物をＲＴで１５分間インキュベートし、次に溶解したＤＢＣＯ−ＮＨ２（１０ｍＭ、無水ＤＭＳＯ）と１ｍＭの最終濃度となるように合わせた。この反応混合物をＲＴ、１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。１５０ｍＭの最終濃度となるように１Ｍトリス−ＨＣｌを添加することにより、反応を停止させた。チューブを４℃で２時間置いておくことにより反応を完全にクエンチし、次に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、０．５ｍＬ）、続いてＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製を実施した。第二に、ＰＭＰ−ＤＢＣＯを７００μＬのＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと混合し、暗所下３７℃で３時間インキュベートした。未結合のセルラーゼ及び副生成物を除去するため、この混合物をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）バイオテクノロジーグレード透析チュービング３００ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してＰＢＳに対して４℃で２日間透析した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）を使用してセルラーゼ修飾ＰＭＰを濃縮した。最終生成物は、ＢＣＡアッセイにより検出したときタンパク質濃度が０．９ｍｇ／ｍＬ及び粒子濃度が５．２×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、ＮａｎｏＦＣＭにより検出したとき蛍光ゲーティングされた集団は７％であった。蛍光定量的セルラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）により検出したとき、残りの初期酵素活性は８．４％であった。
修飾プロトコルｂ．３
ＰＭＰのアミノ基を製造者の指示に従ってＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と反応させて、次にＤＢＣＯ基とアジド基との間の無銅反応を通じてＰＭＰ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯをＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと共役させた（実施例１５（ａ））。手短には、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを１０ｍＭの最終濃度となるように無水ＤＭＳＯに溶解させて、ＰＢＳに再懸濁したＰＭＰ（８．４×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）に１ｍＭの最終ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ濃度となるように添加した。これらの２つの溶液を混合し、ＲＴ、１５０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。１５０ｍＭの最終濃度となるように１Ｍトリス−ＨＣｌを添加することにより、反応を停止させた。チューブを４℃で２時間置いておくことにより反応を完全にクエンチし、次に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、０．５ｍＬ）、続いてＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製を実施した。次に、ＰＭＰ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを７００μＬのＡＦ４８８標識セルラーゼ−ＰＥＧ４−アジドと混合し、暗所下３７℃で３時間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）バイオテクノロジーグレード透析チュービング３００ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してこの混合物をＰＢＳに対して４℃で２日間透析した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）を使用してセルラーゼ修飾ＰＭＰを濃縮した。最終生成物は、ＢＣＡアッセイにより検出したときタンパク質濃度が１．３ｍｇ／ｍＬ及び粒子濃度が２×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、ＮａｎｏＦＣＭにより検出したとき蛍光ゲーティングされた集団は１７％であった。蛍光定量的セルラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）により検出したとき、残りの初期酵素活性は１７％であった。
ｃ）セルラーゼによるＰＭＰの修飾（ｃ．１）
グレープフルーツＰＭＰのカルボキシル基をカルボジイミドケミストリーを用いてＡＦ４８８標識セルラーゼのアミノ基と反応させた。初めに、ＰＭＰのカルボキシル基を製造者の指示に従ってＥＤＣ塩酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して活性化させた。手短には、０．２ｍＬのグレープフルーツＰＭＰ（３．８×１０１３ＰＭＰ／ｍＬ）を、酢酸塩バッファー（最終ｐＨ約５〜５．５）に溶解したての１ｍｇのＥＤＣと混合し、ＲＴで１５分間インキュベートした。次に、ＡＦ４８８標識セルラーゼを活性化したＰＭＰと共に、ＲＴ、１５０ｒｐｍ、暗所下で２時間インキュベートした。ＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製を実施し、続いてＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）バイオテクノロジーグレード透析チュービング３００ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してＰＢＳに対して４℃で２日間透析した。透析後、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）を使用してセルラーゼ修飾ＰＭＰを濃縮した。最終生成物は、ＢＣＡアッセイにより検出したときタンパク質濃度が１．１ｍｇ／ｍＬ及び粒子濃度が１．６×１０１２ＰＭＰ／ｍＬであり、ＮａｎｏＦＣＭにより検出したとき蛍光ゲーティングされた集団は２７％であった。蛍光定量的セルラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）により検出したとき、残りの初期酵素活性は９．２％であった。
