JP2020505375A - サルコリピン発現を減少させ、筋ジストロフィおよび心筋症を予防および治療するための組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

細胞におけるサルコリピン（ＳＬＮ）の発現または活性を阻害するため、ならびに被験体（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）を有するまたはＤＭＤを有する素因があるヒト患者）においてＤＭＤ、およびいくつかの実施形態ではさらに心筋症を予防または治療するための組成物、組換えウイルス、および組換えウイルスベクターは、治療有効量のＳＬＮ阻害剤を含む。これらの組成物、組換えウイルス、および組換えウイルスベクターを使用する方法も本明細書に記載される。これらの組成物、組換えウイルス、および組換えウイルスベクターならびに使用方法は、ＳＬＮの発現および／または活性の低下に基づくＤＭＤおよび関連する心筋症の新規治療法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４４９，３７１号、２０１７年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／５７５，０８９号、および２０１７年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８９，２７３号の優先権を主張するものであり、それらの開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９６７３８−００５６７＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、３．７キロバイトの大きさである。

連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された助成金番号１Ｒ０１ＡＲ０６９１０７−０１Ａ１の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、一般に医学、分子生物学、およびウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、細胞におけるサルコリピン（ＳＬＮ）発現を減少させ、被験体におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）および関連する心筋症を予防および治療するための組成物、ベクター、ウイルス、キットおよび方法に関する。

筋ジストロフィの最も一般的で重篤な形態であるＤＭＤは、筋肉中のジストロフィンタンパク質の欠損によって引き起こされるＸ連鎖疾患であるＤＭＤは、男性３，６００人におよそ１人が罹患する衰弱性疾患である。ＤＭＤは、１０代後半または２０代前半までに死に至る、筋力低下、歩行の喪失ならびに最終的な呼吸および心臓への影響（呼吸不全および心不全に陥る）を特徴とする筋ジストロフィの一形態である。ＤＭＤは主に神経筋障害として分類されるが、心臓病がその病因に決定的な役割を果たす。ほとんどすべてのＤＭＤ患者は、特に１０歳代の間に臨床的な心臓症状を示す。呼吸サポートは改善されたが、心筋症（心不全および不整脈につながる）は罹患率および死亡率のますます重要な原因になっている。現在のところ、ＤＭＤの治療法はない。ジストロフィン発現の回復、エクソンスキッピング、幹細胞置換療法、類似体上方調節および遺伝子置換を含む治療戦略は、呼吸器および心臓の組織および線維化を対象とする大きな課題に直面している。したがって、ＤＭＤ患者の疾患の進行を防止するまたは遅らせる新しい治療法が必要とされている。

蓄積された証拠は、細胞内Ｃａ^２＋（Ｃａ^２＋ｉ）の異常な上昇が、ＤＭＤにおいて疾患進行を開始させ、持続させる重要な初期病原性事象であることを示唆する。筋小胞体のＣａ^２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）ポンプの正常な機能は、サイトゾルからのＣａ^２＋除去および適切な筋収縮の７０％以上を占める。したがって、ＳＥＲＣＡ活性の低下は、ＤＭＤにおけるＣａ^２＋ｉ過負荷および筋機能不全の主要な原因と見なされてきた。

被験体（例えばＤＭＤ、心筋症、またはＤＭＤと心筋症を有する被験体）におけるＳＬＮ発現または活性を低下させ、ならびに被験体においてＤＭＤを、いくつの実施形態では心筋症も、予防、改善または治療するための組成物、ベクター、ウイルス、キットおよび方法を本明細書で説明する。組成物、ベクター、ウイルス、キット、および方法にはすべて、ＳＬＮの発現または活性の阻害剤が含まれる。ＳＬＮはＳＥＲＣＡポンプの阻害剤である。ＤＭＤ患者および動物モデルの筋肉中でＳＬＮが異常に上昇すること、ＳＬＮの上方調節がＤＭＤの骨格筋および心筋の両方でＳＥＲＣＡ機能不全の分子基盤であること、ならびにＳＬＮがＤＭＤにおける横隔膜および骨格筋病変ならびに心筋症の治療のための治療標的であることが発見された。ここで述べる実験結果は、ＤＭＤのより重度のジストロフィン／ユートロフィン二重欠損（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−）マウスモデルにおいて、ＳＬＮ遺伝子の１つの対立遺伝子の生殖系列不活性化がＳＬＮ発現を正常化し、ＳＥＲＣＡ機能を回復し、骨格筋および心臓病変を軽減し、筋再生を改善し、寿命を最大５倍延長させたことを実証する。これらの所見を治療戦略につなげるために、１ヶ月齢のｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおいてＡＡＶ媒介ＲＮＡ干渉を介してＳＬＮ発現をノックダウンした。ｒＡＡＶ処置は、ＳＬＮ発現を著しく減少させ、筋病変を減弱させ、横隔膜、骨格筋、および心機能を改善した。これらのデータは、ＳＬＮ減少がＤＭＤのための治療アプローチであることを示す。

したがって、細胞におけるサルコリピン（ＳＬＮ）発現または活性を低下させるための治療有効量で、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を本明細書で説明する。核酸配列は、例えば配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のうちの１つであり得る。ｒＡＡＶは、例えば血清型９（ＡＡＶ９）であり得る。

これらのｒＡＡＶのいずれかを含む組成物も本明細書で述べる。本明細書で述べる組成物は、μ−ｄｙｓをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む第２のｒＡＡＶベクターを含む第２のｒＡＡＶをさらに含むことができる。第２のｒＡＡＶは、例えば血清型９（ＡＡＶ９）であり得る。

さらに、細胞におけるＳＬＮ発現または活性を減少させるための治療有効量で、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを含む組換えウイルスを含む組成物を本明細書で述べる。組成物は、μ−ｄｙｓをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えウイルスベクターを含む第２の組換えウイルスをさらに含むことができる。

さらに、細胞におけるＳＬＮ発現を減少させる方法を本明細書で説明する。この方法は、本明細書で述べるように、細胞を任意のｒＡＡＶと接触させることを含む。

被験体（例えば哺乳動物）においてデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）を予防または治療する方法も本明細書で述べる。この方法は、本明細書で述べる任意のｒＡＡＶを被験体に投与することを含む。典型的な実施形態では、本明細書で述べるｒＡＡＶのいずれかの投与は、被験体において関連する心筋症を予防または治療する。この方法では、本明細書で述べるｒＡＡＶまたは組成物を、例えばＤＭＤの症状または病変の発症前に、被験体に投与することができる。この方法では、被験体（例えば哺乳動物）に、例えば注射によってｒＡＡＶまたは組成物を投与する。

被験体（例えば哺乳動物）における心筋症を治療する方法を本明細書でさらに説明する。この方法は、本明細書で述べるようにｒＡＡＶまたは組成物を被験体に投与することを含む。

また、細胞におけるＳＬＮ発現を減少させるため、または被験体においてＤＭＤを予防または治療するためのキットを本明細書で説明する。キットは、本明細書で述べる１つ以上のｒＡＡＶ、または本明細書で述べる組成物、使用説明書、および包装を含む。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化またはニトロシル化に関わりなく、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味するために同義に使用される。

「サルコリピンタンパク質」、「ＳＬＮタンパク質」、「サルコリピンポリペプチド」および「ＳＬＮポリペプチド」という用語は、天然のヒトＳＬＮタンパク質［ＭＧＩＮＴＲＥＬＦＬＮＦＴＩＶＬＩＴＶＩＬＭＷＬＬＶＲＳＹＧＹ］（配列番号１）、アクセッション番号、ＮＰ＿００３０５４．１などのＳＬＮ遺伝子の発現産物、または前記と少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、天然ＳＬＮタンパク質の機能的活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能的活性」は、タンパク質の生理学的機能に関連するあらゆる活性である。例えば、天然ＳＬＮタンパク質の機能的活性には、ＳＬＮのリン酸化、脱リン酸化、ニトロシル化および／またはユビキチン化が含まれ得る。

本明細書で使用される「精製された」とは、他の多くの化合物または実体から分離されていることを意味する。化合物または実体（例えば核酸、タンパク質、ウイルス、ウイルスベクター）は、部分的に精製され得る、実質的に精製され得る、または純粋であり得る。化合物または実体は、他のすべての化合物または実体が実質的に除去されている、すなわち、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％除去されている場合、純粋と見なされる。

「単離された」または「生物学的に純粋な」という語句は、その天然の状態で見出される通常それに付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。

本明細書で使用される場合、「ＳＬＮ過剰発現」、「ＳＬＮの過剰発現」および「ＳＬＮの異常な上昇」という語句は、正常レベルまたは正常組織と比較してＳＬＮ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のレベルの増加を意味するために交換可能に使用される。

「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする核酸分子、または特定の場合には機能的または構造的ＲＮＡ（リボ核酸）分子を意味する。

本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、ＲＮＡおよびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの２つ以上のヌクレオチドの鎖を意味する。

本明細書で使用される場合、「発現制御配列」という語句は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を調節する核酸を指す。発現制御配列の例には、プロモータ配列、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル、イントロン、転写終結配列、エンハンサー、上流調節ドメイン、複製起点、および内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）が含まれる。「プロモータ」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させるＤＮＡ調節配列を指すために本明細書で使用される。

本明細書で使用される場合、「作動可能な連結」および「作動可能に連結された」という用語は、意図された方法で機能することを可能にするための、そのように記述された成分の物理的または機能的並置を指す。核酸と作動可能に連結された発現制御エレメントの例では、制御エレメントが核酸の発現を調節する関係にある。

「ＳＬＮ遺伝子」、「ＳＬＮポリヌクレオチド」および「ＳＬＮ核酸」という用語は、天然のヒトＳＬＮをコードする核酸配列、例えば天然のヒトＳＬＮ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＭ＿００３０６３．２）、ＳＬＮ ｃＤＮＡが転写され得る配列を有する核酸、および／または前記の対立遺伝子変異体およびホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを包含する。

本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」および「ショートヘアピンＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用できるタイトなヘアピンターンを有する任意の人工ＲＮＡ分子を意味する。ｓｈＲＮＡは、「干渉ＲＮＡ」および「ＲＮＡ干渉分子」という用語に包含される。

「ベクター」は、関心対象の核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質の組成物であり、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を含む。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語には、自律複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。ウイルスベクターの例には、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。発現構築物は、生細胞において複製することができ、または合成的に作製することができる。作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができるベクターは、しばしば「発現ベクター」と称される。本出願の目的のために、「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、本発明の適用を一般的な例示的意味で実証するために交換可能に使用され、本発明を限定することを意図しない。

組換え「ウイルスベクター」は、ウイルスから野生型ゲノムを除去する分子的方法を使用して、それを異種ポリヌクレオチド配列（例えば治療用遺伝子または他の治療用核酸発現カセット）などの非天然核酸で置き換えることによって、ウイルス（例えばＡＡＶ）の野生型ゲノムから誘導される。「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、ＡＡＶの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶの場合、野生型ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がｒＡＡＶベクター内に保持される。組換えウイルスベクター（例えばｒＡＡＶ）配列は、エクスビボ、インビトロまたはインビボで、細胞のその後の感染（形質転換）のためにウイルス（本明細書では「粒子」または「ビリオン」とも称される）にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクター配列がＡＡＶ粒子にキャプシド化またはパッケージングされる場合、粒子は「ｒＡＡＶ」と称され得る。そのような粒子またはビリオンは、典型的にはベクターゲノムをキャプシド化またはパッケージングするタンパク質を含む。特定の例には、ウイルスエンベロープタンパク質が含まれ、ＡＡＶの場合は、キャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）が含まれる。本明細書で述べる実験では、試験したｒＡＡＶはＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮであった。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶを指すために使用される特徴である。血清学的特徴は、別のＡＡＶと比較して、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の違いは、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いに起因する（例えばＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の違いに起因する）。組換えベクター（例えばｒＡＡＶベクターまたはプラスミド）、組換えウイルスまたはビリオン（組換えウイルス粒子）、ならびにその方法および使用は、任意のウイルス株または血清型を含む。ｒＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質の１つ以上とは異なるＡＡＶ血清型ゲノムに基づき得る。ｒＡＡＶベクター（例えば組換えウイルスゲノム）を含むｒＡＡＶ（粒子）は、異なる血清型、血清型の混合物、または異なる血清型のハイブリッドまたはキメラ、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＲｈ１０血清型のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３キャプシドタンパク質などからの少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含み得る。

「患者」、「被験体」および「個体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、治療される、診断される、および／または生物学的試料を得るための哺乳動物（例えばヒト）被験体を意味する。典型的には、被験体は、ＤＭＤに罹患しているかまたは罹患する可能性があり、いくつかの実施形態では、ＤＭＤおよび関連する心筋症およびジストロフィ心筋症に罹患しているかまたは罹患する可能性がある。特定の実施形態では、被験体は青年男性である。別の特定の実施形態では、被験体は成人男性である。

