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JP2020534788A - アデノ随伴ウイルスカプシド変異体及びその使用方法 - Google Patents

アデノ随伴ウイルスカプシド変異体及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、変異カプシドタンパク質を有する組換え型アデノ随伴ウイルスビリオンを提供し、ここで、かかる組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、対照ＡＡＶと比較して、神経細胞障壁を通過する高い能力、神経幹細胞への高い感染力、神経細胞への高い感染力、及び抗体による中和に対する低い感受性のうち１つ以上を示し、かつ、異種核酸を含む。本開示は、個体の神経幹細胞または神経細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。本開示は、神経幹細胞内または神経細胞内に存在する標的核酸を修飾する方法も提供する。【選択図】なし

Description

相互参照
本願は、その出願が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５５１，１３３号の利益を主張するものである。
緒言
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科ディペンドウイルス属に属し、この属のメンバーは、複製を促進するためにアデノウイルスのようなヘルパーウイルスとの重複感染を必要とし、ヘルパーが存在しない場合、ＡＡＶは潜伏感染状態となる。ビリオンは、２５ｎｍの正二十面体のカプシドで構成され、カプシドは、２つのオープンリーディングフレーム、ｒｅｐ及びｃａｐを有する４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを包含する。非構造ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に不可欠な４つの調節タンパク質をコードし、ｃａｐは、集合して６０−ｍｅｒカプシド殻を構成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ３）をコードする。このウイルスカプシドは、ＡＡＶベクターがウイルス形質導入の生物学的障壁の多くを克服する能力、例えば、細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内輸送、及び核内での脱殻などを仲介する。
当該技術分野には、細胞障壁を通過する高い能力を付与する変異カプシドタンパク質及び／または神経幹細胞を感染させる高い能力を付与する変異カプシドタンパク質及び／または神経細胞を感染させる高い能力を付与する変異カプシドタンパク質を有するＡＡＶビリオンに対するニーズがある。
概要
本開示は、変異カプシドタンパク質を有する組換え型アデノ随伴ウイルスビリオンを提供し、ここで、かかる組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、対照ＡＡＶと比較して、神経細胞障壁を通過する高い能力、神経幹細胞への高い感染力、神経細胞への高い感染力、及び抗体による中和に対する低い感受性のうち１つ以上を示し、かつ、異種核酸を含む。本開示は、個体の神経幹細胞または神経細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。本開示は、神経幹細胞内または神経細胞内に存在する標的核酸を修飾する方法も提供する。
図１Ａ〜Ｆは、最短経路問題としての組換え（ＲＡＳＰＰ）方法適用後の、ＳＣＨＥＭＡに基づくキメラアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ライブラリー設計を提供する。 構成体の設計及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子増幅に使用されたプライマー配列を提供する。 ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶライブラリーのコンビナトリアルゴールデンゲートアセンブリ用に各配列ブロックを増幅させるために、ｊ５ ＤＮＡアセンブリで設計されたプライマー配列を提供する。 図３−１の続きの図である。 図３−２の続きの図である。 ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶライブラリーのコンビナトリアルゴールデンゲートクローニングのためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応を提供する。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター骨格へのコンビナトリアルゴールデンゲートクローニングを促進するため、ブロック接合部にサイレント変異を組み込むよう設計されたプライマーを提供する。 図６Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ指向進化のＣｒｅ依存的選択法を提供する。 リコンビナーゼ欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳｕｒｅ２における細菌プラスミド増殖中の組換えレベルを示す。 ＳＣＨ９カプシドのアミノ酸配列を提供する。 ＳＣＨ２カプシドのアミノ酸配列を提供する。 ＳＣＨ９及びＳＣＨ２のＡＡＶ ｃａｐアミノ酸配列と親ＡＡＶ血清型とのアミノ酸のアラインメントを提供する。ＳＣＨ９のアミノ酸配列：配列番号１；ＳＣＨ２のアミノ酸配列：配列番号２；ＡＡＶ２のカプシドのアミノ酸配列：配列番号１３６；ＡＡＶ６のカプシドのアミノ酸配列：配列番号１１；ＡＡＶ８のカプシドのアミノ酸配列：配列番号１３７；ＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列：配列番号１３８。 図１０−１の続きの図である。 図１０−２の続きの図である。 図１０−３の続きの図である。 図１１Ａ、Ｂは、ＳＣＨ９のカプシドの３次元モデルを提供する。 組換え型自己相補的ＡＡＶベクターのウイルスゲノムの収量を示す。 図１３Ａ〜Ｉは、脳室下帯（ＳＶＺ）の神経幹細胞の形質導入に対するＳＣＨ９の効果を示す。 図１４Ａ〜Ｃは、小脳のプルキンエ細胞におけるＳＣＨ９形質導入のマーカー発現を示す。 組換え型ＡＡＶ１またはＳＣＨ９を深部小脳核へ片側注入後３週間目の小脳でのＧＦＰ発現を示す。 図１６Ａ〜Ｃは、ＳＣＨ９のグリカン結合及び中和抗体耐性の特性解析を示す。 ＡＡＶＲを利用することが既知である対照ＡＡＶ２と比較した場合のＳＣＨ２及びＳＣＨ９の感染力を示す。 図１８Ａ〜Ｆは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチド及び変異体のアミノ酸配列を提供する。 図１８Ａに記載の通り。 図１８Ａに記載の通り。 図１８Ａに記載の通り。 図１８Ａに記載の通り。 図１８Ａに記載の通り。 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。 図２０Ａ〜Ｃは、さまざまなＣｐｆ１ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。 図２０Ａに記載の通り。 図２０Ａに記載の通り。 図２１Ａ〜Ｃは、ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。挿入部位は太字で示され、下線が引かれている。 図２1Ａに記載の通り。 図２1Ａに記載の通り。
定義
本明細書で使用する場合、用語「神経幹細胞」（ＮＳＣ）とは、増殖、自己複製をすることができ、脳の主要な成体神経細胞に分化することができる未分化の神経細胞を指す。ＮＳＣには、自己維持（自己複製）する能力があり、すなわち、各細胞分裂で１つの娘細胞もまた幹細胞となることを意味する。幹細胞ではないＮＳＣ子孫は神経前駆細胞と呼ばれる。１つの多能性ＮＳＣから発生した神経前駆細胞は、ニューロン、アストロサイト（Ｉ型及びＩＩ型）、及びオリゴデンドロサイトに分化する能力がある。したがって、ＮＳＣは、その子孫が神経細胞としての複数の運命を持っているため「多能性」である。このことから、ＮＳＣは、機能上、１）増殖する能力、２）自己複製する能力、及び３）中枢神経系に見られる３つの主要な細胞型、すなわち、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化することができる機能的子孫を産生する能力を有する細胞として定義され得る。ＮＳＣは一般に、成熟ニューロン、成熟グリア細胞、成熟オリゴデンドロサイト、及び成熟アストロサイトのマーカーに対して陰性である。
本明細書で使用する場合、用語「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」または「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」とは、神経細胞（例えば、神経前駆体または成熟ニューロン）、グリア前駆細胞、成熟アストロサイト、または成熟オリゴデンドロサイトなどの子孫を産生することができる細胞を指す。典型的に、細胞は、神経系の特徴である表現型マーカーのいくつかを発現する。「神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」または「神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」とは、成熟ニューロンである子孫を産生することができる細胞である。これらの細胞もまた、グリア細胞産生能力を有する場合と有さない場合がある。
本明細書で使用する場合、「神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ）」は「神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）」と同じ意味で使用され、中枢神経系または末梢神経系のニューロン及びグリアを指す。用語「神経細胞」には、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びシュワン細胞などの細胞が含まれる。かかる用語には、任意の脳組織（例えば、脳組織、例えば、大脳半球、大脳皮質、皮質下運動皮質、線条体、内包、視床、視床下部、海馬、中脳、脳幹、及び小脳など）の神経細胞が含まれる。成熟ニューロンは、成熟ニューロンのマーカーの１つ以上を発現することができ、そのようなマーカーには、例えば、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ１、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロン特異的核タンパク質（ＮｅｕＮ）、ニューロフィラメント（ＮＦ）、Ｓ１００β、タウ、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、タウ、ダブルコルチン（ＤＣＸ）等が含まれる。
「ＡＡＶ」とは、アデノ随伴ウイルスに対する略語であり、ウイルスそれ自身またはその誘導体を指すために使用してよい。かかる用語は、特に定めのない限り、すべてのサブタイプならびに天然に生じる型及び組換え型の両方を包含する。略語「ｒＡＡＶ」とは、組換え型アデノ随伴ウイルスを指し、組換え型ＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。用語「ＡＡＶ」には、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ−１０）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」とは、霊長類から単離されたＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」とは、非霊長類の哺乳類から単離されたＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」とは、ウシである哺乳類（例えば、雌ウシ）から単離されたＡＡＶ等を指す。
本明細書で使用する場合、「ｒＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶポリヌクレオチドとは異種のもの）、典型的には、標的細胞内に導入するための目的配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を隣接させる。用語ｒＡＡＶベクターには、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミドの両方が包含される。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的に、野生型ＡＡＶのすべてのカプシドタンパク質によるもの）及びカプシドに包まれたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達されるべき導入遺伝子など）を含む場合、その粒子は典型的に「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ベクターはｒＡＡＶ粒子内に含有されるものであることから、ｒＡＡＶ粒子の作製には必然的にそのようなｒＡＡＶベクターの作製が含まれる。
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子のアセンブリ及びカプシド形成を生じさせる一連の細胞内事象を指す。
ＡＡＶの「ｒｅｐ」遺伝子及び「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐを本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ぶ。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製及びパッケージングされるようにするウイルスを指す。ＡＡＶのそのような多種多様なヘルパーウイルスは当該技術分野で公知であり、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアなどのポックスウイルスが含まれる。アデノウイルスには多数の異なるサブグループが包含されるが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類及びトリを起源とする多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から利用可能である。ヘルペスウイルス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン−バーウイスル（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもＡＴＣＣなどの寄託機関から利用可能である。
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」とは、ＡＡＶの複製及びパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスゲノムでコードされる機能（複数可）（複製及びパッケージングのための本明細書に記載の他要件と併用）を指す。本明細書に記載のように、「ヘルパーウイルス機能」は多数の方法で提供されてよく、それには、ヘルパーウイルスの提供によるもの、または、例えば、必要機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列をプロデューサー細胞にトランスで提供することによるものがある。
「感染性」のウイルスまたはウイルス粒子とは、ポリヌクレオチド成分を含むものであり、そのウイルス種が指向性である細胞内への送達能があるものである。かかる用語は必ずしもウイルスの複製能を意味するものではない。本明細書で使用する場合、「感染性」のウイルスまたはウイルス粒子は、標的細胞にアクセスすることができ、標的細胞を感染させることができ、標的細胞に異種核酸を発現させることができるものである。したがって、「感染力」とは、ウイルス粒子が標的細胞にアクセスし、標的細胞を感染させ、標的細胞に異種核酸を発現させる能力を指す。感染力とは、インビトロでの感染力またはインビボでの感染力のいずれも指し得る。感染性ウイルス粒子の計数アッセイは、本開示の他の箇所及び当該技術分野で記載がある。ウイルス感染力は、総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比として表すことができる。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノム（ｖｇ）のコピー数として表すことができる。ウイルス粒子が細胞に異種核酸を発現させる能力は、「形質導入」と呼ばれ得る。ウイルス粒子が細胞に異種核酸を発現させる能力は多数の技術を使用してアッセイすることができ、それらには、マーカー遺伝子評価、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（例えば、ウイルスが、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む場合）という、ウイルス粒子に感染させた細胞でＧＦＰを産生させ、それを検出及び／または測定するアッセイのような評価、または産生されたタンパク質の、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定が含まれる。ウイルス感染力は、総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比として表すことができる。総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比を求める方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（感染価測定法ＴＣＩＤ５０を記載）、及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照のこと。
「複製能を有する」ウイルス（例えば、複製能を有するＡＡＶ）とは、感染性であり、かつ、感染細胞内で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもできる、表現型が野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能には一般に、機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般に、本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子が欠失していることから、哺乳類細胞（特にヒトの細胞）における複製能がない。典型的に、そのようなｒＡＡＶベクターでは、複製能を有するＡＡＶが、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入来ｒＡＡＶベクター間の組換えによって発生する可能性を最小限に抑えるために、いかなるＡＡＶパッケージング遺伝子配列も欠いている。一般に、本明細書に記載するｒＡＡＶベクター調製物は、複製能を有するＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも呼ばれる）をほとんど含有しないものである（例えば、ｒＡＡＶ粒子１０２あたりｒｃＡＡＶが約１未満、ｒＡＡＶ粒子１０４あたりｒｃＡＡＶが約１未満、ｒＡＡＶ粒子１０８あたりｒｃＡＡＶが約１未満、ｒＡＡＶ粒子１０１２あたりｒｃＡＡＶが約１未満、またはｒｃＡＡＶ不含）。
用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの任意の長さの高分子形態を指し、これには、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体が含まれる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含んでよく、また非ヌクレオチド成分によって中断されていてよい。修飾が存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーアセンブリの前または後のいずれで付与してもよい。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子と同じ意味を指す。特に明記または定めのない限り、本明細書に記載する本発明のいかなる実施形態も、それがポリヌクレオチドである場合、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２本の相補的一本鎖形態各々の両方が包含される。
あるポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定の割合の「配列同一性」を有するとは、整列させた場合、その２つの配列を比較したときに、その特定の割合の塩基またはアミノ酸が同一であることを意味する。配列類似性は多数の異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するためには、ワールドワイドウェブでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／にて利用可能なＢＬＡＳＴなど、各種方法及びコンピュータプログラムを使用して配列を整列させることができる。別のアラインメントアルゴリズムはＦＡＳＴＡといい、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で利用可能である。アラインメントの他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。特に興味深いのは、配列内のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおいてギャップが許容されるアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照のこと。
興味深いのは、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））を使用して配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティは一般に１〜５、通常は２〜４の範囲、場合によっては３となる。ギャップ伸長ペナルティは一般に約０．０１〜０．２０の範囲となり、多くの場合０．１０となる。プログラムには、比較対象として入力された配列により決定されるデフォルトのパラメータが備わっている。好ましくは、プログラムにより決定されたデフォルトのパラメータを使用して配列同一性を決定する。このプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）からも利用可能である。
興味深い別のプログラムはＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに記載されている。以下のパラメータに基づくＦａｓｔＤＢで配列同一性パーセントを計算する。
ミスマッチペナルティ：１．００、
ギャップペナルティ：１．００、
ギャップサイズペナルティ：０．３３、
ジョイニングペナルティ：３０．０。
「遺伝子」とは、転写、翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができるオープンリーディングフレームを、少なくとも１つ含有しているポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する場合、用語「ガイドＲＮＡ」とは、ｉ）ガイドＲＮＡが配向するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなどのクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）に結合して、そのＲＮＡ配向エンドヌクレアーゼを活性化させる、「アクチベーター」ヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む「ターゲター（ｔａｒｇｅｔｅｒ）」ヌクレオチド配列とを含むＲＮＡを指す。「アクチベーター」ヌクレオチド配列及び「ターゲター」ヌクレオチド配列は、別々のＲＮＡ分子（例えば、「二重ガイドＲＮＡ」）上、または同一ＲＮＡ分子（「シングルガイドＲＮＡ」）上のいずれにあってもよい。
「低分子干渉」ＲＮＡまたは「短鎖干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的遺伝子（「標的遺伝子」）に指向される、ヌクレオチドからなるＲＮＡ二重鎖である。「ＲＮＡ二重鎖」とは、１つのＲＮＡ分子の２領域間で相補的に対形成されることにより形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは遺伝子に「指向」され、そこでは、かかるｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列は、指向標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的となっている。場合によっては、ｓｉＲＮＡ二重鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。場合によっては、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０のヌクレオチド長であり得る。場合によっては、二重鎖の長さは１９〜２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分はヘアピン構造の一部であり得る。ヘアピン構造は、二重鎖部分に加えて、二重鎖を形成する２配列間に位置するループ部分を含有してよい。ループは長さが異なり得る。場合によっては、ループは５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３のヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’または５’の突出末端部分を含有することもできる。場合によっては、突出末端は３’または５’の０、１、２、３、４もしくは５ヌクレオチド長の突出末端である。
本明細書で使用する場合、用語「マイクロＲＮＡ」とは、任意の種類の干渉ＲＮＡを指し、これには内因性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これに限定されるものではない。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的使用を調節することができる、ゲノムにおいて天然でコードされる小さなＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列であってよく、ｍＲＮＡの活性を調節することができる。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列のいずれか１つ以上で構成されるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列は、刊行物、例えば、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１−１００８、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０，Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８−８６１、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７、及びＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９，１７５−１７９などに記載されている。マイクロＲＮＡの例には、より大きいＲＮＡの断片もしくはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、または他の小さな非コードＲＮＡである、任意のＲＮＡが含まれる。例えば、米国特許出願第２００５０２７２９２３号、第２００５０２６６５５２号、第２００５０１４２５８１号、及び第２００５００７５４９２号を参照のこと。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）とは、中にマイクロＲＮＡ配列が組み込まれているステムループ構造をした核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）には、マイクロＲＮＡ前駆体（「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」）から切り出されたかまたは合成された（例えば、無細胞合成による実験室での合成）マイクロＲＮＡが含まれ、長さは約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドであり、例えば、成熟マイクロＲＮＡは、長さが１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔであり得る。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合して、その標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
「組換え」とは、ポリヌクレオチドに使用する場合、そのポリヌクレオチドは、クローニング、制限またはライゲーションステップ、及び自然界に見られるポリヌクレオチドとは異なる構成体をもたらす他の手順をさまざまなに組み合わせて得られた産物であることを意味する。組換え型ウイルスとは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。かかる用語それぞれには、元のポリヌクレオチド構成体を複製したもの、及び元のウイルス構成体の子孫が含まれる。
「制御因子」または「制御配列」とは、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解など、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子相互作用に関与するヌクレオチド配列である。かかる調節は、その過程の頻度、速度、または特異性に影響を与え得、増強性または抑制性のいずれでもあり得る。当該技術分野で公知の制御因子には、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの転写制御配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下、ＲＮＡポリメラーゼと結合して、通常プロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、遺伝因子の並置を指し、ここで、かかる因子は、予測される様態でそれらが機能できるような関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写開始を助ける場合、そのプロモーターはコード領域に機能的に連結されている。この機能的関係が維持されるのであれば、プロモーターとコード領域の間に介在残基があってよい。
