JP2018532709A - Ｖｄａｃ１由来ペプチドの類似体 - Google Patents

Abstract

本発明は、天然の親ペプチドと比較して薬物動態特性が改善されたＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含むペプチドに関し、これらのペプチドは、細胞エネルギー産生の障害、アポトーシスと細胞死、特に癌細胞の細胞死の誘導、癌幹細胞の除去、および肝細胞内の脂肪の蓄積に伴う症状、特に非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とそれに伴う症状の軽減に効果がある。【選択図】なし

Description

本発明は、天然の親ペプチドと比較して薬物動態特性が改善されたＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含むペプチドに関し、これらのペプチドは、細胞エネルギー産生の障害、アポトーシス細胞死、特に癌細胞の細胞死の誘導、癌幹細胞の除去、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に関連する肝細胞における脂肪肝、炎症および線維化に伴う症状の軽減に効果がある。

電位依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ；ミトコンドリアポリン）は、すべての真核細胞においてミトコンドリ外膜に見られる。ＶＤＡＣは、細胞エネルギー代謝の中心的な役割を担っており、かつミトコンドリア仲介アポトーシスにおいて重要な役割を果たし、ミトコンドリアとサイトゾルとの間のイオンフラックスおよび代謝物を制御する。ＶＤＡＣは、種々のリガンドおよびタンパク質とのその結合を介して仲介される、種々の細胞生存シグナルおよび細胞死シグナルの収束点も提供する。ＶＤＡＣはミトコンドリア仲介アポトーシス、特に、サイトゾルへのミトコンドリアアポトーシス促進タンパク質（例えば、シトクロムｃ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）および第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子（Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ））の放出において重要な役割を担っており、アポトーシス調節タンパク質、例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌおよびヘキソキナーゼ（ＨＫ）と相互作用する。

ＶＤＡＣの３種の哺乳動物アイソフォーム、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３が知られており、ＶＤＡＣ１は、哺乳動物細胞中で発現される主要なアイソフォームであり（Ｄｅ Ｐｉｎｔｏ， Ｖ．，ら，２０１０．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９７：１２６８−１２７５）．Ｂｌａｃｈｌｙ−Ｄｙｓｉｏｎら（Ｂｌａｃｈｌｙ−Ｄｙｓｏｎ Ｅら，１９９３．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８（３）：１８３５−４１）、２種のヒトＶＤＡＣアイソフォーム、ＶＤＡＣ１とＶＤＡＣ２の酵母中でのクローニングおよび機能発現が開示された。米国特許第５，７８０，２３５号は、２つのＶＤＡＣ配列を開示しており、それらはＨＡＣＨ（ヒト電圧依存性陰イオンチャネル）と命名され、その後ＶＤＡＣ２とＶＤＡＣ３として特定された。同特許は、遺伝子改変発現ベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、ＨＡＣＨを作成する方法、およびＨＡＣＨの発現と活性を阻害する医薬組成物を特性する方法、ならびに癌および増殖性疾患の処置のためのそのような組成物の使用を提供する。

プログラム細胞死としても知られているアポトーシスは、とりわけ多細胞生物の成長、免疫細胞調節および組織恒常性において中心的役割を果たしている。種々の種からの遺伝解析および分子解析により、アポトーシス経路が高度に保存されていることが明らかにされた。正常な成長と維持にとって不可欠であることに加えて、アポトーシスは、ウイルス感染に対する防御および癌の予防において重要である。ミトコンドリアは、アポトーシスの細胞死において重要な役割を果たしている。ミトコンドリア膜間腔から細胞の細胞質内へのシトクロムｃなどのアポトーシス誘導タンパク質が放出されると、細胞死プログラムを実行するカスパーゼ活性化に関与するカスケードステップが開始される。実質的証拠は、ＶＤＡＣ１をアポトーシスと関連づけて、ＶＤＡＣ１が哺乳動物細胞内のミトコンドリアからのアポトーシス誘導タンパク質の放出において重要な役割を担っていることを示唆している（Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｊ．，およびＨｏｌｍｕｈａｍｅｄｏｖ， Ｅ．２００６．Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７６２：１８１−１９０；Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ Ｖら，２０１０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１（３）：２２７−２８６；Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ ＶおよびＢｅｎ−Ｈａｉｌ Ｄ．２０１２．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ １２（１）：２４−３４；Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ Ｖ およびＧｏｌａｎ Ｍ． ２０１２．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９（５）：７１４−３５； Ｓｈｏｓｈａｎ−Ｂａｒｍａｔｚ，Ｖら，２０１５．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４８（１０ Ｐｔ Ｂ）：２５４７−７５）。

ＶＤＡＣ由来のペプチドはアポトーシスを誘導することができることがすでに示されている（Ｐｒｅｚｍａ Ｔら，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ４：ｅ８０９）。

本発明の発明者およびその他への米国特許第８，１１９，６０１号および同第８，６４８，０４５号は、細胞においてアポトーシスを誘導することができるペプチド由来の単離ＶＤＡＣ１と、異常なアポトーシス、詳しくは癌に伴う疾患の処置において有用なＶＤＡＣ１を含む医薬組成物とを開示する。ペプチドは、ＶＤＡＣ１のＮ末端ドメインならびにＶＤＡＣ１βストランド１４およびそのサイトゾルβループに由来する。

本発明の発明者およびその他への国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０１１７１１号は、ヒトミトコンドリアタンパク質電位依存性陰イオンチャネル１（ＶＤＡＣ）のＮ末端ドメインのアミノ酸配列に基づいた短ペプチド、および細胞透過性が増強された部分をさらに含むペプチド結合体を開示する。ペプチド、ペプチド結合体、および同成分を含む医薬組成物は、細胞過剰増殖または細胞死、詳しくは癌に対する抵抗性によって特徴づけられる疾患の処置に役立つ。

Ｐｒｅｚｍａら（Ｐｒｅｚｍａ Ｔら，２０１３．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ． １９（４）：ｅ８０９）は、短ペプチドを含むＶＤＡＣ１に基づくペプチドが慢性Ｂリンパ性白血病（ＣＬＬ）の患者由来の末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞死を選択的に誘導したが、一方健常ドナー由来のＰＢＭＣに対しては小さな影響を示したことを明らかにした。

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、「無症状」であることが多い肝臓疾患であり、肝細胞および非アルコールユーザの他の肝細胞の細胞質内に脂肪酸とトリグリセリドが過度に異常に蓄積されることを特徴とする。ＮＡＦＬＤは、西洋社会において重要な公衆衛生上の懸念として現れ、異常肝機能で最も一般的な原因である。ＮＡＦＬＤは、良性脂肪肝から連続慢性脂肪肝疾患に及び、その進行形は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。ＮＡＳＨにおいて、肝臓での脂肪蓄積は、炎症および様々な程度の瘢痕を伴う。ＮＡＳＨは、末期肝臓疾患、硬変症および肝細胞癌（ＨＣＣ）に進行するかなりの危険性を有する潜在的に深刻な状態である。肝硬変を発症する一部の患者は、肝不全の危険性があり、最終的に肝移植を必要とすることもあり得る。

非アルコール性脂肪性肝疾患は、単離脂肪肝（ＩＦＬ）およびＮＡＳＨとして分類される。ＩＦＬおよびＮＡＳＨの両方において、肝細胞中に異常量の脂肪が存在するが、ＮＡＳＨでは、加えて肝臓内に炎症があり、結果として、肝細胞は損傷を受ける。細胞が死滅すると、肝細胞は瘢痕組織によって交換され、肝変症の原因となる。

ＮＡＦＬＤの原因は複雑であり、完全に理解されていない。そこで、ＮＡＦＬＤは、全般的に、代謝症候群（ＭＳ）の肝臓の症状として考えられ、インスリン抵抗性はその主要な病態生理学的特徴とみなされる。ＮＡＦＬＤと代謝症候群ならびに世界的な肥満のまん延との強い関連性を考えると、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの有病率は増えている。ＮＡＦＬＤは、一般集団よりも代謝病態の既往歴のある患者のコホートにおいてまん延している。
具体的には、２型糖尿病およびＮＡＦＬＤには、とりわけ緊密な関係がある。２型糖尿病患者の試験では、超音波検査ＮＡＦＬＤの６９％の有病率が報告された。しかし、糖尿病性変性合併症または血糖コントロールと、ＮＡＦＬＤの存在の間の関係性は明白でなかった。肥満者における単純性脂肪肝の有病率は３０％から３７％の範囲であるが、一方ＮＡＦＬＤにおいて診療所に通う太り過ぎの外来患者の５７％から、非糖尿病肥満患者の９８％の範囲である。

ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを防止または処置するための薬物は現在、承認されたものはなく、したがって現在の療法は、生活習慣の改善、およびＮＡＦＬＤに伴う疾患の処置に依存する。この疾患を有する人に与えられる最も重要な忠告としては、体重を減らすこと（肥満または太り過ぎの場合）、バランスのよい健康的な食事を続けること、身体活動を増やし、アルコールや不必要な薬剤を避けること、場合によっては肥満手術が挙げられるが、主な目標は、診断後に疾患症状を軽減させることである。

ミトコンドリアは、エネルギー産出、脂質代謝、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生と解毒、およびアポトーシス促進タンパク質の放出のレベルで細胞運命に影響し得る。さまざまな試験は、ミトコンドリアが脂肪肝の病変形成においてこれらの細胞小器官の形態上の主要な役割を内部に持つことを明らかにした。

ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの治療用途に対する大きな障害は、タンパク質分解に対するそれらの感受性である。レトロ−インベルソペプチドは、そのアミノ酸配列が逆転し、アミノ酸サブユニットのαセンターのキラリティーも反転している。通常、この種のペプチドは、側鎖形態を元のＬアミノ酸ペプチドのそれと同様に維持することに役立つため、タンパク質分解に対してペプチドの抵抗性を高めるために、逆配列にＤ−アミノ酸を組み入れることによって設計される。科学文献でこれらのペプチドの他の報告されている同義語としては、全−Ｄ−レトロ−ペプチド、レトロ−エナンチオ−ペプチド、レトロ−インベルソアナログ、レトロ−インベルソ類似体、レトロ−インベルソ誘導体、レトロ−インベルソペプチドおよびレトロ−インベルソ異性体が挙げられる。Ｄ−アミノ酸は、生物系に存在する天然タンパク質に生じる天然のＬ−アミノ酸の立体構造の鏡像を表す。ペプチド結合の一部だけが逆転し、逆転した部分のアミノ酸残基のキラリティーが反転する、直鎖状ペプチドの部分的修飾型レトロ−インベルソ類似体もある。

Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドは、医薬品として使用される場合、一般的にタンパク質分解に影響を受けにくく、有効時間が長い。適切に設計されている場合、レトロ−インベルソペプチドはＬ−ペプチドと類似している結合特性を有することができる。レトロ−インベルソペプチドは、ペプチドエピトープ、タンパク質−タンパク質界面またはタンパク質−ペプチド界面の形状を模倣するペプチド模倣薬を設計することによるタンパク質−タンパク相互作用の研究の有用な候補である。レトロ−インベルソペプチドは、医薬品として使用されるＬ−ペプチドの魅力的な代替物である。これらのペプチドは、Ｌ−ペプチドと比較して低い免疫原性応答を誘導することが報告されている。しかし、レトロ−インベルソ類似体が代謝安定性の上昇を示すとはいえ、その生物活性は大きく損なわれることが多い（Ｇｕｉｃｈａｒｄ Ｇら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：９７６５−９７６９）。

