JP2019510743A

JP2019510743A - 痛風、ざ瘡及び糖尿病の予防又は治療のためのジメチルフマレート（ｄｍｆ）

Info

Publication number: JP2019510743A
Application number: JP2018542201A
Authority: JP
Inventors: ビーア，ハンズ−ディートマー; ガストキエヴィチ，マーサ; イー．フレンチ，ラース
Original assignee: ウニヴェルズィテートチューリッヒ
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2019-04-18
Also published as: US20190029987A1; BR112018016300A2; EP3413884A1; WO2017137576A1; AU2017216861A1

Abstract

痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、式（Ｉ）で特定される化合物、特にジメチルフマレート（トランス−１，２−エチレンジカルボン酸ジメチルエステル）が提供される。前記化合物を含む剤形及びそれを必要とする患者への前記化合物の投与を含む治療方法も提供される。【選択図】なし

Description

発明の背景
フマル酸ジメチル（ＤＭＦ、ＣＡＳ番号６２４−４９−７）は、乾癬及び多発性硬化症（ＭＳ）の治療薬として承認されている。

ＤＭＦは、ＮＲＦ２（核因子赤血球由来２関連因子２）活性化因子であることが知られている：それは、塩基性ロイシンジッパー転写因子ＮＲＦ２を活性化する。従って、一般的にＮＲＦ２標的遺伝子の発現は、ＤＭＦの治療効果の根拠となると推定されている。

他の既知のＮＲＦ２活性化剤には、スルフォラファン（ＳＦＮ）、第三級ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、ＣＤＤＯ−イミダゾリド及び１５−デオキシ−Ａ−１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄＰＧＪ２）が含まれる。しかしながら、ＮＲＦ２活性化因子の作用様式及びその基礎となる分子機構に関して、いくつかの矛盾した、あいまいな報告が存在する。論争の的となっている問題は次のように要約できる：

ＮＲＦ２及びその標的遺伝子は生体異物及び酸化ストレスからの細胞保護に関与している。したがって、それらの機能は、主に細胞保護及び抗アポトーシス性とみなされてきた。より最近、ＮＲＦ２は、インフラマソーム関連プロセスの調節に関与することが発見されている。インフラマソームはプロテアーゼカスパーゼ−１を活性化する多タンパク質複合体であり、これは順に炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−１β前駆体（ｐｒｏ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ｐｒｏＩＬ）−１β）及び−１８前駆体を活性化する。したがって、インフラマソームは、急性及び慢性の炎症及び炎症プロセスによって引き起こされる状態の両方において重要な役割を果たす。

ＮＲＦ２機能の喪失（ノックアウト、ノックダウン）は、インフラマソームの活性化を防ぎ、ＮＲＦ２標的遺伝子の発現がインフラマソームを活性化することを必要とすることを示す。一方、ＮＲＦ２活性化因子は、インフラマソーム活性化も予防し（これはＤＭＦについては示されていない）、これはＮＲＦ２標的遺伝子がインフラマソームの阻害に関与している可能性があることを示す。

ＮＲＦ２活性化因子は、ＮＲＦ２の安定化及び核への移行を誘導し、ＮＲＦ２標的遺伝子の発現を誘導する。しかしながら、最近、ＮＲＦ２活性化剤スルフォラファンによるインフラマソームの阻害は、ＮＲＦ２及びその標的遺伝子とは無関係であることが報告された。スルフォラファンの効果がＮＲＦ２とは無関係であれば、他のＮＲＦ２活性化剤もインフラマソーム関連疾患に有益な効果を有することは合理的に期待できない。

重要なことに、最近の結果はまた、ＭＳの治療におけるＤＭＦの効果がＮＲＦ２とは無関係であり、代わりにヒドロキシカルボン酸受容体２に依存することを示唆している。

これらの例は、インフラマソーム関連プロセスにおけるＮＲＦ２及びＮＲＦ２活性化剤の作用様式が非常に論争され、理解には程遠いことを示している。したがって、当業者は、ＮＲＦ２活性化剤の投与はインフラマソーム関連疾患において必ずしも有益であると考えられず、このような疾患の治療にＤＭＦを使用しないであろう。

現在、インターロイキン−１（ＩＬ−１）ブロッカーが、インフラマソーム関連疾患の治療に使用されている。代替でき、補完できる薬剤が非常に望ましいであろう。

本発明の根底にある問題は、インフラマソームの活性化により引き起こされる状態、特に痛風、ざ瘡及び糖尿病、より詳細には尋常性ざ瘡及び２型糖尿病を治療するための手段を提供することである。この問題は、独立請求項の主題によって解決される。

