JP2018506530A - 脊柱軟膜下遺伝子送達システム - Google Patents

Abstract

送達デバイス、システム、およびその関連方法は、ヒトにおける細胞、薬剤またはベクターの脊柱送達のために用いられ得る。そのため、システムにより軟膜下送達が可能になり、その結果、白質および灰白質双方におけるほとんど完全な脊柱実質ＡＡＶ９−媒介遺伝子発現またはＡＳＯ分配が得られる。

Description

［関連出願への相互参照］
本出願は、米国特許庁における米国仮出願第６２／１１０，３４０号（出願日：２０１５年１月３０日）からの優先権の恩恵を主張する。本明細書中、同文献全体を参考のため援用する。

本発明は、主に遺伝子治療に関し、より詳細には、哺乳動物の軟膜下空間内へ遺伝子およびオリゴヌクレオチドを送達させ、その脊柱トランス実質感染をもたらすための方法およびシステムに関する。

ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）を脊柱実質中へ送達するための現在用いられているアプローチには、２つの技術があるが、、各々が、本発明と比較して実質的な欠点がある。

第１には、髄腔内送達は、ベクターまたはＡＳＯを脊柱髄腔内空間（すなわち、軟膜外）内に注入する際に用いられる。このアプローチを用いた場合、ＡＡＶ９送達後、深い実質導入遺伝子トランスジーン発現はみられない。軟膜はＡＡＶ９に対して不透過性であるため、Ａ−運動ニューロンおよび一次求心神経の亜集団のみが感染する。ＡＳＯの髄腔内送達の結果、ＡＳＯが良好に脊柱柔組織に浸透し得る場合もあるものの、脊髄全体（すなわち、頸部から仙骨断片の範囲）を通して１ＡＳＯがみられる。そのため、髄腔内送達の場合、ＡＳＯのセグメント限定分布を達成することができていない。

第２には、直接的な脊柱実質注入が用いられ得る。このアプローチを用いることにより、セグメント特異的なトランスジーン発現またはＡＳＯ分布を脊柱柔組織において達成することができる。しかし、この技術は直接脊柱実質への針浸透が必要となるため、その侵襲性が欠点である。

そのため、白質および灰白質の双方において、ほとんど完全な脊柱実質ＡＡＶ９−媒介遺伝子発現またはＡＳＯ分布を可能にする軟膜下送達システムが必要とされている。

中枢神経系における遺伝子特異的なサイレンシングまたはアップレギュレーションを達成するためのＡＡＶ系ベクターの有効なインビボ使用は、臨床的関連性が最も高い送達経路（すなわち、静脈内または髄腔内）を用いた成体動物における限られた深い実質発現以上のものを提供できないために制限されている。そのため、本発明によれば、脊柱軟膜は、髄腔内ＡＡＶ９送達後に脊柱柔組織中への有効なＡＡＶ９浸透を制限する一次バリアに相当することが実証された。そのため、本発明は、大型動物およびヒトの脊柱柔組織中への遺伝子およびオリゴヌクレオチドの送達のための方法およびシステムを提供する。

よって、一実施態様において、本発明は、対象における核酸分子の脊柱トランス実質感染の方法を提供する。本方法は、対象の軟膜下空間へ核酸分子を投与することを含む。対象は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。多様な実施形態において、投与ステップは、対象の脊椎の脊髄分節を露出させること、脊髄分節内に軟膜開口部を設けること、カテーテルを軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させること、および核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させることを含む。軟膜開口部は、軟膜にＬ字型形状のステンレススチールチューブを穿刺することによって設けることができ、カテーテルは、チューブを通じて軟膜下空間内へ前進させられる。多様な実施形態において、核酸分子は、約１〜１０％のデキストロースを含む混合物で投与される。多様な実施形態において、核酸分子は、ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ベクター（例えば、ＡＡＶ９粒子）であり得る。特定の実施形態において、ベクターは、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病など）を調節または治療するタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする核酸分子を含む。

特定の実施形態において、核酸分子は、単回注入として送達される。特定の実施形態において、方法は、さらに、対象の脊椎の別の脊髄分節中への核酸分子の１回以上の第２の軟膜下注入を投与することを含む。特定の実施形態において、方法は、さらに、核酸分子の１回以上の髄腔内注入を対象に投与することを含む。

別の実施態様において、本発明は、遺伝子送達システムを提供する。本システムは、対象の軟膜を穿刺するように構成されたＬ字型形状のガイドチューブと、ガイドチューブ内にスライド可能に配置されかつ対象の脊椎の脊髄分節の軟膜下空間内へ前進させられるように構成されたカテーテルと、カテーテルと流体連通しかつ核酸分子を含む組成を含むリザーバとを含む。多様な実施形態において、Ｌ字型形状のガイドチューブは、１６−２６Ｇステンレススチールチューブであり得、カテーテルは、ポリエチレンチュービング（例えば、ＰＥ−５またはＰＥ−１０）から形成され得る。

別の実施態様において、本発明は、核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させる方法を提供する。本方法は、対象の脊椎の脊髄分節を露出させること、脊髄分節内に軟膜開口部を設けること、脊髄分節の上方に本明細書中に記載の遺伝子送達システムを位置決めすること、カテーテルを軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させること、および核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させることを含む。多様な実施形態において、核酸分子は、約１〜１０％のデキストロースを含む混合物中に入れられて送達される。核酸分子は、ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ベクターである（例えば、ＡＡＶ９粒子）。対象は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。

軟膜下ＡＡＶ９送達および巨視的に規定された脊髄表面トランスジーン発現を示す図であり、ブタ中の脊髄、髄膜および軟膜下に配置されたＰＥ−１０カテーテルの模式図である。 軟膜下ＡＡＶ９送達および巨視的に規定された脊髄表面トランスジーン発現を示す図であり、鋭利な軟膜穿刺先端（インサート）を備えたカテーテル誘導チューブ（１８Ｇ）を示す。この軟膜穿刺先端（インサート）は、軟膜を穿刺することと、ＰＥ−１０カテーテルを軟膜下空間内へ前進させることとのために用いられる。 軟膜下ＡＡＶ９送達および巨視的に規定された脊髄表面トランスジーン発現を示す図であり、軟膜下空間内へのカテーテルの配置の前進を示す図である。先ず、硬膜を切断して開口させ（１Ｃ）、カテーテルを軟膜下空間内へ前進させる（１Ｄおよび１Ｅ）。軟膜下空間内へ注入された気泡が確認できる（１Ｄ−星印）。 軟膜下ＡＡＶ９送達および巨視的に規定された脊髄表面トランスジーン発現を示す図であり、１Ｆおよび１Ｇは、表面ＧＦＰ蛍光デンシトメトリーであり、腰部軟膜下注入の中心点においてみられる最高ＧＦＰ蛍光を用いたブタ脊髄およびラット脊髄双方における高信号を示す。脊髄柔組織中の高ＲＦＰ蛍光の存在が、ブタ胸脊髄中に巨視的に検出されている（１Ｈおよび１Ｊ）。前根における明確な高レベルのＲＦＰ発現も確認できる（１Ｈ−インサート）。脊髄への注入を行わなかった対照サンプルにおいては、蛍光がみられないことが分かる（１Ｉ）。 軟膜下空間内へのＰＥ−１０カテーテルの挿入と、脊柱柔組織全体およびＡＡＶ９注入分節から遠位方向に突出する軸索におけるＧＦＰ発現とを示す図である。 成体ブタにおける単回ボーラス軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰ注入後の有効な実質ＡＡＶ９媒介トランスジーン発現を示す図である。３Ａおよび３Ｂは、ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＧＦを事前に６週間注入したブタの胸中部脊髄から採取された水平脊髄切片を示す。白質および灰白質を含む領域全体において、高ＲＦＰ発現を確認することができる。ＮｅｕＮ抗体（緑色）を用いて染色したところ、実質的に全てのニューロンもＲＦＰ陽性であることが分かった。３Ｃ〜３Ｇは、軟膜下注入領域から採取された横断脊髄切片の画像を示し、脊椎（ＤＦ）横（ＬＦ）および前（ＶＦ）索における横方向に切断されたＲＦＰ＋軸索（ボックスインサート）を示す。ＲＦＰ発現がＧＦＡＰ染色星状細胞（インサート；ＲＦＰ／ＧＦＡＰ）においてもみられる。ＲＦＰ発現運動ニューロン周囲の高密度ＲＦＰ＋神経線維末端（３Ｄおよび３Ｅ）および介在ニューロン（３Ｆおよび３Ｇ）がみられる。（スケールバー：３Ａ〜３Ｃ＝５００μｍ；３Ｄ、３Ｆ＝３０μｍ）。 ブタにおける胸中部軟膜下ＡＡＶ９注入後の腰部脊髄中の下方運動軸索における強力なＧＦＰ発現を示す。４Ａおよび４Ｂは、事前に６週間にわたって胸中部軟膜下空間内への軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入を行った後に腰部脊髄から採取された横断脊髄切片を示す。横（ＬＦ）および前（ＶＦ）索中の横断切断軸索中の高ＧＦＰ発現がみられる（白色の星印）。脊椎索中において、比較的低密度のＧＦＰ＋軸索が確認された（ＤＦ）。対応して、高密度のＧＦＰ＋運動軸索が、後角（ＤＨ）と前角（ＶＨ）との間において局所化した灰白質中へ突出していることが分かる。４Ｃは、ｓｈｏｗｓａより高解像度の共焦点画像であり、中央灰白質中のＧＦＰ＋軸索および神経線維末端の極めて微細な分枝を示す。（スケールバー：４Ａ＝１０００μｍ；４Ｃ＝３０μｍ）、（ＤＨ−後角、ＶＨ−前角、ＤＦ−脊椎索、ＬＦ−横索、ＶＦ−前索）。 ５Ａ〜５Ｌは、成体ブタにおける軟膜下胸中部ＡＡＶ９送達後の脳運動中枢中の逆行性輸送−媒介ＧＦＰ発現を示す図である。５Ａ〜５Ｅは、胸中部における単一ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後におけるブタの運動皮質中の逆行ラベル付けされたピラミッドニューロンを示す。５Ｆ〜５Ｊは、脳幹中に局所化したニューロン中の同等レベルのＧＦＰ発現を示す。５Ｋは、延髄（錐体）中の大型の逆行ラベル付けされた運動ＧＦＰ＋軸索の存在を示す。５Ｌは、網様体中の高密度の順行ラベル付けされた知覚求心神経を示す（スケールバー：５Ａ〜５Ｅおよび５Ｇ〜５Ｊ＝５０μｍ；５Ｋおよび５Ｌ＝５０μｍ）。 成体ラット中の軟膜下頸部ＡＡＶ９送達後の脳運動中枢中の逆行性輸送媒介ＧＦＰ発現を示す。６Ａ〜６Ｄは、上頸部単一ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入の８週間後におけるラットの運動皮質中の両側性逆行性−ＧＦＰラベル付けされたピラミッドニューロンを示す。６Ｅ〜６Ｇは、赤核中の両側性ニューロンＧＦＰ発現を示す（スケールバー：６Ａ、６Ｂ、６Ｅおよび６Ｆ＝５０μｍ；６Ｃおよび６Ｄ＝５０μｍ；６Ｇ＝２０μｍ）。 図７Ａ〜７Ｇは、髄腔内ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ後の分離局部的脊柱トランスジーン発現と、ラット中の軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰ送達とを示す。７Ａは、ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰの腰部髄腔内注入を行った結果、脊椎索（ＤＦ）、後根（ＤＲ）および前根入口帯において優先的ＧＦＰ発現が得られる（白色ボックスインサートＮｏ．２）ことを示す。上頸部脊髄中へ軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰ注入を行うと、明確な下方運動管のラベル付けが得られる。７Ｂは、腰部髄腔内ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後の後根神経節細胞（Ｌ４）中のＧＦＰ発現を示す。７Ｃおよび７Ｄは、髄腔内ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後の高ＧＦＰ発現が後根（ＤＲ）中およびより深い後角（白色星印）中の一次求心神経ボタン中においてみられるが、後角ＮｅｕＮ＋ニューロンにおける発現は確認できなかった。図７Ｅは、脊椎索（ＤＦ）中のＧＦＰおよびＲＦＰの同時局所化がみられない（７Ａ、Ｎｏ．１からの白色インサート）ことを示す。７Ｆは、髄腔内ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入に起因する前根入口帯中に局所化したグリア細胞中のＧＦＰ発現を示す（７Ａ、Ｎｏ．２からの白色インサート）。７Ｇは、ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰを注入した動物中において、ＧＦＰ＋一次Ｉａ求心神経に包囲されたいくつかの逆行ラベル付けされたＧＦＰ発現運動ニューロンがみられることを示す（スケールバー：７Ａ＝５００μｍ；７Ｂ〜７Ｇ＝３０μｍ）、（ＤＲ−後根、ＤＨ−後角、ＶＨ−前角、ＤＦ−脊椎索）。 単一軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後のＣＮＳ全体における軟膜下ＡＡＶ９送達およびその結果発生したトランスジーン（ＧＦＰ）発現を示す模式図である。成体ブタ中において、ＰＥ−１０カテーテルを用いてＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰウイルスを軟膜下空間内へ送達させる。ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰの軟膜下送達を行うと、拡散が発生し、軟膜下注入分節を通過する分節ニューロン（すなわち、介在ニューロンおよびα運動ニューロン）および上方および下方軸索中へウイルスが取り込まれる。その後、その結果得られたトランスジーン発現が以下においてみられる：ｉ）分節ニューロン、ｉｉ）後根神経節細胞（逆行感染）、ｉｉｉ）骨格筋に神経感応する運動軸索（順行性感染）、ｉｖ）運動皮質中のピラミッドニューロン（逆行感染）、およびｖ）脊髄視床ニューロンの脳末端（順行性感染）。 成体ラットに単回ボーラス腰部軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰを注入した後の有効な実質ＡＡＶ９−媒介トランスジーン発現を示す。９Ａ〜９Ｄは、Ｌ１軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後の胸郭下部および上腰部脊髄中のニューロンおよび白質管中の広範なＧＦＰ発現を示す。水平切断切片（９Ａ）中の実質的に全てのニューロンがＧＦＰ発現を示す。横方向切断切片において、薄膜Ｉ〜ＩＸ間においてＧＦＰ＋ニューロンが灰白質全体においてみられる（９Ｂ〜９Ｄ）。多数のＮｅｕＮ−染色ニューロンが表在後角（薄膜Ｉ−ＩＩＩ）および前角中のＧＦＰを発現していることがわかる。９Ｅおよび９Ｆは、上頸部ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後の腰部脊髄中の高密度のＧＦＰ＋下方運動繊維を示す。９Ｆは、高密度共焦点画像であり、灰白質中の容易に認識可能なＧＦＰ＋の神経線維末端を示す。（スケールバー：９Ａ＝１０００μｍ；９Ｂ−９Ｄ＝３０μｍ；９Ｅ＝５０μｍ；９Ｆ＝１００μｍ）、（ＷＭ−白質、ＧＭ−灰白質、ＤＨ−後角、ＶＨ−前角、ＤＦ−脊椎索）。

