JP2021132541A - Method for chopping biological tissue - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体由来組織を細切するための方法、装置、キット等に関する。 The present invention relates to a method, an apparatus, a kit, etc. for chopping a living body-derived tissue.
生体由来組織は種々の生細胞や細胞外基質等から構成される。生体由来組織から生細胞を分離することにより、生細胞を研究開発や医療等の様々な目的に用いることができる。
生体由来組織から生細胞を分離するためには、一般に、まず生体由来組織を破砕し、その後、破砕された生体由来組織から生細胞を選別する必要がある。例えば、生体由来組織を、内部に刃が固定されている装置内で回転させることによって、均質な微小断片に破砕すること、そして、破砕後に一定以上の大きさの断片をふるいによって除去することが知られている（特許文献１）。また、生体由来組織を回転式の刃を有する装置内で破砕すること、そして、破砕後に生細胞を濾過部材により濾過することも知られている（特許文献２）。
Living-derived tissues are composed of various living cells, extracellular matrix, and the like. By separating living cells from living tissue, the living cells can be used for various purposes such as research and development and medical treatment.
In order to separate living cells from living tissue, it is generally necessary to first crush the living tissue and then select the living cells from the crushed living tissue. For example, biological tissue can be crushed into homogeneous microfragments by rotating it in a device with a blade fixed inside, and after crushing, fragments of a certain size or larger can be removed by sieving. It is known (Patent Document 1). It is also known that living tissue is crushed in an apparatus having a rotary blade, and that living cells are filtered by a filtration member after crushing (Patent Document 2).
本発明は、生体由来組織から細胞を高い生存率で回収可能である、生体由来組織を細切するための方法、装置、キット等の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method, an apparatus, a kit and the like for cutting a living tissue, which can recover cells from the living tissue with a high survival rate.
本発明者らは、生体由来組織から生細胞を分離するための方法を研究する中で、生体由来組織が同一の場所で繰り返し破砕されることによって、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じ、細胞の生存率が減少すると考え、かかる生存率を改善する方法を開発すべく鋭意研究を進めたところ、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを同時に行うことにより、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑えることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。 In researching a method for separating living cells from living cells, the present inventors repeatedly crushed living cells in the same place, resulting in excessive load on living cells such as damage and heat. As a result of diligent research to develop a method to improve the survival rate, we found that the step of grinding the biological tissue and the penetration of the ground biological tissue were multiple. We have found that it is possible to suppress the occurrence of excessive load such as damage and heat on living cells by simultaneously performing the step of extruding from the pores, and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］生体由来組織を細切するための方法であって、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを含み、すり潰すステップと押出すステップとが同時になされる、前記方法。
［２］生体由来組織が骨格筋組織である、［１］に記載の方法。
［３］細切された生体由来組織を回収するステップをさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］生体由来組織を細切するための装置であって、複数の貫通孔を有する押出プレートを備え、生体由来組織を押出プレート上ですり潰すことによって、生体由来組織を細切することができる、前記装置。
［５］押圧プレートをさらに備え、押圧プレートで生体由来組織を押出プレート上ですり潰すことによって、生体由来組織を細切することができる、［４］に記載の装置。
［６］生体由来組織が骨格筋組織である、［４］または［５］に記載の装置。
［７］押出プレートを内側で固定できる容器をさらに備え、押出プレートが容器の内部を（ｉ）押圧プレートが生体由来組織を押圧する空間を構成する押圧部と（ｉｉ）細切された生体由来組織を収容する空間を構成する収容部とに仕切る、［５］または［６］に記載の装置。
［８］収容部の全体または一部が着脱可能である、［７］に記載の装置。
［９］押圧プレートおよび／または押出プレートが、すり潰される前の生体由来組織に対する接触面において複数の突起を有する、［５］〜［８］のいずれかに記載の装置。
［１０］操作部をさらに備え、押圧プレートに操作部が連結され、操作部を介して押圧プレートを上下に移動および／または回転させることができる、［５］〜［９］のいずれかに記載の装置。
［１１］操作部を介して押圧プレートを上下に移動および／または回転させることができる駆動装置をさらに備える、［１０］に記載の装置。
［１２］［４］〜［１１］のいずれかに記載の装置を含む、生体由来組織を細切するためのキット。
［１３］細切された生体由来組織から生細胞を回収するステップをさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［１４］［１］〜［３］のいずれかに記載の方法によって細切された生体由来組織から生細胞を分離し、分離された生細胞を培養して移植片を作製するステップを含む、移植片の製造方法。
［１５］［１４］に記載の方法により製造された、移植片。
［１６］［１５］に記載の移植片の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象における疾患の処置方法。
That is, the present invention relates to the following.
[1] A method for chopping a living body-derived tissue, which includes a step of grinding the living body-derived tissue and a step of extruding the ground living body-derived tissue from a plurality of through holes, and a step of grinding. The method, wherein the extruding step is performed at the same time.
[2] The method according to [1], wherein the biological tissue is skeletal muscle tissue.
[3] The method according to [1] or [2], further comprising the step of collecting shredded biological tissue.
[4] A device for shredding a biological tissue, which is provided with an extrusion plate having a plurality of through holes, and the biological tissue can be shredded by grinding the biological tissue on the extrusion plate. The device that can be.
[5] The apparatus according to [4], further comprising a pressing plate, wherein the biological tissue can be shredded by grinding the biological tissue on the extrusion plate with the pressing plate.
[6] The device according to [4] or [5], wherein the biological tissue is skeletal muscle tissue.
[7] The extruded plate is further provided with a container to which the extruded plate can be fixed inside, and the extruded plate is inside the container. The device according to [5] or [6], which partitions the space for accommodating the tissue from the accommodating portion.
[8] The device according to [7], wherein all or part of the accommodating portion is removable.
[9] The apparatus according to any one of [5] to [8], wherein the pressing plate and / or the extruded plate has a plurality of protrusions on the contact surface with respect to the biological tissue before being ground.
[10] The method according to any one of [5] to [9], further comprising an operation unit, the operation unit is connected to the pressing plate, and the pressing plate can be moved and / or rotated up and down via the operation unit. Equipment.
[11] The device according to [10], further comprising a drive device capable of moving and / or rotating the pressing plate up and down via an operation unit.
[12] A kit for shredding a living body-derived tissue, which comprises the device according to any one of [4] to [11].
[13] The method according to any one of [1] to [3], further comprising the step of recovering live cells from shredded biological tissue.
[14] A step of separating living cells from a living-derived tissue chopped by the method according to any one of [1] to [3] and culturing the separated living cells to prepare a graft. How to make a graft.
[15] A graft produced by the method according to [14].
[16] A method for treating a disease in a subject, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the implant according to [15] to the subject in need thereof.
本発明の生体由来組織を細切するための方法、装置、キット等により、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを同時に行うため、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑え、生体由来組織から細胞を高い生存率で回収可能である。 To simultaneously perform the step of grinding the biological tissue and the step of extruding the ground biological tissue from a plurality of through holes by the method, apparatus, kit, etc. for chopping the biological tissue of the present invention. , It is possible to suppress excessive load such as damage and heat to living cells, and to recover cells from living tissue with high survival rate.
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。 Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications and other publications and information referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
［生体由来組織を細切するための方法］
本発明の一側面は、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを含み、すり潰すステップと押出すステップとが同時になされる、生体由来組織を細切するための方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。同方法は、細切された生体由来組織を回収するステップをさらに含み得る。
本発明において、「生体由来組織」は、生体由来の固体形状の組織を指し、例えば、筋組織、脂肪組織、皮膚組織、軟骨組織、腱組織、靭帯組織、間柔組織、脳組織、循環器系組織、消化器系組織、代謝系組織、リンパ系組織、骨髄組織等であり、好ましくは筋組織である。
[Method for chopping living tissue]
One aspect of the present invention includes a step of grinding a living body-derived tissue and a step of extruding the ground living body-derived tissue from a plurality of through holes, and the step of grinding and the step of pushing out are performed at the same time. It relates to a method for shredding a tissue of origin (hereinafter, may be referred to as "the method of the present invention"). The method may further include the step of recovering the shredded biological tissue.
