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JP2020500148A - 新規細胞傷害性剤およびそのコンジュゲート - Google Patents

新規細胞傷害性剤およびそのコンジュゲート Download PDF

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Abstract

一般式Ｉの新規メイタンシノイド化合物が本明細書に提供される。リンカーを介して結合タンパク質に連結された化合物を含み、リンカーを介して結合される化合物を含む試薬を、結合タンパク質と反応可能な少なくとも１つの官能基にコンジュゲートするコンジュゲートも、本明細書に提供される。化合物およびコンジュゲートを含む医薬組成物、例えば癌治療における化合物およびコンジュゲートに関連する治療方法および使用、ならびに新規合成プロセスも本明細書に提供される。

Description

本発明は、新規細胞傷害性剤、新規コンジュゲート、特に抗体−薬物コンジュゲート、およびコンジュゲートを製造するための中間体（新規コンジュゲート試薬を含む）に関する。それはまた細胞傷害性剤を製造するための新規プロセスにも関する。
近年、広範な用途のためのペプチドおよびタンパク質へのペイロードとしての治療薬のコンジュゲーションに対して多くの研究がなされてきた。タンパク質またはペプチド自体が治療特性を有してもよく、かつ／またはそれは結合タンパク質であってもよい。加えて、ポリマーへのコンジュゲーションは、ある特定の治療薬の特性を改善するために使用されてきた。例えば、水溶性合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、治療的に活性なペプチドまたはタンパク質をコンジュゲートするために広く使用されている。これらの治療用コンジュゲートは、循環時間を延長し、クリアランス速度を減少させることにより薬物動態を有利に変え、全身毒性を減少させ、いくつかの例では増加した臨床効果を示すことが示された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質および他のペイロードに共有結合によりコンジュゲートさせるプロセスは、一般に「ＰＥＧ化」として知られている。
結合タンパク質（すなわち、標的上の結合パートナーに結合可能なタンパク質またはペプチド）、特に抗体または抗体断片は、コンジュゲートにおいて頻繁に使用される。例えば、それらを細胞傷害性剤および化学療法薬とコンジュゲートして、そのような薬剤を特定の組織または構造、例えば特定の細胞型または成長因子に標的送達することを可能にし、正常で健康な組織に対する影響を最小限に抑え、化学療法処置と関連付けられる副作用を大幅に低減する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生してもよい。そのようなコンジュゲートは、いくつかの疾患領域、特に癌において広範な潜在的治療用途を有する。
Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９４，１３５４（１９７２）は、最初にメイタンシンをアフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｏｖａｔｕｓの樹皮から単離し、そこでその抗白血病特性が注目された。メイタンシノールおよびメイタンシノールのＣ−３エステルなどのメイタンシノイドは、微生物（ＵＳ４，１５１，０４２）、コケ（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．， ５１（５），８４５−８５０，１９８８）によって作製されることが見出され、合成経路によっても生成することができる（Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．”Ｍｅｄ． “Ｃｈｅｍ．，２１，３１−３７，１９７８，Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７０，７２１−７２２，１９７７）。メイタンシンおよびメイタンシノールは以下の構造を有する。
ＵＳ４，１９０，５８０はメイタンシノイドの合成方法を記載しており、一方ＵＳ４，２６０，６０８は、細胞に対するそれらの抗有糸分裂効果の結果として強力な抗微生物および抗腫瘍活性を有するいくつかのメイタンシン誘導体化合物を特定した。ＵＳ４，２６０，６０８は、Ｒ３位に任意選択で置換されているアルキル基を有するメイタンシン誘導体を開示している。それ以来、メイタンシノイドの他の強力な構造を決定するために数多くの構造−活性関係の研究が行われてきた。Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２（９），３４４１−３４５１（１９８４）は、メイタンシノールのＣ３位で修飾されたいくつかの構造を発表し、それはインビボで強力な抗腫瘍効果を示した。ＥＰ０ ００４ ４６６、ＵＳ４，１３７，２３０、およびＷＯ２０１２／０６１５９０はすべて新規メイタンシノイドを記載している。メイタンシノイドの様々な修飾は、ＵＳ２００９／２５８８７０、Ｔａｆｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，８８０−８８６、およびＨａｒｍｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ，ＢｅｉｌｓｔｅｉｎＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４，１０，５３５−５４３に記載されている。
周知のメイタンシノイドには、ＵＳ５，２０８，０２０およびＷＯ２００４／１０３２７２に記載されるように、ＤＭ１およびＤＭ４として知られているものが含まれる。これらは以下の構造を有する。
アンサマイトシンはメイタンシノイドのサブグループであり、その合成はＴａｆｔ ｅｔ ａｌ， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００８，９，１０５７−１０６０により記載されている。よく知られているアンサマイトシンはＡＰ−３であり、以下の構造を有する。
メイタンシノイドおよびメイタンシノイドエステルは、その後、ＥＰ０４２５２３５内のＡＤＣの文脈内で細胞傷害性ペイロードとして使用され、それ以来広く使用されてきた。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，８６１８−８６２３（１９９６）およびＫｉｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１５（１２），２００９を参照されたい。Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，４３９２−４４０８（２００６）は、チオール連結ＤＭ１およびＤＭ４メイタンシノイドペイロードを記載している。これらのペイロードは、最初にヘテロ二官能性のチオール含有リンカーを抗体内のリジン残基と反応させ、続いてジスルフィド交換によってリンカーにチオール含有ペイロードをコンユゲートさせる二段階プロセスによってコンジュゲートされた。この二段階プロセスによってＡＤＣを産生する別の手段は、抗体内のリシン残基と反応させるために一端にスクシンイミド基を有し、メイタンシノイドのチオール基と反応させるためにもう一端にマレイミド基を有するスクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）ヘテロ二官能性リンカーの使用によるものである。市販の医薬品Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は、ＤＭ１メイタンシノイドペイロードを有するＳＭＣＣリンカーを使用して産生されたＡＤＣの例である。Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は現在、診療所における有数のＡＤＣの１つであり、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療に使用されている。
ＷＯ２０１４／０６４４２４は、薬物を抗体に結合させるために異なる特定の技術を使用するメイタンシンに基づくＡＤＣを記載している。例示されるのは、Ｌｅｖｅｎａ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）から市販されている試薬ＡＨＸ−ＤＭ１から誘導され、以下の構造を有するコンジュゲートである。
ＡＤＣの文脈内で使用され得る新規の強力な細胞傷害性分子が依然として必要とされている。これらのペイロードは、より安定なＡＤＣを生成することを可能にするコンジュゲーション技術を使用して抗体と効率的にコンジュゲートする必要がある。癌の関連する細胞または動物モデルにおいてより高い有効性または効力を示すか、あるいは細胞または試験対象内で同等レベルの有効性／効力を示すが非特異的毒性の量が少ないＡＤＣも必要とされている。
今回、ある特定の新規メイタンシノイド化合物が改善された細胞傷害活性を有し、結合タンパク質とのコンジュゲートへの包含に特に適していることを我々は見出した。メイタンシノイドはさらに、比較化合物と比較して改善された安定性を有する。我々はまた、これらの新規化合物の効率的な調製を可能にする新規合成方法、ならびに他のメイタンシノイドの新規の改善された合成方法も見出した。
ＵＳ４，１５１，０４２ ＵＳ４，１９０，５８０ ＵＳ４，２６０，６０８ ＥＰ０ ００４ ４６６ ＵＳ４，１３７，２３０ ＷＯ２０１２／０６１５９０ ＵＳ２００９／２５８８７０ ＵＳ５，２０８，０２０ ＷＯ２００４／１０３２７２ ＥＰ０４２５２３５ ＷＯ２０１４／０６４４２４
Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９４，１３５４（１９７２） Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．， ５１（５），８４５−８５０，１９８８ Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．"Ｍｅｄ． "Ｃｈｅｍ．，２１，３１−３７，１９７８ Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７０，７２１−７２２，１９７７ Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２（９），３４４１−３４５１（１９８４） Ｔａｆｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，８８０−８８６ Ｈａｒｍｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ，ＢｅｉｌｓｔｅｉｎＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４，１０，５３５−５４３ Ｔａｆｔ ｅｔ ａｌ， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００８，９，１０５７−１０６０ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，８６１８−８６２３（１９９６） Ｋｉｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１５（１２），２００９ Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，４３９２−４４０８（２００６）
本発明は、一般式（Ｉ）の化合物またはその塩を提供し、
式中、Ｒは、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＳ（Ｏ）２−Ｒｘ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｘＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨ、−Ｙ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＯＨ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＮＨ２、または−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２を表し、式中、Ｙは存在しないか、あるいはＹは、酸素原子によって中断されてもよく、かつ／または任意選択で−ＯＨもしくは−ＯＣ１−４アルキルで置換されていてもよいＣ１−６アルキレン、Ｃ２−６アルケニレン、Ｃ２−６アルキニレン、もしくはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すか、あるいはＹは、フェニレンまたはＣ５−１０ヘテロアリーレン基を表すかのいずれかであり、Ｒｘは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、フェニル、Ｃ５−１０ヘテロアリール、またはベンジル基を表し、ＲｙおよびＲｚはそれぞれ、独立して、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、フェニル、Ｃ５−１０ヘテロアリール、またはベンジル基を表し、Ｘは、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、任意選択で置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、またはＣ１−６アルコキシ基を表し、それらはそれぞれ、任意選択で、酸素原子、任意選択で置換されているフェニルもしくはＣ５−１０ヘテロアリール基、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｒｖ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｖＲｗ、−ＮＲｖＣ（Ｏ）Ｒｗ、ＮＲｖＲｗ、＿−ＳＲｖ、−Ｓ（Ｏ）−Ｒｖ、Ｓ（Ｏ）２−Ｒｖ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｖＲｗ、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基によって中断されてもよく、ＲｖおよびＲｗはそれぞれ、独立して、水素、フェニル、ベンジル、および任意選択で置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、またはＣ２−６アルキニル基からなる群から選択され、それらのそれぞれは、任意選択で、酸素原子によって中断されてもよく、ｎは、０、１、２、３、または４であり、Ｒｆは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｇは、水素原子、または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、もしくはヘテロアリール基を表す。
本発明はまた、一般式（Ｉ’）の化合物またはその塩を提供し、
式中、Ｒは、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−ＣＯ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、または−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨを表し、式中、Ｙは存在しないか、またはＹは、Ｃ１−６アルキレンもしくはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すかのいずれかであり、それらのいずれかは、酸素原子によって中断されてもよく、Ｒｘは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−４アルキル基を表し、ＲｙおよびＲｚはそれぞれ、独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｘは、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、ＣＦ３基、またはＣ１−４アルキル基もしくはＣ１−４アルコキシ基を表し、ｎは、０、１、２、３、または４であり、Ｒｆは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｇは、水素原子、または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリール基を表す。
本発明はまた、リンカーを介して結合タンパク質に連結されている一般式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）の化合物、またはそれらの塩を含むコンジュゲートを提供し、該リンカーは、一般式（Ｉ）または（Ｉ’）の基Ｒを介して該化合物に接続されている。
本発明はさらに、結合タンパク質と反応可能な少なくとも１つの官能基にリンカーを介して結合されている一般式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）の化合物、またはそれらの塩を含むコンジュゲート試薬を提供し、該リンカーは、一般式（Ｉ）または（Ｉ’）の基Ｒを介して接続されている。
本発明はさらに、本発明による化合物またはコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に、および任意選択で追加の治療薬と一緒に含む医薬組成物を提供する。薬学的有効量の、本発明による化合物、コンジュゲート、または組成物を患者に投与することを含む、増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患または障害の治療を必要とする患者を治療する方法も提供される。治療に使用するための、特に増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患または障害の治療に使用するための本発明による化合物、コンジュゲート、または組成物も提供される。さらに、本発明による化合物またはコンジュゲートは、増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患または障害の治療に使用するための薬剤の製造に使用することができる。
本発明はまた、本発明による化合物を調製するためのプロセス、および本発明による化合物を調製するのに有用な新規中間体も提供する。
化合物
本発明の化合物は一般式（Ｉ）のものである。本発明の化合物は、予想外の生物学的活性を有する新しいクラスのビフェニル含有化合物である。本発明の化合物はまた、新しい抗体−薬物コンジュゲートおよびコンジュゲート試薬の産生において有用性を見出す。
いくつかの実施形態では、化合物は式（Ｉ’）のものである。
本発明の化合物において、好ましくは、Ｒに存在する任意の基ＲｙまたはＲｚは、メチル基、または特に水素原子である。好ましい一実施形態では、Ｙは存在しない。Ｙが存在する場合、それは、例えば−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−のように、酸素原子によって中断されてもよいＣ１−４アルキレンまたはＣ１−４アルキレンオキシ基が好ましい。アルキレン基は、例えば、メチレン、エチレン、またはｎ−プロピレン基であり得、一方、アルキレンオキシ基は、例えば、メチレンオキシ、エチレンオキシ、またはｎ−プロピレンオキシ基であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒは、−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＳ（Ｏ）２−Ｒｘ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、または−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２であり、式中、Ｙは存在しないか、またはＹはＣ１−６アルキレン基を表し、Ｒｘは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２またはＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−６アルキル基を表す。いくつかの好ましい実施形態では、ＲはＹ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘであり、より好ましくは、Ｒは、Ｙが存在しないＹ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘであり、さらにより好ましくは、Ｒは、Ｙが存在せず、Ｒｘが−ＳＨで置換されているＣ１−６アルキルを表す、Ｙ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘである。いくつかの好ましい実施形態では、Ｒは、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２ＯＨ、または−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨ、特に−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨ、特に−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨである。Ｒが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキルであり、式中、該アルキルが−ＳＨで置換されている（すなわち、−ＮＨ（Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨ）場合、Ｃ１−６アルキル部分は、直鎖または分岐鎖であり得、例えば、Ｒは以下を含み得る：
いくつかの実施形態では、Ｒは、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２もしくは−ＣＯ２Ｈ基、またはＣ１−４アルキレン基、特に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、もしくは−ＣＯ２Ｈ基で置換されているメチレン、エチレン、またはｎ−プロピレン基である。Ｒ基は、フェニル環のいずれの位置にあってよい。基Ｒは、好ましくは、フェニル環の３または４位にある（すなわち、メイタンシノイドコア構造の一部を形成するフェニル環に結合を形成するフェニル環の位置に対して）。
存在する場合、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、任意選択で置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、またはＣ１−６アルコキシ基を表し、それらのそれぞれが、任意選択で、酸素原子、任意選択で置換されているフェニルもしくはＣ５−１０ヘテロアリール基、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｒｖ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｖＲｗ、−ＮＲｖＣ（Ｏ）Ｒｗ、ＮＲｖＲｗ、＿−ＳＲｖ、−Ｓ（Ｏ）−Ｒｖ、Ｓ（Ｏ）２−Ｒｖ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｖＲｗ、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基によって中断されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、ＣＦ３基、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基を表す。いくつかの実施形態では、存在する任意のＲｅ基は、独立して、ハロゲン原子、メトキシ基、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、存在する任意のＲｅ基は、塩素、フッ素、メトキシ基、−ＣＮ基、および−ＮＯ２基からなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、存在する任意のＲｅ基は、好ましくは、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、もしくはフッ素原子、またはメチルもしくはメトキシ基である。好ましくは、ｎは、０、１、または２、特に０または１、特に０である。存在する場合、Ｒｅ基または各Ｒｅ基は、フェニル環がＲ基で置換されている位置以外のフェニル基の任意の位置にあってよい。
好ましくは、ＸはＯＨを表す。好ましくは、Ｒａは、Ｃ１−４アルキル、特にメチルを表す。好ましくは、Ｒｂは水素を表す。好ましくは、Ｒｃは、水素またはメトキシ、より好ましくは水素を表す。好ましくは、Ｒｄは、Ｃ１−４アルキル、特にメチルを表す。好ましくは、Ｒｅは、塩素または水素、特に塩素を表す。好ましくは、Ｒｆは、Ｃ１−４アルキル、特にメチルを表す。
置換基Ｒｇの性質は、本発明に重要であるとは考えられず、メイタンシンコア中のこの位置における非常に広範囲の置換基が文献に報告されている。任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基は、好ましくは、最大１０個、例えば最大６個の炭素原子を有する。シクロアルキル基は、好ましくは、５、６、または７個の環炭素原子を有し、例えば、１つ以上のＣ１−４アルキル基で置換されていてもよい。アリール基は、好ましくは、フェニル基である。ヘテロアリール基は、例えば、少なくとも１個のＯ、Ｓ、および／またはＮ原子を含む５、６、または７個の環原子を有することができる。それは、例えば、チオフェン、ピロール、ピロリドン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、ピラゾリン、イソキサゾール、トリアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、またはピペラジン基であり得る。アリールまたはヘテロアリール基Ｒｇ上に存在し得る任意選択の置換基は、ハロゲン原子、ならびにアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルコキシ基を含み、ここで、任意のアルキル部分は、１〜４個の炭素原子を有する。アルキル基Ｒｇは、例えば、１個以上のハロゲン原子および／またはヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、もしくはジアルキルアミノ基で置換されていてもよく、ここで、任意のアルキル部分は、１〜４個の炭素原子を有する。アルキル基Ｒｇは、１つ以上のアミノ酸、例えば、Ｎ−メチルアラニンまたはＮ−メチルシステインで置換されていてもよい。Ｒｇが置換アルキル基であるいくつかの実施形態では、基−Ｃ（Ｏ）−Ｒｇは、アミノ酸由来であってもよい。例えば、アルキル基Ｒｇは、基Ｎ（Ｒｉ）（Ｒｉｉ）で置換されていてもよく、式中、Ｒｉは、水素またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｉｉは、Ｃ１−４アルキル基、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル基、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ２−６アルケニル基、または−Ｃ（Ｏ）−Ｃ３−６シクロアルキル基を表し、該Ｃ３−６シクロアルキル基は、非置換であるか、または最大２個のメチル基で置換されていてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｇは、非置換であるか、またはＮ（Ｒｉ）（Ｒｉｉ）で置換されているＣ１−４アルキルを表し、Ｒｉは、Ｃ１−４アルキル基を表し、Ｒｉｉは、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル基を表す。そのようなＲｇ基の例には、以下が含まれる：
Ｒｇが置換アルキル基であるいくつかの実施形態では、上述の基Ｎ（Ｒｉ）（Ｒｉｉ）で置換されていることに加えて、アルキル基は、任意選択で、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＭｅ、任意選択でヒドロキシルで置換されているＣ６−１０芳香族炭素環、およびＣ５−１０芳香族複素環からなる群から選択される置換基で置換されていてもよい。上述のように、基−Ｃ（Ｏ）−Ｒｇはアミノ酸由来であってもよい。例えば、基−Ｃ（Ｏ）−Ｒｇは、例えば、Ｌ−アラニンまたはＬ−メチオニンなどのアミノ酸残基を含み得る。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｇは、置換または特に非置換のＣ１−６アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、または任意選択で置換されているフェニル基を表す。最も好ましくは、Ｒｇは、Ｃ１−４アルキル、特にイソプロピルを表す。
いくつかの好ましい実施形態では、ＲａはＣ１−４アルキルを表し、Ｒｂは水素を表し、Ｒｃは、水素またはメトキシを表し、ＲｄはＣ１−４アルキルを表し、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、フッ素、塩素、メトキシ、−ＣＮ、または−ＮＯ２を表し、ｎ＝０または１であり、ＲｆはＣ１−４アルキルを表し、ＲｇはＣ１−４アルキルを表す。
いくつかの好ましい実施形態では、ＲａはＣ１−４アルキルを表し、Ｒｂは水素を表し、Ｒｃは、水素またはメトキシを表し、ＲｄはＣ１−４アルキルを表し、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素を表し、ＲｆはＣ１−４アルキルを表し、ＲｇはＣ１−４アルキルを表す。
好ましくは、化合物は、式（Ｉ’）の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒは、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、または−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨを表し、式中、Ｙは存在しないか、またはＹは、Ｃ１−６アルキレンもしくはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すかのいずれかであり、それらのいずれかは、酸素原子によって中断されてもよく、Ｒｘは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−４アルキル基を表し、ＲｙおよびＲｚはそれぞれ、独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｘは、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、ＣＦ３基、またはＣ１−４アルキル基もしくはＣ１−４アルコキシ基を表し、ｎは、０、１、２、３、または４であり、Ｒｆは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｇは、水素原子、または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリール基を表す。
好ましくは、本発明の化合物は、一般式（Ｉａ）の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ、Ｘ、ｎ、およびＲａ〜Ｒｇは、例えば式（Ｉ）または式（Ｉ’）の化合物について上述される意味および好ましい意味を有する。式（Ｉａ）の化合物はまた、以下のように表すことができる：
より好ましくは、本発明の化合物は、一般式（Ｉｂ）の化合物またはその塩であり、
式中、Ｒ、Ｒｅ、およびｎは、例えば、式（Ｉ）または式（Ｉ’）の化合物について上述される意味および好ましい意味を有する。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉｂ）の化合物（式中、ｎは０または１であり、存在する場合、Ｒｅは、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、または−ＮＯ２であり、Ｒは、−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨである）またはその塩である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉｃ）の化合物
（式中、Ｒｇは、
であり、ｎは０または１であり、存在する場合、Ｒｅは、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、または−ＮＯ２であり、Ｒは、−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨである）またはその塩である。
式（Ｉ）（ならびに（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ））の化合物は、塩を形成してもよい。本発明による好適な塩は、有機酸または無機酸を用いて形成されたものを含む。特に、酸を用いて形成される好適な塩には、鉱酸、強有機カルボン酸、例えば、非置換であるか、または例えばハロゲンで置換されている１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸、例えば飽和または不飽和ジカルボン酸、例えばヒドロキシカルボン酸、例えばアミノ酸を用いて、または有機スルホン酸、例えば、非置換であるか、またはハロゲンで置換されている（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−もしくはアリール−スルホン酸を用いて形成されるものが含まれる。薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、およびグルタミン酸、リジンおよびアルギニンから形成されるものが含まれる。式（Ｉ）（ならびに（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ））の化合物およびそれらの塩は、溶媒和物、例えば水和物の形態でも存在し得る。
本発明の化合物はキラル（不斉中心）を含有する。個々の立体異性体（エナンチオマーおよびジアステレオマー）は本発明の範囲内である。本発明の化合物はアトロプ異性体としても存在し得、これは単結合（例えば、ビアリール結合）の周りの束縛回転によって生じる立体異性体である。いくつかの場合では、アトロプ異性体間の相互変換に対する障壁は、個々のアトロプ異性体が安定であり、単離可能であり得るように十分に高くてよい。したがって、個々のアトロプ異性体もまた本発明の範囲内である。状況によっては、化合物は互変異性形態で存在してもよく、そのような互変異性形態の化合物も本発明に包含される。
本発明のペイロードはコンジュゲートに形成することができ、そのため、それらはコンジュゲートの調製に有用な中間体とみなすことができる。それらの構造は、Ｃ−１９位でのリンカーへの接続を可能にする（命名法については、Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら、１９７７、前記を参照されたい）。Ｃ−３位へのエステル結合を介してリンカーに接続されているメイタンシノイドペイロードは、エステラーゼまたはベータ脱離による切断／加水分解を受けることが知られている。エステラーゼは血中に存在することが知られており、これらの加水分解メカニズムの両方が、細胞に入る前にメイタンシノイドペイロードの早期放出をもたらす可能性があり、それは非特異的毒性および／または抗腫瘍薬の効力の低下を引き起こし得る。しかしながら、メイタンシノイド中のＣ−３エステル置換基の存在は効力の改善と関連することが本発明者らによって理解される。コンジュゲーションがＣ−１９位を介する場合、ベータ脱離および／またはエステラーゼによる加水分解は依然として可能であるが、ペイロード、したがってＡＤＣは依然として活性を保持し、Ｃ−３でコンジュゲートされたペイロードとは異なり、これらの反応後に早期放出を受けない。さらに、本発明者らは、比較インビトロ血清安定性実験を実施し、これは、驚くべきことに、Ｃ−３エステル置換基を介したコンジュゲーションに適する比較化合物がＣ−１９位を介したコンジュゲーションに適するが、依然としてＣ−３エステル置換基も含む化合物よりも安定性が低いことを示す。したがって、本発明の化合物、ならびにそれらの化合物を組み込んでいるコンジュゲートは、良好な安定性を有すると考えられる。
本発明のプロセスの態様
本発明の化合物の重要な特徴は、メイタンシンコア構造に存在するフェニル基が基Ｒで置換されているさらなるフェニル基を担持し、この基Ｒが化合物を結合タンパク質にコンジュゲートするために使用され得ることである。メイタンシンのコア構造は、塩素原子を担持するフェニル基を含有する。本発明者らは、この塩素原子を置換して本発明のフェニル含有化合物を産生する新規方法を発見した。したがって、本発明はまた、以下の一般式：
（式中、Ｘ、Ｒａ〜Ｒｄ、Ｒｆ、およびＲｇは、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物について上記される意味および好ましい意味を有する）の化合物を、アリール−有機金属試薬（ここで、アリール部分は（Ｒｅ）ｎおよびＲまたはＲの保護体で置換されているフェニル基であり、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有する）と反応させることを含み、反応が遷移金属触媒の存在下で実施される、本発明の化合物を調製するためのプロセスも提供する。
アリール−有機金属試薬は、例えば、アリール亜鉛、アリール錫、アリールマグネシウム、またはアリールケイ素試薬であり得る。より好ましくは、アリール−有機金属試薬は、アリールホウ素試薬、特に以下の一般式のアリールボロン酸であり、
式中、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有し、Ｒは保護形態で存在してもよい。
遷移金属触媒は、例えば、銅、ニッケル、または特にパラジウムから誘導され得、金属は一般に酸化状態ＩまたはＩＩである。金属は二座または特に一座配位子と共に存在する。この配位子は、例えば、窒素または特にリンに基づくものであり得る。特に好ましい触媒は、（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル）［（２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）パラジウム（ＩＩ）メタンスルホネート（Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからＳｐｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３として市販されている）である。
