JP2018054495A - 血液検査用センサチップ、血液検査装置及び血液検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】同一流路内において、標的物質の定量的計測を行うとともに、血液のヘマトクリット値を精度良く計測可能な血液検査用センサチップ、並びに、当該センサチップを使用した血液検査装置及び血液検査方法を提供する。【解決手段】本発明の血液検査用センサチップは、血液を流すための第１流路と、第１流路の上流又は下流に位置し、第１流路よりも流路の幅が広い第２流路とを有する。また、本発明の血液検査装置は、前記血液検査用センサチップと、前記血液検査用センサチップに光を照射する投光部と、前記血液検査用センサチップから出射した光の光量を測定する計測部とを有する。また、本発明の血液検査方法は、前記血液検査用センサチップを用いて、血液中に存在する標的物質を含む試料液を第１流路及び第２流路に供給し、第１流路を用いて前記標的物質の定量的計測を行うとともに、第２流路を用いて血液のヘマトクリット値を計測する。【選択図】図３

Description

本発明は、血液検査に使用する血液検査用センサチップ、並びに、当該センサチップを使用した血液検査装置及び血液検査方法に関するものである。具体的には、血液中に存在する特定の物質の定量的測定を行うとともに、血液のヘマトクリット値をも計測する血液検査用センサチップ、並びに、当該センサチップを使用した血液検査装置及び血液検査方法に関するものである。

血液中に存在する特定の物質（例えば、タンパク質、グルコースなど）の濃度等を測定して当該物質の情報を定量的に把握する血液検査は、種々の疾患の診断や治療において重要である。例えば、心筋細胞の壊死によりその細胞質に存在するトロポニンが血液中に逸脱することから、血液中のトロポニン濃度を把握することは、心筋梗塞の早期発見において大きな意味を持つ。

血液中に存在する特定の物質（以下、標的物質とする。）の情報を取得する手段として、微細流路を有するセンサチップを利用した計測方法がある。当該微細流路の中には、標的物質と反応する反応系が設けられており、血液由来の試料液等が微細流路内に供給され反応系と接触した場合、標的物質と反応系との反応が進行する。当該反応の結果に基づいて、標的物質の濃度等に応じた情報を取得することができる。

しかしながら、血球を含有する全血を試料液として使用した場合、標的物質の濃度等に応じた情報の検出結果が血液のヘマトクリット値に大きく影響される。ヘマトクリット値とは、血液中に占める赤血球の容積の割合を示す数値である。そのため、標的物質の濃度等の情報を正確に検出するためには、ヘマトクリット値に基づいて検出結果を補正する必要があり、ヘマトクリット値を正確に把握しなければならない。

そこで、特許文献１は、同一流路内において、血液中の特定成分の濃度を計測するとともに、血液のヘマトクリット値に基づいた補正値を光学的方法により計測し、計測された補正値に基づいて血液中の特定成分の濃度を補正する計測方法を提供している。

特許第４７８５６１１号公報

微細流路を有するセンサチップを利用した計測方法において、吸光度など光学的方法によってヘマトクリット値を計測する場合は、試料液を通過した測定光を検出する必要があるため、測定光の光路長は微細流路の寸法により制限されざるを得ない。

そして、下記式１によれば、試料液の吸光度Ａは、試料液のモル吸光係数εと、試料液の濃度Ｃと、光路長ｌとの積で表すことができる。すなわち、一定のモル吸光係数ε、且つ、一定の濃度Ｃ下において、試料液の吸光度Ａは光路ｌが短くなるに連れて減少していく。なお、式１において、Ａは試料液の吸光度、Ｉ_１は透過光強度、Ｉ_０は入射光強度、εは試料液のモル吸光係数、Ｃは試料液の濃度、ｌは光路長である。
Ａ＝−ｌｏｇ（Ｉ_１／Ｉ_０）＝ε・Ｃ・ｌ （１）

反応系に標的物質を集中させ反応効率を向上させる観点から、流路の高さは、反応可能な領域になるべく一致させ、無駄な空間を無くすべく、小さくすることが望ましい。しかしながら、特許文献１に開示されている発明のように、流路の底面に反応系が設けられ、流路の高さが測定光の光路長となっている場合、流路の高さを小さくすると、測定光の光路も短くなり、既述の通りに試料液の吸光度が減少することから、ヘマトクリット値の測定精度が低下する。