In the present invention, the "living body-derived tissue" refers to a living-derived solid-shaped tissue, for example, muscle tissue, adipose tissue, skin tissue, cartilage tissue, tendon tissue, ligament tissue, soft tissue, brain tissue, circulatory organ. It is a systematic tissue, a digestive system tissue, a metabolic system tissue, a lymphatic system tissue, a bone marrow tissue, or the like, and is preferably a muscle tissue.
本発明において、生体由来組織は、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。生体由来組織は、生体由来組織から分離した生細胞を移植に用いる場合には、移植対象（レシピエント）自身から採取された生体由来組織を用いて分離された自家細胞を用いることにより、拒絶反応を回避することができる。他方、異種や同種非自己の生体由来組織を用いて分離された異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。 In the present invention, the biological tissue can be derived from any organism. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, rodents (mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.), dogs, cats, pigs, horses, cows, goats, sheep and the like. .. When living cells separated from living tissue are used for transplantation, the biological tissue is rejected by using autologous cells separated from the living tissue collected from the transplant target (recipient) itself. Can be avoided. On the other hand, it is also possible to use heterologous cells or allogeneic non-self-derived cells isolated using a heterologous or allogeneic non-self-derived tissue.
骨格筋組織は、筋線維から構成され、筋線維の実質は形質膜に囲まれた多核化細胞であるが、その前駆細胞である筋衛星細胞および／または骨格筋芽細胞等のＣＤ５６陽性細胞は、筋線維の基底膜と形質膜との間にのみ局在するため、対象の骨格筋組織から、これらのＣＤ５６陽性細胞を分離するためには筋線維の基底膜の結合を緩めつつ、ＣＤ５６陽性細胞を破壊しない程度に骨格筋組織を破砕する必要がある。よって、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑えることができる観点から、本発明において、生体由来組織は骨格筋組織であることがさらに好ましい。 Skeletal muscle tissue is composed of muscle fibers, and the parenchyma of the muscle fibers is a multinucleated cell surrounded by a plasma membrane, but its precursor cells such as muscle satellite cells and / or skeletal myoblasts are CD56-positive cells. Since it is localized only between the basal membrane of muscle fibers and the plasma membrane, in order to separate these CD56-positive cells from the target skeletal muscle tissue, the basal membrane of the muscle fibers is loosened and CD56-positive. It is necessary to crush the skeletal muscle tissue to the extent that it does not destroy the cells. Therefore, in the present invention, the biological tissue is more preferably skeletal muscle tissue from the viewpoint of suppressing the occurrence of excessive load such as damage or heat on living cells.
本発明において、「生細胞」は、生体由来組織から分離された任意の生細胞を指し、例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、筋衛星細胞、幹細胞等であり、好ましくは筋芽細胞である。前記のとおり、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑えることができる観点から、本発明において、生細胞は骨格筋芽細胞であることがさらに好ましい。 In the present invention, "living cell" refers to any living cell isolated from a living tissue, for example, myocardial cell, fibroblast, epithelial cell, endothelial cell, hepatocellular cell, pancreatic cell, renal cell, adrenal cell. , Dental membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells, synovial cells, cartilage cells, myoblasts (for example, skeletal myoblasts), muscle satellite cells, stem cells and the like, preferably myoblasts. As described above, in the present invention, the living cells are more preferably skeletal myoblasts from the viewpoint of suppressing the occurrence of excessive load such as damage and heat on the living cells.
「すり潰す」、「押出す」、「細切する」等の操作は、生理的に許容し得る液体中で行うこともできる。生理的に許容し得る液体は、生体由来組織に含まれる生細胞が生存し得る液体を指し、例えば、タンパク質分解酵素溶液、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９等）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）等である。生理的に許容し得る液体は、混入微生物の増殖を抑制する観点から、抗生物質、抗真菌剤等を含んでもよい。 Operations such as "grinding", "extruding", and "slicing" can also be performed in a physiologically acceptable liquid. Physiologically acceptable liquid refers to a liquid in which living cells contained in living tissue can survive, for example, proteolytic enzyme solution, water, physiological saline, various buffer solutions (for example, PBS, HBSS, etc.). , Various liquid media (for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM / F12, etc.) and the like. .. The physiologically acceptable liquid may contain antibiotics, antifungal agents and the like from the viewpoint of suppressing the growth of contaminating microorganisms.
細切された生体由来組織は、本発明の方法を経ずに得たものと比較して、より高い回収生細胞数およびバイアビリティを特徴とする。回収生細胞数およびバイアビリティは、後述の酵素処理を経た後に、それぞれ１．０×１０３個以上、１．０×１０４個以上、１．０×１０５個以上、１．０×１０６個以上、および、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上となり得る。ある一態様において、生細胞の比率は、後述の酵素処理を経た細胞集団を３回継代した後で、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上となり得る。
回収生細胞数およびバイアビリティは、任意の既知の手法を用いて決定することができる。かかる手法としては、例えば、細胞二重染色法などを用いて回収総細胞数および生細胞数を計数し、かかる生細胞数を総細胞数で除すことが挙げられる。骨格筋芽細胞の比率は、任意の既知の手法を用いて決定することができる。かかる手法としては、例えば、骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞に特異的な抗体で標識し、抗体が結合した陽性細胞数を、計数した総細胞数で除すことが挙げられる。細胞の計数は、特異的抗体で染色した標本の顕微鏡観察、顕微鏡像の画像解析、特異的抗体で染色した細胞集団のフローサイトメトリー解析などによって行うことができる。例えば、生細胞が骨格筋芽細胞の場合、該細胞に特異的なマーカーとしては、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ｍｙｏｇｅｎｉｎなどが挙げられる。生細胞が筋衛星細胞に特異的なマーカーとしては、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ３４、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｍｙｆ５、Ｐａｘ７などが挙げられる。
Shredded bio-derived tissue is characterized by a higher number of viable cells recovered and viability as compared to those obtained without the method of the present invention. The number of viable cells recovered and the viability were 1.0 × 10 3 or more, 1.0 × 10 4 or more, 1.0 × 10 5 or more, and 1.0 × 10, respectively, after undergoing the enzyme treatment described later. It can be 6 or more and 80% or more, 85% or more, 90% or more or 95% or more. In one embodiment, the proportion of live cells is 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% after three passages of the enzyme-treated cell population described below. As mentioned above, it can be 90% or more or 95% or more.
The number of viable cells recovered and viability can be determined using any known technique. As such a method, for example, the total number of recovered cells and the number of viable cells are counted by using a cell double staining method or the like, and the total number of viable cells is divided by the total number of cells. The proportion of skeletal myoblasts can be determined using any known technique. Such a technique includes, for example, labeling with an antibody specific for skeletal myoblasts and / or myosatellite cells, and dividing the number of positive cells to which the antibody is bound by the total number of cells counted. Cell counting can be performed by microscopic observation of a specimen stained with a specific antibody, image analysis of a microscopic image, flow cytometric analysis of a cell population stained with a specific antibody, or the like. For example, when the living cell is a skeletal myoblast, the marker specific to the cell is not limited, for example, CD56, α7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx). ), MyoD, Myf5, myogenin and the like. Markers in which living cells are specific to muscle satellite cells include, but are not limited to, CD56, CD34, Myogenin, Myf5, Pax7 and the like.
