JP2020162441A - Preservation liquid - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織または器官用保存液に関する。 The present invention relates to cell, tissue or organ preservatives containing agonists of TRP channels and / or antagonists of TRPC.
細胞、組織、または器官を用いた実験や臓器移植等を実施する場合、実施に供する前に細胞、組織、または器官の適切な保存が必要とされる。例えば、臓器移植において、摘出された臓器がレシピエントに移植されるまで品質の低下を抑えるために適切に保存しておく必要がある。 When conducting experiments using cells, tissues, or organs, organ transplantation, etc., proper preservation of cells, tissues, or organs is required before the performance. For example, in organ transplantation, it is necessary to properly store the excised organ until it is transplanted to a recipient in order to prevent deterioration of quality.
これまでに、冷蔵保存液であり、フリーラジカルを捕捉する物質を含み、低温での細胞状態のバランス最適化（ｐＨ緩衝、膠質浸透圧、エネルギー基質、イオン濃度）が図られたＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（商標）が知られている。また、冷蔵で短期間保存するための保護液であり、生体由来物質および保存補助剤を含まず、無機塩類とグルコースのみで構成された液であるＣＰＳ（商標）−１が知られている。さらに、肺組織／細胞の冷蔵保存液であり、細胞外液に近いイオン組成で、ＤＭＳＯや血清タンパク質が含まれない保存液であるＳｔｅｍＳｕｒｖｉｖｅ−ｌｕｎｇが知られている。また、特許文献１には、細胞傷害に対して細胞を保護するために使用できるクロマン誘導体が開示されている。 Hyposthermosol ™, which is a refrigerated storage solution, contains a substance that traps free radicals, and has been optimized for the balance of cell state at low temperature (pH buffer, oncotic pressure, energy substrate, ion concentration). It has been known. Further, CPS ™ -1, which is a protective liquid for short-term storage in a refrigerator, does not contain a biological substance and a storage aid, and is composed only of inorganic salts and glucose, is known. Further, StemSurvive-rung, which is a refrigerated storage solution for lung tissue / cells and has an ionic composition close to that of extracellular fluid and does not contain DMSO or serum protein, is known. In addition, Patent Document 1 discloses a chroman derivative that can be used to protect cells against cytotoxicity.
臓器移植に際し、ドナーから提供された臓器は代謝低下を目的に低温保存された状態で輸送されている。摘出臓器は血流が遮断され阻血状態となるが低温での代謝抑制により阻血の影響を軽減させている。それでも、臓器移植時の阻血許容時間は心臓で４時間、肺で８時間と臓器に依っては短く、低温保存時間の延長が強く求められている。 At the time of organ transplantation, the organs donated by the donor are transported in a cryopreserved state for the purpose of lowering metabolism. Blood flow is blocked in the excised organ and it becomes ischemic, but the effect of ischemia is reduced by suppressing metabolism at low temperature. Nevertheless, the permissible time for ischemia at the time of organ transplantation is as short as 4 hours for the heart and 8 hours for the lungs, depending on the organ, and there is a strong demand for extension of the cryopreservation time.
また、再生医療に関する研究開発が進み、細胞が原料となる再生医療等製品も開発される状況で、製品の凍結保存はもちろん、冷蔵保存や輸送時の保存の必要性が顕在化してきている。臓器に限らず細胞等の保存性能が高い保存液は未だ希求されているといえる。 In addition, research and development related to regenerative medicine is progressing, and products such as regenerative medicine using cells as raw materials are being developed, and the necessity of refrigerating storage and storage during transportation as well as cryopreservation of products has become apparent. It can be said that there is still a need for a preservation solution having high preservation performance not only for organs but also for cells and the like.
本発明者らは、驚くべきことに、特定のＴＲＰチャネル作用物質を含む保存液を用いることにより、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 The inventors have surprisingly found that cells, tissues, or organs can be preserved in good condition by using a preservation solution containing a specific TRP channel agonist. The present invention is based on these findings.
本発明は、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存できる保存液を提供する。 The present invention provides a preservation solution that can preserve cells, tissues, or organs in good condition.
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織、または器官用保存液。
（２）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、（１）に記載の保存液。
（３）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、ＴＲＰＡのアゴニスト、ＴＲＰＭのアゴニスト、ＴＲＰＶのアゴニスト、およびＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上である、（１）に記載の保存液。
（４）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
イシリン、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド、
２−アミノエトキシジフェニルボラン、
ｌ−メントール、
ポリゴジアール、
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、および
カプサイシン
からなる群から選択される一種または二種以上である、（１）に記載の保存液。
（５）両親媒性高分子を更に含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の保存液。
（６）両親媒性高分子が多糖類または蛋白質である、（５）に記載の保存液。
（７）冷蔵保存液である、（１）〜（６）のいずれかに記載の保存液。
（８）保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストが０．１〜１０００μＭ含まれる、（１）〜（７）のいずれかに記載の保存液。
（９）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを溶液に加える工程を含む、細胞、組織、または器官用保存液の製造方法。
（１０）ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰＣのアンタゴニストを含む溶液を、細胞、組織または器官に加えることを特徴とする、細胞、組織、または器官の保存方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) Preservative solution for cells, tissues, or organs containing an agonist of a TRP channel and / or an antagonist of TRPC of a TRP channel.
(2) TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists
The preservative solution according to (1), which is two or more of TRP channel agonists, or two or more selected from the group consisting of TRP channel agonists and TRP channel TRPC antagonists.
(3) The TRP channel agonist and / or the TRPC antagonist of the TRP channel is one or more selected from the group consisting of a TRPA agonist, a TRPM agonist, a TRPV agonist, and a TRPC antagonist. The storage solution according to 1).
(4) TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists
Icilin,
1- [2- (4-Methoxyphenyl) -2- [3- (4-methoxyphenyl) propoxy] ethyl] -1H-imidazole, monohydrochloride,
2-Aminoethoxydiphenylborane,
l-menthol,
Polygoziar,
N-Butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride,
One or more selected from the group consisting of (1R *, 2S *) -N- (4-methoxyphenyl) -5-methyl-2- (1-methylethyl) cyclohexanecarboxamide, and capsaicin, ( The storage solution according to 1).
(5) The preservative solution according to any one of (1) to (4), further containing an amphipathic polymer.
