JP2019504011A - グルテン不耐症およびそれにより発生する障害を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載される本発明は、１つまたは複数のウツボカズラ酵素を含む医薬組成物の投与による、グルテン不耐症ならびに関連の状態（例えば、セリアック病およびグルテン過敏症）の１つまたは複数の症状の治療のための方法および組成物に関する。【選択図】図１

Description

［関連出願との相互参照］
本願は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている２０１５年１２月１６日出願の米国仮特許出願第６２／２６８，４４５号の優先権を請求するものである。

本明細書に提供されるのは、グルテン不耐症および関連の状態、例えばセリアック病やグルテン過敏症などの治療のための組成物および方法である。食物タンパク質抗原としては、グルテンを含有するコムギ、オオムギ、ライムギなどに見られるタンパク質など、難消化性のプロリンに富む食物が挙げられる。特にグルテンは、消化管中で部分的に加水分解されて、炎症性応答および臨床症状に至らしめることがある。この発明の組成物および方法は、腸でそのような食物タンパク質抗原の量の低減をもたらし、次にそれによって、グルテン不耐症およびセリアック病の症状が低減される。

いくつかの疾患は、過敏性の高い個体内で、抗原性の食物タンパク質に対する反応によって媒介される。例えば、コムギ、オオムギおよびライムギは、抗原性の食物タンパク質（例えば、グルテン）を含有し、その摂取によって、異常な自己免疫応答、例えばセリアック病、小麦アレルギー、や疱疹状皮膚炎をグルテン不耐症の個体に引き起こすことがある。グルテンとは、グルタミンおよびプロリンに富むグルテニンタンパク質分子とプロラミンタンパク質分子との混合物である。

セリアック病は、小腸に影響を及ぼす自己免疫障害である。セリアック病の特徴である異常な自己免疫応答を有する個体の多くが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＱ２分子またはＤＱ８分子を発現する。臨床的には、セリアック病は、グルテンおよび組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）に特異的な抗体を定量することによって、部分的に検出可能である。自己免疫応答の結果として、腺窩の過形成および粘膜の炎症を伴って、小腸粘膜の絨毛の萎縮が発達する。セリアック病の症状は、個体によって様々になり得るものであり、疲労、慢性下痢、便秘、栄養の吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血、ならびに骨粗鬆症および腸の悪性腫瘍（リンパ腫および癌腫）の発達するリスクの実質的な亢進のうち、１つまたは複数を含むことがある。

疾患の症状は、グルテンタンパク質に対する反応によって引き起こされ、消費される穀物製品中の他の貯蔵タンパク質（例えばセルピン、プリニン）も含むことがある。これらのタンパク質／プロラミンは、胃の酵素による完全なタンパク質分解に対し部分的な抵抗性を付与する配列の組合せで、高いレベルのプロリン（１５％）およびグルタミン（３５％）を有する。この配列は、全体の消化の動力学を乏しいものとし、腸のエキソプロテアーゼおよびエンドプロテアーゼによるさらに進んだ消化に耐性である長さ３０〜４０アミノ酸残基のペプチドを生成する。αおよびγ−グリアジンに主に由来するこれらの産物のある画分は、９０％を超えるＣＤ患者に随伴するＭＨＣクラスＩＩ分子であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＱ２およびＤＱ８に親和性を有する。上記のペプチドは、複数の抗原性領域にわたって広がるのに充分な大きさがあり、腸での酵素による脱アミド化のためのグルタミン残基を呈示する。ＨＬＡ親和性はグルタミンからグルタメートへの変換によって増加することから、この脱アミド化によって、炎症性応答が大幅に増幅される。

Ｉ型糖尿病は、セリアック病のリスク要因である。自閉症もまた、セリアック病に関連があり、グルテンフリー制限食は、自閉症のいくつかの症状を軽減する助けとなることがある。同様に、注意欠陥多動性障害のある人には、常食物からグルテンが除去されると示す症状がさらに少なくなる人がいるものと考えられる。食事由来のグルテンの排除により恩恵を受けることがある他の状態としては、関節リウマチおよび線維筋痛症が挙げられる。

グルテン不耐症、特にセリアック病のための治療は、通例、一生続く厳格なグルテンフリー制限食を含む。しかし、グルテンフリー制限食は、不便かつ拘束的であり、グルテンを避けるのは困難である。それゆえ、グルテン不耐症およびセリアック病の有効な代替の治療が求められている。

この発明は、本明細書に記載されるような１つまたは複数のウツボカズラ（Nepenthes）酵素を含む医薬組成物を投与する結果、グルテン不耐症およびセリアック病を含めて、食物抗原に対する免疫応答により発生する症状の低下が生じるという発見に関する。具体的には、１０００：１と１５０００：１との間の比（総タンパク質と酵素）で組成物を投与することは、組成物の安全性および認容性を維持しつつタンパク質（具体的にはグルテンペプチド）の抗原性を低減するのに充分であると考えられる。

グルテンタンパク質（例えば、グリアジンおよびグルテニン）の毒性は、ヒトの消化酵素（ペプシンを含む）がタンパク質を不完全に分解する間に生産される、プロリンおよびグルタミンに富むペプチドに大きく起因すると考えられる。胃および膵臓のエンドプロテアーゼは、これらの不完全な分解による毒性または免疫原性のペプチド副産物を切断することができず、それは、少なくとも部分的には、そのような酵素がプロリンおよび／またはグルタミンに対する特異性に欠けるという事実に起因する。これらのペプチドは、過敏性の個体に非常に数多くの腸の症状を引き起こすと考えられ、そのような症状としては、上皮内のリンパ球増多、絨毛の萎縮および／または炎症が挙げられる。コムギに存在する他のタンパク質もまた、自己免疫応答に関与する場合があり、そのようなタンパク質としては、セルピン、プリニン、アルファ−アミラーゼ／プロテアーゼ阻害物質、グロブリンおよびファリニンが挙げられる。

Ｔ細胞は、過敏性の個体における抗原性の侵襲（すなわち、毒性の食物ペプチドの存在）に対する最初のレスポンダーである。Ｔ細胞は、抗原の侵襲に敏速に反応して、炎症を引き起こし、場合によっては、腸の崩壊を引き起こす。そのため、腸でのＴ細胞の低減は、免疫応答の低下を標示するものであり、過敏性の個体における免疫原性食物（例えばグルテン）の消費に伴う症状の低減または排除の潜在的な指標である。

理論に拘束されるものではないが、グルテン（または他の抗原性のタンパク質）を本明細書に記載されるような医薬組成物と接触させることによって、タンパク質は、免疫応答を低減または排除する（すなわち、毒性ではないか、または毒性の少ない）小さなポリペプチド断片に解体されると考えられる。

本明細書に記載されるような医薬組成物を使用して、食事由来のタンパク質、具体的には消化管酵素によって有効に分解されないプロリンおよび／またはグルタミンに富むタンパク質を分解できるものと想定される。さらに、そのような分解は、タンパク質の吸収を増加させるおよび／または免疫原性を低下させるものと想定される。そのような結果によって、腸の疾患および障害（例えば、セリアック病、グルテン不耐症、過敏性腸症候群、大腸炎、クローン病、食物アレルギーなど）の症状に有益な効果がもたらされることがある。一実施形態では、医薬組成物の投与によって、栄養吸収が改善される。

ＧＩ管の酵素補充は、グルテンの消化の結果生じるものを含めて、抗原性ペプチドに対する免疫応答を鈍らせるための可能性ある療法として登場しており、この療法は、炎症を誘発する主要な抗原性領域においてペプチドサイズを低減することによって行われる。少数の候補物が、そのような目的のために供試されており、多くはプロリルエンドプロテアーゼ（ＰＥＰ）またはプロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）を含む。試験が進んでいる２つの選択肢は、ＡＮ−ＰＥＰ、すなわちコウジカビ（Aspergillus niger）由来のプロリルエンドプロテアーゼと、ＡＬＶ００３、すなわちスフィンゴモナス・カプスラーテ（Sphingomonas capsulate）由来のＰＯＰとグルタミンを標的とするシステインエンドプロテアーゼとの組合せである。

しかしながら、典型的な食事の総タンパク質負荷の複雑さは、補充ストラテジーおよび適切な投薬量を規定するはずである。乳製品、赤身の肉や魚などの食品は、高レベルのプロリンを含むタンパク質を含有し、プロリルエンドプロテアーゼにのみ依存する療法に対し基質負荷を増加させるものとなる。例えば、プロリンは、グリアジンとおおよそ同じ画分レベルで、ベータ−カゼインでは最も豊富なアミノ酸である。チーズサンドイッチは、１．６ｇのグリアジンだけでなく１．８ｇのベータカゼインをも与え、これはＰＥＰベースの療法の基質負荷の２倍である。それゆえ、グルテンフリー制限食の代替として酵素ベースのグルテン解毒療法を考える場合に、総タンパク質は、より安全な程度の基質負荷となる。すなわち、平均総タンパク質消費は、１日当たり２０ｇと７５ｇとの間、好ましくは１日当たり約５０ｇであるものと見積もられる。理に適った投薬量で効能を達成することは、セリアック病の最適な治療としてグルテンフリー制限食と置き換えることの障害となったままである。上述の酵素補充の候補は、消費の限定された状況でグルテンフリー制限食を補うのに最も適するように思われる。

熱帯地域でサルのコップとして通例知られる食虫性の嚢状葉植物である、ウツボカズラの嚢状葉分泌物は、複数のプロテアーゼを含む。濃縮されたウツボカズラ嚢状葉体液は、プロリンおよびグルタミンに富むグルテンペプチドに高い特異性を有する。本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１８６３３０号および第２０１４／０１４０９８０号は、濃縮されたウツボカズラ嚢状葉体液および組換えウツボカズラ酵素の活性および特異性を記載している。嚢状葉体液は酸性であり、その中にある酵素は、概して酸性のｐＨで最も活性がある。

ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）は、ウツボカズラ嚢状葉分泌物ならびに種々の他の植物源から単離または濃縮することができる、アスパラギン酸プロテアーゼである。Tokes et al, Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenthe smacferlanei L., Planta (Berl.) 119, 39-46 (1974)。ネペンテシンの活性は、食物タンパク質をペプチドに分解する役割を部分的に担う、ヒトの胃に存在する酵素であるペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）よりも高いことが見出されている。ネペンテシンは、２つの公知のアイソタイプ、すなわちネペンテシンＩ（２つのバリアント：ネペンテシンｌａおよびネペンテシンｌｂを有することで知られる）およびネペンテシンＩＩを有する。

新規のプロリルエンドペプチダーゼであるネプロシンは、プロリンに富むタンパク質およびオリゴペプチド（グルテンタンパク質など）を切断するための高いタンパク質分解活性を有する。ネプロシンは、ウツボカズラの嚢状葉分泌物から単離または濃縮することができ、広いｐＨ範囲で活性であり、低いｐＨ（例えば、約３から５）で特に活性である。ネプロシンのタンパク質配列は、ゲノムデータベースにある他のどの公知のタンパク質とも相同ではない。ネプロシンは、プロリンのカルボキシ（Ｃ）末端側でペプチドを効率良く切断することができる。この切断は、高度に特異的であるものと思われる。ネプロシンは、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１６／００２２７８５号に記載されている。

ネプロシン、ネペンテシンＩ、およびネペンテシンＩＩは、単独または組合せで、高いタンパク質と酵素との比で、毒性の食物ペプチドをさらに小さな非毒性ペプチドに切断することができる。酵素は広い酸性ｐＨ範囲で活性であるため、酵素による消化を、胃の酸性環境中で開始することができる。

一実施形態では、腸の炎症は、腸におけるＩＥＬの浸潤および／または増殖という特徴がある。したがって、一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原（複数可）の存在に起因する腸の炎症を減弱させるまたは予防するための方法に向けられ、この方法は、少なくとも１つのウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、医薬組成物の量は、ペプチド性食物抗原の存在に起因する腸の炎症を減弱させるまたは予防するのに有効である。一実施形態では、腸の炎症は、内在的な胃のおよび／または腸の酵素による、潜在的に抗原性を持つ食物タンパク質の不完全な消化に起因する。

一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原の存在に起因する上皮内のリンパ球増多を減弱させるまたは予防するための方法に向けられ、この方法は、少なくとも１つのウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、医薬組成物の量は、腸中で上皮内のリンパ球増多を阻害するのに有効である。

一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食物またはタンパク質の摂取の前に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食物またはタンパク質の摂取とともに、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食物の摂取後に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食物またはタンパク質の消費に関わらず、哺乳動物に投与される。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、１つまたは複数のコムギタンパク質である。

一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、消費される抗原性の可能性があるタンパク質の量に依存する。好ましくは、組成物は、１００：１と１５０００：１の間の総タンパク質と酵素との比で投与される。

一実施形態では、ウツボカズラ酵素は、ウツボカズラ植物の嚢状葉体液から濃縮、単離、または抽出される。一実施形態では、ウツボカズラ酵素は、組換えネペンテシンＩ、組換えネペンテシンＩＩ、組換えネプロシン、それらのバリアント、またはそれらの混合物を含む。

一実施形態では、それらのバリアントは、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性をアミノ酸配列が有する、タンパク質を含む。一実施形態では、それらのバリアントは、配列番号２、配列番号４、および配列番号１４からなる群から選択されるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸と少なくとも８５％の配列相同性をアミノ酸配列が有する、タンパク質を含む。

一実施形態では、食物は液体である。一態様では、食物は固体である。好適な一実施形態では、医薬組成物は経口的に投与される。

一実施形態では、医薬組成物は、潜在的に免疫原性のタンパク質を含有する食物を患者が摂取しているか（例えば、そうと知りながら摂取しているか）否かに関わらず投与される。一実施形態では、医薬組成物は、必要に応じて、例えば、潜在的に免疫原性のタンパク質によって汚染される可能性があるか、または潜在的に免疫原性のタンパク質の含有量が未知である、食事の前に、間におよび／または後に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、定期的に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、１日当たり少なくとも１回投与される。一実施形態では、医薬組成物は、１日当たり２回、３回、４回、またはそれを超える回数で投与される。一実施形態では、医薬組成物は、各食事および／または軽食と併せて（例えば、前に、間に、または後に）投与される。一実施形態では、医薬組成物は、徐放性製剤の一部として含まれ、そこでは、食物の抗原性タンパク質の含有量に関わらず断続的な軽食などを可能にする、酵素の継続的な放出がある。

一実施形態では、医薬組成物は、水系で約ｐＨ２で維持され、そこでは、前記酵素の遊離アミノ基が荷電している。一実施形態では、組成物は、胃の中で酸に接触する前に中性ｐＨで維持される。一実施形態では、医薬組成物は、組成物のｐＨが胃の中で酸に接触するとｐＨ５または６で維持されるように、医薬的に許容可能な緩衝液を含む。