「発現ベクター」とは、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図する標的細胞におけるタンパク質の発現を実施するために使用される。発現ベクターは、コード領域に機能的に連結された、標的でのタンパク質発現を促進する制御因子も含む。制御因子と、発現のためにそれらが機能的に連結されている遺伝子（複数可）との組み合わせは「発現カセット」と呼ばれる場合があり、それらの多くは当該技術分野で公知かつ利用可能であるか、または当該技術分野で利用可能な構成成分から容易に構築可能である。
「異種の」とは、遺伝子型が、比較対象実体の他の部分の遺伝子型とは異なる遺伝子型に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。本来の天然コード配列から除去され、天然では連結が見られないコード配列に対して機能的に連結されているプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、通常は天然に生じる野生型ＡＡＶには含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、そのコードされた異種遺伝子産物は、通常は天然に生じる野生型ＡＡＶによりコードされない遺伝子産物である。別の例として、カプシドタンパク質のＧＨループに挿入された異種ペプチドを含む変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、通常は天然に生じる野生型ＡＡＶには含まれないペプチドの挿入が含まれている変異ＡＡＶカプシドタンパク質である。
用語「遺伝子変化」及び「遺伝子改変」（及びその文法的変形）は本明細書では同じ意味で使用され、遺伝因子（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入される過程を指す。因子は、細胞にとって異種のものであっても、またはさらなるコピーであるかもしくは細胞にすでに存在する因子の改善型であってもよい。遺伝子変化は、例えば、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿などによって組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトするか、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることによって実施してよい。遺伝子変化は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスまたはウイルスベクターを用いた形質導入または感染によって実施してもよい。一般に、遺伝因子は細胞の染色体またはミニ染色体内に導入されるが、細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型が変わる変化は、いずれもこの用語に含まれる。
遺伝子配列を用いて細胞が「安定に」変化させられた、形質導入された、遺伝子改変された、または形質転換されたというのは、インビトロでその細胞を長期培養した際に、かかる配列がその機能を実施するために利用可能な場合である。一般に、遺伝子変化が導入されたそのような細胞は「遺伝的に」変化させられ（遺伝子改変され）ており、変化した細胞の子孫にも遺伝性である。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書では同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。かかる用語は、改変されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識成分との複合体化などをも包含する。遺伝子産物を哺乳類の対象に送達するという観点で考察する場合、血管新生阻害ポリペプチド、神経保護ポリペプチド等のようなポリペプチド、及びそのための組成物とは、それぞれの無傷ポリペプチド、またはその任意の断片もしくは遺伝子操作による誘導体であって、その無傷タンパク質の所望の生化学的機能を保持しているものを指す。同様に、血管新生阻害ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳類対象への遺伝子産物（レシピエント細胞に送達されるべき「導入遺伝子」と呼ばれ得る）の送達で使用するための他のそのような核酸への言及には、無傷ポリペプチドまたは所望の生化学的機能を有する任意の断片もしくは遺伝子操作による誘導体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質とは、その物質または類似物質が天然に生じるかまたはそれを元に最初に調製する場合に存在し得る他の構成成分のうち、少なくともいくつかを欠いている物質の調製物を指す。したがって、例えば、精製技術を使用して、供給源混合物から濃縮させることにより単離物質を調製してよい。濃縮は、溶液の体積あたりの質量のような絶対測定に基づくか、または元の混合物中に存在する第２の強力な妨害物質との関係で測定を行う、いずれの測定も可能である。本発明の実施形態の濃縮物が多いほど、より一層単離される。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、場合によっては精製され、例えば、約８０％〜約９０％純粋であり、少なくとも約９０％純粋であり、少なくとも約９５％純粋であり、少なくとも約９８％純粋であるか、もしくは少なくとも約９９％、またはそれ以上純粋である。
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」等は本明細書では一般に、所望の薬理作用及び／または生理学的作用を得ることを指すために使用する。作用は、疾患またはその症状（複数可）を完全もしくは部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／または、疾患及び／またはかかる疾患に起因する有害作用に対する部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であってよい。用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、哺乳類、特にヒトの疾患の任意の治療を包含し、それには、（ａ）疾患または症状（複数可）にかかりやすい可能性はあるが、まだそのように診断されていない対象において、かかる疾患及び／または症状（複数可）の発現を予防すること、（ｂ）疾患及び／または症状（複数可）を阻害すること、すなわち疾患及び／または関連症状の発症を停止させること、または（ｃ）疾患及び関連症状（複数可）を軽減すること、すなわち疾患及び／または症状（複数可）を退縮させることが含まれる。治療を必要とする対象には、すでに苦しんでいる対象（例えば、神経性障害のある対象）ならびに予防が所望される対象（例えば、神経性障害に対する感受性が高い対象、神経性障害であることが疑われる対象、神経性障害の危険因子を１つ以上有する対象等）が含まれ得る。
用語「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は本明細書では同じ意味で使用され、診断、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）が所望される任意の哺乳類の対象、例えば、ヒトを指す。治療を目的とする場合の「哺乳類」とは、哺乳類に分類されている任意の動物を指し、これには、ヒト、飼育用及び家畜用動物、ならびに動物園用、競技用、またはペット用動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ等が含まれる。場合によっては、哺乳類はヒトである。
「治療的有効量」または「有効な量」とは、疾患の治療のために哺乳類または他の対象に投与した場合に、かかる疾患のそのような治療をもたらすために、別の薬剤との併用または単独で１つ以上の用量で十分である化合物の量を意味する。「治療的有効量」は、化合物、疾患及びその重症度ならびに治療すべき対象の年齢、体重等に応じて異なる。
用語「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」は本明細書では同じ意味で使用されて哺乳類を指し、これには、サル及びヒトなどのヒト及び非ヒト霊長類、哺乳類の競技用動物（例えば、ウマ、ラクダなど）、哺乳類の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシなど）、哺乳類のペット（イヌ、ネコなど）、及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット等）が挙げられるが、これに限定されるものではない。場合によっては、個体はヒトである。
本発明を詳述する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、そのような実施形態は当然ながら異なり得ることを理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、あくまで個々の実施形態の記載のみを目的とするものであり、限定することを意図しないということも理解されるべきである。
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限の間に介在する値のそれぞれ（文脈で特に明確な指示がない限り、下限の１０分の１の単位まで）、及びその記述された範囲において記述されているか介在している任意の他の値は、本発明に包含されるものと理解される。これらの小範囲の上限及び下限は、その記述された範囲内に独立して含まれてよく、また、その記述された範囲で具体的に除外された任意の限界値に従って本発明に包含される。記述されている範囲に限界値のうち一方または両方が含まれる場合、その含まれた限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
特に明記しないかぎり、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。本発明の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料も使用することができるが、ここにその好ましい方法及び材料を記載する。本明細書で言及される刊行物はすべて、方法及び／または材料を、引用されている刊行物と関連させて開示及び記載するために参照することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「神経幹細胞」への言及には、そのような細胞の複数が含まれ、「ｒＡＡＶ」への言及には、当業者に公知の１つ以上のｒＡＡＶ及びその同等物への言及が含まれるということになる。請求項は、いかなる任意選択の要素も除外するよう起案されてよいことにさらに留意されたい。したがって、本記述は、「唯一」、「のみ」等のような限定的用語を請求項要素の詳述との関連で使用すること、または「否定的」限定を使用することに対し前提となる根拠として使用されることが意図される。
分かりやすくするために別々の実施形態で記載されている本発明の特定の特徴は、それらの特徴を合せて単一の実施形態で提供してもよいことが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態で記載されている本発明のさまざまな特徴は、別々に、または適切な任意の部分的組み合わせで提供してもよい。本発明に関連する実施形態の組み合わせはすべて明確に本発明に包含され、それらは、ありとあらゆる組み合わせが個々別々に明示的に開示されているかの如く本明細書に開示される。さらに、さまざまな実施形態及びその要素のあらゆる部分的組み合わせもまた明確に本発明に包含され、それらは、ありとあらゆる、そのような部分的組み合わせが個々別々に明示的に本明細書に開示されているかの如く本明細書に開示される。
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみを目的として提供されている。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。さらに、提示される刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、実際の刊行日を個別に確認する必要がある可能性がある。
詳細な説明
本開示は、変異カプシドタンパク質を有する組換え型アデノ随伴ウイルスビリオンを提供し、ここで、かかる組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、対照ＡＡＶと比較して、神経細胞障壁を通過する高い能力、神経幹細胞への高い感染力、神経細胞への高い感染力、及び抗体による中和に対する低い感受性のうち１つ以上を示し、かつ、異種核酸を含む。本開示は、個体の神経幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。本開示は、神経幹細胞内または神経細胞内に存在する標的核酸を修飾する方法も提供する。本開示はさらに、神経疾患を治療する方法を提供する。
変異カプシドポリペプチドを有する組換え型ＡＡＶビリオン
本開示は、（ｉ）本開示の変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非ＡＡＶポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む感染性ｒＡＡＶビリオンを提供する。場合によっては、変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する少なくとも５つのセグメントを含み、ここで、各セグメントは長さが約５０アミノ酸〜約１６０アミノ酸である。変異カプシドタンパク質は、以下の特性のうち１つ以上を付与する：（ｉ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞または神経前駆細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオンと比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、神経幹細胞または神経前駆細胞への感染力が高い、（ｉｉ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる神経細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオンと比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、神経細胞への感染力が高い、（ｉｉｉ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが細胞障壁を通過する能力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオンが細胞障壁を通過する能力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、細胞障壁を通過する能力が高い、（ｉｖ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンにより示される耐性と比較して、または野生型ＡＡＶビリオンと比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、ヒトＡＡＶ中和抗体に対する耐性が高い。
対照ＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むことができる。対照ＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドを含む、例えば、野生型カプシドのみを含む（および本開示のいかなる変異ＡＡＶカプシドも含まない）ＡＡＶビリオンであり得る。例えば、対照ＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ２カプシドを含むことができる。別の例として、対照ＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ６カプシドを含むことができる。別の例として、対照ＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ９カプシドを含むことができる。
神経幹細胞または神経前駆細胞への高い感染力
本開示は、変異カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンを提供し、かかるｒＡＡＶビリオンは、変異カプシドタンパク質を含まない対照親ＡＡＶが神経幹細胞（ＮＳＣ）または神経前駆細胞を感染させる能力と比較して、または野生型ＡＡＶがＮＳＣまたは神経前駆細胞を感染させる能力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンがＮＳＣまたは神経前駆細胞を感染させる能力と比較して、ＮＳＣまたは神経前駆細胞への高い感染力を示し、かつ、かかるｒＡＡＶビリオンは異種核酸を含む。
場合によっては、ＮＳＣは脳室下帯（ＳＶＺ）ＮＳＣである。ＳＶＺは、上衣細胞層に沿って位置し、この上衣細胞により脳室腔とＳＶＺが隔てられている。ＳＶＺのＮＳＣは一過性増殖前駆細胞を生じさせることができ、この細胞は数回分裂してから神経芽細胞となる。場合によっては、ＮＳＣは、海馬の歯状回内の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）にある。顆粒細胞層内側と歯状回門に挟まれた境界にあるＳＧＺの放射状グリア様ＮＳＣ（ＲＧＬ）は中間前駆細胞（ＩＰＣ）を生じさせるが、この前駆細胞は、神経芽細胞を生み出すまでの増殖回数が限られている。神経前駆細胞（ＮＰＣ）には、一過性増殖細胞、ＲＧＬ、ＩＰＣ、及び神経芽細胞が含まれる。場合によっては、ＮＳＣは、海馬由来であるかまたは海馬に存在する。場合によっては、ＮＳＣは発達中の神経系に存在し、例えば、ＮＳＣは胚に存在する。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのＮＳＣへの感染力と比較して、変異カプシドポリペプチドを含まないＡＡＶビリオンのＮＳＣへの感染力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオン（野生型ＡＡＶカプシドを含む）のＮＳＣへの感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンのＮＳＣへの感染力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＮＳＣへの感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかもしくは野生型ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオン、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンを頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、もしくは静脈内注射によって投与した場合のＮＳＣへの感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＮＳＣへの感染力を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンのＮＰＣへの感染力と比較して、変異カプシドポリペプチドを含まないＡＡＶビリオンのＮＰＣへの感染力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオン（野生型ＡＡＶカプシドを含む）のＮＰＣへの感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンのＮＰＣへの感染力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＮＰＣへの感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンの神経芽細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い神経芽細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかもしくは野生型ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンの神経芽細胞への感染力と比較して、または頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合の野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い神経芽細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの一過性増殖細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い一過性増殖細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの一過性増殖細胞への感染力と比較して、または同一投与経路によって野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンを投与した場合の一過性増殖細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い一過性増殖細胞への感染力を示す。
所与のｒＡＡＶビリオンがＮＳＣまたはＮＰＣへの高い感染力を示すかどうかはインビトロでもインビボでも決定することができる。例えば、所与のｒＡＡＶビリオンがＮＳＣへの高い感染力を示すかどうかは、ＮＳＣをインビトロでｒＡＡＶビリオンと接触させ、ｒＡＡＶビリオンによりコードされる異種遺伝子産物のＮＳＣでの発現を検出することによって決定することができる。異種遺伝子産物により検出可能シグナルを得ることができ、ＮＳＣにおけるその検出可能シグナルレベルから、所与のｒＡＡＶビリオンがＮＳＣへの高い感染力を示すか否かに関する指標を得ることができる。
場合によっては、ａ）以下に記載のように、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の少なくとも５つのセグメントを含む本開示の変異カプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、個体に投与した場合、ａ）対照ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶカプシド）と、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む対照ｒＡＡＶビリオンを個体に投与した場合に生じる神経幹細胞での遺伝子産物レベルより大きい、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上というレベルの異種遺伝子産物を神経幹細胞にもたらす。投与は、多数の経路を介した、例えば、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射を介した投与であり得る。
所与のｒＡＡＶビリオンがＮＳＣへの高い感染力を示すかどうかは、ＮＳＣにおいてｒＡＡＶビリオンによりコードされる治療用遺伝子産物の治療効果を評価することによって決定することができる。治療効果には、例えば、ａ）神経発生の亢進、ｂ）神経性の疾患または障害の症状の改善等が含まれ得る。例えば、ａ）本開示の変異カプシドと、ｂ）異種の治療用遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、個体に投与した場合（例えば、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射を介して）、ａ）対照ＡＡＶカプシド（例えば、野生型ＡＡＶカプシド）と、ｂ）異種の治療用遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む対照ｒＡＡＶビリオンを同一投与経路で投与した場合に生じる治療用遺伝子産物の治療効果より大きい、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の治療効果を神経幹細胞にもたらす。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのＮＳＣへの感染力と比較して、または野生型ＡＡＶビリオン（野生型ＡＡＶカプシドポリペプチドを含む）によるＮＳＣへの感染力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＮＳＣへの感染力を示す。
神経細胞への高い感染力
上記のように、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンに存在する変異カプシドポリペプチドは、変異カプシドタンパク質を含まない対照親ＡＡＶまたは野生型ＡＡＶが神経細胞を感染させる能力と比較して、高い神経細胞への感染力をｒＡＡＶビリオンに付与する。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる神経細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むＡＡＶビリオンによる神経細胞への感染力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い神経細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路によって投与した場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの神経細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶによる神経細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い神経細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、大脳半球、大脳皮質、皮質下運動皮質、線条体、内包、視床、視床下部、海馬、中脳、脳幹、または小脳の神経細胞への感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる同一組織の神経細胞への感染力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むＡＡＶビリオンによる神経細胞への感染力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いことを示す。
一例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるプルキンエ細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いプルキンエ細胞への感染力を示す。
一例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるプルキンエ細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いプルキンエ細胞への感染力を示す。
一例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＧＡＢＡ作動性細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＧＡＢＡ作動性細胞への感染力を示す。
一例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＧＡＢＡ作動性細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いＧＡＢＡ作動性細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるグリア細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いグリア細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した場合の、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるグリア細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いグリア細胞への感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのアストロサイトへの感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いアストロサイトへの感染力を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンを頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合のアストロサイトへの感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いアストロサイトへの感染力を示す。
所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すかどうかは、インビトロでもインビボでも決定することができる。例えば、所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すかどうかは、神経細胞をインビトロでｒＡＡＶビリオンと接触させ、ｒＡＡＶビリオンによりコードされる異種遺伝子産物の神経細胞での発現を検出することによって決定することができる。異種遺伝子産物により検出可能シグナルを得ることができ、神経細胞におけるその検出可能シグナルレベルから、所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すか否かに関する指標を得ることができる。