(6) The preservative solution according to (5), wherein the amphipathic polymer is a polysaccharide or protein.
(7) The preservation solution according to any one of (1) to (6), which is a refrigerated preservation solution.
(8) The preservation solution according to any one of (1) to (7), wherein the preservation solution contains 0.1 to 1000 μM of an agonist of a TRP channel and / or an antagonist of TRPC.
(9) A method for producing a preservation solution for cells, tissues, or organs, which comprises a step of adding an agonist of a TRP channel and / or an antagonist of TRPC to a solution.
(10) A method for preserving cells, tissues, or organs, which comprises adding a solution containing an agonist of a TRP channel and / or an antagonist of TRPC to a cell, tissue, or organ.
本発明の保存液を用いることにより、細胞、組織、または器官を良好な状態に保ったまま保存することができる点で有利である。 The use of the preservation solution of the present invention is advantageous in that cells, tissues, or organs can be preserved in good condition.
保存液
本発明によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルの（サブファミリー）ＴＲＰＣのアンタゴニストを含む、細胞、組織、または器官用保存液を提供することができる。
Preservatives According to the present invention, preservatives for cells, tissues, or organs can be provided that contain TRP channel agonists and / or antagonists of TRP channel (subfamily) TRPCs.
ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルとは、ショウジョウバエの光受容応答変異株の原因遺伝子として発見されたチャネル分子であり、哺乳類においては２８種の遺伝子が同定され、Ｃ、Ｍ、Ｖ、ＭＬ、Ｐ、Ａといった６つのサブファミリーを構成し、それぞれのサブファミリーは、ＴＲＰＣ、ＴＲＰＭ、ＴＲＰＶ、ＴＲＰＭＬ、ＴＲＰＰ、およびＴＲＰＡという。 The TRP (Transient Receptor Potential) channel is a channel molecule discovered as a causative gene of a photoreceptive response mutant strain of Drosophila, and 28 kinds of genes have been identified in mammals, and C, M, V, ML, P, It constitutes six subfamilies such as A, and each subfamily is referred to as TRPC, TRPM, TRPV, TRPML, TRPP, and TRPA.
ＴＲＰチャネルをコードする遺伝子としては、例えば、ＴＲＰ ｃｌａｓｓｉｃ（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）（ＴＲＰＣ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｃ１遺伝子、Ｔｒｐｃ２遺伝子、Ｔｒｐｃ３遺伝子、Ｔｒｐｃ４遺伝子、Ｔｒｐｃ５遺伝子、Ｔｒｐｃ６遺伝子、Ｔｒｐｃ７遺伝子）、ＴＲＰ ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ（ＴＲＰＭ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍ１遺伝子、Ｔｒｐｍ２遺伝子、Ｔｒｐｍ３遺伝子、Ｔｒｐｍ４遺伝子、Ｔｒｐｍ５遺伝子、Ｔｒｐｍ６遺伝子、Ｔｒｐｍ７遺伝子、Ｔｒｐｍ８遺伝子）、ＴＲＰ ｖａｎｉｌｌｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＰＶ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｖ１遺伝子、Ｔｒｐｖ２遺伝子、Ｔｒｐｖ３遺伝子、Ｔｒｐｖ４遺伝子、Ｔｒｐｖ５遺伝子、Ｔｒｐｖ６遺伝子）、ＴＲＰ ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ（ＴＲＰＭＬ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｍｌ１遺伝子、Ｔｒｐｍｌ２遺伝子、Ｔｒｐｍｌ３遺伝子）、ＴＲＰ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｎ（ＴＲＰＰ）ファミリー遺伝子群（Ｔｒｐｐ１遺伝子、Ｔｒｐｐ２遺伝子、Ｔｒｐｐ３遺伝子、Ｔｒｐｐ５遺伝子）、ＴＲＰ アンキリン（ＴＲＰＡ）遺伝子（Ｔｒｐａ遺伝子）等が挙げられる。ここで、ＴＲＰチャネル作用物質とは、ＴＲＰチャネルに作用する物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を意味する。 Examples of genes encoding TRP channels include TRP classical (canonic) (TRPC) family genes (Trpc1 gene, Trpc2 gene, Trpc3 gene, Trpc4 gene, Trpc5 gene, Trpc6 gene, Trpc7 gene), and TRP melastatin (TRPM). Family genes (Trpm1 gene, Trpm2 gene, Trpm3 gene, Trpm4 gene, Trpm5 gene, Trpm6 gene, Trpm7 gene, Trpm8 gene), TRP vanilloid receiver (TRPV) family gene group (Trpv1 gene, Trpv2 gene, Trpv3 gene, Trpv4 gene) , Trpv5 gene, Trpv6 gene), TRP mucolipin (TRPML) family gene group (Trpml1 gene, Trpml2 gene, Trpml3 gene), TRP polycystin (TRPP) family gene group (Trpp1 gene, Trppp2 gene, Trppp3 gene, Trpp5 gene), TRP Ankirin (TRPA) gene (Trapa gene) and the like can be mentioned. Here, the TRP channel agonist means a substance (including an agonist and an antagonist) that acts on the TRP channel.
本発明の好ましい態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが、
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、細胞、組織、または器官用保存液が提供される。
According to a preferred embodiment of the invention, the TRP channel agonist and / or the TRP channel TRPC antagonist
Preservatives for cells, tissues, or organs are provided that are two or more of the TRP channel agonists, or two or more selected from the group consisting of TRP channel agonists and TRP channel TRPC antagonists.
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとしては、特に限定されるものではないが、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡのアゴニスト、ＴＲＰＭのアゴニスト、ＴＲＰＶのアゴニスト、およびＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上であることが好ましく、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡ１のアゴニスト、ＴＲＰＭ８のアゴニスト、ＴＲＰＶ１〜Ｖ３のアゴニスト、ＴＲＰＣ１のアンタゴニスト、およびＴＲＰＣ１〜７のアンタゴニストからなる群から選択される一種または二種以上であることがより好ましく、ＴＲＰＭ８のアゴニスト、ＴＲＰＡ１のアゴニスト、またはＴＲＰＣ３〜６のアンタゴニストであることがさらに好ましく、ＴＲＰチャネルのサブファミリーＴＲＰＡ１のアゴニストまたはＴＲＰＭ８のアゴニストであることが特に好ましい。 TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists are not particularly limited, but are TRP channel subfamily TRPA agonists, TRPM agonists, TRPV agonists, and TRP channel subfamily TRPC agonists. It is preferably one or more selected from the group consisting of antagonists, and consists of an agonist of the TRP channel subfamily TRPA1, an agonist of TRPM8, an agonist of TRPV1 to V3, an antagonist of TRPC1, and an antagonist of TRPC1-7. It is more preferably one or more selected from the group, more preferably an agonist of TRPM8, an agonist of TRPA1, or an agonist of TRPC3-6, and an agonist of TRP channel subfamily TRPA1 or an agonist of TRPM8. Is particularly preferable.