本発明は、大型動物およびヒトの脊柱柔組織中へ遺伝子およびオリゴヌクレオチドを送達させる方法およびシステムを提供する。

本発明の組成および方法について説明する前に、組成、方法および実験条件自体は変わるものであるため、本発明は、記載された組成、方法および実験条件に限定されないことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものであるため、本明細書において用いられる用語は、あくまで特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことが理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうではないと明確にならない限り、複数形を含む。よって、例えば「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（方法）」について言及する場合、例えば当業者が本開示を読めば明らかになる本明細書に記載の種類の１つ以上の方法および／またはステップを含む。

「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含有する（containing）」または「により特徴付けられる（characterized by）」と同義に用いられ、包括的またはオープンエンドな言語であり、さらなる記載の無い要素または方法ステップを排除しない。「からなる（consisting of）」という句は、特許請求の範囲に記載されていない任意の要素、ステップまたは成分を除外する。「本質的になる」という句は、特許請求の範囲を、指定された材料またはステップと、特許請求の範囲に記載の発明の基本的かつ新規な特性に本質的に影響しないものとに限定する。本開示は、これらの句それぞれの範囲に対応する本発明の組成および方法の実施形態を企図する。よって、記載の要素またはステップを含む組成または方法は、組成または方法がこれらの要素またはステップから本質的になるかまたはからなる特定の実施形態を企図する。

他に明記無き限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通に理解する同一の意味を持つ。本明細書中に記載のものに類似するかまたは均等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得、以下において、好適な方法および材料について説明する。

本明細書において用いられるように、「軟膜」という用語は、髄膜の最内側層、脳および脊髄を包囲する膜を指す（図１Ａ）。軟膜は、肉薄の繊維組織であり、流体に対して不浸透性である。そのため、軟膜は、脳脊髄流体を封入することができる。このように流体を含むことにより、軟膜は、その他の髄膜層と共に、脳の保護およびクッションとして機能する。脊柱軟膜は、脊髄表面または脊髄を封入し、前裂への接続を通じて取り付けられる。そのため、「軟膜下」という用語は、軟膜下にあるまたは軟膜下で生じることを指す。

本明細書において用いられるように、「柔組織」という用語は、臓器の機能的組織のことを指し、接続および支持組織と区別される。よって、「脊柱実質」という用語は、脊髄の多様な公知の解剖学的組織を指す（例を非限定的に挙げると、灰白質、白質、硬膜、クモ膜、軟膜、後索および前索、後脊髄小脳管および前脊髄小脳管）。

本明細書において用いられるような「対象」という用語は、本方法が施される任意の個人または患者を指す。一般的には対象はヒトであるが、当業者であれば、対象は動物である場合もあることを理解する。よって、他の動物（例えば、哺乳動物（例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、オラウータンおよびゴリラ））が対象の定義に含まれる。

本明細書において用いられるような「治療」とは、患者／対象が明示するかまたは患者／対象が罹りやすい病気、障害または生理的条件に応答して行われる臨床的介入を指す。治療目的を非限定的に挙げると、症状の軽減または回避、病気、障害または状態の進行または悪化の緩慢化または停止ならびに／あるいは病気、障害または状態の緩和がある。「治療」とは、治療および予防的または防止的対策のうち片方または双方を指す。治療を必要としている対象を挙げると、病気または障害または望ましくない生理的条件に既に罹っている対象、病気または障害または望ましくない生理的条件を回避する必要のある対象がある。

本明細書において用いられるような「核酸」および「ポリヌクレオチド」はは同義であり、任意の核酸を指し、ホスホジエステル結合または修飾結合を問わない（例えば、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホアミダート、架橋ホスホアミダート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジヂオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルトン結合、およびこのような結合の組み合わせ）。「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５種類の生物学的に発生する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基によって構成された核酸も特異的に含む。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が天然起源のアミノ酸に対応する人工化学模倣剤であるアミノ酸ポリマーに適用され、また、天然起源のアミノ酸ポリマーおよび非天然起源のアミノ酸ポリマーに適用される。

「アミノ酸」という用語は、天然起源のアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然起源のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣剤を指す。天然起源のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸、後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、α−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）を指す。アミノ酸類似物は、天然起源のアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。このような類似物は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有し、天然起源のアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣剤は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが天然起源のアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。

本明細書において、アミノ酸は、その一般的に知られる３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎから推奨された１文字記号によって言及され得る。ヌクレオチドも、その一般的に受け入れられている１文字記号によって言及され得る。

「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸および核酸配列双方に適用される。特定の核酸配列について、保存的に改変された改変体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮退に起因して、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンによって指定される各位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載の対応するコドンのうちいずれかに変更され得る。このような核酸変異は「サイレント変異」であり、１種の保存的に改変された変異である。ポリペプチドをコードする本明細書中の各核酸配列も、核酸のそれぞれの可能なサイレント変異を表す。当業者であれば、核酸中の各コドン（一般的にメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、一般的にトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子が得られるように修飾可能であることを認識する。よって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載の配列において暗示される。

アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされる配列中の単一アミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を改変、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に改変された変異体」であり、変更の結果、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換となることを認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する同類置換表は、当該分野において周知である。このような保存的に改変された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体、および対立遺伝子に付加され、これらを除外しない。

「ポリヌクレオチド」は、５’〜３’端から読み出されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基単一鎖または二本鎖のポリマー。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から分離してもよいし、インビトロ合成してもよいし、あるいは天然分子および合成分子の組み合わせから調製してもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（「ｂｐ」と省略）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）、またはキロベース（「ｋｂ」）として表現される。文脈が許す場合、後者の２つの用語は、単一鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを記述し得る。この用語が二本鎖分子に適用される場合、この用語は全体的長さを指し、「塩基対」という用語と均等のものとして理解される。当業者であれば、二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、若干長さが異なり得、酵素的切断の結果、その端部を交互配置することができるため、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全ヌクレオチドがペアされ得ないことを認識する。

「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連付けられた核酸の任意の断片を広範に指す。よって、遺伝子は、その発現に必要なコーディング配列および／または調節配列を含む。例えば、「遺伝子」とは、調節配列を含むｍＲＮＡ、機能ＲＮＡ、または特異タンパク質を表現する核酸フラグメントを指す。「遺伝子」は、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡ断片も含む。「遺伝子」は、多様な源（例えば、対象源からのクローン化または既知の配列情報または予測配列情報からの合成）から入手することができ、所望のパラメータを持つように設計された配列を含み得る。「対立遺伝子」は、染色体上の所与の遺伝子座を占有するいくつかの代替的形態の遺伝子の１つである。