一方、光路長を増やそうとして流路高さを大きくすると、式１によれば試料液の吸光度が増大するにもかかわらず、測定光が試料液中の夾雑物による吸収、散乱等の影響を受けやすくなるため、ヘマトクリット値を精度良く計測することは依然として実現されない。

特に、トロポニンのような血液中においてそもそも希少な物質を標的物質とする場合、前述した測定精度の影響が顕著に現れ、ヘマトクリット値を計測することができたとしても、それは十分な精度を有するものではないため、得られたヘマトクリット値による補正を行って標的物質の濃度など正確な情報が取得することはできない。

更に、特許文献１に開示されているような発明は、波長の異なる複数の光源を必要とするため、測定方法ないし測定装置の構成自体が煩雑にならざるを得ないという問題点もある。

本発明の血液検査用センサチップは、血液を流すための第１流路と、前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、を有することを特徴とする。

本発明の血液検査装置は、血液を流すための第１流路と、前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、を有する血液検査用センサチップと、前記血液検査用センサチップに光を照射する投光部と、前記血液検査用センサチップから出射した光の光量を測定する計測部と、を有することを特徴とする。

本発明の血液検査方法は、血液を流すための第１流路と、前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、を有する血液検査用センサチップを用いて、前記血液中に存在する標的物質を含む試料液を、前記第１流路及び前記第２流路に供給し、前記第１流路を用いて前記標的物質の定量的計測を行うとともに、前記第２流路を用いて前記血液のヘマトクリット値を計測することを特徴とする。

本発明によれば、同一流路内において、標的物質の定量的計測を行うとともに、血液のヘマトクリット値を精度良く計測することが可能となる。また、本発明によれば、標的物質の定量的計測と血液のヘマトクリット値の計測とを、単純化した装置又は方法により行うことが可能となる。

計測装置の構成を示す模式図である。 制御演算部のブロック図である。 センサチップの断面図である。 入射光及び各被測定光の光路を示す模式図である。 計測装置の動作を説明するためのフローチャートである。 透過率の測定可能範囲と入射光の光路長との相関関係を示すグラフである。

以下、図面を参照しながら本発明を実施するための一形態について説明する。なお、本実施形態は、標的物質の濃度を計測する方法として、抗原抗体反応を用いて標的物質を捕捉し、捕捉した標的物質に蛍光標識を付与し当該蛍光標識から発せられる蛍光強度を計測する表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ）法を採用しているが、本発明はこの方法に限定されるものではない。例えば、標的物質の濃度の計測には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ)、蛍光イムノアッセイなどの方法を用いても良い。

（計測装置）
まずは、本実施形態に係る計測装置１０の構成について説明する。

図１は、計測装置１０の構成を示す模式図である。計測装置１０は、血液中に存在するトロポニン（Ｔｎ）を標的物質とし、その濃度をＳＰＦＳ法により計測するとともに、試料液の吸光度により血液のヘマトクリット（Ｈｃｔ）値をも計測するものである。ただし、標的物質としては、トロポニン以外にも、例えばシスタチン、Ｄダイマー（D-dimer）、ＢＮＰ（B-type natriuretic peptide）、ＣＲＰ（C-reactive protein）などを計測するようにしても良い。なお、試料液とは、受検者から直接に採取した血液、又はそれを、緩衝液などにより所望の濃度に希釈したものをいう。

図１に示すように、計測装置１０は、投光部２０と、計測部４０と、制御演算部５０と、搬送部８０と、送液部９０とからなる。計測の際、計測装置１０本体にセンサチップ３０が装着される。

投光部２０は、図示しない光源と、光源から発せられた入射光４１をセンサチップ３０の反射面３１ａの所定位置に誘導する光路を構築するための各光学素子（図示しない）と、センサチップ３０の反射面３１ａから出射する反射光４４を受けるためのフォトダイオード２１とからなる。

