JP2021192616A

JP2021192616A - Ｃ／ＥＢＰアルファｓａＲＮＡ組成物および使用方法

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Publication number: JP2021192616A
Application number: JP2021132267A
Authority: JP
Inventors: ワグナー、アンドレアス; Wagner Andreas; ハビブ、ロバート; Habib Robert; イー．フーバー、ハンス; E Huber Hans; セトロム、ポール; Setrom Pal; バッケンストブナー、エンドレ; Bakken Stovner Endre; ホスバッハ、マルクス; Hossbach Markus; クランパート、モニカ; Krampert Monika; ボーンロッハー、ハンス−ペーター; Vornlocher Hans-Peter
Original assignee: Mina Therapeutics Ltd
Current assignee: Mina Therapeutics Ltd
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2021-12-23
Also published as: SG11201707683YA; WO2016170349A1; AU2019210578B2; KR20230156961A; KR102760315B1; CN108291228A; JP2021000119A; AU2016251415A1; EP3286316A1; KR102599712B1; US20200376020A1; CN114525279A; JP6768701B2; AU2016251415B9; US20210187007A1; JP2024079713A; US10912790B2; JP6931733B2; KR20170136542A; AU2019210578A1

Abstract

【課題】Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡおよび前記ｓａＲＮＡを含む治療用組成物を提供する。【解決手段】合成ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成ｓａＲＮＡであって、配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、１４〜３０ヌクレオチドを有する。【選択図】図３

Description

本発明は、ポリヌクレオチド、特にｓａＲＮＡと、Ｃ／ＥＢＰαおよびＣ／ＥＢＰα経路をモジュレートするための組成物と、代謝障害、過増殖疾患を治療したり幹細胞系列をレギュレートしたりするなど、この組成物を治療用途に使用する方法とに関する。

ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃｓ／ＥＢＰアルファ、Ｃ／ＥＢＰＡ、またはＣＥＢＰＡ）は、ヒトおよびラットにわたり保存されるロイシンジッパータンパク質である。この核転写因子は、肝細胞、骨髄単球、脂肪細胞、さらには他のタイプの乳腺上皮細胞に多く含まれる（非特許文献１）。それは、Ｎ末端部の２つのトランス活性化ドメインと、Ｃ末端部の他のＣ／ＥＢＰファミリーメンバーとの二量化を媒介するロイシンジッパー領域およびＤＮＡ結合ドメインとで構成される。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持および傷害への反応に関与する多くの遺伝子のプロモータ領域に存在する。Ｃ／ＥＢＰαは、免疫および炎症反応、発生、細胞増殖、抗アポトーシス、ならびにいくつかの代謝経路に関与するいくつかの肝臓特異的遺伝子の転写に対して多面発現効果を有する（非特許文献２）。それは肝細胞の分化状態の維持に不可欠である。それはアルブミン転写を活性化すると共に、尿素産生に関与する複数のオルニチン回路酵素をコードする遺伝子の発現を調整するため、正常な肝機能に重要な役割を果たす。

成体肝臓では、Ｃ／ＥＢＰαは、最終分化肝細胞で機能することが明らかにされているが、急速増殖肝腫細胞は、Ｃ／ＥＢＰαの一部のみを発現する（非特許文献３）。Ｃ／ＥＢＰαは、レチノブラストーマのアップレギュレーションとＣｄｋ２およびＣｄｋ４の阻害とを介する細胞増殖の強い阻害剤であるｐ２１をアップレギュレートすることが知られている（非特許文献４、非特許文献５）。肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）では、Ｃ／ＥＢＰαは、抗増殖性を有する腫瘍サプレッサーとして機能する（非特許文献６）。

Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレーションを研究するためにさまざまな方法が行われている。Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、翻訳後のリン酸化およびＳＵＭＯ化によりレギュレートされることが知られている。たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤および細胞外シグナル調節キナーゼ１および／または２（ＥＲＫ１／２）は、Ｃ／ＥＢＰαのセリン２１リン酸化をブロックすることによりＣ／ＥＢＰαタンパク質の顆粒球分化能を増加させる（非特許文献７、非特許文献８）。加えて、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−酸（ＣＤＤＯ）によりＣ／ＥＢＰα翻訳を効率的に誘導可能であり、これによりＣ／ＥＢＰαタンパク質アイソフォームの比がｐ３０形よりも全長ｐ４２形に有利に変化するために顆粒球分化が誘導される（非特許文献９）。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子は、染色体１９ｑ１３．１に位置するイントロンレス遺伝子である。ほとんどの真核細胞は、遺伝子発現をレギュレートするための機序としてＲＮＡ相補性を使用する。一例は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡを用いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）により遺伝子発現をノックダウンするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）経路である。現在では、低分子二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子のプロモータ領域を標的としてこの遺伝子の転写活性化を媒介する能力を有することが確証されており、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ：ＲＮＡａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）、または低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）と呼ばれてきた（非特許文献１０）。

レクストロム−ハイムズ（Ｌｅｋｓｔｒｏｍ−Ｈｉｍｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．）、１９９８年、第２７３巻、ｐ．２８５４５〜２８５４８ダーリントン（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ）ら著、カレント・オピニオン・オブ・ジェネティック・ディベロップメント（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｏｆＧｅｎｅｔｉｃＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１９９５年、第５巻、第５号、ｐ．５６５〜５７０ウメク（Ｕｍｅｋ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５１巻、ｐ．２８８〜２９２ティムケンコ（Ｔｉｍｃｈｅｎｋｏ）ら著、ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、１９９６年、第１０巻、ｐ．８０４〜８１５ワング（Ｗａｎｇ）ら著、モレキュラー・セル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ）、２００１年、第８巻、ｐ．８１７〜８２８イアコバ（Ｉａｋｏｖａ）ら著、セミナーズ・イン・キャンサー・バイオロジー（ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣａｎｃｅｒＢｉｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第２１巻、第１号、ｐ．２８〜３４ラドムスカ（Ｒａｄｏｍｓｋａ）ら著、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）、２００６年、第２０３巻、第２号、ｐ．３７１〜３８１ロス（Ｒｏｓｓ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、２００４年、第２４巻、第２号、ｐ．６７５〜６８６コシュミーダ（Ｋｏｓｃｈｍｉｅｄｅｒ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００７年、第１１０巻、第１０号、ｐ．３６９５〜３７０５リー（Ｌｉ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００６年、第１０３巻、ｐ．１７３３７〜１７３４２

遺伝子のｓａＲＮＡ誘導活性化は、マウス、ラット、および非ヒト霊長動物をはじめとする他の哺乳動物種で保存され、遺伝子の内因性アップレギュレーションの効果を研究するための普及した方法に急速になりつつある。したがって、ｓａＲＮＡを用いて治療目的でＣ／ＥＢＰαの標的化モジュレーションを行う必要性が存在する。

本発明は、診断および予後予測を含めて治療目的でＣ／ＥＢＰα遺伝子発現および／または機能をモジュレートする低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）分子の設計、調製、製造、形成、および／または使用のための組成物、方法、およびキットを提供する。

本発明の一態様は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡと少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のさらに他の態様は、幹細胞とＣ／ＥＢＰα転写物を標的とするｓａＲＮＡとを接触させる工程を含む、幹細胞分化および多能性をレギュレートする方法を提供する。

本発明の種々の実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に例示される本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになろう。図中、同一の参照文字は異なる図全体を通じて同一の部分を意味する。図面は、必ずしも原寸通りとは限らず、その代わりに本発明の種々の実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。

肝臓に対するＣ／ＥＢＰαの一次作用を示す図。脂肪組織に対するＣ／ＥＢＰαの二次作用を示す図。本発明のｓａＲＮＡの機能に関与する核酸部分の関係を例示する概略図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるアルブミンのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるアルブミンのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるアルブミンのアップレギュレーションを示す図。ＨＣＣ細胞パネルにおけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるアルブミンのアップレギュレーションを示す図。修飾ｓａＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ＤＵ１４５細胞におけるＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルを示す図。トランスフェクション対照としてＡｈａ１ｍＲＮＡレベルを示す図。ＣＥＢＰＡ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ＦｌｕｃでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ＡｈＡ−１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＡｈＡ−１ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ｓａＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ｓａＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。ｓａＲＮＡでトランスフェクトされたＤＵ１４５細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに規格化して示す図。発現レベルを示す図。非増殖培地中の肝細胞におけるＡｈＡ１、アルブミン、およびＣＥＢＰＡの相対発現レベルを示す。発現レベルを示す図。増殖培地中の肝細胞におけるＡｈＡ１、アルブミン、およびＣＥＢＰＡの相対発現レベルを示す。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトした後のＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＰＬＣＰＲＦ５細胞におけるＣ／ＥＢＰ−αタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットを示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトした後のＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＰＬＣＰＲＦ５細胞における相対ＣＥＢＰＡｍＲＮＡ発現（^＊＊＊ｐ＝０．０００２、^＊＊ｐ＝０．００１２）を示す図。ＨＥＰ３Ｂ細胞系におけるＡＷ５１のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す図。ＨＥＰＧ２細胞系におけるＡＷ５１のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す図。ＰＬＣＰＲＦ５細胞系におけるＡＷ５１のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す図。ＨＥＰ３Ｂ細胞におけるＡＷ５１のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞数アッセイの結果を示す図。ＨＥＰＧ２細胞におけるＡＷ５１のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞数アッセイの結果を示す図。ＰＬＣＰＲＦ５細胞におけるＡＷ５１のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞数アッセイの結果を示す図。ＨｕＨ７細胞で測定されたＡＷ５１オフターゲットを示す図。Ｐａｎｃ−１細胞で測定されたＡＷ５１オフターゲットを示す図。非特異的対照（ＮＣ−５０００００）、非修飾ＡＷ１−５１配列、内部配列突然変異ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１０５００）、ＳＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１２）、およびＡＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１３）、または両鎖修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１４）でトランスフェクトされた細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡのレベルを示す図。非特異的対照（ＮＣ−５０００００）、非修飾ＡＷ１−５１配列、内部配列突然変異ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１０５００）、ＳＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１２）、およびＡＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１３）、または両鎖修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１４）でトランスフェクトされた細胞におけるアルブミンｍＲＮＡのレベルを示す図。一次ヒト肝細胞においてＣＥＢＰＡ５１がＣＥＢＰＡをアップレギュレートすることを実証する図。一次ヒト肝細胞においてＣＥＢＰＡ５１がアルブミン分泌を増加させることを実証する図。Ａｈａ１レベルを示す図。Ａｈａ１ｓｉＲＮＡは、一次細胞におけるトランスフェクション効率を決定するための陽性対照として使用した。統計的有意性は、すべて９５％信頼区間でノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定に従う。ＣＥＢＰＡ５１でトランスフェクトされた培養一次ヒト肝細胞の培地のアルブミンＥＬＩＳＡの結果を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ａ）アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）の転写レベルの相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ｂ）アルブミンの転写レベルの相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ｃ）シトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の転写レベルの相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ｄ）オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の転写レベルの相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ｅ）肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４Ａ）の相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトされた一次ヒト肝細胞において検出された（Ｆ）ＣＥＢＰＡの転写レベルの相対発現を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１の２回目のトランスフェクションの２４時間後のカニクイザル（ＣＹＮＯＭ−Ｋ１）線維芽細胞におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡ発現を示す図。ラット血漿中のＣＥＢＰＡ−５１の安定性を示す図。ヒト血漿中のＣＥＢＰＡ−５１の安定性を示す図。カニクイザル血漿中のＣＥＢＰＡ−５１の安定性を示す図。ラット血漿中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性を示す図。ヒト血漿中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性を示す図。カニクイザル血漿中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性を示す図。１．５ｍｇ／ｋｇＣＥＢＰＡ５１のＩＶ投与後のラット血漿中のＣＥＢＰＡ５１および代謝物／不純物の平均濃度を示す図。１．５ｍｇ／ｋｇＣＥＢＰＡ５１のＩＶ投与後のラット血漿中のインタクトＣＥＢＰＡ５１の平均濃度を示す図。投与の０．５時間後、インタクトＣＥＢＰＡ５１の濃度は検出限界未満である。２．１７５ｍｇ／ｋｇＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＩＶ投与後のラット血漿中のＣＥＢＰＡ５１の平均濃度を示す図。インタクト親化合物とＣＥＢＰＡ５１の代謝物との比較から、血漿中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの高い安定性が示される。２．１７５ｍｇ／ｋｇＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＩＶ投与後のラット血漿中のインタクトＣＥＢＰＡ５１の平均濃度を示す図。投与の４８時間後、ＣＥＢＰＡ５１は依然として血漿中に見いだされる。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおける体重の変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるＡＬＴレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるＡＳＴレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるＡＬＰレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるＧＧＴレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるビリルビンレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおける総タンパク質レベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるアルブミンレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるプロトロンビン時間の変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるアンモニアレベルの変化を示す図。さまざまな用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後のＣＣＬ４処置ラットにおけるヒドロキシプロリンレベルの変化を示す図。健常肝臓、ならびに、ＣＣＬ４および対照で処置された肝臓、ＣＣＬ４および０．３ｍｇ／ｋｇＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置された肝臓、ＣＣＬ４および３．０ｍｇ／ｋｇＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置された肝臓の肉眼病理所見である。ナイーブラットの肝臓のＨ＆Ｅ染色、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色を含む組織学的染色を示す図。シャム対照である。ＣＣＬ４と対照とで処置されたラットの肝臓のＨ＆Ｅ染色、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色を含む組織学的染色を示す図。ＮＯＶ３４０／ｓｉＦｌｕｃ処置（陰性対照）を受けたＣＣＬ４処置ラットである。ＣＣＬ４とＭＴＬ−ＣＥＢＰＡとで処置されたラットの肝臓のＨ＆Ｅ染色、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色を含む組織学的染色を示す図。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置を受けたＣＣＬ４処置ラットである。肝機能パラメータのＡＬＴに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。肝機能パラメータのＡＳＴに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。肝機能パラメータのＡＬＰに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。肝機能パラメータのＧＧＴに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。他のパラメータの総タンパク質に対するＴＡＡ注射の作用を示す図。他のパラメータのアルブミンに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。肝機能パラメータのビリルビン対するＴＡＡ注射の作用を示す図。他のパラメータのアンモニアに対するＴＡＡ注射の作用を示す図。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。トリグリセリドレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。総コレステロールレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。肝コレステロールレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。ＨＤＬ−ｃレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。ＬＤＬ−ｃレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。ＨＤＬ−ｃ／ＬＤＬ−ｃ比。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。ＡＳＴレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す。ＡＬＴレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す。ＴＧ／ＨＤＬ−ｃ比。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。空腹時グルコースレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。インスリンレベル。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。体重変化。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。肝重量変化。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡで処置された糖尿病ラットの血清および物理パラメータを示す図。肝重量／体重比。ＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ研究における体重の変化を示す図。ＭＣＤ誘導ＮＡＳＨ研究における飼料消費量の変化を示す図。研究におけるＡＬＴのレベル変化を示した図。研究におけるＡＳＴのレベル変化を示した図。研究におけるＡＬＰのレベル変化を示した図。研究におけるビリルビンのレベル変化を示した図。研究におけるアルブミンのレベル変化を示した図。研究における肝ＴＧのレベル変化を示した図。肝組織におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡおよびアルブミンｍＲＮＡの発現を示す図。発現値は前処理対照（ＤＥＮ誘発ＨＣＣ）を基準にする。ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＊＊ｐ＜０．０１。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置ＤＥＮラットにおける物理パラメータおよび血清パラメータを示す図。平均±ＳＥＭとして示された値、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで示されたｐ値：ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣに対して^＃ｐ＜０．１、^＊ｐ＜０．０５、前処理対照に対して^＄ｐ＜０．０５。アルゴノートタンパク質とＣＥＢＰＡ５１のビオチン化鎖との共免疫沈降の結果を示す図。両方ともＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでトランスフェクトされた野生型およびＡｇｏ２ノックアウトのマウス胚性線維芽（ＭＥＦ：ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞のＣＥＢＰＡレベルを示す図。両方ともＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでトランスフェクトされた野生型およびＡｇｏ２ノックアウトのマウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞のｐ２１レベルを示す図。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ製造プロセスの全体像。ＣＥＢＰＡ−５１および対照オリゴでトランスフェクトした後のｈｕＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−αの分泌を示す図。ＣＥＢＰＡ−５１および対照オリゴでトランスフェクトした後のｈｕＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−αの分泌を示す図。用量漸増フローチャート。ＡＰＩ溶液の２つの異なるｐＨ値について、注射緩衝液のＡＰＩ濃度に対するリポソームへのＣＥＢＰＡ−５１のカプセル化効率を示す図。注射緩衝液のＡＰＩ濃度に対するリポソームへのＣＥＢＰＡ−５１のカプセル化効率を示す図。８週目または１１週目のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置後のアンモニアレベルを示す。８週目または１１週目のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置後の腹水スコアを示す図。８週目または１１週目のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置後の腹水スコアを示す図。８週目または１１週目のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置後の生存率グラフを示す図。８週目または１１週目のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置後の生存率グラフを示す図。

本発明は、治療目的でＣ／ＥＢＰα遺伝子発現および／または機能をモジュレートするための組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築物を含む。

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、代謝プロセスおよび細胞増殖のクリティカルなレギュレータとして知られる。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子をモジュレートすることは、治療目的で大きい可能性を有する。本発明は、Ｃ／ＥＢＰα転写物を標的とする核酸構築物を提供することにより、こうした必要性に対処する。この核酸構築物は、修飾を含むまたは含まない一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。

本明細書で用いられるＣ／ＥＢＰα遺伝子は、コード鎖と鋳型鎖とを含む二本鎖ＤＮＡである。それはまた本出願では標的遺伝子を意味しうる。
これに関連する「Ｃ／ＥＢＰα転写物」、「Ｃ／ＥＢＰα標的転写物」、または「標的転写物」という用語は、Ｃ／ＥＢＰαタンパク質をコードするＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡでありうる。Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡはＣ／ＥＢＰα遺伝子の鋳型鎖から転写され、ミトコンドリアに存在しうる。

Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖から転写されるＣ／ＥＢＰα遺伝子のアンチセンスＲＮＡは、これ以降では標的アンチセンスＲＮＡ転写物と呼ぶ。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は長い非コードアンチセンスＲＮＡ転写物でありうる。

本発明に関連する「低分子活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ）」、「低分子活性化ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ）」または「ｓａＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現をアップレギュレートするまたはそれに対する正の作用を有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡを意味する。ｓａＲＮＡは、１４〜３０ヌクレオチドの一本鎖でありうる。ｓａＲＮＡはまた、各鎖が１４〜３０ヌクレオチドを含む二本鎖でありうる。この遺伝子は、ｓａＲＮＡの標的遺伝子と呼ばれる。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートするｓａＲＮＡは「Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ」と呼ばれ、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子はＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの標的遺伝子である。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα標的アンチセンスＲＮＡ転写物を標的とするＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現および／または機能をアップレギュレートする。

これに関連する「標的」または「標的化」という用語は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子に対する作用を有することを意味する。作用は直接的または間接的でありうる。直接的作用は、Ｃ／ＥＢＰα標的アンチセンスＲＮＡ転写物との完全なまたは部分的なハイブリダイゼーションにより引き起こしうる。間接的作用は上流または下流でありうる。

Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、生物学的プロセスまたは活性に対する下流作用を有しうる。かかる実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、第２の非標的転写物に対する作用（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか）を有しうる。

これに関連する「遺伝子発現」という用語は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子からＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡを生成する転写工程またはＣ／ＥＢＰα ｍＲＮＡからＣ／ＥＢＰαタンパク質を生成する翻訳工程を含みうる。Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡの増加およびＣ／ＥＢＰαタンパク質の増加は、両方ともＣ／ＥＢＰα遺伝子発現の増加または正の作用の指標となる。

遺伝子の「アップレギュレーション」または「活性化」とは、遺伝子の発現レベル、遺伝子によりコードされるポリペプチドのレベルもしくはその活性、または遺伝子の鋳型鎖から転写されるＲＮＡ転写物のレベルが本発明のｓａＲＮＡの不在下で観測されるよりも増加することを意味する。本発明のｓａＲＮＡは、標的遺伝子の発現に対する直接的または間接的なアップレギュレート作用を有しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、増殖細胞で効力を示しうる。細胞に関して本明細書で用いられる場合、「増殖」とは、急速に成長および／または複製している細胞を意味する。

Ｉ．本発明の組成物
本発明の一態様は、ＣＥＢＰＡ遺伝子をアップレギュレートするｓａＲＮＡと、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。かかるｓａＲＮＡは、これ以降では「Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ」または「本発明のｓａＲＮＡ」と呼ばれ、本出願では同義的に用いられる。

ｓａＲＮＡ設計
Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＣ／ＥＢＰα遺伝子をアップレギュレートする。一実施形態では、それはＣ／ＥＢＰα遺伝子の標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的になるように設計され、標的アンチセンスＲＮＡ転写物をダウンレギュレートすることによりＣ／ＥＢＰα遺伝子発現および／または機能に対する作用を発揮しうる。

これに関連する「相補的」という用語は、ストリンジェント条件下で標的アンチセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能であることを意味する。
本発明に関連する核酸配列を記述するために用いられるときの「センス」という用語は、配列が遺伝子のコード鎖の配列に対する同一性を有することを意味する。本発明に関連する核酸配列を記述するために用いられるときの「アンチセンス」という用語は、配列が遺伝子のコード鎖の配列に相補的であることを意味する。

ＤＮＡのチミジンはＲＮＡのウリジンに置き換えられること、およびこの差は「アンチセンス」または「相補性」という用語の解釈を変えるものではないことを理解すべきである。

標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅ）に対応する位置の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ上流までと、標的遺伝子の転写停止部位に対応する位置の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ下流までとの間のコード鎖の遺伝子座から転写しうる。

一実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位から＋／−１ｋｂ以内に位置するコード鎖の遺伝子座から転写される。
他の実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位から＋／−５００、＋／−２５０、または＋／−１００以内に位置するコード鎖の遺伝子座から転写される。

他の実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位から＋／−２０００ヌクレオチドに位置するコード鎖の遺伝子座から転写される。
他の実施形態では、コード鎖の遺伝子座は、標的遺伝子の転写開始部位に対応する位置から上流または下流の１０００ヌクレオチド以下である。

他の実施形態では、コード鎖の遺伝子座は、標的遺伝子の転写開始部位に対応する位置から上流または下流の５００ヌクレオチド以下である。
本明細書で用いられる「転写開始部位」（ＴＳＳ）という用語は、転写の開始位置に対応するまたはそれをマークする遺伝子の鋳型鎖のヌクレオチドを意味する。ＴＳＳは、遺伝子の鋳型鎖のプロモータ領域内に位置しうる。

本明細書で用いられる「転写停止部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖の１ヌクレオチド以上でありうる領域を意味し、少なくとも１つの特徴部、限定されるものではないが例として、標的転写物の少なくとも１つの停止コドンをコードする領域、標的転写物の３’ＵＴＲの直前の配列をコードする領域、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を放出する領域、スプライス部位またはスプライス部位の前の部分をコードする領域、および標的転写物の転写が終了する鋳型鎖の領域を有する。

本発明の標的アンチセンスＲＮＡ転写物に関連する「特定の遺伝子座から転写される」という語句は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の転写が特定の遺伝子座から開始されることを意味する。

標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のゲノム配列のコード鎖に相補的であり、「ゲノム配列」への本明細書での参照はいずれも「ゲノム配列のコード鎖」に対する簡略表現である。

遺伝子の「コード鎖」は、ＴがｍＲＮＡのＵに置き換えられること以外、産生されるｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する。したがって、遺伝子の「鋳型鎖」は、産生されるｍＲＮＡに相補的かつ逆平行である。

したがって、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ上流と、標的遺伝子の転写停止部位の１００、８０、６０、４０、２０、または１０ｋｂ下流との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含みうる。

一実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ上流と標的遺伝子の転写停止部位の１ｋｂ下流との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含む。

他の実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子の転写開始部位の５００、２５０、または１００ヌクレオチド上流と、標的遺伝子の転写停止部位の５００、２５０、または１００ヌクレオチド下流の終了部との間に位置するゲノム配列に相補的な配列を含む。

標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、ＣＥＢＰＡ遺伝子のコード領域を含むゲノム配列に相補的な配列を含みうる。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、鋳型鎖の標的遺伝子のプロモータ領域にアライメントするゲノム配列に相補的な配列を含みうる。遺伝子は複数のプロモータ領域を有しうる。その場合、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、１つ、２つ、またはそれを超えるプロモータ領域にアライメントしうる。遺伝子のプロモータ領域を同定するために、アノテートされた遺伝子座のオンラインデータベースを使用しうる。ヌクレオチド配列の対に関連して用いられるときの「アライメント」という用語は、ヌクレオチド配列の対が互いに相補的であるかまたは互いに配列同一性を有することを意味する。

標的アンチセンスＲＮＡ転写物と標的遺伝子のプロモータ領域との間のアライメント領域は、部分的でありうると共に１ヌクレオチド長程度の短いものでありうるが、少なくとも１５もしくは少なくとも２０ヌクレオチド長、または少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０、３５、４０、４５、もしくは５０ヌクレオチド長、または少なくとも５５、６０、６５、７０、もしくは７５ヌクレオチド長、または少なくとも１００ヌクレオチド長でありうる。次の特定の各配置は、「アライメント」という用語の範囲内に含まれることが意図される。ａ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物および標的遺伝子のプロモータ領域は、同一の長さでアライメントする（すなわち、それらの全長にわたりアライメントする）。ｂ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモータ領域よりも短く、その全長にわたり標的遺伝子のプロモータ領域にアライメントする（すなわち、それはその全長にわたり標的遺伝子のプロモータ領域内の配列にアライメントする）。ｃ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、標的遺伝子のプロモータ領域よりも長く、標的遺伝子のプロモータ領域は、それにより完全にアライメントされる（すなわち、標的遺伝子のプロモータ領域は、その全長にわたり標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列にアライメントする）。ｄ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物および標的遺伝子のプロモータ領域は、同一の長さまたは異なる長さであり、アライメント領域は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の長さおよび標的遺伝子のプロモータ領域の長さの両方よりも短い。

「アライン」および「アライメント」の以上の定義は、しかるべき変更を加えて、本明細書全体を通じて他のオーバーラップ配列、たとえばアライメント配列の記述にも当てはまる。明らかなように、標的アンチセンスＲＮＡ転写物がプロモータ領域以外の標的遺伝子の領域にアライメントすると記述されている場合、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の配列は、標的遺伝子のプロモータ領域内ではなく記載の領域内の配列にアライメントする。

一実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、少なくとも１ｋｂまたは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ｋｂ、たとえば、２０、２５、３０、３５、もしくは４０ｋｂの長さである。

一実施形態では、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は、その全長に沿って標的遺伝子のコード鎖の配列に少なくとも７５％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％で相補的な配列を含む。

本発明は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物を標的とするｓａＲＮＡを提供し、かかる標的アンチセンスＲＮＡ転写物を効果的かつ特異的にダウンレギュレートしうる。これは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の領域との高度の相補性を有するｓａＲＮＡにより達成可能である。ｓａＲＮＡは、標的とすべき標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の領域とのミスマッチが５以下、または４もしくは３以下、または２以下または１以下であるかあるいはまったくないであろう。

図３を参照すると、標的アンチセンスＲＮＡ転写物が標的遺伝子の鋳型鎖の領域との配列同一性を有するため、標的アンチセンスＲＮＡ転写物は標的遺伝子の鋳型鎖内の領域と部分的に同一であろう。このことから遺伝子の鋳型鎖または標的アンチセンスＲＮＡ転写物のいずれへの参照も可能になろう。ｓａＲＮＡが標的アンチセンスＲＮＡ転写物にハイブリダイズまたは結合する位置（すなわち鋳型鎖の同位置）は、「標的配列」または「標的部位」と呼ばれる。

ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖（一本鎖または二本鎖にかかわらず）は、標的配列の逆相補体と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一である。したがって、ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖の逆相補体は、標的配列との高度の配列同一性を有する。標的配列は、ｓａＲＮＡおよび／またはｓａＲＮＡの逆相補体と同一の長さすなわち同一のヌクレオチド数を有しうる。

いくつかの実施形態では、標的配列は少なくとも１４かつ３０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、標的配列は１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドを有する。

いくつかの実施形態では、標的配列の位置は鋳型鎖のプロモータ領域内に位置する。
いくつかの実施形態では、標的配列は鋳型鎖のＴＳＳ（転写開始部位）コア内に位置する。本明細書で用いられる「コアＴＳＳ」または「ＴＳＳコア配列」とは、ＴＳＳ（転写開始部位）の２０００ヌクレオチド上流と２０００ヌクレオチド下流との間の領域を意味する。したがって、ＴＳＳコアは４００１ヌクレオチドを含み、ＴＳＳはＴＳＳコア配列の５’末端を基準にして位置２００１に位置する。ＣＥＢＰＡＴＳＳコア配列は以下の表に示される。

いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳの１０００ヌクレオチド上流と１０００ヌクレオチド下流との間に位置する。

いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳの５００ヌクレオチド上流と５００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳの２５０ヌクレオチド上流と２５０ヌクレオチド下流との間に位置する。

いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳの１００ヌクレオチド上流と１００ヌクレオチド下流との間に位置する。
いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳコア内のＴＳＳの上流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの上流の２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満でありうる。

いくつかの実施形態では、標的配列はＴＳＳコア内のＴＳＳの下流に位置する。標的配列は、ＴＳＳの下流の２０００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、２５０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満でありうる。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳの周囲の＋／−５０ヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳに実質的にオーバーラップする。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴＳＳコアのＴＳＳにオーバーラップするかまたはＴＳＳコアのＴＳＳで開始もしくは終了する。いくつかの実施形態では、標的配列は、上流方向または下流方向のいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９ヌクレオチドがＴＳＳコアのＴＳＳにオーバーラップする。

鋳型鎖の標的配列の位置は、標的配列の５’末端の位置により定義される。標的配列の５’末端は、ＴＳＳコアの任意の位置でありうると共に、標的配列は、ＴＳＳコアの位置１〜位置４００１から選択される任意の位置で開始しうる。本明細書の参照では、標的配列の最も５’側の末端がＴＳＳコアの位置１〜位置２０００にある場合、標的配列はＴＳＳの上流にあると見なされ、標的配列の最も５’側の末端が位置２００２〜４００１にある場合、標的配列はＴＳＳの下流にあると見なされる。標的配列の最も５’側の末端がヌクレオチド２００１である場合、標的配列はＴＳＳ中心配列であると見なされ、ＴＳＳの上流でも下流でもない。

さらなる参照では、たとえば、標的配列の５’末端がＴＳＳコアの位置１６００にある場合、すなわち、ＴＳＳコアの１６００番目のヌクレオチドである場合、標的配列はＴＳＳコアの位置１６００から開始し、ＴＳＳの上流にあると見なされる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは二本鎖を形成する２つの鎖を有し、一方の鎖はガイド鎖である。ｓａＲＮＡ二本鎖は二本鎖ｓａＲＮＡとも呼ばれる。本明細書で用いられる二本鎖ｓａＲＮＡまたはｓａＲＮＡ二本鎖は、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成可能な２本以上の、好ましくは２本の鎖を含むｓａＲＮＡである。二本鎖ｓａＲＮＡの２つの鎖は、アンチセンス鎖またはガイド鎖およびセンス鎖またはパッセンジャー鎖と呼ばれる。

アンチセンス鎖ｓａＲＮＡまたはアンチセンスｓａＲＮＡと同義的に用いられるｓａＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の領域との高度の相補性を有する。アンチセンス鎖は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内または標的配列内の領域とのミスマッチが５以下または４もしくは３以下または２以下または１以下でありうるか、あるいはまったくないこともありうる。したがって、アンチセンス鎖は鋳型鎖の標的配列との高度の相補性を有する。センス鎖ｓａＲＮＡまたはセンスｓａＲＮＡと同義的に用いられるｓａＲＮＡ二本鎖のセンス鎖は、鋳型鎖の標的配列との高度の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、標的配列は鋳型鎖のプロモータ領域内に位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は鋳型鎖のＴＳＳコア内に位置する。

標的配列を基準にしたｓａＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖の位置、ＴＳＳコア配列を参照することにより定義される。たとえば、標的配列がＴＳＳの下流にある場合、アンチセンスｓａＲＮＡおよびセンスｓａＲＮＡはＴＳＳの下流から開始する。他の例では、標的配列がＴＳＳコアの位置２００から開始する場合、アンチセンスｓａＲＮＡおよびセンスｓａＲＮＡはＴＳＳの上流から開始する。

ｓａＲＮＡ、標的遺伝子、標的遺伝子のコード鎖、標的遺伝子の鋳型鎖、標的アンチセンスＲＮＡ転写物、標的転写物、標的配列／標的部位、およびＴＳＳの関係は図３に示されている。

本発明に関連する「鎖」は、天然に存在しないまたは修飾されたヌクレオチドを含めてヌクレオチドの連続配列を意味する。２つ以上の鎖は、個別分子でありうるかもしくは個別分子の一部を形成しうるか、またはたとえばポリエチレングリコールリンカーなどのリンカーにより共有結合しうる。ｓａＲＮＡの少なくとも１つの鎖は、標的アンチセンスＲＮＡに相補的な領域を含みうる。かかる鎖は、ｓａＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖またはガイド鎖と呼ばれる。ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的な領域を含むｓａＲＮＡの第２の鎖は、センス鎖またはパッセンジャー鎖と呼ばれる。

ｓａＲＮＡ二本鎖はまた、二本鎖領域を含めてヘアピン構造を形成する少なくとも部分的に自己相補的な単分子から形成しうる。かかる場合、「鎖」という用語は、ｓａＲＮＡの他の内部領域に相補的なｓａＲＮＡの領域の１つを意味する。ｓａＲＮＡのガイド鎖は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物内の配列とのミスマッチが５以下、または４もしくは３以下、または２以下または１以下であるかあるいはまったくないであろう。

いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡのパッセンジャー鎖は、ガイド鎖の対応するヌクレオチドに相補的でない少なくとも１つのヌクレオチド（ガイド鎖とのミスマッチと呼ばれる）を含みうる。ガイド鎖とのミスマッチはガイド鎖の優先的なローディングを促進しうる（ウー（Ｗｕ）ら著、プロス・ワン（ＰＬｏＳＯＮＥ）、２０１１年、第６巻、第１２号、ｐ．ｅ２８５８０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。一実施形態では、ガイド鎖との少なくとも１つミスマッチはパッセンジャー鎖の３’末端にありうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との１〜５ミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との２〜３ミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との６〜１０ミスマッチを含みうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡ二本鎖は増殖細胞で効力を示しうる。
ｓａＲＮＡ二本鎖は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域とのｓｉＲＮＡ様相補性、すなわち、ｓａＲＮＡ二本鎖のガイド鎖の５’末端を基準にしてヌクレオチド２〜６と標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との間の１００％の相補性を有しうる。加えて、ｓａＲＮＡの他のヌクレオチドは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有しうる。たとえば、ヌクレオチド７（５’末端から数えて）〜ｓａＲＮＡの３’末端は、標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有しうる。

これに関連する「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与して特定の遺伝子を干渉するまたはその発現を阻害する典型的には２０〜２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡを意味する。この遺伝子はｓｉＲＮＡの標的遺伝子である。たとえば、ＡＰＯＡ１遺伝子の発現を干渉するｓｉＲＮＡは「ＡＰＯＡ１−ｓｉＲＮＡ」と呼ばれ、ＡＰＯＡ１遺伝子は標的遺伝子である。ｓｉＲＮＡは、通常、約２１ヌクレオチド長であり、２つの鎖の各末端に３’オーバーハング（たとえば、２ヌクレオチド）を有する。

ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の１つ以上のＲＮＡ転写物の特定の配列に結合してその切断を促進することにより標的遺伝子発現を阻害する。典型的には、ＲＮＡｉではＲＮＡ転写物はｍＲＮＡであるため、ｍＲＮＡの切断は遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明では、可能な機序の１つは、本発明のｓａＲＮＡが標的アンチセンスＲＮＡ転写物の切断により標的遺伝子発現をモジュレートしうることである。

二本鎖ｓａＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含みうる。二本鎖ｓａＲＮＡおよびｓｉＲＮＡに関連する「オーバーハング」または「テール」という用語は、ｓａＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを意味する。たとえば、ｓａＲＮＡの１つの鎖の３’末端が他の鎖の５’末端を越えて延在するかまたはその逆が成り立つ場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｓａＲＮＡは、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含みうると共に、代替的に、オーバーハングは、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含めてヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含みうるかまたはそれらからなりうる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組合せに存在しうる。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端に存在可能である。ハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように２つのオリゴヌクレオチドを設計する場合、かかるオーバーハングは相補性の決定に関してミスマッチと見なさないものとする。たとえば、１９ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと２１ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｓａＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な１９ヌクレオチドの配列を含む場合、本明細書に記載の目的では依然として「完全に相補的」と見なしうる。

一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖は、その３’末端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングまたはその３’末端に１〜２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１〜１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖は、その３’末端に１〜４ヌクレオチドのオーバーハングまたはその３’末端に１〜２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも３’オーバーハングを有する。３’オーバーハングは、１つ以上のウラシル、たとえば配列ＵＵまたはＵＵＵを含みうる。一実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドの１つ以上はヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられ、ヌクレオシド間結合はチオホスフェートとなる。一実施形態では、オーバーハングは、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド、たとえば配列ｄＴｄＴまたはｄＴｄＴｄＴを含む。一実施形態では、オーバーハングは配列ｄＴ^＊ｄＴを含む。ただし、^＊はチオホスフェートヌクレオシド間結合である。

ｓａＲＮＡが標的遺伝子発現をモジュレートする機序にかかわらず、標的アンチセンスＲＮＡ転写物または標的配列を基準にして本発明のｓａＲＮＡを定義するのが便利であることは、当業者であれば分かるであろう。しかしながら、本発明のｓａＲＮＡは、代替的に標的遺伝子を基準にして定義しうる。標的アンチセンスＲＮＡ転写物は標的遺伝子のコード鎖のゲノム領域に相補的であり、一方、本発明のｓａＲＮＡは標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域に相補的であるため、本発明のｓａＲＮＡは、標的遺伝子のコード鎖の領域との配列同一性を有すると見なしうる。標的アンチセンスＲＮＡ転写物を基準にした本発明のｓａＲＮＡの定義に関して本明細書で考察される特徴はすべて、しかるべき変更を加えて、標的遺伝子を基準にした本発明のｓａＲＮＡの定義にも当てはまるため、標的アンチセンスＲＮＡ転写物との相補性に関するいずれの考察も標的遺伝子のゲノム配列との同一性を含むと理解すべきである。したがって、本発明のｓａＲＮＡは、標的遺伝子のゲノム配列との高いパーセントの同一性、たとえば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％または１００％の同一性を有しうる。ゲノム配列は、標的遺伝子の転写開始部位の上流または下流の２０００、１０００、５００、２５０、または１００ヌクレオチドまででありうる。それは標的遺伝子のプロモータ領域にアライメントしうる。したがって、ｓａＲＮＡは、標的遺伝子のプロモータ領域にアライメントする配列との配列同一性を有しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡを設計するために標的アンチセンスＲＮＡ転写物の存在を決定する必要はない。換言すれば、ｓａＲＮＡの設計は標的アンチセンスＲＮＡ転写物の同定を必要としない。たとえば、ＴＳＳコアのヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子の転写開始部位の上流の２０００ヌクレオチド領域の配列から標的遺伝子の転写開始部の下流の２０００ヌクレオチドまでは、標的遺伝子のコード鎖のゲノム配列により、シーケンシングにより、またはデータベース検索により得られうる。鋳型鎖のＴＳＳコアの位置１〜位置４００１の任意の位置から開始するコアＴＳＳコア内の標的配列を選択可能であり、次いで、ｓａＲＮＡ配列を設計するためにそれを使用可能である。以上で考察したように、ｓａＲＮＡは、標的配列の逆相補体との高度の配列同一性を有する。

次いで、全ゲノムのｓａＲＮＡ配列のオフターゲットヒット数、０ミスマッチ（０ｍｍ）ヒット数、および１ミスマッチ（１ｍｍ）ヒット数を決定する。「オフターゲットヒット数」という用語は、標的遺伝子の鋳型鎖のｓａＲＮＡの標的配列と同一の全ゲノム中の他の部位の数を意味する。「０ｍｍヒット数」という用語は、ｓａＲＮＡの標的転写物以外の既知のタンパク質コード転写物のうち、その相補体にｓａＲＮＡが０ミスマッチでハイブリダイズまたは結合しうるものの数を意味する。換言すれば、「０ｍｍヒット数」は、ｓａＲＮＡ配列と完全に同一の領域を含むｓａＲＮＡの標的転写物以外の既知のタンパク質コード転写物の数をカウントする。「１ｍｍヒット数」という用語は、ｓａＲＮＡの標的転写物以外の既知のタンパク質コード転写物のうち、その相補体にｓａＲＮＡが１ミスマッチでハイブリダイズまたは結合しうるものの数を意味する。換言すれば、「１ｍｍヒット数」は、１ミスマッチのみを有してｓａＲＮＡ配列と同一の領域を含むｓａＲＮＡの標的転写物以外の既知のタンパク質コード転写物の数をカウントする。一実施形態では、オフターゲットヒットなし、０ｍｍヒットなし、かつ１ｍｍヒットなしのｓａＲＮＡ配列のみを選択する。本出願に開示されるｓａＲＮＡ配列は、それぞれオフターゲットヒットなし、０ｍｍヒットなし、かつ１ｍｍヒットなしである。

２０１１年６月２３日出願の米国特許出願公開第２０１３／０１６４８４６号明細書（ｓａＲＮＡアルゴリズム）（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される方法は、ｓａＲＮＡを設計するためにも使用しうる。ｓａＲＮＡの設計は、コーリ（Ｃｏｒｅｙ）らに付与された米国特許第８，３２４，１８１号明細書および米国特許第７，７０９，５６６号明細書、リー（Ｌｉ）らに付与された米国特許出願公開第２０１０／０２１０７０７号明細書、ならびにボウティラ（Ｖｏｕｔｉｌａ）ら著、モレキュラー・セラピー−ヌクレイック・アシッズ（ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）、２０１２年、第１巻、ｐ．ｅ３５（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。

「存在の決定」とは、標的遺伝子の遺伝子座の周りのＥＳＴおよび／もしくはアンチセンスＲＮＡ転写物のデータベースを探索して好適な標的アンチセンスＲＮＡ転写物を同定すること、またはＲＴＰＣＲもしくは任意の他の公知の技術を用いて細胞内の標的アンチセンスＲＮＡ転写物の物理的存在を確認することのいずれかを意味する。

いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは一本鎖または二本鎖でありうる。二本鎖分子は第１の鎖と第２の鎖とを含む。二本鎖の場合、二本鎖の各鎖は、少なくとも１４または少なくとも１８ヌクレオチド長、たとえば、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長でありうる。二本鎖は、少なくとも１２、または少なくとも１５、または少なくとも１７、または少なくとも１９ヌクレオチドの長さ全体にわたりハイブリダイズしうる。各鎖はちょうど１９ヌクレオチド長でありうる。この長さを超えるオリゴヌクレオチド二本鎖はインターフェロン反応を誘導するリスクを増加させうるため、好ましくはｓａＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド未満である。一実施形態では、ｓａＲＮＡの長さは１９〜２５ヌクレオチドである。ｓａＲＮＡ二本鎖を形成する鎖は等しいまたは等しくない長さでありうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、標的配列との少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する少なくとも１４ヌクレオチドかつ３０ヌクレオチド未満の配列を含む。一実施形態では、標的配列との少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、もしくは１９ヌクレオチド長または１８〜２２または１９〜２１またはちょうど１９ヌクレオチド長である。

本発明のｓａＲＮＡは、標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的でない短い３’または５’配列を含みうる。一実施形態では、かかる配列は鎖の３’末端にある。配列は、１〜５ヌクレオチド長または２もしくは３ヌクレオチド長でありうる。配列はウラシルを含みうるため、２または３ウラシルの３’ストレッチでありうる。配列は、ｄＴなどのデオキシリボヌクレオシドを１つ以上含みうる。一実施形態では、配列のヌクレオチドの１つ以上はヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられ、ヌクレオシド間結合はチオホスフェートとなる。たとえば、限定されるものではないが配列は配列ｄＴ^＊ｄＴを含む。ただし、^＊はチオホスフェートヌクレオシド間結合である。この非相補的配列は「テール」と呼びうる。３’テールが存在する場合、鎖はより長くなりうる。たとえば、１９ヌクレオチド＋３’テール（ＵＵまたはＵＵＵでありうる）。かかる３’テールは、ｓａＲＮＡと標的アンチセンスＲＮＡ転写物との間の相補性の決定に関してミスマッチと見なさないものとする。

したがって、本発明のｓａＲＮＡは、（ｉ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する配列と（ｉｉ）ウラシル残基を含みうるまたはそれからなりうる１〜５ヌクレオチドの３’テールとからなりうる。したがって、ｓａＲＮＡは、存在するのであれば３’テールを除いて、典型的にはその全長にわたり標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との相補性を有するであろう。本出願に開示されるｓａＲＮＡ配列はいずれもかかる３’テールを任意選択的に含みうる。したがって、ｓａＲＮＡの表および配列リストに開示されるｓａＲＮＡ配列はいずれもかかる３’テールを任意選択的に含みうる。本発明のｓａＲＮＡは、ダイサーまたはドローシャの基質配列をさらに含みうる。

本発明のｓａＲＮＡはフランキング配列を含有しうる。フランキング配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端または５’末端に挿入しうる。一実施形態では、フランキング配列は、ｓａＲＮＡにｍｉＲＮＡ構成を持たせるｍｉＲＮＡの配列であり、ドローシャおよびダイサーで処理しうる。限定されるものではないが一例では、本発明のｓａＲＮＡは２つの鎖を有し、マイクロＲＮＡ前駆体、たとえばｍｉＲ−３０骨格フランキング配列にクローニングされる。

本発明のｓａＲＮＡは、制限酵素の基質または認識配列を含みうる。制限酵素の認識配列は、本発明のｓａＲＮＡの３’末端または５’末端にありうる。制限酵素の例としては、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは安定に塩基対合されて一体化された２つの鎖からなる。いくつかの実施形態では、パッセンジャー鎖は、ガイド鎖の対応するヌクレオチドに相補的でない少なくとも１つのヌクレオチド（ガイド鎖とのミスマッチと呼ばれる）を含みうる。一実施形態では、ガイド鎖との少なくとも１つミスマッチはパッセンジャー鎖の３’末端にありうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との１〜５ミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との２〜３ミスマッチを含みうる。一実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端はガイド鎖との６〜１０ミスマッチを含みうる。

いくつかの実施形態では、二本鎖ｓａＲＮＡは、３’オーバーハングを形成する各鎖の３’末端にいくつかの非対合ヌクレオチドを含みうる。各鎖の３’オーバーハングを形成する非対合ヌクレオチドの数は、１〜５ヌクレオチドもしくは１〜３ヌクレオチドの範囲内または２ヌクレオチドでありうる。３’オーバーハングは上述した３’テールに形成しうるため、３’テールは二本鎖ｓａＲＮＡの３’オーバーハングでありうる。

したがって、本発明のｓａＲＮＡは一本鎖でありうると共に、（ｉ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する配列と（ｉｉ）ウラシル残基を含みうる１〜５ヌクレオチドの３’テールとからなる。本発明のｓａＲＮＡは、存在するのであれば３’テールを除いて、その全長にわたり標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との相補性を有しうる。上述したように、「標的アンチセンスＲＮＡ転写物に相補的」である代わりに、本発明のｓａＲＮＡはまた、標的遺伝子のコード鎖との「同一性」を有するものとして定義しうる。本発明のｓａＲＮＡは二本鎖でありうると共に、（ｉ）標的アンチセンスＲＮＡ転写物の領域との少なくとも８０％の相補性を有する第１の配列と（ｉｉ）１〜５ヌクレオチドの３’オーバーハングとを含む第１の鎖と、（ｉ）第１の配列と二本鎖を形成する第２の配列と（ｉｉ）１〜５ヌクレオチドの３’オーバーハングとを含む第２の鎖とからなる。

本明細書に記載されるように、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の配列を用いてＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを設計する。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを設計するために、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の配列からＣＥＢＰＡ遺伝子の標的アンチセンスＲＮＡ転写物の配列を決定しうる。しかしながら、かかる標的アンチセンスＲＮＡ転写物の存在を決定する必要はない。本発明の好適なＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの配列は表１に提供される。したがって、配列番号２、４、６、８、１０、および１２から選択される配列を含む第１の鎖を有するＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡが提供される。任意選択的に、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、これらの配列の３’末端に３’テールを含みうる。

