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JP2018515518A - 核酸ワクチン接種によるｃａｒ操作ｔ細胞の効果の増強 - Google Patents

核酸ワクチン接種によるｃａｒ操作ｔ細胞の効果の増強 Download PDF

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Abstract

本発明は一般に、細胞表面上で抗原を発現する細胞を標的にすることによる疾患の処置を包含する。特に、本発明は、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞をin vivoで刺激、プライミング、及び/又は拡大するための方法であって、in vivoでT細胞を抗原又はそのバリアントと接触させる工程を含む方法に関する。一実施形態では、抗原又はそのバリアントは、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与することによって提供される。

Description

本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作されたT細胞の効果を増強するための方法及び手段に関する。
T細胞は、ヒト及び動物における細胞媒介免疫において中心的役割を果たす。特定抗原の認識及び結合は、T細胞の表面上で発現されるT細胞受容体(TCR)によって媒介される。T細胞のTCRは、主要組織適合複合体(MHC)分子に結合し、標的細胞の表面上に提示された免疫原性ペプチド(エピトープ)と相互作用することができる。TCRの特異的結合は、T細胞内部のシグナルカスケードを誘因し、増殖及び成熟エフェクターT細胞への分化をもたらす。
TCRのこの多様性は、TCRの異なる構造的領域をコードする遺伝子の異なる不連続セグメントの遺伝子再配列によって得られる。TCRは、1本のα鎖及び1本のβ鎖又は1本のγ鎖及び1本のδ鎖から構成される。TCR α/β鎖は、抗原認識に関与するN末端高度多型可変領域、及び不変定常領域から構成される。遺伝子レベルで、これらの鎖は、いくつかの領域、即ち可変(V)領域、多様性(D)領域(β及びδ鎖のみ)、接合(J)領域、及び定常(C)領域に分離される。ヒトβ鎖遺伝子は、60個超の可変(V)、2つの多様性(D)、10個超の接合(J)セグメント、及び2つの定常領域セグメント(C)を含有する。ヒトα鎖遺伝子は、50個超のVセグメント、及び60個超のJセグメントを含有するが、Dセグメントを含有せず、且つ1つのCセグメントを含有する。マウスβ鎖遺伝子は、30個超の可変(V)、2つの多様性(D)、10個超の接合(J)セグメント、及び2つの定常領域セグメント(C)を含有する。マウスα鎖遺伝子は、ほぼ100個のVセグメント、60個のJセグメントを含有し、Dセグメントを含有しないが、1つのCセグメントを含有する。T細胞の分化中に、特定のT細胞受容体遺伝子が、1個のV、1個のD(β及びδ鎖のみ)、1個のJ、及び1個のC領域遺伝子を再配列することによって創製される。TCRの多様性は、ランダムヌクレオチドが組換え部位で導入及び/又は欠失される不正確なV-(D)-J再配列によって更に増幅される。TCR遺伝子遺伝子座の再配列は、T細胞の成熟中にゲノム内で起こるので、各成熟T細胞は、1つの特定のα/β TCR又はγ/δ TCRのみを発現する。MHC及び抗原結合は、TCRの相補性決定領域1、2、及び3(CDR1、CDR2、CDR3)によって媒介される。抗原認識及び結合に最も重要であるβ鎖のCDR3は、再配列されたTCR β鎖遺伝子のV-D-J接合部によってコードされる。
TCRは、TCR α及びβ鎖のヘテロ二量体複合体、共受容体CD4又はCD8及びCD3シグナル伝達モジュールを含む複雑なシグナル伝達機構の一部である(図1)。CD3鎖は、活性化シグナルを細胞内部に伝えるが、TCR α/βヘテロ二量体は、単に抗原認識を担う。したがって、TCR α/β鎖の移入は、T細胞を目的の任意の抗原に向けてリダイレクトする機会を提供する。
養子細胞移入(ACT)ベース免疫療法は、低前駆体頻度から臨床的に妥当な細胞数にex vivoで拡大した後に、非免疫レシピエント又は自己宿主に移される以前に感作されたT細胞を用いた受動免疫の形態として広く定義することができる。ACT実験に使用されてきた細胞型は、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞(Mule, J.J.ら(1984) Science 225、1487〜1489;Rosenberg, S.A.ら(1985) N. Engl. J. Med. 313、1485〜1492)、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)(Rosenberg, S.A.ら(1994) J. Natl. Cancer Inst. 86、1159〜1166)、造血幹細胞移植(HSCT)後のドナーリンパ球、及び腫瘍特異的T細胞株又はクローン(Dudley, M.E.ら(2001) J. Immunother. 24、363〜373;Yee, C.ら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99、16168〜16173)である。養子T細胞移入は、CMV等のヒトウイルス感染症に対する治療活性を有することが示された。CMV感染及び内在性潜在ウイルスの再活性化は、健康な個体における免疫系によって制御されるが、これは、免疫力が低下した個体、例えば、移植レシピエント又はAIDS患者等においてかなりの罹患率及び死亡率をもたらす。Riddell及び共同研究者らは、HLAマッチCMV血清陽性移植ドナーに由来するCD8+ CMV特異的T細胞クローンの移入後の免疫が抑制された患者における養子T細胞療法によるウイルス免疫の再構成を実証した(Riddell, S.R.(1992) Science 257、238〜241)。代替手法として、ポリクローナルドナー由来CMV又はEBV特異的T細胞集団が移植片レシピエントに移され、移入T細胞の持続性が増大した(Rooney, C.M.ら(1998) Blood 92、1549〜1555;Peggs, K.S.ら(2003) Lancet 362、1375〜1377)。黒色腫の養子免疫療法について、Rosenberg及び共同研究者らは、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法及び高用量IL2と組み合わせて切除された腫瘍から単離したin vitroで拡大された自己腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の注入を利用するACT手法を確立した。最近公開された臨床試験では、転移性黒色腫に罹患している処置患者の約50%の客観的応答率がもたらされた(Dudley, M.E.ら(2005) J. Clin. Oncol. 23:2346〜2357)。
代替手法は、短時間ex vivo培養中に特異性が分かっている腫瘍反応性免疫受容体を発現するように再プログラムされた自己T細胞の養子移入、その後の患者への再注入である(Kershaw M.H.ら(2013) Nature Reviews Cancer 13(8):525〜41)。このストラテジーは、腫瘍反応性T細胞が患者内に存在しなくても、ACTを様々な一般的な悪性腫瘍に適用可能にする。T細胞の抗原特異性は完全に、TCR α及びβ鎖のヘテロ二量体複合体に基づくので、クローン化TCR遺伝子のT細胞内への移入は、T細胞を目的の任意の抗原に向けてリダイレクトする潜在性を提供する。したがって、TCR遺伝子療法は、処置選択肢として自己リンパ球を用いた抗原特異的免疫療法を開発するための魅力的なストラテジーを提供する。TCR遺伝子移入の主要な利点は、数日内での治療量の抗原特異的T細胞の創製、及び患者の内在性TCRレパートリー中に存在しない特異性を導入する可能性である。
いくつかのグループが、TCR遺伝子移入は、初代T細胞の抗原特異性をリダイレクトするための魅力的なストラテジーであることを実証した(Morgan, R.A.ら(2003) J. Immunol. 171、3287〜3295;Cooper, L.J.ら(2000) J. Virol. 74、8207〜8212;Fujio, K.ら(2000) J. Immunol. 165、528〜532;Kessels, H.W.ら(2001) Nat. Immunol. 2、957〜961;Dembic, Z.ら(1986) Nature 320、232〜238)。ヒトにおけるTCR遺伝子療法の実現可能性は、Rosenberg及び彼のグループによる悪性黒色腫を処置するための臨床トライアルにおいて最初に実証された。黒色腫/メラニン細胞抗原特異的TCRをレトロウイルスによって形質導入された自己リンパ球の養子移入は、処置された黒色腫患者の最大で30%においてがん退縮をもたらした(Morgan, R.A.ら(2006) Science 314、126〜129;Johnson, L.A.ら(2009) Blood 114、535〜546)。その間に、TCR遺伝子療法の臨床試験は、多くの異なる腫瘍抗原を標的にして黒色腫以外のがんにも拡張された(Park, T.S.ら、(2011) Trends Biotechnol. 29、550〜557)。
特異性が分かっている抗原標的受容体をT細胞内に挿入する遺伝子操作手法の使用は、ACTの潜在的能力を大いに拡張した。キメラ抗原受容体(CAR)は、細胞外抗原結合部分、最も一般には、モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片(scFvs)に融合された細胞内T細胞シグナル伝達ドメインから構成される1つのタイプの抗原標的受容体である。CARは、MHC媒介提示と無関係に細胞表面抗原を直接認識し、すべての患者における任意の所与の抗原に特異的な単一受容体構築物の使用を可能にする。最初のCARは、抗原認識ドメインをT細胞受容体(TCR)複合体のCD3ζ活性化鎖に融合させたものであった(図2)。後続のCAR反復は、CD28由来の細胞内ドメイン、又は様々なTNF受容体ファミリー分子、例えば、4-1BB(CD137)及びOX40(CD134)等を含めて、CD3ζと並行して二次共刺激シグナルを含んでいた。更に、第3世代の受容体は、CD3ζに加えて、最も一般にはCD28及び4-1BBからの2つの共刺激シグナルを含む。第2及び第3世代のCARは、一部の場合では、進行がんを有する患者における完全な緩解を含めて、抗腫瘍効力を劇的に改善した。
US2003/0118592 US2003/0133939 WO2013/143683
Mule, J.J.ら(1984) Science 225、1487〜1489 Rosenberg, S.A.ら(1985) N. Engl. J. Med. 313、1485〜1492 Rosenberg, S.A.ら(1994) J. Natl. Cancer Inst. 86、1159〜1166 Dudley, M.E.ら(2001) J. Immunother. 24、363〜373 Yee, C.ら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99、16168〜16173 Riddell, S.R.(1992) Science 257、238〜241 Rooney, C.M.ら(1998) Blood 92、1549〜1555 Peggs, K.S.ら(2003) Lancet 362、1375〜1377 Dudley, M.E.ら(2005) J. Clin. Oncol. 23:2346〜2357 Kershaw M.H.ら(2013) Nature Reviews Cancer 13(8):525〜41 Morgan, R.A.ら(2003) J. Immunol. 171、3287〜3295 Cooper, L.J.ら(2000) J. Virol. 74、8207〜8212 Fujio, K.ら(2000) J. Immunol. 165、528〜532 Kessels, H.W.ら(2001) Nat. Immunol. 2、957〜961 Dembic, Z.ら(1986) Nature 320、232〜238 Morgan, R.A.ら(2006) Science 314、126〜129 Johnson, L.A.ら(2009) Blood 114、535〜546 Park, T.S.ら、(2011) Trends Biotechnol. 29、550〜557 「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H.G.W. Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、(1995)Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989 Wardら、(1989) Nature、341: 544〜546 Birdら、(1988) Science、242: 423〜426 Hustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85: 5879〜5883 Kohler及びMilstein、Nature、256: 495 (1975) Spieker-Poletら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、92:9348 (1995) Rossiら、Am. J. Clin. Pathol.、124: 295 (2005) Berzofskyら「Antibody-Antigen Interactions」、Fundamental Immunology、Paul, W. E.編、Raven Press New York、N Y (1984) Kuby、Janis Immunology、W. H. Freeman and Company New York、N Y (1992) Scatchardら、Ann N.Y. Acad. ScL、51:660 (1949) Smith及びWaterman、1981、Ads App. Math.、2、482 Neddleman及びWunsch、1970、J. Mol. Biol.、48、443 Pearson及びLipman、1988、Proc. Natl Acad. Sci. USA、85、2444 「The T cell receptor facts book」、MP Lefranc、G Lefranc、2001 Casucci、M.ら(2011) 2:378〜382 Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y Kreiterら(2007)、Cancer Immunol. Immunother.、CII、56、1577〜87 Holtkamp, S.ら(2006)、Blood 108、4009〜4017 Rabinovich B.A.ら(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105、14342〜14346 Szymczak A.L.ら(2004) Nat. Biotechnol. 22、589〜594 Kofler D.M.ら、(2011) Molecular Therapy 19(4)、760〜767 Hombach A.ら、(2010) Gene Therapy 17、1206〜1213
移入T細胞の数は、治療応答と相関すると一般に考えられている。しかし、養子T細胞移入のために患者に投与することができる細胞の数は限られており、養子T細胞移入のための大量のT細胞の生成は、依然として課題のままである。細胞持続性の実質的な増大は、患者がTIL又は受容体操作されたT細胞の注入前にリンパ球枯渇前処置レジメンを受けた場合に実現され得る。しかし、大量の操作されたT細胞の空の宿主への移入は、標的抗原が関連した正常組織内で予想外に発現される場合に重度の有害事象のリスクも提起する。したがって、操作されたT細胞が安全であると証明された後に患者内で拡大され得る限られた量の操作されたT細胞を移入することが望ましいはずである。本発明者らは、CAR-T細胞刺激のための抗原をもたらすために核ワクチン接種、特にRNAワクチン接種を使用して養子移入CAR-T細胞を拡大することが可能であることを見出した。CAR-T細胞の養子移入の後、T細胞は、細胞表面上で抗原を発現する細胞、好ましくは抗原提示細胞に曝露することによって抗原特異的拡大に付される。したがって、少量のCAR操作T細胞のみを患者内に移入し、次いで抗原をもたらす核酸ワクチンを投与することによってin vivoでT細胞を拡大することが可能である。
本発明は一般に、細胞表面上で抗原を発現する疾患細胞、特に、細胞表面上で腫瘍抗原を発現するがん細胞等の細胞表面上で抗原を発現する細胞を標的にすることによる疾患の処置を包含する。方法は、その表面上で抗原を発現する細胞の選択的根絶を提供し、それによって抗原を発現しない正常細胞への有害作用を最小限にする。抗原に結合することによって細胞を標的にするキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞が投与される。更に、抗原又はそのバリアントをコードする核酸が投与される。核酸は、適切な標的細胞によって発現されて、T細胞刺激、プライミング、及び/又は拡大のための抗原をもたらす。患者内で刺激、プライミング、及び/又は拡大されたT細胞は、疾患細胞等の細胞表面上で抗原を発現する細胞を認識し、疾患細胞を根絶することができる。本手法は、受動及び能動免疫化を伴うとみなすことができる。CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞の投与を伴う処置は、受動免疫の一形態とみなすことができる。抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与し、それによって標的細胞集団又は組織に対してT細胞媒介免疫応答を刺激することを伴う処置は、能動免疫化の一形態とみなすことができる。
一態様では、本発明は、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞をin vivoで刺激、プライミング、及び/又は拡大するための方法であって、in vivoでT細胞を抗原又はそのバリアントと接触させる工程を含む方法に関する。一実施形態では、抗原又はそのバリアントは、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与することによってもたらされる。核酸は、適切な標的細胞によって発現されてT細胞刺激、プライミング、及び/又は拡大のための抗原又はそのバリアントをもたらす。
一態様では、本発明は、哺乳動物において抗原を発現する標的細胞集団又は標的組織に対する免疫応答を提供するための方法であって、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞を哺乳動物に投与する工程と、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与する工程とを含む方法に関する。
一実施形態では、免疫応答は、T細胞媒介免疫応答である。一実施形態では、免疫応答は、抗腫瘍免疫応答であり、標的細胞集団又は標的組織は、腫瘍細胞又は腫瘍組織である。
一態様では、本発明は、抗原の発現又は発現の上昇に関連した疾患、障害、又は状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞を哺乳動物に投与する工程と、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与する工程とを含む方法に関する。
一実施形態では、疾患、障害、又は状態は、がんである。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は、クローディン、例えば、クローディン6、クローディン18.2等、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、メソテリン、CEA、c-Met、PSMA、GD-2、及びNY-ESO-1からなる群から選択される。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は、病原体抗原である。病原体は、真菌、ウイルス、又は細菌性病原体であり得る。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、哺乳動物の細胞内で発現されて抗原又はそのバリアントをもたらす。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントの発現は、細胞表面におけるものである。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、哺乳動物の細胞内で一過性に発現される。したがって、一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、細胞のゲノム内に一体化されない。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、RNA、好ましくはin vitroで転写されたRNAである。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び/又は抗原若しくはそのバリアントをコードする核酸は、全身に投与される。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、膵臓内での抗原又はそのバリアントの発現が起こる。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞内での抗原又はそのバリアントの発現が起こる。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びB細胞からなる群から選択される。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、肺及び/又は肝臓内での抗原又はそのバリアントの発現は起こらず、又は本質的に起こらない。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、脾臓内での抗原又はそのバリアントの発現は、肺内での発現の量の少なくとも5倍である。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、哺乳動物の細胞内で発現されて、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞による結合のための抗原又はそのバリアントをもたらし、前記結合は、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大をもたらす。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、粒子中等の送達ビヒクル中に製剤化される。一実施形態では、送達ビヒクルは、少なくとも1種の脂質を含む。一実施形態では、少なくとも1種の脂質は、少なくとも1種のカチオン性脂質を含む。一実施形態では、脂質は、抗原又はそのバリアントをコードする核酸と複合体を形成し、且つ/又はそれを封入する。一実施形態では、脂質は、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を封入するベシクル中に含まれる。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、リポソーム中に製剤化される。
本発明のすべての態様の一実施形態では、本方法は、
哺乳動物から細胞の試料を得る工程であって、試料は、T細胞又はT細胞前駆体を含む、工程と
細胞にCARをコードする核酸をトランスフェクトして、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞をもたらす工程と
を更に含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞は、CARをコードする核酸を安定に又は一過性にトランスフェクトされる。したがって、CARをコードする核酸は、T細胞のゲノム内に一体化されるか、又は一体化されない。
本発明のすべての態様の一実施形態では、T細胞及び/又は細胞の試料は、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸が投与される哺乳動物由来である。本発明のすべての態様の一実施形態では、T細胞及び/又は細胞の試料は、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸が投与される哺乳動物と異なる哺乳動物由来である。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞は、内在性T細胞受容体及び/又は内在性HLAの発現について不活化されている。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びT細胞シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対するモノクローナル抗体のscFv配列を含む。
一態様では、本発明は、抗原を標的にしたCARをコードする核酸又は抗原を標的にしたCARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞、及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸を含むキットに関する。一実施形態では、キットは、本発明の方法のいずれかにおけるキットの使用のための指示書を更に含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、T細胞は、哺乳動物に対して自己、同種間、又は同系であり得る。T細胞は、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するようにin vitroで遺伝的に修飾され得る。