また、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下の化合物が挙げられる。
イシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）（３，６−ジヒドロ−１−（２−ヒドロキシフェニル）−４−（３−ニトロフェニル）−２（１Ｈ）−ピリミジノン（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−１−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２（１Ｈ）−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ））（ＴＲＰＡ１およびＴＲＰＭ８のアゴニスト）、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド（ＳＫＦ９６３６５）（１−［２−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−［３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７のアンタゴニスト）、
２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）（ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｎｅ）（ＴＲＰＶ１〜Ｖ３のアゴニスト並びにＴＲＰＣ１、Ｃ３、Ｃ５、およびＣ６のアンタゴニスト）、
ｌ−メントール（５−メチル−２−（プロパン−２−イル）シクロヘキサン−１−オール（５−Ｍｅｔｈｙｌ−２−（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎ−１−ｏｌ））（ＴＲＰＡ１、Ｍ８、およびＶ３のアゴニスト）、
ポリゴジアール（Ｐｏｌｙｇｏｄｉａｌ）（（１Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−１，４，４ａ，６，７，８−ヘキサヒドロナフタレン−１，２−ジカルボキサアルデヒド（（１Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−１，４，４ａ，６，７，８−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ））（ＴＲＰＡ１のアゴニスト）、
２−［［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］安息香酸（Ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）（２−［［３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ））（ＴＲＰＣ６のアゴニスト並びにＴＲＰＣ３およびＣ７のアンタゴニスト）
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）（Ｎ−Ｂｕｔｙｌ−１Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））（ＴＲＰＣ４およびＣ５のアンタゴニスト）、
（３β）−３−（スルホオキシ）−プレグン−５−エン−２０−オン ナトリウム塩（硫酸プレグネノロンナトリウム塩）（Ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（（（３β）−３−（Ｓｕｌｆｏｏｘｙ）−ｐｒｅｇｎ−５−ｅｎ−２０−ｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ））（ＴＲＰＭ３のアゴニスト）、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド（ＷＳ１２）（（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−２−（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（ＴＲＰＭ８のアゴニスト）、
２−［２−（３，４−ジヒドロ−２，２，４−トリメチル−１（２Ｈ）−キノリニル）−２−オキソエチル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＭＬ−ＳＡ１）（２−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２，２，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−１（２Ｈ）−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｉｓｏｉｎｄｏｌｅ−１，３（２Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）（ＴＲＰＭＬ１〜ＴＲＰＭＬ３のアゴニスト）、
カプサイシン（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）（６−ノネン、Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−８−メチル−、（６Ｅ）−（６−Ｎｏｎｅｎａｍｉｄｅ，Ｎ−［（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−８−ｍｅｔｈｙｌ−，（６Ｅ）−））（ＴＲＰＶ１のアゴニスト）、および
１−（４−クロロ−２−ニトロフェニル） スルホニル−４−ベンジルピペラジン（ＲＮ−１７４７）（１−（４−Ｃｈｌｏｒｏ−２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ−４−ｂｅｎｚｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）（ＴＲＰＶ４のアゴニスト）。
The TRP channel agonist and the TRP channel TRPC antagonist are not particularly limited, and examples thereof include the following compounds.
Icilin (3,6-dihydro-1- (2-hydroxyphenyl) -4- (3-nitrophenyl) -2 (1H) -pyrimidonene (3,6-dihydro-1- (2-hydroxyphenyl)- 4- (3-nitrophenyl) -2 (1H) -pyrimidone)) (agonist of TRPA1 and TRPM8),
1- [2- (4-Methoxyphenyl) -2- [3- (4-methoxyphenyl) propoxy] ethyl] -1H-imidazole, monohydrochloride (SKF96365) (1- [2- (4-methoxyphenyl)- 2- [3- (4-methoxyphenyl) propanol] ethyl] -1H-imidazole, methylchloride) (antagonist of TRPC6 and TRPC7),
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) (aminoethoxydiphenylborane), an agonist of TRPV1 to V3 and an antagonist of TRPC1, C3, C5, and C6.
l-Menthol (5-methyl-2- (propan-2-yl) cyclohexane-1-ol (5-Methyl-2- (propan-2-yl) cyclohexan-1-ol)) (TRPA1, M8, and V3) Agonist),
Polygodial ((1R, 4aS, 8aS) -5,5,8a-trimethyl-1,4,4a, 6,7,8-hexahydronaphthalene-1,2-dicarboxaaldehyde ((1R, 4aS)) , 8aS) -5,5,8a-Trimethyl-1,4,4a, 6,7,8-hexahydronaphthaleene-1,2-dicarboxaldehyde)) (TRPA1 agonist),
2-[[3- (Trifluoromethyl) phenyl] amino] benzoic acid (Flufenamic acid) (2-[[3- (trifluoromethyl) phenyl] amino] bentoic acid) (TRPC6 agonist and TRPC3 and C7 antagonist)
N-Butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride (M084 Hydrochloride) (N-Butyl-1H-benzimidazol-2-amine Hydrochloride) (an antagonist of TRPC4 and C5),
(3β) -3- (sulfooxy) -pregn-5-en-20-one sodium salt (pregnenolone sodium salt sulfate) (Pregnenolone sulfate sodium salt) (((3β) -3- (Sulfoxy) -pregn-5-en -20-one sodium salt)) (an agonist of TRPM3),
(1R *, 2S *) -N- (4-Methoxyphenyl) -5-Methyl-2- (1-methylethyl) Cyclohexanecarboxamide (WS12) ((1R *, 2S *)-N- (4-Methylphenyl) -5-methyl-2- (1-methylyl) cyclohexanecarboxamide) (an agonist of TRPM8),
2- [2- (3,4-dihydro-2,2,4-trimethyl-1 (2H) -quinolinyl) -2-oxoethyl] -1H-isoindole-1,3 (2H) -dione (ML-SA1) ) (2- [2- (3,4-Dihydro-2,2,4-trimethyl-1 (2H) -quinolinyl) -2-oxoethyl] -1H-isoindole-1,3 (2H) -dione) (TRPML1 ~ TRPML3 agonist),
Capsaicin (6-nonen, N-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) methyl] -8-methyl-, (6E)-(6-Nonenamide, N-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) ) Methyl] -8-methyl-, (6E)-)) (an agonist of TRPV1), and 1- (4-chloro-2-nitrophenyl) sulfonyl-4-benzylpiperazine (RN-1747) (1- (4) -Chloro-2-nitropheneyl) sulfonyl-4-benzylpiperazine) (an agonist of TRPV4).
