JP2021533759A

JP2021533759A - 癌抗原特異的ｃｄ８＋ｔ細胞を調製および凍結保存するための方法

Info

Publication number: JP2021533759A
Application number: JP2021506966A
Authority: JP
Inventors: ビョンセグォン; ヨンホキム; ムンキキム; グワンヒーキム; ユーヒュンカン; セロムイ
Original assignee: ユーティレックスカンパニーリミテッド
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-12-09
Also published as: CN113302285A; US20200172866A1; EP3835416A4; WO2020032782A1; EP3835416A1; KR20210042142A

Abstract

本発明は、(a)癌抗原特異的CD8+T細胞を含むPBMCの中からCD8+T細胞を活性化し、次いで、該CD8+T細胞の共刺激因子を発現させる工程;(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8+T細胞を選択する工程;(c)工程(b)において選択されたCD8+T細胞の数を増加させる工程;(d)工程(c)において得られたCD8+T細胞を凍結させる工程;および(e)工程(d)において凍結されたCD8+T細胞を解凍する工程を含む、癌抗原特異的CD8+T細胞を調製する方法に関する。

Description

本発明は、抗原特異的CD8⁺T細胞を単離し、増殖させ、かつ凍結保存する技術に関する。

CD8⁺T細胞は、樹状細胞、CD4⁺T細胞、およびNK細胞などの他の細胞と比べて比較的単純な機能を有するので、抗癌免疫療法において予想外の副作用が発生する可能性は低い。一般的に、抗原特異的CD8⁺T細胞を単離するためにMHCクラスI/ペプチド多量体が用いられるが、この方法には欠点がある。なぜなら、十分な量の抗原特異的CD8⁺T細胞を産生するには細胞単離後のアポトーシスによる細胞死の割合が高く、長期間にわたって培養する必要があるからである。従って、T細胞受容体(TCR)を刺激するMHC多量体に取って代わることで、抗原特異的CD8⁺T細胞を単離することができる代用マーカーが必要とされる。この目的のために、タンパク質4-1BB(CD137)が用いられる。

4-1BBは誘導性の共刺激分子であり、活性化T細胞において発現している。特に、4-1BBを介した刺激はCD8⁺T細胞活性を増強するだけでなく、抗アポトーシス分子、例えば、Bcl-2、Bcl-XL、およびBfl-1などの発現を増大させることによって活性化誘導細胞死(AICD)を阻害するように作用することも知られている。

本発明者らは、抗原特異的CD8⁺T細胞を、活性化されたCD8⁺T細胞による4-1BB発現を用いて、または抗4-1BB抗体もしくは五量体COMP-4-1BBLタンパク質を用いて単離しかつ増殖させる方法を以前に開示した(大韓民国登録特許第100882445号（特許文献１）、大韓民国登録特許第101103603号（特許文献２）、大韓民国登録特許第101503341号（特許文献３）)。本明細書の背景は、上記の特許に開示されたT細胞またはT細胞を製造する方法である。

本特許文書は、ウイルス抗原(EBV/LMP2A、CMV/pp65)の形をした外来抗原または自己抗原(WT-1、hTERT、NY-ESO-1など)に対する抗原特異的CD8⁺T細胞を単離および大量培養するための技法を開示する。しかしながら、抗4-1BB抗体コーティングプレートを用いてコーティングされたプレートを用いて抗原特異的CD8⁺T細胞を単離する既存の技法では、単離された細胞の純度は作業者の技能によって大きく異なり、細胞を培養するプロセスも非常に複雑である。さらに、産生プロセスは30日以上かかるので、進行中の研究は、現行の臨床用途の細胞治療剤を産生するのに必要な時間を可能な限り短縮することが必要とされる。

さらに、CD8⁺T細胞を調製する際に、患者の治療スケジュールおよび反復処置などの理由により、必要に応じて細胞を凍結保存し、解凍することが必要であるが、T細胞が凍結および解凍された時に、T細胞の生存率、増殖能力、および癌抗原特異的活性が低下するという問題が現在まである。

従って、より効果的な患者処置のために、もっと簡単に、かつ高純度で、培養プロセス全体を短縮して素早く増殖させるために短時間で抗原特異的CD8⁺T細胞を分離すること、およびT細胞性能の劣化を最小限にするT細胞凍結保存方法を開発することが必要である。

大韓民国登録特許第100882445号大韓民国登録特許第101103603号大韓民国登録特許第101503341号

発明の詳細な説明
解決すべき課題
本発明は、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を産生するための方法であって、産生されたCD8⁺T細胞が凍結保存された後でも高レベルの細胞生存率と癌抗原特異的活性の維持を可能にする方法を提供しようと努力する。

本発明は、凍結保存工程を含む方法によって調製された、CD8⁺T細胞を含有する薬学的組成物を提供しようと努力する。

本発明は、もっと大きな抗原特異性をもつと同時に、高レベルの細胞生存率と癌抗原特異的活性も維持しているCD8⁺T細胞を得ることができるように、凍結された抗原特異的CD8⁺T細胞が解凍され、大量培養が再度行われる方法を提供しようと努力する。

課題を解決する手段
1. (a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

2. (e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

3. 癌抗原が、hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1、およびEBVからなる群より選択される少なくとも1つである、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

4. 工程(b)が閉鎖系フローサイトメーターを用いて行われる、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

5. 工程(d)において、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の数が、1mLあたりの予め決められた細胞数より多い場合またはそれと等しい場合に、凍結が行われる、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

6. 工程(d)において、CD8⁺T細胞の数が、少なくとも1mLあたりの予め決められた細胞数であり、かつ共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の割合が、少なくとも予め決められた比率である場合に、凍結が行われる、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

7. 工程(d)が、CD8⁺T細胞の数と、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の割合とを検出する工程を含む、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

8. (f)工程(e)において得られたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程をさらに含む、項目2の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

9. 共刺激因子が、CD28、CTLA-4、ICOS、PD1、BTLA、HVEM、CD27、OX40、4-1BB、CD30、およびSLAMからなる群より選択される1つまたは複数である、項目1の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。

10. (a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む、癌処置組成物を調製する方法。

11. (e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、項目10の癌処置組成物を調製する方法。

12. (a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む工程によって調製された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含む、癌処置組成物。

13. (e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、項目12の癌処置組成物。

14. (a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む工程によって調製された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含む、薬学的に有効な量の癌処置組成物
を投与する工程を含む、癌処置方法。

15. (e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、項目14の癌処置方法。

発明の効果
本発明のCD8⁺T細胞産生方法を用いると、CD8⁺T細胞の性能を劣化することなくCD8⁺T細胞を凍結保存することが可能になる。

本発明のCD8⁺T細胞産生方法を用いると、CD8⁺T細胞が凍結保存されていても高レベルの細胞生存率と癌抗原特異的活性を維持することが可能になる。

本発明のCD8⁺T細胞産生方法を用いると、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を高純度で選択的に分離および大量培養することが可能になる。

本発明のCD8⁺T細胞産生方法を用いると、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を迅速に生産することが可能になる。

本発明のCD8⁺T細胞産生方法はGMPプロセスにおいて適用され得る。

本発明のCD8⁺T細胞含有薬学的組成物を用いると、凍結保存後でも高レベルの細胞生存率と癌抗原特異的活性を維持することが可能になる。

本発明のCD8⁺T細胞含有薬学的組成物は高度の純度で癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むことができる。