一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１ｇの間である。好ましくは、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１０ｍｇの間である。さらに好ましくは、医薬組成物の有効量は、１日当たり約５ｍｇ未満である。

一実施形態では、医薬組成物の有効量は、基質（例えば、グルテンもしくは他の潜在的に免疫原性のタンパク質、または総タンパク質）１ｇ当たり約１ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、１日の総タンパク質５０グラム当たり約１ｍｇと約２０ｍｇの間である。好適な一実施形態では、医薬組成物の有効量は、１日の総タンパク質５０グラム当たり約１ｍｇと約１０ｍｇとの間である。

一実施形態では、医薬組成物は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、またはそのバリアントのうち２つ以上を含む。

一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一態様では、ヒトは、グルテン過敏症またはセリアック病に罹っている。一態様では、腸の抗原タンパク質過敏性は、直接的または間接的に、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症および／または疱疹状皮膚炎と相互に関係があることが想定される。この発明の組成物を用いてそのような抗原性の腸のタンパク質を腸から除去することは、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症および／または疱疹状皮膚炎に正の効果を有するものとなることがさらに想定される。好適な一実施形態では、ヒトはセリアック病に罹っている。

一態様では、この発明は、腸に移動する摂取タンパク質の毒性ペプチドの含有量を低減するための、有効量のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、またはそれらの混合物を含む、医薬組成物に向けられる。好適な一実施形態では、医薬組成物は、ネプロシンもしくはバリアントおよび／またはそれらの塩を含む。さらに好適な一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加のウツボカズラ酵素をさらに含む。一実施形態では、追加のウツボカズラ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらのバリアントおよび／またはそれらの塩を含む。

理論に拘束されるものではないが、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、およびネプロシンは、中性から酸性のｐＨで、より活性が低いかまたは実質的に不活性であると考えられる。このことは、酵素による望ましくない消化の可能性がある場合には、重要であることがある。例えば、医薬組成物が経口的に投与される場合にでは、口腔粘膜、食道粘膜および組成物と接触する状態となり得る他の細胞が、その中の酵素によって消化されることのないように、組成物をｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ６．５、またはそれよりも大きく緩衝し、その結果、より活性の低い形態の酵素を生じるものとすることがある。同様に、組成物を食物に添加する際に、緩衝された酵素は、食物が消費される前にそれを消化することができない（またはあまりできない）ものとなる。そのような状況では、胃の酸性環境に組成物を導入することは、ｐＨの低下および酵素の活性化をもたらすものとなる。

一実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ５、ｐＨ６、もしくはｐＨ６．５に、またはそれよりも高く緩衝されている。好適な一実施形態では、組成物は、約ｐＨ５から約ｐＨ８．５に緩衝されている。一実施形態では、組成物は、液体の形態である。一実施形態では、組成物は、固体の形態である。一実施形態では、組成物のｐＨは、液体の形態に調整され、組成物は乾燥されて固体を形成する。

一実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の追加のプロテアーゼを含む。一実施形態では、１つまたは複数の追加のプロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼである。一実施形態では、医薬組成物は、１つまたは複数の追加のエキソプロテアーゼ、例えば、ロイシンアミノペプチダーゼやカルボキシペプチダーゼなどを含む。一実施形態では、１つまたは複数の追加のプロテアーゼは、トリプシンである。好適な一実施形態では、１つまたは複数の追加のプロテアーゼは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２〜６）で活性である。

一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む製剤に向けられ、ここでは、製剤が胃の中に存在する間に酵素が継続的に放出されるように、酵素は、遅延放出性の媒体中に存在する。一実施形態では、製剤は、胃の中で酸と接触する前に、約５超のｐＨを有する。一実施形態では、組成物のｐＨが胃の中で酸と接触すると、少なくとも一時期は約ｐＨ５または６のままとなるように、製剤は生物学的に許容可能な緩衝液を含む。

一実施形態では、本発明は、単位用量の医薬組成物の製剤に向けられる。例えば、そして限定はないが、単位用量は、錠剤、カプセルなどの中に存在していてもよい。単位用量は、固体、液体、粉末、または任意の他の形態であってもよい。理論に拘束されるものではないが、単位用量の医薬組成物の製剤は、過剰量の組成物を投与することの潜在的な負の副作用を回避するとともに、適正な用量投与（例えば、摂取された免疫原性タンパク質の量に基づいて）を可能にするものとなることが想像される。

一実施形態では、本発明は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンおよび／またはそれらのバリアントのプロ酵素の形態に向けられる。一実施形態では、プロペプチドは、酵素の上に存在する。好適な一実施形態では、プロペプチドは、酸性ｐＨによって除去され、それによって酵素が活性化される。一実施形態では、プロペプチドは、天然に発生する酵素のプロペプチドのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは、人工のプロペプチドまたは異種のプロペプチド（すなわち、異なるタンパク質および／または種由来の酸に不安定なプロペプチド）である。

図１Ａは刺激されたウツボカズラ体液由来のタンパク質濃縮物の特性解析および安定性試験を示す図である。Ｃ末端切断選好性（Ｐ１位置）を、昇温での蓄積時間の関数として示す。体液濃縮物を、３７℃で０〜７日間インキュベーションした。広範に非特異的に消化するという抽出物の特徴の変化は、時間を通じて観察されなかった。総合的な低減は、ヘモグロビンアッセイ（示さず）を用いて測定した際に、総活性の僅かな全体の低減と相関した。データは、３７℃（ｐＨ２．５）での２分間のタンパク質標品の溶液中消化から収集し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて切断選好性を決定した。各アミノ酸について、残基の総数に対する観察された末端残基数をパーセントで計算することによって、切断の選好性を見積もった。

図１ＢはＮ末端切断選好性（Ρ１’位置）を昇温での蓄積時間の関数として示す図である。データは、図１Ａについて記載されたように生成し収集した。広範に非特異的に消化するという抽出物の特徴の変化は、時間を通じて観察されなかった。

図１Ｃは組換えのネペンテシンＩおよびＩＩの切断選好性を、Ｐ１位置のウツボカズラ体液タンパク質濃縮物と比較して示した図である。一連のタンパク質標品由来のＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを用いて、上記に規定されたように総量に対する相対的な％切断としてデータを示す。この比較では、３つ全ての酵素調製物について、試料を溶液中３７℃で５分間消化した。Ｃ末端プロリン（Ｐ）の切断がないことは、組換え酵素と体液タンパク質濃縮物との主な違いを表している。

図１Ｄは組換えのネペンテシンＩおよびＩＩの切断選好性を、Ｐ１’位置のウツボカズラ体液タンパク質濃縮物と比較して示す図である。図１Ｃについて記載されたようにデータを示す。

図２Ａは胃のペプシン（基質：ヘモグロビン）と比較した際の濃縮体液の相対的な消化活性のプロファイルをｐＨの関数として示す図である（ｎ＝３の平均＋／−標準偏差）。

図２Ｂはタンパク質分解阻害剤がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の消化に及ぼす効果を、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって測定した図である。阻害剤：ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、Ｐ（ペプスタチン）、Ｌ（ロイペプチン）、Ｅ（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＺＰＰ（Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセタール）。記述されたところを除いて、全ての阻害剤濃度を１ｍＭとした。抽出物：体液タンパク質抽出物、Ｍ：レーンマーカー。

図２Ｃは抽出物のアリコートを用いて消化した粗グリアジンスラリーの重量分析を示す図である。挿入図：タンパク質富化体液抽出物を用いた、スラリーの経時プロファイリング（左から右：０、３０、６０、９０分）。

図２Ｄはタンパク質−富化体液の銀染色ＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図であり、画分の限定的な複雑さと、ペプシン存在下でのタンパク質分解の高い安定性とを示す。

図３Ａはタンパク質分解性を有する活性化された体液抽出物由来の２つの画分の単離から得た結果を示す図である。左：ネペンテシンを含有する画分１の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび画分１によりプロセッシングした３３ｍｅｒペプチドのＭＡＬＤＩスペクトル。右：未知の酵素を含有する画分２の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび画分２によりプロセッシングした３３ｍｅｒペプチドのＭＡＬＤＩスペクトル。未消化の３３ｍｅｒのＭＡＬＤＩを赤で、消化された３３ｍｅｒを黒で示す。

図３Ｂはこの研究で名称をネプロシンとした画分２の酵素を２つのドメインからなる構築物として同定する、配列同定のストラテジーを示す図である。

図４Ａはネプロシンのタンパク質配列を示す図であり、この配列は、ＲＮＡ−ｓｅｑデータ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した画分の非特異的な消化物に由来するｄｅ ｎｏｖｏペプチドシークエンシング、ならびに５’および３’ＲＡＣＥを使用した完全長への延長を組み合わせることにより同定した。ドメイン境界を、Ｐｆａｍでの呼称に基づくものとし、シグナルペプチドを、ＳｉｇｎａｌＰ４．１によって検出した。

図４Ｂは単離された画分のタンパク質含有量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、純度が確認され、成熟した酵素が図４Ａの完全配列よりも小さいことが示唆されることを示す図である。推定分子量は２８，８６０である。

図４Ｃは単離および変性されたネプロシンの非特異的な（ペプシンによる）消化から同定したペプチドを示す図であり、５’および３’ＲＡＣＥ（覆域５１％）を使用して同定した配列を支持するものである。出力は、Ｍａｓｃｏｔ ｖ２．３を使用して検出したユニークなペプチドを表し、ｐ＜０．０５についてフィルタリングされている。

図５ＡはＮｐｒおよび他のＤＵＦ２３９ファミリーメンバー（Ｐｆ３０８０）のドメイン編成を示す図である。Ｐｆａｍデータベースの多くのエントリは、ＤＵＦ４４０９とＤＵＦ２３９を縦並びに含有し、多くがシグナルペプチドを持つ。「その他」の分類は、様々なドメインの反復およびＤＵＦ４４０９のみを含む。

図５ＢはＮｐｒｌ（上部）に最も高いパーセントの同一性を有するＢＬＡＳＴのヒット、およびＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アラインメントに基づく階層的クラスタリングを示す図である。

図６はネプロシンと、グルテンの解毒の研究に使用されている公知のプロリン切断酵素との比較を示す図であり、公知のプロリン切断酵素との配列の、機能的な、または構造的な相違を強調している。

図７は中程度に高い頻度でプロリン残基を有する５１１残基のタンパク質である、タンパク質「アプラタキシンおよびＰＮＫ様因子」（ＡＰＬＦ）の配列マップを示す。ＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ機器でＨＣＤ断片化を使用してデータを生成し、酵素特異性がないものと仮定してデータをＭａｓｓ Ｓｐｅｃ ＳｔｕｄｉｏでＡＰＬＦの配列に対して検索し、結果をペプチドの偽発見率（ＦＤＲ）０．５％で切り捨てた。

図８Ａはペプシンのマイクロモル濃度を標示した、１０ｍｇ／ｍＬグリアジンの経時の消化を示す図である（３７℃でｐＨ２．５）。消化されたグリアジンの濁度を、５９５ｎｍ（Ａ_５９５）での吸光度としてモニターした。黒線はプロテアーゼ非存在下でのグリアジンスラリーの濁度を表す。測定精度は＜３％ＲＳＤ（ｎ＝３）であった。

図８Ｂはウツボカズラ体液プロテアーゼのマイクロモル濃度を標示した、１０ｍｇ／ｍＬグリアジンの経時の消化を示す図である（３７℃でｐＨ２．５）。消化されたグリアジンの濁度を、５９５ｎｍ（Ａ_５９５）での吸光度としてモニターした。黒線はプロテアーゼ非存在下でのグリアジンスラリーの濁度を表す。測定精度は＜３％ＲＳＤ（ｎ＝３）であった。

図８Ｃは５μΜペプシンを補充されたウツボカズラ体液プロテアーゼのマイクロモル濃度を標示した、１０ｍｇ／ｍＬグリアジンの経時の消化を示す図である（３７℃でｐＨ２．５）。消化されたグリアジンの濁度を、５９５ｎｍ（Ａ_５９５）での吸光度としてモニターした。黒線はプロテアーゼ非存在下でのグリアジンスラリーの濁度を表す。測定精度は＜３％ＲＳＤ（ｎ＝３）であった。

図８Ｄはウツボカズラ体液酵素のみ、およびペプシンのみを用いた消化について、最大限の効果の９０％で測定された、スラリーの清澄化速度を示す図である。データは図８Ａ〜図８Ｃから得た。値を消化時間分当たりのマイクロモル酵素濃度当たりのグリアジンのミリグラムとして出力した。

図９Ａは希釈条件下で体液プロテアーゼを用いた、２０：１（グリアジン：酵素）でのα−グリアジンペプチド３３ｍｅｒの消化プロファイルを示す図である。カフェインを内部標準として使用して、正規化された相対存在量をＬＣ−ＭＳイオンクロマトグラムから測定した。

図９Ｂは標示濃度のペプシンで消化された１０ｍｇ／ｍＬグリアジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。消化は、ｐＨ２．５および３７℃で９０分間とした。全ての濃度をμΜとした。Ｍ：分子量マーカー、およびグリアジン：プロテアーゼ非存在下での総粗グリアジン。

図９Ｃは標示濃度の体液プロテアーゼで消化された１０ｍｇ／ｍＬグリアジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。消化は、ｐＨ２．５および３７℃で９０分間とした。全ての濃度をμΜとした。Ｍ：分子量マーカー、およびグリアジン：プロテアーゼ非存在下での総粗グリアジン。

図９Ｄは体液プロテアーゼと組み合わせて標示濃度のペプシンで消化された１０ｍｇ／ｍＬグリアジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。消化は、ｐＨ２．５および３７℃で９０分間とした。全ての濃度をμΜとした。Ｍ：分子量マーカー、およびグリアジン：プロテアーゼ非存在下での総粗グリアジン。

図９Ｅはイオンクロマトグラム強度を加重に用いて、加重平均ペプチド長を、ペプシンの存在または非存在下での体液プロテアーゼ濃度の関数として示す図である。ペプチドデータはＬＣ−ＭＳ／ＭＳのラン由来であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ １．０を使用して得られた強度を付記した。

図９Ｆは記された酵素濃度における図９Ｅ由来のデコンヴォルーションされたスペクトルのバーコード表現を示す図であり、強度の単純な２値モデルを用いた分子量の分布を示す。（白：＜０．２％、黒：＞０．２％）．

図９Ｇはグリアジン消化産物から脱アミド化カウンターパートへのＴＧ２誘導性変換を示す図である。画分の脱アミド化を、全てのペプチドについてイオンクロマトグラム強度から定量した。すなわち、データを比として示し、その際に、抗原性ペプチドの脱アミド化を、標示されたプロテアーゼ濃度での非抗原性ペプチドの脱アミドに正規化した。抗原性領域を、挿入された表のＤＱ２クライテリアを用いて規定した。

