JP2020094925A - 品質評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞塊の発生の経緯によらず、細胞塊の品質をその場の細胞塊の状態に基づいて評価することが可能な品質評価方法を提供する。【解決手段】品質評価方法は、３００〜２０００ｎｍに含まれる波長を有する測定光を細胞塊に照射して、当該細胞塊内における複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報を取得する工程と、取得された複数の光強度情報のばらつきを特徴量として生成する工程と、生成された特徴量を指標として細胞塊の品質を評価する工程と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞塊の品質評価方法に関する。

特許文献１では、細胞塊の複層化の状態を確認することを目的として、細胞塊の時系列画像を取得して評価を行う構成が示されている。

国際公開第２０１０／１４３４２０号

一例として、細胞塊は、その発生の経緯によって２種類に分類することができる。１つは、細胞分裂によって細胞数が増え、その結果として複層化した細胞塊であり、もう１つは、細胞の凝集現象が利用されることによって複数の細胞が多層に積層された細胞塊である。凝集現象による細胞塊では、細胞塊の大きさや形状は、凝集させる細胞の数、配置等によって、人為的に決められ得る。そのため、凝集現象による細胞塊では、細胞分裂による細胞塊のように徐々に多層化するのではなく、一度のプロセスで大きな層数の細胞塊を作成することが可能である。

特許文献１に開示された細胞塊の評価方法は、上述の通り、細胞塊の時系列画像に基づいて評価を行っている。そのため、凝集現象による細胞塊のように、短時間で多層化する細胞塊の品質の評価には適さない場合がある。また、細胞分裂に基づく細胞塊であっても、すでに多層化した後の細胞塊の品質を評価する場合には、時系列画像の取得が困難である。

本発明は、細胞塊の発生の経緯によらず、細胞塊の品質をその場の細胞塊の状態に基づいて評価することが可能な品質評価方法を提供することを目的とする。

本発明の一形態に係る品質評価方法は、３００〜２０００ｎｍに含まれる波長を有する測定光を細胞塊に照射して、当該細胞塊内における複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報を取得する工程と、取得された複数の光強度情報のばらつきを特徴量として生成する工程と、生成された特徴量を指標として細胞塊の品質を評価する工程と、を備える。

本発明の一形態によれば、細胞塊の発生の経緯によらず、細胞塊の品質をその場の細胞塊の状態に基づいて評価することが可能な品質評価方法が提供される。

品質評価方法の工程を示す流れ図である。 品質評価装置の一例を示す概略構成図である。 ２次元センサによって取得された細胞塊の画像情報の一例である。 通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊の透過率の分散を示すグラフである。 変化の度合いを導出する過程を説明するための模式図である。 通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの変化の度合いの値を示すグラフである。 濃度生起行列を説明するための画像情報を示す図である。 濃度生起行列を示す模式図である。 通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれのＥｎｅｒｇｙを示すグラフである。 細胞塊の画像を２つに分割した一例について説明するための模式図である。 「領域における光強度情報」を用いて細胞塊を評価した結果を示すグラフである。 「領域における光強度情報」を用いて細胞塊を評価した結果を示すグラフである。 「領域における光強度情報」を用いて細胞塊を評価した結果を示すグラフである。 「領域における光強度情報」を用いて細胞塊を評価した結果を示すグラフである。 品質評価装置における細胞塊の保持手段の他の例を示す概略図である。 品質評価装置における細胞塊の保持手段の他の例を示す概略図である。

［本願発明の実施形態の説明］
最初に本願発明の実施態様を列記して説明する。

本発明の一形態に係る品質評価方法は、３００〜２０００ｎｍに含まれる波長を有する測定光を細胞塊に照射して、当該細胞塊内における複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報を取得する工程と、取得された複数の光強度情報のばらつきを特徴量として生成する工程と、生成された特徴量を指標として細胞塊の品質を評価する工程と、を備える。

上記の品質評価方法では、細胞塊内の複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報のばらつきによって特徴量が生成される。そのため、特徴量には、細胞塊内の隣接する細胞同士の関係、離れた位置にある細胞同士の関係等が反映され得る。細胞塊の品質は、例えば細胞同士の凝集能力の高さに関連する指標であるため、細胞同士の関係が反映された特徴量を指標とすることによって、細胞塊の発生の経緯によらず、細胞塊の品質をその場の細胞塊の状態に基づいて評価することが可能となる。

生成する工程では、複数の光強度情報の分散度合いを特徴量として生成してもよい。この構成では、複数の光強度情報の分散度合いを特徴量とすることによって、光強度情報のばらつきを簡便に導出することができる。