本発明において、「貫通孔」は、任意の部材を一方から他方へ貫通している孔を指し、例えば、同部材を鉛直方向に貫通している孔である。貫通孔の断面の形状は、三角形、四角形、多角形、半円、円、楕円等の任意の形状であり得る。貫通孔が円や楕円である場合、貫通孔の直径は、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から効率的に押出して細切にする観点から、２〜６ｍｍであることが好ましく、３〜５ｍｍであることがさらに好ましい。貫通孔の断面積は、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から効率的に押出して細切にする観点から、３〜２９ｍｍ２であることが好ましく、７〜２０ｍｍ２であることがさらに好ましい。 In the present invention, the "through hole" refers to a hole that penetrates an arbitrary member from one to the other, and is, for example, a hole that penetrates the member in the vertical direction. The cross-sectional shape of the through hole can be any shape such as a triangle, a quadrangle, a polygon, a semicircle, a circle, and an ellipse. When the through-hole is a circle or an ellipse, the diameter of the through-hole is preferably 2 to 6 mm from the viewpoint of efficiently extruding the ground biological tissue from a plurality of through-holes into small pieces. It is more preferably 3 to 5 mm. The cross-sectional area of the through-hole is preferably 3 to 29 mm 2 and preferably 7 to 20 mm 2 from the viewpoint of efficiently extruding the ground biological tissue from a plurality of through-holes into small pieces. More preferred.
本発明において、「酵素処理液」は、タンパク質分解酵素を含む溶液を指し、例えば、線維性組織を分解するコラゲナーゼやマトリックスメタロプロテアーゼ、細胞同士の接着や細胞と培養基材との接着を分離するトリプシン、TrypLE Select（ライフテクノロジーズ社）等のタンパク質分解酵素を含む溶液である。酵素処理液は、タンパク質分解酵素を１種以上含んでもよく、例えば、コラゲナーゼとトリプシンの両方を含んでもよい。コラゲナーゼの濃度は、０．０１〜０．２５％（ｗ／ｖ）、トリプシンの濃度は、０．００１〜０．２５％（ｖ／ｖ）であってもよい。具体的には、トリプシンとして、トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）溶液（ライフテクノロジーズ社）を用いることができ、コラゲナーゼとして、コラゲナーゼＡ（ロシュ・アプライドサイエンス社）、Collagenase Lyophilized（Clostridium Histolyticum由来、ライフテクノロジーズ社）、Liberase MNP-S（ロシュ・アプライドサイエンス社）を用いることができる。生体由来組織に含まれるタンパク質の量に対して過剰量のタンパク質分解酵素を用いることが好ましい。例えば、骨格筋組織の重さが１〜２ｇである場合には、コラゲナーゼＡを０．５ｍｇ／Ｌ含むTrypLE Select２０ｍＬを用いることが好ましい。 In the present invention, the "enzyme treatment solution" refers to a solution containing a proteolytic enzyme, for example, collagenase or matrix metalloprotease that decomposes fibrous tissue, adhesion between cells, or adhesion between cells and a culture substrate is separated. A solution containing proteolytic enzymes such as Trypcin and TrypLE Select (Life Technologies). The enzyme treatment solution may contain one or more proteolytic enzymes, and may contain, for example, both collagenase and trypsin. The concentration of collagenase may be 0.01 to 0.25% (w / v), and the concentration of trypsin may be 0.001 to 0.25% (v / v). Specifically, trypsin-EDTA (1 ×) solution (Life Technologies) can be used as trypsin, and collagenase A (Roche Applied Science), Collagenase Lyophilized (Clostridium Histolyticum-derived, Life Technologies) can be used as collagenase. ), Liberase MNP-S (Roche Applied Science) can be used. It is preferable to use an excess amount of proteolytic enzyme with respect to the amount of protein contained in the biological tissue. For example, when the weight of the skeletal muscle tissue is 1 to 2 g, it is preferable to use 20 mL of TrypLE Select containing 0.5 mg / L of collagenase A.
また、酵素処理液は、カルシウムイオンのキレーターであるＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含んでもよい。ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの濃度は、０．０２〜０．１％（ｗ／ｖ）であってもよい。ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡをタンパク質分解酵素に含ませない場合には、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの溶液をタンパク質分解酵素とは別に準備し、生体由来組織を、酵素処理液に投入する前に、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの溶液に例えば浸漬することが好ましい。この場合のＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの濃度も、０．０２〜０．１％（ｗ／ｖ）であってよい。 The enzyme treatment solution may also contain EDTA or EGTA, which are calcium ion chelators. The concentration of EDTA or EGTA may be 0.02-0.1% (w / v). When EDTA or EGTA is not contained in the proteolytic enzyme, a solution of EDTA or EGTA is prepared separately from the proteolytic enzyme, and the biological tissue is added to the solution of EDTA or EGTA before being added to the enzyme treatment solution. For example, it is preferable to soak. The concentration of EDTA or EGTA in this case may also be 0.02 to 0.1% (w / v).
細切した生体由来組織を酵素処理に供してもよい。酵素処理は、細切した生体由来組織を酵素処理液に所定の時間浸漬することにより行うことができる。
酵素処理の処理温度は、使用する酵素の至適温度、失活温度等に依存するが、一般的に３５〜４０℃が好ましい。酵素溶液の体積は、生体由来組織と生細胞との解離を促進する観点から、細切した生体由来組織全体が浸漬する体積であることが好ましく、また、酵素処理中は撹拌することが好ましい。
The shredded biological tissue may be subjected to enzymatic treatment. The enzyme treatment can be performed by immersing the shredded biological tissue in the enzyme treatment solution for a predetermined time.
The treatment temperature of the enzyme treatment depends on the optimum temperature of the enzyme used, the deactivation temperature, etc., but is generally preferably 35 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting dissociation between the living tissue and the living cells, the volume of the enzyme solution is preferably the volume at which the entire chopped living tissue is immersed, and it is preferable to stir during the enzyme treatment.
酵素処理液から生細胞を回収する方法は特に限定されないが、例えば、酵素処理液を静置または遠心分離して得られた沈殿を回収する方法、酵素処理液を静置または遠心分離して得られた上清と沈殿を別々に回収し、沈殿はそのまま回収し、上清はさらに濾過し、濾過上清を遠心分離して得られた沈殿を回収する方法等が挙げられる。また、セルストレーナー等を利用して、未消化の生体由来組織を分離し、これをさらなる酵素処理に供してもよい。 The method for recovering live cells from the enzyme-treated solution is not particularly limited, and for example, a method for recovering a precipitate obtained by allowing the enzyme-treated solution to stand or centrifuge, or obtaining by allowing the enzyme-treated solution to stand or centrifuge. Examples thereof include a method of collecting the obtained supernatant and the precipitate separately, collecting the precipitate as it is, further filtering the supernatant, and centrifuging the filtered supernatant to recover the obtained precipitate. In addition, undigested biological tissue may be separated by using a cell strainer or the like, and this may be subjected to further enzymatic treatment.
回収された生細胞は、さらに培養ステップ、培養した生細胞を継代する継代ステップへ供してよい。生細胞の培養および継代は、既知の任意の方法を用いて行うことができる。かかる方法によって回収された生細胞は、さらに遺伝子を導入する遺伝子導入ステップへ供してもよい。導入する遺伝子は、治療する疾患の治療に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦ等のサイトカインのものであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等のウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法等の既知の任意の方法を用いて行うことができる。 The recovered live cells may be further subjected to a culture step and a subculture step in which the cultured live cells are subcultured. Culturing and subculture of living cells can be performed using any known method. The live cells recovered by such a method may be further subjected to a gene transfer step for introducing a gene. The gene to be introduced is not particularly limited as long as it is useful for the treatment of the disease to be treated, and may be, for example, a cytokine such as HGF. For gene introduction, any known method such as calcium phosphate method, lipofection method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, method using a viral vector such as adenovirus vector or retrovirus vector, or microinjection method can be used. Can be done using.
［生体由来組織を細切するための装置］
本発明の別の側面は、複数の貫通孔を有する押出プレートを備え、生体由来組織を押出プレート上ですり潰すことによって、生体由来組織を細切することができる、生体由来組織を細切するための装置（以下、「本発明の装置」と記す場合がある）に関する。本発明の装置は、押圧プレートをさらに備えてもよく、押圧プレートで生体由来組織を押出プレート上ですり潰すことによって、生体由来組織を細切することができる。本発明の装置は、本発明の方法において使用するためのものであってもよい。
[Device for chopping living tissue]
Another aspect of the present invention is to shred the biological tissue, which comprises an extruded plate having a plurality of through holes, which can be shredded by grinding the biological tissue on the extruded plate. (Hereinafter, it may be referred to as "the device of the present invention"). The device of the present invention may further include a pressing plate, and the biological tissue can be shredded by grinding the biological tissue on the extrusion plate with the pressing plate. The device of the present invention may be for use in the method of the present invention.