本明細書において用いられるように、「ベクター」とは、遺伝子配列の標的細胞への導入が可能なものである。典型的には、「ベクター構築」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」とは、対象遺伝子の発現を方向付けることができかつ遺伝子配列を標的細胞へ導入することが可能な任意の核酸構築を指す。よって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、組み込み形ベクターを含む。

ウイルスベクターは、本発明の方法を標的細胞中へ行う際に有用なポリヌクレオチドを導入する際に特に有用に用いられ得る。ウイルスベクターは、特定の宿主システム（特に、哺乳動物システム）において用いられるように開発され、例えばレトロウイルスベクター、他のレンチウイルスベクターを含む（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、アデノウイルスベクター（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクターに基づいたもの）（右記を参照：Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-1187 (1996)。本明細書中、同文献それぞれを参考のため援用する）。本発明の一実施態様において、レンチウイルスまたはアデノウイルスベクターが用いられる。アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡウイルスであり、ＤＮＡの双方の鎖が遺伝子をコードする。ゲノムは、約３０個のタンパク質をコードする。本発明の別の実施態様において、アデノ随伴ウイルスベクターが用いられる。

「アデノウイルス」という用語は、ヒトから分離された４０個を超えるアデノウイルス亜型や、他の哺乳動物および鳥類からの多数のものを指す。右記を参照されたい：Strauss, “Adenovirus infections in humans,” in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 451-596 (1984)。組み換えアデノウイルスベクター（例えば、ヒトアデノウイルス５に基づくもの）（例えば、右記に記載のもの：McGrory W J, et al., Virology 163: 614-617, 1988）は、アデノウイルスゲノムからの本質的な早期遺伝子（通常はＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ）が欠失しているため、トランス中の欠失遺伝子生成物を提供する許容細胞ライン内において成長させない限り、複製することができない。欠失しているアデノウイルスゲノム配列の代わりに、対象トランスジーンをクローン化し、複製欠陥アデノウイルスに感染した組織／細胞中に発現させる。アデノウイルスベースの遺伝子導入は一般的にはトランスジーンを宿主ゲノム中に安定して組み込むことができないが（０．１％未満のアデノウイルス媒介トランスフェクションの結果、宿主ＤＮＡ中へのトランスジーン導入に繋がる）、アデノウイルスベクターは高力価で伝播することができ、複製しない細胞をトランスフェクトすることができるが、トランスジーンは娘細胞へ送られず、活発に分裂しない成体心筋細胞への遺伝子導入に適している。レトロウイルスベクターは、安定した遺伝子導入を提供し、現在では高力価をレトロウイルスシュードタイピングを介して得ることができる（Burns, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 8033-8037, 1993）、しかし、現在のレトロウイルスベクターは一般的には、複製しない細胞を効率的に形質導入することができない。

本発明の方法において使用できないアデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターについて記述しているさらなる参考文献を以下に挙げる：Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., et al. (eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990); Graham, F., et al., pp. 109-128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Schneider and French, Circulation 88:1937-1942, 1993; Curiel D. T., et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992; Graham, F. L., et al., 国際公開第９５／００６５５号 (5 Jan. 1995); Falck-Pedersen, E. S., 国際公開第９５／１６７７２(22 Jun. 1995); Denefle, P. et al., 国際公開第９５／２３８６７号(8 Sep. 1995); Haddada, H. et al., 国際公開第９４／２６９１４号(24 Nov. 1994); Perricaudet, M. et al., 国際公開第９５／０２６９７号(26 Jan. 1995); Zhang, W., et al., 国際公開第９５／２５０７１号(12 Oct. 1995)。多様なアデノウイルスプラスミドは、商用源（例えば、トロント、オンタリオのＭｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からも利用可能である（例えば、右記を参照：Microbix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996）。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、小型（２６ｎｍ）の複製欠陥の非エンベロープウイルスであり、細胞成長において、第２のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）の存在に依存する。ＡＡＶは、病気の原因としては既知ではなく、極めて軽度の免疫反応を誘起する。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞双方を感染させ得、そのゲノムを宿主細胞に導入させ得る。本発明の局面は、組み換えＡＡＶベースの遺伝子導入を用いて、トランスジーンを対象中の脊柱組織へ送達させる方法を提供する。

本発明の方法において用いられ得るＡＡＶベクターについて記述するさらなる参考文献は、以下を含む：Carter, B., Handbook of Parvoviruses, vol. I, pp. 169-228, 1990; Berns, Virology, pp. 1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 92-129, 1992; Flotte, T. R., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770: 79-90, 1995; Flotte, T. R., et al., 国際公開第９５／１３３６５号(18 May 1995); Trempe, J. P., et al., 国際公開第９５／１３３９２号(18 May 1995); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2:357-362, 1995; Allen, J. M., 国際公開第９６／１７９４７号(13 Jun. 1996); and Du et al., Gene Therapy 3: 254-261, 1996.右記も参照されたい：米国特許第８，８６５，８８１号明細書。本明細書中、同文献を参考のため援用する。

「有効な量」のＡＡＶとは、対象中の標的組織の充分な数の細胞を感染させるのに充分な量である。有効な量のＡＡＶは、対象における治療的恩恵（例えば、対象の寿命増加、病気の対象１つ以上の症状（例えば、神経変性疾患の症状）の改善）をもたらすのに充分な量であり得る。有効な量は、多様な要素（例えば、種、年齢、体重、対象の健康、標的組織）に応じて異なり得るため、対象および組織によって異なり得る。有効な量は、投与形態によっても異なり得る。例えば、血管内注入によるＣＮＳ組織の標的化においては、髄腔内注入または脳内注入によるＣＮＳ組織の標的化の場合と異なる投与量（例えば、より高い投与量）が必要になり得る。場合によっては、複数の投与量のＡＡＶが投与される。有効な量は、使用される特定のＡＡＶにも依存し得る。例えば、ＣＮＳ組織を標的とする投与量は、ＡＡＶの血清型（例えば、カプシドタンパク質）に依存し得る。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３からなる群から選択されたカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型を持ち得る。特定の実施形態において、有効な量のＡＡＶは、ｋｇあたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４個のゲノムコピーである。特定の実施形態において、有効な量のＡＡＶは、対象あたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５個のゲノムコピーである。

使用される宿主細胞／ベクターシステムに応じて、複数の転写および翻訳要素のうち任意のもの（例えば、構成的および誘導プロモータ、転写エンハンサー要素、転写ターミネータなど）が発現ベクターにおいて用いられ得る（Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987）。例えば、細菌システムにおけるクローニングの場合、誘導プロモータ（例えば、バクテリオファージのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）など）が用いられ得る。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノムから導出されたプロモータ（例えば、ヒトまたはマウスメタロチオネインプロモータ）あるいは哺乳動物ウイルスからのもの（例えば、レトロウイルス長い末端反復）、アデノウイルス後期プロモータまたはワクチニアウイルス７．５Ｋプロモータが用いられ得る。組み換えＤＮＡまたは合成技術によって生成されたプロモータは、インサートされたＧＤＦレセプタコーディング配列の転写のためにも用いられ得る。

本明細書において用いられるように、「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好適には必ずしも必要ではないが、ルーチンアッセイにおいて容易に測定されるタンパク質生成物を生成する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子を非限定的に挙げると、抗生物質抵抗性を媒介するタンパク質をコードする配列（例えば、アンピシリン抵抗、ネオマイシン抵抗、Ｇ４１８抵抗、ピューロマイシン抵抗）、色付きまたは蛍光または発光タンパク質をコードする配列（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ）、および強化細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）がある。エピトープタグを挙げると、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーがある。「発現タグ」を挙げると、対象遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列へ動作可能に結合され得るレポーターをコードする配列がある。

本明細書において用いられるように、「形質転換」または「トランスフェクト」という用語は同義に用いられ、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡが導入され、適切な宿主細胞中へ導入されるプロセスを指す。さらに、他の異種タンパク質をコードする核酸が、宿主細胞中へ導入され得る。このようなトランスフェクト細胞は、安定的にトランスフェクトされた細胞を含み、ここで、インサートＤＮＡは、宿主細胞中の複製を可能にする。典型的には、安定したトランスフェクションには、選択可能なマーカ核酸配列（例えば、抗生抵抗を提供する核酸配列）と共に導入された外因性ＤＮＡが必要であり、その結果、安定したトランスフェクタントの選択が可能になる。このマーカ核酸配列は、外因性ＤＮＡへ結合さえてもよいし、あるいは、外因性ＤＮＡと共に同時コトランスフェクションによって独立的提供してもよい。トランスフェクト細胞は、ＲＮＡまたはＤＮＡの発現を限定された期間にわたって発生させることが可能な一時的に発現する細胞も含む。トランスフェクション手順は、トランスフェクトされている宿主細胞に依存する。これは、ポリヌクレオチドのウイルス中へのパッケージングと、ポリヌクレオチドの直接取り込みとを含み得る。形質転換の結果、インサートＤＮＡが宿主細胞のゲノムへ導入されるか、または、プラスミド形態中の宿主細胞中のインサートＤＮＡが維持され得る。形質転換／トランスフェクションの方法は、当該分野において周知であり、非限定的に挙げると、直接注入がある（例えば、ミクロ注入、ウイルス感染、特に複製欠損性アデノウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびリン酸カルシウム媒介直接取り込み）。

本明細書において用いられるように、核酸配列（例えば、コーディング配列）および調節配列は、調節配列の影響または制御下において核酸配列の発現または転写を配置するように共有結合したときに、動作可能に結合すると言われている。核酸配列を機能タンパク質へ翻訳することが所望される場合、２本のＤＮＡ配列は以下の場合において動作可能に結合すると言われている：５’調節配列中のプロモータの誘導の結果、コーディング配列の転写が行われた場合ならびに２本のＤＮＡ配列間の結合の結果、（１）フレームシフト突然変異の導入、（２）コーディング配列の転写を方向付けるプロモータ領域の能力との干渉、または（３）タンパク質へ翻訳すべき対応するＲＮＡ転写産物の能力との干渉が発生しない場合。そのため、プロモータ領域が得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドへ翻訳されるように当該ＤＮＡ配列の転写を発生させることが可能である場合、プロモータ領域が核酸配列へ動作可能に結合される。同様に、２つ以上のコーディング領域の共通プロモータからの転写によりフレーム内において翻訳された２つ以上のタンパク質の発現が得られるように当該２つ以上のコーディング領域が結合された場合、これらの２つ以上のコーディング領域は動作可能に結合される。いくつかの実施形態において、動作可能に結合されたコーディング配列により、融合タンパク質が得られる。いくつかの実施形態において、動作可能に結合したコーディング配列により、機能ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）が得られる。