満たされていない要求が存在し、薬物動態特性の改善を示し、一方でその生物活性を少なくとも維持するＶＤＡＣ１系ペプチドを有することは非常に有利である。

本発明は、優れた薬物動態特性を有するＶＤＡＣ１系ペプチドの類似体を提供することによって上述の要求に答える。本発明は、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体、特にレトロ類似体および部分的または完全インベルソ類似体を含む合成ペプチドを提供し、本発明の類似体のための基盤を形成する該ＶＤＡＣ１由来ペプチドは、癌細胞内でアポトーシスを誘導することが示された。本発明の類似体は、これまで開示された天然ペプチドと比較して、天然タンパク質の活性を少なくとも維持しながら、薬学的に適合する溶媒において溶解度を向上させ、かつ安定性を向上させ、全体として、細胞過剰増殖によって、または細胞死に対する抵抗性によって特徴づけられる疾患の処置のため、特に癌を処置するための治療薬として良好な候補になることがわかった。予想外に、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することを示した。本発明の合成ペプチドは、癌幹細胞を除去することによって癌を処置することにも効果的である。予想外に、本発明のペプチドは、非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の症状を抑えることにも効果的である。本発明は、ペプチドがＶＤＡＣ１由来ペプチドのレトロ−インベルソ類似体βストランド１４と、トリプトファンジッパーと隣接しているそのサイトゾルβループとから構成され、その天然型内に同じ成分を含む対応するペプチドと比較して、トランスフェリン受容体結合ドメインのレトロ類似体が生理溶液を含む水溶液中の溶解度を増加させ、安定性を増加させ、細胞死誘導活性を増加させたという予想外の発見に一部基づいている。レトロ−インベルソ類似体は癌細胞の死を誘導することに高い効果があり、ＢＢＢを通過できることがわかった。さらに、レトロ−インベルソ類似体が、脂肪肝に伴う症状を軽減することに極めて有効であることがわかった。

一態様によれば、本発明は、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含む合成ペプチドを提供し、該ＶＤＡＣ１由来ペプチドは癌細胞内でアポトーシスを誘導することができ、かつ５〜２６の連続するアミノ酸からなり、該類似体は前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドに関してレトロ修飾型および部分的または完全インベルソ修飾型である。

本明細書で用いる場合、「レトロ修飾型」という用語は、レトロ−修飾されるペプチドに対して反対方向でアミノ酸残基が構築されているＬ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。

本明細書で用いる場合、「インベルソ修飾型」という用語は、インベルソ修飾されるペプチドに対して同じ方向でアミノ酸残基が構築されているＤ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。部分的インベルソ修飾型類似体とは、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むペプチドを指す。完全インベルソ修飾型類似体とは、Ｄ−アミノ酸で構成されているペプチドを指す。

特定の実施形態によれば、類似体は部分的インベルソ修飾型である。

特定の例示的な実施形態によれば、類似体は完全インベルソ修飾型である。

特定の実施形態によれば、癌細胞内でアポトーシスを誘導することができるＶＤＡＣ１由来ペプチドは、ＬＰ４と名付けられ、配列番号１（ＫＫＬＥＴＡＶＮＬＡＷＴＡＧＮＳＮ）に記載のアミノ酸配列からなる。これらの実施形態によれば、レトロ類似体のアミノ酸配列は、配列番号２（ＮＳＮＧＡＴＷＡＬＮＶＡＴＥＬＫＫ）に記載されている。

本明細書で用いる場合、「レトロ−インベルソ」類似体という用語は、レトロ−インベルソ修飾されるペプチドに対して反対方向でアミノ酸残基が構築されているＤ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。

特定の例示的な実施形態によれば、配列番号２に記載のレトロ類似体のすべてのアミノ酸は、配列Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（配列番号３）を有する配列番号１のレトロ−インベルソ修飾型類似体を形成するＤ立体配置にある。

特定の実施形態によれば、癌細胞内でアポトーシスを誘導することができるＶＤＡＣ１由来ペプチドは、配列番号４（ＭＡＶＰＰＴＹＡＤＬＧＫＳＡＲＤＶＦＴＫＧＹＧＦＧＬ）に記載のアミノ酸配列からなり、天然ＶＤＡＣ１のＮ末端でのアミノ酸１〜２６に対応する。これらの実施形態によれば、レトロ類似体のアミノ酸配列は、配列番号５（ＬＧＦＧＹＧＫＴＦＶＤＲＡＳＫＧＬＤＡＹＴＰＰＶＡＭ）に記載されている。

特定の例示的な実施形態によれば、配列番号５に記載のレトロ類似体のすべてのアミノ酸は、配列Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅｔ（配列番号６）を有する配列番号４のレトロ−インベルソ修飾型類似体を形成するＤ立体配置にある。

特定の実施形態によれば、合成ペプチドは細胞認識部分および／または局在化部分をさらに含む。局在化部分は、一般的に細胞膜を通る合成ペプチドの透過性を増強する。当技術分野で周知のように、いずれの認識部分および／または局在化部分は、本発明の教示によって用いることができ、直接結合を介してまたはスペーサーもしくはリンカーを介してＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体の任意の位置に結合させることができる。特定の例示的な実施形態によれば、細胞認識部分および／または局在化成分は、ペプチドである。一部の実施形態によれば、局在化部分は、細胞内の局在化ペプチドであり、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）とも呼ばれる。

一部の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、すべてＬ−立体異性体ペプチドである。別の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、すべてＤ−立体異性体ペプチドである。

一部の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、トランスフェリン受容体結合ドメイン（Ｔｆ）またはそのフラグメントを含む。特定の例示的な実施形態によれば、トランスフェリン受容体結合ドメインは、配列番号７（ＨＡＩＹＰＲＨ）に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態によれば、Ｔｆペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる。特定の例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号８（ＨＲＰＹＩＡＨ）に記載のアミノ酸配列を有する、配列番号７のレトロ修飾型類似体である。さらなる例示的な実施形態によれば、配列番号７および配列番号８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むトランスフェリン受容体結合ドメインは、すべてＬ−立体異性体ペプチドである。

別の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、部分的または完全インベルソ修飾型である。一部の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号７の完全インベルソ類似体である。特定の例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号８の完全インベルソ修飾型類似体である。

さらなる特定の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、ショウジョウバエ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）（Ａｎｔｐ）ドメインまたはそのフラグメントを含むアミノ酸配列である。一部の実施形態によれば、Ａｎｔｐドメインは、配列番号９（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。別の実施形態によれば、Ａｎｔｐドメインは、配列番号９からなる。

別の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９の部分的インベルソ修飾型類似体またはその一部である。さらなる実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９の完全インベルソ修飾型類似体またはその一部である。さらなる実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９のレトロ修飾型類似体であり、配列番号１０（ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＩＫＩＱＲ）に記載のアミノ酸配列またはその一部を有する。さらなる実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号１０のインベルソ類似体である。

一部の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＮ末端に直接、または間接的に結合している。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

特定の例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＣ末端に直接、または間接的に結合している。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

大部分の低分子ペプチドは溶液中で柔軟であり、同じ配列が天然タンパク質で取り入れている構造を取り入れていない。ＶＤＡＣ１トポロジーモデルによれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの一部はβループの形で存在する。したがって、特定の実施形態によれば、本発明の合成ペプチドは、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＣ末端またはＮ末端でそれぞれ互いに独立して位置する「トリプトファン（Ｔｒｐ）ジッパーペプチド」とともに、アミノ酸配列ＳＷＴＷＥ（配列番号１１）およびＫＷＴＷＫ（配列番号１２）を含む。一部の実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドは、配列番号１１のレトロ類似体を含み、前記レトロ類似体は配列番号１３（ＥＷＴＷＳ）に記載のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドは、配列番号１１〜１３のいずれか１項の部分的または完全インベルソペプチドを含む。Ｔｒｐジッパーペプチド配列は、トリプトファン−トリプトファン交差鎖対による安定したβ−ヘアピンの形成を誘導することができる。

特定の例示的な実施形態によれば、本発明の合成ペプチドは、アポトーシスを誘導することができ、かつ５〜２６の連続するアミノ酸からなるＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含み、該類似体はＶＤＡＣ１由来ペプチドに関してレトロ修飾型および部分的または完全インベルソ修飾型であり、前記誘導体はそのＮ末端とＣ末端にＴｒｐジッパーアミノ酸と隣接している。

特定の例示的な実施形態によれば、本発明は、そのＮ末端に配列番号１２に記載のアミノ酸配列と、そのＣ末端に配列番号１３に記載のアミノ酸配列とを有するＴｒｐジッパーと隣接している配列番号１のレトロ−インベルソ類似体を含み、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドのレトロ類似体をさらに含む、合成ペプチドを提供する。特定の現在好ましい例示的な実施形態によれば、合成ペプチドは、配列番号１４（Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ）に記載のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる。

さらなる実施形態によれば、本発明は、そのＮ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドのレトロ類似体に隣接している配列番号４のレトロ−インベルソ類似体を含む。特定の実施形態によれば、合成ペプチドは、配列番号１５（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅｔ）に記載のアミノ酸配列含む。

一部の実施形態によれば、本発明は、そのＮ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドに隣接している配列番号４のレトロ−インベルソ類似体を含む合成ペプチドを提供する。これらの実施形態によれば、合成ペプチドは、配列番号１６（Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅｔ）に記載のアミノ酸配列を含む。

さらなる態様によれば、本発明は、本発明による少なくとも１種の合成ペプチドと、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含むペプチドと、任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤、塩または賦形剤とを含む医薬組成物を提供し、該ＶＤＡＣ１由来ペプチドは癌細胞内でアポトーシスを誘導することができ、かつ５〜２６の連続するアミノ酸からなり、該類似体は前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドに関してレトロ修飾型および部分的または完全インベルソ修飾型である。

特定の例示的な実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種の合成ペプチドを含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

特定の例示的な実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む。

別の例示的な実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つの合成ペプチドを含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

特定の例示的な実施形態によれば、医薬組成物は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる合成ペプチドを含む。

特定の実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含む合成ペプチドを含む医薬組成物は、本発明に従って少なくとも１種のシールド粒子をさらに含む。特定の実施形態において、シールド粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または脂質および／またはポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなる。

さらなる実施形態によれば、医薬組成物は、本発明によるＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含むカプセル化合成ペプチドを含む。特定の実施形態において、合成ペプチドはベシクルまたは免疫リポソームにカプセル化される。

本発明の合成ペプチドおよびそれを含む医薬組成物は、アポトーシスおよび／または細胞死の誘導に効果的である。さらに、本明細書の以下に例示するように、本発明の合成ペプチドは、対応する健康な細胞を含む正常な代謝活性を有する細胞と比較して、高い代謝活性を示す細胞、例えば癌細胞の死を誘導する際により効果的である。

さらなる態様によれば、本明細書に記載の本発明の合成ペプチドおよびそれを含む医薬組成物は、有害な細胞増殖を阻害する際に使用される。特定の実施形態によれば、医薬組成物は、異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連した疾患の処置で使用される。

さらなる態様によれば、本発明は、発明の合成ペプチドまたはそれを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、有害な細胞増殖を阻害するための方法を提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連する疾患を患っている対象を処置するための方法を提供し、該方法は本発明の合成ペプチドまたはそれを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。

特定の実施形態によれば、異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連した疾患は、癌である。特定の例示的な実施形態によれば、癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む白血病、肝癌、神経膠芽腫を含む神経膠腫、肺癌、前立腺癌、膵癌および黒色腫からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

特定の実施形態によれば、癌は白血病である。別の実施形態によれば、癌はＣＬＬである。さらなる実施形態によれば、癌は神経膠芽細胞腫である。別の実施形態によれば、癌は肝癌である。

予想外に、本発明の合成ペプチドが、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、特に非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防、および処置に効果的であることもわかった。

さらなる態様によれば、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状を予防および／または処置する方法を提供し、該方法はそれを必要とする対象に本発明の合成ペプチドまたはそれを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。

さらなる態様によれば、本明細書に記載の本発明の合成ペプチドおよびそれを含む医薬組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状の処置で用いる。

特定の実施形態によれば、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される。一部の実施形態によれば、ＮＡＦＬＤに伴う症状は、脂肪滴の蓄積、炎症、線維化、肝細胞死およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。

本明細書に開示される態様および実施形態の各々のいずれの組み合わせも本発明の開示の範囲内に明確に包含されることを理解すべきである。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明と図面から明白になる。

レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドと比較してＶＤＡＣ−１由来ペプチドＬＰ４を含む合成ペプチド（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と名付けた）による白血病細胞死の誘導を示す。使用した細胞株は、急性単球性白血病（ＡＭＬ）患者由来のヒト単球細胞株のＴＨＰ１であった。 ＶＤＡＣ−１由来ペプチドＬＰ４を含む合成ペプチド（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と名付けた）による肝癌細胞死の誘導をレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドと比較して示す。使用した細胞株は、メチルコラントレン・エポキシドを用いた形質転換によるＢＮＬ ＣＬ．２由来のＢＮＬ１ＭＥであった。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による膵癌細胞死の誘導を表す。図３Ａは、５６歳白人男性の膵管由来の膵癌から樹立されたヒトＰＡＮＣ−１細胞、およびマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）膵管癌から樹立されたマウスＰＡＮＣ−２細胞に対するレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の効果を示す。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による膵癌細胞死の誘導を表す。図３Ｂは、無処置ＰＡＮＣ−２細胞（対照）、５％ＤＭＳＯとともにインキュベートしたＰＡＮＣ−２、および、２μＭのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４とともにインキュベートしたＰＡＮＣ−２細胞のアクリジンオレンジ、エチジウムプロマイド染色を示す。 マウス由来のＢ１６Ｆ１０．０黒色腫癌細胞上でレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによって誘導された細胞死を示す。 ＶＤＡＣ−１由来ペプチドＬＰ４（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と名付けた）を含む合成ペプチドによって誘導された神経膠腫癌細胞株Ｕ−８７ＭＧの細胞死のパーセンテージをレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と比較して示す。使用した細胞株は、マウス神経膠腫細胞株のＧＬ−２６１であった。 ＶＤＡＣ−１由来のペプチドＬＰ４を含む合成ペプチド（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４；（○））；ＶＤＡＣ−１Ｎ末端配列の一部を含む合成ペプチド（Ｄ−ΔＮ−Ｔｅｒ−Ａｎｔｐ；（●））およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４；（Δ）によって誘導された神経膠芽腫由来Ｕ−８７ＭＧ細胞株の細胞死のパーセンテージを示す。 非癌性細胞と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞に対する、および癌幹細胞と比較して癌細胞に対する差異効果を示す。図７Ａは、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞（Ｕ−８７ＭＧ；（○））に対する、および非癌性ＭＤＣＫ細胞（●）に対する差異効果を示す。 非癌性細胞と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞に対する、および癌幹細胞と比較して癌細胞に対する差異効果を示す。図７Ｂは、Ｕ−８７ＭＧおよびＧ７幹細胞の細胞株におけるＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＭｕｓａｓｈｉとＮｅｓｔｉｎの幹細胞マーカーの発現について、特定の抗体を用いる免疫ブロット分析を示す。 非癌性細胞と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞に対する、および癌幹細胞と比較して癌細胞に対する差異効果を示す。図７Ｃは、免疫ブロットの定量分析を示す。 非癌性細胞と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞に対する、および癌幹細胞と比較して癌細胞に対する差異効果を示す。図７Ｄは、ＰＩ染色およびフローサイトメトリーを用いて、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４がＧ７幹細胞（●）の細胞死と、Ｕ−８７ＭＧ細胞（○）の細胞死を効果的に誘導することを示す。 非癌性細胞と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のヒト神経膠芽腫癌細胞に対する、および癌幹細胞と比較して癌細胞に対する差異効果を示す。図７Ｅは、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／Ｐｌ染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のアポトーシスに対する効果を示す。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の安定性を示す。ペプチドＴｆ−Ｄ−ＬＰ４とレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（５％ＤＭＳＯ中０．５ｍＭ）を−２０℃、４℃または２５℃で表示時間の間、インキュベートした。次いで、ＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、ペプチド（１０μＭ）を、Ａ５４９の細胞死を誘導するその能力をアッセイした。無処置細胞において、細胞死は３％であったが、一方ペプチドでは細胞死は９０％を超えた（ｎ＝２）。Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ５４は、−２０℃で保管された場合のみ、その全活性を維持したが、４℃または２５℃で保管された場合、その活性を７５％維持した（図８Ａ）。一方レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４は、４℃および室温を含むすべての試験温度でその全活性を維持した（図８Ｂ）。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の安定性を示す。ペプチドＴｆ−Ｄ−ＬＰ４とレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（５％ＤＭＳＯ中０．５ｍＭ）を−２０℃、４℃または２５℃で表示時間の間、インキュベートした。次いで、ＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、ペプチド（１０μＭ）を、Ａ５４９の細胞死を誘導するその能力をアッセイした。無処置細胞において、細胞死は３％であったが、一方ペプチドでは細胞死は９０％を超えた（ｎ＝２）。Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ５４は、−２０℃で保管された場合のみ、その全活性を維持したが、４℃または２５℃で保管された場合、その活性を７５％維持した（図８Ａ）。一方レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４は、４℃および室温を含むすべての試験温度でその全活性を維持した（図８Ｂ）。 Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と比較して、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の高溶解度を示す。ペプチドを１００％ＤＭＳＯに溶解し、次いで約１０倍希釈して、ＤＭＳＯを１０〜１１％まで、ペプチドを４．４または４ｍＭまで減少させた。不溶性ペプチドを除去するための遠心分離に続いて、上清（ＳＵＰ）中の可溶性ペプチドの量を分析した。Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と比較してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の高溶解度が示される。 遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による神経膠芽腫細胞株Ｕ−８７ＭＧの細胞死誘導を示す。図１０Ａは、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）とその分解産物の構造を示す。図１０Ｂは、ＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（ペレット）による細胞死誘導によって明らかになり、上清（ｓｕｐ）には現れなかったように、ペプチドがＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたことを示す。細胞死をＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析によって分析した。 遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による神経膠芽腫細胞株Ｕ−８７ＭＧの細胞死誘導を示す。図１０Ａは、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）とその分解産物の構造を示す。図１０Ｂは、ＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（ペレット）による細胞死誘導によって明らかになり、上清（ｓｕｐ）には現れなかったように、ペプチドがＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたことを示す。細胞死をＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析によって分析した。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の腫瘍増殖に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。図１１Ａは、Ｕ−８７ＭＧ細胞の移植から３２日後のマウスの脳のＭＲＩ画像を示す。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の腫瘍増殖に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。図１１Ｂは、細胞移植から２５日後（濃い灰色のカラム）および３２日後（薄い灰色のカラム）の算出した腫瘍体積を示す。結果＝平均値±標準誤差（ｎ＝６）（^＊ｐ：＜０．０５，^＊＊＊ｐ：＜０．００１）。 図１１Ｃは、ＰＢＳ／ＤＭＳＯ処置マウスと、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスとの間の生存曲線において統計的な有意差を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。対照マウス（点線）、ＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化されたレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）（黒色線）、またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ、破線）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ累積生存曲線。 ＤＥＮによるマウス処置によって誘導された肝臓内の腫瘍（ＤＥＮ−誘導肝癌）の成長をレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによって阻害することを示す。図１２Ａは、実験プロトコルの略図を示す。 図１２Ｂ〜Ｃは、対照（図１２Ｂ）およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド処置マウス（図１２Ｃ）のＭＲＩ画像を示す。 ＤＥＮによるマウス処置によって誘導された肝臓内の腫瘍（ＤＥＮ−誘導肝癌）の成長をレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによって阻害することを示す。図１２Ｂ〜Ｃは、対照（図１２Ｂ）およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド処置マウス（図１２Ｃ）のＭＲＩ画像を示す。 ＤＥＮによるマウス処置によって誘導された肝臓内の腫瘍（ＤＥＮ−誘導肝癌）の成長をレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによって阻害することを示す。図１２Ｄは、対照（無処置）のＤＥＮ−処置マウスから、およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド処置群からの肝臓の写真を示す。 ＤＥＮによるマウス処置によって誘導された肝臓内の腫瘍（ＤＥＮ−誘導肝癌）の成長をレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによって阻害することを示す。図１２Ｅは、対照およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド処置群の肝臓重量を示す。結果＝平均値±標準誤差（ｎ＝５）（ｐ：^＊≦０．００１）。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介による脂肪肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１３Ａ：高脂肪食（ＨＦＤ）によって誘導された脂肪肝発症、およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド処置開始の過程の略図。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介による脂肪肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１３Ｂ：９週目の終わりに犠牲にしたマウスから摘出した肝臓の写真。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介による脂肪肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１３Ｃ：図１３Ｂに示した肝臓の重量（ＮＤ：固形飼料（通常））。結果＝平均値±標準誤差（ｎ＝５）（ｐ：^＊＜０．０５、^＊＊≦０．００５）。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス、ＨＦＰ−３２試料を与えられたマウス、およびＨＦＤ−３２を与えられ、次いでレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスの血糖値を示す。結果＝平均値±標準誤差（ｎ＝５）、（ｐ：^＊＊＜０．００３）。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス、ＨＦＤを与えられ、次いでＨＰＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注で処置されたマウス、またはＨＦＤを与えられ、次いでレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ、０．９％ＤＭＳＯ）の静注で処置されたマウスから摘出された肝切片を示す。代表的なＨ＆Ｅ染色（図１５Ａ）およびオイルレッド染色（図１５Ｂ）。ＨＦＤ−で発症した脂肪肝は、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置後に防がれた。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス、ＨＦＤを与えられ、次いでＨＰＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注で処置されたマウス、またはＨＦＤを与えられ、次いでレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ、０．９％ＤＭＳＯ）の静注で処置されたマウスから摘出された肝切片を示す。代表的なＨ＆Ｅ染色（図１５Ａ）およびオイルレッド染色（図１５Ｂ）。ＨＦＤ−で発症した脂肪肝は、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置後に防がれた。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４静注処置の脂肪肝阻止への明白な効果を示す。図１６Ａ：膨化を示す代表的なＨ＆Ｅ染色。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４静注処置の脂肪肝阻止への明白な効果を示す。図１６Ｂ：炎症（矢印）を示す代表的なＨ＆Ｅ染色。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４静注処置の脂肪肝阻止への明白な効果を示す。図１６Ｃ：線維化（矢印）についてのシリウスレッド染色。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスにおいてすべて現れているが、ＨＦＤ−３２を与えられ、次いでＴｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスにおいて、または固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウスにおいては現れていない。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介によるＮＡＳＨ肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１７Ａ：ＨＦＤ−３２食によって誘導された脂肪肝後のＮＡＳＨ発症およびペプチド処置の開始点の略図。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介によるＮＡＳＨ肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１７Ｂ：１２週目の終わりに犠牲にしたマウスから摘出した肝臓の写真。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介によるＮＡＳＨ肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１７Ｃ：図１７Ｂに示した肝臓の重量（ｐ：^＊≦０．０５、^＊＊≦０．０１）。 レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４仲介によるＮＡＳＨ肝症状のｉｎ ｖｉｖｏ阻害を示す。図１７Ｄ：ＨＦＤ−３２を与えられたマウスから、およびＨＦＤ−３２を与えられ、次いでレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウス（ｎ＝５）から摘出された精巣上体脂肪（精巣上体）、腸間膜脂肪（腸間膜）の体脂肪重量。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス（図１８Ａ）およびＮＡＳＨに罹患し脂肪肝を示すマウス（図１８Ｂ）からの肝切片と、ＨＦＤを与えられ、ＨＢＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注または１０ｍｇ／ｋｇレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスからの膨化（図１８Ｃ）および炎症（点線で囲んだ部分）（図１８Ｄ）からの肝切片との代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス（図１８Ａ）およびＮＡＳＨに罹患し脂肪肝を示すマウス（図１８Ｂ）からの肝切片と、ＨＦＤを与えられ、ＨＢＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注または１０ｍｇ／ｋｇレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスからの膨化（図１８Ｃ）および炎症（点線で囲んだ部分）（図１８Ｄ）からの肝切片との代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス（図１８Ａ）およびＮＡＳＨに罹患し脂肪肝を示すマウス（図１８Ｂ）からの肝切片と、ＨＦＤを与えられ、ＨＢＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注または１０ｍｇ／ｋｇレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスからの膨化（図１８Ｃ）および炎症（点線で囲んだ部分）（図１８Ｄ）からの肝切片との代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。 固形飼料（ＮＤ）を与えられたマウス（図１８Ａ）およびＮＡＳＨに罹患し脂肪肝を示すマウス（図１８Ｂ）からの肝切片と、ＨＦＤを与えられ、ＨＢＳＳ緩衝液中０．９％ＤＭＳＯの静注または１０ｍｇ／ｋｇレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスからの膨化（図１８Ｃ）および炎症（点線で囲んだ部分）（図１８Ｄ）からの肝切片との代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。 ＨＦＤ−３２食によって誘導された脂肪肝後のＮＡＳＨマウスから、およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスからの肝切片のシリウスレッド染色を示す。矢印は、線維化（コラーゲン）の存在を示している。 ＨＦＤ−３２を与えられ、１２週目に摘出された肝切片、およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）処置マウスから摘出された肝切片の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。バー＝１００μｍ。腫瘍小結節を破線で示す。 Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４が脂肪肝と、ＤＥＮ誘導肝癌（ＨＣＣ）において発症されるＮＡＳＨとを防止することを示す。図２１Ａは、ＤＥＮ誘導ＨＣＣを誘導されたが処置を受けてない（無処置）、しかしレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置（１８ｍｇ／ｋｇ静注）マウス群でないマウスから得た肝切片中の脂肪肝、炎症および膨化を示す代表的なＨ＆Ｒ染色である。 Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４が脂肪肝と、ＤＥＮ誘導肝癌（ＨＣＣ）において発症されるＮＡＳＨとを防止することを示す。図２２Ｂは、ＤＥＮによって癌を誘導され、次いでレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４で処置された、または処置されてない（対照）マウスからの肝切片のシリウスレッド染色を示す。矢印は、線維化の存在を示している。