一本鎖Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは第１の鎖のみからなるが、二本鎖Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは第２の鎖も有する。一本鎖ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡは、表１および１Ａのアンチセンス鎖から選択される配列を含む。二本鎖Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、第１の鎖（ただし、第１の鎖は、表１および１Ａのアンチセンス鎖から選択される配列を含む）と、第２の鎖（ただし、第２の鎖は、表１および１Ａの対応するセンス鎖である配列を含む）とを含む。アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は３’オーバーハングを含みうる。

二機能または二元機能オリゴヌクレオチドもＣ／ＥＢＰα遺伝子発現のアップレギュレーションおよびＣ／ＥＢＰβ遺伝子発現のダウンレギュレーションのために設計される。二元機能オリゴヌクレオチドの一方の鎖はＣ／ＥＢＰα遺伝子発現を活性化し、他方の鎖はＣ／ＥＢＰβ遺伝子発現を阻害する。好ましい二元機能オリゴヌクレオチド配列は表２Ａに示される。各鎖は、表２Ｂに示されるダイサーの基質配列をさらに含みうる。

本発明のｓａＲＮＡは、任意の好適な方法により、たとえば、合成によりまたは当業者に周知の標準的分子生物学技術を用いて細胞内の発現により生成しうる。たとえば、本発明のｓａＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を用いて化学合成または組換え産生しうる。

ｓａＲＮＡの化学修飾
本明細書では、ｓａＲＮＡにおいて「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する構造修飾および／または化学修飾を意味する。本発明のｓａＲＮＡのヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、たとえば、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドを含みうる。本発明のｓａＲＮＡは、任意の有用な修飾、たとえば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（たとえば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）に対する修飾を含みうる。ピリミジン核酸塩基の１個以上の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（たとえば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（たとえば、クロロもしくはフルオロ）により置き換えうるかまたは置換しうる。特定の実施形態では、修飾（たとえば、１つ以上の修飾）は糖およびヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本発明に係る修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドをもたらすリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾でありうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは本明細書に記載の少なくとも１つの修飾を含みうる。
他の実施形態では、ｓａＲＮＡはｓａＲＮＡ二本鎖であり、センス鎖およびアンチセンス配列は独立して少なくとも１つの修飾を含みうる。限定されるものではないが例として、センス配列は修飾を含みうると共にアンチセンス鎖は非修飾でありうる。限定されるものではないが他の例として、アンチセンス配列は修飾を含みうると共にセンス鎖は非修飾でありうる。限定されるものではないがさらに他の例として、センス配列は２つ以上の修飾を含みうると共にアンチセンス鎖は１つの修飾を含みうる。限定されるものではないが例として、アンチセンス配列は２つ以上の修飾を含みうると共にセンス鎖は１つの修飾を含みうる。

本発明のｓａＲＮＡは、糖、核酸塩基、および／またはヌクレオシド間結合への修飾の組合せを含みうる。これらの組合せは、本明細書または２０１２年１０月３日出願の国際公開第２０１３／０５２５２３号パンフレットに記載のいずれか１つ以上の修飾、特に式（Ｉａ）〜（Ｉａ−５）、（Ｉｂ）〜（Ｉｆ）、（ＩＩａ）〜（ＩＩｐ）、（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｃ−１）〜（ＩＩｃ−２）、（ＩＩｎ−１）、（ＩＩｎ−２）、（ＩＶａ）〜（ＩＶｌ）、および（ＩＸａ）〜（ＩＸｒ））（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含みうる。

本発明のｓａＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾しうるかまたは修飾しえない。たとえば、本発明のｓａＲＮＡでは１つ以上またはすべてのタイプのヌクレオチド（たとえば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくはすべて）を均一に修飾しうるかまたは修飾しえない。いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡのすべてのヌクレオチドＸが修飾される。ただし、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、またはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つでありうる。

さまざまな糖修飾、ヌクレオチド修飾、および／またはヌクレオシド間結合（たとえば、骨格構造）は、ｓａＲＮＡの種々の位置に存在しうる。ｓａＲＮＡの機能が実質的に低減されないようにｓａＲＮＡの任意の位置にヌクレオチドアナログまたは他の修飾を配置しうることは、当業者であれば分かるであろう。本発明のｓａＲＮＡは、修飾ヌクレオチドを約１％〜約１００％（全ヌクレオチド分を基準にして、または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上を基準にして）または任意の介在パーセント（たとえば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％の、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）で含有しうる。

いくつかの実施形態では、修飾はリボース環上でありうる。リボース上の２’−ＯＨ基は、リボヌクレアーゼからｓａＲＮＡを保護するために置換しうる。たとえば、２’−ＯＨ基は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−アリル）などで置換しうる。

いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチドの二環式誘導体（ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＣＬＮＡ、ＣＥＮＡ、ＡＥＮＡなど）、非環式ヌクレオチド（ＵＮＡ、ＰＮＡなど）、またはリボースの代わりにピラノース環を含むヌクレオチド（ＡＮＡ、ＨＮＡ）を含む。

いくつかの実施形態では、修飾は、ｓａＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させるために骨格上にありうる。限定されるものではないが例としては、ホスホロチオエート（ＰＳ）基もしくはボラノホスホネート（ＰＢ）基でホスフェート基（ＰＯ）を置き換えること、２’，５’−結合で３’，５’−ホスホジエステル結合を置き換えること、またはエステル結合の代わりにアミド結合にすることなどが挙げられる。

いくつかの実施形態では、修飾は核酸塩基上にありうる。たとえば、ウリジン（Ｕ）は、プソイドウリジン（ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、５−ブロモ−Ｕ、５−ヨード−Ｕなどで置き換えうる。プリンは２，６−ジアミノプリンで置き換えうる。

いくつかの実施形態では、修飾はｓａＲＮＡの末端にありうる。任意の末端修飾を用いて、ヌクレアーゼ耐性を増加させたり、非対称ＲＩＳＣアセンブリーを容易にしたり、細胞内へのｓａＲＮＡ蓄積を支援したり、ｓａＲＮＡ検出を可能にしたりしうる。たとえば、蛍光標識およびビオチンをｓａＲＮＡの末端に結合しうる。他の例では、反転デオキシリボースをｓａＲＮＡの末端で利用しうる。

いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、球状核酸（ＳＮＡ）または環状核酸になるように修飾しうる。化学試薬または酵素により本発明のｓａＲＮＡの末端を結合して、遊離末端を有していない球状ｓａＲＮＡを生成しうる。球状ｓａＲＮＡは、その線状カウンターパートよりも安定でかつＲＮアーゼＲエキソヌクレアーゼによる消化に耐性であることが予想される。球状ｓａＲＮＡは、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣリボヌクレオチドに対する他の構造修飾および／または化学修飾をさらに含みうる。

いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは反転ｄＴ修飾を含みうる。反転修飾は５’末端または３’末端にありうる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの２’−ＯＨは−ＯＭｅで置換され、２’−ＯＭｅと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの２’−ＯＨは−Ｆで置換され、２’−Ｆと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合が存在する。いくつかの実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは脱塩基修飾を含みうる。

本発明のｓａＲＮＡは修飾の組合せを含みうる。ｓａＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾を含みうる。たとえば、ｓａＲＮＡは、２’−Ｆ修飾と２’−ＯＭｅ修飾とを交互に含みうる。いくつかの実施形態では、ｓａＲＮＡはその全長にわたり修飾しうる。

センス鎖の不活性化および／またはオフターゲットの低減に好適でガイド鎖の活性に干渉しない任意の修飾を使用しうる。
表３は、修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ配列および非修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ配列の例を含むが、これらに限定されるものではない。表３中、小文字は２’−ＯＭｅ修飾を意味する。「（ｉｎｖｄＴ）」は３’末端および／または５’末端に反転ｄＴを含むことを意味する。「ｆ」は、その前のヌクレオチドが２’−Ｆ修飾を有することを意味する。「ｓ」は、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合が存在することを意味する。「ｄＴ」はデオキシチミンを意味する。「ｄＧ」はデオキシグアノシンを意味する。「ｄＡ」はデオキシアデノシンを意味する。

ｓａＲＮＡコンジュゲートおよび組合せ
コンジュゲーションは、安定性および／または半減期の増加をもたらしうると共に、細胞、組織、または生物において本発明のｓａＲＮＡを特定の部位に標的化するのに特に有用でありうる。本発明のｓａＲＮＡは、他のポリヌクレオチド、色素、インターカレート剤（たとえば、アクリジン）、架橋剤（たとえば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（たとえば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（たとえば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（たとえば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（たとえば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（たとえば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、たとえば、糖タンパク質、またはペプチド、たとえば、共リガンドへの特異的親和性を有する分子、または抗体、たとえば、癌細胞、内皮細胞、骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモンレセプター、非ペプチド種、たとえば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、または薬剤にコンジュゲートされるように設計可能である。核酸分子に好適なコンジュゲートは、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

本発明によれば、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、さまざまな機能を達成するために、ＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ、エンハンサー由来ＲＮＡまたはエンハンサー駆動ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどの１つ以上と共に投与しうるかまたはそれらをさらにコードしうる。１つ以上のＲＮＡｉ剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ結合部位、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重螺旋形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、またはベクターは、少なくとも１つの修飾または置換を含みうる。いくつかの実施形態では、修飾は、糖位置での核酸の化学置換、ホスフェート位置での化学置換、および塩基位置での化学置換から選択される。他の実施形態では、化学修飾は、修飾ヌクレオチドの取込み、３’キャッピング、高分子量非免疫原性化合物へのコンジュゲーション、親油性化合物へのコンジュゲーション、およびホスフェート骨格へのホスホロチオエートの取込みから選択される。好ましい実施形態では、高分子量非免疫原性化合物はポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータから共発現できるようにトランスジーンに結合しうる。限定されるものではないが一例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に結合される。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーに結合することによりＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ−アプタマーコンジュゲートを生成しうる。アプタマーは、高い選択性、親和性、および安定性を有するオリゴヌクレオチドまたはペプチドである。それは特異的かつ安定な三次元形状をとることにより標的分子へのきわめて特異的な緊密結合を提供する。アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的、さらには細胞、組織、および生物に結合するように、ｉｎｖｉｔｒｏ選択の繰返しラウンドまたは均等にＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）により工学操作された核酸種でありうる。核酸アプタマーは、典型的なワトソン・クリック塩基対合以外の相互作用により分子への特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により生成されたペプチドのように、選択された標的に特異的に結合可能であり、かつ結合を介してその標的の機能能力をブロックする。いくつかの場合、アプタマーはまたペプチドアプタマーでありうる。いずれかの特異的分子標的では、核酸アプタマーは、たとえばＳＥＬＥＸにより核酸のコンビナトリアルライブラリーから同定可能である。ペプチドアプタマーは酵母ツーハイブリッド系を用いて同定しうる。したがって、当業者であれば、肝細胞などの標的細胞に本発明のｓａＲＮＡまたは細胞を送達するのに好適なアプタマーを設計可能である。ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、およびペプチドアプタマーが企図される。肝臓特異的アプタマーを用いて本発明のｓａＲＮＡを肝臓に投与することは特に好ましい。

本明細書で用いられる場合、典型的な核酸アプタマーは、約１０〜１５ｋＤａのサイズ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的に少なくともナノモル親和性で結合し、かつ関連性の高い標的を識別する。核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との混合でありうる。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との混合でありうる。アプタマーは、少なくとも１つの化学修飾を含みうる。

アプタマーに好適なヌクレオチド長は約１５〜約１００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲内であり、種々の他の好ましい実施形態では、１５〜３０ｎｔ、２０〜２５ｎｔ、３０〜１００ｎｔ、３０〜６０ｎｔ、２５〜７０ｎｔ、２５〜６０ｎｔ、４０〜６０ｎｔ、２５〜４０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、次の値、すなわち、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０ｎｔのいずれか、または４０〜７０ｎｔの長さである。しかしながら、配列は、本明細書に記載の距離でアプタマーと２つの標的との相互作用に適合できるように十分な柔軟性を有して設計可能である。アプタマーは、ヌクレアーゼ活性および他の酵素活性からの保護を提供するようにさらに修飾しうる。アプタマー配列は、当技術分野で公知の任意の好適な方法により修飾可能である。

Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ−アプタマーコンジュゲートは、２つの部分を結合するための任意の公知の方法、たとえば、直接化学結合形成、ストレプトアビジンなどのリンカーを介する結合などを用いて形成しうる。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは抗体に結合しうる。標的細胞表面レセプターに対する抗体を生成する方法は周知である。本発明のｓａＲＮＡ分子は、公知の方法を用いて、たとえば、ＲＮＡ担体タンパク質を用いて、かかる抗体に結合しうる。次いで、得られた複合体は、対象に投与してレセプター媒介エンドサイトーシスにより標的細胞に取り込みうる。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、脂質部分、たとえばコレステロール部分（レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８９年、第８６巻、ｐ．６５５３〜６５５６）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９４年、第４巻、ｐ．１０５３〜１０６０）、チオエーテル、たとえばベリル−５−トリチルチオール（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９２年、第６６０巻、ｐ．３０６〜３０９、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９３年、第３巻、ｐ．２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（オーバーハウザ（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．）、１９９２年、第２０巻、ｐ．５３３〜５３８）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（サイソン−ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら著、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ）、１９９１年、第１０巻、ｐ．１１１１〜１１１８、カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．）、１９９０年、第２５９巻、ｐ．３２７〜３３０、シバノルチュク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら著、バイオシミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、１９９３年、第７５巻、ｐ．４９〜５４）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１−３６５４、シーア（Ｓｈｅａ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．）、１９９０年、第１８巻、ｐ．３７７７〜３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、ヌクレオシズ・アンド・ヌクレオチズ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９５年、第１４巻、ｐ．９６９〜９７３）、またはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１〜３６５４、）、パルミチル部分（（Ｍｉｓｈｒａ）ら著、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第１２６４巻、ｐ．２２９〜２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（クルッケ（Ｃｒｏｏｋｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマコロジ・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９６年、第２７７巻、ｐ．９２３〜９３７）（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）にコンジュゲートしうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１８４３２８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるリガンドにコンジュゲートされる。コンジュゲートは、リガンド−［リンカー］_任意選択−［テザー］_任意選択−オリゴヌクレオチド剤の式を有する。オリゴヌクレオチド剤は、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１８４３２８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される式（Ｉ）を有するサブユニットを含みうる。

かかる核酸／脂質コンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号明細書、同第４，９４８，８８２号明細書、同第５，２１８，１０５号明細書、同第５，５２５，４６５号明細書、同第５，５４１，３１３号明細書、同第５，５４５，７３０号明細書、同第５，５５２，５３８号明細書、同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書、同第５，５９１，５８４号明細書、同第５，１０９，１２４号明細書、同第５，１１８，８０２号明細書、同第５，１３８，０４５号明細書、同第５，４１４，０７７号明細書、同第５，４８６，６０３号明細書、同第５，５１２，４３９号明細書、同第５，５７８，７１８号明細書、同第５，６０８，０４６号明細書、同第４，５８７，０４４号明細書、同第４，６０５，７３５号明細書、同第４，６６７，０２５号明細書、同第４，７６２，７７９号明細書、同第４，７８９，７３７号明細書、同第４，８２４，９４１号明細書、同第４，８３５，２６３号明細書、同第４，８７６，３３５号明細書、同第４，９０４，５８２号明細書、同第４，９５８，０１３号明細書、同第５，０８２，８３０号明細書、同第５，１１２，９６３号明細書、同第５，２１４，１３６号明細書、同第５，０８２，８３０号明細書、同第５，１１２，９６３号明細書、同第５，２１４，１３６号明細書、同第５，２４５，０２２号明細書、同第５，２５４，４６９号明細書、同第５，２５８，５０６号明細書、同第５，２６２，５３６号明細書、同第５，２７２，２５０号明細書、同第５，２９２，８７３号明細書、同第５，３１７，０９８号明細書、同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書、同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書、同第５，５１０，４７５号明細書、同第５，５１２，６６７号明細書、同第５，５１４，７８５号明細書、同第５，５６５，５５２号明細書、同第５，５６７，８１０号明細書、同第５，５７４，１４２号明細書、同第５，５８５，４８１号明細書、同第５，５８７，３７１号明細書、同第５，５９５，７２６号明細書、同第５，５９７，６９６号明細書、同第５，５９９，９２３号明細書、同第５，５９９，９２８号明細書、および同第５，６８８，９４１号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら（アルナイラム・ファーマシューティカルズ（ＡｌｎｙｌａｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））に付与された米国特許第８１０６０２２号明細書および同第８８２８９５６号明細書（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意の炭水化物リガンドなどの炭水化物リガンドにコンジュゲートされる。たとえば、炭水化物リガンドは、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖でありうる。これらの炭水化物コンジュゲートＲＮＡ剤は、肝臓の実質細胞を標的としうる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、２つ以上、好ましくは２または３つの炭水化物リガンドにコンジュゲートされる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、１つ以上のガラクトース部分にコンジュゲートされる。他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つ（たとえば、２もしくは３つまたはそれを超える）のラクトース分子にコンジュゲートされる（ラクトースはガラクトースに結合されたグルコースである）。他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つ（たとえば、２もしくは３またはそれを超える）のＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（たとえば、マンノース−６−ホスフェート）にコンジュゲートされる。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、少なくとも１つのマンノースリガンドにコンジュゲートされ、コンジュゲートｓａＲＮＡはマクロファージを標的とする。

本発明のｓａＲＮＡは、考慮対象となる特定の方法で作用を有することが知られる他の活性成分と組み合わせて提供しうる。他の活性成分は、本発明のｓａＲＮＡと同時に、個別に、または逐次的に投与しうる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、異なる標的遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡと共に投与される。例としては、アルブミン、インスリン、またはＨＮＦ４Ａ遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。単一のｓａＲＮＡまたは２つ以上の異なるｓａＲＮＡの組合せを用いて、任意の遺伝子のモジュレーションを達成しうる。本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡと共に投与可能なｓａＲＮＡの例としては、限定されるものではないが２０１２年６月２０日出願の国際公開第２０１２／１７５９５８号パンフレットに開示されるアルブミンまたはＨＮＦ４ＡをモジュレートするｓａＲＮＡ、両方とも２０１１年１０月１０日出願の国際公開第２０１２／０４６０８４号パンフレットおよび国際公開第２０１２／０４６０８５号パンフレットに開示されるインスリンをモジュレートするｓａＲＮＡ、２００６年１１月１３日出願の米国特許第７，７０９，４５６号明細書および２０１０年４月２３日出願の米国特許出願公開第２０１０／０２７３８６３号明細書に開示されるヒトプロゲステロンレセプター、ヒト主要ボールトタンパク質（ｈＭＶＰ）、Ｅ−カドヘリン遺伝子、ｐ５３遺伝子、またはＰＴＥＮ遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡ、および２００６年４月１１日出願の国際公開第２００６／１１３２４６号パンフレットに開示されるｐ２１遺伝子を標的とするｓａＲＮＡ（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰβ遺伝子の発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡすなわちＣ／ＥＢＰβ−ｓｉＲＮＡと共に投与される。本発明の好適なｓｉＲＮＡの好ましい配列は表４に提供される。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、代謝、特に肝機能をレギュレートする１種以上の薬剤と共に投与される。限定されるものではないが一例では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）コレステロールレベルを減少させる薬剤、たとえば、スタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、クロフィブラート、フェノフィブリック、トコトリエノール、フィトステロール、胆汁酸捕捉剤、プロブコール、またはそれらの組合せと共に投与される。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはまた、オービグ（Ｏｒｖｉｇ）らに付与された米国特許第６２８７５８６号明細書に開示されるバナジウムビグアニド複合体と共に投与しうる。他の例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、血清コレステロールを低減するために、ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）に付与された国際公開第２０１１／００２８３８号パンフレット（その内容はその全体が参照により組み込まれる）に開示される組成物と共に投与しうる。組成物は、ＰＣＳＫ９タンパク質に選択的に結合して阻害する抗原結合タンパク質と、細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するＲＮＡエフェクター剤とを含む。さらに他の例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ブルックス−ウイルソン（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ）らに付与された欧州特許第１８５４８８０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、コレステロールレベルをモジュレートするために、ＡＢＣ１生物学的活性を有するＡＢＣ１ポリペプチドまたはＡＢＣ１活性を有するＡＢＣ１ポリペプチドをコードする核酸と共に投与しうる。

他の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、インスリン感受性を増加させるまたはＩＩ型糖尿病を治療する薬剤、たとえば、メトホルミン、スルホニル尿素、非スルホニル尿素分泌促進剤、αグルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グルカゴン様ペプチド−１アナログ、およびジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤、またはそれらの組合せと共に投与される。本発明のｓａＲＮＡと組み合わせて投与しうる他の肝保護剤は、アダムス（Ａｄａｍｓ）ら著、ポストグラジュエート・メディカル・ジャーナル（ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ）、２００６年、第８２巻、ｐ．３１５〜３２２）（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

ガンキリンおよびＦＸＲタンパク質
肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生は、肝過増殖および肝癌をもたらす遺伝子発現の漸進的変化を含む多工程プロセスである。肝癌の発癌時、腫瘍サプレッサータンパク質Ｒｂ、ｐ５３、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）、およびＣ／ＥＢＰ−αは中和される。これらのタンパク質の除去は、２６Ｓプロテアソームの小サブユニット、癌により活性化されるガンキリンにより媒介される。ワング（Ｗａｎｇ）らは、ガンキリンがＣ／ＥＢＰαのＳ１９３−ｐｈアイソフォームと相互作用してそれをユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓｙｓｔｅｍ）媒介分解の標的とすることを開示している。ガンキリンレベルは、肝癌発生の初期に上昇する（ワング（Ｗａｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティケーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）、２０１０年、第１２０巻、第７号、ｐ．２５４９〜２５６２（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。たとえば、ガンキリン遺伝子（ＰＳＭＤ１０遺伝子としても知られる）のｓｉＲＮＡおよび／またはガンキリン阻害剤を用いてガンキリンを阻害することにより、ＨＣＣの予防および／または治療を行いうる。

チャン（Ｊｉａｎｇ）らは、胆汁酸レセプター（ＢＡＲ）またはＮＲ１Ｈ４としても知られるファルネソイドＸレセプター（ＦＸＲ）がＨＤＡＣ１−Ｃ／ＥＢＰβ複合体を介してガンキリンプロモータをサイレンシングすることにより静止肝臓におけるガンキリンの発現を阻害することを見いだした（チャン（Ｊｉａｎｇ）ら著、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１３年、第５７巻、第３号、ｐ．１０９８〜１１０６（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。マウスにおけるＦＸＲシグナリングの欠失は、１２ヶ月齢でガンキリンプロモータの脱抑制および肝癌の自発的発生をもたらす。野生型マウスにおけるジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）媒介肝癌もＦＸＲの低減およびガンキリンの活性化を含む。高齢マウスにおける肝癌およびヒト患者における肝癌の検査から、肝癌の自発的発生時にＦＸＲは低減するがガンキリンは増加することが判明した。チャン（Ｊｉａｎｇ）らは、Ｃ／ＥＢＰβ−ＨＤＡＣ１複合体を介してガンキリンプロモータを阻害し、腫瘍サプレッサータンパク質を分解から後続的に保護することにより、ＦＸＲが肝癌を予防すると結論した。ＦＸＲの安定化および核移行はガンキリンを阻害する。たとえば、ＦＸＲアゴニストもしくはアクチベータまたはＮＲ１Ｈ４遺伝子のアクチベータを用いてＦＸＲを活性化することにより、ＨＣＣを予防および／または治療しうる。

本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ガンキリンをダウンレギュレートするまたはＦＸＲをアップレギュレートする１種以上の治療剤と組み合わせて使用しうる。組合せは、ＨＣＣの予防および／または治療に対して相乗効果を有しうる。いくつかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはガンキリンｓｉＲＮＡと組み合わせて使用しうる。二本鎖ガンキリンｓｉＲＮＡは、「ＲＮＡｉによる内因性遺伝子発現の阻害」のセクション（ヒガシツジ（Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ）ら、キャンサー・セル（ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ）、２００５年、第８巻、ｐ．７５〜８７（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））にヒガシツジ（Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ）らにより開示された方法を用いて生成しうる。いくつかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＦＸＲアゴニストと組み合わせて使用しうる。ＦＸＲアゴニストまたはアクチベータの例としては、限定されるものではないがタウロコール酸、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ＩＮＴ−７６７（インターセプト・ファーマシューティカルズ（ＩｎｔｅｒｃｅｐｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、ＩＮＴ−７７７（インターセプト・ファーマシューティカルズ（ＩｎｔｅｒｃｅｐｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、および米国特許出願公開第２０１４／００５７８８６号明細書、米国特許第８５４６３６５号明細書、米国特許第７９３２２４４号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１００２０９号明細書、米国特許第８４４５４７２号明細書、米国特許第８１１４８６２号明細書、米国特許出願公開第２０１４／００９４４４３号明細書、米国特許第８４１００８３号明細書、米国特許第８７９６２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／００２４６３１号明細書、米国特許第８３７７９１６号明細書、米国特許第８２５８２６７号明細書、米国特許第７７８６１０２号明細書、米国特許第７１３８３９０号明細書、米国特許第７９９４３５２号明細書、米国特許第７８５８６０８号明細書、米国特許第７８１２０１１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１４８４２８号明細書、および米国特許出願公開第２００６／０２５２６７０号明細書（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意のＦＸＲアゴニストまたはアクチベータが挙げられる。

製剤、送達、投与、および用量
医薬製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含みうる。この賦形剤は、本明細書で用いられる場合、所望の特定の剤形に適したあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、滑沢剤などを含むが、これらに限定されるものではない。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技術は当技術分野で公知である（「レミングトン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア、２００６年（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。何らかの望ましくない生物学的作用、さもなければ医薬組成物のいずれか他の成分との有害な相互作用を生じることなどにより、任意の従来の賦形媒体が物質またはその誘導体に不適合性でありうる場合を除いて、従来の賦形媒体の使用は本開示の範囲内で企図しうる。

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、本明細書に記載されるように送達されるＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを一般に意味する。

本明細書に提供される医薬組成物の説明はヒトへの投与に好適な医薬組成物に主に向かっているが、かかる組成物が任意の他の動物、たとえば非ヒト動物、たとえば非ヒト哺乳動物への投与に一般に好適であることは、当業者であれば理解されよう。種々の動物への投与に好適な組成物にするためのヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変はよく理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者であれば、かりに実験を行うとしても通常の実験を行うだけで、かかる改変の設計および／または実施が可能である。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定されるものではないがヒトおよび／もしくは他の霊長動物、哺乳動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなどの商業関連の哺乳動物を含む）、ならびに／またはトリ（家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウなどの商業関連のトリを含む）が挙げられる。

一実施形態では、本明細書に記載の製剤化ｓａＲＮＡの効力は増殖細胞において決定しうる。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学技術分野で公知であるまたは今後開発される任意の方法により調製しうる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１種以上の他の副成分と一体化させる工程と、次いで、必要に応じておよび／または望ましい場合には分割、造形、および／または包装を行って所望の単回または複数回用量ユニットにする工程とを含む。

本発明に係る医薬組成物は、単回ユニット用量としておよび／または複数の単回ユニット用量として大量に調製、包装、および／または販売を行いうる。本明細書で用いられる場合、「ユニット用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別量のことである。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量および／またはかかる投与量の便利な部分量、たとえばかかる投与量の１／２もしくは１／３に等しい。

本発明に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または病態に依存して、さらには組成物の投与経路に依存して変化するであろう。例として、組成物は、０．１％〜１００％、たとえば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含みうる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は少なくとも１種のｓａＲＮＡを含有しうる。限定されるものではないが例として、製剤は、異なる配列を有する１、２、３、４、または５種のｓａＲＮＡを含有しうる。一実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも３種のｓａＲＮＡを含有する。一実施形態では、製剤は、異なる配列を有する少なくとも５種のｓａＲＮＡを含有する。

本発明のｓａＲＮＡは、（１）安定性を向上させるために、（２）細胞トランスフェクションを向上させるために、（３）持続放出または遅延放出（たとえば、ｓａＲＮＡのデポ製剤から）を可能にするために、（４）生体内分布を変化させるために（たとえば、ｓａＲＮＡを特定の組織または細胞型に標的化するために）、（５）ｉｎｖｉｖｏでコードタンパク質の翻訳を増加させるために、および／または（６）ｉｎｖｉｖｏでコードタンパク質の放出プロファイルを変化させるために、１種以上の賦形剤を用いて製剤化可能である。従来の賦形剤、たとえば、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤に加えて、本発明の賦形剤は、限定されるものではないがリピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ｓａＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（たとえば、対象への移植のために）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子ミミック、およびそれらの組合せを含みうる。したがって、本発明の製剤は、それぞれ一緒になってｓａＲＮＡの安定性の向上および／またはｓａＲＮＡによる細胞トランスフェクションの向上を行う量で１種以上の賦形剤を含みうる。さらに、本発明のｓａＲＮＡは、自己集合核酸ナノ粒子を用いて製剤化しうる。薬学的に許容可能な担体、賦形剤、および本発明のｓａＲＮＡを含む製剤で使用しうる核酸用の送達剤は、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、アニーリングにより活性成分として二本鎖Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを形成するそれぞれ２１ヌクレオチド長の２つの単一ＲＮＡ鎖を含む。組成物は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭＮａＣｌ、および５ｍＭＥＤＴＡからなる塩緩衝液をさらに含む。

他の実施形態では、本発明のｓａＲＮＡはデンドリマーと共に送達しうる。デンドリマーは高分岐状マクロ分子である。好ましい実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、標的化ｉｎｖｉｖｏ送達のために可撓性構造のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーと複合体化される。この複合体はＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡデンドリマーと呼ばれる。デンドリマーは、高度の分子均一性、狭い分子量分布、特定のサイズおよび形状特性、ならびに高官能基化末端表面を有する。製造プロセスは、中心開始剤コアから開始される一連の繰返し工程である。各後続の成長工程は、より大きい分子直径および分子量ならびに前の世代よりも高反応性の表面部位を有する新しい世代のポリマーを与える。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、表面上の第１級アミン基と構造内の第３級アミン基とを有する効率的なヌクレオチド送達系である。第１級アミン基は、ヌクレオチド結合に関与すると共に細胞内取込みを促進し、一方、埋め込まれた第３級アミノ基は、エンドソーム内でプロトンスポンジとして作用すると共に細胞質中への核酸の放出を増強する。このデンドリマーは、それにより運ばれるｓａＲＮＡをリボヌクレアーゼ分解から保護し、効率的な遺伝子標的化のためにエンドサイトーシスにより長期にわたりｓａＲＮＡの実質的放出を達成する。こうしたナノ粒子のｉｎｖｉｖｏ効力はこれまでに評価されてきており、デンドリマーは末梢血単核細胞に優先的に蓄積すると共に識別可能な毒性を伴うことなく存続することが生体内分布研究から示される（シュウ（Ｚｈｏｕ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２２２８〜２２３８（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）コア、ジアミノブタン（ＤＡＢ）コア、シスタミンコア（ジアミノヘキサン（ヘキサ）コア）、ジアモノドデカン（ＤＯＤＥ）コア、またはエチレンジアミン（ＥＤＡ）コアを含みうる。好ましくは、ＰＡＭＡＭデンドリマーはＴＥＡコアまたはＤＡＢコアを含む。

リピドイド
リピドイドの合成は広範に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、オリゴヌクレオチドまたは核酸の送達に特に適している（マーン（Ｍａｈｏｎ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．）、２０１０年第２１巻、ｐ．１４４８〜１４５４、シュレーダ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・インターナル・メディスン（ＪＩｎｔｅｒｎＭｅｄ．）、２０１０年、第２６７巻、ｐ．９〜２１、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９、ジークバルト（Ｓｉｅｇｗａｒｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２９９６〜３００１（それらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

これらのリピドイドは、齧歯動物および非ヒト霊長動物において二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を効果的に送達するために使用されてきたが（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９、フランク−カメネツキー（Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．）、２００８年、第１０５巻、ｐ．１１９１５〜１１９２０、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９、ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０（それらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、本開示は、ｓａＲＮＡの送達におけるそれらの製剤および使用を記載する。複合体、ミセル、リポソーム、または粒子は、これらのリピドイドを含有した状態で調製可能であるため、局所および／または全身投与経路によりリピドイド製剤を注射した後、ｓａＲＮＡの有効な送達をもたらしうる。ｓａＲＮＡのリピドイド複合体は、限定されるものではないが静脈内経路、筋肉内経路、または皮下経路を含めて種々の手段により投与可能である。

核酸のｉｎｖｉｖｏ送達は、限定されるものではないが製剤組成、粒子ＰＥＧ化性、充填度、オリゴヌクレオチド対脂質比、および生物物理学的パラメータ、たとえば、限定されるものではないが粒子サイズをはじめとする多くのパラメータにより影響されうる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。一例として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質のアンカー鎖長がわずかに変化すると、ｉｎｖｉｖｏ効力が有意な影響を受ける可能性がある。限定されるものではないがペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミンヒドロクロリド（９８Ｎ１２−５としても知られるＴＥＴＡ−５ＬＡＰ、ムルガイア（Ｍｕｒｕｇａｉａｈ）ら著、アナリティカル・ケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１０年、第４０１巻、ｐ．６１（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、Ｃ１２−２００（誘導体およびバリアントを含む）、およびＭＤ１をはじめとするさまざまなリピドイドを含む製剤は、ｉｎｖｉｖｏ活性に関して試験可能である。

本明細書で「９８Ｎ１２−５」と呼ばれるリピドイドは、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９に開示されており、その内容はその全体が参照により組み込まれる（図２参照）。

本明細書で「Ｃ１２−２００」と呼ばれるリピドイドは、ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９（図２参照）ならびにリウ（Ｌｉｕ）およびホワン（Ｈｕａｎｇ）著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ）、２０１０年、ｐ．６６９〜６７０（図２参照）に開示されており、その両方の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。リピドイド製剤は、ｓａＲＮＡに加えて３もしくは４つまたはそれを超える成分を含む粒子を含みうる。一例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定されるものではないが９８Ｎ１２−５を含み、４２％リピドイド、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ（Ｃ１４アルキル鎖長）を含有しうる。他の例として、特定のリピドイドを含む製剤は、限定されるものではないがＣ１２−２００を含み、５０％リピドイド、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、および１．５％ＰＥＧ−ＤＭＧを含有しうる。

一実施形態では、全身静脈内投与のためにリピドイドを用いて製剤化されたｓａＲＮＡは肝臓を標的としうる。たとえば、ｓａＲＮＡを使用し、４２％９８Ｎ１２−５、４８％コレステロール、および１０％ＰＥＧ−脂質の脂質モル組成を含み、約７．５対１の全脂質対ｓａＲＮＡの最終重量比を有し、ＰＥＧ脂質上にＣ１４アルキル鎖長を有し、かつ約５０〜６０ｎｍの平均粒子サイズを有する最終最適化静脈内投与製剤は、肝臓への製剤の分布が９０％超になりうる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。他の例では、Ｃ１２−２００（米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書および国際公開第２０１０／１２９７０９号パンフレット（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）リピドイドを用いた静脈内投与製剤は、７対１の全脂質対核酸の重量比と、５０／１０／３８．５／１．５のＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比率と、８０ｎｍの平均粒子サイズとを有しうると共に、ｓａＲＮＡの送達に有効でありうる（ラブ（Ｌｏｖｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２０１０年、第１０７巻、ｐ．１８６４〜１８６９（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。他の実施形態では、ＭＤ１リピドイド含有製剤は、ｉｎｖｉｖｏでｓａＲＮＡを肝細胞に効果的に送達するために使用しうる。筋肉内経路または皮下経路に対して最適化されたリピドイド製剤の特徴は、標的細胞型および細胞外マトリックスを介する血流中への製剤の拡散能に有意に依存して異なりうる。効果的肝細胞送達を行うには内皮小孔サイズに基づいて１５０ｎｍ未満の粒子サイズが望まれるが（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２００９年、第１７巻、ｐ．８７２〜８７９（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、内皮細胞、骨髄細胞、および筋細胞（これらに限定されるものではない）をはじめとする他の細胞型に製剤を送達するためのリピドイド製剤化ｓａＲＮＡの使用は、同様なサイズ制限を受けない可能性がある。骨髄細胞および内皮などの他の非肝細胞にｉｎｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを送達するためのリピドイド製剤の使用は報告されている（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００８年、第２６巻、ｐ．５６１〜５６９、ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０、チョー（Ｃｈｏ）ら著、アドバンスト・ファンクショナル・マテリアルズ（Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．３１１２〜３１１８、第８回ジュダ・フォークマン国際会議（８ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｕｄａｈＦｏｌｋｍａｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ、２０１０年１０月８〜９日（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。単球などの骨髄細胞への効果的送達では、リピドイド製剤は類似の成分モル比率を有しうる。リピドイドと、ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧ（これらに限定されるものではない）をはじめとする他の成分とのさまざまな比を用いて、肝細胞、骨髄細胞、筋細胞など（これらに限定されるものではない）をはじめとするさまざまな細胞型への送達のために、ｓａＲＮＡの製剤を最適化しうる。たとえば、成分モル比率としては、限定されるものではないが５０％Ｃ１２−２００、１０％ジステロイルホスファチジルコリン、３８．５％コレステロール、および％１．５ＰＥＧ−ＤＭＧが挙げられうる（ロイシュナー（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２０１１年、第２９巻、ｐ．１００５〜１０１０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介する細胞（たとえば、限定されるものではないが脂肪細胞および筋細胞）への核酸の局所送達のためのリピドイド製剤の使用はまた、全身送達に望まれる製剤成分の必ずしもすべてを必要としないこともあり、したがって、リピドイドとｓａＲＮＡとのみを含みうる。

リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
本発明のｓａＲＮＡは、１種以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化可能である。一実施形態では、ｓａＲＮＡの医薬組成物はリポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層で構成しうる人工調製ベシクルであり、栄養素および医薬製剤を投与するための送達媒体として使用しうる。リポソームはさまざまなサイズでありうる。たとえば、限定されるものではないが何百ナノメートルもの直径でありうると共に狭い水性区画により分離された一連の同心二重層を含有しうるマルチラメラベシクル（ＭＬＶ：ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、５０ｎｍよりも小さい直径でありうるスモールユニセルベシクル（ＳＵＶ：ｓｍａｌｌｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、および５０〜５００ｎｍの直径でありうるラージユニラメラベシクル（ＬＵＶ：ｌａｒｇｅｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）でありうる。リポソーム設計は、非健常組織へのリポソームの結合を改善するためにまたは限定されるものではないがエンドサイトーシスなどのイベントを活性化するために、限定されるものではないがオプソニンまたはリガンドを含みうる。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨを含みうる。

リポソームの形成は、物理化学的特性、たとえば、限定されるものではないが閉じ込められる医薬製剤およびリポソーム成分、脂質ベシクルが分散される媒体の性質、閉じ込められる物質の有効濃度およびその潜在的毒性、ベシクルの適用時および／または送達時に含まれる任意の追加のプロセス、最適化サイズ、意図される用途でのベシクルの多分散性および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム製品のバッチ間の再現性および大量生産の可能性に依存しうる。

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されるものではないが１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、マリーナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）（ワシントン州ボセル）製のＤｉＬａ２リポソーム、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、およびＭＣ３（米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））から形成されるようなリポソーム、ならびに低分子薬剤を送達しうるリポソーム、たとえば、限定されるものではないがヤンセン・バイオテック（ＪａｎｓｓｅｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州ホーシャム）製のドキシル（ＤＯＸＩＬ）（登録商標）を含みうる。

一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されるものではないがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでオリゴヌクレオチドの送達に好適であることがこれまでに記載および証明されてきた安定化プラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されるようなリポソームを含みうる（ホイーラ（Ｗｈｅｅｌｅｒ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．２７１〜２８１、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９９年、第６巻、ｐ．１４３８〜１４４７ジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）ら著、ファーマシューティカル・リサーチ（ＰｈａｒｍＲｅｓ．）、２００５年、第２２巻、ｐ．３６２〜３７２、モリッシー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２巻、ｐ．１００２〜１００７、ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００６年、第４４１巻、ｐ．１１１〜１１４、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（ＪＣｏｎｔｒＲｅｌ．）、２００５年、第１０７巻、ｐ．２７６〜２８７、センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６、ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティケーション（ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２（それらの各内容はその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ホイーラ（Ｗｈｅｅｌｅｒ）らによる独自の製造方法は界面活性剤透析法であった。これは後でジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより改良されて自発的ベシクル形成法と呼ばれる。リポソーム製剤は、ｓａＲＮＡに加えて３〜４つの脂質成分で構成しうる。例として、リポソームは、限定されるものではないがジェフズ（Ｊｅｆｆｓ）らにより記載されるように、５５％コレステロール、２０％ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０％ＰＥＧ−Ｓ−ＤＳＧ、および１５％１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含有しうる。他の例では、特定のリポソーム製剤は、限定されるものではないが４８％コレステロール、２０％ＤＳＰＣ、２％ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、および３０％カチオン性脂質を含有しうる。この場合、ヘイズ（Ｈｅｙｅｓ）らにより記載されるように、カチオン性脂質は、１，２−ジステアルルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、または１，２−ジリノレニルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含みうる。他の例では、核酸−脂質粒子は、マクラクラン（Ｍａｃｌａｃｈｌａｎ）らに付与された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％を占めるカチオン性脂質と、粒子中に存在する全脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％を占める非カチオン性脂質と、粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質とを含みうる。他の例では、核酸−脂質粒子は、マクラクラン（Ｍａｃｌａｃｈｌａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２００６／００８９１０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意の核酸−脂質粒子でありうる。限定されるものではないが例として、核酸−脂質粒子は、式Ｉのカチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質とを含みうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、官能基化脂質二重層間に架橋を有しうる脂質ベシクル中に製剤化しうる。
一実施形態では、リポソームは、バリー（Ｂａｌｌｙ）らに付与された米国特許第５５９５７５６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される糖修飾脂質を含有しうる。脂質は、約１０ｍｏｌパーセントの量のガングリオシドおよびセレブロシドでありうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化しうる。リポソームは、国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、カチオン性脂質中の窒素原子とｓａＲＮＡ中のホスフェートとのモル比（Ｎ：Ｐ比）が１：１〜２０：１でありうる。他の実施形態では、リポソームは、２０：１超または１：１未満のＮ：Ｐ比を有しうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化しうる。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で公知の方法によりおよび／または米国特許出願公開第２０１２／０１７８７０２号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように達成しうる。限定されるものではないが例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、たとえば、限定されるものではないがポリリシン、ポリオルニチン、および／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第２０１２／０１３３２６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のカチオン性ペプチドを含みうる。他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化しうると共に、これは、中性脂質、たとえば、限定されるものではないがコレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）をさらに含みうる。

リポソーム製剤は、限定されるものではないがカチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ＰＥＧ化性、全成分の比、および生物物理学的パラメータ、たとえばサイズの影響を受けうる。センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら（センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．）、２０１０年、第２８巻、ｐ．１７２〜１７６（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））の一例では、リポソーム製剤は、５７．１％カチオン性脂質、７．１％ジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％コレステロール、および１．４％ＰＥＧｃ−ＤＭＡで構成された。

いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤の薬動学的挙動および／または生体内分布を変化させるために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）製剤中のＰＥＧの比を増加もしくは減少させることができ、および／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変することができる。限定されるものではないが例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、およびコレステロールと比較して、１〜５％のモル比率のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧの脂質を含有しうる。他の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、たとえば、限定されるものではないがＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置き換えうる。カチオン性脂質は、当技術分野で公知の任意の脂質、たとえば、限定されるものではないがＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡから選択しうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、国際公開第２０１２／１７０９３０号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の脂質ナノ粒子などの脂質ナノ粒子中に製剤化しうる。

一実施形態では、本発明の製剤で使用しうるカチオン性脂質は、限定されるものではないが国際公開第２０１２／０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１／１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１／１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１／０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１／０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２／０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２／０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１０／０８０７２４号パンフレット、国際公開第２０１０／０２１８６５号パンフレット、および国際公開第２００８／１０３２７６号パンフレット、米国特許第７，８９３，３０２号明細書、同第７，４０４，９６９号明細書、および同第８，２８３，３３３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１０／００３６１１５号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のカチオン性脂質から選択される。他の実施形態では、カチオン性脂質は、限定されるものではないが国際公開第２０１２／０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１／１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１／１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１／０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１／０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２／０５４３６５号パンフレット、および国際公開第２０１２／０４４６３８号パンフレット（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の式Ａから選択される。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質は、限定されるものではないが国際公開第２００８／１０３２７６号パンフレットの式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号明細書の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号明細書の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩ、および米国特許出願公開第２０１０／００３６１１５／号明細書の式Ｉ−ＶＩ（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）から選択される。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質は、ゴーシュロン（Ｇａｕｃｈｅｒｏｎ）らに付与された米国特許第７２２３８８７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるカチオン性脂質などの多価カチオン性脂質でありうる。カチオン性脂質は、ゴーシュロン（Ｇａｕｃｈｅｒｏｎ）らに付与された米国特許第７２２３８８７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、２つの第４級アミン基を含む正荷電ヘッド基と、４つの炭化水素鎖を含む疎水性部分とを有しうる。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質は、マイヤー（Ｍａｉｅｒ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される生分解性脂質のように生分解性でありうる。カチオン性脂質は、マイヤー（Ｍａｉｅｒ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式Ｉ〜ＩＶに記載されるようにカチオン性脂質の脂質部分に位置する１つ以上の生分解性基を有しうる。限定されるものではないが例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメミルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ１８，２１ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ν，Ν−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメイヒルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコス−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコス−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエプタコサ−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，、Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−ｌ３，１６−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］エプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヘプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクト−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２アミン、（２Ｓ）−１−（ヘプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ９，１２ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデク−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ν，Ν−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコス−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデク−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルＨ（１−メトイルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、および（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくは立体異性体から選択しうる。

一実施形態では、脂質は、国際公開第２０１２／１７０８８９号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような切断性脂質でありうる。

一実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の少なくとも１種のカチオン性ポリマーを含みうる。
一実施形態では、カチオン性脂質は、当技術分野で公知の方法により、ならびに／または国際公開第２０１２／０４０１８４号パンフレット、国際公開第２０１１／１５３１２０号パンフレット、国際公開第２０１１／１４９７３３号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０９６５号パンフレット、国際公開第２０１１／０４３９１３号パンフレット、国際公開第２０１１／０２２４６０号パンフレット、国際公開第２０１２／０６１２５９号パンフレット、国際公開第２０１２／０５４３６５号パンフレット、国際公開第２０１２／０４４６３８号パンフレット、国際公開第２０１０／０８０７２４号パンフレット、および国際公開第２０１０／２１８６５号パンフレット（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように合成しうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡのＬＮＰ製剤は、３％脂質モル比率でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有しうる。他の実施形態では、ｓａＲＮＡのＬＮＰ製剤は、１．５％脂質モル比率でＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有しうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡの医薬組成物は、国際公開第２０１２／０９９７５５号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＰＥＧ化脂質の少なくとも１つを含みうる。

一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００）を含有しうる。一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と、当技術分野で公知のカチオン性脂質と、少なくとも１つの他の成分とを含有しうる。他の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と、当技術分野で公知のカチオン性脂質と、ＤＳＰＣと、コレステロールとを含有しうる。限定されるものではないが例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と、ＤＬｉｎ−ＤＭＡと、ＤＳＰＣと、コレステロールとを含有しうる。限定されるものではないが他の例として、ＬＮＰ製剤は、２：４０：１０：４８のモル比でＰＥＧ−ＤＭＧ２０００と、ＤＬｉｎ−ＤＭＡと、ＤＳＰＣと、コレステロールとを含有しうる（たとえば、ゲアール（Ｇｅａｌｌ）ら著、「自己増幅ＲＮＡワクチンの非ウイルス送達（Ｎｏｎｖｉｒａｌｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｓｅｌｆ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ）」、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２９０８２９４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。限定されるものではないが他の例として、本明細書に記載のｓａＲＮＡは、米国特許出願公開第２０１２／０２０７８４５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、非経口経路により送達されるナノ粒子中に製剤化しうる。カチオン性脂質はまた、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１５６８４５号明細書、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０１２９７８５号明細書、Ｗａｓａｎらに付与された国際公開第２０１２／０４７６５６号パンフレット、チェン（Ｃｈｅｎ）らに付与された国際公開第２０１０／１４４７４０号パンフレット、アンセル（Ａｎｓｅｌｌの）らに付与された国際公開第２０１３／０８６３２２号パンフレット、またはマノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された国際公開第２０１２／０１６１８４号パンフレット（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるカチオン性脂質でありうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ホープ（Ｈｏｐｅ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／００１７２２３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、第１および第２のカチオン性脂質などの複数のカチオン性脂質を用いて製剤化しうる。第１のカチオン性脂質は第１の性質に基づいて選択可能であり、かつ第２のカチオン性脂質は第２の性質に基づいて選択可能である。この場合、これらの性質は、米国特許出願公開第２０１３／００１７２２３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に概説されるように決定しうる。一実施形態では、第１および第２の性質は相補的である。