タンパク質をコードする核酸の場合、トランスジーン配列の後および３’ＡＡＶＩＴＲ配列の前に、ポリアデニル化配列が挿入され得る。本発明において有用なＡＡＶ構築は、望ましくはプロモータ／エンハンサー配列とトランスジーンとの間に配置されたイントロンも含み得る。１つの可能なイントロン配列はＳＶ−４０から導出され、ＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。別のベクター要素が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）内において用いられ得る。ＩＲＥＳ配列は、１つよりも多くのポリペプチドを単一遺伝子転写産物から生成するために用いられる。例えば、ＩＲＥＳ配列は、１つよりも多くのポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために用いられる。これらおよび他の共通ベクター要素の選択は従来通りであり、このような配列が多数利用可能である。いくつかの実施形態において、手足口病ウイルス２Ａ配列は、ポリタンパク質中に含まれる。これは、小ペプチド（長さおよそ１８個のアミノ酸）であり、ポリタンパク質の開裂を媒介することが分かっている（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; and Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の開裂活性が、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工システムにおいて以前から実証されている（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; and Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931; and Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。

宿主細胞における遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞種類間において異なり得るものの、一般的には必要に応じて転写および翻訳それぞれの開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサー要素など）。特に、このような５’非転写調節配列は、動作可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を含むプロモータ領域を含む。調節配列は、エンハンサー配列または上流活性化剤配列を所望に含み得る。本発明のベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を選択的に含み得る。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

誘導プロモータは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給された化合物、環境要素（例えば、温度または特定の生理状態の存在（例えば、急性期、細胞または複製細胞のみの特定の分化状態））によって調節され得る。誘導プロモータおよび誘導システムは、多様な商用源（例を非限定的に挙げると、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄ）から利用可能である。他の多数のシステムが記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されたプロモータによって調節される誘導プロモータの例を以下に挙げる：亜鉛誘導ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモータ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、Ｔ７ポリメラーゼプロモータシステム（国際公開第９８／１００８８号）；エクジソン昆虫プロモータ（No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制システム（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導システム（Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、右記も参照されたい：Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)）、ＲＵ４８６誘導システム（Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導システム（Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）。この文脈において有用であり得る他のさらなる種類の誘導プロモータとしては、特定の生理状態（例えば、温度、急性期、細胞または複製細胞のみの特定の分化状態）によって調節されるものがある。

いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的様態で転写を誘発させる組織特異的転写要素に結合する。このような組織特異的調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）は、当該分野において周知である。例示的な組織特異的調節配列を非限定的に以下に挙げる：以下の組織特異的プロモータ：ニューロン（例えば、ニューロン特異的的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ）（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモータ（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータ（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモータは、以下から選択された遺伝子のプロモータである：ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）。他の適切な組織特異的プロモータが、当業者に明らかである。いくつかの実施形態において、プロモータは、ニワトリベータアクチンプロモータである。

いくつかの局面において、本発明は、哺乳動物中の１つ以上の遺伝子欠陥（例えば、遺伝的遺伝子欠陥、体細胞遺伝子変更）（例えば、対象中のポリペプチド欠乏またはポリペプチド過剰の原因となる遺伝子欠陥）を回避および治療する（特に、細胞および組織中のこのようなポリペプチドの欠乏に関連するＣＮＳ関連障害を示す対象における欠乏の重症度または範囲を治療または低減する）方法において用いられるＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、１つ以上の治療ペプチド、ポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードするＡＡＶベクターを薬学的に受容可能なキャリアに入れてそのような障害を持つかまたは持つことが疑われる対象中のＣＮＳ関連障害を治療するのに充分な量および期間において対象に投与することを含む。「アンチセンス抑制」とは、内因性遺伝子またはトランスジーンからのタンパク質発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生成を指す。

よって、ＡＡＶベクターは、ＣＮＳ関連障害を調節または治療するタンパク質または機能ＲＮＡをコードする核酸をトランスジーンとして含み得る。以下は、ＣＮＳ関連障害に関連する遺伝子の非限定的リストである：ニューロンアポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）およびアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。例えば、パーキンソン病の治療における有用なトランスジーンは、ドーパミン合成における律速酵素であるＴＨをコードする。ＴＨコファクターテトラヒドロビオプテリンを生成するＧＴＰＣＨ、をコードするトランスジーンも、パーキンソン病の治療において用いられ得る。Ｌ−ＤｏｐａからＤＡへの変換を促進させるＧＤＮＦまたはＢＤＮＦまたはＡＡＤＣをコードするトランスジーンも、パーキンソン病の治療において用いられ得る。ＡＬＳの治療においては、有用なトランスジーンは、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦまたはＣＮＴＦをコードし得る。また、ＡＬＳの治療においては、、有用なトランスジーンは、ＳＯＤ１発現を抑制する機能ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含むコード得る。虚血の治療においては、有用なトランスジーンは、ＮＡＩＰまたはＮＧＦをコードし得る。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするトランスジーンは、特定のリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳＶＩＩ））の治療に有用であり得る。プロドラッグ活性化遺伝子（例えば、ガンシクロビルを合成を妨害して細胞死を発生させる毒性ヌクレオチドへ変換するＨＳＶ−チミジンキナーゼ）をコードするトランスジーンが、例えばプロドラッグと共に投与された場合に、特定の癌の治療において有用であり得る。βエンドルフィンなどの内因性オピオイドをコードするトランスジーンが、痛みの治療において有用であり得る。本発明のＡＡＶベクターにおいて用いられ得るトランスジーンの他の例が、当業者にとって明らかである（例えば、右記を参照：Costantini L C, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109）。

数十年間において、いくつかの実験的および／または臨床的研究が、ＣＮＳ標的遺伝子送達のためのＡＡＶベクター（特にＡＡＶ９）の使用の成功について報告されている。これらの研究は、標的ＣＮＳ領域強力な遺伝子アップレギュレーションまたはサイレンシングにおけるツールとしてのＡＡＶ送達ベクターの価値を明確に確立させ、この治療アプローチが多数の神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ＳＭＡ、筋痙縮および慢性疼痛）の治療において有効に使用可能である証拠を提供している。これらの励みになるデータおよび広範な前臨床動物研究にも関わらず、異なるＡＡＶ送達経路（全身、髄腔内）の使用後のＡＡＶベクターが脳または脊髄柔組織に貫通する様態についての詳細な機構については、完全には解明されていない。これらのデータは、若年の完全に発達した成体の動物およびヒト対象において等しく強力な新規のより有効なＡＡＶ送達プロトコルの開発において極めて重要である。一般的に、前臨床動物研究は、動物を用いたときまたはＡＡＶの送達経路（例えば、全身または髄腔内）の発達段階に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。個々の研究において用いられるパラメータに応じて、感染しているトランスジーン発現および特異細胞集団（ニューロンおよび／またはグリア）のレベルは大きく異なる。

早期の研究によれば、新生仔マウス中にＡＡＶ９−ＧＦＰを全身静脈（ｉｖ）注入すると、後根ガングリオン、脊柱運動ニューロン（ＭＮ）および脳中のニューロン（新皮質、海馬、小脳）などを含む広範なＣＮＳＧＦＰ発現が得られることが分かっている。成体マウスを用いたｉｖ送達ＡＡＶ９−ＧＦＰの場合、ＣＮＳ全体における優先的な星状細胞感染が得られるが、ニューロン発現は限定的にしかみられない（Foust et.al.,、(2009)。血管内ＡＡＶ９は、新生児ニューロンおよび成体の星状細胞を優先的に標的にする（Nature biotechnology 27: 59-65）。新生仔マウス中のＡＡＶ９の全身（ｉｖ）送達後の広範な脊柱ＭＮＧＦＰ発現を示す比較可能なデータが報告されている（Ｄｕｑｕｅら、（２００９）。自己相補的なＡＡＶ９の静脈内投与を行うと、成体運動ニューロンへのトランスジーン送達が可能になる（Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 17: 1187-1196）。加えて、同じグループは、成体マウスまたはネコへのＡＡＶ９送達後脊柱ＭＮ中のトランスジーン発現の成功を示す。これら２つの研究と同様み、Ｇｒａｙらによれば、ｉｖ成体マウスにおけるＡＡＶ９投与後にＣＮＳニューロンＧＦＰ発現を示しているものの、しかし、脳内におけるニューロンからグリア発現への明確なシフトを示す従来研究と比較して、幼若の非ヒト霊長類における形質導入効率はごく限られている（Gray, et al. (2011）。ニューロンおよびグリアへの血管内ＡＡＶ９送達の前臨床差：成体マウスおよび非ヒト霊長類動物の比較研究（Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 19: 1058-1069））。

成体動物における全身ＡＡＶ９送達後のニューロン発現がこのように明らかに限定されているため、（血液脳バリアをバイパスするための）髄腔内経路の使用がいくつかの研究において調査されている。１歳の２ｋｇＢＷの非ヒト霊長類（カニクイザル）を用いたところ、ＡＡＶ９−ＣＢ−ＧＦＰの腰部髄腔内の単一回注入の結果、ＡＡＶ９注入の２週間後、脊髄全体において５０〜７５％のＭＮ形質導入がみられた。同様に、幼若の２〜３歳の非ヒト霊長類（カニクイザル）または幼若（２ヶ月）のブタを用いたところ、槽内または槽内−腰部髄腔内ＡＡＶ９送達後、脊髄全体において強力なＭＮ形質導入が見られた。加えて、同じ研究において、後根神経節細胞、運動皮質中および小脳皮質中にＧＦＰ発現がみられた。より近年の研究においては、槽内ＡＡＶ９−ＧＦＰ注入後、比較可能な腰部ＭＮＧＦＰ発現が非ヒト霊長類（カニクイザル）においてみられている。

興味深いことに、槽または腰仙髄腔内送達経路を用いた全研究において、利用可能な履歴データを確認したところ、極めて特異な脊柱トランスジーン発現パターンがみられた。これはα運動ニューロン中の高発現によって取り付けられるものの、しかし、ＧＦＰ発現α運動ニューロンの近隣に残留している前角介在ニューロンは、トランスジーン陰性であるようにみえる。同様に、強力なトランスジーン発現は、後根神経節細胞および一次求心神経においてみられる。しかし、表在後角または中間帯中に局所化した小介在ニューロンにおいては、トランスジーン発現はみられない。

このような高レベルのトランスジーン発現選択性およびより深い灰白質細胞の欠如は、（血液脳バリアに加えて）良好に発達した調節バリアシステムの存在を示し、髄腔内空間からより深い脊柱区画中へのウイルス浸透が回避される。脊柱髄膜の良好に記述された解剖学的組織化に基づくと、軟膜は、髄腔内ＡＡＶ送達後の脊柱柔組織中へのＡＡＶ浸透を調節する主要バリアであるとの仮説が立てられる。よって、髄腔内送達後にＭＮおよびＤＲＧ細胞中にみられる高レベルのトランスジーン発現は、脊柱柔組織内外に突出しかつ髄腔内空間（すなわち、前および後根）を通過する軸索の優先的逆および順行性感染が媒介されている可能性が高いと推測される。