所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すかどうかは、個体へのｒＡＡＶビリオンの投与の後、ｒＡＡＶビリオンによりコードされる異種遺伝子産物の神経細胞での発現を検出することによって決定することができる。所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すかどうかは、ｒＡＡＶビリオンの頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与の後、ｒＡＡＶビリオンによりコードされる異種遺伝子産物の神経細胞での発現を検出することによって決定することができる。例えば、ａ）上記のように、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の少なくとも５つのセグメントを含む本開示の変異カプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、投与した場合、ａ）対照ＡＡＶカプシドまたは野生型ＡＡＶカプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む対照ｒＡＡＶビリオンを、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合に生じる神経細胞での遺伝子産物レベルより大きい、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上というレベルの異種遺伝子産物を神経細胞にもたらす。
所与のｒＡＡＶビリオンが神経細胞への高い感染力を示すかどうかは、神経細胞においてｒＡＡＶビリオンによりコードされる治療用遺伝子産物の治療効果を評価することによって決定することができる。治療効果には、例えば、（ａ）神経細胞機能の亢進、（ｂ）神経性の疾患または障害の症状の改善等が含まれ得る。例えば、（ａ）上記のように、ペプチド挿入またはペプチド置換を含む本開示の変異カプシドと、（ｂ）異種の治療用遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、（ａ）ペプチド挿入またはペプチド置換を含まない対照ＡＡＶカプシドと、（ｂ）異種の治療用遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む対照ｒＡＡＶビリオンを同一投与経路で投与した場合に生じる、治療用遺伝子産物の神経細胞での治療効果より大きい、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の治療効果を神経細胞にもたらす。
細胞障壁の通過
本開示は、変異カプシドタンパク質を有する組換え型アデノ随伴ウイルスビリオンを提供し、かかるｒＡＡＶビリオンは、細胞障壁、すなわち生理的障壁を通過する高い能力を示す。例えば、細胞障壁は、神経幹細胞が含まれない第１のコンパートメントと、神経幹細胞が含まれる第２のコンパートメントとの間にある細胞の層を含むことができる。そのような障壁には、例えば、側脳室の表面を覆う上衣細胞層、低細胞性層、アストロサイト細胞体層、血液脳関門、及び移行帯層が含まれる。したがって、本開示は、変異カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンを提供し、かかるｒＡＡＶビリオンは、上衣細胞層、低細胞性層、アストロサイト細胞体層、及び移行帯層の１つ以上を通過する能力が、変異カプシドタンパク質を含まない対照ＡＡＶの層通過能力と比較して、または野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶの能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いことを示し、かつ、かかるｒＡＡＶビリオンは、異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンが、側脳室の表面を覆う上衣細胞層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い上衣細胞層通過能を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンが血液脳関門を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い血液脳関門通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが上衣細胞層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い上衣細胞層通過能を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンが低細胞性細胞層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い低細胞性層通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが低細胞性層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い低細胞性層通過能を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンがアストロサイト細胞体層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いアストロサイト細胞体層通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンがアストロサイト細胞体層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いアストロサイト細胞体層通過能を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンが移行帯層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い移行帯層通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが移行帯層を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い移行帯層通過能を示す。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドを含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ｒＡＡＶビリオンが脳実質を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い脳実質通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射によって投与した場合、同一投与経路で投与した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが脳実質を通過する能力と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い脳実質通過能を示す。
場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与で注入した場合、同一投与経路で注入した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが上衣層を越えて局在する程度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い、上衣層を越えた局在を示す。
例えば、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与で注入した場合、同一投与経路で注入した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが低細胞性層に局在する程度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い低細胞性層への局在を示す。
別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与で注入した場合、同一投与経路で注入した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンがアストロサイト細胞体層に局在する程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高いアストロサイト細胞体層への局在を示す。
別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与で注入した場合、同一投与経路で注入した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが移行帯層に局在する程度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い移行帯層への局在を示す。
別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、または静脈内投与で注入した場合、同一投与経路で注入した際に、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが脳実質に局在する程度と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上高い脳実質への局在を示す。
中和抗体による中和に対する感受性の低下
上記のように、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶに対する中和抗体の結合と比較して、中和抗体への結合低下を示す。
中和抗体への結合低下は都合がよい。中和抗体は野生型カプシドタンパク質に結合する。中和抗体と野生型カプシドタンパク質が結合すると、ウイルス粒子内に野生型カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンの滞留時間の制限、細胞表面へのウイルス結合の妨害、ウイルスの凝集、カプシドの構造変化の誘導、ならびにウイルスの分解及び脱殻（ＤＮＡ放出に必要な段階）の妨害など、いくつかの影響を及ぼし得る。したがって、中和抗体への結合が低下しているｒＡＡＶ粒子は、細胞を感染させる能力が高く、ｒＡＡＶビリオンを用いた投与を受けた個体の体内での滞留時間が長い。そのため、遺伝子産物送達の有効持続時間が長くなる。
ある場合には、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶ（「ｗｔ ＡＡＶ」）または野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶと比較して、中和抗体に対する高い耐性を示す。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、中和抗体に対する耐性がｗｔ ＡＡＶよりも約１．５倍〜約１０倍、１０，０００倍高く、例えば、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、中和抗体に対する耐性がｗｔ ＡＡＶよりも約１．５倍〜約２倍、約２倍〜約２．５倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約５倍、約５倍〜約６倍、約６倍〜約７倍、約７倍〜約８倍、約８倍〜約９倍、または約９倍〜約１０倍高い。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、中和抗体に対する耐性がｗｔ ＡＡＶよりも約１０倍〜約１０，０００倍高く、例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンは、中和抗体に対する耐性が野生型ＡＡＶまたは野生型カプシドタンパク質を含むＡＡＶよりも約１０倍〜約２５倍、約２５倍〜約５０倍、約５０倍〜約７５倍、約７５倍〜約１００倍、約１００倍〜約１５０倍、約１５０倍〜約２００倍、約２００倍〜約２５０倍、約２５０倍〜約３００倍、少なくとも約３５０倍、少なくとも約４００倍、約４００倍〜約４５０倍、約４５０倍〜約５００倍、約５００倍〜約５５０倍、約５５０倍〜約６００倍、約６００倍〜約７００倍、約７００倍〜約８００倍、約８００倍〜約９００倍、約９００倍〜約１０００倍、約１，０００倍〜約２，０００倍、約２，０００倍〜約３，０００倍、約３，０００倍〜約４，０００倍、約４，０００倍〜約５，０００倍、約５，０００倍〜約６，０００倍、約６，０００倍〜約７，０００倍、約７，０００倍〜約８，０００倍、約８，０００倍〜約９，０００倍、または約９，０００倍〜約１０，０００倍高い。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と結合する中和抗体への結合低下を示す。例えば、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と結合する中和抗体に対し約１０倍〜約１０，０００倍の結合減少を示す。例えば、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対する抗体の結合親和性と比較して、野生型カプシドＡＡＶタンパク質と結合する中和抗体に対する約１０倍〜約２５倍、約２５倍〜約５０倍、約５０倍〜約７５倍、約７５倍〜約１００倍、約１００倍〜約１５０倍、約１５０倍〜約２００倍、約２００倍〜約２５０倍、約２５０倍〜約３００倍、少なくとも約３５０倍、少なくとも約４００倍、約４００倍〜約４５０倍、約４５０倍〜約５００倍、約５００倍〜約５５０倍、約５５０倍〜約６００倍、約６００倍〜約７００倍、約７００倍〜約８００倍、約８００倍〜約９００倍、約９００倍〜約１０００倍、約１，０００倍〜約２，０００倍、約２，０００倍〜約３，０００倍、約３，０００倍〜約４，０００倍、約４，０００倍〜約５，０００倍、約５，０００倍〜約６，０００倍、約６，０００倍〜約７，０００倍、約７，０００倍〜約８，０００倍、約８，０００倍〜約９，０００倍、または約９，０００倍〜約１０，０００倍の結合減少（例えば、親和性低下）を示す。
場合によっては、抗ＡＡＶ中和抗体は、本開示のｒＡＡＶビリオンに結合し、親和性が約１０−７Ｍ未満、約５×１０−６Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満、約５×１０−５Ｍ未満、約１０−５Ｍ未満、約１０−４Ｍ未満、またはそれより低い。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶと比較して長い生体内滞留時間を示す。例えば、場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶの滞留時間よりも長い、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、またはそれ以上である滞留時間を示す。
本開示の所与のｒＡＡＶが中和抗体に対する結合減少を示すか否かは、親和性決定に使用される多種多様ないずれの標準的結合アッセイを使用しても決定することができる。
選択的感染力
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは神経細胞を選択的に感染させ、例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンは、神経細胞を、非神経細胞よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上特異的に感染させる。
場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは神経幹細胞を選択的に感染させ、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、神経幹細胞を、非神経幹細胞、例えば、間葉幹細胞、造血幹細胞等よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上特異的に感染させる。
変異カプシドポリペプチド
上記のように、本開示のｒＡＡＶビリオンは変異ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンに存在する変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する少なくとも５つのセグメントを含み、各セグメントは、長さが約５０アミノ酸〜約１６０アミノ酸である。
本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来するセグメントを含む。例えば、場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、及び第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメントを含む。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６であり、第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、及び第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメントを含む。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６であり、第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８であり、第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ６のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１〜アミノ酸１６０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第１のセグメント、ｉｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１〜アミノ酸１６０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第２のセグメント、ｉｉｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ８のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第３のセグメント、ｉｖ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第４のセグメント、ｖ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第５のセグメントを含む。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ６のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１〜アミノ酸１６０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第１のセグメント、ｉｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１〜アミノ酸１６０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第２のセグメント、ｉｉｉ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ８のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第３のセグメント、ｉｖ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ９のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第４のセグメント、ｖ）約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長であり、かつ、図１０に示すＡＡＶ２のカプシドのアミノ酸配列のうちアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸の連続アミノ酸領域に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む、第５のセグメントを含む。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型の約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型の約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメント、第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第６のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第７のセグメント、及び第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第８のセグメントを含む。場合によっては、第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６であり、第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８であり、第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図１０に示すＳＣＨ９アミノ酸配列に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、変異カプシドタンパク質は、図１０に示すＳＣＨ９アミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメント、第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第６のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第７のセグメント、及び第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第８のセグメントを含む。場合によっては、第１の血清型はＡＡＶ６であり、第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８であり、第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図１０に示すＳＣＨ２アミノ酸配列に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、変異カプシドタンパク質は、図１０に示すＳＣＨ２アミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。
場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図８に示すＳＣＨ９アミノ酸配列に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図９に示すＳＣＨ２アミノ酸配列に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる変異
場合によっては、本開示の変異カプシドポリペプチドは、１つ以上のさらなる変異（例えば、アミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の欠失）を含む。
例えば、場合によっては、本開示の変異カプシドポリペプチドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対し、カプシドタンパク質ＧＨループに約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５アミノ酸〜７アミノ酸、７アミノ酸〜１０アミノ酸、１０アミノ酸〜１５アミノ酸、または１５アミノ酸〜２０アミノ酸）の挿入を含む。挿入部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ内、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒接近可能部分内であり得る。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９；Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照のこと。
場合によっては、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対し、長さが約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５アミノ酸〜７アミノ酸、７アミノ酸〜１０アミノ酸、１０アミノ酸〜１２アミノ酸、１２アミノ酸〜１５アミノ酸、または１５アミノ酸〜２０アミノ酸）である異種ペプチドを、カプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ内の挿入部位に挿入する。例えば、挿入部位は、図２１Ａ〜２１Ｃに示すような、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸４１１〜アミノ酸６５０内であっても、または本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質の対応する領域であっても可能である。図２１Ａ〜２１Ｃにアミノ酸配列が示されているので、当業者は本開示の変異カプシド内の適切な挿入部位を容易に決定することができる。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８の間、またはＡＡＶ２のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置、または本開示の変異ＡＡＶカプシドのカプシドサブユニットの対応する位置であり得る。挿入部位５８７／５８８は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質に基づくものであることに留意すべきである。長さが５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５アミノ酸〜７アミノ酸、７アミノ酸〜１０アミノ酸、１０アミノ酸〜１２アミノ酸、１２アミノ酸〜１５アミノ酸、または１５アミノ酸〜２０アミノ酸）である異種ペプチドは、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）の対応する部位、または本開示の変異ＡＡＶカプシドのカプシドサブユニットの対応する位置に挿入することができる。当業者であれば、さまざまなＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質アミノ酸配列の比較に基づいて、任意の所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質、または本開示の変異ＡＡＶカプシドのカプシドサブユニットの対応する位置にある「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７〜アミノ酸５８８に相当する」であろう挿入部位が分かるであろう。例えば、ＡＡＶ１の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７、またＡＡＶｒｈ１０の場合はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０８を参照のこと。例えば、祖先ＡＡＶカプシドについてはＳａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：９３４を参照のこと。
場合によっては、本開示の変異カプシドポリペプチドは、
Figure 2020534788
から選択されるアミノ酸配列を含む挿入を含む。
場合によっては、本開示の変異カプシドポリペプチドは、
Figure 2020534788
から選択されるアミノ酸配列を含む挿入を含む。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＶＭＲＳＴＮＳＧＬＮ（配列番号１５３）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号１５４）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＳＰＹＳＧＳＳＤＧＬＳ（配列番号１５５）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号１５６）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号１５７）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号１５８）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＭＨＶＴＭＭＡＧＬＮ（配列番号１５９）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１６０）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＶＶＳＴＱＡＧＩＧＬＳ（配列番号１６１）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号１６２）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号１６３）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号１６４）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号１６６）である。場合によっては、ペプチド挿入はＮＧＡＶＡＤＹＴＲＧＬＳＰＡＴＧＴ（配列番号１６７）である。場合によっては、ペプチド挿入はＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号１６８）である。場合によっては、ペプチド挿入はＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号１６９）である。場合によっては、ペプチド挿入はＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号１７０）である。場合によっては、ペプチド挿入はＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号１７１）である。場合によっては、ペプチド挿入はＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号１７２）である。