本発明において、「押出プレート」は、すり潰された生体由来組織を押出すことができる複数の貫通孔を有する部材を指す。押出プレートは、例えば、複数の貫通孔を有する板状、カップ状等の部材であり得、すり潰された生体由来組織を効率良く押出す観点から、貫通孔を有する板状であることが好ましい。押出プレートの厚みは、すり潰された生体由来組織を効率良く押出す観点から、２〜７ｍｍが好ましく、３〜５ｍｍがさらに好ましい。押出プレートは、すり潰される前の生体由来組織に対する接触面において複数の突起を有してもよい。 In the present invention, the "extruded plate" refers to a member having a plurality of through holes capable of extruding ground biological tissue. The extruded plate can be, for example, a plate-shaped or cup-shaped member having a plurality of through holes, and is preferably a plate-shaped member having through holes from the viewpoint of efficiently extruding the ground biological tissue. .. The thickness of the extruded plate is preferably 2 to 7 mm, more preferably 3 to 5 mm, from the viewpoint of efficiently extruding the ground biological tissue. The extruded plate may have a plurality of protrusions on the contact surface with respect to the biological tissue before being ground.
本発明において、「押圧プレート」は、押出プレート上の生体由来組織を押圧することができる部材を指す。押圧プレートは、例えば、板状、半球状、球状等の部材であり得、すり潰された生体由来組織を効率良く押圧する観点から、板状であることが好ましい。押圧プレートが板状である場合に、押圧プレートの厚みは、生体由来組織を効率良く押圧する観点から、２〜８ｍｍが好ましく、３〜５ｍｍがさらに好ましい。押圧プレートは、すり潰される前の生体由来組織に対する接触面において複数の突起を有してもよい。
特に、本発明において、押出プレートおよび押圧プレートは、生体由来組織を効率良く押圧し、すり潰された生体由来組織を効率良く押出す観点から、いずれも同一直径の円板状であることが好ましい。
In the present invention, the "pressing plate" refers to a member capable of pressing a biological tissue on an extruded plate. The pressing plate can be, for example, a plate-shaped, hemispherical, spherical or the like member, and is preferably plate-shaped from the viewpoint of efficiently pressing the ground biological tissue. When the pressing plate has a plate shape, the thickness of the pressing plate is preferably 2 to 8 mm, more preferably 3 to 5 mm, from the viewpoint of efficiently pressing the biological tissue. The pressing plate may have a plurality of protrusions on the contact surface with respect to the biological tissue before being ground.
In particular, in the present invention, the extrusion plate and the pressing plate are preferably disc-shaped with the same diameter from the viewpoint of efficiently pressing the biological tissue and efficiently extruding the ground biological tissue. ..
従来、骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の分離は、手作業による細切処理および酵素分解処理が主として行なわれてきた。細切作業により筋線維を破壊する作業は、煩雑かつ長時間を要し、また見極めも作業者の勘に依存することから作業者間での回収できるＣＤ５６陽性細胞の数やＣＤ５６陽性細胞の生存率等のばらつきが存在していた。これに対して、押圧プレートによって、押出プレート上の骨格筋組織を均一に効率良くすり潰すことができるため、作業者間での回収できるＣＤ５６陽性細胞の数やＣＤ５６陽性細胞の生存率等のばらつきを解消することができる。さらに、押出プレート上の骨格筋組織を効率良くすり潰すことができるため、作業時間を短縮することも可能であり、総じてＣＤ５６陽性細胞の回収率を向上させることもできる。かかる観点から、押出プレートおよび押圧プレートは、特に骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の高い生存率での回収に有用である。 Conventionally, the separation of CD56-positive cells from skeletal muscle tissue has been mainly performed by manual shredding treatment and enzymatic decomposition treatment. The work of destroying muscle fibers by shredding is complicated and takes a long time, and the determination depends on the intuition of the worker. Therefore, the number of CD56-positive cells that can be recovered and the survival of CD56-positive cells among the workers. There were variations in rates and the like. On the other hand, since the skeletal muscle tissue on the extrusion plate can be uniformly and efficiently ground by the pressing plate, the number of CD56-positive cells that can be recovered and the survival rate of CD56-positive cells vary among workers. Can be resolved. Furthermore, since the skeletal muscle tissue on the extruded plate can be efficiently ground, the working time can be shortened, and the recovery rate of CD56-positive cells can be improved as a whole. From this point of view, extruded plates and pressing plates are particularly useful for recovering CD56-positive cells from skeletal muscle tissue at high viability.
本発明において、「容器」は、押出プレートを内側で固定できるように構成された容器を指し、例えば、内壁に複数の突起等の押出プレートの足場を有する容器である。容器は、押出プレートおよび押圧プレートを備え、生体由来組織を効率良く押圧し、すり潰された生体由来組織を効率良く押出す観点から、好ましくは、有底筒状のものである。また、容器は、容器内の温度を調節できるように構成された容器であってもよい。例えば、容器は、酵素処理液を含む場合に、容器内の温度を調節することにより同酵素処理液の温度を調節することができる。容器内の温度は、酵素反応を促進する場合には、使用する酵素の至適温度に依存するが、一般的に３５〜４０℃が好ましい。容器内の温度は、酵素反応を停止させる場合には、使用する酵素の失活温度に依存するが、一般的に４℃が好ましい。さらに、容器は、容器内の温度の保持、汚染防止等の観点から、蓋が付いてもよい。押出プレートは、容器の内部を押圧部と収容部とに仕切るものであり得る。細切された生体由来組織が細切される前の生体由来組織と混ざり合うのを防ぐ等の観点から、押出プレートは、容器の内部を押圧部と収容部とに密閉して仕切るものであることが好ましい。
本発明において、「押圧部」は、押圧プレートが生体由来組織を押圧する空間を構成する容器の内部の一部を指す。押圧部の容積は、生体由来組織を押圧する観点から、好ましくは２０〜２００ｍＬ、さらに好ましくは４０〜１５０ｍＬである。
In the present invention, the "container" refers to a container configured so that the extrusion plate can be fixed inside, and is, for example, a container having a scaffolding of the extrusion plate such as a plurality of protrusions on the inner wall. The container is provided with an extrusion plate and a pressing plate, and is preferably a bottomed tubular container from the viewpoint of efficiently pressing the biological tissue and efficiently extruding the ground biological tissue. Further, the container may be a container configured so that the temperature inside the container can be adjusted. For example, when the container contains an enzyme-treated solution, the temperature of the enzyme-treated solution can be adjusted by adjusting the temperature inside the container. The temperature inside the container depends on the optimum temperature of the enzyme used when promoting the enzyme reaction, but is generally preferably 35 to 40 ° C. The temperature inside the container depends on the deactivation temperature of the enzyme used when stopping the enzyme reaction, but is generally preferably 4 ° C. Further, the container may be provided with a lid from the viewpoint of maintaining the temperature inside the container, preventing contamination, and the like. The extruded plate may partition the inside of the container into a pressing portion and an accommodating portion. From the viewpoint of preventing the shredded biological tissue from mixing with the biological tissue before being shredded, the extrusion plate seals the inside of the container between the pressing portion and the accommodating portion to partition the container. Is preferable.
In the present invention, the "pressing portion" refers to a part of the inside of the container that constitutes a space in which the pressing plate presses the biological tissue. The volume of the pressing portion is preferably 20 to 200 mL, more preferably 40 to 150 mL, from the viewpoint of pressing the tissue derived from the living body.