図１０は表４のデータに関連する階層的クラスターのグラフである。分岐点は、有意なペプチドマッチの累積スコアを表し、このペプチドマッチは、分岐間のいかなる区別も除くために排せねばならないものとする。

図１１Ａは粗グリアジン中のα／β−グリアジンＭＭ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８５７３．１）の配列覆域地図、および関連の総イオンクロマトグラムである。消化には、０．４６μΜの体液プロテアーゼを９０分間、３７℃で使用した。赤い文字を用いて配列の覆域を強調し、併せて太字のシアンで切断部位に印を付けた。消化産物のサイズについて、近接する境界を用いてクロマトグラムに印を付けた。

図１１Ｂは粗グリアジン中のα／β−グリアジンＭＭ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８５７３．１）の配列覆域地図、および関連の総イオンクロマトグラムである。黒の線跡は、Ａ（約０．１μΜ）の体液抽出物中に供試された最も高いレベルに合致するネプロシンの濃度を表し、赤の線跡は、この濃度の２倍（約０．２μΜ）を表す。赤い文字を用いて配列の覆域を強調し、併せて太字のシアンで切断部位に印を付けた。消化産物のサイズについて、近接する境界を用いてクロマトグラムに印を付けた。

図１２Ａはαおよびγ−グリアジンの抗原性領域にわたって広がる３つのペプチド（上部）の経時的な消化プロファイルを示す図である。１０ｍｇ／ｍＬの粗グリアジンスラリーに、ｔ＝０で０．４６μΜの体液プロテアーゼ（ネペンテシンとネプロシン４：１）および５μΜのペプシンを補充した。上部にペプチドの名称でコードされたデータの色は、決定した値の平均（ｎ＝３、相対標準偏差＜２％）を表し、この値は、ペプチドの安定同位体標識バージョンに対し標準化されて、最大強度に正規化された値として出力された。

図１２Ｂはαおよびγ−グリアジンの抗原性領域にわたって広がる３つのペプチド（上部図１２Ａ）の経時的な消化プロファイルを示す図である。１０ｍｇ／ｍＬの粗グリアジンスラリーおよび９０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンに、ｔ＝０で０．４６μΜの体液プロテアーゼ（ネペンテシンとネプロシン４：１）および５μΜのペプシンを補充した。上部にペプチドの名称でコードされたデータの色は、決定した値の平均（ｎ＝３、相対標準偏差＜２％）を表し、この値は、ペプチドの安定同位体標識バージョンに対し標準化されて、最大強度に正規化された値として出力された。

図１３はＮＯＤ ＤＱ８トランスジェニックマウスの実験デザインおよびグリアジン給餌スケジュールを示す図である。コレラ毒素（ＣＴ）およびペプシン−グリアジン（Ｐ−Ｇ）を週１回で３週間使用して、４群のマウス（群当たりｎ＝８）を感作した。重量比１００：１のグリアジンと酵素を用いてＰ−Ｇを調製した。次いで、各群を、（Ａ）腸の炎症の陽性対照としてＰ−Ｇの用量に、（Ｂ）０．０２Ｍ酢酸の媒体に、（Ｃ）ペプシンを比１００：１で、および体液酵素濃縮物を比２６４：１で用いて共消化されたグリアジンに、（Ｄ）ペプシンを比１００：１で、およびネペンテシンＩＩを比１００：１で用いて共消化されたグリアジンに、週３回で３週間曝露した。全ての用量を、５ｍｇの量に調製し、３７℃で９０分間消化し、次いで凍結乾燥した。乾燥されたフィードを、用量投与時に、０．０２Ｍ酢酸を用いて再構成した。

図１４はペプシン処理されたグリアジン（陽性対照）、媒体のみ（陰性対照、グリアジンフリー制限食）、体液プロテアーゼ処理されたグリアジン（比１：２６４）、および組換えネペンテシンＩＩ処理されたグリアジン（比１：１００）に曝露された感作マウスについて、腸組織の免疫染色によって定量された上皮内リンパ球のカウント（ＩＥＬＳ）を示す図である。４つの状態について腸組織の代表的な免疫染色切片を右側に示す。統計学的有意性（各状態についてｎ＝８、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

この発明は、記載される具体的な実施形態に限定されず、それはそのようなものが当然ながら様々となり得るためであることを理解されたい。また、この発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を記載することのみを目的としており、限定を意図しないものであることを理解されたい。

本発明の詳細な記載は、読み手の利便性のためにのみ、様々な項に分けられているのであって、いかなる項に見出される開示も、別の項にあるものと組み合わされてもよい。
Ｉ．定義

別段規定されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができるが、好適な方法、デバイスおよび材料をこれより記載する。本明細書に引用される全ての技術刊行物および特許公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。先行発明により本発明がそのような開示に先行する権利が与えられないことを認めると解釈されるものは、本明細書にはない。

本明細書および特許請求の範囲で使用される際に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」とは、文脈が別段明記しない限り、複数形を含む。

本明細書に使用される際に、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、組成物および方法が、記載される要素を含むが他を除外しないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用される際の「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、その組み合わせにとって任意の本質的な重要性を持つ他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で定義されるような要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲に記載される発明の基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない他の要素を除外しないものとなる。「からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、痕跡量よりも多い他の成分および記載される実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

本明細書に使用される際に、「抗原性の可能性がある食物またはタンパク質」とは、過敏性個体の腸において免疫および／または炎症性応答を引き起こし得る任意の食物またはタンパク質である。好適な一実施形態では、個体とはヒトであり、食物とはヒトによる消費を意図されている食物である。抗原性の可能性がある食物としては、限定はないが、コムギ、ライムギ、オオムギ、ピーナッツ、ナッツおよび種子が挙げられる。一実施形態では、これらの食物由来の抗原性の可能性があるタンパク質としては、プロラミンタンパク質、２Ｓアルブミン、非特異的脂質輸送タンパク質、二機能性α-アミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤、ダイズ疎水性タンパク質、インドリン、グルテン、セルピン、プリニン、アルファ-アミラーゼ／プロテアーゼ阻害物質、グロブリンおよびファリニンが挙げられる。好適な一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質（またはペプチド）は、プロリンおよび／またはグルタミン残基に富む。特に好適な一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、グルテンである。別の好適な一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、コムギタンパク質である。

本明細書で使用される際に、用語「グルテン」とは、一般に、ある個体に潜在的な有害作用を有する、コムギ、またはオオムギおよびライムギを含めた近縁の穀物種に存在するタンパク質を指す。グルテンタンパク質は、単量体タンパク質であるα-グリアジン、β-グリアジン、γ-グリアジンやω-グリアジンなどのグリアジン、ならびにジスルフィド結合によって結び付けられた高分子量サブユニットおよび低分子量サブユニットの凝集体の高度に不均一な混合物であるグルテニンを含む。多くのコムギグルテンタンパク質は特徴が明らかになっている。例えば、Woychik et al, Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten, J. Agric. Food Chem., 9(4), 307-310 (1961)を参照されたい。本明細書に使用される際の用語グルテンとは、グルテン含有食物由来のグルテンタンパク質の通常のヒトでの消化に由来し異常な免疫応答を引き起こし得る、オリゴペプチドも含む。これらのオリゴペプチドの中には、通常の消化酵素に抵抗性であるものもある。上記のタンパク質およびオリゴペプチドを含めて、グルテンは、グルテン不耐症（例えば、セリアックスプルー）の患者において、Ｔ細胞（例えば、ＩＥＬ）に対する抗原として作用するものと考えられる。用語グルテンはまた、例えば焼成製品に見出されるであろう変性グルテンも指す。

本明細書に使用される際に、用語「グルテン過敏性および関連する状態」とは、グルテンタンパク質またはペプチドに対する不耐性または過敏性に起因する任意の状態を指す。これらとしては、限定はないが、セリアックスプルー（セリアック病）、コムギアレルギー、グルテン過敏症、グルテン過敏性腸症、特発性グルテン過敏症、および疱疹状皮膚炎が挙げられる。関連する状態としては、限定はないが、自閉症、注意欠陥多動性性障害（ＡＤＨＤ）、関節リウマチ、線維筋痛症、クローン病、栄養の吸収不良、および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）も挙げられる。

用語「ネプロシン」とは、およそ２９キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を持つプロリルエンドプロテアーゼを指す。ネプロシンは、ウツボカズラ種の嚢状葉分泌物から単離することができる。ネプロシンは、高い特異性で、プロリンのカルボキシ末端でタンパク質を切断する。この酵素は、約ｐＨ２から約ｐＨ６で活性である。一実施形態では、ネプロシンは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ネプロシンのアミノ酸配列は、いかなる他の公知のタンパク質にも相同でない。一実施形態では、ネプロシンは、配列番号２のｃＤＮＡ配列によってコードされる。一実施形態では、ネプロシンはシグナル配列を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネプロシンはシグナル配列を含まない。

ネプロシンは、ネプロシン、組換えネプロシン、およびそれらの塩の全てのアイソフォーム、アイソタイプ、およびバリアントを含む。塩とは、遊離ネプロシンの生物学的な有効性および性質を保持し、かつ生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、１つもしくは複数の塩基または１つもしくは複数の酸とともにネプロシンによって形成される塩を指す。無機塩基由来の塩としては、以下に限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などが挙げられる。有機塩基由来の塩としては、以下に限定されないが、第１級、第２級、および第３級アミン、天然に発生する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２-ジメチルアミノエタノール、２-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が挙げられる。塩を形成することができる酸としては、以下に限定されないが、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、および有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。

プロテアーゼの例としては、限定はないが、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが挙げられる。本発明で有用となり得るプロテアーゼとしては、限定はないが、ＢＡＣＥ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、キモシン（または「レンニン」）、ナプシン、ペプシン、プラスメプシン、プレセニリン、レニン、トリプシン、ケモトリプシン（chemotrypsin）、エラスターゼ、およびシステインエンドプロテアーゼ（ＥＰ）Ｂ２（ＥＰＢ２としても知られる）が挙げられる。プロテアーゼは、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第７，３２０，７８８号、第７，３０３，８７１号、第７，３２０，７８８号、第７，６２８，９８５号、第７，９１０，５４１号、および第７，９４３，３１２号；ＰＣＴ特許公開第２００５／１０７７８６号、第２００８／１１５４２８号、第２００８／１１５４１１号、第２０１０／０２１７５２号、第２０１０／０４２２０３号、第２０１１／０９７２６６号に記載されるものを含む。好適な一実施形態では、少なくとも１つの追加のプロテアーゼは、酸性ｐＨ、例えば胃に見られるもの（例えば、ｐＨ１．５から３．５）などで活性である。

用語「ネペンテシン」とは、酵素委員会番号ＥＣ３．４．２３．１２を有するアスパラギン酸プロテアーゼを指し、ネペンテシンＩやネペンテシンＩＩなどのネペンテシンの全てのアイソフォーム、アイソタイプ、およびバリアント、ネペンテシンアイソフォームおよび組換えネペンテシン、ならびにそれらの塩を含む。ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）は、種々の植物源、例えば、熱帯地域でサルのコップとして通例知られる食虫性の嚢状葉植物であるウツボカズラの嚢状葉分泌物から単離および濃縮することのできる、植物起源のアスパラギン酸プロテアーゼである。ネペンテシンは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，００５，６１０号に詳細に記載されている。

一実施形態では、「有効量」とは、対象における症状の阻害もしくは寛解、または所望の生物学的アウトカム、例えば、臨床徴候の改善、疾患の発症の遅延などを結果として生じる組成物の量を指す。有効量は、当業者が決定することができる。選択される投薬量レベルは、治療されている状態の重症度、ならびに治療されている哺乳動物の状態および以前の病歴に依存することがある。しかし、所望の治療効果を達成するのに必要とされるより低いレベルで組成物の用量投与を開始すること、および所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、当技術分野の技能の範囲内である。

用語「セリアック病の発現」とは、セリアック病の症状または臨床像のうちのいずれかを指す。そのような発現としては、限定はないが、腸の炎症、「ぼんやりとした精神状態」、抑うつ、不安、ＡＤＨＤ様行動、腹痛、腹部膨満、下痢、便秘、頭痛、片頭痛、骨または関節の痛み、慢性疲労、小腸の損傷、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）抗体の発生、重度のざ瘡、嘔吐、体重減少、易刺激性、鉄欠乏性貧血、関節炎、四肢の刺痛・しびれ、不妊、および口の潰瘍性口内炎が挙げられる。発現は、陰窩過形成を伴う小腸粘膜絨毛の萎縮、腸の粘膜の炎症、栄養の吸収不良、腹部膨満、ならびに骨粗鬆症および腸の悪性腫瘍（リンパ腫および癌腫）の発生の危険性の実質的な亢進をさらに含む。

「同時投与」または「共治療」は、本明細書に使用する際には、一緒に、または互いに前後する薬剤の投与を含む。

用語「調節する」、「減弱させる」、または「寛解させる」とは、哺乳動物などの対象における疾患または障害の任意の治療を意味し、
・疾患もしくは障害を予防もしくは保護すること、すなわち、異常な生物学的反応もしくは症状を発生させないようにすること、
・疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、異常な生物学的反応および／もしくは臨床症状の発生を抑止または抑制すること、ならびに／または
・疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、異常な生物学的反応および／もしくは症状を後退させること
を含む。

本明細書に使用される際に、用語「予防する」または「阻害する」とは、それを必要とする対象の予防的治療を指す。予防的治療は、病気に罹る危険性がある対象に適切な用量の治療剤を与え、それによって、病気の発症を実質的に防ぐことによって達成することができる。

本明細書に使用される際に、用語「状態」とは、本明細書に提供される化合物、組成物、および方法が使用されている病態を指す。

本明細書に使用される際に、用語「患者」または「対象」とは、哺乳動物を指し、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。本明細書の具体的な実施形態では、患者または対象はヒトである。

数値の前で使用される場合、用語「約」とは、値が合理的な範囲、すなわち±５％、±１％または±０．２％内で変化することがあることを示す。

別の配列とあるパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、整列させた際に、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、その２つの配列の比較において同じであることを意味する。アライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野に公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1.に記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、アライメントについてデフォルトパラメーターを使用する。アライメントプログラムの１つは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。プログラムの例としては、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが挙げられ、これは、以下のデフォルトパラメーターを使用する：Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrics= BLOSUM62; Descriotions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databaseｓ = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTに見出すことができる。

「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合に、これらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共通に有する合致しているかまたは相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共通に有する。
ＩＩ．方法

一態様では、本発明は、患者でグルテン不耐症によって媒介される状態を調節するための方法であって、ウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。好適な一実施形態では、状態はセリアック病またはコムギアレルギーである。