光源は、波長が２００〜９００ｎｍの光を発生可能なレーザーダイオードであり、波長が５００〜７００ｎｍの光を発生可能なものが特に好ましい。ただし、光源はレーザーダイオードに限定されず、波長が前述範囲内の光を発生可能なものであれば良い。例えば、波長が２００〜９００ｎｍの光を発生可能なＬＥＤであっても良い。光源が、波長が５００〜７００ｎｍの光を発生可能なものである場合、光源から発せられた光は、Ｔｎの濃度を計測するための励起光と、血液のＨｃｔ値を計測するための測定光として兼用されることができる。これにより、１つの光源でＴｎの濃度と血液のＨｃｔ値とを計測することが可能となり、計測装置を簡略化することが可能となる。ただし、異なる波長を発生可能な２つの光源を備え、計測の種別によって入射させる光源を選択可能なように構成されていても良い。

各光学素子は、図示しないが、Ｔｎの濃度を計測する場合は、後述するトロポニン捕捉膜６１の位置に対応するセンサチップ３０の反射面３１ａ上の領域に、Ｈｃｔ値を計測する場合はセンサチップ３０の開口３８に、所定の入射角θで入射するように入射光４１を誘導する光路を形成している（センサチップ３０の構造の詳細に関しては後述する）。ただし、これは光路を切り替えることで入射光４１の当たる箇所を制御する場合である。各光学素子が一通りの光路のみ形成し、計測の種別によって光路を切り替えずに、センサチップ３０を移動させて入射光４１の当たる箇所を切り替えるように構成されていても良い。

フォトダイオード２１は、反射光４４の光路上に配置され、反射光４４の光量を測定するものである。Ｔｎの濃度を計測する場合、反射光４４の光量が極小になる時の入射角たる共鳴角が、測定時の入射光４１の入射角θとして特定される。なお、この場合、入射光４１は、Ｔｎに付与された蛍光標識を励起するいわゆる励起光として機能する。反射光４４の光量によって入射光４１（励起光）の入射角θの特定を行わない場合、フォトダイオード２１を省略し、光吸収体等のものに置き換えても良い。

計測部４０は、図示しないが、蛍光測定部と吸光度測定部と、２つの測定機構からなる。Ｔｎの濃度を計測する場合、被測定光４２は計測部４０に出射し、蛍光測定部により光量が測定され、Ｈｃｔ値を計測する場合、被測定光４２は計測部４０に出射し、吸光度測定部により光量が測定される。

蛍光測定部は、受光素子として、光電子増倍管を備える。光電子増倍管は、Ｔｎの濃度を計測する場合の被測定光４２の光路上に配置され、被測定光４２の光量を測定する。なお、この場合、被測定光４２は、Ｔｎに付与された蛍光標識から発せられたいわゆる表面プラズモン励起蛍光（被測定光４２ａ）である。被測定光４２ａの光量は、Ｔｎの濃度の特定に用いられる。

また、光電子増倍管は、散乱光４３の光量をも測定するようにしても良い。この場合、散乱光４３の光量は、Ｔｎの濃度を計測する場合の入射光４１の入射角θの特定に用いられ、散乱光４３の光量が極大になる時の入射角たる増強角θｒが、測定時の入射光４１の入射角θとして特定される。入射光４１の入射角θを、フォトダイオード２１により既述のように特定する場合は、散乱光４３の光量を測定する必要はない。

吸光度測定部は、受光素子として、光電子増倍管を備える。ただし、吸光度測定部の受光素子としては、ＣＭＯＳ（complementary metal-oxide-semiconductor）やフォトダイオードなどを使用しても良い。光電子増倍管は、Ｈｃｔ値を計測する場合の被測定光４２の光路上に配置され、被測定光４２の光量を測定する。なお、この場合、被測定光４２は、試料液を通過した入射光４１（被測定光４２ｂ）である。被測定光４２ｂの光量は、血液のＨｃｔ値の特定に用いられる。

吸光度測定部の受光素子として、光電子増倍管又はフォトダイオードを使用する場合、吸光度測定部は、蛍光測定部の光電子増倍管又はフォトダイオード２１を用いて受光するように構成されていても良い。いずれの場合においても、２つの測定機構を用意する必要がなくなる。

搬送部８０は、センサチップ３０を着脱自在に保持するホルダーと、自在に移動可能な搬送ステージとからなる。計測を行う際、センサチップ３０がホルダーに装着される。搬送ステージは、ホルダーに装着されたセンサチップ３０を移動させ、計測光路から離れた反応位置Ａ、又は計測光路上に位置する測定位置Ｂに配置する（測定装置の動作の詳細については後述する）。