反応は一般に溶媒、例えば、ＴＨＦ、２−メチル−ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、もしくはジメトキシエタンなどのエーテル溶媒、トルエンなどの炭化水素、またはｎ−ブタノールなどのアルコールの存在下で実施される。ＴＨＦの使用が好ましい。通常は基本条件が適している。反応は一般に室温または高温で実施される。反応温度は、例えば２０〜１２０℃、例えば３０〜１００℃、特に４０〜６０℃であり得る。
好ましくは、式（ＩＩ）の化合物は、以下の式：
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｆ、Ｒｇ、およびＸは、例えば、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物について上に定義される通りである）、
を有する。
アリール−有機金属試薬、特に式（ＩＩＩ）（ならびに以下に考察する（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ））の試薬において、基Ｒは保護形態で存在してもよいことが理解されるであろう。カルボキシ基を保護するのに好適な基には、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、９−フルオレニルメチル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびジフェニルメチルが含まれる。アミノ基を保護するのに好適な基には、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、トリチル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ホルミル、トリメチルシリル、およびｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、フタルイミド、およびスクシンイミドが含まれ、ヒドラジンまたはヒドロキシルアミン基を保護するために類似の基が使用され得る。ヒドロキシ基を保護するのに好適な基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、およびｔ−ブチルジメチルシリルなどのトリＣ１−６アルキルシリル基を含むシリル基；ホルミル、アセチル、およびピバロイルなどのＣ１−６アルカノイル基、ベンゾイルなどの芳香族アシル基を含むアシル基；ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、９−フルオレニルメチル、およびジフェニルメチルなどのアリールメチル基；テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）などのアセタール基；アリルエーテルおよびｔ−Ｂｕエーテルなどのエーテル類；メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）および２−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）が含まれる。好適な保護基の多くの例は、例えば、”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２０１４に見出すことができる。
アリール−有機金属試薬が保護形態の基Ｒを含有する場合、本発明のプロセスの直接産物は、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、もしくは（Ｉｃ）の化合物、またはそれらの塩であり、式中、基Ｒはその保護形態、したがって、
でも存在する。
これらの保護された化合物は、保護基の除去により一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、もしくは（Ｉｃ）の対応する化合物、またはそれらの塩に変換され、そのため、保護された化合物は、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、もしくは（Ｉｃ）の化合物、またはそれらの塩の調製のための中間体として有用である。それら自体が生物学的活性を有すると期待されるこれらの保護された化合物は新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。保護基が上述のもののうちの１つである化合物が特に好ましい。
いくつかの好ましい実施形態では、本プロセスは、パラジウム触媒の存在下で、式（ＩＩ）の化合物を、アリール部分が（Ｒｅ）ｎおよびＲまたはＲの保護体で置換されているフェニル基である（式中、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有する）アリール−ホウ素試薬と反応させることを含む。ハロゲン化アリールとアリールホウ素試薬との間のパラジウム触媒反応は、当該技術分野ではしばしば鈴木反応、鈴木カップリング、鈴木−宮浦反応、または鈴木−宮浦カップリングと呼ばれる。プロセスが鈴木反応を含む場合、いくつかの実施形態では、アリールホウ素試薬は、アリール−ボロン酸、アリール−ボロン酸エステル、またはアリールトリフルオロボレート塩である。好ましくは、アリールホウ素試薬は、例えば、式（ＩＩＩ）
のアリール−ボロン酸またはアリールボロン酸エステル、例えば、式（ＩＩＩａ）のピナコールエステル、式（ＩＩＩｂ）の１，３−プロパンジオールエステル、式（ＩＩＩｃ）のネオペンチルグリコールエステル、または式（ＩＩＩｄ）のＮ−メチルイミノ二酢酸エステル：
（式中、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有し、Ｒは保護形態で存在してもよい）のいずれか、特に以下の一般式
（式中、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有し、Ｒは保護形態で存在してもよい）のアリールボロン酸である。アリールホウ素試薬に存在するＲおよび／またはＲｅ基が塩を形成し得る場合（例えば、−ＮＨ２であるＲ基を含有するアリールホウ素試薬の場合）、試薬の好適な塩形態（例えば、Ｒが−ＮＨ２である場合には塩酸塩など）が使用され得る。
本プロセスが鈴木反応（すなわち、アリールホウ素試薬およびパラジウム触媒の使用を伴うカップリング）を実施することを含む場合、反応は典型的には、無機カリウム塩基、例えば、リン酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、またはフッ化カリウムなどの好適な塩基の存在下で実施される。好ましくは、反応はリン酸カリウムの存在下で実施される。
式（ＩＩＩ）の化合物および適切なアリールホウ素試薬を伴う鈴木反応に好適なパラジウム触媒には、シクロヘキシル基を含有する立体障害ホスフィン配位子に基づくもの、例えば、（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル）［（２）−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）パラジウム（ＩＩ）メタンスルホネート（上述のＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３として市販されている）、および（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）メタンスルホネート（Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３として市販されている）、またはその２つの混合物が含まれる。他の例としては、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより商品名ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ４およびＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ４で販売されている触媒が挙げられる。これらの触媒の構造を以下に提供する：
好適な触媒のさらなる例は、やはりＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＸＰｈｏｓ配位子（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル）と組み合わせた酢酸パラジウム（ＩＩ）である。
本プロセスが鈴木反応（すなわち、アリールホウ素試薬およびパラジウム触媒の使用を伴うカップリング）を実施することを含む場合、反応は、例えば、高温（例えば、約３０〜約１００℃または４０〜６０℃の範囲の温度）、またはより好ましくは、周囲温度（例えば、局所周囲条件に応じて、１５〜４０℃の範囲の温度）で実施され得る。
本プロセスが鈴木反応（すなわち、アリールホウ素試薬およびパラジウム触媒の使用を伴うカップリング）を実施することを含む場合、反応は典型的には、水の存在下で行われる。水を添加すると反応が促進され、加速されることがわかった。したがって、好ましい実施形態では、本プロセスは、パラジウム触媒の存在下、および水の存在下で（例えば、水性溶媒系が使用される）、式（ＩＩ）の化合物を、アリール部分が（Ｒｅ）ｎおよびＲまたはＲの保護体で置換されているフェニル基である（式中、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎは、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）について記載される意味を有する）アリール−ホウ素試薬と反応させることを含む。好適な水性溶媒系の例には、ＴＨＦ：水、２−メチルＴＨＦ：水、ジエチルエーテル：水、ジイソプロピルエーテル：水、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル：水、ジメトキシエタン：水、および１，４−ジオキサン：水などのエーテル：水溶媒系が含まれる。さらなる例としては、ｎ−ブタノール：水などのアルコール：水溶媒系、およびトルエン：水系が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、溶媒系は、例えば５：１〜２０：１、特に約１０：１の体積比のＴＨＦ：水である。
アリールホウ素試薬と式（ＩＩ）の化合物との間のパラジウム触媒反応は、酸素の不在下または実質的な不在下で特に良好に進行することも見出された。典型的には、反応は、系から空気をパージした後、アルゴンまたは窒素などの不活性雰囲気下で行われる。系に残存する酸素レベルを最小限に抑えるために、複数回のパージ−再充填サイクルを実施することができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、鈴木反応は、酸素の不在下または実質的な不在下で実施される。
鈴木反応は、水の存在下および酸素の実質的な不在下で特に良好に作用することがわかった。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、アリール−有機金属試薬は、アリール−ボロン酸またはアリール−ボロン酸エステルであり、反応は、水の存在下、および酸素の不在下もしくは実質的な不在下で、パラジウム触媒の存在下で実施される。
本発明のプロセスは、予想外にも、様々な官能基を含む広範囲のビアリールモチーフへのアクセスを提供し、また高収率で式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）のある特定の化合物への直接アクセスも提供する。本発明の化合物を調製する際の温和な条件の使用の成功は、式（ＩＩ）の化合物中の立体障害電子豊富塩化アリール部分の認識される反応性、およびメイタンシノイド化合物の複雑で敏感な化学構造の観点から特に驚くべきことである。特にパラジウム触媒の使用がメイタンシノイドコア構造のジエンおよび／またはエポキシド部分の分解をもたらすと予想されるため、本発明のプロセスの有効性は驚くべきことである。これは実際には起こらない。
ビアリールカップリング工程の後、得られた化合物をさらなる化学変換にかけることができることが理解されよう。例えば、上述のように、アリール−有機金属試薬が保護形態の基Ｒを含有する場合、本プロセスの直接産物も保護形態となり、保護基を除去する脱保護工程に付すことができる。別の例として、ビアリールカップリング工程の産物が式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物である場合、それは、後続の化学変換によって式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のさらなる化合物に変換され得る（例えば、Ｒが−ＮＨ２である化合物は、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル−ＳＨである化合物に変換され得るか、またはＲが−ＣＨ２ＯＨである化合物は、酸化により、Ｒが−ＣＯ２Ｈである化合物に変換され得る）。さらなる例として、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物は、コンジュゲート剤およびコンジュゲートを産生するのに有用であり、本プロセスはまた、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物が本発明のコンジュゲート試薬または本発明のコンジュゲートに変換される、１つ以上のさらなる工程も含み得る。
コンジュゲートおよびコンジュゲート試薬
本発明のコンジュゲートおよび試薬は、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、もしくは（Ｉｃ）の基Ｒを介して、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、もしくは（Ｉｃ）の化合物、またはそれらの塩（本明細書中でペイロードもしくは薬物Ｄと称される）を、本発明のコンジュゲート中の結合タンパク質または本発明のコンジュゲート試薬中の官能基に接続するリンカーを含有する。コンジュゲートおよび試薬は、それぞれ、以下によって概略的に表すことができ、
Ｄ〜リンカー〜Ｆ’または
Ｄ〜リンカー〜Ｆ
式中、Ｄは薬物であり、Ｆは試薬の官能基であり、これは結合タンパク質との反応時に、コンジュゲートに存在する結合タンパク質を含む基Ｆ’を生じさせる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、コアメイタンシノイド構造と結合タンパク質との間のスペーサーとして機能し得るペンダントＲ基を含有する式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物を含むコンジュゲートの場合、結合であり得、他の好ましい実施形態では、リンカーは結合以外であり、例えば、リンカーは、薬物と結合タンパク質との間、または薬物と結合タンパク質と反応する試薬の官能基との間のスペーサーとして機能する基を含む。
いくつかの好ましい実施形態では、コンジュゲートは、式（Ｉ’）の化合物を含む。
本発明の化合物は、当該技術分野で既知の連結化学を使用して基Ｒを介して化合物を適切な結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片など）に連結させることによってコンジュゲート、特に抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に作製され得る。例示的な連結化学は、それぞれＷＯ２００４／０６０９６５およびＷＯ２０１３／０９０５９０内に開示されているマレイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドに基づくもの、およびＷＯ２０１４／０６４４２４Ａ１に開示されているものを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「結合タンパク質」は、結合タンパク質およびペプチドの両方を含むことを意味し、文脈が特に別様に必要としている場合を除いて、ペプチドならびにタンパク質を含むと理解されるべきである。本発明のコンジュゲートにおいて使用され得る結合タンパク質は、標的上の結合パートナーの結合剤としての機能を果たし得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む。標的は、例えば、微生物、ウイルス、または細胞、例えば、癌または免疫細胞であり得る。したがって、結合タンパク質は、本発明の化合物、本発明によるコンジュゲート中のペイロードを特定の標的に標的化するように作用する。そのような結合タンパク質の例には、全長抗体、抗体断片、免疫グロブリン（Ｉｇ）、および非Ｉｇタンパク質足場／合理的またはコンビナトリアルタンパク質工学技術によって得られる抗体模倣物、ならびにレクチンが含まれる。タンパク質−薬物コンジュゲートにおいて使用される最も一般的な結合タンパク質は、抗体であり、結合タンパク質へのいかなる言及も、文脈が特に別様に必要としている場合を除いて、抗体への具体的な言及を含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組み合わせなどの標的抗原を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。用語「抗体」は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のいずれかを含み得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なり、よく知られたサブユニット構造および三次元配置を有する。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
さらに、文脈が別様に必要としいている場合を除いて、用語「抗体」は、全長抗体、および全長抗体の抗原結合領域を含む抗体断片を包含するものと理解されるべきである。抗体断片は、例えば、抗体断片から形成されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ダイアボディ、ミニボディ、または多重特異性抗体、例えば、ｓｃＦｖ断片またはダイアボディの異なる順列で構成されるミニボディ、および任意選択でＦｃ断片またはＣＨドメイン、例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＦＣ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’ＳｃＦｖ）２、ｓｃＤｉａｂｏｄｉｅｓ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、ｓｃＦｖ−ＣＨ３、およびＳＣＦＶ−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質であり得る。抗体断片は、酵素的切断、合成、または組換え技術によって産生され得る。
結合タンパク質は、標的の表面上の受容体、抗原、または他の部分、例えば、増殖性、自己免疫性、または感染性疾患に関連する細胞またはウイルスの結合剤としての機能を果たし得る。例えば、結合タンパク質は、癌細胞上の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体であり得る。癌細胞の抗体標的化のための細胞表面抗原の特定および確認の方法は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｄｅｃ；ｌ ｌ（４）：６５９−８７において既知であり、癌を治療するためのいくつかの抗体−薬物コンジュゲートが現在臨床開発中である。癌の治療に利用可能な抗体、および特定の癌の腫瘍マーカーの例も当該技術分野において周知であり、使用することができる。あるいは、標的は、免疫細胞、例えば、自己免疫抗体の産生に関与する細胞、または自己免疫疾患に関連する活性化リンパ球であり得る。他の実施形態では、標的は、微生物またはウイルスの感染または疾患に関連する微生物またはウイルスであり得る。
本発明のコンジュゲートに有用な抗体の例は、抗ＣＤ３０抗体、例えばキメラモノクローナル抗体ｃＡＣ１０、例えばブレンツキシマブである。本発明のコンジュゲートに有用な抗体のさらなる例は、抗ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブである。
本発明によるコンジュゲート試薬は、結合タンパク質と反応可能な官能基Ｆにリンカーを介した基Ｒを介して結合している本発明による化合物を含む。
上述のように、本発明のコンジュゲートを形成するために任意の種類の既知のコンジュゲーション反応を使用することができる。例えば、反応は、チオール結合、アミンコンジュゲーション、またはクリックケミストリーの既知の方法を用いて実施され得る。例えば、試薬は、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、クリックケミストリー基、例えば、アジドもしくはアルキン基、アミン基、カルボキシル基、または活性エステル基を含有し得る。他の可能性のあるアプローチは、操作されたシステインまたは非天然アミノ酸などのコンジュゲーションのために特異的にアミノ酸を用いて組み換え操作された結合タンパク質の使用、およびトランスグルタミナーゼなどの特定の酵素反応による酵素コンジュゲーションを含む。酵素コンジュゲーションはまた、例えば、結合タンパク質に操作された配列ＬＰＸＴＧにリンカー−薬物部分をコンジュゲートすることができるソルターゼ酵素を使用して達成することもできる。結合タンパク質上の反応部位は、本質的に求核性または求電子性のいずれかであり得る。一般的なコンジュゲーション部位は、リジンもしくはシステインアミノ酸残基、または炭水化物部分にある。あるいは、結合タンパク質に結合されたポリヒスチジンタグでコンジュゲーションが起こり得る。
好ましくは、コンジュゲート試薬は、結合タンパク質に存在する少なくとも１つの求電子剤、または特に求核剤と反応可能であり、したがってそれに化学結合することが可能な官能基を含む。そのため、コンジュゲート試薬は典型的には、求核剤との反応で失われる少なくとも１つの脱離基を含む。コンジュゲート試薬は、例えば、２つ以上の脱離基を含み得、好ましくは、本発明によるコンジュゲート試薬は、２つの求核剤と反応可能である。２つ以上の脱離基が存在する場合、これらは同一または異なり得る。あるいは、コンジュゲート試薬は、２つの脱離基と化学的に等価であり、単一の基が２つの求核剤と反応可能である単一の基を含有し得る。
求核基は硫黄原子およびアミン基を含み、結合タンパク質中の求核基は、例えばシステイン、リジン、またはヒスチジン残基によって提供される。本発明の好ましい一実施形態では、求核基は、結合タンパク質に存在するシステイン残基に存在する硫黄原子である。そのような構造は、結合タンパク質に存在するジスルフィド結合の還元によって得ることができる。別の実施形態では、求核基は、結合タンパク質に結合したポリヒスチジンタグに存在するヒスチジン残基に存在するイミダゾール基であり得る。
試薬の一群は、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，．２０１０，１３２，１９６０−１９６５、およびＳｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２２，１３２−１３６に記載されるビス−ハロ−またはビス−チオ−マレイミドおよびそれらの誘導体に基づく。これらの試薬は以下の官能基を含有し、
式中、各Ｌは脱離基である。マレイミド環の窒素原子は連結基に接続されている。
同様に、単一の脱離基Ｌを含有するマレイミド：
を使用することができる。やはり、マレイミド環の窒素原子は連結基に接続されている。
また、脱離基を欠くマレイミド：
を使用することができる。やはり、マレイミド環の窒素原子は連結基に接続されている。例えば、マレイミド系試薬を、例えば、結合タンパク質に存在し得るジスルフィド結合を還元した後に、結合タンパク質に存在するチオール部分と反応させることができる。
他の群の試薬は、ＷＯ２０１１／７３３９１に記載されているものである。これらの試薬の例は以下の官能基を含み、
式中、各Ｌは脱離基である。
さらなる群のコンジュゲート試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化アシル基に基づくもの、すなわち、以下の式を有する官能基
、またはその塩を含有するものである。
この種類の官能基は、例えば、結合タンパク質に存在する求核性アミン基とのアミド化反応により、結合タンパク質にコンジュゲートするために使用することができる。
コンジュゲート試薬の別の例は、以下のピリジルジスルフィド基を含有するものであり、
式中、Ｒ’は存在しないか、または−ＮＯ２基などの電子求引性基を表すかのいずれかである。この種類の官能基を使用して、例えば、結合タンパク質に存在するチオール部分との反応（例えば、結合タンパク質中のジスルフィド架橋の還元から得られる）によって結合タンパク質にコンジュゲートすることができ、それ自体がジスルフィド連結を含有するコンジュゲートをもたらす。
本発明の特に好ましい実施形態では、コンジュゲート試薬は、以下の官能基Ｆを含有し、
式中、Ｗは電子求引性基、例えば、ケト基、エステル基−Ｏ−ＣＯ−、またはスルホン基−ＳＯ２−を表し、ＡおよびＢはそれぞれ、独立して、Ｃ１−５アルキレンまたはアルケニレン鎖を表し、各Ｌは、独立して、脱離基を表すか、または両方のＬが一緒になって脱離基を表すかのいずれかである。そのような基を含有する試薬がタンパク質と反応すると、最初の脱離基Ｌが失われて、以下の式の官能基を含有するコンジュゲート試薬がその場で形成され、
式中、ｍは０〜４であり、これは第１の求核剤と反応する。次いで、第二の脱離基Ｌが失われ、第二の求核剤との反応が起こる。官能基（Ｖ）および（ＶＩ）が互いに化学的に等価であるため、官能基（Ｖ）を含有する試薬を出発物質として使用する代わりに、官能基（ＶＩ）を含有する試薬を使用することができる。
本発明のこれらのコンジュゲート試薬は、ＷＯ２００５／００７１９７およびＷＯ２０１０／１００４３０に開示されている一般的な種類のものである。そのような試薬は、例えば、ジスルフィド結合の還元によって得られる２個の硫黄原子、またはポリヒスチジンタグに存在するヒスチジン残基に存在するイミダゾール基を標的化するために使用され得る。
脱離基Ｌは、例えば、−ＳＰ、−ＯＰ、−ＳＯ２Ｐ、−ＯＳＯ２Ｐ、−Ｎ＋ＰＲ１３Ｒ１４、ハロゲン、または−Ｏ
であり得、式中、Ｐは、水素原子、またはアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）、アリール（好ましくはフェニル）、もしくはアルキル−アリール（好ましくはＣ１−６アルキル−フェニル）基を表すか、または部分−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−を含む基であり、式中、ｑは６以上の数であり、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ、独立して、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、または基Ｐを表し、
は、置換アリール基、特にフェニル基を表し、これは、少なくとも１つの置換基、例えば、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲａａ、−ＯＲａａ、−ＯＣＯＲａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−ＳＲａａ、−ＳＯＲａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＮＨＣＯＲａａ、−ＮＲａａ ２、ＣＯＲａａ、−ＮＨＣＯ２Ｒａａ、−ＮＰＣＯ２Ｒａａ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲａａＯＨ、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲａａ、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＲａａＣＯＲａａ、−Ｎ＋Ｒａａ ３、−Ｎ＋ＨＲａａ ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒａａ、ハロゲン、特に塩素、または特にフッ素、−Ｃ≡ＣＲａａ、−ＣＨ＝ＣＲａａ ２、および−ＣＨ＝ＣＨＲａａを含有し、式中、各Ｒａａは、水素原子、またはアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）、アリール（好ましくはフェニル）、もしくはアルキル−アリール（好ましくはＣ１−６アルキル−フェニル）基を表す。電子求引性置換基の存在が好ましい。
Ｐが部分−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−（式中、ｑは６以上の数である）を含む基を表すコンジュゲート試薬は、ＷＯ２０１６／０５９３７７に記載されており、そのような脱離基を含む試薬は、本発明の１つの好ましい実施形態を形成する。そのような試薬は、例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｒ１を含み得、式中、Ｒ１はキャッピング基である。Ｒ１は、例えば、水素原子、アルキル基、特にＣ１−４アルキル基、特にメチル基、または任意選択で置換されているアリール基、例えば任意選択で置換されているフェニル基、例えばトリル基であり得る。あるいは、キャッピング基は、カルボキシル基またはアミン基などの官能基を含み得る。そのようなキャッピング基は、例えば、式−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を有し得、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−鎖の末端単位を官能化することによって調製され得る。あるいは、キャッピング基で終結するのではなく、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−基は、２つの求核剤と反応可能な化学的に等価な２つの脱離基が存在するように、コンジュゲート試薬内に２つの結合点を有し得る。
脱離基の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−部分は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）に基づく。ＰＥＧは、直鎖または分岐鎖であり得、それは任意の方法で誘導体化または官能化され得る。ｑは、６以上の数、例えば、６、７、８、９、または１０以上である。例えば、ｑは、６〜９であり得る。ｑの上限は特にない。ｑは、例えば１５０以下、例えば１２０以下、例えば１００以下であり得る。例えば、ｑは、６または７〜１５０、例えば６または７〜１２０であり得る。
本発明による新規コンジュゲート試薬に存在する特に好ましい脱離基Ｌは、−ＳＰまたは−ＳＯ２Ｐ、特に−ＳＯ２Ｐである。この基の中で、好ましい一実施形態は、Ｐがフェニル、または特にトリル基を表す場合である。別の好ましい実施形態は、Ｐが部分−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ、特にｑが上述の値のうちの１つ、特に７を有するものを含む基を表す場合である。特に好ましい脱離基Ｌは、−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈおよび−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｍｅ、特に−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）７−Ｈおよび−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）７−Ｍｅである。本明細書を通して、脱離基Ｌへのいかなる言及もこれらの好ましい基、特に−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｈおよび−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−Ｍｅ、特に−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）７−Ｈおよび−ＳＯ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）７−Ｍｅへの特定の言及を含むと理解されるべきである。
好ましくは、Ｗはケト基を表す。好ましくは、ＡおよびＢのそれぞれは、−ＣＨ２−を表し、ｍは０である。
上記の式ＶおよびＶＩの試薬は、以下の基Ｆ’を含むコンジュゲートを形成し、
式中、Ｗ’は、電子求引性基または電子求引性基の還元により得られる基を表し、Ｐｒは求核剤Ｎｕを介してＡおよびＢに結合した結合タンパク質を表す。コンジュゲーションプロセスの直接産物（以下により詳細に記載される）は、電子求引性基Ｗを含有するコンジュゲートである。しかしながら、コンジュゲーションプロセスは好適な条件下で可逆的である。これは、いくつかの用途、例えば、結合タンパク質の迅速な放出が必要とされる場合には望ましい場合があるが、他の用途にとっては、結合タンパク質の迅速な放出は望ましくない場合がある。したがって、電子求引性部分を還元して結合タンパク質の放出を妨げる部分を得ることによって、コンジュゲートを安定化させることが望ましい場合がある。したがって、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲート中の電子求引性基を還元するさらなる任意選択の工程を含み得る。還元剤としての水素化ホウ素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、またはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムの使用が特に好ましい。使用され得る他の還元剤には、例えば、塩化スズ（ＩＩ）、アルミニウムアルコキシドなどのアルコキシド、および水素化アルミニウムリチウムが含まれる。
したがって、例えば、ケト基を含有する部分Ｗは、ＣＨ（ＯＨ）基を含有する部分に還元することができる。エーテル基ＣＨ．ＯＲａａは、ヒドロキシ基とエーテル化剤との反応によって得ることができる。エステル基ＣＨ．Ｏ．Ｃ（Ｏ）Ｒａａは、ヒドロキシ基とアシル化剤との反応によって得ることができる。アミン基ＣＨ．ＮＨ２、ＣＨ．ＮＨＲａａまたはＣＨ．ＮＲａａ ２は、還元アミノ化によりケトンから調製することができる。あるいは、アミドＣＨ．ＮＨＣ（Ｏ）ＲａａまたはＣＨ．Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）２は、アミンのアシル化によって形成することができる。スルホンは、スルホキシド、スルフィド、またはチオールエーテルに還元することができる。
好ましくは、基Ｆ’およびＦは、以下の式：
を有する。
上記の式において、好ましい脱離基は上記の通りである。好ましくは、各Ｎｕは硫黄原子である。
コンジュゲート試薬の他の好ましい基は、以下の官能基を含み、
〜Ｗ−ＣＲ１５Ｒ１５’−ＣＲ１５．Ｌ．Ｌ’（ＶＩＩＩ）
式中、Ｗは、上記の意味および好ましい意味を有し、
各Ｒ１５は水素原子またはＣ１−４アルキル基を表すか、Ｒ１５’は水素原子を表すかのいずれかであり、各ＬおよびＬ’は、独立して、脱離基を表すか、またはＬおよびＬ’の両方が一緒になって脱離基を表すか、あるいは
各Ｒ１５は水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｌは脱離基を表し、Ｒ１５’およびＬ’は一緒になって結合を表すかのいずれかである。
コンジュゲート試薬の別の基は、以下の官能基Ｆを含み、
〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−（ＣＨ２）２−Ｌ（ＩＸ）または
〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ２（Ｘ）
式中、Ｗは上記の意味および好ましい意味を有し、ｐは、０または１〜４の整数、好ましくは０を表す。この種類の特に好ましい試薬は、以下の官能基を含み、
−ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｌ（ＩＸａ）または
〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２（Ｘａ）
式中、Ａｒ’は、任意選択で置換アリール、特にフェニル基を表す。
すべての場合において、脱離基ＬおよびＬ’の好ましい意味は上述の通りである。
本発明によるコンジュゲート試薬は、結合タンパク質との反応のために２つ以上の官能基を含有し得る。例えば、試薬は、分子の一端に、好ましくは式（Ｖ）または（ＶＩ）の官能基、および分子の他の場所に１つ以上の追加の官能基を含有してもよい。そのような構造は、例えば、Ｂｅｌｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．９（３），２０７−２２６に記載されており、複数の結合タンパク質および／または複数のペイロードを含有するコンジュゲートの合成に有用である。
本発明の新規コンジュゲート試薬は、既知の方法と同様の方法で調製することができる。式（Ｉ）中の全ての可能な基Ｒの共通の特徴は、それらがリンカー上の相補的基と容易に反応可能であることである。したがって、例えば、ヒドロキシルまたはチオール基をリンカー上の酸基と反応させてエステル結合を形成することができる。アミノ基を酸基（ＤＣＣなどの活性化された酸基を含む）と反応させてアミド結合を形成することができる。所望する場合、最初にカルボキシル基を活性化することにより、カルボキシル基をアミン基と反応させてアミド結合を形成してもよい。所望する場合、最初にカルボキシル基を活性化することによりヒドラジンをアルデヒドまたはケトンと反応させてヒドラゾンを形成するか、またはカルボン酸と反応させてヒドラジドを形成することができる。オキシアミン基をアルデヒドまたはケトンと反応させてオキシムを形成することができる。
本発明によるコンジュゲート試薬を結合タンパク質と反応させて、本発明によるコンジュゲートを形成することができ、そのような反応は本発明のさらなる態様を形成する。したがって、好適な官能基、特に官能基ＶまたはＶＩを含むコンジュゲート試薬を、結合タンパク質、特に抗体または抗体断片と反応させて、コンジュゲート、特にグループ（ＶＩＩ）を含むコンジュゲートを形成する。