ｄ）セルラーゼ修飾ＰＭＰを親油性色素で標識する
得られたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識セルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰを二重標識（緑色−ＡＦ４８８及び赤色−ＰＫＨ２６）とするため親油性ＰＫＨ２６色素（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で標識した。修飾ＰＭＰ（ＰＢＳ中２×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）を希釈剤Ｃ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と１：１ｖ／ｖ比で混合した。ＰＫＨ２６色素を希釈剤Ｃに溶解させて、予め希釈したＰＭＰと１：５００（色素：希釈剤Ｃ、ｖ／ｖ）に等しい最終的な比で混合した。この反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いてＰＢＳで平衡化したＺｅｂａスピン脱塩カラム（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）を使用して精製することにより遊離色素を除去した。次に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １００Ｋ装置（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、１０分、４，０００ｇ、３回）を使用してＰＫＨ２６標識セルラーゼ修飾ＰＭＰを濃縮した。ＮａｎｏＦＣＭを用いて最終的なＰＭＰを分析し（約７×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）、ＰＫＨ２６標識の蛍光強度（Ｅｘ／Ｅｍ＝５５０／５７０ｎｍ）を基準として正規化した。前述と同じように希釈剤Ｃとインキュベートして精製した遊離色素を対照として使用した。
ｅ）セルラーゼ修飾グレープフルーツＰＭＰを用いたゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＢＭＳ植物細胞によるＰＭＰ取込みの増加
ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ブラック・メキシカン・スイート（ＢＭＳ）細胞を実施例１３（ｅ）に記載のように増殖させた。ＢＭＳ細胞処理のため、１０ｍＬの細胞懸濁液を採取して％パック細胞容積（ＰＣＶ）を決定した。細胞を３９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットの容積を決定した。ＢＭＳの％ＰＣＶは２０％であった。取込み実験のため、前述したように細胞を培地に希釈することにより培養物の％ＰＣＶを４％に調整した。
実施例１５（ｂ）に記載のように、グレープフルーツＰＭＰを種々の架橋を用いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識セルラーゼと共役してセルラーゼ共役ＰＭＰを生じさせ、続いてＰＭＰ脂質膜をＰＫＨ２６標識した。ＰＫＨ２６で標識されているもののセルラーゼ修飾がないグレープフルーツＰＭＰの対照群（ＧＦ−ＰＭＰ）も調製した。全てのサンプルを滅菌し、滅菌水に再懸濁し、前述したようにＮａｎｏＦＣＭ、タンパク質アッセイ及びセルラーゼ活性アッセイによって分析した。次に、等量のＰＭＰ（２．６５×１０１２ＰＭＰ／ｍＬ）を含有する２５０μＬの各セルラーゼ修飾ＰＭＰ及びＧＦ−ＰＭＰを２４ウェルプレート内の２５０μＬのＢＭＳ細胞懸濁液にデュプリケートで添加した。細胞に２５０μｌの滅菌超純水及び遊離ＰＫＨ２６色素標識対照を添加し、陰性対照として使用した。細胞を暗所下２４℃で３０分間インキュベートし、１ｍＬ滅菌超純水で３回洗浄することにより、細胞によって取り込まれなかった粒子を除去した。細胞を５００μＬの滅菌超純水に再懸濁して落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３）でイメージングした。滅菌超純水及びＰＫＨ２６標識対照とインキュベートした細胞の蛍光レベルは検出不能であった。ＰＫＨ２６で標識したＧＦ−ＰＭＰとインキュベートした細胞からの蛍光シグナルは、セルラーゼ修飾ＰＭＰで処理した植物細胞からの蛍光シグナルと比較して極めて低い／検出不能であった（図１０）。ＮＨ２−ＤＢＣＯ（修飾プロトコルｂ．２）又はＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（修飾プロトコルｂ．３）リンカーを介してセルラーゼ−アジドで修飾したＰＭＰが最も強力な蛍光シグナルを示したことから、植物細胞における取込みはこれらのセルラーゼ修飾ＰＭＰが最も高かったことが指摘される。本発明者らのデータは、ＰＭＰをセルラーゼで修飾すると、インビトロで植物細胞によるグレープフルーツＰＭＰ取込みが改善されたことを示している。
他の実施形態
本発明の一部の実施形態は、以下の番号付けされたパラグラフ内にある。
１．非修飾ＰＭＰと比べて増加した細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含む植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）組成物。
２．増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加した細胞取込みである、パラグラフ１に記載のＰＭＰ組成物。
３．増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍又は１０００倍の増加した細胞取込みである、パラグラフ１に記載のＰＭＰ組成物。
４．細胞は、植物細胞である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５．細胞は、細菌細胞である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