生成する工程では、複数の測定位置のそれぞれにおける周辺の測定位置の光強度情報との変化の度合いを特徴量として生成してもよい。この構成では、細胞塊内において互いに近接した位置に存在する細胞同士の関係が特徴量に反映されやすくなる。

生成する工程では、細胞塊内における複数の光強度情報の不均一性の度合いを特徴量として生成してもよい。光強度情報の不均一性の度合いとは、光強度情報の分布の局所性、変動性、相関性等を表す指標であり、光強度情報の分布のパターンや質感に相当する。この構成では、細胞塊内における細胞のお互いの位置関係による性質の違いが特徴量に反映されやすくなる。

生成する工程では、２以上に分割された細胞塊の領域ごとの光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つ同士の比較結果を特徴量として生成してもよい。この構成では、細胞塊内における領域ごとの細胞の状態を特徴量に反映させやすくなる。

［本願発明の実施形態の詳細］
本発明に係る品質評価方法の具体例を、以下に図面を参照しつつ説明する。なお、本発明はこれらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。

本実施形態に係る品質評価方法では、図１に示されるように、細胞塊内における複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報を取得し（ステップＳ１）、取得された複数の光強度情報のばらつきを特徴量として生成し（ステップＳ２）、生成された特徴量を用いて細胞塊の品質を評価する（ステップＳ３）。本明細書において細胞塊（スフェロイド：spheroid）とは、細胞の凝集現象によって複数の細胞が凝集した塊、又は、細胞分裂によって分裂した複数の細胞の塊であり、２次元状の塊、三次元状の塊など細胞のさまざまな形態を含むものである。一例として、細胞塊は、直径１０μｍ程度の細胞が１万個〜５万個程度凝集した塊であってよい。細胞塊に含まれる細胞とは、動物又はヒトから採取した幹細胞、動物又はヒトから採取した細胞を元に作製した幹細胞、或いは、幹細胞を分化した細胞で構成されている。一つの細胞塊には、複数の細胞種が混在する場合もある。また、細胞塊の「品質」とは、細胞塊の「活性」、「活性度」又は「活性機能」を示す。「活性」、「活性度」又は「活性機能」は、細胞系譜に関する能力、細胞の凝集能力、細胞塊の凝集能力、生体内での組織再生能力、生体内での安全性などに関連する指標である。なお、細胞系譜に関する能力とは、細胞の増殖などのライフサイクルを維持する能力、特定の組織細胞になる能力、細胞としての必要な機能を維持する能力などをいう。

まず、光強度情報を取得する品質評価装置の構成について説明する。図２は品質評価装置の一例を示す概略構成図である。品質評価装置１は、光源３及びレンズ４と、評価対象である細胞塊５を挟んで光源３及びレンズ４に対向する位置に配置される２次元センサ７、バンドパスフィルタ８及びレンズ９とを備えている。一例として、細胞塊５は、複数のウェル１５が２次元に配列されたマイクロプレート１３に収容されていてよい。この場合、品質評価装置１は、マイクロプレート１３が載置される載置台を有してもよい。細胞塊５は培地と共にマイクロプレート１３のウェル１５内に収容される。

光源３及びレンズ４は、マイクロプレート１３の一方の面（図示例では上面）に対面する位置に配置されている。光源３は、測定光Ｌ１を細胞塊５に向けて照射する。測定光Ｌ１は、例えば３００〜２０００ｎｍの波長範囲に含まれる波長を有する。一例の光源３はハロゲンランプであってよいが、光源の種類は特に限定されない。上述の通り、細胞塊５は、細胞の凝集塊である。そのため細胞塊５に入射した光は散乱しやすい。よって、測定光Ｌ１としては、細胞塊５による散乱が小さく、かつ培地による吸収が小さい波長である近赤外光を用いてもよい。具体的には８００〜１８５０ｎｍに含まれる波長範囲の測定光を用いてもよい。光源３から出力された測定光Ｌ１は、レンズ４を介して、マイクロプレート１３内に収容された細胞塊５を透過する。そして、測定光Ｌ１の一部が、透過光Ｌ２として出力される。レンズ４は、光源３からの測定光Ｌ１を集光する集光レンズ又はコリメートするコリメートレンズである。