他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、カリス（Ｃｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許出願公開第２０１２／０２７６２０９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、脂質粒子が固体コアを含む条件で１種以上のカチオン性脂質と１種以上の第２の脂質と１種以上の核酸とを含む脂質粒子を用いて製剤化しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、サティッシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）らに付与された欧州特許第２２９８３５８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン中でカチオン性両親媒性物質と複合体化しうる。カチオン性両親媒性物質は、カチオン性脂質、修飾もしくは非修飾スペルミン、ブピバカイン、またはベンザルコニウムクロリドでありうると共に、油は、野菜油または動物油でありうる。限定されるものではないが例として、核酸−カチオン性両親媒性物質複合体の少なくとも１０％は、水中油型エマルジョンの油相中にある（たとえば、サティッシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）らに付与された欧州特許第２２９８３５８号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の複合体を参照されたい）。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、カチオン性化合物と中性脂質との混合物を含む組成物を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが例として、カチオン性化合物は、アンセル（Ａｎｓｅｌｌ）らに付与された国際公開第１９９９／０１０３９０号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に開示される）に開示される式（Ｉ）でありうると共に、中性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、およびスフィンゴミエリンからなる群から選択しうる。

一実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１１／１２７２５５号パンフレットまたは国際公開第２００８／１０３２７６号パンフレット（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤化しうる。限定されるものではないが例として、本発明のｓａＲＮＡは、国際公開第２０１１／１２７２５５号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／１０３２７６号パンフレット（その各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のいずれかでカプセル化しうる。

一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤はポリカチオン性組成物を含みうる。限定されるものではないが例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式１〜６０から選択しうる。他の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載のｓａＲＮＡをｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏで送達するために使用しうる。

一実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は浸透エンハンサー分子を追加的に含みうる。限定されるものではないが浸透エンハンサー分子は米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４／号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

一実施形態では、医薬組成物は、限定されるものではないがＤｉＬａ２リポソーム（マリーナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、スマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）／ＮＯＶ３４０（マリーナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）、ワシントン州ボセル）、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（たとえば、卵巣癌のためのｓｉＲＮＡ送達（ランデン（Ｌａｎｄｅｎ）ら著、キャンサー・バイオロジー・アンド・セラピー（ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００６年、第５巻、第１２号、ｐ．１７０８〜１７１３）（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））、およびヒアルロナン被覆リポソーム（クワイエット・セラピューティクス（ＱｕｉｅｔＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、イスラエル国）などのリポソーム中に製剤化しうる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、パンズナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）に付与された国際公開第２００８／０４３５７５号パンフレットおよびエスラー（Ｅｓｓｌｅｒ）らに付与された米国特許第８５８０２９７号明細書（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される任意の両性リポソームを用いて製剤化しうる。両性リポソームは、カチオン性両親媒性物質と、アニオン性両親媒性物質と、任意選択的な１種以上の中性両親媒性物質とを含む脂質の混合物を含みうる。両性リポソームは、ヘッド基が１つ以上の両性基で置換された両親媒性分子をベースとする両性化合物を含みうる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、エスラー（Ｅｓｓｌｅｒ）らに付与された米国特許出願公開第２０１４／０２２７３４５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、４〜９の等電点を有する１つ以上の両性基を含む両性脂質を用いて製剤化しうる。

ナノ粒子配合物は、炭水化物担体と核酸分子（たとえば、ｓａＲＮＡ）とを含む炭水化物ナノ粒子でありうる。非限定的な例として、炭水化物担体は、限定されるものではないがアンヒドリド修飾フィトグリコーゲン型またはグリコーゲン型材料、フトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータ−デキストリン、アンヒドリド修飾フィトグリコーゲンベータ−デキストリンを含みうる。（たとえば、国際公開第２０１２／１０９１２１号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を急速排出脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ：ｒａｐｉｄｌｙｅｌｉｍｉｎａｔｅｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることにより改善しうる。限定されるものではないがＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化性カチオン性脂質は、経時的に血漿および組織に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源でありうる。急速排出脂質の急速代謝は、ラットにおいて脂質ナノ粒子の耐容性および治療指数を１ｍｇ／ｋｇ用量〜１０ｍｇ／ｋｇ用量程度改善可能である。酵素分解エステル結合の組込みは、カチオン性成分の分解および代謝プロファイルを向上可能であるが、依然としてｒｅＬＮＰ製剤の活性が維持される。エステル結合は、脂質鎖内に内在しうるかまたは脂質鎖末端に端在しうる。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えうる。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、限定されるものではないがサイレンス・セラピューティクス（ＳｉｌｅｎｃｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（英国ロンドン）製のアツプレックス（ＡＴＵＰＬＥＸ）（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、および他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ステムジェント（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）製のステムフェクト（ＳＴＥＭＦＥＣＴ）（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンをベースとする核酸の標的化および非標的化送達（アレク（Ａｌｅｋｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）、２００８年、第６８巻、ｐ．９７８８〜９７９８、ストラムバーグ（Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ）ら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（ＩｎｔＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ）、２０１２年、第５０巻、ｐ．７６〜７８、サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４、サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０、グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（ＰｕｌｍＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（ＭｉｃｒｏｖａｓｃＲｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３、ウェイド（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００９年、第３２巻、ｐ．４９８〜５０７、ウェイド（Ｗｅｉｄｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００８年、第３１巻、ｐ．１８０〜１８８、パスコロ（Ｐａｓｃｏｌｏ）著、エクスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第４巻、ｐ．１２８５〜１２９４、フォティン−ムレクゼック（Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２０１１年、第３４巻、ｐ．１〜１５、ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７、ペール（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２００７年、第６巻、第１０４号、ｐ．４０９５〜４１００、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．１２５〜１３２（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））など、リポプレックスとして製剤化しうる。

一実施形態では、かかる製剤はまた、限定されるものではないが肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、白血球などのさまざまな細胞型をｉｎｖｉｖｏで受動的または能動的に指向するように、構築または組成変更しうる（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４、ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７、ジャッジ（Ｊｕｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ）、２００９年、第１１９巻、ｐ．６６１〜６７３、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）ら著、マイクロバスキュラー・リサーチ（ＭｉｃｒｏｖａｓｃＲｅｓ）、２０１０年、第８０巻、ｐ．２８６〜２９３、サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１２２２〜１２３４、サンテル（Ｓａｎｔｅｌ）ら著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ）、２００６年、第１３巻、ｐ．１３６０〜１３７０、グートビール（Ｇｕｔｂｉｅｒ）ら著、プルモナリー・ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス（ＰｕｌｍＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１０年、第２３巻、ｐ．３３４〜３４４、バシャ（Ｂａｓｈａ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、２０１１年、第１９巻、ｐ．２１８６〜２２００、フェンケ（Ｆｅｎｓｋｅ）およびカリス（Ｃｕｌｌｉｓ）著、エクスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．２５〜４４、ペール（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、ｐ．６２７〜６３０、ペール（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。肝細胞への製剤の受動標的化の一例は、ｉｎｖｉｖｏアポリポタンパク質Ｅに結合して肝細胞へのこれらの製剤の結合および取込みを促進することが示されているＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡをベースとする脂質ナノ粒子製剤を含む（アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。製剤はまた、限定されるものではないがホレート、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、および抗体による標的化的法により例証されるように、その表面上のさまざまなリガンドの発現を介して選択的に標的化可能である（コルハトカー（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ）ら著、カレント・ドラッグ・デリバリー・テクノロジー（ＣｕｒｒＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｅｃｈｎｏｌ．）、２０１１年、第８巻、ｐ．１９７〜２０６、ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）およびトーチリン（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）著、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス（ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ．）、２０１１年、第１６巻、ｐ．１３８８〜１４１２、ユー（Ｙｕ）ら著、モレキュラー・メンブレン・バイオロジー（ＭｏｌＭｅｍｂｒＢｉｏｌ．）、２０１０年、第２７巻、ｐ．２８６〜２９８、パティル（Ｐａｔｉｌ）ら著、クリニカル・レビューズ・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリヤー・システムズ（ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．）、２００８年、第２５巻、ｐ．１〜６１、ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら著、バイオモレキュールズ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２０１１年、第１２巻、ｐ．２７０８〜２７１４、ザオ（Ｚｈａｏ）ら著、エクスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．）、２００８年、第５巻、ｐ．３０９〜３１９、アキンク（Ａｋｉｎｃ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．１３５７〜１３６４、スリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．）、２０１２年、第８２０巻、ｐ．１０５〜１１６、ベン−アリエ（Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．）、２０１２年、第７５７巻、ｐ．４９７〜５０７、ペール（Ｐｅｅｒ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ）、２０１０年、第２０巻、ｐ．６３〜６８、ペール（Ｐｅｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．４０９５〜４１００、キム（Ｋｉｍ）ら著、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．）、２０１１年、第７２１巻、ｐ．３３９〜３５３、スブラマニア（Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ）ら著、モレキュラー・セラピー（ＭｏｌＴｈｅｒ．）、２０１０年、第１８巻、ｐ．２０２８〜２０３７、ソング（Ｓｏｎｇ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２００５年、第２３巻、ｐ．７０９〜７１７、ペール（Ｐｅｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３１９巻、第号、ｐ．６２７〜６３０、ペール（Ｐｅｅｒ）およびリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）著、ジーン・セラピー（ＧｅｎｅＴｈｅｒ．）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１１２７〜１１３３（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ：ｓｏｌｉｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は１０〜１０００ｎｍの平均直径を有して球状でありうる。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、かつ界面活性剤および／または乳化剤を用いて安定化することができる固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態では、脂質ナノ粒子はセルフアセンブリー脂質−ポリマーナノ粒子でありうる（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら著、ＡＣＳナノ（ＡＣＳＮａｎｏ）、２００８年、第２巻、第８号、ｐ．１６９６〜１７０２を参照されたい（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、制御放出および／または標的化送達のために製剤化可能である。本明細書で用いられる場合、「制御放出」とは、治療アウトカムを達成する特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを意味する。一実施形態では、ｓａＲＮＡは、制御放出および／または標的化送達のために本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の送達剤中にカプセル化しうる。本明細書で用いられる場合、「カプセル化」という用語は、密封、包囲、または収容を意味する。本発明の化合物の製剤に関して、カプセル化は、実質的、完全、または部分的でありうる。「実質的カプセル化」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超または９９．９９９％超を送達剤内に密封、包囲、または収容しうることを意味する。「部分的カプセル化」とは、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０、５０以下を送達剤内に密封、包囲、または収容しうることを意味する。有利には、カプセル化は、蛍光および／または電子顕微鏡写真を用いて本発明の医薬組成物または化合物の逃散または活性を測定することにより決定しうる。たとえば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９％、または９９．９９％超が送達剤内にカプセル化される。

他の実施形態では、ｓａＲＮＡは、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中にカプセル化しうると共に、次いで、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子は、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知のポリマー、ヒドロゲル、および／または外科シーラント中にカプセル化しうる。限定されるものではないが例として、ポリマー、ヒドロゲル、または外科シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ゲルサイト（ＧＥＬＳＩＴＥ）（登録商標）（ナノセラピューティクス・インコーポレイテッド（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州アラチュア）、ハイレネッミス（ＨＹＬＥＮＥＸ）（登録商標）（ハロザイム・セラピューティクス（ＨａｌｏｚｙｍｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）、外科シーラント、たとえば、フィブリノーゲンポリマー（エチコン・インコーポレイテッド（ＥｔｈｉｃｏｎＩｎｃ．）、ジョージア州コーネリア）、ティセル（ＴＩＳＳＥＬＬ）（登録商標）（バクスター・インターナル・インコーポレイテッド（ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）、ＰＥＧ系シーラント、およびコシール（ＣＯＳＥＡＬ）（登録商標）（バクスター・インターナル・インコーポレイテッド（ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、イリノイ州ディアフィールド）でありうる。

他の実施形態では、対象に注射する場合、脂質ナノ粒子は、ゲルを形成しうる当技術分野で公知の任意のポリマー中にカプセル化しうる。限定されるものではないが他の例として、脂質ナノ粒子は、生分解性でありうるポリマーマトリックス中にカプセル化しうる。

一実施形態では、制御放出および／または標的化送達に供されるｓａＲＮＡ製剤はまた、少なくとも１種の制御放出コーティングを含みうる。制御放出コーティングとしては、限定されるものではないがオパドライ（ＯＰＡＤＲＹ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ユードラギットＲＬ（ＥＵＤＲＡＧＩＴＲＬ）（登録商標）、ユードラギットＲＳ（ＥＵＤＲＡＧＩＴＲＳ）（登録商標）、およびセルロース誘導体、たとえば、エチルセルロース水性ディスパージョン（アクアコート（ＡＱＵＡＣＯＡＴ）（登録商標）およびスリリース（ＳＵＲＥＬＥＡＳＥ）（登録商標））が挙げられる。

一実施形態では、制御放出および／または標的化送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有しうる少なくとも１種の分解性ポリエステルを含みうる。分解性ポリエステルとしては、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するようにＰＥＧコンジュゲーションを含みうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０２０２６５２号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される標的化部分などの標的化部分を有する標的化脂質を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが例として、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１３／０２０２６５２号明細書の式Ｉの標的化部分は、所望の器官、組織、細胞、細胞型もしくは亜型、またはオルガネラに脂質が有利に局在化するように選択しうる。限定されるものではないが本発明で企図される標的化部分は、トランスフェリン、アニスアミド、ＲＧＤペプチド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ：ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ）、フコース、抗体、またはアプタマーを含む。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは治療用ナノ粒子中にカプセル化しうる。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の方法により、たとえば、限定されるものではないが国際公開第２０１０／００５７４０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３０７６３号パンフレット、国際公開第２０１０／００５７２１号パンフレット、国際公開第２０１０／００５７２３号パンフレット、国際公開第２０１２／０５４９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００８７３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００６８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２７４７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００６８２８６号明細書、および米国特許出願公開第２０１２／０２８８５４１号明細書、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号明細書、同第８，２９３，２７６号明細書、同第８，３１８，２０８号明細書、および同第８，３１８，２１１号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法により製剤化しうる。他の実施形態では、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２／０１４０７９０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により同定しうる。

一実施形態では、治療用ナノ粒子、持続放出のために製剤化しうる。本明細書で用いられる場合、「持続放出」とは、特定の期間にわたり放出速度に適合する医薬組成物または化合物を意味する。期間は、限定されるものではないが何時間、何日間、何週間、何ヶ月間、および何年間かを含みうる。限定されるものではないが例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマーおよび治療剤、たとえば、限定されるものではないが本発明のｓａＲＮＡを含みうる（国際公開第２０１０／０７５０７２号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１０／０２１６８０４号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２１７３７７号明細書、および米国特許出願公開第２０１２／０２０１８５９号明細書、（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は標的特異的になるように製剤化しうる。限定されるものではないが例として、治療用ナノ粒子はコルチコステロイドを含みうる（国際公開第２０１１／０８４５１８／号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一実施形態では、治療用ナノ粒子は癌特異的になるように製剤化しうる。限定されるものではないが例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第２００８／１２１９４９号パンフレット、国際公開第２０１０／００５７２６号パンフレット、国際公開第２０１０／００５７２５号パンフレット、国際公開第２０１１／０８４５２１号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１０／００６９４２６号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０００４２９３号明細書、および米国特許出願公開第２０１０／０１０４６５５号明細書、（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のナノ粒子中で製剤化しうる。

一実施形態では、本発明のナノ粒子はポリマーマトリックスを含みうる。限定されるものではないが例として、ナノ粒子は、２種以上のポリマー、たとえば、限定されるものではないがポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはそれらの組合せを含みうる。

一実施形態では、治療用ナノ粒子はジブロックコポリマーを含む。一実施形態では、ジブロックコポリマーは、限定されるものではないがポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアンヒドリド、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、またはそれらの組合せなどのポリマーと組み合わせてＰＥＧを含みうる。

限定されるものではないが例として、治療用ナノ粒子はＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（米国特許出願公開第２０１２／０００４２９３号明細書および米国特許第８，２３６，３３０号明細書（それらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。限定されるものではないが他の例として、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡまたはＰＥＧとＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号明細書および国際公開第２０１２／１６６９２３号パンフレット（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は、限定されるものではないが米国特許第８，２６３，６６５号明細書および同第８，２８７，９１０号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のマルチブロックコポリマーなどのマルチブロックコポリマーを含みうる。

一実施形態では、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマーミセルとブロックコポリマーとを含むポリイオン複合体に含まれうる。（たとえば、米国特許出願公開第２０１２／００７６８３６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアクリル系ポリマーを含みうる。アクリル系ポリマーとしては、限定されるものではないがアクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレートおよびメタクリル酸コポリマー、アミノ、アルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、およびそれらの組合せが挙げられる。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は、少なくとも１種のアミン含有ポリマー、たとえば、限定されるものではないがポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）、およびそれらの組合せを含みうる（たとえば、米国特許第８，２８７，８４９号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有しうる少なくとも１種の分解性ポリエステルを含みうる。分解性ポリエステルとしては、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するようにＰＥＧコンジュゲーションを含みうる。

他の実施形態では、治療用ナノ粒子、少なくとも１種の標的化リガンドのコンジュゲーションを含みうる。標的化リガンドは、当技術分野で公知の任意のリガンド、たとえば、限定されるものではないがモノクローナル抗体でありうる。（キルポーチン（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ）ら著、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）、２００６年、第６６巻、ｐ．６７３２〜６７４０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。

一実施形態では、治療用ナノ粒子は、癌を標的とするように使用しうる水性溶液中に製剤化しうる（国際公開第２０１１／０８４５１３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１／０２９４７１７号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、ｓａＲＮＡは、合成ナノ担体にカプセル化、結合、および／または会合しうる。合成ナノ担体は、限定されるものではないが国際公開第２０１０／００５７４０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３０７６３号パンフレット、国際公開第２０１２／１３５０１号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２５２号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２５５号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２５９号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２６５号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２６８号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９２８２号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９３０１号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９３９３号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９４０５号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９４１１号パンフレット、国際公開第２０１２／１４９４５４号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０１９６６９号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００８７３３７号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０２４４２２２号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）のに記載のものを含む。合成ナノ担体は、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の方法を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが例として、合成ナノ担体は、国際公開第２０１０／００５７４０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３０７６３号パンフレット、および国際公開第２０１２／１３５０１号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２６２４９１号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０４６４５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／００８７３３７号明細書、および米国特許出願公開第２０１２／０２４４２２号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤化しうる。他の実施形態では、合成ナノ担体製剤は、国際公開第２０１１／０７２２１８号パンフレットおよび米国特許第８，２１１，４７３号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により凍結乾燥しうる。

一実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のｓａＲＮＡを放出するために反応性基を含有しうる（国際公開第２０１２／０９５２５５２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１２／０１７１２２９号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、合成ナノ担体は標的化放出のために製剤化しうる。一実施形態では、合成ナノ担体は、特定のｐＨでおよび／または所望の時間後にｓａＲＮＡを放出するように製剤化しうる。限定されるものではないが例として、合成ナノ粒子は、２４時間後におよび／または４．５のｐＨでｓａＲＮＡを放出するように製剤化しうる（国際公開第２０１０／１３８１９３号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１３８１９４号パンフレットならびに米国特許出願公開第２０１１／００２０３８８号明細書および米国特許出願公開第２０１１／００２７２１７号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

一実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のｓａＲＮＡの制御放出および／または持続放出のために製剤化しうる。限定されるものではないが例として、持続放出に供される合成ナノ担体は、当技術分野で公知の、本明細書に記載の、ならびに／または国際公開第２０１０／１３８１９２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１０／０３０３８５０号明細書（それらの各内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤化しうる。

一実施形態では、ナノ粒子は経口投与のために最適化しうる。ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性バイオポリマー、たとえば、限定されるものではないがキトサンまたはその誘導体を含みうる。限定されるものではないが例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２／０２８２３４３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により製剤化しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許第８５７５１２３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなモジュール組成物中に製剤化しうる。限定されるものではないが例として、モジュール組成物は、核酸、たとえば本発明のｓａＲＮＡと、少なくとも１種のエンドソーム分解成分と、少なくとも１種の標的化リガンドとを含みうる。モジュール組成物は、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許第８５７５１２３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のいずれかの式などの式を有しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）らに付与された米国特許第８５４６５５４号明細書（その内容はその全体が参照により組み込まれる）に記載されるような安定な核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を形成するように脂質配合物中にカプセル化しうる。脂質はカチオン性または非カチオン性でありうる。限定されるものではないが一例では、脂質対核酸比（質量／質量比）（たとえば、脂質対ｓａＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、もしくは約６：１〜約９：１の範囲内、または５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、もしくは１１：１であろう。他の例では、ＳＮＡＬＰは、６３．０±２０ｎｍの粒子サイズおよび０．０２７の核酸／脂質比率を有して、４０％２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（リピドＡ）、１０％ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、４０％コレステロール、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含む。他の実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ラム（Ｌａｍ）らに付与された米国特許第７１８９７０５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるエンドソーム膜不安定化剤を含む核酸−脂質粒子を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが例として、エンドソーム膜不安定化剤はＣａ^２＋イオンでありうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、アキン（Ａｋｉｎｅ）らに付与された米国特許第８１４８３４４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される製剤化脂質粒子（ＦＬｉＰ：ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅ）を用いて製剤化しうる。アキン（Ａｋｉｎｅ）らは、ＦＬｉＰが一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含みうると教示している。この場合、オリゴヌクレオチドは、親油性物質と、コンジュゲートオリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されたエマルジョンまたはリポソームの少なくとも１つとにコンジュゲートされている。こうした粒子は、驚くべきことに、アキン（Ａｋｉｎｅ）らに付与された米国特許第８１４８３４４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、心臓、肺、および筋肉にオリゴヌクレオチドを効果的に送達することが示されている。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、タム（Ｔａｍ）らに付与された米国特許第６０８６９１３号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、脂質製剤中に発現ベクターを含む組成物を用いて細胞に送達しうる。タム（Ｔａｍ）により開示された組成物は血清安定性であり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ）の第１のおよび第２の反転反復配列とＡＡＶのｒｅｐ遺伝子と核酸断片とを含む発現ベクターを含む。タム（Ｔａｍ）の発現ベクターは脂質と複合体化される。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、ド・フジュロル（ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ）らに付与された米国特許出願公開第２０１２／０２７０９２１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される脂質製剤を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが一例では、脂質製剤は、米国特許出願公開第２０１２／０２７０９２１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の式Ａを有するカチオン性脂質を含みうる。限定されるものではないが他の例として、米国特許出願公開第２０１２／０２７０９２１号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表Ａに開示される例示的な核酸−脂質粒子の組成物は、本発明のｓａＲＮＡと共に使用しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、マウラー（Ｍａｕｒｅｒ）らに付与された米国特許出願公開第２０１２／０２７６２０７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される脂質粒子中に完全にカプセル化しうる。粒子は、あらかじめ形成されたベシクルと治療剤との混合物を不安定化溶媒中に形成するように、あらかじめ形成された脂質ベシクルと荷電治療剤と不安定化剤とを含む脂質組成物を含む。この場合、前記不安定化溶媒は、ベシクルを破壊することなくあらかじめ形成された脂質ベシクルの膜を不安定化するのに有効である。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡはコンジュゲート脂質を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが一例では、コンジュゲート脂質は、リン（Ｌｉｎ）らに付与された米国特許出願公開第２０１２／０２６４８１０号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような式を有しうる。コンジュゲート脂質は、カチオン性脂質と中性脂質と凝集を低減可能な脂質とをさらに含む脂質粒子を形成しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡ、フィッツジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）らに付与された米国特許出願公開第２０１２／０２４４２０７号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような中性リポソーム製剤中に製剤化しうる。「中性リポソーム製剤」という語句は、生理ｐＨでほぼ中性または中性の表面電荷を有するリポソーム製剤を意味する。生理ｐＨは、たとえば約７．０〜約７．５、またはたとえば約７．５、またはたとえば７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、もしくは７．５、またはたとえば７．３、またはたとえば７．４でありうる。中性リポソーム製剤の例は、イオン化性脂質ナノ粒子（ｉＬＮＰ：ｉｏｎｉｚａｂｌｅｌｉｐｉｄ
ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）である。中性リポソーム製剤は、イオン化性カチオン性脂質、たとえばＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含みうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、荷電脂質またはアミノ脂質を用いて製剤化しうる。本明細書で用いられる場合、「荷電脂質」という用語は、１または２つの脂肪アシル鎖または脂肪アルキル鎖と第４級アミノヘッド基とを有する脂質を含むことを意味する。第４級アミンは永久正電荷を有する。ヘッド基は、生理ｐＨでプロトン化しうる第１級、第２級、第３級アミンなどのイオン化性基を任意選択的に含みうる。第４級アミンの存在は、第４級アミンの欠如した構造類似化合物（たとえば、第４級アミンが第３級アミンで置き換えられる）中のイオン化性基のｐＫａと比較してイオン化性基のｐＫａを変化させうる。いくつかの実施形態では、荷電脂質は「アミノ脂質」と呼ばれる。限定されるものではないが一例では、アミノ脂質は、ホープ（Ｈｏｐｅ）らに付与された米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のアミノ脂質でありうる。たとえば、アミノ脂質は、ホープ（Ｈｏｐｅ）らに付与された米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される構造（ＩＩ）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡとして開示される構造を有しうる。他の例では、アミノ脂質は、ムチアー（Ｍｕｔｈｉａｈ）らに付与された国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される構造（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、もしくは（ＩＶ）、または４−（Ｒ）−ＤＵｎ−Ｋ−ＤＭＡ（ＶＩ）、４−（Ｓ）−ＤＵｎ−Ｋ−ＤＭＡ（Ｖ）を有しうる。他の例では、本明細書に記載の製剤のいずれかで使用される荷電脂質は、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された欧州特許第２５０９６３６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の任意の荷電脂質でありうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、脂質とリポソームとリポプレックスとを含有する会合複合体を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが一例では、会合複合体は、マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）らに付与された米国特許第８０３４３７６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される式（Ｉ）により定義される構造、式（ＸＶ）による定義される構造を有するＰＥＧ−脂質、ステロイド、および核酸をそれぞれ有する１種以上の化合物を含む。ｓａＲＮＡは、米国特許第８０３４３７６号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のいずれかの会合複合体を用いて製剤化しうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、リバースヘッド基脂質を用いて製剤化しうる。限定されるものではないが例として、ｓａＲＮＡは、ヘッド基を含む双性イオン性脂質を用いて製剤化しうる。この場合、レオン（Ｌｅｕｎｇ）らに付与された国際公開第２０１１／０５６６８２号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の構造（Ａ）または構造（Ｉ）を有する脂質のように、正電荷はアシル鎖領域の近傍に位置し、負電荷はヘッド基の先端部に位置する。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは脂質二重層担体中に製剤化しうる。限定されるものではないが例として、ｓａＲＮＡは、核酸−脂質−界面活性剤混合物を提供するために、約５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％の量の凝集防止剤と、約０．５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質と、膜融合脂質と、界面活性剤との脂質混合物を含む脂質−界面活性剤混合物と組み合わせうると共に、次いで、緩衝塩溶液に対して前記核酸−脂質−界面活性剤混合物を透析して前記界面活性剤を除去し、かつ前記核酸を脂質二重層担体中にカプセル化し、かつ脂質二重層−核酸組成物を提供しうる。この場合、前記緩衝塩溶液は、前記核酸の約４０％〜約８０％をカプセル化するのに十分なイオン強度を有する。これについては、カリス（Ｃｕｌｌｉｓ）らに付与された国際公開第１９９９／０１８９３３号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、心臓、肝臓、または腫瘍組織部位にｓａＲＮＡを選択的に標的化可能な核酸−脂質粒子中に製剤化しうる。たとえば、核酸−脂質粒子は、カリス（Ｃｕｌｌｉｓ）らに付与された欧州特許第１３２８２５４号明細書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、（ａ）核酸、（ｂ）１．０モル％〜４５モル％のカチオン性脂質、（ｃ）０，０モル％〜９０モル％の他の脂質、（ｄ）１，０モル％〜１０モル％の二重層安定化成分、（ｅ）０，０モル％〜６０モル％のコレステロール、および（ｆ）０，０モル％〜１０モル％のカチオン性ポリマー脂質、を含みうる。カリス（Ｃｕｌｌｉｓ）は、前記カチオン性脂質、二重層安定化成分、他の脂質、コレステロール、およびカチオン性ポリマー脂質の各量を変化させることにより、心臓、肝臓、または腫瘍組織部位に対する組織選択率を付与可能であることから、前記心臓、肝臓、または腫瘍組織部位に核酸を選択的に標的化可能な核酸−脂質粒子が同定されると教示している。

送達
本開示は、薬剤送達の科学の進歩の可能性を考慮して任意の適切な経路により治療、医薬、診断、またはイメージングのいずれかのためにｓａＲＮＡを送達することを包含する。送達はネイキッド状態または製剤化状態でありうる。

本発明のｓａＲＮＡは、ネイキッド状態で細胞に送達しうる。本明細書で用いられる場合、「ネイキッド」とは、トランスフェクションを促進する作用剤を用いずにｓａＲＮＡを送達することを意味する。たとえば、細胞に送達されるｓａＲＮＡは修飾を含まないものでありうる。ネイキッドｓａＲＮＡは、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達しうる。

本発明のｓａＲＮＡは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化しうる。製剤は、修飾型および／または非修飾型でありうるｓａＲＮＡを含有しうる。製剤は、限定されるものではないが細胞透過剤、薬学的に許容可能な担体、送達剤、生侵食性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポをさらに含みうる。製剤化ｓａＲＮＡは、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達しうる。

組成物はまた、直接浸漬または沐浴する方法、カテーテルを介した方法、ゲル剤、粉末剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤による方法、組成物で被覆または含浸された布または生分解性材料などの基材を用いた方法など（これらに限定されるものではない）をはじめとする当技術分野のいくつかの方法のいずれかで、器官または組織に直接送達するために製剤化しうる。本発明のｓａＲＮＡはまた、レトロウイルス複製ベクター（ＲＲＶ：ｒｅｔｒｏｖｉｒｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒ）中にクローニングして細胞にトランスデュースしうる。

投与
本発明のｓａＲＮＡは、治療上有効なアウトカムをもたらす任意の経路により投与しうる。こうした経路としては、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経真皮、硬膜外（硬膜上）、大脳内（大脳中へ）、脳室内（脳室中へ）、皮膚上（皮膚上への適用）、真皮内（皮膚自体中へ）、皮下（皮膚下へ）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈中へ）、動脈内（動脈中へ）、筋肉内（筋肉中へ）、心臓内（心臓中へ）、骨内注入（骨髄中へ）、髄腔内（脊柱管中へ）、腹腔内、（腹膜中への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を介して）、空洞内注射、（陰茎基部中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経真皮（全身分布のためのインタクト皮膚を介する拡散）、経粘膜（粘膜を介する拡散）、吹送（経鼻吸入）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上へ）、または点耳が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を通過できるようにする方法で投与しうる。２０１２年１２月１４日出願の国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される投与経路は、本発明のｓａＲＮＡを投与するために使用しうる。

剤形
本明細書に記載の医薬組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注射用（たとえば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下）などの本明細書に記載の剤形で製剤化しうる。２０１２年１２月１４日出願の国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の液体剤形、注射用製剤、経肺剤形、および固体剤形は、本発明のｓａＲＮＡ用の剤形として使用しうる。

ＩＩ．使用方法
本発明の一態様は、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの使用方法および前記Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡと少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＣ／ＥＢＰα遺伝子発現をモジュレートする。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ増加する。さらに好ましい実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する。

一実施形態では、本明細書に記載のｓａＲＮＡの遺伝子発現の増加は増殖細胞で示される。
代謝調節
肝細胞は、いくつかの生命機能の維持に重要であると一般に認識されている。たとえば、それは炭水化物および脂質の代謝ならびに外因性および内因性の化合物の解毒を調節可能である。Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪細胞、ＩＩ型肺胞細胞、および肝細胞をはじめとする多くの細胞型の分化に重要な役割を果たすさまざまな組織で発現される。マウスでは、Ｃ／ＥＢＰαは、脂肪組織、肝組織、および肺組織に最も多く豊富に見いだされる。Ｃ／ＥＢＰαの機能的役割としては、限定されるものではないがα−１−アンチトリプシン、トランスサイレチン、およびアルブミンのレギュレーションが挙げられる。さらに、肝細胞系（ＨｅｐＧ２）におけるＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現は、内因性基質の代謝に関与すると共に主要な生体異物の解毒および代謝活性化に重要な役割を果たすモノオキシゲナーゼのスーパーファミリーであるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）のレベルの増加をもたらす［ジョウバー（Ｊｏｖｅｒ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ）、１９９８年、第４３１巻、第２号、ｐ．２２７〜２３０（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、主要なグローバルな健康問題であり、米国では３名中１名が罹患する。ＮＡＦＬＤは、過剰アルコール使用が原因とならない肝細胞への余分な脂肪（脂質）の蓄積である。それは肝臓の重量の５％〜１０％超が脂肪であるときに脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝炎、硬変、および肝癌に進行するおそれがある。それはメタボリック症候群、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満などの代謝障害に関連付けられる。治療方法としては、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルの低下、インスリン感受性の向上、代謝リスク因子の治療、体重減少などが挙げられる［アダムス（Ａｄａｍｓ）ら著、ポストグラジュエート・メディカル・ジャーナル（ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ）、２００６年、第８２巻、ｐ．３１５〜３２２、ムッソ（Ｍｕｓｓｏ）ら著、カレント・オピニオン・イン・リピドロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．）、２０１１年、第２２巻、第６号、ｐ．４８９〜４９６（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。

Ｃ／ＥＢＰαタンパク質は、肝機能および代謝の調節に重要な役割を果たす。肝臓へのＣ／ＥＢＰαの一次作用は、ＣＤ３６タンパク質レベルの低下による脂肪酸取込みの減少、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰ）、および脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）タンパク質のレベルの低下によるｄｅｎｏｖｏ脂質生成の減少、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターアルファ（ＰＰＡＲα）ならびにペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマコアクチベータ１−アルファおよび−ベータ（ＰＧＣ−１αおよびβ）のタンパク質レベルの増加によるβ酸化の増加、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）および低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ：ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質のレベルの低下による肝脂質過負荷の減少、ＰＧＣ−１βタンパク質レベルの増加による線維症への進行の減少、ならびにペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲγ）タンパク質レベルの増加によるインスリン抵抗性の減少を含めて、図１に示される。さらに、Ｃ／ＥＢＰαは、図２に示されるように脂肪組織への二次作用を有する。白色脂肪組織（ＷＡＴ：Ｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ）は、脂質生成組織および脂肪貯蔵組織であるだけでなく、エネルギーホメオスタシス、脂質代謝、食欲、妊性、ならびに免疫反応およびストレス反応を調節する重要な内分泌器官でもある。褐色脂肪組織（ＢＡＴ：Ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ）は、ＷＡＴと比較して多数のより小さい脂質小滴およびかなりより多くの鉄含有ミトコンドリアを含有する。それは栄養エネルギー、エネルギー収支、および体重に重要な役割を果たす。ＢＡＴの萎縮が肥満に関連付けられるという証拠が存在する。特に、ＢＡＴにおける熱発生の障害は齧歯動物の肥満の病因に重要なことが研究から示唆された［トレイハーンＰ．（ＴｒａｙｈｕｒｎＰ．）著、ジャーナル・オブ・バイオサイエンシズ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．）、１９９３年、第１８巻、第２号、ｐ．１６１〜１７３］。Ｃ／ＥＢＰαは、肝脂肪症およびインスリン抵抗性を減少させると共にＰＧＣ−１αタンパク質レベルを増加させ、続いてＷＡＴの褐変、ＷＡＴからＢＡＴへの変換、次いでＢＡＴの活性化を引き起こし、それにより体脂肪および体量を低減する。したがって、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝機能の調節、脂肪症の低減、血清脂質の低減、ＮＡＦＬＤの治療、インスリン抵抗性の治療、エネルギー消費の増加、および肥満の治療に使用しうる。

一実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することによりｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで肝代謝遺伝子をレギュレートする方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することによりｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏでＮＡＦＬＤに関与する肝遺伝子をレギュレートする方法も提供される。遺伝子は、限定されるものではないがステロール調節エレメント結合因子１（ＳＲＥＢＦ１またはＳＲＥＢＦ）、分化クラスター３６（ＣＤ３６）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２（ＡＣＡＣＢ）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマコアクチベータ１アルファ（ＰＰＡＲγ−ＣｏＡ１αまたはＰＰＡＲＧＣ１Ａ）、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマコアクチベータ１ベータ（ＰＰＡＲγ−ＣｏＡ１βまたはＰＥＲＣ）、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲγ）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＡＣＡ）、炭水化物応答エレメント結合タンパク質（ＣｈＲＥＢＰまたはＭＬＸ１ＰＬ）、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化レセプターアルファ（ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲＡ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、および哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）を含む。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＳＲＥＢＦ１遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＡＰＯＣ３遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＭＴＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＰＰＡＲγ−ＣｏＡ１α遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＰＰＡＲγ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＰＰＡＲα遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＭＬＸＩＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞のＤＧＡＴ２遺伝子の発現を少なくとも１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％だけ減少させる。

Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはまた、ＢＡＴ細胞において以上に開示される肝代謝遺伝子の発現をモジュレートする。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＬＤＬＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＡＰＯＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＰＥＲＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＭＬＸＰ１遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＭＴＯＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＰＰＡＲＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＢＡＴ細胞のＤＧＡＴ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、より好ましくは少なくとも２００％、２５０％、３００％だけ増加させる。

Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、またＷＡＴ細胞中で以上に開示される肝代謝遺伝子の発現をモジュレートする。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＳＲＥＢＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＬＤＬＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＰＰＡＲＧＣ１Ａ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＭＴＰ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０倍、より好ましくは少なくとも５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０倍だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＡＰＯＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％だけ増加させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＡＣＡＣＢ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＰＥＲＣ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＡＣＡＣＡ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、好ましくは少なくとも７５％、９０％、９５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＭＬＸ１ＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＭＴＯＲ遺伝子の発現を少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、７５％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＦＡＳＮ遺伝子の発現を少なくとも５％、１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％だけ減少させる。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＷＡＴ細胞のＤＧＡＴ遺伝子の発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、より好ましくは４０％、５０％だけ減少させる。

他の実施形態では、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することによりインスリン抵抗性（ＩＲ：ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を低減するまたはインスリン感受性を増加させる方法が提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することによりＩＩ型糖尿病、高インスリン血症、および脂肪症を治療する方法が提供される。肝細胞がインスリン抵抗性でありかつインスリンを効果的に使用できない場合、高血糖が発生する。その結果、膵臓のβ細胞はインスリンの産生を増加させ、高インスリン血症およびＩＩ型糖尿病もたらす。多くのレギュレータは、肝細胞のインスリン抵抗性に影響を及ぼす。たとえば、ステロール調節エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ１またはＳＲＥＢＰ）は、コレステロールのマスターレギュレータであり、およびインスリン抵抗性の増加に関連付けられる。コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）のアップレギュレーションは、インスリン抵抗性の増加に関連付けられる。肝脂肪酸トランスロカーゼ／分化クラスター３６（ＦＡＴ／ＣＤ３６）のアップレギュレーションは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の患者においてインスリン抵抗性、高インスリン血症、脂肪症の増加に関連付けられる。リポタンパク質リパーゼ遺伝子（ＬＰＬ）の肝特異的過剰発現は、肝特異的インスリン抵抗性を引き起こす。肝Ｘレセプター遺伝子（ＬＸＲ）は、肝臓においてステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−１ｃ誘導脂肪酸合成のインスリン媒介活性化に中心的役割を果たす。他の因子は、トリグリセリド合成をレギュレートするジグリセリドアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）および脂肪酸生合成をレギュレートする脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）を含む。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞のＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子の発現を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは９０％だけ低減する。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞のＬＰＬ遺伝子の発現を少なくとも２０、３０、４０％、好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、より好ましくは少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、および４００％だけ増加させる。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、無治療の肝細胞と比較して肝細胞のＬＸＲ遺伝子の発現を少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、より好ましくは少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０および４００％、さらにより好ましくは少なくとも４５０、５００、５５０、６００％だけ増加させる。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＳＲＥＢＰ１遺伝子の発現を減少させる。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＤＧＡＴ２遺伝子の発現を減少させる。他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＣＥＴＰ遺伝子の発現を減少させる。さらに他の実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはＦＡＳＮ遺伝子の発現を減少させる。

Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡでモジュレートしうるＮＡＦＬＤおよびＩＲ遺伝子のまとめを表５に示す。表５中の略語：ＮＡＦＬＤ：非アルコール性脂肪肝疾患、ＩＲ：インスリン抵抗性、ＤＮＬ：ｄｅｎｏｖｏ脂質生成、ＦＡ：脂肪酸、ＴＧ：トリグリセリド、ＬＰＬ：リポタンパク質リパーゼ、ＨＰ：肝リパーゼ、ＣＨＯＬ：コレステロール。

本発明の一実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することによりｉｎｖｉｔｒｏ血清コレステロールレベルを低減する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを用いると血清コレステロールレベルは、無治療の血清コレステロールレベルと比較して少なくとも２５％、好ましくは５０％、より好ましくは７５％だけ低減する。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの投与によりｉｎｖｉｖｏで肝細胞のＬＤＬレベルおよびトリグリセリドレベルを低減するおよびＬＤＬの循環レベルを増加させる方法も提供される。循環ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下でのＬＤＬレベルの循環と比較して少なくとも２倍、好ましくは３倍、好ましくは４倍、好ましくは５倍、好ましくは１０倍、好ましくは１５倍だけ増加しうる。肝トリグリセリドレベルは、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での肝トリグリセリドレベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ低減しうる。肝ＬＤＬレベルは、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での肝ＬＤＬレベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ低減しうる。

本発明の一実施形態では、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することによりＮＡＦＬＤを治療するおよび脂肪肝サイズを低減する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療された患者の脂肪肝のサイズは、無治療の患者と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％だけ低減される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することにより体重を低減するおよび肥満を治療する方法が提供される。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療された患者の体重は、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ治療を受けない患者の体重によりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％だけ減少する。本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、１回、２回、３回、またはそれを超えて投与しうる。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより遊離脂肪酸の肝取り込みを減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより白色脂肪組織（ＷＡＴ）炎症を低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することによりｄｅｎｏｖｏ脂質生成を低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓のβ酸化を増加させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を増加させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより肝脂質取込みを低減する方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することによりＷＡＴにおける脂質生成を減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療することにより肝臓への脂質貯蔵を減少させる方法も提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの治療により肝臓への脂質過負荷を軽減する方法も提供される。

他の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは肝機能を向上させるために使用される。限定されるものではないが一例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、アルブミン遺伝子発現を増加させることにより血清アルブミンレベルおよび非コンジュゲートビリルビンレベルを増加させる。アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ増加しうる。さらなる好ましい実施形態では、アルブミン遺伝子の発現は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのアルブミン遺伝子の発現と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する。限定されるものではないが他の例として、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルファフェクトプロテイン（ＡＦＰ）、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の量を減少させる。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、またはＨＧＦの量は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡの不在下でのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＦＰ、またはＨＧＦのいずれかの量と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ減少しうる。

他の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバーのレベルを調節するために投与される。Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの用量に依存してＣ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、およびＣ／ＥＢＰζの発現を増加させる。さらに他の実施形態では、細胞内のＣ／ＥＢＰαまたはＣ／ＥＢＰβタンパク質アイソフォームの比率は、前記細胞と本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡとを接触させることにより調節される。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰαの４２ＫＤａアイソフォームが増加する。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰβの３０ｋＤａアイソフォームが増加する。

ｅｃＣＥＢＰＡ
ＣＥＢＰＡ遺伝子座から転写される機能性ｎｃＲＮＡであるエクストラコードＣＥＢＰＡ（ｅｃＣＥＢＰＡ）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）と相互作用してＣＥＢＰＡ遺伝子メチル化を防止することによりＣＥＢＰＡメチル化を調節する。ｅｃＣＥＢＰＡノックダウンは、ＣＥＢＰＡｍＲＮＡ発現の減少およびＤＮＡメチル化の有意な増加をもたらすことが見いだされている（ラスキオ（Ｒｕｓｃｉｏ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１３年、第５０３巻、ｐ．３７１〜３７６（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。他の実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡはｅｃＣＥＢＰＡレベルをアップレギュレートするために使用される。

外科ケア
肝切除、すなわち、肝臓または肝組織の外科的切除は、肝不全、アルブミンおよび凝固因子の産生の低減を引き起こすおそれがある。肝切除後の適正な外科ケアが必要とされる。いくつかの実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝再生の促進および生存率の増加のために肝切除後の外科ケアに使用される。

過増殖障害
本発明の一実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、過増殖細胞の細胞増殖を低減するために使用される。過増殖細胞の例としては、癌細胞、たとえば、癌腫、肉腫、リンパ腫、および芽腫が挙げられる。かかる癌細胞は良性または悪性でありうる。過増殖細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬などの自己免疫病態から生じうる。過増殖細胞はまた、過敏免疫系を有する患者がアレルゲンに接触することにより生じうる。過敏免疫系が関与するかかる病態としては、限定されるものではないが喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、およびアレルギー反応、たとえばアレルギーアナフィラキシーが挙げられる。一実施形態では、腫瘍細胞の発生および／または増殖が阻害される。好ましい実施形態では、固形腫瘍細胞増殖が阻害される。他の好ましい実施形態では、腫瘍細胞の転移が予防される。他の好ましい例では、未分化腫瘍細胞増殖が阻害される。

細胞増殖の阻害または増殖の低減とは、増殖が低減されるかまたは完全に停止することを意味する。したがって、「増殖の低減」は「増殖の阻害」の実施形態である。細胞の増殖は、本発明のｓａＲＮＡの存在下では、本発明のｓａＲＮＡで治療する前の前記細胞の増殖と比較してまたは均等な未治療細胞の増殖と比較して少なくとも２０％、３０％、もしくは４０％、または好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０、９０、もしくは９５％だけ低減される。細胞増殖が過増殖細胞において阻害される実施形態では、「均等」な細胞は過増殖細胞でもある。好ましい実施形態では、増殖は、均等な健常（非過増殖）細胞の増殖速度に匹敵する速度に低減される。別の見方をすると、「細胞増殖の阻害」の好ましい実施形態は、増殖の正常健常レベルを達成するように過増殖を阻害することまたは細胞増殖をモジュレートすることである。

限定されるものではないが一例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、白血病細胞およびリンパ腫細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ジャーカット細胞（急性Ｔ細胞性リンパ腫細胞系）、Ｋ５６２細胞（赤白血病細胞系）、Ｕ３７３細胞（膠芽腫細胞系）、および３２Ｄｐ２１０細胞（骨髄性白血病細胞系）を含む。

限定されるものではないが他の例として、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、卵巣癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、ラット肝癌細胞、およびインスリノーマ細胞の増殖を低減するために使用される。好ましくは、細胞は、ＰＥＯ１およびＰＥＯ４（卵巣癌細胞系）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌細胞系）、Ｐａｎｃ１（ヒト膵癌細胞系）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌細胞系）、ＤＵ１４５（ヒト転移前立腺癌細胞系）、ラット肝癌細胞、ならびにＭＩＮ６（ラットインスリノーマ細胞系）を含む。

限定されるものではないが他の例として、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、腫瘍細胞増殖を低減するためにＣ／ＥＢＰβ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと組み合わせて使用される。腫瘍細胞は、ＨｅｐＧ２細胞などの肝細胞癌細胞およびＭＣＦ７細胞などの乳癌細胞を含みうる。

一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡは、過増殖障害を治療するために使用される。腫瘍および癌は、特に興味深い過増殖障害であり、すべてのタイプの腫瘍および癌、たとえば、固形腫瘍および血液癌が含まれる。癌の例としては、限定されるものではないが頸癌、子宮癌、卵巣癌、腎癌、胆嚢癌、肝癌、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、胃腸癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、肺癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（たとえば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病）、脳癌（たとえば、星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫）、神経芽腫、肉腫、結腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、黒色腫、および他の皮膚癌が挙げられる。肝癌として、限定されるものではないが胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、または肝細胞癌（ＨＣＣ：Ｈｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）が挙げられうる。ＨＣＣは特に興味深い。