式（Ｖ）または（ＶＩ）のコンジュゲート試薬を使用することの重要な特徴は、α−メチレン脱離基および二重結合がマイケル活性化部分としての機能を果たす電子求引性官能基と交差共役することである。脱離基が直接置換よりも交差官能性試薬中で脱離する傾向があり、電子求引性基がマイケル反応に好適な活性化部分である場合、連続的なマイケルおよびレトロマイケル反応によって逐次分子内ビス−アルキル化が起こり得る。官能基（Ｖ）を含有する試薬において、脱離基は、最初のアルキル化が起こるまで露出されない潜在的共役二重結合を遮蔽して、官能基（ＶＩ）を含む試薬を得るのに役立ち、ビス−アルキル化は、相互作用的なマイケルおよびレトロマイケル反応から生じる。交差官能性アルキル化剤は、二重結合にコンジュゲートした、または脱離基と電子求引性基との間に複数の結合を含有し得る。
結合タンパク質への結合がタンパク質中のジスルフィド結合から誘導される２個の硫黄原子を介する場合、本プロセスはジスルフィド結合を還元することにより実施することができ、その後還元産物は本発明による試薬と反応する。好ましくは、ジスルフィド結合を還元し、過剰の還元剤を、例えば緩衝液交換により除去した後に、コンジュゲート試薬を導入する。ジスルフィド結合は、従来の方法を用いて、例えば、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、またはトリス−カルボキシエチルホスフィンを用いて還元することができる。
例えば式（Ｖ）または（ＶＩ）の基を含むコンジュゲート剤の場合、コンジュゲーション反応は、ＷＯ２００５／００７１９７、ＷＯ２００９／０４７５００、ＷＯ２０１４／０６４４２３、およびＷＯ２０１４／０６４４２４に開示されている条件を含む、既知のコンジュゲーションプロセスと同様の条件下で実施され得る。
例えば、結合タンパク質に存在する求核性アミン基とのアミド化反応によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有するコンジュゲート試薬を使用してコンジュゲーションが実施される場合、コンジュゲーション反応は、例えば、Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．”Ｍｅｄ． ２００６，４９（１４），ｐ４３９２−４４０８、ＷＯ２００４／１０３２７２、ＷＯ２０１２／０６１５９０、またはＷＯ２０１３／０９０５９０に開示されている条件を含む、既知のコンジュゲーションプロセスと同様の条件下で実施することもできる。同様に、マレイミド連結化学については、ＷＯ２００４／０１０９５７またはＷＯ２００４／０６０９６５に開示されているものなどの条件を使用することができる。
本プロセスは、例えば、全ての反応物が可溶性である溶媒または溶媒混合物中で実施することができる。例えば、結合タンパク質を水性反応媒体中でポリマーコンジュゲート試薬と直接反応させることができる。求核剤のｐＨ要件に応じて、この反応媒体も緩衝化することができる。反応に最適なｐＨは一般に、少なくとも４．５、典型的には約５．０〜約８．５、好ましくは約６．０〜７．５であろう。最適な反応条件は、当然のことながら、用いられる特定の反応物に依存する。
水性反応媒体を使用する場合、３〜４０℃の反応温度が一般に好適である。有機媒体（例えば、ＴＨＦ、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＤＭＡ）中で行われる反応は、典型的には、周囲温度までの温度で行われる。好ましい一実施形態では、反応は、ある割合の有機溶媒、例えば最大５０体積％の有機溶媒、典型的には５〜２０体積％の有機溶媒を含有し得る水性緩衝液中で実施される。
結合タンパク質は、化学量論的当量またはわずかに過剰のコンジュゲート試薬を使用して効果的にコンジュゲートすることができる。しかしながら、過剰の化学量論のコンジュゲート試薬を用いてコンジュゲーション反応を行うことも可能であり、これはいくつかのタンパク質に対して、またはより高い平均比の薬物対抗体（より高いＤＡＲ）を含有するコンジュゲートが望まれる場合に望ましい場合がある。過剰の試薬は、後続のコンジュゲートの精製中に、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって容易に除去することができる。
当然のことながら、タンパク質が十分な好適な結合点を含有する場合、２つ以上のコンジュゲート試薬を結合タンパク質にコンジュゲートさせることが可能である。例えば、２つの異なるジスルフィド結合を含有する結合タンパク質、または１つのジスルフィド結合を含有し、ポリヒスチジンタグも担持する結合タンパク質において、式（Ｖ）または（ＶＩ）のコンジュゲート試薬を使用して、結合タンパク質１分子あたり試薬２分子をコンジュゲートすることが可能であり、そのようなコンジュゲートは本発明の一部を形成する。
リンカー
ペイロードを、一般式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の基Ｒを介して本発明によるコンジュゲート中の結合タンパク質、または本発明によるコンジュゲート試薬中の結合タンパク質と反応可能な官能基に接続するリンカーは、任意の所望の基、例えば、この分野で一般的に見られる従来の基のいずれかを含有し得る。
リンカーサブセクション（ｉ）。
一実施形態では、ペイロードと式Ｆ’／Ｆの基との間のリンカー、特に式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、および（Ｘ）のコンジュゲートまたは試薬中の式Ｆ’／Ｆの基に直ぐ隣接するリンカーのその部分は、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または任意選択で置換されているアリールもしくはヘテロアリール基を含み得、そのうちのいずれかは、１個以上の酸素原子、硫黄原子、−ＮＲａａ基（式中、Ｒａａは、水素原子またはアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）、アリール（好ましくはフェニル）、またはアルキル−アリール（好ましくはＣ１−６アルキル−フェニル）基である）、ケト基、−Ｏ−ＣＯ−基、−ＣＯ−Ｏ−基、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲａａ−、−ＮＲ−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲａａ−、および／または−ＮＲａａ．ＣＯ−基で終結されるか、または中断されてもよい。好適なアリール基は、フェニルおよびナフチル基を含み、一方好適なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含む。基Ｆ／Ｆ’に直ぐ隣接するリンカーのその部分として特に好ましいのは、アリール基、特にフェニル基である。基Ｆ／Ｆ’に直ぐ隣接するリンカーのその部分としてさらに特に好ましいのは、ヘテロアリール基、例えば上述のもののうちの１つである。
アリールまたはヘテロアリール基は、−ＮＲａａ．ＣＯ−もしくは−ＣＯ．ＮＲａａ−基、例えば−ＮＨ．ＣＯ−もしくは−ＣＯ．ＮＨ−基であるか、またはそれらを含有する連結基のさらなる部分に隣接していてもよい。ここで、および本明細書の他の箇所で、基Ｒａａが存在する場合、これは、好ましくはＣ１−４アルキル、特にメチル基、または特に水素原子である。
任意選択で置換されているアリール、特にフェニル、またはヘテロアリール基上に存在し得る置換基には、例えば、アルキル（好ましくはＣ１−４アルキル、特にメチル、ＯＨまたはＣＯ２Ｈで任意選択で置換されている）、−ＣＦ３、−ＮＲａａ ２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲａａ、−ＯＲａａ、−ＯＣＯＲａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−ＳＲａａ、−ＳＯＲａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＮＨＣＯＲａａ、−ＮＲａａＣＯＲａａ、−ＮＨＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲａａ．ＣＯ２Ｒａａ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲａａ．ＯＨ、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣＯＲａａ、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＲａａ．ＣＯＲａａ、−Ｎ＋Ｒａａ ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲａａ ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒａａ、ハロゲン、例えば、フッ素もしくは塩素、−Ｃ≡ＣＲａａ、−ＣＨ＝ＣＲａａ ２、および−ＣＨ＝ＣＨＲａａから選択される同一または異なる置換基のうちの１つ以上が含まれ、式中、各Ｒａａは、独立して、水素原子、またはアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）、アリール（好ましくはフェニル）、もしくはアルキル−アリール（好ましくはＣ１−６アルキル−フェニル）基を表す。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基としては、例えば、ＣＮ、ＮＯ２、−ＯＲａａ、−ＯＣＯＲａａ、−ＳＲａａ、−ＮＨＣＯＲａａ、−ＮＨＯＨ、および−ＮＲａａ．ＣＯＲａａが挙げられる。
好ましくは、リンカーは、基Ｆ’／Ｆに隣接する上記の基のうちの１つを含む。特に好ましいのは、基：
あるいは、特に
を含むコンジュゲートおよびコンジュゲート試薬である。
式：
−ＣＯ−ＮＨ−Ｈｅｔ−Ｆ’、−ＣＯ−ＮＨ−Ｈｅｔ−Ｆ、−ＮＨ−ＣＯ−Ｈｅｔ−Ｆ’、および−ＮＨ−ＣＯ−Ｈｅｔ−Ｆ（式中、Ｈｅｔは、ヘテロアリール基、例えば、上述のもののうちの１つを表す）のコンジュゲートおよびコンジュゲート試薬も好適である。
上記の構造のいずれも、以下のサブセクション（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に記載の構造のいずれかと隣接し得る。
上記の式全て、特に式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、および（ＸＩＶ）において、好ましくは、Ｆ’は、式（ＶＩＩ）、例えば上記の（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、または（ＶＩＩｃ）を有し、好ましくは、Ｆは、式（Ｖ）または（ＶＩ）、例えば、上記の（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、または（ＶＩｂ）を有する。
リンカーサブセクション（ｉｉ）。
一実施形態では、リンカーは、分解性基を含有し得る、すなわち、それは生理学的条件下で分解し、結合しているかまたは結合するであろうタンパク質からペイロードを分離する基を含有し得る。あるいは、それは生理学的条件下で切断可能ではないリンカーであり得る。リンカーが生理学的条件下で切断する場合、それは細胞内条件下で切断可能であることが好ましい。標的が細胞内である場合、好ましくは、リンカーは、細胞外条件に対して実質的に非感受性である（すなわち、十分な用量の治療薬の細胞内標的への送達が禁止されないように）。
リンカーが分解性基を含有する場合、これは一般に、加水分解条件に敏感であり、例えば、それはある特定のｐＨ値（例えば酸性条件）で分解する基であり得る。加水分解／酸性条件は、例えば、エンドソームまたはリソソームに見出すことができる。酸性条件下で加水分解を受けやすい基の例には、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、およびケタールが含まれる。加水分解条件の影響を受けやすい基の例には、以下が含まれる：
好ましい実施形態では、リンカーは以下を含む：
例えば、以下を含む：
リンカーはまた、還元条件下でも分解を受けやすい可能性がある。例えば、チオールなどの生物学的還元剤に曝されると切断可能なジスルフィド基を含有し得る。ジスルフィド基の例には以下が含まれ、
式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、それぞれ独立して、水素またはＣ１−４アルキルである。好ましい実施形態では、リンカーは以下を含む：
例えば、以下を含む：
リンカーはまた、酵素分解を受けやすい基も含有し得、例えば、それはプロテアーゼ（例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼ）またはペプチダーゼによる切断を受けやすい可能性がある。本発明の特に好ましい実施形態では、リンカーの一部は、少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個のアミノ酸残基、特に天然に存在するアルファアミノ酸を含むペプチジル基を含有する。例えば、リンカーのその部分は、配列Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、またはＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを含有し得、Ｖａｌ−Ｃｉｔペプチジル基の存在が好ましい。以下に考察するように、配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢを含有するリンカーが特に好ましい。
酵素分解を受けやすい基の特に好ましい例は以下であり、
式中、ＡＡはプロテアーゼ特異的アミノ酸配列、例えば上述のもののうちの１つ、特にＶａｌ−Ｃｉｔを表す。言い換えれば、好ましい実施形態では、リンカーは以下を含む。
例えば、以下を含む：
いくつかの好ましい実施形態では、リンカーのＰＡＢ部分（すなわち、ベンジルオキシカルボニル部分）は、薬物部分のＲ基（例えば、−ＮＨ２基の残基）に直接連結され、したがって、カルバメート部分を形成してもよく、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物においてＲが−ＮＨ２の場合、Ｖａｌ基の窒素は、リンカーの残りの部分に接続され得る。
上に考察するように、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物は、式−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨのＲ基を含有し得る。本発明のコンジュゲートまたはコンジュゲート試薬に組み込まれるとき、これはジスルフィド連結の使用によって達成され得、例えば以下である。
そのような場合、コンジュゲートまたはコンジュゲート試薬のリンカー部分は、ジスルフィド結合の還元によって切断されて、式−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨのＲ基を含有する式（Ｉ）の化合物を放出することができる−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−基を含有するとみなすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、以下から選択される−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−基を含む：
この種類のコンジュゲートは、例えば、好適なカルボン酸またはカルボン酸誘導体とのアミド化反応により、Ｒ基が−ＮＨ２基である式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）の化合物から合成されてもよい。結果として、リンカー基は、代わりに以下の基：
（例えば、上述のように、生物学的還元剤に曝されると切断可能であるジスルフィド基を含有するリンカー基）を含むとみなすことができる。
本発明のコンジュゲートは、Ｒ基の残基を介して（例えば、Ｒが−ＮＨ２である式（Ｉ）の化合物の場合には−ＮＨ−基を介するか、またはＲが−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレン−ＳＨである式（Ｉ）の化合物の場合には、基−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキレン−Ｓ−を介して）薬物Ｄにコンジュゲートされる結合タンパク質を含む。
リンカーは、単一のペイロードＤ、または２つ以上の基Ｄを担持し得る。複数の基Ｄは、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸または同様の残基を組み込み得る分岐リンカーの使用によって組み込まれ得る。これは以下の式の分岐要素を導入し、
式中、ｂは、１、２、３、または４であり、ｂ＝１はアスパラギン酸であり、ｂ＝２はグルタミン酸であり、ｂ＝３は１つの好ましい実施形態を表す。上記の式中のアシル部分はそれぞれ、基Ｄにカップリングされてもよい。上記の分岐基は、−ＣＯ．ＣＨ２−基を組み込んでいてもよく、したがって、
所望する場合、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸または類似の残基を、さらなるアスパラギン酸および／もしくはグルタミン酸ならびに／または類似の残基、例えば、
などにカップリングさせてもよい。
同様に、アミノ酸リジン、セリン、トレオニン、システイン、アルギニン、もしくはチロシン、または類似の残基（例えば、リジンまたはセリン）を導入して分岐基を形成してもよく、したがって、
（式中、ｂはリジンの場合４である）および
（式中、ｂはセリンの場合１である）。
リンカーサブセクション（ｉｉｉ）。
本発明の試薬およびコンジュゲートのリンカーは、所望する場合、オリゴマーまたはポリマー（本明細書では便宜上一緒に「ポリマー」と呼ばれる）を含有し得る。ポリマーは、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、例えばポリアクリロイルモルホリン、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、またはポリメタクリルアミド、例えばポリカルボキシメタクリルアミド、またはＨＰＭＡコポリマーであり得る。さらに、ポリマーは、酵素分解または加水分解的分解を受けやすいポリマーであり得る。そのようなポリマーは、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート、ポリ（イミノカーボネート）、およびポリアミド、例えば、ポリ（アミノ酸）を含む。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー、またはブロックコポリマーなどの構造的に定義されたコポリマーであり得、例えば、それは２つ以上のアルキレンオキシド、またはポリ（アルキレンオキシド）およびポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、またはポリ（アミノ酸）のいずれかから誘導されるブロックコポリマーであり得る。使用され得る多官能性ポリマーとしては、ジビニルエーテル−無水マレイン酸およびスチレン−無水マレイン酸のコポリマーを挙げることができる。
天然に存在するポリマー、例えば、キチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、デンプン、セルロース、グリコーゲン、ポリ（シアリル酸）、ヒアルロン酸、およびそれらの誘導体などの多糖類も使用され得る。糖類またはアミノ酸などの天然モノマーおよびエチレンオキシドまたはメタクリル酸などの合成モノマーから誘導されるハイブリッドポリマーを使用することができるため、ポリグルタミン酸などのポリマーも使用することができる。
ポリマーは、好ましくは、水溶性の合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールである。ポリマーがポリアルキレングリコールである場合、これは、好ましくは、Ｃ２および／またはＣ３単位を含有するものであり、特にポリエチレングリコールである。ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、単一の直鎖を含有し得るか、またはそれは、小さいかまたは大きいかのいずれかの多くの鎖で構成される分岐形態を有し得る。置換またはキャップされたポリアルキレングリコール、例えば、メトキシポリエチレングリコールを使用することができる。
ポリマーは、任意選択で、任意の所望の方法で誘導体化または官能化されてもよい。反応性基は、ポリマー末端または末端基において、あるいはペンダントリンカーを介してポリマー鎖に沿って連結されてもよい。
ＰＥＧがリンカーに存在する場合、本発明のコンジュゲートおよび試薬のリンカーに存在する〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜単位の最適な数は当然のことながら、意図する用途に依存するであろう。いくつかの用途では、高分子量ＰＥＧを使用することができ、例えば、数平均分子量は、最大約７５，０００、例えば、最大５０，０００、４０，０００、または３０，０００ｇ／モルであり得る。例えば、数平均分子量は、５００〜約７５，０００ｇ／モルの範囲であり得る。しかしながら、より小さなＰＥＧ部分がいくつかの用途には好ましい場合がある。例えば、リンカーのＰＥＧ部分は、最大３，０００ｇ／モルの分子量を有し得る。しかしながら、わずか２つの繰り返し単位、例えば２〜５０の繰り返し単位を含有するＰＥＧ基は、いくつかの用途に有用である。２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の繰り返し単位、または１２、２０、２４、３６、４０、または４８の繰り返し単位を有するＰＥＧ含有部分が、例えばリンカーに存在し得る。
ＷＯ２０１６／０６３００６には、特定の構造のＰＥＧ含有リンカーを有する試薬およびコンジュゲートが記載されており、そのようなリンカーを含む試薬およびコンジュゲートは、本発明の１つの好ましい実施形態を形成する。
そのような試薬およびコンジュゲートにおいて、式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒの末端基を有するペンダントＰＥＧ鎖であるか、またはそれを含むＰＥＧ部分があり、式中、Ｒｒは、水素原子、アルキル基、例えば、Ｃ１−４アルキル基、特にメチル基、または任意選択で置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す。
この種類のコンジュゲートは、以下の式によって概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明の新規ペイロードを表し、Ｆ’は結合タンパク質を表し、ＰＥＧは式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒの末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す。
この種類の試薬は、以下の式によって概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロードを表し、Ｆは結合タンパク質と反応可能な官能基を表し、ＰＥＧは、式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒの末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を表す。官能基Ｆは、好ましくは、上で説明したようにタンパク質またはペプチドに存在する２つの求核剤と反応可能であり、好ましくは式（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩＩ）、特に（Ｖ）または（ＶＩ）のものである。
好ましい一実施形態では、リンカーのＰＥＧ部分中のＰＥＧ全てがペンダントＰＥＧ鎖に存在する。別の実施形態では、ＰＥＧはコンジュゲートまたは試薬の主鎖にも存在し得る。
全体のＰＥＧ部分と同様に、ペンダントＰＥＧ鎖のサイズは、意図する用途に依存するであろう。例えば、該ペンダントＰＥＧ鎖は、最大３，０００ｇ／モルの分子量を有し得る。しかしながら、例えばわずか２つの繰り返し単位、例えば２〜５０の繰り返し単位を有する別個のＰＥＧ鎖からなる非常に小さいオリゴマーはいくつかの用途に有用であり、本発明の好ましい一実施形態では該ＰＥＧ鎖として存在する。ペンダントＰＥＧ鎖は、直鎖または分岐鎖であり得る。ＰＥＧ鎖、例えば、１２、２０、２４、３６、４０、または４８の繰り返し単位を有する直鎖または分岐鎖を例えば使用することができる。
リンカーが環内に少なくとも２つの〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜単位を含むコンジュゲートおよび試薬も企図される。例えば、環は、環内の単一の連結原子を介してリンカーの残りの部分に結合され得るか、または環は、環内の２個以上の連結原子を介してリンカーの残りの部分に単一点で結合され得る。
この種類のコンジュゲートは、以下の式によって概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロードを表し、Ｆ’はリンカーのタンパク質またはペプチド結合部分を介してコンジュゲートの残りの部分に結合したタンパク質またはペプチドを表し、
は、少なくとも２つのエチレングリコール（〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜）単位を含む環を表す。
この種類の試薬は、以下の式によって概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロードを表し、Ｆはタンパク質またはペプチドに結合可能な官能基を表し、
は、少なくとも２つのエチレングリコール（〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜）単位を含む環を表す。官能基Ｆは、以下により詳細に説明されるように、タンパク質またはペプチドと反応可能である。
連結原子は、例えば、窒素、炭素、リン、またはケイ素原子、特に窒素および／または炭素原子であり得、リンカーの残りの部分への結合点に存在する原子は、例えば、窒素または炭素原子であり得る。
以下は、本発明のコンジュゲートまたは試薬中のリンカーの残りの部分への環の結合の可能な形態の概略図であり、Ｔは環中の連結原子を表し、ＰＥＧは少なくとも以下の２つの〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜単位を表す。
好適な環の具体例には以下のものが含まれ、式中、記号「〜」は、環の以下のリンカーへの組み込み点を示す。
好ましくは、環は、単一点でリンカーの残りの部分に結合しており、最も好ましくは、環は、環内の単一の連結原子を介して単一点でリンカーの残りの部分に結合される。
環は、例えば、〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘ〜単位からなってもよく、式中、ｘは、少なくとも２、好ましくは２〜２０である。あるいは、環は、〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｘ〜単位を含有し得、式中、ｘは、少なくとも２、好ましくは２〜５０、特に２〜２０であるが、上述の１つ以上の追加の原子も含み得るか、または他の方法で誘導体化され得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の繰り返し単位、または２４、３６、４０、または４８の繰り返し単位を有するＰＥＧ含有環が例えば使用され得る。
コンジュゲートおよび試薬は、クラウンエーテルから容易に合成することができる。クラウンエーテルは、エチレングリコールの環状オリゴマーであり、多くの異なるクラウンエーテルが知られており、それらのいくつかは完全にエチレングリコール単位からなり、それらのいくつかは環内に追加の原子を含有する。例えば、アザ−クラウンエーテルは窒素原子を含有し、一方ジアザ−クラウンエーテルは２個の窒素原子を含有する。多くのクラウンエーテルが市販されており、これらは、本発明によるコンジュゲートおよび試薬の合成のための便利な出発点を提供する。他の化合物と反応し得る官能基を担持するクラウンエーテルが知られており、例えば、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、イソシアネート、ニトロ、またはアルデヒド基などの官能基を任意選択で担持するベンゼン環に融合したクラウンエーテルであるため、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、またはアルデヒド基を担持するクラウンエーテルが知られている。
本発明によるコンジュゲートおよび試薬に組み込むことができる典型的なクラウンエーテルは、以下に示す構造を含む。
これらは、環内に存在する原子、特に窒素原子を介する反応により、または例えば、側鎖上に存在するヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、アルデヒド、イソシアネート、もしくはニトロ基などの基を介して、本発明のコンジュゲートおよび試薬のリンカーの主鎖に結合し得る。典型的な連結は以下の通りである：
リンカーがシクロデキストリンを含むコンジュゲートおよび試薬も企図される。例えば、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンであり得る。シクロデキストリンを含むコンジュゲートにおいて、シクロデキストリンは、例えば、３または６位を介して、例えばアミノ官能化シクロデキストリンを介してリンカーの残りの部分に結合され得る。この種類のコンジュゲートおよび試薬のいくつかの実施形態では、シクロデキストリンは単環式であり得る。この種類のコンジュゲートおよび試薬のいくつかの実施形態では、シクロデキストリンは、リンカーの主鎖に連結されるペンダント基として存在してもよい。
いくつかの実施形態では、コンジュゲート試薬は、以下の式により概略的に表すことができ、
かつ／またはコンジュゲートは、以下の式により概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロード、例えば、以下の式の基を表し、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、
は、本発明のコンジュゲートに存在する場合、生理学的条件下でコンジュゲートの分解を容易にする部分を含む基、例えば、Ｄが−ＮＨ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ａｌａ−Ｖａｌ−もしくは−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−基、またはコンジュゲートに存在する別の硫黄原子に共有結合している硫黄含有基（すなわち、コンジュゲートに存在しているジスルフィド−Ｓ−Ｓ−部分をもたらす）、例えば、Ｄが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキエン−Ｓ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−部分を含有する基を表し、
Ｆは、結合タンパク質と反応可能な官能基、例えば、
（式中、Ｒ’は存在しないか、または電子求引性基、例えば−ＮＯ２基のいずれかを表す）を表すか、
またはＦは、
を表し、
Ｆ’は、官能基の残基を介してコンジュゲートの残りの部分に結合したタンパク質またはペプチドを表す。
例えば、この種類のコンジュゲート試薬は、以下の構造を有し得、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、Ｒ’は存在しないか、または−ＮＯ２基などの電子求引性基のいずれかを表し、コンジュゲートは、リンカーのタンパク質またはペプチド結合部分とタンパク質またはペプチドとの反応から生じる対応する構造を有し得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲート試薬は、以下の式により概略的に表すことができ、
かつ／またはコンジュゲートは、以下の式により概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロード、例えば、以下の式の基を表し、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、
は、本発明のコンジュゲートに存在する場合、生理学的条件下でコンジュゲートの分解を容易にする部分を含む基、例えば、Ｄが−ＮＨ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ａｌａ−Ｖａｌ−もしくは−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−基、またはコンジュゲートに存在する別の硫黄原子に共有結合している硫黄含有基（すなわち、コンジュゲートに存在しているジスルフィド−Ｓ−Ｓ−部分をもたらす）、例えば、Ｄが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキエン−Ｓ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−部分を含有する基を表し、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール含有基を表し、
Ｆは、結合タンパク質と反応可能な官能基、例えば、
（式中、Ｒ’は存在しないか、または電子求引性基、例えば−ＮＯ２基のいずれかを表す）を表すか、
またはＦは、
を表し、
Ｆ’は、官能基の残基を介してコンジュゲートの残りの部分に結合しているタンパク質またはペプチドを表す。
例えば、この種類のコンジュゲート試薬は、以下の構造を有し得、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、
コンジュゲートは、リンカーのタンパク質またはペプチド結合部分とタンパク質またはペプチドとの反応から生じる対応する構造を有し得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲート試薬は、次式により概略的に表すことができ、
かつ／またはコンジュゲートは、次式により概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロード、例えば、次式の基を表し、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、
は、本発明のコンジュゲートに存在する場合、生理学的条件下でコンジュゲートの分解を容易にする部分を含む基、例えば、Ｄが−ＮＨ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ａｌａ−Ｖａｌ−もしくは−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−基、またはコンジュゲートに存在する別の硫黄原子に共有結合している硫黄含有基（すなわち、コンジュゲートに存在しているジスルフィド−Ｓ−Ｓ−部分をもたらす）、例えば、Ｄが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキエン−Ｓ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−部分を含有する基を表し、
は、Ｇｌｕ、ＡＳＰ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、または同様の残基などの分岐部分を含有する基を表し、
ＰＥＧは、式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒの末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖（式中、Ｒｒは、水素原子、アルキル基、例えばＣ１−４アルキル基、特にメチル基、または任意選択で置換されているアリール基、特にフェニル基、特に非置換フェニル基を表す）を表し、
Ｆは、結合タンパク質と反応可能な官能基、例えば、
（式中、Ｒ’は存在しないか、または電子求引性基、例えば−ＮＯ２基のいずれかを表す）を表すか、
またはＦは、
を表し、
Ｆ’は、官能基の残基を介してコンジュゲートの残りの部分に結合しているタンパク質またはペプチドを表す。
例えば、この種類のコンジュゲート試薬は、以下の構造を有し得、


式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、
コンジュゲートは、リンカーのタンパク質またはペプチド結合部分とタンパク質またはペプチドとの反応から生じる対応する構造を有し得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲート試薬は、次式により概略的に表すことができ、
かつ／またはコンジュゲートは、次式により概略的に表すことができ、
式中、Ｄは本発明のペイロード、例えば、次式の基を表し、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは、存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２であり、
は、本発明のコンジュゲートに存在する場合、生理学的条件下でコンジュゲートの分解を容易にする部分を含む基、例えば、Ｄが−ＮＨ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ａｌａ−Ｖａｌ−もしくは−ＰＡＢ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−基、またはコンジュゲートに存在する別の硫黄原子に共有結合している硫黄含有基（すなわち、コンジュゲートに存在しているジスルフィド−Ｓ−Ｓ−部分をもたらす）、例えば、Ｄが−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキエン−Ｓ−基を介してコンジュゲートされている場合、−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−部分を含有する基を表し、
は、Ｇｌｕ、ＡＳＰ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、または同様の残基などの分岐部分を含有する基を表し、
は、少なくとも２つのエチレングリコール（〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜）単位を含む環を表し、
Ｆは、結合タンパク質と反応可能な官能基、例えば、
（式中、Ｒ’は存在しないか、または電子求引性基、例えば−ＮＯ２基のいずれかを表す）を表すか、
またはＦは、
を表し、
Ｆ’は、官能基の残基を介してコンジュゲートの残りの部分に結合したタンパク質またはペプチドを表す。
例えば、この種類のコンジュゲート試薬は、以下の構造を有し得、
式中、Ｒｇは、−Ｃ（ＣＨ３）２または
であり、ｎは、０または１であり、Ｒｅは存在しないか、または存在する場合、塩素、フッ素、メトキシ、−ＣＮ、もしくは−ＮＯ２のいずれかであり、コンジュゲートは、リンカーのタンパク質またはペプチド結合部分とタンパク質またはペプチドとの反応から生じる対応する構造を有し得る。