２次元センサ（受光部）７は、細胞塊５内における複数の測定位置をそれぞれ透過した透過光Ｌ２を検出する。２次元センサ７は、受光面を備える。受光面には、複数の受光素子が２次元に配列されている。各受光素子は、光を受け、電気信号に変換する。２次元センサ７は、一例として、ＩｎＧａＡｓ、ＨｇＣｄＴｅ等の２次元素子を備えるカメラであってよい。例えば、２次元センサ７は、細胞塊５を透過した透過光Ｌ２によって形成される画像を取得する。すなわち、２次元センサ７によって取得される細胞塊５の画像情報は、細胞塊５内における位置ごとの透過光Ｌ２の強度情報を含む。以下の説明において、「画素」には、「位置」の意味が含まれ得る。

図３は２次元センサによって取得された細胞塊の画像情報の一例である。図３に示す画像情報には、測定光Ｌ１が細胞塊５に照射されたときの透過光Ｌ２の強度がグレースケールで反映されている。画像において、濃いグレーで示される部分は細胞塊５のなかで透過率が低い部分であり、薄いグレーで示される部分は細胞塊５のなかで透過率が高い部分である。

なお、図２に示すように、細胞塊５を透過した透過光Ｌ２は、レンズ９及びバンドパスフィルタ８を介して２次元センサ７に入射している。一形態では、レンズ９は対物レンズである。バンドパスフィルタ８は、透過光Ｌ２のうちの特定波長の光を透過し、２次元センサ７に入力する。なお、バンドパスフィルタ８がレンズ９と２次元センサ７との間に配置されている例を示しているが、バンドパスフィルタ８は光源３と２次元センサ７との間の任意の位置に設けられ得る。また、透過光Ｌ２のうちの特定波長だけでなく、複数の波長について別々に画像情報を取得したい場合には、バンドパスフィルタ８に代えて分光器を備えてもよい。２次元センサ７によって取得された透過光Ｌ２の強度を示す信号（すなわち画像情報）は、分析部１０に出力される。

分析部１０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）と、主記憶装置であるＲＡＭ（Random Access Memory）及びＲＯＭ（Read Only Memory）と、２次元センサ等の他の機器との間の通信を行う通信モジュールと、ハードディスク等の補助記憶装置等とのハードウェアを備えるコンピュータとして構成される。そして、これらの構成要素が動作することにより、分析部１０としての機能が発揮される。

分析部１０は、細胞塊５内における複数の測定位置ごとに光強度情報を取得する。光強度情報とは、細胞塊５に測定光Ｌ１を照射した際に取得される透過光強度、拡散反射光強度、及び蛍光強度、並びに、これらに基づいて得られる透過率及び吸光度を含む概念である。また、細胞塊５の同じ位置に対して複数の波長の測定光Ｌ１を用いて光強度情報が取得された場合、複数の波長における光強度情報を互いに組み合わせて得た情報も光強度情報に含まれる。例えば、複数の波長における透過光強度同士の差分なども光強度情報に含まれる。

一例として、分析部１０は、２次元センサ７から入力された信号に基づいて透過光強度を取得する。また、分析部１０では、細胞塊５に係る透過光強度の測定とは別に、細胞塊５がない状態で光源３からの測定光Ｌ１が２次元センサ７に入射することで得られる光強度を予め取得する。そして、分析部１０は、この光強度と細胞塊５に係る透過光強度とに基づいて、細胞塊５に由来する透過光Ｌ２の透過率を求めてもよい。

また、分析部１０は、位置ごとに取得された光強度情報のばらつきに基づいて特徴量を取得し、取得された特徴量を指標として細胞塊５の品質を評価する。評価結果は、分析部１０からモニタやプリンタ等の出力装置を介して出力され得る。光強度情報の「ばらつき」とは、細胞塊を特定の方向から観察した平面内における光強度情報の偏りの指標、細胞塊の特定断面での光強度情報の偏りの指標、又は、細胞塊を立体的に捉えたときの光強度情報の偏りの指標であってよい。そのため、ばらつきに基づく特徴量とは、細胞塊内の光強度情報における、分散度合い、変化の度合い、不均一性の度合い等であってよい。

以下、第１〜第５の例を挙げて、光強度情報のばらつきを特徴量として生成し、特徴量を指標として細胞塊の品質を評価可能であることについて説明する。なお、第１〜第５の例は品質評価方法の例示であり、本実施形態は第１〜第５の例に限定されない。

（第１の例）
第１の例では、細胞塊内における光強度情報のばらつきを示す特徴量として、光強度情報の分散（分散値）が用いられる。分散は、光強度情報の分散度合いを示す指標の一例である。この例では、まず、細胞塊の品質の評価基準が設定される。評価基準の設定には、通常条件で培養された通常の細胞塊と、活性度（品質の一例）が低下した細胞塊と、が用いられる。一例として、通常の細胞塊は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて２日間培養された細胞塊である。活性度が低下した細胞塊は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が５体積％添加されたＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。評価対象の細胞塊を構成する細胞は、ＮＨＤＦである。