本発明は、活性を維持し、かつ非修飾ペプチドと比較して、さらに改善した活性、ならびに新規の活性を有するＶＤＡＣ１由来のペプチドのレトロ−インベルソ類似体を含む、合成ペプチドを提供する。加えて、レトロ−インベルソ類似体は溶解度および安定性が改善され、血液脳関門を通過することができ、したがって治療用ペプチドとしての使用に極めて適している。

「ＶＤＡＣ１」および「ｈＶＤＡＣ１」という用語は本明細書では同じ意味で用いられ、およびミトコンドリアポリンの高度に保存されたファミリーのヒト電位依存性陰イオンチャネルアイソフォーム１（ｈＶＤＡＣ１）を指す。３つの遺伝子によってコードされる４種のＶＤＡＣアイソフォームがこれまで知られており、本明細書で使用するように、用語「ＶＤＡＣ１」およびヒト「ｈＶＤＡＣ１」は、２８３アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００３３６５）を指す。

本明細書で用いる場合「ペプチド」という用語は、天然アミノ酸残基、非自然アミノ酸残基および／または化学修飾アミノ酸残基を包含し、各残基は、ペプチド結合または非ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ末端とカルボキシ末端を有することによって特徴づけられる。当技術分野で既知のように、アミノ酸残基は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して１文字または３文字表記のいずれかで表わされている。本発明の特定のペプチドは、好ましくはβ−ヘアピン型で利用される。

一態様によれば、本発明はＶＤＡＣ１系ペプチドの類似体を含む合成ペプチドを提供し、ＶＤＡＣ１系ペプチドは癌細胞内でアポトーシスを誘導することができ、５〜２６の連続するミノ酸からなり、類似体はＶＤＡＣ１由来ペプチドに関してレトロ修飾型、および部分的または完全なインベルソ修飾型である。

本明細書で用いる場合、「ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体」または「ＶＤＡＣ１系ペプチドの類似体」という用語は、修飾されるＶＤＡＣ１に関して、ＶＤＡＣ１由来の天然ペプチドの癌細胞死の誘導を少なくとも模倣することができる合成ペプチド分子を指す。

本明細書で用いる場合、「レトロ修飾型」という用語は、レトロ修飾されるペプチドに対して反対方向でアミノ酸残基が構築されているＬ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。

本明細書で用いる場合、「インベルソ修飾型」という用語は、インベルソ修飾されるペプチドに対して同じ方向でアミノ酸残基が構築されている少なくとも１つのＤ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。部分的インベルソ修飾型類似体とは、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含むペプチドを指す。完全インベルソ修飾型類似体とは、Ｄ−アミノ酸で構成されているペプチドを指す。

本明細書で用いる場合、「レトロ−インベルソ」修飾型という用語は、レトロ−インベルソ修飾されるペプチドに対して反対方向でアミノ酸残基が構築されているＤ−アミノ酸で構成されているペプチド類似体を指す。

特定の実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドは、配列番号１および配列番号４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる。特定のさらなる実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる。

特定の例示的な実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体は、配列番号１に関してレトロ−インベルソ類似体である。これらの実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、そのすべてのアミノ酸は配列番号３を形成するＤ−アミノ酸である。

特定のさらなる例示的な実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体は、配列番号４に関してレトロ−インベルソ類似体である。これらの実施形態によれば、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、そのすべてのアミノ酸は配列番号６を形成するＤ−アミノ酸である。

特定の実施形態によれば、合成ペプチドは、細胞認識部分および／または局在化部分をさらに含む。一部の実施形態によれば、細胞局在化部分は、合成ペプチドの透過性を増加させる。「透過性」とは、障壁、膜または皮膚層を通して浸透する、広がる、または拡散する薬剤もしくは物質の能力を指す。「細胞透過性部分」または「細胞浸透性部分」または「細胞透過性増強部分」とは、膜を通して分子の浸透を容易にすることができる、もしくは増強することができる当技術分野で既知のいかなる分子を指す。非限定的な例としては、脂質、脂肪酸、ステロイドおよび嵩高い芳香族化合物または脂肪族化合物などの疎水性部分；
細胞膜受容体、または、例えばステロイド、ビタミンおよび糖などの担体、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、トランスポーターペプチドを有し得る部分；ナノ粒子およびリポソームが挙げられる。

特定の例示的な実施形態によれば、認識部分および／または局在化部分は、ペプチド細胞浸透性増強部分である。一般的に細胞浸透ペプチドまたは細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）と呼ばれるそのようなペプチドは、外見的にはエネルギー非依存様式で、時には受容体非依存様式で大分子を含む分子を迅速に細胞内部に移動させる短いペプチド配列からなる。ＣＰＰは、毒性が低く、送達収率が高い。例示的なＣＰＰは、Ａｎｔｐドメイン（配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する）、ＨＩＶ−１転写因子ＴＡＴ、ＨＳＶ−１からのＶＰ２２がある。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、トランスフェリンとのその相互作用を通して細胞の鉄の取り込みにおいて機能する。この受容体は、多くの癌型の表面で増加し、効率的に内部移行されるので、癌の標的治療にとって魅力的な分子である。Ｔｆは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するトランスフェリン受容体によって認識されるペプチド配列である。予想外に、現在、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するトランスフェリン受容体結合ドメインのレトロ類似体が癌細胞認識部分および浸透部分としても使用し得ることを示す。

特定の例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号７またはそのレトロ類似体を含み、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する。さらなる例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号７またはそのレトロ類似体からなり、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる。別の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号７または配列番号８の部分的インベルソ修飾型類似体である。さらなる実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号７または配列番号８の完全インベルソ修飾型類似体である。

特定のさらなる例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９またはそのレトロ類似体を含み、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。さらなる例示的な実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９またはそのレトロ類似体からなり、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる。別の実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９または配列番号１０の部分的インベルソ修飾型類似体である。さらなる実施形態によれば、認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドは、配列番号９または配列番号１０の完全インベルソ修飾型類似体である。

特定の実施形態によれば、本発明の合成ペプチドは、「トリプトファン（Ｔｒｐ）ジッパーペプチド」またはそのレトロ類似体（複数可）とともに、アミノ酸配列ＳＷＴＷＥ（配列番号１１）およびＫＷＴＷＫ（配列番号１２）を含み、各々はＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＣ末端またはＮ末端に互いに独立して位置する。

特定の実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドまたはそのレトロ類似体は、すべてＬ−立体異性体ペプチドである。他の実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドまたはそのレトロ類似体は、部分的インベルソ修飾型である。さらなる実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドまたはそのレトロ類似体は、Ｄ−アミノ酸だけを含有する完全インベルソ修飾型である。一部の実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドのレトロ類似体は、配列番号１３（ＥＷＴＷＳ）に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、Ｔｒｐジッパーペプチドは、配列番号１１、配列番号１２またはその組み合わせのレトロ−インベルソ類似体を含む。

さらなる例示的な実施形態によれば、本発明は、そのＮ末端に配列番号１２に記載のアミノ酸配列と、そのＣ末端に配列番号１３に記載のアミノ酸配列とを有するＴｒｐジッパーと隣接している配列番号１のレトロ−インベルソ類似体を含み、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドをさらに含む合成ペプチドを提供する。一部の実施形態によれば、合成ペプチドは、配列番号１９（Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ）に記載のアミノ酸配列を含む。特定の例示的な実施形態によれば、ペプチドは配列番号１９からなる。

本発明の合成ペプチドの例示的な配列は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＴｒｐジッパーペプチドを含み、ここではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、配列番号１に記載のレトロ−インベルソ類似体（配列番号２のアミノ酸配列を有し、ここではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、配列番号３を形成する）が続き、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＴｒｐジッパーペプチドが続き、ここではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、配列番号７（配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するレトロ類似体）に記載のアミノ酸配列を有するＴｆ認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドのレトロ類似体が続く。本明細書ではレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４、レトロ−インベルソペプチド、レトロ−インベルソＴｆ−Ｄ−ＬＰ４、またはレトロ−インバースＴｆ−Ｄ−ＬＰ４と同じ意味で用いられるペプチドは、アミノ酸配列Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ（配列番号１４）からなる。

本発明の合成ペプチドのさらなる例示的な配列は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＡｎｔｐ細胞浸透性ペプチドのレトロ類似体（配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するレトロ類似体）を含み、配列番号４のレトロ−インベルソ類似体（配列番号５のアミノ酸配列を有し、ここではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、配列番号６を形成する）が続く。本明細書で「レトロ−インベルソＮ末端」またはレトロ−Ｄ−Ｎ末端と呼ばれるペプチドは、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−ＬｙＤ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｍｅｔ（配列番号１５）からなる。

特定の実施形態によれば、本発明のペプチドのＣ末端は、アミド化、アシル化、還元、またはエステル化され得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

本明細書で用いる場合、「アポトーシス」または「アポトーシス細胞死」という用語は、末端が細胞フラグメンテーションになる細胞収縮、膜小疱形成およびクロマチン凝縮によって特徴付づけられ得るプログラム細胞死を指す。アポトーシスを受けている細胞は、ＤＮＡ切断の特徴的パターンも示す。あるいは、アポトーシスは、アポトーシス経路のメンバーの活性化または発現における変化、例えばシトクロムｃのミトコンドリア放出の増加によって間接的に特徴づけられ得る。当技術分野で周知のアポトーシス誘導試薬の非限定的な例としては、アクチノマイシンＤ、抗生剤Ａ−２３１８７、ｂ−ラパコン、カンプトテシン、セラミド、クルクミン、デキサメタゾン、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（登録商標）、Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、ヒペリシン、プロスタグランジンＡ２、Ｓ−ニトロソグルタチオン、スタウロスポリン、スリンダク硫化物、スルホン化スリンダク、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、４−ヒドロキシフェニルレチンアミド、ベツリン酸などが挙げられる。

以下に例証されるように、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４は癌細胞死を誘導する際に高活性である。さらに、ヒト初代神経芽細胞腫細胞株Ｕ−８７（図５）で例証されるように、ＶＤＡＣ−１由来ペプチドＬＰ４のレトロ−インベルソ類似体を含む合成ペプチドは、非悪性マディン−ダービーイヌ腎臓上皮細胞と比較して、癌細胞死を誘導することにおいてははるかに効果的であった。

レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドは、トランスフェリン受容体結合ドメインのレトロ類似体を含む。予想外に、本発明は、現在、レトロ類似体が天然ペプチドとして同等の認知活性および／または局在化活性を有することを示す。

本明細書で以下にさらに例証するように、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４はｉｎ ｖｉｖｏで癌の発症を阻害する上で効果的であることが示された。レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の脳腫瘍の頭蓋内異種移植の成長に対する効果を示す１モデルと、ペプチドのジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）−誘導肝癌に対する効果を示す他のモデルとの２つのモデルを使用した。