図１は、完全なインフラマソーム活性化のためにはＮｒｆ２発現が必要であるが、Ｎｒｆ２標的遺伝子はＮＬＲＰ３インフラマソーム調節に関与しないことを示す。（Ａ〜Ｃ）ヒト初代ケラチノサイト（ＨＰＫ）を示されるとおり特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした（ｓｃｒ：スクランブル、ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子（追加対照）、ｃ１：カスパーゼ−１（ｃａｓｐａｓｅ−１）、Ｎ２：Ｎｒｆ２）。（Ａ、Ｂ）３日後にＵＶＢを照射又は（Ｃ）モック（ｍｏｃｋ）処理し５時間後に回収した。インフラマソーム活性化は、示されるとおり（Ａ）上清中のＩＬ−１βのＥＬＩＳＡ測定、又は（Ｂ）ウェスタンブロットによって分析した。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）カスパーゼ１、Ｎｒｆ２又は対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後、モック処理されたＨＰＫのカスパーゼ−１発現及びＮｒｆ２／Ｋｅａｐ１複合体タンパク質の分析のためのウェスタンブロット。（Ｄ〜Ｆ）骨髄細胞及び対照マウス由来のＮｒｆ２の構成的に活性な（ｃａ）変異体を過剰発現するマウスから腹腔マクロファージを単離した。細胞は記載のとおり処理し（補足図１Ａ）、（Ｄ）ＥＬＩＳＡ又は（Ｅ）ウェスタンブロットによる上清中のＩＬ−１β測定によるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化について分析した。（Ｆ）Ｎｒｆ２標的遺伝子のスルフェレドキシン１（Ｓｒｘｎ１）、グルタメート−システインリガーゼ、修飾サブユニット（Ｇｃｌｍ）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（Ｇｓｔｐ１）の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｇ、Ｈ）ＨＰＫを、示されるタンパク質をコードするレンチウイルス構築物で形質導入した（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質；ｄｎＮｒｆ２：ドミナントネガティブＮｒｆ２、Ｋｅａｐ１と相互作用なし、転写活性化ドメインなし；ｃａＮｒｆ２：構成的に活性なＮｒｆ２、Ｋｅａｐ１結合ドメインなし；Ｎｒｆ２＿ＮＬＳ：核局在ドメインを欠損したＮｒｆ２；ｎｔ：形質導入しない）。形質導入された細胞は、抗生物質含有培地中で１日間培養することによって選択された。３日後にドキシサイクリンで発現を誘導した。（Ｇ）細胞にＵＶＢを照射し、５時間後に溶解物及び上清を回収し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットにより分析した。Ｎｒｆ２については、異なるエピトープを標的とする２つの異なる抗体を使用した。（Ｈ）ＨＰＫを採取し、示されるＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（Ａ〜Ｈ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ）エラーバーは、３回実施された代表的な実験の平均±ＳＤを表す。一元配置分散分析を行った。（Ｄ）エラーバーは、遺伝子型につき３匹のマウスを用いて行った代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。＊＊＊Ｐ≦０．００１。図１は、完全なインフラマソーム活性化のためにはＮｒｆ２発現が必要であるが、Ｎｒｆ２標的遺伝子はＮＬＲＰ３インフラマソーム調節に関与しないことを示す。（Ａ〜Ｃ）ヒト初代ケラチノサイト（ＨＰＫ）を示されるとおり特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした（ｓｃｒ：スクランブル、ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子（追加対照）、ｃ１：カスパーゼ−１（ｃａｓｐａｓｅ−１）、Ｎ２：Ｎｒｆ２）。（Ａ、Ｂ）３日後にＵＶＢを照射又は（Ｃ）モック（ｍｏｃｋ）処理し５時間後に回収した。インフラマソーム活性化は、示されるとおり（Ａ）上清中のＩＬ−１βのＥＬＩＳＡ測定、又は（Ｂ）ウェスタンブロットによって分析した。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）カスパーゼ１、Ｎｒｆ２又は対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後、モック処理されたＨＰＫのカスパーゼ−１発現及びＮｒｆ２／Ｋｅａｐ１複合体タンパク質の分析のためのウェスタンブロット。（Ｄ〜Ｆ）骨髄細胞及び対照マウス由来のＮｒｆ２の構成的に活性な（ｃａ）変異体を過剰発現するマウスから腹腔マクロファージを単離した。細胞は記載のとおり処理し（補足図１Ａ）、（Ｄ）ＥＬＩＳＡ又は（Ｅ）ウェスタンブロットによる上清中のＩＬ−１β測定によるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化について分析した。（Ｆ）Ｎｒｆ２標的遺伝子のスルフェレドキシン１（Ｓｒｘｎ１）、グルタメート−システインリガーゼ、修飾サブユニット（Ｇｃｌｍ）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（Ｇｓｔｐ１）の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｇ、Ｈ）ＨＰＫを、示されるタンパク質をコードするレンチウイルス構築物で形質導入した（ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質；ｄｎＮｒｆ２：ドミナントネガティブＮｒｆ２、Ｋｅａｐ１と相互作用なし、転写活性化ドメインなし；ｃａＮｒｆ２：構成的に活性なＮｒｆ２、Ｋｅａｐ１結合ドメインなし；Ｎｒｆ２＿ＮＬＳ：核局在ドメインを欠損したＮｒｆ２；ｎｔ：形質導入しない）。形質導入された細胞は、抗生物質含有培地中で１日間培養することによって選択された。３日後にドキシサイクリンで発現を誘導した。（Ｇ）細胞にＵＶＢを照射し、５時間後に溶解物及び上清を回収し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットにより分析した。Ｎｒｆ２については、異なるエピトープを標的とする２つの異なる抗体を使用した。（Ｈ）ＨＰＫを採取し、示されるＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（Ａ〜Ｈ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ）エラーバーは、３回実施された代表的な実験の平均±ＳＤを表す。一元配置分散分析を行った。（Ｄ）エラーバーは、遺伝子型につき３匹のマウスを用いて行った代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。＊＊＊Ｐ≦０．００１。図２は、Ｎｒｆ２活性化がインフラマソーム活性化をブロックすることを示す。（Ａ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物ｔＢＨＱの示される濃度で処理し、３０分ＵＶＢで照射した後、５時間後に回収した。ＥＬＩＳＡ測定をＩＬ−１β分泌の定量のために行い、ウェスタンブロットは示されるタンパク質の発現及び活性化を分析するために行った。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、そしてインフラマソーム活性化（５μＭニゲリシン、１５０μｇ／ｍｌＭＳＵ）１時間前に、ＳＦＮ（１０μＭ）、１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）又はＤＭＦ（５０μＭ）で処理した。５時間後に細胞及び上清を採取し、示されるとおりＩＬ−１β及びウェスタンブロットのＥＬＩＳＡ測定によるインフラマソーム活性化を分析した。（Ｃ）ヒト血液から新たに単離したＰＢＭＣを、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）によるインフラマソーム活性化の１時間前にＳＦＮ（１０μＭ）、ｔＢＨＱ（１０μＭ）、ＤＭＦ（５０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。インフラマソーム活性化のリードアウトとしてＩＬ−１βの分泌のＥＬＩＳＡ測定を５時間後に行った。（Ｄ）ＨＰＫ又は（Ｅ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞はＳＦＮ（１０μＭ）を細胞に添加する前に１時間タンパク質合成をブロックするために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、３０μｇ／ｍｌ）で前処理し、さらに１時間後に（Ｄ）ＵＶＢ照射又は（Ｅ）ニゲリシン（５μＭ）処理によりインフラマソームを活性化した。細胞及び上清を（Ｄ）６時間後又は（Ｅ）３．５時間後に採取し、示されるとおりウェスタンブロットによりインフラマソーム活性化について分析した。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ〜Ｃ）エラーバーは、３回実施した代表的な実験の平均±ＳＤを表す。一元配置分散分析を行った。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図２は、Ｎｒｆ２活性化がインフラマソーム活性化をブロックすることを示す。（Ａ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物ｔＢＨＱの示される濃度で処理し、３０分ＵＶＢで照射した後、５時間後に回収した。ＥＬＩＳＡ測定をＩＬ−１β分泌の定量のために行い、ウェスタンブロットは示されるタンパク質の発現及び活性化を分析するために行った。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、そしてインフラマソーム活性化（５μＭニゲリシン、１５０μｇ／ｍｌＭＳＵ）１時間前に、ＳＦＮ（１０μＭ）、１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）又はＤＭＦ（５０μＭ）で処理した。５時間後に細胞及び上清を採取し、示されるとおりＩＬ−１β及びウェスタンブロットのＥＬＩＳＡ測定によるインフラマソーム活性化を分析した。（Ｃ）ヒト血液から新たに単離したＰＢＭＣを、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）によるインフラマソーム活性化の１時間前にＳＦＮ（１０μＭ）、ｔＢＨＱ（１０μＭ）、ＤＭＦ（５０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。インフラマソーム活性化のリードアウトとしてＩＬ−１βの分泌のＥＬＩＳＡ測定を５時間後に行った。（Ｄ）ＨＰＫ又は（Ｅ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞はＳＦＮ（１０μＭ）を細胞に添加する前に１時間タンパク質合成をブロックするために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ、３０μｇ／ｍｌ）で前処理し、さらに１時間後に（Ｄ）ＵＶＢ照射又は（Ｅ）ニゲリシン（５μＭ）処理によりインフラマソームを活性化した。細胞及び上清を（Ｄ）６時間後又は（Ｅ）３．５時間後に採取し、示されるとおりウェスタンブロットによりインフラマソーム活性化について分析した。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ〜Ｃ）エラーバーは、３回実施した代表的な実験の平均±ＳＤを表す。一元配置分散分析を行った。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１。図３は、Ｎｒｆ２活性化因子が腹膜炎を抑制することを示す。ＰＢＳ中の（Ａ、Ｂ、Ｃ）ＳＦＮ（２５ｍｇ／ｋｇ）又は０．０８％メトセル及び１０％ＤＭＳＯを含むＨ_２Ｏ中の（Ｄ、Ｅ、Ｆ）ＤＭＦ（２０ｍｇ／ｋｇ）を強制経口投与により処理されたマウス、対照としてビヒクル処理されたマウス。（Ａ）ＳＦＮ又は（Ｄ）ＤＭＦ処理の形態。腹膜炎は、２ｍｇのＭＳＵ結晶の腹腔内注射によって誘発された。（Ｂ、Ｅ）６時間後、腹腔洗浄液の好中球数をフローサイトメトリーで測定した。（Ｃ、Ｆ）同時に、肝臓を単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２標的遺伝子Ｇｓｔｐ１、Ｎｑｏ１及びＳｒｘｎ１の発現について分析した。統計：スチューデントｔ検定。（Ｂ、Ｃ）ｎ≧３、（Ｅ、Ｆ）ｎ＝７。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図４は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化においてＮｒｆ２が分解されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫに（Ａ）ＵＶＢを照射又は（Ｂ）ニゲリシン（５μＭ）で処理し、細胞及び上清を示されるとおり異なる時点で採取した。示されるタンパク質の発現及び活性化の分析のためのウェスタンブロット。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｃ）Ｎｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｄ、Ｅ）ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（２７ｎＭ）で３日間分化させ、ｕｐＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩プライミングし、ニゲリシン（５μＭ）又はＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）で処理した。示されるとおり異なる時点で細胞及び上清を採取し、（Ｄ）ウェスタンブロットにより示されるとおりのタンパク質の発現及び活性化を、（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりＮｒｆ２及びＮｒｆ２標的遺伝子の発現を分析した。（Ｆ）示されるとおりＨＰＫを特定のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし（ｓｃｒ：スクランブル、ｃ１：カスパーゼ−１、Ｋ１：Ｋｅａｐ１）、２日後にＵＶＢを照射又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間又は５時間後に細胞を採取し、溶解物をウェスタンブロットにより示されるタンパク質の発現について分析した。（Ｇ、Ｈ）示される遺伝子のノックアウトを有する分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理、又は（Ｈ）ＳＦＮ（１０μＭ）でさらに前処理した。３．５時間後、溶解物及び上清を採取し、示されるタンパク質の発現及び活性についてウェスタンブロットによって分析した。（Ｇ）示されるバックグラウンドバンドに関連するＮｒｆ２発現をウェスタンブロットから定量した。ニゲリシン処理とモック処理の比率を計算した。（Ｉ）分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をニゲリシン（５μＭ）で処理した。１時間後、細胞を直接（１時間）採取、又はＭＧ１３２（１μＭ）で処理、又はモック処理した。２．５時間後、細胞を採取し、示されるタンパク質の発現についてウェスタンブロットにより分析した。（Ａ〜Ｉ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ、Ｅ）一元配置分散分析。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１図５Ｎｒｆ２及びＳＦＮはＮＬＲＰ３インフラマソームに異なるメカニズムで影響を与える。（Ａ）対照のためＨＰＫをスクランブルｓｉＲＮＡ又はＲｂｘ１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３日後に細胞を採取し、カスパーゼ−１特異的抗体又はＨＡ抗体を用いてＩＰを行い、後者はアイソタイプ対照とした。カスパーゼ−１及びＲｂｘ１のウェスタンブロット。カスパーゼ−１阻害剤は使用しなかった。（Ｂ）ＨＰＫを、Ｔｅｔ−Ｏｎ誘導性プロモーターの制御下で、ＦＬＡＧタグ化カスパーゼ−１又はＧＦＰをコードするレンチウイルス構築物で形質導入した。３日間の選択の後、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の添加によって発現を誘導した。