そのため、この問題に対処するため、本発明は、哺乳動物における軟膜下ベクター送達方法を提供し、この送達経路により、強力な経脊髄トランスジーン発現により、軟膜下注入分節の灰白質中のニューロンの集団全体を感染させる。加えて、下方および上方軸索のほとんど完全な感染が達成され、脳中心（すなわち、運動皮質、赤核）中のトランスジーン発現に一致した。

よって、本明細書において記載される方法および送達システムにより、脊柱軟膜下遺伝子治療（例えば、ＡＡＶ９ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）送達）の大型動物またはヒト中の脊柱柔組織中へのが可能になる。ＡＡＶ９またはＡＳＯを軟膜下空間内へ送達するために、９０°に屈曲された誘導チューブおよびカテーテル（例えば、ＰＥ−５またはＰＥ−１０）を含むように新規な送達システムを設計した。この設計により、標的脊髄分節の脊椎軟膜下空間内へ軟膜下カテーテルを正確に誘導および配置することが可能になる。カテーテルを配置した後、ＡＡＶ９またはＡＳＯを特定の時間にわたって注入し、その後取り外した。多様な実施形態において、ＡＡＶ９またはＡＳＯをおよそ２〜３分間注入した。

本明細書において用いられるように、「ＰＥ−１０」とは、内径がおよそ０．０１０インチのポリエチレンチューブを指す。特定の実施形態において、ＰＥ−１０チューブの内径は約０．０１１インチである。同様に、「ＰＥ−５」という用語は、内径がおよそ０．００５インチのポリエチレンチューブを指す。特定の実施形態において、ＰＥ−５チューブの内径は約０．００８インチである。

よって、特許請求の範囲に記載のシステムは、治療対象の白質および灰白質双方におけるほとんど完全な脊柱実質ＡＡＶ９媒介遺伝子発現またはＡＳＯ分配を提供する軟膜下送達（すなわち、軟膜のバイパス）を提供する。現在利用可能な非侵襲的技術の場合、比較可能なレベルの脊柱実質トランスジーン発現や良好に制御された分節特異的遺伝子サイレンシングは不可能である。

哺乳動物対象中に軟膜下カテーテルを配置するために、露出した「無硬膜」脊髄の近隣における器具／カテーテル操作に関連する脊柱負傷の可能性を最小化するために、いくつかの順次の手順ステップが遵守され得る。多様な実施形態において、（椎弓切除の真上および真下に配置された）尾側および頭蓋側脊柱クランプの使用により、カテーテル配置時の脊髄脈拍が最小化される。また、多様な実施形態において、ＸＹＺマニピュレータ（例えば、本明細書において参考のため援用する米国特許出願公開第２０１５／０２２４３３１号明細書に記載のもの）上に取り付けられた「Ｌ」字型のカテーテルステンレススチール誘導チューブ（例えば、９０°で屈曲された１６−２６Ｇステンレススチールチューブ９０°）を軟膜下カテーテル配置に用いる。

特定の実施形態において、先ず、屈曲３０Ｇ針を用いて軟膜を穿刺する。貫通した３０Ｇ針の先端が軟膜下空間内において約１〜１．５ｍｍの位置に来たところで、軟膜を１〜２ｍｍだけ若干上昇させる。その後、カテーテルを誘導チューブから前進させることにより、軟膜下カテーテルを軟膜下空間内へ配置する。カテーテルを標的長さまで前進させた後、誘導チューブの貫通針先端を軟膜下空間から除去する。ベクター注入を（典型的には２〜５分間およびいくつかの実施形態において約３分間）完了した後、カテーテルを軟膜下空間から抜き取り、硬膜を閉じる。この技術的アプローチを用いることにより、硬膜を開いた瞬間から約３〜５分間以内に軟膜下カテーテルの配置を達成することができる。

この技術を用いて、本明細書中に記載の軟膜下カテーテルを、１７頭のブタ中に成功裏に配置して、軟膜下カテーテル配置を一貫的かつ無負傷に達成した。成体ラットにおいて、同一の技術を用いたが、ＰＥ−５カテーテルを代わりに使用した。これらの成体ラットおよびブタを用いて得られたデータは、以下を示した：ｉ）単回ボーラス軟膜下ＡＡＶ９送達後のニューロンおよびグリア細胞を含む白質および灰白質における強力な脊柱実質トランスジーン発現、ｉｉ）頸部または胸軟膜下ＡＡＶ９注入後の、脊髄長さ全体におけるほぼ全ての下方運動軸索への送達、ｉｉｉ）脳運動中枢（運動皮質および脳幹）における強力な逆行トランスジーン発現、およびｉｖ）ＡＡＶ９送達後に３ヶ月間まで通常の神経機能が定義されたことによる、このアプローチの安全性。よって、ＡＡＶ−９の軟膜下送達により、成体哺乳動物における広範囲の実験的および臨床的利用を用いた遺伝子ベースの治療が可能になる。

一実施形態において、９０°で屈曲された１６−２６ＧステンレススチールチューブをＰＥ−１０カテーテルの誘導カニューレとして用いた。この誘導チューブを脊柱軟膜の真上に配置した後、ＰＥ−カテーテルを小軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させ（図１Ａ〜図１Ｅ）。その後、ＡＡＶ９またはＡＳＯを軟膜下空間内へ注入した。特定の実施形態において、ＡＡＶ９を」１〜１０％のデキストラン（１０，０００〜３０，０００ＭＷ）を含む混合物中に入れて送達して、ＡＡＶ９粒子を脊柱柔組織中により長時間堆積させた。ＡＡＶ９−ＧＦＰ送達後、注入レベルにおける脊柱柔組織全体およびＡＡＶ９注入分節から遠位方向に（腰部脊髄中に）突出する軸索において、一貫したＧＦＰ発現がみられた。

本明細書中において示すように、単一回の軟膜下ＡＡＶ９注入により、強力な実質トランスジーン発現が体軸方向に拡散する様子が複数の分節において見られた。よって、軟膜下ＡＡＶ９送達により、軟膜下注入分節中の灰白質および上方および下方軸索全体において、ニューロン中の広範なトランスジーン発現に繋がる。例えば、成体ブタの脊髄において、投与ポイントから約１０〜１５ｃｍの距離において、トランスジーン拡散が一貫してみられた。全灰白質薄膜中のニューロンおよびグリア細胞ならびに前索、横索および脊椎索中の軸索において発現が特定され、その結果、脊柱柔組織全体において軟膜下注入されたＡＡＶ９ベクターのほとんど完全な浸透が確認された。胸中部ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入（すなわち、ＡＡＶ９送達部位から約３０ｃｍの距離）を施したブタ中の横断腰部脊髄切片を分析することにより、ＡＡＶ９注入後６週間後において、実質的に全ての下方運動軸索がラベル付けされたようにみえた。より高解像度の共焦点顕微鏡観察を行ったところ、神経線維末端を含む微細な軸索分枝の高密度ネットワークが灰白質全体において確認された。白質中の感染軸索のレベルおよび分配と一貫して、逆行性感染のＧＦＰ発現ニューロンが運動皮質および脳幹中に特定された。同様に、中央に突出した知覚軸索が、網様体および視床中に特定された。

ラット中の軟膜下対髄腔内ＡＡＶ９送達後のトランスジーン発現パターンを比較することにより、本発明は、実質的に異なる局部的細胞発現を示した。よって、軟膜は、髄腔内送達後のＡＡＶ９の有効な実質浸透のための一次バリアを示す。

先ず、髄腔内送達後、発現は、脊椎および前根入口帯と形態学的に関連付けられた領域およびニューロングリアプール中のみにみられた。そのため、強力なトランスジーン発現は一次求心神経においてみられ、脊椎索、後角中の一次求心神経および前角へ突出するＩａ求心神経中に明確に存在した。一次求心神経中のこのトランスジーン発現は、後根神経節細胞中の強力な発現に一致した。同様に、前角中のいくつかの逆行ラベル付けされたα運動ニューロンを含む前根入口帯の周囲においても、明確な発現がみられた、しかし、これと対照的に、トランスジーン発現は薄膜Ｉ−ＶＩＩおよびＸ間の他のニューロン全て中には実質的にみられず、横または前索中においてラベル付けされた下方運動軸索も無かった。同様に、ラット中のＧＦＰ発現一次求心神経によって包囲された（脊椎索ベース上に局所化した）皮質脊髄管の軸索においては、トランスジーン発現はみられなかった。理論に縛られることなく言えば、これらのデータを総合的に勘案すると、脊柱実質ＧＦＰ発現は（ニューロン中のものであれまたは突出する一次求心神経中のものであれ）逆行または順行性のトランスジーン発現に起因し得るものであり、ＡＡＶ９の髄腔内空間から脊柱柔組織中への取り込みに起因するものではないことが分かる。この所見は、成体の非ヒト霊長類または幼若ブタ中の単一回の髄腔内または槽ＡＡＶ９−ＧＦＰ注入後の強力なα運動ニューロンＧＦＰ発現を示す、他の研究所からのデータと一貫する。しかし、ＧＦＰ＋α運動ニューロンのごく近隣にある介在ニューロンにおいては、介在ニューロンＧＦＰ発現はみられなかった（Ｍｅｙｅｒら、（２０１５）。ＳＭＡのためのＡＡＶ９−媒介遺伝子治療の単一注入ＣＳＦ送達の向上：マウスおよび非ヒト霊長類中の投与量応答研究。Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23: 477-487; Foust, et al. (2013)。変異体ＳＯＤ１の治療ＡＡＶ９媒介抑制は、病気進行を遅らせ、遺伝ＡＬＳモデルにおける寿命を延ばす（Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21: 2148-2159; Passini, et al. (2014)）。脊柱筋萎縮症のための自己相補的なＡＡＶ９−生存運動ニューロン１の髄腔内送達の翻訳忠実度（Human gene therapy 25: 619-630; Bell, et al. (2015)）。カニクイザルにおけるＡＡＶ９の槽内送達後の運動ニューロン形質導入（Human gene therapy methods 26: 43-44)）。

これと対照的に、上記したように、軟膜下ＡＡＶ９送達は、灰白質ニューロン（すなわち、α運動ニューロンおよび介在ニューロン）中ならびに注入分節の実質的に全ての下方運動軸索および一次求心神経中の強力なトランスジーン発現と関連付けられた。これらのデータは、軟膜が前および後根入口帯から離隔位置にある他の脊髄区画中へのＡＡＶ９の浸透を防ぐ一次バリアを示すことを明確に示す。軟膜をバイパスし、ＡＡＶ９を軟膜下空間内へ堆積させることにより、白質および灰白質トランス実質感染を成体齧歯動物または大型動物において有効に達成することができる。