場合によっては、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５とアミノ酸５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９とアミノ酸５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間である。
別の例として、場合によっては、本開示の変異カプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較するとアミノ酸置換を含んでいる。アミノ酸置換（複数可）は、カプシド内の溶媒接近可能部位、例えば、溶媒接近可能ループに位置させることができる。例えば、アミノ酸置換（複数可）は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループに位置させることができる。場合によっては、変異カプシドタンパク質は、ＡＡＶ６カプシド（配列番号１１）のアミノ酸配列、またはＡＡＶ６以外の血清型の対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸４５１及び／またはアミノ酸５３２におけるアミノ酸置換を含む。場合によっては、変異カプシドタンパク質は、ＡＡＶ６カプシド（配列番号１１）のアミノ酸配列、またはＡＡＶ６以外の血清型の対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸３１９及び／またはアミノ酸４５１及び／またはアミノ酸５３２及び／またはアミノ酸６４２におけるアミノ酸置換を含む。場合によっては、変異カプシドタンパク質は、ＡＡＶ６カプシド（配列番号１１）のアミノ酸配列と比較して、次の置換Ｉ３１９Ｖ、Ｎ４５１Ｄ、Ｄ５３２Ｎ、及びＨ６４２Ｎの１つ以上を含む。
異種遺伝子産物
上記のように、本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物（１つ以上の異種遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。場合によっては、遺伝子産物はポリペプチドである。場合によっては、遺伝子産物はＲＮＡである。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がＲＮＡである場合、場合によっては、ＲＮＡ遺伝子産物はポリペプチドをコードする。遺伝子産物がＲＮＡである場合、場合によっては、ＲＮＡ遺伝子産物はポリペプチドをコードしない。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、単一の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一異種核酸を含む。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一異種核酸を含む。単一異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、場合によっては、かかる２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は同一プロモーターに機能的に連結される。単一異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、場合によっては、かかる２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は２つの異なるプロモーターに機能的に連結される。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一異種核酸を含む。単一異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、場合によっては、かかる３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は同一プロモーターに機能的に連結される。単一異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、場合によっては、かかる３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は２つまたは３つの異なるプロモーターに機能的に連結される。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、各々が異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む２つの異種核酸を含む。
場合によっては、遺伝子産物はポリペプチドをコードするＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物は干渉ＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。場合によっては、遺伝子産物はアプタマーである。場合によっては、遺伝子産物はポリペプチドである。場合によっては、遺伝子産物は治療用ポリペプチド、例えば、臨床的利益を提供するポリペプチドである。場合によっては、遺伝子産物は、遺伝子機能を部位特異的にノックダウンさせる部位特異的ヌクレアーゼである。場合によっては、遺伝子産物は、標的核酸の修飾を提供するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。場合によっては、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾を提供するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）標的核酸内の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含むガイドＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾を提供するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）標的核酸内の第１の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含む第１のガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）標的核酸内の第２の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含む第１のガイドＲＮＡである。
核酸遺伝子産物
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適切なＲＮＡｉには、細胞でのアポトーシス因子または血管新生因子レベルを低下させるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞でのアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低下させる、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。その遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子を本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と呼び、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ；タンパク質）を「アポトーシス促進遺伝子産物」と呼ぶ。アポトーシス促進遺伝子産物には、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、及びＢａｄなどの遺伝子産物が含まれる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照のこと。
一例として、場合によっては、干渉ＲＮＡは、欠陥アレルのＲＮＡ及び／またはポリペプチド産物のレベルを特異的に低下させる。例えば、場合によっては、ＲＮＡｉは、ハンチンチンをコードするＲＮＡレベルを特異的に低下させる、及び／またはハンチンチンポリペプチドのレベルを特異的に低下させる。
別の例として、場合によっては、ｍｉＲＮＡは、欠陥アレルのＲＮＡ及び／またはポリペプチド産物のレベルを特異的に低下させる。
別の例として、場合によっては、ＲＮＡｉは、例えば、ＳＯＤ１のＲＮＡ及びポリペプチドが欠陥アレルによりコードされる場合、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）ＲＮＡをコードするＲＮＡのレベルを特異的に低下させる、及び／または、ＳＯＤ１ポリペプチドのレベルを特異的に低下させる。
別の例として、場合によっては、ＲＮＡｉは、例えば、ＳＭＮ１のＲＮＡ及びポリペプチドが欠陥アレルによりコードされる場合、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）ＲＮＡをコードするＲＮＡのレベルを特異的に低下させる、及び／またはＳＭＮ１ポリペプチドのレベルを特異的に低下させる。
干渉ＲＮＡはまた、血管新生産物、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｃａｎｄ５；例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、及びＲｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照のこと）；ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）（例えば、Ｓｉｒｎａ−０２７；例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：２２５を参照のこと）；またはＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）（Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）にも対抗可能であろう。米国特許第６，６４９，５９６号、第６，３９９，５８６号、第５，６６１，１３５号、第５，６３９，８７２号、及び第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号及び第７，９１９，４７３号も参照のこと。
遺伝子産物がアプタマーである場合、例示的な目的アプタマーにはＶＥＧＦに対抗するアプタマーが含まれる。例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１８９０２を参照のこと。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’−ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ−３’（配列番号１２）を含むことができる。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用に好適であり、例えば、Ｎｉ ａｎｄ Ｈｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１、及びＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７を参照のこと）。
ポリペプチド遺伝子産物
遺伝子産物がポリペプチドである場合、場合によっては、ポリペプチドは、神経幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞の機能を高めるポリペプチドである。
場合によっては、遺伝子産物は、神経幹細胞の分化を誘導する、例えば、神経幹細胞がニューロン、グリア細胞、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに分化するのを誘導するポリペプチドである。神経幹細胞の分化を誘導するポリペプチドの非限定的な例には、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅファミリー塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子１（ＭＡＳＨ１；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９２：５４８）、ペアード様ホメオボックス２ａ（ＰＨＯＸ２Ａ）、ニューロジェニン１（ＮＧＮ１）、ペアードボックス６（ＰＡＸ６）、性決定領域Ｙボックス１（ＳＯＸ１）、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １（ＮｅｕｒｏＤ１）、ＮｅｕｒｏＤ関連因子（ＮＤＲＦ）、オリゴデンドロサイト転写因子２（Ｏｌｉｇ２）が含まれる。例えば、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９３：２３、及びＢｏｎｄ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １７：３８５を参照のこと。
例示的ポリペプチドには、神経保護ポリペプチド（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びニュールツリン（ＮＴＮ））；芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素；グルタミン酸脱炭酸酵素；トリペプチジルペプチダーゼ；アスパルトアシラーゼ；血管新生阻害ポリペプチド（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体；ＶＥＧＦ結合抗体；ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）；エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）；可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照のこと）；毛様体神経栄養因子；下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド；組織メタロプロテアーゼ阻害物質３（ＴＩＭＰ−３）；転写因子、例えば、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １（Ｎｅｕｒｏ Ｄ１）、オリゴデンドロサイト転写因子１（Ｏｌｉｇ１）、オリゴデンドロサイト転写因子２（Ｏｌｉｇ２）、Ａｃｈａｅｔｅ−ＳｃｕｔｅファミリーＢＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣｉｉ）、ＤＮＡ−タンパク質阻害因子ＩＤ−１（Ｉｄ１）、ＤＮＡ−タンパク質阻害因子ＩＤ−２（Ｉｄ２）、ニューロジェニン、シグナル伝達兼転写活性化因子３、ＮＫ２転写因子様タンパク質Ｂ等などが含まれる。適切なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子、及びソニック・ヘッジホッグが挙げられるが、これに限定されるものではない。
部位特異的エンドヌクレアーゼ
場合によっては、目的遺伝子産物は、遺伝子機能を部位特異的にノックダウンさせる部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、その場合、かかるエンドヌクレアーゼは神経疾患に関連したアレルをノックアウトする。例えば、顕性アレルが、野生型では神経構造タンパク質である遺伝子についての欠陥コピーをコードする、及び／または正常な神経機能を提供するという場合、部位特異的エンドヌクレアーゼを欠陥アレルに指向させ、欠陥アレルをノックアウトすることができる。場合によっては、部位特異的エンドヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。
部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能性コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組換えを刺激することができる。したがって、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンを使用して、欠陥アレルをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達することができ、また、対象ｒＡＡＶビリオンを使用して、欠陥アレルの機能性コピーを送達し、欠陥アレルの修復を生じさせ、それにより神経機能タンパク質を産生させることができる。場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と、欠陥アレルの機能性コピーをコードし、その機能性コピーが機能性神経タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む。
神経性の疾患及び障害に関連するかまたはそれを生じさせる変異が含まれ得る遺伝子の例には、ヒポキサンチングアニンホスホリボキシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｘｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ１）、神経線維腫症ＩＩ型（ＮＦ２）、ＡＴＰ１Ａ３（Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼのα３サブユニットをコードする）、ＤＹＮＣ１Ｈ１（細胞質ダイニン１の重鎖をコードする）、ＨＴＴ（ハンチンチンをコードする）、ＳＯＤ１、ＳＭＮ１、ＡＴＸ３（脊髄小脳失調症３をコードする）、ＦＸＮ／Ｘ２５（フラタキシンをコードする）、ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼをコードする）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２をコードする）、アトロフィン１、ＮＲ４Ａ２（核内受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２タンパク質をコードする）、ＰＩＮＫ１（ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１をコードする）、ＬＲＲＫ２（ロイシンリッチリピートキナーゼ２をコードする）、ＭｅＣＰ２（メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２をコードする）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などが含まれるが、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは天然には生じないものであり、特定の遺伝子を標的とするよう改変されている。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内部の特定の位置を切断するよう人工的に操作することができ、その後、非相同末端結合は、いくつかのヌクレオチドの挿入または欠失を行いながら切断を修復することができる。その後、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「インデル（ＩＮＤＥＬ）」とも呼ばれる）は、そのタンパク質をフレームから破棄し、遺伝子を有効にノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照のこと。適切な部位特異的エンドヌクレアーゼには、人工メガヌクレアーゼをさらに操作したホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。適切なエンドヌクレアーゼにはＩ−Ｔｅｖｌヌクレアーゼが含まれる。適切なメガヌクレアーゼには、Ｉ−Ｓｃｅ１（例えば、Ｂｅｌｌａｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１０３７を参照のこと）、及びＩ−Ｃｒｅ１（例えば、Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６８を参照のこと）が含まれる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
場合によっては、遺伝子産物はＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物はガイドＲＮＡ、例えば、シングルガイドＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡは、ａ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域、及びｂ）標的核酸に結合する領域を含むことができる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）である。適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）である。場合によっては、適切なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、適切なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）である。場合によっては、ゲノム指向組成物には、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質など）が含まれる。場合によっては、適切なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質；「Ｃａｓ１３ａ」タンパク質とも呼ばれる）である。また、ＣａｓＸタンパク質も使用に好適である。また、ＣａｓＹタンパク質も使用に好適である。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）とＣａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとが会合することにより、かかる配列内の標的部位へと誘導される（例えば、標的部位にて安定化される）。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａに示す化膿レンサ球菌Ｃａｓ９に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％以上であるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の組成物または方法に使用するＣａｓ９ポリペプチドは黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。場合によっては、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、図１９に示すｓａＣａｓ９アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。
場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは高忠実度（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０。例えば、図１８Ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えばアラニンなどで置換される。例えば、ＨＦ Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１９Ａに示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含むことができ、その場合、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えばアラニンなどで置換される。適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａ〜１８Ｆのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、変化したＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照のこと。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、図２０に示すＣｐｆ１アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＣａｓＸまたはＣａｓＹポリペプチドである。ＣａｓＸポリペプチド及びＣａｓＹポリペプチドは、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７に記載されている。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。適切なゲノム編集ヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）である。適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど）である。場合によっては、適切なゲノム編集ヌクレアーゼはクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）である。場合によっては、適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）である。場合によっては、適切なゲノム編集ヌクレアーゼは、クラス２のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質；「Ｃａｓ１３ａ」タンパク質とも呼ばれる）である。また、ＣａｓＸタンパク質も使用に好適である。また、ＣａｓＹタンパク質も使用に好適である。
場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼは、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも呼ばれる）に融合する融合タンパク質である。場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼを、細胞内局在を提供するアミノ酸配列（融合パートナー）、すなわち、融合パートナーは細胞内局在配列（例えば、核へ指向させるための１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳ等）であるアミノ酸配列と融合させる。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｅエンドヌクレアーゼである。場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）とＣａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとが会合することにより、かかる配列内の標的部位へと誘導される（例えば、標的部位にて安定化される）。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａに示す化膿レンサ球菌Ｃａｓ９に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％以上であるアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の組成物または方法に使用するＣａｓ９ポリペプチドは黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。場合によっては、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、図１９に示すｓａＣａｓ９アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。
場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａに示す化膿レンサ球菌Ｃａｓ９に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％以上であるが、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、及びＲ１０６０Ａという置換を有するアミノ酸配列を含む。Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８４−８８。場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは図１８Ｅに示すアミノ酸配列を含む。適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａ〜１８Ｆのいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは高忠実度（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０。例えば、図１８Ａに示すアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えばアラニンなどで置換される。例えば、ＨＦ Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１８Ａに示すアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含むことができ、その場合、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えばアラニンなどで置換される。場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、図１８Ｆに示すアミノ酸配列を含む。
場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、変化したＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照のこと。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、図２０Ａに示すＣｐｆ１アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、図２０Ｂに示すＣｐｆ１アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、図２０Ｃに示すＣｐｆ１アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％であるアミノ酸配列を含む。