細胞を２４時間後に収穫し、ＩＰをＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（シグマ）で行った。ウェスタンブロットは示されたタンパク質の発現及び相互作用を示す。（Ｃ）ＨＰＫをスクランブル又はＲｂｘ１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。２日後、細胞をＳＦＮ（５０μＭ）又は溶媒ＤＭＳＯで処理し、１時間後に採取した。ＩＰはカスパーゼ−１特異的抗体を用いて実施し、ＨＡに対する抗体はアイソタイプ対照とした。カスパーゼ−１及びＲｂｘ１のウェスタンブロット。（Ｄ、Ｅ）ＤＣをｗｔ（野生型）及びＮｒｆ２ノックアウトマウス（ｎ＝４）の骨髄から分化させ、ｕｐＬＰＳで一晩プライミングし、溶媒ＤＭＳＯ（対照）又はＳＦＮ（１０μＭ）で処理した。１時間後、ＢＭＤＣを５μＭニゲリシンで処理し、４．５時間後に収穫した。（Ｄ）示されるタンパク質の発現及び活性化のためのウェスタンブロット及び（Ｅ）ＩＬ−１βの分泌の定量のためのＥＬＩＳＡ。（Ｆ）ＴＨＰ１細胞（ＴＰＡで３日間分化させＬＰＳで一晩プライミングした）をＳＦＮ（１０μＭ）又は溶媒ＤＭＳＯで刺激し、そして２．５時間、モック処理又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。溶解物をトリトン緩衝液中で回収し、ＡＳＣモノマー、二量体及びオリゴマーの検出のために可溶性及び不溶性（スペック形成を示す）ＡＳＣ又はＤＳＳ含有緩衝液についてウェスタンブロッティングにより分析した。ＩＬ−１β分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。（Ａ〜Ｃ）特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。（Ｅ）エラーバーは、３回実施した代表的な実験の平均±ＳＤを表す。図５Ｎｒｆ２及びＳＦＮはＮＬＲＰ３インフラマソームに異なるメカニズムで影響を与える。（Ａ）対照のためＨＰＫをスクランブルｓｉＲＮＡ又はＲｂｘ１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３日後に細胞を採取し、カスパーゼ−１特異的抗体又はＨＡ抗体を用いてＩＰを行い、後者はアイソタイプ対照とした。カスパーゼ−１及びＲｂｘ１のウェスタンブロット。カスパーゼ−１阻害剤は使用しなかった。（Ｂ）ＨＰＫを、Ｔｅｔ−Ｏｎ誘導性プロモーターの制御下で、ＦＬＡＧタグ化カスパーゼ−１又はＧＦＰをコードするレンチウイルス構築物で形質導入した。３日間の選択の後、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の添加によって発現を誘導した。細胞を２４時間後に収穫し、ＩＰをＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（シグマ）で行った。ウェスタンブロットは示されたタンパク質の発現及び相互作用を示す。（Ｃ）ＨＰＫをスクランブル又はＲｂｘ１特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。２日後、細胞をＳＦＮ（５０μＭ）又は溶媒ＤＭＳＯで処理し、１時間後に採取した。ＩＰはカスパーゼ−１特異的抗体を用いて実施し、ＨＡに対する抗体はアイソタイプ対照とした。カスパーゼ−１及びＲｂｘ１のウェスタンブロット。（Ｄ、Ｅ）ＤＣをｗｔ（野生型）及びＮｒｆ２ノックアウトマウス（ｎ＝４）の骨髄から分化させ、ｕｐＬＰＳで一晩プライミングし、溶媒ＤＭＳＯ（対照）又はＳＦＮ（１０μＭ）で処理した。１時間後、ＢＭＤＣを５μＭニゲリシンで処理し、４．５時間後に収穫した。（Ｄ）示されるタンパク質の発現及び活性化のためのウェスタンブロット及び（Ｅ）ＩＬ−１βの分泌の定量のためのＥＬＩＳＡ。（Ｆ）ＴＨＰ１細胞（ＴＰＡで３日間分化させＬＰＳで一晩プライミングした）をＳＦＮ（１０μＭ）又は溶媒ＤＭＳＯで刺激し、そして２．５時間、モック処理又はニゲリシン（５μＭ）で処理した。溶解物をトリトン緩衝液中で回収し、ＡＳＣモノマー、二量体及びオリゴマーの検出のために可溶性及び不溶性（スペック形成を示す）ＡＳＣ又はＤＳＳ含有緩衝液についてウェスタンブロッティングにより分析した。ＩＬ−１β分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。（Ａ〜Ｃ）特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。（Ｅ）エラーバーは、３回実施した代表的な実験の平均±ＳＤを表す。図６：Ｎｒｆ２欠損マウス及び野生型同腹子から骨髄（ＢＭ）細胞を単離し、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。（Ａ、Ｂ）ｕｐＬＰＳで一晩プライミングした後、ＢＭＤＣをＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化因子ニゲリシン（２０μＭ）、ザイモサン（２０μｇ／ｍｌ）、ＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）、ＡＴＰ（５ｍＭ）又はポリ（ｄＡ：ｄＴ）（１μｇ／ｍｌ）でＡＩＭ２インフラマソームの活性化のために処理した。６時間後、上清を（Ａ）ＥＬＩＳＡ又は（Ｂ）ウェスタンブロットによりＩＬ−１βの分泌について分析した。モック処理されたがプライミング処理のＢＭＤＣは、（Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、又は（Ｄ）ウェスタンブロットによりタンパク質レベルでのインフラマソームタンパク質及びＩＬ−１β前駆体の発現について分析した。（Ｂ、Ｄ）遺伝子型当たり２匹の個々のマウスからの重複を示す（生物学的複製）。（Ｅ〜Ｇ）ＨＰＫを、Ｎｒｆ２活性化因子ＳＦＮ（１０μＭ）、ｔＢＨＱ（１０μＭ）、ＤＭＦ（５０μＭ）及び１５ｄ−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。１時間後、細胞を採取し、全細胞溶解物（Ｅ）又は細胞質及び核溶解物（Ｆ）を用いて示されるタンパク質の発現について分析した。核タンパク質ラミンＡ／Ｃ及び細胞質タンパク質α−チューブリンのウェスタンブロットを対照とした。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｇ）全ＲＮＡを８時間後に単離し、Ｎｒｆ２標的遺伝子グルタメート−システインリガーゼ、触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、グルタメート−システインリガーゼ、モディファイアーサブユニット（ＧＣＬＭ）、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）の発現の定量化のためにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。（Ａ〜Ｇ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ）エラーバーは、遺伝子型当たり３匹のマウスで行った代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。（Ｇ）エラーバーは、代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。＊Ｐ≦０．０５図６：Ｎｒｆ２欠損マウス及び野生型同腹子から骨髄（ＢＭ）細胞を単離し、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。（Ａ、Ｂ）ｕｐＬＰＳで一晩プライミングした後、ＢＭＤＣをＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化因子ニゲリシン（２０μＭ）、ザイモサン（２０μｇ／ｍｌ）、ＭＳＵ（１５０μｇ／ｍｌ）、ＡＴＰ（５ｍＭ）又はポリ（ｄＡ：ｄＴ）（１μｇ／ｍｌ）でＡＩＭ２インフラマソームの活性化のために処理した。６時間後、上清を（Ａ）ＥＬＩＳＡ又は（Ｂ）ウェスタンブロットによりＩＬ−１βの分泌について分析した。モック処理されたがプライミング処理のＢＭＤＣは、（Ｃ）ｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで、又は（Ｄ）ウェスタンブロットによりタンパク質レベルでのインフラマソームタンパク質及びＩＬ−１β前駆体の発現について分析した。（Ｂ、Ｄ）遺伝子型当たり２匹の個々のマウスからの重複を示す（生物学的複製）。（Ｅ〜Ｇ）ＨＰＫを、Ｎｒｆ２活性化因子ＳＦＮ（１０μＭ）、ｔＢＨＱ（１０μＭ）、ＤＭＦ（５０μＭ）及び１５ｄ−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。１時間後、細胞を採取し、全細胞溶解物（Ｅ）又は細胞質及び核溶解物（Ｆ）を用いて示されるタンパク質の発現について分析した。核タンパク質ラミンＡ／Ｃ及び細胞質タンパク質α−チューブリンのウェスタンブロットを対照とした。特定のバンドにはアスタリスクを付加する。（Ｇ）全ＲＮＡを８時間後に単離し、Ｎｒｆ２標的遺伝子グルタメート−システインリガーゼ、触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、グルタメート−システインリガーゼ、モディファイアーサブユニット（ＧＣＬＭ）、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）の発現の定量化のためにｑＲＴ−ＰＣＲを行った。（Ａ〜Ｇ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ａ）エラーバーは、遺伝子型当たり３匹のマウスで行った代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。（Ｇ）エラーバーは、代表的な実験の平均±ＳＤを表す。マンホイットニー検定を行った。＊Ｐ≦０．０５図７：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫを、示されるとおり３日間ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ及び非関連血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とするｓｉＲＮＡを対照とした。（Ａ）全溶解物又は（Ｂ）核及び細胞質溶解物のウェスタンブロット及び（Ｃ）標的遺伝子発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＨＰＫをＭＧ１３２（１μＭ）、ＰＤＴＣ（５００μＭ）又はＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１２．５μＭ）で１０分間処理し、（ＵＶ前に）採取又はＵＶＢを照射して１時間後に採取した。Ｎｒｆ２の発現を示すウェスタンブロット。（Ｅ）一晩ｕｐＬＰＳで細胞プライミングする前に、分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をシクロヘキシミド（ＣＨＸ、３０μｇ／ｍｌ）で１時間前処理した。ウェスタンブロットは、示されるタンパク質の発現を示す。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ）ｓｃｒ対照に関連するマンホイットニー検定。＊Ｐ≦０．０５図７：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫを、示されるとおり３日間ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。スクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ及び非関連血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とするｓｉＲＮＡを対照とした。（Ａ）全溶解物又は（Ｂ）核及び細胞質溶解物のウェスタンブロット及び（Ｃ）標的遺伝子発現を示すｑＲＴ−ＰＣＲ。（Ｄ）ＨＰＫをＭＧ１３２（１μＭ）、ＰＤＴＣ（５００μＭ）又はＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１２．５μＭ）で１０分間処理し、（ＵＶ前に）採取又はＵＶＢを照射して１時間後に採取した。Ｎｒｆ２の発現を示すウェスタンブロット。（Ｅ）一晩ｕｐＬＰＳで細胞プライミングする前に、分化しプライミングしたＴＨＰ−１細胞をシクロヘキシミド（ＣＨＸ、３０μｇ／ｍｌ）で１時間前処理した。ウェスタンブロットは、示されるタンパク質の発現を示す。（Ａ〜Ｅ）少なくとも３回実施された代表的な実験を示す。統計：（Ｃ）ｓｃｒ対照に関連するマンホイットニー検定。＊Ｐ≦０．０５図８：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物（Ａ）ＳＦＮ、（Ｂ）ＤＭＦ、及び（Ｃ）１５ｄ−ＰＧＪ２で処理し、３０分後ＵＶＢで照射し、５時間後に回収した。ｔＢＨＱについて図２Ａに記載されるとおり類似性実験。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞をＴＰＡで３日間分化させ、ＬＰＳで一晩プライミングした。次に、細胞を溶媒ＤＭＳＯ、ＳＦＮ（１０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。３０分後、ニゲリシン処理によりインフラマソームを活性化し、細胞及び上清を２．５時間後に採取した。ウェスタンブロットは、溶解物及び上清中のＩＬ−１β前駆体及び成熟ＩＬ−１βを示す。比較を可能にするために、２０％溶解物及び１２ウェルの上清をそれぞれ使用した。ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ−１βを定量し、細胞毒性はＬＤＨ放出により定量した。図８：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物（Ａ）ＳＦＮ、（Ｂ）ＤＭＦ、及び（Ｃ）１５ｄ−ＰＧＪ２で処理し、３０分後ＵＶＢで照射し、５時間後に回収した。ｔＢＨＱについて図２Ａに記載されるとおり類似性実験。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞をＴＰＡで３日間分化させ、ＬＰＳで一晩プライミングした。次に、細胞を溶媒ＤＭＳＯ、ＳＦＮ（１０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。３０分後、ニゲリシン処理によりインフラマソームを活性化し、細胞及び上清を２．５時間後に採取した。ウェスタンブロットは、溶解物及び上清中のＩＬ−１β前駆体及び成熟ＩＬ−１βを示す。比較を可能にするために、２０％溶解物及び１２ウェルの上清をそれぞれ使用した。ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ−１βを定量し、細胞毒性はＬＤＨ放出により定量した。図８：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物（Ａ）ＳＦＮ、（Ｂ）ＤＭＦ、及び（Ｃ）１５ｄ−ＰＧＪ２で処理し、３０分後ＵＶＢで照射し、５時間後に回収した。ｔＢＨＱについて図２Ａに記載されるとおり類似性実験。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞をＴＰＡで３日間分化させ、ＬＰＳで一晩プライミングした。次に、細胞を溶媒ＤＭＳＯ、ＳＦＮ（１０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。３０分後、ニゲリシン処理によりインフラマソームを活性化し、細胞及び上清を２．５時間後に採取した。ウェスタンブロットは、溶解物及び上清中のＩＬ−１β前駆体及び成熟ＩＬ−１βを示す。比較を可能にするために、２０％溶解物及び１２ウェルの上清をそれぞれ使用した。ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ−１βを定量し、細胞毒性はＬＤＨ放出により定量した。図８：（Ａ〜Ｃ）ＨＰＫをＮｒｆ２活性化化合物（Ａ）ＳＦＮ、（Ｂ）ＤＭＦ、及び（Ｃ）１５ｄ−ＰＧＪ２で処理し、３０分後ＵＶＢで照射し、５時間後に回収した。ｔＢＨＱについて図２Ａに記載されるとおり類似性実験。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞をＴＰＡで３日間分化させ、ＬＰＳで一晩プライミングした。次に、細胞を溶媒ＤＭＳＯ、ＳＦＮ（１０μＭ）又は１５−ＰＧＪ２（１０μＭ）で処理した。３０分後、ニゲリシン処理によりインフラマソームを活性化し、細胞及び上清を２．５時間後に採取した。ウェスタンブロットは、溶解物及び上清中のＩＬ−１β前駆体及び成熟ＩＬ−１βを示す。比較を可能にするために、２０％溶解物及び１２ウェルの上清をそれぞれ使用した。ＥＬＩＳＡにより上清中のＩＬ−１βを定量し、細胞毒性はＬＤＨ放出により定量した。