よって、特許請求の範囲に記載の方法およびシステムを対象中において用いて、下方運動軸索中の神経栄養遺伝子の発現レベルをアップレギュレートすることにより、脊柱外傷後の軸索出芽を増加させることができる。さらに、このようにＡＳＯを局所的送達することにより、標的となる慢性疼痛または筋痙縮の進行に関連付けられた遺伝子の断片に制限されたサイレンシングが可能になるが、髄腔内ＡＳＯ送達後に通常発生する脊髄上位の副作用は無くなる。

軟膜下誘導感染および成体動物中の脊髄および脳中に感染されているニューロン細胞集団の効力は、いくつかの高い臨床的意義および実験的意義がある。第１に、特異的遺伝子をサイレンスダウン冷却牛レートさせるべき場合、サイレンシングＡＡＶ９構築の単一回の頸部軟膜下注入を行うと、脊髄の長さ全体および上方知覚繊維の大部分における下方運動軸索において、頸部ニューロンおよびグリア細胞中の有効な遺伝子サイレンシングが得られる。ＡＬＳ患者の良好に特徴付けられた神経変性パターンおよびＡＬＳの実験的モデル、上運動ニューロンおよび突出下方運動軸索、下運動ニューロンおよび脊柱介在ニューロンの変性進行を含むものを鑑みると、広範な突然変異遺伝子サイレンシングを達成する能力により、最も高い治療効果を達成する実質的な利点が得られる可能性が高い。加えて、単一頸部軟膜下注入を、標的腰部ニューロン／グリア集団への腰部拡張中への１回以上の追加軟膜下注入および／または胸および腰部脊髄全体の標的α運動ニューロンプールへの腰部髄腔内注入と組み合わせてもよい。第２に、軸索出芽と関連付けられた治療遺伝子（例えば、成長要素）の発現増加を下方運動管および上方知覚繊維中に容易に達成することができ、例えば脊柱外傷研究における治療効力について試験することができる。この場合、ＡＡＶ９ベクターを負傷中心点にある単一椎弓切除部位から軟膜下カテーテルを用いて投与し、切断された運動軸索の遠位端および上方知覚軸索の近位端をそれぞれ標的としてこの軟膜下カテーテルを吻側および尾側へ全身させることができる。第３に、頸部軟膜下ＡＡＶ９−ＧＦＰ注入から達成することが可能な完全に近い下方運動管ラベル付けにより、対象および脊柱グラフト細胞のラベル付けされた運動軸索間の軸索出芽形成およびシナプス形成が可能になる。脊柱負傷の細胞グラフトされた大型動物モデルにおける軸索出芽レベルおよび／またはシナプス結合の進行を体系的に特徴付けるこのようなデータは、現時点では得られていない。

本明細書において用いられるように、軟膜下ＡＡＶ９送達を髄腔内送達と比較した時の利点としては、脊柱トランス実質トランスジーン発現が優れている点であると思われる。加えて、比較可能な高レベルのトランスジーン発現が、完全成体ラットまたはミニブタにおいて達成される。成体の３５〜４０ｋｇのブタ中の脊髄の寸法はヒトのものと類似しているため、同様の実質ＡＡＶ９取り込みが成人においても達成されることが期待される。

本明細書中に記載の軟膜下送達技術が比較的制限される点として、軟膜下注入脊髄の脊椎表面へアクセスするために、局所的椎弓切除を行う必要がある点がある。このように椎弓切除を行う必要があると。その各使用が制限され得る（これは、髄腔内送達の繰り返しの効力と対照的である）。しかし、軟膜下ＡＡＶ９送達後に達成することが可能なトランスジーン発現のレベルは、この制限を（追い越すことはないにしても）バランスをとっているようにみえる（ただし、軟膜下遺伝子送達を病気修正研究において用いた後に明確かつより強力な治療効果がみられた場合）。加えて、投与後１２ヶ月後において高レベルの脊柱ＧＦＰ発現がナイーブ対照マウス中の腰部脊髄中に継続的に残っていたことが最近判明した。Ｉこれは、治療遺伝子の単一軟膜下送達の結果、長期間係属する効果がさらなる遺伝子送達の必要性を検討する前に得られたことを強く示唆する。

実験哺乳動物対象（例えば、成体ブタおよびマウス）を用いて、本発明によれば、本明細書中に記載の軟膜下脊髄ＡＡＶ９送達技術により、脊柱柔組織、下方および上方軸索において広範なトランスジーン発現が可能になり、直接脊髄組織針浸透は不要である（図８を参照）ことが分かる。脊柱局部的トランスジーン発現に加えて、脳運動中枢においてロバストな逆行発現がみられた。この技術は、特異脊髄分節中および／または突出する運動および上方知覚軸索中の遺伝子のアップレギュレートまたはダウンレギュレートを目的とする前臨床およびヒト臨床的研究において強力に使用され得る。これらの実験用の成体動物におけるトランスジーン発現の範囲は、多様な脊柱神経変性疾患および／またはＣＮＳ関連障害を標的とする成人患者集団において本発明を成功裏に用いることが可能であることを示唆している。例示的な神経変性疾患、ＣＮＳ関連障害、病気または外傷を非限定的に挙げると、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、グロボイド細胞性ロイコジストロフィ（ライソゾーム病）およびワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン・プラス症候群（例えば、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、および大脳皮質基底核変性症）、外科切除、脊髄負傷または外傷、腫瘍切除に起因するＣＮＳ負傷、横断性脊髄炎、視神経炎、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、脳卒中、外傷脳負傷、放射後負傷、化学療法の神経学的合併症、前部乏血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーバ‐ビニャーミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、舌咽神経痛、重症筋無力症、てんかん、ベル麻痺、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽性延髄麻痺、進行性球麻痺、脊柱筋萎縮症、進行性球麻痺、遺伝性筋萎縮症、椎間板障害（例えば、脱出性、破裂性および脱出性の椎間板症候群）、頸部脊椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、ポルフィリン症、軽度認知障害、および慢性疼痛症候群がある。

いくつかの実施形態において、特に高いＡＡＶ濃度（例えば、〜１０１３ＧＣ／ｍｌ以上）が存在する場合に組成中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するようにＡＡＶ組成を製剤する。ＡＡＶ凝集を低減させる方法は当該分野において周知であり、例を挙げると、例えば、界面活性剤、ｐＨ調整、塩濃度調節の付加などがある（例えば、右記を参照されたい：Wright F R, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178。本明細書中、同文献の内容をを参考のため援用する。）。

薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の製剤は、当該分野の当業者にとって周知であり、多様な治療レジメンにおいて本明細書中に記載される特定の組成を使用するための適切な投薬および治療レジメンの開発も同様である。典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性成分を含み得るが、もちろん、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは異なり得、便宜的には全体製剤の重量または体積の約１または２％〜約７０％または８０％以上であり得る。当然のことに、適切な投与量が化合物の任意の所与の単位投与量において得られるように、各治療的に有用な組成中の活性成分の量を調製するとよい。当業者であれば、このような医薬製剤の調製において、溶解性、生物学的利用率、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間、他の薬理学的考慮事項などの要素を企図するため、多様な投与量および治療レジメンが所望され得る。

注射用途に適した医薬形態を挙げると、無菌の注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌水溶液または分散液などが挙げられる。分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、およびこれらおよび油の混合物中においても調製され得る。通常の保存および使用条件下において、これらの調製物は、微生物の成長を回避するための保存量を含む。多くの場合において、この形態は、注射針通過性が容易である範囲内において無菌流体である。この形態は、製造および保管条件下において安定していなければなく、バクテリアおよび菌類微生物の汚染作用を防ぐように保存しなければならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、ポリピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、その適切な混合物および／または植物油を含む溶剤または分散媒体であり得る。例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散の場合に必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。

注射用水溶液の投与のためには、例えば、溶液を必要な場合に適切に緩衝し、先ず液体希釈液を充分な生理食塩水またはグルコースによって等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能な無菌水溶媒体は、当業者にとって公知である。例えば、１つの投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入流体に加えるかまたは提案注入部位に注入する（例えば、以下を参照：“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580）。宿主の状態に応じて、投与量の改変が必要になる。投与担当者は、どんな場合においても、個々の生体の適切な投与量を決定する。

適切な溶剤中の必要な量の活性ＡＡＶおよび本明細書中に列記した他の成分のうち多様な成分を必要なだけ採用することにより無菌注射溶液を調製した後、濾過滅菌を行う。一般的に、分散物は、無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合に基本的分散媒体および上記に羅列した成分の中から必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中へ多様な無菌活性成分を投入することにより調製され、好適な調製方法としては、事前に無菌濾過されたその溶液から活性成分の粉末＋任意の他の所望の成分が得られる真空乾燥およびフリーズドライ技術がある。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の薬剤、組成および／またはシステムを医薬キットまたは診断キットまたは研究キットとして組み立てて、治療、診断または研究用途における使用を容易化することができる。キットは、本発明の構成要素そ収容する１つ以上のコンテナおよび使用に関する指示事項を含み得る。詳細には、このようなキットは、本明細書中に記載のような投与のためのＡＡＶを含む組成を、当該組成の意図される用途および適切な使用を記載する指示事項と共に含み得る。特定の実施形態において、キットは、９０°で屈曲された誘導チューブ（例えば、１８または２３Ｇ）と、特定の用途および組成の軟膜下投与方法に適したカテーテル（例えば、ＰＥ−５またはＰＥ−１０）とを含む別個のコンテナをさらに含み得る。研究目的のためのキットは、構成要素を多様な実験を実行するための適切な濃度または数量で含み得る。キットは、組成を対照に軟膜下投与するために必要な構成要素（例えば、尾側および／または頭蓋側脊柱クランプｓ、ＸＹＺマニピュレータ）のうち１つ以上または全てをらに含み得る。

本明細書において用いられるように、「指示」とは、指示および／または促進構成要素を定義し得、本発明パッケージングまたはそれに関連する文書による指示を含み得ることが多い。指示は、指示がキットと関連するものとであるとユーザが容易に認識できるように提供された任意の口述指示または電子指示も含み得る（例えば、視覚聴覚的なもの（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤ）、インターネットおよび／またはウェブベースの通信）。文書による指示は、医薬製品または生物学的製品の製造、使用または販売を管轄する政府機関によって規定された様式をとり得、これらの指示は、動物投与の製造、使用または販売を担当する機関による承認も反映し得る。

以下の例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定することを意図していない。

実施例１
材料および方法
動物および一般的な外科的処置−成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄および雌、２５０〜３５０グラム、ｎ＝１６）またはミネソタ系およびゲッティンゲン系の交雑育種から得た成体のミニブタ（雄雌両方、３０〜４０ｋｇ；ｎ＝６）を用いた。ラットを５％イソフルランによって麻酔し、手術時において、呼吸速度および足ピンチ応答に応じて２〜３％のイソフルランにおいて維持した。次に、ラットの背中を毛ぞりし、２％クロルヘキシジンで洗浄した。皮膚切開後、頸部、胸または腰部脊柱脊椎の周囲の脊椎傍筋肉を除去し、動物を先に記載のようにＣｕｎｎｉｎｇｈａｍの脊柱クランプを用いて脊柱固定化フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）へ固定した（Kakinohana, et al. (2004)。ラット中の頸部および腰部脊髄中への領域特異的細胞グラフト：定性的かつ定量的な立体解析学的研究。Experimental neurology 190: 122-132)。脊髄を露出させるため、対応する脊椎の脊椎椎弓切除を歯科用ドリルを用いて行った。その後、硬膜を外科用メスを用いて切り開いた。