本発明において、「収容部」は、細切された生体由来組織を収容する空間を構成する容器の内部の一部を指す。収容部はその全体または一部を着脱可能なものとすることができる。これによって、例えば、生体由来組織をすり潰す間は収容部を容器に連結させ、細切された生体由来組織が収容部の底部に集められた後に、収容部の底部を取り外すことによって、細切された生体由来組織を簡便に回収可能である。収容部の容積は、細切された生体由来組織を収容する観点から、好ましくは１０〜１５０ｍＬ、さらに好ましくは１５〜１００ｍＬである。 In the present invention, the "containment unit" refers to a part of the inside of a container that constitutes a space for accommodating shredded biological tissue. The housing may be removable in whole or in part. Thereby, for example, while grinding the biological tissue, the container is connected to the container, and after the shredded biological tissue is collected at the bottom of the container, the bottom of the container is removed to shred the tissue. It is possible to easily recover the tissue derived from the living body. The volume of the accommodating portion is preferably 10 to 150 mL, more preferably 15 to 100 mL, from the viewpoint of accommodating the shredded biological tissue.
本発明において、「突起」は、生体由来組織がすり潰されるのを促進する形状の部材を指し、例えば、三角形、四角形、多角形、半円、円、楕円等の平面形状や、針状、角錐状、円錐状、立方体状、直方体状、半球状、球状等の立体形状の部材であり得、生体由来組織を効率的にすり潰す観点から、これらの形状で鋭利な先端部を有するものが好ましい。また、生体由来組織を効率的にすり潰す観点から、突起の高さは、好ましくは１〜４ｍｍ、さらに好ましくは２〜３ｍｍである。 In the present invention, the "protrusion" refers to a member having a shape that promotes the grinding of biological tissue, for example, a planar shape such as a triangle, a quadrangle, a polygon, a semicircle, a circle, an ellipse, or a needle shape. It can be a member having a three-dimensional shape such as a pyramid, a cone, a cube, a rectangular parallelepiped, a hemisphere, or a sphere. preferable. Further, from the viewpoint of efficiently grinding the tissue derived from the living body, the height of the protrusion is preferably 1 to 4 mm, more preferably 2 to 3 mm.
本発明において、「操作部」は、押圧プレートを操作するための部材を指し、例えば、押圧プレートに連結されることによって、押圧プレートを上下に移動および／または回転させることができる部材であり、例えば、角錐状、円錐状、立方体状、直方体状等の形状の部材である。押圧プレートを上下に移動させる操作の観点から、操作部は長い辺を有する形状であることが好ましい。容器に蓋が付いている場合には、操作部は蓋を貫通するように配置されてもよく、この場合に、蓋と操作部が摺動する箇所においてパッキンを有してもよい。パッキンは、非金属パッキン、金属と非金属材料を組合せたセミメタリックパッキン、および金属パッキンのいずれも使用することができ、蓋と操作部が摺動する箇所の滑りの観点からシリコンパッキンが好ましい。容器内の温度の保持、汚染防止等の観点から、蓋と操作部はパッキンにより液密に摺動可能であることが好ましい。 In the present invention, the "operating unit" refers to a member for operating the pressing plate, for example, a member capable of moving and / or rotating the pressing plate up and down by being connected to the pressing plate. For example, it is a member having a shape such as a pyramid, a cone, a cube, or a rectangular parallelepiped. From the viewpoint of the operation of moving the pressing plate up and down, the operation portion preferably has a shape having a long side. When the container has a lid, the operation portion may be arranged so as to penetrate the lid, and in this case, a packing may be provided at a position where the lid and the operation portion slide. As the packing, any of non-metal packing, semi-metallic packing in which a metal and a non-metal material are combined, and metal packing can be used, and silicon packing is preferable from the viewpoint of slippage at a place where the lid and the operation portion slide. From the viewpoint of maintaining the temperature inside the container, preventing contamination, and the like, it is preferable that the lid and the operating portion can be slidtable in a liquid-tight manner by means of packing.
本発明において、「駆動装置」は、操作部を動かす装置を指し、例えば、操作部を介して押圧プレートを上下に移動および／または回転させることができる装置である。駆動装置は、例えば、電動モーターを内蔵する装置であってもよい。操作部に連結された駆動装置は、バネ等の弾性体によって押圧プレートの上下操作を調節してもよい。
本発明において、「上下操作」は、押圧プレートを押出プレートに対して近付けまたは遠ざける方向に移動させる操作を指す。上下操作は、押圧プレートを生体由来組織に適切な圧力下で接触させ、生体由来組織を押圧し、押出プレート上ですり潰すために行われる。
In the present invention, the "driving device" refers to a device that moves an operating unit, for example, a device that can move and / or rotate a pressing plate up and down via an operating unit. The drive device may be, for example, a device having a built-in electric motor. The drive device connected to the operation unit may adjust the vertical operation of the pressing plate by an elastic body such as a spring.
In the present invention, the "up and down operation" refers to an operation of moving the pressing plate in a direction toward or away from the extrusion plate. The up-and-down operation is performed to bring the pressing plate into contact with the biological tissue under appropriate pressure to press the biological tissue and grind it on the extrusion plate.
本発明において、「回転操作」は、押圧プレートを時計または半時計周りに回転させる操作を指す。回転操作は、押圧プレートに接触した生体由来組織にせん断応力を生じさせ、生体由来組織を押出プレート上ですり潰すために行われる。回転操作は、生体由来組織を効率的にすり潰す観点から、好ましくは８０〜１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは９０〜１４０ｒｐｍの回転数でなされる。生体由来組織が骨格筋組織の場合には、回転操作は、骨格筋組織を効率的にすり潰す観点から、好ましくは１００〜１４０ｒｐｍ、さらに好ましくは１１０〜１３０ｒｐｍの回転数でなされる。 In the present invention, the "rotation operation" refers to an operation of rotating the pressing plate clockwise or counterclockwise. The rotation operation is performed to generate shear stress in the biological tissue in contact with the pressing plate and grind the biological tissue on the extrusion plate. The rotation operation is preferably performed at a rotation speed of 80 to 150 rpm, more preferably 90 to 140 rpm, from the viewpoint of efficiently grinding the tissue derived from the living body. When the biological tissue is skeletal muscle tissue, the rotation operation is preferably performed at a rotation speed of 100 to 140 rpm, more preferably 110 to 130 rpm from the viewpoint of efficiently grinding the skeletal muscle tissue.
［生体由来組織を細切するためのキット］
本発明の別の側面は、本発明の装置を含む、生体由来組織を細切するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。
本発明において、「キット」は、生体由来組織を細切するための種々の構成要素を含むキットを指し、例えば、生体由来組織を細切するための装置、生理的に許容し得る液体、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、指示書（例えば、使用説明書、本発明の方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）等を含む。本発明のキットは、使い捨て可能であってもよい。
[Kit for chopping living tissue]
Another aspect of the present invention relates to a kit for shredding biological tissue, including the apparatus of the present invention (hereinafter, may be referred to as "kit of the present invention").
In the present invention, the "kit" refers to a kit containing various components for shredding a biological tissue, for example, a device for shredding a biological tissue, a physiologically acceptable liquid, an instrument. Classes (eg, pipettes, droppers, tweezers, etc.), instructions (eg, instructions for use, media on which information about the methods of the invention are recorded, such as flexible discs, CDs, DVDs, Blu-ray discs, memory cards, USB memory sticks, etc. ) Etc. are included. The kit of the present invention may be disposable.
本発明の方法は、細切された生体由来組織から生細胞を回収するステップをさらに含み得る。該ステップは、例えば、細切した生体由来組織の酵素処理およびその後の細胞培養を含む。
酵素処理は、細切した生体由来組織を酵素処理液に所定の時間浸漬することにより行うことができる。酵素処理の処理温度は、使用する酵素の至適温度、失活温度等に依存するが、一般的に３５〜４０℃が好ましい。酵素溶液の体積は、生体由来組織と生細胞との解離を促進する観点から、細切した生体由来組織全体が浸漬する体積であることが好ましく、また、酵素処理中は撹拌することが好ましい。酵素処理液から生細胞を回収する方法は特に限定されないが、例えば、酵素処理液を静置または遠心分離して得られた沈殿を回収する方法、酵素処理液を静置または遠心分離して得られた上清と沈殿を別々に回収し、沈殿はそのまま回収し、上清はさらに濾過し、濾過上清を遠心分離して得られた沈殿を回収する方法等が挙げられる。また、セルストレーナー等を利用して、未消化の生体由来組織を分離し、これをさらなる酵素処理に供してもよい。
細胞培養は、回収された生細胞を培養すること、および任意に培養した生細胞を継代することにより行うことができる。生細胞の培養および継代は、既知の任意の方法を用いて行うことができる。
The method of the present invention may further include the step of recovering live cells from shredded living tissue. The steps include, for example, enzymatic treatment of shredded living tissue and subsequent cell culture.