癌抗原特異的CD8⁺T細胞を産生するためのプロセスを模式的に示す。

発明を実施する最良の態様
本発明は、T細胞を凍結保存する方法と、このような方法によって産生されたT細胞とに関する。

本発明は、産生されたCD8⁺T細胞が凍結保存された後でも高レベルの細胞生存率と癌抗原特異的活性の維持を可能にする、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を産生する方法、およびこのような方法によって生産されたT細胞治療剤に関する。

本発明の薬学的組成物は、癌抗原(例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3、ネオアンチゲンなど)に特異的な細胞傷害性T細胞を含む。最初の増殖から、最後のT細胞大量培養が終了した後の凍結までかかる時間は31日になる場合がある。改善された産生プロセスは29日、26日、20日、または15日を要する場合がある。

本発明による癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法は、(a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程;および(e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程を含む。

CD8⁺T細胞は以下のように活性化される。

CD8⁺T細胞を活性化するために、血液から単離されたPBMCと、癌抗原に由来するそれぞれのペプチドとが一緒に培養され、IL-2、IL-7、IL-15、およびIL-21からなる群に由来する少なくとも1種類のサイトカインで定期的に処理される。

CD8⁺T細胞の共刺激因子は、CD28ファミリーに属するタンパク質、例えば、CD28、CTLA-4、ICOS、PD1、およびBTLAであり、TNFRファミリーに属するタンパク質は、例えば、HVEM、CD27、0X40、4-1BB、GITR、およびCD30であり、SLAMファミリーに属するタンパク質は、例えば、SLAM、2B4、CD2、CD48、CD84、CD229、CRACC、NTB-Aであり、TIMファミリーに属するタンパク質は、例えば、TIM-1およびTIM-3であるが、これらに限定されない(K. C. Beier et al., European Respiratory Journal 2007 29: 804-812)。本発明の一態様では、共刺激因子は4-1BBである。

または、共刺激因子を発現する活性化CD8⁺細胞が以下の調製方法によって調製され得る。

一態様は、a)最初に、癌患者の血液から単離されたPBMC(末梢血単核球)を、癌抗原に由来するそれぞれのペプチドと共に培養し、癌抗原CD8⁺T細胞エピトープをスクリーニングするように活性化T細胞をスクリーニングする工程;ならびにb)癌患者の血液から単離されたPBMCを、IL-2、IL-7、IL-15、およびIL-21からなる群より選択される少なくとも1種類のサイトカインと、スクリーニングされたエピトープとを含む培地中で培養し、それによって、PBMCにおいて4-1BB発現を誘導する工程を含む。

本願に従う方法では、CD8⁺T細胞エピトープのソーティングまたはスクリーニングの工程は、癌細胞に対するアビディティを増大させるか、または0.1％以下という低濃度で血中に存在する癌抗原特異的CD8⁺T細胞の濃度を増大させることを目的とし、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を選択的に増殖させかつ単離するのを可能にする第1の工程である。

この工程では、CD8⁺T細胞が認識することができる、様々な癌抗原(例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3など)に由来するエピトープが使用され得る。しかしながら、これは患者一人一人の状態に応じて変化する。言い換えると、癌抗原において同じタイプの癌抗原、例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3などであっても、エピトープとして働く可能性がある部分は各患者のHLA-A型および状態に左右される。従って、同じ癌抗原の中にあっても、癌患者一人一人の血中に存在する癌抗原CD8⁺T細胞エピトープをエピトープスクリーニングによって選択および使用することが重要である。なぜなら、抗原エピトープとして働く可能性があるペプチド部分は各癌患者について異なるからである。一般的に、T細胞治療剤の調製において使用するためには、エピトープとして働く3〜4種類のペプチドが選択される。

本願に従う方法では、様々な癌抗原に由来する、個体においてCD8⁺T細胞を選択しかつ増殖させるのに最適なエピトープを選択する。自己由来(自己)抗原と非自己抗原の両方を含む、この目標を果たす様々な癌抗原が使用され得る。

例えば、患者自身の遺伝子に由来する自己癌抗原は、hTERT(GenBank:BAC11010.1)、WT1(GenBank:AAO61088.1)、NY-ESO1(GenBank:CAA05908.1)、MAGE-A3(NCBI参照配列:NP_005353.1)、および癌特異的変異抗原、例えば、ネオアンチゲン、変異P53、RASなどを含み、腫瘍サプレッサー遺伝子またはトリガー遺伝子、および外来癌抗原、例えば、発癌性ウイルス抗原、例えば、CMV、EBV、HPVなどを含んでもよい。

しかしながら、本願の本発明の特徴は、それぞれのタイプの癌に特異的な様々な癌抗原に由来する各個体に最適なエピトープを選択し、これらを使用してT細胞を産生することであり、これらに限定されない。既知の自己癌抗原には、例えば、WT1、hTERT、NY-ESO1、メソテリン、MAGEなどが含まれる。例えば、自己型癌抗原であるhTERTは、テロメア依存性細胞死から逃れるために癌細胞が過剰に活性化する、染色体末端でテロメアDNAを合成する酵素であり、肺癌、胃癌、および膵臓癌を含む様々な固形癌の標的抗原として知られている(Kim NW, et al. Science. 1994; 266: 2011-2015)。WT1は、ウィルムス腫瘍に関連する遺伝子であり、細胞増殖、分化、アポトーシス、および臓器発生に関与するタンパク質であるジンクフィンガー転写因子をコードし、脳脊髄の癌、肺癌などの標的抗原として知られている(Call KM, et al., Cell. 1990. 60: 509-520; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21: 113-6)。さらに、前述したNY-ESO1は、癌精巣抗原(CTA)に属するタンパク質の1つであり、主に、生殖細胞、肉腫、および乳癌を含む様々な癌細胞において発現していることが知られている(Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006; 95:1-30)。MAGE-A3は、メラノーマ関連抗原ファミリーに属するタンパク質である。健常細胞におけるその機能は未知であるが、肺癌、肉腫、およびメラノーマを含む様々な癌細胞において過剰発現していることが知られており、癌免疫療法に適した標的抗原だと評価されている(Decoster L, et al., Ann. Oncol. 2012 Jun; 23 (6): 1387-93)。従って、本願の方法では、個々の癌抗原CD8⁺T細胞を産生するために、特定の癌に関連することが知られている癌抗原が使用され得る。

さらに、例えば、EBV、HPV、MCポリオーマウイルス、HBV、HCV、およびCMVを含むウイルス癌抗原が知られている。エプスタイン-バーウイルス抗原は、ホジキンリンパ腫、鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、およびNK/Tリンパ腫の標的抗原として知られ、ヒトパピローマウイルス抗原は子宮癌および頭頚部癌の標的抗原として知られ、これに対して、MCポリオーマウイルスはメルケル細胞癌の標的抗原として知られている。B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルスも肝臓癌の標的抗原として知られている。

組織特異的癌抗原として、チロシナーゼ、GP100、およびMNRT-1がメラノーマ標的抗原としてとして知られ、PSMA、PAP、およびPSAが前立腺癌標的抗原として知られている。