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は、がん細胞等の疾患細胞内で発現される。一実施形態では、抗原は、がん細胞等の疾患細胞の表面上で発現される。一実施形態では、CARは、抗原又はそのバリアントの細胞外ドメイン、又は細胞外ドメイン内のエピトープに結合する。一実施形態では、CARは、生細胞の表面上に存在する抗原又はそのバリアントの天然エピトープに結合する。一実施形態では、前記抗原は、クローディン、特に、クローディン6又はクローディン18.2であり、前記CARは、前記クローディンの第1の細胞外ループに結合する。一実施形態では、T細胞によって発現され且つ/又はT細胞上に存在する場合の前記CARが抗原提示細胞等の細胞上に存在する抗原又はそのバリアントに結合すると、前記T細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大がもたらされる。一実施形態では、T細胞によって発現され且つ/又はT細胞上に存在する場合の前記CARががん細胞等の疾患細胞上に存在する抗原に結合すると、疾患細胞の細胞溶解及び/又はアポトーシスがもたらされ、前記T細胞は、好ましくは細胞傷害性因子、例えば、パーフォリン及びグランザイムを放出する。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、CARのエキソドメインによって構成される。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対する抗体の単鎖可変断片(scFv)を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原(VH(抗原))に対する特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域(VH)及び抗原(VL(抗原))に対する特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域(VL)を含む。一実施形態では、前記重鎖可変領域(VH)及び対応する軽鎖可変領域(VL)は、ペプチドリンカー、好ましくはアミノ酸配列(GGGGS)3を含むペプチドリンカーによって接続される。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性アルファヘリックスである。一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメイン又はその断片を含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、T細胞シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、T細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内に位置している。一実施形態では、T細胞シグナル伝達ドメインは、CD28と任意選択で組み合わせてCD3-ゼータ、好ましくはCD3-ゼータのエンドドメインを含む。一実施形態では、T細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号8による配列若しくはその断片、又は前記配列若しくは断片のバリアントを含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、新生タンパク質を小胞体内に向けるシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、抗原結合ドメインに先行する。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号5による配列若しくはその断片、又は前記配列若しくは断片のバリアントを含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域を含む。一実施形態では、スペーサー領域は、抗原結合ドメインが異なる方向に向いて抗原認識を促進するのを可能にする。一実施形態では、スペーサー領域は、IgG1由来のヒンジ領域を含む。一実施形態では、スペーサー領域は、配列番号6による配列若しくはその断片、又は前記配列若しくは断片のバリアントを含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、構造:
NH2-シグナルペプチド-抗原結合ドメイン-スペーサー領域-膜貫通ドメイン-T細胞シグナル伝達ドメイン-COOH
を含む。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、好ましくは、特に、疾患細胞又は抗原提示細胞等の細胞の表面上に存在する場合、それが標的にされる抗原に対して特異的である。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARは、T細胞、好ましくは細胞傷害性T細胞によって発現され得、且つ/又はその表面上に存在し得る。一実施形態では、T細胞は、CARが標的にされる抗原と反応性である。
本発明のすべての態様の一実施形態では、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び/又は抗原若しくはそのバリアントをコードする核酸は、一緒に又は互いに別個に、薬学的に許容される担体を含み得、1種又は複数のアジュバント、安定剤等を任意選択で含み得る医薬組成物で投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のもの等のがん疾患等の抗原を伴う疾患の処置又は予防において使用するためである。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法において使用するための本明細書に記載の作用物質及び組成物を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の方法において使用するための抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞に関する。
一態様では、本発明は、本発明の方法において使用するための抗原又はそのバリアントをコードする核酸に関する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明を以下で詳細に記載するが、本発明は、本発明に記載の特定の方法論、プロトコール、及び試薬が多様であり得るので、これらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定するように意図されていないことも理解されるべきである。別段に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
以下において、本発明の要素を記載する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、これらは、追加の実施形態を作るために任意の様式で、且つ任意の数で組み合わせることができることが理解されるべきである。様々に記載される実施例及び好適な実施形態は、明示的に記載される実施形態のみに本発明を限定するように解釈されるべきでない。本記載は、明示的に記載される実施形態を、開示され、且つ/又は好適な要素の任意の数と組み合わせる実施形態を支持及び包含することが理解されるべきである。更に、本願におけるすべての記載される要素の任意の並び換え及び組合せは、脈絡により別段に示されていない限り、本願の記載によって開示されているとみなされるべきである。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H.G.W. Leuenberger、B. Nagel、及びH. Kolbl編、(1995)Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerlandに記載されているように定義される。
本発明の実行には、別段に示されてない限り、本分野の文献(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版、J. Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989を参照)に説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えDNA技法の従来法を使用する。
本明細書、及び以下に続く特許請求の範囲全体にわたって、脈絡により別段に要求されない限り、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」等の変形は、述べたメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群を含めることを暗示するが、任意の他のメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群を除外せず、とはいえ、いくつかの実施形態では、このような他のメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群が除外される場合があり、即ち、主題は、述べたメンバー、整数、若しくは工程、又はメンバー、整数、若しくは工程の群を含めることにあることが理解される。本発明を記載することとの関連で(特に、特許請求の範囲との関連で)使用される用語「a」及び「an」及び「the」、並びに同様の言及は、本明細書で別段に示されていない限り、又は脈絡によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方に及ぶと解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の記述は、その範囲内に入る各別個の値を個々に指す簡便な方法として機能を果たすように単に意図されている。本明細書で別段に示されていない限り、各個々の値は、それが本明細書で個々に列挙されているように明細書に組み込まれている。
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別段に示されていない限り、又は脈絡により別段に明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意且つすべての例、又は例示的な言い回し(例えば、「等」)の使用は、本発明をより良好に例示するように単に意図されており、別段に主張される本発明の範囲を限定しない。本明細書中の言い回しは、本発明の実行に本質的な任意の主張されていない要素を示すものとして解釈されるべきでない。
いくつかの文献が、本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書で引用される文献(すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書等を含む)のそれぞれは、上記のものであれ、以下のものであれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中のいずれも、先行発明によって本発明がそのような開示に先行する権利がないことを承認するものとして解釈されるべきでない。
用語「免疫応答」は、抗原に対する一体化された身体的応答を指し、好ましくは細胞性免疫応答又は細胞性及び体液性免疫応答を指す。免疫応答は、保護的/予防的(preventive)/予防的(prophylactic)及び/又は治療的であり得る。
「免疫応答を提供すること」は、免疫応答を提供する前に特定の標的抗原、標的細胞、及び/又は標的組織に対する免疫応答がなかったことを意味し得るが、これは、免疫応答を提供する前に特定の標的抗原、標的細胞、及び/又は標的組織に対するある特定のレベルの免疫応答があり、免疫応答を提供した後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、「免疫応答を提供すること」は、「免疫応答を誘導すること」及び「免疫応答を増強すること」を含む。好ましくは、対象において免疫応答を提供した後、前記対象は、がん疾患等の疾患を発生させることから保護され、又は病状が、免疫応答を提供することによって寛解する。例えば、腫瘍抗原に対する免疫応答を、がん疾患を有する患者又はがん疾患を発生させるリスクにある対象において提供することができる。この場合における免疫応答を提供することは、対象の病状が寛解する、対象が転移を発生させない、又はがん疾患を発生させるリスクにある対象ががん疾患を発生させないことを意味し得る。
「細胞媒介免疫」若しくは「細胞性免疫」、又は同様の用語は、抗原の発現によって特徴付けられる、特に、クラスI又はクラスII MHCでの抗原の提示によって特徴付けられる細胞に向けられた細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルバー」又は「キラー」として作用するT細胞又はTリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーT細胞(CD4+ T細胞とも呼ばれる)は、免疫応答を調節することによって中心的役割を果たし、キラー細胞(細胞傷害性T細胞、細胞溶解性T細胞、CD8+ T細胞、又はCTLとも呼ばれる)は、がん細胞等の疾患細胞を殺傷し、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
用語「抗原」は、免疫応答が生じることになり、且つ/又は向けられるエピトープを含む作用物質に関する。好ましくは、本発明との関連における抗原は、任意選択でプロセシング後に、免疫反応を誘導する分子であり、免疫反応は、好ましくは、抗原又は好ましくは細胞表面上で抗原を発現する細胞に特異的である。用語「抗原」は、特にタンパク質及びペプチドを含む。抗原は、天然に存在する抗原に対応する、又はそれに由来する生成物である。このような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、並びに他の感染エージェント及び病原体を含み得、若しくはこれらに由来し得、又は抗原は、腫瘍抗原でもあり得る。本発明によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えば、ウイルスタンパク質又はその一部に対応し得る。
用語「病原体」は、病原性微生物に関し、ウイルス、細菌、真菌、単細胞生物、及び寄生虫を含む。病原性ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス(HSV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、HBV、HCV、パピローマウイルス、及びヒトTリンパ向性ウイルス(HTLV)である。単細胞生物は、マラリア原虫、トリパノソーマ、アメーバ等を含む。
好適な実施形態では、抗原は、疾患関連抗原である。用語「疾患関連抗原」は、病理学的に意義のあるすべての抗原を指す。特に好適な一実施形態では、疾患関連抗原は、疾患細胞、組織、及び/又は臓器内に存在するが、これは、健康な細胞、組織、及び/又は臓器内に存在せず、又は低減された量で存在し、したがって、例えば、抗原を標的にしたCARを担持するT細胞によって疾患細胞、組織、及び/又は臓器を標的にするのに使用することができる。一実施形態では、疾患関連抗原は、疾患細胞の表面上に存在する。
好適な実施形態では、抗原は、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原、即ち、細胞質、細胞表面、及び細胞核に由来し得るがん細胞の構成要素、特に、がん細胞上の表面抗原として好ましくは大量に産生される抗原である。
本発明との関連で、用語「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」は、通常の条件下で、限られた数の組織及び/又は臓器内で、又は特定の発達段階において特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば、腫瘍抗原は、通常の条件下で、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器、例えば、精巣、栄養膜組織、例えば、胎盤、又は生殖系列細胞内で特異的に発現され得、1つ又は複数の腫瘍又はがん組織内で発現され、又は異常に発現される。この脈絡において、「限られた数」は、好ましくは、3以下、より好ましくは2以下を意味する。本発明との関連における腫瘍抗原としては、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、即ち、通常の条件下で、ある特定の分化段階である特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、がん/精巣抗原、即ち、通常の条件下で、精巣及び時に胎盤内で特異的に発現されるタンパク質、並びに生殖系列特異的抗原がある。本発明との関連で、腫瘍抗原は、好ましくは、がん細胞の細胞表面と会合し、好ましくは正常組織内で発現されず、又は稀にしか発現されない。好ましくは腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異所性発現は、がん細胞を同定する。本発明との関連で、対象、例えば、がん疾患に罹患している患者においてがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは、前記対象における自己タンパク質である。好適な態様では、本発明との関連における腫瘍抗原は、通常の条件下で、本質的でない組織若しくは臓器、即ち、免疫系によって損傷された場合に対象の死に至らない組織若しくは臓器、又は免疫系によってアクセス可能でない、若しくはほんのわずかにしかアクセス可能でない臓器若しくは体の構造内で特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織内で発現される腫瘍抗原とがん組織内で発現される腫瘍抗原との間で同一である。
本発明において有用であり得る腫瘍抗原の例は、p53、ART-4、BAGE、ベータカテニン/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えば、CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2、及びCLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(又はhTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A、好ましくはMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、又はMAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/メラン-A、MC1R、ミオシン/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190マイナーBCR-abl、Pm1/RARa、PRAME、プロテイナーゼ3、PSA、PSM、RAGE、RU1又はRU2、SAGE、SART-1又はSART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、並びにWTである。特に好適な腫瘍抗原としては、CLAUDIN-18.2(CLDN18.2)及びCLAUDIN-6(CLDN6)がある。
用語「CLDN」は、本明細書において使用する場合、クローディンを意味し、CLDN6及びCLDN18.2を含む。好ましくは、クローディンは、ヒトクローディンである。クローディンは、タイトジャンクションの最も重要な成分であるタンパク質のファミリーであり、タイトジャンクションでは、これらは、上皮の細胞同士間の細胞間隙内で分子の流れを制御する傍細胞障壁を確立する。クローディンは、膜の内外に4回またがる膜貫通タンパク質であり、N末端及びC末端はともに細胞質内に位置する。第1の細胞外ループは、EC1又はECL1と呼ばれ、平均で53アミノ酸からなり、第2の細胞外ループは、EC2又はECL2と呼ばれ、約24アミノ酸からなる。クローディンファミリーの細胞表面タンパク質は、様々な起源の腫瘍内で発現され、これらの選択的発現(毒性関連正常組織内で発現無し)及び形質膜への局在化に起因して、抗体媒介がん免疫療法に関連した標的構造として特に適している。
CLDN6及びCLDN18.2は、腫瘍組織内で差次的に発現されると同定されており、CLDN18.2を発現する唯一の正常組織は、胃であり、CLDN6を発現する唯一の正常組織は、胎盤である。
CLDN18.2は、胃粘膜の分化上皮細胞内の正常組織中で選択的に発現される。CLDN18.2は、様々な起源のがん、例えば、膵癌、食道癌、胃癌、気管支癌、乳癌、及びENT腫瘍等において発現される。CLDN18.2は、原発性腫瘍、例えば、胃がん、食道がん、膵がん、非小細胞肺がん(NSCLC)等の肺がん、卵巣がん、大腸がん、肝がん、頭頸部がん、及び胆嚢のがん、並びにこれらの転移、特にクルーケンベルク腫瘍等の胃がん転移、腹膜転移、及びリンパ節転移の予防及び/又は処置のための貴重な標的である。
CLDN6は、例えば、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、腎細胞がん、及び膀胱がんにおいて発現されることが判明した。CLDN6は、卵巣がん、特に、卵巣腺癌及び卵巣奇形癌、小細胞肺がん(SCLC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)を含む肺がん、特に、扁平細胞肺癌及び腺癌、胃がん、乳がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、特に、基底細胞癌及び扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、頭頸部がん、特に、悪性多形性腺腫、肉腫、特に、滑膜肉腫及び癌肉腫、胆管がん、膀胱のがん、特に、移行上皮癌及び乳頭状癌、腎がん、特に、明細胞腎細胞癌及び乳頭腎細胞癌を含む腎細胞癌、大腸がん、回腸のがんを含む小腸がん、特に、小腸腺癌及び回腸の腺癌、精巣胎児性癌、胎盤絨毛癌、子宮頸がん、精巣がん、特に、精巣精上皮腫、精巣奇形腫及び胎児性精巣がん、子宮がん、胚細胞腫瘍、例えば、奇形癌又は胎児性癌、特に、精巣の胚細胞腫瘍、並びにこれらの転移形態を予防/又は処置するための特に好適な標的である。
用語「CLDN18.2」は、好ましくは、ヒトCLDN18.2、特に、配列表の配列番号1によるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列のバリアントを含み、好ましくはそれからなるタンパク質を指す。CLDN18.2の第1の細胞外ループは、好ましくは、配列番号1に示したアミノ酸配列のアミノ酸27〜81、より好ましくはアミノ酸29〜78を含む。CLDN18.2の第2の細胞外ループは、好ましくは、配列番号1に示したアミノ酸配列のアミノ酸140〜180を含む。前記第1及び第2の細胞外ループは、好ましくは、CLDN18.2の細胞外部分を形成する。
用語「CLDN6」は、好ましくは、ヒトCLDN6、特に、配列表の配列番号2又は配列番号3のアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列のバリアントを含み、好ましくはそれからなるタンパク質を指す。CLDN6の第1の細胞外ループは、好ましくは、配列番号2に示したアミノ酸配列又は配列番号3に示したアミノ酸配列のアミノ酸28〜80、より好ましくはアミノ酸28〜76を含む。CLDN6の第2の細胞外ループは、好ましくは、配列番号2に示したアミノ酸配列又は配列番号3に示したアミノ酸配列のアミノ酸138〜160、好ましくはアミノ酸141〜159、より好ましくはアミノ酸145〜157を含む。前記第1及び第2の細胞外ループは、好ましくは、CLDN6の細胞外部分を形成する。
本発明による用語「バリアント」は、特に、突然変異体、スプライスバリアント、コンホメーション、アイソフォーム、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び種同族体、特に、天然に存在するものを指す。対立遺伝子バリアントは、遺伝子の正常な配列の変化に関し、その重要性は、不明確であることが多い。完全な遺伝子配列決定は、多くの場合、所与の遺伝子に対して多数の対立遺伝子バリアントを同定する。種同族体は、所与の核酸又はアミノ酸配列のものと異なる起源の種に対する核酸又はアミノ酸配列である。用語「バリアント」は、任意の翻訳後修飾されたバリアント及びコンホメーションバリアントを包含するものとする。
本発明によって投与される核酸によってコードされる抗原又はそのバリアント、即ち、ワクチン抗原は、CAR操作T細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大をもたらすはずである。前記刺激、プライミング、及び/又は拡大されたT細胞は、標的抗原、特に、疾患細胞、組織、及び/又は臓器上で発現される標的抗原、即ち、疾患関連抗原に向けられるはずである。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応する場合があり、又はこれは、そのバリアントであり得る。一実施形態では、このようなバリアントは、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本発明との関連で、用語「抗原のバリアント」は、CAR操作T細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大をもたらす作用物質を意味し、この刺激、プライミング、及び/又は拡大されたT細胞は、特に、疾患細胞、組織、及び/又は臓器上で発現される場合に、抗原、即ち、疾患関連抗原を標的にする。したがって、本発明によって投与される核酸によってコードされるワクチン抗原は、疾患関連抗原と同一であり得、疾患関連抗原若しくはその部分を含み得、又は疾患関連抗原若しくはその部分と相同である抗原を含み得る。本発明によって投与される核酸によってコードされるワクチン抗原が、疾患関連抗原の部分又は疾患関連抗原と相同である抗原の部分を含む場合、前記部分は、CAR操作T細胞のCARが標的にされる疾患関連抗原のエピトープを含み得る。したがって、本発明によれば、投与される核酸によってコードされる抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片、例えば、疾患関連抗原のペプチド断片等を含み得る。本発明による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、抗原に結合するCARを担持するT細胞又は抗原を発現する細胞を刺激、プライミング、及び/又は拡大することができる抗原の部分又は断片に関する。ワクチン抗原(疾患関連抗原と同様の)は、T細胞上のCARが結合するための関連したエピトープを提供するように、抗原提示細胞等の細胞の表面上で発現され得ることが好適である。本発明によって投与される核酸によってコードされるワクチン抗原は、組換え抗原であり得る。