本明細書で使用される場合、「結合する」、または「〜と相互作用する」とは、１つの分子が試料または生物中の特定の第２の分子を認識して付着するが、試料中の他の構造的に無関係な分子を実質的に認識しないまたはそれに付着しないことを意味する。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、その第２の分子に対して約１０^８〜１０^１２モル／リットルを超える結合親和性を有し、共有結合および非共有結合（水素結合、疎水性、イオン性、およびファンデルワールス）であり得る正確な「ハンドイングローブ」ドッキング相互作用を含む。

核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、プローブまたは抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質を核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、プローブまたは抗体にカップリングする（すなわち物理的に結合する）ことによる核酸、ペプチド、ポリペプチド、細胞、プローブまたは抗体の直接標識を包含することを意図する。

核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、「天然」という用語は、天然に存在する（例えば野生型（ＷＴ））核酸またはポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治癒する、治療する、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、和らげる、改善する、または影響を及ぼすことができる任意の分子、化学物質、組成物、薬物、または生物学的作用物質を包含することを意図する。「治療薬」という用語には、ｓｈＲＮＡ、小分子、アンチセンス試薬、核酸、ｓｉＲＮＡ、抗体、酵素、ポリペプチド、ペプチド、組換えウイルス、有機または無機分子、天然または合成化合物などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「治療」および「療法」という用語は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治癒する、治療する、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、和らげる、改善する、または影響を及ぼすことを目的とした、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を有する患者への治療薬の適用もしくは投与、または前記患者から単離された組織もしくは細胞株への治療薬の適用もしくは投与として定義される。本明細書で述べる組成物の方法および使用には、治療効果または有益な効果をもたらす治療方法が含まれる。本明細書に開示される組成物の方法および使用の特定の態様では、核酸の発現は、哺乳動物（例えばＤＭＤに罹患しているヒト）に治療的利益を提供する。様々な実施形態では、１つ以上の有害な（例えば身体的）症状、障害、疾病、疾患、または疾患に起因するもしくは関連する合併症（例えばＤＭＤに関連する心筋症）を阻害する、減少させる、または低減させることがさらに含まれる。

「治療有効量」および「有効投与量」という語句は、治療的に（例えば臨床的に）望ましい結果を生じさせるのに十分な量を意味する；例えば、結果は、細胞におけるＳＬＮの発現または活性の低下、被験体（例えばヒトを含む哺乳動物）におけるＤＭＤの予防または治療、ＤＭＤに罹患している被験体における心機能の増加などであり得る。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」とは、サブユニットの一致を最大化するために、すなわちギャップと挿入を考慮して、２つの配列を整列させる場合、２つの配列の対応する位置にある同一のサブユニットの割合を意味する。配列同一性は、２つの配列の両方のサブユニット位置が同じヌクレオチドまたはアミノ酸で占められている場合に存在し、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて所与の位置がアデニンで占められている場合、分子はその位置で同一である。例えば、１０ヌクレオチド長の配列中の７つの位置が２番目の１０ヌクレオチド配列中の対応する位置と同一である場合、２つの配列は７０％の配列同一性を有する。配列同一性は、任意の適切な配列解析ソフトウェアを使用して測定することができる。

核酸分子中の突然変異に言及する場合、「サイレントな」変化とは、ヌクレオチド配列中の１つ以上の塩基対を置換するが、その配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は変化させないものである。「保存的」変化とは、核酸配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換されるように、核酸のタンパク質コード領域の少なくとも１つのコドンが変化したものである。

本明細書で述べるものと類似または等価の組成物、ベクター、ウイルス、キット、および方法を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な組成物、ベクター、ウイルス、キット、および方法を以下で説明する。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、ならびにＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用などの他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。以下で論じる特定の実施形態は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。