本発明の保存液に用いられるＴＲＰチャネルのアゴニストまたはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストとして好ましくは、イシリン、１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド（ＳＫＦ９６３６５）、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）、ｌ−メントール、ポリゴジアール、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）、（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド（ＷＳ１２）、およびカプサイシンからなる群から選択される一種または二種以上であり、より好ましくはイシリン、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）、およびカプサイシンからなる群から選択される一種または二種以上であり、さらに好ましくは、イシリン、Ｍ０８４塩酸塩、カプサイシン、または２−ＡＰＢであり、特に好ましくはイシリンである。 Icilin, 1- [2- (4-methoxyphenyl) -2- [3- (4-methoxyphenyl) propoxy] is preferable as an agonist of TRP channel or an antagonist of TRPC of TRP channel used in the preservation solution of the present invention. Ethyl] -1H-imidazole, monohydrochloride (SKF96365), 2-aminoethoxydiphenylboran (2-APB), l-menthol, polygodial, N-butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride (M084 hydrochloride) ), (1R *, 2S *) -N- (4-methoxyphenyl) -5-methyl-2- (1-methylethyl) cyclohexanecarboxamide (WS12), and one or two selected from the group consisting of capsaicin. More preferably, it is selected from the group consisting of icirin, 2-aminoethoxydiphenylborane (2-APB), N-butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride (M084 hydrochloride), and capsaicin. One or more, more preferably cilin, M084 hydrochloride, capsaicin, or 2-APB, and particularly preferably cilin.
本発明の保存液に含まれる、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される好ましい二種以上の組合せとしては以下の通りである：
（１）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニスト、ＴＲＰＡアゴニスト、およびＴＲＰＶアゴニストからなる群から選択される少なくとも一種との組合せ、
（２）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニストおよびＴＲＰＡアゴニストからなる群から選択される少なくとも一種との組合せ、
（３）ＴＲＰＭアゴニストの少なくとも一種と、ＴＲＰＣアンタゴニストの少なくとも一種との組合せ。
Preferred combinations of two or more selected from the group consisting of TRP channel agonists and TRP channel TRPC antagonists contained in the preservation solution of the present invention are as follows:
(1) A combination of at least one TRPM agonist and at least one selected from the group consisting of TRPC antagonists, TRPA agonists, and TRPV agonists.
(2) A combination of at least one TRPM agonist and at least one selected from the group consisting of TRPC antagonists and TRPA agonists.
(3) A combination of at least one TRPM agonist and at least one TRPC antagonist.
本発明の保存液に含まれる、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択されるより好ましい二種以上の組合せとしては以下の通りである：
（ｉ）イシリンと、２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）との組合せ、
（ｉｉ）イシリンと、Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩（Ｍ０８４塩酸塩）との組合せ、
（ｉｉｉ）イシリンと、カプサイシン（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）との組合せ。
More preferred combinations of two or more selected from the group consisting of TRP channel agonists and TRP channel TRPC antagonists contained in the preservation solution of the present invention are as follows:
(I) Combination of icillin and 2-aminoethoxydiphenylborane (2-APB),
(Ii) Combination of icillin and N-butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride (M084 hydrochloride),
(Iii) A combination of icillin and capsaicin.
本発明の保存液は、一種以上のＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／または一種以上のＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストに加えて、両親媒性高分子をさらに含むことが好ましい。両親媒性高分子は、疎水性基および親水性基を有する高分子であれば特に限定されないが、多糖類または蛋白質が好ましく、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キチン、キトサン、または不凍蛋白質がより好ましく、ヒドロキシプロピルセルロースおよび／またはヒドロキシエチルスターチがさらに好ましく、ヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。これらの両親媒性高分子は、イシリンと共に用いて本発明の保存液とすることにより、より細胞等の保存効果、また細胞等の増殖能維持効果、生存率が高まる。 The preservation solution of the present invention preferably further contains an amphipathic polymer in addition to one or more TRP channel agonists and / or one or more TRP channel TRPC antagonists. The amphoteric polymer is not particularly limited as long as it has a hydrophobic group and a hydrophilic group, but a polysaccharide or a protein is preferable, and hydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl starch, dextran, hyaluronic acid, alginic acid, chitin, etc. Chitin, or antifreeze protein, is more preferred, hydroxypropyl cellulose and / or hydroxyethyl starch is even more preferred, and hydroxypropyl cellulose is particularly preferred. By using these amphipathic polymers together with icillin to prepare the preservation solution of the present invention, the preservation effect of cells and the like, the growth ability maintenance effect of cells and the like, and the survival rate are further enhanced.
本発明の保存液は、抗酸化剤を更に含んでもよい。抗酸化剤としてはアスコルビン酸、グルタチオン、Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ、ビタミンＥ、ユビキノン、カロチノイド、α−トコフェノール、β‐カロテン、ポリフェノールが挙げられ、その他、日本薬局法に抗酸化機能を保持する記述がある既存の抗酸化剤より選択される一種または二種以上の混合物を併用して添加することもできる。 The preservation solution of the present invention may further contain an antioxidant. Antioxidants include ascorbic acid, glutathione, Allopurinol, vitamin E, ubiquinone, carotenoids, α-tocophenol, β-carotene, polyphenols, and other existing descriptions in the Japanese Pharmacy Law that retain antioxidant function. One or a mixture of two or more selected from antioxidants can also be added in combination.