送液部９０は、シリンジポンプと、シリンジポンプを駆動する駆動機構と、試料液など液体を一時的に保持するピペットチップを所定の位置に移動させる移動機構とからなる。

シリンジポンプは、シリンジと、シリンジ内を往復運動可能なプランジャーとからなる。シリンジの先端にピペットチップが装着される。プランジャーの往復運動により液体が定量的に吸引又は吐出される。駆動機構は、プランジャーを往復運動させる手段であり、例えば、ステッピングモーターからなる。移動機構は、シリンジの先端に装着されたピペットチップを移動させる手段であり、例えば、ロボットアーム、２軸ステージ、又は上下動自在なターンテーブルからなる。

また、送液部９０は、ピペットチップの先端の位置を検出する手段を更に有することが、センサチップ３０におけるピペットチップの位置を相対的に調整する、及びセンサチップ３０内の残液量を一定に管理する観点から好ましい。

制御演算部５０は、ＣＰＵと、ＲＡＭと、記憶装置と（ＲＯＭ、ハードディスク、不揮発性半導体メモリーなど）からなるコンピューターである。記憶装置には、制御演算部５０に読取可能・実行可能なプログラムが格納されており、制御演算部５０は、当該プログラムを実行することにより既述各部の動作を制御し所望の機能を実現させる。

図２は、制御演算部５０のブロック図である。図２を用いて、制御演算部５０の制御・演算機能について説明する。

制御演算部５０は、図２に示すように、ＣＰＵ５１と、投光制御部５２と、搬送制御部５３と、送液駆動制御部５４と、送液移動制御部５５と、送液位置制御部５６と、計測制御部５７と、計測演算部５８とを備える。

ＣＰＵ５１は、計測全体の制御を行い、必要に応じて後述する各制御部又は演算部を作動させる。投光制御部５２は、所定の光源を照射させ所定の位置に入射させる。搬送制御部５３は、搬送部８０の搬送ステージを、計測光路から離れた反応位置Ａ、又は計測光路上に位置する測定位置Ｂに移動させる。送液駆動制御部５４は、シリンジポンプのプランジャーを移動させ、所定の液体を所定量、所定速度で吸引又は吐出する。送液移動制御部５５は、シリンジの先端に装着されたピペットチップを所定の位置に移動させる。送液位置制御部５６は、ピペットチップの先端位置を検出しそれを微調整する。計測制御部５７は、Ｔｎの濃度を計測する場合の表面プラズモン励起蛍光（被測定光４２ａ）の光量測定を行うか、又はＨｃｔ値を計測する場合の試料液の吸光度測定を行うかによって、対応する計測機構を切り替える。計測演算部５８は、表面プラズモン励起蛍光の光量からＴｎの濃度を算出する処理と、試料液の吸光度から血液のＨｃｔ値を算出する処理と、その他データの補正処理等を行う。

以上により、Ｔｎの濃度と血液のＨｃｔ値とを、単純化した装置により行うことが可能となる。

（センサチップ）
次に、本実施形態に係るセンサチップ３０の構造について説明する。

図３は、センサチップ３０の断面図である。センサチップ３０は、図３に示すように、底面部材３２と、流路シート３３と、流路蓋３５とからなる。

底面部材３２は、台形を底面とする柱体である。ただし、底面部材３２の形状は、これに限定されず、適宜変更することが可能である。図３に示すように、底面部材３２は、支持部材３２ａと、プリズム３２ｂとからなる。

支持部材３２ａは、アクリル樹脂からなる。ただし、支持部材３２ａの材料は、これに限定されず、入射光４１に対して透明な材料であれば良い。プリズム３２ｂは、入射光４１に対して透明な誘電体からなる。プリズム３２ｂの流路蓋３５側の表面には、金属薄膜３２ｃが形成されている。この金属薄膜３２ｃが形成された領域に対応するプリズム３２ｂの面を、反射面３１ａと称する。