The enzyme treatment can be performed by immersing the shredded biological tissue in the enzyme treatment solution for a predetermined time. The treatment temperature of the enzyme treatment depends on the optimum temperature of the enzyme used, the deactivation temperature, etc., but is generally preferably 35 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting dissociation between the living tissue and the living cells, the volume of the enzyme solution is preferably the volume at which the entire chopped living tissue is immersed, and it is preferable to stir during the enzyme treatment. The method for recovering live cells from the enzyme-treated solution is not particularly limited, and for example, a method for recovering a precipitate obtained by allowing the enzyme-treated solution to stand or centrifuge, or obtaining by allowing the enzyme-treated solution to stand or centrifuge. Examples thereof include a method of collecting the obtained supernatant and the precipitate separately, collecting the precipitate as it is, further filtering the supernatant, and centrifuging the filtered supernatant to recover the obtained precipitate. In addition, undigested biological tissue may be separated by using a cell strainer or the like, and this may be subjected to further enzymatic treatment.
Cell culture can be performed by culturing the collected live cells and subculturing the arbitrarily cultured live cells. Culturing and subculture of living cells can be performed using any known method.
［移植片の製造方法］
本発明の別の側面は、本発明の方法によって細切された生体由来組織から生細胞を分離し、分離された生細胞を培養して移植片を作製するステップを含む、移植片の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と記す場合がある）に関する。
本発明において、「移植片」は、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に生細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。好ましくは、移植片は、生細胞および生細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールド等）を含まない移植用構造物である。本発明の移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊等が挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。
[Manufacturing method of graft]
Another aspect of the present invention is a method for producing a graft, comprising the step of separating live cells from living tissue shredded by the method of the present invention and culturing the separated live cells to prepare a graft. (Hereinafter, it may be referred to as "the manufacturing method of the present invention").
In the present invention, the "graft" means a structure for transplantation into a living body, and particularly means a structure for transplantation containing living cells as a constituent component. Preferably, the implant is a structure for transplantation that does not contain living cells and structures other than living cell-derived substances (eg, scaffolds, etc.). The implant piece of the present invention is not limited to this, and examples thereof include sheet-like cell cultures, spheroids, cell aggregates, etc., preferably sheet-like cell cultures or spheroids, and more preferably sheet-like cells. It is a culture.
本発明において、「シート状細胞培養物」は、生細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。生細胞同士は、直接（接着分子等の細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、生細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックス等が挙げられる。介在物質は、好ましくは生細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する生細胞に由来するものである。生細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の生細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の生細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層等）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、生細胞が明確な層構造を示すことなく、生細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、生細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。 In the present invention, the "sheet-like cell culture" refers to a sheet-like culture in which living cells are connected to each other to form a sheet. Living cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances. The intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting living cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix. The intervening substance is preferably derived from living cells, particularly from living cells constituting the sheet-like cell culture. Living cells are at least physically (mechanically) linked, but may be more functionally, for example, chemically or electrically linked. The sheet-like cell culture may be composed of one viable cell layer (single layer) or two or more viable cell layers (laminate (multilayer), for example, two layers, three layers. Layers, 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.) may be used. Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one living cell without showing a clear layer structure of the living cell. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, living cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction.
［移植片］
本発明の別の側面は、本発明の製造方法により製造された移植片（以下、「本発明の移植片」と記す場合がある）に関する。
本発明の移植片、特にシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に生細胞を付着させ、シート状細胞培養物等の移植片の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明の移植片は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明の移植片は、好ましくは、移植片を構成する生細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
[Graft]
Another aspect of the present invention relates to a implant produced by the production method of the present invention (hereinafter, may be referred to as "implant of the present invention").
The implants of the invention, especially sheet cell cultures, preferably do not contain scaffolds. Scaffolds may be used in the art to attach live cells on and / or inside the scaffold to maintain the physical integrity of implants such as sheet cell cultures, eg, Films made of polyvinylidene fluoride (PVDF) and the like are known, but the implant of the present invention can maintain its physical integrity even without such a scaffold. In addition, the implant of the present invention preferably comprises only substances derived from living cells constituting the implant, and does not contain any other substances.
［対象における疾患の処置方法］
本発明の別の側面は、本発明の移植片の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象における疾患の処置方法（以下、「本発明の処置方法」と記す場合がある）に関する。
本発明において、「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防等を目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を含むものを指し、例えば、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を含む。
[How to treat the disease in the subject]
Another aspect of the present invention is a method of treating a disease in a subject, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the implant of the present invention to a subject in need thereof (hereinafter referred to as "therapeutic method of the present invention"). In some cases).
In the present invention, "treatment" refers to those comprising all kinds of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at curing, transient remission or prevention of a disease, eg, tissue. Includes medically acceptable interventions for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with an abnormality, regressing or eliminating a lesion, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like.
本発明の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能等を高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分等を、本発明の移植片等と併用することができる。
本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って、本発明の移植片を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞の供給源となる生体由来組織を採取するステップをさらに含んでもよい。例えば、生細胞または骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。例えば、骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞または骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。例えば、骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞または骨格筋芽細胞および／または筋衛星細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
In the treatment method of the present invention, an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of the implant, another active ingredient useful for treating the target disease, etc. are used in combination with the implant of the present invention. be able to.
The treatment method of the present invention may further include the step of producing the implant of the present invention according to the production method of the present invention. The treatment method of the present invention further includes the step of collecting biological tissue that is a source of skeletal myoblasts and / or myosatellite cells for producing the implant from the subject before the step of producing the implant. It may be included. For example, the subject from which tissue from which live cells or skeletal myoblasts and / or muscle satellite cells are sourced is collected is the same individual as the subject to whom the cell culture, composition, or graft is administered. For example, subjects from whom skeletal myoblasts and / or myoblasts or tissues from which skeletal myoblasts and / or muscle satellite cells are sourced are collected receive administration of cell cultures, compositions, implants, or the like. The subject is a separate body of the same species. For example, the subject from which the skeletal myoblast and / or myoblast or the tissue that is the source of the skeletal myoblast and / or the muscle satellite cell is collected is an individual different from the subject to which the graft or the like is administered. ..
本発明において、「治療有効量」は、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）を指し、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、治療有効量は、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタ等の実験動物や疾患モデル動物における試験等により適宜決定することができ、かかる試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、治療有効量決定のための重要な指標となり得る。 In the present invention, the "therapeutically effective amount" is an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, size, weight, number of sheet-shaped cell cultures, etc.). It is an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease. In addition, the therapeutically effective amount is preferably an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration. Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, a disease model animal, or the like, and such a test method is well known to those skilled in the art. In addition, the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining a therapeutically effective amount.