本発明の保存液は、細胞、組織、または器官用の保存液として用いられる。細胞、組織、または器官は、特に限定されず、微生物、細菌、動物、植物などのいずれの細胞、組織、または器官であってもよい。本発明においては、細胞、組織、または器官は、動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。本発明における動物の細胞、組織、または器官としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、どのような形式のものであってもよい。 The preservation solution of the present invention is used as a preservation solution for cells, tissues, or organs. The cell, tissue, or organ is not particularly limited, and may be any cell, tissue, or organ such as a microorganism, a bacterium, an animal, or a plant. In the present invention, the cells, tissues, or organs are preferably of animal origin, more preferably of human origin. The animal cells, tissues, or organs in the present invention include cells that have been established as cultured cells, non-established normal cells obtained from biological tissues, and transformed cells obtained by genetic engineering techniques. It may be of the form.
本発明の保存液の好ましい態様によれば、細胞、組織、または器官用の冷蔵保存液である。本発明において、冷蔵保存とは、凍らない程度に低温に冷却して保存することを意味し、好ましくは１０℃以下であり、より好ましくは０〜８℃であり、さらに好ましくは３〜５℃である。 According to a preferred embodiment of the preservation solution of the present invention, it is a refrigerated preservation solution for cells, tissues, or organs. In the present invention, refrigerated storage means storing by cooling to a low temperature so as not to freeze, preferably 10 ° C. or lower, more preferably 0 to 8 ° C., still more preferably 3 to 5 ° C. Is.
本発明の保存液は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが０．１〜１０００μＭ含まれ、より好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが０．５〜２００μＭ含まれ、さらに好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが１０〜２００μＭ含まれ、特に好ましくは、保存液中にＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストが２０〜１５０μＭ含まれる。 The preservation solution of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited, but preferably, the preservation solution contains 0.1 to 1000 μM of an agonist of the TRP channel and / or an antagonist of TRPC of the TRP channel. More preferably, the preservation solution contains 0.5 to 200 μM of an agonist of TRP channel and / or an antagonist of TRPC of TRP channel, and more preferably, an agonist of TRP channel and / or an antagonist of TRP channel is contained in the preservation solution. It contains 10 to 200 μM of TRPC antagonists, and particularly preferably 20 to 150 μM of TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists in the preservation solution.
本発明の保存液は、細胞、組織、または器官用の市販の培地へ、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）、保存液としてもよいが、無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、脂質、タンパク質、ペプチド、血清などと共に、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）作成したものを本発明の保存液とし、この保存液を市販の培地へ加えて用いてもよい。また、保存液としての含有成分（緩衝剤、抗生物質、抗菌剤、抗酸化剤、血清、糖類、脂質、ビタミン、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ｐＨ指示薬、キレート剤、浸透圧調整剤）を最適化したものにＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを加えて（好ましくは、更に両親媒性高分子を加えて）保存液として用いてもよい。 The preservation solution of the present invention is a commercially available medium for cells, tissues, or organs to which an agonist of TRP channel and / or an antagonist of TRPC of TRP channel is added (preferably, an amphipathic polymer is further added). , TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists, along with inorganic salts, carbohydrates, amino acids, vitamins, fatty acids, lipids, proteins, peptides, serum, etc. (preferably further). The prepared solution (by adding an amphoteric polymer) may be used as the preservation solution of the present invention, and this preservation solution may be added to a commercially available medium. In addition, the components contained as a preservation solution (buffers, antibiotics, antibacterial agents, antioxidants, serum, sugars, lipids, vitamins, proteins, peptides, amino acids, pH indicators, chelating agents, osmotic pressure regulators) are optimized. An agonist of the TRP channel and / or an antagonist of the TRPC of the TRP channel may be added to the prepared solution (preferably, an amphoteric polymer is further added) and used as a preservation solution.
保存対象の細胞に関しては接着状態、懸濁液状態でもよく、また組織、器官に関してはシート、スフェロイドでもよく、血管または血管様組織を含むものに関しては保存液を灌流させて用いてもよい。 The cells to be preserved may be in an adherent state or a suspension state, tissues and organs may be sheets or spheroids, and those containing blood vessels or blood vessel-like tissues may be used by perfusing a preservation solution.
本発明の別の態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを溶液に加える工程を含む、細胞、組織または器官用保存液の製造方法が提供される。ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニスト等は、上記の本発明の保存液と同じであってもよく、更に両親媒性高分子を加える工程を含んでいてもよい。 According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a preservation solution for cells, tissues or organs, which comprises adding a TRP channel agonist and / or a TRP channel TRPC antagonist to a solution. The TRP channel agonist and / or the TRP channel TRPC antagonist and the like may be the same as the above-mentioned preservation solution of the present invention, and may further include a step of adding an amphipathic polymer.
本発明の別の態様によれば、ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストを含む溶液を、細胞、組織または器官に加えることを特徴とする、細胞、組織または器官の保存方法（好ましくは、冷蔵保存方法）が提供される。ＴＲＰチャネルのアゴニストおよび／またはＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニスト等は、上記の本発明の保存液と同じであってもよく、更に両親媒性高分子を加える工程を含んでいてもよい。 According to another aspect of the present invention, a method for preserving cells, tissues or organs, characterized in that a solution containing an agonist of the TRP channel and / or an antagonist of TRPC of the TRP channel is added to the cell, tissue or organ. Preferably, a refrigerated storage method) is provided. The TRP channel agonist and / or the TRP channel TRPC antagonist and the like may be the same as the above-mentioned preservation solution of the present invention, and may further include a step of adding an amphipathic polymer.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
試験例１：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞冷蔵保存安定性評価１
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であるイシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−ＡＰＢ（富士フィルム和光純薬株式会社製）、ｌ−メントール（富士フィルム和光純薬株式会社製）、ポリゴジアール（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−［［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］安息香酸（Ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｍ０８４塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、（３β）−３−（スルホオキシ）−プレグン−５−エン−２０−オン ナトリウム塩（硫酸プレグネノロンナトリウム塩）（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＷＳ１２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、またはカプサイシン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれる本発明の各種ＴＲＰチャネル作用物質の濃度は図１に記載の通り（１００μＭまたは５０μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
Test Example 1: Evaluation of cell refrigeration storage stability by addition of TRP channel agonist of the present invention 1
(1) SH-SY5Y cells (origin: human neuroblastoma) were counted to a concentration of 4 × 10 3 cell / well, and 100 μl was seeded in each well of a 96-well microplate.