癌抗原に由来する2種類、3種類、4種類、5種類、またはそれより多いペプチドが用いられる。特に、一般的に、エピトープとして働く3〜4種類のペプチドがT細胞治療剤を調製するために用いられることを考慮すると、使用される癌抗原に由来するペプチドの数は、少なくとも4種類以上、5種類以上、6種類以上、7種類以上、8種類以上、9種類以上、またはそれより多いが、これらに限定されず、本願の方法の特徴および関連分野の技術を考慮すれば当業者によって決定され得る。

本願の方法が含むエピトープスクリーニング工程は、スクリーニング中に、活性化T細胞(例えば、4-1BB⁺CD8⁺T細胞)をスクリーニングする方法によってエピトープが選択され得る点で従来のエピトープスクリーニングプロセスとは異なる。例えば、抗原刺激後に、活性化T細胞が選択され、このような細胞を誘導することができる抗原エピトープが、存在する活性化T細胞(例えば、4-1BB⁺CD8⁺T細胞)の存在および量を検出することによって選択され得る。活性化T細胞(例えば、4-1BB⁺CD8⁺T細胞)は自動セルソーターを用いてスクリーニングされ得る。自動セルソーターはGMPプロセスにおいて使用することができるものでもよい。例えば、これは閉鎖系自動セルソーターでもよい。

次の工程では、癌患者血液から単離されたPBMCにおいて、これらのPBMCを、選択されたエピトープとサイトカインの組み合わせを含む培地中で培養することによって4-1BB発現が誘導される。

本願に従う一態様では、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、およびIL-21からなる群より選択される任意のサイトカインでよい。別の態様では、サイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、およびIL-21からなる群より選択される少なくとも2つの組み合わせでもよい。例えば、サイトカインは、IL-2とIL-7、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-7とIL-15、IL-7とIL-21、またはIL-15とIL-21の組み合わせでもよい。

従来の癌抗原特異的CD8⁺T細胞の増殖は14日間の培養にわたって行われ、培養して14日目に、抗原特異的CD8⁺T細胞において4-1BB発現を誘導するために24時間のさらなる再活性化が必要とされる。

この態様では、本願の工程b)は、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、または14日間にわたって行われてもよい。

本願の目的を考慮して、本願に従う方法の第1の工程および第2の工程において用いられる末梢血単核球(PBMC)は同じ患者に由来する。PBMCは、当技術分野において公知の方法を用いて全血から単離されてもよい。

次に、活性化CD8⁺T細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞が、抗共刺激因子抗体と抗CD8抗体とを用いて染色された後に単離される。単離は、例えば、自動セルソーターを用いて行われてもよい。抗原特異的共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を、自動セルソーターを用いて単離すると、共刺激因子でコーティングされたプレートを使用する従来のプロセスによって引き起こされる、いくつかの問題、例えば、純度と研究の難しさが改善する可能性がある。共刺激因子を用いる場合、抗CD8抗体に関して、抗原によって刺激されたCD8⁺T細胞の表面にしか発現せず、蛍光標識剤と結合されるマーカーについて染色した後に、両種の蛍光を有する抗原特異的CD8⁺T細胞が効率的に単離され得る。

前記のように、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞が自動セルソーターを用いて選択される調製方法は、癌抗原、例えば、EBV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、およびMAGE-A3に特異的なCD8⁺T細胞の調製において使用され得る。前記のように、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を、自動セルソーターを用いて選択する方法によって調製された薬学的組成物は、癌抗原特異的細胞傷害性T細胞の少なくとも90％(例えば、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％)を含む場合がある。より好ましくは、前記薬学的組成物は少なくとも95％(例えば、95％、96％、97％、98％、または99％)を含む場合がある。

前記のように、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞が自動セルソーターを用いて選択される調製方法によって調製された薬学的組成物(例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、またはMAGE-A3に特異的な細胞傷害性T細胞を含む組成物)は高純度の癌抗原特異的細胞傷害性T細胞を有し、従って、T細胞治療剤として優れた臨床有効性(例えば、抗癌有効性など)を有する。

上記の選択工程において用いられる自動セルソーターはGMPプロセスにおいて使用することができるものでもよい。例えば、これは閉鎖系自動セルソーターでもよい。

スクリーニングされたCD8⁺T細胞の数は培養によって増加させてもよく、当技術分野において公知のCD8⁺T細胞培養方法が用いられてもよい。例えば、本発明の一態様では、T細胞は、抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされた6ウェルプレートRPMI培地(不活化FBS、1-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、2-メルカプトエタノール、1％ITS:インシュリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウム)にプレートされ、ある期間にわたってインキュベートされ、インキュベーション後にIL-7およびIL-2が添加されて、細胞は回収され、IL-7およびIL-2を含む新鮮培地上で再インキュベートされる。しかしながら、上記の方法は例示的な一例であり、本発明は、これに限定されない。

本発明の別の態様では、CD8⁺T細胞の数は、培養:a)最初に、癌患者の血液から単離されたPBMC(末梢血単核球)を、癌抗原に由来するそれぞれのペプチドと共に培養し、癌抗原CD8⁺T細胞エピトープをスクリーニングするように活性化T細胞をスクリーニングする工程;b)癌患者の血液から単離されたPBMCを、IL-2、IL-7、IL-15、およびIL-21からなる群より選択される少なくとも1種類のサイトカインと、スクリーニングされたエピトープとを含む培地中で培養し、それによって、PBMCにおいて4-1BB発現を誘導する工程;ならびにc)4-1BB発現が誘導された細胞を、抗4-1BB抗体と抗CD8抗体を用いて染色し、次いで、これらを分離する工程によって増加させてもよい。

本明細書中、以下において、抗原特異的CD8⁺T細胞を産生するために抗原エピトープをスクリーニングし、抗原特異的CD8⁺T細胞を単離しかつ増殖させるための本発明の方法が段階ごとに説明される。

本願に従う方法では、エピトープのソーティングまたはスクリーニングの工程は、癌細胞に対するアビディティを増大させるか、または0.1％以下という低濃度で血中に存在する癌抗原特異的CD8⁺T細胞の濃度を増大させることを目的とし、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を選択的に増殖させかつ単離するのを可能にする第1の工程である。

この工程では、CD8⁺T細胞によって認識され得る様々な癌抗原(例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3など)に由来するエピトープが使用され得る。しかしながら、これは患者一人一人の状態に応じて変化する。言い換えると、癌抗原において同じタイプの癌抗原、例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3などであっても、エピトープとして働く可能性がある部分は各患者のHLA-A型および状態に左右される。従って、同じ癌抗原の中にあっても、癌患者一人一人の血中に存在する癌抗原CD8⁺T細胞エピトープをエピトープスクリーニングによって選択および使用することが重要である。なぜなら、抗原エピトープとして働く可能性があるペプチド部分は各癌患者について異なるからである。一般的に、T細胞治療剤の調製において使用するためには、エピトープとして働く3〜4種類のペプチドが選択される。

本願に従う方法は、様々な癌抗原に由来する、個体においてCD8⁺T細胞を選択しかつ増殖させるのに最適なエピトープを選択する工程を含む。自己由来(自己)抗原と非自己抗原の両方を含む、この目標を果たす様々な癌抗原が使用され得る。