上述のものと類似のプロセスにより、例えば、適切な塩化アリールメイタンシノイド化合物およびアリール−ホウ素試薬を使用する鈴木カップリングにより、ならびに任意選択で、以下の式（Ｉ）の化合物を産生するための後続の反応により（例えば、脱保護および／またはアミド化により）産生され得る本発明の化合物も含み、
、式中、Ｓｕｂは、
である。
例えば、Ｓｕｂ基のフェニル環上のある特定のオルト置換基の存在により結合したビアリールの周りの束縛回転により、単離可能なアトロプ異性体が産生される場合、本発明はそれら個々のアトロプ異性体も含む。例えば、Ｓｕｂが
である場合、本発明の化合物は、
であり得る。
本発明の化合物はまた、下記の例示化合物も含む。
本発明のコンジュゲートは、式（Ｉ）の上記化合物を組み込むものも含む。
医薬組成物および医療用途
本発明による化合物およびコンジュゲートは、薬学的に許容される担体と一緒に、任意選択で治療に使用するための、具体的には増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患の治療のための薬剤として使用するための追加の治療薬と一緒に医薬組成物に製剤化することができる。患者を治療する方法は、薬学的有効量のそのような化合物、コンジュゲート、または組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む。患者は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトであり得る。本発明が有用性を見出す例示的な状態には、例えば、癌、例えば、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、リンパ球性白血病、および慢性骨髄性白血病を含む白血病；胃癌；乳癌；卵巣癌；肝臓癌；腸癌；結腸癌；腎臓癌、例えば腎細胞癌；肺癌、例えば小細胞肺癌；黒色腫；膀胱癌；ならびに肉腫が含まれる。
例示的な医薬組成物は、非経口投与用の無菌の水性または油性懸濁液の形態のものを含む。非経口投与としては、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、および髄腔内注射、ならびに注入技術が挙げられる。非経口投与（例えば、注射による）に適した製剤は、水性または非水性、等張性、発熱物質不含、無菌の液体（例えば、溶液、懸濁液）を含む。そのような液体は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、および製剤を意図するレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質などの他の薬学的に許容される成分をさらに含有し得る。液体製剤用の例示的な担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、またはそれらの組み合わせが含まれる。製剤は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤など、またはそれらの組み合わせなどの薬学的に許容される補助物質を任意選択でさらに含んでもよい。
本発明の化合物、コンジュゲート、および組成物は、所望する場合、追加の治療薬、例えば追加の抗癌剤、例えば、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチラメラミン、アセトゲニン、アウリスタチン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリースタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネマイシン、ビスフォスフォネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗菌性発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルマイシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤、葉酸補給剤、例えばフロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デホファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルホルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモル、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメト、ピラルビシン、ロソキサントリン、ポドフィリン酸２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’、２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベルラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を減少させるＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ−Ａの阻害剤；ならびにそれらの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用され得る。
本発明の化合物は、コンジュゲート、および組成物はまた、追加の抗体、例えば、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベバシズマブ、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、セツキシマブ、シタツズマブ（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブ（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ドゥシギツマブ、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ダセツズマブ、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エロツズマブ、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、イブリツモマブ、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブン（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラムシルマブ、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブ（ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ（ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タカツズマブ（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用することもできる。
本発明の化合物、コンジュゲート、および組成物は、放射線療法と組み合わせて治療に使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、化合物、コンジュゲート、コンジュゲート試薬、組成物、処理方法、プロセス、または中間体は、以下の番号を付けた項で定義される通りである。
１．一般式（Ｉ）の化合物またはその塩であって、
式中、Ｒは、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−ＣＯ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、または−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨを表し、式中、Ｙは存在しないか、またはＹは、Ｃ１−６アルキレンもしくはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すかのいずれかであり、それらのいずれかは、酸素原子によって中断されてもよく、Ｒｘは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−４アルキル基を表し、ＲｙおよびＲｚはそれぞれ、独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｘは、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃは、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、各Ｒｅは、独立して、ハロゲン原子、ＣＦ３基、またはＣ１−４アルキル基もしくはＣ１−４アルコキシ基を表し、ｎは、０、１、２、３、または４であり、Ｒｆは、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｇは、水素原子、または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリール基を表す、化合物。
２．Ｙが存在しないか、またはＹが、酸素原子によって中断されてもよいＣ１−４アルキレンもしくはＣ１−４アルキレンオキシ基を表す、項１に定義される化合物。
３．Ｒが、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、もしくは−ＣＯ２Ｈ基、または−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、もしくは−ＣＯ２Ｈ基で置換されているＣ１−４アルキレン基である、項１または項２のいずれかに定義される化合物。
４．Ｒが、フェニル環の３または４位にある、項１〜３のいずれか一項に定義される化合物。
５．存在する任意のＲｅ基が、ハロゲン原子またはメチルもしくはメトキシ基である、項１〜４のいずれか一項に定義される化合物。
６．ｎが、０、１、または２である、項１〜５のいずれか一項に定義される化合物。
７．Ｘが、ＯＨを表す、項１〜６のいずれか一項に定義される化合物。
８．ＲａがＣ１−４アルキルを表し、Ｒｂが水素を表し、Ｒｃが水素またはメトキシを表し、ＲｄがＣ１−４アルキルを表し、Ｒｅが塩素または水素を表し、ＲｆがＣ１−４アルキルを表し、ＲｇがＣ１−４アルキルを表す、項１〜７のいずれか一項に定義される化合物。
９．一般式（Ｉａ）の化合物またはその塩である、項１〜８のいずれか一項に定義される化合物：
１０．一般式（Ｉｂ）の化合物またはその塩である、項９に定義される化合物：
１１．リンカーを介して結合タンパク質に連結される、項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物を含み、該リンカーが、一般式Ｉの基Ｒを介して該化合物に接続されている、コンジュゲート。
１２．前記結合タンパク質が、全長抗体または前記全長抗体の抗原結合領域を含む抗体断片である、項１１に定義されるコンジュゲート。
１３．前記結合タンパク質が、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４、またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４の断片である、項１１に定義されるコンジュゲート。
１４．以下の部分であって、
式中、Ｗ’が、電子求引性基または電子求引性基の還元により得られる基を表し、ＡおよびＢがそれぞれ、独立して、Ｃ１−５アルキレンまたはアルケニレン鎖を表し、Ｐｒが、求核剤Ｎｕを介してＡおよびＢに結合した前記結合タンパク質を表す、部分を含むか、または以下の部分であって、
〜Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−（ＣＨ２）２−Ｎｕ−Ｐｒ
式中、Ｗ’が、電子求引性基または電子求引性基の還元により得られる基を表し、ｐが、０または１〜４の整数であり、Ｐｒが求核剤Ｎｕを介して分子の残りの部分に結合した前記結合タンパク質を表す、部分を含む、項１１〜１３のいずれか一項に定義されるコンジュゲート。
１５．以下の部分を含むか、
または以下の部分であって、
〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｎｕ−Ｐｒ
式中、Ａｒ’が、任意選択で置換されているアリール基を表す、部分を含む、項１４に定義されるコンジュゲート。
１６．各Ｎｕが、前記結合タンパク質Ｐｒ中のシステイン残基に存在する硫黄原子を表すか、または各Ｎｕが、前記結合タンパク質に結合したポリヒスチジンタグに存在するイミダゾール基を表す、項１１〜１５のいずれか一項に定義されるコンジュゲート。
１７．前記リンカーが、式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒ（式中、Ｒｒは、水素原子、アルキル基、または任意選択で置換されているアリール基を表す）の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を含む、項１１〜１６のいずれか一項に定義されるコンジュゲート。
１８．前記リンカーが、少なくとも２つの天然に存在するアルファアミノ酸を含むペプチジル基を含む、項１１〜１７のいずれか一項に定義されるコンジュゲート。
１９．前記リンカーが、配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢを含む、項１８に定義されるコンジュゲート。
２０．結合タンパク質と反応可能な少なくとも１つの官能基にリンカーを介して結合され、前記リンカーが、一般式Ｉの基Ｒを介して前記化合物に接続されている、項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物を含むコンジュゲート試薬。
２１．前記官能基が、以下の式：
（式中、Ｗは電子求引性基を表し、ＡおよびＢはそれぞれ、独立して、Ｃ１−５アルキレンまたはアルケニレン鎖を表し、各Ｌは、独立して、脱離基を表すか、または両方のＬが一緒になって脱離基を表すかのいずれかである）、または
（式中、ＷおよびＡは上記の意味を有し、Ｌは脱離基を表し、ｍは０〜４である）、または
〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−（ＣＨ２）２−Ｌもしくは〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ２
（式中、Ｗは電子求引性基を表し、ｐは０または１〜４の整数を表し、Ｌは脱離基を表す）を有する、項２０に定義されるコンジュゲート試薬。
２２．前記官能基が、以下の式を有し、
〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｌもしくは〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２
式中、Ａｒ’が、任意選択で置換されているアリール基を表す、項２１に定義されるコンジュゲート試薬。
２３．前記脱離基または各脱離基が、部分−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−（式中、ｑは６以上の数である）を含む、項２０〜２２のいずれか一項に定義されるコンジュゲート試薬。
２４．前記リンカーが、項１７〜１９のいずれか一項に定義される特徴を含む、項２０〜２３のいずれか一項に定義されるコンジュゲート試薬。
２５．項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物、または項１１〜１９のいずれか一項に定義されるコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に、任意選択で追加の治療薬と一緒に含む、医薬組成物。
２６．増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患または障害の治療を必要とする患者を治療する方法であって、薬学的有効量の、項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物、項１１〜１９のいずれか一項に定義されるコンジュゲート、または項２５に定義される医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
２７．治療に使用するための、項１〜１０のいずれか一項に定義される化合物または項１１〜１９のいずれか一項に定義されるコンジュゲート。
２８．項１〜１０のいずれか一項に定義される一般式Ｉの化合物またはその塩を調製するためのプロセスであって、以下の一般式の化合物であって、
式中、Ｘ、Ｒａ〜Ｒｄ、Ｒｆ、およびＲｇが、前記一般式Ｉについて記載される意味を有する化合物を、アリール−有機金属試薬であって、アリール部分が（Ｒｅ）ｎおよびＲまたはＲの保護体で置換されているフェニル基であり、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎが、前記一般式Ｉについて記載される意味を有する、アリール−有機金属試薬と反応させることを含み、前記反応が、遷移金属触媒の存在下で実施される、プロセス。
２９．前記アリール−有機金属試薬が、以下の一般式のボロン酸、
またはその保護体であり、前記反応がパラジウム触媒の存在下で実施される、項２８に定義されるプロセス。
３０．以下の一般式：
（式中、Ｘ、ｎ、およびＲａ−Ｒｇは、一般式Ｉについて記載される意味を有し、Ｒｐｒｏｔは、保護基を担持する一般式Ｉの基Ｒである）を有する、項１〜１０のいずれか一項に定義される一般式Ｉの化合物もしくはその塩の調製に有用な中間体、またはその塩。
３１．Ｒが、−ＯＨ、もしくは−ＳＨ基を含み、保護基が、シリル基、アシル基、もしくはアリールメチル基であるか、Ｒが、−ＣＯ２Ｈ基を含み、前記保護基が、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、９−フルオレニルメチル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、もしくはジフェニルメチルであるか、またはＲが、−ＮＨＲ’、−ＮＨＲ’‘、もしくは−ＮＨＲ’‘‘基を含み、前記保護基が、ｔ−ブトキシカルボニル、トリチル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ホルミル、トリメチルシリル、もしくはｔ−ブチルジメチルシリルである、項３０に定義される中間体。
実施例２の結果を示し、ＣＤ３０陽性ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対するインビトロアッセイにおける化合物３およびＤＭ１の細胞生存％対化合物濃度のプロットを示す。 実施例２の結果を示し、ＣＤ３０陽性ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対するインビトロアッセイにおける化合物３およびＤＭ１の細胞生存％対化合物濃度のプロットを示す。 実施例１６に記載のマウス異種移植片研究の結果を示し、ビヒクル、本発明のコンジュゲート２９、またはＫａｄｃｙｌａ（登録商標）をマウスに投与した後の経時的な平均腫瘍体積±標準誤差のプロットを示す。 実施例３８のマウス血清研究の結果を示し、化合物２６および７８の経時的な薬物関連イオンのプロットを示し、３７℃で７日後にマウス血清中で化合物７８の有意な分解が起こったが、化合物２６については同等の分解産物は観察されなかったことを示す。 実施例３８のマウス血清研究の結果を示し、化合物２６および７８の経時的な薬物関連イオンのプロットを示し、３７℃で７日後にマウス血清中で化合物７８の有意な分解が起こったが、化合物２６については同等の分解産物は観察されなかったことを示す。
以下の実施例は本発明を図示する。
一般的な方法：
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、適切なＮＭＲ機器（例えば、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ５００ＭＨｚ ＮＭＲ機器）を使用して記録した。クロマトグラフィー純度はＬＣ／ＭＳ（例えばＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＬＣ／ＭＳシステム）を使用して決定した。
実施例１：４−（Ｎ−Ｂｏｃアミノ）フェニル−ＡＰ３，３の調製
化合物１ ４−（Ｎ−Ｂｏｃアミノ）フェニルボロン酸（１８．７ｍｇ）を、固体のＡＰ３ ２（３２．６ｍｇ）に、リン酸三カリウム（３２．７ｍｇ）およびパラジウム触媒Ｓｐｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（１ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）と共に添加した。固体をＡｒ３ｘでパージし、混合物に乾燥ＴＨＦ（１５０μＬ）を添加した。次いで、Ａｒを反応混合物に６０秒間通気し、反応容器を密封し、４０℃で２時間加熱し、その時点でＬＣ／ＭＳにより反応は完了したとみなされた。次いで、短いＳｉＯ２パッドを通して反応混合物を濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、濃縮した。次いで、混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｇｅｍｉｎｉ１５０×３０ｍｍカラム）（Ｈ２Ｏ中５→９５％ＡＣＮ、それぞれ０．０５％ＡｃＯＨを含有）で精製し、所望の画分を凍結乾燥して３を白色の結晶性固体（１４．３ｍｇ、３５％収率）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ−ｄ）δ＝７．４１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝１．５，１０．７Ｈｚ，２Ｈ），６．５８−６．４６（ｍ，２Ｈ），６．２７−６．１８（ｍ，２Ｈ），５．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．０，１５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２８（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．６１−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．０９−２．９５（ｍ，３Ｈ），２．７０−２．６８（ｍ，３Ｈ），２．６５（ｑｕｉｎ，Ｊ７．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２５（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．３３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ：保持時間３．４９分（（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ｅ分析用ＨＰＬＣカラム（モノリシック、５０×２ｍｍ）；分析用ＨＰＬＣ法：注入体積５μＬ；流速１ｍＬ／分；５分間にわたって水中５→９５％アセトニトリル）；λ＝２５４または２２０ｎｍでのアジレントダイオードアレイ検出器；室温）、Ｃ４３Ｈ５８Ｎ３Ｏ１１の（ＥＳ＋）計算値：［Ｍ＋Ｈ］＋７９２；実測値７９２。
ＢＯＣ保護基を化合物３から除去して、遊離アミン基を含有する対応する化合物を産生することができる。次いで、この化合物を同様に既知の方法を用いてアミン基を介してコンジュゲートさせて、コンジュゲート、具体的には抗体−薬物コンジュゲートを産生することができる。
実施例２：Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＳＫ−ＢＲ−３細胞株における化合物３のインビトロ効力アッセイ
インビトロで細胞傷害性薬またはＡＤＣで処理した後の腫瘍細胞の生存の消失は、増加濃度の薬物またはＡＤＣの存在下で細胞株を成長させ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して増殖または代謝活性の消失を定量することによって測定することができる。プロトコルは、ウェルに存在する細胞の数に直接関係する、ＡＴＰ合成に基づく未処理細胞に関する細胞播種、薬物処理、および細胞の生存の決定を記載する。
ＣＤ３０陽性ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ−２９９は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｍｂｒｉｄｇｅのＡｂｒａｈａｍ Ｋａｒｐａｓ博士から得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ培地中で成長させた。Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を、ウェルあたり２，５００細胞（５０μＬ／ウェル）で透明底白色壁９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−３０）を、１０％ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充したＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で成長させた。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を剥離し、ウェルあたり５，０００細胞（１００μＬ／ウェル）でポリ−Ｄ−リジンコーティングした透明底白色壁９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
適切な細胞培養培地を希釈剤として使用して、化合物の連続希釈物を三つ組で調製した。ＣＤ３０陽性Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞を、２×アッセイ濃度で５０μＬの化合物で処理した。ＳＫ−ＢＲ−３アッセイプレートから培地を除去し、１×アッセイ濃度で１００μＬの連続希釈化合物と交換した。アッセイ濃度は表１に特定される。次いで、細胞を化合物（総体積１００μＬ／ウェル）と共に３７℃および５％ＣＯ２でさらに９６時間インキュベートした。
インキュベーションの終わりに、製造者の指示書に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ試薬を使用して細胞の生存を測定した。続いて、４パラメーター非線形回帰モデルを用いてデータを分析した。
生存率は未処理細胞の％として表し、以下の式を用いて計算した。
全化合物についてのＩＣ５０値を外挿するために、生存％（Ｙ軸）をｎＭで表した薬物濃度（Ｘ軸）の対数に対してプロットした。
結果を表２ならびに図１および２に示す。両方の細胞株において、化合物３は対照ＤＭ１よりも高い効力を有する。
実施例３：メイタンシノイド化合物４の調製。
アリールホウ素試薬、４−アミノフェニルボロン酸（２１５ｍｇ）、リン酸三カリウム（６６８ｍｇ）、触媒ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（１５．４ｍｇ）、およびＡＰ３（５００ｍｇ）をアルゴンパージ反応容器に順次添加した。次いで、容器を密封し、固体をアルゴンでパージした（４×排気／パージサイクル）。次いで、アルゴンでパージすることによって厳密に脱酸素化したＴＨＦ（６ｍＬ）および水（０．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（６０ｍＬ）で希釈し、鹹水（２０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の画分を凍結乾燥して化合物４を白色の個体（４４９ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．９０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，２Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４９−５．４４（ｍ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｓ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），２．９７−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６１（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５２−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（６９２，１００％）。
実施例４：メイタンシノイド化合物５の調製。
実施例３の化合物４と同様の方法で化合物５を合成した。簡単に説明すると、４−アミノ−３−クロロフェニルボロン酸ピナコールエステル（１００ｍｇ）、リン酸三カリウム（６７４ｍｇ）、ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（１５．２ｍｇ）、およびＡＰ３（５００ｍｇ）を、アルゴンパージ反応容器に順次添加した。次いで、容器を密封し、固体をアルゴンでパージした（４×排気／パージサイクル）。次いで、アルゴンでパージすることによって厳密に脱酸素化したＴＨＦ（６ｍＬ）および水（０．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で５時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（６０ｍＬ）で希釈し、鹹水（２０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の画分を凍結乾燥して化合物５を白色の個体（８０ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．０５（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｓ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４６（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０２−２．９９（ｍ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．９３（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，１２．２Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２４−２．２１（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．３０−１．２７（ｍ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２６，１００％）。
実施例５：メイタンシノイド化合物６の調製。
工程１：化合物７の合成。
ＴＨＦ：ＤＭＦ（８ｍＬ、１：１ｖ／ｖ）中の２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（９３０ｍｇ）および４−メルカプト−ペンタン酸（１９７ｍｇ）の溶液にピリジン（１５０μＬ）を添加し、溶液を室温で１５時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、鹹水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。次いで、残渣を、ヘキサン：酢酸エチル（１００：０ｖ／ｖから６０：４０ｖ／ｖ）で溶出する順相クロマトグラフィーにより精製した。溶媒を真空中で除去して、化合物７を淡黄色の固体（１９４ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ９．２６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３９（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１３−３．０６（ｍ，１Ｈ），２．６４−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．０４−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（２８９，１００％）。
工程２：化合物８の合成。
０℃のＤＭＦ（８ｍＬ）中の化合物４（２３７ｍｇ）、化合物７（１０２ｍｇ）、およびＨＡＴＵ（４０５ｍｇ）の撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２４０μＬ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温に温め、１６時間撹拌した。溶液を水（２０ｍＬ）および鹹水（２０ｍＬ）で希釈し、得られた混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、真空中で濃縮した。残渣をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を凍結乾燥して、化合物８を淡黄色の固体（２５３ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ９．２７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄｔ，Ｊ＝８．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９５−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．５６−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４７−７．４５（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，０．４Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），６．５４−６．４８（ｍ，１Ｈ），６．２４（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３４−４．２９（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．２２−３．１７（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９７（ｍ，３Ｈ），２．６９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，３Ｈ），２．６７−２．５６（ｍ，３Ｈ），２．２７−２．２４（ｍ，１Ｈ），２．１２−２．０７（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），１．５５−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．４２−１．４１（ｍ，３Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２７−１．２６（ｍ，１Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９６２，１００％）。
工程３：化合物６の合成。
アセトニトリル：水（１．８ｍＬ、５：４ｖ／ｖ）中の化合物８（２２ｍｇ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ．ＨＣｌ、６７ｍｇ）の溶液に、７〜８のｐＨが達成されるまで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１．２ｍＬ）をゆっくり添加した。次いで、反応混合物を室温で２時間撹拌した後、溶液を真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解した。次いで、アセトニトリル溶液を鹹水（２０ｍＬ）で洗浄し、層を分離し、有機層を真空中で濃縮した。次いで、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の画分を凍結乾燥して化合物６を白色の個体（１４ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．５８−７．５７（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．５１（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），６．２２−６．２０（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３４−４．２９（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０７−２．９６（ｍ，４Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．６６−２．６２（ｍ，１Ｈ），２．６１−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．２７−２．２４（ｍ，１Ｈ），２．１９−２．１３（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．８０（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．４８（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２７−１．２６（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８０８，１００％）。
実施例６：メイタンシノイド化合物９の調製。
工程１：化合物１０の合成。
４−メルカプト−ペンタン酸の代わりに４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を使用して、実施例５の化合物７と同様の方法で化合物１０を合成した。化合物１０を淡黄色の固体として単離した。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（３０３，１００％）。
工程２：化合物１１の合成。