図１は、ＤＭＤモデルの心室におけるＳＬＮの上方調節を示す。図１（ａ）：ｍｄｘマウスおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心室におけるＳＬＮ上方調節を示す代表的なウェスタンブロット（クロップされていない）。ＳＥＲＣＡ２ａおよびＰＬＮレベルは変化しない。図１（ｂ）：定量化は、ＳＬＮレベルがｍｄｘマウスの心室と比較してｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心室では有意に高いことを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。図１（ｃ）：Ｃａ^２＋依存性ＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの速度および図１（ｄ）Ｃａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘは、ｍｄｘおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの両方の心室で有意に低下する。図１（ｅ）：ＷＴマウスとＤＭＤマウス間でのＣａ^２＋取り込みのＥＣ_５０は不変である。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。３〜４ヶ月齢のマウスからの組織を上記のすべての実験に使用する。 図２は、ＤＭＤの犬の筋肉におけるＳＬＮ上方調節を示す。図２（ａ）：ＤＭＤの犬および非ＤＭＤの犬のＥＣＵ筋肉におけるＳＬＮおよびＳＥＲＣＡアイソフォームのタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット。このウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１５ａに示す。図２（ｂ）：定量化は、ＤＭＤの犬のＥＣＵでは、ＳＬＮおよびＳＥＲＣＡ１レベルが有意に上昇し、一方ＳＥＲＣＡ２ａレベルが有意に低下することを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。図２（ｃ）：Ｃａ^２＋依存性ＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの速度、および図２（ｄ）Ｃａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘは、ＤＭＤの犬のＥＣＵ筋肉において有意に低下する。図２（ｅ）：非ＤＭＤおよびＤＭＤの犬の組織間で、Ｃａ^２＋取り込みのＥＣ_５０は不変である。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。 図３は、ＤＭＤ患者の心臓と筋肉におけるＳＬＮ上方調節を示す。図３（ａ）：ＤＭＤ患者の四頭筋におけるＳＬＮ、ＳＥＲＣＡ１、ＳＥＲＣＡ２ａおよびＣＳＱタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。図３（ｂ）：定量化は、群あたりｎ＝２で、非ＤＭＤ対照群と比較して、ＤＭＤ患者の四頭筋ではＳＬＮが約１．５倍上方調節され、ＳＥＲＣＡ２ａが５０％未満下方調節されることを示す。図３（ｃ）：ヒト心室生検におけるＳＬＮ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＬＮおよびＣＳＱタンパク質のウェスタンブロット分析。図３（ｄ）：定量化は、群あたりｎ＝２で、ＤＭＤ患者からの心室生検でＳＬＮレベルが異常に高いことを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。このウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１５ｂ〜１５ｃに示す。 図４は、ＳＬＮ発現の減少がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの寿命を延長させることを示す。図４（ａ）：年齢および性別が一致するＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対象マウスの体重と比較したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの体重。この実験には３〜４ヶ月齢のマウスを使用した。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。^＊＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．００５、ウェルチの補正を伴うｔ検定）。図４（ｂ）：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの寿命が、ノンパラメトリックログランク検定で決定されたｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照の寿命と比較して増加していることを示す；ｐ＜０．０００１。図４（ｃ）：Ｃａ^２＋依存性ＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの増加；図４（ｄ）：Ｃａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘの増加；および図４（ｅ）：ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの横隔膜のＥＣ_５０値の減少は、ＳＥＲＣＡ機能の改善を示す。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。^＊＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．０００５、ウェルチの補正によるｔ検定）。^＊ＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスとは有意に異なる（ｐ＜０．００５、ウェルチ補正によるｔ検定）。図４（ｆ）、図４（ｇ）および図４（ｈ）：それぞれ横隔膜、胸筋、および四頭筋のＳＬＮ、ＳＥＲＣＡ１、ＳＥＲＣＡ２ａ、およびＣＳＱタンパク質の代表的なウェスタンブロット分析および定量化。組織は３〜４ヶ月齢のマウスからのものである。ウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１４（ａ）、１４（ｂ）、および１４（ｃ）に示す。データは平均値±標準誤差として表している。各群のｎ数は、棒グラフ内に表示している。^＊他の群とは有意に異なる、ｐ＜０．０５、ウェルチ補正によるｔ検定。 図４は、ＳＬＮ発現の減少がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの寿命を延長させることを示す。図４（ａ）：年齢および性別が一致するＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対象マウスの体重と比較したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの体重。この実験には３〜４ヶ月齢のマウスを使用した。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。^＊＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．００５、ウェルチの補正を伴うｔ検定）。図４（ｂ）：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの寿命が、ノンパラメトリックログランク検定で決定されたｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照の寿命と比較して増加していることを示す；ｐ＜０．０００１。図４（ｃ）：Ｃａ^２＋依存性ＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの増加；図４（ｄ）：Ｃａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘの増加；および図４（ｅ）：ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの横隔膜のＥＣ_５０値の減少は、ＳＥＲＣＡ機能の改善を示す。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。^＊＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．０００５、ウェルチの補正によるｔ検定）。^＊ＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスとは有意に異なる（ｐ＜０．００５、ウェルチ補正によるｔ検定）。図４（ｆ）、図４（ｇ）および図４（ｈ）：それぞれ横隔膜、胸筋、および四頭筋のＳＬＮ、ＳＥＲＣＡ１、ＳＥＲＣＡ２ａ、およびＣＳＱタンパク質の代表的なウェスタンブロット分析および定量化。組織は３〜４ヶ月齢のマウスからのものである。ウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１４（ａ）、１４（ｂ）、および１４（ｃ）に示す。データは平均値±標準誤差として表している。各群のｎ数は、棒グラフ内に表示している。^＊他の群とは有意に異なる、ｐ＜０．０５、ウェルチ補正によるｔ検定。 図５は、ＳＬＮ発現の減少が筋病変を改善することを示す。図５（ａ）：カルパイン活性は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの胸筋において正常レベルに回復する。データは、２回重複して実施した５つの独立した実験の平均値±平均誤差（ウェルチ補正によるｔ検定）として表示する。各群のｎ数はバー内に表示している。図５（ｂ）：代表的なＨ＆Ｅおよびマッソン三色染色した四頭筋および横隔膜筋。矢印は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおける増加した単核細胞浸潤（壊死の指標）およびコラーゲン（青色）の蓄積（線維症の指標）を示す。元の倍率は２０倍である。スケールバー、１００μｍ。図５（ｃ）、図５（ｄ）、図５（ｅ）、図５（ｆ）：定量化は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスの横隔膜と四頭筋の両方、およびｔＫＯマウスの四頭筋において壊死および線維化領域が有意に減少したことを示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。３〜４ヶ月齢のマウスからの組織を上記のすべての実験に使用する。 図５は、ＳＬＮ発現の減少が筋病変を改善することを示す。図５（ａ）：カルパイン活性は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの胸筋において正常レベルに回復する。データは、２回重複して実施した５つの独立した実験の平均値±平均誤差（ウェルチ補正によるｔ検定）として表示する。各群のｎ数はバー内に表示している。図５（ｂ）：代表的なＨ＆Ｅおよびマッソン三色染色した四頭筋および横隔膜筋。矢印は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおける増加した単核細胞浸潤（壊死の指標）およびコラーゲン（青色）の蓄積（線維症の指標）を示す。元の倍率は２０倍である。スケールバー、１００μｍ。図５（ｃ）、図５（ｄ）、図５（ｅ）、図５（ｆ）：定量化は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスの横隔膜と四頭筋の両方、およびｔＫＯマウスの四頭筋において壊死および線維化領域が有意に減少したことを示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。３〜４ヶ月齢のマウスからの組織を上記のすべての実験に使用する。 図６は、ＳＬＮ発現の減少が筋肉の再生を改善し、線維型移行を防ぐことを示す。図６（ａ）：線維サイズ測定に使用される四頭筋のＷＧＡ染色切片の代表的な画像。元の倍率は１０倍である。棒グラフに示されている筋線維サイズの最小の「フェレット」直径変動係数（ＶＣ）の測定値は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの四頭筋で線維サイズのＶＣが有意に減少していることを示す。データは、４つの独立した実験の平均値±標準誤差として提示している。^＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５、ウェルチ補正によるｔ検定）。スケールバー、１００μｍ。図６（ｂ）：ｅＭｙＨＣまたはＩ型ＭｙＨＣで免疫染色され、ＷＧＡで染色された胸筋切片の代表的な画像。元の倍率は１０倍である。スケールバー、１００μｍ。ｅＭｙＨＣおよびＩ型ＭｙＨＣに陽性の筋線維の定量化を棒グラフ中に示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。ＮＳ−統計的に有意ではない。３〜４ヶ月齢のマウスからの組織を上記のすべての実験に使用する。 図６は、ＳＬＮ発現の減少が筋肉の再生を改善し、線維型移行を防ぐことを示す。図６（ａ）：線維サイズ測定に使用される四頭筋のＷＧＡ染色切片の代表的な画像。元の倍率は１０倍である。棒グラフに示されている筋線維サイズの最小の「フェレット」直径変動係数（ＶＣ）の測定値は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの四頭筋で線維サイズのＶＣが有意に減少していることを示す。データは、４つの独立した実験の平均値±標準誤差として提示している。^＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５、ウェルチ補正によるｔ検定）。スケールバー、１００μｍ。図６（ｂ）：ｅＭｙＨＣまたはＩ型ＭｙＨＣで免疫染色され、ＷＧＡで染色された胸筋切片の代表的な画像。元の倍率は１０倍である。スケールバー、１００μｍ。ｅＭｙＨＣおよびＩ型ＭｙＨＣに陽性の筋線維の定量化を棒グラフ中に示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。ＮＳ−統計的に有意ではない。３〜４ヶ月齢のマウスからの組織を上記のすべての実験に使用する。 図７は、ＳＬＮ発現の減少がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの骨格筋機能を改善することを示す。図７（ａ）：握力測定装置を使用して測定した前肢の強さは、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスにおける筋肉強度の改善を示す。３〜４ヶ月齢の雄性および雌性マウスをこの試験に使用した。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差（ウェルチ補正によるｔ検定）として提示している。＃ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−に対してｐ＜０．０００１。^＊ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスに対してｐ＜０．０５。図７（ｂ）および図７（ｅ）：それぞれＥＤＬおよび半横隔膜の２Ｈｚでの単収縮力の代表的なトレース。図７（ｃ）および図７（ｆ）：２ＨｚでＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される最大力は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスと比較してｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスでは有意に増加する。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。図７（ｄ）および図７（ｇ）：ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスのＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される力がすべての周波数で有意に増加することを示す力周波数曲線。ＥＤＬおよび半横隔膜は３〜４ヶ月齢のマウスからのものである。 図７は、ＳＬＮ発現の減少がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの骨格筋機能を改善することを示す。図７（ａ）：握力測定装置を使用して測定した前肢の強さは、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスにおける筋肉強度の改善を示す。３〜４ヶ月齢の雄性および雌性マウスをこの試験に使用した。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差（ウェルチ補正によるｔ検定）として提示している。＃ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−に対してｐ＜０．０００１。^＊ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスに対してｐ＜０．０５。図７（ｂ）および図７（ｅ）：それぞれＥＤＬおよび半横隔膜の２Ｈｚでの単収縮力の代表的なトレース。図７（ｃ）および図７（ｆ）：２ＨｚでＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される最大力は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスと比較してｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスでは有意に増加する。各群のｎ数はバー内に表示している。データは平均値±標準誤差として提示している。図７（ｄ）および図７（ｇ）：ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスのＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される力がすべての周波数で有意に増加することを示す力周波数曲線。ＥＤＬおよび半横隔膜は３〜４ヶ月齢のマウスからのものである。 図８は、ＳＬＮ発現の減少が筋収縮を改善することを示す。図８（ａ）および図８（ｂ）：ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスからのＥＤＬ筋は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスと比較して２Ｈｚで、１０％〜９０％の上昇勾配で表される収縮速度の増加および９０％〜１０％の減衰勾配で表される弛緩速度の増加を示す。図８（ｃ）および図８（ｄ）；これらの変化は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスの横隔膜ではあまり顕著ではなかった。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。^＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。 図９は、ＳＬＮ発現の減少がＤＭＤの心機能を改善することを示す。図９（ａ）：ＷＴ、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの心房および心室のＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＬＮ、ＰＬＮ、ＣＳＱおよびＲｙＲタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット（クロップされていない）。図９（ｂ）：３〜４ヶ月齢のＷＴ、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスのベースラインにおける左心室の代表的なＭモード心エコー検査画像。 図９は、ＳＬＮ発現の減少がＤＭＤの心機能を改善することを示す。図９（ａ）：ＷＴ、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの心房および心室のＳＥＲＣＡ２ａ、ＳＬＮ、ＰＬＮ、ＣＳＱおよびＲｙＲタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット（クロップされていない）。図９（ｂ）：３〜４ヶ月齢のＷＴ、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスのベースラインにおける左心室の代表的なＭモード心エコー検査画像。 図１０は、ＳＬＮ発現の除去がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心筋症を予防することを示す。すべての心臓試験は３〜４ヶ月齢のマウスで実施する。図１０（ａ）：代表的なＨ＆Ｅおよびマッソン三色染色した心室組織切片。元の倍率は１０倍である。スケールバー、１００μｍ。棒グラフは、ＳＬＮの減少または切除がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−心臓の線維化および壊死を有意に低減したことを示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。図１０（ｂ）および図１０（ｃ）：心エコー測定は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスにおいて左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）および左室内径短縮率（ＦＳ）が正常値に回復することを実証する。^＊＊他の群に対してｐ＜０．０００１；群あたりｎ＝６。データは平均値±標準誤差（ウェルチの補正によるｔ検定）として提示している。 図１０は、ＳＬＮ発現の除去がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心筋症を予防することを示す。すべての心臓試験は３〜４ヶ月齢のマウスで実施する。図１０（ａ）：代表的なＨ＆Ｅおよびマッソン三色染色した心室組織切片。元の倍率は１０倍である。スケールバー、１００μｍ。棒グラフは、ＳＬＮの減少または切除がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−心臓の線維化および壊死を有意に低減したことを示す。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。データは平均値±標準誤差として提示している。図１０（ｂ）および図１０（ｃ）：心エコー測定は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスにおいて左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）および左室内径短縮率（ＦＳ）が正常値に回復することを実証する。^＊＊他の群に対してｐ＜０．０００１；群あたりｎ＝６。データは平均値±標準誤差（ウェルチの補正によるｔ検定）として提示している。 図１１は、出生後のＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ治療がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおけるＤＭＤおよび関連する心筋症を改善することを示す。１ヶ月齢の雄性および雌性マウスにＡＡＶまたは生理食塩水を注射し、注射の１２週間後に実験を行った。図１１（ａ）および図１１（ｂ）：代表的なウェスタンブロットは、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ処置が骨格筋（胸筋）および心筋（心室筋）のＳＬＮ発現を有効に低減することを示す。ウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１４（ｄ）および１４（ｅ）に示す。ＡＡＶ処置は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの胸筋のＳＥＲＣＡ２ａおよびＣＳＱレベルを低下させた。図１１（ｃ）および図１１（ｄ）：Ｈ＆Ｅ染色した組織切片における単核細胞浸潤のある領域の定量化は、生理食塩水を注射したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの四頭筋および心室の両方で細胞壊死が有意に減少することを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。図１１（ｅ）：ＬＶ ＥＦ；図１１（ｆ）：前肢の筋力；および図１１（ｇ）、図１１（ｈ）：２ＨｚでＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される最大単収縮力は、生理食塩水を注射したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ＡＡＶ処置マウスでは有意に改善される。^＊＊他の群に対してｐ＜０．０００１。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。 図１１は、出生後のＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ治療がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおけるＤＭＤおよび関連する心筋症を改善することを示す。１ヶ月齢の雄性および雌性マウスにＡＡＶまたは生理食塩水を注射し、注射の１２週間後に実験を行った。図１１（ａ）および図１１（ｂ）：代表的なウェスタンブロットは、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ処置が骨格筋（胸筋）および心筋（心室筋）のＳＬＮ発現を有効に低減することを示す。ウェスタンブロットのクロップされていないスキャンを図１４（ｄ）および１４（ｅ）に示す。ＡＡＶ処置は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの胸筋のＳＥＲＣＡ２ａおよびＣＳＱレベルを低下させた。図１１（ｃ）および図１１（ｄ）：Ｈ＆Ｅ染色した組織切片における単核細胞浸潤のある領域の定量化は、生理食塩水を注射したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの四頭筋および心室の両方で細胞壊死が有意に減少することを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。図１１（ｅ）：ＬＶ ＥＦ；図１１（ｆ）：前肢の筋力；および図１１（ｇ）、図１１（ｈ）：２ＨｚでＥＤＬおよび半横隔膜によって生成される最大単収縮力は、生理食塩水を注射したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ＡＡＶ処置マウスでは有意に改善される。^＊＊他の群に対してｐ＜０．０００１。データは平均値±標準誤差として提示している。各群のｎ数およびｐ値（ウェルチの補正によるｔ検定）をグラフ内に示す。 図１２は、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ処置がマウスのＤＭＤを軽減し、ＡＡＶ処置群の単核細胞浸潤を減少させたことを示す。図１２（ａ）および図１２（ｂ）：ウェスタンブロットからのシグナルの定量化は、ＡＡＶ処置がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの骨格筋（胸筋）と心室の両方でＳＬＮタンパク質発現を有意に減少させたことを示す。さらに、ＡＡＶ処置は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの胸筋におけるＳＥＲＣＡ２ａおよびＣＳＱ発現の誘導を抑制する。データは平均値±標準誤差として提示している。^＊他の群とは有意に異なる（群あたりｎ＝４、ｐ＜０．０５、ウェルチ補正によるｔ検定）。図１２（ｃ）：四頭筋および心室切片の代表的なＨ＆Ｅ染色は、ＡＡＶ処置群の単核細胞浸潤の減少を示す。元の倍率は５倍である。挿入図は壊死領域に焦点を合わせた４０倍である。矢印は、単核細胞浸潤を伴う壊死領域を示す。スケールバーは１００μｍである。 図１３は、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ処置がＤＭＤマウスの筋機能を改善することを示す。図１３（ａ）および図１３（ｂ）：ＡＡＶ処置マウスからのＥＤＬは、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスと比較して２Ｈｚで、１０％〜９０％の上昇勾配で表される収縮速度の増加および９０％〜１０％の減衰勾配で表される弛緩速度を示す。図１３（ｃ）および図１３（ｄ）：これらの変化は、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの横隔膜ではあまり顕著ではなかった。各群のｎ数をバー内に示す。^＊＊他の群とは有意に異なる（ｐ＜０．００５、ウェルチの補正によるｔ検定）。図１３（ｅ）および図１３（ｆ）：力−周波数の関係曲線は、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスのＥＤＬと横隔膜の両方においてすべての周波数で筋力が有意に改善されることを示す。データは平均値±標準誤差として提示している。 図１４は、クロップされていないウェスタン画像である。ウェスタン画像は、図１４（ａ）：図４（ｆ）；図１４（ｂ）：図４（ｇ）； 図１４（ｃ）：図４（ｈ）； 図１４（ｄ）：図１１（ａ）；および図１４（ｅ）：図１１（ｂ）に示されている画像に対応する。 図１４は、クロップされていないウェスタン画像である。ウェスタン画像は、図１４（ａ）：図４（ｆ）；図１４（ｂ）：図４（ｇ）； 図１４（ｃ）：図４（ｈ）； 図１４（ｄ）：図１１（ａ）；および図１４（ｅ）：図１１（ｂ）に示されている画像に対応する。 図１５は、クロップされていないウェスタン画像である。ウェスタン画像は、図１５（ａ）：図２ａ； 図１５（ｂ）：図６ａおよび図１５（ｃ）：図６ｃに示されている画像に対応する。 図１６は、ＳＬＮタンパク質レベルが、正常な（対照）犬の筋芽細胞と比較して、犬のジストロフィ筋芽細胞および３日間分化した筋管において増加したことを示す。正常な筋管と比較して、ジストロフィ筋管では主要なアイソフォームであるＳＥＲＣＡ１は減少し、ＳＥＲＣＡ２ａは増加する。 図１７は、犬特異的ＳＬＮ ｓｈＲＮＡ（ＡＡＶ９．ｃｓｈＳＬＮ）を発現するＡＡＶ ９で処置すると、３日間分化した犬ジストロフィ筋管でＳＬＮタンパク質レベルが低下することを示す。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。 図１８（Ａ）（ウェスタンブロット分析）および１８（Ｂ）（定量化）は、ＨＥＫ２９３細胞でのコトランスフェクション実験におけるヒトＳＬＮ発現の減少に対する様々なショートヘアピンＲＮＡの作用を示す。

細胞におけるＳＬＮ発現を減少させ、被験体（例えばヒト）におけるＤＭＤ、およびいくつかの実施形態では心筋症を予防および治療するための治療有効量のＳＬＮ阻害剤を含む組成物、ベクター、ウイルス、およびキットを本明細書で説明する。これらの組成物、ベクター、ウイルス、ならびにこれらの組成物、ベクター、およびウイルスを含むキットを使用する方法も本明細書で説明する。本明細書で述べる実験結果は、ＳＬＮ発現を減少させ、筋病変を減弱させ、横隔膜、骨格筋および心機能を改善し、ならびに寿命を延長させるためのＳＬＮ発現の阻害剤の治療的有用性を実証する。本明細書で述べる実験結果はまた、被験体においてＤＭＤを予防するためにＳＬＮ発現を阻害することの治療的有用性も実証する。これらの組成物、ベクターおよびキットは、ＤＭＤおよび関連する心筋症の新規治療法である。

生物学的方法
従来の分子生物学技術を含む方法を本明細書で説明する。そのような技術は一般に当技術分野で公知であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｔｈｅ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００６；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５（定期的更新を含む）などの方法論論文に詳述されている。遺伝子導入および遺伝子治療の従来の方法も、本発明での使用に適合させ得る。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９７；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｏｔｔｏ−Ｗｉｌｈｅｌｍ Ｍｅｒｔｅｎ ａｎｄ Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１１；およびＮｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｒｋ Ａ．Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１０参照。ウイルスベクターを構築および使用する方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９２，７：９８０−９９０参照）。ｒＡＡＶの大規模生産の方法は、Ｕｒａｂｅ Ｍ．Ｊ．（２００６）Ｖｉｒｏｌ．８０：１８７４−１８８５；Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０：Ｒ２−６；Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７−１２２５；およびＭｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ．（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：２１２−２２２に記載されている。ｒＡＡＶ遺伝子治療法の総説については、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（２０１４）ＡＡＶ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．１：４２７−４５１参照。ｒＡＡＶベクター、変異体、キメラ、およびｒＡＡＶベクター媒介遺伝子導入法は、米国特許第９，８４０，７１９号に記載されている。