６．細胞は、真菌細胞である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
７．修飾ＰＭＰは、細胞透過性薬剤を含む、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
８．修飾ＰＭＰは、植物細胞透過性薬剤を含む、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
９．修飾ＰＭＰは、細菌細胞透過性薬剤を含む、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
１０．修飾ＰＭＰは、真菌細胞透過性薬剤を含む、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
１１．細胞透過性薬剤は、酵素又はその機能性ドメインを含む、パラグラフ１〜１０のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
１２．酵素は、細菌酵素、真菌酵素、植物酵素又は原生動物酵素である、パラグラフ１１のＰＭＰ組成物。
１３．酵素は、細胞壁を分解することが可能な細菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１２に記載のＰＭＰ組成物。
１４．酵素は、細胞壁を分解することが可能な真菌酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１２に記載のＰＭＰ組成物。
１５．酵素は、細胞壁を分解することが可能な植物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１２に記載のＰＭＰ組成物。
１６．酵素は、細胞壁を分解することが可能な原生動物酵素の配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１２に記載のＰＭＰ組成物。
１７．酵素は、セルラーゼである、パラグラフ１２に記載のＰＭＰ組成物。
１８．セルラーゼは、細菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１７に記載のＰＭＰ組成物。
１９．セルラーゼは、真菌のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１７に記載のＰＭＰ組成物。
２０．セルラーゼは、原生動物のセルラーゼの配列の全て又は一部に対する少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の同一性を有する、パラグラフ１７に記載のＰＭＰ組成物。
２１．細胞透過性薬剤は、洗剤を含む、パラグラフ８に記載のＰＭＰ組成物。
２２．洗剤は、サポニンである、パラグラフ２１に記載のＰＭＰ組成物。
２３．細胞透過性薬剤は、カチオン性脂質を含む、パラグラフ８に記載のＰＭＰ組成物。
２４．カチオン性脂質は、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である、パラグラフ２３に記載のＰＭＰ組成物。
２５．カチオン性脂質は、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）である、パラグラフ２３に記載のＰＭＰ組成物。
２６．室温で少なくとも１日安定及び／又は４℃で少なくとも１週間安定である、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
２７．ＰＭＰは、少なくとも２４時間、４８時間、７日間又は３０日間安定である、パラグラフ２６に記載のＰＭＰ組成物。
２８．ＰＭＰは、少なくとも４℃、２０℃、２４℃又は３７℃の温度で安定である、パラグラフ２７に記載のＰＭＰ組成物。
２９．組成物中のＰＭＰは、真菌の適応度を減少させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３０．組成物中のＰＭＰは、真菌の適応度を減少させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３１．組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を増加させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３２．組成物中のＰＭＰは、植物の適応度を減少させるのに有効な濃度である、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３３．組成物中の複数の修飾ＰＭＰは、少なくとも１、１０、５０、１００又は２５０μｇ ＰＭＰタンパク質／ｍｌの濃度である、パラグラフ１〜３２のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３４．修飾ＰＭＰは、異種機能性薬剤を含む、パラグラフ１〜３３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
３５．修飾ＰＭＰは、２種以上の異なる異種機能性薬剤を含む、パラグラフ３４に記載のＰＭＰ組成物。
３６．異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々によって封入される、パラグラフ３４又は３５に記載のＰＭＰ組成物。
３７．異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に包埋される、パラグラフ３４又は３５に記載のＰＭＰ組成物。
３８．異種機能性薬剤は、複数のＰＭＰの各々の表面に共役される、パラグラフ３４又は３５に記載のＰＭＰ組成物。
３９．異種機能性薬剤は、施肥剤である、パラグラフ３４〜３８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
４０．施肥剤は、植物栄養素である、パラグラフ３９に記載のＰＭＰ組成物。
４１．異種機能性薬剤は、除草剤である、パラグラフ３４〜３８のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
４２．異種機能性薬剤は、異種ポリペプチド、異種核酸又は異種小分子である、パラグラフ３４〜３９及び４１のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
４３．異種核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子である、パラグラフ４２に記載のＰＭＰ組成物。