化合物７の代わりに化合物１０を使用して、実施例５の化合物８と同様の方法で化合物１１を合成した。化合物１１を淡黄色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ９．３５−９．２４（ｍ，１Ｈ），８．４４−８．３６（ｍ，１Ｈ），７．８８（ｄｄ，Ｊ＝４６．８，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．３４（ｍ，１Ｈ），７．０９−７．０７（ｍ，１Ｈ），６．８７−６．８６（ｍ，２Ｈ），６．５１−６．４６（ｍ，１Ｈ），６．２６（ｓ，１Ｈ），６．２０−６．１７（ｍ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．５５（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２８−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．１６−３．１２（ｍ，１Ｈ），３．０３−２．９４（ｍ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６６−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．５６−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．２２（ｍ，１Ｈ），２．１５−２．０７（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６９−１．６６（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３７（ｓ，６Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９７６，１００％）。
工程３：化合物９の合成。
化合物８の代わりに化合物１１を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物９を合成した。化合物９を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．５６−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｓ，１Ｈ），７．０８−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５１−６．４６（ｍ，１Ｈ），６．２１−６．１８（ｍ，２Ｈ），５．４９−５．４４（ｍ，１Ｈ），４．８５−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０１−２．９４（ｍ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６１（ｍ，１Ｈ），２．５９−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．２２（ｍ，１Ｈ），２．０４−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６９−１．６７（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，６Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８２２，１００％）。
実施例７：メイタンシノイド化合物１２の調製。
工程１：化合物１３の合成。
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（６８２ｍｇ）および４−メチルモルホリン（ＮＭＭ、６００μＬ）の撹拌溶液に、酢酸エチル（２ｍＬ）中の４−メルカプト酪酸（２２２ｍｇ）の溶液をゆっくり添加し、混合溶液を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、および酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。水層を混合し、１Ｍ ＨＣｌ（７０ｍＬ）で酸性化した後、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。次いで、混合有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣を、ヘキサン（０．５％酢酸）：酢酸エチル（１００：０ｖ／ｖから６０：４０ｖ／ｖ）で溶出する順相クロマトグラフィーにより精製した。溶媒を真空中で除去して、化合物１３を淡黄色の固体（８２ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．２８（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（四重項，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（２７５，１００％）。
工程２：化合物１４の合成。
化合物７の代わりに化合物１３を使用して、実施例５の化合物８と同様の方法で化合物１４を合成した。化合物１４を淡黄色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ９．３０（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５７−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４４−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．１１−７．０８（ｍ，２Ｈ），６．９０−６．８８（ｍ，２Ｈ），６．５３−６．４８（ｍ，１Ｈ），６．２３−６．１９（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．４７（ｍ，１Ｈ），４．８６−４．８３（ｍ，１Ｈ），４．３４−４．２９（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０４−２．９７（ｍ，５Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．６７−２．６２（ｍ，１Ｈ），２．５８−２．５５（ｍ，２Ｈ），２．２７−２．２４（ｍ，１Ｈ），２．２１−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．０，１．４，０．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，４Ｈ），１．２７−１．２６（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９６（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９４８，１００％）。
工程３：化合物１２の合成。
化合物８の代わりに化合物１４を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物１２を合成した。化合物１２を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．５６−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１８（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２８−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９５（ｍ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．２６−２．２２（ｍ，１Ｈ），２．０７−２．０２（ｍ，２Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６９（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３８（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７９４，１００％）。
実施例８：メイタンシノイド化合物１５の調製。
工程１：化合物１６の合成。
０℃の水（１５ｍＬ）中の３−メルカプト−プロピオン酸（０．４１ｍＬ）の撹拌溶液に、エタノール（７．５ｍＬ）中のＳ−メチルメタンチオールスルホネート（０．４９ｍＬ）の溶液を添加した。反応混合物を室温に温め、１８時間撹拌した後、真空中で濃縮した。７〜８のｐＨが達成されるまで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（８ｍＬ）を残渣に添加し、次いで、得られた混合物をジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で抽出した。層を分離し、水層を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液（１２ｍＬ）、次いで１Ｍ ＨＣｌ溶液（６ｍＬ）で酸性化して、溶液ｐＨを２〜３にした。次いで、水層を酢酸エチル（２×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、混合し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、化合物１６を白色の固体（０．７１ｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ２．９４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１５２，１００％）。
工程２：化合物１７の合成。
化合物７の代わりに化合物１６を使用して、実施例５の化合物８と同様の方法で化合物１７を合成した。化合物１７を白色の固体として単離した。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８２６，１００％）。
工程３：化合物１５の合成。
化合物８の代わりに化合物１７を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物１５を合成した。化合物１５を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．６３（ｓ，１Ｈ），７．５７−７．５５（ｍ，１Ｈ），７．０９−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２２−６．１８（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０４−２．９５（ｍ，３Ｈ），２．９０（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．７，４．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），１．７０−１．６６（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７８０，１００％）。
実施例９：メイタンシノイド化合物１８の調製。
工程１：化合物１９の合成。
エタノール：水（１０ｍＬ、１：１ｖ／ｖ）中の４−メルカプトペンタン酸（０．９７ｇ）の溶液に、Ｓ−メチルメタンチオールスルホネート（０．７２ｍＬ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で２２時間撹拌した。エタノールを減圧下で除去した後、反応溶液を鹹水（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。次いで、混合有機層を鹹水（１５ｍＬ）で洗浄し、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、化合物１９を黄色の油状物（０．９ｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ９．０９（ｓ，１Ｈ），２．８９（ｍ，１Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），２．０３−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
工程２：化合物２０の合成。
アルゴン雰囲気下、０℃の無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の化合物１９（３３ｍｇ）の溶液に、イソブチルクロロホルメート（２５μＬ）およびＮＭＭ（５０μＬ）を添加した。０℃で２０分間撹拌した後、無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中の化合物５（４２ｍｇ）の溶液を、反応混合物にゆっくり添加し、それは室温に温められ、さらに１６時間撹拌された。次いで、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中の化合物１９（３３ｍｇ）およびイソブチルクロロホルメート（２５μＬ）の溶液を、反応混合物に添加した。次いで、反応溶液を２４時間撹拌した後、溶媒を真空中で除去し、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％酢酸（８０：２０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物２０を白色の固体（２０ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．４２（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９４−２．８９（ｍ，３Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６４（ｄｑ，Ｊ＝２１．７，７．３Ｈｚ，３Ｈ），２．４３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．２３−２．２１（ｍ，１Ｈ），２．１７−２．１５（ｍ，１Ｈ），２．０６（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，７．４Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．５０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．４０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，５Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８８８，１００％）。
工程３：化合物１８の合成。
化合物８の代わりに化合物２０を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物１８を合成した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．４１（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８０（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６７−２．５９（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，１Ｈ），２．０８−２．０４（ｍ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．３６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，５．５Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８４２，１００％）。
実施例１０：メイタンシノイド化合物２１の調製。
工程１：化合物２２の合成。
化合物４の代わりに化合物５を使用し、化合物７の代わりに化合物１０を使用して、実施例５の化合物８と同様の方法で化合物２２を合成した。化合物２２を白色の固体として単離した。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０１０，１００％）。
工程２：化合物２１の合成。
化合物８の代わりに化合物２２を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物２１を合成した。化合物２１を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ８．４４−８．４２（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝０．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０６−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５１−６．４５（ｍ，１Ｈ），６．２２−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．８４−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．６６−２．６０（ｍ，３Ｈ），２．２４−２．２１（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｄｄ，Ｊ＝９．２，６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，６Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２５（ｓ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８５６，１００％）。
実施例１１：メイタンシノイド化合物２３の調製。
工程１：化合物２４の合成。
０℃のＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物５（５０ｍｇ）、化合物１６（２９ｍｇ）、およびＨＡＴＵ（７９ｍｇ）の撹拌溶液にＤＩＰＥＡ（５０μＬ）をゆっくり添加した。反応混合物を室温に温め、１４時間撹拌した。追加量の、ＤＭＦ（５００μＬ）、ＨＡＴＵ（１２９ｍｇ）、およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ）中の化合物１６（４７ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温でさらに６時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物２４を白色の固体（１５ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８６０，１００％）。
工程２：化合物２３の合成。
化合物８の代わりに化合物２４を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物２３を合成した。化合物２３を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ８．４５−８．４３（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８８−６．８５（ｍ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０２−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．９４−２．９０（ｍ，３Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８１４，１００％）。
実施例１２：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬２５の調製。
工程１：化合物２６の合成。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物８（１７ｍｇ）および４−メルカプトペンタン酸（１０ｍｇ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、鹹水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、真空中で濃縮した後、残渣をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物２６をオフホワイト色の固体（２３ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ８．１７（ｓ，１Ｈ），７．５９−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．０６−７．０５（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｓ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７９（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｔ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９０−２．８４（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，３Ｈ），２．６２（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５５−２．４０（ｍ，４Ｈ），２．３２−２．２５（ｍ，１Ｈ），２．０７−１．９５（ｍ，３Ｈ），１．７９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６８−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．２４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９４０，１００％）。
工程２：試薬２５の合成。
無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物２６（２３ｍｇ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ、１２ｍｇ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５ｍｇ）の混合物を室温で４時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解した後、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、試薬２５を白色の固体（２５ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．７５−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．５８−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．０８−７．０６（ｍ，２Ｈ），６．８７−６．８５（ｍ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０１−２．８４（ｍ，６Ｈ），２．８２（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，３Ｈ），２．８０−２．７３（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．５３−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．２１（ｍ，１Ｈ），２．１５−２．１１（ｍ，１Ｈ），２．０６−１．９６（ｍ，３Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．３４−１．３０（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０３７，１００％）。
実施例１３：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬２７の調製。
工程１：化合物２８の合成。
４−メルカプト−ペンタン酸の代わりに４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を使用して、実施例１２の化合物２６と同様の方法で化合物２８を合成した。化合物２８を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤ３ＯＤ）δ７．６３−７．６２（ｍ，２Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），６．７１−６．６６（ｍ，１Ｈ），６．２９−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．５８−５．５３（ｍ，１Ｈ），４．７６−４．７３（ｍ，１Ｈ），４．２６−４．２２（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．６３−３．６０（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｍ，１Ｈ），３．０７−３．０２（ｍ，１Ｈ），２．９９−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．８７（ｍ，１Ｈ），２．７９−２．７４（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），２．６３−２．５４（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．３７（ｍ，２Ｈ），２．２７−２．２４（ｍ，１Ｈ），２．０６−１．９０（ｍ，５Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．６５−１．５４（ｍ，３Ｈ），１．３６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２９−１．２７（ｄ，１３Ｈ），１．２２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９５４，１００％）。
工程２：試薬２７の合成。
化合物２６の代わりに化合物２８を使用して、実施例１２の試薬２５と同様の方法で試薬２７を合成した。試薬２７を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．８９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｓ，１Ｈ），３．００−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．８７−２．８３（ｍ，６Ｈ），２．７７−２．７１（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．５５−２．４８（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０９−１．９６（ｍ，４Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．３０−１．２８（ｍ，９Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０５１，１００％）。
実施例１４：試薬２５および２７のトラスツズマブへのコンジュゲーションにより、それぞれ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）２９および３０を産生する。
コンジュゲーション試薬２５および２７をトラスツズマブにコンジュゲートし、それぞれＡＤＣ２９および３０を得た。簡単に説明すると、試薬をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭのストック溶液を得た。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０中のトラスツズマブの溶液にプロピレングリコール（４０％ｖ／ｖ）を添加し、溶液を穏やかに混合して４．８ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度を得た。次いで、コンジュゲーション試薬（１３当量／ｍＡｂ）を抗体溶液に添加し、反応混合物を穏やかに混合し、２４℃で３時間インキュベートした。次いで、活性炭粉末（７０％ｗ／ｗのｍＡｂ）を、室温で３０分間穏やかに撹拌した反応溶液に添加して未反応の薬物関連種を除去した。次いで、反応混合物を濾過し（０．２２μｍのＰＥＳ膜）、精製した試料をＰＤ−１０脱塩カラムを使用して１０ｍＭコハク酸、６％ｗ／ｖトレハロース、０．０１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５に緩衝液交換した。
コンジュゲートのＤＡＲは、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用した試料の脱グリコシル化後の質量分析によって決定した。コンジュゲートの平均ＤＡＲは、個々のＤＡＲ種の相対ピーク強度から計算した。３．３および２．８のＤＡＲ割り当てを、抗体薬物コンジュゲート２９および３０についてそれぞれ決定した。
実施例１５：ＳＫ−ＢＲ−３細胞株における化合物のインビトロ効力アッセイ。
本発明の化合物で処理した後の腫瘍細胞の生存の消失を、実施例２に記載のように、増加濃度の本発明の化合物の存在下でＳＫ−ＢＲ−３細胞株を成長させ、増殖または代謝活性の消失を定量することによって試験した。本発明の化合物についての平均ＩＣ５０値を表３に示し、アッセイ濃度を表４に特定する。Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，８８０−８８６からの以下の比較化合物３１のＩＣ５０値
も提供する。
ビフェニル部分を含有する本発明の化合物は、アリルアミン含有比較化合物よりも、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖の阻害に関して、予想外に低いＩＣ５０値を有する。
実施例１６：トラスツズマブ−薬物コンジュゲート２９をＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（比較）と比較したＪＩＭＴ−１マウス異種移植片研究。
実施例１４に記載したようにコンジュゲート２９を調製した。到着時６週齢の健康な雌のＮＭＲＩヌードマウス（ＲｊＯｒｌ：ＮＭＲＩ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を細胞接種に使用した。
ＰＢＳ中の２００μＬの細胞懸濁液中の５×１０６のＪＩＭＴ−１細胞（乳癌）を右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。腫瘍細胞の接種の直前に、マトリゲル（細胞懸濁液２００μＬあたりマトリゲル４０μＬ）を添加した。カリパスを用いて腫瘍を週に２回測定し、以下の式を用いて体積を推定した。
腫瘍体積が約１３４ｍｍ３の平均腫瘍体積に達したとき、動物を無作為に８匹のマウスの群に分け、処置を開始した（０日目）。全ての試験物質は尾静脈（ｉ．ｖ．ボーラス）を介して注射した。単回用量の３０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣを１０ｍＬ／ｋｇで与え、ＰＢＳをビヒクル群に使用した。
マウスの生存および行動を毎日記録した。体重を週に２回測定した。人道的評価項目に到達したとき（例えば、群分布時の体重と比較して＞１０％の体重および／または腫瘍体積＞２０００ｍｍ３の算出腫瘍重量＞２０％の動物体重減少、腫瘍の潰瘍形成、運動性の欠如、疼痛の一般的な徴候）、またはあらかじめ決められた試験終了日に動物を安楽死させた。
処置後０日目および１４日目の平均腫瘍体積±標準誤差を図３に表す。結果は、ビヒクル処置動物について、腫瘍体積が０日目〜１４日目の間に約２倍になった（１３５対２６８ｍｍ３）ことを示す。コンジュゲート２９（３０ｍｇ／ｋｇ用量）で処置した動物については、１４日目までに腫瘍体積は０日目に記録された値のほぼ半分（１３４対７３ｍｍ３）に減少したが、臨床製品Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は同じ期間にわたって腫瘍体積の増加（１３４対１６５ｍｍ３）を示した。すべての化合物は忍容性良好であった。
実施例１７：メイタンシノイド化合物３２の調製。
実施例３の化合物４と同様の方法で化合物３２を合成した。簡単に説明すると、４−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル（１６ｍｇ）、リン酸三カリウム（３３ｍｇ）、ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（６ｍｇ）、およびメイタンシン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能、２５ｍｇ）をアルゴンパージ反応容器に順次添加した。次いで、容器を密封し、固体をアルゴンでパージした（４×排気／パージサイクル）。次いで、アルゴンでパージすることによって厳密に脱酸素化したＴＨＦ（６００μＬ）および水（６０μＬ）を添加し、反応混合物を室温で１７時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、鹹水（１０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の画分を凍結乾燥して化合物３２を白色個体（１７．３ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．９０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．７２−６．６６（ｍ，３Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．４６（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），５．７０（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３５−５．３１（ｍ，１Ｈ），４．８２（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２８（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４２−３．４１（ｍ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１０−３．０３（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．６５（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．５４−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．３０（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７４９，１００％）。
実施例１８：メイタンシノイド化合物３３の調製。
工程１：化合物３４の合成。
化合物４の代わりに化合物３２を使用して、実施例５の化合物８と同様の方法で化合物３４を合成した。化合物３４を淡黄色の固体として単離した。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０１９，１００％）。
工程２：化合物３３の合成。
化合物８の代わりに化合物３４を使用して、実施例５の化合物６と同様の方法で化合物３３を合成した。化合物３３を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．５６−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｄｑ，Ｊ＝３．１，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０７−７．０５（ｍ，２Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），６．７２−６．６９（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝０．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４８−６．４２（ｍ，１Ｈ），６．２１（ｓ，１Ｈ），５．７１−５．６６（ｍ，１Ｈ），５．３５−５．３１（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．７９（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４０−３．３９（ｍ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．１７−３．１４（ｍ，１Ｈ），３．０７（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０３−２．９８（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．５７−２．５２（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．２３（ｍ，１Ｈ），２．１７−２．１１（ｍ，１Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．８２−１．７５（ｍ，１Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．６４−１．６１（ｍ，１Ｈ），１．４６−１．４４（ｍ，１Ｈ），１．４１−１．４０（ｍ，３Ｈ），１．３１−１．２９（ｍ，６Ｈ），１．２６−１．２３（ｍ，１Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８６５，１００％）。
実施例１９：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬３５の調製。
工程１：化合物３６の合成。
４−［２，２−ビス［（ｐ−トリルスルホニル）−メチル］アセチル］安息香酸（１．０ｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１（５４），２２４１−２２５２）の溶液を、窒素雰囲気下、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３０６ｍｇ）に添加した。得られた溶液を０℃に冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド（３１０μＬ）を滴加した。反応混合物を０℃で２０分間撹拌した後、室温に温めた。１時間後、追加のＴＨＦ（１０ｍＬ）を反応混合物に添加した。１８時間後、生じた沈殿物を濾過し、冷ＴＨＦ（２ｘ５ｍＬ）で洗浄した後、真空中で乾燥させた。固体をメタノール（１０ｍＬ）と共に室温で１時間撹拌し、濾過により回収し、メタノール（２×５ｍＬ）およびジエチルエーテル（５ｍＬ）で順次洗浄した。次いで、固体を真空中で乾燥させて、化合物３６を白色の固体（１．１ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（６１８，１００％）。