評価基準を設定する場合、まず、品質評価装置１を用いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの光強度情報を取得する。一例として、光強度情報は、２次元センサによって生成される画像情報から取得される透過光の透過率である。

続いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれについて、画素ごとに取得された複数の透過率の分散が求められる。そして、求められた分散に基づいて、通常の細胞塊と活性度が低下した細胞塊との判別に用いられる評価基準としての分散の値を設定する。

図４は、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊の透過率の分散を示すグラフである。図４に示すように、通常の細胞塊は、活性度が低下した細胞塊に比べて、高い分散の値を有している。そのため、透過率の分散を用いることによって通常の細胞塊と活性度が低下した細胞塊とを判別することができる。図中、通常の細胞塊の分散のうちの最小値と活性度が低下した細胞塊の分散のうちの最大値との間に、評価基準としての分散を示す破線が例示されている。品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊の透過率の分散が取得される。そして、この透過率の分散と設定された評価基準とを比較することによって、細胞塊の品質が評価され得る。すなわち、細胞塊が評価基準よりも高い分散の値を有している場合、当該細胞塊の品質は通常の細胞塊と同等であると評価され得る。また、細胞塊が評価基準よりも低い分散の値を有している場合、当該細胞塊の品質は活性度が低下した細胞塊と同等であると評価され得る。なお、評価の確実性を高めるために、評価基準を任意に設定してよい。例えば、通常の細胞塊と同等の品質を有する細胞塊のみを確実に選択し、活性度が低下した細胞塊が含まれないようにするために、評価基準としての分散の値を図示の評価基準よりも高くしてもよい。

（第２の例）
第２の例では、細胞塊内における光強度情報のばらつきを示す特徴量として、光強度情報の変化の度合いが用いられる。光強度情報の変化の度合いとは、複数の測定位置のそれぞれにおける光強度情報と周辺の測定位置の光強度情報との差分又は微分に基づく値である。この例では、まず、細胞塊の品質の評価基準が設定される。評価基準の設定には、通常条件で培養された通常の細胞塊と、活性度が低下した細胞塊と、が用いられる。一例として、通常の細胞塊は、ＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。活性度が低下した細胞塊は、ＤＭＳＯが５体積％添加されたＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。本例において、評価対象の細胞塊を構成する細胞は、ＮＨＤＦである。

評価基準を設定する場合、まず、品質評価装置を用いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの光強度情報を取得する。一例として、光強度情報は、２次元センサによって生成される画像情報から取得される透過光の透過率である。

続いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれについて、透過率の変化の度合いを求める。そして、求められたそれぞれの透過率の変化の度合いに基づいて、通常の細胞塊と活性度が低下した細胞塊との判別に用いられる評価基準としての透過率の変化の度合いの値を設定する。

図５は、変化の度合いを導出する過程を説明するための模式図である。図では、２次元センサによって取得される画像情報の画素の一部が示されており、それぞれの画素にａ〜ｉの符号を割り当てている。一例として、任意の画素における透過率の変化の度合いとは、任意の画素の透過率とその周辺の他の画素の透過率との差分の絶対値の和として定義される。図示例では、任意の画素の透過率と任意の画素に隣接する他の画素の透過率との差分の絶対値の和が任意の画素における透過率の変化の度合いである。例えば、画素ｅにおける透過率の変化の度合いをＴとすると、Ｔは以下の式で与えられる。なお、Ｔ（ａ）〜Ｔ（ｉ）は画素ａ〜画素ｉにおける透過率をそれぞれ示す。
Ｔ＝｜Ｔ（ａ）−Ｔ（ｅ）｜＋｜Ｔ（ｂ）−Ｔ（ｅ）｜＋・・・＋｜Ｔ（ｈ）−Ｔ（ｅ）｜＋｜Ｔ（ｉ）−Ｔ（ｅ）｜