ＳＬＮの発現および活性を低下させ、ＤＭＤおよび関連する心筋症を予防および治療するための組成物およびベクター
ＳＬＮ発現および／または活性を低下させるための本明細書で述べる組成物は、治療有効量のＳＬＮ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量とは、被験体のジストロフィ筋肉のＳＥＲＣＡ機能を改善するのに有効な量である。組成物は、薬学的に許容される担体も含むことができる。ＳＬＮ発現の減少には、ＳＬＮ転写の減少およびＳＬＮ ＲＮＡのプロセシングの阻害が含まれる。ＳＬＮ活性の低下には、ＳＬＮの阻害作用の低下、ＳＥＲＣＡとＳＬＮとの相互作用の減少、およびＳＬＮが膜に到達することの防止が含まれる。ＲＮＡ分子を含む、ＳＬＮ発現および／または活性を低下させる任意の治療分子を使用し得る。ＲＮＡ分子の例には、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの干渉ＲＮＡ分子が含まれる。

干渉ＲＮＡをＳＬＮの阻害剤として使用する場合、干渉ＲＮＡは、典型的には発現ベクターまたはウイルスベクターに含まれる。ベクターは、エピソーム、例えばプラスミド、ウイルス由来ベクターであってもよく、または相同組換えもしくはランダムな組み込みを介して標的細胞ゲノムに組み込まれてもよい。任意の適切な発現ベクター（例えばウイルスベクター）を使用することができる。ウイルスは、その遺伝子を宿主細胞に効率的に送達する自然に進化したビヒクルであり、したがって治療用核酸の送達のための望ましいベクター系である。好ましいウイルスベクターは、宿主細胞に対して低い毒性を示し、関心対象の核酸の治療量を産生／送達する（いくつかの実施形態では、組織特異的に）。哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースの系が開発されている。例えば、ＡＡＶは遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。別の例として、レトロウイルスは遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。さらに他の例では、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターが使用される。選択した核酸配列をベクター（ベクターゲノム）に挿入し、当技術分野で公知の技術を用いてウイルス粒子にパッケージングする（例えばｒＡＡＶベクターをｒＡＡＶ粒子にパッケージングする）ことができる。次いで、組換えウイルスを単離し、被験体の細胞に送達することができる。

本明細書で述べる実験では、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡを使用してＳＬＮ発現を減少させ、これらの実験では、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列をｒＡＡＶ（血清型９）ベクターに含めた。任意の適切なｒＡＡＶベクターを使用することができる。組換えＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８、およびその変異体が含まれる。ｒＡＡＶの例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４もしくはＡＡＶ−２ｉ８のいずれかのキャプシド配列、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４もしくはＡＡＶ−２ｉ８のキャプシド変異体が含まれ得る。特定のキャプシド変異体には、アミノ酸置換、欠失または挿入／付加を有するキャプシド配列などの、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のキャプシド変異体が含まれる。ＡＡＶベクターは、シスまたはトランスで機能する追加エレメントを含むことができる。特定の実施形態では、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターはまた、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列の５’もしくは３’末端に隣接する１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、構成的もしくは調節可能な制御エレメントまたは組織特異的発現制御エレメントなどの、核酸配列の転写を駆動する発現制御エレメント（例えばプロモータもしくはエンハンサー）、および／または核酸配列の３’に位置するポリアデニン配列も有する。

典型的な実施形態では、筋向性を有するＡＡＶ血清型を使用する。例えば、ヒトでは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９が高い筋向性を有する（インビボでの組織向性の総説については、Ｎｏｎｎｅｎｍａｃｈｅｒ Ｍ．ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ Ｔ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：６４９−６５８；Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ Ｍ．ａｎｄ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ Ｊ．（２０１１）ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ−Ｉｎ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ＲＯ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，ｐ．４７−９２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ；およびＡｓｏｋａｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：６９９−７０８参照）。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ８を使用することができる。

治療薬を送達するための改善された特徴を有するｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶ（ビリオン）を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、より高い形質導入頻度または増加した筋向性を有する新しいキャプシド変異体を有するｒＡＡＶを使用することができる。例えば、キャプシドライブラリを、指向性進化と呼ばれる工程（Ｂａｒｔｅｌ Ｍ．Ａ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：６９４−７００）でスクリーニングして、特定の組織または細胞型に感染させるための濃縮されたキャプシドを選択することができる。別の例として、特定の細胞型（例えば心筋特異的）を標的とするリガンドで修飾されたキャプシドを有するｒＡＡＶを使用することができる。別の例として、偽型ｒＡＡＶ（第２の血清型（すなわち第１のＡＡＶ血清型とは異なるもの）の少なくとも１つのＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含むＡＡＶキャプシドによってキャプシド化またはパッケージングされる第１のＡＡＶ血清型に由来する核酸またはゲノム）を使用することができる。キャプシド修飾に加えて、本明細書で述べるｒＡＡＶは、組織特異的プロモータ（例えば筋特異的プロモータ）および誘導性プロモータを含み得る。ｒＡＡＶ遺伝子治療法の総説については、Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（２０１４）ＡＡＶ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．１：４２７−４５１参照。ｒＡＡＶ、変異体、キメラ、およびｒＡＡＶ媒介遺伝子導入法はまた、米国特許第９，８４０，７１９号に記載されている。

ｒＡＡＶは、任意の適切な方法を用いて作製することができる。ｒＡＡＶの大規模生産の方法は公知であり、Ｕｒａｂｅ Ｍ．Ｊ．（２００６）Ｖｉｒｏｌ．８０：１８７４−１８８５；Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０：Ｒ２−６；Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７−１２２５；Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ．（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：２１２−２２２；ならびに米国特許第６，４３６，３９２号、同第７，２４１，４４７号、および同第８，２３６，５５７号に記載されている。例えば、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができる。本明細書で述べる実験では、プラスミドｐＦＢ−ＩＴＲ−ｓｈ−ＳＬＮを使用して、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組換えバキュロウイルスを作製した。ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮをＳｆ９昆虫細胞において作製し、主として以前にＵｒａｂｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３：１９３５−１９４２に記載されたように（ＢａｃＶＰの代わりにＢａｃＣａｐ９を使用したことを除く）精製した。この方法では、イオジキサノール勾配超遠心分離によってウイルスを精製し、乳酸加リンガー液に対して透析した。

本明細書で述べるベクターは、典型的には１つ以上の発現制御エレメントを含む。発現制御エレメントには、多くの異なる細胞型でポリヌクレオチド（核酸）の発現を駆動することができる遍在性または無差別プロモータ／エンハンサーが含まれる。そのようなエレメントには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモータ／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ／エンハンサー配列、および様々な哺乳動物細胞型で活性な他のウイルスプロモータ／エンハンサー、または自然界には存在しない合成エレメント、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモータ、細胞質β−アクチンプロモータ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータなどが含まれるが、これらに限定されない。

発現制御エレメントには、本明細書では「組織特異的発現制御エレメント／プロモータ」と称される、特定の組織または細胞型で活性なものが含まれる。組織特異的発現制御エレメントは、典型的には特定の細胞または組織（例えば筋肉）において活性である。発現制御エレメントはまた、調節可能な方法で発現を付与することができる、すなわちシグナルまたは刺激が、作動可能に連結された核酸の発現を増加または減少させる。シグナルまたは刺激に応答して作動可能に連結された核酸の発現を増加させる調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」とも称される（すなわちシグナルによって誘導される）。シグナルまたは刺激に応答して作動可能に連結された核酸の発現を減少させる調節可能なエレメントは、「抑制性エレメント」と称される（すなわちシグナルが除去されるかまたは存在しない場合に発現が増加するように、シグナルが発現を減少させる）。典型的には、そのようなエレメントによって与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルまたは刺激の量に比例する；シグナルまたは刺激の量が多いほど、発現の増加または減少が大きくなる。

発現制御エレメントには、ネイティブエレメント（１つまたは複数）も含まれる。ネイティブ制御エレメント（例えばプロモータ）は、核酸の発現が天然の発現を模倣し得ることが望ましい場合に使用し得る。ネイティブエレメントは、核酸の発現が一時的にもしくは発生過程で、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節されるべきである場合に使用し得る。イントロン、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他のネイティブ発現制御エレメントも使用し得る。

任意の適切な非ウイルス送達方法も使用することができる。ＳＬＮのＳｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの非ウイルス媒介送達は、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを、例えばＰＥＩ、ポリ−ｌ−リシンおよびデンドリマーなどの天然または合成ポリマーに結合することによって達成することができる。これらのポリマーは、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ攻撃から保護し、ｓｉＲＮＡのシステムへの更新を増強する。

いくつかの実施形態では、ＤＭＤ、およびいくつかの実施形態では心筋症を予防または治療するための組成物は、ＳＬＮの阻害剤および公知のＤＭＤ治療薬を含むことができる。例えば、そのような組成物は、ＳＬＮに特異的な干渉ＲＮＡ分子（例えばＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡ）および公知のＤＭＤ治療薬を含むことができる。公知のＤＭＤ治療薬の例には、エテプリルセンおよびマイクロジストロフィン（μ−ｄｙｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ発現を減少させる核酸を、μ−ｄｙｓをコードする核酸と組み合わせる、併用遺伝子治療を使用することができる。例えば、ＤＭＤの予防または治療のための組成物は、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮとμ−ｄｙｓを発現するウイルスベクター（例えばＡＡＶ９μｄｙｓ）の両方を含むことができる。

ＳＬＮの発現および活性を低下させ、被験体におけるＤＭＤおよび関連する心筋症を予防および治療する方法
細胞におけるＳＬＮ発現または活性を低下させる方法を本明細書で説明する。これらの方法は、細胞を本明細書で述べるベクター、ウイルス、または組成物と接触させることを含む。また、被験体におけるＤＭＤ、およびいくつかの実施形態では被験体における関連する心筋症も予防および治療する方法を本明細書で説明する。典型的には、組成物、ベクター、およびウイルスを被験体（例えばヒト患者）の適切な標的細胞に送達する。典型的な標的細胞は、ＳＬＮのレベルが上昇している（上方調節されている）任意の筋肉細胞である。

この方法は、本明細書で述べる組成物、ベクターおよびウイルスのいずれかの投与を含む。本明細書で述べる組成物、ベクターまたはウイルスの被験体への投与は、被験体におけるＤＭＤの予防、改善、または治療（例えばＤＭＤの症状または病変の予防、緩和または軽減）、およびいくつかの実施形態では、さらに関連する心筋症の予防、改善、または治療（例えば心筋症の症状または病変の予防、緩和または軽減）をもたらす。典型的な実施形態では、ＤＭＤを有する被験体への組成物、ウイルスまたはベクターの投与は、ＳＬＮ発現を減少させ、ＳＥＲＣＡ機能を回復し、ＬＶ収縮機能および心臓リモデリングを改善し、前肢筋力を改善し、寿命を延長させる。ＤＭＤを有する素因がある被験体においてＤＭＤを予防するための実施形態では、ジストロフィン遺伝子中に突然変異（１つまたは複数）を有する被験体に組成物、ウイルスまたはベクターを投与する。ＤＭＤモデル由来の筋芽細胞（始原筋細胞）におけるＳＬＮ上方調節は、ＳＬＮ上方調節がジストロフィン欠損／変異筋細胞の固有の特徴であることを示唆する。したがって、ＳＬＮ発現を低下させるための組成物、ウイルス、またはベクターの投与は、症状が現れる前であっても突然変異が同定されるとすぐに実施することができる。有害な症状、状態、合併症などが発生する前に、被験体への投与またはインビボ送達を行うことができる。

上述したように、併用療法は、被験体におけるＤＭＤおよび関連する心筋症を予防または治療するために使用し得る。いくつかの実施形態では、併用療法は、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列および公知のＤＭＤ治療薬を投与することを含む。そのような実施形態の一例では、第１のＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮを被験体に投与し、μ−ｄｙｓを発現する第２のウイルスベクターを含む第２のウイルス（例えばＡＡＶ９μｄｙｓ）を被験体に投与する。そのような実施形態では、２つのウイルスを同じ組成物で同時に投与するか、または異なる時点で投与することができる（例えば２つの異なる組成物を２つの異なる時点で投与する）。併用療法の別の例では、ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮを、薬剤（例えばエテプリルセンなどのＤＭＤ薬剤）などの別のＤＭＤ治療薬と組み合わせて被験体に投与する。任意の併用療法では、２つ以上の治療薬を同時にまたは連続的に、例えば２つ以上の異なる時点で投与することができる。典型的には、そのような併用療法はジストロフィン機能を回復し、ＳＥＲＣＡ機能を改善し、ならびに骨格および心筋の両方の病変を軽減する。併用療法の一実施形態では、ＳＬＮ発現を減少させる組成物とμ−ｄｙｓレベルまたは発現を増加させる組成物を同じ注射または注入量で混合する。