ミニブタを筋肉内アザペロン（２ｍｇ／ｋｇ）およびアトロピン（１ｍｇ／ｋｇ；Ｂｉｏｔｉｋａ、ＳＫ）によって麻酔前投薬した後、ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ；ＩＶ）によって誘導した。誘導後、動物に２．５Ｆ気管チューブを挿管した。麻酔は、５０％／５０％の空気／酸素混合物中の１．５％イソフルランを一定の２Ｌ／分の流速において維持した。手術の間中ずっと酸素飽和をパルスオキシメーター（Ｎｅｌｌｃｏｒ Ｐｕｒｉｔａｎ Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｉｎｃ．、アイルランド）を用いて監視した。麻酔誘導後、動物を先に記載のような脊柱固定化装置内に配置した（Usvald, et al. (2010)。免疫抑制ミニブタ中のヒト脊柱幹細胞の髄腔内グラフトの投薬レジメンおよび再現性の分析。Cell transplantation 19: 1103-1122）。その後、Ｔｈ５およびＬ３〜Ｌ６脊髄分節にそれぞれ対応するＴｈ５またはＬ２〜Ｌ４脊椎の脊椎椎弓切除を行い、硬膜外脂肪をコットンでぬぐって除去した。硬膜を切り開き、６．０Ｐｒｏｌｉｎｅを用いて周辺組織へ固定させた（図１Ｃ〜１Ｅ）。

軟膜下のカテーテル配置および軟膜下ＡＡＶ９注入−軟膜下カテーテルを配置するため、Ｌ字型のカテーテル誘導チューブ（１８または２３Ｇ）を構築した（図１Ｂ）。この誘導チューブをＸＹＺ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）マニピュレータ内に取りつけ、露出した脊髄分節の表面へ前進させた。事前に４５°に屈曲させた３０Ｇ針を用いて、軟膜に穿刺した。次に、軟膜下カテーテル（ブタ用はＰＥ−１０ｆｏｒｐｉｇおよびラット用はＰＥ−５）を誘導チューブの他端から手動で押すことにより、そのカテーテルを誘導チューブから軟膜下空間内へ前進させた。ラットにおいては、カテーテルを軟膜下空間内に約１〜１．５ｃｍだけ前進させ、ブタにおいては約３〜６ｃｍだけ前進させた。その後、ウイルスを５０または２５０μｌハミルトン注射器を用いて軟膜下空間内に３分間かけて注入した。注入後、カテーテルを除去し、６．０Ｐｒｏｌｉｎｅを用いて硬膜を閉じた（硬膜を閉じたのはブタの場合のみ）、その後動物を回復させた。

インビボ注入用のＡＡＶ９の調製−１．２ｋｂユビキチン−Ｃ（ＵＢＣ）プロモータをオリゴヌクレオチド合成によって作製し、ｅＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ（ＲＦＰ）、およびＳＶ４０ポリＡシグナルと結合させ、自己相補的二本鎖ＤＮＡゲノムＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクタープラスミドにクローン化した（Xu, et al. (2012)。髄腔内送達後の自己相補的なアデノ随伴ウイルス血清型５により媒介されるラット後根ガングリオン媒介におけるインビボ遺伝子ノックダウン。PloSone7:e32581）。ＵＢＣプロモータによって駆動されるｅＧＦＰまたはＲＦＰのいずれかを発現するヘルパーウイルスフリーのｓｃＡＡＶ９ベクターを、ベクタープラスミド、ｐＲｅｐ２−Ｃａｐ９およびｐＡｄ−ヘルパープラスミドによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより生成した（Xu, et al.(1998)。ヘルパーアデノウイルスの不存在下における高力価組み換えアデノ随伴ウイルスベクターの生成。JVirol72:2224-2232）。プラスミドｐＲｅｐ２−Ｃａｐ９は、Ｕ．ＰｅｎｎのＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから得られた。トランスフェクションの７２時間後に調製された細胞溶解物中のＡＡＶベクターは、を先に述べたように洗浄し、Ｑ−ＰＣＲによって力価を求めた（Xu, et al.,前出）。最終力価を１．０ｘ１０１３ゲノムコピー／ｍｌ（ｇｃ／ｍｌ）に調整した。注入直前にウイルスをデキストラン（１０，０００ＭＷ）と１：１で混合し、最終デキストラン濃度を２．５％とした。軟膜下注入物量は、ラットの場合で３０μｌであり、ブタの場合に２００μｌであった。

脊髄および脳切片の灌流固定、検死解剖インサイチュＧＦＰ蛍光イメージングおよび免疫蛍光法−動物（ラットおよびブタ）をペントバルビタールによって深く麻酔し、２００ｍｌ（ラット）または２０００ｍｌ（ブタ）のヘパリン処置生理食塩水によって経心的に灌流した後、ＰＢＳ中の４％パラフォルムアルデヒドの２５０ｍｌ（ラット）または４０００ｍｌ（ブタ）によって経心的に灌流した。脊髄および脳を解剖し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド中に一晩４℃で後置した後、３０％スクロースＰＢＳ中にて凍結保護し、横断または縦断切片（厚さ３０μｍ）をクリオスタット上において切出し、ＰＢＳ中で保存した。切片化を行う前に、脊髄全体をＩＶＩＳスペクトル光画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いてインサイチュで画像化した。配列取得を励起波長４６５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍにおいて行った。中程度のビニングを用い、露出時間は３秒とした。画像分析をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ４．３．１（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）ソフトウェアを用いて行った。シグナル計算を固定容量ＲＯＩを用いて行った。調製された切片の免疫染色を、ＰＢＳ中において０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：ウサギ抗グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；１：５００、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）およびマウス抗ニューロン核坑原（ＮｅｕＮ、１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共に作製された一次抗体を用いて一晩４°Ｃで行った。一次抗体との培養により、切片をＰＢＳ中において３回洗浄し、蛍光結合二次ロバ抗ウサギおよびロバ抗マウス抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、５４６または６４７、１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それそれならびに一般核染色のためのＤＡＰＩによって培養した。その後、切片をスライド上に載せ、室温において乾燥させ、長期褐色防止キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって被覆した。蛍光画像のキャプチャをＺｅｉｓｓ ＩｍａｇｅｒＭ２顕微鏡を用いて行い、共焦点画像をＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０００顕微鏡を用いて撮影した。

このアプローチの一貫性、高レベルの脊柱実質トランスジーン発現、および実行可能性は、現行のアプローチに比して大きな技術的向上を示し、一般的に脊柱遺伝子アップレギュレーションまたはサイレンシングを狙った直接臨床的用途において可能性を持つ。現在用いられているアプローチでは、脊柱髄腔内または侵襲性の直接実質内ＡＡＶ注入が用いられており、低レベルの実質トランスジーン発現またはよりロバストな感染効果を達成するために必要とされる侵襲性などの点において制約が明らかにある。また、このアプローチの場合、シナプス接続の範囲を研究することおよび齧歯動物および大型動物種双方における標的となる脊髄分節中の軸索出芽を調節する要素（すなわち、遺伝子、神経栄養要素）を同定するために、ＡＡＶ９送達の部位から遠位にある分節において比類の無いレベルの運動および知覚繊維ラベル付けが可能であり、研究にとって極めてロバストなツールとなる。

脊柱軟膜下ＡＡＶ９送達の原理を示す実施例およびその結果得られる局部的実質発現と、ＡＡＶ９送達の２ヶ月後に成体ブタ中のＡＡＶ９送達部位から遠位にある分節における軸索ラベル付けとについて本明細書中に記載する。

実施例２
単一回の脊髄ボーラス後実質ＡＡＶ９媒介トランスジーン発現
先ず、ラットおよびブタにおける単回ボーラス軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰまたはＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰ送達の効力について試験した。動物において、２０μｌ（ラット）または２００μｌ（ブタ）の２．５％デキストラン溶液中のＡＡＶ９ベクターを頸部（Ｃ４−６）、胸（Ｔｈ６−９）または腰部（Ｌ２−Ｌ５）分節の軟膜下空間内に送達させた。ＡＡＶ９送達の６〜８週間後、脊髄を４％パラフォルムアルデヒド固定動物から解剖し、Ａｖｉｓ蛍光システムを用いてインサイチュで画像化した。次に、横断または水平脊髄切片をＡＡＶ９注入分節から切出し、ＧＦＰまたはＲＦＰの存在について分析し、ニューロン（ＮｅｕＮ）およびグリア（ＧＦＡＰ）抗体と共に共染色した。ラット脊髄およびブタ脊髄双方において、高ＧＦＰまたはＲＦＰ発現が脊髄表面上にみられ、視覚検査により黄色〜緑色領域または赤色領域として容易に同定された。図１Ｈおよび１Ｊは、横断されたブタの脊髄および前根（図１Ｈ、インサート）中におけるＲＦＰ（赤色）の存在をナイーブ脊髄（図１Ｉ）と比較して示している。これに対応して、ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰを注入した動物に脊柱表面濃度測定分析を行ったところ、広範なＧＦＰシグナルが軟膜下ＡＡＶ９送達中心点から５〜１０ｃｍまで拡散していた（図１Ｆおよび１Ｇ）。

胸中部レベルにおいてＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰを事前に軟膜下注入したブタから採取した水平切断された胸切片（図１Ｈに示すような同じ脊髄）を用いて、広範囲の実質ＲＦＰ発現がみられた。ＲＦＰ発現が大部分の介在ニューロンおよびα運動ニューロンにおいて容易に特定され、４〜６個の脊髄分節の全体において拡散していた（図３Ａおよび３Ｂ）。同様に、軸索樹状突起間分岐において、ＲＦＰ発現灰白質全体において高ＲＦＰ発現がみられた（図３Ａおよび３Ｂ、白色星印）。

軟膜下ＡＡＶ９注入の中心点から採取された横断脊髄部位を分析したところ、白質および灰白質全体において高ＲＦＰ発現が確認された。白質においては、点状のＲＦＰ発現が横方向に切断された軸索の大部分においてみられ（図３Ｃ、白色星印ｓ、ボックスインサート）、脊椎、横および前索において特定された（図３Ｃ、ＤＦ、ＬＦ、ＶＦ；ボックスインサート）。灰白質においては、多数の介在ニューロンが薄膜Ｉ−ＩＸと前角中の前α運動ニューロンとの間において分散しており、細胞体および軸索樹状突起間分岐において高ＲＦＰ発現がみられた。高密度のＲＦＰ発現が灰白質中の神経線維末端においてもみられた（図３Ｄ〜３Ｇ）。同様に、共焦点分析を行ったところ、星状細胞中のＲＦＰシグナルの存在が見られた（図３Ｃ、インサート：ＲＦＰ／ＧＦＡＰ）。