細胞塊内におけるすべての画素についての変化の度合いの総和が当該細胞塊の透過率の変化の度合いとして定義される。

図６は、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの変化の度合いの値を示すグラフである。図６に示すように、通常の細胞塊は、活性度が低下した細胞塊に比べて、高い変化の度合いの値を有している。そのため、透過率の変化の度合いの値を用いることによって通常の細胞塊と活性度が低下した細胞塊とを判別することができる。図中、通常の細胞塊の透過率の変化の度合いの値のうちの最小値と、活性度が低下した細胞塊の透過率の変化の度合いの値のうちの最大値との間に、評価基準としての変化の度合いの値を示す破線が例示されている。品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊の透過率の変化の度合いが取得される。そして、この透過率の変化の度合いの値を設定された評価基準と比較することによって、細胞塊の品質が評価され得る。すなわち、細胞塊が評価基準よりも高い透過率の変化の度合いの値を有している場合、当該細胞塊の品質は通常の細胞塊を同等であると評価され得る。また、細胞塊が評価基準よりも低い透過率の変化の度合いの値を有している場合、当該細胞塊の品質は活性度が低下した細胞塊を同等であると評価され得る。なお、評価の確実性を高めるために、評価基準を任意に設定してよい。例えば、通常の細胞塊と同等の品質を有する細胞塊のみを選択し、活性度が低下した細胞塊が含まれないようにするために、評価基準としての透過率の変化の度合いの値を図示の評価基準よりも高くしてもよい。

（第３の例）
第３の例では、細胞塊内における光強度情報のばらつきを示す特徴量として、光強度情報の不均一性の度合いが用いられる。一例とし、光強度情報の不均一性の度合いを反映する情報としてテクスチャ解析に基づく特徴量が利用される。テクスチャ解析に基づく特徴量は、画像情報の各画素によって示される形状、分布、密度、方向等の２次元分布の性質を包括的に反映している。すなわち、テクスチャ解析に基づく特徴量は、画像情報における各画素の情報の周期性、均一性、不均一性、局所性、変動性、相関性といった分布の特徴を反映し得る。本例では、テクスチャ解析の一例として濃度生起行列を用いた解析を用いるが、例えば構造的解析のような他の手法を用いてもよい。

この例では、まず、細胞塊の品質の評価基準が設定される。評価基準の設定には、通常条件で培養された通常の細胞塊と、活性度が低下した細胞塊と、が用いられる。一例として、通常の細胞塊は、ＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。活性度が低下した細胞塊は、ＤＭＳＯが５体積％添加されたＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。評価対象の細胞塊を構成する細胞は、例えばＮＨＤＦである。

評価基準を設定する場合、まず、品質評価装置を用いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの光強度情報を取得する。一例として、光強度情報は、２次元センサによって生成される画像情報から取得される透過光の透過率である。

続いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれについて、透過率が反映された濃度生起行列が求められる。図７は、濃度生起行列を生成するために加工された画像情報を説明するための模式図である。図８は、濃度生起行列を説明するための模式図である。図７の例では、細胞塊の画像情報の一部の画素が模式的に示されている。各画素には、画素ごとの透過率を複数段階（図示例では５段階）に正規化した値（グレーレベル）が関連づけられる。図８は、図７の例の画像情報に基づいて生成される濃度生起行列を示している。

濃度生起行列では、中心として捉えた画素のグレーレベルの値（ｉ）が行にとられており、中心として捉えた画素に隣接する画素の数が隣接する画素のグレーレベルの値（ｊ）ごとに集計されている。例えば、図７において、グレーレベルの値が５である画素は、右下の画素のみである。すなわち、中心として捉える画素のグレーレベルが５であるケース（すなわち、ｉ＝５の行）については、右下の画素のみに注目すればよい。ｉ＝５の行について説明すると、右下の画素に隣接する画素は、上、左上、左の３つの画素であり、これら３つの画素のグレーレベルには１，２，５が含まれていない。そのため、濃度生起行列のｉ＝５の行においてｊ＝１、２，５の列における値は０となっている。右下の画素に隣接する３画素のグレースケールは、４，３，４となっている。すなわち、グレースケールが３の画素が１つ、グレースケールが４の画素が２つである。そのため、濃度生起行列のｉ＝５の行においてｊ＝３，４の列における値はそれぞれ１，２となっている。

求められた濃度生起行列からテクスチャ解析に基づく特徴量が導出される。テクスチャ解析に基づく特徴量は、画像情報が表現する形状・分布・密度・方向といった２次元分布の性質を包括的に表現する。この特徴量は、「energy」、「uniformity」、「entropy」、「dissimilarity」、「contrast」、「homogeneity」、「inverse difference moment」、「maximumprobability」等によって表現され得る。一例として、濃度生起行列の各成分をＰ_ｉ，ｊで示すときの、「Entropy」、「Energy」、「Dissimilarity」、「Homogeneity」を導出する式を以下に示す。なお、本例では、一例としてＥｎｅｒｇｙを特徴量として利用する。