(2) This 96-well microplate was pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours. The preculture was performed on EMEM medium (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (Sigma) containing 15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM. This was done in 50/50 mixed medium.
(3) The mixed medium of (2) is used as the TRP channel agonist of the present invention, isylin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2-APB (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), l-menthol ( Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Polygodial (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2-[[3- (Trifluoromethyl) phenyl] amino] benzoic acid (Fluphenamic acid) (Tocris Bioscience), M084 hydrochloride (manufactured by Tocris Bioscience), (3β) -3- (sulfooxy) -5-en-20-one sodium salt (pregnenolone sodium sulfate) (manufactured by Tocris Bioscience), WS12 (manufactured by Tocris Bioscience) ) Or Capsaicin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was replaced with 100 μl of a preservative solution added to the mixed medium. The concentration of various TRP channel agonists of the present invention contained in the preservation solution was adjusted as shown in FIG. 1 (100 μM or 50 μM). The storage solution containing no TRP channel agonist of the present invention was used as a control (Ctr).
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
Storage for 0 h (4) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate buffered saline, Phosphate buffered saline), cell culture medium (15% bovine fetal serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / 50/50 mixed medium of F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing amino acids was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(5) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(6) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(7) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図１に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
After storage for 96 hours (8), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(9) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate Buffered Salts) to add cell culture medium (15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM). 100 μl of EMEM medium (50/50 mixed medium of DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(10) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(11) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(12) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
The above results are shown in FIG. 1 (the vertical axis of the graph is a relative value when the absorbance of the control stored at 0 h is 100).
図１の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であればいずれの物質であっても、また１００μＭおよび５０μＭのいずれの濃度であっても、コントロールに比べて吸光度（相対値）が高くなり、細胞の生存率が高いことが分かった。
また、本発明のＴＲＰチャネル作用物質ではないが、カルシウムチャネル阻害剤として知られるＹＭ−５８４８３（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、ＲＯＣＫインヒビターとして知られるＹ２７６３２（富士フィルム和光純薬株式会社製）とについて、本発明のＴＲＰチャネル作用物質と同様に、これらの物質を前培養後に加えて、吸光度を測定した（データには示さず）。その結果、ＹＭ−５８４８３およびＹ２７６３２はコントロールとほぼ同程度の吸光度（相対値）を示し、コントロールとほぼ同程度の細胞の生存率であることが分かった。
From the results shown in FIG. 1, the absorbance (relative value) was higher than that of the control regardless of any substance as long as it was the TRP channel agonist of the present invention, and at any concentration of 100 μM or 50 μM. It was found that the cell viability was high.
Further, YM-58483 (manufactured by Sigma-Aldrich), which is not a TRP channel agonist of the present invention but is known as a calcium channel inhibitor, and Y27632 (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) known as a ROCK inhibitor. , These substances were added after preculture and the absorbance was measured (not shown in the data), similar to the TRP channel agonists of the present invention. As a result, it was found that YM-58483 and Y27632 showed almost the same absorbance (relative value) as the control, and the cell viability was almost the same as that of the control.
試験例２：本発明のＴＲＰチャネル作用物質及び両親媒性高分子添加による細胞の冷蔵保存安定性評価２
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）（富士フィルム和光純薬株式会社製）およびヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（セルニー：日本曹達株式会社製）を組み合わせて、または単独で混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンおよびヒドロキシプロピルセルロースの濃度は図２に記載の通り（イシリン：１２μＭまたは０．６μＭ、ＨＰＣ：５０ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬ）に調製した。イシリンおよびヒドロキシプロピルセルロースを含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
Test Example 2: Evaluation of refrigerated storage stability of cells by adding TRP channel agonist and amphipathic polymer of the present invention 2
(1) SH-SY5Y cells (origin: human neuroblastoma) were counted to a concentration of 4 × 10 3 cell / well, and 100 μl was seeded in each well of a 96-well microplate.
(2) This 96-well microplate was pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours. The preculture was performed on EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing 15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM. It was carried out in 50/50 mixed medium.
(3) The mixed medium of (2) is a mixed medium in combination with Icilin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and hydroxypropyl cellulose (HPC) (Selney: manufactured by Nippon Soda Co., Ltd.) or alone. It was replaced with 100 μl of the preservative solution added to. The concentrations of icillin and hydroxypropyl cellulose contained in the preservation solution were prepared as shown in FIG. 2 (icillin: 12 μM or 0.6 μM, HPC: 50 mg / mL or 10 mg / mL). A preservative solution free of icillin and hydroxypropyl cellulose was used as control (Ctr).
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
Storage for 0 h (4) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate buffered saline, Phosphate buffered saline), cell culture medium (15% bovine fetal serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / 50/50 mixed medium of F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing amino acids was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(5) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(6) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(7) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図２に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
After storage for 96 hours (8), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(9) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate Buffered Salts) to add cell culture medium (15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM). 100 μl of EMEM medium (50/50 mixed medium of DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(10) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(11) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(12) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
The above results are shown in FIG. 2 (the vertical axis of the graph is a relative value when the absorbance of the control stored at 0 h is 100).
図２の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）を単独で用いた場合でもコントロールに比べて、吸光度（相対値）が高くなり細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かるが、イシリンと、ヒドロキシプロピルセルロースとを組み合わせた場合の方が、吸光度（相対値）がより高くなり、細胞生存率がより高くなることが分かった。 From the results of FIG. 2, it can be seen that even when the TRP channel agonist (icirin) of the present invention is used alone, the absorbance (relative value) is higher and the survival rate of the cells after refrigerated storage is higher than that of the control. , Icilin and hydroxypropyl cellulose were found to have higher absorbance (relative value) and higher cell viability.
試験例３：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞の冷蔵保存安定性評価３
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質であるイシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）、２−ＡＰＢ（富士フィルム和光純薬株式会社製）、Ｍ０８４塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、およびカプサイシン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を図３に記載の通りに単独で、または組み合わせて混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれる本発明のＴＲＰチャネル作用物質の濃度は図３に記載の通り（イシリン：１２μＭ、２−ＡＰＢ：４０μＭ、Ｍ０８４塩酸塩：８０μＭ、カプサイシン：８０μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
Test Example 3: Evaluation of refrigerated storage stability of cells by addition of TRP channel agonist of the present invention 3
(1) SH-SY5Y cells (origin: human neuroblastoma) were counted to a concentration of 4 × 10 3 cell / well, and 100 μl was seeded in each well of a 96-well microplate.