用語「免疫学的に等価な」は、免疫学的に等価なアミノ酸配列等の免疫学的に等価な分子は、同じ若しくは本質的に同じ免疫学的性質を呈し、且つ/又は例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じ若しくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明との関連で、用語「免疫学的に等価な」は、好ましくは、免疫化に使用される抗原又は抗原バリアントの免疫学的効果又は性質に関して使用される。例えば、アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列が、対象の免疫系、例えば、参照アミノ酸配列に結合するCARを担持するT細胞又は参照アミノ酸配列を発現する細胞に曝露される場合に、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、CAR操作T細胞が標的にされる抗原と、CAR操作T細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大に関して同じ若しくは本質的に同じ性質を呈し、且つ/又は同じ若しくは本質的に同じ効果を発揮する。
本発明によれば、抗原又はそのバリアントは、CARによって認識できるはずである。好ましくは、抗原又はそのバリアントは、CARによって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、抗原又はそのバリアントを認識するCARを担持するT細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大を誘導することができる。本発明の実施形態との関連で、抗原又はそのバリアントは、好ましくは、細胞、好ましくは抗原提示細胞の表面上に存在する。疾患細胞の表面上の抗原が認識されると、抗原(又は抗原を発現する細胞)に対する免疫反応がもたらされ得る。
本発明の様々な態様によれば、目的は、好ましくは、腫瘍抗原を発現するがん細胞、例えば、CLDN6又はCLDN18.26に対する免疫応答を提供すること、及び腫瘍抗原を発現する細胞、例えば、CLDN6又はCLDN18.2を伴うがん疾患を処置することである。好ましくは、本発明は、腫瘍抗原を発現するがん細胞、例えば、CLDN6又はCLDN18.2を標的にしたCAR操作T細胞の投与を伴う。
本発明によれば、用語「腫瘍抗原陽性がん」又は同様の用語は、好ましくは前記がん細胞の表面上で腫瘍抗原を発現する、がん細胞を伴うがんを意味する。表面上の腫瘍抗原を発現するがん細胞は、腫瘍抗原を標的にしたCARを担持する免疫反応細胞によって標的にされ得る。
「細胞表面」は、当技術分野でその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質及び他の分子による結合にアクセス可能である細胞の外側を含む。抗原は、それが前記細胞の表面に位置しており、例えば、添加される腫瘍抗原特異的抗体による細胞への結合にアクセス可能である場合、細胞の表面上で発現される。一実施形態では、細胞の表面上で発現される抗原は、CARによって認識される細胞外部分を有する膜内在性タンパク質である。
用語「細胞外部分」又は「エキソドメイン」は、本発明との関連で、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば、細胞の外側に位置した抗体等の結合分子によって前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質等の分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、1つ又は複数の細胞外ループ若しくはドメイン又はこれらの断片を指す。
用語「部分」又は「一部」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸配列等の構造の連続的又は不連続的エレメントを指す。用語「断片」は、アミノ酸配列等の構造の連続的エレメントを指す。構造の部分、一部、又は断片は、好ましくは、1つ又は複数の機能的性質、例えば、前記構造の抗原性、免疫性、及び/又は結合性質を含む。タンパク質配列の部分又は一部は、好ましくは、少なくとも6、特に、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、又は少なくとも100のタンパク質配列の連続した及び/又は連続しないアミノ酸を含む。タンパク質配列の断片は、好ましくは、少なくとも6、特に、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、又は少なくとも100のタンパク質配列の連続したアミノ酸を含む。
本発明によれば、抗原は、発現のレベルが検出限界未満である場合、且つ/又は発現のレベルが低すぎて細胞に添加される抗原特異的抗体による結合を可能にすることができない場合、細胞内で(実質的に)発現されない。本発明によれば、抗原は、発現のレベルが検出限界より上である場合、且つ/又は発現のレベルが、細胞に添加される抗原特異的抗体による結合を可能にするのに十分高い場合、細胞内で発現される。好ましくは、細胞内で発現される抗原は、前記細胞の表面上で発現又は曝露され、即ち存在し、したがって、細胞に添加される抗体等の抗原特異的分子又はCAR分子による結合に利用可能である。
「標的細胞」は、細胞性免疫応答等の免疫応答の標的である細胞を意味するものとする。標的細胞としては、がん細胞等の任意の望ましくない細胞がある。好適な実施形態では、標的細胞は、好ましくは細胞表面上に存在する標的抗原を発現する細胞である。
用語「エピトープ」は、抗原等の分子内の抗原決定基、即ち、免疫系によって認識される、即ち結合を受ける、例えば、抗体又はCARによって認識される分子の一部又は断片を指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別個の3次元の部位である。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の3次元の構造的特徴、及び特定の帯電特性を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、後者へではなく前者への結合が、変性溶媒の存在下で失われる点で区別される。好ましくは、エピトープは、抗原又は抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することができる。好ましくは、この用語は、抗原の免疫原性部分に関する。腫瘍抗原等のタンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続部分又は不連続部分を含み、好ましくは5から100の間、好ましくは5から50の間、より好ましくは8から30の間、最も好ましくは、10から25の間のアミノ酸長であり、例えば、エピトープは、好ましくは、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25アミノ酸長であり得る。
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセッション産物(procession product)への分解(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)、及び細胞、好ましくは抗原提示細胞による特異的T細胞への提示のためのこれらの断片の1つ又は複数のMHC分子との会合(例えば、結合を介した)を指す。
抗原提示細胞(APC)は、その表面上で主要組織適合複合体(MHC)との関連における抗原を表示する細胞である。T細胞は、これらのT細胞受容体(TCR)を使用してこの複合体を認識することができる。抗原提示細胞は、抗原をプロセシングし、これらをT細胞に提示する。本発明によれば、用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナル抗原提示細胞及びノンプロフェッショナル抗原提示細胞を含む。
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用又は受容体媒介エンドサイトーシスによって抗原を内部移行し、次いでその膜上でクラスII MHC分子に結合した抗原の断片を表示することにおいて非常に効率的である。T細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原-クラスII MHC分子複合体を認識し、それと相互作用する。次いで追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって産生され、T細胞を活性化する。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。
プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、樹状細胞であり、これらは、抗原提示の最も広い範囲を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞、マクロファージ、B細胞、及びある特定の活性化上皮細胞である。
ノンプロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブT細胞との相互作用に要求されるMHCクラスIIタンパク質を構成的に発現せず、これらは、IFNγ等のある特定のサイトカインによってノンプロフェッショナル抗原提示細胞が刺激された際にのみ発現される。
樹状細胞(DC)は、MHCクラスII及びI抗原提示経路の両方を介して周辺組織内で捕捉された抗原をT細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞は、免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化は、抗腫瘍免疫の誘導に極めて重要な工程であることが周知である。
樹状細胞及び前駆体は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、又は任意の他の適当な組織若しくは流体から得ることができる。例えば、樹状細胞を、サイトカイン、例えば、GM-CSF、IL-4、IL-13、及び/又はTNFa等の組合せを末梢血から回収した単球の培養物に添加することによってex vivoで分化させることができる。代わりに、末梢血、臍帯血、又は骨髄から回収したCD34陽性細胞を、培養基に樹状細胞の分化、成熟、及び増殖を誘導するGM-CSF、IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンド、及び/又は他の化合物の組合せを添加することによって分化させて樹状細胞にすることができる。
樹状細胞は、好都合なことには、「未成熟」及び「成熟」細胞として分類され、これらは、2つのよく特徴付けられた表現型を区別する単純なやり方として使用することができる。しかし、この命名法は、分化のすべての可能な中間段階を除外するように解釈されるべきでない。
未成熟樹状細胞は、抗原取込み及びプロセシングの高い能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられ、この能力は、Fcγ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーのより低い発現、しかし、T細胞活性化を担う細胞表面分子、例えば、クラスI及びクラスII MHC、接着分子(例えば、CD54及びCD11)、並びに共刺激分子(例えば、CD40、CD80、CD86、及び4-1 BB)等の高発現によって特徴付けられる。
樹状細胞成熟は、このような抗原提示樹状細胞がT細胞プライミングをもたらす樹状細胞活性化の状態といわれる一方、未成熟樹状細胞による提示は、寛容性をもたらす。樹状細胞成熟は、内生受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子(細菌DNA、ウイルスRNA、エンドトキシン等)、炎症促進性サイトカイン(TNF、IL-1、IFN)、CD40Lによる樹状細胞表面上のCD40によるライゲーション、及びストレスの多い細胞死を起こしている細胞から放出される物質によって主に引き起こされる。樹状細胞は、サイトカイン、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)及び腫瘍壊死因子アルファとともにin vitroで骨髄細胞を培養することによって得ることができる。
用語「免疫原性」は、免疫反応を誘導するための抗原の相対的な効率に関する。
本発明との関連における用語「免疫エフェクター機能」は、例えば、腫瘍細胞等の疾患細胞の殺傷、又は腫瘍蔓延及び転移の阻害を含めた腫瘍増殖の阻害及び/若しくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明との関連における免疫エフェクター機能は、T細胞媒介性エフェクター機能である。このような機能は、ヘルパーT細胞(CD4+ T細胞)の場合において、サイトカインの放出並びに/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化、並びにCTLの場合において、例えば、アポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解を介した細胞、即ち、抗原の発現によって特徴付けられる細胞の排除、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解殺傷を含む。
本発明との関連における用語「免疫反応細胞」又は「免疫エフェクター細胞」は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応細胞」は、好ましくは、細胞の表面上で発現される抗原等の抗原を結合させ、免疫応答を媒介することができる。例えば、このような細胞は、サイトカイン及び/又はケモカインを分泌し、微生物を殺傷し、抗体を分泌し、感染又はがん性細胞を認識し、任意選択でこのような細胞を排除する。例えば、免疫反応細胞は、T細胞(細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤性T細胞)、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。好ましくは、本発明との関連で、「免疫反応細胞」は、T細胞、好ましくはCD4+及び/又はCD8+ T細胞である。本発明によれば、用語「免疫反応細胞」は、適当な刺激で成熟して免疫細胞(T細胞、特に、ヘルパーT細胞又は細胞溶解性T細胞等)になることができる細胞も含む。免疫反応細胞は、CD34+造血幹細胞、未成熟及び成熟T細胞、並びに未成熟及び成熟B細胞を含む。T細胞前駆体の細胞溶解性T細胞への分化は、抗原に曝露される場合、免疫系のクローン選択と同様である。
好ましくは、「免疫反応細胞」は、特に、抗原提示細胞、又はがん細胞等の疾患細胞の表面上に存在する場合、ある程度の特異性を伴って抗原を認識する。好ましくは、前記認識は、抗原を認識する細胞を応答性又は反応性であるようにする。細胞がヘルパーT細胞(CD4+ T細胞)である場合、このような応答性又は反応性により、サイトカインの放出、且つ/又はCD8+リンパ球(CTL)及び/若しくはB細胞の活性化を伴い得る。細胞がCTLである場合、このような応答性又は反応性により、例えば、アポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞溶解を介して、細胞、即ち、抗原の発現によって特徴付けられる細胞の排除を伴い得る。本発明によれば、CTL応答性として、持続的カルシウム流出、細胞分裂、IFN-γ及びTNF-α等のサイトカインの産生、CD44及びCD69等の活性化マーカーの上方調節、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解殺傷を挙げることができる。CTL応答性は、CTL応答性を正確に示す人工レポーターを使用して判定することもできる。抗原を認識し、応答性又は反応性であるこのようなCTLは、本明細書で「抗原応答性CTL」とも呼ばれる。
「リンパ系細胞」は、任意選択で適当な修飾後に、例えば、T細胞受容体又はCARの移入後に、細胞性免疫応答等の免疫応答を生じさせることができる細胞、又はこのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはTリンパ球、リンパ芽球、及び血漿細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載の免疫反応細胞であり得る。好適なリンパ系細胞は、細胞表面上でT細胞受容体又はCARを発現するように修飾することができるT細胞である。一実施形態では、リンパ系細胞は、T細胞受容体の内在性発現を欠く。
用語「T細胞」及び「Tリンパ球」は、本明細書で互換的に使用され、ヘルパーT細胞(CD4+ T細胞)、及び細胞溶解性T細胞を含む細胞傷害性T細胞(CTL、CD8+ T細胞)を含む。
T細胞は、リンパ球として公知の白血球のグループに属し、細胞媒介免疫において中心的役割を果たす。これらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によってB細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球タイプと区別することができる。胸腺は、T細胞の成熟を担う主要臓器である。それぞれ別個の機能を有するT細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
ヘルパーT細胞は、他の機能の中でも血漿細胞へのB細胞の成熟、並びに細胞傷害性T細胞及びマクロファージの活性化を含めた免疫学的過程において他の白血球を補助する。これらの細胞は、CD4+ T細胞としても公知であり、その理由は、これらは、これらの表面上でCD4タンパク質を発現するためである。ヘルパーT細胞は、これらが抗原提示細胞(APC)の表面上で発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原で提示される場合、活性化された状態になる。活性化されると、これらは、急速に分裂し、能動免疫応答を調節又は補助するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。
細胞傷害性T細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも結びつけられる。これらの細胞は、CD8+ T細胞としても公知であり、その理由は、これらは、これらの表面上でCD8糖タンパク質を発現するためである。これらの細胞は、体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在するMHCクラスIと関連した抗原に結合することによってこれらの標的を認識する。
T細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するT細胞受容体(TCR)を有する。実際のT細胞受容体は、2本の別個のペプチド鎖から構成されており、これらは、非依存性のT細胞受容体アルファ及びベータ(TCRα及びTCRβ)遺伝子から産生され、α-及びβ-TCR鎖と呼ばれる。γδ T細胞(ガンマデルタT細胞)は、これらの表面上で別個のT細胞受容体(TCR)有するT細胞の小サブセットを代表する。しかし、γδ T細胞では、TCRは、1本のγ-鎖及び1本のδ-鎖で構成されている。T細胞のこのグループは、αβ T細胞よりずっと少ない(全T細胞の2%)。
すべてのT細胞は、骨髄中の造血幹細胞に起源を有する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は、胸腺に存在し、細胞分裂によって拡大して未成熟胸腺細胞の大集団を生じる。最も初期の胸腺細胞は、CD4もCD8も発現せず、したがって二重陰性(CD4-CD8-)細胞と分類される。これらがその発達を通じて進行するにつれて、これらは、二重陽性胸腺細胞(CD4+CD8+)となり、最終的に成熟して単一陽性(CD4+CD8-又はCD4-CD8+)胸腺細胞となり、次いでこれらは、胸腺から周辺組織に放出される。
T細胞は一般に、標準手順を使用してin vitro又はex vivoで調製することができる。例えば、T細胞は、市販の細胞分離システムを使用して、患者等の哺乳動物の骨髄、末梢血、又は骨髄若しくは末梢血の画分から単離することができる。代わりに、T細胞は、関係した、又は関連しないヒト、非ヒト動物、細胞株、又は培養物に由来し得る。T細胞を含む試料は、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)であり得る。
本発明によって使用されるT細胞は、内在性T細胞受容体を発現することができ、又は内在性T細胞受容体の発現を欠く場合がある。
CARをコードするRNA等の核酸を、T細胞又は溶解能を有する他の細胞、特に、リンパ系細胞内に導入することができる。
用語「抗原を標的にするCAR」は、T細胞等の免疫反応細胞上に存在する場合、抗原提示細胞又はがん細胞等の疾患細胞の表面上等の抗原を認識し、その結果、免疫反応細胞が刺激、プライミング、及び/若しくは拡大され、又は上述した免疫反応細胞のエフェクター機能を発揮するCARに関する。
用語「抗原特異的T細胞」又は同様の用語は、特に、CARに関して提供される場合、CARが抗原提示細胞又はがん細胞等の疾患細胞の表面上等で標的にされる抗原を認識し、好ましくは上述したT細胞のエフェクター機能を発揮するT細胞に関する。T細胞及び他のリンパ系細胞は、細胞が抗原を発現する標的細胞を殺傷する場合、抗原に特異的であるとみなされる。T細胞特異性は、様々な標準技法のいずれかを使用して、例えば、クロム放出アッセイ又は増殖アッセイの範囲内で評価することができる。代わりに、リンホカイン(インターフェロン-γ等)の合成を測定することができる。
用語「主要組織適合複合体」及び略語「MHC」は、MHCクラスI及びMHCクラスII分子を含み、すべての脊椎動物中に生じる遺伝子の複合体に関する。MHCタンパク質又は分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞又は疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、MHCタンパク質又は分子は、ペプチドを結合させ、T細胞受容体による認識のためにこれらを提示する。MHCによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上で発現され、自己抗原(細胞自体に由来するペプチド断片)及び非自己抗原(例えば、侵入する微生物の断片)の両方をT細胞に表示する。
本発明によれば、用語「キメラ抗原受容体(CAR)」は、用語「キメラT細胞受容体」及び「人工T細胞受容体」と同義である。
これらの用語は、T細胞等の免疫エフェクター細胞上にモノクローナル抗体の特異性等の任意の特異性を付与する操作された受容体に関する。このように、多数のがん特異的T細胞を養子細胞移入のために生成することができる。したがって、CARは、例えば、T細胞自体のT細胞受容体の代わりに、又はそれに加えてT細胞上に存在し得る。このようなT細胞は、標的細胞を認識するのに抗原のプロセシング及び提示を必ずしも必要としないが、むしろ標的細胞上に存在する任意の抗原を好ましくは特異性を伴って認識することができる。好ましくは、前記CARは、細胞の表面上で発現される。本発明の目的に関して、CARを含むT細胞は、本明細書で使用する用語「T細胞」によって含まれる。
本発明によれば、用語「CAR」(又は「キメラ抗原受容体」)は、がん細胞等の標的細胞上の標的構造(例えば、抗原)を認識し、即ちそれに結合し(例えば、抗原結合ドメインが標的細胞の表面上で発現される抗原に結合することによって)、細胞表面上の前記CARを発現するT細胞等の免疫エフェクター細胞に特異性を付与することができる単一分子又は分子の複合体を含む人工受容体に関する。好ましくは、CARによって標的構造が認識されると、前記CARを発現する免疫エフェクター細胞が活性化される。CARは、1つ又は複数のタンパク質ユニットを含むことができ、前記タンパク質ユニットは、本明細書に記載の1つ又は複数のドメインを含む。用語「CAR」は、T細胞受容体を含まない。
一実施形態では、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片(scFv)は、CD3-ゼータ膜貫通型及びエンドドメインに融合される。このような分子は、標的細胞上のその抗原標的のscFvによる認識に応えてゼータシグナルを伝達し、標的抗原を発現する標的細胞を殺傷する。やはり使用され得る抗原認識ドメインは、とりわけT細胞受容体(TCR)アルファ及びベータ単鎖を含む。実際には、高親和性で所与の標的を結合させるほとんどすべてを、抗原認識ドメインとして使用することができる。
抗原認識の後、受容体クラスター及びシグナルが細胞に伝達される。この点において、「T細胞シグナル伝達ドメイン」は、抗原が結合した後、T細胞に活性化シグナルを伝達するドメイン、好ましくはエンドドメインである。最も一般に使用されるエンドドメイン成分は、CD3-ゼータである。
キメラ抗原受容体を発現するCAR操作T細胞を用いた養子細胞移入療法は、有望な抗がん治療であり、その理由は、CAR修飾T細胞は、実質的に任意の腫瘍抗原を標的にするように操作することができるためである。例えば、患者のT細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられたCARを発現するように遺伝子操作し(遺伝的に修飾し)、次いで患者中に注入して戻すことができる。
本発明によれば、CARは、上述したT細胞受容体の機能を置き換えることができ、特に、細胞溶解活性等の反応性を上述したT細胞等の細胞に付与することができる。しかし、T細胞受容体の上述した抗原ペプチド-MHC複合体への結合と対照的に、CARは、特に、細胞表面上で発現される場合、抗原に結合することができる。
T細胞表面糖タンパク質CD3-ゼータ鎖は、ヒトにおいてCD247遺伝子によってコードされるタンパク質である。CD3-ゼータは、T細胞受容体アルファ/ベータ及びガンマ/デルタヘテロ二量体、並びにCD3-ガンマ、-デルタ、及び-イプシロンと一緒に、T細胞受容体-CD3複合体を形成する。ゼータ鎖は、抗原認識をいくつかの細胞内シグナル形質導入経路にカップリングすることにおいて重要な役割を果たす。用語「CD3-ゼータ」は、好ましくは、ヒトCD3-ゼータ、特に、配列表の配列番号8のアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列のバリアントを含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。