工程２：化合物３７の合成。
窒素雰囲気下、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＬ−グルタミン酸５−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１９８ｍｇ）の撹拌懸濁液に、ＮＭＭ（１０７μＬ）を添加した。反応混合物を０℃に冷却した後、化合物３６（６０３ｍｇ）を添加した。得られた懸濁液を０℃で１時間撹拌した後、反応混合物を室温に温めた。１９時間後、得られた溶液を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：５％アセトニトリル：０．１％ギ酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％ギ酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、化合物３７を白色の固体（１９８ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８（１Ｈ，ｄ），７．８６（２Ｈ），７．７１−７．６５（６Ｈ，ｍ），７．３６（４Ｈ，ｄ），４．６８（１Ｈ，ｄｄｄ），４．３４（１Ｈ，ｑ），３．６２（２Ｈ，ｄｄｄ），３．５０（２Ｈ，ｄｄｄ），２．６９（１Ｈ ｄｄｄ），２．５５−２．４５（１Ｈ，ｍ），２．４８（６Ｈ，ｓ），２．３４−２．１６（２Ｈ，ｍ），１．４６（９Ｈ，ｓ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［２Ｍ＋Ｈ］＋（１３７１，７０％），［２Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋（１３１５，７０％），［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋（６３０，１００％）。
工程３：化合物３８の合成。
化合物３７（５０ｍｇ）および（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）（４０ｍｇ）を無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮＨ２−ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ（９９ｍｇ）およびＮＭＭ（１０μＬ）の溶液に添加した。反応混合物を０℃で撹拌し、４時間後、追加量のＢＯＰ（１０ｍｇ）およびＮＭＭ（２．５μＬ）を反応混合物に添加し、それはさらに１５分間撹拌された後、−２０℃で１８時間保存された。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：５％アセトニトリル：０．１％ギ酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％ギ酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、ビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｇｌｕ−［ＯｔＢｕ］−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］を無色の油状物（１２８ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１７５７Ｄａ，１００％），［Ｍ＋２Ｈ］２＋（８７９，１００％）。ビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｇｌｕ−［ＯｔＢｕ］−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］（１２６．５ｍｇ）をギ酸（２．５ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下、室温で撹拌した。２０時間後、反応混合物を真空中で濃縮し、１８時間高真空下で乾燥させて、化合物３８を無色の油状物（１２２ｍｇ、推定定量的収率）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１７００，１００％）。
工程４：化合物３９の合成。
０℃に冷却した、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物４（５０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、８５ｍｇ）、および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（１１．５ｍｇ）の溶液にＤＩＰＥＡ（４０μＬ）を添加した。反応混合物を室温に温め、１９時間撹拌した。追加のＨＯＡｔ（１４ｍｇ）を添加し、混合物を室温で９時間撹拌した後、−２０℃で７２時間保存した。さらにＨＯＡｔ（１８ｍｇ）を添加し、混合物を室温で６時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。産物の画分を混合し、減圧下で濃縮し、水溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。層を分離し、有機層を鹹水で洗浄した。次いで、酢酸エチル層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。産物をジクロロメタン：メタノール（１００：０ｖ／ｖから８５：１５ｖ／ｖ）で溶出する順相クロマトグラフィーによりさらに精製した。溶媒を真空中で除去して、化合物３９を白色個体（４４ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ｐｐｍ０．８３−１．０３（ｍ，１４Ｈ），１．１２−１．３４（ｍ，１７Ｈ），１．４６−１．６７（ｍ，７Ｈ），１．７９（ｓ，６Ｈ），１．９２（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），２．０３−２．１４（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｄ，Ｊ＝１４．１７Ｈｚ，２Ｈ），２．６９（ｓ，４Ｈ），２．７６（ｄｔ，Ｊ＝１３．９２，６．７２Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｄ，Ｊ＝９．７７Ｈｚ，２Ｈ），２．９９−３．１６（ｍ，３Ｈ），３．１６−３．２４（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝６．３５Ｈｚ，８Ｈ），３．５７−３．６３（ｍ，３Ｈ），３．８２（ｓ，４Ｈ），３．９８（ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．１７−４．２７（ｍ，３Ｈ），４．３４−４．４６（ｍ，３Ｈ），４．５０−４．６１（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝９．７７Ｈｚ，２Ｈ），５．１５（ｓ，３Ｈ），５．５５（ｄｄ，Ｊ＝１５．１４，８．７９Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｄ，Ｊ＝１０．７５Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄｄ，Ｊ＝１５．６３，１１．２３Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），７．０４−７．１５（ｍ，４Ｈ），７．２７−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ，５Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．３，３Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝８．３，３Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１３２０，１００％）。
工程５：化合物４０の合成。
アルゴン雰囲気下、無水メタノール（２ｍＬ）中の化合物３９（５２ｍｇ）の溶液にジエチルアミン（２５０μＬ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、追加のジエチルアミン（２５０μＬ）を添加し、混合物を室温でさらに２時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物４０を白色の固体（２５ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２３（ｓ，１Ｈ），９．８０（ｓ，１Ｈ），８．６９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｓ，３Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．６２（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），５．８９−５．８６（ｍ，１Ｈ），５．４３（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，８．９Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．５９−４．５２（ｍ，２Ｈ），４．１１（ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．６８−３．６６（ｍ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５４−３．５１（ｍ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．０６−３．０５（ｍ，１Ｈ），２．９８−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６６−２．６３（ｍ，１Ｈ），２．２２（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０９（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７６−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．５１−１．３８（ｍ，４Ｈ），１．１５−１．１３（ｍ，５Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９７−０．９４（ｍ，９Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０９８，１００％）。
工程６：試薬３５の合成。
０℃に冷却した無水ＤＭＦ（４００μＬ）中の化合物３８（２５．３ｍｇ）の溶液に、ＨＡＴＵ（５．７ｍｇ）を添加した。２５分間撹拌した後、ＮＭＭ（１．５μＬ）を添加し、溶液を１５分間撹拌した後、室温に温め、さらに１０分間撹拌した。無水ＤＭＦ（３００μＬ）中の化合物４０（１５ｍｇ）の別の溶液にＮＭＭ（１．５μＬ）を添加し、溶液を室温で１０分間撹拌した。次いで、溶液を混合し、追加のＨＡＴＵ（５．７ｍｇ）およびＮＭＭ（０．８μＬ）を反応混合物に添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（９５：５ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、試薬３５を無色の固体（２７．２ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｎａ］２＋（１４１２Ｄａ，４０％），［Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ］２＋（１４０１，５０％），［Ｍ＋２Ｈ＋Ｎａ］３＋（９３５，８０％），［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋３Ｈ］３＋（９２１，１００％）。
実施例２０：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬４１の調製。
工程１：化合物４２の合成。
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のジエタノールアミン（２．５ｇ）およびトリエチルアミン（６．０５ｇ）の撹拌溶液に、室温でジクロロメタン（１５ｍＬ）中の塩化トシル（３．８ｇ）の溶液をゆっくり添加した。２時間後、水（２５ｍＬ）を反応混合物に添加し、産物をジクロロメタン（５×３０ｍＬ）で抽出した。混合有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、次いで溶液を濾過し、揮発物を真空中で除去して、化合物４２を白色の固体（４．７ｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（２８２，９５％），［Ｍ＋Ｈ］＋（２６０，１００％）。
工程２：化合物４３の合成。
無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の化合物４２（１７６ｍｇ）の溶液を、室温の無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中の水素化ナトリウム（８０ｍｇ、鉱油中６０％分散液）の溶液に１時間かけて滴加した。１時間撹拌した後、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中のヘキサエチレングリコールジ−ｐ−トルエンスルホネート（４００ｍｇ）の溶液を２時間かけて添加し、反応混合物を室温で７２時間撹拌した。水（３０ｍＬ）を添加し、ＴＨＦを真空中で除去した。水溶液をクロロホルム（４×２５ｍＬ）で抽出し、有機相を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶液を濾過し、真空中で濃縮した。次いで、残渣を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：５％アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、化合物４３を無色の油状物（７８ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ），３．６７−３．５８（ｍ，２４Ｈ），３．５８−３．５３（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（５２８，８０％），［Ｍ＋Ｈ］＋（５０６，５０％）。
工程３：化合物４４の合成。
無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中の化合物４３（７８ｍｇ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（１．１３ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）を添加し、溶液を１６時間還流加熱した後、反応混合物を０℃に冷却し、水を滴加してクエンチした。懸濁液を濾過し、沈殿物をクロロホルム：エタノール（９：１ｖ／ｖ、５×６ｍＬ）で洗浄した。ろ液および洗液を混合し、真空中で濃縮して、化合物４４を無色の油状物（５０ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（３７４，７０％），［Ｍ＋Ｈ］＋（３５２，１００％）。
工程４：化合物４５の合成。
０℃の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（７８ｍｇ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１０８ｍｇ）およびＮＭＭ（３４μＬ）を添加し、混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の化合物４４（４４ｍｇ）の溶液を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下０℃で１５分間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した。ピペリジン（７０μＬ）を添加し、溶液を室温で９０分間撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：５％アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、化合物４５を橙色の油状物（４４ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（５３７，４５％）。
工程５：化合物４６の合成。
０℃の無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の４−［２，２−ビス［（ｐ−トリルスルホニル）−メチル］アセチル］安息香酸（３７．５ｍｇ）の溶液に、ＨＡＴＵ（６５ｍｇ）およびＮＭＭ（２０μＬ）を添加し、混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の化合物４５（４４．３ｍｇ）の溶液を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下０℃で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（６０：４０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を凍結乾燥により除去して、ビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−アザ−２４−クラウン−８を白色の固体（２８．５ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（１０４１，２０％），［Ｍ＋Ｈ］＋（１０１９，５％）。無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中のビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−アザ−２４−クラウン−８（２６．５ｍｇ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（５００μＬ）を添加し、溶液をアルゴン雰囲気下室温で１時間撹拌した。揮発物を真空中で除去して、化合物４６を白色の固体として得た（推定定量的収率）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（９８５，３５％），［Ｍ＋Ｈ］＋（９６３，３０％）。
工程６：試薬４１の合成。
０℃に冷却したＤＭＦ（３００μＬ）中の化合物４６（１０．５ｍｇ）の溶液に、ＨＡＴＵ（４ｍｇ）を添加した。２０分間撹拌した後、ＮＭＭ（１μＬ）を添加し、反応溶液を０℃でさらに３０分間撹拌した。０℃に冷却したＤＭＦ（２００μＬ）中の化合物４０（１０ｍｇ）の別の溶液にＮＭＭ（１μＬ）を添加し、溶液を４０分間撹拌した。次いで、溶液を混合した後、追加量のＨＡＴＵ（４ｍｇ）およびＮＭＭ（１μＬ）を添加し、反応混合物を室温に温め、３．２５時間撹拌した。次いで、反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（７０：３０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、試薬４１を白色の固体（８．２ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｎａ］２＋（１０４３，３０％），［Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ］２＋（１０３３，６０％），［Ｍ＋２Ｈ］２＋（１０２１，１００％），［Ｍ＋３Ｈ］３＋（６８２，３０％）。
実施例２１：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬４７の調製。
工程１：化合物４８の合成。
０℃の無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物４（５０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｃｒｅａｇｅｎ、６７ｍｇ）およびＨＡＴＵ（８５ｍｇ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を添加した。溶液を室温に温め、１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製し、所望の画分を凍結乾燥して化合物４８を白色の個体（５７ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０８４，１００％）。
工程２：化合物４９の合成。
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の化合物４８（３０ｍｇ）の撹拌溶液にジエチルアミン（１４０μＬ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した後、溶液を真空中で濃縮した。残渣をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物４９を白色の固体（２０ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（８６２，１００％）。
工程３：試薬４７の合成。
０℃のＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３８（１５．６ｍｇ）、化合物４９（８ｍｇ）、およびＨＡＴＵ（６．６ｍｇ）の溶液にＮＭＭ（３０μＬ）を添加し、混合物を０℃で９０分間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、試薬４７を白色の固体（１５ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９９（ｓ，０．５Ｈ），９．９２（ｓ，０．５Ｈ），８．７３（ｄｄ，Ｊ＝７．２，５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４０−８．３９（ｍ，０．５Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，０．５Ｈ），８．０５−８．０１（ｍ，１Ｈ），７．９７−７．８７（ｍ，２Ｈ），７．６７−７．５１（ｍ，６Ｈ），７．４６−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．１３−７．０９（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．６５−６．６０（ｍ，１Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），６．２３−６．２１（ｍ，１Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５９−４．５７（ｍ，１Ｈ），４．４６−４．３９（ｍ，２Ｈ），４．２７−４．１７（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．０９（ｍ，１Ｈ），４．０１−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．８４−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．７５−３．７１（ｍ，６Ｈ），３．５１（ｓ，９６Ｈ），３．４４−３．４２（ｍ，５Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，６Ｈ），２．８９−２．８３（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），２．４０−２．２２（ｍ，４Ｈ），２．０８−１．９０（ｍ，３Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．５１−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．３８（ｍ，１Ｈ），１．３３−１．３１（ｍ，４Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ），０．９０−０．８４（ｍ，６Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｈ］２＋（１２７２，３０％），［Ｍ＋３Ｈ］３＋（８４８，１００％）。
実施例２２：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬５０の調製。
工程１：化合物５１の合成。
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中のアミノ−ＰＥＧ（２ｕ）−酸（５０ｍｇ）および６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（６０ｍｇ）の撹拌懸濁液にＤＩＰＥＡ（８０μＬ）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物５１を白色の固体（４３ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８３−７．８０（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），３．４１−３．３６（ｍ，６Ｈ），３．３４−３．３３（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，３Ｈ），２．４５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｄｔ，Ｊ＝１４．９，７．４Ｈｚ，４Ｈ），１．２３−１．１３（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（３７１，１００％）。
工程２：試薬５０の合成。
０℃に冷却したＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物４０（１２ｍｇ）、化合物５１（５．６ｍｇ）、およびＨＡＴＵ（８．２ｍｇ）の溶液にＮＭＭ（２０μＬ）を添加し、混合物を０℃で２．５時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、試薬５０を白色の固体（１２ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．０６（ｓ，１Ｈ），９．７９−９．７８（ｍ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８２−７．８０（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．００（ｓ，２Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．６２（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０４−６．０１（ｍ，１Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），５．４５−５．４０（ｍ，３Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），４．５９−４．５６（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．３７（ｍ，１Ｈ），４．２５−４．２２（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．０９（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．６３−３．５９（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４８−３．４６（ｍ，４Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，４Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．０４−２．９２（ｍ，２Ｈ），２．８８−２．８３（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６７−２．６１（ｍ，１Ｈ），２．４７−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．４１−２．３６（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０１−１．９４（ｍ，１Ｈ），１．７３−１．６５（ｍ，５Ｈ），１．６３−１．５８（ｍ，１Ｈ），１．５１−１．４２（ｍ，７Ｈ），１．４０−１．３５（ｍ，２Ｈ），１．２０−１．１２（ｍ，８Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１４４９，１００％）。
実施例２３：一連のメイタンシノイド化合物の調製。
４−アミノフェニルボロン酸をある範囲のアリールホウ素試薬で置き換えて、化合物５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、および６４を産生することにより、実施例３に記載したものと類似の手順を用いて一般式（ＸＶ）の一連のメイタンシノイド化合物を調製した。実施例３に記載される化合物構造および合成プロトコルに対する修飾を表５に示す。
化合物５２の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．２１−７．１５（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６８−６．６５（ｍ，１Ｈ），６．５１−６．４５（ｍ，３Ｈ），６．２２−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４９−５．４４（ｍ，１Ｈ），４．８４−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５７−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２９−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．０２−２．９０（ｍ，３Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６９−２．６１（ｍ，１Ｈ），２．２７−２．２２（ｍ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６９−１．６６（ｍ，１Ｈ），１．５０−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（６９２，１００％）。
化合物５３の特徴付けデータ：ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２２、１００％）。
化合物５４の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．９８（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１６（ｍ，４Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．７４（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｄｔ，Ｊ＝１３．９，６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．２５（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７３７， １００％）。
化合物５５の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．９９（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，２Ｈ），６．５４−６．４７（ｍ，２Ｈ），６．４４−６．３９（ｍ，１Ｈ），６．２１−６．１６（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３３−４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），３．５８−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．０２−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６７−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２２（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［２Ｍ＋Ｈ］＋（１４２０，１００％），［Ｍ＋Ｈ］＋（７１０，７０％）。
化合物５６の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．８３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２３−７．２１（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１９（ｍ，２Ｈ），５．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．３０−３．２７（ｍ，１Ｈ），３．０２−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７６（ｓ，３Ｈ），１．６９−１．６７（ｍ，１Ｈ），１．５３−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２０，１００％）。
化合物５７の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．９４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１８（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），４．８２（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３１−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０１−２．９１（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．５９（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６６（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，１．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５２−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２３（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７５６，１００％）。
化合物５８の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．９６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２８（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０２−２．９６（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６４−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２５−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（６９３，１００％）。
化合物５９の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．２２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｓ，２Ｈ），６．８３−６．８０（ｍ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｓ，１Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４４−４．３６（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｓ，２Ｈ），２．６３−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．４１−２．３５（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．７１−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．５７−１．４５（ｍ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２８−１．２７（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（６９３，１００％）。