別の一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原の存在に起因する、腸におけるＩＥＬの生産および／または動員を、減弱させるまたは予防するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸におけるＩＥＬの生産および／または動員を減弱させるかまたは予防するように、グルテンタンパク質が、医薬組成物によって分解される。

一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原の存在に起因する腸の炎症を減弱させるかまたは予防するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸の炎症を減弱させるかまたは予防するように、ペプチド性食物抗原は、酵素によって分解される。

一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原の存在に起因する上皮内のリンパ球増多を減弱させるかまたは予防するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸の上皮内のリンパ球増多を減弱させるかまたは予防するように、ペプチド性食物抗原は、医薬組成物によって分解される。

一態様では、この発明は、哺乳動物の腸中のペプチド性食物抗原の存在に起因する絨毛の萎縮を減弱させるかまたは予防するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ウツボカズラ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸中の絨毛の萎縮を減弱させるかまたは予防するように、ペプチド性食物抗原は、医薬組成物によって分解される。一実施形態では、絨毛の萎縮は、腸の炎症の結果である。

一実施形態では、ウツボカズラ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、またはそれらの混合物である。好適な一実施形態では、医薬製剤は徐放性製剤である。

一実施形態では、バリアントは、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、または配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、バリアントは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。

一実施形態では、医薬組成物は、ウツボカズラ嚢状葉体液の抽出物を含む。一実施形態では、医薬組成物は、ウツボカズラ嚢状葉体液の抽出物から精製されたネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／またはネプロシンを含む。一実施形態では、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、またはそれらのバリアントのうち少なくとも１つは、組換えタンパク質である。一実施形態では、医薬組成物は、投与の前に約ｐＨ５と約ｐＨ８の間である。本明細書に記載の方法で使用するための医薬組成物は、下記にさらに詳細に議論される。

好適な一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、ヒトは、グルテン不耐症、セリアック病、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症、および疱疹状皮膚炎からなる群から選択される疾患に罹っている。一実施形態では、ヒトは、食物アレルギーに罹っている。

一実施形態では、医薬組成物は、グルテン含有食物の消費の前に、間に、または直後に経口的に投与される

実施形態によっては、医薬組成物は、グルテンを含むか、またはグルテンを含む疑いがある食物を対象が摂取する前に、対象に投与される。実施形態によっては、医薬組成物は、対象が摂取することになる食物中のグルテンを分解する際に、酵素が少なくとも部分的に有効（例えば、本来の活性の少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）である期間内に投与される。実施形態によっては、医薬組成物は、対象が食品を摂取する前の約４時間、３時間、２時間、１時間または３０分以内に投与される。

実施形態によっては、医薬組成物は、免疫原性の可能性がある食物を対象が摂取するのと同時に対象に投与される。実施形態によっては、酵素組成物は、食物とともに投与される。実施形態によっては、医薬組成物は、食物とは別に投与される。

実施形態によっては、医薬組成物は、免疫原性の可能性がある食物を対象が摂取したすぐ後に対象に投与される。実施形態によっては、医薬組成物は、食物中の抗原の少なくとも一部（例えば、少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）がまだ対象の胃の中にある期間内に投与される。実施形態によっては、医薬組成物は、対象が食物を摂取した後の４時間、３時間、２時間、１時間または３０分以内に投与される。

典型的には、医薬組成物は、安全でありかつペプチド性食物抗原の解毒という所望の効果をもたらすのに充分な量で投与される。医薬組成物の投薬量は、多くの要因、例えば、投与される具体的な酵素、食物に対する対象の過敏性、摂取される抗原含有食物の量および種類、酵素の薬力学的特性、投与様式、レシピエントの年齢、健康および体重、症状の特質および程度、治療の頻度、ならびにもしあれば併用療法の種類、ならびに酵素のクリアランス速度に応じて変わることがある。当業者は、上記の要因に基づいて、適切な投薬量を決定することができる。組成物は、臨床応答に応じて、必要に応じて調整され得る適切な投薬量で、最初に投与することができる。最適な投薬量の範囲を特定する一助とするために、Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを任意選択で採用してもよい。製剤に採用される正確な用量はまた、投与経路および／または疾患もしくは障害の重症度にも依存するものとなり、医師の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。

成人対象の投薬または用量投与のレジメンを、小児および幼児用に比例的に調整してもよいし、また、例えば分子量または免疫応答に応じて、他の投与または他の形式用に調整してもよい。医師の裁量で、投与または治療を適切な間隔で反復してもよい。

一般に、医薬組成物は、必要な場合に、例えば、抗原性タンパク質を含むか、もしくは抗原性タンパク質を含む疑いがある食物を対象が摂取することになる、または摂取している、または摂取した場合などに、投与される。いずれにしても、それは、１日につきｋｇ体重あたり約０．００１ｍｇから約１０００ｍｇの酵素の投薬量で、または平均的な人に対して、用量あたり約１ｍｇから約１００ｇの投薬量で投与することができる。実施形態によっては、酵素は、１日当たり０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重でおよびこれらの値のうちいずれか２つの間の範囲（端点を含む）で、投与することができる。実施形態によっては、酵素は、用量当たり１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、７０ｇ、１００ｇでおよびこれらの値のうちいずれか２つの間の範囲（端点を含む）で、投与することができる。実施形態によっては、それは、対象が抗原性タンパク質を含む食物を消費する回数および／またはそのような食物のどのくらいが消費されるかに応じて、１日に１回、２回、３回など投与されてもよい。本明細書に記載される酵素の量は、組成物中の総酵素または各酵素に関するものとしてよい。

実施形態によっては、投与される医薬組成物の量は、消費された／消費される基質（例えば、グルテンおよび／または他のタンパク質もしくは抗原性の可能性があるタンパク質）の量（またはおおよその量）に依存する。一実施形態では、約１ｍｇから約１ｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約５ｍｇから約１ｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１０ｍｇから約１ｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１００ｍｇから約１ｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１ｍｇから約５００ｍｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１ｍｇから約２５０ｍｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１ｍｇから約１００ｍｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。一実施形態では、約１ｍｇから約１０ｍｇの酵素が基質１ｇ当たりに投与される。これは、これらの範囲（端点を含む）、およびこれらの値のいずれか２つの間にある部分範囲のいずれかの内にある、任意の値を含む。

一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１ｇの間である。好ましくは、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１０ｍｇの間である。さらに好ましくは、医薬組成物の有効量は、１日当たり約５ｍｇ未満である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約２０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約３０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約４０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約５０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約６０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約７０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約８０ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１００ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約５００ｍｇと約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約５００ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約２５０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約２００ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約１００ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約９０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約８０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約７０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約６０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約５０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約４０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約３０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約２０ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約５ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約４ｍｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１ｍｇと約３ｍｇの間である。これは、これらの範囲（端点を含む）、およびこれらの値のいずれか２つの間にある部分範囲のいずれかの内にある、任意の値を含む。

一実施形態では、基質（総タンパク質）と投与される酵素（単独のウツボカズラ酵素またはウツボカズラ酵素の組合せ）との比は、約１：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約５００：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０００：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約５０００：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００００：１と約１５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約５００：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０００：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約５０００：１と約１００００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１：１と約５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００：１と約５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約５００：１と約５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０００：１と約５０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１：１と約１０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約１０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００：１と約１０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１：１と約５００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約５００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１００：１と約５００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１：１と約１００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素との比は、約１０：１と約１００：１の間である。これは、これらの範囲（端点を含む）、およびこれらの値のいずれか２つの間にある部分範囲のいずれかの内にある、任意の値を含む。

総タンパク質は、例えば、所与の食事で消費される総タンパク質，または特定の期間に（例えば、１時間、２時間、もしくは３〜２４時間に）消費される総タンパク質としてもよい。一実施形態では、総タンパク質は、対象が１時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が２時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が３時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が４時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が５時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が１０時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が１２時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、は、対象が１５時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、総タンパク質は、対象が２０時間に消費する全タンパク質の総量である。一実施形態では、は、対象が２４時間に消費する全タンパク質の総量である。

この発明の医薬組成物は、単独の活性剤として投与することができるか、またはそれは、他の薬剤と組み合わせて（同時に、連続的にもしくは別々に、または共製剤によって）投与することができ、そのような他の薬剤としては、同じもしくは同様の治療活性を示し、そのような併用投与に安全かつ効果的であると判定される他の化合物が挙げられる。

実施形態によっては、医薬組成物は、追加の酵素、例えば、胃のプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、ペプシノーゲンやChen et al, Aspartic proteases gene family in rice: Gene structure and expression, predicted protein features and phylogenetic relation, Gene 442: 108-118 (2009)によって記載されるものなど）や、別のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）、およびジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＤＣＰ）またはシステインプロテイナーゼＢ（米国特許第７，９１０，５４１号に記載）などの酵素とともに投与される。一実施形態では、他の酵素は、追加の酵素を生産および／または分泌する細菌の形態で投与される。一実施形態では、細菌は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、および／またはそれらのバリアントを生産および／または分泌するように遺伝子操作される。

実施形態によっては、医薬組成物は、別の薬剤とともに対象に投与される。医薬組成物とともに投与することができる薬剤の非限定的な例としては、組織トランスグルタミナーゼの阻害剤、抗炎症剤、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、エンドペプチダーゼ、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、およびアトルバスタチン）、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカストおよびザフィルルカスト）、ＣＯＸ-２阻害剤（例えば、セレコキシブおよびロフェコキシブ）、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＲＢ-７９６）、肥満細胞安定化剤、例えば、クロモグリク酸ナトリウム（クロモリン）、ペミロラスト、プロキシクロミル、レピリナスト、ドキサントラゾール、アンレキサノクス ネドクロミルおよびプロビクロミル、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、例えば、抗ヒスタミン剤（例えば、アクリバスチン、セチリジン、デスロラタジン、エバスチン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン、およびミゾラスチン）、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の阻害剤、抗ＴＮＦα剤ならびに抗生物質が挙げられる。一実施形態では、追加の薬剤はプロバイオティクスである。プロバイオティクスとしては、限定はないが、ラクトバチルス、酵母、バチルスまたはビフィズス菌の種および株が挙げられる。一実施形態では、他の薬剤はエラフィンである。一実施形態では、他の薬剤は、追加の薬剤を生産および／または分泌する細菌の形態で投与される。

実施形態によっては、他の薬剤は、腸で活性である酵素（例えば、プロテアーゼ）を含む。理論によって制限されるものでないが、そのような酵素は、医薬組成物の酵素と相乗的に作用して、免疫原性タンパク質をさらに分解することがあるものと考えられる。

また、本明細書に提供されるのは、前述の状態および疾患のうちの１つを治療または予防するための医薬の製造における、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアントおよび／またはそれらの塩を含む酵素組成物の使用である。
ＩＩＩ．医薬組成物

医薬組成物は、種々の組成物で、単独で、または適切な医薬的に許容可能な担体、賦形剤、もしくは希釈剤とともに、投与することができる。

したがって、別の一態様では、本明細書で提供されるのは、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、および／またはそれらの塩を含む組成物である。実施形態によっては、組成物は医薬組成物である。組成物は、固体、半固体、または液体の形態、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射剤、ゲル、およびマイクロスフェアに製剤化されてもよい。組成物の投与は、様々な方法で、例えば経口投与によって達成することができる。

実施形態によっては、医薬組成物は、治療有効量のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、またはそれらの混合物、および医薬的に許容可能な担体を含む。具体的な一実施形態では、用語「医薬的に許容可能な」とは、動物で、さらに具体的にはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって認可されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはともに治療剤が投与される媒体を指す。そのような医薬担体は、滅菌した液体、例えば水や、石油、動物、植物、または合成の起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などとすることができる。生理食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液体担体として採用することができる。

適した医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望に応じて、少量の加湿剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。適した医薬担体の例は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、対象に適切に投与するための形態を提供するように、治療有効量の酵素を好ましくは精製された形態で、適した量の担体とともに含有するものとなる。製剤は投与様式に適合するべきである。

経口投与については、医薬組成物を、単独で、または適切な添加剤と組み合わせて使用して、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、液体、懸濁液などを作製することができる。例えば、組成物の固体の経口形態は、従来の添加剤、崩壊剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、および着香剤を用いて調製することができる。賦形剤の非限定的な例としては、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、香料、および着色剤が挙げられる。実施形態によっては、製剤は、対象の胃の中に酵素を放出し、その結果、ペプチド性食物抗原を、酵素によって分解することができる。

組成物を、任意選択で適切な緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、イミダゾール緩衝液）および賦形剤（例えば、ショ糖、ラクトース、トレハロースなどの抗凍結剤）の存在下で、水溶液から凍結乾燥することができる。凍結乾燥ケークを、任意選択で賦形剤と混ぜることができ、様々な形態に作製することができる。

別の一態様では、提供されるのは、それを必要とする患者において、グルテン不耐症または関連する状態、例えば、セリアック病、コムギアレルギー、グルテン過敏症および疱疹状皮膚炎を治療するための方法であって、グルテンを含むか、またはグルテンを含む疑いがある食物を、患者が消費する前に、有効量の組成物で処理することを含む方法である。実施形態によっては、食物は、その調製の間に有効量の組成物と組み合わされる。一実施形態では、組成物は、食物の調製の任意の加熱ステップの後に添加される。一実施形態では、組成物は、食品の調製の１つまたは複数の加熱ステップの前に添加される。

ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよびネプロシンは、活性化前に、ウツボカズラ中にプロ酵素として発生する。すなわち、これらのタンパク質は、嚢状葉体液中で酵素を活性化するために切断されるプロペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、プロペプチドを含む、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、および／またはそれらの塩を含む。一実施形態では、プロペプチドは、酵素のＮ末端に隣接する。一実施形態では、プロペプチドは、天然に発生する、酵素のプロペプチドである。一実施形態では、プロペプチドは、（例えば、異なるタンパク質もしくは種に由来する、または合成の）異種のプロペプチドである。一実施形態では、プロペプチドは酸性条件によって切断される。一実施形態では、プロペプチドは酵素によって切断される。一実施形態では、プロペプチドが存在する結果、（例えば、プロペプチドを除去し、成熟した酵素を生産するのに必要とされる時間に起因して）胃で酵素の活性が遅延する。一実施形態では、プロペプチドは、胃での酵素の活性を遅延させるために、よりゆっくりと除去されるように遺伝子操作される。一実施形態では、プロペプチドは、胃での酵素の活性のスピードを上げるために、より敏速に除去されるように遺伝子操作される。

好適な一実施形態では、製剤は制御放出製剤である。用語「制御放出製剤」とは、徐放性製剤および時間放出製剤を含む。制御放出製剤は、当技術分野に周知である。これらは、薬物の持続性放出、周期的放出、パルス放出、または遅延放出を可能にする賦形剤を含む。制御放出製剤は、限定はないが、マトリックス中に薬物を包埋すること、腸溶性コーティング、マイクロカプセル化、ゲルおよびハイドロゲル、ならびに薬物の制御放出を可能にする任意の他の製剤を含む。