CD28(表面抗原分類28)は、T細胞活性化に要求される共刺激シグナルを提供するT細胞上で発現される分子の1種である。CD28は、CD80(B7.1)及びCD86(B7.2)の受容体である。T細胞受容体(TCR)に加えてCD28による刺激は、様々なインターロイキン(特にIL-6)の産生のためにT細胞に強力な共刺激シグナルを提供することができる。用語「CD28」は、好ましくは、ヒトCD28、特に、配列表の配列番号7のアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列のバリアントを含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。
本発明によれば、CARは一般に、3つのドメインを含み得る。
第1のドメインは、抗原を認識し、結合させる結合ドメインである。
第2のドメインは、共刺激ドメインである。共刺激ドメインは、CARが標的部分に結合すると細胞傷害性リンパ球の増殖及び生存期間を増強するように機能を果たす。共刺激ドメインの同一性は、CARが標的部分に結合すると細胞増殖及び生存期間を増強する能力を有する点においてのみ限定される。適当な共刺激ドメインは、CD28、CD137(4-1BB)、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのメンバー、CD134(OX40)、受容体のTNFR-スーパーファミリーのメンバー、及びCD278(ICOS)、活性化T細胞上で発現されるCD28-スーパーファミリー共刺激分子がある。当業者は、これらの言及した共刺激ドメインの配列バリアントを、本発明に悪影響することなく使用することができ、この場合、バリアントは、これらがモデル化されるドメインと同じ又は同様の活性を有することを理解するであろう。このようなバリアントは、これらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%の配列同一性を有することになる。本発明の一部の実施形態では、CAR構築物は、2つの共刺激ドメインを含む。特定の組合せは、4つの言及したドメインのすべての可能なバリエーションを含むが、特定の実施例は、CD28+CD137(4-1BB)及びCD28+CD134(OX40)を含む。
第3のドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン(又はT細胞シグナル伝達ドメイン)である。活性化シグナル伝達ドメインは、CARが抗原に結合すると細胞傷害性リンパ球を活性化するように機能を果たす。活性化シグナル伝達ドメインの同一性は、それが、CARが抗原に結合すると選択された細胞傷害性リンパ球の活性化を誘導する能力を有する点においてのみ限定される。適当な活性化シグナル伝達ドメインとしては、T細胞CD3[ゼータ]鎖及びFc受容体[ガンマ]がある。当業者は、これらの言及した活性化シグナル伝達ドメインの配列バリアントを、本発明に悪影響することなく使用することができ、この場合、バリアントは、これらがモデル化されるドメインと同じ又は同様の活性を有することを理解するであろう。このようなバリアントは、これらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%の配列同一性を有することになる。
本発明のCARは、融合タンパク質の形態で一緒に、3つのドメインを含み得る。このような融合タンパク質は一般に、N末端からC末端方向に連結された結合ドメイン、1つ又は複数の共刺激ドメイン、及び活性化シグナル伝達ドメインを含むことになる。しかし、本発明のCARは、この配置に限定されず、他の配置も許容され、結合ドメイン、活性化シグナル伝達ドメイン、及び1つ又は複数の共刺激ドメインを含む。結合ドメインは、自由に抗原に結合することができなければならないので、融合タンパク質中の結合ドメインの配置は、一般に、細胞の外部上で領域の表示が実現されるようなものとなることが理解されることになる。同じ様式で、共刺激及び活性化シグナル伝達ドメインは、細胞傷害性リンパ球の活性及び増殖を誘導するように機能を果たすので、融合タンパク質は一般に、細胞の内部においてこれらの2つのドメインを表示することになる。CARは、追加のエレメント、例えば、細胞表面への融合タンパク質の適切な搬出を保証するためのシグナルペプチド、融合タンパク質が膜内在性タンパク質として維持されるのを保証するための膜貫通ドメイン、及び結合ドメインに柔軟性を付与し、抗原への強い結合を可能にするヒンジドメイン(又はスペーサー領域)を含み得る。
本発明のCARシステムに関連して使用される細胞は、好ましくはT細胞、特に、好ましくは細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、及びリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞から選択される細胞傷害性リンパ球である。活性化されると、これらの細胞傷害性リンパ球のそれぞれは、標的細胞の破壊を誘因する。例えば、細胞傷害性T細胞は、以下の手段のいずれか又は両方によって標的細胞の破壊を誘因する。第1に、活性化されると、T細胞は、細胞毒、例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシン等を放出する。パーフォリン及びグラニュリシンは、標的細胞内に孔を創製し、グランザイムは細胞に入り、細胞質内でカスパーゼカスケードを誘因し、それは、細胞のアポトーシス(プログラム細胞死)を誘導する。第2に、アポトーシスは、T細胞と標的細胞との間のFas-Fasリガンド相互作用を介して誘導され得る。細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞又は同種細胞も使用することができる。
非ウイルスベースDNAトランスフェクション、トランスポゾンベースシステム、及びウイルスベースシステムを含めて、様々な方法を使用してCAR構築物をT細胞内に導入することができる。非ウイルスベースDNAトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースシステムは、一体化エレメント(integrating element)を含有しないプラスミドより効率的に導入遺伝子を一体化することができる。ウイルスベースシステムは、γ-レトロウイルス及びレンチウイルスベクターの使用を含む。γ-レトロウイルスは、T細胞を生成し、効率的且つ永続的に形質導入するのが相対的に容易であり、初代ヒトT細胞内での一体化観点から予め安全であることが証明されている。レンチウイルスベクターも、T細胞を効率的且つ永続的に形質導入するが、製造コストが高い。これらも、レトロウイルスベースシステムより潜在的に安全である。
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体又はB細胞受容体(BCR)等の抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、構造ドメイン、即ち、特徴的な免疫グロブリン(Ig)フォールドを有する免疫グロブリンドメインによって特徴付けられる。この用語は、膜結合型免疫グロブリン及び可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合型免疫グロブリンは、一般にBCRの一部である表面免疫グロブリン又は膜免疫グロブリンとも呼ばれる。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは一般に、何本かの鎖、典型的には2本の同一の重鎖及び2本の同一の軽鎖を含み、これらは、ジスルフィド結合を介して連結されている。これらの鎖は主に、免疫グロブリンドメイン、例えば、VL(可変軽鎖)ドメイン、CL(定常軽鎖)ドメイン、並びにCH(定常重鎖)ドメインCH1、CH2、CH3、及びCH4から構成される。5つのタイプの哺乳動物免疫グロブリン重鎖、即ちα、δ、ε、γ、及びμが存在し、これらは、異なるクラスの抗体即ち、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMに相当する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜又は表面免疫グロブリンの重鎖は、これらのカルボキシ末端で膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物では、2つのタイプの軽鎖、即ち、ラムダ及びカッパが存在する。免疫グロブリン鎖は、可変領域及び定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は、高度に多様であり、抗原認識を担う。
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質を指す。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(VHと本明細書で省略する)及び重鎖定常領域で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VLと本明細書で省略する)及び軽鎖定常領域で構成されている。VH領域及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域とともに散在した相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各VH及びVLは、以下の順序、即ち、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された3つのCDR及び4つのFRから構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、効果細胞)、及び古典的補体系の第1の成分(Clq)を含めた、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用する場合、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性及び親和性を示す。一実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された非ヒト動物、例えば、マウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマによって生成される。
用語「組換え抗体」は、本明細書において使用する場合、組換え手段によって調製、発現、創製、又は単離されるすべての抗体、例えば、(a)自己から調製される免疫グロブリン遺伝子又はハイブリドーマに関してトランスジェニック又はトランスクロモソーマル(transchromosomal)である動物(例えば、マウス)から単離される抗体、(b)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、(c)組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、及び(d)他のDNA配列に免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングする任意の他の手段によって調製、発現、創製、又は単離される抗体等を含む。
用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むように意図されている。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroでのランダム若しくは部位特異的な突然変異誘発によって、又はin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合性部位を有する分子であって、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び/又は配列に基づく、分子を指す。抗原結合性部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインを含み、又は可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上にグラフトされた相補性決定領域(CDR)のみを含むことができる。抗原結合性部位は、野生型であっても、1つ又は複数のアミノ酸置換によって修飾されていても、例えば、ヒト免疫グロブリンにより密接に類似するように修飾されていてもよい。ヒト化抗体のいくつかの形態は、すべてのCDR配列を保存する(例えば、マウス抗体由来の6つすべてのCDRを含有するヒト化マウス抗体)。他の形態は、元の抗体に対して変更された1つ又は複数のCDRを有する。
用語「キメラ抗体」は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの1つの部分が、特定の種に由来する、又は特定のクラスに属する抗体中の対応する配列と相同であり、一方、鎖の残りのセグメントは、別のものにおける対応する配列と相同である抗体を指す。一般に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の1つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部分は、別の種に由来する抗体の配列と相同である。このようなキメラ形態の1つの明らかな利点は、可変領域を、好都合なことには、例えば、ヒト細胞標本に由来する定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物体からの容易に入手可能なB細胞又はハイブリドーマを使用して現在分かっている源から導出することができることである。可変領域は、調製の容易さという利点を有し、特異性は、源によって影響されないが、ヒトである定常領域は、非ヒト源由来の定常領域が誘発するより、抗体が注射される場合、ヒト対象から免疫応答を誘発しにくい。しかし、定義は、この特定の例に限定されない。
抗体は、それだけに限らないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びヒトを含めた様々な種に由来し得る。
本明細書に記載の抗体としては、IgA、例えば、IgA1又はIgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM、及びIgDの抗体がある。様々な実施形態では、抗体は、IgG1抗体、より具体的には、IgG1、カッパ、若しくはIgG1、ラムダアイソタイプ(即ち、IgG1、κ、λ)、IgG2a抗体(例えば、IgG2a、κ、λ)、IgG2b抗体(例えば、IgG2b、κ、λ)、IgG3抗体(例えば、IgG3、κ、λ)、又はIgG4抗体(例えば、IgG4、κ、λ)である。
用語の抗体の「抗原結合性部分」(若しくは単に「結合性部分」)、又は抗体の「抗原結合性断片」(若しくは単に「結合性断片」)、又は同様の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1種又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、全長抗体の断片によって遂行され得ることが示されている。用語の抗体の「抗原結合性部分」の中に包含される結合性断片の例としては、(i)Fab断片、VL、VH、CL、及びCHのドメインからなる一価の断片;(ii)F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)VHドメイン及びCHドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVLドメイン及びVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Wardら、(1989) Nature、341: 544〜546);(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、及び(vii)合成リンカーによって任意選択で接合され得る2つ以上の単離されたCDRの組合せがある。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別個の遺伝子によってコートされるが、これらは、VL領域及びVH領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して接合することができる(単鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Birdら、(1988) Science、242: 423〜426;及びHustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85: 5879〜5883を参照)。このような単鎖抗体も、用語の抗体の「抗原結合性断片」の中に包含されることが意図されている。さらなる例は、(i)免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合されている結合性ドメインポリペプチド、(ii)ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH2定常領域、及び(iii)CH2定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域を含む結合性ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合性ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域であり得る。結合性ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、US2003/0118592及びUS2003/0133939に更に開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣例的な技法を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
本発明によれば、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原に対する抗体、即ち、抗原に向けられており、好ましくは抗原に特異的である抗体の抗原結合部分を含み、好ましくはそれに関する。
用語「結合ドメイン」は、所与の標的構造/抗原/エピトープに結合し/それと相互作用する例えば抗体の構造を本発明に関連して特徴付ける。したがって、本発明による結合ドメインは、「抗原相互作用部位」を指定する。
抗体及び抗体の誘導体は、抗体断片等の結合ドメインを提供するのに、特に、VL及びVH領域を提供するのに有用である。
CAR内に存在し得る抗原の結合ドメインは、抗原に結合する(それを標的にする)能力、即ち、抗原中に存在するエピトープ、好ましくは抗原の細胞外ドメイン内に位置したエピトープに結合する(それを標的にする)能力を有する。好ましくは、抗原の結合ドメインは、抗原に特異的である。好ましくは、抗原の結合ドメインは、細胞表面上で発現される抗原に結合する。特定の好適な実施形態では、抗原の結合ドメインは、生細胞の表面上に存在する抗原の天然エピトープに結合する。
本発明の目的に関して本明細書に記載されるすべての抗体及び抗体断片等の抗体の誘導体は、用語「抗体」によって包含される。
抗体は、慣例的なモノクローナル抗体の方法、例えば、Kohler及びMilstein、Nature、256: 495 (1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を含めた、様々な技法によって生成することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好適であるが、原理上は、モノクローナル抗体を生成するための他の技法、例えば、B-リンパ球のウイルス形質転換若しくは癌化、又は抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も使用することができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好適な動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は、非常によく確立された手順である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫化プロトコール及び技法は、当技術分野で公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)、及び融合手順も公知である。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好適な動物系は、ラット系及びウサギ系である(例えば、Spieker-Poletら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、92:9348 (1995)に記載されており、Rossiら、Am. J. Clin. Pathol.、124: 295 (2005)も参照)。
抗体を生成するために、記載したように、マウスを、抗原配列、即ち、抗体が向けられる配列に由来する担体コンジュゲートペプチド、組換えで発現された抗原若しくはその断片の濃縮製剤、及び/又は抗原を発現する細胞で免疫することができる。代わりに、マウスを、抗原又はその断片をコードするDNAで免疫することができる。抗原の精製又は濃縮された製剤を使用して免疫化しても、抗体がもたらされない場合には、マウスを、抗原を発現する細胞、例えば、細胞株で免疫して、免疫応答を促進することもできる。
免疫応答は、尾静脈採血又は眼窩後方採血によって得られる血漿試料及び血清試料を用いて免疫化プロトコールの過程にわたって監視することができる。十分な力価の免疫グロブリンを有するマウスを、融合に使用することができる。特異的抗体分泌ハイブリドーマの割合を増大させるために、マウスを、屠殺及び脾臓の取り出しの3日前に、抗原発現細胞で腹腔内又は静脈内に追加免疫することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫化マウスからの脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株等の適切な不死化細胞株に融合することができる。次いで得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体を生成するためにスクリーニングすることができる。次いで個々のウェルを、抗体分泌ハイブリドーマについてELISAによってスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を使用する免疫蛍光及びFACS分析によって、抗原に対して特異性を有する抗体が同定され得る。抗体分泌ハイブリドーマを再び蒔き、再びスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体について依然として陽性である場合、希釈を制限することによってサブクローニングすることができる。次いで安定なサブクローンをin vitroで培養して組織培養基中で抗体を生成し、特徴付けることができる。
抗体及び他の結合剤の抗原を結合させる能力は、標準的な結合アッセイ(例えば、ELISA、ウエスタンブロット、免疫蛍光、及びフローサイトメトリー分析)を使用して判定することができる。
用語「結合性」は、本発明によれば、好ましくは、特異的結合性に関する。
本発明によれば、CAR等の作用物質は、これが所定の標的に対して有意な親和性を有し、標準的なアッセイで前記所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に結合する(を標的とする)ことができる。「親和性」又は「結合親和性」は、平衡解離定数(KD)によって測定されることが多い。好ましくは、用語「有意な親和性」は、10-5M以下、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、又は10-12M以下の解離定数(KD)で所定の標的に結合することを指す。
作用物質は、これが、標的に対して有意な親和性を有さず、標準的なアッセイで前記標的に有意に結合しない、特に検出可能な程度に結合しない場合、前記標的に(実質的に)結合する(を標的とする)ことができない。好ましくは、作用物質は、最大2、好ましくは10、より好ましくは20、特に、50、若しくは100μg/ml、又はそれ以上の濃度で存在する場合、前記標的に検出可能な程度に結合しない。好ましくは、作用物質は、これが、作用物質が結合することができる所定の標的への結合性についてのKDより、少なくとも10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、又は106倍高いKDで一標的に結合する場合、前記標的に対して有意な親和性をまったく有さない。例えば、作用物質の、該作用物質が結合することができる標的への結合性についてのKDが10-7Mである場合、作用物質が有意な親和性をまったく有さない一標的への結合性についてのKDは、少なくとも10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、又は10-1Mである。
作用物質は、これが、所定の標的に結合することができる一方、他の標的に(実質的に)結合することができず、即ち、他の標的に対して有意な親和性を有さず、標準的なアッセイで他の標的に有意に結合しない場合、前記所定の標的に特異的である。好ましくは、このような他の標的に対する親和性及びそれへの結合性が、所定の標的、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、又はヒト血清アルブミン(HSA)等と関連しないタンパク質に対する親和性又はそれへの結合性を有意に超えない場合、作用物質は、所定の標的に特異的である。好ましくは、作用物質は、それが特異的でない標的への結合に関するKDより、少なくとも10分の1、100分の1、103分の1、104分の1、105分の1、又は106分の1低いKDで、それが前記標的に結合する場合、所定の標的に特異的である。例えば、作用物質の、これが特異的である標的への結合性についてのKDが10-7Mである場合、これが特異的でない標的への結合性についてのKDは、少なくとも10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、又は10-1Mであるはずである。