脳同所性腫瘍モデルにおいて神経膠芽細胞腫Ｕ−８７ ＭＧ細胞がヌードマウス頭脳に移植された。遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドまたはＰＬＧＡナノ粒子カプセル化ペプチドで静注処置されたマウスは、かなり低い腫瘍体積を示した（遊離ペプチドの場合、最高９０％の低下、図１１）。これらの結果は、遊離形態であるとき、ペプチドがＢＢＢも通過する可能性が最も高いことを示唆する。いかなる特定の理論または作用機構にも拘束されることを望むものでなはいが、ＢＢＢを通過することは、由来類似体であるＶＤＡＣに結合される配列を認識するＴｆＲによって仲介され得るが、しかしＴｆドメインも上述のようにレトロ−立体配置である。

ＤＥＮによって誘導された肝細胞癌（ＨＣＣ）において、マウスは、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド、または対照溶液（ＨＢＳＳ中２％のＤＭＳＯ）を静脈内に注射された。無処置、対照群においてマウスの肝臓は、多数の腫瘍小結節を示した（図１２Ｂ、１２Ｄ）が、ペプチドで処置されたマウスにおいて、腫瘍小結節は観察されなかった（図１２Ｃ、１２Ｄ）。対照群において、肝臓は、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスからの肝臓と比較して、サイズおよび重量が大きかった（図１２Ｅ）。これらの結果は、ペプチドが腫瘍成長を阻害したことを示す。

予想外に、本発明のレトロ−インベルソペプチドは、さらに、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の防止および／または処置において顕著な活性を示した。脂肪性肝炎／ＮＡＳＨ（ＳＴＡＭ）のために用いたモデルは、ＮＡＳＨを有する大部分のヒトにおいて生じるようにカロリー過剰によって脂肪肝疾患が誘導されるＨＦＤ−３２に基づき、ヒトＮＡＳＨの生理的、代謝的、組織学的、および臨床的なエンドポイントのすべてを示した。ＨＦＤ−３２摂食の開始後すぐに、マウスは脂肪性肝炎を発症し、肝細胞中の脂肪滴の蓄積、炎症性細胞浸潤の散在、膨化およびＭａｌｌｏｒｙ−Ｄｅｎｋ体、線維化、および最終的にＨＣＣ症小結節を有した（図１３〜２０）。静脈内に投与されたＶＤＡＣ１系ペプチド、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４は、これらのすべての肝臓の病変形成を除去し、または高度に減少させた。ペプチド処置マウスからの肝臓は、非常に少ない脂肪性沈着物、炎症性細胞浸潤またはコラーゲン繊維を示した（図１３〜２０）。

さらなる態様によれば、本発明は、ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体を含む少なくとも１種の合成ペプチドと、任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤、塩または賦形剤を含む医薬組成物を提供し、該ＶＤＡＣ１由来ペプチドは癌細胞内でアポトーシスを誘導することができ、かつ５〜２６の連続するアミノ酸からなり、該類似体はＶＤＡＣ１由来ペプチドに関してレトロ修飾型および部分的または完全インベルソ修飾型である。

「薬学的に許容される担体」という用語は、意図した標的に有効成分を送達し、ヒトまたは他のレシピエント生物に有害事象を引き起こさない賦形薬を指す。本明細書で用いる場合、「医薬品」とは、ヒトおよび動物用の両医薬品を包含すると理解される。有用な担体としては、例えば、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１、３−ジオール、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテートまたは鉱物油が挙げられる。医薬組成物の調合のための方法と成分は、周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ，編， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，１９９０に見いだすことができる。

医薬組成物は、他の任意選択の材料を含むこともでき、組成物の担体および／または使用目的に応じて選択されてよい。さらなる成分としては、抗酸化剤、キレート剤、カルボマーなどの乳剤安定剤、メチルパラベンなどの保存剤、芳香剤、グリセリンなどの湿潤剤、ＰＶＰ／エイコセンコポリマーなどの防水剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの水溶性フィルム形成剤、油溶性フィルム形成剤、カチオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

他のことは考慮しなくても、本発明の新規活性成分がペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣薬であるという事実は、調合がこれらの種類の化合物の送達に好適であることを決定づける。一般にペプチドは、胃酸または腸内酵素による消化に対する感受性のために経口投与にあまり適していないが、本発明の組成物は、本発明の安定したレトロ−インベルソペプチドについて観測される高活性のために、経口投与されることができる。加えて、代謝的に安定し、および経口生物学的利用が可能なペプチド模倣薬類似体を設計し、提供するために、新規方法が使用される。

本発明の医薬組成物は、いずれの適切な手段、例えば、鼻腔内、皮下、筋内、静脈内、動脈内、関節内を含む局所的もしくは非経口的な投与、または病巣内投与によって投与されてよい。

有効成分としての本発明の分子は、周知のように、薬学的に許容され、および有効成分と適合する希釈剤または賦形剤に溶解される、分散させる、または混合される。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせがある。別の好適な担体は、当業者には周知である（例えば、Ａｎｓｅｌら，１９９０およびＧｅｎｎａｒｏ，１９９０を参照されたい）。加えて、必要に応じて、組成物は、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような補助物質を少量含むことができる。

本明細書（図９）に例示したように、本発明は現在、ＶＤＡＣ１由来ペプチドのレトロ−インベルソ類似体を含む合成ペプチドが生理学的に適合した溶液に高度に可溶性であることを示す。この溶解度は、これまで知られているＶＤＡＣ１由来のペプチドを超える、本発明のレトロ−インベルソペプチドの意味のある利点であり、レトロ−インベルソパプチドを薬物としての用途の適合性を高める。

さらなる態様によれば、本発明は、異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連する疾患を患っている対象を処置するための方法を提供し、該方法は本発明の合成ペプチドまたはそれを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。

特定の実施形態によれば、異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連する疾患は癌である。特定の例示的な実施形態によれば、癌は神経膠芽腫を含む神経膠腫；肝細胞癌を含む肝癌；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む白血病；膵癌と乳癌および黒色腫からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表わす。

さらなる態様によれば、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状を予防および／または処置する方法を提供し、該方法はそれを必要とする対象に本発明の合成ペプチドまたはそれを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。

本明細書で用いる場合、「処置する」という用語は、治療上の処置を意味し、用語「減少させる」、「抑える」、「寛解させる」および「阻害する」を包含する。これは一般的に、腫瘍増殖を減少させる、もしくは抑える、および／または癌細胞増殖を減少させる、もしくは抑える、および／または癌幹細胞の腫瘍形成能を減少させる、および／またはＮＡＦＬＤの発症およびＮＡＦＬＤに伴う症状を減少させる、もしくは抑えることを意味すると理解される。

特定の実施形態によれば、本発明のペプチドは、予防使用のため、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の進行を阻止するおよび／または低減させる。

本明細書で用いる場合、「治療有効量」という用語は、対象に投与されると、抗癌活性を発現するおよび／またはＮＡＦＬＤおよびＮＡＦＬＤに伴う症状を減少させる、もしくは抑えることができる医薬組成物の量を指す。さらなる態様によれば、本明細書に記載の本発明の合成ペプチドおよびそれを含む医薬組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状の処置で用いる。

特定の実施形態によれば、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される。一部の実施形態によれば、ＮＡＦＬＤに伴う症状は、脂肪滴の蓄積、炎症、線維化、肝細胞死およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。

以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより完全に例示するために示される。しかし、実施例は本発明の広範な範囲を限定すると決して解釈されてはならない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変更および修正を容易に考案することができる。

材料および方法
細胞培養
細胞株ＴＨＰ−１、ＢＮＬ１ＭＥ、ＧＬ−２６１、ＰＡＮＣ−１、ＰＡＮＣ−２、Ｂ１６Ｆ１０．０、ＭＤＣＫ、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−２５１ＭＧ、Ｕ−１１８ＭＧ、ＬＮ−１８を、１０％のＦＣＳ、ペニシリン（１００ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む推奨される培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。

ＶＤＡＣ１系ペプチドによる細胞処置および細胞死分析
懸濁液中の細胞を計数し（２ｘ１０^６／ｍＬ）、同日に処置したが、接着細胞は処置の１６〜２４時間前に計数し、１２ウェルプレートに播種した（１．５〜２×１０^５／ｍＬ）。
懸濁液中の細胞または接着細胞を、種々の濃度の目的のペプチドとともに、無血清培地（それぞれ２００μＬまたは５００μＬ）中で、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃でインキュベートした（それぞれ９０分間または６時間）。細胞を収集し（接着細胞はトリプシン処理によって）、遠心分離し（１５００×ｇ、５分間）、ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色とフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを用いて細胞死について分析した。

ペプチド
対照合成ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＶＤＡＣ１由来ペプチド（ＬＰ４と名付けた）で構成されており、配列番号１のアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、そのＮ末端に配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＴｒｐジッパーと隣接し、かつそのＣ末端に配列番号１２に記載のアミノ酸配列と隣接し、これらのアミノ酸は、配列番号１１のＮ末端に結合した配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＤ立体配置のＴｆ局在化ペプチドであり、配列番号１７（Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｙｓ）を形成する。このペプチドは、Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と名付ける。

レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と名付け、試験した合成ペプチドは、上述のように構成された配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。

このペプチドは、＞９５％の純度までＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成された。ペプチドを以下のように溶解した：２ｍｇのＴｆ−Ｄ−ＬＰ４またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４を５μＬの１００％ＤＭＳＯで溶解し、４００ｍｇ／ｍＬ（９７．３６ｍＭ）の濃度のペプチド溶液を得、この溶液を３７℃の水浴中で３０分間さらにインキュベートした。次いで、この溶液に９５μＬの蒸留水を混合しながら加えることによって２０ｍｇ／ｍＬ（４．８６ｍＭ）のペプチド濃度になるまで希釈し、希釈溶液を３７℃の水浴中で３０分間インキュベートして、溶液が透明になるまでさらに可溶化させた。次いで、ペプチド溶液を１５，０００ｇで５分間遠心分離させ、各調製の上清を結合能の低い新たなエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液のアリコートをペプチド濃度についてのさらなる分析のために使用した。

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色
ＰＩ溶液を０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるまでＰＢＳで希釈した。２．５μＬのＰＩ溶液を各ＦＡＣＳチューブに加え、次いでチューブを穏やかにボルテックスして、細胞懸濁液を均質にした。細胞生存率をＦＡＣＳチャネルＦＬ３で測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してデータを分析した。

ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）、オイルレッドＯ；マッソントリクロームおよびシリウスレッド染色
パラフィン包埋肝臓の切片（５μｍの厚さ）のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、標準プロトコルを使用して行った。

オイルレッドＯ染色は、細胞中の脂肪滴を染色するために行われるアッセイである。新鮮な肝臓検体をＯ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓｃｉｇｅｎ，ＵＳＡ）に包埋することによって調製された凍結切片を６０％イソプロパノールで穏やかに洗浄し、次いで、６０％イソプロパノールに溶解した０．５ｇのオイルレッドＯ（ＢＤＨ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のワーキング溶液で１５分間、染色した。染色した切片を蒸留水で数回洗浄して、取り込まれていない染料を除去した。次いで、検体をヘマトキシリンで５分間、対比染色した。光学顕微鏡を使用して結果を調べた。脂肪滴は赤色に見え、核は青色に見える。

マッソントリクローム（Ｂｉｏ ｏｐｔｉｃａ，Ｉｔａｌｙ）染色を既述（Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ Ｔら，２０１５．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．３０（８）， ９６３−９６９）のように行った。この染色によって、コラーゲンは青色に見え、筋繊維は赤色に見え、核は黒色／青色に見える。

シリウスレッド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）染色は、既述（Ｚｈａｎｇ Ｙら，２０１４． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０，９１９−９３０）のように、パラフィン包埋肝切片上で行った。手短に言うと、固定され、パラフィンに包埋された肝切片を０．１％のシリウスレッド−ピクリン酸溶液で染色した。切片を酢酸で迅速に洗浄して、光学顕微鏡下で撮影した。コラーゲンは、淡黄色の背景上で赤色に見える。

異種移植片実験
頭蓋内同所性異種移植マウスモデルのために、定位装置を使用してＵ−８７ＭＧ細胞（８×１０^４）をヌードマウス脳に移植した。手術から４８時間後に、マウスを３つの群（群当たり６匹の動物）にランダム化し、３日ごとにＤＭＳＯ（１．４４％）、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＬＧＡナノ粒子中にカプセル化したレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。マウスをＭＲＩにかけ、次いで犠牲にした。ＩＨＣのために脳を摘出して、処理した。ＶｉｖｏＱｕａｎｔ ２．１０ソフトウェアを使用して腫瘍体積を分析した。