原発性肝癌は、全世界で５番目に多い癌であり、癌関連死亡の３番目に多い原因である。ＨＣＣは原発性肝癌の大多数を占める［エル−セラグ（Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ）ら著、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２００７年、第１３２巻、第７号、ｐ．２５５７〜２５７６（その内容はその全体が本明細書に開示される）］。ＨＣＣは、癌細胞生物学、免疫系、およびさまざまな病因（ウイルス、毒物、および一般物）を含むいくつかの因子の相互作用による影響を受ける。ＨＣＣ患者の大多数は、肝硬変を経て悪性腫瘍を発症する。現在、ほとんどの患者は進行期に診断されるため、ＨＣＣ患者の大多数の５年生存率は依然として悲惨である。外科的切除、局所切除、および肝移植は、現在、ＨＣＣが治癒する可能性を有する治療選択肢に過ぎない。しかしながら、個別の肝機能および腫瘍負荷の評価に基づいて、患者の約５〜１５％が外科的介入に適格であるに過ぎない。Ｃ／ＥＢＰ転写因子ファミリーの結合部位は、正常な肝細胞機能の維持および傷害への反応に関与する多くの遺伝子のプロモータ領域に存在する（アルブミン、インターロイキン６反応、エネルギー恒常性、オルニチン回路調節、および血清アミロイドＡ発現を含む）。本発明は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をモジュレートするためにならびに肝硬変およびＨＣＣを治療するためにＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを利用する。

本発明の方法は、腫瘍体積を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％だけ低減しうる。好ましくは、１つ以上の新しい腫瘍の発生が阻害される。たとえば、本発明に従って治療された対象は、より少ないおよび／またはより小さい腫瘍を発生する。より少ない腫瘍とは、設定期間にわたり均等な対象よりも少ない数の腫瘍を発生することを意味する。たとえば、均等な対照（未治療）対象よりも少なくとも１、２、３、４、または５少ない腫瘍を発生する。より小さい腫瘍とは、腫瘍が均等な対象の腫瘍よりも重量および／または体積で少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、また９０％小さいことを意味する。本発明の方法は、腫瘍負荷を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％だけ低減する。

設定期間は任意の好適な期間でありうる。たとえば、月数または年数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０でありうる。
限定されるものではないが一例では、細胞、組織、または器官と本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡとを接触させる工程を含む、未分化腫瘍の治療方法が提供される。未分化腫瘍は、一般に、分化腫瘍と比較してより悪い予後を有する。腫瘍の分化度は予後に関係するため、分化生物学的因子の使用は有益な抗増殖薬剤でありうるという仮説が立てられる。Ｃ／ＥＢＰαは、骨髄分化を回復して急性骨髄性白血病の造血細胞の過増殖を予防することが知られている。好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療しうる未分化腫瘍としては、未分化小細胞肺癌腫、未分化膵腺癌、未分化ヒト膵癌、未分化ヒト転移前立腺癌、および未分化ヒト乳癌が挙げられる。

限定されるものではないが一例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、標的化ｉｎｖｉｖｏ送達のためのＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡデンドリマーと呼ばれるＰＡＭＡＭデンドリマー中に複合体化される。静脈内注射されるＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡデンドリマーの治療効果は、実施例１に示されるような臨床的に妥当なラット肝腫瘍モデルに実証される。４８時間間隔で尾静脈注射により３回投与後、治療硬変ラットは、１週間以内に血清アルブミンレベルの有意な増加を示した。肝腫瘍負荷は、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡデンドリマー治療群で有意に減少した。活性化ＲＮＡ低分子による遺伝子標的化を全身静脈内投与で用いてＨＣＣ硬変ラットの肝機能の改善および腫瘍負荷の低減を同時に行えることが、この研究から初めて実証される。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子をレギュレートするために使用される。好ましくは、癌遺伝子の発現はダウンレギュレートしうる。癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％だけ低減する。さらなる好ましい実施形態では、癌遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、より好ましくは少なくとも１／１５、１／２０、１／２５、１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、１／５０、さらにより好ましくは少なくとも１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００に低減される。好ましくは、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は阻害しうる。腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％、さらにより好ましくは少なくとも１００％だけ増加する。さらなる好ましい実施形態では、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加される。癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の例としては、限定されるものではないがＢｃｌ−２−関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、ディセーブルホモログ２相互作用タンパク質（ＤＡＢ２１Ｐ）、肝癌欠失１（ＤＬＣ１）、Ｆａｓ表面デスレセプター（ＦＡＳ）、脆弱ヒスチジントライアド（ＦＨＩＴ）、成長停止・ＤＮＡ損傷誘導ベータ（ＧＡＤＤ４５Ｂ）、ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ＨＨＩＰ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、リンパエンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、タンパク質チロシンキナーゼ２（ＰＴＫ２）、レチノブラストーマ１（ＲＢ１）、ｒｕｎｔ関連転写因子３（ＲＵＮＸ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、サイトカインシグナリングサプレッサー（３ＳＯＣＳ３）、トランスフォーミング成長因子ベータレセプターＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１０（ＴＮＦＳＦ１０）、ｐ５３、ディスインテグリン・メタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１７（ＡＤＡＭ１７）、ｖ−ａｋｔネズミ胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１（ＡＫＴ１）、アンギオポイエチン２（ＡＮＧＰＴ２）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）、ＢＣＬ２様１（ＢＣＬ２Ｌ１）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有２（ＢＩＲＣ２）、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５（ＢＩＲＣ５）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、サイクリンＤ２（ＣＣＮＤ２）、カドヘリン（ＣＤＨ１）、カドヘリン１３（ＣＤＨ１３）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（ＣＤＫＮ１Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ（ＣＤＫＮ１Ｂ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）、ＣＡＳＰ８・ＦＡＤＤ様アポトーシスレギュレータ（ＣＦＬＡＲ）、カテニン（カドヘリン関連タンパク質）ベータ１（ＣＴＮＮＢ１）、ケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００（ＥＰ３００）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）関連ビアデスドメイン（ＦＡＤＤ）、ｆｍ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）、フリズルドファミリーレセプター７（ＦＺＤ７）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼパイ１（ＧＳＴＰ１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリンレセプター基質１（ＩＲＳ１）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）、キナーゼインサートドメインレセプター（ＫＤＲ）、骨髄細胞白血病配列１（ＭＣＬ１）、ｍｅｔ癌原遺伝子（ＭＥＴ）、ｍｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ｍｕｔＳホモログ３（ＭＳＨ３）、メタドヘリン（ＭＴＤＨ）、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＭＹＣ）、Ｂ細胞カッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサー核因子１（ＮＦＫＢ１）、神経芽腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）、オピオイド結合タンパク質／細胞接着分子様（ＯＰＣＭＬ）、血小板由来成長因子レセプター、アルファポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ、ＮＩＭＡ相互作用１（ＰＩＮ１）、プロスタグランジンエンドペルオキサイドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、ＰＹＤ・ＣＡＲＤドメイン含有（ＰＹＣＡＲＤ）、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ＲＡＣ１）、ｒａｓ関連（ＲａｌＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリーメンバー１（ＲＡＳＳＦ１）、リーリン（ＲＥＬＮ）、ｒａｓホモログファミリーメンバーＡ（ＲＨＯＡ）、分泌フリズルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー７（ＳＭＡＤ７）、サイトカインシグナリングサプレッサー１（ＳＯＣＳ１）、シグナルトランスデューサ・転写アクチベータ３（ＳＴＡＴ３）、転写因子４（ＴＣＦ４）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦＡ）、トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、アポトーシスＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）、およびＹｅｓ関連タンパク質１（ＹＡＰ１）が挙げられる。

一実施形態では、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することにより白色白血球数を増加させる方法が提供される。また、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを患者に投与することにより、敗血症または慢性炎症疾患（たとえば、肝炎および肝硬変）を有する患者および免疫無防備患者（たとえば、化学療法を受けている患者）の白血球減少を治療する方法も提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することにより、白血病およびリンパ腫を含めてプレＢ細胞およびＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法も提供される。また、必要とする患者に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを投与することにより白血球、造血幹細胞、または間葉幹細胞を動員する方法も提供される。一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡで治療された患者の白色白血球数は、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ治療なしと比較して少なくとも５０％、７５％、１００％、より好ましくは少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５倍、より好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０倍だけ増加する。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、肝細胞癌の治療でマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）をレギュレートするために使用される。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現をレギュレートする低分子非コードＲＮＡである。それらは重要な生理学的機能に関与し、発癌のそれぞれ工程に関与しうる。それらは典型的には２１ヌクレオチドを有し、前記ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することによりｍＲＮＡ翻訳の遮断またはｍＲＮＡ分解の誘導を介して転写後レベルで遺伝子発現をレギュレートする。

腫瘍では、ｍｉＲＮＡ発現のレギュレーションは腫瘍発生に影響を及ぼす。ＨＣＣでは、他の癌の場合と同様に、ｍｉＲＮＡは、細胞の成長および増殖、細胞の代謝および分化、アポトーシス、血管新生、転移、および最終的には予後に影響を及ぼす癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子のいずれかとして機能する。［リン（Ｌｉｎ）ら著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２００８年、第３７５巻、ｐ．３１５〜３２０、クタイ（Ｋｕｔａｙ）ら著、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２００６年、第９９巻、ｐ．６７１〜６７８、メング（Ｍｅｎｇ）ら著、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、２００７年、第１３３巻、第２号、ｐ．６４７〜６５８（それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現および／または機能をモジュレートすると共にＨＣＣ細胞でｍｉＲＮＡレベルをレギュレートする。本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡによりレギュレートしうるｍｉＲＮＡの例としては、限定されるものではないがｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３２−５ｐが挙げられる。

限定されるものではないが一例では、ｍｉＲＮＡは発癌性ｍｉＲＮＡであり、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下ではＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下と比較して少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、２．５、および３だけダウンレギュレートされる。限定されるものではないが他の例として、ｍｉＲＮＡは腫瘍抑制ｍｉＲＮＡであり、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下ではＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下と比較して少なくとも０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、さらにより好ましくは少なくとも６０（７０、８０、９０、１００だけアップレギュレートされる。

幹細胞レギュレーション
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、自己再生多能性因子をレギュレートして幹細胞分化に影響を及ぼすために使用される。さまざま臨床状況、治療状況、および研究状況において、目的のタンパク質を発現するためにまたは細胞を異なる細胞表現型に変化させるために細胞の表現型の変化が使用されてきた。細胞の表現型の変化は、現在、ＤＮＡまたはウイルスベクターからタンパク質を発現することにより達成される。現在、パーキンソン病および糖尿病などの種々の疾患ならびに脊髄傷害などの傷害に対する治療の選択肢としてヒト胚性幹細胞の使用を評価するために行われている研究が存在する。胚性幹細胞は、任意の分化細胞型を生成するために多能性を維持しつつ無期限に成長する能力を有する。

多能性因子、細胞表現型変化因子、分化転換因子、分化因子、脱分化因子などの多くの因子は、細胞表現型を変化させるために利用され、個別再生医学、細胞療法、および他の疾患の療法の分野に有用である。たとえば、幹細胞の自己再生性および多能性は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＫＬＦ遺伝子を含めて中心的調節回路の転写因子およびクロマチンリモデリング酵素などの一連の遺伝子によりレギュレートされる［ブーリロット（Ｂｏｕｒｉｌｌｏｔ）ら著、ＢＭＣバイオロジー（ＢＭＣＢｉｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第８巻、ｐ．１２５（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。この自己調節ネットワーク調節回路はまた、下流の遺伝子にも影響を及ぼす。オリゴヌクレオチドは、中心的調節回路をレギュレートするために利用されてきた。スー（Ｘｕ）らは、ｍｉＲＮＡ−１４５がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４の３’ＵＴＲを標的とすることを明らかにした。ｍｉＲＮＡ−１４５を低減すると分化が損なわれ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４が上昇する。［スー（Ｘｕ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３７巻、ｐ．１〜１２（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）］。

一実施形態では、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、自己再生多能性遺伝子をレギュレートするために使用される。多能性遺伝子の例としては、限定されるものではないがＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ｃＫｉｔ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＮＡＮＯＧ、ＣＤＸ２、およびＳＡＬＬ４が挙げられる。一実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下と比較して少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０、９０、または９５％だけ低減する。他の実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下と比較して少なくとも２０、３０、４０％、より好ましくは少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％だけ増加する。好ましい実施形態では、多能性遺伝子の発現は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの存在下では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡの不在下での発現と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、より好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、さらにより好ましくは少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する。

一実施形態では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）をレギュレートするために使用される。いくつかの腫瘍は、癌細胞の異なる系列への分化を介して自己再生および腫瘍開始能の保持が可能な癌幹細胞または癌幹様細胞を含有する。ＥＭＴは、癌幹様細胞、腫瘍の侵攻性および転移、ならびに腫瘍再発に関連付けられることが実証されている。［コング（Ｋｏｎｇ）ら著、キャンサーズ（Ｃａｎｃｅｒｓ）、２０１１年、第３巻、第１号、ｐ．７１６〜７２９］。ｍｉＲ−２００およびｍｉＲ−１３４などのｍｉＲＮＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの成長因子、さらにはＮｏｔｃｈ−１およびＷｎｔシグナリング経路などの因子を含めて、ＥＭＴをレギュレートする多くの因子が存在する。限定されるものではないが一例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ｍｉＲ−１３４の発現をモジュレートすることによりＥＭＴをレギュレートする。限定されるものではないが他の例では、Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡは、ＲＵＮＸ３、ＣＴＮＢ１、ＨＧＦ、ＳＭＡＤ７、またはＴＧＦＢ１遺伝子の発現をモジュレートすることによりＥＭＴをレギュレートする。

ＩＩＩ．キットおよびデバイス
キット
本発明は、本発明に係る方法を便宜的および／または効果的に行うためのさまざまなキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の治療を行えるようにおよび／または複数の実験を行えるように、十分な量および／または数の成分を含むであろう。

一実施形態では、本明細書に記載のｓａＲＮＡを含むキットは、増殖細胞と共に使用して効力を示しうる。
一実施形態では、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ、またはＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡ、他の遺伝子をモジュレートするｓａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡの組合せを含む、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで遺伝子の発現をレギュレートするためのキットを提供する。キットは、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含みうる。送達剤は、生理食塩水、緩衝溶液、リピドイド、デンドリマー、または本明細書に開示される任意の送達剤を含みうる。遺伝子の例としては、限定されるものではないがＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰファミリーの他のメンバー、アルブミン遺伝子、アルファフェクトプロテイン遺伝子、肝特異的因子遺伝子、成長因子、核因子遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、多能性因子遺伝子が挙げられる。

限定されるものではないが一例では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、および／またはＥＤＴＡを含みうる。限定されるものではないが他の例では、緩衝溶液は、限定されるものではないが生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムとマンノースとを含む塩化ナトリウム（米国特許出願公開第２０１２／０２５８０４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を含みうる。限定されるものではないがさらに他の例では、緩衝溶液は沈殿させうるかまたは凍結乾燥させうる。各成分の量は、一貫して再現性のあるより高濃度の生理食塩水または単純な緩衝配合物が得られるように変化させうる。成分はまた、ある期間にわたりおよび／またはさまざまな条件下で緩衝溶液中のｓａＲＮＡの安定性を増加させるために変化させうる。

他の実施形態では、本発明は、細胞に導入したときに細胞増殖を阻害するのに有効な量で提供される本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡと、任意選択的に標的細胞の増殖をさらにレギュレートするためのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡと、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞増殖をレギュレートするためのキットを提供する。

他の実施形態では、本発明は、本発明のｓａＲＮＡ分子と、任意選択的にＬＤＬ低減薬剤と、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞のＬＤＬレベルを低減するためのキットを提供する。

他の実施形態では、本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡと、任意選択的にｓｉＲＮＡ、ｅＲＮＡ、およびｌｎｃＲＮＡと、パッケージおよび説明書ならびに／または製剤組成物を形成するための送達剤とを含む、細胞のｍｉＲＮＡ発現レベルをレギュレートするためのキットを提供する。

デバイス
本発明は、本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを組み込みうるデバイスを提供する。このデバイスは、必要とする対象、たとえばヒト患者に即時送達するために利用可能な安定な製剤を含有する。限定されるものではないがかかる対象の例としては、過増殖障害、たとえば、癌、腫瘍、または肝硬変、および代謝障害、たとえば、ＮＡＦＬＤ、肥満、高ＬＤＬコレステロール、またはＩＩ型糖尿病を有する対象が挙げられる。

限定されるものではないがデバイスの例としては、ポンプ、カテーテル、針、経真皮パッチ、加圧経鼻送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層マイクロ流体デバイスが挙げられる。デバイスは、単回投与、多数回投与、または分割投与のレジメントに従って本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを送達するために利用しうる。デバイスは、生体組織を横切って、真皮内に、皮下に、または筋肉内に本発明のＣ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡを送達するために利用しうる。オリゴヌクレオチドの送達に好適なデバイスのより多くの例は、２０１２年１２月１４日出願の国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の使用と本節に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、この節の定義を優先するものとする。

約：本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、挙げられた値の＋／−１０％を意味する。
組み合わせて投与される：本明細書で用いられる場合、「組み合わせて投与される」または「組合せ投与」という用語は、２種以上の作用剤、たとえばｓａＲＮＡを対象に同時にまたは患者に対する各作用剤の作用がオーバーラップしうるインターバル内で投与することを意味する。いくつかの実施形態では、それらは互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、作用剤の投与は、組合せ（たとえば、相乗）効果が達成されるように互いに十分接近した時間で行われる。

アミノ酸：本明細書で用いられる場合、１つまたは複数の「アミノ酸」という用語は、すべての天然に存在するＬ−アルファ−アミノ酸を意味する。アミノ酸は、次のように一文字または三文字の表記により同定される。アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リシン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）。ただし、最初にアミノ酸、続いてカッコ内にそれぞれ三文字コードおよび一文字コードが列挙される。

動物：本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生段階のヒトを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発生段階の非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（たとえば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長動物、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物、トリ、爬虫動物、両生動物、サカナ、および虫を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子工学操作動物、またはクローンである。

およそ：本明細書で用いられる場合、「およそ」または「約」という用語は、関心対象の１つ以上の値に適用される場合、明記された参照値に類似した値を意味する。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記されていない限りまたは特に文脈から自明でない限り、明記された参照値のいずれの方向にも（それよりも大きい方向にも小さい方向にも）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも少ない範囲内に入る値の範囲を意味する（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

会合：本明細書で用いられる場合、「会合」、「コンジュゲート」、「結合」、「装着」、および「テザー連結」という用語は、２つ以上の部分に対して用いられる場合、直接にまたはリンク剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または接続されて、構造が用いられる条件下で、たとえば、生理学的条件下で、これらの部分が、物理的に会合された状態を維持するように、十分に安定な構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接の共有化学結合を介する必要はない。また、それは、イオン結合、水素結合、または「会合」要素が物理的会合を維持するように十分に安定なハイブリダイゼーションに基づく結合をも示唆しうる。

二機能性：本明細書で用いられる場合、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能が可能であるまたはそれを維持する任意の物質、分子、または部分を意味する。機能は、同一のアウトカムまたは異なるアウトカムに影響しうる。機能を発揮する構造は、同一であっても異なっていてもよい。

生体適合性：本明細書で用いられる場合、「生体適合性」という用語は、生細胞、組織、傷害のリスクをほとんどまたはまったく示さない器官もしくは系、毒性、または免疫系による拒絶に適合しうることを意味する。

生分解性：本明細書で用いられる場合、「生分解性」という用語は、生物の作用により無害な産物に分解可能であることを意味する。
生物学的活性：本明細書で用いられる場合、「生物学的活性」という表現は、生体系および／または生物で活性を有する任意の物質の特性を意味する。たとえば、生物に投与されたとき、その生物に対して生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、ｓａＲＮＡの一部であっても、生物学的に活性であれば、または生物学的に関連があると見なされる活性を模倣するのであれば、本発明のｓａＲＮＡは、生物学的に活性であると考えうる。

癌：本明細書で用いられる場合、個体における「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞に典型的な特性、たとえば、無制御な増殖、不死、転移能、速い成長および増殖の速度、ならびに特徴的なモルフォロジー特性を有する細胞の存在を意味する。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形態であろうが、かかる細胞は、個体内に単独で存在しうるか、または白血病細胞などの独立細胞として血流中を循環しうる。

細胞成長：本明細書で用いられる場合、「細胞成長」という用語は、細胞複製（すなわち増殖）により生じる細胞数の増大に主に関連付けられ、その速度は細胞死（たとえば、アポトーシスまたは壊死による）の速度よりも大きく、細胞集団のサイズの増加をもたらすが、特定の状況下では、その成長のごく一部は、個別細胞の細胞サイズまたは細胞質体積の増加にも起因する。したがって、細胞成長を阻害する作用剤は、増殖の阻害もしくは細胞死の促進のいずれかまたはその両方によりこれらの２つの対立するプロセスの平衡を変化させるように阻害を行いうる。

細胞型：本明細書で用いられる場合、「細胞型」という用語は、所与の起源（たとえば、組織、器官）の細胞、または所与の分化状態の細胞、または所与の病理もしくは遺伝子構成に関連付けられる細胞を意味する。

染色体：本明細書で用いられる場合、「染色体」という用語は、細胞に見いだされるＤＮＡおよびタンパク質の組織化構造を意味する。
相補的：本明細書で用いられる場合、核酸に関する「相補的」という用語は、ヌクレオチド間または核酸間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合を意味する。たとえば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間またはオリゴヌクレオチドプローブと標的との間などは相補的である。

病態：本明細書で用いられる場合、「病態」という用語は、任意の細胞、器官、器官系、または生物の状態を意味する。病態は、疾患状態または単にエンティティーの生理学的提示もしくは状況を反映しうる。病態は、疾患の巨視的提示などの表現型病態または病態に関連付けられる根底にある遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイルなどの遺伝子型病態として特徴付けうる。病態は良性または悪性でありうる。

制御放出：本明細書で用いられる場合、「制御放出」という用語は、治療アウトカムをもたらす特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを意味する。

細胞静止：本明細書で用いられる場合、「細胞静止」とは、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せの成長、分裂、または増殖の阻害、低減、抑制を意味する。

細胞傷害性：本明細書で用いられる場合、「細胞傷害性」とは、細胞（たとえば、哺乳動物細胞（たとえば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを死滅させることまたはそれらに有害作用、毒性作用、もしくは致命的作用を引き起こすことを意味する。

送達：本明細書で用いられる場合、「送達」とは、化合物、物質、要素、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する行為または方式を意味する。
送達剤：本明細書で用いられる場合、「送達剤」とは、標的細胞への本発明のｓａＲＮＡのｉｎｖｉｖｏ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を意味する。

不安定化：本明細書で用いられる場合、「不安定」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同一の領域または分子の初期型、野生型、または天然型よりも安定でない領域または分子を意味する。

検出可能な標識：本明細書で用いられる場合、「検出可能な標識」とは、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などをはじめとする当技術分野で公知の方法により容易に検出される、他のエンティティーへの装着、組込み、または会合が行われる１つ以上のマーカ、シグナル、または部分を意味する。検出可能な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、酵素、染料、金属イオン、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびハプテン）、量子ドットなどが挙げられる。検出可能な標識は、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド、たとえば、本明細書に開示されるｓａＲＮＡの任意の位置に位置しうる。それらは、場合により、Ｎ末端もしくはＣ末端または５’末端もしくは３’末端に位置するアミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチド中に存在しうる。

カプセル化：本明細書で用いられる場合、「カプセル化」というという用語は、密封、包囲、または収容を意味する。
工学操作：本明細書で用いられる場合、本発明の実施形態は、構造的か化学的かにかかわらず、出発点、野生型、または天然型の分子と異なる特徴または性質を有するように設計される場合、「工学操作」される。

均等な対象：本明細書で用いられる場合、「均等な対象」は、たとえば、類似の年齢、性別、および健康、たとえば、肝臓の健康もしくは癌の病期の対象、または本発明に係る治療を行う前の同一の対象でありうる。均等な対象は、本発明に係るｓａＲＮＡの治療を受けない点で「未治療」である。しかしながら、本発明のｓａＲＮＡで治療される対象が同一のまたは均等な従来の抗癌治療を受けるのであれば、従来の抗癌治療を受けてもよい。

エキソソーム：本明細書で用いられる場合、「エキソソーム」とは哺乳動物細胞により分泌されるベシクルである。
発現：本明細書で用いられる場合、核酸配列の「発現」とは、次のイベント、すなわち、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（たとえば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（たとえば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾の１つ以上を意味する。

特徴：本明細書で用いられる場合、「特徴」とは、特性、性質、または識別エレメントを意味する。
製剤：本明細書で用いられる場合、「製剤」は、少なくとも本発明のｓａＲＮＡと送達剤とを含む。

断片：「断片」とは、本明細書で用いられる場合、一部分を意味する。たとえば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含みうる。

機能性：本明細書で用いられる場合、「機能性」生物学的分子とは、特徴付けられる性質および／または活性を呈する形態の生物学的分子のことである。
遺伝子：本明細書で用いられる場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御配列とほとんどの場合にコード配列とを含む核酸配列を意味する。しかしながら、遺伝子は翻訳されなくてもよく、その代わりに調節または構造ＲＮＡ分子をコードしうる。

遺伝子は、植物、菌類、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核、核、もしくはプラスミドのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学合成ＤＮＡを含めて、全体または一部が当技術分野で公知の任意の起源に由来しうる。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現の速度、または発現制御の方式に影響を及ぼしうる１つ以上の修飾をコード領域または非翻訳領域のいずれかに含有しうる。かかる修飾としては、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、および置換が挙げられるが、これらに限定されるものではない。遺伝子は非中断コード配列を構成しうるか、または適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含みうる。

遺伝子発現：本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現」という用語は、核酸配列がうまく転写されて、ほとんどの場合、翻訳されてタンパク質またはペプチドを産生するプロセスを意味する。明確さを期して、「遺伝子発現」の測定が参照される場合、測定は転写の核酸産物、たとえばＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたは翻訳のアミノ酸産物、たとえばポリペプチドもしくはペプチドの測定でありうることを意味すると理解すべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定する方法は、当技術分野で周知である。

ゲノム：「ゲノム」という用語は、核ＤＮＡ成分、染色体または染色体外のＤＮＡ、さらには細胞質内ドメイン（たとえば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含めて、生物の全ＤＮＡ相補体を含むことが意図される。

相同性：本明細書で用いられる場合、「相同性」という用語は、高分子間、たとえば、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。いくつかの実施形態では、高分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を意味する。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、さらには９９％であれば、相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、ユニークに特定された少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、ユニークに特定された少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力により決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに関して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一であれば、相同であると見なされる。

「過増殖細胞」という用語は、均等な健常細胞（「対照」と呼びうる）の増殖速度と比較して異常に高い速度で増殖する任意の細胞を意味しうる。「均等な健常」細胞とは、細胞の正常な健常カウンターパートである。したがって、それは、同一のタイプの細胞、たとえば、コンパレータ細胞と同一の機能を行う、同一の器官の細胞である。たとえば、過増殖肝細胞の増殖は健常肝細胞を基準にして評価すべきであり、一方、過増殖前立腺細胞の増殖は健常前立腺細胞を基準にして評価すべきである。

増殖の「異常に高い」速度とは、過増殖細胞の増殖速度が均等な健常（非過増殖）細胞の増殖速度と比較して少なくとも２０、３０、４０％、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、または少なくとも８０％だけ増加することを意味する。増殖の「異常に高い」速度とはまた、均等な健常細胞の増殖速度と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍、または少なくとも６０、７０、８０、９０、１００倍だけ増加する速度を意味する。

本明細書で用いられる「過増殖細胞」という用語は、ほとんどの細胞と比較してより高速で天然で増殖する細胞を意味するものではなく、それは健常細胞である。生涯を通じて定常的に分裂することが知られる細胞の例は、皮膚細胞、胃腸管細胞、血液細胞、および骨髄細胞である。しかしながら、かかる細胞がそれらの健常カウンターパートよりも高速で増殖する場合、それらは過増殖である。

過増殖障害：本明細書で用いられる場合、「過増殖障害」とは、以上に定義される過増殖細胞を含む任意の障害でありうる。過増殖障害の例としては、新生物障害、たとえば癌、乾癬性関節炎、関節リウマチ、胃過増殖障害、たとえば炎症性腸疾患、皮膚障害、たとえば乾癬、ライター症候群、毛孔性紅色粃糠疹、および角化障害の過増殖異型障害が挙げられる。

過増殖細胞をいかに同定するかは当業者の熟知するところである。動物内の過増殖細胞の存在は、Ｘ線、ＭＲＩ、ＣＴスキャンなどのスキャンを用いて同定可能でありうる。ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ、ＷＳＴ−１アッセイなどの細胞増殖アッセイを用いてｉｎｖｉｔｒｏでサンプルを培養することによっても過増殖細胞を同定しうるか、または細胞増殖をアッセイしうる。ｉｎｖｉｔｒｏ細胞増殖はまた、フローサイトメトリーを用いて決定可能である。

同一性：本明細書で用いられる場合、「同一性」という用語は、高分子間、たとえば、オリゴヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。たとえば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適比較目的で２つの配列をアライメントすることにより、行うことが可能である（たとえば、最適アライメントになるように第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較目的では異なる配列を無視することが可能である）。特定の実施形態では、比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列が最適アライメントになるように導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、計算分子生物学（ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、オックスフォード大学出版局（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、バイオコンピューティング：インフォマティクスとゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅ
Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３年、フォン・ヘインジ，Ｇ（ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ）著、分子生物学における配列解析（ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、１９８７年、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ）、第Ｉ部、フマナ・プレス（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）、ニュージャージ、１９９４年、ならびにグリプスコウ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、配列解析プライマー（ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ）、Ｍストックトン・プレス（ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１年（それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような方法を用いて決定可能である。たとえば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤー（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（生物科学におけるコンピュータ利用（ＣＡＢＩＯＳ）、１９８９年、第４巻、ｐ．１１〜１７）により、決定可能である。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、他の選択肢として、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムにより、決定可能である。配列間の同一性パーセントを決定するのに一般に利用される方法は、カリロ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭジャーナル・オブ・アプライアンス・マセマティクス（ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．）、１９８８年、第４８巻、ｐ．１０７３（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含むが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための技術は、公的に入手可能なコンピュータプログラムの形態で体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示的コンピュータソフトウェアは、デベロー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、「ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＣＧｐｒｏｇｒａｍｐａｃｋａｇｅ）」、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１９８４年、第１２巻、第１号、ｐ．３８７、アルツシュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、「ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３を含むが、これらに限定されるものではない。

遺伝子発現の阻害：本明細書で用いられる場合、「遺伝子発現の阻害」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドでありうる。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的技術を用いて決定可能である。

Ｉｎｖｉｔｒｏ：本明細書で用いられる場合、「ｉｎｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境下、たとえば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こるイベントを意味する。

Ｉｎｖｉｖｏ：本明細書で用いられる場合、「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、生物（たとえば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞）内に起こるイベントを意味する。

単離された：本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、一体化された成分（自然環境または実験現場のいずれであるかにかかわらず）の少なくとも一部から分離された物質または要素を意味する。単離された物質は、一体化されていた物質に対してさまざまなレベルの純度を有しうる。単離された物質および／または要素は、それが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはより多くから分離されうる。いくつかの実施形態では、単離された作用剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度である。本明細書で用いられる場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まないのであれば、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、生成または検出された環境から化合物が実質的に分離されていることを意味する。部分的な分離は、たとえば、本開示に係る化合物が富化された組成物を含みうる。実質的な分離は、重量基準で、本開示に係る化合物またはその塩の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％を含有する組成物を含みうる。化合物およびその塩を単離する方法は、当技術分野で慣用されているものである。

標識：「標識」という用語は、物質、化合物、または対象物を検出できるように対象物に組み込まれる物質または化合物を意味する。
リンカー：本明細書で用いられる場合、リンカーとは原子団（たとえば、１０〜１，０００原子）を意味し、限定されるものではないが炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、イミンなどの原子または基で構成可能である。リンカーは、第１の末端を修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドの核酸塩基または糖部分に、かつ第２の末端を検出可能剤または治療剤などのペイロードに装着可能である。リンカーは、核酸配列中への組込みを妨害しない十分な長さでありうる。リンカーは、本明細書に記載されるように、ｓａＲＮＡコンジュゲートを形成したりさらにはペイロードを投与したりするなど、任意の有用な目的に使用可能である。リンカーに組込み可能な化学基の例としては、限定されるものではないがアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられ、それらは、それぞれ本明細書に記載されるように任意選択的に置換可能である。リンカーの例としては、限定されるものではないが不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（たとえば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、たとえば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、およびデキストランポリマー、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。他の例は、たとえばジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）などの切断可能な部分をリンカー中に含んで還元剤または光分解を用いて切断可能であるが、これらに限定されるものではない。限定されるものではないが選択的に切断可能な結合の例としては、たとえばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、もしくは他の還元剤および／または光分解を用いて切断可能なアミド結合、さらにはたとえば酸加水分解もしくは塩基加水分解により切断可能なエステル結合が挙げられる。

転移：本明細書で用いられる場合、「転移」という用語は、原発腫瘍として最初に生じた場所から体内の離れた位置に癌が広がるプロセスを意味する。転移はまた、原発腫瘍の広がりから得られる癌も意味する。たとえば、ある乳癌罹患者は、自身のリンパ系、肝臓、骨、または肺に転移を発症しうる。

修飾：本明細書で用いられる場合、「修飾」とは、本発明に係る分子の変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的、構造的、および機能的なものを含めて、多くの方法で修飾されうる。一実施形態では、本発明のｓａＲＮＡ分子は、非天然のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入により修飾される。

天然に存在する：本明細書で用いられる場合、「天然に存在する」とは、人為的な支援を受けることなく天然に存在することを意味する。
核酸：本明細書で用いられる「核酸」という用語は、１つ以上のヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方で構成された分子を意味する。この用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドは、５’→３’結合を介して結合一体化される。リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのポリマーは一本鎖または二本鎖でありうる。しかしながら、結合は当技術分野で公知の結合のいずれかを含みうる。たとえば、核酸は５’→３’結合を含む。ヌクレオチドは天然に存在しうるか、または天然に存在する塩基対との塩基対関係を形成可能な合成により生成されたアナログでありうる。塩基対合関係を形成可能な天然に存在しない塩基の例は、限定されるものではないがアザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログ、ならびにピリミジン環の炭素原子および窒素原子の１つ以上がヘテロ原子、たとえば、酸素、硫黄、セレン、リンなどにより置換された他のヘテロ環塩基アナログを含みうる。

患者：本明細書で用いられる場合、「患者」とは、治療を求めているもしくはそれが必要な状態にあると思われる、治療を必要とする、治療を受けている、または治療を受けるであろう対象、あるいは特定の疾患もしくは病態に対して訓練された専門家によるケアを受けている対象を意味する。

ペプチド：本明細書で用いられる場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。

薬学的に許容可能：「薬学的に許容可能」という表現は、本明細書では、妥当な便益／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題、または合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または製剤を意味する。

薬学的に許容可能な賦形剤：本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外で患者において実質的に非毒性かつ非炎症性の性質を有する任意の成分を意味する（たとえば、活性化合物の懸濁または溶解が可能な媒体）。賦形剤としては、たとえば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤またはコーティング剤、風味剤、香気剤、滑剤（流動促進剤）、滑沢剤、保存剤、プリントインク、収着剤、懸濁化剤または分散剤、甘味剤、および水和水が挙げられうる。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（第２）、カルシウムステアレート、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、マグネシウムステアレート、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコレート、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

薬学的に許容可能な塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を包含する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能な塩」とは、既存の酸部分または塩基部分をその塩形に変換することにより（たとえば、遊離塩基基と好適な有機酸とを反応させることにより）親化合物が修飾された開示化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミンなどの塩基残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオン、たとえば、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む。本開示に係る薬学的に許容可能な塩は、親化合物の従来型の非毒性塩、たとえば、非毒性の無機酸または有機酸から生成されたものを含む。本開示に係る薬学的に許容可能な塩は、塩基部分または酸部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成可能である。一般的には、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中または両者の混合物中で、これらの化合物の遊離の酸形または塩基形と化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより、調製可能である。一般的には、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、「レミングトンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）、ペンシルバニア州イーストン、１９８５年、ｐ．１４１８、Ｐ．Ｈ．スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワーマス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、「医薬塩：性質、選択、および使用（ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄＵｓｅ）」、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、ならびにベルジェ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ）、１９７７年、第６６巻、ｐ．１〜１９（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。

薬学的に許容可能な溶媒和物：「薬学的に許容可能な溶媒和物」という用語は、本明細書で用いられる場合、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれた本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理学的に耐容性である。たとえば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿により調製しうる。好適な溶媒の例は、エタノール、水（たとえば、一、二、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、エチルアセテート、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジルベンゾエートなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。

薬理学的効果：本明細書で用いられる場合、「薬理学的効果」とは、生物または系が外因性作用剤と接触した後またはそれに暴露された後に起こる生物または系において測定可能な生物学的現象のことである。薬理学的効果は、治療上有効なアウトカム、たとえば、１つ以上の症状の治療や改善、疾患、障害、病態、または感染の診断、予防、およびそれらの発症の遅延をもたらしうる。かかる生物学的現象の測定は、定量的、定性的、または他の生物学的現象に対して相対的でありうる。定量測定は統計的に有意でありうる。定性的測定は、程度または種類でありうると共に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えて異なりうる。それらは、存在するまたは不在である、より良好であるまたはより悪い、より多いまたはより少ないとして観測可能である。外因性作用剤とは、薬理学的効果を参照する場合、全体または一部が生物または系に対して外来性である作用剤のことである。たとえば、野生型バイオ分子への修飾は、構造的か化学的かにかかわらず、外因性作用剤を生じるであろう。同様に、生物または系では天然に見いだされない化合物、分子、または物質への野生型分子の組込みまたはそれらと野生型分子との組合せも外因性作用剤を生じるであろう。本発明のｓａＲＮＡは外因性作用剤を含む。薬理学的効果の例としては、限定されるものではないが細胞数の変化、たとえば、好中球、網状赤血球、顆粒球、赤血球（赤血球）、巨核球、血小板、単球、結合組織マクロファージ、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、または網状赤血球の増加または減少が挙げられる。薬理学的効果はまた、血液化学、ｐＨ、ヘモグロビン、ヘマトクリットの変化、酵素、たとえば限定されるものではないが肝酵素ＡＳＴおよびＡＬＴのレベルの変化、脂質プロファイル、電解質、代謝マーカ、ホルモン、または当業者に公知の他のマーカもしくはプロファイルの変化を含む。

物理化学的：本明細書で用いられる場合、「物理化学的」とは、物理的および／もしくは化学的な性質またはそれに関することを意味する。
予防：本明細書で用いられる場合、「予防」という用語は、感染、疾患、障害、および／もしくは病態の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは臨床病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、特定の感染、疾患、障害、および／もしくは病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは病変の発生を部分的にもしくは完全に遅延すること、感染、特定の疾患、障害、および／もしくは病態からの進行を部分的にもしくは完全に遅延すること、ならびに／または感染、疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病理発生のリスクを減少させることを意味する。

プロドラッグ：本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグを包含する。本明細書で用いられる場合、「プロドラッグ」とは、物質、分子、または要素が化学的または物理的な変化を受けたときに治療剤として作用すると見なされる形態をとる任意の物質、分子、または要素を意味する。プロドラッグは、共有結合されていても、何らかの方法で捕獲されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後、活性薬剤部分を放出するかまたはそれに変換される。プロドラッグは、慣例的な操作によりまたはｉｎｖｉｖｏで修飾が切断されて親化合物になるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより、調製可能である。プロドラッグは、ヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与されたときにそれぞれ遊離のヒドロキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基、またはカルボキシル基を生成するように切断される任意の基に結合されている化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規な送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓａｓＮｏｖｅｌＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ）」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ）の第１４巻、ならびにエドワードＢ．ロッシュ（ＥｄｗａｒｄＢ．Ｒｏｃｈｅ）編、「薬剤設計における生体可逆性担体（ＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅＣａｒｒｉｅｒｓｉｎＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ）」、米国薬剤師協会（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）およびパーガモンプレス（ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ）、１９８７年（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。

予後予測：本明細書で用いられる場合、「予後予測」という用語は、特定の生物学的イベントが将来起こるであろうことまたは起こる可能性が非常に高いことの陳述または主張を意味する。

進行：本明細書で用いられる場合、「進行」または「癌の進行」という用語は、疾患もしくは病態のまたはそれらに向かう促進もしくは悪化を意味する。
増殖：本明細書で用いられる場合、「増殖」という用語は、成長、拡張、もしくは増大すること、または迅速に成長、拡張、もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖」とは、増殖性に対抗するまたは不適である性質を有することを意味する。

タンパク質：「タンパク質」とは、ペプチド結合により結合一体化されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で用いられる場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。しかしながら、典型的には、タンパク質は少なくとも５０アミノ酸長であろう。いくつかの場合、コードされたタンパク質は約５０アミノ酸未満である。この場合、ポリペプチドはペプチドと称される。タンパク質が短いペプチドである場合、それは少なくとも約１０アミノ酸残基長であろう。タンパク質は、天然に存在するもの、組み換えられたもの、もしくは合成されたもの、またはこれらの任意の組合せでありうる。タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質またはペプチドの断片を含みうる。タンパク質は、単分子でありうるかまたは多分子複合体でありうる。タンパク質という用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学アナログであるアミノ酸ポリマーにもあてはまりうる。

タンパク質発現：「タンパク質発現」という用語は、アミノ酸配列またはタンパク質の検出可能なレベルが発現されるように核酸配列が翻訳を受けるプロセスを意味する。
精製された：本明細書で用いられる場合、「精製する」、「精製された」、「精製」とは、望ましくない成分、材料汚染、混合、または不完全から実質的に純粋または清澄にすることを意味する。

退縮：本明細書で用いられる場合、「退縮」または「退縮度」という用語は、表現型または遺伝子型のいずれかにおける癌の進行の逆転を意味する。癌の進行の遅延または停止は退縮であると見なしうる。

サンプル：本明細書で用いられる場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、その組織、細胞、または構成部分（たとえば、限定されるものではないが血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液、および精液をはじめとする体液）の一部を意味する。サンプルは、たとえば、限定されるものではないが、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、外側皮膚切片、呼吸管、腸管、および泌尿生殖管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含めて、全生物体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは一部分から調製されるホモジネート、ライセート、または抽出物をさらに含みうる。サンプルは、タンパク質分子または核酸分子などの細胞成分を含有している可能性がある媒体、たとえば、栄養ブロスまたはゲルをさらに意味する。

シグナル配列：本明細書で用いられる場合、「シグナル配列」という語句は、タンパク質の輸送または局在化を指示可能な配列を意味する。
単回ユニット用量：本明細書で用いられる場合、「単回ユニット用量」とは、１回で／一時点／一経路／一接触点で、すなわち単回投与イベントで投与される任意の治療剤の用量のことである。

類似性：本明細書で用いられる場合、「類似性」という用語は、高分子間、たとえば、ポリヌクレオチド分子（たとえば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。互いの高分子の類似性パーセントの計算は、当技術分野で理解されている保存的置換を考慮して類似性パーセントを計算すること以外、同一性パーセントの計算と同一の方式で実施可能である。

分割用量：本明細書で用いられる場合、「分割用量」とは、単回ユニット用量または全一日用量を２つ以上に分割した用量のことである。
安定：本明細書で用いられる場合、「安定」とは、反応混合物から有用な純度への単離に耐えるのに十分なロバスト性のある、好ましくは、有効な治療剤への製剤化が可能である化合物を意味する。

安定化された：本明細書で用いられる場合、「安定化する」「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすることまたは安定になることを意味する。
対象：本明細書で用いられる場合、「対象」または「患者」という用語は、たとえば、実験、診断、予防、および／または治療の目的で、本発明に係る組成物が投与されうる任意の生物を意味する。典型的な対象としては、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物、ヒトなど哺乳動物）および／または植物が挙げられる。

実質的に：本明細書で用いられる場合、「実質的に」という用語は、対象の特徴または性質の全体またはほぼ全体の範囲または度合いを呈する定性的条件を意味する。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、最終状態に達することおよび／または完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あっても稀であるものと理解されよう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象に固有の完全性の欠如の可能性を取り込むように本明細書で用いられる。

実質的に等しい：用量間の時間差に関して本明細書で用いられる場合、この用語は、±２％を意味する。
実質的に同時に：複数の用量に関して本明細書で用いられる場合、この用語は、２秒間以内を意味する。

に罹患している：疾患、障害、および／または病態「に罹患している」個体は、疾患、障害、および／または病態と診断されているまたはそれらの１つ以上の症状を呈する。
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または病態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または病態の症状で診断されていないか、かつ／またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態（たとえば、癌）に罹患しやすい個体は、次のもの、すなわち、（１）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子突然変異、（２）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる遺伝子多型、（３）疾患、障害、および／または病態に関連付けられるタンパク質および／または核酸の発現および／または活性の増大および／または低減、（４）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる習性および／または生活習慣、（５）疾患、障害、および／または病態の家族歴、ならびに（６）疾患、障害、および／または病態の発生に関連付けられる微生物への暴露および／またはその感染、の１つ以上により特徴付け可能である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生するであろう。いくつかの実施形態では、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発生しないであろう。

持続放出：本明細書で用いられる場合、「持続放出」という用語は、特定の期間にわたり放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを意味する。
合成：「合成」という用語は、ヒトの手により産生、調製、および／または製造されることを意味する。本発明に係るポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的もしくは酵素的でありうる。

標的細胞：本明細書で用いられる場合、「標的細胞」とは、任意の１つ以上の目的の細胞を意味する。細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは器官で見いだされうる。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者でありうる。

治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与したとき、治療効果、診断効果、および／もしくは予防効果を有する、ならびに／または所望の生物学的効果および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の作用剤を意味する。

治療上有効量：本明細書で用いられる場合、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に投与したとき、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発生を診断、予防、および／または遅延するのに十分な送達作用剤（たとえば、核酸、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。

治療上有効なアウトカム：本明細書で用いられる場合、「治療上有効なアウトカム」という用語は、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたは罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、および／または病態を治療、その症状を改善、その発症を診断、予防、および／または遅延するのに十分なアウトカムを意味する。

全一日用量：本明細書で用いられる場合、「全一日用量」とは、２４時間以内で投与または処方される量のことである。それは、単回ユニット用量として投与されうる。
転写因子：本明細書で用いられる場合、「転写因子」という用語は、たとえば、転写の活性化または抑圧により、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を意味する。いくつかの転写因子は、転写のみの調節を行うが、他のものは、他のタンパク質と協奏的に作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下で転写の活性化および抑制の両方を行うことが可能である。一般的には、転写因子は、標的遺伝子の調節領域の特定のコンセンサス配列にきわめて類似した１つもしくは複数の特異的標的配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子との複合体で調節しうる。

治療：本明細書で用いられる場合、「治療」という用語、特定の感染、疾患、障害、および／または病態を部分的にまたは完全に緩和、寛解、改善、軽減したり、その発症を遅延したり、その進行を阻害したり、その重症度を低減したり、かつ／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の出現を低減したりすることを意味する。たとえば、癌を「治療」することは、腫瘍の生存、増殖、および／または拡がりを阻害することを意味しうる。治療は、疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を呈しない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態に関連付けられる病変を発生するリスクを低減する目的で、疾患、障害、および／もしくは病態の早期徴候を呈する対象に施すことが可能である。

「治療方法」という語句またはその均等語は、たとえば癌に適用する場合、個体において癌細胞の数を低減、排除、もしくは予防するようにまたは癌の症状を軽減するように設計された手順または行動方針を意味する。癌または他の増殖性障害の「治療方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際上完全に排除されること、細胞数もしくは障害が実際上低減されること、または癌もしくは他の障害の症状が実際上軽減されることを必ずしも意味するとは限らない。多くの場合、癌の治療方法は、成功する可能性が低い場合でさえも行われるであろう。ただし、それにもかかわらず、個体の病歴および推定余命を考慮して全体的に有益な行動方針と見なされる。

腫瘍成長：本明細書で用いられる場合、「腫瘍成長」または「腫瘍転移成長」という用語は、特に指定がない限り、腫瘍学で通常使用されるように用いられる。ただし、この用語は、主に腫瘍細胞成長の結果としての腫瘍または腫瘍転移の増加量または増加体積に主に関連付けられる。