発明の説明
本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）：
により特定される化合物は、各Ｒ１が、Ｈ及びＣ_１−Ｃ_６アルキルから単独で選択され、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するために提供される。

上記の全ての状態において、インフラマソーム活性化は重要な病態生理学的メカニズムである。上記の症状のひとつに苦しんでいる患者は、インフラマソームを阻害し、そしてインフラマソーム活性を制御することを可能にする治療により恩恵を受けるであろうということを当業者は認識している。

本明細書の文脈内では、用語「心血管疾患」は、当該技術分野で知られている一般的な意味を有し、心臓、心臓弁、血液、及び脈管構造に影響を与える状態を分類するために使用される。心臓血管疾患には、内皮機能不全、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、狭心症、心筋梗塞、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、高血圧症、脳血管疾患、脳卒中、一過性虚血発作、深部静脈血栓症、末梢動脈疾患、心筋症、不整脈、大動脈狭窄及び動脈瘤を含む。そのような疾患は、しばしばアテローム性動脈硬化症を伴う。

本明細書の文脈内では、用語「メタボリックシンドローム」は、当技術分野で知られている一般的な意味を有する。次の５つの病状のうち少なくとも３つのクラスタリングである：腹部（中央）肥満、血圧上昇、空腹時血漿グルコース上昇、高血清トリグリセリド、低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル。メタボリックシンドロームは、心臓血管疾患及び糖尿病を発症するリスクと関連している。

本明細書の文脈内では、用語「糖尿病の合併症」は、当技術分野で知られているその一般的な意味を有する。糖尿病の急性合併症には、糖尿病性ケトアシドーシス、非ケトン性高浸透圧性昏睡、低血糖症、糖尿病性昏睡、呼吸器感染症及び歯周病が含まれる。糖尿病の可能性のある慢性合併症には、微小血管症、糖尿病性心筋症、糖尿病性ニューロパチー、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性脳症（アルツハイマー型認知症を含むが、これに限定されない）、大血管疾患、循環器疾患、糖尿病の足（足における神経損傷による足の合併症又は足への血流不良）及び皮膚感染症が含まれる。合併症は、よく管理された血糖値を有する人では、はるかに一般的でなく重症度も低い。