酵素的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
また、酵素活性が低いＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼも使用に好適である。そのようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは「デッド（ｄｅａｄ）」ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと呼ばれ、例えば、実質的にエンドヌクレアーゼ活性を全く示さないが、ガイドＲＮＡと複合体を形成させた際に依然として標的核酸に結合するような特定のアミノ酸置換を含むＣａｓ９ポリペプチドは、「デッド」Ｃａｓ９または「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。場合によっては、「デッド」Ｃａｓ９タンパク質は、標的二本鎖核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。例えば、「ヌクレアーゼ欠損」Ｃａｓ９は、機能性ＲｕｖＣドメインを欠き（すなわち、標的二本鎖ＤＮＡの非相補鎖を切断しない）、また機能性ＨＮＨドメインを欠く（すなわち、標的二本鎖ＤＮＡの相補鎖を切断しない）。非限定的な例として、場合によっては、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質は、かかるポリペプチドが、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方に対する切断能が低くなる（例えば、切断しない）よう、配列番号４０の残基Ｄ１０及びＨ８４０（またはＣａｓ９のホモログの対応残基）に対応するアミノ酸位置に変異を有する（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、一本鎖または二本鎖の標的核酸）を切断する能力は低くなっているが、標的核酸と結合する能力は保持されている。標的核酸を切断することができないＣａｓ９タンパク質（例えば、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの触媒ドメインでの、例えば、１つ以上の変異のため）は、「ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９」、「デッドＣａｓ９」または単に「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。他の残基を変異させて上記の効果を達成する（すなわち、ヌクレアーゼ部分のいずれか一方を不活性化させる）ことができる。非限定的な例として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）を変化させる（すなわち、置換する）ことができる。場合によっては、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＤ９８６の２つ以上（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）を置換する。場合によっては、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０及びＮ８６３（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）は、Ａｌａで置換する。また、アラニン置換以外の変異も適している。
場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９相乗的活性化メディエーター（Ｃａｓ９−ＳＡＭ）として知られる、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（及び対応するガイドＲＮＡ）である。Ｃａｓ９−ＳＡＭシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、転写活性化ドメイン（ここで、適切な転写活性化ドメインには、例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、及びＳＥＴ７／９が含まれる）または転写リプレッサードメイン（ここで、適切な転写リプレッサードメインには、例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、及びＳＩＤ４Ｘドメインが含まれる）に融合させた「デッド」Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９−ＳＡＭシステムのガイドＲＮＡは、転写アクチベータードメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、またはＳＥＴ７／９）または転写リプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、またはＳＩＤ４Ｘドメイン）に融合させたアダプタータンパク質と結合するループを含む。例えば、場合によっては、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの１つまたは２つのループ内に挿入されたＭＳ２ ＲＮＡアプタマーを含むシングルガイドＲＮＡであり、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４に融合させたｄＣａｓ９を含む融合ポリペプチドであり、アダプター／機能性タンパク質は、ｉ）ＭＳ２、ｉｉ）ｐ６５、及びｉｉｉ）ＨＳＦ１を含む融合ポリペプチドである。例えば、米国特許公開第２０１６／０３５５７９７号を参照のこと。
また、ａ）デッドＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、ｂ）融合異種ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドも使用に好適である。適切な融合異種ポリペプチドの例には、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性、または核酸結合活性などを有するポリペプチドが含まれる。
ガイドＲＮＡ
クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質；Ｖ型またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質；Ｃｐｆ１タンパク質等）に結合し、かかる複合体を標的核酸内の特定の位置に指向させる核酸を、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と呼ぶ。ガイドＲＮＡは、指向セグメントを含めることにより標的特異性を複合体（ＲＮＰ複合体）に与え、かかるセグメントには、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（本明細書では標的指向配列とも呼ばれる）が含まれる。
場合によっては、ガイドＲＮＡには、２つの別個の核酸分子、すなわち、「アクチベーター」と「ターゲター」が含まれ、本明細書では「二重ガイドＲＮＡ」、「ダブル分子ガイドＲＮＡ」、「２分子ガイドＲＮＡ」、または「ｄｇＲＮＡ」と呼ぶ。場合によっては、ガイドＲＮＡは１つの分子であり（例えば、一部のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質では、対応するガイドＲＮＡは単一分子であり、場合によっては、アクチベーターとターゲターは、例えば、介在ヌクレオチドを介して、互いに共有結合で連結されている）、かかるガイドＲＮＡを「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と呼ぶ。
遺伝子産物がＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方である場合、この遺伝子産物は標的核酸を修飾することができる。場合によっては、例えば、標的核酸が欠陥アレルに有害変異（例えば、神経細胞の標的核酸における有害変異）を含む場合、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体を、有害変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー核酸（例えば、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能性コピーをコードするヌクレオチド配列を含むドナー核酸）と共に使用して、例えば、相同組換え型修復（ＨＤＲ）により有害変異を修正することができる。
場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び２つの別個のｓｇＲＮＡであり、その場合、２つの別個のｓｇＲＮＡが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して標的核酸を欠失させる。
場合によっては、遺伝子産物は、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）１つのガイドＲＮＡである。場合によっては、ガイドＲＮＡは、単一分子（または「シングルガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）である。場合によっては、ガイドＲＮＡは、二重分子（または「二重ガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）である。
場合によっては、遺伝子産物は、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）２つの別個のｓｇＲＮＡであり、その場合、２つの別個のｓｇＲＮＡが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して標的核酸を欠失させる。場合によっては、ガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。場合によっては、ガイドＲＮＡはｄｇＲＮＡである。
場合によっては、遺伝子産物は、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、及びｉｉ）ガイドＲＮＡ前駆体であり、これらの場合、前駆体をＣｐｆ１ポリペプチドにより切断して、２つ以上のガイドＲＮＡを作製することができる。
本開示は、個体における神経細胞の、有害変異を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）有害変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡ鋳型をコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンの投与により、ＨＤＲによる標的核酸での有害変異の修正がもたらされる。
本開示は、個体における神経細胞の、有害変異を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸内の第１の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）標的核酸内の第２の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンの投与により、ＮＨＥＪによる標的核酸での有害変異の除去がもたらされる。
本開示は、個体における神経幹細胞の、有害変異を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）有害変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡ鋳型をコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンの投与により、ＨＤＲによる標的核酸での有害変異の修正がもたらされる。
本開示は、個体における神経幹細胞の、有害変異を含む標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸内の第１の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）標的核酸内の第２の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンの投与により、ＮＨＥＪによる標的核酸での有害変異の除去がもたらされる。
医薬組成物
本開示は、ａ）上記のような対象ｒＡＡＶビリオンと、ｂ）薬理学的に許容される担体、希釈剤、添加剤、または緩衝剤とを含む医薬組成物を提供する。場合によっては、薬理学的に許容される担体、希釈剤、添加剤、または緩衝剤はヒトでの使用に好適である。
そのような添加剤、担体、希釈剤、及び緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与可能な任意の医薬品が含まれる。薬理学的に許容される添加剤には、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。その中に薬理学的に許容される塩を含めることができ、例えば、塩酸塩、水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸の塩を含めることができる。さらに、そのようなビヒクル中に湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような助剤が存在してよい。多種多様な薬理学的に許容される添加剤が当該技術分野で公知であり、本明細書での詳しい考察を要しない。薬理学的に許容される添加剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃなど、さまざまな刊行物に十分に記載されている。
方法
遺伝子産物の送達方法
本開示は、個体の神経細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供し、かかる方法は、上記のように個体に対象ｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。遺伝子産物は、上記のようなポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）であり得る。神経細胞に遺伝子産物を送達することにより神経疾患の治療を提供することができる。
本開示は、神経細胞の標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、１）ガイドＲＮＡと結合するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンと、２）ガイドＲＮＡとに、神経細胞を接触させることを含む。本開示は、神経細胞の標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、ｉ）ガイドＲＮＡと結合するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、ｉｉ）ガイドＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンに、神経細胞を接触させることを含む。場合によっては、方法は、神経細胞をドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。場合によっては、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。場合によっては、ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
本開示は、個体のＮＳＣ細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供し、かかる方法は、上記のような対象ｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含む。遺伝子産物は、上記のようなポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）であり得る。ＮＳＣに遺伝子産物を送達することにより、神経疾患の治療を提供することができる。
本開示は、ＮＳＣの標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、１）ガイドＲＮＡと結合するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンと、２）ガイドＲＮＡとに、神経幹細胞を接触させることを含む。本開示は、ＮＳＣの標的核酸を修飾する方法を提供し、かかる方法は、ｉ）ガイドＲＮＡと結合するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと、ｉｉ）ガイドＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンに、ＮＳＣを接触させることを含む。場合によっては、方法は、ＮＳＣをドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。場合によっては、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。場合によっては、ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡである。
本開示は、神経疾患（例えば、神経疾患）を治療する方法を提供し、かかる方法は、上記のような対象ｒＡＡＶビリオンの有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む。対象ｒＡＡＶビリオンは、頭蓋内注射による投与、または他の好都合な任意の投与方法もしくは投与経路による投与のいずれでも可能である。他の好都合な投与方法または投与経路には、例えば、脳室内、髄腔内、大槽内、または静脈内等が含まれる。
「治療的有効量」は、実験及び／または臨床試験を介して決定され得る比較的広い範囲となるであろう。例えば、生体内注射、すなわち、脳内に直接注入する場合、治療的に有効な用量は約１０６〜約１０１５のｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０８〜１０１２ｒＡＡＶビリオン程度となろう。インビトロの形質導入では、細胞に送達されるべきｒＡＡＶビリオンの有効量は約１０８〜約１０１３ｒＡＡＶビリオン程度となろう。他の有効用量は、用量反応曲線を作成する日常的試験を介して当業者が容易に確立することができる。
場合によっては、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）を用いて、所望レベルの遺伝子発現を達成してよい。場合によっては、２回以上の投与をさまざまな間隔、例えば、１日１回、週１回、月２回、月１回、３か月に１回、６か月に１回、年１回等で投与する。場合によっては、複数投与を１か月〜２か月、２か月〜４か月、４か月〜８か月、８か月〜１２か月、１年〜２年、２年〜５年、または５年以上という期間にわたり投与する。
神経性の疾患または障害を治療する方法
対象方法を使用して治療され得る神経性疾患には、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経性の疾患及び障害、ならびに末梢神経系（ＰＮＳ）の神経性の疾患及び障害が含まれる。
神経性の疾患及び障害には、びまん性軸索損傷、周産期低酸素性虚血性損傷、外傷性脳損傷、脳卒中、虚血性梗塞、塞栓症、及び高血圧性出血；ＣＮＳ毒素への曝露、中枢神経系の感染、例えば、細菌性髄膜炎など；代謝性疾患、例えば、低酸素性虚血性脳症、末梢神経障害、及び糖原病などに関与するもの；または多発性硬化症、レビー小体認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンチントン病が含まれるがこれに限定されない慢性の神経損傷もしくは神経変性疾患に由来するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
神経性の疾患及び障害には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、レビー小体病、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、認知症、統合失調症、麻痺、多発性硬化症、脊髄損傷、脳損傷、脳神経障害、末梢性感覚ニューロパチー、てんかん、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルパース病、小脳／脊髄小脳変性症、バッテン病、大脳皮質基底核変性症、ベル麻痺、ギラン−バレー症候群、ピック病、レット症候群、前頭側頭型認知症、及び自閉症が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＰＮＳの神経性の疾患及び障害には、例えば、糖尿病性神経障害、多発ニューロパチー、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）等が含まれる。
本開示は、神経障害を治療する方法を提供する。場合によっては、方法は、本開示のｒＡＡＶビリオン、または本開示のｒＡＡＶビリオンを含む組成物を、それを必要とする個体の脳に投与することを含む。
当業者は、神経性の疾患または障害に関連する症状など、１つ以上のパラメータに対する効果を試験することにより、ｒＡＡＶビリオンの有効量を容易に決定することができる。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量を投与することにより、脳機能、解剖学的完全性、または脳健康の喪失率の低下、例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上の喪失率の低下、ひいては疾患の進行低下がもたらされ、例えば、喪失率、ひいては疾患の進行低下が１０倍以上低下する。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量を投与することにより、脳機能の獲得、脳の解剖学的形態もしくは健康の改善、及び／または脳機能の安定化がもたらされ、例えば、脳機能、脳の解剖学的形態もしくは健康が２倍、３倍、４倍または５倍以上改善され、例えば、脳機能、脳の解剖学的形態もしくは健康、及び／または脳の安定性が１０倍以上改善する。
核酸及び宿主細胞
本開示は、上記のような対象変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
対象組換え型ＡＡＶベクターを使用して、上記のような対象組換え型ＡＡＶビリオンを作製することができる。したがって、本開示は、適切な細胞内に導入した場合に、対象組換え型ＡＡＶビリオンの産生を提供することができる組換え型ＡＡＶベクターを提供する。
本開示はさらに、対象核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された（遺伝子改変）宿主細胞を提供する。対象宿主細胞は、単離された細胞、例えば、インビトロ培養の細胞であり得る。対象宿主細胞は、以下に記載のように、対象ｒＡＡＶビリオン作製に有用である。対象ｒＡＡＶビリオンを産生させるために対象宿主細胞を使用する場合、その細胞を「パッケージング細胞」と呼ぶ。場合によっては、対象宿主細胞は、対象核酸で安定に遺伝子が組み換えられる。他の場合には、対象宿主細胞は、対象核酸で一過性に遺伝子が組み換えられる。
対象核酸は、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、リポソームを用いたトランスフェクション等が含まれるがこれに限定されない確立された技術を使用して、安定または一過性に宿主細胞に導入される。安定な形質転換では一般に、対象核酸にさらに選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性のようないくつかの周知の選択マーカー等のいずれかなどが含まれるであろう。
対象宿主細胞は、例えば、例としてマウス細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などが含まれる、哺乳類細胞など、多種多様な細胞のいずれかに対象核酸を導入することによって作製される。適切な哺乳類細胞には、初代細胞及び細胞株が挙げられるが、これに限定されるものではなく、その場合、適切な細胞株には、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞等が含まれるが、これに限定されるものではない。適切な宿主細胞の非限定的な例には、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が含まれる。対象宿主細胞は、Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞を感染させるバキュロウイルスを使用して作製することもでき、その細胞にＡＡＶを産生させる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照のこと）。
場合によっては、対象の遺伝子改変宿主細胞には、上記のような、変異ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加え、１つ以上のＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が含まれる。他の場合には、対象宿主細胞はさらにｒＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶビリオンは、対象宿主細胞を使用して作製することができる。ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は、例えば、米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
開示の非限定的態様例
上記の本願主題の実施形態などの態様は、単独でも、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせても有益であり得る。上述の記載を限定するものではないが、１〜６５の番号を付した特定の非限定的な開示態様を以下に記載する。本開示を読むと当業者には明らかとなるように、個々別々に番号付けされた態様の各々を使用しても、またはそれより前もしくは後の個々別々に番号付けされた態様と組み合わせてもいずれでもよい。これは、態様のそのような組み合わせをすべて支持することを意図しており、下記で明示的に提供する態様の組み合わせに限定するものではない。
態様１．
組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
ａ）少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の少なくとも５つのセグメントを含み、かつ、ｉ）神経幹細胞への感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して高い、ｉｉ）ニューロンへの感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによるニューロンへの感染力と比較して高い、ｉｉｉ）ヒトＡＡＶ中和抗体に対する耐性が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い、という特性のうち１つ以上を付与する、変異ＡＡＶカプシドタンパク質、及び
ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、前記組換え型アデノ随伴ウイルスビリオン。
態様２．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、及び前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメントを含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３．
前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４．
前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様５．
前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様６．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、及び第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメントを含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様７．
前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、態様６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様８．
前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、態様６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様９．
前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、態様６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１０．
前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、態様６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１１．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型の約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型の約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメント、第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第６のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第７のセグメント、及び前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第８のセグメントを含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１２．