４４．ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は阻害性ＲＮＡである、パラグラフ４３に記載のＰＭＰ組成物。
４５．阻害性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、パラグラフ４４に記載のＰＭＰ組成物。
４６．阻害性ＲＮＡは、植物における遺伝子発現を阻害する、パラグラフ４４又は４５に記載のＰＭＰ組成物。
４７．阻害性ＲＮＡは、植物共生体における遺伝子発現を阻害する、パラグラフ４４又は４５に記載のＰＭＰ組成物。
４８．核酸は、ｍＲＮＡ、改変ｍＲＮＡ又は植物において酵素の発現を増加させるＤＮＡ分子、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである、パラグラフ４２又は４３に記載のＰＭＰ組成物。
４９．核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、ＬＮＡ、ｐｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマー、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は植物において酵素の発現を減少させるＤＮＡ分子、転写因子、分泌タンパク質、構造因子、リボタンパク質、タンパク質アプタマー、シャペロン、受容体、シグナル伝達リガンド又は輸送体である、パラグラフ４２又は４３に記載のＰＭＰ組成物。
５０．ポリペプチドは、酵素、孔形成タンパク質、シグナル伝達リガンド、細胞膜透過ペプチド、転写因子、受容体、抗体、ナノボディ、遺伝子編集タンパク質、リボタンパク質、タンパク質アプタマー又はシャペロンである、パラグラフ４２に記載のＰＭＰ組成物。
５１．植物は、農業又は園芸植物である、パラグラフ１〜５０のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５２．農業植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である、パラグラフ５１に記載のＰＭＰ組成物。
５３．植物は、雑草である、パラグラフ１〜５０のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５４．植物への送達のために製剤化される、パラグラフ１〜５３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５５．農業的に許容可能な担体を含む、パラグラフ１〜５４のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５６．液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、パラグラフ１〜５５のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
５７．増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、
（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；
（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
（ｄ）純粋なＰＭＰに細胞透過性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した動物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップ；及び
（ｅ）動物への送達のためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップ
を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
５８．パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物を含む細菌。
５９．パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物を含む真菌。
６０．パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物を含む植物。
６１．植物にＰＭＰ組成物を送達する方法であって、植物を、パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物と接触させることを含む方法。
６２．植物の適応度を増加させる方法であって、パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載の有効量の組成物を植物に送達することを含み、植物の適応度を、治療されていない植物に対して増加させる方法。
６３．ＰＭＰは、異種施肥剤を含む、パラグラフ６１又は６２に記載の方法。
６４．植物は、農業又は園芸植物である、パラグラフ６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．植物は、ダイズ植物、コムギ植物又はトウモロコシ植物である、パラグラフ６４に記載の方法。
６６．植物の適応度を減少させる方法であって、パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載の有効量の組成物を植物に送達することを含み、植物の適応度を、治療されていない植物に対して減少させる方法。
６７．ＰＭＰは、異種農薬用薬剤を含む、パラグラフ６１又は６６に記載の方法。
６８．植物は、雑草である、パラグラフ６１、６６及び６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ＰＭＰ組成物は、植物の葉、種子、根、果実、新芽、花粉又は花に送達される、パラグラフ６１〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．ＰＭＰ組成物は、液体、固体、エアゾール、ペースト、ゲル又は気体として送達される、パラグラフ６１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．細胞は、哺乳動物細胞である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
７２．細胞は、ヒト細胞である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載のＰＭＰ組成物。