特定の実施形態において、化合物は尋常性ざ瘡の予防又は治療における使用のために提供される。

特定の実施形態において、化合物は、２型糖尿病の予防又は治療における使用のために提供される。

特定の実施形態では、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル又はブチルである。

特定の実施形態では、前記化合物はジメチルフマレート（トランス−１，２−エチレンジカルボン酸ジメチルエステル；ＣＡＳ番号６２４−４９−７）である。

特定の実施形態では、化合物はフマル酸エチル水素（１つのＲ１はエチルであり、他の１つはＨである）又はエチル水素フマレートの塩である。特定の実施形態では、化合物は、エチル水素フマレートのマグネシウム塩である。特定の実施形態では、化合物は、エチル水素フマレートのカルシウム塩である。特定の実施形態では、化合物は、エチル水素フマレートの亜鉛塩である。

特定の実施形態では、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療において使用される活性成分は、ジメチルフマレートとエチル水素フマレートのマグネシウム塩、カルシウム塩及び亜鉛塩の混合物である。フマダーム（Ｆｕｍａｄｅｒｍ）として市販されている市販の調製物は、投与形態ごとに、ジメチルフマレート３０ｍｇ、エチル水素フマレートカルシウム塩６７ｍｇ、エチル水素フマレートマグネシウム塩５ｍｇ及び亜鉛塩３ｍｇを含む。また、市販されているものは、１２０ｍｇのジメチルフマレート及び９５ｍｇのエチル水素フマレートを含むトローチ剤（Ｌｏｚｅｎｇｅ）であり、後者はカルシウム（８７ｍｇ）、マグネシウム（５ｍｇ）及び亜鉛（３ｍｇ）のそれぞれの塩として投与される。これらの投与形態は、本発明の可能な実施形態と同様に考えられる。

本発明者らは、この化合物が低用量で有効であり、潜在的な副作用を最小限にすることを実証する。ＤＭＦは何十年もの間医薬品として使用されており、耐容性が高いことが示されてきた。ＳＦＮ（ＣＡＳ番号４４７８−９３−７）又は１５ｄ−ＰＧＪ_２（ＣＡＳ番号８７８９３−５５−８）のようなインフラマソームを阻害することができる代替の化合物もまた、他の細胞経路に影響を及ぼし、医薬品としてのその使用は安全性が低い可能性がある。

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様による化合物を含む剤形は、痛風、座瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するために提供される。

特定の実施形態では、剤形は、本発明の第１の態様に従って特定される化合物を、単独で、又は一つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は担体と一緒に含む。

特定の実施形態では、剤形は、経口製剤、特に錠剤、カプセル、トローチ剤、粉末、溶液又はシロップである。

特定の実施形態では、剤形は、局所用薬剤、特に皮膚外用剤、より具体的にはクリーム、ゲル、軟膏又はローションである。

特定の実施形態では剤形はクリームとして製剤化される。特定の実施形態では剤形はローションとして製剤化される。特定の実施形態では剤形は軟膏として製剤化される。特定の実施形態では、剤形はスプレーとして製剤化される。

当業者は、Ｂｅｎｓｏｎ及びＷａｔｋｉｎｓｏｎ（編）、局所的及び経皮的薬物送達：原則と実践（第１版、Ｗｉｌｅｙ２０１１、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０４７０４５０２９１）；Ｇｕｙ及びＨａｎｄｃｒａｆｔ：経皮薬物送達システム：改訂及び拡張（第２版、ＣＲＣＰｒｅｓｓ２００２、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８２４７０８６１０）；Ｏｓｂｏｒｎｅ及びＡｍａｎｎ（編）：局所薬物送達製剤（第１版ＣＲＣＰｒｅｓｓ１９８９、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８２４７８１８３５）の内容により例示されるとおり、局所製剤を提供するための可能な製法の広範囲を認識している。

剤形は、単独で、又は一種以上の治療剤と組み合わせて、特にインターロイキン−１阻害剤と組み合わせて投与することができる。

本発明の別の態様によれば、痛風、ざ瘡、壊死性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の治療又は予防方法が提供され、本発明の第１の様態に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む。投与は、前述の手段のいずれかによって行うことができる。

化合物は、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症とすでに診断された患者、又は痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症を患っている疑いのある患者に投与することができる。あるいは、化合物は、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症を発症する危険性のある患者のための予防剤として使用することができる。

本発明は、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる次のアイテム（Ｉｔｅｍ）、実施例及び図面によりさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、範囲を限定するものではない。

アイテム（Ｉｔｅｍ）
１．式（Ｉ）：
により特定される化合物であって、各Ｒ１は独立してＨ及びＣ_１−Ｃ_６から選択される、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための前記化合物。

２．痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、各Ｒ１はメチル（ＣＨ_３）である、式（Ｉ）により特定される化合物。

３．痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、一つのＲ１がエチル（ＣＨ_２ＣＨ_３）であり、他のＲ１がＨ及びＣ_１−Ｃ_６アルキルから選択される、式（Ｉ）で特定される化合物。

４．痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、他のＲ１がＨであるアイテム３に記載の化合物。

５．ジエチルフマレート及びエチル水素フマレートの一つ又は複数の塩、特にエチル水素フマレートのマグネシウム塩、カルシウム塩及び亜鉛塩から選択される塩を含む調製物。

６．痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、アイテム１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含む剤形。

７．痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の予防又は治療に使用するための、アイテム２に記載の化合物及びアイテム３に記載の化合物を含む剤形。

８．アイテム１〜７のいずれか一項に記載の化合物、調整物又は剤形を、それを必要とする患者へ投与することを含む、痛風、ざ瘡、壊疽性膿皮症、白斑、心血管疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病及び／又は糖尿病の合併症の治療又は予防の方法。

実施例
略語：ＤＭＦ：ジメチルフマレート、Ｎｒｆ２：核因子赤血球由来２関連因子２、ＲＯＳ：活性酸素種、ＫＥＡＰ１：Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１、Ｃｕｌ３：カリン３（Ｃｕｌｌｉｎ３）、Ｒｂｘ１：ＲＩＮＧボックスタンパク質１、ＳＦＮ：スルフォラファン、ＭＳ：多発性硬化症、ＮＬＲＰ３：ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ及びＰＹＤドメイン含有タンパク質３、ＡＳＣ：ＣＡＲＤを含むアポトーシス関連のスペック様タンパク質、ＩＬ：インターロイキン、ＢＭＤＣ：骨髄由来樹状細胞、ＨＰＫ：ヒト初代ケラチノサイト、ｔＢＨＱ：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、１５ｄ−ＰＧＪ２：１５−デオキシ−Ｄ−プロスタグランジンＪ２、ｃａ：構成的活性、ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞、ＭＳＵ：尿酸ナトリウム、共ＩＰ：共免疫沈降。

Ｎｒｆ２発現は、効率的なインフラマソーム活性化に必要である
Ｎｒｆ２の基礎活性がインフラマソーム活性化に必要であるかどうかを特定するために、本発明者らは、Ｎｒｆ２欠損マウス及び野生型同腹子から骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を作製した。本発明者らは、ＬＰＳで細胞をプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）し、いくつかの強力な誘導物質によってＮＬＲＰ３及びＡＩＭ２インフラマソームを活性化し、成熟ＩＬ−１βの分泌をカスパーゼ−１活性化のリードアウトとして分析した。ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡによって示されるとおり、Ｎｒｆ２欠損ＢＭＤＣによるＩＬ−１βの分泌が著しく損なわれた（図６Ａ、Ｂ）。対照として、本発明者らは、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルでのＩＬ−１β前駆体（ｐｒｏ−ＩＬ−１β）の発現及びいくつかのインフラマソームタンパク質の発現を分析した。しかし、これらの遺伝子の発現は、Ｎｒｆ２の喪失によって有意に影響されなかった（図６Ｃ、Ｄ）。ヒト初代ケラチノサイト（ＨＰＫ）は、ＩＬ−１β前駆体及びインフラマソームタンパク質を構成的に発現する。したがって、ＵＶＢ照射誘発性インフラマソーム活性化により媒介される成熟ＩＬ−１β及び−１８の分泌にはプライミングを必要としない。Ｎｒｆ２活性化化合物ＳＦＮ、ＤＭＦ、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）又は１５−デオキシ−Ｄ−１２，１４１１６−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）によるＨＰＫの処理は、Ｎｒｆ２タンパク質の迅速かつ強固な安定化及び核蓄積をもたらし、他のＮｒｆ２複合体タンパク質Ｋｅａｐ１、Ｃｕｌ３、及びＲｂｘ１の発現は影響を受けなかった（図６Ｅ、Ｆ）。Ｎｒｆ２安定化及び核蓄積は、古典的なＮｒｆ２標的遺伝子の誘導を伴う（図６Ｇ）。さらに、Ｋｅａｐｌ又はＣｕｌ３発現のノックダウンは、Ｎｒｆ２の安定化、その核内蓄積及び標的遺伝子発現の増強を誘導した（図７Ａ〜Ｃ）。これらの実験は、Ｎｒｆ２経路がＨＰＫにおいて機能的であることを実証する。