作用物質の標的への結合性は、任意の適当な方法を使用して実験的に判定することができ、例えば、Berzofskyら「Antibody-Antigen Interactions」、Fundamental Immunology、Paul, W. E.編、Raven Press New York、N Y (1984)、Kuby、Janis Immunology、W. H. Freeman and Company New York、N Y (1992)、及び本明細書に記載の方法を参照。親和性は、平衡透析によって;製造者が概説した一般的な手順を使用してBIAcore 2000計測器を使用することによって;放射標識された標的抗原を使用するラジオイムノアッセイによって;又は当業者に公知の別の方法によって等、慣例的な技法を使用して容易に判定することができる。親和性データは、例えば、Scatchardら、Ann N.Y. Acad. ScL、51:660 (1949)の方法によって分析することができる。特定の抗体-抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件、例えば、塩濃度、pH下で測定される場合、変動し得る。したがって、親和性並びに他の抗原結合性パラメータ、例えば、KD、IC50の測定は、抗体及び抗原の標準化された溶液、並びに標準化された緩衝液を用いて行われることが好ましい。
好ましくは、本発明によれば、抗原又はそのバリアントをコードするRNA等の核酸は、哺乳動物中に導入される。核酸は、哺乳動物の抗原提示細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞、又は他の細胞)内に吸収される。核酸の抗原性翻訳産物が形成され、産物は、抗原に向けられたCAR操作T細胞による認識のために、細胞の表面上に表示される。
代わりに、本発明は、本明細書に列挙した抗原を発現する核酸が、ex vivoで抗原提示細胞、例えば、患者から採取した抗原提示細胞内に導入され、ex vivoで任意選択でクローン的に繁殖された抗原提示細胞が、同じ患者中に移植して戻される実施形態を想定する。トランスフェクト細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは、静脈内、腔内、腹腔内、又は腫瘍内投与によって滅菌形態で患者中に再導入することができる。
本発明の方法は、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を発現させるための抗原提示細胞を伴い得る。この目的を達成するために、本発明の方法は、抗原をコードする核酸の樹状細胞等の抗原提示細胞内への導入を伴い得る。樹状細胞等の抗原提示細胞のトランスフェクションのために、抗原をコードする核酸を含む医薬組成物を使用することができる。樹状又は他の抗原提示細胞に対する核酸を標的にする送達ビヒクルを患者に投与し、in vivoで起こるトランスフェクションをもたらすことができる。
本発明によれば、抗原又はそのバリアントをコードする核酸の製剤であって、全身投与後に脾臓内の樹状細胞(DC)等の抗原提示細胞に高い選択性で核酸を送達する、製剤を使用することが好適である。例えば、粒子の正味の電荷がゼロに近いか、又は負である規定された粒径を有するナノ粒子RNA製剤、例えば、RNA及びリポソーム由来の電気的中性の又は負に荷電したリポプレックス、例えば、DOTMA及びDOPE又はDOTMA及びコレステロールを含むリポプレックス等は、全身投与後に脾臓DC内で相当なRNA発現をもたらす。標的細胞(脾臓)内に強い発現が測定されたが、他の臓器内での発現は低かった。
本明細書において使用する場合、用語「ナノ粒子」は、特に、核酸の全身、特に非経口投与に適した粒子を作製する直径、典型的には1000ナノメートル(nm)未満の直径を有する任意の粒子を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、600nm未満の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、400nm未満の直径を有する。
本明細書において使用する場合、用語「ナノ粒子製剤」又は同様の用語は、少なくとも1種のナノ粒子を含有する任意の物質を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な収集物である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、分散液又はエマルジョンである。一般に、分散液又はエマルジョンは、少なくとも2種の不混和性材料が組み合わされる場合に形成される。
用語「リポプレックス」又は「核酸リポプレックス」、特に、「RNAリポプレックス」は、脂質及び核酸、特に、RNAの複合体を指す。リポプレックスは、中性「ヘルパー」脂質も含むことが多いカチオン性リポソームが核酸と混合される場合に、自発的に形成される。
本発明が、電荷、例えば、正電荷、負電荷、若しくは中性電荷、又はカチオン性化合物、陰性化合物、若しくは中性化合物に言及する場合、これは、一般に、述べた電荷が生理的pH等の選択されたpHで存在することを意味する。例えば、用語「カチオン性脂質」は、生理的pH等の選択されたpHで正味の正電荷を有する脂質を意味する。用語「中性脂質」は、正味の正又は負電荷を有さず、生理的pH等の選択されたpHで非荷電又は中性両性イオンの形態で存在し得る脂質を意味する。本明細書で「生理的pH」とは、約7.5のpHを意味する。
本発明における使用に企図された脂質担体等のナノ粒子担体には、RNA等の核酸が、例えば、核酸と複合体を形成し、又は核酸が密閉され、若しくは封入されるベシクルを形成することによって、会合することができる任意の物質又はビヒクルが含まれる。これは、裸の核酸と比較して、核酸の安定性を増大させ得る。特に、血液中の核酸の安定性が増大し得る。
カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、及び正電荷を有する他の物質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。これらのカチオン性分子は、核酸と複合体を形成し、それによって例えば、それぞれいわゆるリポプレックス又はポリプレックスを形成するのに使用することができ、これらの複合体は、細胞内に核酸を送達することが示されている。
本発明で使用するためのナノ粒子核酸調製物は、様々なプロトコールによって、且つ様々な核酸複合体形成化合物(nucleic acid complexing compound)から得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、又は両親媒性物質は、典型的な複合体形成剤である。一実施形態では、複合体形成化合物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リシン、ポリ-L-アルギニン、又はヒストンからなる群から選択される少なくとも1種の作用物質を含む。
本発明によれば、プロタミンは、カチオン性担体剤として有用である。用語「プロタミン」は、アルギニンに富み、特に、様々な動物(魚のような)の精子細胞内の体細胞ヒストンの代わりにDNAと付随して見いだされる相対的に低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、用語「プロタミン」は、強塩基性であり、水中で可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解すると主にアルギニンを生じる魚の精子中に見つかるタンパク質を指す。精製形態では、これらは、インスリンの長時間作用型製剤において、及びヘパリンの抗凝固効果を中和するのに使用される。
本発明によれば、用語「プロタミン」は、本明細書において使用する場合、その断片を含めた天然又は生物源から得られ、又はそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、及び前記アミノ酸配列又はその断片の多量体形態を含むことを意味する。更に、この用語は、特定の目的のために人為的及び特別に設計され、天然又は生物源から単離することができない(合成)ポリペプチドを包含する。
本発明によって使用されるプロタミンは、プロタミン硫酸塩又はプロタミン塩酸塩であり得る。好適な実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子の生成に使用されるプロタミン源は、プロタミン5000であり、これは、等張塩溶液中に10mg/ml(1ml当たり5000ヘパリン中和単位)超でプロタミンを含有する。
リポソームは、リン脂質等のベシクル形成脂質の1つ又は複数の二重層を有することが多い微視的な脂質ベシクルであり、薬物を封入することができる。多層膜ベシクル(MLV)、小単層ベシクル(SUV)、大単層ベシクル(LUV)、立体的に安定化されたリポソーム(SSL)、多小胞ベシクル(MV)、及び大多小胞ベシクル(LMV)、並びに当技術分野で公知の他の二重層形態を含めて、これらに限定されることなく、異なるタイプのリポソームを本発明との関連で使用することができる。リポソームのサイズ及びラメラリティは、調製の様式に依存することになり、使用されるベシクルのタイプの選択は、好適な投与モードに依存することになる。ラメラ相、六方晶系及び逆六方晶系相、立方相、ミセル、単層から構成される逆ミセルを含む、脂質が水性媒体中に存在し得るいくつかの他の形態の超分子組織が存在する。これらの相は、DNA又はRNAとの組合せで得ることもでき、RNA及びDNAとの相互作用は、相状態に実質的に影響し得る。記載した相は、本発明のナノ粒子核酸製剤中に存在し得る。
核酸及びリポソームから核酸リポプレックスを形成するために、リポソームを形成する任意の適当な方法を、それが、想定される核酸リポプレックスをもたらす限り使用することができる。リポソームは、標準方法、例えば、逆蒸発法(REV)、エタノール注入法、脱水-再水和法(DRV)、超音波処理、又は他の適当な方法を使用して形成することができる。
リポソーム形成後、リポソームをサイズ分けして、実質的に均質なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。
二重層形成脂質は、典型的には、2本の炭化水素鎖、特にアシル鎖、及び極性又は非極性の頭部基を有する。二重層形成脂質は、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、及びスフィンゴミエリン等を含む、天然に存在する脂質又は合成起源から構成され、この場合、2本の炭化水素鎖は、典型的には、長さが約14〜22の間の炭素原子であり、様々な程度の不飽和を有する。本発明の組成物において使用するための他の適当な脂質としては、糖脂質、並びにコレステロール及びその様々な類似体等のステロールがあり、これらは、リポソームにおいて使用することもできる。
カチオン性脂質は、典型的には、ステロール等の親油性部分、アシル又はジアシル鎖を有し、全体的な正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には、正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは1〜10価の正電荷、より好ましくは1〜3価の正電荷、より好ましくは1価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例としては、それだけに限らないが、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA);ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB);1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP);1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP);1,2-ジアシルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン;1,2-ジアルキルオキシ-3-ジメチルアンモニウムプロパン;ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジミリストイルオキシプロピル-1,3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム(DMRIE)、及び2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミウムトリフルオロアセテート(DOSPA)がある。DOTMA、DOTAP、DODAC、及びDOSPAが好適である。DOTMAが最も好適である。
更に、本明細書に記載のナノ粒子は、好ましくは、構造的安定性等を考慮して中性脂質を更に含む。中性脂質は、核酸-脂質複合体の送達効率を考慮して適切に選択することができる。中性脂質の例としては、それだけに限らないが、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、ステロール、及びセレブロシドがある。DOPE及び/又はDOPCが好適である。DOPEが最も好適である。カチオン性リポソームがカチオン性脂質及び中性脂質の両方を含む場合では、カチオン性脂質の中性脂質に対するモル比は、リポソームの安定性等を考慮して適切に決定することができる。
一実施形態によれば、本明細書に記載のナノ粒子は、リン脂質を含み得る。リン脂質は、グリセロリン脂質であり得る。グリセロリン脂質の例としては、3つのタイプの脂質:(i)例えば、ホスファチジルコリン(PC)、卵黄ホスファチジルコリン、天然、部分水素化、又は完全水素化形態でのダイズ由来PC、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、スフィンゴミエリン(SM)を含む、双性イオン性リン脂質;(ii)例えば、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ジパルミトイルPG、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)を含む、負に荷電したリン脂質;メトキシ-ポリエチレン,グリコール-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(mPEG-DSPE)にも当てはまる、コンジュゲートが双性イオン性リン脂質を負に荷電させる合成誘導体;及び(iii)例えば、ホスホモノエステルがO-メチル化されてカチオン性脂質を形成したホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリンを含むカチオン性リン脂質があり、これらに限定されない。
核酸の脂質担体への会合は、例えば、担体が核酸を物理的に捕捉するように担体の隙間空間を満たす核酸によって、又は共有結合性、イオン性、若しくは水素結合によって、又は非特異的結合による吸着の手段によって起こり得る。会合のモードが何であれ、核酸は、その治療的な、即ち、抗原をコードする性質を保持しなければならない。
特定の実施形態では、抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、CAR操作T細胞の投与の前、同時、及び/又は後に投与される。好ましくは抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、CAR操作T細胞の投与後に投与される。
CAR操作T細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、共通の組成物中に存在することができ、即ち、一緒に混合することができる。更に、CAR操作T細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸が一緒に存在するが、同じ組成物中に存在しない実施形態も本発明によって想定される。前記実施形態は、特に、1つの容器が、CAR操作T細胞を含む組成物を含有し、別の容器が、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を含む組成物を含有する少なくも2つの容器を有するキットに関する。
本発明によれば、一実施形態における抗原又はそのバリアントをコードする核酸は、RNA、好ましくはmRNAである。RNAは、好ましくはin-vitro転写によって得られる。
用語「核酸」は、本明細書において使用する場合、DNA及びRNA、例えば、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、組換えで生成される及び化学合成される分子を含むように意図されている。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。RNAには、in vitroで転写されたRNA(IVT RNA)又は合成RNAが含まれる。本発明によれば、核酸は、好ましくは単離核酸である。
核酸は、ベクター内に含まれる場合がある。用語「ベクター」は、本明細書において使用する場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は人工染色体ベクター、例えば、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、若しくはP1人工染色体(PAC)を含めた当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターは、発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、一般に、特定の宿主生物(例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、若しくは哺乳動物)又はin vitro発現系内で作動可能に連結したコード配列の発現に必要な所望のコード配列及び適切なDNA配列を含有する。クローニングベクターは、一般に、ある特定の所望のDNA断片を操作及び増幅するのに使用され、所望のDNA断片の発現に必要な機能的配列を欠く場合がある。
本発明との関連で、用語「RNA」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくはリボヌクレオチド残基から完全又は実質的に構成されている分子を指す。「リボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の2'位でヒドロキシル基を含むヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、単離RNA、例えば、部分的に精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換えで生成されたRNA、並びに1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び/又は変更によって天然に存在するRNAと異なる修飾RNAを含む。このような変更は、RNAの末端への、又は内部での、例えば、RNAの1つ若しくは複数のヌクレオチドにおいて等での非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。RNA分子内のヌクレオチドは、非標準的なヌクレオチド、例えば、天然に存在しないヌクレオチド、又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドも含み得る。これらの変更されたRNAは、類似体又は天然に存在するRNAの類似体と呼ぶことができる。
本発明によれば、用語「RNA」は、「メッセンジャーRNA」を意味し、鋳型としてDNAを使用して生成され得る「転写物」に関し、ペプチド又はタンパク質をコードする「mRNA」を含み、好ましくは「mRNA」に関する。mRNAは、典型的には、5'非翻訳領域(5'-UTR)、タンパク質又はペプチドコード領域、及び3'非翻訳領域(3'-UTR)を含む。mRNAは、細胞内及びin vitroで限られた半減時間を有する。好ましくは、mRNAは、DNA鋳型を使用してin vitro転写によって生成される。本発明の一実施形態では、RNAは、in vitro転写又は化学合成によって得られる。in vitro転写方法は、当業者に公知である。例えば、様々なin vitro転写キットが市販されている。
本発明の一実施形態では、RNAは、一本鎖自己複製RNA等の自己複製RNAである。一実施形態では、自己複製RNAは、プラスセンスの一本鎖RNAである。一実施形態では、自己複製RNAは、ウイルスRNA又はウイルスRNAに由来するRNAである。一実施形態では、自己複製RNAは、アルファウイルスゲノムRNAであり、又はアルファウイルスゲノムRNAに由来する。一実施形態では、自己複製RNAは、ウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施形態では、ウイルスは、セムリキ森林ウイルスである。一実施形態では、自己複製RNAは、1種又は複数の導入遺伝子を含有し、前記導入遺伝子の少なくとも1種は、本明細書に記載の作用物質をコードする。一実施形態では、RNAがウイルスRNAであり、又はウイルスRNAに由来する場合、導入遺伝子は、構造タンパク質をコードするウイルス配列等のウイルス配列と部分的又は完全に入れ替わることができる。一実施形態では、自己複製RNAは、in vitroで転写されたRNAである。
本発明によって使用されるRNAの発現及び/又は安定性を増大させるために、RNAを、好ましくは発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく修飾することができる。
用語「修飾」は、本発明によって使用されるRNAとの関連で、前記RNAにおいて天然に存在しないRNAの任意の修飾を含む。
本発明の一実施形態では、本発明によって使用されるRNAは、キャップのない5'-トリホスフェートを有さない。このようなキャップのない5'-トリホスフェートの除去は、ホスファターゼでRNAを処理することによって実現することができる。
本発明によるRNAは、その安定性を増大させ、且つ/又は細胞傷害性を減少させるために修飾された天然に存在する又は合成のリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、本発明によって使用されるRNAにおいて、5-メチルシチジンが、シチジンを部分的又は完全に、好ましくは完全に置換する。代替として又は追加的に、一実施形態では、本発明によって使用されるRNAにおいて、プソイドウリジンが、ウリジンを部分的又は完全に、好ましくは完全に置換する。
一実施形態では、用語「修飾」は、5'-キャップ又は5'-キャップ類似体を有するRNAを提供することに関する。用語「5'-キャップ」は、mRNA分子の5'末端に見つかるキャップ構造を指し、一般に、珍しい5'-5'三リン酸連結を介してmRNAに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは、7位でメチル化されている。用語「慣例的な5'-キャップ」は、天然に存在するRNA 5'-キャップ、好ましくは7-メチルグアノシンキャップ(m7G)を指す。本発明との関連で、用語「5'-キャップ」は、5'-キャップ類似体を含み、それは、RNAキャップ構造に類似し、好ましくはin vivo及び/又は細胞内で、RNAに付着された場合にRNAを安定化する能力を有するように修飾されている。
RNAへの5'-キャップ又は5'-キャップ類似体の提供は、前記5'-キャップ又は5'-キャップ類似体の存在下でDNA鋳型のin vitro転写によって実現することができ、前記5'-キャップは、生成されるRNA鎖中に共転写的に組み込まれ、又はRNAは、例えば、in vitro転写によって生成することができ、5'-キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にRNAに付着させることができる。
RNAは、さらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるRNAのさらなる修飾は、天然に存在するポリ(A)テールの伸長若しくは切断、又は5'-若しくは3'-非翻訳領域(UTR)の変更、例えば、前記RNAのコード領域に関連しないUTRの導入、例えば、グロビン遺伝子、例えば、アルファ2-グロビン、アルファ1-グロビン、ベータ-グロビン、好ましくはベータ-グロビン、より好ましくはヒトベータ-グロビン等に由来する3'-UTRの1つ若しくは複数の、好ましくは2つのコピーの挿入等であり得る。
したがって、本発明によって使用されるRNAの安定性及び/又は発現を増大させるために、これは、好ましくは10〜500、より好ましくは30〜300、更により好ましくは65〜200、特に100〜150アデノシン残基の長さを有するポリ-A配列と併せて存在するように修飾することができる。特に好適な実施形態では、ポリ-A配列は、およそ120アデノシン残基の長さを有する。更に、2つ又はそれ超の3'-非翻訳領域(UTR)をRNA分子の3'-非翻訳領域中に組み込むと、翻訳効率を増強することができる。一特定の実施形態では、3'-UTRは、ヒトβ-グロビン遺伝子に由来する。
用語RNAの「安定性」は、RNAの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分を排除するのに必要とされる時間に関する。本発明との関連で、RNAの半減期は、前記RNAの安定性を示す。RNAの半減期は、RNAの「発現の継続時間」に影響を与え得る。長い半減期を有するRNAは、長時間にわたって発現されることが予期され得る。
本発明との関連で、用語「転写」は、DNA配列内の遺伝子コードがRNAへと転写されるプロセスに関する。引き続いて、RNAは、タンパク質へと翻訳され得る。本発明によれば、用語「転写」は、「in vitro転写」を含み、用語「in vitro転写」は、RNA、特に、mRNAが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して無細胞系内でin vitro合成されるプロセスを指す。好ましくは、クローニングベクターが、転写物を生成するために適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば、用語「ベクター」によって包含される。
用語「翻訳」は、本発明によれば、メッセンジャーRNAの鎖が、アミノ酸の配列のアセンブリーにペプチド又はタンパク質を作製するように指示する細胞のリボソーム内のプロセスに関する。
核酸は、本発明によれば、単独で、又は相同若しくは非相同であり得る他の核酸と組み合わせて存在し得る。好適な態様では、核酸は、前記核酸に関して相同又は非相同であり得る発現制御配列に機能的に連結される。用語「相同の」は、核酸が、やはり天然に機能的に連結されることを意味し、用語「非相同の」は、核酸が天然に機能的に連結されないことを意味する。