組織特異的癌抗原として、チロシナーゼ、GP100、およびMNRT-1はメラノーマ標的抗原として知られており、PSMA、PAP、およびPSAは前立腺癌標的抗原として知られている。

癌抗原に由来する2種類、3種類、4種類、5種類、またはそれより多いペプチドが用いられる。特に、一般的に、エピトープとして働く3〜4種類のペプチドがT細胞治療剤を調製するために用いられることを考慮すると、使用される癌抗原に由来するペプチドの数は、4種類以上、5種類以上、6種類以上、7種類以上、8種類以上、9種類以上、またはそれより多いが、これらに限定されず、本願の方法の特徴および関連分野の技術を考慮すれば当業者によって決定され得る。

癌抗原特異的CD8⁺T細胞は血中には0.1％以下という低濃度で存在するので、1種類または複数種のサイトカインと、エピトープスクリーニングから選択された3〜4種類のペプチドとを、血液から単離されたPBMCに添加し、次いで、7〜9日間インキュベートすることによって、癌抗原に由来するペプチドに特異的なCD8⁺T細胞を増殖させ、4-1BB発現を誘導することができる(図1.B-1、B-2)。結果として、全インキュベーション期間は29日以下、26日以下、20日以下、18日以下、特に、15日まで短縮され得る。

この態様では、本願の工程b)は7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、または14日間にわたって行われてもよい。

第3の工程では、4-1BB発現が誘導された抗原特異的細胞が、抗4-1BB抗体と抗CD8抗体とを用いて染色された後に単離される。単離は、例えば、自動セルソーターを用いて行われてもよい。自動セルソーターを用いて抗原特異的4-1BB⁺CD8⁺T細胞を単離すると、4-1BB抗体でコーティングされたプレートを使用する従来のプロセスによって引き起こされる、いくつかの問題、例えば、純度と研究の難しさが改善する可能性がある。4-1BBタンパク質の場合、抗CD8抗体と抗4-1BB抗体とを用いて、抗原によって刺激されたCD8⁺T細胞の表面にしか発現せず、蛍光標識剤と結合されるマーカーについて染色した後に、両種の蛍光を有する抗原特異的CD8⁺T細胞が効率的に単離され得る。

前記のように、4-1BB⁺を発現するCD8⁺T細胞が自動セルソーターを用いて選択される調製方法は、EBV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、およびMAGE-A3などの癌抗原に特異的なCD8⁺T細胞の調製において使用され得る。前記のように、4-1BB⁺を発現するCD8⁺T細胞を、自動セルソーターを用いて選択する方法によって調製された薬学的組成物は、癌抗原特異的細胞傷害性T細胞の少なくとも90％(例えば、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％)を含む場合がある。

前記のように、4-1BB⁺を発現するCD8⁺T細胞が自動セルソーターを用いて選択される調製方法によって調製された薬学的組成物(例えば、EBV、CMV、hTERT、NY-ESO-1、WT1、またはMAGE-A3に特異的な細胞傷害性T細胞を含む組成物)は高純度の癌抗原特異的細胞傷害性T細胞を有し、従って、T細胞治療剤として優れた臨床有効性(例えば、抗癌有効性など)を有する。

本願に従う方法は、これらの単離された4-1BB⁺CD8⁺T細胞を大量増殖させる工程をさらに含む。

大量産生工程は、単離された癌抗原特異的CD8⁺T細胞と、放射線照射済み同種異系PBMCとを、IL-2、抗CD3抗体、および自家血漿を含む培地中で培養する工程を含んでもよい。一態様では、4-1BB⁺CD8⁺T細胞(5×10⁵〜3×10⁶個の細胞)と、1L培養容器(培養バックまたはG-Rex装置)中に単離された放射線照射済み同種異系PBMC(1×10⁸〜3×10⁸個の細胞)と、1000U/mL IL-2と、30ng 抗CD3 mAbとを混合し、7〜11日にわたって定期的に培地に添加し、次いで、癌患者に投与され得る1×10⁹細胞/Lを超えるレベルまで増殖させるように細胞を大量培養する。本発明の一態様では、約1×10⁶細胞/mL以上、約2×10⁶細胞/mL以上、約3×10⁶細胞/mL以上、約4×10⁶細胞/mL以上、約8×10⁶細胞/mL以上、約6×10⁶細胞/mL以上、約7×10⁶細胞/mL以上、約8×10⁶細胞/mL以上、約9×10⁶細胞/mL以上、約1×10⁷細胞/mL以上、約2×10⁷細胞/mL以上、約3×10⁷細胞/mL以上、約4×10⁷細胞/mL以上、約5×10⁷細胞/mL以上、約6×10⁷細胞/mL以上、約7×10⁷細胞/mL以上、約8×10⁷細胞/mL以上、約9×10⁷細胞/mL以上、約1×10⁸細胞/mL以上、約2×10⁸細胞/mL以上、約3×10⁸細胞/mL以上、約4×10⁸細胞/mL以上、約5×10⁸細胞/mL以上、約6×10⁸細胞/mL以上、約7×10⁸細胞/mL以上、約8×10⁸細胞/mL以上、または約9×10⁸細胞/mL以上の細胞が含まれるように、増殖が行われる。

本願に従う方法は、増殖された(拡大された)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を凍結させる工程を含む。

凍結させる工程は、共刺激分子の発現によって、前の工程において増殖された細胞の中から予め選択されているCD8⁺T細胞の数が、予め決められた細胞数/mLに達した時に凍結保存剤(例えば、DMSO)を添加することによって実施され得る。この予め決められた細胞数は、1×10⁶細胞/mL、2×10⁶細胞/mL、3×10⁶細胞/mL、4×10⁶細胞/mL、5×10⁶細胞/mL、6×10⁶細胞/mL、7×10⁶細胞/mL、8×10⁶細胞/mL、9×10⁶細胞/mL、1×10⁷細胞/mL、2×10⁷細胞/mL、3×10⁷細胞/mL、4×10⁷細胞/mL、5×10⁷細胞/mL、6×10⁷細胞/mL、7×10⁷細胞/mL、8×10⁷細胞/mL、または9×10⁷細胞/mLでもよい。しかしながら、必要に応じて、当業者は凍結時間を調節し得る。DMSOは、例えば、10％、7.5％、5％、または2.5％で添加される。共刺激分子を発現するCD8⁺T細胞は、例えば、共刺激分子が抗原刺激工程において発現した細胞でもよく、例えば、共刺激分子が増殖工程において発現した細胞でもよい。

本発明の一態様では、CD8⁺T細胞の数が、少なくとも予め決められた細胞数/mLである一方で、共刺激因子発現について選択されたCD8⁺T細胞の割合が、少なくとも予め決められた割合である時に、凍結させる工程は行われる。