投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用等が挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、細胞培養物、組成物、またはシート状細胞培養物等を対象の組織に縫合糸やステープル等の係止手段により固定してもよい。
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。
Examples of the administration method include intravenous administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intrathecal administration, direct application to tissues, and the like. The frequency of administration is typically once per treatment, but multiple doses can be administered if the desired effect is not obtained. When applied to a tissue, a cell culture, a composition, a sheet-like cell culture, or the like may be fixed to the target tissue by a locking means such as a suture or a staple.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
［第１実施形態］
本発明の第１実施形態において、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを含み、すり潰すステップと押出すステップとが同時になされる、生体由来組織を細切するための方法が提供される。同方法は、細切された生体由来組織を回収するステップをさらに含むこともできる。同方法において、酵素処理液中の生体由来組織をすり潰すこともでき、これにより、酵素処理液中のタンパク質分解酵素の酵素反応によって、生体由来組織と生細胞との解離が促進されるため、効率的に生体由来組織から生細胞を分離することができる。本発明の第１実施形態により、生体由来組織をすり潰すステップと、すり潰された生体由来組織を複数の貫通孔から押出すステップとを同時に行うため、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑え、生体由来組織から細胞を高い生存率で回収可能である。
[First Embodiment]
In the first embodiment of the present invention, the step of grinding the biological tissue and the step of extruding the ground biological tissue from a plurality of through holes are included, and the grinding step and the pushing step are performed at the same time. , A method for shredding biological tissue is provided. The method can further include the step of recovering the shredded biological tissue. In the same method, the biological tissue in the enzyme-treated solution can be ground, and the enzymatic reaction of the proteolytic enzyme in the enzyme-treated solution promotes the dissociation between the biological tissue and the living cells. Live cells can be efficiently separated from living tissue. According to the first embodiment of the present invention, since the step of grinding the biological tissue and the step of extruding the ground biological tissue from a plurality of through holes are simultaneously performed, the living cells are damaged or excessive heat or the like is excessively extruded. It is possible to suppress the occurrence of load and recover cells from living tissue with a high survival rate.
［第２実施形態］
本発明の第２実施形態において、複数の貫通孔を有する押出プレートを備え、生体由来組織を押出プレート上ですり潰すことによって、生体由来組織を細切することができる、生体由来組織を細切するための装置が提供される。同装置は、細切された生体由来組織を回収する回収部をさらに含むこともできる。同装置は、酵素処理液中の生体由来組織をすり潰すこともでき、これにより、酵素処理液中のタンパク質分解酵素の酵素反応によって、生体由来組織と生細胞との解離が促進されるため、効率的に生体由来組織から生細胞を分離することができる。本発明の第２実施形態により、生体由来組織がすり潰されるのと同時に、すり潰された生体由来組織が複数の貫通孔から押出されるため、生細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑え、生体由来組織から細胞を高い生存率で回収可能である。
[Second Embodiment]
In the second embodiment of the present invention, the living-derived tissue can be shredded by providing an extruded plate having a plurality of through holes and grinding the living-derived tissue on the extruded plate. Equipment for doing so is provided. The device can also further include a recovery unit that collects shredded biological tissue. The device can also grind the biological tissue in the enzyme-treated solution, which promotes the dissociation between the biological tissue and the living cells by the enzymatic reaction of the proteolytic enzyme in the enzyme-treated solution. Live cells can be efficiently separated from living tissue. According to the second embodiment of the present invention, at the same time that the biological tissue is ground, the ground biological tissue is extruded from a plurality of through holes, so that the living cells are subjected to excessive load such as damage and heat. It is possible to suppress the occurrence and recover cells from living tissue with a high survival rate.
［第３実施形態］
本発明の第３実施形態について以下に説明する。図１Ａ〜Ｃは、本発明の第３実施形態に係る装置１を示す概念図である。なお、本願における各図において、説明を容易とするため、各部材の大きさは、適宜強調されており、図示の各部材は、実際の大きさを示すものではない。
図１Ａに示すとおり、装置１は貫通孔４を有する押出プレート３を内側で固定できる容器２を備える。押出プレート３は、容器２の内部を押圧部５と収容部６とに仕切る。収容部６の一部は、着脱部位７において容器２に着脱可能である。押出プレート３上で生体由来組織８をすり潰すことにより、すり潰された生体由来組織８は押出プレート３の貫通孔４から押出され、細切されて収容部６中に収容される。収容された細切は、収容部６の一部を着脱部位７において容器２から取り外すことによって容易に回収できる。
また、図１Ｂに示すとおり、容器２中に酵素処理液９を加え、酵素処理液９中の生体由来組織８をすり潰すこともできる。これにより、酵素処理液９中のタンパク質分解酵素の酵素反応によって、生体由来組織と生細胞との解離が促進されるため、効率的に生体由来組織から生細胞を分離することができる。
[Third Embodiment]
A third embodiment of the present invention will be described below. 1A to 1C are conceptual diagrams showing the
As shown in FIG. 1A, the
Further, as shown in FIG. 1B, the enzyme-treated
また、図１Ｃに示すとおり、押圧プレート１０を用いて、生体由来組織８を押出プレート３上ですり潰すこともできる。押圧プレート１０が操作部１１と連結されることにより、操作部１１を介して押圧プレート１０を上下に移動および／または回転させることができる。これにより、押圧プレート１０を押出プレート３上の生体由来組織８に適切な圧力下で接触させ、生体由来組織８を押圧し、均一に効率良くすり潰すことができる。また、操作部１１を駆動装置と連結させて、操作部１１を介して押圧プレート１０を上下に移動および／または回転させることもできる。さらに、押圧プレート１０および／または押出プレート３のすり潰される前の生体由来組織に対する接触面において複数の突起を設けることにより、生体由来組織８をすり潰す効率を向上させることもできる。
さらに、図１Ａ〜Ｃの装置１を、上下逆転させることもできる。ただし、この場合、押圧は下から上になされ、すり潰された生体由来組織は、下から上に押出される。また、操作部１１を駆動装置と連結させて、操作部１１を介して押圧プレート１０を上下に移動および／または回転させることもできる。
Further, as shown in FIG. 1C, the
Further, the
［本発明の骨格筋組織への適用］
本発明の第１〜３実施形態は、骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の高い生存率での回収に特に有用である。骨格筋組織は、筋線維から構成され、筋線維の実質は形質膜に囲まれた多核化細胞であるが、その前駆細胞である筋衛星細胞および／または骨格筋芽細胞等のＣＤ５６陽性細胞は、筋線維の基底膜と形質膜との間にのみ局在するため、対象の骨格筋組織から、これらのＣＤ５６陽性細胞を分離するためには筋線維の基底膜の結合を緩めつつ、ＣＤ５６陽性細胞を破壊しない程度に骨格筋組織を破砕する必要がある。これに対して、本発明の第１〜３実施形態は、骨格筋組織をすり潰すステップと、すり潰された骨格筋組織を複数の貫通孔から押出すステップとを同時に行うため、ＣＤ５６陽性細胞に損傷や熱等の過度の負荷が生じることを抑え、骨格筋組織からＣＤ５６陽性細胞を高い生存率で回収可能である。
[Application of the present invention to skeletal muscle tissue]
The first to third embodiments of the present invention are particularly useful for recovering CD56-positive cells from skeletal muscle tissue at a high survival rate. Skeletal muscle tissue is composed of muscle fibers, and the parenchyma of the muscle fibers is a multinucleated cell surrounded by a plasma membrane, but its precursor cells such as muscle satellite cells and / or skeletal myoblasts are CD56-positive cells. Since it is localized only between the basal membrane of muscle fibers and the plasma membrane, in order to separate these CD56-positive cells from the target skeletal muscle tissue, the basal membrane of the muscle fibers is loosened and CD56-positive. It is necessary to crush the skeletal muscle tissue to the extent that it does not destroy the cells. On the other hand, in the first to third embodiments of the present invention, since the step of grinding the skeletal muscle tissue and the step of extruding the ground skeletal muscle tissue from a plurality of through holes are performed at the same time, CD56-positive cells It is possible to recover CD56-positive cells from skeletal muscle tissue with a high survival rate by suppressing the occurrence of excessive load such as damage and heat.