そのような組成物、ウイルスまたはベクターを被験体に投与する任意の適切な方法を使用し得る。これらの方法では、組成物、ウイルス、およびベクターは、任意の適切な経路によって、例えば筋肉内経路で、静脈内注射によって全身的に、経口的に、鼻腔内送達などによって被験体に投与することができる。組成物は、血管によってアクセス可能な部位にカテーテルによって投与し得る。

いくつかの実施形態では、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶは、動脈または門脈へのボーラス注射によって被験体に投与される。静脈内注射によって投与される場合、組成物は、単回ボーラス、複数回注射、または持続注入（例えば静脈内、腹膜透析、ポンプ注入）によって投与され得る。他の実施形態では、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶは、筋肉への四肢注入によって被験体に投与される（Ｓｕｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：１５００−１５０５）。非経口投与の場合、組成物は、好ましくは発熱物質を含まない滅菌形態で製剤化される。上記のように、本明細書で述べる組成物は、無菌注射に適した形態であり得る。そのような組成物を調製するために、適切な活性治療薬（１つまたは複数）（例えばＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡ、それをコードするベクター、組換えウイルス）を非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁する。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液の添加によって適切なｐＨに調整された水、１，３−ブタンジオール、リンガー液、および等張塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液がある。水性製剤はまた、１つ以上の防腐剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはｎ−プロピル）を含み得る。治療薬の１つが水にやや溶けにくいまたは溶けにくい場合、溶解促進剤または可溶化剤を添加することができ、または溶媒は１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでもよい。本明細書で述べる組成物、ウイルスおよびウイルスベクターは、従来の薬務に従って任意の適切な製剤中で哺乳動物（例えばげっ歯動物、ヒト、非ヒト霊長動物、犬、ネコ、ヒツジ、ウシ）に投与し得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２０ｔｈ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００） ａｎｄ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８−１９９９）、この分野およびＵＳＰ／ＮＦにおける標準テキスト参照）。例示的な薬学的に許容される担体および希釈剤、ならびに医薬製剤の説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：上記参照、に見出すことができる。組成物を安定化および／または保存するために他の物質を組成物に添加してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、インビボ送達または接触に適した生物学的に許容される製剤、気体、液体もしくは固体、またはそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的またはその他の点で望ましくない物質ではなく、例えば物質は、実質的に望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく被験体に投与され得る。したがって、そのような医薬組成物は、例えばウイルスベクターまたはウイルス粒子を被験体に投与する際に使用され得る。

本明細書で使用される「単位剤形」は、治療される被験体のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、任意に、１つ以上の用量で投与された場合に所望の効果（例えば予防効果または治療効果）を生じさせるように計算される医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは充填剤）と関連してあらかじめ定められた量を含有する。単位剤形は、例えば、液体組成物、または凍結乾燥状態の組成物を含み得るアンプルおよびバイアル内に存在してもよく、例えば滅菌液体担体は、投与またはインビボ送達の前に添加することができる。個々の単位剤形は、複数回用量キットまたは容器に含めることができる。ウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）、ウイルスおよびその医薬組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単一または複数の単位剤形で包装することができる。

本明細書で述べる治療方法は、一般に、治療有効量の本明細書で述べる組成物またはベクターを、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする被験体（例えば動物、ヒト）に投与することを含む。そのような治療は、疾患、障害、またはその症状（例えばＤＭＤ、心筋症）に罹患している、有している、罹患しやすい、またはその危険性がある被験体、特にヒトに適切に投与される。「危険性がある」被験体の決定は、被験体または医療提供者の診断試験または見解による客観的または主観的な決定によって行われ得る。

追加の実施形態
本明細書で述べる組成物、ベクター、ウイルス、および方法を使用して、ＳＬＮが上昇している組織のＳＬＮ発現を減少させることができる。例えば、ＳＬＮは僧帽弁逆流の患者の心室、およびたこつぼ型心筋症の患者、およびエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィの筋肉においても上昇するため、ＳＬＮをこれらの疾患で標的とすることができ、本明細書で述べる組成物、ウイルスおよびベクターを投与することによってＳＬＮ発現を減少させ得る。

有効用量
本明細書で述べる組成物、ウイルスおよびベクターは、好ましくは有効量、すなわち治療される哺乳動物において望ましい結果（例えばＳＬＮ発現の減少、ＳＥＲＣＡ機能の回復、ＬＶ収縮機能と心臓リモデリングの改善、前肢筋力の改善、寿命の延長）をもたらすことができる量で哺乳動物（例えばヒト）に投与される。そのような治療有効量は、標準的な方法に従って決定することができる。本発明の方法で利用される組成物およびベクターの毒性および治療効果は、標準的な製薬手順によって決定することができる。医学および獣医学の分野で周知のように、１被験体についての投与量は、被験体の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、投与の時間と経路、全般的な健康、および同時に投与されている他の薬剤を含む多くの因子に依存する。本明細書で述べる組成物、ウイルスまたはベクターの送達用量は、前臨床効果および安全性に基づいて決定される。

キット
ＳＬＮの発現または活性を阻害し、被験体のＤＭＤおよび関連する心筋症を予防および治療するためのキットを本明細書で説明する。典型的なキットには、薬学的に許容される担体（例えば生理学的緩衝液）と治療有効量のＳＬＮ阻害剤（例えばＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡ）を含有する組成物、および使用説明書が含まれる。いくつかの実施形態では、キットはまた、公知のＤＭＤ治療薬（例えばＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする第１のベクターおよびμＤｙｓをコードする第２のベクター、またはウイルスベクターを含む組換えウイルスを含むキット）も含む。そのようなキットは併用療法に使用することができる。キットはまた、典型的には容器と包装も含む。本明細書で述べる組成物およびベクターの調製および使用のための説明資料が一般的に含まれる。説明資料は、典型的には書面または印刷物を含むが、これらに限定されない。そのような指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体は、本明細書のキットに包含される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体には、そのような説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれ得る。

データおよび分析
本明細書で述べる組成物、ウイルス、ベクター、キットおよび方法の使用は、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムを使用し得る。有用なコンピュータソフトウェア製品は、典型的には、方法の論理的工程を実行するためのコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読媒体を含む。適切なコンピュータ可読媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが含まれる。コンピュータ実行可能命令は、適切なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組み合わせで書かれていてもよい。基礎計算生物学の方法は、例えばＳｅｔｕｂａｌ ａｎｄ Ｍｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；Ｒａｓｈｉｄｉ ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ２０００）およびＯｕｅｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｂｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ ｅｄ．，２００１）に記載されている。米国特許第６，４２０，１０８号参照。

本明細書で述べる組成物、ウイルス、ベクター、キットおよび方法はまた、試薬設計、データの管理、および分析などの様々な目的のために様々なコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを利用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号参照。さらに、本明細書で述べる実施形態は、インターネットなどのネットワークを介してデータ（例えば実験結果、分析）および他の種類の情報を提供するための方法を含む。

本発明を以下の特定の実施例によってさらに説明する。実施例は例示のみを目的として提供され、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例１
サルコリピン発現の低減はマウスのＤＭＤおよび関連する心筋症を軽減する
ここで、ＳＬＮレベルを低減すると、ＤＭＤの重度のジストロフィン／ユートロフィン二重変異体（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−）マウスモデルのジストロフィ病変が改善されることが示される。ＳＬＮ遺伝子の１つの対立遺伝子の生殖系列不活性化は、ＳＬＮ発現を正常化し、ＳＥＲＣＡ機能を回復し、骨格筋と心臓病変を軽減し、筋肉の再生を改善し、寿命を延長させる。これらの所見を治療戦略につなげるために、１ヶ月齢のｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスのＡＡＶ９媒介ＲＮＡ干渉においてＳＬＮ発現をノックダウンした。ＡＡＶ処置は、ＳＬＮ発現を著明に減少させ、筋病変を減弱させ、横隔膜、骨格筋および心機能を改善した。合わせて考慮すると、これらの所見は、ＳＬＮの低減がＤＭＤの治療アプローチであることを示す。

ＳＬＮの上方調節がＤＭＤの骨格筋および心臓における一般的な分子変化であるかどうかを判定するために、ＤＭＤマウスの心室のＳＬＮタンパク質レベルを分析した。結果は、ｍｄｘおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの両方の心室でＳＬＮレベルが異常に高かったことを示す。さらに、ＳＬＮレベルは、ｍｄｘマウスの心室と比較してｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心室では約２倍高かった（図１ａ−１ｂ）。ＳＥＲＣＡ２ａおよびホスホランバン（ＰＬＮ）の発現レベルは、ジストロフィ心臓で変化していなかった。しかしながら、Ｃａ^２＋依存性Ｃａ^２＋取り込みの速度（図１ｃ）およびＣａ^２＋取り込みの最大速度（Ｖ_ｍａｘ）（図１ｄ）は有意に低下し、一方、Ｃａ^２＋取り込みのＥＣ_５０はＤＭＤマウスの心室で変化していなかった（図１ｅ）。犬のＤＭＤモデルの骨格筋でも同様の変化が観察された。ＳＬＮタンパク質の発現は、非ＤＭＤ対照のものと比較して、罹患犬の尺側手根伸筋（ＥＣＵ）で有意に増加した（図２ａ〜２ｂ）。さらに、これらの筋肉ではＳＥＲＣＡ １レベルは有意に増加し、ＳＥＲＣＡ２ａレベルは減少した（図２ａ〜２ｂ）。ＳＥＲＣＡアイソフォームの変化に関わりなく、Ｃａ^２＋依存性Ｃａ^２＋取り込みの速度（図２ｃ）およびＣａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘ（図２ｄ）は、ジストロフィの犬の筋肉では有意に低下した。Ｃａ^２＋活性化のＥＣ_５０は、非ＤＭＤ犬とＤＭＤ犬の組織間で有意差はなく（図２ｅ）、ＳＥＲＣＡポンプのＣａ^２＋親和性は変化しなかったことを示す。動物モデルと同様に、ＳＬＮレベルはＤＭＤ患者の四頭筋（図３ａ〜３ｂ）と心室（図３ｃ〜３ｄ）の両方で増加した。これらの所見は、ＤＭＤ患者とＤＭＤモデルの両方のジストロフィン欠損骨格筋および心筋における一般的な分子変化としてのＳＬＮ上方調節を明らかにした。

ＳＬＮの除去は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの寿命を延長させる。ＤＭＤにおけるＳＬＮ上方調節の役割を決定するために、ＳＬＮハプロ不全のｍｄｘ：ｕｔｒ−／−ノックアウト（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−）およびＳＬＮ欠損ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ−／−）トリプルノックアウト（ｔＫＯ）マウスを作製した。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯの仔犬は正常に出産された。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの体重は正常化され（図４ａ）、寿命は有意に延長された（図４ｂ；ノンパラメトリックログランク検定によりｐ＜０．０００１）。生存期間の中央値は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−の同腹仔の生存期間（７３日）と比較して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスでそれぞれ４４６日および３５８日増加した。これらの所見は、ＳＬＮの減少または除去がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの生存期間を著明に改善することを示唆する。

ＳＬＮ発現の低減は、ＤＭＤのＳＥＲＣＡ機能を回復する。ＳＬＮ遺伝子の１つの対立遺伝子の欠失は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの横隔膜におけるＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの速度（図４ｃ）およびＶ_ｍａｘ（図４ｄ）をＷＴマウス近くに改善した。ＳＬＮの完全な喪失は、ｔＫＯ横隔膜のＣａ^２＋取り込みの速度のさらなる上昇をもたらしたが、Ｃａ^２＋取り込みのＶ_ｍａｘは、ＷＴ対照と統計的に差がなかった（図４ｄ）。さらに、Ｃａ^２＋活性化のＥＣ_５０は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの両方の横隔膜で有意に低下し（図４ｅ）、ＳＬＮ欠損ジストロフィ筋肉のＣａ^２＋イオンに対するＳＥＲＣＡポンプの見かけの親和性の増加を示す。合わせると、これらの所見は、ＳＬＮの上方調節がジストロフィ筋肉のＳＥＲＣＡ機能不全の主な原因であることを示唆する。

ＳＬＮの除去が、ジストロフィ横隔膜、四頭筋および胸筋におけるＳＥＲＣＡアイソフォームおよびカルセクエストリン（ＣＳＱ）の発現レベルに影響を及ぼすかどうかを判定した。１つのＳＬＮ対立遺伝子の欠失は、横隔膜、胸筋および四頭筋のＳＬＮタンパク質発現をＷＴ対照近くに減少させた（図４ｆ〜４ｈ）。さらに、結果は、ＳＬＮの減少または除去がＳＥＲＣＡアイソフォームの発現を回復し、ならびにこれらの筋肉のＣＳＱレベルを正常化することを示した（図４ｆ〜４ｈ）。合わせて考慮すると、これらの所見は、ＳＬＮハプロ不全が、ＳＬＮ発現を正常化し、ジストロフィ筋肉のＳＲ機能を回復するのに十分であることを示唆する。