この予め決められた細胞数は、1×10⁶細胞/mL、2×10⁶細胞/mL、3×10⁶細胞/mL、4×10⁶細胞/mL、5×10⁶細胞/mL、6×10⁶細胞/mL、7×10⁶細胞/mL、8×10⁶細胞/mL、9×10⁶細胞/mL、1×10⁷細胞/mL、2×10⁷細胞/mL、3×10⁷細胞/mL、4×10⁷細胞/mL、5×10⁷細胞/mL、6×10⁷細胞/mL、7×10⁷細胞/mL、8×10⁷細胞/mL、または9×10⁷細胞/mLでもよい。しかしながら、必要に応じて、当業者は凍結のタイミングを調節し得る。共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞のパーセントは、例えば、1％〜10％、10％〜20％、20％〜30％、30％〜40％、40％〜50％、50％〜60％、60％〜70％、70％〜80％、80％〜90％、または90％〜100％でもよい。この目標に向かって、本発明の一態様では、本発明による凍結工程は、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の数およびCD8⁺T細胞の割合を検出する工程を含んでもよい。本明細書において、この範囲内にある全ての数値が本明細書に開示されるとみなされる。

本願に従う方法は、凍結された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を解凍する工程を含む。

本願に従う方法は、解凍された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。例えば、解凍後の増殖工程は凍結前の増殖工程と同じやり方で行われてもよく、類似するやり方で行われてもよい。解凍後の増殖工程において、癌患者に投与され得るレベルまで増殖させるために、細胞は>1×10⁹細胞/mLのレベルで大量培養されてもよい。

本発明の一態様では、癌抗原は自己癌抗原、ウイルス癌抗原、または組織特異的癌抗原でもよい。

本発明の組成物は薬学的に有効な量のT細胞を含む。有効量は、本明細書における開示に基づいて当業者によって容易に決定され得る。一般的に、薬学的に有効な量は、最初に、低濃度の活性成分を投与し、次いで、対象において副作用が全くなく望ましい効果が得られるまで(例えば、癌に関連する症状が軽減するか、または無くなるまで)濃度を漸増することによって決定される。本発明による組成物を投与するのに適した投与量または投与間隔を決定する方法は、例えば、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005、およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005)に記載されている。

本発明に従って組成物を投与する方法は、対象の癌のタイプ、年齢、体重、性別、医学的状態、疾患の重篤度、投与経路、および別々に投与される他の薬物などの様々な要因に基づいて決定され得る。従って、投与方法は多種多様であるが、一般的に用いられる方法に従って決定され得る。

対象に投与される本発明による組成物の量は、投与方法、対象の健康状態、体重、および医学的助言などの非常に多くの要因によって決定され得る。これらの要因は全て当業者の知識の範囲内である。

本発明による癌抗原特異的細胞傷害性T細胞を含む、癌を予防または処置するための薬学的組成物は、約1×10⁶細胞/mL以上、約2×10⁶細胞/mL以上、約3×10⁶細胞/mL以上、約4×10⁶細胞/mL以上、約8×10⁶細胞/mL以上、約6×10⁶細胞/mL以上、約7×10⁶細胞/mL以上、約8×10⁶細胞/mL以上、約9×10⁶細胞/mL以上、約1×10⁷細胞/mL以上、約2×10⁷細胞/mL以上、約3×10⁷細胞/mL以上、約4×10⁷細胞/mL以上、約5×10⁷細胞/mL以上、約6×10⁷細胞/mL以上、約7×10⁷細胞/mL以上、約8×10⁷細胞/mL以上、約9×10⁷細胞/mL以上、約1×10⁸細胞/mL以上、約2×10⁸細胞/mL以上、約3×10⁸細胞/mL以上、約4×10⁸細胞/mL以上、約5×10⁸細胞/mL以上、約6×10⁸細胞/mL以上、約7×10⁸細胞/mL以上、約8×10⁸細胞/mL以上、または約9×10⁸細胞/mL以上を含んでもよいが、当業者は、細胞傷害性T細胞の濃度を、同じ効果が得られる可能性がある範囲内に調節し得る。

癌抗原は、OY-TES-1、hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1、PSMA、TARP、メソテリン、チロシナーゼ、GP100、MNRT-1、PAP、PSA、CMV、HCV、HBV、MCポリオーマウイルス、HPV、およびEBVからなる群より選択される少なくとも1つである。本発明の一態様では、癌抗原は、hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1、およびEBVからなる群より選択されてもよい。

本発明に開示される「組成物」とは、活性成分である本発明による細胞傷害性T細胞と、不活性成分、例えば、天然または人工の担体、標識、または検出器、活性成分、例えば、アジュバント、希釈剤、カップリング剤、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、および防腐剤との組み合わせを指し、薬学的に許容される担体を含む。担体はまた、1〜99.99wt％またはvol％で、薬学的賦形剤、ならびにさらなるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物(例えば、単糖;二糖;三糖;四糖;オリゴ糖;アルジトール、アルドン酸、糖由来多糖類、例えば、エステル化糖、または糖重合体など)を、単独で、または組み合わせて含んでもよい。タンパク質賦形剤には、例えば、ヒト血清アルブミン、組換えヒトアルブミン、ゼラチン、カゼインなどが含まれるが、これに限定されない。緩衝液の役割を果たし得る代表的なアミノ酸成分には、例えば、アラニン、アルギニン、グリシン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれるが、これに限定されない。炭水化物賦形剤には、例えば、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボース;二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース;多糖類、例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン、およびデンプン;ならびにアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール、およびミオイノシトールも含まれるが、これに限定されない。

当業者は、当技術分野において公知の方法によって本発明の薬学的組成物を処方することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、必要に応じて、水または別の薬学的に許容される液体を用いた滅菌溶液または滅菌懸濁液の注射液の形で非経口的に使用され得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または媒体、特に、滅菌水または食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などと適切に組み合わされ得る。本発明の薬学的組成物は、一般に認められている薬務によって求められる単位剤形で混合することによって処方され得る。製剤中に使用される活性成分の量は、示された範囲の適切な投与量が得られる可能性がある量である。

さらに、注射用の滅菌組成物が、賦形剤液体、例えば、注射用蒸留水を用いて、従来の処方操作に従って処方され得る。注射用水溶液として、例えば、生理食塩水;グルコースまたは他の補助剤、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、および適切な溶解補助剤、例えば、アルコール、特に、エタノール、および多価アルコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールを含有する等張溶液;ならびに非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート80(商標)、HCO-50の組み合わせが使用され得る。油性液体は、例えば、ゴマ油およびダイズ油を含み、溶解補助剤である安息香酸ベンジルおよびベンジルアルコールと組み合わせて使用され得る。

注射製剤は、例えば、静脈内注射、動脈内注射、選択的動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、室内注射、頭蓋内注射、髄内注射などによって投与されてもよい。しかしながら、好ましくは、注射製剤は静脈内注射によって投与される。

これはまた、緩衝液、例えば、リン酸緩衝溶液または酢酸ナトリウム緩衝溶液;鎮痛薬、例えば、塩酸プロカイン;安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、および抗酸化物質と組み合わされてもよい。調製された注射溶液は、通常、適切なアンプルに充填される。

懸濁液およびエマルジョンは、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してもよい。活性化合物と一緒になる、筋肉内注射用の懸濁液または溶液は、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えば、プロピレングリコール、および必要に応じて、適量の塩酸リドカインである。

本発明による細胞傷害性T細胞を含む薬学的組成物は、対象に、例えば、静脈注射(ボーラス注入)または連続注入によって投与されてもよい。例えば、本発明による薬学的組成物は、連続して、または指定された時間間隔で、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月にわたって、または臨床判断によって決定された間隔で、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、または少なくとも5回投与されてもよい。注射調製物はアンプルの形で処方されてもよく、複数回投与容器を用いて単位剤形で処方されてもよい。しかしながら、当業者は、本発明による薬学的組成物の投与量が、対象の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、および以前の治療歴などの様々な要因に応じて変化することがあることを理解する。