化合物６０の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．３９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），６．２２−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８２（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），４．３３−４．２６（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５３−３．５０（ｍ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０３−２．９１（ｍ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．６７−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，３．０Ｈｚ，１Ｈ），１．７５（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，３Ｈ），１．７０−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．５５−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７０７，１００％）。
化合物６１の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．４０−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），７．０７−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２１−６．１７（ｍ，２Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８０（ｍ，１Ｈ），４．７０（ｓ，２Ｈ），４．３３−４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０４−２．９１（ｍ，３Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．６３−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２８−２．２２（ｍ，１Ｈ），１．８６−１．８２（ｍ，１Ｈ），１．７５（ｓ，３Ｈ），１．７０−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２７−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７０７，１００％）。
化合物６２の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．１１（ｓ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．８５（ｍ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，３Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｓ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，１２．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．５９（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５２−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２７−１．２５（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２７，１００％）。
化合物６３の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．０５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，０．３３Ｈ），６．９８（ｄ，０．６６Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，０．６６Ｈ），６．９４−６．９１（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８５（ｍ，２．３３Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，０．６６Ｈ），６．５１−６．４４（ｍ，１Ｈ），６．２３−６．１５（ｍ，２Ｈ），５．５０−５．４１（ｍ，１Ｈ），４．８４（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，３．０Ｈｚ，０．６６Ｈ），４．７４（ｄｄ，Ｊ＝１２．１，３．１Ｈｚ，０．３３Ｈ），４．３２−４．２３（ｍ，１Ｈ），３．９４−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，１Ｈ），３．５９−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），３．３６（ｓ，１Ｈ），３．３１−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０２−２．７８（ｍ，４Ｈ），２．６９（ｓ，２Ｈ），２．６５−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２７−２．２３（ｍ，０．６６Ｈ），２．１４−２．１１（ｍ，０．３３Ｈ），１．７７（ｓ，１Ｈ），１．７４（ｓ，２Ｈ），１．７０−１．６２（ｍ，１Ｈ），１．５２−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．２５（ｍ，７Ｈ），１．２１−１．１９（ｍ，３Ｈ），０．９５（ｓ，２Ｈ），０．９０（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７１７，１００％）。
化合物６４の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．３０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，０．２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，０．８Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，０．２Ｈ），６．９０（ｓ，０．８Ｈ），６．８３−６．７９（ｍ，２Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５１−６．４６（ｍ，１Ｈ），６．２２−６．１５（ｍ，２Ｈ），５．４９−５．４１（ｍ，１Ｈ），４．８６（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，２．７Ｈｚ，０．８Ｈ），４．６８−４．６５（ｍ，０．２Ｈ），４．３３−４．２４（ｍ，１Ｈ），３．８５−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７６−３．７３（ｍ，３Ｈ），３．６８−３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５９−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．３７−３．３６（ｍ，３Ｈ），３．２８−３．２２（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．０２（ｍ，２．４Ｈ），２．９３（ｓ，０．６Ｈ），２．９１−２．８５（ｍ，０．６Ｈ），２．７０（ｓ，２．４Ｈ），２．６７−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．２９−２．２６（ｍ，０．８Ｈ），１．８０（ｓ，０．６Ｈ），１．７８−１．７４（ｍ，０．２Ｈ），１．７３（ｓ，２．４Ｈ），１．７２−１．６３（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．３０（ｍ，３Ｈ），１．２８−１．２４（ｍ，４Ｈ），１．２１−１．１８（ｍ，３Ｈ），０．９７（ｓ，２．４Ｈ），０．９１（ｓ，０．６Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７５０，１００％）。
実施例２４：メイタンシノイド化合物６５の調製。
反応容器に化合物６１（３６ｍｇ）、硝酸鉄（ＩＩＩ）９水和物（１３ｍｇ）、ＴＥＭＰＯ（４．８ｍｇ）、塩化カリウム（６．２ｍｇ）、および１，２−ジクロロエタン（２ｍＬ）を順次添加し、混合物を酸素雰囲気下で５日間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、その後、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物６５を白色の固体（４．５ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤ３ＯＤ）δ８．０１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８２−７．８０（ｍ，１Ｈ），７．５３−７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４２−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．７２−６．６７（ｍ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５９−５．５１（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．２２（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．６５−３．６１（ｍ，３Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．１１−３．０６（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），２．８０−２．７４（ｍ，１Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ），２．３２−２．２９（ｍ，１Ｈ），１．８１（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．５７（ｍ，３Ｈ），１．３１−１．２７（ｍ，７Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），１．０４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２１，１００％）。
実施例２５：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬６６の調製。
工程１：化合物６７の合成。
０℃のＤＭＦ（１５ｍＬ）中の化合物５８（３２８ｍｇ）、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、６８８ｍｇ）、およびトリ−ｎ−ブチルホスフィン（７００μＬ）の撹拌溶液に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（５６０μＬ）をゆっくり添加した。混合物を徐々に室温に温め、２．５時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物６７を淡黄色の固体（９２ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１１５４，１００％）。
工程２：化合物６８の合成。
ギ酸（２ｍＬ）中の化合物６７（９２ｍｇ）の溶液を室温で８０分間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、その後、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物６８を白色の固体（４７ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０５４，１００％）。
工程３：試薬６６の合成。
化合物４９の代わりに化合物６８を使用して、実施例２１の試薬４７と同様の方法（工程３）で試薬６６を合成した。試薬６６を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．０２（ｓ，１Ｈ），８．７６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，０．５Ｈ），８．１６−８．１４（ｍ，０．５Ｈ），８．０５−８．０２（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．６９−７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５７−７．５１（ｍ，５Ｈ），７．４７−７．４３（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０９−７．０８（ｍ，２Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．６５−６．６０（ｍ，０．５Ｈ），６．５３（ｓ，０．５Ｈ），６．２３−６．２０（ｍ，０．５Ｈ），５．９９−５．９７（ｍ，０．５Ｈ），５．８９−５．８７（ｍ，１Ｈ），５．４５−５．４０（ｍ，３Ｈ），５．０６−５．００（ｍ，１Ｈ），４．５９−４．５３（ｍ，０．５Ｈ），４．４４−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．２７−４．２４（ｍ，０．５Ｈ），４．１４−４．０７（ｍ，０．５Ｈ），４．０２−３．９７（ｍ，０．５Ｈ），３．８６−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７４−３．７１（ｍ，１．５Ｈ），３．６８−３．６３（ｍ，０．５Ｈ），３．５１（ｓ，９６Ｈ），３．４６−３．４２（ｍ，５Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，７Ｈ），３．０５−２．９４（ｍ，１．５Ｈ），２．９０−２．８５（ｍ，０．５Ｈ），２．７２−２．７０（ｍ，１Ｈ），２．６６−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），２．４０−２．３７（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．２７（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．０５−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．６２−１．５９（ｍ，０．５Ｈ），１．５２−１．３５（ｍ，４．５Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｈ］２＋（１３６８，２０％），［Ｍ＋３Ｈ］３＋（９１２，７０％），［Ｍ＋４Ｈ］４＋（６８４，１００％）。
実施例２６：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬６９の調製。
化合物５８の代わりに化合物６２を使用して、実施例２５の試薬６６と同様の方法（工程１）で試薬６９を合成した。試薬６９を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ９．１５（ｓ，０．５Ｈ），７．９６−７．８８（ｍ，２．５Ｈ），７．８０−７．７２（ｍ，１Ｈ），７．７５−７．６６（ｍ，８Ｈ），７．４７−７．４４（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．３２（ｍ，７Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．０Ｈｚ，０．５Ｈ），６．２５−６．１７（ｍ，１．５Ｈ），５．９７−５．８６（ｍ，０．５Ｈ），５．５０−５．４５（ｍ，０．５Ｈ），５．１１−５．００（ｍ，４Ｈ），４．８１（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，１．９Ｈｚ，１Ｈ），４．６７−４．６５（ｍ，０．５Ｈ），４．５６−４．５５（ｍ，０．５Ｈ），４．３８−４．２０（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｓ，９６Ｈ），３．５７−３．５２（ｍ，１２Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，６Ｈ），３．２７−３．２０（ｍ，３Ｈ），２．９４（ｄｄ，Ｊ＝２７．１，１１．３Ｈｚ，２Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．６５−２．６１（ｍ，１Ｈ），２．４７（ｓ，６Ｈ），２．４１−２．３４（ｍ，１．５Ｈ），２．２２−２．１３（ｍ，２．５Ｈ），１．９８−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．８３−１．７９（ｍ，３Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６６（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５８−１．４８（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，５Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｈ］２＋（１３８５，１５％），［Ｍ＋３Ｈ］３＋（９２３，７５％），［Ｍ＋４Ｈ］４＋（６９３，１００％）。
実施例２７：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬７０の調製。
工程１：化合物７１の合成。
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１８（１８ｍｇ）および化合物７（１９ｍｇ）の溶液を室温で１８時間アルゴン雰囲気下で撹拌した。次いで、反応溶液を水（１ｍＬ）で希釈し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％酢酸（７０：３０ｖ／ｖから１０：９０ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、真空中で濃縮し、凍結乾燥して、化合物７１を白色の固体（１２ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．４１（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，１０．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３１（ｓ，１Ｈ），６．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，０．５Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２８（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２８−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，３Ｈ），２．６７−２．５６（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），２．２３（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．１６（ｄｔ，Ｊ＝１２．７，６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０３（ｄｄｔ，Ｊ＝２５．３，１２．２，６．５Ｈｚ，４Ｈ），１．５０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．４５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．３６（ｄｔ，Ｊ＝６．９，３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，５Ｈ），１．２５（ｄｔ，Ｊ＝７．５，４．１Ｈｚ，４Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９７４，１００％），［Ｍ＋Ｎａ］＋（９９６，４５％）
工程２：試薬７０の合成。
無水ジクロロメタン（３ｍＬ）中の化合物７１（１１ｍｇ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１５ｍｇ）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）の混合物を室温で７２時間アルゴン雰囲気下で撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタン：アセトニトリル（２ｍＬ、１：１ｖ／ｖ）に溶解した後、ジクロロメタン：アセトニトリル（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する順相クロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、溶媒を真空中で除去して、試薬７０を白色の固体（１２ｍｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．４１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９−７．７０（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．０６−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，２Ｈ），５．４９−５．４５（ｍ，１Ｈ），４．８３（ｄｄ，Ｊ＝１１．７，２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｔ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２Ｈ），２．９３（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，４．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８７−２．７９（ｍ，７Ｈ），２．７２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ），２．６２（ｔｔ，Ｊ＝１３．４，６．５Ｈｚ，３Ｈ），２．２３（ｄ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｄｄｄｄ，Ｊ＝３１．６，２３．４，１６．２，７．７Ｈｚ，４Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．４７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．３７（ｄｄ，Ｊ＝６．８，１．７Ｈｚ，２Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２６（ｑ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，５Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０７１，１００％），［Ｍ＋Ｎａ］＋（１０９３，８０％）。
実施例２８：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬７２の調製。
工程１：化合物７３の合成。
０℃の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４７０ｍｇ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１．４ｇ）を添加した。これに、０℃の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＮＨ２−ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ（１ｇ）およびＮＭＭ（３４０μＬ）の溶液を添加した後、溶液を室温に温め、１時間撹拌した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（９５：５ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］を得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｎａ］＋（１５６０，１００％），［Ｍ＋Ｈ］＋（１５３９，８０％）。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］の溶液にピペリジン（０．９ｍＬ）を添加し、溶液を室温で１０分間撹拌した。反応溶液を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（９５：５ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、化合物７３を白色の固体（１ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１３１６，１０％），［Ｍ＋２Ｈ−Ｂｏｃ］２＋（６０９，１００％）。
工程２：化合物７４の合成。
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３６（４２０ｍｇ）の溶液に、無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物７３（１ｇ）およびＮＭＭ（９２μＬ）の溶液を添加した。室温で２．５撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（９５：５ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、ビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｌｙｓ−［Ｂｏｃ］−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］を白色の固体（０．８４ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｈ−Ｂｏｃ］２＋（８５０，９５％）。次いで、ビス−トリルスルホニル−プロパノイル−ベンズアミド−Ｌ−Ｌｙｓ−［Ｂｏｃ］−［ＰＥＧ（２４ｕ）−ＯＭｅ］（０．８４ｇ）をギ酸（３ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で３時間撹拌した。揮発物を真空中で除去し、残渣をトルエン（３×６ｍＬ）で洗浄した後、残渣を真空中で乾燥させ、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（９５：５ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。有機溶媒を真空中で除去し、水性溶媒を凍結乾燥により除去して、化合物７４を白色の固体（０．５９ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１６９９，５％），［Ｍ＋２Ｈ］２＋（８５０，１００％）。
工程３：試薬７２の合成。
無水ＤＭＦ（０．９ｍＬ）中の化合物７４（５２ｍｇ）の溶液に、試薬２５（２１ｍｇ）、続いてＮＭＭ（９μＬ）を添加し、混合物を室温で撹拌した。２および４時間後、さらに６時間後に追加量のＮＭＭ（２×９μＬ）を添加し、反応溶液を−２０℃でさらに１６時間保存した。次いで、反応溶液を真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル（４００μＬ）に溶解し、その後、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％トリフルオロ酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％トリフルオロ酢酸（７０：３０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、試薬７２を白色の固体（１７ｍｇ）として得た。ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋２Ｎａ］２＋（１３３３，１０％）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋（８７４，１００％），［Ｍ＋４Ｈ］４＋（６５６，３０％）。
実施例２９：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬７５の調製。
工程１：化合物７６の合成。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物３４（４０ｍｇ）および４−メルカプトペンタン酸（２７ｍｇ）の混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．１％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．１％酢酸（１００：０ｖ／ｖから０：１００ｖ／ｖ）で溶出する逆相Ｃ−１８カラムクロマトグラフィーにより直接精製した。所望の画分を混合し、凍結乾燥して、化合物７６を白色の固体（３６ｍｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（９９８，１００％），［Ｍ＋２Ｈ］２＋（４９９，２０％）。
工程２：試薬７５の合成。
化合物２６の代わりに化合物７６を使用して、実施例１２の試薬２５と同様の方法で試薬７５を合成した。試薬７５を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ７．７６−７．７０（ｍ，１Ｈ），７．５８−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．０８−７．０６（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７２−６．６８（ｍ，２Ｈ），６．４６（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｓ，１Ｈ），５．７２−５．６７（ｍ，１Ｈ），５．３６−５．３２（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．７９（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｔｄ，Ｊ＝１１．２，１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．１８−３．１５（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．９６−２．７３（ｍ，６Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．５４−２．５１（ｍ，２Ｈ），２．２８−２．２４（ｍ，１Ｈ），２．１５−１．９５（ｍ，６Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．６６（ｄ，Ｊ＝０．４Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．３７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．３４−１．２５（ｍ，１３Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（１０９４，１００％）。
実施例３０：メイタンシノイド細胞傷害性ペイロードを含むコンジュゲーション試薬７７（比較物）の調製。
工程１：化合物７８の合成。
化合物１８の代わりにＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）を使用して、実施例２７の化合物７１と同様の方法で化合物７８を合成した。化合物７８を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ６．８３（ｓ，１Ｈ），６．６９−６．６７（ｍ，１Ｈ），６．４２（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．９，１１．３，３．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６９−５．６２（ｍ，１Ｈ），４．９２−４．８６（ｍ，１Ｈ），４．３２（四重項，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｄｄｄ，Ｊ＝２０．７，１３．１，７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｔｄ，Ｊ＝１０．４，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．１７−３．１２（ｍ，１Ｈ），３．０１−２．９５（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，８．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔｄ，Ｊ＝１４．１，６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６７−２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５５−２．３６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．９５（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．８１（ｄｔ，Ｊ＝２０．０，５．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｄｄ，Ｊ＝１９．２，１４．２Ｈｚ，１Ｈ），１．６５（ｓ，３Ｈ），１．４８−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｄｄ，Ｊ＝１２．６，６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３４（ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３２−１．２５（ｍ，１２Ｈ），０．８２（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．７Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋（８８０，１００％）、［Ｍ＋Ｈ］＋（８９８，１５％），［Ｍ＋Ｎａ］＋（９２０，６０％）。
工程２：試薬７７の合成。
化合物２６の代わりに化合物７８を使用して、実施例１２の試薬２５と同様の方法で試薬７７を合成した。試薬７７を白色の固体として単離した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ６．８６−６．８３（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），５．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，９．４，５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），３．０４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．８５（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，９Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５５−２．４９（ｍ，１Ｈ），２．４６−２．３５（ｍ，１Ｈ），２．１７（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０４−１．８３（ｍ，４Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．５７（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５１（ｓ，２Ｈ），１．４８−１．４４（ｍ，１Ｈ），１．３０−１．２３（ｍ，１４Ｈ），０．８０（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：（ＥＳ＋）［Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋（９７７，１００％），［Ｍ＋Ｈ］＋（９９５，１５％），［Ｍ＋Ｎａ］＋（１０１７，５５％）。
実施例３１：メイタンシノイド化合物７９の調製。
アトロプ異性体の混合物として合成された化合物７９は、実施例３の化合物４と同様の方法で調製された。簡単に説明すると、４−アミノ−２−クロロフェニルボロン酸ピナコールエステル（６６ｍｇ）、リン酸三カリウム（１４８ｍｇ）、ＳＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（１３．６ｍｇ）、およびＡＰ３（１００ｍｇ）を、アルゴンパージ反応容器に順次添加した。次いで、容器を密封し、固体をアルゴンでパージした（４×排気／パージサイクル）。次いで、アルゴンでパージすることによって厳密に脱酸素化したＴＨＦ（１．２ｍＬ）および水（１２０μＬ）を添加し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳによる粗反応混合物の分析は、化合物７９について予想される分子量を有する２つのピークを特定した。２．８１および３．００分に分解された２つのピークは２つのアトロプ異性体種に対応する。以後、２．８１分および３．００分で溶出するアトロプ異性体は、それぞれ化合物８０および８１と呼ばれる。