ＳＬＮ発現の低減は、筋肉の病態生理を改善する。次に、ＳＥＲＣＡ機能の増強を介したＣａ^２＋ _ｉサイクリングの改善が、Ｃａ^２＋依存性プロテアーゼ活性を低下させ、筋損傷を防止するかどうかを判定した。ＳＬＮ発現の低減または除去は、代表的な、重度に罹患したジストロフィ筋肉である胸筋のカルパイン活性を減弱させた（図５ａ）。組織病理学的分析（図５ｂ）および定量化は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスの横隔膜（図５ｃ〜５ｄ）および四頭筋（図５ｅ〜５ｆ）の両方ならびにｔＫＯマウスの四頭筋における壊死および線維化の有意な減少を示した。これらの改善は、ｔＫＯ横隔膜ではあまり顕著ではなく、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と統計的に差がなかった。次に、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色後の最小フェレット直径変動係数（ＶＣ）を測定することによって四頭筋の筋線維サイズを決定した（図６ａ）。ＶＣはｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの筋肉で有意に増加しており、線維サイズの不均一性を示した。他方で、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの筋肉では、ＶＣが有意に低下し、小さな再生分割線維および肥大線維の減少を示した。次に、ＳＬＮ除去が筋肉の再生過程および線維型移行に影響を与えるかどうかを判定した。免疫染色および定量化は、胚性ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ）またはＩ型ＭｙＨＣを発現する線維が、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの胸筋で有意に高く（図６ｂ）、ジストロフィ四頭筋に関する以前の所見と一致することを示した。これに対し、これらのタンパク質を発現する線維の数は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの筋肉では有意に減少した（図６ｂ）。これらの所見は、ＳＬＮ発現の低減が筋再生過程を改善し、ジストロフィ筋肉の線維型移行を防止できることを示唆する。

次に、筋力学へのＳＬＮ除去の影響を検討した。前肢筋の握力は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−同腹仔のものと比較して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスでは有意に増加した（図７ａ）。これらの試験を、ジストロフィ長趾伸筋（ＥＤＬ；あまり影響を受けない）および横隔膜（より深刻な影響を受ける）筋の等尺性収縮特性を測定することによって拡張した。２Ｈｚでの単収縮張力（図７ｂ〜７ｃ）、１０％〜９０％の上昇勾配（収縮速度）および９０％〜１０％の減衰勾配（弛緩速度）（図８ａ〜８ｂ）ならびに力−周波数曲線（図７ｄ）は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスのＥＤＬ筋で有意に増加した。これらの収縮パラメータは、ｔＫＯマウスのＥＤＬでも増加したが、統計的に有意なレベルではなかった。ＥＤＬの最大力の半分の刺激周波数は、実験群間で変化しないままであった［ＷＴ＝２７±３（ｎ＝７）、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−＝２８±３（ｎ＝５）、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−： ｓｌｎ＋／−＝２６±２（ｎ＝８）およびｔＫＯ＝２８±１（ｎ＝５）Ｈｚ；ウェルチの補正による対応のないｔ検定］。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの横隔膜機能へのＳＬＮ除去の影響はあまり顕著ではなかった。２Ｈｚでの単収縮張力は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−の半横隔膜で有意に増加したが、ｔＫＯマウスでは有意に増加しなかった（図７ｅ〜７ｆ）。２Ｈｚでのｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯの半横隔膜から得られた１０％〜９０％の上昇勾配および９０％〜１０％の減衰勾配は、わずかに増加する傾向を示したが、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照のものと有意差はなかった（図８ｃ〜８ｄ）。同様に、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−からの半横隔膜の力−周波数曲線は上方にシフトしたが、ｔＫＯマウスではより小さな程度であった（図７ｇ）。半横隔膜の最大力の半分の刺激周波数は、４つすべてのマウス群で変化しないままであった［ＷＴ＝１１±０．３（ｎ＝６）、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−＝１３±０．８（ｎ＝５）、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−＝１２±０．５（ｎ＝６）およびｔＫＯ＝１４±１．２（ｎ＝６）Ｈｚ；ウェルチの補正による対応のないｔ検定］。これらの機能データは、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの横隔膜で見られる相違と構造の改善を裏付けた（図５ｂ）。これらの所見は、ＳＬＮ発現の低減がジストロフィ骨格筋の機能的特性を改善するのに十分であることを示唆する。

ＳＬＮの除去はジストロフィ心筋症を改善する。次に、ＳＬＮの除去がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心臓病変を改善するかどうかを判定した。ウェスタンブロット分析（図９ａ）および定量化は、１つのＳＬＮ対立遺伝子の喪失が心房（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−＝１．７±０．２対ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−＝０．９±０．１倍；ｎ＝４、ｐ＜０．０５；ウェルチの補正によるｔ検定）およびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心室でのＳＬＮタンパク質発現をＷＴレベル近くに減少させるのに十分であることを示した。ＳＬＮ除去は、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＬＮ、リアノジン受容体（ＲｙＲ）、およびＣＳＱの発現レベルに影響を及ぼさなかった（図９ａ）。Ｈ＆Ｅおよび三色染色ならびに定量化は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−対照と比較して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯ心室では単核細胞浸潤および線維化が有意に減少することを示した（図１０ａ）。心エコー検査で評価した心機能（図９ｂ）は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの左室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ；図１０ｂ）および左室内径短縮率（ＦＳ；図１０ｃ）の増加から明らかなように、左室機能の著明な改善を示した。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスでは、ＬＶ内径拡張末期（ＬＶＩＤｄ）の有意な減少と共に、心室中隔収縮末期（ＩＶＳ）および後壁厚の増加が存在した（表１）。この所見は、これらのマウスの心臓が、心機能の改善に寄与する特異的求心性リモデリングを受けることを示唆した。これらの所見は、ＳＬＮレベルを正常化することが、マウスの心機能を維持し、ジストロフィ心筋症を軽減するのに十分であることを示す。これらの試験はまた、１×１０^１１ｖｇが、毒性を伴わずにｍｄｘマウスのＳＬＮ発現を正常化するのに十分であることも示唆する。

ＩＶＳｄ−心室中隔拡張末期、ＩＶＳｓ−心室中隔収縮末期、ＬＶＩＤｄ−左室内径拡張末期、ＬＶＩＤｓ−左室内径収縮末期、ＬＶＰＷｄ−左室後壁拡張末期、ＬＶＰＷｓ−左室後壁収縮末期、ＦＳ−左室内径短縮率、ＥＦ−駆出率、ＨＲ−心拍数。^＄ＷＴに対してｐ＜０．００５；^＊他の群に対してｐ＜０．０５；^＊＊他の群に対してｐ＜０．０００１；^＃ＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−に対してｐ＜０．０５；＋＋ＷＴおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−に対してｐ＜０．０５；群あたりｎ＝６。データは平均値±標準誤差として提示している。

出生後のＡＡＶ９ ＳＬＮ ｓｈＲＮＡ遺伝子治療はＤＭＤを軽減する。上記の試験からの所見は、ＳＬＮ発現の正常化が、筋肉の病態生理、横隔膜機能および心筋症を含む重度のＤＭＤ表現型を軽減するのに十分であることを示唆する。これらの所見を治療戦略につなげるために、ＳＬＮ特異的ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）のＡＡＶ９媒介発現を介して１ヶ月齢のｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスにおいて出生後にＳＬＮ発現をノックダウンした。１２週間のＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ処置は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの骨格筋（生理食塩水で処置した対照に対して０．２２倍、ｐ＜０．０５）およびＬＶ（ＷＴに類似）の両方でＳＬＮ発現を有意に減少させた（図１１ａ〜１１ｂおよび図１２ａ〜１２ｂ）。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−心筋では、ＡＡＶ処置はＳＥＲＣＡ２ａ、ＰＬＮ、ＣＳＱ、およびＲｙＲのタンパク質発現に影響を及ぼさなかった（図１１ｂ）。他方で、ＡＡＶ処置は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの胸筋のＳＥＲＣＡ２ａ（ｐ＜０．０５）およびＣＳＱ（ｐ＜０．０７）タンパク質レベルを低下させた（図１１ａおよび図１２ａ）。これらのデータは、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスに関する所見と一致しており（図４ｇ）、ＳＬＮ発現の出生後減少もｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスのＳＲ機能を回復できることを示唆する。

次に、ＡＡＶ遺伝子治療がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心筋および骨格筋の病態生理を軽減するかどうかを判定した。これらの試験の結果は、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−マウスからのデータを模倣する。Ｈ＆Ｅ染色（図１２ｃ）および定量化は、単核細胞の浸潤および細胞壊死が、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの骨格筋（図１１ｃ）および心室（図１１ｄ）の両方で有意に減少したことを示した。ＡＡＶ処置はまた、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスのＬＶ収縮機能および心臓リモデリングも改善した（図１１ｅおよび表２）。前肢筋力は、ＡＡＶ処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスで有意に改善された（図１１ｆ）。さらに、２Ｈｚで１０％〜９０％の上昇勾配および９０％〜１０％の減衰勾配として測定された単収縮張力（図１１ｇ〜１１ｈ）ならびに力−周波数関係（図１３ａ〜１３ｆ）は、ＡＡＶ処置群のＥＤＬおよび半横隔膜の両方で有意に増加し、筋力学の改善を示した。合わせると、これらの所見は、ＳＬＮ発現のＡＡＶを介した出生後減少がｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの重度の筋ジストロフィおよび関連する心筋症を軽減するのに十分であることを示唆する。ＳＬＮの減少または完全な喪失のいずれかが、ＬＶ機能を等しく改善し、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの心筋線維化および壊死を減少させることが示された。

要約すると、これらの所見は、ＳＬＮ発現の減少がジストロフィ筋肉のＳＥＲＣＡ機能を改善するのに十分であることを示唆する。ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮの全身注射は、心臓および骨格筋の両方でＳＬＮ発現を減少させた。さらに、ＳＬＮタンパク質発現の減少は重度の筋ジストロフィ表現型を改善し、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの寿命を延長させた。これらの所見はまた、ＳＬＮ発現の減少が筋再生過程を改善し、ジストロフィ筋肉の線維型移行を防ぐことができることを示唆する。

方法
動物試験：この試験でマウスを使用するすべての実験手順は、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｒｕｔｇｅｒｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。正常およびＤＭＤ犬由来の組織試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯのＩＡＣＵＣによって承認された試験からのものであった。

マウス：Ｃ５７ＢＬ／６背景の３〜４ヶ月齢の雄性および雌性マウスを、この試験で述べるすべての実験に使用した。ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯ（ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ−／−）マウスは、ｍｄｘ：ｕｔｒ＋／−マウスをｓｌｎ−／−マウスに交配することによって作製した。これらのマウスを５世代交配して、同質遺伝子背景のｍｄｘ：ｕｔｒ＋／−：ｓｌｎ＋／−マウスを得た。次に、雄性と雌性のｍｄｘ：ｕｔｒ＋／−：ｓｌｎ＋／−マウスを交配して、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスを作製した。マウスは、温度２２〜２４℃、湿度６０〜７０％で、１２時間の明暗サイクルの下で飼育し、通常固形飼料を自由に摂取させた。マウスの遺伝子型は、以前に公開された配列を使用したＰＣＲ分析によって同定した。動物の数はパイロット試験に基づいて事前に決定し、サンプルサイズはこの分野で一般的に用いられるものと同様であった。データ分析から除外された試料、マウス、またはデータ点はなかった。遺伝子型を除いて、動物は無作為化しなかった。心エコー検査および筋力測定のために、試験担当者を遺伝子型について盲検化した。様々な生化学的、組織病理学的および機能的分析に使用した組織を以下に示す。

実験犬：犬に関連するすべての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｓｓｏｕｒｉのＩＡＣＵＣによって承認され、ＮＩＨガイドラインに従って実施された。すべての実験犬は、ゴールデンレトリバー、ラブラドールレトリバー、コーギーおよびビーグル犬からなる混合遺伝的背景にあり、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉの施設内で人工授精によって作製された。罹患犬は、ジストロフィンの発現を抑制するジストロフィン遺伝子の様々な突然変異を担持する。遺伝子型は、公開されているプロトコルに従ってポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。診断は、罹患犬における血清クレアチンキナーゼレベルの有意の上昇によって確認された。すべての実験犬を特定病原体除去動物飼育施設に収容し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルの下で飼育した。罹患犬は一段高い壇の犬舎に収容し、正常犬は通常の床の犬舎に収容した。年齢と大きさに応じて、２匹以上の犬を一緒に収容し、社会化を促進した。正常犬にはドライＰｕｒｉｎａ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５００６食餌を与え、罹患犬にはウェットＰｕｒｉｎａ Ｐｒｏｐｌａｎ Ｐｕｐｐｙ食餌を与えた。犬には清浄な飲料水を自由に摂取させた。犬舎では豊かさのために犬用のおもちゃを許可した。犬を、全体的な健康状態と活動について飼育担当者が毎日観測した。何らかの異常な変化（挙動、活動、食物と水の消費、および臨床症状など）について、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉの動物研究室の獣医が完全な理学的検査を実施した。この試験では、雄性と雌性の両方の犬を使用した。非ＤＭＤ対照は１．７３〜３１ヶ月齢の年齢範囲にあり、ＤＭＤ犬は６．８〜１１．９ヶ月齢の年齢範囲にあった。実験被験体は、動物の安楽死に関する２０１３年ＡＶＭＡガイドラインに従って試験の終わりに安楽死させた。新鮮解剖したＥＣＵ筋を液体窒素中で約０．５〜１ｃｍ^３のブロックとして瞬間凍結した。凍結した筋組織は、使用時まで−８０℃の冷凍庫に保管した。