本発明の第３実施形態は、骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の高い生存率での回収にさらなる利点をもたらす。従来、骨格筋組織からのＣＤ５６陽性細胞の分離は、手作業による細切処理および酵素分解処理が主として行なわれてきた。細切作業により筋線維を破壊する作業は、煩雑かつ長時間を要し、また見極めも作業者の勘に依存することから作業者間での回収できるＣＤ５６陽性細胞の数やＣＤ５６陽性細胞の生存率等のばらつきが存在していた。これに対して、本発明の第３実施形態は、押圧プレートを押出プレート上の骨格筋組織に適切な圧力下で接触させ、生体由来組織を押圧し、均一に効率良くすり潰すことができるため、作業者間での回収できるＣＤ５６陽性細胞の数やＣＤ５６陽性細胞の生存率等のばらつきを解消することができる。さらに、押出プレート上の骨格筋組織を効率良くすり潰すことができるため、作業時間を短縮することも可能であり、総じてＣＤ５６陽性細胞の回収率を向上させることもできる。 A third embodiment of the present invention brings additional advantages to the high viability recovery of CD56 positive cells from skeletal muscle tissue. Conventionally, the separation of CD56-positive cells from skeletal muscle tissue has been mainly performed by manual shredding treatment and enzymatic decomposition treatment. The work of destroying muscle fibers by shredding is complicated and takes a long time, and the determination depends on the intuition of the worker. Therefore, the number of CD56-positive cells that can be recovered and the survival of CD56-positive cells among the workers. There were variations in rates and the like. On the other hand, in the third embodiment of the present invention, the pressing plate can be brought into contact with the skeletal muscle tissue on the extrusion plate under appropriate pressure to press the biological tissue and grind it uniformly and efficiently. It is possible to eliminate variations in the number of CD56-positive cells that can be recovered and the survival rate of CD56-positive cells among workers. Furthermore, since the skeletal muscle tissue on the extruded plate can be efficiently ground, the working time can be shortened, and the recovery rate of CD56-positive cells can be improved as a whole.
以上、本発明を図示の実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の第１〜３実施形態における各構成は、自由に組み合わせることができる。
本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。
Although the present invention has been described above with reference to the illustrated embodiment, the present invention is not limited thereto. Each configuration in the first to third embodiments of the present invention can be freely combined.
In the present invention, each configuration can be replaced with any configuration capable of exerting the same function, or any configuration can be added.
例１．骨格筋組織からの生細胞の回収
上記の本発明の第１実施形態を骨格筋組織へ適用した。骨格筋組織をすり潰すステップと、すり潰された骨格筋組織を複数の貫通孔から押出すステップとを同時に行うことにより、以下に記す比較例による方法と比較して、本発明の第１実施形態は、より効率的に生細胞を回収することが可能であった。
骨格筋組織はブタ下肢より採取したものを洗浄して用いた。具体的には、ブタ下肢の骨格筋から約３ｇの組織を採取し、組織輸送液（ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solution、ライフテクノロジーズ社）中、ブドウ糖注（テルモ社）１．６ｍｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン（富士製薬工業社）０．１ｍｇ／ｍＬ、ファンギゾン（ライフテクノロジーズ社）２．５μｇ／ｍＬ）に浸漬し、洗浄した。
本発明の第１実施形態の骨格筋組織への適用に際し、骨格筋組織を細切するステップ後の酵素処理ステップおよび培養ステップについては比較例の下記（２）および（３）と同様に行った。
Example 1. Recovery of Live Cells from Skeletal Muscle Tissue The first embodiment of the present invention described above was applied to skeletal muscle tissue. By simultaneously performing the step of grinding the skeletal muscle tissue and the step of extruding the ground skeletal muscle tissue from a plurality of through holes, the first embodiment of the present invention is compared with the method according to the comparative example described below. The morphology made it possible to recover live cells more efficiently.
The skeletal muscle tissue collected from the lower limbs of the pig was washed and used. Specifically, about 3 g of tissue was collected from the skeletal muscle of the lower limbs of pigs, and in a tissue transport solution (HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution, Life Technologies)), glucose injection (Termo) 1.6 mg / mL, gentamicin. (Fuji Pharma Co., Ltd.) 0.1 mg / mL, Fungizone (Life Technologies) 2.5 μg / mL) was immersed and washed.
In applying the first embodiment of the present invention to skeletal muscle tissue, the enzyme treatment step and the culture step after the step of chopping the skeletal muscle tissue were carried out in the same manner as in the following (2) and (3) of the comparative example. ..
［比較例］
通常の細胞用破砕装置であるgentleMACSを使用して上記骨格筋組織を破砕し、生細胞を回収した。
（１）gentleMACSにより破砕するステップ
上記骨格筋組織をメスで５ｍｍ角に切断した後、１０ｍＬの酵素消化液とともにgentleMACS C Tubes（Miltenyi Biotec K.K、Order no: 130-093-237）へ投入し、これをgentleMACS Octo Dissociator（Miltenyi Biotec K.K、Order no: 130-093-237）へ供し、骨格筋組織を破砕した。gentleMACS Octo Dissociatorでの破砕条件は下記の条件１および２で行なった。
・条件１：（１）３分、＋６０ｒｐｍ、（２）９分、−３０ｒｐｍ、（３）５分、＋／−３０ｒｐｍ×６回、（４）１２分、−３０ｒｐｍ
・条件２：（１）３０秒、＋１０００ｒｐｍ、（２）１０秒、−１０００ｒｐｍ、２０秒、＋１０００ｒｐｍ
（なお、刃の向きに対して「＋」は順回転、「−」は逆回転を示す）
[Comparison example]
The skeletal muscle tissue was crushed using a normal cell crusher, gentleMACS, and live cells were collected.
(1) Step of crushing with gentleMACS After cutting the above skeletal muscle tissue into 5 mm squares with a scalpel, it is put into gentleMACS C Tubes (Miltenyi Biotec KK, Order no: 130-093-237) together with 10 mL of enzyme digestive juice. Was sent to the gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec KK, Order no: 130-093-237) to crush the skeletal muscle tissue. The crushing conditions in the gentleMACS Octo Dissociator were the following
-Condition 1: (1) 3 minutes, +60 rpm, (2) 9 minutes, -30 rpm, (3) 5 minutes, +/- 30 rpm x 6 times, (4) 12 minutes, -30 rpm
-Condition 2: (1) 30 seconds, +1000 rpm, (2) 10 seconds, -1000 rpm, 20 seconds, +1000 rpm
(Note that "+" indicates forward rotation and "-" indicates reverse rotation with respect to the direction of the blade.)
（２）酵素処理ステップ
上記（１）で得た骨格筋組織処理物にそれぞれ酵素消化液を添加して３７℃で酵素反応を行った。反応終了後、酵素消化物をコニカルチューブで攪拌した後、静置し、セルストレーナー（BD Falcon（商標）セルストレーナー、４０μｍ、日本ＢＤ社）を新たなコニカルチューブにセットし、回収した上清を濾過して回収した。セルストレーナーを初代増殖用培地でリンスし、コニカルチューブに回収した。回収した濾液を遠心処理し沈殿した細胞に初代増殖用培地を添加して懸濁して、培養フラスコ（底面積１７５ｃｍ２）に播種した。
（３）培養ステップ
酵素処理ステップから回収した細胞を培養フラスコ（底面積１７５ｃｍ２）に移し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２条件下で培養した。培養後、細胞を回収し、細胞数を計数した。
(2) Enzyme treatment step Enzyme digestive juice was added to each of the skeletal muscle tissue treated products obtained in (1) above, and an enzyme reaction was carried out at 37 ° C. After completion of the reaction, the enzyme digested product was stirred with a conical tube and then allowed to stand, a cell strainer (BD Falcon (trademark) cell strainer, 40 μm, Nippon BD Co., Ltd.) was set in a new conical tube, and the collected supernatant was prepared. It was filtered and collected. The cell strainer was rinsed with primary growth medium and collected in a conical tube. The collected filtrate was centrifuged, and the cells precipitated were added with a medium for primary growth, suspended, and seeded in a culture flask (bottom area 175 cm 2).
(3) Culture step The cells collected from the enzyme treatment step were transferred to a culture flask (bottom area 175 cm 2 ) and cultured under 37 ° C. and 5% (v / v) CO 2 conditions. After culturing, cells were collected and the number of cells was counted.
１ 装置
２ 容器
３ 押出プレート
４ 貫通孔
５ 押圧部
６ 収容部
７ 着脱部位
８ 生体由来組織
９ 酵素処理液
１０ 押圧プレート
１１ 操作部
1
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