(2) This 96-well microplate was pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours. The preculture was performed on EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing 15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM. It was carried out in 50/50 mixed medium.
(3) The mixed medium of (2) is mixed with icirin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2-APB (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), M084 hydrochloride (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Tocris Bioscience (manufactured by Tocris Bioscience) and Capsaicin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were replaced with 100 μl of a preservative solution added to the mixed medium alone or in combination as shown in FIG. The concentration of the TRP channel agonist of the present invention contained in the preservation solution was adjusted as shown in FIG. 3 (icillin: 12 μM, 2-APB: 40 μM, M084 hydrochloride: 80 μM, capsaicin: 80 μM). The storage solution containing no TRP channel agonist of the present invention was used as a control (Ctr).
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
Storage for 0 h (4) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate buffered saline, Phosphate buffered saline), cell culture medium (15% bovine fetal serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / 50/50 mixed medium of F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing amino acids was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(5) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(6) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(7) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図３に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
After storage for 96 hours (8), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(9) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate Buffered Salts) to add cell culture medium (15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM). 100 μl of EMEM medium (50/50 mixed medium of DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(10) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(11) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(12) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
The above results are shown in FIG. 3 (the vertical axis of the graph is a relative value when the absorbance of the control stored at 0 h is 100).
図３の結果から、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を単独で用いた場合であっても、組み合わせて用いた場合であっても、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かった。また、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を図３のように組み合わせて用いた場合の方が、単独で用いるよりも吸光度（相対値）がより高くなり、細胞の生存率がより高いことが分かった。 From the results of FIG. 3, the absorbance of the TRP channel agonist of the present invention, whether used alone or in combination, is higher than that without the addition of the TRP channel agonist of the present invention. It was found that the (relative value) was high and the survival rate of the cells after refrigeration storage was high. It was also found that when the TRP channel agonists of the present invention were used in combination as shown in FIG. 3, the absorbance (relative value) was higher and the cell viability was higher than when they were used alone. ..
試験例４：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による細胞の冷蔵保存安定性評価４
（１）上記ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とは異なるＣａｃｏ−２細胞（由来：ヒト結腸癌）を、８×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンの濃度は図４に記載の通り（イシリン：１２μＭまたは６μＭ）に調製した。本発明のＴＲＰチャネル作用物質を含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
Test Example 4: Evaluation of refrigerated storage stability of cells by addition of TRP channel agonist of the present invention 4
(1) Caco-2 cells (origin: human colon cancer) different from the SH-SY5Y cells were counted so as to have a concentration of 8 × 10 3 cell / well, and 100 μl was added to each well of the 96-well microplate. Sowed.
(2) This 96-well microplate was pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours. Preculture was performed on EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM.
(3) The mixed medium of (2) was replaced with 100 μl of a preservation solution containing icillin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in the mixed medium. The concentration of icillin contained in the preservation solution was adjusted as shown in FIG. 4 (icillin: 12 μM or 6 μM). The storage solution containing no TRP channel agonist of the present invention was used as a control (Ctr).
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製））を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
Storage for 0 h (4) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate buffered saline, Phosphate buffered saline), cell culture medium (10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) containing amino acids was added, and the cells were cultured in a carbon dioxide gas incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(5) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(6) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(7) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
９６ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１０％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製））を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図４に示す（グラフの縦軸は、０ｈ保存のコントロールの吸光度を１００としたときの相対値である）。
After storage for 96 hours (8), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(9) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate Buffered Salts) to add cell culture medium (10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) containing the medium was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(10) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(11) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(12) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
The above results are shown in FIG. 4 (the vertical axis of the graph is a relative value when the absorbance of the control stored at 0 h is 100).
図４の結果から、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とは異なるＣａｃｏ−２細胞を用いた場合であっても、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）を用いた場合には、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の冷蔵保存後の生存率が高いことが分かった。すなわち、本発明のＴＲＰチャネル作用物質の効果は、特定の細胞に依存しないことが分かった。 From the results shown in FIG. 4, even when Caco-2 cells different from SH-SY5Y cells were used, when the TRP channel agonist (icirin) of the present invention was used, the TRP channel agonist of the present invention was used. It was found that the absorbance (relative value) was higher and the survival rate of the cells after cold storage was higher than that without the addition of. That is, it was found that the effect of the TRP channel agonist of the present invention does not depend on a specific cell.
試験例５：本発明のＴＲＰチャネル作用物質添加による冷蔵保存後の細胞増殖能の評価
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（由来：ヒト神経芽細胞腫）を、４×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度になるように計数し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ播いた。
（２）この９６穴マイクロプレートを炭酸ガスインキュベーター内で７２時間前培養した。前培養は、１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地で行った。
（３）（２）の混合培地を、イシリン（富士フィルム和光純薬株式会社製）を混合培地に加えた保存液１００μｌと交換した。保存液に含まれるイシリンの濃度は図５に記載の通り（イシリン：１２μＭ、６μＭ、または０．６μＭ）に調製した。イシリンを含まない保存液をコントロール（Ｃｔｒ）とした。
Test Example 5: Evaluation of cell proliferation ability after refrigerated storage by adding TRP channel agonist of the present invention (1) SH-SY5Y cells (origin: human neuroblastoma) to a concentration of 4 × 10 3 cell / well 100 μl was sown in each well of the 96-well microplate.
(2) This 96-well microplate was pre-cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours. The preculture was performed on EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing 15% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM. It was carried out in 50/50 mixed medium.
(3) The mixed medium of (2) was replaced with 100 μl of a preservation solution containing icillin (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in the mixed medium. The concentration of icillin contained in the preservation solution was adjusted as shown in FIG. 5 (icillin: 12 μM, 6 μM, or 0.6 μM). A preservative solution containing no icillin was used as a control (Ctr).
０ｈ保存
（４）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで６０分間培養した。
（５）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（６）炭酸ガスインキュベーター内で３時間呈色反応を行った。
（７）マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
Storage for 0 h (4) Wash twice with 100 μl of PBS (Phosphate buffered saline, Phosphate buffered saline), cell culture medium (15% bovine fetal serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential for MEM). 100 μl of EMEM medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / 50/50 mixed medium of F-12 Ham medium (manufactured by Sigma) containing amino acids was added, and the cells were cultured in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator for 60 minutes.