実施形態によっては、組成物は、抗原性の可能性がある食物タンパク質を含むか、または含む疑いがある食物とともに、食物添加剤として投与される。一実施形態では、食物はグルテンを含むか、または含む疑いがあり、例えば、コムギ、ライムギ、およびオオムギなどから作られたパン、パスタ、シリアルなどである。

一実施形態では、組成物中の酵素は、酸に接触すると（すなわち、胃の中で）活性化される。

実施形態によっては、ネプロシン、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらのバリアント、またはそれらの組合せを含む組成物は、食物と混ぜ合わされるか、またはグルテンを含有する食材を前処理するために使用される。食物中に存在する組成物は、摂取の前または間の食物中のグルテンのレベルを低減するために、酵素的に活性にすることができる。

実施形態によっては、組成物は、約０．１％から約９９％まで、約０．５％から約９５％まで、約１％から約９５％まで、約５％から約９５％まで、約１０％から約９０％まで、約２０％から約８０％まで、約２５％から約７５％までの酵素を含む。実施形態によっては、組成物中の酵素の量は、総組成物または総食品の約０．０１％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、もしくは約９５％、またはそれらの値のうちいずれか２つの間の範囲にある（端点を含む）。

実施形態によっては、組成物は、ネプロシンおよびネペンテシン、またはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、ネペンテシンは、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩ、またはそれらのバリアントである。実施形態によっては、ネペンテシンは、組換えネペンテシンＩおよび／もしくは組換えネペンテシンＩＩ、またはそれらのバリアントである。実施形態によっては、ネペンテシンは、組換えネペンテシンＩおよび組換えネペンテシンＩＩ、またはそれらそれぞれのバリアントである。実施形態によっては、ネプロシンは、組換えネプロシンまたはそのバリアントである。好適な一実施形態では、組成物は、ウツボカズラ種由来のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／もしくはネプロシンのアミノ酸配列を含む、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／もしくはネプロシン、またはそれらのバリアントを含む。

ネペンテシンＩのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列は、いくつかのウツボカズラ種、例えば、ネペンテス・ミラビリス（Nepenthes mirabilis）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ４９４４０１）、ネペンテス・グラシリス（Nepenthes gracilis）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１１４９１４）およびネペンテス・アラータ（Nepenthes alata）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ２６６８０３）を由来として記載されている。ネペンテシンＩＩのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列は、いくつかのウツボカズラ種、例えば、ネペンテス・ミラビリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ４９４４０２）およびネペンテス・グラシリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１１４９１５）を由来として記載されている。

ネペンテシンＩのタンパク質配列は、いくつかのウツボカズラ種、例えば、ネペンテス・ミラビリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＶ２６０２４；配列番号５）、ネペンテス・グラシリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＤ０７４７４；配列番号７）、およびネペンテス・アラータ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＦ９８９１５；配列番号６）を由来として記載されている。ネペンテシンＩＩのタンパク質配列は、いくつかのウツボカズラ種、例えば、ネペンテス・ミラビリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＶ２６０２５；配列番号８）およびネペンテス・グラシリス（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＤ０７４７５；配列番号９）を由来として記載されている。これらの配列はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開２０１４／０１８６３３０に見出される。

本明細書に提供されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号によって表される配列のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施形態によっては、ネペンテシンは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号２１）と少なくとも約８５％の配列相同性を有するネペンテシンのバリアントである。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９６％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９７％の配列相同性を示す。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９８％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列と少なくとも約９９％の配列相同性を有する。一実施形態では、ネペンテシンは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。

実施形態によっては、ネペンテシンは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号８、配列番号９、または配列番号２２）と少なくとも約８５％の配列相同性を有するネペンテシンのバリアントである。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９６％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９７％の配列相同性を示す。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９８％の配列相同性を有する。実施形態によっては、バリアントは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列と少なくとも約９９％の配列相同性を有する。一実施形態では、ネペンテシンは、配列番号８、配列番号９、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

本発明の一態様では、組成物中のネプロシンとネペンテシンＩおよび／またはＩＩとの比は、グルテン不耐症、セリアック病、コムギアレルギー、もしくは疱疹状皮膚炎、対象の腸における炎症、ＩＥＬの増殖もしくは動員、上皮内のリンパ球増多、および／もしくは絨毛の萎縮、またはそれらの任意の症状を予防するように、ペプチド性食物抗原が充分に小さくおよび／または無害な断片に切断されるような比である。

実施形態によっては、ネプロシン：ネペンテシンの比は、約１：１００から約１００：１の間である。好ましくは、ネプロシン：ネペンテシンの比は、約１：１から約１：１０の間である。さらにいっそう好ましくは、ネプロシン：ネペンテシンの比は約１：４である。

実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１００：１のネプロシンとネペンテシン（ネペンテシンＩおよび／またはＩＩ）との比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約９０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約７０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約６０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約５０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約４０：１ネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約３０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約２０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約５：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約４：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約３：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約２：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：２のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：３のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：４のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：５のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：２０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：３０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：４０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：５０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：６０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：７０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：８０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：９０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１００のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。

本発明の一態様では、組成物中のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比は、対象の腸における炎症、ＩＥＬの増殖もしくは動員、上皮内のリンパ球増加、および／または絨毛の萎縮を予防するように、ペプチド性食物抗原が充分に小さくおよび／または無害な断片に切断されるような比である。実施形態によっては、ネペンテシンＩ：ネペンテシンＩＩの比は、約１：１００から約１００：１の間である。

実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１００：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物少なくとも約９０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約７０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約６０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約５０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約４０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約３０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約２０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約５：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約４：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約３：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約２：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：２のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：３のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：４のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：５のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：２０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：３０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：４０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：５０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：６０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：７０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：８０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：９０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組成物は、少なくとも約１：１００のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。

本発明の一態様では、１つまたは複数のウツボカズラ酵素を含む組成物は、約２０００：１から約１：１の基質（例えば、総タンパク質またはグルテン）と酵素との比で対象に投与される。
ＩＶ．調製の方法

ネペンテシンおよび／またはネプロシンを、当技術分野に公知の方法、例えば（以下に限定されないが）、濾過または固定化されたペプスタチンに基づくアフィニティ精製によって、ウツボカズラなどの植物の嚢状葉分泌物を含めた天然源から、濃縮（もしくは抽出）または精製できることが想定される。また、古典的なタンパク質クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィーとしても知られる）および／またはクロマトフォーカシングクロマトグラフィーを使用して、ネペンテシンおよび／またはネプロシンを濃縮（もしくは抽出）または精製してもよい。クロマトフォーカシングは、サイズ排除の前に使用しても後に使用してもよい。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよびネプロシンは、天然の植物分泌物中に比較的少量で見出される。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよび／またはネプロシンの生産量は、例えば、量の増加した所望の酵素またはそのバリアントを発現および／または分泌するトランスジェニック植物を作出するための生物工学技術を使用して、増加させることができる。

植物源から単離することに加えて、ウツボカズラ酵素またはそのバリアントを、化学合成によって調製してもよい。化学合成は、所望の酵素またはバリアントの配列に従ってアミノ酸をカップリングすることによって達成することができる。様々なペプチドカップリング方法および市販のペプチド合成装置が、ペプチドまたはタンパク質を合成するのに利用可能であり、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、フォスターシティ、カリフォルニア州、Ｂｅｃｋｍａｎ、および他の製造者による自動合成機などがある。

別の一態様では、提供されるのは、細胞が酵素を生産することが可能となるように、酵素のＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）および／またはメッセンジャーＲＮＡを用いて細胞を形質転換またはトランスフェクションすることによる組換え生産系を使用して、ウツボカズラ酵素またはそれらのバリアントを調製する方法である。例えば、ネペンテシンは、生物、例えば大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、バチルス（Bacilli）、コウジカビ（Aspergilli）、およびタバコ細胞などの植物細胞培養における宿主-ベクター系を確立することによって生産することができる。

また、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかを含有するポリヌクレオチドおよび組成物を含む、ベクターおよび大腸菌などの宿主細胞が提供される。

別の一態様では、提供されるのは、組換えウツボカズラ酵素（ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／もしくはネプロシン、またはそれらのバリアント）を生産するための方法であって、選ばれた宿主生物において前記酵素をコードする核酸配列を発現すること、および適切に設計されたベクター内に核酸配列を挿入することを含む方法である。一態様では、組換え酵素は、ネペンテシンＩまたはそのバリアントである。一態様では、組換え酵素は、ネペンテシンＩＩまたはそのバリアントである。一態様では、組換え酵素は、ネプロシンまたはそのバリアントである。一態様では、組換え酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、および／もしくはネプロシン、またはそれらのバリアントの混合物である。

別の一態様では、提供されるのは、組換えネペンテシン、例えばネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩまたはそれらのバリアントなどを含む組成物である。一態様では、組換えネペンテシンは、ネペンテシンＩまたはそのバリアントである。一態様では、組換えネペンテシンは、ネペンテシンＩＩまたはそれらのバリアントである。一態様では、組換えネペンテシンは、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩまたはそれらのバリアントの混合物である。

一態様では、この発明は、本明細書に記載されるようなｃＤＮＡに関する。一実施形態では、この発明は、本明細書に記載されるようなｃＤＮＡを含むベクターに関する。好適な一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一実施形態では、この発明は、組換えネペンテシンＩ、組換えネペンテシンＩＩ、組換えネプロシン、それらのバリアントまたは混合物を発現する細胞に関する。

実施形態によっては、ウツボカズラ酵素の生合成は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号４、配列番号５、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ４９４４０１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１１４９１４、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ２６６８０３のヌクレオチド配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができる。実施形態によっては、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに相同な配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができ、その配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約６０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約７０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８５％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９５％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９６％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９７％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９８％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９９％の相同性を有することがある。好適な一実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持するネペンテシンＩのバリアントをコードする。特に好適な一実施形態では、配列は、少なくとも１つの毒性のグルテンペプチドを分解するネペンテシンＩのバリアントをコードする。

実施形態によっては、ウツボカズラ酵素の生合成は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号８、配列番号９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＪＸ４９４４０２、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ１１４９１５のヌクレオチド配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができる。実施形態によっては、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに相同な配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができ、その配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約６０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約７０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８５％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９０％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９５％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９６％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９７％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９８％の相同性を有することがある。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９９％の相同性を有することがある。好適な一実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持するネペンテシンＩＩのバリアントをコードする。特に好適な一実施形態では、配列は、少なくとも１つの毒性のグルテンペプチドを分解するネペンテシンＩＩのバリアントをコードする。

実施形態によっては、ウツボカズラ酵素の生合成は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号２のヌクレオチド配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができる。実施形態によっては、ネプロシンの生合成は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに相同な配列を含むベクターを用いて、細胞を形質転換することによって達成することができ、その配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約６０％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約７０％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８５％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９０％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９５％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９６％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９７％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９８％の相同性を有することがある。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９９％の相同性を有することがある。好適な一実施形態では、配列は、プロリルエンドプロテアーゼ活性を保持するネプロシンのバリアントをコードする。特に好適な一実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持するネプロシンのバリアントをコードする。特に好適な一実施形態では、配列は、少なくとも１つの毒性のグルテンペプチドを分解するネプロシンのバリアントをコードする。

理論に拘束されるものではないが、罹患した個体の腸におけるグルテンに対する炎症性応答は、毒性の（免疫毒性の）グルテンペプチドの形成をもたらすグルテンタンパク質の不完全な加水分解に起因すると考えられる。免疫毒性のおよび／または免疫毒性の可能性があるいくつかのグルテンペプチドが公知である。これらとしては、以下に限定されないが、α−グリアジン由来の３３−ｍｅｒ（配列番号１５、ＬＱＬＱＰＦ（ＰＱＰＱＬＰＹ）３ＰＱＰＱＰＦ）およびｐ３１−４９（配列番号１６、ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ）；低分子量グルテニン由来のＧｌｙ−１５６（配列番号１７、ＱＱＱＱＰＰＦＳＱＱＱＱＳＰＦＳＱＱＱＱ）；ならびに高分子量グルテニン由来のノナペプチドリピート（配列番号１８、ＧＹＹＰＴＳＰＱＱ）およびヘキサペプチドリピート（配列番号１９、ＰＧＱＧＱＱ）が挙げられる。

実施形態によっては、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンおよび／またはそのバリアントは、所望の各酵素のｃＤＮＡ配列を含む１つまたは複数のベクターを用いて細胞をトランスフェクションする、感染させる、または形質転換することによって合成される。すなわち、単一細胞、細胞株、または生物が、２つ以上の酵素を生産するように遺伝子操作されることがある。実施形態によっては、所望の酵素は、別々の細胞によって合成され、医薬組成物中に組み合わされる。好適な一実施形態では、組換えのネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、および／またはそれらのバリアントは、グリコシル化されていない。一実施形態では、組換えのネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、および／またはそれらのバリアントは、天然の酵素（すなわち、ウツボカズラ植物から単離されるネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはネプロシン）とは異なるグリコシル化パターンを有する。

合成の（例えば、組換えの）ウツボカズラ酵素は、公知の方法、例えば植物の嚢状葉液からウツボカズラ酵素を単離するための方法に従って、濃縮または精製することができる。

実施形態によっては、天然源または合成（例えば、組換え）源から単離されたタンパク質産物は、少なくとも２０重量％の少なくとも１つのウツボカズラ酵素またはそのバリアントを含む。実施形態によっては、単離されたタンパク質産物は、少なくとも約５０％、約７５％、約９０％、約９５重量％のウツボカズラ酵素またはそのバリアントを含む。実施形態によっては、単離されたタンパク質産物は、少なくとも９９重量％のウツボカズラ酵素またはそのバリアントを含む。

実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそのバリアントは、実質的に組換えネペンテシンまたはそのバリアントのみを含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンまたはそのバリアントは、実質的に組換えネペンテシンＩまたはそのバリアントのみを含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンまたはそのバリアントは、実質的にネペンテシンＩＩまたはそのバリアントのみを含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンまたはそのバリアントは、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩ、またはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンまたはそのバリアントは、少なくとも約１００：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩ（またはそれらのそれぞれのバリアント）との比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約９０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約７０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約６０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約５０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約４０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約３０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約２０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約５：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約４：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約３：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約２：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：２のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：３のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：４のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：５のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：２０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：３０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：４０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：５０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：６０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：７０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：８０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：９０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。実施形態によっては、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１００のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの比を含む。