前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、態様１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１３．
前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、態様１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１４．
前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、態様１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１５．
前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、態様１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１６．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、第１のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第１のセグメント、第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第２のセグメント、第３のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第３のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第４のセグメント、第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第５のセグメント、前記第４のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第６のセグメント、前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第７のセグメント、及び前記第２のＡＡＶ血清型に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の第８のセグメントを含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１７．
前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１８．
前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様１９．
前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２０．
前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２１．
前記ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍高い神経幹細胞への感染力を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２２．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、態様２１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２３．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、態様２１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２４．
前記ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、少なくとも１０倍高い神経幹細胞への感染力を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２５．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、態様２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２６．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、態様２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２７．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１に記載の（及び図８に示す）アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約９０％であるアミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２８．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１に記載の（及び図８に示す）アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約９５％であるアミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様２９．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１に記載の（及び図８に示す）アミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３０．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２に記載の（及び図９に示す）アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約９０％であるアミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３１．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２に記載の（及び図９に示す）アミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも約９５％であるアミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３２．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２に記載の（及び図９に示す）アミノ酸配列を含む、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３３．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い耐性を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３４．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、態様３４に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３５．
前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、態様３４に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３６．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約１．５倍高い耐性を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３７．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約３倍高い耐性を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３８．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約５倍高い耐性を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様３９．
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約１０倍高い耐性を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４０．
前記神経幹細胞は脳室下帯由来である、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４１．
前記プルキンエ細胞は小脳由来である、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４２．
前記遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様１〜４１のいずれか１態様に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４３．
前記遺伝子産物はポリペプチドである、態様１〜４１のいずれか１態様に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４４．
前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、血管新生阻害ポリペプチド、神経幹細胞の分化を誘導するポリペプチド、または神経幹細胞の機能を高めるポリペプチドである、態様４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４５．
前記ポリペプチドは、セレブロライシン、ラミニン−ＩＫＶＡＶ、ｃｒｉｐｔｏ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、上皮成長因子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子、またはソニック・ヘッジホッグである、態様４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４６．
前記ポリペプチドはゲノム編集酵素である、態様４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４７．
前記ゲノム編集酵素は、Ｃａｓ９ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、または酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、態様４６に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４８．
前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、態様４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様４９．
前記遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、態様１〜４１のいずれか１態様に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様５０．
ａ）態様１〜４９のいずれか１態様に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスビリオン、及びｂ）薬理学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
態様５１．
個体の神経幹細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、態様１〜４９のいずれか１態様に記載の組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは態様５０に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
態様５２．
前記投与は、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射による、態様５１に記載の方法。
態様５３．
前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様５１に記載の方法。
態様５４．
前記遺伝子産物はポリペプチドである、態様５１に記載の方法。
態様５５．
前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、血管新生阻害ポリペプチド、または神経幹細胞の機能を高めるポリペプチドである、態様４３に記載の方法。
態様５６．
前記ポリペプチドは、セレブロライシン、ラミニン−ＩＫＶＡＶ、ｃｒｉｐｔｏ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、上皮成長因子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、トリペプチジルペプチダーゼ、アスパルトアシクラーゼ（ａｓｐａｒｔｏａｃｙｌａｓｅ）、またはソニック・ヘッジホッグである、態様４４に記載のｒＡＡＶビリオン。
態様５７．
前記ポリペプチドはゲノム編集酵素である、態様５４に記載の方法。
態様５８．
前記ゲノム編集酵素は、Ｃａｓ９ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、または酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、態様５７に記載の方法。
態様５９．
前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、態様５７に記載の方法。
態様６０．
前記遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、態様５１に記載の方法。
態様６１．
神経性障害を治療する方法であって、態様１〜４９のいずれか１態様に記載の組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは態様５０に記載の組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
態様６２．
前記神経性障害は、脊髄小脳失調症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、リソソーム蓄積障害、フリードライヒ運動失調症、神経膠芽腫、レット症候群、前頭側頭型認知症、またはてんかんである、態様６２に記載の方法。
態様６３．
変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、
前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の少なくとも５つのセグメントを含み、かつ、ｉ）神経幹細胞への感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して高い、ｉｉ）ニューロンへの感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによるニューロンへの感染力と比較して高い、ｉｉｉ）ヒトＡＡＶ中和抗体に対する耐性が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む前記対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い、という特性のうち１つ以上を付与する、前記核酸。
態様６４．
態様６３に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
態様６５．
変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長の少なくとも５つのセグメントを含み、かつ、ｉ）神経幹細胞への感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して高い、ｉｉ）ニューロンへの感染力が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによるニューロンへの感染力と比較して高い、ｉｉｉ）ヒトＡＡＶ中和抗体に対する耐性が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むかまたは野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い、という特性のうち１つ以上を付与する、前記変異アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質。
以下の例は、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが自身の発明であると見なす範囲を限定することも、また、下記実験が実施した全てまたは唯一の実験であると表すことも意図しない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差を考慮するべきである。特に指定しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏、及び圧力は大気圧または大気圧近傍圧である。例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）等、標準的略語を使用してよい。
実施例１：ＳＣＨＥＭＡに基づくキメラＡＡＶライブラリー設計
材料及び方法
特に記載がない限り、本明細書に記載の実施例で提示されている結果には一般に以下の材料及び方法が適用される。
ＳＣＨＥＭＡライブラリー設計
キメラＡＡＶのライブラリーは、複数の系統分岐群を表す（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８を参照のこと）ＳＣＨＥＭＡスコアリング関数及びＲＡＳＰＰアルゴリズム（例えば、Ｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６、及びＥｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＥＤＳ １７を参照のこと）を使用して設計されたが、これは、さまざまな受容体結合特性を有しており（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０を参照のこと）、臨床において多少の効果が享受された（例えば、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１７を参照のこと）。ＭＵＳＣＬＥ（例えば、Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２を参照のこと）を使用してＡＡＶ２、４、５、６、８、及び９のアミノ酸配列を整列させ、親配列アラインメントを生成した。多量体ＡＡＶカプシドにおけるサブユニットアミノ酸内の接触及びサブユニットアミノ酸同士の接触の両方が考慮されるようＳＣＨＥＭＡを変更したが、ここで、一対の残基が接触しているのは、それらに水素以外の原子が４．５オングストローム以内に含有されている場合である。ＡＡＶ２（１ＬＰ３）、ＡＡＶ４（２Ｇ８Ｇ）、ＡＡＶ５（３ＮＴＴ）、ＡＡＶ６（３ＯＡＨ）、ＡＡＶ８（２ＱＡ０）、及びＡＡＶ９（３ＵＸ１）の結晶構造を使用して、接触残基の位置を計算した。最終接触マップは、これらの６つの親構造の少なくとも５０％で接触している残基対を含有した。ライブラリーの高い多様性を達成するため、６つの交差を含有するライブラリーをカプシドの結晶化領域内に設計するべきであり、７つ目の交差を、その位置での組換えが成功している先の例に基づき、位置１２８の非結晶化ＶＰ１領域（アミノ酸１〜アミノ酸２１６）に設計する。例えば、Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６を参照のこと。６種の親血清型由来のカプシドタンパク質ブロックを８つ含有するライブラリーから、理論上、１６０万（６８）を越えるキメラ変異型というライブラリー多様性が得られる。キメラカプシドのＳＣＨＥＭＡ破壊＜Ｅ＞は、親配列のいずれにも存在しない、アミノ酸の新しい組み合わせを含有する接触の数であった。キメラカプシドの＜ｍ＞は、最も近い親配列からの変異の数であった。
図１．
ＲＡＳＰＰアルゴリズムを使用して、平均構造破壊＜Ｅ＞と平均配列多様性＜ｍ＞のバランスのとれたライブラリーを設計した。ＳＣＨＥＭＡスコアリング関数をさらに変更して、ライブラリー構築のコンビナトリアルゴールデンゲートアセンブリの影響を受けやすい交差位置について検索したが、これには、すべてのＡＡＶ親配列を通じて保存されている４つのヌクレオチド領域を要した。可能な交差部位の数を増やして、より大きい配列空間をインシリコで探索するために、４つのヌクレオチド領域は、ライブラリーアセンブリ中はサイレント変異させて、すべての親配列で同一となるように含めた。ライブラリー設計では、最小許容配列ブロック長は２０アミノ酸及び最大長さは２５０アミノ酸を検討した。最終ライブラリーは、その＜Ｅ＞が低いもの、その均一なブロックサイズ、及びカプシドの主要構造特徴の組み換えに基づいて選択した。
ＳＣＨＥＭＡライブラリー構築
図２．
ＩＩ型の制限酵素ＢｓａＩを用いたコンビナトリアルゴールデンゲートクローニングを容易に行うために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）、ＡＡＶ２、４、５、６、８、及び９に見られるＢｓａＩ認識部位をすべて、部位特異的変異導入のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅによりサイレント変異させた。
図３及び図４．
シャッフルしたブロックそれぞれに相当する４８のＤＮＡ配列を、ＤＮＡアセンブリ設計オートメーションソフトウェアのｊ５で設計したＰＣＲプライマーを使用して、親ｃａｐ遺伝子からＰＣＲ増幅させた。例えば、Ｈｉｌｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１を参照のこと。
図５．
プライマーは、ブロック接合部にサイレント変異を組み込んでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター骨格へのゴールデンゲートクローニングを促進するよう設計された。ゴールデンゲート反応物をエレクトロコンピテントなＤＨ１０Ｂ大腸菌に形質転換し、理論上の多様性である６８クローンより大きなライブラリーサイズを達成した。その後、ライブラリーを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩを使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＡＡＶパッケージングプラスミドｐＳｕｂ２ＦｌｏｘＣａｐにサブクローニングした。
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを使用して、パッケージング前後のＳＣＨＥＭＡライブラリーを分析した。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含有する２．５ｋｂ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＮｏｔＩ部位を使用してｐＳｕｂ２ＦｌｏｘＣａｐベクターから切り出し、ゲル抽出した。これらのゲル抽出したインサートを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）への投入物として使用した。各種インデックスプライマーを使用して各試料をバーコード化した。得られるライブラリーを、高感度Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｑｕｂｉｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、最後に定量ＰＣＲ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量した。平均配列断片は約１，４００ｂｐであった。２ライブラリーを等モル比でプールし、ＭｉＳｅｑ、バージョン３、２×３００、５％ ＰｈｉＸ対照スパイクインを用いたランを使用して配列決定した。ＡＡＶ親すべてに対し、読み取られたシークエンシングのマッピングをＢｏｗｔｉｅ２を使用して行い（例えば、Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０を参照のこと）、読取り位置と親に対する配列同一性とを考慮して、存在する特定配列ブロックを決定した。
Ｃｒｅ依存的選択のためのＡＡＶ構成体の設計
構成体設計及びｃａｐ増幅に使用したＰＣＲプライマーは図２に提示されている。ｐＳｕｂ２ＲｅｐＫＯ及びｐＲｅｐヘルパーを使用した。ＡＡＶパッケージングプラスミドｐＳｕｂ２でｒｅｐをノックアウトさせたｐＳｕｂ２ＲｅｐＫＯ（例えば、Ｍａｈｅｓｈｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４を参照のこと）を、ＳｇｒａＩ及びＢａｍＨＩを用いた消化、クレノウ反応、及び平滑末端ライゲーションにより作製した。ＡＡＶパッケージングの際にＲｅｐをトランスで供給するために使用するｐＲｅｐＨｅｌｐｅｒを、ＰｍｅＩ及びＢｓｍＩを用いたｐＡＡＶ２／ｒｈ１０の連続消化、クレノウ反応、及び平滑末端ライゲーションにより創製した。ｌｏｘ６６をｃａｐの５’部位に挿入するため、プライマーＢｇｌＩＩＦｗｄ及びＢｇｌＩＩＲｅｖを使用した部位特異的変異導入により、ｐＳｕｂ２ＲｅｐＫＯに固有ＢｇｌＩＩ部位を導入した。オリゴヌクレオチドＬｏｘ６６Ｆｗｄ及びＬｏｘ６６Ｒｅｖをアニールし、ｐＳｕｂ２ＲｅｐＫＯのＢｇｌＩＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結してｐＳｕｂ２Ｌｏｘ６６を形成した。ｌｏｘ７１をｃａｐの３’部位に挿入するため、プライマーＸｈｏＩＦｗｄ／ＸｈｏＩＲｅｖ及びＫｐｎＩＦｗｄ／ＫｐｎＩＲｅｖをそれぞれ用いた部位特異的変異導入により、固有ＸｈｏＩ部位及び固有ＫｐｎＩ部位をｐＳｕｂ２Ｌｏｘ６６に導入した。オリゴヌクレオチドＳＯＥＬｏｘ７１Ｆｗｄ及びＳＯＥＬｏｘ７１Ｒｅｖをオーバーラップエクステンションでスプライスして組み立て、Ｌｏｘ７１Ｆｗｄ及びＬｏｘ７１Ｒｅｖを用いて増幅した。得られる断片及びｐＳｕｂ２Ｌｏｘ６６をＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化させ、連結してｐＳｕｂ２Ｆｌｏｘを創製した。この選択で使用するｐＳｕｂ２Ｆｌｏｘ及びＡＡＶ ｃａｐライブラリーをＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化させ、連結してウイルスパッケージング用ｐＳｕｂ２ＦｌｏｘＣａｐライブラリーを産生した。
ＡＡＶベクター作製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。先にＫｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６、及びＭａｈｅｓｈｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４に記載のように、サイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはＣｒｅリコンビナーゼの発現を誘導する、ＡＡＶライブラリーまたは自己相補的組換え型ＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージングした。簡単に言えば、一過性トランスフェクション、イオジキサノールの密度勾配遠心分離による精製、及びＡｍｉｃｏｎでのろ過によるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）へのバッファー交換を、３回繰り返してＡＡＶベクターを作製した。ＤＮａｓｅ耐性ウイルスゲノム力価を、Ｂｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。
ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶ変異体のインビボ選択及び特性解析
７週齢のＧＦＡＰ−Ｃｒｅ７３．１２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ ０１２８８６）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ０００６６４）、またはＡｉ９ ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ ００７９０９）をイソフルランで麻酔し、定位固定装置に置いた。切開を行って頭蓋骨を露出させ、ドリルで注入用の穴を作製した。ライブラリー選択では、先に記載の１００のように、ＡＡＶライブラリーの等モル混合物（１×１０１０ウイルスゲノム／μｌ）５マイクロリットルを、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３）の右側脳室内、座標がブレグマより０．０５ｍｍ後ろ、１．０ｍｍ側方、深さ２．５ｍｍにハミルトンシリンジを使用して定位的に注入した。マウス脳アトラス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ，２００７）を使用して注入座標を選択し、０．１％ＦａｓｔＧｒｅｅｎ色素（Ｓｉｇｍａ）を用いて試験注入をしてから調整した。試験期間を通しての注入精度は、脈絡叢内及び対側の側脳室周辺のレポーター発現により確認された。注入から３週間後にマウスを屠殺し、脳組織を採取した。乳鉢及び乳棒を使用してドライアイス上で注射部位の対側半球を均質化した。プロテアーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＲＮａｓｅ Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加したＨｉｒｔ溶解バッファー中で均質化組織を５５℃にて３時間消化させ、先のＡｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４に記載のようなＨｉｒｔ法を使用して染色体外ＤＮＡを単離した。ＰＣＲプライマーＣａｐ＿ＩＳＦ及びＣａｐ＿Ｒを使用して逆位ｃａｐを増幅させ、プライマーＣａｐ＿ＮＳＦ及びＣａｐ＿Ｒで非逆位ｃａｐを特異的に増幅させた。逆位ｃａｐの増幅が困難な場合はネステッドＰＣＲでプライマーＩｎｔｅｒｎａｌ＿Ｃａｐ＿ＩＳＦ及びＩｎｔｅｒｎａｌ＿Ｃａｐ＿Ｒを使用してよい。選択を３ラウンド行った後、サンガー法による配列決定（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でカプシド配列を決定し、優性変異体をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＸＸ２Ｎｏｔに連結して組換え型ＡＡＶパッケージングに供した。