(5) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well.
(6) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 3 hours.
(7) Using a microplate reader, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
４８ｈ保存後
（８）６０分間３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。
（９）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）１００μｌで２回洗浄して、細胞培養培地（１５％牛胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、およびＭＥＭ用非必須アミノ酸を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）／Ｆ−１２ Ｈａｍ培地（Ｓｉｇｍａ社製）の５０／５０の混合培地）を１００μｌ加え、３７℃炭酸ガスインキュベーターで回復培養前サンプルとして６０分間培養をし、２４時間回復培養後サンプルとして２４時間回復培養を行った。
（１０）生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）溶液を回復培養前サンプルと、２４時間回復培養後サンプルとのそれぞれの各ウェルに１０μｌずつ添加した。
（１１）炭酸ガスインキュベーター内で４時間呈色反応を行った。
（１２）マイクロプレートリーダーを用い、回復培養前サンプル（回復培養前）と、２４時間回復培養後サンプル（２４時間の回復培養後）の細胞について、４５０ｎｍ（参照波長：６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。マイクロプレートリーダーはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。
上記の結果を図５に示す（グラフの縦軸は、各サンプルにおける回復培養前のサンプル（４８ｈ保存時）の吸光度を１００としたときの２４時間回復培養後のサンプルの相対値である）。
After storage for 48 hours (8), the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 60 minutes.
(9) Wash twice with 100 μl of PBS (Phospate buffered salts) to add cell culture medium (15% bovine fetal serum, 1% penicillin / streptomycin, 2 mM glutamine, and non-essential amino acids for MEM). Add 100 μl of EMEM medium (50/50 mixed medium of DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) / F-12 Ham medium (manufactured by Sigma), and incubate for 60 minutes as a sample before recovery culture in a 37 ° C. carbon dioxide gas incubator. Then, after the recovery culture for 24 hours, the recovery culture was performed for 24 hours as a sample.
(10) 10 μl of a solution of a reagent for measuring the number of living cells SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was added to each well of the sample before recovery culture and the sample after recovery culture for 24 hours.
(11) A color reaction was carried out in a carbon dioxide incubator for 4 hours.
(12) Using a microplate reader, the absorbance of 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured for the cells of the pre-recovery culture sample (before recovery culture) and the 24-hour recovery culture sample (after 24-hour recovery culture). .. As the microplate reader, a SpectraMax Plus 384 Microplate Reader (manufactured by Molecular Devices) was used.
The above results are shown in FIG. 5 (the vertical axis of the graph is the relative value of the sample after 24-hour recovery culture when the absorbance of the sample before recovery culture (when stored for 48 hours) in each sample is 100).
図５の結果によれば、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を用いた場合、２４時間の回復培養後で、イシリンを添加した場合の方が、本発明のＴＲＰチャネル作用物質を添加しないものに比べて、吸光度（相対値）が高くなり、細胞の増殖能がより保存されていることが分かる。 According to the results of FIG. 5, when the TRP channel agonist of the present invention was used, the case where icylin was added after the recovery culture for 24 hours was better than the case where the TRP channel agonist of the present invention was not added. Therefore, it can be seen that the absorbance (relative value) is increased and the proliferative ability of the cells is more conserved.
一方、図５には示していないが、市販品であるＲＯＫＥＰＩＥ（商標）（Ｓｕｌｆａｔｅｑ Ｂ．Ｖ．社製）、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）、またはＣＰＳ（商標）−１（株式会社細胞科学研究所製）を、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）の代わりに添加して上記の回復能の評価を行った。これらの市販品では、２４時間の回復培養後で、回復培養前と比べて吸光度はほとんど上昇せずに、コントロールと同様に細胞の増殖が止まってしまうことが分かり、本発明のＴＲＰチャネル作用物質（イシリン）の方が細胞の増殖能の保存の点で優れた効果を示すことが分かった。 On the other hand, although not shown in FIG. 5, commercially available products such as ROKEPIE (trademark) (manufactured by Sulfateq VV), Hyperthermosol (trademark) (manufactured by BioLife Solutions), or CPS (trademark) -1 (manufactured by BioLife Solutions Co., Ltd.) (Manufactured by Cell Science Laboratory) was added in place of the TRP channel agonist (icirin) of the present invention, and the above-mentioned recovery ability was evaluated. It was found that in these commercially available products, after 24 hours of recovery culture, the absorbance was hardly increased as compared with that before recovery culture, and cell proliferation stopped as in the control, and the TRP channel agonist of the present invention was found. It was found that (icillin) was more effective in preserving the proliferative capacity of cells.
Claims (10)
ＴＲＰチャネルのアゴニストの二種以上、または
ＴＲＰチャネルのアゴニストおよびＴＲＰチャネルのＴＲＰＣのアンタゴニストからなる群から選択される二種以上
である、請求項１に記載の保存液。 TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists
The preservation solution according to claim 1, wherein two or more kinds of TRP channel agonists, or two or more kinds selected from the group consisting of TRP channel agonists and TRP channel TRPC antagonists.
イシリン、
１−［２−（４−メトキシフェニル）−２−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］エチル］−１Ｈ−イミダゾール、モノヒドロクロリド、
２−アミノエトキシジフェニルボラン、
ｌ−メントール、
ポリゴジアール、
Ｎ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン塩酸塩、
（１Ｒ＊，２Ｓ＊）−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−５−メチル−２−（１−メチルエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、および
カプサイシン
からなる群から選択される一種または二種以上である、請求項１に記載の保存液。 TRP channel agonists and / or TRP channel TRPC antagonists
Icilin,
1- [2- (4-Methoxyphenyl) -2- [3- (4-methoxyphenyl) propoxy] ethyl] -1H-imidazole, monohydrochloride,
2-Aminoethoxydiphenylborane,
l-menthol,
Polygoziar,
N-Butyl-1H-benzimidazol-2-amine hydrochloride,
(1R *, 2S *) -N- (4-methoxyphenyl) -5-methyl-2- (1-methylethyl) cyclohexanecarboxamide, and capsaicin, which is one or more selected from the group. Item 1. The storage solution according to item 1.
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