したがって、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてＨＰＫ中のＮｒｆ２発現をノックダウンし、ＵＶＢ照射時にインフラマソーム活性化を分析した（図１Ａ〜Ｃ）。Ｎｒｆ２ノックダウンＨＰＫにおいてカスパーゼ１の活性化が阻害されＩＬ−１β及び−１８の分泌が減少した。Ｎｒｆ２の発現がヒトケラチノサイトにおける効率的なインフラマソーム活性化にも必要であることが示された。

Ｎｒｆ２誘導遺伝子発現は、インフラマソーム調節に関与しない
Ｎｒｆ２は転写因子であるため、Ｎｒｆ２標的遺伝子発現の低下は、Ｎｒｆ２発現切除におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害の原因であると考えられる。本発明者らは、Ｎｒｆ２媒介遺伝子発現の活性化が反対の作用を有しＩＬ−１β前駆体の成熟を増強する結果になるかどうかを特定するために、骨髄細胞においてＮｒｆ２の構成的活性（ｃａ）変異体を発現するトランスジェニックマウスから単離された腹腔マクロファージを特徴付けた。この変異体は、Ｋｅａｐ１への結合を媒介するドメインを欠いている。Ｎｒｆ２標的遺伝子の発現は誘導された（図１Ｆ）が、ｃａＮｒｆ２発現における成熟ＩＬ−１βの分泌、及び結果的にＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化は変化しなかった（図１Ｄ、Ｅ）。

Ｎｒｆ２標的遺伝子がＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を調節する可能性をさらに指摘するために、本発明者らはＨＰＫにおいて実験を行った。本発明者らは、野生型Ｎｒｆ２又はＫｅａｐｌ、又は変異タンパク質をコードするレンチウイルス構築物でこれらの細胞を形質導入した。発現の誘導後、細胞にＵＶＢを照射し、成熟ＩＬ−１βの分泌により反映されるとおりインフラマソーム活性化を生じた（図１Ｇ）。対照として、Ｎｒｆ２標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した（図１Ｈ）。野生型Ｎｒｆ２の過剰発現は、ＩＬ−１βの分泌を実際に増加させた（図１Ｇ）。しかしながら、ｃａＮｒｆ２−トランスジェニックマウス由来のマクロファージで得られた結果と一致して、ｃａＮｒｆ２変異体の過剰発現は標的遺伝子発現を同様の程度まで増加させたが、ＩＬ−１β前駆体成熟を増強しなかった。核局在配列を欠くＮｒｆ２変異体（Ｎｒｆ２＿ＮＬＳ）は、標的遺伝子発現をわずかに増加させたが、ＩＬ−１β産生を強く増加させた（図１Ｇ、Ｈ）。Ｎｒｆ２分解を媒介することができない野生型Ｋｅａｐｌ及び変異体は、タンパク質がＮｒｆ２標的遺伝子発現に逆の影響を及ぼしたが、ＨＰＫの上清中のＩＬ−１βを増加させた。これらの結果は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化がＮｒｆ２標的遺伝子の発現と相関しないことを実証する。

Ｎｒｆ２活性化因子は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を阻害する
インフラマソーム活性化に対するＮｒｆ２活性化化合物の効果を特定するために、本発明者らはケラチノサイトを異なる用量のＳＦＮ、ｔＢＨＱ、ＤＭＦ又は１５ｄ−ＰＧＪ２で処理し、細胞にＵＶＢを照射した。これらの化合物は、上清中の処理されたカスパーゼ−１及び成熟ＩＬ−１β及び−１８の減少量の検出により反映されるとおり、用量依存的にインフラマソーム活性化を阻害した（図２Ａ、図８Ａ〜Ｃ）。ＳＦＮ及び１５ｄ−ＰＧＪ２は、ｔＢＨＱ及びＤＭＦよりはるかに効率的であった。Ｎｒｆ２活性化因子の抗炎症効果は、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１（図２Ｂ）及びヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（図２Ｃ）におけるＩＬ−１β分泌も阻害するため、ヒトケラチノサイトに限定されない。Ｎｒｆ２活性化化合物は、細胞質酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出の減少により反映され、インフラマソーム活性化ＴＨＰ−１細胞におけるパイロトーシスを強く阻害した（図８Ｄ）。しかし、成熟ＩＬ−１βはこれらの細胞に蓄積しなかったので、実験はＳＦＮ及び１５−ＰＧＪ２が、パイロトーシスだけではなくインフラマソーム活性化を実際に阻害することを実証する。インフラマソーム活性化のわずか１５〜３０分前にＮｒｆ２活性化因子を細胞に添加したので、Ｎｒｆ２標的遺伝子がインフラマソーム阻害に関与している可能性は低い。この可能性をさらに試験するために、本発明者らは、ＨＰＫ（図２Ｄ）又はＴＨＰ−１細胞（図２Ｅ）を、タンパク質合成をブロックするシクロヘキシミドで処理した（図７Ｅ）。ＳＦＮで細胞を処理する直前に添加した場合、シクロヘキシミドはＮｒｆ２活性化因子によるインフラマソーム阻害を阻止しなかった。これらの実験は、Ｎｒｆ２標的遺伝子の誘導はＳＦＮによるインフラマソーム阻害の原因ではないという強力な証拠を提供する。

ＤＭＦはインフラマソーム依存性炎症を軽減する
重要な未解決の問題は、Ｎｒｆ２活性化化合物がインビボでインフラマソーム依存性炎症をブロックできるかどうかである。ＤＭＦは、乾癬及びＭＳの炎症性疾患の治療のための薬物として使用されるが、その作用機序はほとんど特徴付けられていない。しかしながら、両方の疾患において、インフラマソームの関与が議論されている。尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶誘発性腹膜炎は、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ１、ＭｙＤ８８及びＮＬＲＰ３インフラマソームに依存する炎症及び痛風のマウスモデルである。最近、Ｎｒｆ２発現がこのタイプの炎症に必要であることが示されている。最も重要なことに、Ｎｒｆ２活性化因子１５ｄ−ＰＧＪ２及びＳＦＮの高濃度は、腹膜内に注入されると、インフラマソーム活性化をブロックし、ＭＳＵ誘発性腹膜炎を減少させた。発明者らは、インビボでＮｒｆ２活性化因子の潜在的な抗炎症活性を測定するために、異なる投与方法を選択し、強制経口投与によりＳＦＮ又はＤＭＦを与えた（図３）。ＤＭＦは同じ濃度のＳＦＮよりもインフラマソーム阻害においてあまり効力がなかったので（図８Ａ、Ｂ）、腹膜炎の誘導の前にマウスをＳＦＮで２日間ではなく、ＤＭＦで６日間処理した（図３Ａ、Ｄ）。本発明者らは、ＭＳＵ結晶の注射６時間後の腹膜における細胞浸潤を分析した。好中球の数は、対照マウスと比較してＳＦＮ−処理及びＤＭＦ−処理で有意に減少した（図３Ｂ、Ｅ）。ＳＦＮ及びＤＭＦ処理の対照として、本発明者らは、肝臓におけるＮｒｆ２標的遺伝子の発現を測定し、ｍＲＮＡ発現の増加を見出した（図３Ｃ、Ｆ）。これらの結果は、ＳＦＮ及びＤＭＦが、経口投与された場合、ＮＬＲＰ３インフラマソーム依存性マウスモデルにおける炎症を阻害することを実証する。

ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化はＮｒｆ２発現をダウンレギュレーションする
次に本発明者らは、インフラマソーム活性化がＲＯＳ−依存性であるため、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化におけるＮｒｆ２の活性を調べた。興味深いことに、ＨＰＫのＵＶＢ照射は、Ｎｒｆ２タンパク質レベルの強力かつ迅速なダウンレギュレーションを誘導し、続いてＮｒｆ２標的遺伝子発現の低下をもたらし、カスパーゼ−１活性が誘導された（図４Ａ、Ｃ）。ＵＶＢ照射がＲＯＳ産生の強力な誘導物質であり細胞がＮｒｆ２活性化の恩恵を受けると予想できるため、このことは驚くべきことである。ＨＰＫによるＵＶＢ誘発ＩＬ−１β分泌は、ＮＬＲＰ１及びＮＬＲＰ３［２１］の発現を必要とする。ニゲリシンとＭＳＵの両方の結晶は「真の」ＮＬＲＰ３活性化剤とみなされるが、ＨＰＫはＭＳＵ結晶を貪食できない。したがって、本発明者らは、ＨＰＫをニゲリシンのみで処理し、ＴＨＰ−１細胞をこれらのＮＬＲＰ３活性化剤のいずれかで処理した。これらの処理はまた、Ｎｒｆ２タンパク質レベル（図４Ｂ、Ｄ）及び標的遺伝子発現（図４Ｅ）の迅速なダウンレギュレーションをもたらし、ＵＶＢ照射のみがＮｒｆ２ｍＲＮＡ発現を強くダウンレギュレーションした（図４Ｃ、Ｅ）。したがって、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化はＮｒｆ２タンパク質分解を誘導する可能性が最も高い。興味深いことにこの効果は、カスパーゼ−１の発現及び活性を必要とせず、ＴＨＰ−１細胞におけるＨＰＫ又はノックアウトのこれらのタンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンによって測定されるように、Ｋｅａｐｌから部分的に独立している（図４Ｆ、Ｇ）。しかし、インフラマソーム活性化誘導Ｎｒｆ２分解は、ＡＳＣ又はＮＬＲＰ３発現の切除において（図４Ｇ）及びＲＯＳブロッカーＰＤＴＣ又はＣａ２＋キレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭ（補足図２Ｄ）による細胞の処理においてブロックされた。Ｋｅａｐｌ切除は、結果としてＩＬ−１β前駆体及びＮＬＲＰ３レベルを減少させ（図４Ｇ）、このことはＮｒｆ２によるＩＬ−１β前駆体発現の阻害又はＴＬＲ４シグナル伝達障害によって説明され得る。しかし、ＩＬ−１８前駆体（図４Ｈ）の正常な処理に反映されるように、インフラマソームの機能は損なわれなかった。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（図４Ｉ及び図７Ｄ）によってＮｒｆ２分解が阻害されたため、インフラマソーム活性化によるＮｒｆ２分解にＫｅａｐｌ発現は部分的に必要不可欠であるが、これらの条件下において転写因子はプロテアソームに向けられる。

Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１／Ｃｕｌ３／Ｒｂｘ１複合体は、カスパーゼ−１と物理的に相互作用する
本発明者らの実験は、Ｎｒｆ２標的遺伝子が、Ｎｒｆ２とＮＬＲＰ３インフラマソームとの間のクロストークに関与していない可能性が高いことを実証し、転写因子が炎症に関連することによる新規メカニズムを指摘する。ＨＰＫ（図１Ｇ、Ｈ）における過剰発現実験は、細胞質Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１の量とインフラマソーム活性化との間の相関を示唆したので、ＮｒＲＰ２は免疫複合体との直接的又は間接的な物理的相互作用によるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を支持する可能性がある。この点に対処するために、本発明者らは、カスパーゼ−１に対する抗体とＨＰＫの溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）との共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験を行った。しかし、本発明者らは、カスパーゼ−１とＮｒｆ２との間の相互作用を検出することができなかった（結果は示さず）。しかしながら興味深いことに、カスパーゼ−１とＲｂｘ１との相互作用が見出された。バンドの特異性は、Ｒｂｘ１発現のノックダウンによって確認した（図５Ａ）。さらに、本発明者らは、ＨＰＫ中のカスパーゼ−１のＦＬＡＧタグ化バージョンを過剰発現し、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧＭ２アフィニティーゲルでプロテアーゼを沈殿させた（図５Ｂ）。この沈殿物内在性のＮｒｆ２において、Ｋｅａｐｌ、Ｃｕｌ３及びＲｂｘ１が検出され、過剰発現カスパーゼ１がこれらのタンパク質と相互作用することが実証された。しかし、ＳＦＮによるＨＰＫの処理は、カスパーゼ−１とＲｂｘ１との間の相互作用を妨げなかった（図５Ｃ）。Ｎｒｆ２複合体タンパク質がインフラマソームタンパク質と直接相互作用するかどうかの問題に対処するために、本発明者らは、トランスフェクトされたＣＯＳ−１又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物との共ＩＰ実験を行った。しかし、Ｎｒｆ２、Ｋｅａｐｌ及びＲｂｘ１とカスパーゼ−１、ＩＬ−１β前駆体及びＮＬＲＰ３との相互作用は、再現可能な方法で検出できなかった（結果は示さず）。これらの実験は、Ｎｒｆ２とＮＬＲＰ３複合体との間の物理的クロストークを示し、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化のためのＮｒｆ２発現の必要性を説明することができる。

おそらく、この相互作用は直接的ではなく未知のタンパク質によって媒介される。Ｒｂｘ１がＨＰＫのＳＦＮ処理に際してもカスパーゼ−１に結合するという事実は、Ｎｒｆ２活性化因子が異なる分子メカニズムを介してインフラマソーム活性化を阻害する可能性を高める。この可能性に対処するために、本発明者らは、野生型及びＮｒｆ２ノックアウトマウスのＢＭＤＣをＳＦＮ又はビヒクルで処理した（図５Ｄ、Ｅ）。Ｎｒｆ２切除はＩＬ−１β成熟を減少させ、したがってインフラマソーム活性化を低下させたが、ＳＦＮはＮｒｆ２発現とは無関係にサイトカインの分泌を完全になくした。最も重要なことに、ＳＦＮによるインフラマソーム阻害は、Ｋｅａｐｌ非依存性である（図４Ｈ）。これらの実験は、Ｎｒｆ２切除及びＳＦＮが、異なる分子メカニズムによるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を阻害することを実証する。ＳＦＮがどのようなレベルでインフラマソーム活性化を阻止するかを分析するために、本発明者らはＳＦＮ処理及びインフラマソーム活性化ＴＨＰ１細胞におけるＡＳＣスペックの形成を測定した（図５Ｆ）。ＡＳＣスペックの形成は、インフラマソーム活性化の上流事象である。興味深いことに、ＳＮＦ処理は、アダプタータンパク質のオリゴマー化を妨げ、化合物によるインフラマソーム阻害が上流効果であることを実証した。

材料及び方法
材料
ＳＦＮ、ＤＭＦ、１５ｄ−ＰＧＪ２、ｔＢＨＱ、ザイモサン、ＡＴＰ、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）、シクロヘキシミド、ピューロマイシン及びドキシサイクリンをシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミュンヘン、ドイツ）から購入し、ニゲリシンをエンゾライフサイエンス（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）（ニューヨーク、米国−ニューヨーク州）から、ＭＧ１３２をカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ダルムシュタット、ドイツ）から、及びブラストサイジンをインビボゲン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（フランス、トゥールーズ）から購入した。製造元（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、米国−ミネソタ州）の指示に従って、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βの放出を測定した。ＭＳＵ結晶は、穏やかな塩基性条件下で尿酸の過飽和溶液を結晶化させることによって調製した。簡潔には、尿酸をＮａＯＨの溶液に添加し、尿酸が溶解しフィルターを通過するまで、溶液を沸騰させた。ＮａＣｌを添加し結晶化を４℃で行った。結晶を濾過し、スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）を用いて乾燥し、加重してオートクレーブした。

構築物
Ｎｒｆ２、ｄｎＮｒｆ２（Ａｌａｍら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９９９、２７４：２６０７１−２６０７８）、ｃａＮｒｆ２（Ｓｃｈａｆｅｒら、ＧｅｎｅｓＤｅｖ２０１０．２４：１０４５−１０５８）及びＫｅａｐ１の発現構築物は、ヴェルナー教授の好意により提供された。レンチウイルス系及びベクターは、（Ｃａｍｐｅａｕら、ＰＬｏＳＯｎｅ２００９．４：ｅ６５２９）に記載される。ｐＬｅｎｔｉＣＭＶｔｉｇｈｔＰｕｒｏＤＥＳＴ（ｗ７６８−１）（アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ）：２６４３０）、ｐＬｅｎｔｉＣＭＶｒｔＴＡ３Ｂｌａｓｔ（ｗ７５６−１）（アドジーン：２６４２９）、ｐＥＮＴＲ１ＡｎｏｃｃＤＢ（アドジーン：１７３９８）、ｐＬｅｎｔｉＣＭＶｔｉｇｈｔｅＧＦＰＰｕｒｏ（ｗ７７１−１）（アドジーン：２６４３１）。

抗体
ネズミ：ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ、ＡＦ−４０１−ＮＡ）、カスパーゼ−１（サンタクルズ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、米国−カリフォルニア州；ｓｃ−５１４）、Ａｓｃ（アディポジェン（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）、スイス、リースタル；ＡＬ１７７）、β−アクチン（シグマ、ＡＣ−１５）。ヒト：Ｎｒｆ２（サンタクルズ、ｓｃ−１３０２）、Ｋｅａｐ１（サンタクルズ、ｓｃ−１５２４６）、Ｒｂｘ１（アブカム（Ａｂｃａｍ）、ケンブリッジ、英国；ａｂ１３３５６５）、β−アクチン（シグマ、ＡＣ−１５）、ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ、ＭＡＢ２０１）、ＩＬ−１８（ＭＢＬ、ウォバーン、米国−マサチューセッツ州；ＰＭ０１４）、ラミンＡ／Ｃ（サンタクルズ、ｓｃ−６２１５）、α−チューブリン（カルビオケム、ＣＰ０６）、ＦＬＡＧ（Ｍ２、シグマ、Ｆ１８０４）。