ヒト試料：ＮＩＨ ＮｅｕｒｏＢｉｏＢａｎｋネットワークのメンバーであるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋから入手した２つの非ＤＭＤおよび２つのＤＭＤ男性心室試料をこの試験に使用した。すべての試料は死後に解剖された。ＤＭＤ１の死因は１５歳での心不全に帰せられ、一方、ＤＭＤ２の死因は１７歳での肺血栓塞栓症によるものであった。これらの試料の研究使用は、Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの施設内審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。

ヒトの四頭筋組織の研究使用は、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＩＲＢによって承認され、関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。２つの非ＤＭＤヒト四頭筋は、４歳と６歳の正常な小児からのものであった。２つのＤＭＤ四頭筋は、１１歳と１５歳のＤＭＤ患者からのものであった。組織を分析したすべての被験者からインフォームドコンセントを得た。

ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮの作製およびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスへの送達：ｓｈＳＬＮ配列（ＡＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧ）（配列番号２）を、最初にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を使用してプラスミドｐｄｓ−ｓｈＰＬＢにクローニングし、ｓｈＰＬＢ配列を置き換えた。９７５ｂｐのＡＡＶカセット全体（ＩＴＲ−Ｕ６−プロモータ−ｓｈＳＬＮ−ｂｇＨｐＡ−ＩＴＲ）およびＩＴＲに隣接するプラスミド骨格領域の一部をＢｓｐＨＩで消化し、ＮｃｏＩ部位でｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌに挿入した。得られたプラスミド「ｐＦＢ−ＩＴＲ−ｓｈ−ＳＬＮ」を使用して、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組換えバキュロウイルス「Ｂａｃ−ＩＴＲ−ｓｈ−ＳＬＮ」を作製した。ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮを、以前に記載されているようにＳｆ９昆虫細胞で作製した（Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３，１９３５−１９４３（２００２））。簡単に説明すると、Ｓｆ９昆虫細胞株にＢａｃ−ＩＴＲ−ｓｈ−ＳＬＮ、ＢａｃＲｅｐおよびＢａｃＣａｐ９ウイルスを感染させた。感染３日後、細胞を回収し、イオジキサノール勾配超遠心分離によってＡＡＶを精製し、乳酸加リンガー液に対して透析した。ウイルス力価を、ｂＧＨ領域に結合するプライマー（順方向：５’ＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴ（配列番号：３）；逆方向：５’ＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣ（配列番号：４））およびＡＡＶ２参照標準物質（ＡＴＣＣ）の希釈物を用いたｑＰＣＲによって決定し、標準曲線を作成した。

ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ注射試験では、１ヶ月齢の雄性および雌性ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスを使用した。マウスを２つの群：ＡＡＶ処置群と生理食塩水処置群に分けた。群あたり６匹のマウスを使用した。ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮベクター（１×１０^１１ゲノム）を単回ボーラス尾静脈注射によってマウスに送達した。Ｍモード心エコー検査によって前肢の強さと心機能を測定した後、マウスを１６週齢で犠死させ、組織を機能的および生化学的試験に使用した。

等尺性力の測定：単離された筋組織の等尺性力を前述のように決定した。簡単に説明すると、安楽死後直ちに半横隔膜とＥＤＬを採取し、低温酸素化リンガー液（ミリモル／リットルで、１３５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ_２、２ＣａＣｌ_２、１Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５ＮａＨＣＯ_３、および５．５グルコース）中に保持した。半横隔膜およびＥＤＬ調製物を、室温（〜２２℃）で酸素化（９５％Ｏ_２〜５％ＣＯ_２）リンガー液を含むＲｏｄｎｏｔｉチャンバ（Ｒｏｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）に取り付けた。一方の腱はＲｏｄｎｏｔｉチャンバの底部に取り付け、もう一方の腱はＧｒａｓｓ力変換器に取り付けた。筋の直接刺激のために、Ｇｒａｓｓ刺激装置によって生成された１ミリ秒の長い正方形の電気パルスを送達するためのＲｏｄｏｎｏｔｉチャンバの内壁に取り付けた２つの平行プレート（１×１ｃｍ^２）銀電極。筋を力の発生に最適な長さ（Ｌｏ）に調整した。プロトコルの最後に、それぞれノギスと体重計を使用して筋の長さと重量を測定した。閾値刺激を検出するために、最大収縮力が達成されるまで刺激電圧を上げた。筋力の生成を調べるために２〜１５０Ｈｚの範囲の４０閾値上（閾値の１２０％）刺激を適用した。ＰＣＬＡＭＰソフトウェア（バージョン１０．１、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して応答シグナルをデジタル化し（Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、取得し、分析した。力の正規化のための筋の断面積（ＣＳＡ）を、前述のように以下の式を使用して計算した。ＣＳＡ＝ｍ／（Ｌｏ×Ｌ／Ｌｏ×１．０６ｍｇ／ｍｍ^３）、ここで、「ｍ」は筋量（ｍｇ）、Ｌｏは最適な筋長、Ｌ／Ｌｏは線維長と筋長の比（ＥＤＬについては０．４５、横隔膜については１）および１．０６ｍｇ／ｍｍ^３は筋密度である。

組織学的分析：ＷＴ、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−：ｓｌｎ＋／−およびｔＫＯマウスの様々な骨格および心臓組織の５ミクロンパラフィン切片を、標準的な手順に従ってヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびマッソンの三色で染色した。線維化を示す三食染色による赤色染色コラーゲン領域およびＨ＆Ｅで染色された単核細胞を含む壊死領域を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ １．４３ｕプログラムを用いて計算した。

免疫蛍光：ｅＭｙＨＣ（ＢＦ４５）および１型ＭｙＨＣ（ＢＡＦ８）に特異的なマウスモノクローナル抗体をＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋから購入した。組織を１０ミクロンで凍結切片化し、ｅＭｙＨＣ（１：１０）または１型ＭｙＨＣ（１：５）に特異的な抗体を使用して４℃で一晩免疫染色し、前述のように処理した。線維サイズの測定のために、組織切片をＷＧＡで染色した（フルオロフォア結合、１：１００、カタログ番号Ｗ１１２６２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ Ｂａｓｅ上でＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０を使用して画像を取得し、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓを使用して処理した。ＩｍａｇｅＪ １．４３ｕプログラムを使用して、ＷＧＡ染色切片に関して筋線維サイズの最小「フェレット」直径変動係数を計算した。

ウェスタンブロット分析：マウス組織を解剖し、滅菌ＰＢＳですすぎ、液体窒素で瞬間凍結した。マウス、イヌまたはヒト組織の均質化を、ＰＭＳＦ（１ミリモル）、ＮａＶＯ_３（５ミリモル）、オカダ酸（１０ナノモル）、ＮａＦ（１ミリモル）、およびベンズアミジン（１ミリモル）を添加した溶解緩衝液（ミリモル／リットルで、５０トリス、ｐＨ７．４、１５０ＮａＣｌ、１ＥＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０）中で実施した。等量の全タンパク質抽出物を、事前に染色した分子量マーカーと共にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、室温で１時間ニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜をポンソーＳで染色し、試験した各タンパク質の分子量に基づいて小さな細片に切断した。次に、膜細片をリン酸緩衝生理食塩水中の３％乳でブロックし、ＳＬＮ（抗ウサギ、１：３０００）、ＳＥＲＣＡ１（抗ウサギ、１：２０００、カスタムメイド）、ＳＥＲＣＡ２ａ（抗ウサギ、１：５０００、カスタムメイド）、ＰＬＮ（抗ウサギ、１：３０００、カスタムメイド）、心臓アイソフォームと骨格アイソフォームの両方を認識するＣＳＱ（抗ウサギ、１：５０００、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）、ＲｙＲ（抗マウス、１：１０００、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）またはＧＡＰＤＨ（抗マウス、１：１０，０００、Ｓｉｇｍａ）に特異的な抗体を使用して４℃で一晩プローブした。膜を適切な二次抗体と共に室温で４５分間インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰイメージングシステムを使用してＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で視覚化した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂバージョン５．１ソフトウェアを使用してシグナルの定量化を行い、次いでＧＡＰＤＨレベルに正規化した。ウェスタンブロットを少なくとも３回繰り返した。ウェスタン画像のクロップされていないスキャンを図１４および１５に示す。

握力測定：握力測定装置（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して筋機能の評価を記録した。握力測定装置を水平に配置し、マウスをその尾で支えて、三角形のプルバーをしっかりと握らせた。マウスが三角形のプルバーをしっかりと握った後、マウスを装置と平行に後方に引いた。解放時にバーに加えられた力をピーク握力（ニュートン）として記録した。これを３回繰り返し、各マウスの平均力を決定した。握力の値を各動物の体重（ｇ）で正規化して、握力（Ｎ／ｇ）比を得た。

ＳＲ Ｃａ^２＋の取り込み：ＳＲ Ｃａ^２＋の取り込みを、前述のようにＭｉｌｌｉｐｏｒｅろ過技術に従って測定した。簡単に説明すると、約１５０μｇの全タンパク質抽出物を、１．５ｍｌのＣａ^２＋取り込み培地（ミリモル／リットルで、４０イミダゾール、ｐＨ７．０、１００ＫＣｌ、５ＭｇＣｌ_２、５ＮａＮ_３、５シュウ酸カリウム、および０．５ＥＧＴＡ）ならびに様々な濃度のＣａＣｌ_２中３７℃でインキュベートして、０．０３〜３μｍｏｌ／Ｌの遊離Ｃａ^２＋（１μＣｉ／μｍｏｌ ^４５Ｃａ^２＋を含む）を得た。ＳＲ Ｃａ^２＋取り込みの最大刺激を得るために、基質を添加してＣａ^２＋取り込みを開始する直前に、ルテニウムレッドを最終濃度１μｍｏｌまで添加した。ＡＴＰを５ｍｍｏｌの最終濃度まで添加することによって反応を開始し、ろ過によって１分で終了した。各アッセイは二重に行った。ＳＲ Ｃａ^２＋の取り込みの速度およびＥＣ_５０に必要なＣａ^２＋濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０１ソフトウェアを使用した非線形曲線適合分析によって決定した。

カルパインアッセイ：タンパク質抽出物中の活性化カルパインを、カルパイン活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６５３０８）を使用して測定した。簡単に説明すると、胸筋の細胞質タンパク質抽出物を、抽出手順中のカルパインの自動活性化を防ぐ抽出緩衝液を用いて調製した。カルパイン活性は、カルパイン基質Ａｃ−ＬＬＹ−ＡＦＣを用いた蛍光アッセイを使用して測定した。活性を相対蛍光単位（ＲＦＵ）／ｍｇタンパク質として表した。

心エコー検査：マウスを２．５％トリブロモエタノールで麻酔し、前述のように高周波トランスデューサ（３０ＭＨｚ）を備えた高解像度超音波装置ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ／Ｖｅｖｏ ７７０システムを使用して心エコー検査を実施した。左室（ＬＶ）寸法、壁の厚さ、左室内径短縮率（ＦＳ）、およびＬＶ駆出率（ＥＦ）をＬＶ Ｍモード画像から測定した。

統計分析：線維サイズの結果測定、線維化と壊死の定量化、および筋肉力学については、確立されたＤＭＤ標準操作手順に従った。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０１ソフトウェアを使用して実施した。結果は平均値±標準誤差として提示する。ウェルチの補正による両側の対応のないスチューデントの「ｔ」検定を使用して差を決定した。必要に応じて、複数群比較のために、ポストホックボンフェローニ補正による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。ｐ＜０．０５の値を有意と見なした。カプラン・マイヤー生存分析を使用して生存率曲線を作成し、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用してデータを分析した。

実施例２
犬のジストロフィ筋芽細胞のＳＬＮタンパク質レベルの増加
ＳＬＮはジストロフィ犬の筋芽細胞で上方調節される（図１６）。ＡＡＶ９を使用して発現させた犬特異的ｓｈＳＬＮ（５’−ｃｔｇｔｔｔｃｔｃａａｃｔｔｃａｃｔａｔｔｇｔｔｔｃａａｇａｇａａｃａａｔａｇｔｇａａｇｔｔｇａｇａａａｃａｇ−３’）（配列番号５）は、ジストロフィ犬の筋芽細胞におけるＳＬＮ発現を減少させた（図１７）。