腫瘍負荷：本明細書で用いられる場合、「腫瘍負荷」という用語は、対象が有する直径３ｍｍ超の全腫瘍小結節の全腫瘍体積を意味する。
腫瘍体積：本明細書で用いられる場合、「腫瘍体積」という用語は、腫瘍のサイズを意味する。ｍｍ^３単位の腫瘍体積は、式：体積＝（幅）^２×長さ／２により計算される。

非修飾：本明細書で用いられる場合、「非修飾」とは、何らかの方法で変化させる前の任意の物質、化合物、または分子を意味する。非修飾とは、生体分子の野生型または未改変型を意味するが、常にそうであるとは限らない。分子は、一連の修飾を受けうるが、それにより、各修飾分子は、それに続く修飾のための「非修飾」出発分子として役立ちうる。

均等物および範囲
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明に係る特定の実施形態に対する多くの均等な形態が分かるであろう。またはそれらを確認できるであろう。本発明の範囲は、以上の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に明記される通りである。

特許請求の範囲では、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、相反する指示がない限りまたは特に文脈から自明でない限り、１つ以上を意味しうる。グループの１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、相反する指示がない限りまたは特に文脈から自明でない限り、グループメンバーの１つ、１つ超、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する場合、満たされると考えられる。本発明は、厳密にグループの１つのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する、実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの１つ超またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在するか、そこで利用されるか、または他の方法でそれに適合する、実施形態を含む。

また、「含む」という用語は、オープンであることが意図され、追加の要素または工程の組込みを許容することにも留意されたい。
範囲が与えられた場合、端点が含まれる。さらに、特に指定がない限りまたは特に文脈および当業者の理解から自明でない限り、範囲として表現された値は、文脈上明らかに異なる場合を除いて、範囲の下限の１／１０単位まで、本発明のさまざまな実施形態で指定の範囲内の任意の特定の値または部分範囲を仮定しうると理解されるべきである。

それに加えて、先行技術に包含される本発明の特定の実施形態はいずれも請求項の任意の１項以上から明示的に除外されうると理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、たとえ本明細書で明示的に除外が明記されていないとしても、それらは除外されうる。本発明に係る組成物の特定の実施形態（たとえば、任意の核酸、それによりコードされたタンパク質、任意の製造方法、任意の使用方法など）はいずれも、先行技術の存在の有無にかかわらず、任意の理由でいずれか１項以上の請求項から除外しうる。

引用された出典、たとえば、本明細書に引用された参考文献、刊行物、データベース、データベース項目、および技術はすべて、たとえ引用に明確に記載されていないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典の記載内容と本出願の記載内容とが矛盾する場合、本出願の記載内容が優先するものとする。

限定されるものではないが以下の実施例により本発明をさらに説明する。
（実施例）
材料および手順はＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／００３０５４号明細書に開示されている。

実施例１．Ｃ／ＥＢＰα−ｓａＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ研究
ＡＷ５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ１−５１００００としても知られる）は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ４７５細胞などのＨＣＣ細胞系パネルにトランスフェクトした。播種時に細胞を５０ｎＭのＡＷ５１でリバーストランスフェクトし、２４時間後にフォワードトランスフェクトし、７２時間で採取した。ＣＥＢＰＡｍＲＮＡおよびアルブミン（ＡＬＢ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。図４Ａ〜４Ｄおよび図５Ａ〜５Ｄに示されるようにＣＥＢＰＡおよびＡＬＢのｍＲＮＡのアップレギュレーションが観測された。

実施例２．修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡはＣＥＢＰＡをアップレギュレートする
表３の修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡをＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。播種時に細胞を２．５ｎＭおよび１０ｎＭ修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでリバーストランスフェクトし、２４時間後にフォワードトランスフェクトし、７２時間で採取した。ＣＥＢＰＡおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。表６、図６Ａの結果は、ＣＥＰＢＡ−ｓａＲＮＡが大きい修飾に耐えうることを示している。

以下の表は、この実施例で使用した対照を含む。トランスフェクション対照としてＡｈａ１ｓｉＲＮＡを使用して２．５ｎＭおよび１０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。

ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡをＧａｌＮａｃクラスターにコンジュゲートして（ＧａｌＮａｃ−ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡと呼ばれる）、ＤＵ１４５細胞にトランスフェクトする。播種時に細胞を２．５ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭＧａｌＮａｃ−ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでリバーストランスフェクトし、２４時間後にフォワードトランスフェクトし、７２時間で採取する。ＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを測定する。

ＡＷ５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ１−５１００００としても知られる）をＧａｌＮａｃクラスターにコンジュゲートして、ＤＵ１４５細胞にトランスフェクトする。播種時に細胞を２．５ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭＧａｌＮａｃ−ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでリバーストランスフェクトし、２４時間後にフォワードトランスフェクトし、７２時間で採取する。ＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを測定する。

実施例３．ｓａＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ用量反応および効力比較
ＤＵ１４５細胞における３種の非修飾ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ（ＸＤ−０３２８７、ＸＤ−０３３０２、ＸＤ−０３３１７）のＥＣ５０をＤＵ１４５細胞におけるＡＨＡ１およびＣＥＢＰＡに対するｓｉＲＮＡのＩＣ５０と比較した。

ｓａＲＮＡのＥＣ５０試験では、０時間でＤＵ１４５細胞（ｐ１５、８０００細胞／ウェル）をＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡでリバーストランスフェクトし（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００、０．４μｌ／ウェル）、２４時間でフォワードトランスフェクトし、７２時間で採取した。１００ｎＭから２×希釈系列でＸＤ−０３２８７、ＸＤ−０３３０２、ＸＤ−０３３１７を投与した。ＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨに規格化した。

ｓｉＲＮＡのＩＣ５０試験では、０時間でＤＵ１４５細胞（ｐ１５、８０００細胞／ウェル）に１回トランスフェクションを行って２４時間で採取した。５０ｎＭから５×希釈系列でライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＣＥＢＰＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡｘｏ非修飾ＡＨＡ１を投与した。

表１０および図７Ａ〜７ＣにｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を示した。表１１および図８Ａ〜８ＣにｓａＲＮＡのＥＣ５０値を示した。ｓａＲＮＡ／ｓｉＲＮＡの傾き比が約５であることから異なる機序が示唆される。傾き平均および比の計算では、傾きを１００％のＹ軸範囲で規格化した。この結果、ｓｉＲＮＡ（ＣＥＢＰＡ−ｓｉＲＮＡおよびＡｈａ−１−ｓｉＲＮＡ）では約０．５およびｓａＲＮＡ（ＸＤ−０３２８７、ＸＤ−０３３０２およびＸＤ−０３３１７）では約２．７の平均傾きが得られる。ＥＣ５０およびＩＣ５０は、変曲点（ＩＰ：ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｏｉｎｔ）すなわち半値活性の尺度である。したがって、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡは、低ｎＭ範囲のＩＣ５０を有してきわめて効力が高い。

実施例４．ヒト肝細胞におけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡを用いたｉｎｖｉｔｒｏ研究
一次ヒト肝細胞（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を非増殖培地に配置した。播種日、細胞をリバーストランスフェクション工程に付した。この際、ｓａＲＮＡトランスフェクション複合体を細胞に添加した後、単層として付着させた。２４時間後、培地を変更してフォワードトランスフェクションを行った。翌日、培地を変更し、細胞採取前に細胞をさらに２４時間インキュベートして分析に供した。ＡＷ５１で肝細胞をトランスフェクトした。４８時間および７２時間でＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを測定した。対照としてＡｈａ−１−ｓｉＲＮＡおよびＦｌｕｃを使用した。表１２および図９ＡにＡｈａ１、アルブミン、ＣＥＢＰＡの相対発現を示した。

材料
一次肝細胞解凍培地：凍結保存肝細胞回復培地（ＣＨＲＭ：ＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＲｅｃｏｖｅｒｙＭｅｄｉｕｍ）、５０ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号ＣＭ７０００）
一次肝細胞プレーティング培地：ウシ胎仔血清、熱不活性化−５０ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１６１４０−０７１）
インスリン−トランスフェリン−セレン（１００Ｘ）−５ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号４１４００−０４５）
ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）−５ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１５６３０−０５６）
Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液−５ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｇ１１４６）
デキサメタゾン−最終濃度４０ｎｇ／ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｄ８８９３）
ウィリアムＥ培地、フェノールレッドなし−全量５００ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１２１７６−０１）
一次肝細胞維持培地：一次肝細胞維持サプリメント（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号ＣＭ４０００）
ウィリアムＥ培地、フェノールレッドなし−全量５００ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１２１７６−０１）
一次肝細胞培養プレート：コラーゲンＩ、被覆プレート、２４ウェル（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１１４２８−０２）
トランスフェクション試薬：ハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号３０１７０４）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ血清低減培地、フェノールレッドなし（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１１０５８−０２１）
プロトコル
ｓａＲＮＡアニーリング：
ＲＮアーゼフリーの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭＮａＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ中に１ｍＭになるように各凍結乾燥ｓａＲＮＡ鎖を再懸濁した。十分に混合して再懸濁を終了した。温和な撹拌により等体積のセンス鎖とアンチセンス鎖とを一緒に混合した。組み合わされた鎖の入ったチューブを９５℃に加熱された水の入ったビーカ中に配置した。ビーカにカバーをかけて室温に冷却した。ＲＮアーゼフリー水を用いて後続の希釈を行った。２４ウェル方式では一般にストック溶液を１０μＭに希釈した。アリコートアニールｓａＲＮＡをアリコートして−２０℃で貯蔵した。

一次肝細胞の解凍およびプレーティング：
水浴中でＣＨＲＭおよびプレーティング培地を３７℃に加温した。氷晶が残留しなくなるまで凍結保存肝細胞を３７℃の水浴中で解凍した。７０％エタノールを用いてバイアルを消毒した。無菌組織培養フード内で解凍肝細胞をＣＨＲＭ中に直接導入した。１００×ｇ（ＴｈｅｒｍｏＦ−Ｇ１固定角ロータ中９００ｒｐｍ）で肝細胞を室温で１０分間遠心分離した。上清を廃棄ボトル中に慎重に注いで捨てた。１×１０６凍結保存細胞当たり１ｍＬのプレーティング培地中にペレットを再懸濁させた。ヌクレオカウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）ＮＣ−２００凝集細胞アッセイを用いて細胞をカウントし、細胞生存能を決定した。２４ウェルプレートを用いて１ウェル当たり５００μＬのプレーティング培地中に２．０×１０５生存細胞をプレーティングした。

リバーストランスフェクション（播種直後）：
トランスフェクトされる各ウェルに対して１２μＬの１０μＭｓａＲＮＡを８５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬのハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）を添加し、撹拌により十分混合した。トランスフェクション系を室温で１５分間インキュベートした。２００ｎＭの最終ｓａＲＮＡ濃度になるように１００μＬのトランスフェクション複合体を各ウェルに添加した。加湿インキュベータ中で５％ＣＯ_２を用いてプレートを３７℃でインキュベートした。５時間後、培地を５００μＬの予備加温維持培地に変更した。

フォワードトランスフェクション（播種２４時間後）：
トランスフェクトされる各ウェルに対して１２μＬの１０μＭｓａＲＮＡを８５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬのハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）を添加し、撹拌により十分混合した。トランスフェクション系を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション時、培地を１ウェル当たり５００μＬの新鮮な予備加温維持培地に変更した。２００ｎＭの最終ｓａＲＮＡ濃度になるように１００μＬのトランスフェクション複合体を各ウェルに添加した。プレートをインキュベータに戻した。２４時間後、培地を５００μＬの新鮮な予備加温維持培地に変更した。ピーク遺伝子活性は細胞接種７２時間後に生じた。細胞および／または上清を収集してこの時点で下流分析に供した。

増殖一次ヒト肝細胞におけるｓａＲＮＡトランスフェクションプロトコル
一次ヒト肝細胞（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を増殖培地に配置した。播種日、細胞をリバーストランスフェクション工程に付す。この際、ｓａＲＮＡトランスフェクション複合体を細胞に添加した後、単層として付着させる。２４時間後、培地を変更してフォワードトランスフェクションを行う。翌日、培地を変更し、細胞採取前に細胞をさらに２４時間インキュベートして分析に供した。ＡＷ５１で肝細胞をトランスフェクトした。４８時間および７２時間でＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを測定した。対照としてＡｈａ−１−ｓｉＲＮＡおよびＦｌｕｃを使用した。表１３および図９ＢにＡｈａ１、アルブミン、ＣＥＢＰＡの相対発現を示した。

材料
一次肝細胞解凍培地：
凍結保存肝細胞回復培地（ＣＨＲＭ）、５０ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号ＣＭ７０００）
一次肝細胞プレーティング培地：
ウシ胎仔血清、熱不活性化−５０ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１６１４０−０７１）
インスリン−トランスフェリン−セレン（１００Ｘ）−５ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号４１４００−０４５）
ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）−５ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１５６３０−０５６）
Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液−５ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｇ１１４６）
デキサメタゾン−最終濃度４０ｎｇ／ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｄ８８９３）
ウィリアムＥ培地、フェノールレッドなし−全量５００ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１２１７６−０１）
一次肝細胞維持培地：
一次肝細胞維持サプリメント（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号ＣＭ４０００）
肝細胞成長因子ヒト−最終濃度４０ｎｇ／ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｈ５７９１）
表皮成長因子ヒト−最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｅ９６４４）
ニコチンアミド−最終濃度２．５μｇ／ｍＬ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログ番号Ｎ０６３６）
ウィリアムＥ培地、フェノールレッドなし−全量５００ｍＬ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１２１７６−０１）
一次肝細胞培養プレート：
コラーゲンＩ、被覆プレート、２４ウェル（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号Ａ１１４２８−０２）
トランスフェクション試薬：
ハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カタログ番号３０１７０４）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ血清低減培地、フェノールレッドなし（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号１１０５８−０２１）
プロトコル
ｓａＲＮＡアニーリング：
ＲＮアーゼフリーの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭＮａＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ中に１ｍＭになるように各凍結乾燥ｓａＲＮＡ鎖を再懸濁した。十分に混合して再懸濁を終了した。温和な撹拌により等体積のセンス鎖とアンチセンス鎖とを一緒に混合した。組み合わされた鎖と共にチューブを９５℃に加熱された水の入ったビーカ中に配置した。ビーカにカバーをかけて室温に冷却した。ＲＮアーゼフリー水を用いて後続の希釈を行った。２４ウェル方式では一般にストック溶液を１０μＭに希釈した。アニールｓａＲＮＡをアリコートして−２０℃で貯蔵した。

一次肝細胞の解凍およびプレーティング：
水浴中でＣＨＲＭおよびプレーティング培地を３７℃に加温した。氷晶が残留しなくなるまで凍結保存肝細胞を３７℃の水浴中で解凍した。７０％エタノールを用いてバイアルを消毒した。無菌組織培養フード内で解凍肝細胞をＣＨＲＭ中に直接導入した。１００×ｇ（ＴｈｅｒｍｏＦ−Ｇ１固定角ロータ中９００ｒｐｍ）で肝細胞を室温で１０分間遠心分離した。上清を廃棄ボトル中に慎重に注いで捨てた。１×１０６凍結保存細胞当たり１ｍＬのプレーティング培地中にペレットを再懸濁させた。ヌクレオカウンター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）ＮＣ−２００凝集細胞アッセイを用いて細胞をカウントし、細胞生存能を決定した。２４ウェルプレートを用いて１ウェル当たり５００μＬのプレーティング培地中に１．０×１０５生存細胞をプレーティングした。

リバーストランスフェクション（播種直後）：
トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬの１０μＭｓａＲＮＡを９４μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬのハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）を添加し、撹拌により十分混合した。トランスフェクション系を室温で１５分間インキュベートした。５０ｎＭの最終ｓａＲＮＡ濃度になるように１００μＬのトランスフェクション複合体を各ウェルに添加した。

加湿インキュベータ中で５％ＣＯ_２を用いてプレートを３７℃でインキュベートした。５時間後、培地を５００μＬの予備加温維持培地に変更した。
フォワードトランスフェクション（播種２４時間後）：
トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬの１０μＭｓａＲＮＡを９４μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈した。トランスフェクトされる各ウェルに対して３μＬのハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）を添加し、撹拌により十分混合した。

トランスフェクション系を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション時、培地を１ウェル当たり５００μＬの新鮮な予備加温維持培地に変更した。５０ｎＭの最終ｓａＲＮＡ濃度になるように１００μＬのトランスフェクション複合体を各ウェルに添加した。プレートをインキュベータに戻した。２４時間後、培地を５００μＬの新鮮な予備加温維持培地に変更した。ピーク遺伝子活性は細胞接種７２時間後に生じた。細胞および／または上清を収集してこの時点で下流分析に供した。

表１２〜１３および図９Ａ／９Ｂは、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡが増殖培地に暴露されたときに肝細胞のＣＥＢＰＡおよびアルブミンをアップレギュレートすることを示している。したがって、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡは増殖細胞において効力を示す。ｓｉＲＮＡは増殖細胞および非増殖性細胞の両方で効力を示す。

実施例５．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡを用いたｉｎｖｉｔｒｏ研究
肝細胞系におけるＣＥＢＰＡ−５１の生物学的作用：
研究目標：本研究の目標は、高分化ＨＣＣ（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ）または低分化ＨＣＣ（ＰＬＣＰＲＦ５）を表すＨＣＣ細胞系の内因性ＣＥＢＰＡ転写レベルを測定してＣＥＢＰＡ−５１によるトランスフェクション後のＣＥＢＰＡｍＲＮＡおよびＣ／ＥＢＰ−αタンパク質発現の相対増加を決定することであった。加えて、細胞増殖に及ぼすＣ／ＥＢＰ−αアップレギュレーションの作用を評価した。

ＨＥＰ３Ｂ、ＨＥＰＧ、およびＰＬＣＰＲＦ５を含む肝細胞系パネルをＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトした。Ｃ／ＥＢＰ−αタンパク質は、トランスフェクションの７２時間後の細胞ライセートにおいてウェスタンブロットにより検出された（定量：ＲＣ−ＤＣブラッドフォードアッセイ、参照タンパク質：チューブリン）。ＣＥＢＰＡの内因性転写レベルは、ＰＬＣＰＲＦ５細胞と比較してＨｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２細胞において有意に高かった。ＣＥＢＰＡ−５１による処置は、非トランスフェクト対照および非特異的ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＦＬＵＣ）による処置と比較して、試験した３つすべてのＨＣＣ細胞系において、ＣＥＢＰＡｍＲＮＡ転写レベルの有意な増加およびＣ／ＥＢＰ−αタンパク質レベルの増加もたらした（図１０Ａおよび１０Ｂ）。

ＷＳＴ−１増殖アッセイおよびＳＲＢ比色アッセイを用いて細胞増殖を測定した。結果は図１１Ａ〜１１Ｆに示した。ＣＥＢＰＡ−５１は、ＨＥＰ３ＢおよびＨＥＰＧ２の細胞系では対照と比較して細胞増殖を低減したが、ＰＬＣＰＲＦ５細胞では低減しなかった。したがって、細胞増殖を阻害するＣＥＢＰＡ−５１の能力は、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞において確認された。これとは対照的に、ＰＬＣＰＲＦ５細胞はＣＥＢＰＡ−５１処置による影響を受けなかった。

ＡＷ５１のオフターゲット分析：
ＡＷ５１の特異性は予測されたオフターゲット部位から確認された。バイオインフォマティクスオフターゲット分析を行った。ＡＷ５１は、いずれの他のヒト転写物に対してもアンチセンス鎖の少なくとも２ミスマッチを有する。アンチセンス鎖に対して２ミスマッチを有する４つのオフターゲットのみが予測された。オフターゲットは、Ｈｕｈ７細胞およびＰａｎｃ−１細胞において２４時間のインキュベーションを行ってｖｉｔｒｏで測定した。ｍＲＮＡレベルはｇａｐｄｈに対して規格化し、結果は図１２Ａ（Ｈｕｈ７細胞）〜１２Ｂ（Ｐａｎｃ−１細胞）に示した。ＡＷ５１トランスフェクション後の潜在的オフターゲットの発現パターンから、ＡＷ５１により遺伝子が有意に影響を受けないことが示された。

実施例６．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡの機序研究
鎖の選択／同定および切断の分析
５’末端の反転脱塩基修飾は、Ａｇｏ２複合体中のガイド位置へのローディングを防止することが示されている。Ｃ／ＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖（ＡＳ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓｔｒａｎｄ）およびセンス鎖（ＳＳ：ｓｅｎｓｅｓｔｒａｎｄ）の５’末端を反転脱塩基修飾（ｂ）でブロックしてＣ／ＥＢＰＡｍＲＮＡ発現を測定し、Ｃ／ＥＢＰＡｍＲＮＡ発現に及ぼすブロック化ＡＳおよび／またはＳＳ鎖の影響を決定した。

ＲＮＡｉは標的ｍＲＮＡの切断を含む。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡが標的ＥＳＴ（ＡＷ６６５８１２）を切断するかを決定するために、中心３塩基対の突然変異を有する非切断配列を試験した（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１０５００）。中心３塩基対の突然変異は、鎖がガイドとして機能するかにかかわらず、非切断性ｓａＲＮＡを生成する。

ｓａＲＮＡはすべて、水中で合成してアニールした。ＲＰ−ＨＰＬＣでは９０％の純度を有する。オリゴヌクレオチドサンプルの配列は以下の表に示した。

クリティカルな試薬
トランスフェクション。１μＬリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて１０ｎＭの最終オリゴヌクレオチド濃度で２４ウェルディッシュ中で１００，０００細胞／ウェルで細胞をトランスフェクトした。

ＲＮＡ単離。製造業者（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、オランダ国フェンロー）のプロトコルに従ってＲＮイージ（ＲＮｅａｓｙ）ミニキットを用いて全ＲＮＡを単離した。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成。２０μＬ反応で５００ｎｇのＲＮＡを用いて製造業者（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））のプロトコルに従ってクオンティテクト（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ）逆転写キットによりｃＤＮＡを合成した。

定量ＰＣＲ。製造業者のプロトコルに従ってアプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によりクオンティファストＳＹＢＲグリーン（ＱｕａｎｔｉＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）ＰＣＲマスターミックス（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて定量ＰＣＲを行った。各反応で１２．５ｎｇのｃＤＮＡを用いてトリプリケートウェルで反応を行った。

細胞系
３７℃に維持されたインキュベータ内で５％ＣＯ_２を用いて１０％ウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス）が追加されたＲＰＭＩ培地中にＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞を保持した。

実験計画
実験はトリプリケートウェルで行った。１００，０００細胞／ウェルで２４ウェルディッシュにＨｅｐＧ２細胞を接種し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて１０ｎＭ（ｆ．ｃ．）の各テストアイテムでリバーストランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて１０ｎＭ（ｆ．ｃ．）の各テストアイテムで追加のフォワードトランスフェクション工程を行った。予備試験により最大ｓａＲＮＡ活性が２回目のトランスフェクション後に観測されることを確認した。２回目のトランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解して捕集し、定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを決定した。

データ評価
ＳＤＳソフトウェア（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてＣｔ値を決定し、非トランスフェクト細胞に対して規格化することにより相対量を計算した。加えて、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部対照として機能させた。トリプリケートでトランスフェクション実験を行い、トリプリケートでｑＰＣＲの決定を行った。統計的有意性はウェルチ補正を用いてｔ検定により決定した。

結果および考察
非トランスフェクト細胞と比較して、非修飾ＡＷ１−５１配列、ＳＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１２）、および内部配列突然変異ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１０５００）でトランスフェクトした細胞で、２〜２．５倍のＣＥＢＰＡｍＲＮＡアップレギュレーションが観測された（図１３Ａ）（すべてｐ＜０．０１で統計的に有意である）。非特異的対照（ＮＣ−５０００００）、ＡＳ修飾ＡＷ１−５１（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１４）、両鎖修飾（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１３）を用いてトランスフェクションした後、ＣＥＢＰＡｍＲＮＡのアップレギュレーションは観測されなかった。この活性化パターンは、ＣＥＢＰＡ転写活性化の下流標的であるアルブミン発現のアップレギュレーションにｐ＜０．０５で統計的に有意に一致した（図１３Ｂ）。

反転脱塩基修飾は５’鎖がロードされないようにＡｇｏ２をブロックすることが知られているため、この修飾を両方の鎖に有するオリゴであるＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１００１４は不活性であると予想される。このことは実験で確認することができた。したがって、ＡＳではなくＳＳに反転脱塩基修飾を行ってＣＥＢＰＡ活性化が観測されることから、ＡＳはＣＥＢＰＡｍＲＮＡ発現をトリガーするためにＡｇｏ２にロードされるガイド鎖であることが示唆される。

Ａｇｏ２による標的の切断は、ガイド鎖と標的配列（ゲノムＤＮＡまたは遺伝子から生じるアンチセンスＲＮＡ転写物）との間の配列中心ミスマッチにより阻害される。中心突然変異を含有するＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ配列（ＣＥＢＰＡ−ＡＷ０１−５１０５００）は、非突然変異オリゴと比較してＣＥＢＰＡ活性化の差を示さなかったことから、ＣＥＢＰＡ配列の切断はｓａＲＮＡ活性に必要でないことが示唆される。

結論
ＡＷ１−５１のアンチセンス鎖はｓａＲＮＡ活性に関与するガイド鎖であることが実証された。さらに、センス鎖上の５’反転脱塩基修飾がＣＥＢＰＡ遺伝子活性化に何ら影響を及ぼさないことが示された。加えて、Ａｇｏ２による標的アンチセンスＲＮＡ切断はｓａＲＮＡ活性をトリガーするのに必要でなかった。

実施例７．一次ヒト肝細胞におけるＣＥＢＰＡ−５１ｓａＲＮＡ活性
これまでに示されたように、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡは、静止肝細胞ではなく増殖肝細胞でＣＥＢＰＡｍＲＮＡおよびアルブミンｍＲＮＡをアップレギュレートする（図９Ａおよび図９Ｂ）。本研究では、増殖肝細胞に及ぼすＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡの作用を再び評価し（図１４）、アルブミン分泌（図１５）および下流マーカ（図１６Ａ〜図１６Ｆ）に及ぼす作用も調べた。

正常ヒト一次ヒト肝細胞におけるＣＥＢＰＡ−５１の作用を評価した。培養下の一次肝細胞は増殖しないため、本研究では成長因子およびサイトカインの存在下で増殖するように誘導された一次肝細胞においてＣＥＢＰＡ−５１ＣがＥＢＰＡ転写物およびのアルブミンをアップレギュレートすることを実証する。さらに、本研究では、ＣＥＢＰＡ−５１が効率的な肝機能にきわめて重要な因子のレギュレーションを引き起こすことを示す。これらは、肝アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、およびＨＮＦ４Ａを含む。

本研究の目的は、ＣＥＢＰＡおよびアルブミン発現に及ぼす正常ヒト一次肝細胞におけるＣＥＢＰＡ−５１の効力を確証することであった。加えて、ＣＥＢＰＡ−５１が好ましい作用を引き起こすかを評価するために肝機能に重要な因子をスクリーニングした。これらの因子は、以下のものを含んでいた。

− アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）。ＡＧＸＴ発現は肝特異的であり、肝細胞の代謝機能に必要とされる。
− アルブミン。血清アルブミンはヒト血漿の主要タンパク質であり、肝臓により排他的に合成される。その主要機能は、血液のコロイド浸透圧を調節すること、さらには脂溶性ホルモン、胆汁酸塩、非コンジュゲートビリルビン、アポタンパク質、カルシウム、および特定の薬剤（ワルファリン、クロフィブラートなど）の担体分子として作用することである。

− シトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）。ＣＹＰ３Ａ４は、薬剤代謝に関与する酸化酵素のシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーである。ＣＹＰ３Ａ４は、主に肝臓に見いだされる。シトクロムＰ４５０のこのファミリーにはいくつかの他のメンバーが存在するが、ＣＹＰ３Ａ４は最も一般的かつ汎用的なメンバーである。

− オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）。ＯＴＣは、尿素回路の一部としてミトコンドリアにおいてシトルリンおよびホスフェートを形成するカルバモイルリン酸とオルニチンとの間の反応を触媒する酵素である。

− 肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４Ａ）。ＨＮＦ４Ａは、脂質の輸送ならびに薬剤およびグルコースの代謝に関与する遺伝子の肝特異的遺伝子発現のマスターレギュレータであると認識されている肝特異的転写因子である。

ＣＥＢＰＡ−５１、ＣＥＢＰＡ、およびアルブミンの標的エンゲージメントを確認するために、肝機能プローブと協同して転写レベルを確認した。加えて、ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトした後の細胞培養培地中へのアルブミン分泌を測定するために、アルブミン特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡを行った。

材料および方法
本実験のテストアイテムはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＡＰＩであるＣＥＢＰＡ−５１であった。加えて、陰性対照として非標的化二本鎖ｓｉＦＬＵＣおよびトランスフェクション効率対照としてＡｈａ−１ｓｉＲＮＡも使用した。これらのＲＮＡオリゴヌクレオチド（以下の表を参照されたい）は、商業的に合成されたものであり（ＳＴファーム（ＳＴＰｈａｒｍ）、韓国ソウル、補遺に分析証明）、アニールしてＲＮアーゼフリーＨ２Ｏ中に−２０℃で１０μＭアリコートとして貯蔵した。

クリティカルな試薬
一次肝細胞解凍培地。各バイアルを解凍するために凍結保存肝細胞回復培地（ＣＨＲＭ）を使用した（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＭ７０００）。

一次肝細胞プレーティング培地。ウシ胎仔血清、熱不活性化−５０ｍｌ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１６１４０−０７１）、インスリン−トランスフェリン−セレン（１００×）−５ｍｌ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４１４００−０４５）、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）−５ｍｌ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１５６３０−０５６）、Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液−５ｍｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｇ１１４６）、デキサメタゾン−最終濃度４０ｎｇ／ｍｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｄ８８９３）、フェノールレッドフリーのウィリアムＥ培地（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａ１２１７６−０１）。

一次肝細胞維持培地。一次肝細胞維持サプリメント（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＭ４０００）、ヒト肝細胞成長因子−最終濃度４０ｎｇ／ｍｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｈ５７９１）、表皮成長因子−最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｅ９６４４）、ニコチンアミド−最終濃度２．５μｇ／ｍｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｎ０６３６）、フェノールレッドフリーのウィリアムＥ培地−５００ｍｌ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａ１２１７６−０１）。

トランスフェクション。３μＬのハイパーフェクト（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ）トランスフェクション試薬（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、３０１７０４）を用いて５０ｎＭの最終オリゴヌクレオチド濃度で２４ウェルコラーゲン被覆ディッシュ中で１００，０００細胞／ウェルで細胞をトランスフェクトした。プレーティング培地中で細胞を５時間インキュベートして単層を形成してから維持培地で置き換えた。第２の（フォワード）トランスフェクションでは、リバーストランスフェクションの場合と同一の条件を使用した。実験の残りの時間では維持培地を使用した。

ＲＮＡ単離。製造業者（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、オランダ国フェンロー）のプロトコルに従ってＲＮイージ（ＲＮｅａｓｙ）ミニキットを用いて全ＲＮＡを単離した。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成。２０μＬ反応で５００ｎｇのＲＮＡを用いて製造業者のプロトコルに従ってクオンティテクト（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ）逆転写キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））によりｃＤＮＡを合成した。

定量ＰＣＲ。製造業者のプロトコルに従ってアプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によりクオンティテクトＳＹＢＲ（ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＳＹＢＲ）マスターミックス（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて定量ＰＣＲを行った。反応はトリプリケートウェルで行った。

アルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ＡｌｂｕｍｉｎＥｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）。製造業者の説明書に従ってヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量セット（ベチル・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ）、米国）を用いてアルブミン含有量に関して、各実験群内でインキュベートした一次細胞の培養培地を測定した。コスター−３５９６−９６（Ｃｏｓｔａｒ−３５９６−９６）ウェルプレート（平底、ＴＣ処理、非発熱、ポリスチレン、無菌プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、米国）の各ウェル上にアルブミンに対するヒト特異的抗体を固定化した。インハウスで調製した試薬には以下のものが含まれていた。

ＥＬＩＳＡプレートコーティング緩衝液。０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｃ−３０４１）、ｐＨ９．６。
ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液。５０ｍＭトリス、０．１４ＭＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｐ１３７９）ｐＨ８．０）。

ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液。５０ｍＭトリス、０．１４ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ａ−４５０３）、ｐＨ８．０）。
サンプル／コンジュゲート緩衝液。５０ｎＭトリス、０．１４ＭＮａＣｌ、１％のＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ａ−４５０３）、０．０５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｐ１３７９）。

酵素基質緩衝液。３，３’，５，５’テトラメチベンジジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｔ０４４０）。ＥＬＩＳＡ停止液。（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓ５８１４）。
細胞系
ヒト正常一次肝細胞はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＨＭＣＰＴＳ）から購入した。リピートはすべて同一のバッチ（ＨＵ８２００−Ａ）に由来するものであった。

実験計画
相対遺伝子発現
標的転写物の相対定量ではトリプリケートで実験を行った。一次肝細胞プレーティング培地を用いて１００，０００細胞／ウェルの密度で２４コラーゲン被覆ウェルディッシュ（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａ１１４２８−０２）にヒト一次肝細胞を接種し、続いて、細胞が依然として懸濁状態のまま５０ｎＭ（ｆ．ｃ）のＣＥＢＰＡ−５１で初回トランスフェクションを行った（リバーストランスフェクション）。次いで、５時間にわたり細胞で単層を形成し、その後、プレーティング培地を維持培地で置き換えた。リバーストランスフェクションの２４時間後、５０ｎＭのＣＥＢＰＡ−５１を用いて２回目の（フォワード）トランスフェクションを行った。リバーストランスフェクションの７２時間後の採取時まで２４時間ごとに新鮮な維持培地で置き換えた。その時点で細胞から抽出した全ＲＮＡを標的遺伝子発現に関してスクリーニングした。

ＥＬＩＳＡ
本研究の７２時間の時点における培養培地を捕集し、９６ウェルプレートのウェル上に固定されたヒト特異的抗アルブミン（ベチル・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８０−１２９Ａ）を用いてＥＬＩＳＡに供した。既知のアルブミン量の標準曲線（ベチル・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲＳ１０−１１０−４）に１０μｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、および６．２５ｎｇ／ｍｌを追加した。サンプルおよび既知の対照量をそのまま室温（２０〜２５℃）で３時間にわたり回転プレート上のＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。製造業者のプロトコルに詳述される適切な回数の洗浄後、１：１５０，０００）の濃度でＨＲＰ検出抗体（ベチル・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８０−１２９Ｐ）を添加し、室温（２０〜２５℃）で３時間にわたり回転プレート上で１時間インキュベートした。５回の洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、酵素呈色反応が現れるまで室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ停止液の添加により反応を停止させ、４５０ｎｍの光学濃度の吸光度をプレートリーダ上で測定した。

データ評価
相対発現
リバック方法（２−ΔΔＣＴ）（リバックＫ（ＬｉｖａｋＫ）およびシュミットゲンＴＤ（ＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ）、２００１年）を用いてリアルタイムＰＣＲの結果を分析した。ＳＤＳソフトウェア（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてＣｔ値を決定し、非トランスフェクト細胞に対して規格化することにより相対量を計算する。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを内部対照として機能させる。トリプリケートでトランスフェクション実験を行い、トリプリケートでｑＰＣＲの決定を行った。統計的有意性はウェルチ補正を用いてノンパラメトリックｔ検定により決定した。

ＥＬＩＳＡ
各標準濃度に対して平均吸光度値からブランク値を減算して垂直（Ｙ）軸にとり、対応するヒトアルブミン濃度を水平（Ｘ）軸にとり、曲線当てはめソフトウェア（エクセル（Ｅｘｃｅｌ））を用いて、未知サンプルのヒトアルブミンの量を決定するための標準曲線を作成した。未知サンプルで得られた吸光度値（Ｙ軸）に対応するヒトアルブミン濃度（Ｘ軸）を用いて、未知サンプル中のヒトアルブミン濃度の大きさを計算した。

結果および考察
一次ヒト肝細胞へのＣＥＢＰＡ−５１のトランスフェクションは、アルブミンと同様にＣＥＢＰＡ転写レベルを有意に２．５倍だけ増加させる（図１４Ａおよび１４Ｂ）。有効なトランスフェクション効率を確認するために、Ａｈａ１−ｓｉＲＮＡを対照として使用したところ、標的転写物が１／７に低減することが実証された（図１４Ｃ）。

正常ヒト一次肝細胞におけるＣＥＢＰＡ−５１の生物学的作用
ＣＥＢＰＡ−５１トランスフェクション後のＣＥＢＰＡ転写物の内因性発現レベルの増加を確認した後、分泌アルブミンのレベルに関して細胞の培養培地を測定した。ヒト特異的抗アルブミン抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイでは、肝細胞からのアルブミンの分泌は有意に１．３倍だけ増加することが確認された（図１５）。

ＣＥＢＰＡおよびアルブミン転写レベルの増加が肝機能に重要な因子のポジティブレギュレーションをも反映したものでもあるかを評価するために、ＣＥＢＰＡ−５１でトランスフェクトした一次肝細胞において次の転写物の発現レベルを評価した。図１６Ａでアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）は１．４倍だけ増加した。図１６Ｂでアルブミンは１．５倍だけ増加した。図１６ＣでシトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）は１．５倍だけ増加した。図１６Ｄでオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）は２．３倍だけ増加した。図１６Ｅで肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４Ａ）は１．５倍だけ増加した。さらに図１６ＦでＣＥＢＰＡは１．６倍だけ増加した。

結論
ＣＥＢＰＡは重要な肝臓富化転写因子として認識される。その生物学的機能はノックアウトおよびノックイントランスジェニック動物研究でより明らかになる。正常ヒト一次肝細胞において肝細胞機能にさらに適合するＣＥＢＰＡおよびその下流エフェクターのＣＥＢＰＡ−５１誘導アップレギュレーションの転写反応が、本研究から実証される。正常一次肝細胞は、アルブミン分泌の有意な増加および解毒酵素の有意なアップレギュレーションを伴ってＣＥＢＰＡ−５１トランスフェクションに有利に反応することが見いだされる。

実施例８．カニクイザル線維芽におけるＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡのｓａＲＮＡ活性
細胞系
一次カニクイザル肝細胞は、プリマサイト・セル・カルチャー・テクノロジー（ＰｒｉｍａｃｙｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（独国シュベリン）から入手した。ＣＹＮＯＭ−Ｋ１カニクイザル胚性線維芽細胞（英国公衆衛生庁（ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＥｎｇｌａｎｄ）、英国ソールズベリー）は、５％ＣＯ_２を含む３７℃に維持されたインキュベータ内で１０％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸（ライフ・テクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および１×Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス）が追加されたＭＥＭ培地中に保持された。カニクイザル細胞においてＣＥＢＰＡ−５１がＣＥＢＰＡｍＲＮＡをアップレギュレートする能力は評価して交差反応性を確認した。最初に、ＣＥＢＰＡ−５１標的部位のカニクイザルゲノム配列を検証した。公用データベースから配列をアクセスすると共にｇＤＮＡ誘導ＰＣＲ産物の直接シーケンシングにより検証した。ＢＬＡＳＴを用いてマカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ゲノムに対するクエリー検索としてＣＥＢＰＡ５１標的配列を使用した。クエリーをＣＥＢＰＡのゲノム位置にマッピングしたところ、ＣＥＢＰＡ−５１配列とゲノム標的部位との間のミスマッチは存在しなかった。この配列情報を検証するために、一次カニクイザル肝細胞からｇＤＮＡを単離して標的部位のＰＣＲ産物を生成し、直接シーケンスに供した。得られた配列は、発表されたカニクイザルゲノム配列およびＣＥＢＰＡ−５１標的部位にミスマッチを伴うことなくアライメントする。

カニクイザルゲノム標的配列の確認後、ＣＥＢＰＡ−５１をカニクイザル線維芽中にトランスフェクトして、ＣＥＢＰＡ−５１が交差反応性であるかおよび肝細胞以外の細胞においてＣＥＢＰＡｍＲＮＡをアップレギュレートするかを決定した。非トランスフェクト細胞、ｓｉＦＬＵＣトランスフェクト細胞、およびＣＥＢＰＡ５１トランスフェクト細胞のｍＲＮＡレベルを測定した。実験はトリプリケートで行った。１００，０００細胞／ウェルで２４ウェルディッシュにＣＹＮＯＭ−Ｋ１細胞を接種し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて１０ｎＭ（ｆ．ｃ．）の各テストアイテムでリバーストランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて２０ｎＭ（ｆ．ｃ．）の各テストアイテムで追加のフォワードトランスフェクション工程を行った。予備試験により最大ｓａＲＮＡ活性が２回目のトランスフェクション後に観測されることを確認した。２回目のトランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解して捕集し、定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルを決定した。図１７に示されるように、ＣＥＢＰＡ−５１による細胞への２回目のトランスフェクションの２４時間後、非トランスフェクト細胞と比較して２倍のＣＥＢＰＡｍＲＮＡアップレギュレーションが観測されたが、ｓｉＦＬＵＣではアップレギュレーションが見られなかった。このアップレギュレーションはｐ＜０．０５で統計的に有意であった。

したがって、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡの交差反応性はカニクイザル細胞系で確認された。カニクイザルのゲノム配列は、ＢＬＡＳＴデータベースによりＣＥＢＰＡ−５１標的配列とのミスマッチを含有しないことが実証された。このことは、一次カニクイザルｇＤＮＡのシーケンシングことによりさらに検証された。次いで、カニクイザル線維芽中へのトランスフェクションおよびＣＥＢＰＡ遺伝子活性化の観測によりＣＥＢＰＡ−５１の交差反応性が確認された。

実施例９．ラット、カニクイザル、およびヒトの血清におけるｉｎｖｉｔｒｏ安定性分析
本研究は、３７℃で１２０ｍｉｎにわたりＥＤＴＡ−Ｋ２を用いて抗凝固処理されたラット、カニクイザル、およびヒトの血漿におけるＣＥＢＰＡ−５１およびリポソーム製剤化ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性を研究するｉｎｖｉｔｒｏ安定性分析である。

ＰＢＳ中の３μＬの５０μＭＣＥＢＰＡ−５１溶液または３μＬのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ溶液と３０μＬの血漿と混合し、３７℃で０、５、１０、２０、３０、６０、および１２０ｍｉｎにわたり血漿中でインキュベートした。ＰＢＳ中の３μＬのＣＥＢＰＡ−５１溶液または３０μＬのＰＢＳ中の３μＬのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ溶液のインキュベーションを非特異的分解の対照をとして機能させた。エッペンドルフ・マスターサイクラー（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）を用いてシールされた９６ウェルＰＣＲプレート中でインキュベーションを行った。指定の時点でプロテイナーゼＫ処理によりインキュベーションを停止させ、血漿サンプル中に存在するすべてのヌクレアーゼを消化した。プロテイナーゼＫ処理後、ＣＥＢＰＡ−５１は、サンプル中およびＳＤＳを含有する溶解緩衝液中で安定である。ＣＥＢＰＡ−５１はＬＮＰ製剤のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡから放出される。

続いて、サーモフィッシャ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ＤＮＡＰａｃＰＡ２００カラム（４×２５０ｍｍ）を用いて高ｐＨ（１１）および４０℃で一般的ＡＥＸ−ＨＰＬＣ法により変性条件下でサンプルを分析した。ＨＰＬＣカラムからＲＮＡ鎖を分離溶出させるために、１ｍＬ／ｍｉｎの流量で１８分間で２５０〜６２０ｍＭの臭化ナトリウムグラジエントを使用した。検出は２６０ｎｍでＵＶ検出器を用いて行った。

これらの条件下で、ＣＥＢＰＡ−５１単独またはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡから放出されたＣＥＢＰＡ−５１の２つの一本鎖を互いにおよび分解産物から分離し、識別可能なピークとして評価可能であった。参照一本鎖を入手できず、しかもＡＥＸ−ＨＰＬＣと質量分析とを組み合わせることができなかったため、２つの一本鎖の帰属はできなかった。したがって、２つの鎖は、グラジエント溶出時の保持時間に依存して標識された第１および第２の鎖であった。データの評価では、ＣＥＢＰＡ−５１単独およびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ中のＣＥＢＰＡ−５１の２つの一本鎖のピーク面積を評価したに過ぎない。Ｔ＝０のピーク面積を１００％に設定し、すべての他の時点をそれぞれの種の血漿でのＴ＝０のピーク面積に規格化した。次いで、Ｔ＝０に規格化したインタクト鎖％としてデータを報告した。

結果
製剤化されていないＣＥＢＰＡ−５１：
ＣＥＢＰＡ−５１は、ＥＤＴＡを用いて抗凝固処理されたラット血漿中で比較的安定であり、第１のピークの１５％の分解および第２のピークの８％の分解が観測された（図１８Ａ参照）。ＣＥＢＰＡ−５１はヒト血漿中で約２時間にわたり約５０％分解される（図１８Ｂ参照）。ＣＥＢＰＡ−５１は、カニクイザル血漿中で最も安定でなく、両方鎖の約８５％が２時間以内に分解した（図１８Ｃ参照）。

ＣＥＢＰＡ−５１単独は、ヒトおよびカニクイザルの血漿中ではそれほど安定でなかったが、ラット血漿中では２時間にわたり比較的安定であったことがデータから実証される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ラット血漿中では、ＲＮＡの分解は、２価カチオンに依存する３’エキソヌクレアーゼにより主に誘導される。したがって、抗凝固剤としてのＥＤＴＡの使用はこの分解経路を効率的にブロックし、ＣＥＢＰＡ−５１は比較的安定である。これとは対照的に、ヒトおよびカニクイザルの血漿における主要分解経路はＲＮアーゼＡに依存する。このエンドヌクレアーゼの活性は２価カチオンに依存しないため、リポソーム製剤による保護を含まないＣＥＢＰＡ−５１はこれらの種の血漿中で分解される。

リポソーム製剤化ＣＥＢＰＡ−５１：
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ中のＣＥＢＰＡ−５１は、すべての種の血漿中で２時間にわたり安定であり、有意な分解は観測されなかった（図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃを参照されたい）。このことから、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＬＮＰ製剤は２時間にわたり安定であり、血漿中でＣＥＢＰＡ−５１を分解から完全に保護することが示唆される。

結果から、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ製剤は血漿中で少なくとも２時間にわたりインタクトであると結論付けることができる。
実施例１０．ラットにおけるｉｎｖｉｖｏ薬動学的試験
本研究は、群１では２．１７５ｍｇ／ｋｇＭＴＬ−ＣＥＢＰＡおよび群２では１．５ｍｇ／ｋｇＣＥＢＰＡ−５１の単回ＩＶ適用を１回行った後のラット血漿サンプル中のＣＥＢＰＡ−５１およびリポソーム製剤化ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを調べるＰＫ研究である。各群は３匹の雄ラットを含む。０．２５、０．５、１、２、３、６、１２、２４、および４８時間後、両方の群で血液を採取した。

ＳＤＳ含有緩衝液系でプロテイナーゼＫ処理により血漿のアリコートをホモジナイズした。プロテイナーゼＫ消化後、３ＭＫＣｌを用いてＳＤＳを沈殿させ、遠心分離により除去した。相補的１５ｍｅｒ蛍光標識ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブの存在下で上清を加熱して、ＰＮＡと、ＣＥＢＰＡ−５１単独またはリポソーム製剤化ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡから放出されたＣＥＢＰＡ−５１のアンチセンス鎖との間で安定な二本鎖を特異的に形成した。ＰＮＡは、ＣＥＢＰＡ−５１（この実施例では親化合物と呼ぶ）との間で二本鎖を形成したが、代謝物または合成からの不純物とも形成した。次いで、形成された二本鎖を蛍光検出器と組み合わされた非変性陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）により分析した。代謝物または合成不純物はＡＥＸ−ＨＰＬＣにより主化合物から分離された。

未処置血漿ライセート中にスパイクされた既知濃度の親化合物から生成された外部校正曲線を用いてＣＥＢＰＡ−５１の濃度を計算した。各サンプルで全ピーク面積から親化合物のピーク面積を減算することにより全代謝物／合成不純物レベルを決定した。次いで、得られたピーク面積を外部校正曲線と対比して定量した。

結果
製剤化されていないＣＥＢＰＡ−５１：
ＣＥＢＰＡ−５１で処置されたラットから得られた血漿中で親化合物の高い分解が観測された。親化合物は、第１のサンプリング時点（投与の１５分後、図２０Ａおよび２０Ｂを参照されたい）で検出されたに過ぎなかった。代謝物は投与の６０分後まで検出されたが、投与の２時間後では検出限界（ＢＤＬ：ｂｌｏｗｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔ）以下であった。