７３．哺乳動物の適応度を増加させる方法であって、パラグラフ１〜５７のいずれか１つに記載の有効量の組成物を哺乳動物に送達することを含み、哺乳動物の適応度を、治療されていない哺乳動物に対して増加させる方法。
７４．ＰＭＰは、異種治療薬を含む、パラグラフ７３に記載の方法。
７５．哺乳動物は、ヒトである、パラグラフ７３又は７４に記載の方法。
７６．増加した動物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、
（ａ）植物又はその部分から初期サンプルを提供するステップであって、植物又はその部分は、ＥＶを含む、ステップ；
（ｂ）初期サンプルから粗ＰＭＰ画分単離するステップであって、粗ＰＭＰ画分は、初期サンプルのレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
（ｃ）粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、複数の純粋なＰＭＰは、粗ＥＶ画分のレベルと比べて、植物又はその部分からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
（ｄ）純粋なＰＭＰに細胞透過性薬剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した動物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップ；及び
（ｅ）動物への送達のためにステップ（ｄ）のＰＭＰを製剤化するステップ
を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
７７．植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外来性のイオン化可能な脂質を含むＰＭＰを標的細胞に導入することを含み、外来性のイオン化可能な脂質を含むＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて増加した、標的細胞による取込みを有する、方法。
７８．修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のイオン化可能な脂質を含む、パラグラフ７７に記載の方法。
７９．修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）由来の脂質を含む、パラグラフ７７に記載の方法。
８０．外来性のイオン化可能な脂質は、１，１’−（（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン−２−オール）（Ｃ１２−２００）である、パラグラフ７７に記載の方法。
８１．植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外来性双性イオン性脂質を含むＰＭＰを標的細胞に導入することを含み、外来性双性イオン性脂質を含むＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて増加した、標的細胞による取込みを有する、方法。
８２．修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の双性イオン性脂質を含む、パラグラフ８１に記載の方法。
８３．修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）由来の脂質を含む、パラグラフ８１に記載の方法。
８４．外来性双性イオン性脂質は、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である、パラグラフ８１に記載の方法。
８５．外来性カチオン性脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物。
８６．修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む、パラグラフ８５に記載のＰＭＰ組成物。
８７．外来性のイオン化可能な脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物。
８８．修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のイオン化可能な脂質を含む、パラグラフ８７に記載のＰＭＰ組成物。
８９．イオン化可能な脂質は、Ｃ１２−２００である、パラグラフ８７に記載のＰＭＰ組成物。
９０．外来性双性イオン性脂質を含む複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物。
９１．修飾ＰＭＰの各々は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の双性イオン性脂質を含む、パラグラフ９０に記載のＰＭＰ組成物。
９２．双性イオン性脂質は、ＤＥＰＣ又はＤＯＰＣである、パラグラフ９０に記載のＰＭＰ組成物。
９３．増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、
（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；
（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び
（ｃ）外来性カチオン性脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性カチオン性脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップ
を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
９４．増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、
（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；
（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び
（ｃ）外来性のイオン化可能な脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性のイオン化可能な脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップ
を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
９５．増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、ＰＭＰは、
（ａ）複数の精製ＰＭＰを提供するステップ；
（ｂ）複数のＰＭＰを処理して脂質薄膜を生成するステップ；及び
（ｃ）外来性双性イオン性脂質の存在下で脂質薄膜を再構成し（ここで、再構成されたＰＭＰは、少なくとも１％の外来性双性イオン性脂質を含む）、それにより増加した細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生成するステップ
を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例としてある程度詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
他の実施形態は、特許請求の範囲に含まれる。
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Claims (14)

  1. 植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）を標的細胞に送達する方法であって、外因性カチオン性脂質を含むＰＭＰを前記標的細胞に導入することを含み、前記外因性カチオン性脂質を含む前記ＰＭＰは、非修飾ＰＭＰと比べて、前記標的細胞による増加した取込みを有する、方法。
  2. 前記修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超のカチオン性脂質を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記修飾ＰＭＰは、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９０％超の、植物細胞外小胞（ＥＶ）に由来する脂質を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記増加した細胞取込みは、非修飾ＰＭＰと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の増加した細胞取込みである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記修飾ＰＭＰは、異種機能性薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記異種機能性薬剤は、前記複数のＰＭＰの各々によって封入される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記異種機能性薬剤は、前記複数のＰＭＰの各々の表面に包埋される、請求項５に記載の方法。
  8. 前記異種機能性薬剤は、前記複数のＰＭＰの各々の表面に共役される、請求項５に記載の方法。
  9. 前記細胞は、植物細胞である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記細胞は、細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記細胞は、真菌細胞である、請求項１に記載の方法。
  12. 非修飾ＰＭＰと比べて増加した細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含む植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）組成物。
  13. 増加した植物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、前記ＰＭＰは、
    （ａ）植物又はその一部から初期サンプルを提供するステップであって、前記植物又はその一部は、ＥＶを含む、ステップ；
    （ｂ）前記初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、前記粗ＰＭＰ画分は、前記初期サンプルのレベルと比べて、前記植物又はその一部からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
    （ｃ）前記粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、前記複数の純粋なＰＭＰは、前記粗ＥＶ画分のレベルと比べて、前記植物又はその一部からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
    （ｄ）前記純粋なＰＭＰに植物細胞透過剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した植物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせるステップ；及び
    （ｅ）植物への送達のためにステップ（ｄ）の前記ＰＭＰを製剤化するステップ
    を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
  14. 増加した動物細胞取込みを有する複数の修飾ＰＭＰを含むＰＭＰ組成物であって、前記ＰＭＰは、
    （ａ）植物又はその一部から初期サンプルを提供するステップであって、前記植物又はその一部は、ＥＶを含む、ステップ；
    （ｂ）前記初期サンプルから粗ＰＭＰ画分を単離するステップであって、前記粗ＰＭＰ画分は、前記初期サンプルのレベルと比べて、前記植物又はその一部からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
    （ｃ）前記粗ＰＭＰ画分を精製し、それにより複数の純粋なＰＭＰを生成するステップであって、前記複数の純粋なＰＭＰは、前記粗ＥＶ画分のレベルと比べて、前記植物又はその一部からの少なくとも１つの混入物又は不要な成分の低下したレベルを有する、ステップ；
    （ｄ）前記純粋なＰＭＰに細胞透過剤をロードし、それにより非修飾ＰＭＰと比べて増加した動物細胞取込みを有する修飾ＰＭＰを生じさせる、ステップ；及び
    （ｅ）動物への送達のためにステップ（ｄ）の前記ＰＭＰを製剤化するステップ
    を含むプロセスによって生成される、ＰＭＰ組成物。
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