アトロプ異性体の分離は、逆相分取ＨＰＬＣによって達成された。最初に、粗反応混合物を酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、次に鹹水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、真空中で濃縮し、残渣をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。アトロプ異性体８０および８１を、緩衝液Ａ（ｖ／ｖ）：水：０．０５％酢酸および緩衝液Ｂ（ｖ／ｖ）：アセトニトリル：０．０５％酢酸（９０：１０ｖ／ｖから１０：９０ｖ／ｖ、３５分、室温）で溶出するＬｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（２５０ｍｍ Ｌ×５０ｍｍ ＩＤ、５μｍ）を使用する逆相分取ＨＰＬＣにより分離した。２つのアトロプ異性体に対応する画分（ＬＣ／ＭＳによって確認される）を分離し、凍結乾燥して、化合物８０および８１を白色の固体として得た。次いで、各化合物をジクロロメタン：アセトン（１００：０ｖ／ｖから５０：５０ｖ／ｖ）で溶出する順相クロマトグラフィーによりさらに精製して、化合物８０（１５ｍｇ）および化合物８１（１０ｍｇ）を白色の固体として得た。順相精製後の化合物８０および８１のＨＰＬＣクロマトグラムは、両方の化合物がピーク面積で純度＞９６％を達成したことを示す。
アトロプ異性体の安定性は、ＤＭＳＯ中の化合物８０および８１の溶液を５０℃で１時間加熱することによって調べた。１時間加熱した後、化合物をＨＰＬＣで分析し、予熱した試料のＨＰＬＣクロマトグラムから変化は観察されず、両方のアトロプ異性体が安定であり、示された高温で相互変換しないことを示した。
化合物８０の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｓ，２Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５１−６．４５（ｍ，１Ｈ），６．２１（ｓ，１Ｈ），６．１８−６．１６（ｍ，１Ｈ），５．４７−５．４２（ｍ，１Ｈ），４．７６−４．７４（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．５５（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．０１（ｓ，１Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｔ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６４−２．５９（ｍ，１Ｈ），２．１９−２．１５（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．６３（ｍ，１Ｈ），１．５０−１．４５（ｍ，１Ｈ），１．２９−１．２４（ｍ，６Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８７（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：保持時間２．８１分（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１×５０ｍｍカラム、水（０．０５％酢酸）：アセトニトリル（０．０５％酢酸）で溶出（９５：５ｖ／ｖから５：９５ｖ／ｖ）、５分勾配、０．６ｍＬ／分、室温）、（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２６，１００％）。
化合物８１の特徴付けデータ：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５１−６．４６（ｍ，１Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８４−４．８２（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．０２−２．９１（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．６７−２．５８（ｍ，１Ｈ），２．２３−２．２１（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５３−１．４７（ｍ，２Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．２８−１．２４（ｍ，４Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９４（ｓ，３Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：保持時間３．００分、（ＥＳ＋）［Ｍ＋Ｈ］＋（７２６，１００％）。
本発明は、式７９の化合物の個々のアトロプ異性体を含む。例えば、それは、実施例３１において上記に示した条件下でＬＣ／ＭＳにより分析したとき、２．８１分の保持時間を有するアトロプ異性体を含み、また実施例３１において上記に示した条件下でＬＣ／ＭＳにより分析したとき、３．００分の保持時間を有するアトロプ異性体も含む。
２Ｄ ＮＭＲ（ＲＯＥＳＹ）分光法および分子モデリング研究の組み合わせを使用して、化合物８０および８１が以下の構造を有することが提案される。
実施例３２：ＳＫ−ＢＲ−３細胞株における化合物のインビトロ効力アッセイ。
本発明の化合物で処理した後の腫瘍細胞の生存の消失を、実施例２に記載のように、増加濃度の本発明の化合物の存在下でＳＫ−ＢＲ−３細胞株を成長させ、増殖または代謝活性の消失を定量することによって試験した。本発明の化合物についての平均ＩＣ５０値を表６に示し、アッセイ濃度を表７に特定する。
これらのデータは、ビフェニル部分を含有する本発明の化合物が、アリルアミン含有比較物よりも予想外に低いＩＣ５０値を有することを示す。
実施例３３：試薬３５、４７、６９、および７２のトラスツズマブへのコンジュゲーションにより、それぞれＤＡＲ４を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）８２、８３、８４、および８５を産生する。
ＷＯ２０１４０６４４２３およびＷＯ２０１４０６４４２４に記載されているものと同様の方法を用いて、コンジュゲーション試薬３５、４７、６９、および７２をトラスツズマブにコンジュゲートして、ＡＤＣ８２、８３、８４、および８５を得た。
簡単に説明すると、トラスツズマブ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５中５〜７．４ｍｇ／ｍＬ）を１５分間加熱ブロック中で４０℃に加熱した。５ｍＭ ＴＣＥＰ溶液（６当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に添加し、穏やかに混合し、４０℃で１時間インキュベートした後、２２℃に冷却した。
試薬３５、４７、および６９を使用するコンジュゲーションのために、次いで、還元ｍＡｂ溶液を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で４．４ｍｇ／ｍＬに希釈した。コンジュゲーション試薬３５、４７、および６９をＤＭＦに溶解して１．５ｍＭ溶液を得た。コンジュゲーション試薬（５．６当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に添加して、４．０ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度を得た。試薬７２を使用するコンジュゲーションのために、試薬をプロピレングリコール：ＤＭＦ（３：１ｖ／ｖ）に溶解して、０．７５ｍＭ溶液を得た。次いで、試薬７２（５．６当量／ｍＡｂ）を還元ｍＡｂ溶液に添加して、４．０ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度を得た。
次いで、各コンジュゲーション反応溶液を穏やかに混合し、２２℃で１８〜２１時間インキュベートした。次いで、粗反応溶液を等体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７と混合し、得られた溶液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ − ６５０Ｓ ＨＩＣカラムにロードした。各ＡＤＣを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７（２０％イソプロパノール）の勾配でカラムから溶出した。ＤＡＲ４ＡＤＣを含有する画分をプールし、濃縮した。濃縮した試料をＰＢＳ、ｐＨ７．１〜７．５に緩衝液交換し、滅菌濾過した（０．２２μｍのＰＶＤＦ膜）。ＤＡＲ割り当ては、Ａ２４８／Ａ２８０吸収比に基づいた。ＡＤＣ８２、８３、８４、および８５の平均ＤＡＲは、２８０ｎｍでのＨＩＣ分析後の個々のＤＡＲ種の相対ピーク面積から計算した。
実施例３４：試薬４１のブレンツキシマブへのコンジュゲーションにより、ＤＡＲ４を有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）８６を産生する。
実施例３３に記載されているものと同様の方法を用いて、コンジュゲーション試薬４１をブレンツキシマブにコンジュゲートしてＡＤＣ８６を得た。簡単に説明すると、ブレンツキシマブ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中８．５ｍｇ／ｍＬ）を１５分間加熱ブロック中で４０℃に加熱した。ＴＣＥＰ（６当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に添加し、穏やかに混合し、４０℃で１時間インキュベートした後、２２℃に冷却した。コンジュゲーション試薬４１をＤＭＦに溶解して１．６ｍＭ溶液を得た。還元ｍＡｂ溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で６．７ｍｇ／ｍＬに希釈し、続いてプロピレングリコールを添加して、４．４ｍｇ／ｍＬの最終還元ｍＡｂ溶液濃度を得た。コンジュゲーション試薬（６当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に添加して、４ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度を得た。反応溶液を穏やかに混合し、２２℃で２４時間インキュベートした。この後、反応溶液を、２２℃で３０分間、５０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（試薬に対して２０当量）で処理した。次いで、粗反応溶液を等体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７と混合し、得られた溶液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｓ ＨＩＣカラムにロードした。ＡＤＣは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７（２０％イソプロパノール）の勾配でカラムから溶出した。ＤＡＲ４ＡＤＣを含有する画分をプールし、濃縮した（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、１０ｋＤａ ＰＥＳ膜）。濃縮した試料をＤＰＢＳ、ｐＨ７．１〜７．５に緩衝液交換し、滅菌濾過した（０．２２μｍのＰＶＤＦ膜）。ＡＤＣを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．７で平衡化したヒドロキシアパタイトＦｏｒｅｓｉｇｈｔ ＣＨＴカラムを使用してさらに精製した。ＡＤＣは、１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７の勾配でカラムから溶出した。ＡＤＣを含有する画分をプールし、濃縮し（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、３０ｋＤａ ＰＥＳ膜）、濃縮した試料をＤＰＢＳ、ｐＨ７．１〜７．５に緩衝液交換し、滅菌濾過した（０．２２μｍのＰＶＤＦ膜）。実施例３３に記載の方法を用いてコンジュゲートのＤＡＲを決定した。
実施例３５：試薬５０のトラスツズマブへのコンジュゲーションにより、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）８７を産生する。
コンジュゲーション試薬５０をトラスツズマブにコンジュゲートして、ＡＤＣ８７を得た。簡単に説明すると、試薬５０をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭストック溶液を得た。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（５ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ濃度）中のトラスツズマブを、３７℃で２時間、ＴＣＥＰ（２．２当量／ｍＡｂ）で還元した。還元ｍＡｂ溶液を２５℃に冷却し、次いでＤＭＳＯ（１０％ｖ／ｖ）で希釈した。次いで、コンジュゲーション試薬５０（１０当量／ｍＡｂ）を還元ｍＡｂ溶液に添加し、反応混合物を穏やかに混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。反応溶液をＮ−アセチルシステイン（１０当量／ｍＡｂ）と共に２５℃で３０分間インキュベートすることにより、過剰の試薬５０をクエンチした。次いで、活性炭粉末（７０％ｗ／ｗのｍＡｂ）を反応溶液に添加し、これを室温で３０分間穏やかに撹拌して未反応の薬物関連種を除去した。次いで、反応混合物を濾過し（０．２２μｍのＰＥＳ膜）、精製した試料をＰＤ−１０脱塩カラムを使用して１０ｍＭコハク酸、６％ｗ／ｖトレハロース、０．０１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５に緩衝液交換した。実施例３３に記載の方法を用いて、４の平均ＤＡＲをコンジュゲート８７に割り当てた。
実施例３６：試薬７０、７５、および７７（比較物）のトラスツズマブへのコンジュゲーションにより、それぞれ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）８８、８９、および９０（比較物）を産生する。
以下の一般的なコンジュゲーションプロトコルを使用して、コンジュゲーション試薬７０、７５、および７７（比較物）をトラスツズマブにコンジュゲートし、それぞれＡＤＣ８８、８９、および９０（比較物）を得た。簡単に説明すると、試薬をＤＭＦに溶解して１．８〜４．０ｍＭストック溶液を得た。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中のトラスツズマブの溶液に、試薬ストック溶液（１回の添加としてまたはインキュベーション期間を通して複数のアリコートとしてのいずれかで５〜２０当量／ｍＡｂ）を添加して、３．０〜４．０ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度（ＤＭＦ１０％ｖ／ｖを含有する）を得た。反応溶液を２２℃で１〜４時間インキュベートした。
ＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇカラムを用いた分取ＳＥＣクロマトグラフィーおよび溶離液としてＰＢＳ（１５％イソプロパノール）を使用する無勾配溶出により、ＡＤＣ８８および８９を精製した。１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．７で平衡化したＦｏｒｅｓｉｇｈｔ ＣＨＴヒドロキシアパタイトカラムを使用してＡＤＣ９０（比較物）を精製し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の勾配でＡＤＣをカラムから溶出した。
カラムクロマトグラフィーの後、所望のＡＤＣ含有画分をプールし、濃縮した。濃縮した試料をＰＢＳに緩衝液交換し、滅菌濾過した。質量分析後、個々のＤＡＲ種の相対ピーク強度からＤＡＲ割り当てを計算した。ＡＤＣ８８、８９、および９０（比較物）について、それぞれ２．０、３．２、および３．１の平均ＤＡＲを計算した。
実施例３７：インビトロ細胞生存アッセイによるＡＤＣの分析
実施例２に記載のように、本発明のメイタンシノイドを組み込むＡＤＣで処理した後の腫瘍細胞の生存の消失を、増加濃度のＡＤＣの存在下で細胞株を成長させ、増殖または代謝活性の消失を定量することによって試験した。本発明のメイタンシノイドを組み込むＡＤＣの平均ＩＣ５０値を表８に示し、アッセイ濃度を表９に特定する。
得られたＩＣ５０値は、本発明の新規メイタンシノイドを組み込むＡＤＣがインビトロで強力な殺細胞特性を有することを示す。
実施例３８：マウス血清中の化合物２６および７８（比較物）の安定性。
ＤＭＦ：緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の５０／５０ｖ／ｖ混合物（０．５ｍｇ／ｍＬ）中の化合物２６および７８（比較物）の溶液を、マウス血清中０．０５ｍｇ／ｍＬ（９０％（ｖ／ｖ）血清含有量）に希釈した。「０」時点に対応する各試料のアリコートを−８０℃で直ちに凍結し、一方残りの試料を３７℃で７日間インキュベートした。さらなるアリコートを４日後および７日後に採取し、−８０℃で凍結した。分析の前に、試料を冷凍庫から取り出し、メイタンシノイド関連種をタンパク質沈殿によって血清から抽出した。各時点のアリコートにアセトニトリル（７５％ｖ／ｖ）を添加し、穏やかに混合した後、混合物を４℃で２時間放置することによってタンパク質沈殿を行った。次いで、沈殿したタンパク質を遠心分離（１４００×ｇ、３０分、４℃）により分離し、抽出したメイタンシノイド関連種を含有する上清をＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳにより分析した。
逆相Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ分析試料を水でさらに希釈して１５％ｖ／ｖのアセトニトリル溶液を得た。次いで、各溶液のアリコート（２．５μＬ）を、ＰｅｐＭａｐ Ｃ１８カラム（０．０７５×１５０ｍｍ）を装着したＤｉｏｎｅｘ ＵＬＴＩＭＡＴＥ３０００ＵＰＬＣからなるナノ液体クロマトグラフィーＭＳシステムに注入し、ロックマスを使用して７５Ｋの解像度でＥＳポジティブモードで操作されたＯｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ装置にオンラインで連結した。緩衝液Ａは、両方とも０．１％ギ酸を含有する１００％水および１００％アセトニトリルの緩衝液Ｂからなり、１５〜８０％Ｂの勾配を流速０．３μＬ／分で６０分間かけて行った。Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウェアツールを使用して潜在的な分解産物について分析することにより、データ分析を手動で行った。
図４ａは、マウス血清中３７℃で４および７日後に、化合物７８（比較物）の有意な分解が起こり、分解産物ＡおよびＢに対応するピークが逆相Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ＭＳ分析によって検出可能であることを示す。特に分解産物Ｂの量は４日目から７日目まで増加する。対照的に、図４ｂでは、７日間のインキュベーション後に、化合物２６についてＡおよびＢと同等の分解産物（以下ではＣおよびＤと示す）は観察されなかった。これらのデータは、化合物７８（比較物）に対して安定性が改善された化合物２６と一致する。化合物７８ならびに断片ＡおよびＢの構造を以下に示す。
化合物２６ならびに断片ＣおよびＤの構造を以下に示す。

Claims (44)

  1. 一般式Ｉの化合物またはその塩であって、
    式中、Ｒが、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＳ（Ｏ）２−Ｒｘ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｘＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨ、−Ｙ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＯＨ、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＮＨ２、または−Ｙ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２を表し、式中、Ｙが存在しないか、あるいはＹが、酸素原子によって中断されてもよく、および／または任意選択で−ＯＨもしくは−ＯＣ１−４アルキルで置換されていてもよい、Ｃ１−６アルキレン、Ｃ２−６アルケニレン、Ｃ２−６アルキニレンまたはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すか、あるいはＹが、フェニレンまたはＣ５−１０ヘテロアリーレン基を表すかのいずれかであり、
    Ｒｘが、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されている、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、フェニル、Ｃ５−１０ヘテロアリール、またはベンジル基を表し、
    ＲｙおよびＲｚがそれぞれ、独立して、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、フェニル、Ｃ５−１０ヘテロアリール、またはベンジル基を表し、
    Ｘが、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂが、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃが、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、
    各Ｒｅが、独立して、ハロゲン原子、任意選択で置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、またはＣ１−６アルコキシ基を表し、それらのそれぞれが、任意選択で、酸素原子、任意選択で置換されているフェニルもしくはＣ５−１０ヘテロアリール基、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｒｖ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｖＲｗ、−ＮＲｖＣ（Ｏ）Ｒｗ、ＮＲｖＲｗ、＿−ＳＲｖ、−Ｓ（Ｏ）−Ｒｖ、Ｓ（Ｏ）２−Ｒｖ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｖＲｗ、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基によって中断されてもよく、ＲｖおよびＲｗがそれぞれ、独立して、水素、フェニル、ベンジル、および任意選択で置換されているＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、またはＣ２−６アルキニル基からなる群から選択され、それらのそれぞれが、任意選択で、酸素原子によって中断されてもよく、ｎが、０、１、２、３、または４であり、
    Ｒｆが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、
    Ｒｇが、水素原子または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、もしくはヘテロアリール基を表す、化合物。
  2. Ｒが、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２ＯＨ、または−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキレン−ＳＨ基である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒが、アルキルが−ＳＨで置換されている−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキルである、請求項２に記載の化合物。
  4. 存在する任意のＲｅ基が、ハロゲン原子、メトキシ基、−ＣＮ基、または−ＮＯ２基からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
  5. Ｒｇが、非置換であるか、またはＮ（Ｒｉ）（Ｒｉｉ）で置換されているＣ１−４アルキルを表し、Ｒｉが、Ｃ１−４アルキル基を表し、Ｒｉｉが、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル基を表す、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
  6. Ｒが、基−Ｙ−ＯＨ、−Ｙ−Ｏ−Ｒｘ、−Ｙ−ＳＨ、−Ｙ−Ｓ−Ｒｘ、−Ｙ−ＣＯ２Ｈ、−Ｙ−ＣＯ−Ｒｘ、−Ｙ−ＮＨＲｙ、−Ｙ−ＮＲｙ−ＮＨＲｚ、または−Ｙ−ＣＲｙ＝ＮＯＨを表し、式中、Ｙが存在しないか、またはＹは、Ｃ１−６アルキレンもしくはＣ１−６アルキレンオキシ基を表すかのいずれかであり、それらのいずれかは、酸素原子によって中断されてもよく、Ｒｘが、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲｙ、または−ＣＯ２Ｈで置換されているＣ１−４アルキル基を表し、ＲｙおよびＲｚはそれぞれ、独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｘが、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、ＳＨ、Ｓ１−４アルキル、またはＣＮを表し、Ｒａが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｂが、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｃが、水素、ＯＨ、Ｃ１−４アルコキシ、またはＣ１−４アルキルＣ（Ｏ）Ｏ−を表し、Ｒｄが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、各Ｒｅが、独立して、ハロゲン原子、ＣＦ３基、またはＣ１−４アルキル基もしくはＣ１−４アルコキシ基を表し、ｎが、０、１、２、３、または４であり、Ｒｆが、水素原子またはＣ１−４アルキル基を表し、Ｒｇが、水素原子または任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、もしくはヘテロアリール基を表す、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｙが存在しないか、またはＹが、酸素原子によって中断されてもよいＣ１−４アルキレンもしくはＣ１−４アルキレンオキシ基を表す、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
  8. Ｒが、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、もしくは−ＣＯ２Ｈ基、または−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、もしくは−ＣＯ２Ｈ基で置換されているＣ１−４アルキレン基である、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
  9. Ｒが、フェニル環の３または４位にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 存在する任意のＲｅ基が、ハロゲン原子またはメチルもしくはメトキシ基である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. ｎが、０、１、または２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. Ｘが、ＯＨを表す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
  13. ＲａがＣ１−４アルキルを表し、Ｒｂが水素を表し、Ｒｃが水素またはメトキシを表し、ＲｄがＣ１−４アルキルを表し、Ｒｅが塩素または水素を表し、ＲｆがＣ１−４アルキルを表し、ＲｇがＣ１−４アルキルを表す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 一般式Ｉａの化合物またはその塩である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物：
    。
  15. 一般式Ｉｂの化合物またはその塩である、請求項１４に記載の化合物：
    。
  16. リンカーを介して結合タンパク質に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物を含むコンジュゲートであって、前記リンカーが、一般式Ｉの基Ｒを介して前記化合物に接続されている、コンジュゲート。
  17. 前記リンカーが、基−Ｓ−Ｃ１−６アルキレン−を含む、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. 前記コンジュゲートが、請求項６に記載の化合物を含む、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  19. 前記結合タンパク質が、全長抗体または前記全長抗体の抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項１６〜１８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  20. 前記結合タンパク質が、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４、またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４の断片である、請求項１６〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート。
  21. 以下の部分：
    であって、
    式中、Ｗ’が、電子求引性基または電子求引性基の還元により得られる基を表し、ＡおよびＢがそれぞれ、独立して、Ｃ１−５アルキレンまたはアルケニレン鎖を表し、Ｐｒが、求核剤Ｎｕを介してＡおよびＢに結合した前記結合タンパク質を表す、部分を含むか、または以下の部分であって、
    〜Ｗ’−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−（ＣＨ２）２−Ｎｕ−Ｐｒ
    式中、Ｗ’が、電子求引性基または電子求引性基の還元により得られる基を表し、ｐが、０または１〜４の整数であり、Ｐｒが求核剤Ｎｕを介して分子の残りの部分に結合した前記結合タンパク質を表す、部分を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 以下の部分：
    を含むか、
    または以下の部分であって、
    〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｎｕ−Ｐｒ
    式中、Ａｒ’が、任意選択で置換されているアリール基を表す、部分を含む、請求項２１に記載のコンジュゲート。
  23. 各Ｎｕが、前記結合タンパク質Ｐｒ中のシステイン残基に存在する硫黄原子を表すか、または各Ｎｕが、前記結合タンパク質に結合したポリヒスチジンタグに存在するイミダゾール基を表す、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  24. 前記リンカーが、式−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲｒ（式中、Ｒｒが、水素原子、アルキル基、または任意選択で置換されているアリール基を表す）の末端基を有するペンダントポリエチレングリコール鎖を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記リンカーが、環内に少なくとも２つの〜（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）〜単位を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  26. 前記リンカーが、少なくとも２つの天然に存在するアルファアミノ酸を含むペプチジル基を含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  27. 前記リンカーが、配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢまたはＶａｌ−Ａｌａを含む、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. 結合タンパク質と反応可能な少なくとも１つの官能基にリンカーを介して結合され、前記リンカーが、一般式Ｉの基Ｒを介して前記化合物に接続されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物を含むコンジュゲート試薬。
  29. 以下の部分
    、またはそれらの塩を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート試薬。
  30. 以下の部分
    を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート試薬。
  31. 前記官能基が、以下の式：
    （式中、Ｗは電子求引性基を表し、ＡおよびＢはそれぞれ、独立して、Ｃ１−５アルキレンまたはアルケニレン鎖を表し、各Ｌは、独立して、脱離基を表すか、または両方のＬが一緒になって脱離基を表すかのいずれかである）、または
    （式中、ＷおよびＡは上記の意味を有し、Ｌは脱離基を表し、ｍは０〜４である）、または
    〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−（ＣＨ２）２−Ｌもしくは〜Ｗ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ２
    （式中、Ｗは電子求引性基を表し、ｐは０または１〜４の整数を表し、Ｌは脱離基を表す）を有する、請求項２８に記載のコンジュゲート試薬。
  32. 前記官能基が、以下の式：
    、または
    〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｌもしくは〜ＮＨ−ＣＯ−Ａｒ’−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２を有し、
    式中、Ａｒ’が、任意選択で置換されているアリール基を表す、請求項３１に記載のコンジュゲート試薬。
  33. 前記脱離基または各脱離基が、部分−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−（式中、ｑは６以上の数である）を含む、請求項３１または３２に記載のコンジュゲート試薬。
  34. 前記リンカーが、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の特徴を含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート試薬。
  35. 前記コンジュゲート試薬が、請求項６に記載の化合物を含む、請求項２８〜３４に記載のコンジュゲート試薬。
  36. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１６〜２７のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、薬学的に許容される担体と一緒に、任意選択で追加の治療薬と一緒に含む、医薬組成物。
  37. 増殖性、自己免疫性、または感染性の疾患または障害の治療を必要とする患者を治療する方法であって、薬学的有効量の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項３６に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
  38. 治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物または請求項１６〜２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  39. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の一般式Ｉの化合物またはその塩を調製するためのプロセスであって、以下の一般式の化合物：
    であって、
    式中、Ｘ、Ｒａ〜Ｒｄ、Ｒｆ、およびＲｇが、前記一般式Ｉについて記載される意味を有する化合物を、アリール−有機金属試薬であって、アリール部分が（Ｒｅ）ｎおよびＲまたはＲの保護体で置換されているフェニル基であり、Ｒおよび（Ｒｅ）ｎが、前記一般式Ｉについて記載される意味を有する、アリール−有機金属試薬と反応させることを含み、前記反応が、遷移金属触媒の存在下で実施される、プロセス。
  40. 前記式Ｉの化合物が請求項６に定義される通りである、請求項３９に記載のプロセス。
  41. 前記アリール−有機金属試薬が、アリール−ボロン酸またはアリール−ボロン酸エステルであり、前記反応が、水の存在下、および酸素の不在もしくは実質的な不在下で、パラジウム触媒の存在下で実施される、請求項３９または４０に記載のプロセス。
  42. 前記アリール−有機金属試薬が、以下の一般式のボロン酸、
    またはその保護体であり、前記反応がパラジウム触媒の存在下で実施される、請求項３９〜４１のいずれかに記載のプロセス。
  43. 以下の一般式：
    （式中、Ｘ、ｎ、およびＲａ−Ｒｇは、一般式Ｉについて記載される意味を有し、Ｒｐｒｏｔは、保護基を担持する一般式Ｉの基Ｒである）を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の一般式Ｉの化合物もしくはその塩の調製に有用な中間体、またはその塩。
  44. Ｒが、−ＯＨもしくは−ＳＨ基を含み、保護基が、シリル基、アシル基、もしくはアリールメチル基であるか、Ｒが、−ＣＯ２Ｈ基を含み、前記保護基が、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、９−フルオレニルメチル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、もしくはジフェニルメチルであるか、またはＲが、−ＮＨＲ’、−ＮＨＲ’‘、もしくは−ＮＨＲ’‘‘基を含み、前記保護基が、ｔ−ブトキシカルボニル、トリチル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ホルミル、トリメチルシリル、もしくはｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項４３に記載の中間体。
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