本発明による薬学的組成物は徐放型で処方されることがあり、徐放製剤は、投与しようとする細胞傷害性T細胞と複合体化され得るか、または投与しようとする細胞傷害性T細胞を含有し得るポリマーを用いて調製することができる。例えば、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)のマトリックス、またはステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが生合成多量体として使用されることがある。

本明細書で使用する「癌」という用語は、異常な、制御されていない細胞増殖によって引き起こされる、非常に多くの、あらゆる疾患または障害を指す。癌の原因となる可能性がある細胞は癌細胞と呼ばれ、制御されていない増殖、不死性、転移能力、急速な成長および増殖などの独特の類型学的特徴を有する。多くの場合、癌細胞は腫瘍の形をとることがあるが、このような細胞は個々に哺乳動物に存在してもよく、白血病細胞などの非腫瘍細胞でもよい。癌は、腫瘍の存在を検出するために臨床方法または放射線学的方法によって検出されてもよく、腫瘍または生検などの手段によって得られた他の生物学的試料に由来する細胞を試験することによって検出されてもよく、CA125、PAP、PSA、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、LDH、およびNSEなどの癌血液マーカーを検出することによって検出されてもよく、TP53およびATMなどの癌マーカー遺伝子型を検出することによって検出されてもよい。しかしながら、上記の方法による陰性の発見は、必ずしも非癌診断を意味するわけではない。例えば、癌から完全に回復したことが判明している対象でも癌がある場合がある。これは再発という形で確認される。

本明細書で使用する「約」という用語は、当技術分野において一般的に用いられる範囲内、例えば、平均の2標準偏差の範囲内だと理解され得る。「約」は、述べられた値の50％以内、45％以内、40％以内、35％以内、30％以内、25％以内、20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、または0.01％以内を意味すると理解され得る。

さらに、注射用の滅菌組成物が、賦形剤液体、例えば、注射用蒸留水を用いて従来の処方操作に従って処方され得る。注射用水溶液として、例えば、生理食塩水;グルコースまたは他の補助剤、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、および適切な溶解補助剤、例えば、アルコール、特に、エタノール、および多価アルコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールを含有する等張溶液;ならびに非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート80(商標)、HCO-50の組み合わせが使用され得る。油性液体は、例えば、ゴマ油およびダイズ油を含み、溶解補助剤である安息香酸ベンジルおよびベンジルアルコールと組み合わせて使用され得る。

本明細書で使用する「癌」という用語は、異常な、制御されていない細胞増殖によって引き起こされる、非常に多くの、あらゆる疾患または障害を指す。癌の原因となる可能性がある細胞は癌細胞と呼ばれ、制御されていない増殖、不死性、転移能力、急速な成長および増殖などの独特の類型学的特徴を有する。多くの場合、癌細胞は腫瘍の形をとることがあるが、このような細胞は個々に哺乳動物に存在してもよく、白血病細胞などの非腫瘍細胞でもよい。癌は、腫瘍の存在を検出するために臨床方法または放射線学的方法によって検出されてもよく、腫瘍または生検などの手段によって得られた他の生物学的試料に由来する細胞を試験することによって検出されてもよく、CA125、PAP、PSA、CEA、AFP、HCG、CA19-9、CA15-3、CA27-29、LDH、およびNSEなどの癌血液マーカーを検出することによって検出されてもよく、TP53およびATMなどの癌マーカー遺伝子型を検出することによって検出されてもよい。しかしながら、上記の方法による陰性の発見は必ずしも非癌診断を意味するわけではない。例えば、癌から完全に回復したことが判明している対象でも癌がある場合がある。これは再発という形で確認される。

本発明において、確認試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.24(フローサイトメトリー)に従って行われ、CD8⁺T細胞の少なくとも65％が確認され、CD8⁺T細胞の少なくとも80％にCD45ROマーカーがあると確認された場合に確認がなされたとみなされる。

本発明において、純度試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.24(フローサイトメトリー)に従って行われ、CD8⁺T細胞の中のCD45RAのパーセントは20％以下に設定され、CD57の比率は35％以下に設定され、PD-1は20％以下に設定される。

本発明における細胞機能試験または効力試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.24(フローサイトメトリー)に従って試験され、CD8⁺T細胞におけるIFN-γ発現率は少なくとも10％である。または、本発明における細胞機能試験または効力試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.24(フローサイトメトリー)に従って試験され、CD8⁺T細胞におけるLAMP1発現率は10％以上である。

本発明における細胞生存率試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.29(有核細胞数および生存率)における手操作による色素排除法(dye-exclusion method)に従って行われ、生細胞の割合は少なくとも70％である。

本発明において、総細胞数試験は、好ましくは、欧州薬局方2.7.29(有核細胞数および生存率)における手操作による色素排除法に従って行われ、完成品100mL中にある細胞数は1.4×10⁹細胞/100mL±20％(1.12〜1.68×10⁹細胞/100mL)である。

本発明では、品質試験は、好ましくは、細胞治療剤の未加工の薬物および完成した薬物を対象にした規格および試験方法に定められている試験によって確かめることができるが、必ずしも、関連する規制またはガイドラインによって確かめられる必要があるわけではない。

本明細書で使用する「抗癌」という用語は「予防」および「処置」を包含する。「予防」とは、本発明の抗体を含む組成物を投与することによって癌が阻害されるか、または遅延する任意の行為を意味する。「処置」とは、本発明の抗体を投与することによって癌の症状を改善するか、または有利に変える任意の行為を意味する。

本明細書中、以下において、本発明は以下の態様に関連して詳細に説明される。これらの態様は、本発明をもっと具体的に例示することを目的とし、本発明の範囲を限定しない。

実施例1:本願の方法に従うEBV特異的CD8⁺T細胞治療剤の試験的産生(20日プロセス)
1-1.EBV特異的CD8⁺T細胞の増殖
PBMCを以下の通りにEBV陽性健常個体の血液から単離した。10mLの血液を、5mL フィコール(GE Healthcare, Ficoll paque plus, 17144002)を充填した15mLチューブの中にゆっくりと流し込み、フィコール溶液の上にかぶせた。チューブを室温および800×gで20分間(ブレーキ速度:0)遠心分離した。フィコールと血漿の間にある白色の層だけを回収し、洗浄し、PBMCとして使用した。自己血漿(autoplasma)(自家血漿)を、PBMCの上にある薄い黄色の層から単離し、フィルターで濾過した後に使用した。

単離したPBMCを、3％自家血漿を含むCTL培地(WELGENE, LM011-77)に1×10⁶細胞/mLで懸濁し、EBVペプチド(Peptron)を2μg/mLの濃度に達するように添加した。細胞懸濁液を14mLラウンドチューブ(round tube)に、それぞれ1mLで分注し、CO₂インキュベーター(Nuaire, NU-5841)に入れてインキュベーションを開始した。