リポソーム製剤化ＣＥＢＰＡ−５１：
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ製剤は血漿中で高い安定性を示した。親化合物は、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置されたラットから得られたすべての血漿ライセート中に見いだされた。親化合物と代謝物との比は約９：１であった。すなわち、リポソーム製剤化群ではインタクトな親が約８８％であった。より後の時点では、親化合物の相対含量は「代謝物／不純物」よりも増加した。なぜなら、後者のシグナルは、クロマトグラムのマイナーな位置のピークのほとんどで検出限界以下であったからである（図２１Ａを参照されたい）。投与の４８時間後、ＣＥＢＰＡ−５１は、依然としてラット血漿中に検出可能であった（図２１Ａおよび２１Ｂを参照されたい）。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＩＶ投与後に観測される代謝物は、検出されるＲＮＡの約１０％を占め、強い代謝からではなくＲＮＡ合成プロセスに由来しうることが本研究から示唆される。しかしながら、非カプセル化化合物（ＣＥＢＰＡ−５１）との比較は血漿中不安定性が原因で利用できないため、また、非製剤化ＣＥＢＰＡ−５１はきわめて急速なクリアランスを示すため、ｄｓＲＮＡの代謝変換は排除できない。

実施例１１．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡを用いたＣＣＬ４誘導肝不全／線維症のｉｎｖｉｖｏ研究
肝線維症は、慢性ウイルス性肝炎（たとえば、Ｂ型およびＣ型肝炎）、アルコール乱用、薬剤過負荷／毒性、胆汁鬱滞性肝傷害、先天性異常、肝細胞自己免疫発作などの慢性炎症性肝疾患の病理学的結果である。それは、肝星細胞（ＨＳＣ：ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ）増殖および筋線維芽様細胞への分化により細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ）およびコラーゲンの堆積をもたらすことにより特徴付けられる。四塩化炭素（ＣＣＬ４）誘導肝線維症は、肝線維症および肝硬変の研究用として齧歯動物において十分に確立されたかつ広く認められた実験モデルである。ラットへの四塩化炭素の長期投与は、組織学的に観測可能な肝線維症を伴って肝機能の重篤な擾乱を引き起こす。

両性リポソーム（マリーナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）により提供されたＮＯＶ３４０スマーティクル（Ｓｍａｒｔｉｃｌｅ）リポソーム）を用いて製剤化されたＣＥＢＰＡ５１（ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡと呼ばれる）を用いて１０週間にわたる研究を行った。ＣＥＢＰＡ５１（ＸＤ−０３９３４）は、センス鎖に２’ＯＭｅ修飾および５’反転脱塩基修飾を含むこと以外、ＡＷ５１と同一の配列を有する。ＮＯＶ３４０中の脂質は、Ｍｏｃｈｏｌ、Ｃｈｅｍｓ、ＤＯＰＥ、およびＰＯＰＣを含む。四塩化炭素（ＣＣＬ４）の腹腔内注射を週２回行ってスプラーグドーリーラットで肝不全を引き起こした。１２０〜１５０ｇの出発体重を有する雄スプラーグドーリーラットを使用した。動物に対してＣＣＬ４：オリーブ油（１：１の比）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を２週間にわたり２ｍｌ／ｋｇで週２回、続いて８週間にわたり１ｍｌ／ｋｇで週２回（ｉ．ｐ）行った。動物の体重を週２回測定し、２２±３℃の温度、５０±２０％の湿度、各１２時間の明／暗周期、および１時間当たり１５〜２０回の新鮮空気交換を含む制御環境中に保持した。動物を群別（３匹の動物／ケージ）に収容し、敷料としてオートクレーブ処理トウモロコシ穂軸を使用し、研究期間中、認定照射実験齧歯動物食餌を用いて給餌、不断給餌を行った（ヌトリラボ（Ｎｕｔｒｉｌａｂ）ブランド、テトラゴン・ヒェミーＰｖｔ．Ｌｔｄ（ＴｅｔｒａｇｏｎＣｈｅｍｉｅＰｖｔ．Ｌｔｄ）、バンガロール）。

ビリルビン、体重、およびＡＳＴに基づいてラットをランダム化した。１群：シャム対照、２群：ｐａｔｈ対照−１、３群：ｐａｔｈ対照−２、４群：試験化合物−０．３ｍｇ／ｋｇ、５群：試験化合物−１ｍｇ／ｋｇ、６群：試験化合物−３ｍｇ／ｋｇ、試験化合物＝ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの群に分けた。４〜６群のラットは、ＣＣＬ４の継続注射を併用して３ｍｇ／ｋｇまでの尾静脈注射を介して８週目から始めて２週間にわたり試験化合物で処置した。３群のラットは、３ｍｇ／ｋｇでＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣが投与された。試験化合物のｉ．ｖ．注射は、８週、８．５週、９週、および９．５週で行った。

ＣＣＬ４投与の８週間後の線維症の状態を評価するために、ｐａｔｈ対照−１群で肝機能試験、ヒドロキシプロリンレベル、および病理組織診断を行った。ＣＣＬ４投与の１０週間後の線維症の状態を評価するために、ｐａｔｈ対照−２群で肝機能試験、ヒドロキシプロリンレベル、および病理組織診断を行った。疾患の進行を抑えたりまたは線維症を逆転させたりする能力により試験化合物の効力を評価した。評価パラメータは、体重（３日に１回）、肝機能試験（０日、４２日（６週）、５６日（８週）、６３日（９週）、および７０日（１０週））、研究終了時の病理組織診断、および研究終了時のヒドロキシルプロリンアッセイ（ｐａｔｈ対照−１では８週および残りの群では１０週）であった。病理組織診断には、研究終了時のすべての動物に対するＨ＆Ｅ染色、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色が含まれていた。肝機能試験には、０、４、６、８、９、および１０週で測定されるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰ）、アルブミン、グロブリン、およびアルブミン／グロブリン比が含まれていた。図２２Ａ〜２２Ｋに示される８週、９週、および１０週のパラメータは、ビリルビン（７５％減少、図２２Ｆ）、循環アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（６０％減少、図２２Ｂおよび図２２Ｃ）、およびプロトロンビン時間（２０％減少、図２２Ｉ）を含む臨床関連パラメータの逆転および略正常化を実証した。加えて、血清アルブミン（図２２Ｈ）および総タンパク質（図２２Ｇ）の有意な増加、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（図２２Ｄ）およびガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（図２２Ｅ）の有意な減少が見られた。肝ヒドロキシプロリンは、用量依存的に有意に減少した（図２２Ｋ）。体重の有意な増加は関連毒性を伴うことなく観測された（図２２Ａ）。

病理診断結果は図２３に示した。ナイーブ動物は、褐色を帯びた桃色で鮮明な境界を有して滑らかな健常肝臓を有していた。ＣＣＬ４および媒体対照で処置された動物の肝臓は、表面全体に広がった複数の硬変結節を含んでより淡色のより堅固な肝臓を有していた。ＣＣＬ４およびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物の肝臓は、表面全体に広がった小さい結節を含んで淡色のより堅固な肝臓であった。この肝臓の色は、ＣＣＬ４および媒体対照の群の肝臓の色よりも暗色であった。ＣＣＬ４およびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（３ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物の肝臓は、でこぼこの表面を有し非常に軽度の結節を形成して正常な褐色を帯びた色を有していた。

組織学的染色結果は図２４Ａ〜２４Ｃに示した。図２４Ａはシャム対照である。図２４Ｂは、ＮＯＶ３４０／ｓｉＦｌｕｃ処置（陰性対照）を受けたＣＣＬ４処置ラットである。図２４Ｃは、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置を受けたＣＣＬ４処置ラットである。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置動物は、対照群の動物よりも低減された線維組織および偽小葉形成を有していた。

以上で考察したデータは、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡがすべての臨床関連パラメータにわたり肝不全を逆転することを示した。多くのパラメータは正常に逆転された。血清アルブミンレベルは正常よりも良好でさえあった。

実施例１２．急性肝不全を治療するｉｎｖｉｖｏ研究
急性肝不全（ＡＬＦ：Ａｃｕｔｅｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅ）は高い死亡率を有する臨床病態である。急性肝不全（ＡＬＦ）は、既知の先行肝疾患を伴うことなく患者において肝細胞機能の急速かつ重篤な悪化により特徴付けられる病態である。肝毒性薬剤チオアセトアミド（ＴＡＡ）は本研究でＡＬＦを引き起こすために使用した。ＳＤラットのチオアセトアミド（ＴＡＡ）誘発急性肝不全モデルを確立するために、次のパラメータを測定した。ａ）生存率、ｂ）肝機能試験（ＬＦＴ：ｌｅｖｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｔｅｓｔ）および生化学的パラメータ。

試験系
試験種：ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）。
株：スプラーグドーリーラット（ＳＤラット）。

性別：雄。
体重／年齢：１５０〜２００ｇ／７〜８週齢。
群の数：４。動物／群の数：８。

供給元：ハーラン・ラボラトリーズ（ＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
試験期間：７日間。
６〜７週齢の雄ＳＤラットをＨａｒｌａｎから調達した。２２±３℃の温度、５０±２０％の湿度、各１２時間の明／暗周期、および１時間当たり１５〜２０回の新鮮空気交換を含む制御環境中に動物を保持した。動物を群別（３匹の動物／ケージ）に収容し、敷料としてオートクレーブ処理トウモロコシ穂軸を使用した。受取り次第、動物を１週間隔離状態にした。消せないマーカペンを用いて動物の尾の付け根に一時的な数を割り当てた。隔離後、動物を実験部屋に移し、気候順化のために実験開始前の１週間にわたり飼育した。

装置：ＥＭ−３６０臨床化学アナライザー（エルバ・マンハイム（ＥｒｂａＭａｎｎｈｅｉｍ）、独国）。
疾患誘発
基礎パラメータの群間変動が１０％未満になるように考慮して、−２日に基礎体重、ビリルビン、およびＡＳＴに基づいて、すべての動物を４つの群にランダム化した。試験番号、研究コード、群番号、性別、用量、ケージ番号、動物数、および動物数詳細を示すケージカードによりケージを同定した。１〜４群：０日に３５０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）、体積５ｍｌ／ｋｇの用量で生理食塩水中のＴＡＡの単回腹腔内（ｉ．ｐ）注射によりすべての研究動物に投与を行った。１群は何ら処置を受けず、病理学的対照として機能させた。２群には−２４ｈで、３群には０ｈで、および４群にはＴＡＡ注射後２４ｈでＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを静脈内注射した。１、２、３、４、および５日に、ＬＦＴおよび生化学的パラメータ、たとえば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、総タンパク質（ＴＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、およびアンモニアに関して動物を評価した。研究の終了時、すべての利用可能な動物をＣＯ_２窒息で安楽死させ、血漿を採取して−８０℃で貯蔵した。

適切なディスポーザブルシリンジおよび針を用いて尾静脈を介して試験品ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを静脈内投与した。２、３、および４群の動物にＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した。用量はすべて、１ｍｌ／ｋｇ動物体重の投与体積で投与した。

観測
体重および動物死亡
すべての動物に対して個別に初期体重を記録し、その後、７日間の全試験期間にわたり１日１回記録した。健康状態の観測は同一時刻に毎日行った。これには、警戒感、髪質、ケージ内の動き、さらには鼻、眼、口、および耳からの何らかの排出物の存在が含まれる。各群の動物はすべて、ＴＡＡ投与に起因する死亡に関して毎日モニターした。

生化学分析−ＬＦＴ（ランダム化のため）
−２日に、弱いイソフルラン麻酔下で後眼窩穿刺法により血液サンプルを採取し、完全自動化ランダムアクセス臨床化学アナライザー（ＥＭ−３６０、製造元：エルバ・マンハイム（ＥｒｂａＭａｎｎｈｅｉｍ）、独国）によりＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＴＢＩＬ、ＴＰ、ＡＬＢ、およびアンモニアを推定するために血漿を分離した。次いで、総ビリルビン、体重、およびＡＳＴに基づいて動物をランダム化した。

生化学的パラメータの評価、ＴＡＡ注射後のＬＦＴ
弱いイソフルラン麻酔下で後眼窩穿刺法によりすべての動物から血液サンプルを採取し（ＴＡＡ注射後１日から研究が終了するまで）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＴＢＩＬ、ＴＰ、ＡＬＢ、およびアンモニアを推定するために血漿を分離した。

統計解析
一元または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計解析を行い、適用可能であれば、続いてダネット多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。データは平均値±ＳＥＭとして表した。

結果
肝臓機能パラメータおよび体重
−２日に、ＴＡＡ注射によりＡＬＦを誘発するためにおよびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡによる予防的、同時、および防止的治療のために、総ビリルビン（ＴＢ）、体重、およびＡＳＴレベルに基づいて、すべての動物を４つの群にランダム化した。

病理学的対照（ＴＡＡ対照）群は、その基礎体重と比較して２、３、４日（ｐ＜０．０１）、および５日（ｐ＜０．０５）に体重の有意な減少を示した。異なる時間インターバルでの２群、３群、および４群のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの静脈内投与は、異なる日のＴＡＡ対照群と比較して１日から５日まで体重の有意な変化を示さなかった。

ＴＡＡ群および試験品処置群で全研究期間（７日間）にわたり観測された死亡はなかった。局所（注射部位）徴候および一般的臨床徴候に関して動物を定期的にモニターした。ＴＡＡ注射後１日にすべての動物に嗜眠状態が見られたが、後続日に正常状態が回復された。

ＴＡＡの単回ｉ．ｐ注射は、その基礎読取り値と比較して、１日（ｐ＜０．０５）および２日（ｐ＜０．００１）のＡＬＴ、１日および２日（ｐ＜０．００１）にＡＳＴ、３日（ｐ＜０．０５）のＧＧＴ、３日（ｐ＜０．０５）のビリルビンなどの肝機能パラメータのほとんどで有意でない増加をもたらし、１日（ｐ＜０．０１）、２日（ｐ＜０．００１）、３日（ｐ＜０．０５）のアルブミン、１日および２日（ｐ＜０．００１）のアンモニアなどの他のパラメータの有意な減少をもたらした。

防止的ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注射では示されないが、予防的、同時ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注射では、処置後のさまざまな日のＴＡＡ対照と比較して、ＡＬＴ（ｐ＜０．０５）、ＡＳＴ（ｐ＜０．０５）、ＡＬＰ（ｐ＜０．００１）、ＧＧＴ（ｐ＜０．０５）、ビリルビン（ｐ＜０．０５）などの肝機能パラメータで、および総タンパク質（ｐ＜０．０１）、アルブミン（ｐ＜０．０１）、アンモニア（ｐ＜０．０１）などの他のパラメータで、有意な改善が示された（図２５Ａ〜２５Ｈ）。

考察および結論
本研究では、ＴＡＡ注射を施すことによりＳＤラットにおいて腹腔内に急性肝不全モデルが確立された。ＴＡＡ注射後、いずれの群でも死亡は観測されなかった。ＴＡＡ注射は、病理学的対照（ＴＡＡ対照）動物で観測されたその基礎レベルと比較して、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、ＧＧＴ、総タンパク質、アルブミン、アンモニアなどの肝生化学的パラメータに有意な変化をもたらした。ＴＡＡ対照動物では体重の有意な減少も観測された。予防的（−２４時間）におよびＴＡＡ注射と同時（０時間）に注射した場合、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置は、ＬＦＴパラメータおよびアンモニアの有意な改善を示した。

実施例１３．糖尿病治療のｉｎｖｉｖｏ研究
グルコース代謝の調節におけるＣＥＢＰＡの役割を考慮して、ＣＥＢＰＡ活性化が臨床関連血液パラメータを改善可能であるかを決定するために糖尿病のラットモデルで研究室を行った。高脂肪食により６匹のウィスターラットでＩＩ型糖尿病を誘発した。次いで、ＮＯＶ３４０リポソーム中に製剤化された合計４．３５ｍｇ／ｋｇのＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ（ＡＷ１−５０）または非標的化ＦＬＵＣｓｉＲＮＡを用いてラットを治療した。最後の治療の６日後、血液を採取し動物を屠殺して血清化学および重量の変化を評価した。

図２６Ａ〜２６Ｎに示されるように、対照と比較して、ＮＯＶ３４０−ＣＥＢＰＡで治療されたラットは、肝コレステロール、血清中ＡＳＴ、空腹時グルコース、およびトリグリセリド対ＨＤＬ−ｃ比の有意な減少を示した。また、体重さらには肝重量対体重比の有意な減少を有していた（図２６Ｌおよび図２６Ｎ）。インスリンレベルはＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ治療（図２６Ｋ）により増加する。こうした結果から、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによるＣＥＢＰＡアップレギュレーションは糖尿病の管理に有益でありうることが示唆される。ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡはまた、脂肪肝疾患およびインスリン抵抗性を治療するためも使用しうる。

実施例１４．ＮＡＳＨ治療のｉｎｖｉｖｏ研究
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝臓への脂肪の蓄積により誘発されうる肝炎および肝損傷である。それは非アルコール性脂肪肝疾患と呼ばれる病態群の一部である。ＮＡＳＨは、肝臓の瘢痕化を誘発しうると共に、このことからは硬変を生じうる。ＮＡＳＨ治療におけるＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの作用は、メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ：ｍｅｔｈｏｎｉｎｅｃｈｏｌｉｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）食で飼育されたる動物を用いて研究される。ＭＣＤ食は、ＮＡＳＨに類似した肝傷害もたらす。

本研究では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＣＤ誘発ＮＡＳＨを治療するためにＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡを使用した。研究期間は６週間であった。０日の体重に基づいて雄７〜８週齢Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスをランダム化した。１群は４週間にわたり２群は６週間にわたり普通食を摂取した。３群は４週間にわたり４〜８群は６週間にわたりＭＣＤ食を摂取した。４週でビリルビン、体重、およびＡＬＴレベルに基づいて治療群（４〜８群）をランダム化した。４〜８群はｉ．ｖ．注射によるＰＢＳ治療または治療剤治療を毎週２回受けた（４、４．５、５、および５．５週）。

１群および３群は４週で終了した。２群および４〜８群は６週で終了した。肝機能試験（ＬＦＴ）（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、アルブミン、総ビリルビン、および肝トリグリセリド（ＴＧ））ならびに肝臓の病理組織診断（Ｈ＆Ｅ染色、オイルレッドＯ染色、およびマッソントリクローム）を行った。血清中サイトカイン／マーカ（ＩＬ１β、ＩＬ６、およびＴＮＦ−α）ならびにα２マクログロブリンを測定した。

図２７Ａ〜２７Ｂは体重および飼料消費量の変化を示した。予想どおり、ＭＣＤ食治療は、研究全体にわたり体重および飼料消費量の有意な減少を示した。治療群（Ｇ５〜Ｇ８）は、ＭＣＤ食対照と比較して体重および飼料摂取量の有意な変化を示さなかった。したがって、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療は体重および飼料消費量を変化さなかった。図２７Ｃ〜２７Ｇは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン、およびアルブミンのレベル変化を含むＬＦＴ結果を示した。ＭＣＤ食を摂取した動物は、普通食対照と比較してＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビンなどのＬＦＴパラメータの有意な増加およびタンパク質レベルの低減を示した。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡによる治療は、ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルの有意な減少を示した。低減はまた、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療によりＡＬＰおよびビリルビンでも観測された。図２７Ｈは、肝トリグリセリド（ＴＧ）のレベル変化を示した。肝ＴＧは、ＭＣＤ食対照群で有意に増加した。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡによる治療は、肝ＴＧレベルの有意な減少を示し、肝ＴＧを逆転して正常レベルにした。

したがって、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡ治療はＮＡＳＨ治療に使用しうる。
実施例１５．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡによる他のｉｎｖｉｖｏ研究−−ＤＥＮ誘発ＨＣＣのラットモデルにおけるＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ効力の評価
本研究の目的は、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで治療することによるＣＥＢＰＡの活性化がＨＣＣのラットモデルにおいて臨床パラメータを改善するかを調べることであった。

実験計画：雄ウィスターラットをＤＥＮで処置してＨＣＣを誘発した。簡潔に述べると、動物をＤＥＮで９週間処置した後、３週間無処置にした。次いで、体重に従って動物を３つの群にランダム化した（６〜７匹の雄／群）。１群は、１日に屠殺して処置前対照として機能させ、２および３群は、ＮＯＶ３４０中に製剤化された非標的化ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＬＵＣ）またはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのいずれかにより４ｍｇ／ｋｇの用量で３回ｉ．ｖ．処置した（１、３、および５日）。１２日に、血液を採取し、すべての動物を屠殺した。腫瘍重量および肝重量を測定し、肝組織のセクションをｍＲＮＡ分析のためにただちにフラッシュ凍結した。ＣＥＢＰＡおよびアルブミンのｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した（ハウスキーピング遺伝子：ＧＡＰＤＨ、トリプリケート測定）。

結果：図２８に示されるように、ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣ（非標的化リポソーム対照、媒体対照）と比較して、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置された動物は、肝臓においてＣＥＢＰＡｍＲＮＡ発現の有意な増加を示した。アルブミンｍＲＮＡ発現が増加する傾向が観測されたが、これは統計的に有意ではなかった。

図２９Ａ〜２９Ｉに示されるように、ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣ対照と比較して、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置されたラットは、血清中アンモニア（ｐ＜０．０５）の有意な減少、さらには体重（ｂｗ：ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、腫瘍体積、コレステロール、およびヘモグロビンの変化を示し、これらは統計的に有意な傾向にあった（ｂｗ：ｐ＝０．０６３、腫瘍体積：ｐ＝０．１０、コレステロール：ｐ＝０．０８、ヘモグロビン：ｐ＝０．０５）。処置前対照と比較して、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置されたラットは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびビリルビンの有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。

結論：ＨＣＣのＤＥＮ誘発ラットモデルでは、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ処置は、ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣ対照と比較して、標的エンゲージメント（肝臓におけるＣＥＢＰＡｍＲＮＡのアップレギュレーション）ならびにヘモグロビン、アンモニア、およびコレステロールを含めていくつかの疾患マーカで改善をもたらした。動物数がすくないため統計的に有意でないが、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡで処置された群は、ＮＯＶ３４０／ｓｉＦＬＵＣ対照よりも約８０％小さい平均腫瘍サイズを有して腫瘍成長阻害の傾向を示した。処置前疾患対照との比較に見られるように、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、疾患症状を安定化させただけでなく、ＡＳＴ、ＡＬＴ、およびビリルビンを含めていくつかの肝毒性血清中マーカを逆転し、ＣＣＬ４線維症モデルでこれらのマーカに見られた利益と一致する。まとめると、こうした結果から、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは肝機能を改善可能であると共に、ＤＥＮ誘発肝線維症およびＨＣＣの広く使用されるラットモデルで腫瘍成長を低減可能であることが示唆される。

実施例１６．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡとＡｇｏタンパク質との相互作用の研究
ＨｅｐＧ２細胞をビオチン化アンチセンス鎖（ＡＳ）およびセンス鎖（ｓｓ）−ＣＥＢＰＡ５１でトランスフェクトし、非トランスフェクト対照またはスクランブルビオチン対照と比較した。採取時点（７２時間）で、ビオチン化コンジュゲートを１％ホルムアルデヒドで架橋し、続いてストレプトアビジンアガロースビーズ上に固定した。次いで、抗Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、およびＡｇｏ４との共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）を行った。アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した。次いで、共免疫沈降されたコンジュゲートをダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）−プロテインＧで固定した。プルダウン免疫複合体を洗浄し、磁気カラム上で溶出させた。次いで、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、それぞれのアルゴノート抗体に対してウェスタンブロッティングのためにＰＶＤＦ上に移した。

図３０Ａに示されるように、Ａｇｏ２は、ＳＳ−ビオチン鎖と比較してＡＳ−ビオチン鎖上に強く現われる。Ａｇｏ１、３、および４は、いずれの鎖上にも現われない。このことから、ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡのアンチセンス鎖はＡｇｏ２とは会合するが、他のアルゴノートとは会合しないことが示唆される。

さらなる研究では、マウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞でＡｇｏ２をノックアウトした。野生型細胞およびＡｇｏ２ノックアウト細胞を２４ウェルプレート中に９．８×１０５／ウェルで播種した。２０ｎＭのＣＥＢＰＡ５１およびＦｌｕｃを以上に記載したように（フォワード＋リバース）トランスフェクトした。４８時間の時点でＲＮＡを採取してｓａＲＮＡの活性を決定した。図３０Ｂに示されるように、ＣＥＢＰＡ転写レベルは、ＣＥＢＰＡ５１でトランスフェクトされた野生型細胞でＦｌｕｃの２倍だけ増加した。図３０Ｃは、ｐ２１転写レベルがＣＥＢＰＡ５１でトランスフェクトされた野生型細胞でＦｌｕｃの４倍だけ増加したことを示した。しかしながら、Ａｇｏ２ノックアウト細胞ではＣＥＢＰＡも２１も誘導が測定されなかった。Ａｇｏ２はｓａＲＮＡによる遺伝子活性化に必要とされることが実証される。

実施例１７．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡの製剤化
ＣＥＢＰＡ−５１ｓａＲＮＡをリポソーム内にカプセル化する。使用した送達技術は、マリーナバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ．）が所有するＮＯＶ３４０スマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）技術である。このナノ粒子の脂質成分は、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル−ヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート（ＭＯＣＨＯＬ）で構成される。ＮＯＶ３４０は、６：２４：２３：４７のモル比でＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＣＨＥＭＳ、およびＭＯＣＨＯＬからなる。ナノ粒子は生理ｐＨでアニオン性であり、その特有の脂質比はリポソームに「ｐＨチューナブル」特性および電荷を付与する。これらはマイクロ環境の周囲ｐＨに依存して変化し、生理学的膜を横切る移動を容易にする。広範な即時肝分離を回避するためにスマーティクルズ（ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ）（登録商標）ナノ粒子のサイズを設定する。平均直径は概略で約５０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約１２０ｎｍであり、ｉ．ｖ．注射後、より長時間の全身的分布および向上した血清中安定性が促進され、より広い組織分布がもたらされ、報告された肝臓、脾臓、および骨髄で高レベルになるようにする。

ホスホロアミダイトモノマーを逐次的にカップリングさせることによりＣＥＢＰＡ−５１の各鎖を固体担体上に合成する。合成は、自動シンセサイザー、たとえば、アクタ・オリゴパイロット１００（ＡｋｔａＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００）（ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））、および固体担体が充填された合成反応器（カラムタイプ）に対して特定の体積の試薬および溶媒の送入／送出を行うテクニクロム（Ｔｅｃｈｎｉｋｒｏｍ）シンセサイザー（アサヒ・カセイ・バイオ（ＡｓａｈｉＫａｓｅｉＢｉｏ））を用いて行われる。プロセスは、反応器に接続された指定の貯蔵槽に試薬を仕込むことおよび適切な固体担体を反応槽に充填することから始まる。試薬および溶媒のフローは、流量および圧力の自動記録を行いながら一連のコンピュータ制御バルブおよびポンプにより制御される。固相法は、合成の各工程で溶液相中の試薬から反応生成物が固相に結合されるため、固体担体を溶媒で洗浄することにより反応生成物を効率的に分離することが可能である。

ＣＥＢＰＡ−５１合成の概要は以下の通りである。

ＣＥＢＰＡ−５１合成の詳細なフローチャートは以下の通りである。

溶液中に存在するＣＥＢＰＡ−５１の一般サイズおよび純度は、主に二本鎖体と一本鎖体とを区別するためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定される。ＣＥＢＰＡ−５１二本鎖の融点は配列特異的である。それは二本鎖の熱誘起「融解」（デハイブリダイゼーション）時に形成されるＵＶ（２６０ｎｍ）対Ｔ（℃）曲線の変曲点として決定される。このＴｍ値は、２６０ｎｍの吸収増加（濃色効果）との関連で８１．３℃と決定された。吸光係数は、ナトリウム塩として≧９０％の含有率のオリゴヌクレオチドに基づいて２６０ｎｍおよび２５℃でＰＢＳ中で決定した。分子質量は、製造プロセス時にＬＣ−ＭＳにより両方の一本鎖に対して決定される。放出試験では、二本鎖を一本鎖に分離し、ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳとの組合せにより行われるＭＳにより各ピークを分析した。

不純物
産物関連不純物：
潜在的産物関連不純物は、マルチマー、アグリゲート、さらには伸長形、トランケート／分解形である。これらはＳＥ−ＨＰＬＣにより制御される。

さらに不完全または非効率な合成の結果として、欠如している点で異なるポリマー副産物、たとえば、ｎ−１またはｎ−２ヌクレオチドを生じる可能性がある（すなわち、「ｎ＝２１」の場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の完全な鎖長の２１ｍｅｒの代わりに２０ｍｅｒまたは１９ｍｅｒ）。また、１または２ヌクレオチドによる配列伸長が起こって、ｎ＋１またはｎ＋２オリゴヌクレオチド（２２−または２３ｍｅｒ）を生じる可能性もある。しかしながら、後者の可能性はより低い。これらの変異体は、ＳＥ−ＨＰＬＣでは分解能に制限があるために同定できないが、ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣでは決定可能である。

さらにまた、リボヌクレオチドの取込みまたは修飾の誤りが起こって、産物関連不純物を生じる可能性もある。後者は、イオン対逆相高圧クロマトグラフィー（ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ）ＭＳまたはＭＳ／ＭＳシーケンシングのいずれかにより検出される。

プロセス関連不純物：
潜在的プロセス関連不純物は、化学合成で残留する試薬、反応剤、および溶媒を含む。製造プロセスで使用される固相および試薬による所与のＲＮＡ合成に基づいて、以下のプロセス関連不純物が予想されうる（表１４）。

製剤
必要量のＣＥＢＰＡ−５１をｐＨ４．０の酢酸ナトリウム／スクロース緩衝液に周囲温度で溶解させ、かつ必要量の脂質を５５℃で無水エタノールに溶解させる。クロスフローエタノール注入技術によりリポソームを調製する。リポソーム形成直後、サスペンジョンをｐＨ９．０の塩化ナトリウム／リン酸緩衝液でオンライン希釈する。捕集した中間生成物を０．２μｍの細孔サイズのポリカーボネート膜に通して押し出す。限外濾過により目標ｓａＲＮＡ濃度を達成する。ｐＨ７．５のスクロース／リン酸緩衝液を用いて後続の透析濾過により非カプセル化薬剤物質および残留エタノールを除去する。その後、濃厚リポソームサスペンジョンを０．２μｍ濾過し、５±３℃で貯蔵する。最後に、バルク生成物を製剤化し、０．２μｍで濾過し、２０ｍｌバイアル中に充填する。

注入のために濃縮溶液としてＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ提供する。各バイアルは、約７．５のｐＨの２０ｍｌのスクロース／リン酸緩衝液中に５０ｍｇのＣＥＢＰＡ−５１（ｓａＲＮＡ）を含有する。

以下の表１５にＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの組成を提供する。

サスペンジョンの形態でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを供給し、栓付き２０ｍＬガラスバイアル中にパッケージ化する。シリンジにより主容器から２０ｍｌを確実に抜き出せるように、２０．６ｍｌ（２１．４ｇと均等）のオーバーフィルがある。製造過剰はない。処方は以下の通りである。

賦形剤
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ中の賦形剤は、次の２つの群：リポソーム形成脂質賦形剤（ＮＯＶ３４０−マリーナ・バイオテック（ＭａｒｉｎａＢｉｏｔｅｃｈ）が所有するスマーティクル（Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ）（登録商標）技術）および緩衝液形成賦形剤のスクロースおよびリン酸塩（表１５も参照されたい）に分けることが可能である。リポソームおよびその組成物の開発については、アンドレアコス（ＡｎｄｒｅａｋｏｓＥ．）ら著、アースリティス・アンド・リューマトロジー（ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ）、２００９年、第６０巻、第４号、ｐ．９９４〜１００５（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている。使用したスクロース−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）は、賦形剤および薬剤物質との良好な適合性を有することが知られている。

リポソーム形成脂質賦形剤は、以下の表１６に示されるように６：２４：２３：４７のモル比で１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル−ヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および４−（２−アミノエチル）モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート（ＭＯＣＨＯＬ）で構成される。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ製造プロセスの全体像は図３１に示される。以下の表１７は詳細プロセスである。

最初にエタノールに脂質を溶解させ、個別に酢酸ナトリウム／スクロース緩衝液ｐＨ４．０にＣＥＢＰＡ−５１を溶解させることにより、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを調製した（工程１ａおよび工程１ｂ）。

次いで、２つの溶液を注入プロセスにより組み合わせて一次ベシクルを形成し、その後、エタノール濃度を急速に減少させ、ｐＨ調整緩衝液（塩化ナトリウム／リン酸緩衝液ｐＨ９．０）の添加によりｐＨを急速に増加させる（工程２）。

次いで、中間リポソーム混合物をポリカーボネート膜に通して押し出すことにより、大粒子および凝集物のサイズを低減する（工程３）。
次いで、バルク混合物を限外濾過により濃縮し、緩衝液を少なくとも７体積のスクロース／リン酸緩衝液ｐＨ７．５と交換することによりエタノールおよび塩の濃度を低減する（工程４）。次いで、生物汚染を低減するためにこのバルク生成物を０．２μｍフィルターに通す（工程５）。生成物を最終目標濃度に調整し、０．２μｍ滅菌濾過により滅菌する（工程６）。続いて、バルク生成物を無菌バイアル中に充填する（工程７）。充填バイアルの最終放出試験を行う（工程８）。現在のインプロセス制御は以下のそれぞれの図に示されている。本明細書に規定される仕様に基づく薬剤生成物の最終放出は、この薬剤生成物で行われる。

最終バイアル充填および放出を含むプロセスの終了後、ＤＰバイアル全体を−２０℃以下で貯蔵する（工程９）。
ｐＨ４．０の緩衝液に可溶化されたＣＥＢＰＡ−５１は、この環境で正に荷電されるＭＯＣＨＯＬと相互作用するため、リポソーム形成時点における脂質対薬剤比は、リポソーム内へのＲＮＡのカプセル化効率に特に重要である。カプセル化収率を最適化するために、ＥｔＯＨ溶液中の脂質濃度を一定に維持し、溶液中のＣＥＢＰＡ−５１の濃度を１．０６〜３．４４ｍｇ／ｍｌの範囲内で変化させた。得られた結果から、溶液中のＣＥＢＰＡ−５１濃度を減少させることによりカプセル化効率のわずかな増加が見られることを示唆する傾向が明確に示された。

容器クロージャ系
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ用として選択した容器クロージャ系は、２０ｍｍクロージャを含む標準的２０ｍｌ血清バイアル構成である。ガラスバイアルは、浸出の可能性を最小限に抑えて生成物の良好な保護を提供する透明ＵＳＰタイプＩボロシリケートガラスから作製される。このタイプのガラスはまた、凍結物の貯蔵に重要な良好な熱安定性を有する。栓は、標準的クロロブチルゴムコンパウンドから作製され、生成物接触表面は、生成物吸着の可能性を最小限に抑えるフルオロポリマーで被覆される。最後に、アルミニウムクリンプキャップは、バイアルに対する栓の確実なシールを提供し、使用時までゴムセプタムの外部界接部を潜在的汚染から保護する。

微生物学的属性
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは無菌単回使用バイアルとして提供される。微生物の成長を阻害するための保存剤は添加しない。ゴム栓付きの標準的ガラス血清バイアルおよびアルミニウムクリンプキャップは、微生物汚染を防止することが十分に証明されたバリアを提供する。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの生物汚染は０．２μｍフィルターに通して濾過することにより低減される。無菌バイアルに充填する直前に、生成物は滅菌グレード０．２μｍフィルターに通すことにより滅菌される（工程６、ＤＰ）。パッケージング成分はすべて、「即使用可能」な無菌状態で提供される。それらは追加の処理を行うことなくＩＳＯクラス５環境の無菌条件下で取り扱われる。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは−２０℃±５℃で凍結貯蔵され、かつ光から保護される。輸送はドライアイスが充填されたクーラに入れて行われる。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、−２０℃で６ヶ月間まで貯蔵したとき安定であり、わずかな減少の傾向も変化の傾向も示さない（分析のバラツキの範囲内）。凍結状態では材料品質の急激な低下は非常に起こりにくいと考えられるため、−２０℃で貯蔵された材料では１２ヶ月の貯蔵寿命が提案される。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡはｉ．ｖ．注入（２５０ｍＬ）により投与される。２．５ｍｇ／ｍＬのｓａＲＮＡの濃度のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡが室温で解凍され、その後、静脈内使用では濃度にかかわらず２５０ｍＬの体積が得られるように０．９％正常生理食塩水中にサスペンジョンが希釈される。

試験品および希釈剤は、注入バッグを手で反転させて混合一体化させる（起泡を回避するため）。
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、注入ポンプを用いて静脈（末梢または中心）内に６０分間にわたり一定速度で投与される。

調製溶液の貯蔵：室温（１５〜２５℃）で少なくとも６時間の最大予想使用寿命。
ＣＥＢＰＡ−５１ｓａＲＮＡおよびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの性質は表１８−１および表１８−２に示されており、一般に、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは乳白色サスペンジョンである。蛍光検出により測定されるｓａＲＮＡカプセル化は≧７５％である。動的光散乱により測定される粒子サイズは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約１００〜約１４０ｎｍである。動的光散乱により測定される多分散性指数は≦０．２００である。動的光散乱により測定されるζ電位はｐＨ７．２〜７．８の≦−３０．０ｍＶである。電位差測定法により測定されるｐＨ値は約７．２〜約７．８である。凝固点降下により測定されるオスモル濃度は約２８０〜約４００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定される不純物ｓａＲＮＡは≦１５％である。

ｓａＲＮＡのカプセル化：全体および「外部」遊離のｓａＲＮＡ含有量は、リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）とｓａＲＮＡとの複合体化による蛍光強度を測定して％カプセル化を決定するすることにより定量される。薬剤生成物サンプル溶液は、２つの異なる条件で分析され、外部のｓａＲＮＡに対しては未処理サンプルおよび全体のｓａＲＮＡに対してはトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で処理されたサンプルが分析される。ＲＮＡの含有量は、既知濃度を含む標準から生成された校正曲線を用いて決定される。

カプセル化ｓａＲＮＡのパーセント含有量は次のように計算される。

Ｅ（％）％カプセル化ｓａＲＮＡ
Ｃ_ＴｓａＲＮＡの全含有量
Ｃ_Ｆ遊離（外部）ｓａＲＮＡの含有量
粒子サイズおよび多分散性指数：リポソームのサイズおよびＰＤＩは、ゼータサイザー・ナノＺＳインストラメント（ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ））を用いて光子相関分光法（ＰＣＳ）により決定される。

ζ電位：表面電位は、ゼータサイザー・ナノＺＳインストラメント（ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ））を用いてレーザドップラ速度／レーザドップラ流速測定（ＬＤＶ／ＬＤＡ）により決定される。

ｐＨ：リポソーム薬剤生成物のｐＨは、ガラス電極を用いて２０〜２５℃で測定される。
オスモル濃度：オスモル濃度の決定は、オスモマット（Ｏｓｍｏｍａｔ）０３０（ゴノテック（Ｇｏｎｏｔｅｃ））を用いた純水と比較する凝固点降下の原理に基づく。

残留エタノール：リポソームクルクミン薬剤生成物中の残留エタノールは、フレームイオン化検出器（ＧＣ／ＦＩＤ）を用いてヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより定量される。

不純物ｓａＲＮＡ：ｓａＲＮＡ不純物の含有量（面積％）は、ウォーターズ・エックスブリッジ（ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅ）Ｃ１８カラム（４．６×１００ｍｍ、粒子サイズ３．５μｍ）を用いてイオン対逆相（ＩＰＲＰ）ＨＰＬＣにより定量される。ナノ粒子は２％トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）緩衝液で破壊され、放出されたｓａＲＮＡは、水中１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）／７ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）および１００％メタノールのグラジエントを用いてＨＰＬＣカラムで分離される。ＲＮＡは２６０ｎｍで検出される。不純物（面積％）の含有量は、全ピーク面積（１００面積％）から主要鎖（アンチセンス鎖、センス鎖）のピーク面積（％）を減算することにより決定される。

実施例１８．一次ヒトＰＢＭＣにおけるＣＥＢＰＡ−５１の免疫安全性研究
研究目標：本研究の目的は、ヒト血液細胞においてｅｘｖｉｖｏでＴＬＲ経路の活性化により測定されるＣＥＢＰＡ−５１の免疫安全性を評価することであった。

実験計画：ＣＥＢＰＡ−５１によるサイトカインの誘導は、２名のヒトドナー（ｈｕＰＢＭＣ）から単離された末梢血単核細胞で試験した。
ＴＮＦ−α：ｈｕＰＢＭＣは、トランスフェクション試薬としてドータップ（Ｄｏｔａｐ）を用いて１３３ｎＭのＣＥＢＰＡ−５１または対照配列ＲＤ−０１０１０（陽性対照）およびＲＤ−０１０１１（陰性対照）でトリプリケートでトランスフェクトした。トランスフェクション試薬は、モック対照として単独で使用した。加えて、対照ＯＤＮ２２１６（ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド）およびＲＤ−０１００２（コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ）は、トランスフェクションを用いずに５００ｎＭの濃度で直接添加した。２０時間のインキュベーション後、トリプリケートトランスフェクションからの上清をプールし、市販のヒトＴＮＦ−αＥＬＩＳＡアッセイ（デュプリケートでサンプルを測定した）を用いてＴＮＦ−α分泌を測定した。

ＩＦＮ−α：ｈｕＰＢＭＣは、トランスフェクション試薬としてジーンポータ−２（Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒ−２）を用いて１３３ｎＭのＣＥＢＰＡ−５１または対照配列ＲＤ−０１０１０（陽性対照）およびＲＤ−０１０１１（陰性対照）でトリプリケートでトランスフェクトした。トランスフェクション試薬は、モック対照として単独で使用した。加えて、対照ＯＤＮ２２１６（ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド）およびＲＤ−０１００２（コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ）は、トランスフェクションを用いずに５００ｎＭの濃度で直接添加した。２０時間のインキュベーション後、トリプリケートトランスフェクションからの上清をプールし、市販のヒトＩＦＮ−αＥＬＩＳＡアッセイ（デュプリケートでサンプルを測定した）を用いてＩＦＮ−α分泌を測定した。

結果：ヒトＰＢＭＣによるサイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの分泌は、ＣＥＢＰＡ−５１または対照オリゴでトランスフェクション後に測定した。ＣＥＢＰＡ−５１は、２０時間のインキュベーション後、細胞培養培地へのいずれのサイトカインの有意な分泌も誘導しなかったが、陽性対照は予想されたサイトカイン放出をトリガーした（図３２Ａおよび３２Ｂを参照されたい）。

結論：ＣＥＢＰＡ−５１は、ＣＥＢＰＡ−５１のトランスフェクション後、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−α放出の欠如により示唆されるように、ヒトＰＢＭＣにおいてＴＬＲ−８またはＴＬＲ７／９の経路の活性化をトリガーしなかった。こうした結果から、化学修飾ｓａＲＮＡは免疫刺激活性がないことが示唆される。

実施例１９．第Ｉ相試験および安全な開始用量の選択
提案されたファーストインヒューマン臨床試験
ＦＩＨ試験は、進行肝癌の患者において安全性および耐容性を調べるためのＲＮＡオリゴヌクレオチドＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを用いた多施設オープンラベル第１相臨床試験であろう。

適応症
肝細胞癌または肝外の原発癌タイプに由来する二次肝腫瘍を呈する進行期癌により特徴付けられる組織学的進行癌を有し、いずれの療法も手術も適さないと見なされるまたは局所療法およびソラフェニブ後で進行している患者の治療。

試験目的
主目的：
肝細胞癌または肝外の原発癌タイプに由来する二次肝腫瘍を呈する進行期癌により特徴付けられる組織学的進行癌の参加者に３週間にわたりＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与を毎週１回行って安全性および耐容性を決定すること。

副目的：
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）を決定すること、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの薬動学（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）パラメータを特徴付けること、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの薬力学（ＰＤ：ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）プロセスを評価すること、特に血清中のアルブミンおよびビリルビンに対するＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの作用を特徴付けること、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与後のＨＣＣ患者の健康関連の生活の質の変化を評価すること。

バイオマーカ
バイオマーカストラテジー
予測バイオマーカ
組込み／排除バイオマーカ
これまでのところ、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの予測バイオマーカも遺伝子シグネチャーも同定されていない。したがって、試験の患者適格性基準はかかるバイオマーカを含まない。

探索予測バイオマーカ
ＣＥＢＰＡ−５１による前臨床データおよびツール化合物ならびに科学文献では、ＣＥＢＰＡに対するｓａＲＮＡへのＨＣＣ反応の複数のバイオマーカ仮説が提案される。たとえば、ＣＥＢＰＡｓａＲＮＡに反応する腫瘍細胞成長停止は、ＣＥＢＰＡ発現の基礎レベルに依存しうる。Ｃ／ＥＢＰ−αタンパク質を不活性化する特定の調節機序は、ＣＥＢＰＡｓａＲＮＡへの抵抗性をもたらし、その例として、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路活性化またはＣ／ＥＢＰ−βのドミナントネガティブ型の過剰発現の結果としてのＳｅｒ１９３の脱リン酸化が挙げられる。

本研究は、腫瘍反応に対するプロスペクティブ探索バイオマーカを含まない。しかしながら、腫瘍感受率／耐性のバイオマーカのレトロスペクティブ解析は保管された生検に基づいて行いうる。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡへの線維症肝または硬変肝の反応性について、これまでのところ決定的なバイオマーカ仮説は構築されていないが、特定のエンドクリンループ、たとえば、インスリンおよびＴＮＦ−αを介するものは、ＣＥＢＰＡ活性をモジュレートすることが知られている。予測バイオマーカのプロスペクティブ解析は現時点では想定してないが、レトロスペクティブ解析は保管された組織に対して行いうる。

反応バイオマーカ
標的エンゲージメント
ＣＥＢＰＡ−５１ｓａＲＮＡの分子標的はＣＥＢＰＡプロモータである。ＣＥＢＰＡ転写のアップレギュレーションは、ＣＥＢＰＡｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを介してまたはＣ／ＥＢＰ−αタンパク質の免疫染色を介して組織サンプルで測定可能である。

いくつかの探索方法は、ＣＥＢＰＡ発現の変化を測定して機序証明を確立するために探究されよう。拡張局面では、Ｃ／ＥＢＰ−αタンパク質レベルの免疫染色のために治療前／後で循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌ）が捕集されよう。いずれか対応のある治療前／後の生検から十分な組織が得られれば、前臨床モデルで用いられるｑＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルを調べたり、さらには免疫染色法によりＣ／ＥＢＰ−αタンパク質レベルを調べたりすることを目指すことになろう。ＷＢＣなどのサロゲート組織の使用はこれまでのところ検証されていないが、ＭＴＤが確立されれば導入しうる標的エンゲージメントを実証するための他の潜在的選択肢として探索されよう。

ＰＤバイオマーカ
ＰＤバイオマーカ、Ｃ／ＥＢＰ−αの直接転写制御下にある肝特異的遺伝子およびそのそれぞれのタンパク質産物（基端バイオマーカ）、さらにはＣ／ＥＢＰ−α依存の分化または増殖プログラムのマーカである下流遺伝子標的およびタンパク質（先端バイオマーカ）を含む。Ｃ／ＥＢＰ−αのいくつかの基端バイオマーカは、血清中でモニター可能な分泌タンパク質、たとえば、アルブミン、ＡＦＰ、トランスフェリン、凝固因子などである。

血清中アルブミンは、サンプル採取が容易でありかつ検証臨床アッセイが入手可能であることから一次肝特異的ＰＤバイオマーカとして選択された。他の血清ベースのバイオマーカは、追加の探索ＰＤバイオマーカとして研究中である。

治療前／後の腫瘍生検の入手可能性に依存して、細胞周期調節タンパク質ｐ２１の変化は、腫瘍細胞成長停止のマーカとしてＩＨＣにより腫瘍切片で評価されよう。
サロゲート効力バイオマーカ
血清中アルブミンおよび総ビリルビンのレベルは本研究の副エンドポイントである。アルブミンおよびビリルビンは総合肝機能状態の検証バイオマーカである。加えて、アルブミンおよびビリルビンの血清中レベル（ＡＬＢＩグレード）の組合せ尺度は、進行ＨＣＣおよび肝疾患の患者において生存率と相関することが示されている。血清中アルブミンおよびビリルビンは、両方とも肝疾患の前臨床モデルにおいてＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療に反応することが示されており、対照群と比較してアルブミンの改善およびビリルビンレベルの略正常化をもたらす。