肝癌の誘導
肝癌誘導のために、ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）、別名Ｎ−ニトロソジエチルアミン、を用いた。ＤＥＮは、実験動物モデルにおいて発癌性物質として広く使われている（Ｓｈｉｒａｋａｍｉ Ｙら，２０１２．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３３，２６８−２７４；Ｔｏｌｂａ，Ｒら，２０１５．Ｌａｂ Ａｎｉｍ ４９，５９−６９）。

１４日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（雄）にＤＥＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍｇ／ｋｇ体重を注射し（腹腔内）、その後定期的に調べた。２匹のマウスをランダムに犠牲にすることによって、マウスの肝腫瘍成長を調べた。腫瘍成長は、３０週目から始まる。
腫瘍成長の確認後、マウスを以下の通りにグループ分けした：ＨＢＳＳ緩衝液に溶解した２％ＤＭＳＯを５０μＬ、静脈内投与される対照群マウス（ｎ＝１２）；１８ｍｇ／ｋｇのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４を静脈注射で投与される処置群（ｎ＝１２）。ペプチド処置は、最初の２週間に３回（それから４３週目まで週２回）施した。腫瘍サイズは、ＭＲＩで分析した。実験終了後、病理組織学的分析のためにマウスを犠牲にし、肝臓を撮影して、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定した。

非アルコール性脂肪性肝炎−肝細胞癌（ＮＡＳＨ−ＨＣＣ）マウスモデル
雄と雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、ＥＮＶＩＧＯ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。すべてのマウスはＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｎ−Ｇｕｒｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂｅｅｒ−Ｓｈｅｖａ Ｉｓｒａｅｌ）において無菌条件下で飼育されていた。脂肪肝−ＮＡＳＨ−ＨＣＣを既述（Ｆｕｊｉｉ Ｍら，Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ ４６，１４１−１５２）のように得た。脂肪肝−ＮＡＳＨを誘導するためにマウスを飼育し、２日齢の新生児雄マウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（２００μｇ／マウス）を皮下注射し、授乳ために母マウスのケージに戻した。

４週齢目にマウスに高脂肪食（ＨＦＤ−３２）を摂取させた。肝臓脂肪性症状は６週目に、ＮＡＳＨは９週目に発現し始める。対照群（ｎ＝１０）および処置群（ｎ＝１０）としてマウスをグループ分けし、脂肪肝調査についての処置を７週目から９週目に、ＮＡＳＨ調査についての処置を９週目から１２週目に開始した。対照群には、ＨＢＳＳ緩衝液に溶解した０．９％ＤＭＳＯを５０μＬ投与した。処置群−１（ｎ＝１０）にはレトロ−Ｔｆ−ＤーＬＰ４（配列番号１４）を１０ｍｇ／ｋｇで、および処置群−２（ｎ＝１０）にはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（配列番号１４）を１８ｍｇ／ｋｇで、すべて静脈注射で投与した。ペプチド処置は、週に３回施した。実験終了後、マウスにケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）と、ＰＢＳに溶解したキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）とで麻酔し、次いで血液サンプルを採取した。胸部を切開して、血液を心臓から採取した。次いで、マウスをＣＯ_２吸入によって犠牲にした。肝臓を摘出し、撮影して、計量した。肝臓の一部を固定し、パラフィンに包埋して、薄片を作り、次いで上述のようにヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を施した。オイルレッド染色の場合、肝臓の一部をＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ化合物（Ｏ．Ｃ．Ｔ）中で凍結させ、包埋し、薄片を作り、次いで上述のようにオイルレッドＯ染色法を用いて、脂肪分を染色した。

血糖値は、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａ血糖測定器（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ（登録商標）を使用して測定した。

ＮＡＳＨ−ＨＣＣモデルマウスの食事介入
すでにＳＴＺを注射した４週齢の雄マウスを母マウスから離し、実験の経過中は、高脂肪食（ＨＦＤ−３２）を与えた。ＨＦＤ−３２飼料は、卵白粉末（ＭＭ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ；Ｗｉｍｂｏｒｎｅ，ＵＫ）５％；ラクトース（ＰＨＡＲＭＡ ＧＲＡＤＥ；Ｎｅｌｓｏｎ，ＵＫ）６．９２８％；牛脂（飽和脂肪）粉末（８０％の牛脂を含む）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）１５．８８％；ミルクカゼイン（Ｓｈａａｎｘｉ Ｆｕｈｅｎｇ（ＳＦ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｘｉ’ａｎ，Ｃｈｉｎａ）２４．５％；サフラワー油（高オレイン酸タイプ）（Ｂｕｓｔａｎ ａＢｒｉｕｔ；Ｇａｌｉｌ，Ｉｓｒａｅｌ）２０％；ショ糖（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ；Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）６．４５％；重酒石酸コリン（ＢＵＬＫ ＰＯＷＤＥＲＳ，Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）０．３６％；結晶セルロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ；Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５．５％；Ｌ−システイン（Ｓｏｕｒｃｅ Ｎａｔｕｒａｌｓ，Ｓｃｏｔｔｓ Ｖａｌｌｅｙ， ＵＳＡ）０．４３％；マルトデキストリン（ＢＵＬＫ ＰＯＷＤＥＲＳ，Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）８．２５％；ＡＩＮ９３Ｇ−ミネラル混合物（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）５％；ＡＩＮ９３ＶＸ−ビタミンミックス（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）１．４％、および第三ブチルヒドロキノン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）０．００２％で構成された。対照Ｃ５７Ｂｌ／６マウスには、標準固形飼料を与えた。

動物試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＲＡＲＣ） ｏｆ Ｂｅｎ−Ｇｕｒｉｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ）「実験動物の管理と使用に関する指針」のすべての適用される方針、手法および規制条件に従って実施した。

実施例１：白血病細胞における細胞死の誘導
本実験では、急性単球性白血病患者由来のヒト単球細胞株の細胞（ＴＨＰ−１細胞、ウェル当たりの４００，０００細胞）を使用した。本明細書において上述したように、対照（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）およびいくつかの濃度でのアッセイ レトロ−インベルソ（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）ペプチドのそれぞれを無血清培地に加え、各ペプチド型の存在下で細胞を５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で９０分間インキュベートした。

図１に示すように、両ペプチドはかなりの細胞死を誘導した。レトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）による細胞死は、対照ペプチド（Ｔｆ−Ｄ−ＬＤ４）の８μＭのＥＣ_５０と比較して、４．５μＭのＥＣ_５０で得られた。

実施例２：肝癌細胞における細胞死の誘導
図２は、対照（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）および試験レトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）の肝癌マウスＢＮＬ１ＭＥ細胞株に対する効果を示す。細胞を無血清培地中で各ペプチド型とともに、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６時間インキュベートした。

白血病細胞と同様に、両ペプチドは、同程度のＥＣ_５０（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびＴｆ−Ｄ−ＬＰ４に対してそれぞれ２．５μＭおよび２．７μＭのＥＣ_５０）で、大量の細胞死を誘導した。しかし、より高い最大の細胞死誘導は、レトロ−インベルソペプチド（７０％と比較して９５％）で得られた。

実施例３：ＰＡＮＣ−１またはＰＡＮＣ−２細胞における細胞死の誘導
本アッセイでは、ヒト（ＰＡＮＣ−１）およびマウス（ＰＡＮＣ−２）膵癌細胞を使用した。細胞を播種し（１００，０００細胞／ウェル）、無血清培地中で５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６時間レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置した。細胞死はＰＩ染色によって分析し、細胞死のパーセンテージはフローサイトメトリーで測定した。

図３Ａに示すように、レトロ−インベルソペプチド（レトロ−ＴＦ−Ｄ−ＬＰ４）は、両細胞株において約４μＭのＥＣ_５０で細胞死を誘導した。

図３Ｂは、ＰＡＮＣ−２細胞のアクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド染色を表わし、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４がアポトーシスを誘導することを示す。

実施例４：黒色腫細胞における細胞死の誘導
Ｂ１６Ｆ１０．０黒色腫細胞（１２ウェルプレートにおいて１５０，０００細胞／ウェル）を播種し、翌日、無血清培地中で、表示濃度のレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドとともに５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６時間インキュベートした。細胞死をＰＩ染色およびＦＡＣＳによって分析した。

図４に示すように、レトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）が、７μＭのＥＣ_５０で、濃度依存細胞死を誘導した。

実施例５：マウス神経膠腫細胞における細胞死の誘導
マウス神経膠腫ＧＬ−２６１細胞を、無血清培地中で、対照Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４またはいくつかの濃度のレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４とともに５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６時間インキュベートし、細胞死をＰＩ染色およびＦＡＣＳによって分析した。

図５に示すように、両ペプチドはかなりの細胞死を誘導したが、しかしレトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）による細胞死の誘導は、対照ペプチドの３．３μＭのＥＣ_５０と比較して、２．２μＭのＥＣ_５０であり、対照ペプチドと比較して著しく高かった。

実施例６：神経膠芽腫細胞における細胞死の誘導
ヒト原発性神経膠芽腫由来細胞株（Ｕ−８７ＭＧ）をｍＬ当たり６×１０^５細胞で、無血清培地中でいくつかの濃度の試験ペプチドとともに５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で６時間インキュベートした。本実験で使用したペプチドはＴｆ−Ｄ−ＬＰ４、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４、およびアミノ酸配列Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｍｅｔ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ（配列番号１８）を含む、Ｄ−ΔＮ−Ｔｅｒ−Ａｎｔｐと名付けられた、ＶＤＡＣ１由来の追加のペプチドである。次いで、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し（１５００×ｇ、５分間）、ＰＢＳで洗浄して、ＰＩ染色およびフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）ならびにＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用して細胞死を分析した。図６に示すように、Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の両ペプチドは、それぞれ１．５μＭのＥＣ_５０および２．２μＭのＥＣ_５０で同程度の大量の細胞死を誘導した。

実施例７：癌幹細胞および癌細胞株対非癌細胞株の細胞死誘導
癌細胞と比較して非癌性細胞内でアポトーシスを誘導するレトロ−インバースペプチドのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の能力を試験して、ペプチドの癌特異性を確立した。Ｕ−８７ＭＧおよびＭＤＣＫ（成犬雌コッカースパニエルの腎臓組織由来のメイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞）を無血清培地中でいくつかの濃度のレトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）とともに６時間インキュベートした。

レトロ−インベルソペプチド（レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）が癌細胞に対する特異性で、癌細胞と非癌細胞を識別することを図７Ａは明らかに示す。１５μＭのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドは癌細胞株において約８０％の細胞死を誘導したが、同じ濃度のペプチドは非癌性細胞株ＭＤＣＫにおいてわずかに約３０％の細胞死を誘導した。

癌幹細胞へのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の効果も、ＧＢＭ患者由来の神経膠腫由来の幹細胞（ＧＳＣ）系Ｇ７（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｓ Ｍら，２００９．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（６）：５６８−５８０）を使用して調べた。既述（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｓ Ｍら，２００９．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．４（６）：５６８−５８０）のように、Ｇ７ ＧＳＣ細胞株は特定の神経膠芽腫幹細胞培地を使用して増殖させた。

Ｕ−８７ＭＧ細胞と比較して、ＧＳＣ特異的マーカーであるＳｏｘ２，ＭｕｓａｓｈｉおよびＮｅｓｔｉｎは、Ｇ７内で高度に発現され、約１％のＧＳＣを含有しており、したがって細胞の幹細胞性を確認する（図７Ｂ、７Ｃ）。Ｋｌｆ４は、両細胞株において、Ｇ７におけるよりもわずかに高いレベルで発現される。レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドによるＧ７幹細胞での細胞死の誘導は、Ｕ−８７ＭＧ細胞株での細胞死誘導と類似していた（図７Ｄ）。５０％の細胞死（ＥＣ_５０、ｎ＝３）を誘導するための濃度は、Ｕ−８７ＭＧ細胞とＧ７細胞でそれぞれ、１．５±０．３と２．５±０．３μＭであった。ａｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色およびＦＡＣＳ分析を使用してアポトーシスをアッセイすると、同様の結果が得られた（図７Ｅ）。