実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそのバリアントは、実質的に組換えネプロシンまたはそのバリアントのみを含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそれらのバリアントは、ネプロシンおよびネペンテシンまたはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそのバリアントは、ネプロシンおよびネペンテシンＩまたはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそのバリアントは、ネプロシンおよびネペンテシンＩＩまたはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそれらのバリアントは、ネプロシン、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩ、またはそれらのバリアントを含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素またはそのバリアントは、少なくとも約１００：１のネプロシンとネペンテシン（またはそれらのそれぞれのバリアント）との比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約９０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約７０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約６０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約５０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約４０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約３０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約２０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１０：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約５：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約４：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約３：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約２：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：１のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：２のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：３のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：４のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：５のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：１０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：２０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：３０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：４０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：５０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：６０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：７０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：８０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：９０のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。実施形態によっては、組換えウツボカズラ酵素は、少なくとも約１：１００のネプロシンとネペンテシンとの比を含む。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネペンテシンＩのアミノ酸配列に少なくとも約７０％相同なアミノ酸（例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２１）を含む。一実施形態では、タンパク質産物は、プロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約８０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約８５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９６％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９７％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９８％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩと少なくとも約９９％相同であることがある。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩに少なくとも約７０％相同なタンパク質（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号２０）を含む。一実施形態では、タンパク質産物は、プロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約８０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約８５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９６％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９７％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９８％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩと少なくとも約９９％相同であることがある。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネプロシンに少なくとも約７０％相同なタンパク質（例えば、配列番号１）を含む。一実施形態では、タンパク質産物は、プロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約８０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約８５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９０％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９５％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９６％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９７％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９８％相同であることがある。タンパク質は、ウツボカズラのネプロシンと少なくとも約９９％相同であることがある。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％超を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％超を有するネペンテシンまたはそのバリアントを含む。

実施形態によっては、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、ウツボカズラのネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。実施形態によっては、タンパク質産物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の約１００％超を有するネプロシンまたはそのバリアントを含む。

特段に述べない限り、本明細書を通じて使用される略称は、以下の意味を有する。
ｇ＝グラム
ｋＤａ＝キロダルトン
ｋｇ＝キログラム
Ｌ＝リットル
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｉｎ＝分
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル
ＭＳ＝質量分析
ｎＭ＝ナノモル
ｐＭ＝ピコモル
ｓ．ｄ．＝標準偏差
μＣｉ＝マイクロキュリー
μｇマイクログラム
μＬ＝マイクロリットル
μΜ＝マイクロモル
μｍ＝マイクロメートル
℃＝摂氏度

これらの１文字記号は、アミノ酸を表す際に以下の意味を持つ。
Ａ＝アラニン
Ｒ＝アルギニン
Ｎ＝アスパラギン
Ｄ＝アスパラギン酸
Ｃ＝システイン
Ｅ＝グルタミン酸
Ｑ＝グルタミン
Ｇ＝グリシン
Ｈ＝ヒスチジン
Ｉ＝イソロイシン
Ｌ＝ロイシン
Ｋ＝リジン
Ｍ＝メチオニン
Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐ＝プロリン
Ｓ＝セリン
Ｔ＝スレオニン
Ｗ＝トリプトファン
Ｙ＝チロシン
Ｖ＝バリン

実施例１：園芸およびウツボカズラ体液の生産
ネペンテス・ベントラータ（N. ventrata）（８”ポットに１００植物体）を専用の温室（アーバンボグ（Urban Bog）、ラングリー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）で成長させた。植物を木の樹皮、パーライト、ピートモスおよび腐植土の混合物（それぞれ４０、３５、１０、５％）に鉢植えして、天然光下、制御された湿度および温度で成長させた。水を嚢状葉に加えないように灌漑を地表面に適用した。嚢状葉には、環境から昆虫も捕獲されたものの（例えばスズメバチ）、各嚢状葉１匹または２匹（およそ１０００枚の嚢状葉）の凍結ショウジョウバエを給餌した。翌週、体液をピペットで採取し、このサイクルを、５リットルの体液が収集されるまで繰り返した。０．２２μｍフィルターを使用して粗嚢状葉体液を清澄化し、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａカットオフスピンフィルター（ミリポア）を使用してタンパク質画分を１０×に濃縮し、１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５、活性条件）を用いて３×洗浄して、自己の消化または残りの獲物の消化の結果生じた何らかのペプチドを除去した。
実施例２：ウツボカズラ体液の特性解析

ｐＨプロファイリングのために、ヘモグロビン活性アッセイの改変バージョンを使用して、タンパク質分解活性を測定した。アッセイは、４μＬの濃縮ウツボカズラ体液を１．２５ｍｇのウマヘモグロビン（シグマアルドリッチ）と混合して、適切な緩衝液での最終体積を１００μＬとすることから成った。タンパク質を３７℃、２００ｒｐｍで３０分消化し、１０％ＴＣＡでクエンチした。沈殿を遠心分離（１４０００ｇ、１０分）によって除去し、上清を使用して、可溶性ペプチドの吸光度を２８０ｎｍ（ＧＥ Ｎａｎｏｖｕｅ ｐｌｕｓ分光光度計）で測定した。全てのデータポイントは、３つの技術的な再現および３つの生物学的な再現の平均である。

酵素阻害試験については、ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）を、０．１２μΜウツボカズラ酵素により３７℃で１５分間消化し、短時間の煮沸によりクエンチして、次いで、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。酵素を対照および阻害剤とともに４℃で２日間、前処理した後、消化実験に供した。ＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイペプチン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＴはシグマアルドリッチから、ＺＰＰ（Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−ジメチルアセタール）はバッヘム（Bachem）からのものである。

結果：濃縮画分は、可溶性タンパク質標品に対する高いタンパク質分解活性を有し（図１Ａ〜１Ｄ）、４℃で何週間もの間、および凍結／融解サイクルの下で安定なままであった。消化についての古典的なヘモグロビンアッセイを使用すると、体液濃縮物は、ｐＨ２．５で最大の活性を示し、ｐＨ５まで活性を保持し（図２Ａ）、ヒトの胃の典型的なｐＨの範囲を網羅するものであった。ｐＨプロファイルは、ペプシンにいくらか類似性を示したが、消化は、体液中に存在することで知られるアスパラギン酸プロテアーゼの構成成分のみに帰属させることができなかった（図１Ａ、１Ｂおよび２Ｂ）。アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤であるペプスタチンは、部分的に酵素活性を抑制できたに過ぎなかった。しかし、これらの条件下で効果を有する他の阻害剤はなかった。粗コムギグリアジンのスラリーを調製して、体液のタンパク質画分を添加した。すると、体液のタンパク質画分は、ｐＨ２．５で速やかにスラリーを清澄化した（図２Ｃ）。

タンパク質抽出物は、ペプシンの存在下で安定なままである、複雑さの限定された植物サブプロテオームを含有していた（図２Ｄ）。
実施例３：ウツボカズラ体液の分画

２つのタンパク質分解構成成分を単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して、α−グリアジン由来の３３ｍｅｒに対する活性を再試験した。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（シナピン酸をマトリックスとする）を使用して、画分をタンパク質含有量について分析すると、２９ｋＤａに単一のピークが浮かび上がった。非特異的な切断性に富化された画分を、ゲル濾過を使用してさらに精製し、純度についておよび３３ｍｅｒに対する活性について再試験した。
体液タンパク質濃縮物を、５０ｍＭグリシンに交換し、分画付きのカラムクロマトフォーカシングに供した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｓｃｉｅｘ ５８００ ＴＯＦ／ＴＯＦ、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとする）を使用して、活性について画分を分析した。活性について試験するために、タンパク質基質を、カラム画分のアリコートとともに、室温で２０分インキュベーションし、消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。プロリン切断に富化された画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭａｃｒｏＴｒａｐｓ（オプティマイズテクノロジーズ）上の逆相クロマトグラフィーによって手動で精製した。酵素を溶出し、タンパク質基質に対し活性であることを確認した。

結果：各画分は、６つの重なり合うＴ細胞エピトープにわたって広がり、セリアック患者において強力なＴ細胞応答を刺激する、α−グリアジン由来の３３ｍｅｒのペプチドＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号２２）を消化することができた（図３Ａ）。このペプチド配列は、胃のペプシンによる消化に対する高い抵抗性を、期間を延長しても有しており、このことは対照の消化を用いて確認された（データ示さず）。
実施例４：ウツボカズラタンパク質の同定

ゲルフリーおよびゲルベースのプロテオミクス法を用いて、体液濃縮物およびカラム画分を分析した。ゲルフリー法については、標準的な方法を用いて、タンパク質をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。変性した試料を、トリプシンとともに一晩、または濃縮されたウツボカズラ体液とともに１時間消化した。消化物溶液を凍結乾燥し、１％ギ酸（ＦＡ）に再懸濁した後、データ依存ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のため質量分析計に注入した。タンパク質を脱グリコシル化するため、製造業者の方法に従って試料をＰＮＧａｓｅ Ｆ（ニューイングランドバイオラボ）で処理した後、トリプシン消化に供した。体液画分のゲルベースのプロテオミクス分析のため、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、バンドを産物のゲル内トリプシン消化およびデータ依存ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに用いるために選択した。洗浄、還元およびアルキル化の後、ゲル片をトリプシンとともに一晩インキュベーションし、次いで質量分析用に抽出した。

ナノ流速構成で動作するＬＣシステム（Ｅａｓｙ−ｎＬＣ １０００、サーモサイエンティフィック）を使用して、タンパク質消化物を分離した。高／低の構成のＴｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ ＥＴＤ質量分析計（ＭＳ：分解能６０，０００のＯｒｂｉｔｒａｐおよびＭＳ／ＭＳ：イオントラップ）における衝突誘導性解離（ＣＩＤ）についてのトップ１０データ依存実験で、ペプチドを選択した。従来のトリプシン消化用の設定を用いて、ＮＣＢＩの緑色植物亜界（Viriplantae）（緑色植物）、ショウジョウバエ（Drosophila）および細菌／真正細菌のデータベースに対しＭａｓｃｏｔ ｖ２．３（マトリックスサイエンシズ）を使用して、データを検索した。体液ベースの消化については、「ｎｏ ｅｎｚｙｍｅ」の特異性を使用して検索を構成し、他の設定は同じままとした。ネプロシンの同定については、体液抽出物を使用して生成されたペプチドを、ＰＥＡＫＳソフトウェアｖ７．１による支援の下、ｄｅ ｎｏｖｏでシークエンシングして、正確性＞９０％の４ｋＤａの配列を生じ、ウツボカズラのトランスクリプトームに対し検索した（下記を参照）。

結果：画分１によるグリアジン３３ｍｅｒの消化は、体液中のアスパラギン酸プロテアーゼの作用に起因するものと思われる。ネペンテシンＩおよびＩＩは、アスパラギン酸プロテアーゼでは非正準な切断性を有する。プロテオミクス手法を用いておよび利用可能なデータベースを検索して、タンパク質抽出物中にネペンテシンＩが存在することを確認した（表１および表２）。従来のボトムアップのプロテオミクス法は、トリプシン消化に基づくものであり、この体液に理想的なものとなりそうになかった。ネペンテシンＩの配列解析では、１つのトリプシン切断部位が１つのみ示されたが、このことは、他の構成成分が同様に、このアプローチで特定するのが困難である可能性があることを示唆する。標準的なプロテオミクスのワークフローにおいて、トリプシンを活性の体液プロテアーゼに置き換えて、同様に体液中にネペンテシンＩＩが存在することを確認した（補遺の表３）。同じように分析された精製画分１では、ネペンテシンＩＩのみを同定した。

実施例５：ウツボカズラのトランスクリプトームのシークエンシング

トリプシンまたは活性体液による消化のストラテジーを用いて画分２を分析した結果、ヒットはなかった。ウツボカズラのシークエンシングされたゲノムが利用不能であることを考慮し、異なるストラテジーを実行して、プロリンに活性である酵素と思われるものを特定した。画分のゲル分析では、組成物が単純であることが示唆されるため（図３Ａ）、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを、タンパク質画分の非特異的な消化によって生成されたペプチドのｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングと組み合わせた。

ネペンテス・アンプラリア（N. ampullaria）を、小さなテラリウム中１５−９時間の明暗光周期で、実験室で成長させた。嚢状葉が成熟したところで、ＲＮＡ抽出の２４時間前に、嚢状葉当たり１匹または２匹のショウジョウバエを植物に給餌した。ＲＮＡ抽出のために、消化体液を除去し、嚢状葉を脱イオン水で洗浄して、部分的に消化された物質および他の残骸を除去した。分泌細胞を含有する嚢状葉の下部３分の１を切り取り、液体窒素中で凍結し、液体窒素下で微粉末に摩砕した。改変されたＣＴＡＢプロトコールを用いて、総ＲＮＡが抽出した。

ネペンテス・アンプラリアのトランスクリプトームのＳＯＬｉＤシークエンシングは、カルガリー大学ゲノミクス施設（カルガリー、アルバータ州）が実施した。Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ、ライフテクノロジーズ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、ポリ（Ａ）ＲＮＡを１０μｇの総ＲＮＡから富化した。ＳＯＬＩＤ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（ライフテクノロジーズ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、全トランスクリプトームＲＮＡライブラリーをポリＡ捕捉ＲＮＡから調製した。ペアエンド７５＋３５ｂｐランを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをＡＢＩ ＳＯＬＩＤ ５５００シークエンサー（ライフテクノロジーズ）でシークエンシングした。解析のために、ＳＯＬｉＤのＸＳＱ ＴｏｏｌｓおよびローカルＰｅｒｌスクリプトを使用して、シークエンシングの生データをｃｓＦａｓｔｑに変換した。ＦａｓｔＱＣ品質管理統計に基づきクリーニングフィルターをデータファイルに適用し、Ｃｕｔａｄａｐｔを用いてＳｏＬｉＤシークエンシングアダプターを検出した。スライディングウィンドウを４として、Ｐｈｒｅｄ２０の閾値でＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ＰＥを使用して、リードを切り取り、切り取られた配列を最小長２５ｂｐで戻した。フォワードリードとリバースリードの両方が保持されていた事例のみを確保した。クリーニングしたこれらのリードペアを、アセンブリのために擬似ベーススペースに変換した。カラースペースに適合させて、Ｖｅｌｖｅｔ（バージョン１．２．１０）およびＯａｓｉｓ（バージョン０．２．８）を用いて、ｄｅ ｎｏｖｏ転写物アセンブリを様々なｋ−ｍｅｒで実施した。最終的に３９のｋ−ｍｅｒを使用し、全シークエンスレーンの組み合わされたフォワードリードセットをシングルエンドアセンブリでアセンブリした。ｄｅ ｎｏｖｏ ＭＳ／ＭＳによって生成された配列タグの検索には、アセンブリをベーススペースに転換することが必要であった。これをＳＯＬｉＤのｄｅｎｏｖｏ２パイプラインのパッケージおよびローカルｐｅｒｌスクリプトのユーティリティを使用して実施した。ｔＢｌａｓｔｎを使用して、クエリに最も合致した６２８ｂｐの部分コンティグを特定した。ヒットの上流および下流の配列を決定するために、以下のプライマーを使用した：
それぞれ５’および３’ＲＡＣＥ用にＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＧ（ＬＳ０２Ｒ；配列番号２３）およびＡＣＧＡＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＧＧ（ＬＳ０７Ｆ；配列番号２４）（カルガリー大学コアＤＮＡサービスにより合成）。ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５７３’キット（クロンテック、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、５’および３’ＲＡＣＥを実施した。簡潔に述べれば、製造業者の改変オリゴ（ｄＴ）および／またはＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを逆合成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて、特異的なプライマー（ＬＳ０２ＲまたはＬＳ０７Ｒ）と対をなすＳＭＡＲＴｅｒユニバーサルプライマーを使用して、５’および３’ＲＡＣＥ ＰＣＲを増幅した。ＰＣＲは、９８℃での３０秒間の変性、６２℃での３０秒間のアニーリング、および７２℃での９０秒間の伸長からなる３０サイクルを含むものであった。１ｋｂの５’ＲＡＣＥおよび５００ｂｐの３’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物をゲル精製し、カルガリー大学コアＤＮＡサービスによりシークエンシングした。５’および３’ＲＡＣＥをネペンテス・ベントラータおよびネペンテス・ラフレシアナ（N. rafflesiana）由来のｃＤＮＡに繰り返して、９７％の同一性があるＮｐｒｌ配列（示さず）を見出した。