培養して2日目に、100IU/mL IL-2(Novartis, Proleukin)と3％自家血漿を含むCTL培地1mLを各チューブに添加した。培養して7日目に、1mLの培地上層を除去し、100IU/mL IL-2と3％自家血漿を含む新鮮なCTL培地1mLを添加し、さらに2日間インキュベートした。

1-2.EBV特異的CD8⁺T細胞の選択的単離
培養して9日目に、培養中のPBMCを回収し、RPMI培地(WELGENE, LM011-01)で洗浄した。洗浄したPBMCを、抗4-1BB抗体(Biolegend, 309818)および抗CD8抗体(Biolegend, 560347)で、4℃で30分間染色し、次いで、RPMI培地で再洗浄した。染色後に洗浄したPBMCを、4-1BBおよびCD8を発現する細胞からフローサイトメーター(BD Biosciences, FACSMelody)を用いて選択的に単離した。選択的に単離した細胞をRPMI培地で洗浄し、自動セルカウンター(Logos Biosystems, LUNA-FL)を用いて計数した。単離した細胞を、ALyS505N培地(CELL SCIENCE & TECHNOLOGY INSTITUTE INC., 1020P10)を用いて懸濁した後に、以下の工程を行った。

1-3.抗原特異的CD8⁺T細胞の大量培養
細胞死を誘導するために正常ドナー血液に放射線照射し、PBMCを単離し、1×10⁷細胞/mLで懸濁し、凍結させた。T細胞の増殖を誘導するのに必要な同時刺激を与えるために、放射線照射済みPBMC(同種異系PBMC)を培養添加物として使用した。次いで、単離した同種血漿(alloplasma)を、PBMCの上層に接している薄い黄色の層から分離し、フィルターを用いて濾過し、次いで、使用した。

50mLチューブ中に、選択的に単離したEBVペプチド特異的CD8⁺T細胞と、単離した細胞の数の200倍で調製した放射線照射済み同種異系PBMCとを、3％同種血漿を含むALys505N培地30mLに懸濁した。これに、1,000IU/mL IL-2と30ng/mL抗CD3抗体(BD Biosciences, 555336)を添加した。次いで、細胞懸濁液30mLを75Tフラスコに入れ、CO₂インキュベーターに入れてインキュベーションを開始した。

培養して3日目に、1,000IU/mL IL-2、3％同種血漿を含むALys505N培地20mLを75Tフラスコに添加した。培養して5〜11日目に、2〜3日の間隔で、1,000IU/mL IL-2、3％同種血漿を含む等量のALys505N培地を添加した。培養して11日目に全ての培養細胞を回収した。

実施例2:本願の方法に従うEBV特異的CD8⁺T細胞治療剤の試験的産生(26日プロセス)
2-1.EBV特異的CD8⁺T細胞の増殖
実施例1の1-1プロセスを全く同じに実施した。

2-2.EBV特異的CD8⁺T細胞の選択的単離
培養して14日目に、培養物中のPBMCを回収し、RPMI培地で洗浄した。洗浄したPBMCを、自動セルカウンターを用いて計数し、細胞をCTL培地に懸濁して、それぞれ2×10⁶細胞/mLでインキュベートした。3％自己血漿と100IU/mL IL-2をCTL培地に添加し、これに細胞を懸濁し、次いで、懸濁した細胞を24ウェルプレートの各ウェルに1mLにつき2×10⁶個の細胞で入れた。培養の初日に添加するEBVペプチドを2μg/mLの濃度に達するように添加し、CO₂インキュベーターに入れてインキュベートした。

培養して15日目に、培養物中のPBMCを回収し、RPMI培地で洗浄した。洗浄したPBMCを、抗4-1BB抗体および抗CD8抗体で、4℃で30分間染色し、次いで、RPMI培地で再洗浄した。染色後に洗浄したPBMCを、4-1BBおよびCD8を発現する細胞から自動セルソーターを用いて選択的に単離した。選択的に単離した細胞をRPMI培地で洗浄し、自動セルカウンターを用いて細胞を計数した。単離した細胞を、ALyS505N培地を用いて懸濁し、次いで、以下の工程を行った。

2-3.抗原特異的CD8⁺T細胞の大量培養
細胞死を誘導するために正常ドナー血液に放射線照射し、PBMCを単離し、1×10⁷細胞/mLで懸濁し、次いで、凍結させ、保管した。T細胞の増殖を誘導するのに必要な同時刺激を与えるために、放射線照射済みPBMC(同種異系PBMC)を培養添加物として使用した。次いで、単離した同種血漿を、PBMCの上層に接している薄い黄色の層から分離し、フィルターを用いて濾過し、次いで、使用した。

50mLチューブ中に、選択的に単離したEBVペプチド特異的CD8⁺T細胞と、単離した細胞の数の200倍で調製した放射線照射済み同種異系PBMCとを、3％同種血漿を含むALys505N培地30mLに懸濁した。これに、1,000IU/mL IL-2と30ng/mL抗CD3抗体を添加した。次いで、細胞懸濁液30mLを75Tフラスコに入れ、CO₂インキュベーターに入れてインキュベーションを開始した。

前記のように、26日プロセスで産生された抗原特異的CD8⁺T細胞の確認および純度試験の結果から、表1に示した全ての基準を満たしたことが確認された。

さらに、以下の表に示したように、効力試験結果から、表1の効力試験基準を満たしたことが確認された。

実施例3:20日プロセスの15日目の半完成細胞の凍結
全プロセスの15日目に大量培養細胞の半分を収集し、RPMI培地で洗浄し、自動セルカウンターを用いて計数した。上清を除去するために、細胞を室温、1,800rpmで5分間遠心分離し、5×10⁵細胞/mLで分割し、次いで、CS-5凍結用培地(Biolife solution, 205102)に懸濁した。5×10⁵細胞/mLで細胞凍結用チューブに入れられていた細胞を細胞凍結用容器(Biocision, BCS-170)に入れ、-80℃ディープフリーザー(ThermoFisher, IU28886D)に入れて1日保管した。再度、凍結細胞を1日取り出し、有効期限まで-196℃液体窒素タンク(Chart, 10650197)に入れて保管した。

実施例4:20日プロセス完成品の凍結
インキュベーションが終了したら、全ての培養細胞を回収し、RPMI培地で洗浄し、自動セルカウンターを用いて計数した。2×10⁷個の細胞を取っておき、T細胞治療剤の品質を試験するための表現型分析および有効性試験に使用した。残った細胞を5mLのCS-5凍結用培地に懸濁し、自動セルカウンターを用いて計数し、凍結のために3×10⁷細胞/mLと5×10⁶細胞/mL細胞で50mLチューブに入れて分割した。3×10⁷細胞/mLと5×10⁶細胞/mLで細胞凍結用チューブに入っている細胞を細胞凍結用容器に入れ、-80℃極低温冷凍庫に1日入れた。1日凍結された細胞を再度取り出し、有効期限まで-196℃液体窒素タンクに入れて保管した。

実施例5:26日プロセスの完成品の凍結
インキュベーションが終了したら、全ての培養細胞を回収し、RPMI培地で洗浄し、自動セルカウンターを用いて計数した。2×10⁷個の細胞を取っておき、T細胞治療剤の品質を試験するための表現型分析および有効性試験に使用した。残った細胞を5mLのCS-5凍結用培地に懸濁し、自動セルカウンターを用いて計数し、凍結のために3×10⁷細胞/mLと5×10⁶細胞/mL細胞で50mLチューブに入れて分割した。3×10⁷細胞/mLと5×10⁶細胞/mLで細胞凍結用チューブに入っている細胞を細胞凍結用容器に入れ、-80℃極低温冷凍庫に1日入れた。1日凍結された細胞を再度取り出し、有効期限まで-196℃液体窒素タンクに入れて保管した。