インビボでのＳＣＨ９及びＡＡＶ９の特徴を明らかにするため、ＧＦＰまたはＣｒｅを発現している自己相補的組換えベクター（１×１０１０ウイルスゲノム／μｌ）５マイクロリットルを、Ｃ５７ＢＬ／６またはＡｉ９ ｔｄＴｏｍａｔｏマウスそれぞれの右側脳室内、座標がブレグマより０．０５ｍｍ後ろ、１．０ｍｍ側方、深さ２．５ｍｍにハミルトンシリンジを使用して定位的に注入した。Ａｉ９マウスは、一本鎖ＳＣＨ９ ＣＡＧ−Ｃｒｅの注入に先立ち、５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の注入を３日間連続で受けた。深部小脳核への注入では、ＧＦＰを発現している組換え型ＡＡＶベクター（２×１０９ウイルスゲノム／μｌ）４マイクロリットルを、右半球内、座標がブレグマより６．０ｍｍ後ろ、２．０ｍｍ側方、小脳表面から深さ２．２ｍｍにハミルトンシリンジを使用して定位的に注入した。動物処置法は、ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたものであり、動物管理に関するＮＩＨガイドラインに従って実施された。
免疫組織染色
マウスを、ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により麻酔し、０．９％生理食塩水で経心腔的灌流を行った後、４％パラホルムアルデヒドで経心腔的灌流を行った。脳を４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて一晩、灌流後固定を行い、ＰＢＳで洗浄し、脳が沈んでくるまで３０％ショ糖中で保存した。冠状断または矢状断での連続切片を、Ｓｅｒｉｅｓ ８０００スライディングミクロトーム（Ｂｒｉｇｈｔ）で厚さ４０μｍにカットして作製し、使用時まで凍結保護剤中で−２０℃にて保存した。浮遊切片をＰＢＳ中で３回洗浄し、ブロッキング溶液（１０％ロバ血清、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ）と共に室温で２時間インキュベートし、一次抗体を用いてブロッキング溶液中で４℃にて７２時間染色した。本試験では以下の一次抗体を使用した：マウス抗カルビンジン（１：２０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ８２８１２）、ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ−１１１２２）、ヤギ抗ＧＦＡＰ（１：７５０；Ａｂｃａｍ、ａｂ５３５５４）、モルモット抗ＤＣＸ（１：１０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ２２５３）、ラット抗ＶＣＡＭ１（１：５０；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ２６２７）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：７５０；Ａｂｃａｍ、ａｂ４６７４）、ラット抗ＢｒｄＵ（１：７５０；Ａｂｃａｍ、ａｂ６３２６）、及びウサギ抗ｔｄＴｏｍａｔｏ（１：７５０、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６００−４０１−３７９）。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、切片を二次抗体と共に室温で２時間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１０分間染色した。染色した切片をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ ＨａｒｄＳｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してスライドガラス上に封入した。
画像処理及び解析
Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１または共焦点Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０ ＮＬＯ ＡｘｉｏＥｘａｍｉｎｅｒ（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）を使用して画像を取得した。画像解析はすべて、同等の設定で取得した原画像で実施した。データは、平均±ＳＥＭとして提示され、統計的有意性は両側スチューデントのｔ検定により確証された。
ＳＶＺは、上衣細胞、成体ＮＳＣ（Ｂ型細胞）、一過性増殖細胞（Ｃ型細胞）、神経芽細胞（Ａ型細胞）、及び成熟アストロサイトなど、複数の細胞型で構成される。例えば、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．８を参照のこと。ＳＶＺにおけるＮＳＣの形質導入の有効性を評価するため、ＮＳＣ内に選択的に発現させた分子マーカーを最初に評価した。ほとんどのマーカーは、細胞系譜が進行する間の遺伝子発現の連続体を反映して、ＳＶＺ内の複数の細胞型で発現されるが、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）は、脳室と接する、ＮＳＣのエンドフィートに特異的に局在する。例えば、Ｋｏｋｏｖａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １１を参照のこと。
ＳＶＺの形質導入体積を決定するため、ＳＶＺでＧＦＰを発現している表面積を、１群につきマウス３匹の、側脳室前角から前交連までのＳＶＺに及ぶ６冠状断でＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．７を参照のこと）閾値処理画像から定量化した。総表面積に、切片厚さ（４０μｍ）と切片間距離を掛け、形質導入体積を得た。同じ閾値処理画像は、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用した、ＧＦＰ発現の積分強度の定量化に使用された。
吻側移動経路のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性神経芽細胞の割合を定量化するため、吻側移動経路におけるダブルコルチン及びｔｄＴｏｍａｔｏに陽性の細胞体の閾値、セグメント、及びスコアに対しＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒのセルセグメンテーション能を適用した。各群ともマウス４〜５匹を用い、動物それぞれにおいて吻側移動経路を含有している２〜５枚の矢状方向組織切片から測定を行った。成体神経幹細胞への形質導入を評価するため、脳室下帯のすべてのＢｒｄＵ陽性細胞の同一性を、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＧＦＡＰまたはＤＣＸとの共局在によりスコア化した。マウス５匹のＳＶＺに及ぶ矢状断切片を動物１体につき４〜５枚採取し、切片５枚ごとの共焦点画像でカウントを実施した。
ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性である、カルビンジン染色面積の割合を計算するため、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒパイプラインを用いて、カルビンジン染色の閾値処理マスクを生成した。このマスクを、閾値処理したｔｄＴｏｍａｔｏ画像に適用し、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性面積を総カルビンジン面積で割った。カルビンジンマスク内の閾値処理ｔｄＴｏｍａｔｏの積分強度も記録した。各群のマウス４〜５匹で、小脳に及ぶ４０μｍの矢状方向組織切片４〜７枚の測定を行った。
ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶ変異体のインビトロ特性解析
特に断りのない限り、細胞株はすべて、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。ＳＣＨ９、ＳＣＨ２、及び野生型ＡＡＶ２のヘパリン親和性を、先のＪａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９に記載のように決定した。１ｍｌ ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で平衡化した。１×１０１１の精製ウイルスゲノム粒子をカラムに担持させ、５０ｍＭのＮａＣｌを最終濃度９５０ｍＭまで段階的に増加させて溶出を行い、その後、１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。各溶出画分を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させ、感染から４８時間後、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ６ＨＴフローサイトメーター（ＥＭＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用してＧＦＰ陽性細胞の割合を定量化した。
細胞の形質導入に対する、ＡＡＶによるガラクトース及びヘパラン硫酸プロテオグリカンの利用を、先のＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８に記載のように特徴付けした。細胞表面に末端ガラクトース残基を提示するＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）の組織培養施設から入手し、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＭＥＭ αヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。播種の翌日、細胞を４℃で３０分間インキュベートし、その後、１００μｇ／ｍＬのＥｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチン（ＥＣＬ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）添加または無添加のＭＥＭで完全に培地交換を行った。自己相補的ｒＡＡＶ ＣＡＧ−ＧＦＰビリオンに、可溶性ヘパリン（５００μｇ／ｍＬ）含有ＰＢＳによる処理または偽処理を１時間行い、その後、ゲノムＭＯＩ １２，０００（ｎ＝３）で使用して細胞を感染させた。ウイルスと１時間インキュベーションした後、Ｌｅｃ２細胞を冷やしたＰＢＳで３回洗浄して未結合ＡＡＶを除去し、感染から７２時間後にＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーで定量化した。
抗体回避特性を分析するため、ＳＣＨ９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を、熱非働化処理ＩＶＩＧ（Ｇａｍｍａｇａｒｄ）の系列希釈と共に３７℃で１時間インキュベートし、その後、先のＳａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２に記載のように、ゲノムＭＯＩ ８，０００（ｎ＝３）で使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させた。感染から４８時間後にＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーで定量化した。中和抗体価は、ＧＦＰ発現の５０％以上の減少が観察された最初のＩＶＩＧ濃度として記録された。
ＡＡＶＲへの依存を検討するため、野生型のＨｅＬａまたはＡＡＶＲＫＯ細胞（クローンＫＩＡＡ０３１９Ｌ）を、ＳＣＨ９、ＳＣＨ２、または自己相補的ＣＡＧ−ＧＦＰを保持するＡＡＶ２にゲノムＭＯＩ ２０，０００（ｎ＝６）で感染させた。感染から７２時間後にＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーで定量化した。
結果
６つの天然の血清型−ＡＡＶ２、４、５、６、８、及び９を組み換えたキメラＡＡＶライブラリーを設計した。
図１．
設計パラメータを指定した後、ＲＡＳＰＰによる方法（最短経路問題としての組換え）（例えば、Ｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＥＤＳ １７を参照のこと）を適用して、変異レベルの範囲にわたり、最も破壊の少ない１６０のライブラリー設計（７つの交差位置からなる各種セット）を短時間で同定した。これらの設計それぞれについて、平均ライブラリー破壊スコア＜Ｅ＞及び最も近い親血清型に対する導入されたアミノ酸変異数＜ｍ＞を計算し（図１Ａ）、すべてのＲＡＳＰＰ設計の交差位置を図１Ｂに提示した。いくつかの理由から、カプシドの結晶化領域のサブユニットあたりの平均破壊スコア＜Ｅ＞が５９、平均変異数＜ｍ＞が８２である最終設計（図１Ａ−Ｃ）を選択した。第１に、この設計は、＜Ｅ＞における極小を高レベルの変異で表すＲＡＳＰＰライブラリークラスター内にあった（図１Ａ）。第２に、選択した設計では、表面露出ループ及び天然のＡＡＶ血清型の進化において最も可変な領域を表す超可変領域など、カプシドの主要な構造的特徴がシャッフルされていた（図１Ｃ）。接触に富むこれらの領域内での組換えにより大きな破壊がもたらされたが、新規かつ興味深い機能を有するＡＡＶキメラを生じさせる可能性も高かった。例えば、ブロック５とブロック６を合わせることにより有意に低い破壊スコアの達成が可能と考えられたが、そのようにすることで、単一親配列由来の表面露出ループ領域を有するカプシドが生じることが考えられた。最終的に、ブロックサイズの分布が比較的均等に得られることから、このセットの交差位置を選択した。２０〜２５０アミノ酸の許容ブロックサイズ範囲が考慮されるようＲＡＳＰＰをプログラムした。＜Ｅ＞が最も低い設計の大部分には２つの長ブロック（ブロック３及びブロック４で１７５アミノ酸超）、それに続く一連の短ブロック（ブロック５〜７で３０アミノ酸未満）（図１Ｂ）が含有されていた。対照的に、選択された交差位置セット（図１Ｃ）では、ブロックサイズの分布がさらに均等に得られ、これにより、多様性に限界がある親配列の少数領域内に交差を限定する場合とは対照的に、カプシド全体のシャッフリングが保証された。
選択されたライブラリー設計をコンビナトリアルゴールデンゲートクローニングで構築し（例えば、Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７３を参照のこと）、エレクトロコンピテントな大腸菌にクローニングして５×１０６超の形質転換体を得、ＡＡＶビリオンにパッケージングした。ウイルスパッケージングの前後で、各ブロック位置における親血清型の頻度をディープシークエンシングにより分析した（図１Ｆ）。ウイルスパッケージング前には各ブロック位置にて各親血清型配列は良好に表れ、分布していたが、パッケージングにより、恐らく安定なカプシドに有意な選択圧がかかり、それにより、ライブラリー組成に劇的な変更が生じたと考えられる。例えば、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５の頻度はそれぞれ、パッケージングされたライブラリーを通じて平均で３４８倍及び３７２倍低下しており、これは、ライブラリーアセンブリに使用した他のＡＡＶ親より、これらの血清型のアミノ酸配列同一性が平均して低かった（ＡＡＶ４：６０％、ＡＡＶ５：６５％）ことによると考えられる。パッケージング時のライブラリー組成の変更もまた、結晶化サブユニットあたりの平均破壊スコア＜Ｅ＞が５９から４に減少し、平均変異数＜ｍ＞が８２から２８に減少したことに反映されていた。したがって、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＥＤＳ １９、及びＯｔｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．１１に記載のＳＣＨＥＭＡに関する先行出願と一致して、＜Ｅ＞が低いキメラはライブラリーにおいて重度に濃縮されていた。ＡＡＶ２の選択性はブロック５及びブロック６に、ＡＡＶ９の選択性はブロック８にあった。今後、これらの傾向を使用すれば合理的なカプシド操作を導くことができるであろう。
実施例２：ＡＡＶ指向進化のＣｒｅ依存的選択法
ＮＳＣを特異的に指向させるため、ＳＶＺのＮＳＣを感染させたＡＡＶ変異体の陽性選択を誘導するよう、インビボのＣｒｅ依存的指向進化及び選択法を設計した。本試験の期間中、概念上は似ているが別個のＣｒｅ依存的システムが報告された。Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４を参照のこと。
細胞型特異的プロモーターの制御下でＣｒｅ発現を誘導した３００を超えるトランスジェニックマウスを作製した。例えば、Ｈｅｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．３を参照のこと。
図６．
ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子の選択的回収を仲介するよう、ｃａｐ遺伝子を一対のｌｏｘＰ部位で挟むことによりＣｒｅ発現の細胞型特異性を形成させた。Ｃｒｅを発現している細胞をＡＡＶに感染させて２本目のＡＡＶゲノムを合成させ、ｆｌｏｘｅｄになっていたｃａｐの逆位を生じさせ、逆位になった遺伝子鋳型でのみフォワードプライマーとリバースプライマーの対として機能するＰＣＲプライマーを使用して、Ｃｒｅ逆位ｃａｐ遺伝子を脳組織から選択的に回収した（図６Ａ、Ｂ）。変異ｌｏｘＰ部位であるｌｏｘ６６及びｌｏｘ７１ ４０を用いて、Ｃｒｅ組換えの平衡を一方向性逆位に誘導した。最初、ｌｏｘＰ部位をｃａｐの３’ＵＴＲに挿入したが、その際、Ｃｒｅ依存的回収に使用するリバースプライマー用の標的配列を含有した短いスタッファー配列にｌｏｘＰ部位を隣接させた。図７に示すように、細菌プラスミドの増殖中、組換えは少量出現し、リコンビナーゼ欠損大腸菌のＳｕｒｅ２でも低かった。インビボ選択の際、こうした望ましくない逆位ｃａｐ回収がないようにするため、ｌｏｘＰ部位がｃａｐに隣接するよう位置を決め直し、ベクタープラスミドライブラリーの細菌増殖の際の人工的逆位が、ウイルスタンパク質をコードしない逆位ｃａｐ配列を生じさせて、２９３細胞にそれ以上パッケージングが行われないようにしたが、これは、別の設計には含まれていない規定である。例えば、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４を参照のこと。ｌｏｘＰ部位をｃａｐ遺伝子に隣接させて挿入したことにより、ｒｅｐ遺伝子の読み枠が変化したことに留意されたい。したがって、ｒｅｐの翻訳開始コドンを除去し、ｃａｐ発現を誘導したウイルスプロモーターは維持した（図６Ａ）が、その代わりに、ｒｅｐをコードする別個のヘルパーを一過性にトランスフェクションすることにより、ウイルスパッケージングにｒｅｐをトランスで供給した。ウイルスパッケージングプラスミドに対するこれらの修飾により、ｑＰＣＲで定量化したＡＡＶウイルスゲノムの収量は高かった（図６Ｃ）。
ＳＶＺの成体ＮＳＣはグリア細胞のマーカーを発現し、これらには、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７を参照のこと）、グルタミン酸・アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ）（例えば、Ｐｌａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｌｉａ ５７を参照のこと）、及び脳型脂質結合タンパク質（ＢＬＢＰ）（例えば、Ｇｉａｃｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２を参照のこと）が含まれる。成体ＮＳＣの形質導入用に選択するため、マウスＧＦＡＰプロモーターによりＣｒｅリコンビナーゼ発現が制御されるＧＦＡＰ−Ｃｒｅ７３．１２マウス系統を用いた。ＧＦＡＰを発現している成体神経幹細胞及び成熟アストロサイトでＣｒｅ発現が観察された。例えば、Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７を参照のこと。Ｃｒｅは、神経幹細胞に加えアストロサイトでも発現したが、脳室内（ＩＣＶ）投与経路は、神経幹細胞が存在するＳＶＺへの選択的形質導入をもたらし、ＧＦＡＰはＮＳＣ固有性に関する重要なマーカーとして機能した。例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７を参照のこと。ｃａｐのＣｒｅ依存的回収を確認するため、ｆｌｏｘｅｄのｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶライブラリー（ｐＳｕｂ２ＦｌｏｘＣａｐ）をＧＦＡＰ−Ｃｒｅ７３．１２またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスに脳室内注入で送達した。逆位ｃａｐは、Ｃｒｅを発現しているマウスの脳組織からしか増幅させることができなかったが、非逆位ｃａｐは両群に存在していた（図６Ｄ）。Ｃｒｅ組換えが生じるためには、治療用導入遺伝子発現に必要とされるように、ＡＡＶゲノムは二本鎖形態になければならない。したがって、ＧＦＡＰ陽性細胞を感染させなかったカプシドを示すＧＦＡＰ−Ｃｒｅ７３．１２マウスから増幅させたｃａｐ遺伝子の非逆位プールは、ウイルスの生活環という側面（例えば、カプシド脱殻、エンドソーム脱出）の一部で欠陥があった、または第２鎖合成が完了しなかったのだと考えられた。このことから、Ｃｒｅ依存的選択法では、標的細胞型における確実な導入遺伝子発現に必要な全ステップを完了するカプシド変異体に限定して回収した。
実施例３：インビボでのライブラリー選択から優性ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶ変異体が絞られる
ｃａｐのＣｒｅ依存的回収を確認した後、６つのＡＡＶライブラリーの等モル混合物を使用してインビボ選択を開始し、ライブラリーの各々は、１０６〜１０７の特有の変異体、すなわち、（ｉ）新規ＳＣＨＥＭＡ ＡＡＶ、（ｉｉ）エラーが起こりやすいＡＡＶ９、（ｉｉｉ）祖先ＡＡＶ（例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２を参照のこと）、（ｉｖ）ＤＮａｓｅ Ｉにより消化し、ＡＡＶ１、２、４、５、６、８、及び９を再構築することによる、シャッフルＡＡＶの作製（例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６を参照のこと）、（ｖ）エラーが起こりやすいＡＡＶ２（例えば、Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃ．１を参照のこと）、及び（ｖｉ）アミノ酸５８８に７ｍｅｒペプチドの挿入があるＡＡＶ２（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１を参照のこと）を含有した。ライブラリーｉｉｉ〜ｖｉは、これまでの本発明者らの指向進化選択では高感染性クローンを与え、進化的なＳＣＨＥＭＡライブラリー競争をした。例えば、Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５；Ｔｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｎ；Ｓｔｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ １；Ｋｏｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６；及びＳａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２を参照のこと。ライブラリーを合わせて成体ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウス（ｎ＝３）の右側脳室内に脳室内投与で注入し、両半球のＳＶＺ全体にわたりＮＳＣに形質導入した。対照的に、ＳＶＺへの直接注入は局所組織に対しより破壊的であり、同量の組織体積を網羅するためには複数注入を要し得たであろう。
注入から３週間後、対側の脳半球を採取してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｃｒｅにより組み換えられたＡＡＶ ｃａｐ変異体をＧＦＡＰ発現細胞からＰＣＲで回収した。対側半球を採取し、皮質上方から側脳室にかけての注入路に関連する形質導入からは、ｃａｐ変異体は回収されなかったことを確認した。３ラウンドのインビボ選択の後、２４のクローンをサンガー法による配列決定で解析したところ、ＳＣＨＥＭＡライブラリーに由来する２つの変異体に絞られることが明らかになった。ＳＣＨ９（キメラ６、９、８、９、９、２、９、９；＜Ｅ＞９、＜ｍ＞４９）は回収されたクローンの５４％を表し、ＳＣＨ２（キメラ６、９、８、９、２、２、９、９；＜Ｅ＞４、＜ｍ＞３７）は３３％を表した。それ以外のクローンは、ＡＡＶ２ ７ｍｅｒ挿入（８％）及び祖先ライブラリー（４％）に由来した。ＳＣＨ９は最も近い親であるＡＡＶ９とは異なり、総変異数５８（アミノ酸同一性９２％）である。これら（＜ｍ＞）のうち４９はカプシドの結晶化領域にあり、９は非結晶化領域にある。ＳＣＨ９、ＳＣＨ２、及び複数の親ＡＡＶ血清型の各配列のアミノ酸アラインメントはそれぞれ図８、９、及び１０に記載されている。２つのＳＣＨＥＭＡ変異体はブロック５のみが異なり、１８アミノ酸の相違がある。
図１１．
ＳＣＨ９の３次元構造モデルにより、ＡＡＶ９はカプシド表面のループＶＲ−ＩＶに、ＡＡＶ２はループＶ〜ループＶＩＩＩに、ＡＡＶ８は５回回転対称軸の細孔構造に示された。これらの興味深い特徴、及び選択プールに対するその優位性に基づき、ＳＣＨ９のインビボ特性解析を行った。
実施例４：ＳＣＨ９は成体マウスのＳＶＺの成体神経幹細胞に効率的に形質導入する
ＳＶＺでのＳＣＨ９の形質導入特性を評価するため、自己相補的ＣＡＧ−ＧＦＰカセットを保持するｒＡＡＶを首尾よくパッケージングし（組換え型ＡＡＶパッケージングの収量は図１２に報告されている）、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側脳室に送達した。ＡＡＶ９はＣＮＳで広く使用されており、髄腔内注入後、脳脊髄液（ＣＳＦ）から脳実質へ形質導入する能力があることから、ＡＡＶ９を基準にＳＣＨ９を評価した。例えば、Ｓａｍａｒａｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３、及びＳｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．８を参照のこと。さらに、天然血清型のうち、ＡＡＶ９がＳＣＨ９に最も近縁の配列である。
図１３．
注入から４週間後に対側半球の形質導入を解析したところ、ＧＦＰ発現は脳室周辺領域に主に関連しており、その強度は脳室下帯で最も強かった（図１３Ａ）。形質導入効率を、ＧＦＰ発現強度、及びＧＦＰ陽性であったＳＶＺの総体積の両方によって評価した。ＳＣＨ９では、組込みＧＦＰの蛍光強度は２４倍高く、またＧＦＰは、ＡＡＶ９と比べて１２倍大きいＳＶＺ形質導入体積で発現した（図１３Ｂ、Ｃ）。初回特性解析として、脳室下帯でＧＦＰ／ＧＦＡＰ／ＶＣＡＭ１陽性成体神経幹細胞にＳＣＨ９により形質導入した（図１３Ｄ）。
組換え型ＡＡＶゲノムはエピソームに維持され、ＳＶＺでの成体神経発生の特徴であるように細胞分裂の際に徐々に失われていった。具体的に、神経幹細胞から嗅球介在ニューロンまでの系譜の進行では７回を超える細胞分裂が行われた。例えば、Ｐｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ １２を参照のこと。ＡＡＶゲノムが希釈されていった結果、注入後の後半の測定ポイントにおいて導入遺伝子の発現を続ける細胞の大部分は、ゆっくりと分裂するＮＳＣまたは分裂終了細胞であった。さらに、レトロウイルスベクターの組み込みを使用した先の研究では、神経芽細胞が吻側移動経路を横切って嗅球へ達するまでに要する時間は９日であったこと、また、注入時にＳＶＺに存在していた一過性増殖細胞及び神経芽細胞はいずれも嗅球に分化及び／または遊走し、注入後３０日までに樹状突起を形成したことが示された。例えば、Ｐｅｔｒｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２；及びＬｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４を参照のこと。これらの結果から、注入後、後半の測定ポイントで吻側移動経路に存在していた神経芽細胞はＮＳＣに由来していたことが示され、レンチウイルスまたはウイルス以外によるＳＶＺのＮＳＣへの形質導入の確証にこれまで用いられた結論であることが示された。例えば、Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１、及びＢａｒｎａｂｅ−Ｈｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５を参照のこと。ＮＳＣの形質導入の指標として、注入後３０日にｔｄＴｏｍａｔｏを発現している移動神経芽細胞数を決定する同様の系譜解析法を設計した。Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする組換え型ＳＣＨ９またはＡＡＶ９を成体Ａｉ９ ｆｌｏｘｅｄ ＳＴＯＰ ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの右側脳室内に注入した（例えば、Ｍａｄｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３を参照のこと）が、それらのマウスでは、Ｃｒｅ活性によって形質導入細胞及びその子孫でｔｄＴｏｍａｔｏの発現がもたらされた。Ｃｒｅ発現ＳＣＨ９の注入から３０日後の吻側移動経路において、神経芽細胞の大部分（右半球に注入が８３．２±３．６％、左半球に注入が５０．３±４．４％）がｔｄＴｏｍａｔｏ陽性であり（図１３Ｅ、Ｇ）、ＡＡＶ９の形質導入を４倍以上超えていた。さらに、大量のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性神経芽細胞が嗅球で放射状移動し、顆粒細胞ニューロンの形態をとることが観察された（図１３Ｆ）。