そして、求められたそれぞれのＥｎｅｒｇｙから、通常の細胞塊と、活性度が低下した細胞塊との判別に用いられる評価基準としてのＥｎｅｒｇｙの値を設定する。図９は、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれのＥｎｅｒｇｙを示すグラフである。図９に示すように、通常の細胞塊は、活性度が低下した細胞塊に比べて、低いＥｎｅｒｇｙの値を有している。そのため、Ｅｎｅｒｇｙを用いることによって通常の細胞塊と活性度が低下した細胞塊とを判別することができる。図中、通常の細胞塊のＥｎｅｒｇｙのうちの最大値と、活性度が低下した細胞塊のＥｎｅｒｇｙのうちの最小値との間に、評価基準としてのＥｎｅｒｇｙの値を示す破線が例示されている。

品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊の透過率のＥｎｅｒｇｙの値が取得される。そして、このＥｎｅｒｇｙの値を設定された評価基準と比較することによって、細胞塊の品質が評価され得る。すなわち、細胞塊が評価基準よりも低いＥｎｅｒｇｙを有している場合、当該細胞塊の品質は通常の細胞塊を同等であると評価され得る。また、細胞塊が評価基準よりも高いＥｎｅｒｇｙを有している場合、当該細胞塊の品質は活性度が低下した細胞塊を同等であると評価され得る。なお、評価の確実性を高めるために、評価基準を任意に設定してよい。例えば、通常の細胞塊と同等の品質を有する細胞塊のみを選択し、活性度が低下した細胞塊が含まれないようにするために、評価基準としてのＥｎｅｒｇｙの値を図示の評価基準よりも低くしてもよい。

（第４の例）
第４の例では、細胞塊内における光強度情報のばらつきを示す特徴量として、細胞塊の領域ごとの光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つ同士の比較結果が用いられる。以下、光強度情報を用いることで細胞塊の品質が評価できることについて説明する。この例では、通常条件で培養された通常の細胞塊と、活性度（すなわち品質）が低下した細胞塊と、が用いられる。一例として、通常の細胞塊は、ＤＭＥＭを用いて２日間培養された細胞塊である。活性度が低下した細胞塊は、培養条件などにより性状が異なる細胞が混入した細胞塊である。細胞塊を構成する細胞にはＮＨＤＦを用いた。

品質評価装置を用いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの光強度情報が取得される。一例として、光強度情報は、２次元センサによって生成される画像情報から取得される透過光の透過率である。

続いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれについて、画像を２つ以上の領域に分割する。図１０は、細胞塊の画像を２つに分割した一例について説明するための模式図である。図１０の例では、細胞塊内の領域を中央部（図中に破線で示す）と外周部とに分割している。図示例では、中央部は、細胞塊の直径の約半分程度の長さの辺によって構成される正方形である。なお、中央部は、細胞塊の半径の約半分程度の長さの半径を有する円形であってもよい。外周部は、細胞塊から中央部を除いた部分であってよい。

次に、中央部と外周部とで、それぞれの領域に含まれる画素の光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つを「領域における光強度情報」として求める。例えば、基本統計量は、領域内の光強度情報の全体としての特徴、傾向等を示す指標であり、一例として、平均値、最頻値、中央値等であってよい。

そして、求められたそれぞれの「領域における光強度情報」同士を比較し、比較結果を得る。この比較結果は、細胞塊内における「領域における光強度情報」のばらつきを示す。図１１は、「領域における光強度情報」として透過率の平均値を用いたときの、正常な細胞塊の比較結果を示す。図示の通り、正常な細胞塊では、外周部の透過率平均が中央部の透過率平均よりも小さい。図１２は、「領域における光強度情報」として透過率の平均値を用いたときの、活性度が低下した細胞塊の比較結果を示す。図示の通り、活性度が低下した細胞塊では、外周部の透過率平均が中央部の透過率平均よりも大きい。品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊における中央部の透過率平均と外周部の透過率平均との比較結果が取得される。そして、この比較結果に基づいて細胞塊の品質が評価され得る。すなわち、外周部の透過率平均が中央部の透過率平均よりも小さい場合には、品質の良い正常な細胞であると評価され得る。

図１３は、領域における光強度情報として透過率の分散を用いたときの、正常な細胞塊の比較結果を示す。図示の通り、正常な細胞塊では、外周部の透過率の分散が中央部の透過率の分散よりも大きい。図１４は、領域における光強度情報として透過率の分散を用いたときの、活性度が低下した細胞塊の比較結果を示す。図示の通り、活性度が低下した細胞塊では、外周部の透過率の分散が中央部の透過率の分散よりも小さい。品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊における中央部の透過率の分散と外周部の透過率の分散との比較結果が取得される。そして、この比較結果に基づいて細胞塊の品質が評価され得る。すなわち、外周部の透過率の分散が中央部の透過率の分散よりも大きい場合には、品質の良い正常な細胞であると評価され得る。