実施例３
ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮとＡＡＶ９μｄｙｓを組み合わせた遺伝子治療
ＳＬＮ発現の低減はＤＭＤを緩和するのに有益であった；しかしながら、このアプローチではジストロフィンの欠乏は矯正されない。ＡＡＶを介したマイクロジストロフィン（μ−ｄｙｓ）治療はジストロフィン機能を回復することができる。しかし、多くのグループからの試験は、μ−ｄｙｓがジストロフィ筋肉の収縮力を正常化できないことを示している。ＳＬＮ減少とμ−ｄｙｓ療法の組み合わせは、これらの問題を克服し、より良好な保護をもたらし得る。したがって、１ヶ月齢のｍｄｘおよびｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスを、尾静脈注射によって各マウスあたりそれぞれ１×１０^１１ｖｇおよび５×１０^１２ｖｇの用量のＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮおよびＹ７３１Ｆ ＡＡＶ９．ΔＲ２ μＤｙｓで処置する（Ｙｕｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２４（２０）：５８８０−９０）。これらのマウスを、上記のように構造的および機能的矯正に関して注射の１２週間後に評価する。データを単一ベクターで処置したマウスと比較する。

ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮの１×１０^１１〜１×１０^１２ｖｇの範囲は、非特異的な毒性を伴わずにインビボでＳＬＮ発現を減少させる高い効果が期待される。ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮとＡＡＶ９．μ−ｄｙｓを組み合わせた遺伝子治療は、いずれかの治療単独よりも優れた構造的および機能的保護をもたらすはずであると予想される。

ＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮおよびＡＡＶ９．ｓｈＳＬＮ／ＡＡＶ９．μ−ｄｙｓで処置したｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの寿命が延長することが予想される。したがって、ｍｄｘ：ｕｔｒ−／−マウスの処置時間を増加し、生存期間に応じて検査する。

本明細書で使用される場合、「マイクロジストロフィン」、「マイクロ−ジストロフィン」、および「μ−ｄｙｓ」という用語は、一般に、コード配列の大部分を欠くジストロフィン配列を意味する。本明細書で述べるベクター、組成物、および方法では、任意の適切なマイクロジストロフィン配列を使用することができる。ヒトでは、マイクロジストロフィン療法は、典型的にはヒトμ−ｄｙｓまたはヒト最適化μ−ｄｙｓ（例えば、Ｋｏｒｎｅｇａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８，１５０１−１５０８，２０１０）を含み、典型的にはエクソン１８〜５８の間にジストロフィン変異を有する患者向けである。ジストロフィンのＮ末端アクチン結合ドメインとＣ末端ドメインはジストログリカン複合体（ＤＧＣ）構築に必要であり、ジストロフィンタンパク質の機能に重要であることがいくつかの試験で示されているため、典型的な実施形態では、これらのドメインを含むマイクロジストロフィン遺伝子を合成し、筋特異的プロモータの下に置き、上記のようにｒＡＡＶを使用して送達し、発現させる。ヒトマイクロジストロフィン配列の一例は、Ｊ．Ｒ．Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｏｃｔ ７；３６３（１５）：１４２９−３７に記載されているものであり、その中で、ｒＡＡＶベクターは、ヒトジストロフィン遺伝子のアミノ末端アクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）、５つのロッドリピートドメイン（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４）、３つのヒンジドメイン（Ｈ１、Ｈ３およびＨ４）、ならびにシステインリッチ（ＣＲ）ドメインをコードしている。そのようなマイクロジストロフィン配列は、本明細書で述べるベクター、組成物および方法において使用することができる。ヒトジストロフィン遺伝子配列は公知であり、入手可能である。

実施例４
ヒトｓｈＳＬＮ配列
ヒト被験者（例えばＤＭＤまたはＤＭＤと心筋症を有する被験者）におけるＳＬＮ発現または活性を低下させ、ＤＭＤ、およびいくつかの実施形態では心筋症も予防、改善、または治療するために使用し得るヒトｓｈＳＬＮ配列の例は、
ｓｈＲＮＡ１：ｃｔｇｔｇａａａａｔｇｇｇｇａｔａａａｃａｃｃ ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ ｇｇｔｇｔｔｔａｔｃｃｃｃａｔｔｔｔｃａｃａｇ（配列番号６）
ｓｈＲＮＡ２：ＧＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＧＧＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＣ（配列番号７）
を含む。

さらなるヒトｓｈＳＬＮ配列には、例えば配列番号６または配列番号７と８５％以上（例えば９０％、９５％、９９％）の配列同一性を有するものが含まれる。

ヒトＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡ配列を同定し、試験した。これらの配列は、細胞培養系においてヒトＳＬＮ発現を有効に減少させた。ヒトＳＬＮ（ｈｓｈＳＬＮ）に特異的な潜在的ｓｈＲＮＡを選択するために、ｓｈＲＮＡ発現プラスミド（ｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏベクター、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にクローニングしたいくつかの小さな干渉ＲＮＡ配列を、ヒトＳＬＮ ｃＤＮＡ構築物とのヒト細胞株、ＨＥＫ２９３のコトランスフェクションによってスクリーニングした。対照として、ヒトＳＬＮ発現に影響を及ぼさないマウスｓｈＳＬＮ（ｍｓｈＳＬＮ）を発現するプラスミドを、ヒトＳＬＮ ｃＤＮＡと共にトランスフェクトした。ヒトＳＬＮタンパク質レベルを有効に低下させる５つの異なるショートヘアピン配列が見出された。表３は、これら５つのｓｈＲＮＡ配列のＤＮＡ配列情報を示す。５つのｓｈＲＮＡ配列の中で、ｈｓｈＳＬＮ１とｈｓｈＳＬＮ３は、ＳＬＮタンパク質レベルの低下において非常に高い効果を有していた。これら２つのｓｈＲＮＡは、ＳＬＮタンパク質レベルを９０％超減少させた（図１８）。ｈｓｈＳＬＮ２とｈｓｈＳＬＮ５はＳＬＮタンパク質レベルを〜５０％に、ｓｈＳＬＮ４は〜３０％に減少させた（図１８）。これらの情報に基づき、ヒトＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡの選好順序は次のとおりである：
１）ｈｓｈＳＬＮ１
２）ｈｓｈＳＬＮ３
３）ｈｓｈＳＬＮ２
４）ｈｓｈＳＬＮ５
５）ｈｓｈＳＬＮ４
さらなるヒトｓｈＳＬＮ配列には、例えば配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１と８５％以上（例えば９０％、９５％、９９％）の配列同一性を有するものが含まれる。

実施例５
ヒトＳＬＮ ｍＲＮＡ配列
１ ａｇｔｃｃａｇａｃａ ｇｃｃｔｇｇｇａｇｇ ｇｇａｇａａｇｇａｇ ｔｔｇｇａｇｃｔｃａ ａｇｔｔｇｇａｇａｃ ａｇｃｇａｇｇａｇａ
６１ ａａｃｃｔｇｃｃａｔ ａｇｃｃａｇｇｇｔｇ ｔｇｔｃｔｔｔｇａｔ ｃｃｔｃｔｔｃａｇｇ ａｇｇｔｇａｇｇａｇ ａａｇｃｃａｇａｇｇ
１２１ ｔｃｃｔｔｇｇｔｇｔ ｇｃｃｃｔｃａｇａａ ａｔｃｔｇｃｃｔｇｃ ａｇｔｔｃｔｃａｃｃ ａａｇｃｃｇｃｔｇｔ ｇａａａａｔｇｇｇｇ
１８１ ａｔａａａｃａｃｃｃ ｇｇｇａｇｃｔｇｔｔ ｔｃｔｃａａｃｔｔｃ ａｃｔａｔｔｇｔｃｔ ｔｇａｔｔａｃｇｇｔ ｔａｔｔｃｔｔａｔｇ
２４１ ｔｇｇｃｔｃｃｔｔｇ ｔｇａｇｇｔｃｃｔａ ｔｃａｇｔａｃｔｇａ ｇａｇｇｃｃａｔｇｃ ｃａｔｇｇｔｃｃｔｇ ｇｇａｔｔｇａｃｔｇ
３０１ ａｇａｔｇｃｔｃｃｇ ｇａｇｃｔｇｃｃｔｇ ｃｔｃｔａｔｇｃｃｃ ｔｇａｇａｃｃｃｃａ ｃｔｇｃｔｇｔｃａｔ ｔｇｔｃａｃａｇｇａ
３６１ ｔｇｃｃａｔｔｃｔｃ ｃａｔｃｃｇａｇｇｇ ｃａｃｃｔｇｔｇａｃ ｃｔｇｃａｃｔｃａｃ ａａｔａｔｃｔｇｃｔ ａｔｇｃｔｇｔａｇｔ
４２１ ｇｃｔａｇｇａｔｔｇ ａｔｔａｔｇｔｇｔｔ ｃｔｃｃａａａｇａｔ ｇｃｔｇｃｔｃｃｃａ ａｇｇｇｃｔｇｃｃａ ａｇｔｇｔｔｔｇｃｃ
４８１ ａｇｇｇａａｃｇｇｔ ａｇａｔｔｔａｔｔｃ ｃｃｃａａｃｔｃｔｔ ａａｃｔｇａａａａｔ ｇｔｇｔｔａｇａｃａ ａｇｃｃａｃａａａｇ
５４１ ｔｔａａａａｔｔａａ ａｃｔｇｇａｔｔｃａ ｔｇａｔｇａｔｇｔａ ｇｇａｔｔｇｔｔａｃ ａａｇｃｃｃｃｔｇａ ｔｃｔｇｔｃｔｃａｃ
６０１ ｃａｃａｃａｔｃｃｃ ｔｔｃａａｃｃｃａｃ ａｃｇｇｔｃｔｇｃａ ａｃｃａａａｃｔｃｔ ａａｔｔｃａａｃｃｔ ｇｃｃａｇａａｇｇａ
６６１ ａｔｇｔｔａｇａｇｇ ａａｇｔｃｔｔｔｇｔ ｃａｇｃｃｃｔｔａｔ ａｇｃｔａｔｃａｔｇ ｔｇａａｔａａａｇｔ ｔａａｇｔｃａａｃｔ
７２１ ｔｃａａａａａｃａａ ａａａａａａａａ（配列番号１２）。

他の実施形態
本明細書に開示されるすべての核酸、核酸名、遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物、ウイルス、ベクター、キット、および方法が適用可能なあらゆる種のホモログに対応することを意図している。したがって、これらの用語には、ヒト、マウスおよびイヌの核酸、遺伝子および遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。特定の種からの核酸、遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示のみを意図し、それが現れる文脈が明確に指示しない限り、限定として解釈されるべきではないことが理解される。組成物、ウイルス、ベクター、キット、および方法の工程の一部または全部において改善が行われ得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、本発明を明らかにすることを意図し、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本発明または好ましい実施形態の性質または利点に関する本明細書のいかなる記述も限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲はそのような記述によって限定されると見なされるべきではない。より一般的には、本明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正および等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に指示しない限り、または文脈によって明らかに禁忌でない限り、本発明に包含される。

Claims (17)

1. 細胞におけるサルコリピン（ＳＬＮ）発現または活性を低下させるための治療有効量で、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
2. 前記核酸配列が、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群より選択される、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ｒＡＡＶが血清型９（ＡＡＶ９）である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
4. 請求項１、請求項２または請求項３に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
5. μ−ｄｙｓをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む第２のｒＡＡＶベクターを含む第２のｒＡＡＶをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
6. 前記第２のｒＡＡＶが血清型９（ＡＡＶ９）である、請求項５に記載の組成物。
7. 細胞におけるサルコリピン（ＳＬＮ）発現または活性を低下させるための治療有効量で、ＳＬＮに特異的なｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを含む組換えウイルスを含む組成物。
8. μ−ｄｙｓをコードする核酸配列を含む異種ポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えウイルスベクターを含む第２の組換えウイルスをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
9. 細胞におけるＳＬＮ発現を減少させる方法であって、前記細胞を請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
10. 被験体のデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）を予防または治療する方法であって、請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
11. 前記被験体が哺乳動物である、請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物の投与が、前記被験体における関連する心筋症を予防または治療する、請求項１０に記載の方法。
13. 請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物を、ＤＭＤの症状または病変の発症前に前記被験体に投与する、請求項１０に記載の方法。
14. 前記哺乳動物に請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物を注射によって投与する、請求項１１に記載の方法。
15. 被験体の心筋症を治療する方法であって、請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
16. 前記被験体が哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
17. 細胞におけるＳＬＮ発現を減少させる、または被験体のＤＭＤを予防もしくは治療するためのキットであって、
    （ａ）請求項１、請求項２もしくは請求項３に記載のｒＡＡＶ、または請求項４、請求項５、請求項６、請求項７もしくは請求項８に記載の組成物；
    （ｂ）使用説明書；および
    （ｃ）包装
    を含む、キット。