したがって、結果は、ＧＳＣがＶＤＡＣ１由来ペプチドのレトロ−インベルソ類似体に感受性があることを明確に示している。

実施例８：レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の溶解度および安定性
ＶＤＡＣ−１由来ペプチドを含む合成ペプチド、対照Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびレトロ−インベルソペプチドのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の溶解度を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験および処置において動物への静脈投与のペプチド適合性を判断するために評価した。前述のようにペプチドを溶解した。試験した濃度は、４ｍＭであり、使用した溶媒は、薬物投与のための一般的な生理的適合溶液としてのＤＤＷ／１０％ＤＭＳＯ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＮａＣｌは１５０ｍＭの最終濃度で、後で加えた）であった。

Ｔｆ−Ｄ−ＬＰの分子量＝４１１１．６７ｇ／ｍｏｌ。したがって、分析規模で使用して１．４ｍｇのペプチド（Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４）を計量した。８．５μＬのＤＭＳＯ１００％をペプチドに加えて、４０ｍＭの濃度にし、次いでこの溶液が透明になるまで、水浴中３７℃で１５分間インキュベートした。得られた溶液をＤＤＷで約１０倍希釈し、４．４ｍＭ（１１．１％ＤＭＳＯ）の最終濃度にし、水浴中３７℃で１５分間インキュベートし、次いで４℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、溶液を１５，０００×ｇで５分間、遠心分離した。上清を新たなＬｏｂｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、０．１５Ｍの最終濃度までＮａＣｌを加えた。得られた溶液を水浴中３７℃で１５分間、インキュベートし、１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を新たなＬｏｂｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。各ステップでペプチド濃度を分析した。

ペプチド濃度の判定
ペプチド濃度を以下の計算式を使用し、その変性に続いて２８０ｎｍでの吸光度から判定した。

重量／体積（ｍｇ／ｍＬ）濃度を以下の式に従って算出した。
ｍｇペプチド／ｍＬ＝（ＡＵ×ＤＦ×Ｍｗ）／［（ＴｒｙｐＷ＃×５５６０）＋（ＴｙｒＹ＃×１２００）］：
ＡＵ−ペプチド吸光度測定値
ＤＦ−希釈係数
Ｗｍ−分子量
ＴｒｙｐＷ＃−ペプチド配列中のトリプトファンの数
ＴｙｒＹ＃−ヘプチド配列中のチロシンの数

図９は、上述の２８０ｎｍの吸光度分析によって算出した総ペプチド含有量から可溶性ペプチドのパーセンテージとしてＴｆ−Ｄ−ＬＰ４の溶解度（白色バー）とレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の溶解度（黒色バー）との間の比較を示す。図９に明確に示すように、ＤＭＳＯ濃度が１０％まで減少すると、ほとんどのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４は溶解されたが、この条件下ではわずか約１０％のＴｆ−Ｄ−ＬＰ４が溶解した。

Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４とレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の両ペプチドは、１００％ＤＭＳＯ中で高溶解度を示した。予想外に、１０％ＤＭＳＯで、レトロ−インベルソ レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドは、Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４と比較して５〜７倍より可溶であることが示された。

レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＤ４は、その調合物が医薬用途用に可能になるので、この特徴は非常に重要である。

実施例９：ペプチドカプセル化
固形腫瘍を処置するため、特に脳腫瘍を処置するための治療薬としてペプチドを使用する上での１つの主な障害は、治療用ペプチドを患部に送達すること、および脳腫瘍の場合、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することである。ＢＢＢは制限性および選択性が高く、極めて小さい分子（＜６００Ｄａ）または拡散によって、もしくは特定のトランスポーターを介して通過するペプチドだけが通過できる。ナノ粒子にカプセル化された薬物、または細胞受容体によって認識され、かつ取り込まれる配列に結合された薬物はＢＢＢを通過することができる。ここでは、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４が、ＢＢＢ内で高度に発現されるＴｆＲ（例えば、Ｂｉｅｎ−Ｌｙ Ｎら，２０１４．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１１（２），２３３−２４４）を介してＢＢＢを通過することを想定してレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４を使用し、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）（図１０Ａ）で作られているナノ粒子を用いて、カーゴの制御放出を可能にした。

これまでに報告されているように（Ａｎｄｒｉｅｕ Ｖら，１９８９．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｌｉｖ ４， ２９５−３０２；Ｄａｓ Ｊら，２１０４．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ ２２５，４５４−４６６）、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４を充填したＰＬＧＡ複合体を、一部修正した溶媒置換法によって調製した。２０ミリグラムのレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４を４０μＬの１００％ＤＭＳＯに溶解し、次いで無菌ＤＤＷで２０倍に希釈して、最終濃度５％のＤＭＳＯ中の２５ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＰＬＧＡ（５０ｍｇ）をアセトン（１ｍＬ）に溶解した。次いで、１０５μＬのペプチドをＰＬＧＡ−アセトン溶液に加えた。生じたペプチド−ＰＬＧＡ−アセトン混合物を、１％ＰＶＡ（ｗ／ｖ）含有水溶液１０ｍＬに滴下した（０．５ｍＬ／分）。有機溶媒が完全に蒸発するまで、混合物を室温で連続して撹拌した。ナノ粒子を１５，０００ｇ（４℃で２０分間）で遠心分離し、次いでペレットを無菌ＤＤＷに再懸濁させて、２回洗浄した。生じたペレットをＨＢＳＳ溶液と混合して、マウスへの静脈注射用に使用した。ペプチドがＰＬＧＡナノ粒子内にカプセル化され、活性であることを示すために、粒子を遠心分離し、生じた上清および再懸濁させたナノ粒子の細胞死誘導活性を分析した（図１０Ｂ）。ペプチドがＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化され、Ｕ−８７ＭＧ細胞内で細胞死を誘導したことを結果は明確に示した。

実施例１０：レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の腫瘍細胞死に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果
レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４のｉｎ ｖｉｖｏ効果を、脳同所性腫瘍モデルを使用して検討した。同所性モデルは、生きた動物と関連して、腫瘍、特に脳などのユニークな生理的かつ構造的性質を有する部位での腫瘍の特性を調査するための、現在の最善の方法を提供する。これらのモデルは、特徴、例えば代謝、ＢＢＢを越えるドラッグデリバリーおよび毒性の評価を可能にする。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の臨床状況をより良く模倣するために、頭蓋内同所異種移植（Ｐｉｅｒｃｅ ＡＭおよびＫｅａｔｉｎｇ ＡＫ． ２０１４．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．９１，５２０１７）を用いて、腫瘍増殖を阻害するレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドの有効性を検討した。

Ｕ−８７ＭＧ細胞（８×１０^４）をヌードマウス脳に移植し、次いでマウスをＰＬＧＡナノ粒子にカプセル化したレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、または遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）を、ＰＢＳ中ＤＭＳＯ（１．０５％）とともに静注（ｉ．ｖ．）により処置した。２５日後および３２日後に、腫瘍増殖をＭＲＩでモニターした（図１１Ａ）。マウスを遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）の静注により処置し、後処置開始から２５日目および３２日目に、同所性異種腫瘍の体積において８０％および９０％の縮小が得られた（図１１Ｂ）。同様に、ＰＬＧＡカプセル化（１０ｍｇ／ｋｇ）レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による処置も、後処置開始から２５日目および３２日目に同所性異種腫瘍の体積においてそれぞれ４５％および６５％の縮小を示した（図１１Ｂ）。

Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いた分析により、ＰＢＳ／ＤＭＳＯ処置マウスと、遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスまたはＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４処置マウスとの間の生存に統計的な有意差が明らかになった（図１１Ｃ）。ペプチド処置は、無処置マウスで観察された３５日の生存を超えて、遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４で処置されたマウス、またはＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４で処置されたマウスの生存をそれぞれ４０％と５０％延ばした。

静脈投与された遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４およびＰＬＧＡカプセル化レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４の両製剤がＢＢＢを通過して、腫瘍細胞に到達し、腫瘍細胞死を効果的に誘導することができ、遊離レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４が腫瘍サイズの縮小およびマウス生存の両方においてより効果的であることをこれらの結果は明確に示している。

実施例１１：レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４によるＤＥＮ−誘導性癌の阻害
遺伝毒性薬物、ジエチルニトロサミン（ＤＥＮ）は、マウスにおける肝癌の誘導で最も広く使用されている化学物質である。肝細胞が依然として活発に増殖しているとき、２週齢よりも若い雄マウスに注射されると、ＤＥＮはシトクロムＰ４５０ファミリーの酵素によって肝細胞内で代謝活性化を起こし、完全な発癌性物質として作用する（Ｂａｋｉｒｉ ＬおよびＷａｇｎｅｒ Ｆ．２０１３．Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ ７，２０６−２２３）。ＤＥＮによって誘導された肝細胞癌（ＨＣＣ）は、進行性過程を辿り、ＤＥＮ処置後３０〜３２週間で腫瘍が目に見える。

マウスにおいてＤＥＮ誘導ＨＣＣは、上述のように行った（図１２Ａにまとめる）。
肝臓をＭＲＩによって画像化した（図１２Ｂ、１２Ｃ）。犠牲にしたマウスからの肝臓を肉眼病理学的観察のために撮影した（図１２Ｄ）。無処置、対照群において、マウス肝臓は多数の腫瘍小結節を示した（図１２Ｂ、１２Ｄ）が、ペプチドで処置したマウスにおいて、腫瘍小結節は観察されなかった（図１２ Ｃ、１２Ｄ）。対照群において、肝臓は、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置したマウスからの肝臓と比較して、サイズと重量が大きかった（図１２Ｅ）。これらの結果は、ペプチドが腫瘍成長を阻害したことを示す。

実施例１２：レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による脂肪肝の阻害
形態学的変化
ペプチドの脂肪肝に対する効果を調査するために、マウス（４〜９週齢マウス）に５週間、通常の固形飼料（対照）または高脂肪食（ＨＦＤ−３２）を与え、最後の２週間、マウスをＨＢＳＳ中ＤＭＳＯ２％またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。本調査の過程は、図１３Ａに模式的に示した。９週目の終わりに、マウスを犠牲にし、肝臓を撮影し（図１３Ｂ）、計量し（図１３Ｃ）、次いで病理組織学的分析のためのさらなるプロセシングのために固定または凍結させた。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝臓は、通常食（固定飼料）を与えられたマウス、またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスの肝臓と比較して、黄味がかった色を示した（図１３Ｂ）。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝臓の重量は、通常食（固形飼料）を与えられたマウスの肝臓の重量と比較して、約３０％増加していたが、一方この増加はレトロ−インベルソペプチドで処置されたＨＦＤ−３２マウスにおいて減少していた（図１３Ｃ）。これらの結果は、ＨＦＤ−３２マウスの肝臓組織において脂肪の増加および液体の蓄積（炎症）を示しているが、これらはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４によって処置することが可能である。

ＨＦＤ−ＳＴＡＭマウスにおいてレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４による血糖値の低下
以前の調査結果と一致して、血糖値は、通常（固形飼料）食を与えられたマウスにおける約１５０ｍｇ／ｄＬから、ＨＦＤ−３２を与えられたマウスにおける４５０ｍｇ／ｄＬまで、ＨＦＤ−３２食を与えられたマウスにおいて高度に上昇した（図１４）。この上昇は、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４で処置されたマウスにおいて抑えられ、通常食を与えられたマウスの血糖値に匹敵する血糖値を示した。

肝臓病理組織学的変化
形態変化は、固定、パラフィン包埋肝切片で、Ｈ＆Ｅ染色を用いて評価した。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝組織の代表的なＨ＆Ｅ染色切片は、肝細胞内に示される脂肪滴の蓄積、炎症性細胞浸潤の拡散、および線維化によって特徴づけられる脂肪肝の徴候を示す（図１５、１６）。

ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝臓は、脂肪滴の蓄積を示していた。対照的に、ペプチド処置マウスからの肝臓は、サイズおよび脂肪滴の数の両方が明白に減少したことを示した（図１５Ａ）。

脂肪滴を良好に可視化するために、肝切片にオイルレッド染色を施した。ＨＦＤ−３２を与えられた３匹のマウスからの肝切片は、高度に赤色染色された脂肪滴が肝臓を占めていたが、一方通常（固形飼料）食を与えられたマウスまたはＨＦＤ−３２を与えられ、ペプチドで処置されたマウスからの肝切片にはそのような染色が観察されなかった（図１５Ｂ）。