ＣＴＣおよび循環ＤＮＡは腫瘍反応の探索バイオマーカとして拡張局面で採取されよう。血清中アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）はＨＣＣ負荷の検証マーカである。しかしながら、ＡＦＰ遺伝子はまた、正常肝臓においてＣ／ＥＢＰ−αの制御下にあり、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療がＡＦＰ血清中レベルを増加させることが期待される。肝臓および腫瘍における反応が反対であるため、ＡＦＰレベルは慎重に解釈する必要があるであろう。

肝機能状態は、血清中化学、たとえば、アルブミン、総タンパク質、ビリルビン、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびアンモニアのレベルにより評価されよう。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療に対する腫瘍反応はＣＴまたはＭＲＩによりモニターされ、標準的基準（ＲＥＣＩＳＴ）を用いて評価されよう。

薬剤ＰＫおよび生体内分布
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＡＤＭＥモニタリングは血漿中の総ＡＰＩレベルの決定に限定されよう。遊離ｄｓＲＮＡの急速代謝およびクリアランスが理由で、全ＡＰＩレベルは主にカプセル化ＣＥＢＰＡ−５１を表すであろう。ナノ粒子およびその脂質成分は個別にモニターされないであろう。循環状態のインタクトナノ粒子のレベルは、ＡＰＩの合計レベルに比例すると推定される。ＣＥＢＰＡ−５１の組織内分布および代謝物は測定されないであろう。

バイオマーカアッセイ
すべての血清中バイオマーカは地方の公認実験室により評価されよう。生検の遺伝子発現は検証免疫組織化学（ＩＨＣ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）アッセイにより測定されよう。

プログラム特異的ＰＫアッセイは参加者の血漿中の総ＡＰＩを測定するために開発された。アッセイは、２つのＲＮＡ鎖を分離するためのＣＥＢＰＡ−５１の熱変性、それに続く固定化相補的ＰＮＡプローブへのアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションに基づく。このため、アッセイは、ＲＮＡ二本鎖自体ではなく、アンチセンス鎖（およびＰＮＡプローブにハイブリダイズ可能なその代謝物のいずれか）の濃度を測定する。アッセイは、独国のアキソラブスＧｍｂＨ（ＡｘｏｌａｂｓＧｍｂＨ）により開発され、非臨床使用および臨床使用で検証された。

研究アウトカム尺度
主アウトカム尺度
生命徴候（血圧、脈拍、体温、呼吸数を含む）の連続測定、ＥＣＧ（１２リード）、および安全性実験室データ（血液学、凝固、臨床化学、凝血、ならびに補体因子Ｂ（Ｂｂ）および補体因子３ａ（Ｃ３ａ）の活性化断片を含む）、さらには参加者および研究者の両方による耐容性の評価の記述が収集されよう。

最初のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注入後に報告されたすべての有害イベントは、重症度、予測可能性、および試験薬剤との関係に関して、「関連なし」、「可能性あり」、「予想される」、または「明白である」に類別されよう。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安全性および耐容性は、毒性基準（ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ４．０３）に従ってグレード分けされたならびに体組織および診断によりカテゴリー化された有害イベントの頻度により評価されよう。

副アウトカム尺度
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの血漿中濃度は、静脈内投与後に血漿中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの薬動学的（ＰＫ）性質を決定するためにハイブリダイゼーションに基づくＨＰＬＣアッセイを用いた規定の時間点で分析されよう。

このプロトコルは、アルブミン、ビリルビン、肝酵素レベル、ケモカイン、および腫瘍マーカを含むサロゲートＰＤバイオマーカの測定の収集を計画する。腫瘍組織における遺伝子およびタンパク質の発現レベルはまた、静脈内投与後の肝腫瘍参加者におけるＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの薬力学特性の決定を支持するであろう。

自己管理ＦＡＣＴ−Ｈｅｐアンケートを用いて、健康関連の生活の質のアンケートデータは、１日、１５日、８週、およびパート１ｂのＥＯＳで収集されよう。
研究設計
本研究は、多施設、オープンラベル、ファーストインヒューマンの第１相臨床試験であり、２つのパート、すなわち、用量漸増およびそれに続く用量拡大からなる。

パート１ａ − 用量漸増
研究の用量漸増パートは、標準的３＋３設計に従う。量は約２０〜約１６０ｍｇ／ｍ^２である。進行ＨＣＣの参加者または適格性基準を満たす二次肝腫瘍の参加者は、薬剤関連グレード３毒性（ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥバージョン４．０３）が発生するまでまたは以上に規定されたように血清中アルブミンの最大改善が観測されるまで、次の用量、すなわち、２８、４７、７０、９８、１３０、１６０ｍｇ／ｍ２の用量でそれぞれ３名の参加者からなる６つのコホートにリクルートされよう。用量漸増手順は以上に記載される。用量およびスケジュールは研究から生じるデータに依存して変更しうる。

第１の用量のコホートでは、最初の参加者は、研究の開始用量でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療を受ける。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、３週間にわたり週１回６０分間の静脈内注入により投与され、続いて１週間の休止期間を設け、これにより４週間のサイクルを規定する。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの開始用量の決定は、齧歯動物およびカニクイザルにおけるＧＬＰ毒性試験に基づいた。これらのデータに基づいて、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの開始用量２８ｍｇ／ｍ^２はヒトにおいて安全な開始用量であると見なされた。

臨床効果が得られる本研究のパート１ａの参加者は、さらなるサイクルを受けるよう勧められよう。参加者はまた、特別にＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの摂取を継続してもよく、研究者は、参加者が治療を継続可能になる前にケースバイケースでスポンサーと検討しなければならない。

３名のＨＣＣのみの参加者の追加のコホートは、この群の患者でＲＰ２Ｄを確認するためにパート１ａの終了後かつパート１ｂの開始前に追加されよう。このコホートは、臨床データの審査後かつ本研究のパート１ａへのＨＣＣ参加者のリクルート後にＰＩおよびスポンサーの安全委員会により適切であると見なされた場合にのみ考慮されよう。

ＲＰ２Ｄは、研究の用量拡大パートの参加者集団に有利なリスク／利益報酬を最大化する最も適切な用量として安全審査委員会（ＳＲＣ：ｓａｆｅｔｙｒｅｖｉｅｗｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により規定されよう。

パート１ｂ − 用量拡大
ＲＰ２Ｄが得られたら、進行ＨＣＣの１２〜１５名の適格参加者の追加の群が逐次的にリクルートされよう。各参加者は２サイクルで登録され、参加者が研究から身を引くまでＲＰ２ＤでＭＴＬ−ＣＥＢＰＡが投与されよう。

臨床効果が得られる本研究のパート１ｂの参加者は、さらなるサイクルを受けるよう勧められよう。参加者はまた、特別にＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの摂取を継続してもよく、研究者は、参加者が治療を継続可能になる前にケースバイケースでスポンサーと検討しなければならない。

研究エンドポイント
主エンドポイント
パート１ａでは、主エンドポイントは、次のように定義される用量制限毒性（ＤＬＴ：ｄｏｓｅｌｉｍｉｔｉｎｇｔｏｘｉｃｉｔｙ）であろう。有害イベント共通用語基準（ＣＴＣＡＥ：ＣｏｍｍｏｎＴｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙＣｒｉｔｅｒｉａｆｏｒＡｄｖｅｒｓｅＥｖｅｎｔｓ）ｖ４．０３に基づいて３以上の任意の薬剤関連毒性グレード、たとえば、グレード≧３３日間を超える適正治療にもかかわらず悪心、嘔吐、および下痢、参加者のパフォーマンスステータスの減少≧ベースラインと比較して２ポイント、グレード≧３７日間を超える疲労、グレード≧３ヘモグロビン、血小板、または好中球の異常臨床検査値、５日間を超える骨髄抑制、グレード≧３ビリルビン異常臨床検査値（＞３．０×ＵＬＮ）、グレード４ＡＳＴおよび／またはＡＳＴ異常臨床検査値（＞２０．０×ＵＬＮ）。

最初の２８日間（すなわち最初のサイクル）で何らかの潜在的ＤＬＴの評価が行われるであろう。いずれの用量漸増も実施可能になる前に、コホートのすべての患者がＤＬＴ期間をクリアすべきであり、この目的では、可能な治療関連副作用を評価するために、本研究のパート１ａ時に前のコホートの最終参加者に第３の用量が投与された後の７日間以上のインターバルが必須である。

パート１ｂでは、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安全性および耐容性は、毒性基準（ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ４．０３）に従ってグレード分けされたかつ体組織および診断によりカテゴリー化された有害イベントの頻度により評価されされよう。

副エンドポイント
ＰＫパラメータは、最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、最大血漿中濃度に達する時間（Ｔｍａｘ）、血漿中濃度曲線下の面積（ＡＵＣ）、および静脈内投与後のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの半減期（ｔ１／２）により規定されよう。

このプロトコルは、進行ＨＣＣの参加者またはアルブミン、ビリルビン、肝酵素レベル、ケモカイン、ＣＴＣ、腫瘍マーカ、ならびに腫瘍組織における遺伝子およびタンパク質の発現レベルをはじめとするサロゲートバイオマーカのベースラインからの変化の記述的分析を用いて二次肝腫瘍を呈する参加者において、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの臨床効力（ＰＤ）の評価を計画する。健康関連の生活の質は、ＦＡＣＴ−Ｈｅｐスコアのベースラインからの変化の記述的分析を用いて進行ＨＣＣの参加者において評価されよう。

研究の登録および辞退
スクリーニング段階では、参加者がＩＣＦに署名した後、次の基準が評価されよう。すなわち、各参加者は、本研究の選択基準のすべてを満たすべきであり、かつ除外基準をまったく満たすべきない。いかなる事情があろうとも、この規則の例外はありえないため、ウェーバはＧＣＰに不適当かつノンコンプライアントであると見なされ、スポンサーにより承認されないであろう。

参加者は、リクルートの順にユニークな参加者治験ＩＤが順次に割り当てられるであろう（たとえば、００１、００２など）。
選択基準
参加者は、研究への参加に適格であるために以下の選択のすべてを満たすべきである。

用量漸増の選択基準（パート１ａ）
研究の用量漸増パートは、進行ＨＣＣまたは二次肝腫瘍のいずれかのリクルート患者に重点を置くであろう。リクルートは観測された毒性に依存するであろう。それにもかかわらず、プロトコルは、パート１ａで最大３０名の参加者の募集を目指す。

進行ＨＣＣの患者の選択基準：組織学的に確認される進行ＨＣＣ、手術または任意の他の治療に不適格であると見なされる患者、局所療法および／またはソラフェニブ後で進行している患者（ナイーブソラフェニブ患者は適格である）、ＭＲＩまたはＣＴにより測定される標的病変サイズ≧１．０ｃｍを有する少なくとも１つの測定可能な病変、チャイルド・ピューＡまたはクラスＢ７疾患、血小板≧７５×１０^９／Ｌ、血清中アルブミン＞２８ｇ／Ｌかつ＜３５ｇ／Ｌ、ＡＬＴおよびＡＳＴ≦５×ＵＬＮ
二次肝癌の患者の選択基準：従来の標準的療法に不応性の組織学的に確認される進行肝外固形腫瘍および不治の肝腫瘍または標準的療法が存在しないもの、肝臓に位置するＭＲＩまたはＣＴにより測定される標的病変サイズ≧１．０ｃｍを有する少なくとも１つの測定可能な病変、血小板≧１００×１０９／Ｌ、血清中アルブミン＞２５ｇ／Ｌ、ＡＬＴおよびＡＳＴ≦３×ＵＬＮ。

他の選択基準：いずれの治験特異的手順前にも得られる書面によるインフォームドコンセント、年齢≧１６歳の男性または女性、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０および１、利用可能な長期保存腫瘍組織または治療前腫瘍生検を行う能力および意欲、次のものにより実証される許容可能実験室パラメータ：ビリルビン≦５０μｍｏｌ／Ｌ、ＷＢＣ≧２．０×１０^９／Ｌ、好中球絶対数≧１．５×１０^９／Ｌ、ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ、またはプロトロンビン時間（ＰＴ：Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎｔｉｍｅ）＜２０秒間、次のものにより実証される許容可能腎機能：血清中クレアチニン≦１．５×ＵＬＮまたは計算クレアチニンクリアランス≧６０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２（ＣＫＤ−ＥＰＩ式を用いて推定）、出産可能性のある女性の陰性血液妊娠検査、スクリーニング開始前の少なくとも２ヶ月間にわたりホルモン避妊剤を用いて確立される治療を用いる全研究期間にわたる出産可能性のある女性の安全な避妊：出産可能性のある女性の場合（スクリーニング開始前の少なくとも２ヶ月間にわたりホルモン避妊剤を用いない）、受胎調節に有効な方法の基準を満たす全研究期間にわたる二重の避妊法が必要とされる。すなわち、コンドーム、ペッサリー、子宮内避妊具などの少なくとも２つの有効な受胎調節法を使用しなければならない。出産可能性のあるパートナを有する男性の参加者は、バリア型避妊具を使用する必要があると共に、そのパートナは、治験期間中および最後の投与を行った後の３ヶ月間他の避妊法を使用する。男性の参加者も妊婦または授乳中の女性との性交を避けるかまたはコンドームを使用するように推奨されよう。予定訪問、治療計画、臨床検査、および他の研究手順を含むすべてのプロトコル要件を遵守する意欲および能力。

用量拡大（パート１ｂ）の選択基準
このプロトコルは、進行ＨＣＣを有する１２〜１５名の参加者の募集を目指す。
手術または任意の他の治療に適格でないと見なされる局所療法およびソラフェニブ後で進行している患者（ナイーブソラフェニブ患者は適格である）、ＭＲＩまたはＣＴにより測定される標的病変サイズ≧１．０ｃｍを有する少なくとも１つの測定可能な病変、チャイルド・ピューＡまたはＢ７疾患、血小板≧７５×１０^９／Ｌ、血清中アルブミン＞２８ｇ／Ｌかつ＜３５ｇ／Ｌを有する肝機能障害、ＡＬＴおよびＡＳＴ≦正常範囲の上限の５倍、ビリルビン≦５０μｍｏｌ／Ｌ、いずれの治験特異的手順前にも得られる書面によるインフォームドコンセント、年齢≧１６歳の男性または女性、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０および１、利用可能な長期保存腫瘍組織または治療前腫瘍生検を行う能力および意欲、次のものにより実証される許容可能実験室パラメータ：ＷＢＣ≧２．０×１０^９／Ｌ、好中球絶対数≧１．５×１０^９／Ｌ、ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ、またはプロトロンビン時間（ＰＴ）＜２０秒、次のものにより実証され許容可能腎機能：血清中クレアチニン≧１．５×ＵＬＮ、計算クレアチニンクリアランス≧６０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２（ＣＫＤ−ＥＰＩ式）、または出産可能性のある女性の陰性血液妊娠検査、スクリーニング開始前の少なくとも２ヶ月間にわたりホルモン避妊剤を用いて確立される治療を用いる全研究期間にわたる出産可能性のある女性の安全な避妊：出産可能性のある女性の場合（スクリーニング開始前の少なくとも２ヶ月間にわたりホルモン避妊剤を用いない）、受胎調節に有効な方法の基準を満たす全研究期間にわたる二重の避妊法が必要とされる。すなわち、コンドーム、ペッサリー、子宮内避妊具などの少なくとも２つの有効な受胎調節法を使用しなければならない。出産可能性のあるパートナを有する男性の参加者は、バリア型避妊具を使用する必要があると共に、そのパートナは、治験期間中および最後の投与を行った後の３ヶ月間他の避妊法を使用する。男性の参加者も妊婦または授乳中の女性との性交を避けるかまたはコンドームを使用するように推奨されよう。予定訪問、治療計画、臨床検査、および他の研究手順を含むすべてのプロトコル要件を遵守する意欲および能力。

参加者除外基準
以下の除外基準のいずれかが満たされる場合、患者は試験に参加するべきでない。
進行ＨＣＣ患者のための除外基準：チャイルド・ピュークラスＢ８、Ｂ９、またはＣ。

過去２８日間以内にＴＡＣＥ、ソラフェニブ、または化学療法で治療された患者。
他の除外基準：１５日間以内に従来の全身性癌指向治療または過去３０日間以内に研究薬剤、スクリーニング時にグレード＞１治療関連毒性（脱毛症を除く）、臨床的に有意な癌腹水を有する患者、過去３ヶ月間以内で食道静脈瘤から何らかの出血エピソードまたは他の無制御出血、最初のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注射前の過去７日間で血清中アルブミンが投与された患者。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）による既知の感染、中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）転移を有する患者、ニューヨーク心臓協会（ＮｅｗＹｏｒｋＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＹＨＡ）クラスＩよりも大きいとして特徴付けられる心不全の徴候および症状、フリデリシアの補正式を用いて≧４５０ｍｓ（男性）および≧４６０ｍｓ（女性）として定義される延長補正ＱＴ時間（ＱＴｃ）インターバルを呈する患者、または他の臨床的に有意な心臓異常、過去３０日間大手術、敗血症、閉塞性黄疸、または脳症の患者、の証拠特発性細菌性腹膜炎または腎不全または作用剤もしくは賦形剤へのアレルギー反応、妊婦または授乳中の女性、研究者の判断で、プロトコル特異的手順に従う参加者の能力に影響を及ぼしうる任意の他の病態（たとえば、既知または推定のコンプライアンスなど）。

治療割当て手順
パート１ａ − 用量漸増
参加者は２サイクルで登録されよう。研究の用量漸増段階は、図３３に示されるように標準的３＋３設計に従うであろう。３名の適格な参加者の６つのコホートが次の用量：２８、４７、７０、９８、１３０、１６０ｍｇ／ｍ^２で計画される。個別の用量は、デュボイス（ＤｕＢｏｉｓ）およびデュボイス（ＤｕＢｏｉｓ）（１３３）の体表面積（ＢＳＡ：ｂｏｄｙｓｕｒｆａｃｅａｒｅａ）計算を用いて参加者の直近の身長および体重に基づくであろう。

各用量コホートで最初の参加者は、研究開始用量でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療を受ける。ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、６０分間にわたる静脈内注入により３週間にわたり週１回、１日、８日、および１５日に投与され、残りの１週間がこれに続く。これにより１サイクルが規定される。

後続の参加者は、治療関連副作用の評価ができるように最初の参加者の初回投与の７日間以上後にリクルートされよう。
以上に規定されるいずれの潜在的ＤＬＴの評価も最初の２８日間（すなわち最初のサイクル）で行われるであろう。

有害イベントまたは毒性が明らかになるように、前のコホートの最後の参加者の最終投与との間に７日間以上の間隔をあけるべきである。その次のコホートに進む決定は、ＳＲＣによるすべての参加者に対する前のコホートの安全性および臨床データの審査を必要とするであろう。審査に従って、その次のコホートが開始されうる。決定は書面で記録され、記録は治験マスターファイル（ＴＭＦ：ＴｒｉａｌＭａｓｔｅｒＦｉｌｔｅｒ）に保存されよう。

用量コホートの３名の参加者にＤＬＴと認定される毒性がない場合、その次の用量レベルへの用量漸増を行いうる。用量コホートの３名の参加者のうち１名にＤＬＴがある場合、さらなる３名の参加者がこの用量に登録されよう。これらの追加の３名の参加者にさらなるＤＬＴがない場合、その次の用量レベルへの漸増を行いうる。しかしながら、これらの６名の参加者（３＋３）のうち２名以上がＤＬＴを呈する場合、さらなる用量漸増工程は行わず、この用量レベルが最大耐容用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍｔｏｌｅｒａｔｅｄｄｏｓａ）と見なされよう。加えて、単一のコホートで２名の参加者がＤＬＴを呈する場合、さらなる用量漸増工程は行わず、この用量レベルがＭＴＤと見なされよう。すべての用量漸増決定はＳＲＣの判断に基づくであろう。

３名のＨＣＣのみの参加者の追加のコホートは、パート１ａの終了後かつパート１ｂの開始前に追加しうると共に、パート１ａと同一の投与レジメンを用いて中間用量のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与しうる。このコホートは、臨床データの審査後かつ本研究のパート１ａへのＨＣＣ参加者のリクルート後にＰＩおよびスポンサーの安全委員会により適切であると見なされた場合にのみ考慮されよう。

ＲＰ２Ｄは、研究の用量拡大パートの参加者集団に有利なリスク／利益報酬を最大化する最も適切な用量としてＳＲＣにより規定されよう。図３３は用量漸増のフローチャートである。

パート１ｂ − 用量拡大
本研究の漸増パートの終了後、進行ＨＣＣを呈する１２〜１５名の適格参加者は、本研究の用量拡大パートに２サイクルで順次に登録され、ＲＰ２ＤでＭＴＬ−ＣＥＢＰＡが投与されよう。

辞退の理由
参加者は次の理由で研究から継続を中断しうる。
患者による決定：参加者は、いつでも自由に不利益を伴うことなく研究への参加を辞退できる。グレード≧３記載の予防手順で抑制されない研究投薬への注入関連アレルギー反応）。何らかの臨床有害イベント（ＡＥ：ａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔ）、実験室異常、併発病、または他の医学的病態もしくは状況が起こるかまたは悪化して、本研究への参加の継続が参加者の最大利益にならない。疾患進行が確認される。ただし、研究者の意見で参加者が臨床効果を得られる場合を除く。研究者の判断でこのプロトコルへの重篤なノンコンプライアンス。参加者が妊婦になる。参加者が死亡する。

試験特異的中断基準：血清中アルブミン≧４５ｍｇ／Ｌの増加に伴う利益の存在。参加者は、中断が参加者の得策である場合、または参加者の反応が良好であり、手術、ＲＦＡ、ＴＡＣＥ、ソラフェニブなど、研究の開始時には不適切であった他の従来療法を参加者が受けられる場合（すなわち病期の移行）、研究投薬の継続を中断するように研究者により推奨されうる。

研究の終了
患者は、いつでも自由にさらなる治療に対して不利益を伴うことなく（同意の辞退）研究（ＩＰおよび評価）を辞退できる。かかる参加者は、理由および何らかのＡＥの存在を常に聞かれるであろう。可能であれば、研究者により観察および評価がされるであろう。ＡＥは追跡されるであろう。

予定された研究の終了時および参加者が辞退に同意した場合、公的利用可能源または参加者との連絡に基づいて、生存者の医療ケアを検討しうる。こうしたデータはｅＣＲＦで集められよう。

追跡不能な参加者をなくすために、最近親者との連絡を含めて連絡の詳細を最初に収集し、現場スタッフまたは代表者により定期的に更新すべきである。
投与スキーム
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与は３週間にわたり週１回であり、残りの１週間がそれに続であろう［３＋１週間＝４週間＝１サイクル］。進行中の前臨床実験の結果または研究から生じるデータに依存して他のスケジュールおよび投与量を検討しうる。

３名の適格参加者の６つのコホートが次の用量、すなわち、２８、４７、７０、９８、１３０、１６０ｍｇ／ｍ^２で計画される。
さらなる認可された治療選択肢が存在しない一次または二次肝腫瘍の患者において計画されたＦＩＨ第１相試験で治療の臨床利益が得られる患者では、延長治療が許容される。すなわち、臨床効果が持続する限り、治療を継続しうる。

ヒト開始用量の計算に関する考察
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは２つの肝疾患モデルで有効であった。ＣＣＬ４モデルでは、０．３ｍｇ／ｋｇ程度の低い２週間に１回の用量は、疾患症状の一部の低減または逆転を示した。しかしながら、血清中アルブミンおよび肝ヒドロキシプロリンを含めて疾患に関連すすると考えられるいくつかのバイオマーカに対して最大の影響を及ぼすには、３ｍｇ／ｋｇの最高用量が必要とされた。したがって、このモデルの最大有効用量は、２週間のｂｉｗレジメンでおそらく３ｍｇ／ｋｇ以上であろう。ＤＥＮモデルでは単回用量レベル（４ｍｇ／ｋｇで３回投与）を評価したに過ぎない。したがって、より低用量が活性を有するか、より高用量が腫瘍および他の疾患メトリックに対して観測される影響をさらに向上させるかは明らかでない。したがって、１週間の治療の有効用量は４ｍｇ／ｋｇと推定される。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを用いたラットＰＫデータに基づいて、ＣＣＬ４およびＤＥＮのモデルのｂｉｗおよびｔｉｗのスケジュールは、循環状態で薬剤蓄積をもたらさないはずであるため、単回用量に基づいてヒト用量推定が可能である。まとめると、ＤＥＮモデルでの非常に短い治療期間を考慮すれば、意味のある抗腫瘍効果には３〜４ｍｇ／ｋｇの反復用量で十分でありうると共に肝機能の向上には０．３〜３ｍｇ／ｋｇの用量で十分でありうる。

非臨床毒性プログラムは、毒素動態プロファイリングおよび局所許容差評価を含めて、ラットおよびカニクイザルでの反復投与毒性検査を含んでいた。
４週間にわたり連続３日間で静脈内経路（１時間注入）により７．５ｍｇ／ｋｇでカニクイザルに毎日投与されるＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（合計で１２回投与）は、臨床的に十分に耐容性であり、体重、食糧消費、臨床検査室パラメータの一過性の有害でない変化、さらには血小板数の減少ならびに代替および共有の補体経路の活性化を引き起こしたに過ぎない。１ヶ月間の研究継続時間にわたり週３回７．５ｍｇ／ｋｇ投与は、カニクイザルでＮＯＡＥＬとして規定された。４週間にわたり７．５ｍｇ／ｋｇで静脈内経路（１時間注入）により連続３日間で毎日ラットにＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与したところ（合計で１２回投与）、より少ない体重増加および食物摂取、少数の動物で臨床徴候、血液学、凝固、および血清臨床化学パラメータの種々の変化、さらには注入位置における局所反応を誘発した。それらの大きさおよび可逆性は小さいため、これらの臨床病理学変化は有害であると見なされなかった。組織学的には、主要知見はいくつかの器官または組織でのマクロファージ空胞形成であり、これは微粒子状試験品のクリアランスを反映したものでありうるために有害であると見なされない。１ヶ月間の研究継続期間にわたり週３回７．５ｍｇ／ｋｇ投与は、ラットでＨＮＳＴＤとして規定された。

治療期間の終了時、サルまたはラットにＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ関連眼科知見も心血管知見もなかった。
ＣＥＢＰＡ−５１をトランスフェクトした一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でｉｎ
ｖｉｔｒｏ免疫原性アッセイを行った。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの評価では誘発を示さなかったため、トール様レセプター（ＴＬＲ）経路誘発による免疫刺激活性はなかった。

以上のように、１ヶ月間の研究持続時間にわたり週３回投与された７．５ｍｇ／ｋｇは、ラットではＨＮＳＴＤとしておよびサルではＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのＮＯＡＥＬとして規定された。動物からヒトへの用量推定は、従来、体表面積（ＢＳＡ）関連スケーリングまたは類似の数学的パラダイムに基づいていたが、これらの慣例は低分子抗癌剤で行われた研究に由来したものであり、リポソームＡまたはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡなどの他の脂質粒子送達系中のＲＮからなる生成物を用いた用量推定に適合する見込みは非常に少ない。ＢＳＡベースのクロス種スケーリングのそもそものきっかけは、体重関連ＭＴＤからの直接推定が細胞傷害性抗癌剤に対するヒト感受率を低めに予測し、体表面積当たりの用量で表した場合に種間のＭＴＤのよりも良好な相関が得られたという報告に由来する。より大きい種よりも齧歯動物などのより小さい種のほうが低分子抗癌剤に対するに感受率が低い主な理由は、より小さい種がより大きい種よりも速く肝シトクロムＰ４５０系を介してかかる分子を代謝すること、および／または血中コンパートメントからのより速いクリアランスを呈することにある。これは全体として、ヒトを含めてより大きい種よりも急速または強力な解毒に寄与する。

非臨床開発を介して発展した脂質製剤化オリゴヌクレオチドの多くでは、齧歯動物でのＭＴＤは、サルまたは他の非齧歯動物種に類似したまたはそれよりも少ない傾向があり、これがＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの場合に当てはまる。このパターンは、齧歯動物ではサルのようなより大きい種よりも高いＭＴＤを予測するＢＳＡに基づくスケーリングの基本原則に一致しない。核酸ペイロードも賦形剤も肝シトクロムＰ４５０系と有意に相互作用することが示されておらず（または予想されておらず）、製剤は微粒子形態で血流を移動して低分子薬剤とは異なるユニークな薬動学的挙動およびクリアランス経路を呈するため、製剤化オリゴヌクレオチド生成物が低分子抗癌剤とは異なる挙動することは驚くべきことではない。

活性ｓａＲＮＡ成分（ＣＥＢＰＡ−５１）の血漿中ＡＵＣは、類似の用量レベルではサルよりもラットのほうが実質的に小さいが、血液成分との相互作用から生じる毒性が存在しないため、かつ観測される一次作用（すなわち、種々の組織におけるマクロファージの空胞形成）が、血液、濃度ではなく組織と相関すると予想されるため、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡにより生じる毒性は、循環状態の薬剤の量に関連しない。実際に、ラットでの循環系からのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（ＣＥＢＰＡ−５１）のより速いクリアランスは、マクロファージによるより急速な取込みを反映し、この結果、そうした細胞のより大きい活性化をもたらす可能性があり、かかる活性化からより顕在化した下流の後遺症をもたらす可能性があり、サルよりもラットのほうが非常に高い毒性度であることが説明されよう。したがって、同一のｍｇ／ｋｇ用量レベルではサルよりもラットのほうがより少ない血漿暴露となり、従来のＢＳＡに基づくスケーリングと一致するにように思われるが、この差はラットのほうが毒性度が低いことと相関しないのは間違いなく、ラットでの血中コンパートメントからの粒子のより速いクリアランスは、実際にはより大きい毒性の根底をなす可能性がある。換言すれば、このタイプの薬剤生成物では、種間の暴露を比較した場合、より小さいＡＵＣ値により反映されるより速いクリアランスは、細胞傷害性抗癌剤で見られたように、より低い感受率を示唆すると解釈すべきでない。

したがって、ＢＳＡに基づくスケーリングは、カニクイザルＮＯＡＥＬおよびラットＨＮＳＴＤからのヒト均等用量（ＨＥＤ：ｈｕｍａｎ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｄｏｓｅ）の計算に適用可能ではない。また、サルはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡに対するヒト感受率のより良好な予測因子でありうる考えられるが、これは現時点では明らかにできない。したがって、薬理学的活性および臨床効力が害されるほど控えめに低くすることなく、十分な安全域を達成する初期臨床治験に適切な開始用量レベルを同定する試みを期して、ラットで７．５ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍ（４週間にわたる週３回の投与）のＨＮＳＴＤおよびサルでのＮＯＡＥＬすなわち０．７５ｍｇ／ｋｇの１／１０の用量レベルが適切な選択であると考える。この提案された開始用量レベルは、４週間のラットおよびサルの研究のＨＮＳＴＤでは用量が初期治験で意図した週１回の投与とは対照的に毎週連続３日間投与されたことを考えると、さらに控えめである。したがって、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、６０分間静脈内（ｉ．ｖ．）注入として毎週１回投与される０．７５ｍｇ／ｋｇ（２８ｍｇ／ｍ２）の意図された初回用量でヒトにおける使用を妨げる異常なまたは驚くべき毒性徴候を伴わずに安全かつ良好な耐容性であると予想されると結論付けられる。薬理学に基づいて、０．３〜３．０ｍｇ／ｋｇで肝機能利益および約４ｍｇ／ｋｇで腫瘍利益が見られると予想しうる。したがって、０．７５ｍｇ／ｋｇの用量で開始すると初期患者は、肝臓改善に奏効する有望な機会が与えられるが、直接的抗腫瘍活性を達成するには用量漸増が必要でありうる。

治験薬の投与量、調製、および投与
用量漸増時および用量拡大時、投与量はスケジュールに従うであろう。用量は、デュボイス（ＤｕＢｏｉｓ）およびデュボイス（ＤｕＢｏｉｓ）（１３３）の体表面積（ＢＳＡ）計算を用いて参加者の直近の身長および体重に基づくであろう。

ＢＳＡ（ｍ２）＝０．００７１８４×身長（ｃｍ）^{０．７２５}×重量（ｋｇ）^{０．４２５}
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、静脈内使用のために０．９％正常生理食塩水中に薬剤生成物サスペンジョンを希釈する前に室温で解凍される。作製される注入バッグの体積は、濃度にかかわらず２５０ｍＬにすべきであり、フィルター（ＩＭＰの取扱いの説明に関してさらに詳しくは薬学マニュアルを参照されたい）のない注入ポンプを用いて静脈（末梢または中心）内に６０分間にわたり一定速度で投与すべきである。

調製物は６ｈの最大使用寿命で室温（２５℃）保存すべきである。
ＩＭＰと希釈剤および／または注入デバイスとの間の適合性の問題は予想されない。
参加者に対する治験薬投与の変更
進行中の前臨床実験の結果または研究から生じるデータに依存して他のスケジュールおよび投与量を検討しうる。

グレード≧３注入反応（たとえば、血圧低下、顔面潮紅、胸部絞扼感、背痛もしくは腹痛、心拍数上昇、発汗）のイベントでは、注入は、症状が鎮静化するまでただちに停止すべきである。次いで、注入を再開可能である。症状が再び現れた場合、研究者は注入を停止すべきである。この時点で投与された注入の体積は、ＣＲＦでキャプチャされよう。研究者は、実施前の何らかの用量変更計画について医療モニターと検討すべきである。これは、続く２日間にわたる残りの週用量の均等な分割をもたらしうる。次の投与は、記載のように３日間投与スケジュールに従う。

投与の変更にもかかわらず、症状が持続する場合、治療の継続を中断して、参加者に研究を辞退するように推奨すべきである。
併用される医薬／治療
試験治療開始前の４週間で何らかの治療および試験期間中に与えられすべての併用治療に関する情報は、治療の理由と共にｅＣＲＦに記録されよう。

禁止される投薬および手順
治験時、次の投薬は参加者の参加期間中は禁止される。他の治験薬、抗新生物剤。
予防的な投薬および手順
すべての参加者は、注入反応の可能性を低減するためにＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与前に前投薬されよう（禁忌でない限り）。前投薬は、次のように注入開始の３０〜６０前に行うべきである。すなわち、ステロイド単回用量（すなわち８ｍｇ経口デキサメタゾンまたは静脈内１０ｍｇ）、経口Ｈ２ブロッカー単回用量（すなわちラニチジン１５０ｍｇまたはファモチジン２０ｍｇまたは均等な他のＨ２ブロッカー用量）、経口Ｈ１ブロッカー単回用量、１０ｍｇセチリジン（参加者がセチリジンに耐えなければ、ヒドロキシジン２５ｍｇまたはフェキソフェナジンで置き換えてもよい）。

治験医薬品の過量
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは治験薬であり、このプロトコルに挙げられた以外のすべての病態が禁忌である。

過量になった場合、既知の解毒剤はない。過量に起因する症状および徴候は、症状的に治療すべきである。不注意で意図したよりも高用量を摂取した参加者はすべて、回復して期待通り追跡が行われるまで、綿密にモニターして適切な支持的ケアを受けるべきである。

かかる過量は次のように記録すべきである。すなわち、関連ＡＥ／ＳＡＥを伴う過量は、ｅＣＲＦの関連ＡＥ／ＳＡＥモジュールおよび過量ｅＣＲＦモジュールにＡＥ診断／症状として記録される。関連症状のない過量は、過量ｅＣＲＦモジュールにのみ報告される。

研究の過程で過量が起こった場合、現場作業者は、１日以内に、すなわちただちに、ただし、気付いた日の次の営業日の終りまでにＰＩに通知しなければならない。過量はＰＩによりスポンサーに報告されるであろう。

ＳＡＥを伴う過量では、標準報告期限が適用される。他の過量では、報告は３０日以内に行うべきである。
妊娠および母親の暴露
ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは治験薬であるため、妊婦には禁忌であり、したがって、本研究への参加から除外される。出産可能性のある女性ではすべて、バリア型避妊具を使用すべきであり、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡによる治療の終了後、少なくとも３ヵ月間継続すべきである。しかしながら、参加者が研究期間中に妊娠した場合、指示通りバリア型避妊具を使用したにもかかわらず、研究の即時中断が要求される。

試験医薬が精子または精液に影響を及ぼすか知られていないため、男性は治療時および最終処理後少なくとも３ヶ月間にわたり信頼性があるバリア型の避妊具を使用するように推奨される。

研究スケジュール
研究スケジュールは、研究のパート１ａおよびパート１ｂに適用される。各治療サイクルは、１、８、および１５日の治療の３週間と、それに続く残りの１週間とをからなる。

スクリーニング受診（−２１日〜−１日）：次のデータが登録時に集められ、ＣＲＦの適切な箇所に記録されよう。ＩＣＦに署名した日、人口統計データ、完全病歴、理学的検査、生命徴候の記録、行動スコア、体重（ｋｇ）、身長（ｃｍ）、および胴回り寸法（ｃｍ）。選択基準および除外基準に対する評価。ベースライン症状および因果関係の記録。従来医薬および併用医薬。出産可能性のある女性の血液妊娠検査。血液学評価のための６時間空腹時血液サンプル採取、凝血プロファイル、臨床生化学（ＬＦＴ、腎臓プロファイルを含む）、脂質プロファイル、適切な腫瘍マーカ、サイトカインプロファイル、および補体活性化因子ＢｂおよびＣ３ａ。１２−誘導心電図。胸部Ｘ線。ＲＥＣＩＳＴ報告を有する肝臓および腹部のＭＲＩまたはＣＴスキャン。（注釈：前のスキャンが試験治療開始の１ヶ月前以内で利用可能な場合、スキャンを繰り返すべきでない）。フィブロスキャンはＨＣＣ参加者のみで行われるであろう。ＦＤＧ−ＰＥＴスキャン（パート１ｂのみ）。腫瘍組織の放射線ガイド下肝生検は、記録資料が利用不可能な参加者で行われるであろう。腫瘍組織はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ：ｆｏｒｍａｌｉｎｆｉｘｅｄ
ｐａｒａｆｆｉｎｅｍｂｅｄｄｅｄ）サンプルであろう。

血清中アルブミンレベルが選択範囲外であるために最初のスクリーニング受診で不合格の参加者は、１４日後に再スクリーニングが可能である。３回目のスクリーニングは許容できない。

１、８、および１５日の訪問（＋／−２日）：特に明記されていない限り、手順および評価は投与前に行うべきである。標準的理学的検査、体重、および胴回り測定。前の訪問以来の新しい症状および新しい投薬、行動スコア、１２誘導心電図の記録。投与前１日および投与後１５日、８週、および研究訪問の終了時、ＦＡＣＴ−Ｈｅｐ生活の質アンケート管理（パート１ｂの参加者のみ）。静脈（末梢または中心）内にカニューレを挿入する。血液学、凝血プロファイル、および臨床生化学（ＬＦＴおよび腎機能試験を含む）、ならびに補体活性化因子ＢｂおよびＣ３ａの６時間空腹時血液サンプル採取評価。８および１５日のみ：適切な腫瘍マーカおよびサイトカインプロファイルのための血液サンプル採取。所要により、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注入の３０分前にカニューレを介して前投薬を行う。投与スケジュールに従って６０分間にわたりカニューレを介してＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを静脈内投与する。投与前、投与後の１５分、３０分間、１時間、および２時間の時点で生命徴候（体重および胴回り測定以外）を記録。次の時点で注入前後のＰＫサンプル（１および８日のパート１ａ参加者のみ）：投与前、注入直後、注入の終了から０．２５時間、１時間、３時間、および６時間。投与の１５日後のＦＤＧ−ＰＥＴスキャン（パート１ｂの参加者のみ）（注釈：ＰＫを除くすべての治療前血液サンプルは、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与の前日に分析した）。

２、９、および１６日の訪問：新しい症状および投薬、生命徴候、および行動スコアの記録。血液学、凝血プロファイル、および臨床生化学（ＬＦＴおよび腎機能試験を含む）、ならびに補体活性化因子ＢｂおよびＣ３ａの６時間空腹時血液サンプル採取評価。注入終了の２４時間後のＰＫ（２および９日のパート１ａ参加者のみ）。

３および１０日の訪問：パート１ａの参加者のみの４８時間ＰＫサンプリング。
４および１１日の訪問：パート１ａの参加者のみの７２時間ＰＫサンプリング。
２２日の訪問（＋／−２日間）：標準的理学的検査。新しい症状および投薬、生命徴候、および行動スコアの記録。出産可能性のある女性の血液妊娠検査。血液学、凝血プロファイル、臨床生化学（ＬＦＴ、腎臓プロファイルを含む）、脂質プロファイル、適切な腫瘍マーカ、サイトカインプロファイル、ならびに補体活性化因子ＢｂおよびＣ３ａの評価の６時間空腹時血液サンプル採取。ＦＡＣＴ−Ｈｅｐ生活の質アンケート管理（パート１ｂのみ）。胸部Ｘ線。

サイクル２の８週−２２日の訪問（＋／−２日）：以上に列挙した２２日の研究および手順に加えて、次のイメージング手順を行うべきである。ＭＲＩ／ＣＴスキャンを行い、その後、８週間ごとに行う。パート１ｂの参加者のみでＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを８週で行い、その後は繰り返さないであろう。

研究の終了時の訪問（２９日または１４日間、最終投与の＋／−７日後）：標準的理学的検査、体重、および胴回り測定。前の訪問以来の新しい症状および新しい投薬、生命徴候、および行動スコアの記録。ＦＡＣＴ−Ｈｅｐ生活の質アンケート管理（パート１ｂのみ）。出産可能性のある女性の血液妊娠検査。血液学、凝血プロファイル、および臨床生化学（ＬＦＴおよび腎機能試験を含む）、ならびに補体活性化因子ＢｂおよびＣ３ａの６時間空腹時血液サンプル採取評価。早期辞退参加者のみ（すなわち、２２日に行われなかった場合）、空腹時脂質プロファイル、適切な腫瘍マーカ、およびサイトカインプロファイルのための血液サンプル採取。フィブロスキャン（ＨＣＣのみを有する参加者）。腫瘍生検、治療後生検はきわめて望ましく、研究者の判断で行われるであろう。

早期終了訪問：参加者が研究を辞退する場合、以上に記載の評価を行うべきである。
予定外訪問：予定外訪問または電話連絡は有害イベント追跡のために行いうる。
妊娠訪問：試験期間中に妊娠する参加者のイベントでは、参加者は試験治療をただちに停止するように推奨されるべきである。辞退の理由はｅＣＲＦに記録されよう。また、研究訪問の終了に関してすべての評価を終えて以上に記載の試験薬剤の安全性を評価するために、研究者により参加者の観察および評価が行われるであろう。

レスポンダーのための治療計画：パート１ａおよびパート１ｂの参加者は、最初に２サイクルで登録されある。最初のサイクルの終了時、参加者が臨床効果（たとえば、肝機能の向上）を呈し、研究の継続に合意すれば、参加者は、同一の治療レジメンベース（ＰＫサンプル採取を除く）でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの追加のサイクルを受けてもよい。第２のサイクルの終了時、腫瘍反応が評価されよう。腫瘍進行を示さない参加者は、さらに２回の追加治療サイクルを受けるよう勧められよう。

この時点では、参加者は、離脱が参加者の得策である場合、または参加者の反応が良好であり、手術、ＲＦＡ、ＴＡＣＥ、ソラフェニブなど、研究の開始時には不適切であった他の従来療法を参加者が受けられる場合（すなわち病期の移行）、研究者により研究から離脱するよう推奨されうる。

参加者は、治療に対する反応が継続する限り、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡのさらなるサイクルを受ける機会が与えられよう。
研究の手順／評価 − 患者報告アウトカム
癌療法の機能評価−肝胆道（ＦＡＣＴ−Ｈｅｐ）バージョン４アンケートは、１日および１５日および８週にＲＰ２Ｄレベル（パート１ｂ）でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを投与した後の参加者の健康関連の生活の質の変化を評価するために使用されよう。

ＦＡＣＴ−Ｈｅｐアンケート
癌療法の機能評価−肝胆道（ＦＡＣＴ−Ｈｅｐ）は、検証された健康関連の生活の質アンケートであり、ＦＡＣＴ−Ｇｅｎｅｒａｌと１８アイテムモジュールとの組合せであり、肝胆道癌に関連付けられる治療の症状および副作用を測定するように特別に設計されている。ＦＡＣＴ−Ｇは、物理的、社会的／家族的、情動的、および機能的な幸福を含めて生活の質の４つの次元を測定する多次元２７アイテムインストルメントである。ＦＡＣＴ−Ｈｅｐはまた、肝胆道癌の症状および治療の副作用（追加の関心事）を評価する１８アイテムモジュールを含む。

評価の方法
ＦＡＣＴＨｅｐは、予定訪問のアンケートのペーパーバージョンを用いて自己管理されよう。アンケートは、投与前１日ならびに投与後１５日および２２日（８週）に評価されよう。

ＰＲＯアンケートの管理
ＦＡＣＩＴスケールは、参加者の自己管理用として設計されており、面接形式で管理することも可能である。自己管理では、参加者はページのトップの簡単な説明を読むように指示されるはずである。参加者の適正な理解が確認された後、いずれもスキップすることなく順にすべてのアイテムを終了するように奨励されるはずである。患者は、もっとも当てはまる反応を丸で囲むように奨励されるはずである。たとえば、参加者が現在のところ何ら治療を受けていなければ、参加者は、「治療の副作用に悩まされている」という質問に「まったくない」を丸で囲むべきである。面接管理は、バイアスのかからない参加者の反応を引き出すためのインタビューアの適切な所与の好適なトレーニングと見なされる。

スコアリング
ＦＡＣＴ−Ｈｅｐは、次の５つの次元、すなわち、「物理的幸福」、「社会的／家族的幸福」、「情動的幸福」、「機能的幸福」、および「追加の関心事」を含む。各次元は、次の５つのレベル、すなわち、「まったくない」、「ごくわずかのみ」、「いくらか」、「かなり」、および「きわめて」を有する。参加者は、過去７日間でＦＡＣＴ−Ｈｅｐ上の記述に当てはまる反応を示すように１行ごとに数値を丸で囲むかまたはマークすることによりＦＡＣＴ−Ｈｅｐに現在の健康状態を等級付けする。これはＦＡＣＴ−Ｈｅｐスコアである。

実験室安全性評価
サンプル捕集時間はイベントの研究スケジュールに含まれる。方法および参照範囲の詳細はＴＭＦに保管されよう。ベースラインから有意に変化したかつ臨床問題があると見なされる臨床検査値は、有害イベントとして記録し、必要に応じて追跡しなければならない。

１サイクルで各参加者から収集される推定血液体積は以下に示される。

［ａ］総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血漿中アンモニア、腫瘍マーカ総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃおよびトリグリセリドは、ＰＤバイオマーカの精査のために評価される。［ｂ］出産可能な女性に対して。

各参加者から各訪問で５０ｍＬ未満、４週間のサイクル当たり合計で３００ｍＬ未満が採取されよう。
局所臨床試験
実験室安全性評価用のサンプルはすべて、現地の慣行に従って各研究現場で収集され、ルーチン試験用の標準的方法を用いて現地の実験室で分析されよう。血液サンプルはすべて、スクリーニング時のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注入前、ならびに１、２、８、９、１５、１６、２２日、およびＥＯＳ（脂質プロファイルを除く）に捕集すべきである。

臨床生化学パラメータおよび血液学パラメータが測定されよう。肝機能、アンモニアおよびグルコース、さらには脂質プロファイルを含む臨床生化学サンプルは、空腹状態（血液サンプルの６時間前）で収集すべきである。

［ａ］総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血漿中アンモニアは、スクリーニングでの適格性の精査のためおよびＰＤバイオマーカの審査のために評価される。［ｂ］総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃおよびトリグリセリドは、スクリーニングにおいて、各サイクルの最後に（２２日目）およびＥＯＳ（早期辞退参加者の場合）で、探索ＰＤバイオマーカの審査のために評価される。

妊娠試験（血液）
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、スクリーニング時、２２日、およびその後、８週間ごとに（参加者がさらなる治療サイクルを受ける場合）、出産可能性のある女性で測されよう。

腫瘍マーカ
以下のリスト中の最も好適なマーカは、癌病歴に基づいて選択され、スクリーニング時ならびに８、１５、２２、およびＥＯＳ（早期辞退参加者の場合）に行われよう。

イメージング
胸部Ｘ線：胸部Ｘ線はスクリーニング時および４週に照射されよう。さらなるＸ線は１２週に照射され、その後、参加者がさらなるＭＴＬ−ＣＥＢＰＡサイクルを受けるのであれば、標準的な注意を払って照射されよう。

ＭＲＩまたはＣＴスキャン：胸部および腹部のＭＲＩまたはＣＴスキャンは、スクリーニング時および８週（試験薬剤の１回目の投与の１ヶ月前以内）に行われよう。ＭＲＩは好ましい方法であるが、ＣＴスキャンが許容される。ＭＲＩまたはＣＴスキャンを使用する場合、各参加者に対する評価方法に一貫性を有することが重要である。