結果：４ｋＤａのセグメントをオーバーラッピングペプチドからアセンブリし、トランスクリプトームを検索して、５’および３’ＲＡＣＥによる伸展に基づき、未知の機能を持つ２つのドメインであるＰｆａｍエントリＤＵＦ２３９およびＤＵＦ４４０９によって表されるタンパク質（図３Ｂ）を特定するコンティグを明らかにした。質量分析により、主にＤＵＦ２３９から成る成熟した酵素であることが支持された（図４Ａ〜図４Ｃ）。ＰｆａｍにおけるＤＵＦ２３９についての機能予測では、Ｃ末端ペプチダーゼ活性が示唆されているが、このことは実証されていない。その多くが植物に見られるＤＵＦ２３９ドメインを担持する、他のメンバーと共通に有する配列同一性のレベルは、僅かなものに過ぎない（図５Ａおよび５Ｂ）。興味深いことに、この酵素は、構造面と機能面のどちらも、公知のプロリン切断酵素とは異なっている（図６）。そのことは、ＤＵＦ２３９が、以前に未知であったプロリン指向性プロテアーゼのクラスを表すことを示唆する。大きなタンパク質の標品を使用してタンパク質分解マップを生成したところ、マップは、Ｐｒｏ−Ｘ切断特異性の際立っているエンドプロテアーゼを明確に示した（図７）。２９ｋＤａで、その酵素は、どの公知のプロリルエンドプロテアーゼよりも極めて小さく、プロリルオリゴペプチダーゼに観察される基質の長さの制限がないようであった。この新たに発見されたタンパク質分解酵素を、ネプロシン（Ｎｐｒ１）と命名した。
実施例６：ウツボカズラタンパク質の定量

グルテン解毒の可能性について抽出物を試験する前に、および治療概念には投薬量が重要であることを考慮し、ＡＱＵＡペプチドを含む方法を利用して、活性のタンパク質分解構成成分の濃度を測定した。ＡＱＵＡ法には、特定可能なトリプシン処理ペプチドおよび完全な消化が必要であり、活性酵素を表す安定同位体標識ペプチドを内部標準として添加した。成熟したネペンテシンＩＩはＫ残基またはＲ残基を持たないため、ネペンテシンＩおよびネプロシンのみをこの方式でモニターすることができた。

ＦＡＳＰプロトコールの変形を適用して体液濃縮物を消化し、ＡＱＵＡペプチド定量法と組み合わせた。簡潔に述べれば、重原子標識されたペプチドを、ネペンテシンＩ（ＧＰＬＳＬＰＳＱＬＤＶＴＫ；配列番号２５）およびネプロシン（ＡＳＹＶＲ；配列番号２６）について合成した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。体液濃縮物を、８Ｍ尿素中、中性ｐＨかつ還元条件下で変性させた。タンパク質をヨードアセトアミドでアルキル化し、次いで、トリプシンで消化した。ＡＱＵＡペプチドを添加し、次いで、試料を質量分析用に精製した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ ＥＴＤで、消化物を逆相ＬＣ−ＭＳによって分析した。トリプシン処理ペプチドの軽原子形態と重原子形態との相対強度を、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアで測定し、タンパク質濃度の決定に使用した。タンパク質濃度がプラトーに達するまで、消化時間を徐々に長く、酵素と基質との比をさらに高く、適用した。ネペンテシンＩＩのレベルを見積もるために、体液プロテアーゼ画分の非特異的な消化物に適用する標識フリーの方法（ｅｍＰＡＩおよびＴ３ＰＱ）が必要であった。

結果：強烈な変性および消化のプロトコールを用いて、完全な消化を達成した。濃縮体液画分中に、ネペンテシンＩは４５０＋／−５０ｎＭ（ｎ＝３）で、ネプロシンは２５０＋／−４０ｎＭ（ｎ＝３）で存在していた。非特異的な消化のプロトコールを用いて体液全体のサブプロテオームから収集された標識フリーのプロテオミクスのデータに基づくと、ネペンテシンＩＩの濃度は、ネペンテシンＩとほぼ等しかった。グルテン解毒実験での用量評価を目的として、濃縮物の総酵素濃度を、９００ｎＭのネペンテシンＩ／ＩＩと２５０ｎＭのネプロシンからなるおよそ１．１５μΜとした。
実施例７：ウツボカズラ酵素によるグリアジンの消化

次に、ウツボカズラ酵素濃度の範囲にわたって、粗グリアジンの消化の特徴をモニターした。消化産物を、複数の方法を用いて、対照としてペプシンで生成されたペプチドと比較した。胃の条件のみをシミュレーションするために、消化をｐＨ２．５で実施した。腸のプロテアーゼ（すなわちトリプシン、キモトリプシン）を用いた中性ｐＨでの消化の第２段階は使用しなかった。

粗グリアジン（シグマアルドリッチカタログ番号Ｇ３３７５）を粉末に摩砕した。２０〜５０ｍｇ／ｍＬのストックのグリアジンスラリーを酸性溶液（１００ｍＭグリシンＨＣ１、ｐＨ２．５）に調製し、少しの間超音波処理して大きな粒子をさらに細かく砕き、懸濁液化を促進した。１０ｍｇ／ｍＬのグリアジンスラリーの消化を、酵素（ペプシン、体液酵素、または両方）の添加によって開始し、緩やかに回転させながら３７℃に保持した。消化の進行を重量分析、光透過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および質量分析によってモニターした。重量分析に用いるために、消化物を煮沸によってクエンチし、ＴＣＡ／クロロホルムで処理した後、遠心分離して未消化または消化不足のタンパク質を除去した。光透過を用いてモニターするために、消化反応を、９６ウェルプレート中、各反応条件について＞３連のレプリカを用いて実施し、濁度を５９５ｎｍ、３７℃で２分毎に９０分間、モニターした（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー、モレキュラーデバイス）。測定と測定の間に、プレートを中程度のスピードで少しの間振盪した。９０分間の反応の後、消化物を、１０分間煮沸することによってクエンチした（事後に、消化プロファイルに何も影響がないことを確認した）。反応混合物のアリコートを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。残りの量を遠心分離して、上清を質量分析によって分析した。

結果：まず、光学密度測定を用いて、１０ｇ／Ｌの粗グリアジン抽出物のスラリーの清澄化速度をモニターした（図８Ａ〜図８Ｃ）。ペプシンをヒトの胃の濃度の範囲の高めの域（約５μΜ）までアプライし、体液プロテアーゼをこの量のおよそ１／１０とした。ペプシンのみでは０．３ｍｇ／μΜ／分という最大の清澄化速度が達成された（図８Ｄ）。いくらかの不透明度の残存が認められたが、それは、水に不溶性の高分子量グルテニンまたは抽出プロセス由来の典型的な残渣、例えば脂質などに起因する可能性がある。体液プロテアーゼのみでは、清澄化速度が１０倍超増加した（図８Ｄ）。興味深いことに、この試験で使用された高めの体液プロテアーゼのレベルでは、不透明度は消化時間に伴って増加し、ペプシンを用いた共消化はその効果を増幅した。この知見は、グルテン加水分解物の乳化性に一致する。エマルジョンによる粗画分中の脂質の安定化は、散乱を増すものとなり、消化の進行につれて高まるものと思われた。この効果は、ペプシンと体液プロテアーゼとの組合せを使用した清澄化速度の測定を妨げるものであった。しかし、体液抽出物の清澄化速度は高く、体液プロテアーゼは、ペプシンとともに相乗的にグリアジンを消化するように思われる。
実施例８：グリアジン消化物のプロテオミクス分析

上記の結果は、有効な消化のプロセスを示唆しているが、消化の完全性に関する情報を伝えるものではない。ペプシン耐性の３３ｍｅｒを使用して、希釈条件下でペプチド産物の進展をモニターした。

高／低構成でＣＩＤを使用してトップ１０のイオン選択について構成された２つの１時間逆相勾配ランで、データ依存ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、上清を分析した。あるランでは、イオン選択を２＋およびさらに高い電荷状態に制限した。他のランでは、イオン選択を１＋電荷状態のみに適用した。両ラン由来のデータを組み合わせて、全ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔエントリに対しパンコムギ由来のグリアジンおよびグルテニン（２５種のタンパク質）について検索した。検索には、Ｍａｓｃｏｔ ｖ２．３を使用し、非特異的な消化について構成し、ペプチドヒットについてｐ＜０．０５でフィルタリングした。ペプチドサイズの分布を見積もるために、全ＬＣ−ＭＳスペクトルを組み合わせて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｖ１．０で適切な設定を用いてデコンヴォルーションした。データベース検索で特定された消化物のサブセットを使用した標識フリーの定量分析のために、ヒットのリストをＭａｓｓ Ｓｐｅｃ Ｓｔｕｄｉｏで生データと組み合わせ、一連のペプチドイオンクロマトグラムを生成するのに使用した。このペプチドイオンクロマトグラムは、特定された各ペプチド配列について重量平均強度を決定するために、全ての同位体にわたって一元化されたものである。

添加されるタンパク質がグリアジンの消化効率に及ぼす影響を決定するために、グリアジン（１０ｍｇ／ｍＬ）を超える過剰量でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、９０ｍｇ／ｍＬ）をアプライして、０．４６μΜの体液プロテアーゼおよび５μΜのペプシンを用いて消化した。試料を３７℃、ｐＨ２．５で消化し、分析用に複数の時点でアリコートを抜き取った。試料を希釈し、煮沸によってクエンチした。対照として、同様のコースの反応をＢＳＡ非存在下で実施した。消化物の質量分析の前に、α−グリアジンの抗原性領域を表す固定量のＡＱＵＡペプチド２種［ＹＬＱＬＱＰＦＰＱＰ（配列番号２７）およびＬＱＬＱＰＦＰＱＰ（配列番号２８）］と、γ−グリアジンの抗原性領域を表す固定量のＡＱＵＡペプチド１種（ＱＱＰＹＰＱＱＰ；配列番号２９）とを添加した（下線部は重原子標識アミノ酸）。逆相ＬＣ−ＭＳシステム（Ｑｔｒａｐ ６５００のＥｋｓｉｇｅｎｔ ｍｉｃｒｏＬＣ）で定期的なＭＲＭ法を用いて、各ペプチド（軽原子形態および重原子形態）の複数の転移をモニターした。各消化および時点についてデータを３連で収集した。それぞれの数量の転移についてクロマトグラフィーのピーク強度を測定し、対応の重原子ペプチドに対応する転移に対して標準化した。

結果：１０分でおよそ５０％の３３ｍｅｒが消化され、全体の消化が１００分で達成された（図９Ａ）。ペプシンもミキソコッカス・ザンサス（Myxococcus xanthus）（ＭＸ）由来の細菌性プロリルエンドプロテアーゼも、至適ｐＨ（それぞれ２および７）での同等の消化条件では、ペプチドをあまり多くの程度（データ示さず）には加水分解できなかった。これらの知見を拡げるために、プロテオミクス手法を用いて、スラリーの消化産物を大規模にマッピングした。まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、体液プロテアーゼを用いて総タンパク質が広範に消化されることが示され、この消化は、ペプシンのみでは達成できなかった（図９Ｂ〜図９Ｄ）。次に、データ依存ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータを消化産物について収集し、全体的にペプチドのサイズおよび配列の特徴を分析した。同一性に関わらずＬＣ−ＭＳデータ由来の全てのペプチドシグナルを定量する標識フリーの方法を用いたところ、高濃度のペプシン（５μΜ）が予想通りにグリアジンを中程度のレベルに加水分解し（図９Ｅ）、平均ペプチド長１９．２残基を産生することが観察された。体液抽出物は、はるかに低い用量（０．２３μΜ）を用いて、平均長１３．２残基で飽和する。ペプシンとの共消化を用いると、平均長はさらに１１．５残基まで低減する。体液プロテアーゼもまた、さらに狭い分布の産物長を生成した（図９Ｆ）。高濃度のペプシンによって、４０００Ｄａ超の分子量を有する２５重量％の検出産物を含む消化が生じるが、このことは、グルテンのタンパク質分解耐性の性質を確定するものである。体液プロテアーゼは、この画分を２重量％未満に低減する。

ＭＳ／ＭＳペプチド断片化データは、消化産物の特定および代替的な定量分析を支援する。公知のグルテンタンパク質から構成されるデータベース検索に基づくと、粗グリアジン画分は、α／β−グリアジンのアイソタイプおよびγ−グリアジンのアイソタイプの分布を含有する。グルテニンについても多くのペプチドが明らかであった。低分子量サブユニットが特に豊富であり、このことは、従来のグリアジン抽出プロセスの粗製物の特質を浮き彫りにしている（表４および図１０）。５μΜのペプシンによる消化についての加重平均ペプチド長は１６．９残基（１０３０形体に基づく）であり、それは、総消化シグナルのうち１３％を占めるに過ぎなかった。０．４６μΜでの体液プロテアーゼによる消化は、平均ペプチド長１１．２残基を生じ（１３７０形体）、総シグナルの３０％を占めていた。これら２つの濃度を用いた共消化は、加重平均１０．２残基を生成し（１５７１形体）、消化シグナルの４０％を占めていた。この画分は、プロテオミクス実験での高いシグナル使用を表す。すなわち、未同定の画分は、殆どの場合、未消化のタンパク質というよりも、サンプリング率の限界と僅かなペプチドスコアとの組合せを表す。プロテアーゼの組合せを用いてさらに長く消化することによって、総ＬＣ−ＭＳシグナルは、サイズ分布の変化を生じることなく低減するが、このことは、長さ＜６アミノ酸残基のペプチドを検出することができないプロテオミクス法に一致する。以上をまとめると、プロテオミクスのデータは、低濃度の体液プロテアーゼの作用下での粗グリアジンの広範な消化に向いており、この消化では、体液酵素が飽和しているように見えるとしても、ペプシンとの共消化によってタンパク質分解が亢進する。