ｓｉＲＮＡｓ
ｓｉＲＮＡはマイクロシンセ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）（バルガッハ、スイス）又はシグマ（ミュンヘン、ドイツ）から購入した。

インビボ腹膜炎モデル
前述のとおりマウスに２ｍｇのＭＳＵ結晶で６時間攻撃した（Ｃｈｅｎら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００６、１１６：２２６２−２２７１）。

統計分析
統計解析は、プリズムソフトウェア（ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ）（グラフパッドソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて行った。

マウス
すべての動物実験は、地方の獣医当局（チューリッヒ、スイス）の承認を得た。マウスを、連邦ガイドラインに従って無菌の動物施設に保管した。Ｎｒｆ２ノックアウトマウス（Ｃｈａｎら、米国科学アカデミー紀要、１９９６、９３：１３９４３−１３９４８）はサンフランシスコ、カリフォルニア大学のＹｕｅｔ−ＷａｉＫａｎ博士の好意により提供された。骨髄細胞中のｃａＮｒｆ２を発現するマウスを、ＬｙｓＭ遺伝子プロモーター（Ｃｌａｕｓｅｎら、ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ１９９９：８：２６５−２７７）の制御下でＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスを、β−アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーの制御下でｃａＮｒｆ２を発現するトランスジェニックマウスと交配させることによって作製した。全ての細胞における導入遺伝子の発現を避けるために、ｃａＮｒｆ２ｃＤＮＡは、ｌｏｘＰ部位に隣接され、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下においてｃａＮｒｆ２導入遺伝子の発現を可能とする（Ｓｃｈａｆｅｒら、ＥＭＢＯＭｏｌＭｅｄ２０１２、４：３６４−３７９）。

細胞
ヒト初代ケラチノサイト（ＨＰＫ）を単離し、記載のとおり増殖させた（Ｆｅｌｄｍａｙｅｒら、ＣｕｒｒＢｉｏｌ２００７。１７：１１４０−１１４５）。簡潔には、表皮成長因子（ＥＧＦ）及びウシ下垂体抽出物を補充したケラチノサイト無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ペイズリー、スコットランド）でＨＰＫを培養した。すべての実験において、ＨＰＫは３代継代で使用された。特定のｓｉＲＮＡ（補足表１）のトランスフェクションのために、ＨＰＫを１２ウェルあたり０．３〜０．５×１０^５の密度で播種した。翌日、ＨＰＫを１０ｎＭのｓｉＲＮＡ及び１μｌのＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ（ポリプラス（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、イルキルシュ、フランス）でトランスフェクトした。必要であれば、トランスフェクションを２日後に繰り返した。

ＴＨＰ−１細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集
ｇＲＮＡは、Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇオンラインツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）を用いて設計した。マイクロシンセ（バルガッハ、スイス）から一本鎖フォワード及びリバースＤＮＡオリゴを注文した。オリゴのリン酸化及びアニーリングの後、それらを、前述のとおりレンチウイルスの生産（Ｓａｎｊａｎａら、ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ２０１４。１１：７８３−７８４）に記載のＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ベクター（アドジーンプラスミド＃５２９６１）に連結した。ＴＨＰ−１細胞を形質導入し、２４時間後に培地を交換した。さらに２４時間後、選択するためにピューロマイシンを５μｇ／ｍｌの最終濃度となるよう添加した。

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ｑＲＴ−ＰＣＲは、全細胞ＲＮＡを用いてライトサイクラー４８０ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ又はファストスタートユニバーサルＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ（いずれもロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ロートクロイツ、スイス）を用いて行った。特定のプライマー対（補足表２）は、対応する遺伝子のイントロン−エクソン境界に隣接する約１５０ｂｐの断片を生成するように設計した。製造業者の指示に従って、ライトサイクラー４８０９６ウェルバージョン（ロシュ、ロートクロイツ、スイス）又はＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ、カールスバッド、米国−カリフォルニア州）を反応及び検出に使用した。

乳酸脱水素酵素アッセイ（ＬＤＨ）
上清を収集し、遠心分離（４００×ｇ）後に分析に使用した。細胞を２％トリトンＸ−１００の培地で１０分間溶解させた。ＬＤＨ活性は、製造者に従って測定した（Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ、プロメガ、マディソン、米国−ウィスコンシン州）。

共免疫沈降
記載されるとおり、ＨＰＫの溶解物を用いて共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）を行った（Ｓｏｌｌｂｅｒｇｅｒら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ２０１２。１８８：１９９２−２０００）。簡潔には、ＨＰＫを１０ｃｍディッシュで増殖させ、ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ又はＲｂｘ１を標的とするｓｉＲＮＡ）を用いてトランスフェクトし、８０％の密集度（３日間）まで増殖させた。４つのディッシュを、完全プロテイナーゼ阻害剤（ロシュ、ロートクロイツ、スイス）を含む１５０μｌｃｏ−ＩＰ緩衝液中でそれぞれ収穫した。ダウサー（ｄｏｕｎｃｅｒ）での処理の後、溶解物を遠心分離した（２０分間、１７０００×ｇ）。上清をｃｏ−ＩＰ緩衝液で１：１に希釈し、２０μｇの抗体（カスパーゼ−１又はＨＡ）を用いてインキュベートした。遠心分離後、１５０μｌ（５０ｍｇ／ｍｌ）のプロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア、リトル・チャルフォント、英国）を添加した。９０分後、ビーズをｃｏ−ＩＰ緩衝液で４回洗浄し、１００μｌの２×ローディングＳＤＳ緩衝液に再懸濁した。あるいは、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（シグマ）を用いて同時免疫沈降を行った。ＨＰＫを１０ｃｍディッシュで増殖させ、上述のとおりＦＬＡＧタグ化カスパーゼ−１又はＧＦＰをコードするレンチウイルス構築物を形質導入した。３日間の抗生物質選択の後、目的の遺伝子の発現がドキシサイクリンの添加によって誘導された。２４時間後、細胞を溶解緩衝液中に集め、遠心分離し、得られた上清を製造者の手順に従って免疫沈降に供した。

ＡＳＣオリゴマー化の分析
記載されるとおりＡＳＣスペックを分析した（Ｈａｒａら、ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ２０１３。１４：１２４７−１２５５）。

レンチウイルスの生産とＨＰＫの形質導入
目的の遺伝子を誘導可能に過剰発現するケラチノサイトを作製するために、本発明者らは、レンチウイルス系を使用した（Ｃａｍｐｅａｕら、ＰＬｏＳＯｎｅ２００９。４：ｅ６５２９）。ＤＮＡを発現ベクターからｐＥＮＴＲＩＡｎｏｃｃＤＢ（ｗ４８−１）ベクターにクローニングし、続いてレンチウイルスｐＬｅｎｔｉＣＭＶｔｉｇｈｔＰｕｒｏＤＥＳＴ（ｗ７６８−１）ベクターにサブクローニングした。所望の目的遺伝子をコードするｐＬｅｎｔｉＣＭＶｔｉｇｈｔＰｕｒｏＤＥＳＴ（ｗ７６８−１）ベクター又は逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター３（ｒｔＴＡ３）をコードするｐＬｅｎｔｉＣＭＶｒｔＴＡ３Ｂｌａｓｔ（ｗ７５６−１）のいずれかの混合物及び二つのパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることによりレンチウイルスを作製した。トランスフェクションの４８時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を回収し、１６０００×ｇで４時間遠心分離した。得られたウイルスペレットをＫ−ＳＦＭに再懸濁し、新たに解凍したＨＰＫに添加した。形質導入の２４時間後、培地を交換し、細胞をさらに２４時間放置してから、選択（ブラストサイジン１μｇ／ｍｌ及びピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌ）を実施した。２４〜４８時間後、形質導入したＨＰＫを１２ウェルプレートに播種した。翌日、２０時間、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を添加することにより目的の遺伝子の発現を誘導した。

Claims

式（Ｉ）：
により特定される化合物であって、各Ｒ１は独立してＣ_１−Ｃ_６アルキルから選択される、痛風、ざ瘡、２型糖尿病、白斑及び／又は壊疽性膿皮症の予防又は治療に使用するための前記化合物。
各Ｒ１はメチル（ＣＨ_３）である、痛風、ざ瘡、２型糖尿病、白斑及び／又は壊疽性膿皮症の予防又は治療に使用するための前記式（Ｉ）により特定される化合物。
痛風、ざ瘡、２型糖尿病、白斑及び／又は壊疽性膿皮症の予防又は治療に使用するための請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を含む剤形。
請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、痛風、ざ瘡、２型糖尿病、白斑及び／又は壊疽性膿皮症の治療又は予防方法。