次いで、ＭＲＩ／ＣＴスキャンは８週間ごとに行われよう。
フィブロスキャン：フィブロスキャンは、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡによる治療前後に肝臓の線維性を評価するためにスクリーニング時および研究終了時にＨＣＣの参加者でのみ行われよう。

ＦＤＧ−ＰＥＴスキャン：肝臓および腫瘍の代謝は、パート１ｂに登録された参加者のみでＦＤＧ−ＰＥＴスキャンを用いて評価されよう。ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンは、スクリーニング時、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ注入後の１５日、および再開ＣＴ時（すなわち８週）に行われよう。

患者はＰＥＴ研究開始（すなわちＦＤＧ注射時間を基準にして）の少なくとも６ｈ前にいかなる食品も糖も消費することが許されない。実際には、午前にＰＥＴ研究が行われる予定の患者は真夜中を過ぎたら摂食すべきでなく、好ましくはＰＥＴ研究前の夜に軽い食事（アルコールなし）をとる。午後にＰＥＴ研究が行われる予定の患者は、８．００ａ．ｍよりも前に軽い朝食をとってもよい（すなわち、糖も糖含有サンドイッチ食材も含まないサンドイッチ２つまで）。投薬は指定通り行いうる。

肝生検
利用可能である場合、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍ブロックの形態の長期保存組織サンプルが各参加者で収集されよう。腫瘍ブロックが得られないかまたは存在しない場合、参加者はインフォームドコンセントプロセスの一部としてスクリーニング時の生検に合意していなければならない。

長期保存腫瘍組織は研究チームにより要求されるべきであり、記載のように送付されるべきである。長期保存腫瘍ブロックは、研究終了時または要求時、必要に応じてより早い時期に供給元に戻されよう。

治療後肝腫瘍生検はＥＯＳ訪問時がきわめて望ましい。
何ら凝固異常が起こらないように、必要に応じて新鮮凍結血漿および血小板を投与すべきである。

薬動学（ＰＫ）
最初のサイクルの１、２、３、および４、８、９、１０、１１日、および次の時間点、すなわち、試験薬剤投与前、注入終了直後、次いで注入終了から０．２５時間、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、および７２時間の時間点で、本研究の用量漸増パートの６つのそれぞれのコホートの各参加者から５ｍＬの全血のＰＫ血液サンプルがＥＤＴＡチューブ中に収集されよう。

臨床担当者は、予定の時間点でＰＫ分析用の血液サンプルを採取するように勧められる。しかしながら、予定のサンプル時間からの偏りはプロトコル偏りと見なされない。採血の厳密な日時は、明瞭な形式を用いて記録しなければならない。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの血漿中濃度は、ハイブリダイゼーションに基づくＨＰＬＣアッセイを用いて規定の時間点でセンターで分析されよう。
検体調製、取扱い、および貯蔵に関する説明は以下に記載される。

薬力学（ＰＤ）
肝機能試験、ＡＦＰ腫瘍マーカ（ＨＣＣ参加者用）、サイトカインプロファイル、およびＣＥＢＰＡ遺伝子発現は、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの薬理学的効果のサロゲートバイオマーカとして同定されている。

肝機能試験：アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、血清中アルブミン、血漿中アンモニア、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、および総ビリルビンは、１日（投与前）、２日、８日（投与前）、１５日（投与前）、２２日、およびＥＯＳ訪問時に測定されよう。これらのサンプルは現地の実験室で分析されよう。

ＡＦＰ腫瘍マーカ：ＡＦＰは、１日（投与前）、８日（投与前）、１５日（投与前）、２２日、およびＥＯＳ訪問時（早期辞退参加者の場合）に試験されるであろう。これらのサンプルは現地の実験室で分析されよう。

脂質プロファイル：総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、およびトリグリセリドは、各サイクルの１、８、１５、２２日、およびＥＯＳ時（早期辞退参加者の場合）に探索ＰＤバイオマーカの審査を可能にするように評価されよう。

サイトカインプロファイル：ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−４、ＩＬ１７ａ、ＩＬ−１０は、スクリーニング時、８日（投与前）、１５日（投与前）、２２日訪問時、およびＥＯＳ訪問時（早期辞退参加者の場合）に試験されよう。サンプルは中央実験室で分析されよう。

ＣＥＢＰＡ遺伝子発現は、長期保存腫瘍組織ならびに／またはスクリーニング訪問時およびＥＯＳ訪問時に新しい生検組織から得られるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍生検サンプルで免疫化学染色アッセイを用いてＣＥＢＰαおよびｐ２１タンパク質発現により研究されよう。

検体調製、取扱い、および輸送
検体調製、取扱い、および貯蔵のための説明書
ＰＫサンプルおよびサイトカインプロファイルサンプルを除くすべてのサンプルは、現地の慣行に従って現場で収集され、ルーチン試験の標準的方法を用いて現地の実験室で分析されよう。

詳細な説明を与える研究者のための実験室マニュアルは、研究開始前にそれぞれの研究現場に提供されよう。研究者および委任現場作業者は、実験室マニュアルに規定された手順に従うべきである。

ＰＫサンプルでは、５ｍＬの全血がＥＤＴＡ処理チューブ中に収集される。ＥＤＴＡチューブはサンプリング直後に処理され、冷却遠心機（４℃）を用いて遠心分離されて血漿を生成する。得られたら、氷上のまま血漿は１００μＬの少なくとも２つのアリコートに分割されよう。アリコートは、以上に挙げたのと同一のプロトコルに従って遠心分離され、−８０℃で貯蔵する前に液体窒素またはドライアイスを用いてスナップ凍結される。血液採取から血漿貯蔵までの推奨時間は３０ｍｉｎである。

サイトカインプロファイルでは、３ｍＬがＥＤＴＡ処理チューブ中に収集されよう。チューブは血漿を生成するために遠心分離されよう。サンプルは、現場で−８０℃で凍結貯蔵して中央実験室へ送付されよう（以下の節を参照されたい）。

長期保存腫瘍ブロックは、利用可能な場合、関連病理診断部から要求されるべきである。新たに得られた腫瘍組織サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）すべきである。ブロック（好ましくは）またはスライドは、ＩＨＣ染色試験を行うために短縮した中央実験室へ送付されよう（以下の節を参照されたい）。

有害イベント（ＡＥ）
有害イベント（ＡＥ）は、試験治療との因果関係にかかわらず医薬品が投与された参加者または臨床試験参加者における任意の不利な医学的出現（既存の医学的病態の悪化を含む）と定義される。したがって、ＡＥは、治験医薬品（ＩＭＰ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｒｏｄｕｃｔ）の使用に伴う一時的に研究の異常結果（たとえば、検査所見、心電図）、症状（たとえば、悪心、胸痛）、徴候（たとえば、頻脈、肝臓肥大）または疾患を含めて任意の不利な意図されない徴候でありうる。

ＡＥは、インフォームドコンセントから研究訪問の終了まで研究全体を通じて収集されよう。「重篤有害イベント」の基準を満たさない局所および全身反応を含むＡＥすべては、適切なｅＣＲＦに取り込むべきである。

参加者により自然に報告された、または試験員からの自由回答式質問に答えて報告された、または観測によって明らかにされたＡＥはすべて、ＣＲＦに収集され記録されよう。ＡＥを収集する場合、徴候および症状のリストを記録するよりも診断を記録するほうが有利である（可能であれば）。しかしながら、診断が既知であり、かつ一般にいその診断の一部でない他の徴候または症状がある場合、診断および各徴候または症状が個別に記録される。

インフォームドコンセントに署名された時点で存在している医学的病態はいずれも病歴と見なすべきであり、ＡＥとして報告すべきでない。しかしながら、ＩＣＦに署名した後のいずれかの時点で悪化する場合、それはＡＥとして記録すべきである。

ＡＥ変動因子
次の変動因子は各ＡＥに収集されよう。診断／症状（逐語的）。ＡＥの開始日（発症日）および停止日（解消日）。ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ最大重症度。ＡＥは重篤かどうか（重症度）。研究者による治験薬との因果律評価。ＩＭＰに対してとった行動。ＡＥがＩＰからの参加者の辞退の原因であったか否か。アウトカム。

加えて、次の変動因子はＳＡＥに収集されよう。ＡＥが重篤なＡＥの基準を満たした日。研究者は重篤なＡＥに気付いた日。重篤なものとして分類した理由。入院日。退院日。入院理由。考えられる死亡原因。死亡日。行った事後分析。研究手順との因果関係評価。他の投薬との因果関係評価。追加の試験薬剤との因果関係評価。ＡＥの説明。

試験時に生じたＡＥはすべて、関係があるかにかかわらず適切に報告しなければならない。ＡＥはすべて、イベントが安定化するかまたは適正に解消するまで現地の慣行に従って追跡されよう。

ＡＥはすべて、重症度および試験薬剤との関係をグレード分けしなければならない。
参加者に対するＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ投与の変更
代替的または中間的な用量およびスケジュールは、研究からの生じる臨床データに依存して必要となろう。これは、必要用量のスケジュール変更、分割、低減、または漸増中止を含みうる。

参加者のスケジュール変更
投与訪問はこのプロトコルに明記される許容時間ウィンドウ内で計画すべきである。しかしながら、参加者がスケジュール投与日に参加できない場合（たとえば、参加者の体調がよくない）、投与の計画を見直して、それに従って後続の試験訪問のタイミングを変更すべきである。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの投与は１週間まで遅延しうる。参加者がその次の投与日に参加できない場合、参加者は研究を辞退すべきであり、ＥＯＳ研究訪問はスケジュールすべきである。

参加者の用量およびスケジュールの変更
グレード≧３注入反応のイベントでは、上述された手順に従うべきである。この手順に従って、初回用量は連続した３日間に分割しうる。

分割用量スケジュールの一例は以下に示される。

３日間にわたる分割投与イベントでは、ＰＫサンプルは、計画どおりに１日および８日、次いで、投与前、２、３日、および９、１０日にすべきである。

いかなる場合も、用量およびスケジュールの変更は、実施前に医療モニターと検討すべきである。
参加者の用量変更
用量の漸増を中止（たとえば、特定のスケジュールでの開始用量がＭＴＤを超えるような毒性をもたらす場合）または用量の低減の決定は、ＳＲＣにより勧められよう。

実施例２０．製剤最適化研究
ＮＯＶ３４０は、オリゴヌクレオチドのカプセル化に使用される十分に確立されたリポソーム製剤である。表１９は製剤の脂質組成をモル比で示している。

本最適化研究はリポソーム内へにＣＥＢＰＡ−５１のカプセル化効率を向上させるために行った。ＮＯＶ３４０リポソーム中に製剤化されるオリゴヌクレオチドのプロセス開発および最適化のインハウス経験に基づいて、ＣＥＢＰＡ−５１の最適化の最臨界パラメータはカプセル化効率である。カプセル化効率（％）は、リポソーム会合オリゴヌクレオチド（カプセル化および膜結合）の量を、水含有量および不純物を除くカプセル化を意図したＡＰＩ溶液に溶解された全量で減算した値である。カプセル化効率を計算する場合、小スケールで調製する場合の高いプロセス損失も考慮すべきである。そうした損失はサンプリングならびにフィルタユニットおよびチューブのデッドボリュームによる。製造スケールを増加した場合、プロセス損失が低減されるであろう。したがって、脂質回収率に基づいたカプセル化効率も計算される。カプセル化効率を改善するために、ＲＮＡと脂質との間の相互作用を最大化させることは最も合理的な方向であった。これを達成するために、２つの異なるパラメータを変化させて評価した。第１は、リポソーム形成時の脂質対薬剤比であり、第２は、ＣＥＢＰＡ−５１を溶解するために使用される緩衝液のｐＨであった。ＲＮＡと脂質製剤との間の相互作用が主にＭｏＣｈｏｌとオリゴヌクレオチドとの間で起こる。ＭｏＣｈｏｌは、酸性媒体中で正に荷電する６．５のｐＫａを有する両親媒性脂質である。正荷電ＭｏＣｈｏｌと負荷電ＲＮＡとの間の相互作用の結果として、リポソーム内へのＲＮＡのカプセル化が増加する。したがって、我々の仮説によれば、ＡＰＩ緩衝液のｐＨを減少させるとＭｏＣｈｏｌ荷電が増加してＭｏＣｈｏｌとＣＥＢＰＡ−５１との間の相互作用が増加するため、増加したカプセル化効率が得られるであろう。第２の選択肢は、最適脂質対薬剤比、より簡単に言えば、「飽和点」（ＭｏＣｈｏｌと相互作用可能なＣＥＢＰＡ−５１の最大量）を同定することであった。したがって、リポソーム調製実験の過程で種々の脂質対薬剤比を試験した。ＡＰＩ溶液中のＣＥＢＰＡ−５１の濃度を減少させることにより脂質対薬剤比を変化させた。７つの異なるＣＥＢＰＡ−５１濃度を試験した。

方法
リポソーム調製
クロスフローエタノール注入法によりリポソームを調製した。簡潔に述べると、脂質（ＰＯＰＣ、Ｃｈｅｍｓ、およびＤＯＰＥ）を５５℃で無水ＥｔＯＨに溶解させる。完全可溶化後、あらかじめ秤量されたＭｏＣｈｏｌを含有する他のボトル中に溶液を定量導入する。Ｃｈｏｌに対するＭｏＣｈｏｌの分解を最小限に抑えるために、無水ＥｔＯＨの選択および脂質の可溶化の２工程が必要であることが同定された。脂質の完全溶解後、エタノール脂質溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、加熱キャビネット中５５℃に昇温されたインジェクター中に定量導入する。その間に、オリゴヌクレオチドを酢酸Ｎａ／スクロース緩衝液に溶解させ、０．２μｍのフィルターに通して濾過し、ＲＴのＡＰＩ緩衝液中に移す。ＮＯＶ３４０製剤用のＡＰＩ緩衝液の標準的ｐＨはｐＨ４であるが、本最適化研究では、ｐＨ３．５およびｐＨ４．０の緩衝液を使用した。注入モジュール中で脂質溶液とＡＰＩ緩衝液とを混合したとき、ポソームが形成する。リポソーム形成の直後、リポソーム製剤のｐＨを中和するために希釈緩衝液（ＲＴでＮａＣｌ／Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｐＨ９．０）を用いたオンライン希釈工程が存在する。リポソームに製剤化されたオリゴヌクレオチドは、ＩＶボトル中に採取され、押出し前に室温で３０分間撹拌される。次いで、リポソームのサイズおよびＰｄＩを精密化するために、この中間サスペンジョンを０．２μｍポリカーボネート膜に通して押し出す。押出し後、遊離ＲＮＡおよびＥｔＯＨは透析濾過により除去され、限外濾過による目標ｓａＲＮＡ濃度に濃縮されている。バイアル中に充填する前に、リポソーム生成物は０．２μｍのフィルターに通して無菌濾過する。

リポソームのサイズ測定
リポソームサイズの決定測定は、マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）ナノＺＳ（２２４／ＳＯＰ／００２）を用いて動的レーザ光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ−Ｌａｓｅｒ−Ｌｉｇｈｔ−Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により行った。この系は、波長６３３ｎｍの４ｍＷヘリウム／ネオンレーザを備えており、１７３°の検出角で非侵入後方散乱技術でリポソームサンプルを測定する。リポソームは最適リポソーム濃度を達成するために水性相に希釈した。また、実験は２５℃で行った。結果は、リポソーム均一性を決定する多分散性指数と共にリポソームサスペンジョン（ｚ−平均平均値）の平均直径で表される。

リポソームのζ電位測定
リポソームのζ電位は、２２４／ＳＯＰ／０１２に基づいてマルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）ナノＺＳを用いて最終バルク生成物で測定した。

ＲＮＡ吸光係数の定量
ＲＮＡの定量は、２２１／ＳＯＰ／０１２に基づいてＯＤ２６０ｎｍで分光光度計により行った。ＲＮＡはＡＰＩ溶液および最終バルク生成物で定量した。ＣＥＢＰＡ−５１製剤開発の非常に初期では、ｓａＲＮＡの各一本鎖の吸光係数を測定した。したがって、ｓａＲＮＡの定量は、各一本鎖の吸光係数値の平均を用いて行った。ハイパークロミシティー効果のため、平均吸光係数を用いたｓａＲＮＡの定量は、３０台前半パーセント範囲に減少したカプセル化効率値をたらした。開発段階で、適正な吸光係数値はＳＴＰｈａｒｍにより決定され、適正なｓａＲＮＡ定量、および最適化カプセル化効率をもたらした。ＣＥＢＰＡ−５１の定量に使用される第１の吸光係数は、３０．１であり、更新された値は２０．６８．（Ｌ／（ｍｏｌｅ・ｃｍ））あった。

脂質の定量
サンプル中の脂質濃度は、２２２／ＳＯＰ／００４に基づいてＨＰＬＣを用いてバルク体積から測定した。

結果および考察
新旧吸光係数間の比較
製剤のプロセス最適化を開始する前に調製されたサンプルに対して両方の吸光係数値により計算して誘導されたカプセル化効率を表２０に列挙する。更新される吸光係数は、リポソーム内へのＣＥＢＰＡ−５１のカプセル化効率を顕著に改善することは、誘導された値から明らかである。しかしながら、ｓａＲＮＡの収率を最大化するためにさらなる最適化研究を最終配合物で行った。実際には、ほぼ３０％の初期カプセル化効率から、最適化製剤では、ほぼ６０％のカプセル化効率をもたらした。

ｐＨ３．５緩衝液中に可溶化されたＡＰＩを含むリポソーム製剤
カプセル化効率に及ぼすＡＰＩ溶液のｐＨの作用を研究するために、ＡＰＩ溶液のｐＨをｐＨ４．０からｐＨ３．５に低減した。加えて、ＡＰＩ溶液中の３つの異なるＣＥＢＰＡ−５１濃度を用いて、カプセル化効率に対する脂質対薬剤比の作用を調べた。ｐＨ３．５のＡＰＩ溶液を用いて調製されたすべての製剤およびそれらの特性を表２１に列挙する。表２２、２３および２４は、ｐＨ３．５のＡＰＩ溶液で調製された製剤とｐＨ４．０のＡＰＩ溶液で調製されたそれらのそれぞれの製剤とを比較して示す。図３４は、表２２、２３、および２４示された結果をグラフとして表している。得られた結果から、ＡＰＩ溶液中のＲＮＡの低濃度（１．８５ｍｇ／ｍＬ）で、ＡＰＩ緩衝液のｐＨの変化がわずかに増加されたカプセル化効率をもたらすことは明らかである。他の２つの試験した濃度（２．２５および２．６５ｍｇ／ｍＬ）では、この方向への明らかな傾向は観測できなかった。加えて、ｐＨの低減は、増加したサイズおよびＰｄＩを含むリポソームの形成をもたらした。サイズおよびＰｄＩのかかる増加は追加の押出しサイクルを必要とすることになり、ＲＮＡ損失およびプロセス継続時間を増加させることになろうために推奨されない。したがって、注入緩衝液のｐＨ４．０から３．５に低減することは選択肢とならない。脂質対薬剤比の変化に関して、ＡＰＩ緩衝液中のＲＮＡ濃度を減少させることにより、カプセル化効率の増加が認められた。この傾向はＡＰＩ溶液の両方のｐＨ値に対しても同じであるとように思われる。

脂質対薬剤比の最適化
リポソーム形成時点における脂質対薬剤比はリポソーム内へのＲＮＡのカプセル化効率に特に重要である。これを最適化するために、ＥｔＯＨ溶液中の脂質濃度を同一に維持し、ＡＰＩ溶液中のＣＥＢＰＡ−５１の濃度を１．０６〜３．４４ｍｇ／ｍｌの範囲内で変化させた。すべての他のプロセスパラメータを一定に維持し、ＡＰＩ溶液のｐＨをｐＨ４．０に保持した。調製したすべての製剤およびそれらの特性を表２５に列挙する。同一の結果を図３５にグラフとしてプロットする。得られた結果から、ＡＰＩ溶液中のＣＥＢＰＡ−５１濃度を減少させることによりカプセル化効率のわずかな増加が見られることを示唆する傾向が明確に示された。この時点で、最終生成物中の脂質濃度は、ｓａＲＮＡの最大収率を達成しようとする場合に考慮すべき主要な結果であることを述べることが重要である。一方、最終生成物中の増加した脂質濃度は、最終０．２μｍの濾過でクリティカルとなり、ある時点で、フィルター膜は、フィルター膜領域に暴露される過度の脂質をブロックするおそれがある。したがって、目標は、単にＲＮＡ損失を最小限に抑えるだけでなく、それに加えて最終製品中の増加したＣＥＢＰＡ−５１濃度を可能にする最適脂質濃度を達成することである。

最適化研究の確認
リポソーム内へのｓａＲＮＡのカプセル化効率の最適化を目指してすべての実験を行った後、２つのより大量の最終バッチを調製して結果を確認した。表２６は、誘導されたデータを示しており、これはまた、すべての他の調製されたバッチの結果と共に図３５にグラフで表される。得られたデータから、注入緩衝液中のＣＥＢＰＡ−５１の濃度を２．３８ｍｇ／ｍＬに設定するように下された決定が明確に確認される。なぜなら、これにより、ｓａＲＮＡのより高いカプセル化効率と、最終リポソーム生成物中のＣＥＢＰＡ−５１のより高い濃度との両方がもたらされるからである。

結論
本研究はリポソーム内へのＣＥＢＰＡ−５１のカプセル化効率を最適化した。誘導された結果から、リポソームの製造はｐＨ４．０のＡＰＩ緩衝を用いて行うべきであり、かつ液ＡＰＩ溶液中のＣＥＢＰＡ−５１濃度を約２．３８ｍｇ／ｍＬに設定すべきであることが示唆される。そうした設定では、ＮＯＶ３４０と共にオリゴヌクレオチドを製剤化した場合に得られる典型的な収率であるより高い５０パーセント程度の収率を有するリポソーム製剤が得られるはずである。

実施例２１．使用安定性試験
５１．８０〜２９６．００ｍｇのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡを２５０ｍｌの全注入体積に希釈して注入バッグ中０．２１〜１．１８ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。１つのタイプの注入バッグを使用し（バクスター・バイアフロ（ＢａｘｔｅｒＶＩＡＦＬＯ）２５０ｍｌ塩化ナトリウム０．９％静脈内注入ＢＰ）、２つの代表的で典型的なスペースライン（ＰＶＣおよびＰＶＣフリー）を評価のために選択した。０．２１ｍｇ／ｍｌの最低用量（２８ｍｇ／ｍ２の臨床用量レベルに対応する）を最悪のシナリオとして使用研究に選択した。

材料
５バイアルＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ薬剤生成物、ロットＭＩＴ１２１５−Ａ、ｓａＲＮＡ含有量：２．５ｍｇ／ｍｌ、公称容積２０ｍｌ、注入バッグ：４×バクスター・バイアフロ（ＢａｘｔｅｒＶＩＡＦＬＯ）２５０ｍｌ塩化ナトリウム０．９％静脈内注入ＢＰ（ｒｅｆ：ＦＥ１３２２）。注入スペースライン：１）．２×ブラウン・インヒューフソマット（ＢｒａｕｎＩｎｆｕｓｏｍａｔ）（登録商標）スペースライン−ニュートラピュア（Ｎｅｕｔｒａｐｕｒ）（ポリウレタン）ＰＶＣフリー（ｒｅｆ：８７００１１０ＳＰ）、２）．２×ブラウン・インヒューフソマット（ＢｒａｕｎＩｎｆｕｓｏｍａｔ）（登録商標）スペースライン−ＰＶＣ（ＤＥＨＰフリー）（ｒｅｆ：８７０００３６ＳＰ）。針：たとえば、ＢＤミロランス（ＢＤＭｉｒｏｌａｎｃｅ）（ｒｅｆ：３０１３００）。シリンジ：たとえば、ＢＤシリンジ（ｒｅｆ：３０９６５８）。インキュベータＱＣＧＴＢＳ０１ＭＭ（２３〜２７℃）。

投与溶液の調製、サンプリング、および貯蔵
約２１ｍｌの０．９％正常生理食塩水を除去して約２１ｍｌの薬剤生成物で置き換えることによりＭＩＴ１２１５−Ａ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を注入バッグに希釈した。各スペースラインに対してデュプリケートバッグを準備し、合計４つの注入バッグとした。生理食塩水の除去前および除去後ならびに薬剤生成物の添加後、バッグの重量を測定した。薬剤生成物の添加量の計算に１．０４ｇ／ｍｌの密度を用いた。２つのバッグ（＃１および＃２）をＰＶＣフリースペースラインで接続し、残りの２つのバッグ（＃３および＃４）をＰＶＣスペースラインで接続した。バッグは２５±２℃で２４時間保存した。

バッグ準備直後（時間点０時間）、８時間後、および２４時間後、スペースラインを介してサンプル（各時間点および各バッグにつき４×０．５ｍｌ）を収集し、−２０±５℃で保存した。８時間および２４時間の時間点で、サンプリング前にラインを約３０ｍｌパージすることにより、スペースラインでインキュベートされた材料ではなく注入バッグからのサンプル材料を確実に収集するようにした。サンプルの分析はすべて、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（含有量）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（脂質）の１回の分析ラン内で行った。

試験および判定基準
概要

合格基準は、注入用サスペンジョンの調製における約１２倍のそれぞれの稀釈倍率（すなわち、ｓａＲＮＡ含有量を２．５±０．５ｍｇ／ｍｌから０．２１±０．０４ｍｇ／ｍｌに希釈する）を考慮して薬剤生成物（ＤＰ：ＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔ）仕様に基づいて適用した。

結果
ｓａＲＮＡ含有量
全ｓａＲＮＡの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１３に基づいてＵＶ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表２８に列挙する。バッグはすべて、目標値に近いｓａＲＮＡ濃度を含有し、観測期間全体を通して０．２１±０．０４ｍｇ／ｍｌの合格基準を満たした。

ＰＯＰＣ含有量
全ＰＯＰＣの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１８に基づいてＣＡＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表２９に列挙する。バッグはすべて、目標値に近いＰＯＰＣ濃度を含有し、観測期間全体を通して０．２９〜０．４９ｍｇ／ｍｌの合格基準を満たした。

ＤＯＰＥ含有量
全ＤＯＰＥの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１８に基づいてＣＡＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表３０に列挙する。バッグはすべて、目標値に近いＤＯＰＥ濃度を含有し、観測期間全体を通して１．１３〜１．９０ｍｇ／ｍｌの合格基準を満たした。

ＣＨＥＭＳ含有量
全ＣＨＥＭＳの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１８に基づいてＣＡＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表３１に列挙する。

ＭｏＣｈｏｌ含有量
全ＭｏＣｈｏｌの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１８に基づいてＣＡＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表３２に列挙する。バッグはすべて、目標値に近いＭｏＣｈｏｌ濃度を含有し、観測期間全体を通して１．７１×２．８４ｍｇ／ｍｌの合格基準を満たした。

コレステロール含有量
全コレステロールの含有量は、２２２／ＳＯＰ／０１８に基づいてＣＡＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。サンプルはすべて、同一のＨＰＬＣシーケンス内で分析した。結果を表３３に列挙する。バッグはすべて、最大許容限界未満のコレステロール濃度を含有し、観測期間全体を通して≦０．１７ｍｇ／ｍｌの合格基準を満たした。

結論
２４時間にわたる室温における注入バッグ中のＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性および企図される注入ラインとの適合性を確認するために、使用試験を行った。

薬剤生成物は０．２１ｍｇ／ｍｌの意図された最低臨床用量で少なくとも８時間にわたり安定性および適合性を有することが、結果から確認される。
したがって、選択された材料（注入バッグおよびスペースライン）は薬剤生成物との適合性があり、かつ少なくとも８時間の時間内でＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの臨床試験に使用可能であると、結論付け可能である。

実施例２２．ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性試験
長期貯蔵は−２０±５℃で行った。加速条件下の安定性は２〜８℃で調べた。安定性の指標となるパラメータを同定するためのストレス試験研究は、２５±２℃および４０±２℃で貯蔵して行った。表３４は、継続時間、条件、および現時点で入手可能なデータを含めて、安定性試験で試験されたバッチの概要を示す。

安定性プログラムで使用した分析手順には、外観、ｐＨ、アッセイ、純度、脂質含有量、および粒子特性の試験が含まれていた。

安定性のまとめおよび結論
長期貯蔵条件（２０±５℃）で貯蔵されたＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（ＭＩＴ０６１５−Ａ）の一バッチで安定性データが得られた。ストレス試験データは２５±２℃および４０±２℃で貯蔵された同一のバッチで得られた。

６ヶ月間まで２０±５℃で貯蔵されたＭＩＴ０６１５−Ａでは変化は観測されなかった。ストレス条件下（２５±２℃および４０±２℃）で貯蔵されたサンプルは、ＭＯＣＨＯＬの分解によるＭＯＣＨＯＬの減少および貯蔵によるコレステロールへの変換を示した。この分解は、２５±２℃と比較して４０±２℃でより顕在化された。

２５℃で３日間（７２時間）にわたるストレス試験下では、主要な脂質のＭＯＣＨＯＬの含有量が３３．２ｍｇ／ｍｌから２７．８ｍｇ／ｍｌに減少し（１６％減少）、一方、４０℃で３日後には３０．１ｍｇ／ｍｌから２．５ｍｇ／ｍｌに減少した（２５％減少）。このＭＯＣＨＯＬ低減は分解生成物コレステロールの形成に対応し、コレステロールは２５℃で３日後に１．１ｍｇ／ｍｌから２．２ｍｇ／ｍｌに、４０℃で３日後に１．０ｍｇ／ｍｌから８．２ｍｇ／ｍｌに増加した。他の脂質賦形剤は、加速条件下で有意な変化を示さなかった。有意な変化は、他の脂質、全ｓａＲＮＡ含有量およびその不純物でも観測されなかった。表３５〜３８は、異なる条件でのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの安定性試験およびストレス試験の結果を示す。

ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡは、少なくとも６ヶ月間にわたり長期貯蔵条件（２０±５℃）で貯蔵されたとき安定であり、分析変動に由来する以外の減少または変化の傾向を示さない。それは２〜８℃（５±３℃）の加速条件下で少なくとも１ヶ月間にわたり安定である。

実施例２３．ＣＥＢＰＡ−ｓａＲＮＡを用いたＣＣＬ４誘発肝硬変のｉｎｖｉｖｏ研究
本研究は、遅延投与を探究する腹水および生存率による実施例１１の反復であった。四塩化炭素（ＣＣＬ４）誘発肝線維症は、肝線維症および肝硬変の研究用として齧歯動物において十分に確立されたかつ広く認められた実験モデルである。ラットへの四塩化炭素の長期投与は、組織学的に観測可能な肝線維症を伴って肝機能の重篤な擾乱を引き起こす。

スプラーグドーリーラットの肝硬変はＣＣＬ４のｉ．ｐ．注射により誘発した。１２０〜１５０ｇの開始体重を有する雄スプラーグドーリーラットを使用した。ＣＣＬ４処置動物は、研究全体を通して体重の有意な減少を示した。ＣＣＬ４処置動物は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、ビリルビンなどの肝機能試験（ＬＦＴ）パラメータの有意な増加を示したが、８週間（最初のランダム化）までＧＧＴの増加を示さなかった。ｐａｔｈ対照動物では８週間までアンモニアの有意な増加および総タンパク質の有意な減少が見られた。

８週でのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（１ｍｐｋ）による治療は動物の体重の有意な改善を示した。ＬＦＴおよびアンモニアレベルは１３週間まで有意に逆転した。総タンパク質レベルは有意に増加した。１１週でのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ（１ｍｐｋ）による治療も１３週間までＬＦＴおよびアンモニアレベルの有意な逆転を示した。図３６は、８週からのＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療が高アンモニア血症を逆転することを示した。

図３７Ａおよび図３７ＢはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療が腹水を低減することを示した。腹水は視覚的／理学的検査に基づいて０〜３のスケールで評価した。腹水の不在は０として、かろうじて触知可能な腹水は１として、側腹部の緊張を有する大量腹水は２として、および緊満性腹水は３と記録した。腹水は９週よりも前に認知可能であり、１３週に高スコアに達した。

図３８Ａおよび図３８Ｂの生存率グラフに示されるように、ＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ治療は生存率の有意な改善をもたらした。
実施例２４．マウスおよびラットにおけるＣＥＢＰＡ−５１交差反応性
研究目標：本研究の目的は、ラットおよびマウスが前臨床肝疾患モデルのためのおよびＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ／ＣＥＢＰＡ−５１を用いた非臨床毒性研究のための適切な齧歯動物種であるかを調べることであった。

実験計画：本研究は、１）データベース検索による配列マッチングと、２）ラットおよびマウスのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のシーケンシングと、３）ラットおよびマウスの細胞系におけるＣＥＢＰＡのアップレギュレーションラインの確認との３部で構成した。

最初に、ＣＥＢＰＡの配列相同性を公用データベースで評価した（ＢＬＡＳＴ検索）。ＣＥＢＰＡ−５１標的配列は、ＢＬＡＳＴを用いてラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）株）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株）のゲノムに関するクエリー検索として使用した。

加えて、ラットおよびマウスの肝葉からゲノムＤＮＡを単離し、標的部位のＰＣＲ産物を生成してダイレクトシーケンシングに供した。次いで、得られた配列と発表されたラットおよびマウスのゲノム配列とをＢＬＡＳＴを介して比較した。

次いで、ラット肝臓クローン−９細胞およびマウス肝臓ＡＭＬ１２細胞にＣＥＢＰＡ−５１をトランスフェクトしてＣＥＢＰＡｍＲＮＡのアップレギュレーションを測定することにより、機能交差反応性を評価した。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて２０ｎＭ（ｆ．ｃ．）の各試験品（ＣＥＢＰＡ−５１またはｓｉＦＬＵＣ、非標的化ｓｉＲＮＡ）で細胞をリバーストランスフェクトし、続いて、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて各試験品の追加のフォワードトランスフェクション工程（２０ｎＭｆ．ｃ．）を行った。２回目のトランスフェクションの２４時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＣＥＢＰＡｍＲＮＡレベルを決定した（ハウスキーピング遺伝子：ＧＡＰＤＨ、トリプリケートで測定）。

結果：ＢＬＡＳＴ検索によりＣＥＢＰＡ−５１の配列とラットおよびマウスの標的部位（ＣＥＢＰＡ遺伝子のゲノム位置）との間のミスマッチの不在を確認した。加えて、ＣＥＢＰＡ−５１とラットおよびマウスの肝臓のｇＤＮＡに由来する増幅配列との比較でミスマッチは見られなかった。

ラットクローン−９細胞およびマウスＡＭＬ１２細胞へのＣＥＢＰＡ−５１のトランスフェクションの結果、それぞれ２倍（ｎ＝１）および１．７倍（ｎ＝２）のＣＥＢＰＡｍＲＮＡアップレギュレーションになったが、非標的化対照ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＦＬＵＣ）ではアップレギュレーションは観測されなかった。

ラットおよびマウスのＣＥＢＰＡのゲノム配列は、ＢＬＡＳＴデータベースによればＣＥＢＰＡ−５１標的配列と同一である。これはラットおよびマウスの肝臓のｇＤＮＡのシーケンシングによりさらに検証された。ＣＥＢＰＡ−５１の機能交差反応性は、ラットおよびマウスの肝細胞系における初期試験でＣＥＢＰＡ遺伝子のアップレギュレーションを実証することにより検証された。したがって、肝癌および肝疾患のラットモデルおよびマウスモデルはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡ活性の前臨床評価に適していると考えられると共に、ラットはＭＴＬ−ＣＥＢＰＡの非臨床毒性試験に適した齧歯動物種と考えられる。

他の実施形態
本開示をその詳細な説明と組み合わせて説明してきたが、以上の説明は例示することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲により規定される本開示の範囲を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内にある。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、以下、記載する。
［項１］
Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成ｓａＲＮＡであって、配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、１４〜３０ヌクレオチドを有する、単離された合成ｓａＲＮＡ。
［項２］
一本鎖である、項１に記載のｓａＲＮＡ。
［項３］
３’オーバーハングを含む、項２に記載のｓａＲＮＡ。
［項４］
修飾されている、項２に記載のｓａＲＮＡ。
［項５］
少なくとも２つの修飾を含む、項４に記載のｓａＲＮＡ。
［項６］
前記修飾が２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、反転デオキシリボース、またはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合のいずれかを含む、項４に記載のｓａＲＮＡ。
［項７］
配列番号３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、９３（ＡＷ５１）、および１０９（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項２に記載のｓａＲＮＡ。
［項８］
二本鎖であり、かつアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む、項１に記載のｓａＲＮＡ。
［項９］
前記アンチセンス鎖が、配列番号３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、９３（ＡＷ５１）、および１０９（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項５に記載のｓａＲＮＡ。
［項１０］
前記センス鎖が、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４８、９４、および１１０から選択される配列を含む、項６に記載のｓａＲＮＡ。
［項１１］
修飾されている、項８に記載のｓａＲＮＡ。
［項１２］
少なくとも２つの修飾を含む、項１１に記載のｓａＲＮＡ。
［項１３］
前記修飾が２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、反転デオキシリボース、またはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合のいずれかを含みうる、項１１に記載のｓａＲＮＡ。
［項１４］
前記修飾が前記センス鎖にある、項１１に記載のｓａＲＮＡ。
［項１５］
前記修飾が前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方にある、項１１に記載のｓａＲＮＡ。
［項１６］
コンジュゲートされている、項１に記載のｓａＲＮＡ。
［項１７］
炭水化物リガンドにコンジュゲートされている、項１６に記載のｓａＲＮＡ。
［項１８］
細胞においてＣ／ＥＢＰα遺伝子をアップレギュレートする方法であって、前記細胞に項１〜１５のいずれか一項に記載のｓａＲＮＡを投与する工程を含む、方法。
［項１９］
前記細胞が増殖細胞である、項１８に記載の方法。
［項２０］
前記細胞が癌細胞である、項１９に記載の方法。
［項２１］
前記細胞が肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞である、項２０に記載の方法。
［項２２］
Ｃ／ＥＢＰα ｍＲＮＡアップレギュレーションのＥＣ５０が１．０超である、項１８に記載の方法。
［項２３］
Ｃ／ＥＢＰα遺伝子が少なくとも２０％だけアップレギュレートされる、項１８に記載の方法。
［項２４］
Ｃ／ＥＢＰα遺伝子が少なくとも２倍だけアップレギュレートされる、項２２に記載の方法。
［項２５］
細胞において、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、シトクロムＰ４５０３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、または肝細胞核因子４−アルファ（ＨＮＦ４ａ）から選択される遺伝子の発現をアップレギュレートする方法であって、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成ｓａＲＮＡまたはその医薬組成物を投与する工程を含み、前記ｓａＲＮＡが配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、前記ｓａＲＮＡが１４〜３０ヌクレオチドを有する、方法。
［項２６］
前記細胞が過増殖細胞である、項２５に記載の方法。
［項２７］
前記細胞が癌細胞である、項２６に記載の方法。
［項２８］
前記細胞が肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞である、項２７に記載の方法。
［項２９］
前記細胞が過増殖細胞でない、項２５に記載の方法。
［項３０］
前記細胞が一次ヒト肝細胞である、項２９に記載の方法。
［項３１］
前記Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のコード鎖から転写されるアンチセンスＲＮＡ転写物が切断されない、項２５に記載の方法。
［項３２］
前記ｓａＲＮＡがＡｇｏ２タンパク質に会合する、項２５に記載の方法。
［項３３］
前記遺伝子発現が少なくとも２０％だけアップレギュレートされる、項２５に記載の方法。
［項３４］
前記遺伝子発現が少なくとも２倍だけアップレギュレートされる、項２６に記載の方法。
［項３５］
治療を必要とする対象の肝線維症、肝不全、または非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療する方法であって、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成ｓａＲＮＡまたはその医薬組成物を投与する工程を含み、前記ｓａＲＮＡが配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、前記ｓａＲＮＡが１４〜３０ヌクレオチドを有する、方法。
［項３６］
前記肝不全が急性肝不全である、項３５に記載の方法。
［項３７］
前記対象の総ビリルビン（ＴＢＩＬ）レベル、循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル、ガンマ−グルタミル−トランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル、肝ヒドロキシプロリンレベル、プロトロンビン時間、アンモニア、または肝トリグリセリド（肝ＴＧ）レベルが減少される、項３５に記載の方法。
［項３８］
前記対象の血清中アルブミンレベル、総タンパク質レベルが増加される、項３５に記載の方法。
［項３９］
前記対象の線維組織または偽小葉の形成が低減される、項３５に記載の方法。
［項４０］
治療を必要とする対象のＩＩ型糖尿病またはインスリン抵抗性を治療する方法であって、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現をアップレギュレートする単離された合成ｓａＲＮＡまたはその医薬組成物を投与する工程を含み、前記ｓａＲＮＡが配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、前記ｓａＲＮＡが１４〜３０ヌクレオチドを有する、方法。
［項４１］
前記対象の肝コレステロールレベル、血清中ＡＳＴレベル、空腹時グルコースレベル、トリグリセリド対ＨＤＬ−ｃ比、または肝臓対生体比が減少される、項４０に記載の方法。
［項４２］
前記対象のインスリンレベルが増加される、項４０に記載の方法。
［項４３］
前記ｓａＲＮＡが二本鎖であり、かつアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む、項２５、３５、または４０に記載の方法。
［項４４］
前記ｓａＲＮＡの前記アンチセンス鎖および／または前記センス鎖が３’オーバーハングを含む、項４３に記載の方法。
［項４５］
前記ｓａＲＮＡが修飾されている、項４３に記載のｓａＲＮＡ。
［項４６］
前記ｓａＲＮＡが少なくとも２つの修飾を含む、項４５に記載のｓａＲＮＡ。
［項４７］
前記修飾が２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、反転デオキシリボース、またはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合のいずれかを含みうる、項４５に記載のｓａＲＮＡ。
［項４８］
前記修飾が前記センス鎖にある、項４５に記載のｓａＲＮＡ。
［項４９］
前記修飾が前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方にある、項４５に記載のｓａＲＮＡ。
［項５０］
前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、９３（ＡＷ５１）、および１０９（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項４３に記載の方法。
［項５１］
前記センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４８、９４（ＡＷ５１）、および１１０（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項５０に記載のｓａＲＮＡ。
［項５２］
リポソーム内にカプセル化された単離された合成ｓａＲＮＡを含む医薬組成物であって、前記ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子またはその医薬組成物の発現をアップレギュレートし、前記ｓａＲＮＡが配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、前記ｓａＲＮＡが１４〜３０ヌクレオチドを有する、医薬組成物。
［項５３］
前記リポソームが、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル−ヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート（ＭＯＣＨＯＬ）を含む、項５２に記載の医薬組成物。
［項５４］
ＰＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＭＯＣＨＯＬのモル比が約６：２４：２３：４７である、項５３に記載の医薬組成物。
［項５５］
前記リポソームのサイズが約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍである、項５２に記載の医薬組成物。
［項５６］
前記リポソームの前記サイズが１００ｎｍ〜約１２０ｎｍである、項５５に記載の医薬組成物。
［項５７］
前記ｓａＲＮＡが二本鎖であり、かつアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む、項５２に記載の医薬組成物。
［項５８］
前記ｓａＲＮＡの前記アンチセンス鎖および／または前記センス鎖が３’オーバーハングを含む、項５７に記載の医薬組成物。
［項５９］
前記ｓａＲＮＡが修飾されている、項５７に記載の医薬組成物。
［項６０］
前記ｓａＲＮＡが少なくとも２つの修飾を含む、項５９に記載の医薬組成物。
［項６１］
前記修飾が２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、反転デオキシリボース、またはヌクレオチド間のホスホロチオエート結合のいずれかを含みうる、項５９に記載の医薬組成物。
［項６２］
前記修飾が前記センス鎖にある、項５９に記載の医薬組成物。
［項６３］
前記修飾が前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方にある、項５９に記載の医薬組成物。
［項６４］
前記ｓａＲＮＡの前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、９３（ＡＷ５１）、および１０９（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項５７に記載の医薬組成物。
［項６５］
前記ｓａＲＮＡの前記センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４８、９４（ＡＷ５１）、および１１０（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項５７に記載の医薬組成物。
［項６６］
前記ｓａＲＮＡが配列番号１０９のアンチセンス鎖と配列番号１１０のセンス鎖とを有する、項５２に記載の医薬組成物。
［項６７］
前記ｓａＲＮＡが約２ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、項５２に記載の医薬組成物。
［項６８］
前記ｓａＲＮＡが約２．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、項６７に記載の医薬組成物。
［項６９］
約７．２〜約７．８のｐＨを有する、項５２に記載の医薬組成物。
［項７０］
約７．５のｐＨを有する、項６９に記載の医薬組成物。
［項７１］
リン酸緩衝液を有する、項５２に記載の医薬組成物。
［項７２］
前記リン酸緩衝液がリン酸水素二ナトリウム二水和物およびリン酸二水素カリウムを含む、項７１に記載の医薬組成物。
［項７３］
凍結保護剤を含む、項５２に記載の医薬組成物。
［項７４］
前記凍結保護剤がスクロースである、項７３に記載の医薬組成物。
［項７５］
イオン強度調整剤を含む、項５２に記載の医薬組成物。
［項７６］
前記イオン強度調整剤が塩化カリウムである、項７５に記載の医薬組成物。
［項７７］
光から保護される、項５２に記載の医薬組成物。
［項７８］
栓付きガラスバイアル中に貯蔵される、項５２に記載の医薬組成物。
［項７９］
−２０℃±５℃で凍結貯蔵される、項５２に記載の医薬組成物。
［項８０］
前記リポソーム内にカプセル化された前記単離された合成ｓａＲＮＡが少なくとも６ヶ月間にわたり安定性を維持する、項７９に記載の医薬組成物。
［項８１］
静脈内使用のために０．９％正常生理食塩水で希釈される、項５２に記載の医薬組成物。
［項８２］
対象の癌を治療する方法であって、前記対象に項５２に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
［項８３］
前記対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する、項８２に記載の方法。
［項８４］
前記ＨＣＣが進行ＨＣＣである、項８３に記載の方法。
［項８５］
前記対象が二次肝腫瘍を有する、項８２に記載の方法。
［項８６］
前記医薬組成物の用量が約２０〜約１６０ｍｇ／ｍ^２である、項８２に記載の方法。
［項８７］
前記医薬組成物が３週間にわたり週１回、１日目、８日目、およびに１５日目に静脈内注入により投与される、項８２に記載の方法。
［項８８］
単離された合成ｓａＲＮＡをリポソーム内にカプセル化する方法であって、
前記ｓａＲＮＡを第１の緩衝液に溶解させてｓａＲＮＡ溶液を形成する工程と、
前記ｓａＲＮＡ溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過する工程と、
前記濾過されたｓａＲＮＡ溶液と脂質溶液とを注入モジュール内で混合してリポソーム配合物を形成する工程と、
前記リポソーム配合物に第２の緩衝液を添加する工程とを含み、
前記ｓａＲＮＡがＣ／ＥＢＰα遺伝子またはその医薬組成物の発現をアップレギュレートし、前記ｓａＲＮＡが配列番号７７の領域に対して少なくとも８０％相補的であり、前記ｓａＲＮＡが１４〜３０ヌクレオチドを有する、方法。
［項８９］
前記第１の緩衝液が酢酸Ｎａ／スクロースである、項８８に記載の方法。
［項９０］
前記ｓａＲＮＡ溶液のｐＨが約４．０である、項８８に記載の方法。
［項９１］
前記ｓａＲＮＡ溶液中の前記ｓａＲＮＡの濃度が約２．３８ｍｇ／ｍＬである、項８８に記載の方法。
［項９２］
前記脂質溶液が、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グルセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステリル−ヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミスクシネート（ＭＯＣＨＯＬ）を含む、項８８に記載の方法。
［項９３］
ＰＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ：ＭＯＣＨＯＬのモル比が約６：２４：２３：４７である、項９２に記載の方法。
［項９４］
前記第２の緩衝液が約９のｐＨを有する、項８８に記載の方法。
［項９５］
前記第２の緩衝液がＮａＣｌ／Ｎａ_２ＨＰＯ_４である、項９４に記載の方法。
［項９６］
前記ｓａＲＮＡが二本鎖であり、かつアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む、項８８に記載の方法。
［項９７］
前記ｓａＲＮＡの前記アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、６４（ＡＷ５１）、および７８（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項９６に記載の方法。
［項９８］
前記ｓａＲＮＡの前記センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、５０（ＡＷ５１）、および７９（ＣＥＢＰＡ５１）から選択される配列を含む、項９７に記載の方法。

Claims

本明細書に記載の発明。