脂肪肝の別の特徴は、明らかに膨化した肝細胞の細胞形態であり、一般的に隣接の肝細胞の２〜３倍のサイズであり、Ｈ＆Ｅ染色切片上の透明になったわずかな細胞質によって特徴づけられる。肝細胞の膨化変性は、肝細胞の細胞死を伴う（Ｙｉｐ Ｗ Ｗ およびＢｕｒｔ Ａ Ｄ．２００６．Ｓｅｍｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｐａｔｈｏｌ ２３，１４９−１６０）。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝臓は、膨化細胞の蓄積を示した（図１６Ａ）。対照的に、通常（ＮＤ、固形飼料）食を与えられたマウスからの肝臓には、膨化細胞が示されず、ＨＦＤ−３２を与えられ、ペプチドで処置されたマウスは膨化細胞が高度に減少したことを示した（図１６Ａ）。

肝細胞膨化現象は、炎症（脂肪性肝炎）と関連している（Ｌｉａｎｇｐｕｎｓａｋｕｌ ＳおよびＣｈａｌａｓａｎｉ Ｎ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ６，４５５−４６３）。実際、Ｈ＆Ｅ染色は、ＨＦＤ−３２を与えられたマウスの肝臓内に炎症区域を示した。ペプチド処置マウス由来の組織切片において、炎症が高度に減少したことが肝組織切片中で認められた（図１６Ｂ）。ＨＦＤ−３２を与えられ、続いてシリウスレッド染色で染色されたマウスの肝臓において線維化は目に見えたが、レトロ−インベルソ レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスにおいては高度に減少した（図１６Ｃ）。

レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドはＮＡＳＨを阻害／後退させる
組織学的には、ＮＡＳＨは、極めて小さいものから肝細胞をほぼ埋めてしまうまで大きさが変化する脂肪球を有する大滴性脂肪肝によって、および線維化とともに、マロリー小体の有無にかかわらず肝細胞の膨化変性によって特徴づけられる（Ｋｌｅｉｎｅｒ Ｄら，２００５．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１，１３１３−１３２１）。

本調査において、マウスに通常の固形飼料（対照）またはＨＦＤ−３２を８週間与え（４〜１２週齢のマウス）、最後の３週間、ＨＢＳＳ中ＤＭＳＯ０．９％またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４（１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置した（図１７Ａ）。１２週目の終わりに、マウスを犠牲にし、肝臓を撮影し（図１７Ｂ）、計量し（図１７Ｃ）、次いで病理組織学的分析、免疫ブロット分析またはｑＰＣＲ分析のためのさらなるプロセシングのために固定または凍結させた。ＨＦＤ−３２食を与えられたマウスからの肝臓は、通常食（固定飼料）を与えられたマウス、またはレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたＨＦＤ−３２食を与えられたマウスの肝臓と比較して、黄色に見えた（図１７Ｂ）。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝臓の重量は、通常食（固形飼料）（ＮＤ）を与えられたマウスの肝臓と比較して、約１．８倍増加したが、一方この増加はレトロ−インベルソペプチドで処置したＨＦＤ−３２を与えられたマウスにおいてわずかに１．４倍であった（図１７Ｃ）。

脂肪は、肝臓または身体の内臓に、大部分は腹腔内に蓄積され得る（内臓脂肪または腹部脂肪）。したがって、精巣上体脂肪（精巣上体）および腸間膜脂肪（腸間膜）を、ＨＦＤ−３２を与えられたマウスおよびＨＦＤ−３２を与えられ、レトロ−Ｔｆ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスから収集した。後者は、無処置マウスと比較して、約４０％短い運命を示した（図１７Ｄ）。

ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからのＮＡＳＨ肝組織の代表的なＨ＆Ｅ染色切片は、脂肪肝について上に示したように、マクロベシクルおよびマイクロベシクルとともに脂肪滴蓄積を示した。これらのベシクルはペプチド処置群において高度に減少している（図１８Ｂ）。ＨＦＤ−３２を与えられたマウスからの肝切片において、膨化肝細胞形態（図１８Ｃ）および炎症（図１８Ｄ）が明確に観察された。対照的に、通常食（固形飼料）を与えられたマウスからの肝臓は、膨化する細胞または炎症徴候を示さず（図１８Ａ）、ＨＦＤ−３２を与えられ、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスは膨化および炎症の徴候をほとんど示さなかった（図１８Ｂ〜Ｄ）。

肝線維化は、コラーゲン細胞外マトリクスの過剰な蓄積による持続的な障害に対する肝臓の異常応答である。肝線維化は、肝臓における慢性炎症によって刺激され、促進される（Ｃｚａｊａ，Ａ Ｊ． ２０１４． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０，２５１５−２５３２）。コラーゲン、線維化マーカーのマッソントリクロームおよびシリウスレッド染色は、ＨＦＤ−３２を与えられたマウスの肝組織において、中心静脈および門脈域周囲の高レベルのコラ−ゲン繊維と、類洞周囲線維化の明白な徴候とを示したが、
ＨＦＤ−３２を与えられ、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドで処置されたマウスの肝組織は、コラーゲン染色をほとんど示さず、ペプチド処置が炎症と線維化を防止したことを示唆する（図１９）。

ＨＦＤ−３２食は、肝細胞癌（ＨＣＣ）をもたらし得る（Ｓｃｏｒｌｅｔｔｉ Ｅら，２０１４．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０，１２１１−１２２１）。したがって、ＨＦＤ−３２を与えられたマウスにおいてＮＡＳＨ段階での微小腫瘍を探した。腫瘍形成能に関連した組織切片の小結節は、明らかに見られる（図２０）。これらの小結節は、ＨＦＤ−３２を与えられ、ペプチドで処置されたマウスの肝切片中では認められず、レトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチドも腫瘍形成を防止することを示唆した。

ＤＥＮ−誘導性ＨＣＣにおいてＴｆ−Ｄ−ＬＰ４は脂肪肝およびＮＡＳＨ発症を予防する
ＤＥＮで誘導されたＨＣＣマウスモデルを生成し、上述のように腫瘍が肝臓内で見えるようになってから、ペプチドで処置した。ＤＥＮによって誘導されたＨＣＣからの肝臓のＨ＆Ｅ染色によって、脂肪肝を含む肝臓病変の腫瘍形成過程に沿って、膨化変性、炎症および線維化が発現されることが明確に示された（図２１Ａ、２１Ｂ）。マウスをレトロ−Ｔｆ−Ｄ−ＬＰ４ペプチド（１８ｍｇ／ｋｇ）で処置すると、そのような肝臓症状は観察されなかった（図２１Ａ、Ｂ）。これらの結果は、ペプチドがＨＣＣ成長ならびに肝臓関連の症状を予防することを示している。

特定の実施形態についての前述の説明は、本発明の全般的な性質を完全に明らかにしているため、現在の知識を適用することにより、当業者が過度の実験を行うことなく、および一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を種々の用途に合わせて容易に修正および／または適合させることができ、したがって、そのような適合および修正は開示された実施形態の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、包含されることが意図される。本明細書で使用される語法または用語は説明を目的とするものであり、限定のためではないことを理解すべきである。種々の開示した機能を実施するための手段、材料およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態を取ることができる。

Claims (50)

1. ＶＤＡＣ−１由来ペプチドの類似体を含む合成ペプチドであって、前記ＶＤＡＣ−１由来ペプチドが癌細胞内でアポトーシスを誘導することができ、かつ５〜２６の連続するアミノ酸からなり、前記類似体がレトロ修飾型であり、前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドに関して部分的または完全インベルソ修飾型である、合成ペプチド。
2. 前記ＶＤＡＣ−１由来ペプチドが配列番号１および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
3. 前記ＶＤＡＣ−１由来ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の合成ペプチド。
4. 前記ＶＤＡＣ−１由来ペプチドが配列番号１および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の合成ペプチド。
5. 前記ＶＤＡＣ−１由来ペプチドが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる、請求項に記載の合成ペプチド。
6. 前記類似体が配列番号２、配列番号３、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
7. 前記類似体が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の合成ペプチド。
8. 前記類似体が配列番号２および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の合成ペプチド。
9. 前記類似体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の合成ペプチド。
10. 前記類似体が完全インベルソ修飾型である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
11. 前記ペプチドが細胞認識部分および／または局在化部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
12. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドがすべてＬ−立体異性体ペプチドおよびすべてＤ−立体異性体ペプチドから選択される、請求項１１に記載の合成ペプチド。
13. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドがトランスフェリン受容体結合ドメイン（Ｔｆ）またはそのフラグメントを含む、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
14. 前記トランスフェリン受容体結合ドメインが配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の合成ペプチド。
15. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドがトランスフェリン受容体結合ドメイン（Ｔｆ）のレトロ類似体またはそのフラグメントを含む、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
16. 前記トランスフェリン受容体結合ドメイン（Ｔｆ）のレトロ類似体が配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸のすべてがＬ立体配置にある、請求項１５に記載の合成ペプチド。
17. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドが前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＮ末端またはＣ末端に直接結合している、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
18. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドが前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＮ末端またはＣ末端にリンカー配列を介して結合している、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
19. 前記ペプチドが、おのおの前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＣ末端またはＮ末端に独立して位置する配列番号１１に記載のアミノ酸配列および配列番号１２に記載のアミノ酸をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
20. 前記ペプチドが、おのおの前記ＶＤＡＣ１由来ペプチドの類似体のＣ末端またはＮ末端に独立して位置する配列番号１２に記載のアミノ酸配列および配列番号１３に記載のアミノ酸をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
21. 配列番号１１および配列番号１３のいずれか１つに記載のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項２０に記載の合成ペプチド。
22. 前記ペプチドが配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の合成ペプチド。
23. 前記ペプチドが配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる、請求項２２に記載の合成ペプチド。
24. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドがＡｎｔｐドメインまたはそのフラグメントを含む、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
25. 前記Ａｎｔｐドメインが配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の合成ペプチド。
26. 前記認識ペプチドおよび／または局在化ペプチドがＡｎｔｐドメインのレトロ類似体またはそのフラグメントを含む、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の合成ペプチド。
27. 前記Ａｎｔｐドメインのレトロ類似体が配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の合成ペプチド。
28. 前記ペプチドが配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の合成ペプチド。
29. 前記ペプチドが配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の合成ペプチド。
30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の合成ペプチドを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩または賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
31. 前記医薬組成物が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 前記医薬組成物が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
33. 前記合成ペプチドが配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 有害な細胞増殖を阻害する際に用いる、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
35. 異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連する疾患の処置で用いる、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
36. 前記疾患が癌性疾患である、請求項３５に記載の医薬組成物。
37. 前記癌性疾患が神経膠腫、肝癌、白血病、肺癌、前立腺癌、乳癌、膵癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
38. 前記神経膠腫が神経膠芽腫である、請求項３７に記載の医薬組成物。
39. 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状の予防および／または処置で用いる、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
40. 前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される、請求項３９に記載の医薬組成物。
41. 前記ＮＡＦＬＤに伴う症状が脂肪滴の蓄積、炎症、線維化、肝細胞の細胞死、およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
42. 有害な細胞増殖を阻害するための方法であって、それを必要とする対象に請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与すること、それによって有害な細胞増殖を阻害することを含む、方法。
43. 異常なアポトーシスおよび／または細胞過剰増殖に関連する疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与すること、それによって異常なアポトーシスおよび／または細胞の過剰増殖に関連する疾患を処置することを含む、方法。
44. 前記疾患が癌性疾患である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記過剰増殖する細胞が癌幹細胞である、請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記癌性疾患が神経膠腫、肝癌、白血病、肺癌、前立腺癌、乳癌、膵癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項４４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記神経膠腫が神経膠芽腫である、請求項４６に記載の方法。
48. 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＮＡＦＬＤに伴う症状を処置するおよび／または予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与すること、それによって非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはそれに伴う症状を処置するおよび／または予防することを含む、方法。
49. 前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪肝および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
50. 前記ＮＡＦＬＤに伴う症状が脂肪滴の蓄積、炎症、線維化、肝細胞の細胞死、およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項４９〜５０のいずれか１項に記載の方法。

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