なお、図１１〜図１４の例では、平均値又は分散を用いて「領域における光強度情報」同士を比較しているが、「領域における光強度情報」同士を比較する際には、その他の基本統計量を用いてもよい。

（第５の例）
第５の例では、細胞塊内における光強度情報のばらつきを示す特徴量の複数の組み合わせに基づいて品質の評価が行われる。この例では、いわゆる機械学習によって品質の評価が行われる。一例では、複数の特徴量を説明変数とし、品質を目的変数とする回帰式が生成される。回帰式の生成では、変数の共線性の影響が最小化するように、例えばＬＡＳＳＯ回帰が用いられる。

この例では、通常条件で培養された通常の細胞塊と、活性度（すなわち品質）が低下した細胞塊と、が用いられる。一例として、通常の細胞塊は、ＤＭＥＭを用いて２〜４日間培養された細胞塊である。活性度が低下した細胞塊は、ＤＭＳＯが１体積％添加されたＤＭＥＭを用いて２〜４日間培養された細胞塊（サンプル１）、ＤＭＳＯが５体積％添加されたＤＭＥＭを用いて２〜４日間培養された細胞塊（サンプル２）、ＡＧ４９０が添加されたＤＭＥＭを用いて２〜４日間培養された細胞塊（サンプル３）、Rock Inhibitorが添加されたＤＭＥＭを用いて２〜４日間培養された細胞塊（サンプル４）、無血清培養によって２〜４日間培養された細胞塊（サンプル５）、及び、過継代の細胞を用いて２〜４日間培養された細胞塊（サンプル６）である。評価対象の細胞塊を構成する細胞にはＮＨＤＦを用いた。

品質評価装置を用いて、通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれの光強度情報が取得される。一例として、光強度情報は、２次元センサによって生成される画像情報から取得される透過光の透過率である。この例では、バンドパスフィルタに代えて分光器を用いることで、３００〜２０００ｎｍの波長範囲に含まれる６５種類の波長ごとに透過率を取得した。

通常の細胞塊、及び活性度が低下した細胞塊のそれぞれについて、各波長における画素ごとの透過率の分散を求める。この分散は、培養時間が２日経過した時点、３日経過した時点、及び４日経過した時点のそれぞれで取得した。これにより取得される特徴量の数は、培養時間が３通りであり、波長が６５通りであり、透過率が２通りに加工されているため、３×６５×２となる。

さらに、培養時間が２日経過した時点、３日経過した時点、及び４日経過した時点のそれぞれで透過率の変化度を求める。これにより取得される特徴量の数は、培養時間が３通りであり、波長が６５通りであるため、３×６５×１となる。透過率の変化度は、第３の例と同様に求められ得る。

さらに、培養時間が２日経過した時点、３日経過した時点、及び４日経過した時点のそれぞれでテクスチャ解析に基づく特徴量を求める。テクスチャ解析に基づく特徴量は、例えばＥｎｅｒｇｙであってよく、第４の例と同様に求められ得る。これにより取得される特徴量の数は、培養時間が３通りであり、波長が６５通りであるため、３×６５×１となる。

さらに、細胞塊の領域ごとの光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つを特徴量として求める。一例として、細胞塊を５つの領域に分割し、分割された領域ごとに透過率の分散を求める。細胞塊の画像情報は複数の方法によって分割され得る。一例として、細胞塊の中心を基準にして周方向に均等に５分割する方法と、細胞塊を縦方向に５分割する方法と、細胞塊を横方向に５分割する方法とによって、細胞塊の画像情報が分割されてよい。これにより取得される特徴量の数は、培養時間が３通りであり、波長が６５通りであり、５分割にする方法が３通りであり、透過率が２通りに加工されているため、３×６５×（５×３）×２となる。

上記のように求められた特徴量を説明変数とし、品質を目的変数とする回帰式が予め生成される。品質が判明していない細胞塊の品質を評価する場合、まず、当該細胞塊の透過率から画素ごとの透過率の分散、透過率の変化度、テクスチャ解析に基づく特徴量、及び、分割された領域ごとの光強度情報の特徴量、が取得される。そして、これらの特徴量が回帰式に当てはめられることによって、細胞塊の品質が評価され得る。一例として、上記のサンプル１〜６のそれぞれと通常の細胞塊との判別が可能である。