ＮＳＣの形質導入をさらに特徴づけるため、一本鎖ＳＣＨ９ ＣＡＧ−Ｃｒｅの注入に先立ち、チミジンアナログであるＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）を投与して、ＳＶＺの分裂細胞を標識した。２週間のウォッシュアウト期間の後、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現と、ＧＦＡＰ＋ ＮＳＣへのＢｒｄＵの取り込みとの共局在を分析した（図１３Ｈ）。ＳＶＺでｔｄＴｏｍａｔｏを発現している成体ＮＳＣ（ＧＦＡＰ＋、ＢｒｄＵ＋、ダブルコルチン−）、一過性増殖細胞（ＧＦＡＰ−、ＢｒｄＵ＋、ダブルコルチン−）、及び神経芽細胞（ＧＦＡＰ−、ＢｒｄＵ＋、ダブルコルチン＋）の割合を定量化した（図１３Ｉ）。両半球共にＮＳＣの約６０％が形質導入されており、一本鎖フォーマット及び自己相補的フォーマットの両方を使用する、ＮＳＣへの遺伝子送達についてのＳＣＨ９の有効性を支持している。
実施例５：ＳＣＨ９は小脳のプルキンエ細胞指向性も示す
標的細胞型の感染を高めるカプシド変異は脳の他の領域での形質導入を同時に改善することができる。
図１４．
脳室内注入の後のＳＣＨ９による形質導入は主にＳＶＺに関連しているが、脳脊髄液中を循環するベクターに直接接近可能な脳の領域である小脳のプルキンエ細胞において、レポーター発現の増加も観察された（図１４Ａ）。プルキンエ細胞は、脊髄小脳失調症など神経変性疾患に対する遺伝子治療の主要標的である。例えば、Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９７を参照のこと。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒで定量化したところ、ＳＣＨ９−Ｃｒｅの送達によりｔｄＴｏｍａｔｏレポーター発現はＡＡＶ９−Ｃｒｅよりも１２．２倍強く活性化し、カルビンジン陽性領域は９．３倍広い領域を占めた（図１４Ｂ、Ｃ）。
脳脊髄液からのプルキンエ細胞への形質導入にＳＣＨ９が成功したことから、ＳＣＨ９が持つ、小脳への遺伝子送達ベクターとしての可能性が示唆された。小脳の遺伝子治療には、プルキンエ細胞から抑制性入力を受ける小脳回路の主な中心部である深部小脳核に対するｒＡＡＶによる送達が利用されている。例えば、Ｋｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｒａｉｎ：Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３８、及びＤｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６を参照のこと。この回路を使用して、深部小脳核にｒＡＡＶを単回注入すれば、逆行性輸送ベクターにより小脳皮質全体にわたってプルキンエ細胞に形質導入することができるであろう。
図１５．
小脳への遺伝子送達に最も一般的に使用される血清型であるＡＡＶ１の形質導入パターンとＳＣＨ９の形質導入パターンを、右半球深部小脳核内への片側注入の後、比較した。両ベクターとも、同側半球の小脳全体にわたりプルキンエ細胞への強い形質導入を支持したことから、ＳＣＨ９は逆方向に輸送され得ることが示された。
実施例６：ＳＣＨ９はヘパラン硫酸プロテオグリカン及びガラクトースのどちらも細胞形質導入に利用することができる
ＳＣＨ９の感染特性が有望であることから、その複数の親血清型の受容体結合能を調節することによりＳＣＨ９に選択的長所を付与し得るか否かを決定するため、そのキメラとしての性質を次に調べた。ＳＣＨ９のブロック６はＡＡＶ２カプシドのヘパリン結合ポケットを含有した。例えば、Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７を参照のこと。さらに、ブロック２及びブロック５は、ＡＡＶ９のガラクトース結合残基Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｎ４７０、及びＹ４４６を含有し、ブロック６は残基Ｗ５０３を保存していた。例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６を参照のこと。対照的に、ＳＣＨ２は、ブロック５でＡＡＶ９がＡＡＶ２で置換されたため主要ガラクトース結合残基を２つ欠いた。
図１６．
両ＳＣＨＥＭＡ変異体のヘパリン親和性がＡＡＶ２に匹敵することを示すため、最初にクロマトグラフィーを利用し、これにより、ヘパリンポケット外側のキメラ配列構成は結合親和性に有意な影響を与えないことが示された（図１６Ａ）。次に、末端ガラクトース残基及びＨＳＰＧを細胞表面に発現するＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞を感染させ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）とガラクトースとを二重に利用する可能性を評価した。先にＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８に記載されるように、Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチン（ＥＣＬ）を付加すると末端ガラクトースは遮断されたが、ウイルスを可溶性ヘパリンとインキュベーションすると、ＨＳＰＧを細胞への進入に利用するＡＡＶ血清型を競合的に阻害した。予測通り、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９の対照ベクターはそれぞれ、ＨＳＰＧ及びガラクトースを利用した。興味深いことに、ＳＣＨ２はもっぱらＨＳＰＧ依存的であったが、ＳＣＨ９はＨＳＰＧ及びガラクトースの双方を使用することができたため、実際には、細胞へ形質導入しないよう双方を遮断する必要があった（図１６Ｂ）。ＳＣＨ２及びＳＣＨ９の異なるグリカン結合特性を特徴付けた後、天然のＡＡＶ血清型でＡＡＶ感染に重要な、新たに記載されたタンパク質受容体であるＡＡＶＲの利用を両変異体が保持したか否かを決定するため、これらの変異体を調べた。例えば、Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５３０を参照のこと。
図１７．
ＳＣＨ２、ＳＣＨ９、及びＡＡＶ２対照はいずれも、明らかにＡＡＶＲに依存していた。
最後に、ＤＮＡシャッフリングは中和抗体エピトープを破壊することが示されていたため（例えば、Ｍａｈｅｓｈｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４、及びＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２を参照のこと）、天然ＡＡＶ血清型に対する抗体混合物のポリクローナル抗体であるヒト静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）に対するＳＣＨ９の耐性を定量化した。本明細書で表１に示されているように、ＳＣＨ９の中和に要する抗体価は、それが由来する親配列よりも２〜１０倍高かった（図１６Ｃ）。注目すべきことに、改善倍率が最も大きかったのは、最も近縁の親配列であるＡＡＶ９に対してであった。
（表１）ＳＣＨ９及び由来元の親血清型の中和ＩＶＩＧ抗体価。中和抗体価は、ＧＦＰ発現の５０％以上の減少が観察された最初のＩＶＩＧ濃度を表す。
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参考文献
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本発明をその具体的な実施形態を参照にして記載してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなくさまざまな変更及び同等物での置き換えを行ってよいことを当業者は理解するべきである。さらに、特定の状況、材料、物質組成、処理、処理ステップまたは複数ステップを本発明の目的、趣旨及び範囲に適応させるために、多数の修正を行ってよい。そのような修正はいずれも、本明細書に添付の請求の範囲内であることが意図される。

Claims (65)

  1. 組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
    （ａ）少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する少なくとも５つのセグメントを含み、かつ、
    （ｉ）野生型ＡＡＶビリオンを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して前記神経幹細胞への感染力が高い、
    （ｉｉ）野生型ＡＡＶビリオンを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経細胞への感染力と比較して前記神経細胞への感染力が高い、
    （ｉｉｉ）野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが細胞障壁を通過する能力と比較して前記細胞障壁を通過する能力が高い、
    （ｉｖ）ヒトＡＡＶ中和抗体に対する耐性が、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い、
    という特性のうち１つ以上を付与する、変異ＡＡＶカプシドタンパク質、及び
    （ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、前記組換え型アデノ随伴ウイルスビリオン。
  2. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、
    （ａ）第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第１のセグメント、
    （ｂ）第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第２のセグメント、
    （ｃ）第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第３のセグメント、
    （ｄ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第４のセグメント、及び
    （ｅ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第５のセグメント
    を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  3. 前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
  4. 前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
  5. 前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
  6. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、
    （ａ）第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第１のセグメント、
    （ｂ）第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第２のセグメント、
    （ｃ）第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第３のセグメント、
    （ｄ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第４のセグメント、及び
    （ｅ）第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第５のセグメント
    を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  7. 前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、請求項６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  8. 前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、請求項６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  9. 前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、請求項６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  10. 前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、請求項６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  11. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、
    （ａ）第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第１のセグメント、
    （ｂ）第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第２のセグメント、
    （ｃ）第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第３のセグメント、
    （ｄ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第４のセグメント、及び
    （ｅ）第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１〜アミノ酸８００に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第５のセグメント、
    （ｆ）前記第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２５１〜アミノ酸９６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第６のセグメント、
    （ｇ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸３０１〜アミノ酸１１２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第７のセグメント、及び
    （ｈ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸３５１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第８のセグメント
    を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  12. 前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、請求項１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  13. 前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、請求項１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  14. 前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、請求項１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  15. 前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、請求項１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  16. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に、
    （ａ）第１のＡＡＶ血清型のアミノ酸１〜アミノ酸１６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第１のセグメント、
    （ｂ）第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸５１〜アミノ酸３２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第２のセグメント、
    （ｃ）第３のＡＡＶ血清型のアミノ酸１０１〜アミノ酸４８０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第３のセグメント、
    （ｄ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸１５１〜アミノ酸６４０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第４のセグメント、及び
    （ｅ）第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２０１〜アミノ酸８００に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第５のセグメント、
    （ｆ）前記第４のＡＡＶ血清型のアミノ酸２５１〜アミノ酸９６０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第６のセグメント、
    （ｇ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸３０１〜アミノ酸１１２０に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第７のセグメント、及び
    （ｈ）前記第２のＡＡＶ血清型のアミノ酸３５１からＣ末端までのアミノ酸に由来する約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する第８のセグメント
    を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  17. 前記第１のＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  18. 前記第２のＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  19. 前記第３のＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  20. 前記第４のＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  21. 前記ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む前記対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、少なくとも５倍高い前記神経幹細胞への感染力を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  22. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、請求項２１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  23. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、請求項２１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  24. 前記ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む前記対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、少なくとも１０倍高い前記神経幹細胞への感染力を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  25. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
  26. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
  27. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図８に示すアミノ酸配列に対する少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  28. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図８に示すアミノ酸配列に対する少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  29. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  30. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図９に示すアミノ酸配列に対する少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  31. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図９に示すアミノ酸配列に対する少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  32. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、図９に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  33. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して高い耐性を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  34. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ９である、請求項３３に記載のｒＡＡＶビリオン。
  35. 前記対照ＡＡＶビリオンはＡＡＶ２である、請求項３３に記載のｒＡＡＶビリオン。
  36. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約１．５倍高い耐性を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  37. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約３倍高い耐性を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  38. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約５倍高い耐性を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  39. 前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒトＡＡＶ中和抗体に対し、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンが示す耐性と比較して少なくとも約１０倍高い耐性を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  40. 前記神経幹細胞は脳室下帯由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  41. 前記神経幹細胞は小脳由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  42. 前記遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
  43. 前記遺伝子産物はポリペプチドである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
  44. 前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、血管新生阻害ポリペプチド、神経幹細胞の分化を誘導するポリペプチド、または神経幹細胞の機能を高めるポリペプチドである、請求項４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
  45. 前記ポリペプチドは、セレブロライシン、ラミニン−ＩＫＶＡＶ、ｃｒｉｐｔｏ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、上皮成長因子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、トリペプチジルペプチダーゼ、アスパルトアシクラーゼ、またはソニック・ヘッジホッグである、請求項４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
  46. 前記ポリペプチドはゲノム編集酵素である、請求項４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
  47. 前記ゲノム編集酵素は、Ｃａｓ９ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、または酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、請求項４６に記載のｒＡＡＶビリオン。
  48. 前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
  49. 前記遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
  50. （ａ）請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスビリオン、及び
    （ｂ）薬理学的に許容される添加剤
    を含む、医薬組成物。
  51. 個体の神経幹細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、
    請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは請求項５０に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
  52. 前記投与は、頭蓋内注射、脳室内注射、髄腔内注射、大槽内注射、または静脈内注射による、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記遺伝子産物はポリペプチドである、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、血管新生阻害ポリペプチド、神経幹細胞の分化を誘導するポリペプチド、または神経幹細胞の機能を高めるポリペプチドである、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ポリペプチドは、セレブロライシン、ラミニン−ＩＫＶＡＶ、ｃｒｉｐｔｏ、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、上皮成長因子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子、またはソニック・ヘッジホッグである、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記ポリペプチドはゲノム編集酵素である、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記ゲノム編集酵素は、Ｃａｓ９ポリペプチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、または酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記遺伝子産物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
  61. 神経性障害を治療する方法であって、
    請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは請求項５０に記載の組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
  62. 前記神経性障害は、脊髄小脳失調症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、リソソーム蓄積障害、フリードライヒ運動失調症、神経膠芽腫、レット症候群、前頭側頭型認知症、またはてんかんである、請求項６１に記載の方法。
  63. 変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、
    前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質が、少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する少なくとも５つのセグメントを含み、かつ
    前記変異カプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、前記神経幹細胞への高い感染力を付与する、
    前記核酸。
  64. 請求項６３に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
  65. 変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、
    少なくとも３つの異なるＡＡＶ血清型に由来する、各セグメントが約５０アミノ酸長〜約１６０アミノ酸長を有する少なくとも５つのセグメントを含み、かつ
    野生型ＡＡＶカプシドを含む対照ＡＡＶビリオンによる神経幹細胞への感染力と比較して、前記神経幹細胞への高い感染力を付与する、
    前記変異アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質。
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