核酸及び発現制御配列は、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるやり方で、これらが互いに共有結合的に連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が機能タンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列で、前記発現制御配列の誘導は、コード配列中でフレームワークシフトを起こすことなく、前記核酸の転写をもたらし、さもなければ、前記コード配列は、所望のタンパク質又はペプチドに翻訳され得ない。
用語「発現制御配列」又は「発現制御エレメント」は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又はmRNAの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は、調節され得る。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型の関数として変動し得るが、一般に、それぞれ転写並びに翻訳の開始に関与する5'-非転写並びに5'-及び3'-非翻訳配列、例えば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等を含む。より具体的には、5'-非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列又は上流活性化因子配列も含み得る。
用語「発現」は、その最も一般的な意味で本発明によって使用され、例えば、転写及び/又は翻訳によるRNA及び/又はペプチド若しくはタンパク質の産生を含む。RNAに関して、用語「発現」又は「翻訳」は、特に、ペプチド又はタンパク質の産生に関する。これは、核酸の部分的な発現も含む。更に、発現は、一過性又は安定であり得る。本発明によれば、用語の発現は、「異所性発現」又は「異常発現」も含む。
「異所性発現」又は「異常発現」は、本発明によれば、発現が、参照、例えば、ある特定のタンパク質、例えば、腫瘍抗原の異所性発現又は異常発現と関連した疾患を有していない対象における状態と比較して、変更され、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも10%、特に、少なくとも20%、少なくとも50%、若しくは少なくとも100%、又はそれ以上の増大を指す。一実施形態では、発現は、病変組織内でのみ見つかり、一方、健康組織内の発現は、抑圧される。
用語「特異的に発現される」は、タンパク質が本質的に特定の組織又は臓器内でのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜内で特異的に発現される腫瘍抗原は、前記タンパク質が胃粘膜内で主に発現され、他の組織内で発現されない、又は他の組織若しくは臓器型内で有意な程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞内でもっぱら発現され、精巣等の任意の他の組織内で有意により少ない程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞内で特異的に発現される。一部の実施形態では、腫瘍抗原はまた、1つを超える組織型又は臓器内、例えば、2又は3つの組織型又は臓器内等、しかし好ましくは、3つ以下の異なる組織又は臓器型内で、通常の条件下で特異的に発現され得る。この場合、腫瘍抗原は、そのとき、これらの臓器内で特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が、肺及び胃内で好ましくはおよそ等しい程度に、通常の条件下で発現される場合、前記腫瘍抗原は、肺及び胃内で特異的に発現される。
本発明によれば、用語「〜をコードする核酸」は、核酸が、適切な環境下、好ましくは細胞内に存在する場合、発現されてそれがコードするタンパク質又はペプチドを産生することができることを意味する。
本明細書に記載の核酸は、組換え及び/又は単離分子であり得る。
「単離分子」は、本明細書において使用する場合、他の細胞物質等の他の分子を実質的に含まない分子を指すように意図されている。
本発明との関連における用語「組換え型の」は、「遺伝子操作によって作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明との関連における組換え細胞等の「組換え型物体」は、天然に存在しない。
用語「天然に存在する」は、本明細書において使用する場合、物体を自然において見つけることができる事実を指す。例えば、有機体(ウイルスを含む)中に存在し、自然における源から単離することができ、実験室で人によって意図的に修飾されていないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
用語「自己の」は、同じ対象に由来するものを記述するのに使用される。例えば、「自己移植」は、同じ対象に由来する組織又は臓器の移植を指す。このような手順は、これらがさもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので有利である。
用語「同種間の」は、同じ種の異なる個体に由来するものを記述するのに使用される。2以上の個体は、1つ又は複数の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、互いに同種間であると言われる。
用語「同系の」は、同一の遺伝子型を有する個体又は組織、即ち、一卵性双生児若しくは同じ近交系の動物、又はこれらの組織に由来するものを記述するのに使用される。
用語「異種の」は、複数の異なるエレメントからなるものを記述するのに使用される。一例として、1つの個体の骨髄の異なる個体への移動は、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の源に由来する遺伝子である。
用語「トランスフェクション」は、細胞内への核酸、特にRNAの導入を指す。本発明の目的に関して、用語「トランスフェクション」は、細胞内への核酸の導入、又はこのような細胞による核酸の取込みも含み、細胞は、対象、例えば、患者の中に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸をトランスフェクトするための細胞は、in vitro又はin vivoで存在することができ、例えば、細胞は、患者の臓器、組織、及び/又は有機体の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは、一過性又は安定であり得る。トランスフェクションの一部の用途については、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現される場合、それは十分である。トランスフェクションプロセスで導入される核酸は、通常核ゲノム内に一体化されないので、異質核酸は、有糸分裂によって希釈され、又は分解されることになる。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大いに低減する。トランスフェクトされた核酸が細胞及びその娘細胞のゲノム内に実際に残ることが望まれる場合、安定なトランスフェクションが行われなければならない。RNAは、そのコードされるタンパク質を一過性に発現するように細胞内にトランスフェクトすることができる。
本発明によれば、核酸を細胞内に導入、即ち、移入又はトランスフェクトするのに有用な任意の技法を使用することができる。好ましくは、RNAは、標準技法によって細胞内にトランスフェクトされる。このような技法としては、電気穿孔、リポフェクション、及びマイクロインジェクションがある。本発明の特に好適な一実施形態では、RNAは、電気穿孔によって細胞内に導入される。電気穿孔又は電気透過処理は、外部印加電場によって引き起こされる細胞形質膜の導電率及び透過性の有意な増大に関する。これは通常、何らかの物質を細胞内に導入するやり方として分子生物学において使用される。本発明によれば、タンパク質又はペプチドをコードする核酸の細胞内への導入が、前記タンパク質又はペプチドの発現をもたらすことが好適である。
用語「ペプチド」は、本発明によれば、オリゴ及びポリペプチドを含み、2以上、好ましくは3以上、好ましくは4以上、好ましくは6以上、好ましくは8以上、好ましくは9以上、好ましくは10以上、好ましくは13以上、好ましくは16以上、好ましくは21以上、最大で好ましくは8、10、20、30、40、又は50、特に、100のペプチド結合によって共有結合的に接合されたアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、大きいペプチド、好ましくは100超のアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、同義語であり、本明細書で互換的に使用される。
特異的なアミノ酸配列、例えば、配列表に示したものに関して本明細書で与える教示は、前記特異的配列と機能的に等価である配列、例えば、特異的なアミノ酸配列の性質と同一又は同様の性質を呈するアミノ酸配列をもたらす前記特異的配列のバリアントにも関するように解釈されるべきである。1つの重要な性質は、ペプチドのその標的への結合性を保持することである。
特にCDR配列、超可変領域及び可変領域の配列は、その標的に結合する能力を失うことなく修飾することができることが、当業者によって理解される。例えば、CDR領域は、親抗体の領域と同一又は高度に相同になる。「高度に相同の」によって、1〜5、好ましくは1〜4、例えば、1〜3又は1若しくは2等の置換が、CDR中で行われ得ることが企図されている。
本発明の目的に関して、アミノ酸配列の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアント、及び/又はアミノ酸置換バリアントを含む。タンパク質のN末端及び/又はC末端で欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、N末端及び/又はC末端トランケーションバリアントとも呼ばれる。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列中に単一又は2つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合では、1つ又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列中の特定の部位内に挿入されるが、得られる産物の適切なスクリーニングを用いてランダムに挿入することも可能である。
アミノ酸付加バリアントは、1つ又は複数のアミノ酸、例えば、1、2、3、5、10、20、30、50、又はそれ以上のアミノ酸等のアミノ及び/又はカルボキシ末端融合を含む。
アミノ酸欠失バリアントは、配列からの1つ又は複数のアミノ酸の除去によって、例えば、1、2、3、5、10、20、30、50、又はそれ以上アミノ酸の除去等によって特徴付けられる。欠失は、タンパク質の任意の位置内とすることができる。
アミノ酸置換バリアントは、配列中の少なくとも1種の残基が除去され、別の残基がその場所に挿入されることによって特徴付けられる。相同タンパク質又はペプチド同士間で保存されていないアミノ酸配列中の位置内にある修飾、及び/又はアミノ酸を同様の性質を有する他のアミノ酸と置き換えることが好ましい。好ましくは、タンパク質バリアント中のアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、即ち、同様に帯電したアミノ酸又は無荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、自己の側鎖に関係しているアミノ酸のファミリーの1つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は一般に、4つのファミリー、即ち、酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、及び無荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン)のアミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは時折、芳香族アミノ酸として合同で分類される。
所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%になる。類似性又は同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は約100%であるアミノ酸領域について好ましくは与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が200アミノ酸からなる場合、類似性又は同一性の程度は、少なくとも約20、少なくとも約40、少なくとも約60、少なくとも約80、少なくとも約100、少なくとも約120、少なくとも約140、少なくとも約160、少なくとも約180、又は約200のアミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について好ましくは与えられる。好適な実施形態では、類似性又は同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するための整列は、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良配列整列を使用して、例えば、標準的な設定、好ましくはEMBOSS::needle、Matrix: Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5を使用するAlignを使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか、又は保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。2つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列同士間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
用語「パーセンテージ同一性」は、最良整列をした後に得られる、比較される2つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを表すように意図されており、このパーセンテージは、純粋に統計的であり、2つの配列間の差異は、ランダムに、且つこれらの全長にわたって分布している。2つのアミノ酸配列間の配列比較は、これらの配列を最適に整列した後にこれらを比較することによって慣例的に実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定及び比較するために、セグメントによって、又は「比較のウインドウ」によって実施される。比較のための配列の最適な整列は、手作業に加えて、Smith及びWaterman、1981、Ads App. Math.、2、482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman及びWunsch、1970、J. Mol. Biol.、48、443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson及びLipman、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85、2444の類似性検索法によって、又はコンピュータープログラムであって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group社、575 Science Drive、Madison、Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N、及びTFASTA)を使用する、プログラムによって、生成することができる。
パーセンテージ同一性は、比較されている2つの配列間の同一の位置の数を判定し、この数を比較された位置の数で除し、得られた結果に100を乗じ、その結果、これらの2つの配列間のパーセンテージ同一性を得ることによって計算される。
相同アミノ酸配列は、本発明によれば、アミノ酸残基の少なくとも40%、特に、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、好ましくは、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を呈する。
本発明によれば、アミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質のバリアント、断片、一部、又は部分は、好ましくは、これが由来した、それぞれアミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質の機能的性質を有し、即ち、これは、機能的に等価である。一実施形態では、アミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質のバリアント、断片、一部、又は部分は、これが由来した、それぞれアミノ酸配列、ペプチド、又はタンパク質と免疫学的に等価である。一実施形態では、機能的性質は、免疫学的性質である。
用語「由来する」は、本発明によれば、特定のエンティティ、特に、特定の配列が、それが由来した物体、特に、有機体又は分子中に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合では、「由来する」は、特に、関連したアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列に由来することを意味する。
用語「細胞」又は「宿主細胞」は、好ましくはインタクト細胞、即ち、その通常の細胞内成分、例えば、酵素、小器官、又は遺伝物質を放出していないインタクトな膜を有する細胞に関する。インタクト細胞は、好ましくは生存細胞、即ち、その通常の代謝機能を実施することができる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸をトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。好ましくは、外因性核酸をトランスフェクトされ、レシピエントに移されたときの細胞は、レシピエント内で核酸を発現することができる。用語「細胞」は、細菌細胞を含み、他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞、又は哺乳動物細胞である。適当な細菌細胞としては、グラム陰性菌株、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、プロテウス(Proteus)、及びシュードモナス(Pseudomonas)の株、並びにグラム陽性菌株、例えば、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、及びラクトコッカス(Lactococcus)の株に由来する細胞がある。適当な真菌細胞としては、トリコデルマ(Trichoderma)、ニューロスポラ(Neurospora)、及びアスペルギルス(Aspergillus)の種に由来する細胞がある。適当な酵母細胞としては、サッカロミセス(Saccharomyces)(例えば、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae))、シゾサッカロミセス(例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo saccharomyces pombe))、ピキア(Pichia)(例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)及びピキア・メタノリカ(Pichia methanolicd))、並びにハンゼヌラ(Hansenula)の種に由来する細胞がある。適当な哺乳動物細胞としては、例えば、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、293 HEK等がある。しかし、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種タンパク質の発現のために当技術分野で使用される任意の他の細胞も、同様に使用することができる。哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類に由来する細胞が養子移入に特に好適である。細胞は、多数の組織型に由来することができ、免疫系の細胞等の初代細胞及び細胞株、特に、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞及びT細胞、幹細胞、例えば、造血幹細胞及び間葉幹細胞、並びに他の細胞型を含む。抗原提示細胞は、その表面上に主要組織適合複合体との関連で抗原を表示する細胞である。T細胞は、そのT細胞受容体(TCR)を使用してこの複合体を認識することができる。
核酸分子を含む細胞は、好ましくは、核酸によってコードされるペプチド又はタンパク質を発現する。
用語「プライミング」は、T細胞がその特異的抗原とその最初の接触を行い、エフェクターT細胞への分化を引き起こすプロセスを指す。
用語「クローン性増殖」又は「拡大」は、特定のエンティティが増加するプロセスを指す。本発明との関連で、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的リンパ球が増幅される免疫応答との関連で使用される。好ましくは、クローン拡大は、リンパ球の分化をもたらす。
「低減する」又は「阻害する」は、本明細書において使用する場合、レベルの、好ましくは5%以上、10%以上、20%以上、より好ましくは50%以上、最も好ましくは75%以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。用語「阻害する」又は同様の語句は、完全な又は本質的に完全な阻害、即ち、ゼロ又は本質的にゼロへの低減を含む。
「増大させる」又は「増強する」等の用語は、好ましくは、約少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも100%の増大又は増強に関する。
本明細書に記載の作用物質、組成物、及び方法は、疾患、例えば、抗原を発現する疾患細胞の存在によって特徴付けられる疾患を有する対象を処置するのに使用することができる。特に好適な疾患は、がん疾患である。
本明細書に記載の作用物質、組成物、及び方法は、本明細書に記載の疾患を予防するための免疫化又はワクチン接種にも使用することができる。
用語「疾患」は、個体の体に影響する異常な状態を指す。疾患は、特異的な症状及び徴候に関連した医学的状態と解釈されることが多い。疾患は、感染疾患等、元来外部源からの要因によって引き起こされる場合があり、又は疾患は、自己免疫疾患等、体内の機能不全によって引き起こされる場合がある。ヒトにおいて、「疾患」は、それ患う個体に疼痛、機能不全、苦痛、社会的問題、若しくは死を引き起こす任意の状態、又は個体と接触している者に対する同様の問題を指すのにより広く使用されることが多い。このより広い意味では、疾患は、傷害、身体障害、障害、症候群、感染症、孤立症状、逸脱した挙動、並びに構造及び機能の非定型の変形を時に含み、一方、他の脈絡では、且つ他の目的に関して、これらは、区別可能なカテゴリーと考えることができる。疾患は通常、身体的にだけでなく情緒的にも個体に影響し、その理由は、多くの疾患に罹り、これらとともに生活することは、人生観及び人格を変化させ得るためである。本発明によれば、用語「疾患」は、感染疾患及びがん疾患、特に、本明細書に記載のがんの形態を含む。がん又は特定の形態のがんへの本明細書での任意の言及は、そのがん転移も含む。
本発明によって処置される疾患は、好ましくは、抗原を伴う疾患である。「抗原を伴う疾患」、「抗原の発現若しくは発現の上昇に関連した疾患」、又は同様の表現は、本発明によれば、抗原が病変組織又は臓器の細胞内で発現されることを意味する。病変組織又は臓器の細胞内の発現は、健康な組織又は臓器内の状態と比較して増大し得る。一実施形態では、発現は、病変組織内でのみ見つかり、一方、健康組織内の発現は、抑圧されている。本発明によれば、抗原を伴う疾患には、感染疾患及びがん疾患が含まれ、疾患関連抗原は、好ましくは、それぞれ感染エージェントの抗原及び腫瘍抗原である。好ましくは、抗原を伴う疾患は、好ましくは細胞表面上で抗原を発現する細胞を伴う疾患であることが好ましい。
用語「健康な」又は「正常な」は、非病理学的状態を指し、好ましくは、非感染又は非がん性を意味する。
用語「がん疾患」又は「がん」は、典型的には未調節の細胞増殖によって特徴付けられる個体における生理的状態を指し、又は記述する。がんの例としては、それだけに限らないが、癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病がある。より特定すれば、このようながんの例としては、骨がん、血液がん、肺がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、膀胱のがん、腎臓のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中枢神経系(CNS)の新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫がある。用語「がん」は、本発明によれば、がん転移も含む。好ましくは、「がん疾患」は、腫瘍抗原を発現する細胞によって特徴付けられ、がん細胞は、腫瘍抗原を発現する。
一実施形態では、がん疾患は、退形成、浸潤性、及び転移の性質によって特徴付けられる悪性疾患である。悪性腫瘍(malignant tumor)は、悪性腫瘍(malignancy)が、成長において自己限定的でなく、隣接組織内に侵入することができ、遠位組織に拡散し得る場合があり(転移性)、一方、良性腫瘍が、これらの性質のいずれも有さない点で、非がん性良性腫瘍と対比される。
本発明によれば、用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」は、細胞(新生物細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる)の異常増殖によって形成される腫大又は病変部を指す。「腫瘍細胞」とは、急速な、制御されない細胞増殖(cellular proliferation)によって増殖し、新しい増殖(growth)を開始した刺激が終わった後、増殖し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造的機構、及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、良性、前悪性、又は悪性であり得る、組織の別個の塊を通常形成する。