なお、複数種類の波長ごとに画像情報が取得される場合、波長間での光強度情報の組み合わせ（例えば差分、比）に基づいて、光強度情報のばらつきに関する特徴量を求めてもよい。

以上説明した品質評価方法では、細胞塊内の複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報のばらつきによって特徴量が生成される。そのため、特徴量には、細胞塊内の隣接する細胞同士の関係、離れた位置にある細胞同士の関係等が反映され得る。細胞塊の品質は、例えば細胞同士の凝集能力の高さに関連する指標であるため、細胞同士の関係が反映された特徴量を指標とすることによって、細胞塊の発生の経緯によらず、細胞塊の品質をその場の細胞塊の状態に基づいて評価することが可能となる。

また、複数の光強度情報の分散度合いを特徴量として生成した場合、光強度情報のばらつきを簡便に導出することができる。

また、複数の測定位置のそれぞれにおける周辺の測定位置の光強度情報との変化の度合いを特徴量として生成した場合、細胞塊内において互いに近接した位置に存在する細胞同士の関係が特徴量に反映されやすくなる。

また、細胞塊内における複数の光強度情報の不均一性の度合いを特徴量として生成した場合、細胞塊内において不均一に存在する細胞同士の関係が特徴量に反映されやすくなる。

また、２以上に分割された細胞塊の領域ごとの光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つ同士の比較結果を特徴量として生成した場合、細胞塊内における領域ごとの細胞の状態を特徴量に反映させやすくなる。

以上、本発明の実施の形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではない。例えば、実施形態の具体例として、第１〜第５の例を示したがこれに限定されない。すなわち、本発明の実施形態は、第１〜第５の例における互いの構成の置き換え、追加等がなされた形態も包含する。

また、マイクロプレートのウェルに収容された細胞塊の品質を評価する例を示したが、これに限定されない。図１５、図１６は、品質評価装置における細胞塊の保持手段の他の例を示す概略図である。例えば、図１５に示すように、吸着ピンセット２０によって保持された細胞塊５に測定光Ｌ１が照射されてもよい。また、図１６に示すように、不織布のようなシート体３０上に載置された細胞塊５に測定光Ｌ１が照射されてもよい。この場合、シート体３０は培養液を含んでいてもよい。図１５、図１６の例では、細胞塊５によって反射された反射光Ｌ３が入力される位置に２次元センサを配置し、２次元センサに反射光が入力されるようにしてもよい。このように、細胞塊５は、測定光Ｌ１が照射可能であり、且つ、透過光Ｌ２、反射光Ｌ３等が２次元センサによって受光可能であれば、どのように保持されていてもよく、例えばシャーレ内に保持されていてもよい。

また、上記実施形態では、互いの大きさが揃った細胞塊同士を評価する例を示したが、これに限定されない。例えば、互いの大きさが異なる細胞塊同士を評価する場合において、大きさと特徴量とに相関があるときには、細胞塊の大きさや測定点数で特徴量を補正してもよい。一例として、第２の例では、細胞塊内におけるすべての画素についての変化の度合いの平均を細胞塊の透過率の変化の度合いとして定義してもよい。

１…品質評価装置、３…光源、７…２次元センサ（受光部）、１０…分析部。

Claims (5)

1. ３００〜２０００ｎｍに含まれる波長を有する測定光を細胞塊に照射して、当該細胞塊内における複数の測定位置のそれぞれに対応する複数の光強度情報を取得する工程と、
   取得された前記複数の光強度情報のばらつきを特徴量として生成する工程と、
   生成された前記特徴量を指標として前記細胞塊の品質を評価する工程と、
   を備える、品質評価方法。
2. 前記生成する工程では、前記複数の光強度情報の分散度合いを前記特徴量として生成する、請求項１に記載の品質評価方法。
3. 前記生成する工程では、前記複数の測定位置のそれぞれにおける前記光強度情報と周辺の前記測定位置の前記光強度情報との変化の度合いを前記特徴量として生成する、請求項１に記載の品質評価方法。
4. 前記生成する工程では、前記細胞塊内における前記複数の光強度情報の不均一性の度合いを前記特徴量として生成する、請求項１に記載の品質評価方法。
5. 前記生成する工程では、前記細胞塊内において２以上に分割された領域ごとの前記光強度情報のばらつき及び基本統計量の少なくとも一つ同士の比較結果を前記特徴量として生成する、請求項１に記載の品質評価方法。