実施例6:凍結細胞の解凍
6-1.20日プロセスによって調製されたT細胞治療剤の凍結後の解凍
196℃液体窒素タンクに保管した細胞を取り出し、細胞を37℃恒温ウォーターバス(WB-2, Daehan Science Ltd., DH.WB000122)に2分30秒〜3分間浸漬することで解凍した。解凍した細胞を15mLチューブに移し、自動セルカウンターを用いて計数し、解凍した細胞の細胞数および生存率をチェックした。10mLの温かいRPMI培地を、解凍した細胞の上にゆっくりとかぶせた。上清を除去するために、チューブを室温、1,800rpmで5分間遠心分離し、細胞を1mLのALys505N培地に懸濁した。1mLに懸濁した細胞の数および生存率を、自動セルカウンターを用いて再計数し、必要とされる細胞数を使用した。

実施例1の手順を実施し、2週間後、4週間後、8週間後、および12週間後に、実施例4の手順によって凍結させた細胞を前記のように解凍し、回収率および生存率を測定した。さらに、検証、純度、および効力試験を行った。

20日完成品を解凍した時に、以下の表2に示したように、少なくとも64％の回収率が確認され、最低の生存率が約77.0％だと見出された。

さらに、以下の表3に示したように、検証および純度試験の結果から、各基準の全てに合格したことが確認された。

上記の実験に加えて、効力試験の結果が各基準に合格したことも確認された(表4)。

6-2.26日プロセスによって調製されたT細胞治療剤の凍結後の解凍
実施例2の手順を実施し、2週間後および4週間後に、実施例5の手順によって凍結させた細胞を実施例6の手順に供して、回収率および生存率を測定した。さらに、検証、純度、および効力試験を行った。

26日完成品を解凍した時に、以下の表5に示したように80％回収率が確認され、生存率は少なくとも91％だった。

さらに、検証および純度試験結果から、以下の表6に示したように内部基準に合格したと確認された。

効力試験結果は、以下の表7に示したように各基準に合格したことも確認された。

実施例7:凍結細胞を用いた大量培養プロセス
細胞死を誘導するために正常ドナー血液に放射線照射し、PBMCを単離し、1×10⁷細胞/mLで懸濁し、次いで、凍結させ、保管した。T細胞の増殖を誘導するのに必要な同時刺激を与えるために、放射線照射済みPBMC(同種異系PBMC)を培養添加物として使用した。

細胞を、上記の実施例6の凍結細胞解凍方法に従って解凍し、計数し、3％同種血漿を含むALys505N培地30mLに懸濁した。これに、同種異系PBMCで放射線照射した細胞を、解凍した細胞の数の200倍の量で添加し、1,000IU/mL IL-2と30ng/mL抗CD3抗体を添加した。添加物が添加されている細胞を全て75Tフラスコに移し、CO₂インキュベーターに入れてインキュベートした。培養して3日目に、1,000IU/mL IL-2および3％同種血漿を含むALys505N培地20mLを75Tフラスコに添加した。培養して5日目に、1,000IU/mL IL-2、3％同種血漿を含むALys505N培地50mLを75Tフラスコに添加した。培養して7日目に、1,000U/mL IL-2、3％同種血漿を含むALys505N培地100mLを調製し、培養細胞と一緒に175Tフラスコに移した。培養して9日目に、1,000U/mL IL-2、3％同種血漿を含むALys505N培地200mLを添加し、2つの175Tフラスコに入れて培養した。培養して11日目に全ての培養細胞を回収した。

実施例3の手順を実施して1ヶ月後、2ヶ月後、および3ヶ月後に、実施例7の手順を実施した時に、以下の表8に示したように細胞生存率は大量培養後に少なくとも92％だと確認された。細胞増殖は少なくとも4800倍に達したことが見出された。

さらに、以下の表9に示したように、検証および純度試験から全て各基準に合格したことが分かった。

さらに、以下の表10に示したように、効力試験の結果から、各基準の全てに合格したことが分かった。

実施例4の手順を実施した後に、4週間後、8週間後、および12週間後に実施例7の手順を実施した時に、以下の表に示したように細胞生存率は大量培養後に89％以上だと確認された。細胞増殖は少なくとも175倍に達したことが見出された。

さらに、以下の表12に示したように、検証および純度試験から、各基準の全てに合格したことが分かった。

さらに、以下の表13に示したように、効力試験の結果も各基準に合格した。

例えば、特許請求の範囲を作成する目的で、以下に示された特許請求の範囲が、いかなる方法によっても、その文字通りの言葉よりも狭く解釈されることは意図されず、従って、本明細書からの例示的な態様が、特許請求の範囲の意味に読み取られることは意図されない。従って、本発明は例示として説明され、特許請求の範囲を限定するものとして説明されないと理解しなければならない。従って、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本願において引用された全ての刊行物、発行された特許、特許出願、書籍、および学術論文はそれぞれ、その全体が参照により本願に組み入れられる。

Claims

(a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む、癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
(e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
癌抗原が、hTERT、NY-ESO1、MAGE-A3、WT1、およびEBVからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
工程(b)が閉鎖系フローサイトメーターを用いて行われる、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
工程(d)において、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の数が、1mLあたりの予め決められた細胞数より多い場合またはそれと等しい場合に、凍結が行われる、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
工程(d)において、CD8⁺T細胞の数が、少なくとも1mLあたりの予め決められた細胞数であり、かつ共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の割合が、少なくとも予め決められた比率である場合に、凍結が行われる、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
工程(d)が、CD8⁺T細胞の数と、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞の割合とを検出する工程を含む、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
(f)工程(e)において得られたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程をさらに含む、請求項2記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
共刺激因子が、CD28、CTLA-4、ICOS、PD1、BTLA、HVEM、CD27、OX40、4-1BB、CD30、およびSLAMからなる群より選択される1つまたは複数である、請求項1記載の癌抗原特異的CD8⁺T細胞を調製する方法。
(a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む、癌処置組成物を調製する方法。
(e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項10記載の癌処置組成物を調製する方法。
(a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む工程によって調製された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含む、癌処置組成物。
(e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項12記載の癌処置組成物。
(a)癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含むPBMCの中からCD8⁺T細胞を活性化し、次いで、該CD8⁺T細胞の共刺激因子を発現させる工程;
(b)工程(a)において活性化された細胞の中から、共刺激因子を発現するCD8⁺T細胞を選択する工程;
(c)工程(b)において選択されたCD8⁺T細胞の数を増加させる工程;および
(d)工程(c)において得られたCD8⁺T細胞を凍結させる工程
を含む工程によって調製された癌抗原特異的CD8⁺T細胞を含む、薬学的に有効な量の癌処置組成物
を投与する工程を含む、癌処置方法。
(e)工程(d)において凍結されたCD8⁺T細胞を解凍する工程をさらに含む、請求項14記載の癌処置方法。