本発明によれば、「癌」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、乳房、前立腺、肺、及び大腸がんの一般的な形態を含む最も一般的ながんを表す。
「腺癌」は、腺組織に由来するがんである。この組織は、上皮組織として知られるより大きい組織カテゴリーの一部でもある。上皮組織は、皮膚、腺、及び体の腔及び臓器を裏打ちする様々な他の組織を含む。上皮は、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉に発生学的に由来する。腺癌として分類されるために、細胞は、分泌性を有する限り、必ずしも腺の一部である必要はない。この形態の癌は、ヒトを含めたいくつかの高等哺乳動物において起こり得る。十分に分化した腺癌は、これらが由来する腺組織に類似する傾向がある一方、不十分に分化した腺癌は、類似しない場合がある。生検からの細胞を染色することによって、病理学者は、腫瘍が腺癌であるか、又はいくつかの他のタイプのがんであるかを判定する。腺癌は、体内の腺のユビキタスな性質に起因して、体の多くの組織内で生じ得る。各腺は、同じ物質を分泌しない場合があるが、細胞への外分泌機能がある限り、それは、腺とみなされ、したがってその悪性形態は、腺癌と呼ばれる。悪性腺癌は、他の組織に浸入し、転移する十分な時間が与えられると転移することが多い。卵巣腺癌は、卵巣癌の最も一般的なタイプである。これには、漿液性腺癌及び粘液腺癌、明細胞腺癌、並びに類内膜腺癌が含まれる。
リンパ腫及び白血病は、造血(血液形成)細胞に由来する悪性腫瘍である。
芽細胞腫瘍又は芽腫は、未成熟又は胚組織に類似する腫瘍(通常悪性)である。これらの腫瘍の多くは、小児において最も一般的である。
「転移」とは、その元の部位から体の別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の浸透、並びに次いで、血液によって輸送された後、標的臓器の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍の増殖は、血管新生に依存する。腫瘍細胞又は腫瘍成分が残存し、転移能を発生させる場合があるので、腫瘍転移は、原発性腫瘍が除去された後でさえ起こることが多い。一実施形態では、本発明による用語「転移」は、「遠隔転移」に関し、これは、原発性腫瘍及び局所リンパ節系から離れた転移に関する。一実施形態では、本発明による用語「転移」は、リンパ節転移に関する。
再発病又は再発は、人が、過去にその人に影響した状態によって再び影響される場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患し、前記疾患の順調な処置を受けたのに、前記疾患を再び発生させる場合、前記新しく発生した疾患は、再発病又は再発とみなすことができる。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発病又は再発は、元の腫瘍疾患の部位で起こり得るが、必ずしもそこで起こる必要はない。したがって、例えば、患者は、卵巣腫瘍に罹患し、順調な処置を受けた場合、再発病又は再発は、卵巣腫瘍の出現又は卵巣と異なる部位での腫瘍の出現であり得る。腫瘍の再発病又は再発は、腫瘍が元の腫瘍の部位と異なる部位及び元の腫瘍の部位で起こる局面も含む。好ましくは、患者が処置を受けた元の腫瘍は、原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位と異なる部位での腫瘍は、続発性又は転移性腫瘍である。
用語「処置」又は「治療的処置」は、個体の健康状態を改善し、且つ/又は寿命を延長する(増大させる)任意の処置に関する。前記処置は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発生を停止若しくは減速し、個体における疾患の発生を阻害若しくは減速し、個体における症状の頻度若しくは重症度を低下させ、且つ/又は疾患を現在有する、若しくは疾患を以前に有したことのある個体における再発を低下させることができる。
用語「予防的処置(prophylactic treatment)」又は「予防的処置(preventive treatment)」は、疾患が個体において起こるのを予防するように意図された任意の処置に関する。用語「予防的処置(prophylactic treatment)」又は「予防的処置(preventive treatment)」は、互換的に本明細書で使用される。
用語「個体」及び「対象」は、互換的に本明細書で使用される。これらは、疾患又は障害(例えば、がん)を患い得る、又はそれに感受性であるが、疾患又は障害を有していてもよく、又は有さなくてもよいヒト、非ヒト霊長類、又は他の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類)を指す。多くの実施形態では、個体は、ヒトである。別段の記載のない限り、用語「個体」及び「対象」は、特定の年齢を表さず、したがって成人、高齢者、小児、及び新生児を包含する。本発明の好適な実施形態では、「個体」又は「対象」は、「患者」である。用語「患者」は、本発明によれば、処置の対象、特に罹病対象を意味する。
「リスクにある」とは、一般的な集団と比較して、疾患、特にがんを発生させる通常より高い公算を有すると同定されている対象、即ち患者を意味する。更に、疾患、特に、がんを有していたことがある、又は現在有する対象は、疾患を発生させるリスクが増大している対象であり、その理由は、このような対象は、疾患を発生させ続け得るためである。がんを現在有する、又は有していたことがある対象はまた、がん転移のリスクが増大している。
用語「免疫療法」は、特異的免疫反応を伴う処置に関する。
本発明との関連で、「保護する」、「予防する(prevent)」、「予防的な(prophylactic)」、「予防的な(preventive)」、又は「保護的な」等の用語は、対象における疾患の出現及び/又は伝播の予防若しくは処置又は両方、特に、対象が疾患を発生させる公算を最小限にし、又は疾患の発生を遅延させることに関する。例えば、腫瘍のリスクにある人は、上述したように、腫瘍を予防する療法の候補である。
免疫療法の予防的投与、例えば、本発明の作用物質又は組成物の予防的投与は、好ましくは、疾患の発生からレシピエントを保護する。免疫療法の治療的投与、例えば、本発明の作用物質又は組成物の治療的投与は、疾患の進行/成長を阻害し得る。これは、疾患の進行/成長の鈍化、特に、疾患の進行の混乱を含み、それは、好ましくは、疾患を排除させる。
免疫療法は、本明細書に提供される作用物質が、好ましくは、患者から抗原発現細胞を除去するように機能する様々技法のいずれかを使用して実施することができる。このような除去は、抗原又は抗原を発現する細胞に特異的な患者における免疫応答を増強又は誘導する結果として起こり得る。
能動免疫療法は、処置が、免疫応答修飾剤(抗原をコードする核酸等)を投与して疾患細胞に対して反応させるための内在性宿主免疫系のin vivo刺激を利用する、免疫療法の一形態である。
受動免疫療法は、処置が、抗腫瘍効果を直接的又は間接的に媒介することができ、インタクトな宿主免疫系に必ずしも依存しない確立された腫瘍免疫反応性を有する作用物質(エフェクター細胞等)の送達を伴う、免疫療法の一形態である。エフェクター細胞の例としては、Tリンパ球(CD8+細胞傷害性Tリンパ球及びCD4+ T-ヘルパーリンパ球等)、並びに抗原提示細胞(樹状細胞及びマクロファージ等)がある。抗原に特異的な人工T細胞受容体を、養子免疫療法のためにエフェクター細胞内に移入することができる。
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」は、治療的又は予防的理由で免疫応答を誘導する目的で対象を処置するプロセスを記述する。
用語「in vivo」は、対象における状況に関する。
本明細書に記載の化合物及び作用物質は、任意の適当な医薬組成物の形態で投与され得る。
本発明の医薬組成物は、好ましくは滅菌したものであり、所望の反応又は所望の効果を生じさせるために有効量の本明細書に記載の作用物質及び任意選択で本明細書に論じた更なる作用物質を含有する。
医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体は公知の様式で調製することができる。医薬組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態であり得る。
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤、及び/又は賦形剤を含むことができ、これらのすべては、好ましくは薬学的に許容される。用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない材料の無毒性を指す。
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するのに使用してもよく、本発明の中に含まれる。この種類の薬学的に許容される塩は、非制限的な様式で、以下の酸から調製されるものを含む:塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩等としても調製することができる。
医薬組成物中に使用するのに適した緩衝物質としては、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、及び塩でのリン酸がある。
医薬組成物中に使用するのに適した防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールがある。
注射製剤は、リンガー乳酸塩等の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
用語「担体」は、適用を促進し、増強し、又は可能にするために活性成分が組み合わされる、天然又は合成の性質の有機又は無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」は、患者への投与に適している1種又は複数の適合性の固体フィラー若しくは液体フィラー、希釈剤、又は封入物質も含む。
非経口投与に可能な担体物質は、例えば、滅菌水、リンガー、リンガー乳酸塩、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンコポリマーである。
用語「賦形剤」は、本明細書で使用する場合、医薬組成物中に存在することができ、活性成分でないすべての物質、例えば、担体、バインダー、滑剤、増粘剤、表面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝液、香味剤、又は着色剤等を示すことが意図されている。
本明細書に記載の作用物質及び組成物は、任意の慣例的な経路を介して、例えば、注射又は注入によるものを含めた非経口投与等によって投与され得る。投与は、好ましくは非経口的、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内、又は筋肉内である。
非経口投与に適した組成物は通常、好ましくはレシピエントの血液に対して等張性である、活性化合物の滅菌した水性又は非水性製剤を含む。適合性の担体及び溶媒の例は、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。更に、通常、滅菌固定油が溶液又は懸濁培地として使用される。
本明細書に記載の作用物質及び組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、又はさらなる用量と一緒に所望の反応又は所望の効果を実現する量を指す。特定の疾患又は特定の状態の処置の場合では、所望の反応は、好ましくは疾患の過程の阻害に関する。これは、疾患の進行の減速、及び特に、疾患の進行の中断又は逆転を含む。疾患又は状態の処置における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発病の遅延又は発病の予防でもあり得る。
本明細書に記載の作用物質又は組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、年齢、生理的条件、サイズ、及び体重を含めた患者の個々のパラメータ、処置の継続時間、付随療法のタイプ(存在する場合)、特定の投与経路、並びに同様の要因に依存することになる。したがって、本明細書に記載の作用物質の投与される用量は、様々のこのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量で不十分である場合には、より高い用量(又は異なるより局在的な投与経路によって実現される有効により高い用量)を使用することができる。
本明細書に記載の作用物質及び組成物は、本明細書に記載のもの等の様々な障害を処置又は予防するために、例えば、in vivoで患者に投与することができる。好適な患者としては、本明細書に記載の作用物質及び組成物を投与することによって、矯正し、又は寛解させることができる障害を有するヒト患者がある。これは、抗原の発現によって特徴付けられる細胞を伴う障害を含む。
例えば、一実施形態では、本明細書に記載の作用物質は、がん疾患、例えば、抗原を発現するがん細胞の存在によって特徴付けられる本明細書に記載のもの等のがん疾患を有する患者を処置するのに使用することができる。
本発明によって記載される医薬組成物及び処置の方法は、本明細書に記載の疾患を予防するための免疫化又はワクチン接種にも使用され得る。
本発明の医薬組成物は、1種又は複数のアジュバント等の補足免疫増強物質と一緒に投与することができ、その有効度を更に増大させるため、好ましくは免疫刺激の相乗効果を実現するための1種又は複数の免疫増強物質を含み得る。用語「アジュバント」は、免疫応答を延長又は増強又は加速する化合物に関する。アジュバントの様々なタイプに応じて、様々な機構がこの点において可能である。例えば、DCの成熟を可能にする化合物、例えば、リポ多糖又はCD40リガンドは、第1のクラスの適当なアジュバントを形成する。一般に、「危険シグナル」(LPS、GP96、dsRNA等)又はGM-CSF等のサイトカインのタイプの免疫系に影響を与える任意の作用物質を、免疫応答が制御された様式で強化され、且つ/又は影響を与えられることを可能にするアジュバントとして使用することができる。CpGオリゴデオキシヌクレオチドも、この脈絡において任意選択で使用することができるが、上記に説明した、ある特定の環境下で起こるこれらの副作用が考慮されるべきである。特に好適なアジュバントは、サイトカイン、例えば、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、若しくはケモカイン等、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-α、又は増殖因子、例えば、hGHである。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、又はMontanide(登録商標)、最も好適なMontanide(登録商標)ISA51等の油である。Pam3Cys等のリポペプチドも、本発明の医薬組成物中にアジュバントとして使用するのに適している。
医薬組成物は、局所的又は全身的に、好ましくは全身的に投与することができる。
用語「全身投与」は、作用物質が有意な量で個体の体内に広く分布された状態になり、所望の効果を発生させるような作用物質の投与を指す。例えば、作用物質は、血液中のその所望の効果を発生させることができ、且つ/又は血管系を介して作用のその所望の部位に到達する。典型的な全身経路の投与としては、血管系内に作用物質を直接導入することによる投与、又は経口、肺、若しくは筋肉内投与があり、作用物質は、吸着され、血管系に入り、血液を介して作用の1つ又は複数の所望の部位に運ばれる。
本発明によれば、全身投与は、非経口投与によるものであることが好適である。用語「非経口投与」は、作用物質が腸を通過しないような作用物質の投与を指す。用語「非経口投与」は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、又は動脈内投与を含むが、これらに限定されない。
投与は、例えば、経口的、腹腔内、又は筋肉内に実行することもできる。
本明細書に提供される作用物質及び組成物は、単独で、或いは慣例的な治療レジメン、例えば、手術、照射、化学療法、及び/又は骨髄移植(自己、同系、同種間、又は無関係)と組み合わせて使用することができる。
本発明は、以下の図面及び実施例によって詳細に記載され、これらは、例示目的でのみ使用されており、限定的であることを意味しない。本記載及び実施例により、本発明に同様に含まれるさらなる実施形態が、熟練労働者に利用可能である。
TCR-CD3複合体の表示である。細胞質内CD3免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)が円柱として示されている(「The T cell receptor facts book」、MP Lefranc、G Lefranc、2001から脚色)。 CARの連続する世代の設計を示す図である。CARの異なる世代の略図(1G、第1世代、2G、第2世代、3G、第3世代)。第1世代は、細胞傷害性を媒介する細胞外scFv及び細胞質CD3ζ鎖/ZAP70を含有し、第2世代は、増殖を促進するCD28/PI3Kを更に含有し、第3世代は、細胞生存を持続する4-1BB又はOX40/TRAFを更に含有する(Casucci、M.ら(2011) 2:378〜382)。 抗原に対するT細胞のリダイレクションのための異なる受容体フォーマットの略図である。左:抗原特異的scFv断片、IgG1由来スペーサードメイン、CD28共刺激及びCD3ζシグナル伝達ドメインからなる第2世代のCAR(CAR-28ζ);中央:scFvのマウスTCRβ鎖の定常ドメインとの連結及びマウスTCRα鎖の定常ドメインの同時発現に基づく新規CARフォーマット(CAR/Cα);右:TCRα/β鎖から構成されるマウスTCR(ミュー、マウスTCR)。 異なる量の抗原を認識した際のヒトCLDN6-特異的T細胞の増殖を示す図である。CFSE染色CLDN6-CAR操作CD8+ T細胞の増殖能を、示された量のCLDN6 IVT RNAをトランスフェクトした自己iDCとともに共培養した後に分析した。(A)滴定量のCLDN6 RNAをトランスフェクトしたiDC上のCLDN6発現を、Alexa-Fluor-647コンジュゲートCLDN6-特異的抗体(IMAB027、Ganymed社)で染色後、電気穿孔して約20時間後に分析した。細胞を単一細胞に対してゲーティングした。 (B、C、D)CLDN6-CAR又は対照CAR RNA若しくはRNA無し(モック)をトランスフェクトしたCD8+ T細胞上のCAR及びTCR表面発現を、蛍光色素コンジュゲートイディオタイプ特異的抗体で染色した後、CLDN6-CAR(B)又は対照CAR(C)を検出して分析した。マウスCLDN6-特異的TCRの表面発現を、マウスTCRベータ鎖特異的抗体で染色した後に査定した(D)。細胞を単一CD8+ Tリンパ球に対してゲーティングした。 (B、C、D)CLDN6-CAR又は対照CAR RNA若しくはRNA無し(モック)をトランスフェクトしたCD8+ T細胞上のCAR及びTCR表面発現を、蛍光色素コンジュゲートイディオタイプ特異的抗体で染色した後、CLDN6-CAR(B)又は対照CAR(C)を検出して分析した。マウスCLDN6-特異的TCRの表面発現を、マウスTCRベータ鎖特異的抗体で染色した後に査定した(D)。細胞を単一CD8+ Tリンパ球に対してゲーティングした。 (B、C、D)CLDN6-CAR又は対照CAR RNA若しくはRNA無し(モック)をトランスフェクトしたCD8+ T細胞上のCAR及びTCR表面発現を、蛍光色素コンジュゲートイディオタイプ特異的抗体で染色した後、CLDN6-CAR(B)又は対照CAR(C)を検出して分析した。マウスCLDN6-特異的TCRの表面発現を、マウスTCRベータ鎖特異的抗体で染色した後に査定した(D)。細胞を単一CD8+ Tリンパ球に対してゲーティングした。 (E)共培養して96時間後に、CD8+ T細胞のCFSE希釈液をフローサイトメトリーを使用して分析した。陽性対照:CLDN6-特異的TCRをトランスフェクトしたCD8+ T細胞;陰性対照:RNA無しをトランスフェクトしたCD8+ T細胞(モック);対照CAR RNAをトランスフェクトしたCD8+ T細胞。 (F)CLDN6 IVT RNAトランスフェクト自己iDC 5μgとともに共培養した後の受容体トランスフェクトT細胞のFACS分析の代表的ドットプロットが示されている。数値は、親集団のパーセンテージを示す。 マウスT細胞上のCLDN6特異的CAR構築物の表面発現を示す図である。脾細胞に、CLDN6-CAR、対照CAR、又はeGFP導入遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを形質導入した。第2の形質導入工程の4時間後に、すべてのCAR分子をこれらの特異性と無関係に認識するAPC-Cy7コンジュゲート抗CD4、PE-Cy7コンジュゲートCD8、PEコンジュゲート抗ヒトIgG、及びそれぞれのCAR分子を認識したDyLight650コンジュゲート抗イディオタイプCLDN6 CAR(B)又はAlexaFluor647コンジュゲート抗イディオタイプ対照CAR(C)抗体で細胞を染色した。一般的なゲーティングストラテジーが(A)に示されている。数値は、親集団のパーセンテージを示す。 マウスCAR形質導入T細胞の、これらのそれぞれの抗原を認識した際の抗原特異的増殖能を示す図である。CFSE染色CAR形質導入T細胞を、特異的な又は無関係の抗原トランスフェクトBMDC(E:T比8:1)とともに共培養し、陰性対照として、T細胞をBMDC無しで培養した。48時間後、細胞を回収し、CLDN6-CAR形質導入(A)及び対照CAR形質導入(B)T細胞のCFSE染色を、フローサイトメトリーを使用して測定した。数値は、親集団の拡大された細胞のパーセンテージを示した(単一細胞ゲート)。 RNA(Lip)ワクチン接種後の免疫適格性マウスにおけるCLDN6-CAR T細胞の抗原特異的in situ拡大を示す図である。BALB/c-マウス(n=12/群)に、5×106個のCLDN6-CAR-effLuc-GFP又は対照CAR-effLuc-eGFP形質導入BALB/c-Thy1.1+ T細胞をそれぞれi.v.移植した。ACTの1日後(1日目)、各群中の半分のマウス(n=6)を、CLDN6 RNA 25μgを含むRNA(F12-Lip)でi.v.処置し、一方他方の半分を対照抗原RNA 25μgを含むRNA(Lip)で処置した。両実験群(CLDN6-CARのACT対対照CAR-T細胞)において、非標的抗原コードRNA(Lip)で処置したマウスは、陰性対照として機能を果たした。in vivo発光強度を、ACTの1時間後(0日目)及び72時間後(3日目)に測定した。(A)実験セットアップの概略の全体像。 (B)ACT及び示したRNA(Lip)での処置後の様々な時点における側臥位のマウスの生物発光イメージング(BLI)。退色した画像は、グレースケール参照写真上に重ね合わされた光強度(黒色、最も弱い;白色〜最大で暗灰色、最も強い)を表す。 (C)RNA(Lip)処置後3日目(CAR T細胞拡大のピーク)に、マウスの発光を査定した(平均±SEM)。異なる処置群の発光の差異を、ウェルチ補正を含む両側t-検定を使用して分析した。 RNA(Lip)ワクチン接種によるCAR T細胞のin vivo拡大は、RNAの量に依存することを示す図である。CLDN6 RNAを含む異なる用量のRNA(Lip)を、図7に記載したようにACTの1日後にThy1.1+ CLDN6-CAR T細胞を移植したBALB/cマウス(n=4/群/RNA量)にi.v.注射によって施した。CLDN6-CAR T細胞を受けたが、RNA(Lip)を受けなかったBALB/cマウス(n=2)は、対照として機能を果たした。CLDN6-CAR T細胞の拡大を、ルシフェラーゼベース生物発光イメージングを使用してin situで、及びフローサイトメトリーを使用してACT後3日目に末梢血中で監視した。(A)ACT及び示したRNA(Lip)での処置後の様々な時点での側臥位におけるマウスの生物発光イメージング。退色した画像は、グレースケール参照画像上に重ね合わされた光強度(黒色、最も弱い;白色〜最大で暗灰色、最も強い)を表す。 (B)in vivo生物発光データの時間経過(n=4、対照群n=2;平均±SEM)。 (C)養子移入Thy1.1+ T細胞の頻度並びにこれらの細胞のCD4及びCD8 T細胞組成を、PerCPコンジュゲートマウスCD90.1/Thy1.1、APC-Cy7コンジュゲートマウスCD4、及びPE-Cy7コンジュゲートマウスCD8αモノクローナル抗体を使用して、ワクチン接種の48時間後に末梢血中でフローサイトメトリーによって査定した。各処置について、代表的なゼブラプロット及びドットプロットが示されている。数値は、親集団のパーセンテージを示す(D及びE)。すべてのマウスのフローサイトメトリー結果が要約されている(平均±SD)。 (C)養子移入Thy1.1+ T細胞の頻度並びにこれらの細胞のCD4及びCD8 T細胞組成を、PerCPコンジュゲートマウスCD90.1/Thy1.1、APC-Cy7コンジュゲートマウスCD4、及びPE-Cy7コンジュゲートマウスCD8αモノクローナル抗体を使用して、ワクチン接種の48時間後に末梢血中でフローサイトメトリーによって査定した。各処置について、代表的なゼブラプロット及びドットプロットが示されている。数値は、親集団のパーセンテージを示す(D及びE)。すべてのマウスのフローサイトメトリー結果が要約されている(平均±SD)。 (C)養子移入Thy1.1+ T細胞の頻度並びにこれらの細胞のCD4及びCD8 T細胞組成を、PerCPコンジュゲートマウスCD90.1/Thy1.1、APC-Cy7コンジュゲートマウスCD4、及びPE-Cy7コンジュゲートマウスCD8αモノクローナル抗体を使用して、ワクチン接種の48時間後に末梢血中でフローサイトメトリーによって査定した。各処置について、代表的なゼブラプロット及びドットプロットが示されている。数値は、親集団のパーセンテージを示す(D及びE)。すべてのマウスのフローサイトメトリー結果が要約されている(平均±SD)。
本明細書で使用される技法及び方法が、本明細書に記載されており、又はそれ自体公知の様式で、且つ例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Yに記載されているように実行される。キット及び試薬の使用を含むすべての方法は、具体的に示されていない限り、製造者の情報に従って実行される。
(実施例1)
材料及び方法
末梢血単核細胞(PBMC)、単球、及び樹状細胞(DC)