ペプチド配列を精査すると、数多くのＰｒｏ−Ｘ切断部位が観察された。消化効率の大幅な増加の発生をネプロシンのみが担うのか否かを試験するために、精製ネプロシンを用いて、粗グリアジンスラリーを消化した。二峰性分布の産物が観察され、その分布は低分子量および高分子量の両方の画分からなっていた（図１１）。低分子量画分の加重平均ペプチド長は１２．５であり、総シグナルの１０％を占めていたが、濃度を２倍にしても二峰性は減少せず、覆域の深度も大幅には向上しなかった。高分子量画分は充分にあるままであったが、このことは、アスパラギン酸プロテアーゼが消化を促進する役割を果たすことを裏付けている。天然のアスパラギン酸プロテアーゼとネプロシンとの比を、組換えネペンテシンＩＩ（以前に記載された方法、例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開第２０１５／１９２２１１号および国際特許出願公開第２０１４／１３８９２７に記載されたものなどを用いて作製）および精製ネプロシンを用いて再構成した。グリアジン消化のプロファイルは、体液抽出物のものと同等であった（示さず）。このことは、抽出物のタンパク質分解活性が、アスパラギン酸プロテアーゼおよびネプロシンのみから生じることを裏付けている。
実施例９：抗原性領域の脱アミド化

消化の亢進したプロファイルが抗原性領域の脱アミドに影響を及ぼすか否かを検討した。Ｔ細胞による免疫優性ペプチドの認識は、これらのペプチドがそのコア結合領域で、特にセリアック病に関連のあるＨＬＡ ＤＱ２のＰ４位またはＰ６位で、組織トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）によって脱アミド化されると、増幅される。脱アミド化は、ペプチドの配列と長さの両方に依存し、主要な抗原性領域の脱アミド化レベルは、配列の他のどこよりもはるかに高い。粗グリアジン消化物を、脱アミド化されていないペプチドから脱アミド化された形態への変換について分析し、ＤＱ２結合モチーフを特定するために既に公開されているアルゴリズムを使用して、全てのペプチドをソートした。

公開されているプロトコールに従って、粗グリアジン消化物由来の上清を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＣａＣｌ_２中、０．１ｍｇ／ｍＬのヒトトランスグルタミナーゼ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号４３７６−ＴＧ−０５０）を用いて３７℃で９０分処理し、９５℃で１５分間クエンチした。処理された消化物を、上に記載されたようにデータ依存ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、データベース検索の際に様々にＮおよびＱを脱アミド化させた。明確に特定された全ての脱アミド化ペプチドおよび脱アミド化されていないペプチドのクロマトグラフィー強度を、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ Ｓｔｕｄｉｏを用いて決定し、相対的な脱アミド化度を表す比を、ペプチド当たりで決定した。

図９Ｇ（および表５）に示されるように、ペプシン消化によって、非抗原性領域に比べて５．５倍を超える高いペプチド変換が抗原性領域に生じた。濃度を増加させて体液プロテアーゼを適用することによって、抗原性領域における変換レベルは非抗原性配列のものに近付き、特に、ペプチドの各カテゴリーについて相対的なＱ含有量を考慮した際に近付いた（高い酵素濃度では、抗原性ペプチドのみの中でのさらに高いＱ含有量に基づき、変換比１．３となるものと予想される）。
実施例１０：ウツボカズラ酵素によるグルテン解毒の効能に及ぼす非グルテンタンパク質の効果

これらの分析に基づき、１２６５：１の基質と体液プロテアーゼとの比を用いて、粗グリアジンスラリーの大規模な消化を達成することができ、その際に、酵素は、４：１のネペンテシンとネプロシンとの混合からなる。添加される非グルテンタンパク質がグルテン解毒の有効性に及ぼす影響を試験するために、９０ｇ／Ｌの血清アルブミンを１０ｇ／Ｌの粗グリアジンスラリーに添加することによって消化実験を実施し、そこでは、グリアジンは、総タンパク質の１０重量％のみを占めていた。体液プロテアーゼを０．４６μΜに、ペプシンを５μΜに維持した。過剰なアルブミンによって、データ依存プロテオミクス法の使用が妨げられたため、α−グリアジンの抗原性領域から選んだペプチドを、標的プロテオミクス法、および内部標準としてＡＱＵＡペプチド（上記を参照）を用いてモニターした。アルブミンフリーのスラリーの消化に対する方法を適用することによって、上に記載されるような抗原性領域の断片化が確認され（図１２Ａ）、抗原のプロセッシングが６０分にまで及ぶことが示された。大過剰のアルブミンを含有する消化によって、α−グリアジン抗原の断片化の時間枠は２〜３倍延長されたのみであったが、γ−グリアジン抗原の断片化には大きな影響がなかった。
実施例１１：腸のバリア機能不全およびグリアジン過敏症に及ぼすネペンテシンの効果

体液プロテアーゼ抽出物の効能および認容性を、腸バリア機能不全およびグリアジン過敏症を示すトランスジェニックＮＯＤ／ＨＬＡ−ＤＱ８マウスモデルで、ＤＱ８依存的な方式で試験した。

ＮＯＤ ＤＱ８マウスを、グリアジンへの経口寛容を破壊するためにコレラ毒素（ＣＴ）およびペプシン−グリアジン（Ｐ−Ｇ）消化物を用いて感作し、腸の炎症の陽性対照として３週間にわたってＰ−Ｇを継続的に給餌した（図１３）。陰性対照は、ＣＴおよびＰ−Ｇで処理したが、以降の経口のグリアジン曝露をしないままとした。感作マウスを２群に分け、うち一方の群をペプシンおよび体液プロテアーゼで共消化されたグリアジンに曝露し、他方をペプシンおよび組換えネペンテシンＩＩで共消化されたグリアジンに曝露した。８頭のマウスを４群のそれぞれに使用した。マウスを全体の外観（挙動、開眼、毛繕い）について評価し、実験を通して体重を記録した。腸の組織を免疫組織化学によりＣＤ３＋上皮内リンパ球について試験した。動物試験は、全ての施設の倫理的なガイドラインを満たすものであった。

結果：ペプシンで消化された粗グリアジンを感作後３週間にわたって５ｍｇの用量で給餌されたマウスは、予想通り、小腸のＣＤ３＋上皮内リンパ球（ＩＥＬ）のカウントが大幅に増加した（図１３）。対照として、感作マウスのコホートを、同じ期間にわたって媒体のみで処理して、グリアジンフリーの制限食を模倣したところ、ＩＥＬのカウントは大幅に低下した。これら２つの対照により、植物抽出物が誘導する効果を計量する手段が提供された。富化された体液プロテアーゼ画分および組換えネペンテシンＩＩを供試した。どちらも良好な認容性があり、どちらもグリアジンフリーの制限食の対照とは区別できないレベルにまで大幅なＩＥＬカウントの低減を生じた。驚くべきことに、これらの結果は、非正準のアスパラギン酸プロテアーゼのみを補充することによって、おそらくはネプロシンの存在が効能を向上させているとはいえ無視できないほどの効果を誘導できることを示している。
考察

嚢状葉植物のウツボカズラ属は、脊椎動物、植物由来物、および動物の排泄物を消化することが可能な分泌物を含有する嚢状葉の下位層内に、窒素に富んだ獲物を引き寄せて罠に捕らえることによって、窒素欠乏条件での成長に適応している。嚢状葉は、咀嚼の助けを借りることなく、哺乳動物の全消化管に相当するたった１段階で、消化を達成する。キチナーゼ、ホスファターゼ、リボヌクレアーゼ、およびプロテアーゼが、獲物の解体に関与するが、この栄養分の捕捉および取込みの見事な妙技を発揮させる特有の酵素構成成分については、知られていることは極めて僅かである。タンパク質構成成分のアミノ酸組成が異色であること、および利用可能な配列データベースがないことは、徹底したプロテオミクス特性解析の妨げとなっている。初期の検討の間にカバーされなかった２つのアスパラギン酸プロテアーゼ（ネペンテシンＩおよびＩＩ）は、これまでに最も多くの研究の対象となっており、体液のタンパク質分解能を規定するものと推定されている。上記の体液は、アスパラギン酸プロテアーゼのみでは殆どが異色である、切断特異性のプロファイルを有していた。上記のネペンテシンは、切断特異性が非正準であり、ペプシンのように疎水性残基の後を切断するだけでなく、低いｐＨで異色のトリプシン性およびキモトリプシン性の特性を持つ。堅固なＣ末端プロリン切断活性が、さらに体液に観察され、それはアスパラギン酸プロテアーゼのみでは再現されなかった。これらの知見は、グルテン解毒で使用するための分泌物の評価に際して我々の関心を刺激し、我々は、プロリン切断を担う酵素の解明を目指した。

最新の研究では、体液のプロリン切断の特徴は、アスパラギン酸プロテアーゼの作用と区別され、併せて強力なグルテン消化のプロファイルを含むことが実証されている。ネプロシンは、植物でよく代表される未知のドメインについてコアの機能を規定する新しいクラスのプロリルエンドプロテアーゼと思われるもののうち、最初に特性が明らかにされたメンバーである。ＤＵＦ２３９の他のメンバーと共通に有する配列の同一性は、僅かに過ぎず、このことは、このプロリルエンドプロテアーゼが、アスパラギン酸プロテアーゼのように、クラスの基準外の何らかの性質を有する可能性があることを示唆する。ＤＵＦ２３９の他のメンバーへのさらに進んだ研究は当然である。しかしながら、ネプロシンが堅固な消化のプロファイルに重要である一方で、植物のアスパラギン酸プロテアーゼは、効率の良いプロセスに寄与する。ネペンテシンＩＩのみをペプシンと組み合わせた際の腸の炎症の驚くほどの低減は、これらのアスパラギン酸プロテアーゼの特質が同等でないことを浮き彫りにしている。ペプシンもまた、体液プロテアーゼの存在下でのグリアジンの消化にさらに有効であり（図９Ｅ）、このことは、宿主プロテアーゼと植物プロテアーゼとの間の相乗効果がある可能性を示唆している。

これらの知見は、酵素補充ストラテジーを通じてセリアック病を治療するための可能性を広げた。極めて低い酵素レベルによって、グリアジンスラリーの可溶化速度は大幅に亢進し、胃の条件下での消化の完全性は向上し、それゆえグルテンの脱アミド化および抗原性は低減する。我々は、非特異的なアスパラギン酸プロテアーゼをネペンテシンのクラスに補充することが、胃での消化を必要とするどの概念にも重要な要素であるものと提案する。胃の複雑な環境では、グルテンタンパク質をさらに低減することを効果的とすることができるよりも、総タンパク質を効率良く解体することが必要となり、このことは、ネペンテシンの役割であると思われる。体液プロテアーゼよりも高い用量であろうとネペンテシンの補充のみで炎症の低減に繋がるという知見は、このアスパラギン酸プロテアーゼの非正準の特質が、効能への重要な貢献要素であることを示唆している。有効な補充の閾値が高いことから、食事の持つ様々なサイズと複雑な特質を考慮すると、両方の酵素が必要となりそうに思われる。測定された天然のレベルで混ぜ合わせる場合、比が（総タンパク質と体液酵素とで）１２，０００：１を超える場合でさえ、高い抗原解体能が保持される。これは、５０グラムの１日の総タンパク質負荷に対する５ミリグラム未満の酵素を表す。代替の配合および投薬量の僅かな増加により、セリアック病の治療で、グルテンフリー制限食の有効な代替を補助することができる可能性がある。

Claims (26)

1. それを必要とする患者においてグルテン不耐症の１つまたは複数の症状を減弱させるための方法であって、グルテンを非抗原性ペプチドへと切断して、それによって前記症状を減弱させるように、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらのバリアント、およびそれらの混合物から選択される酵素を含む有効量の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記有効量は、前記患者が摂取する１日の総タンパク質と酵素との比を、約１０００：１と約１５０００：１の間で含むものである方法。
2. 前記１つまたは複数の症状が、腸の炎症、絨毛の萎縮、上皮内のリンパ球増多からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、ネプロシンおよびネペンテシンを約１：４の比（ネプロシン：ネペンテシン）で含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ネペンテシンが、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、またはそれらの混合物である、請求項３に記載の方法。
5. 前記医薬組成物が、グルテン含有食物の消費の前に、間に、または直後に経口的に投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記患者が、セリアック病，注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症、栄養吸収不良および疱疹状皮膚炎からなる群から選択される疾患に罹っている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記医薬組成物が徐放性製剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記医薬組成物が、ウツボカズラ嚢状葉体液の抽出物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、またはそれらのバリアントのうち少なくとも１つが組換えタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記バリアントが、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を持つアミノ酸配列を有するタンパク質であって、前記バリアントが、プロテアーゼ活性を保持する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記医薬組成物が、約ｐＨ５と約ｐＨ８との間である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記酵素が、ネプロシンまたはそのバリアントである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記酵素が、ネペンテシンＩまたはそのバリアントである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記酵素が、ネペンテシンＩＩまたはそのバリアントである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記酵素が、ネペンテシンＩまたはそのバリアントとネプロシンまたはそのバリアントとの混合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記酵素が、ネペンテシンＩＩまたはそのバリアントとネプロシンまたはそのバリアントとの混合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記酵素が、ネペンテシンＩまたはそのバリアントとネペンテシンＩＩまたはそのバリアントとの混合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記酵素が、ネペンテシンＩまたはそのバリアントとネペンテシンＩＩまたはそのバリアントとネプロシンまたはそのバリアントとの混合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
19. ネプロシンおよび医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、前記ネプロシンは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であり、ネペンテシン酵素またはそれらのバリアントをさらに含み、前記組成物中のネプロシンとネペンテシン酵素との比は、約１：１と約１：１０の間である、医薬組成物。
20. 前記ネプロシンのアミノ酸配列が、シグナル配列のない配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 前記ネペンテシン酵素またはそれらのバリアントが、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよび／またはそれらの混合物である、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
22. 徐放性製剤である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
23. 固体組成物であって、前記組成物のｐＨがｐＨ５超である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
24. 少なくとも１つの追加のプロテアーゼをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
25. 前記少なくとも１つの追加のプロテアーゼが、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼである、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 製剤が胃に存在する間、前記ネプロシンが継続的に放出されるように、前記ネプロシンが多重層に存在する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬製剤。