同様のニューロンＧＦＰ発現パターンが、軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ注入後のラット腰部脊髄においてＬ１〜２レベルでみられた。高密度のＧＦＰ＋ニューロンがＬ１〜Ｌ５腰部分節全体に存在し、また薄膜Ｉ〜ＩＸ間の灰白質全体に局所化していることが特定された（図９Ａ〜９Ｄ）。

実施例３
遠位の脊髄分節におけるＧＦＰ発現
次に、ラットおよびブタ双方における胸中部（Ｔｈ６−７）または下頸部分節の軟膜下空間内へのＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰの軟膜下注入後、腰部脊髄における下方脊柱管ＧＦＰ発現の範囲を特徴付けた。軟膜下ＡＡＶ９送達の３〜６週間後、高ＧＦＰ発現が腰部脊髄全体にみられた。ブタから採取した横断腰部（Ｌ２−Ｌ６）脊髄切片を用いて、横および前索中の横断軸索における高強度ＧＦＰ発現が、さらなるＧＦＰ免疫染色無しに容易に特定された（図４Ａ、白色星印）。これらの領域において、同様の密度のＧＦＰ＋軸索が白質全体においてみられた。横および前索と対照的に、比較的少数のＧＦＰ＋軸索が脊椎索においてみられた（図４Ａ、ＤＦ）。横および前索の白質中にみられる軸索ラベル付けのレベルと一貫して、灰白質中に終端するＧＦＰ＋軸索の高密度網がみられた（図４Ａおよび４Ｂ）。これらの軸索は、薄膜ＩＩＩ〜Ｘ間において特定された。ごく僅かのＧＦＰ＋軸索がラミナＩ〜ＩＩＩ中に見られた。強力共焦点顕微鏡を用いたところ、高密度の微細なＧＦＰ＋軸索が灰白質中の多数の神経線維末端と共にみられた（図４Ｃ）。

事前にＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰの上頸部軟膜下注入を施したラットにおいて、腰部灰白質中の下方運動軸索における比較可能なＧＦＰ発現パターンがみられた（図９Ｅおよび９Ｆ）。

実施例４
脊柱軟膜下送達後の脳運動領域における逆行トランスジーン発現
ブタにおいて軟膜下ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ送達を行った６週間後において、脳運動中枢（運動皮質、赤核および網様体）におけるトランスジーン（ＧＦＰ）発現を分析したところ、高くＧＦＰラベル付けされたピラミッドニューロンが運動皮質中にみられた（図５Ａ〜５Ｅ）。同様に、多数のＧＦＰ＋ニューロンが脳幹内に局所化している様子も特定された（図５Ｆ〜５Ｊ）。運動皮質中のＧＦＰ＋ニューロンの存在と一貫して、多数のＧＦＰ＋皮質脊髄軸索が延髄の前領域（錐体）中に存在する様子がみられた（図５Ｋ）。加えて、高密度の順行ラベル付けされたＧＦＰ＋脊髄網様末端が網様体全体においてみられ（図５Ｌ）、脊髄視床末端が視床核においてみられた（図示せず）。

同様に、ブタにおいてみられるように、高密度のＧＦＰ＋ピラミッドニューロンが両側性運動皮質中に局所化している様子がラットにおいてみられた（図６Ａ〜６Ｄ）。同様の高レベルのＧＦＰ発現が赤核においてもみられ、両側に局所化したＧＦＰ＋核ニューロンクラスタの存在によって容易に特定される（図６Ｅ〜６Ｇ）。

実施例５
分離局部的な脊柱トランスジーン発現
髄腔内対軟膜下ＡＡＶ９送達
次に、同じ動物（ラット）においてＡＡＶ９を腰部（Ｌ１−Ｌ２）髄腔内空間内に注入し（ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ）および胸Ｔｈ７分節（ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＲＦＰ）の軟膜下空間内に注入した後、脊柱トランスジーン発現の分配を比較した。腰部髄腔内ＡＡＶ９注入の３週間後に軟膜下ＡＡＶ９注入を行い、軟膜下ＡＡＶ９注入の３週間後に発現パターンを横断腰部脊髄部位において分析した。ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰの髄腔内注入の結果、ラミナＶ〜ＶＩＩ後角（ラミナＩＩ−ＩＩＩ）および中央部分中の脊椎索、一次求心神経において、高ＧＦＰ発現が得られた。ＣＨＡＴ＋α運動ニューロンの近隣の前角において終端しているいくつかのＧＦＰ＋Ｉａ求心神経も特定された。一次求心神経中の高ＧＦＰ発現と一貫して、多数のＧＦＰ＋ニューロンが後根神経節細胞においてみられた（図７Ｂ）。ＧＦＰ発現の増加の明確な増加が、前根入口帯の周辺において一貫してみられた（図７Ａおよび７Ｆ）。この領域において、いくつかのＧＦＰ発現グリア細胞がみられた。同様に、２〜３個のＧＦＰ＋細胞が後根入口帯においてみられた。前灰白質において、いくつかのα運動ニューロンがＧＦＰ発現を示した（図７Ｇ）。ＧＦＰ発現を示したこれらの領域および細胞基を除いて、ニューロンまたはグリアＧＦＰ発現のほとんど完全な欠失が灰白質の他のより深い領域（例えば、後角、中間帯および横および前索の白質）においてみられた（図７Ａ）。興味深いことに、表在後角中に局所化しかつ髄腔内空間のごく近隣にある（が軟膜によって分離されている）ニューロンの場合、ＧＦＰ発現は全くみられなかった（図７Ｃおよび７Ｄ）。

髄腔内ＡＡＶ９−ＵＢＩ−ＧＦＰ送達後にみられるＧＦＰ発現パターンと対照的に、頸部軟膜下ＡＡＶ９注入に起因するＲＦＰ発現は、同一腰部脊髄切片において分析した場合に実質的に異なる局部的発現パターンを示した。ｄｓＲＥＤ発現が白質中の大部分の軸索において同定され、横および前索中に存在した。後角、中間帯（ラミナＶＩＩ）および前角の灰白質中に突出した多数の軸索もみられた（図７Ａ）。共焦点顕微鏡を用いたところ、実質的に全てのＲＦＰ＋繊維が白質または灰白質がＧＦＰ陰性であることが判明した。興味深いことに、多数のＲＦＰ＋皮質脊髄軸索が脊椎索上に残っている様子がＧＦＰラベル付けされた一次求心神経のごく近隣においてみられたが、ＲＦＰ＋ＧＦＰの共局在はこれらの繊維のいずれにおいてもみられなかった（図７Ｅ）。

本発明について上記の例を参照して述べてきたが、変更および改変が本発明の意図および範囲内に包含されることが理解される。よって、本発明は、以下の特許請求の範囲のみによって制限される。

Claims (26)

1. 対象の軟膜下空間へ核酸分子を投与することを含む、対象中での核酸分子の脊柱トランス実質感染の方法。
2. 投与ステップが、
   （ａ）対象の脊椎の脊髄分節を露出させること、
   （ｂ）脊髄分節内に軟膜開口部を設けること、
   （ｃ）カテーテルを軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させること、および
   （ｄ）核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させること
   を含む請求項１記載の方法。
3. 軟膜開口部が、軟膜をＬ字型形状のステンレススチールチューブによって穿刺することによって設けられ、カテーテルをチューブを通じて軟膜下空間内へ前進させる請求項２記載の方法。
4. 核酸分子が、約１〜１０％のデキストロースを含む混合物に入れて投与される請求項１記載の方法。
5. 核酸分子が、ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である請求項１記載の方法。
6. ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターである請求項５記載の方法。
7. ベクターがＡＡＶ９粒子である請求項６記載の方法。
8. ベクターが、神経変性疾患を調節または治療するタンパク質または機能ＲＮＡをコードする核酸分子を含む請求項７記載の方法。
9. 神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病である請求項８記載の方法。
10. 核酸分子が単回注入として送達される請求項１記載の方法。
11. 核酸分子の１回以上の第２の軟膜下注入を対象の脊椎の異なる脊髄分節中に投入することをさらに含む請求項２記載の方法。
12. 核酸分子の１回以上の髄腔内注入を対象へ投与することをさらに含む請求項２の方法。
13. 対象が哺乳動物である請求項１記載の方法。
14. 対象がヒトである請求項１３記載の方法。
15. 遺伝子送達システムであって、
    （ａ）対象の軟膜を穿刺するように構成されたＬ字型形状のガイドチューブと、
    （ｂ）ガイドチューブ内にスライド可能に配置されかつ対象の脊椎の脊髄分節の軟膜下空間内へ前進されるように構成されたカテーテルと、
    （ｃ）カテーテルと流体連通しかつ核酸分子を含む組成を含むリザーバと、
    を含むシステム。
16. Ｌ字型形状のガイドチューブが１６〜２６Ｇのステンレススチールチューブである請求項１５記載の方法。
17. カテーテルがポリエチレンチュービングから形成される請求項１５記載の方法。
18. 対象の軟膜下空間へ核酸分子を送達する方法であって、
    （ａ）対象の脊椎の脊髄分節を露出させること、
    （ｂ）脊髄分節内に軟膜開口部を設けること、
    （ｃ）請求項１６の脊髄分節遺伝子送達システムの情報に位置決めすること、
    （ｄ）カテーテルを軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させること、および
    （ｅ）核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させること
    を含む方法。
19. 必要としている対象において神経変性疾患を治療する方法であって、ベクターまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を対象の軟膜下空間へ投与することを含む方法。
20. 投与ステップは、
    （ａ）対象の脊椎の脊髄分節を露出させること、
    （ｂ）脊髄分節内に軟膜開口部を設けること、
    （ｃ）カテーテルを軟膜開口部を通じて軟膜下空間内へ前進させること、および
    （ｄ）核酸分子を対象の軟膜下空間へ送達させること
    を含む請求項１９の方法。
21. 軟膜開口部は、軟膜をＬ字型形状のステンレススチールチューブによって穿刺することによって設けられ、カテーテルは、チューブを通じて軟膜下空間内へ前進させられる請求項２０記載の方法。
22. 神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病である請求項１９の方法。
23. 対象の脊椎の異なる脊髄分節中へベクターまたはＡＳＯの１回以上の第２の軟膜下注入を投与することをさらに含む請求項１９の方法。
24. ベクターまたはＡＳＯの１以上の髄腔内注入を対象へ投与することをさらに含む請求項１９の方法。
25. 対象が哺乳動物である請求項１９記載の方法。
26. 対象がヒトである請求項２５記載の方法。