PBMCは、フィコール-ハイパック(Amersham Biosciences社、Uppsala、Sweden)密度勾配遠心分離によってバフィーコートから単離した。単球は、抗CD14マイクロビーズ(Miltenyi Biotech社、Bergisch-Gladbach、Germany)で濃縮した。未成熟DC(iDC)は、Kreiterら(2007)、Cancer Immunol. Immunother.、CII、56、1577〜87に記載されているようにサイトカイン補充培養基で5日間単球を分化させることによって得た。
脾臓細胞の単離及び活性化
ナイーブC57Bl6マウスの脾細胞を単離し、1*107個を培養基(RPMI1640)中に移し、2μg/ml 抗CD3(eBioscience社)、1μg/mL 抗CD28(Novus Biologicals社)、並びに5ng/mL組換えヒト(rh)IL-7及び10ng/mL rh IL-15(Miltenyi社)で予備活性化した。
マウス脾細胞のレトロウイルス形質導入
非組織プレート(non tissue plate)を、2.1μg/cm2 RetroNectin(Clontech社)で4℃にて一晩コーティングした。コーティング後、RetroNectinを除去し、次いで、各ウェルについてPBS/2% BSA[w/v]500μlで室温にて30分ブロックした。BSA溶液を除去し、ウェルをPBSで1回洗浄した。PBSを、CLDN6-CAR、対照-CAR、又はeGFP導入遺伝子を含有するレトロウイルス(MLV-E)ベクターと置き換え、プレートを1300×gで15分遠心分離した。このプロセスを、新鮮なウイルス培養上清を用いて更に2回繰り返した。次いでウェルをPBSで慎重にフラッシュした後、1×106個の24時間予備活性化したマウス脾細胞をコーティングしたウェル上でインキュベートした。4時間インキュベートした後、ウイルス上清を添加し、スピン形質導入を300×g 37℃で実施し、細胞をインキュベーター内で追加の1時間インキュベートした後、ウイルス上清を5ng/mLのIL-7及び10ng/mLのIL-15を含有する培養基と置き換えた。全形質導入手順を1日後に繰り返した。第2の形質導入工程の後、ウイルス上清を、新たな培養基によって置き換えた。CFSEベース増殖アッセイについて、細胞を単離後7日目に回収し、フィコール-Paque PREMIUM(1.084)でフィコール浄化した後、CFSE染色を行った。
in vitro転写(IVT)RNAの生成及び細胞内への移入
IVT RNAの生成を以前に記載されたように実施し(Holtkamp, S.ら(2006)、Blood 108、4009〜4017)、示した量のIVT RNA(マウスBMDC内にCLDN6又は対照抗原:6μg;ヒトT細胞内にCAR:15〜20μg;ヒトT細胞内にTCR:各鎖20μg;iDC内にCLDN6又はgp100:10μg)を予め冷却した4-mmギャップ滅菌電気穿孔キュベット(Peqlab社)内のX-VIVO 15培地(Lonza社、Basel、Switzerland)250μL中に懸濁した細胞に添加した。電気穿孔は、ECM830矩形波電気穿孔システム装置(BTX)(マウスBMDC:400V、3ms、1パルス、ヒトT細胞 500V、3ms、1パルス、ヒトiDC:300V、12ms、1パルス)で実施した。
CFSEベース増殖アッセイ
マウス細胞を5μM CFSEで標識し、ヒトT細胞を0.8μMで標識した。標識細胞を洗浄し、示したエフェクター標的比でIVT-RNAトランスフェクト細胞APC(例えば、BMDC又はiDC)とともに共培養した。共培養の2日後又は4日後に、細胞を回収し、増殖を細胞分裂後の娘細胞内のCFSE蛍光の段階的半減に基づいてフローサイトメトリーによって分析した。
フローサイトメトリー分析
形質導入CARの細胞表面発現を、scFv断片を認識する蛍光色素コンジュゲートイディオタイプ-特異的抗体(Ganymed pharmaceuticals社)及びIgG1-リンカー(すべてのCAR構築物中に含有される)を認識するヒトIgG-PE抗体を使用して分析した。CLDN6の細胞表面発現を、Alexa-Fluor-647コンジュゲートCLDN6特異的抗体IMAB027(Ganymed pharmaceuticals社)を使用して実施した。フローサイトメトリー分析を、FACS Divaソフトウェア(BD Biosciences社)を使用してFACS CANTO IIフローサイトメーターで実施した。
動物
マウスは、市販の提供者から購入した。年齢(8〜10週齢)及び性別(雄又は雌)の一致した動物を実験全体にわたって使用した。
養子T細胞移入のためのレトロウイルス遺伝子マニピュレーション及びCAR T細胞の調製
ナイーブBALB/c-Thy1.1+の脾細胞を単離し、5ng/mL rh IL-7及び1.5〜10ng/mL rh IL-15(Miltenyi社)の存在下で2μg/mL コンカナバリンA(Sigma-Aldrich社)によって予備活性化した。予備活性化した細胞を、セクション「マウス脾細胞のレトロウイルス形質導入」に記載したように形質導入した。対照CAR又はCLDN6-CARを含有するレトロウイルスベクターは、高感度ホタルルシフェラーゼ(effLuc; Rabinovich B.A.ら(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105、14342〜14346)及びeGFP(高感度緑色蛍光タンパク質)レポーター遺伝子を同様にコードし、これらは、「自己切断型」T2A-エレメント(Szymczak A.L.ら(2004) Nat. Biotechnol. 22、589〜594)を使用して別個に発現された。フィコール浄化後、細胞をPBSで2回洗浄して血清タンパク質を除去し、次いで養子細胞移入(ACT)のために調製した。
リポソーム製剤化IVT RNA(RNA(Lip))の生成
異なる量のCLDN6又は対照IVT RNAを、WO2013/143683に以前に記載されたように、DOTMA/DOPE(1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン/1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(2:1 mol:mol))を含むF12-リポソームと複合体形成させた。
マウス実験
200μL中の5×106個のCAR-T2A-effLuc-T2A-eGFP形質導入BALB/c-Thy1.1+ T細胞を、各BALB/cドナーマウス中に静脈内(i.v.)移入した。引き続いて、マウスに養子T細胞移入(ACT)の24時間後に1.3:2のF12:RNA比のRNA(Lip)をi.v.ワクチン接種した。末梢血供与及び全身生物発光イメージングを実施した。
in vivoルシフェラーゼイメージング(BLI)
CAR-effLuc-GFP形質導入T細胞の拡大及び分布を、IVIS Luminaイメージングシステム(Caliper Life Sciences社)を使用してin vivo生物発光イメージングによって評価した。簡単に言えば、D-ルシフェリンの水溶液(80mg/体重1kg; Perkin Elmer社)を、ACTの1時間(0日目)、72時間(3日目)、及び96時間(4日目)後にi.p.注射した。その5分後に、放出された光子を定量化した(1分の積分時間)。目的の領域(ROI)内のin vivo生物発光を、IVIS Living Image 4.0ソフトウェアを使用して平均放射輝度(光子/秒/cm2/sr)として定量化した。動物内のルシフェラーゼ発現細胞に由来する透過光の強度を、グレースケール画像として表した。ここで黒色は、最も弱く、白色から暗灰色は、最も強い生物発光シグナルである。マウスのグレースケール参照画像は、LED低光照射下で得た。画像を、Living Image 4.0ソフトウェアを使用して重ね合わせた。
マウスの末梢血のフローサイトメトリー
移入Thy1.1+ T細胞の細胞組成を、低張性を用いて溶解した末梢血試料(ACK緩衝液;GIBCO社)中でACTの72時間後(3日目)に査定した。マウスCD90.1/Thy1.1(BD Pharmingen社)、CD8α(eBioscience社)、及びCD4(BD Pharmingen社)を検出する蛍光色素結合モノクローナル抗体を使用した。フローサイトメトリーデータを、FACS-Canto II分析用フローサイトメーターで取得し、FlowJo X(Tree Star社)ソフトウェアを使用することによって分析した。
(実施例2)
in vitroでのIVT RNAパルスAPCを用いたCAR操作T細胞の拡大
患者におけるCAR操作T細胞の増殖及び持続性に重要な必要条件は、血液悪性腫瘍におけるCD19特異的CARの有望な臨床トライアルによって実証されたように、抗原の存在である。MHC-ペプチド複合体によるTCR刺激を介したRNA免疫化による内在性T細胞の拡大に類似して、本発明者らは、養子移入CAR T細胞を、標的細胞のリポソーム媒介RNA-ワクチン接種を使用して拡大して、CAR T細胞刺激のための天然の表面発現抗原をもたらすことができるか否かを分析したいと望んだ。このような「切り換え」は、少量のCAR操作T細胞を患者中に最初に移すことを可能にすることができる。この移入が患者において重度の副作用をもたらさない場合、操作されたT細胞を、リポソーム製剤化RNAを用いて拡大することができる。更に、この方法は、一部の状況において、養子T細胞移入のための空間を人工的に作る化学療法を回避するための腫瘍患者の機会であり得る。
本発明者らは、腫瘍抗原CLDN6を特異的に標的にするCARについてのin vitroでの拡大概念を評価した。CLDN6-CARは、それぞれCD3ζ及びCD28のシグナル伝達及び共刺激部分を含有する古典的な第2世代CARを代表する。CD28エンドドメイン内のlck結合部分の欠失は、CARエンゲージメントの際のIL-2分泌を阻止して調節性T細胞の誘導を防止する(Kofler D.M.ら、(2011) Molecular Therapy 19(4)、760〜767)。CARの細胞外部分内のIgG1 Fc「スペーサー」ドメインの修飾は、自然免疫応答の「標的外」活性化及び意図されない開始を回避する(Hombach A.ら、(2010) Gene Therapy 17、1206〜1213)。
第1に、本発明者らは、CAR操作ヒトT細胞も、RNAトランスフェクト標的細胞を使用して拡大してCAR T細胞刺激のための天然CLND6をもたらすことができるか否かを分析したいと望んだ。CFSEベースin vitro共培養アッセイを、滴定量のCLDN6 IVT RNAをトランスフェクトした自己iDCと一緒にCLDN6-CAR-RNAトランスフェクトヒトCD8+ T細胞を使用して実施した。得られた用量依存的CLDN6表面発現を、CLDN6特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって査定した(図4A)。陽性対照として、CD8+ T細胞にHLA-A*0201制限CLDN6特異的マウスTCRをコードするRNAをトランスフェクトし、陰性対照として、対照CARを含めた。トランスフェクトCAR及びTCRの表面発現を、イディオタイプ特異的及びマウスTCRベータ特異的抗体で染色した後に分析した(図4B、C、D)。共培養の4日後に、CLDN6発現iDCに応答したすべての受容体トランスフェクト及びCFSE標識CD8+ T細胞の抗原特異的増殖を、フローサイトメトリーによってCFSE蛍光の段階的半減に基づいて分析した。CLDN6-CARは、低抗原濃度(1μgのCLDN6 RNA;95%)でさえも、CLDN6トランスフェクト標的細胞に応答してほどんどすべてのCD8+ T細胞の増殖を媒介した。増殖するCLDN6-CAR T細胞のパーセンテージは、約90%を占める陽性対照として機能を果たしたCLDN6-TCRトランスフェクトT細胞の割合より高くさえあり、一方、対照CARは、CLDN6抗原接触の際に増殖を誘導しなかった(図4E、F)。
この結果は、CAR分子は、RNAトランスフェクトiDC、RNAワクチン接種後にin vivoでリンパ節内のRNA取込みを主に担う細胞集団とともに共培養した後、in vitroでT細胞の増殖を強く誘導することができることを確認した。
本発明者らのストラテジーをin vivo実験に移行させるために、本発明者らは、第1に、同様の実験セットアップを使用してマウスCLDN6-CAR発現T細胞の増殖能を分析した。その目的に向けて、C57Bl/6マウスの脾細胞に、CLDN6-CAR若しくは対照CARを含有し、又は導入遺伝子を含有しないレトロウイルスベクターを形質導入した。
CARは、MHC又はHLA非依存性scFv媒介抗原結合をもたらすので、これらは、CD4+及びCD8+ T細胞の両方において機能的である。したがって、本発明者らは、マウス脾細胞上の両方のCARをレトロウイルス形質導入した後のCD4+及びCD8+ T細胞上のCAR表面発現を最初に分析した(図5)。両分子は、CAR-特異的抗体(遍在的に存在したIgG1-Fcスペーサー領域を認識する抗イディオタイプ特異的抗体及びPAN-CAR抗体)を使用してCD4+及びCD8+ T細胞の表面上で検出することができる。CFSEベースin vitro増殖アッセイを、CLDN6又は対照RNAトランスフェクトBMDCと一緒にCLDN6-CAR又は対照CAR形質導入脾細胞を使用して実施した(図6)。CLDN6-CARは、CLDN6トランスフェクト標的細胞に応答して強い増殖性質を示し(約78%)、一方、対照CARによって認識される抗原を発現した標的細胞の認識の際に増殖は観察されなかった。逆の場合も同様に、対照CARは、それぞれの抗原を発現する標的細胞にもっぱら応答して形質導入T細胞の増殖を開始し(55.4%)、一方、CLDN6発現標的細胞の共培養後に増殖は観察することができなかった。
この結果は、in vitroでのマウスT細胞内のCLDN6-CARの機能性を確認し、マウスCLDN6-CAR T細胞が、RNA移入後にヒトCLDN6抗原を発現するマウスBMDCに応答して強く増殖することができることを実証した。これは、同系動物モデルにおけるリポソーム製剤化RNAワクチン接種と組み合わせたマウスCAR発現T細胞の養子移入を使用するin vivo環境での本発明者らの提案したストラテジーを試験するための基礎をもたらす。
(実施例3)
in vivoでのIVT RNAパルスAPCを用いたCAR操作T細胞の拡大
生理的な設定においてこの画期的な概念を試験するために、本発明者らは、完全に免疫適格性であり、したがって、患者の免疫状態をより密接に反映し、移入CAR T細胞の持続性の分析を可能にする同系マウスモデルを確立した。
抗原、例えば、CLDN6コード、リポソーム製剤化RNA(RNA(Lip))を、制御された様式で、in vivoでCAR T細胞を拡大するのに使用するものとする。RNA(Lip)は、二次リンパ器官、特に脾臓においてDC様APCを選択的に標的にする。CAR-T細胞のRNA(Lip)取込み後にCLDN6を異所性に発現するAPCとの相互作用は、in situで天然の共刺激を提供することによって適切なCAR-T細胞活性化及び増殖を支持することが予期される。in vivoでCAR-T細胞の拡大及び運命を促進するために、pES12.6-CLDN6-CARベクター及び対照CARベクターを、それぞれのCARの下流の、ウイルスT2A配列により隔てられたルシフェラーゼ(effLuc)及びeGFPレポーター遺伝子を発現するように修飾した。注目すべきことに、CLDN6-CAR及び対照CARの表面発現及び抗原特異性は、CAR形質導入マウスT細胞内のルシフェラーゼ及びGFPの同時発現によって有意に影響されなかった(データを示さず)。
BALB/cマウスに、先にリンパ枯渇させることなく5×106個のCAR-レポーター形質導入コンジェニックThy1.1+マウスバルクT細胞(約2.5×108細胞/体重1kg)を移植した。ヒトCLDN6又は対照RNA 25μgを含有するRNA(Lip)200μLを、養子CAR-T細胞移入の1日後にマウス中に眼窩後方投与した(図7A)。次いでCAR-T細胞を、マウス1匹当たりD-ルシフェリン溶液1.66mgを腹腔内投与することによってin vivoで追跡した。ACTの1時間後に、CAR-T細胞のほとんどは、既に脾臓内に見いだされた。ACTの3日後の生物発光イメージングによって検出した場合、トータルフラックスの有意な(最大で6倍)の増大が、RNA(Lip)25μgでの処置によって誘導された(図7B+C)。この効果は、CLDN6コードRNA(Lip)で処置した後にCLDN6-CAR T細胞を受けたマウス、及び対照RNAコードRNA(Lip)で処置した後に対照CAR-R細胞を受けたマウスについて観察されたが、それぞれの対照群において観察されなかった。これらのデータは、CAR-T細胞を高度に抗原特異的な様式でin situで順調に拡大することができることを実証する。更に、体重及び全身の健康状態の変化についてのマウスの臨床監視は、CAR-T細胞移入及び後続のRNA(Lip)での処置のいずれの明白な負の効果も明らかにしなかった(データを示さず)。
CAR-T細胞を、それぞれの抗原をコードするRNA(Lip)を使用してin situで順調に拡大することができることを実証した後(原理証明)、本発明者らは、この効果が用量応答試験において使用されるRNA(Lip)の量と相関するか否かを調査した。この目的のために、CLDN6-CAR形質導入マウスThy1.1+T細胞移植BALB/cマウスを、CLDN6-RNA(Lip)0.4〜25μgで処置した(上述した通り)。CLDN6-CAR T細胞の用量依存的拡大を、BLIを介してin situで観察することができた。低用量のCLDN6コードRNA(0.4〜1μg/マウス)の投与でさえも、非処置群と比較してマウスにおいて発光が増大した(図8 A+B)。RNA(Lip)ワクチン接種後の生物発光の変化に加えて、養子移入CLDN6-CAR Thy1.1+T細胞の頻度は、非ワクチン接種マウスと比較してACTの3日後に末梢血中で約4.2倍の増大を示した(ワクチン接種無し:0.63±0.09% Thy1.1+ T細胞;25μgのCLDN6-RNA(Lip)-ワクチン接種:2.65±0.38% Thy1.1+ T細胞;平均±SD)(図8 C+D)。末梢血中で検出された拡大されたThy1.1+T細胞は、CD4+ T細胞が優勢である非ワクチン接種マウスと比較して、主に細胞傷害性CD8+ CAR-T細胞、即ち、患者において抗腫瘍機能を直接的に実行することができる細胞型であった(図8E)。亜集団の変化は、明確に濃度依存性であった。
これらのデータは、RNA(Lip)技術を使用して患者において直接的にCAR-T細胞拡大を制御したアイデアが実現可能であることを強く支持する。

Claims (34)

  1. 哺乳動物において抗原を発現する標的細胞集団又は標的組織に対する免疫応答を提供するための方法であって、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞を哺乳動物に投与する工程と、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与する工程とを含む方法。
  2. 免疫応答が、T細胞媒介免疫応答である、請求項1に記載の方法。
  3. 免疫応答が、抗腫瘍免疫応答であり、標的細胞集団又は標的組織が、腫瘍細胞又は腫瘍組織である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 抗原の発現又は発現の上昇に関連した疾患、障害、又は状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、抗原を標的にしたキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾されたT細胞を哺乳動物に投与する工程と、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を投与する工程とを含む方法。
  5. 疾患、障害、又は状態が、がんである、請求項4に記載の方法。
  6. 抗原が腫瘍抗原である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 抗原が、クローディン、例えば、クローディン18.2及びクローディン6等、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、メソテリン、CEA、c-Met、PSMA、GD-2、並びにNY-ESO-1からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 抗原が病原体抗原である、請求項1、2、及び4のいずれか一項に記載の方法。
  9. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、哺乳動物の細胞内で発現されて抗原又はそのバリアントをもたらす、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 抗原又はそのバリアントの発現が、細胞表面におけるものである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、哺乳動物の細胞内で一過性に発現される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、RNA、好ましくはin vitroで転写されたRNAである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び/又は抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、全身に投与される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、脾臓内での抗原又はそのバリアントの発現が起こる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞内での抗原又はそのバリアントの発現が起こる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 抗原提示細胞が、樹状細胞、マクロファージ、及びB細胞からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
  17. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、肺及び/又は肝臓内での抗原又はそのバリアントの発現が起こらず、又は本質的に起こらない、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸を全身投与した後、脾臓内での抗原又はそのバリアントの発現が、肺内での発現の量の少なくとも5倍である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、哺乳動物の細胞内で発現されて、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞による結合のための抗原又はそのバリアントをもたらし、前記結合が、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞の刺激、プライミング、及び/又は拡大をもたらす、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、粒子中等の送達ビヒクル中に製剤化される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 送達ビヒクルが、少なくとも1種の脂質を含む、請求項20に記載の方法。
  22. 少なくとも1種の脂質が、少なくとも1種のカチオン性脂質を含む、請求項21に記載の方法。
  23. 脂質が、抗原又はそのバリアントをコードする核酸と複合体を形成し、且つ/又はそれを封入する、請求項21又は22に記載の方法。
  24. 脂質が、抗原又はそのバリアントをコードする核酸を封入するベシクル中に含まれる、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 抗原又はそのバリアントをコードする核酸が、リポソーム中に製剤化される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 哺乳動物から細胞の試料を得る工程であって、試料は、T細胞又はT細胞前駆体を含む、工程と
    細胞にCARをコードする核酸をトランスフェクトして、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞をもたらす工程と
    を更に含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞が、CARをコードする核酸を安定に又は一過性にトランスフェクトされる、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. T細胞及び/又は細胞の試料が、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸が投与される哺乳動物由来である、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
  29. T細胞及び/又は細胞の試料が、CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸が投与される哺乳動物と異なる哺乳動物由来である、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
  30. CARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞が、内在性T細胞受容体及び/又は内在性HLAの発現について不活化されている、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
  31. CARが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びT細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 抗原結合ドメインが、抗原に対するモノクローナル抗体のscFv配列を含む、請求項31に記載の方法。
  33. 抗原を標的にしたCARをコードする核酸又は抗原を標的にしたCARを発現するように遺伝的に修飾されたT細胞、及び抗原又はそのバリアントをコードする核酸を含むキット。
  34. 請求項1から32のいずれか一項に記載の方法におけるキットの使用のための指示書を更に含む、請求項33に記載のキット。
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