金属薄膜３２ｃは、金の薄膜である。ただし、金属薄膜３２ｃの材料は、これに限定されず、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば良い。例えば、金、銀、銅、アルミニウム、又はこれらの合金を含むものであっても良い。金属薄膜３２ｃの膜厚は、特に限定されるものではないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

流路シート３３は、底面部材３２と流路蓋３５とを接合する接着剤としての機能も兼ねる。流路シート３３には、図示しないが、微細流路６０を形成するための細長い開口である流路溝が形成されている。流路溝は、例えば幅が０．１〜５ｍｍであり、長さが１０〜５０ｍｍである。

流路蓋３５は、アクリル樹脂からなる構造体である。ただし、流路蓋３５の材料は、これに限定されず、入射光４１及び被測定光４２に対して透明な材料であれば良い。これにより、入射光４１及び被測定光４２が流路蓋３５を通過する際に、散乱が低減する。なお、被測定光４２とは、Ｔｎの濃度を計測する場合は表面プラズモン励起蛍光（被測定光４２ａ）であり、Ｈｃｔ値を計測する場合は試料液を通過した入射光４１（被測定光４２ｂ）である。また、流路蓋３５の材料として成型性の良いものを使用すれば、Ｈｃｔ値を計測する場合の被測定光４２ｂの所望の光路長を確保することができる。

流路蓋３５は、流路シート３３を介して底面部材３２と接合される。流路蓋３５と底面部材３２とが接合された際に、流路シート３３が流路蓋３５の流路シート３３側の底面と底面部材３２の流路蓋３５側の表面とに挟まれて、流路シート３３に形成された流路溝が微細流路６０となる。微細流路６０の高さは、後述するように、流路蓋３５の流路シート３３側の底面の構造に応じて変化するが、例えば０．１〜６ｍｍである。微細流路６０内には、Ｔｎとの反応場となるトロポニン捕捉膜６１が設けられている。トロポニン捕捉膜６１は、Ｔｎと特異的に反応するトロポニン捕捉抗体が金属薄膜３２ｃに固定されてなる。Ｔｎの濃度を計測する場合、Ｔｎを含んだ試料液を微細流路６０内に供給すれば、試料液とトロポニン捕捉膜６１とが接触することにより、Ｔｎは、トロポニン捕捉抗体と反応して捕捉され、トロポニン捕捉膜６１に留まる。

微細流路６０一方端は、ピペットチップを挿入するためのインターフェース３６と接続されており、微細流路６０の他方端は、液体を流路内を往復させる時に液体が撹拌されるようにするための混合槽３７と接続されている。液体とは、計測に使用される各種試薬や試料液等のことを言い、例えば、試料液、測定液、洗浄液、蛍光標識液である。インターフェース３６の微細流路６０と接続されない開口には、インターフェース密閉シール３６ａが貼り付けられており、混合槽３７の微細流路６０と接続されない開口には、混合槽シール３７ａが貼り付けられている。混合槽シール３７ａには通気性を確保するための通気孔３７ｂが設けられている。

インターフェース密閉シール３６ａは、ポリウレタンからなるフィルムである。ただし、インターフェース密閉シール３６ａの材質は、これに限定されず、ピペットチップをインターフェース３６の中に挿入した際、ピペットチップとインターフェース密閉シール３６ａとが互いに密着して、インターフェース３６を、液体を微細流路６０内に供給できる程度に密閉することができるものであれば良い。例えば、インターフェース密閉シール３６ａの材質は、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ナイロン、無延伸ポリプロピレン（ＣＰＰ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、シリコーン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）などであっても良い。

流路蓋３５のインターフェース３６側の底面には、微細流路６０の高さを増やすための切り欠き３８が設けられている。これにより、切り欠き３８が設けられた箇所において、微細流路６０の高さが、切り欠き３８が設けられていない箇所より大きくなる。

図４は、入射光４１及び被測定光４２の光路を示す模式図である。図４に示すように、Ｔｎの濃度を計測する場合、入射光４１は、プリズム３２ｂの図示しない入射面に入射し、微細流路６０内に形成されたトロポニン捕捉膜６１の位置に対応する反射面３１ａ上の領域に当たるように入射され、被測定光４２ａは、計測部４０に出射し、蛍光測定部にて光量が測定される。一方、Ｈｃｔ値を計測する場合、入射光４１は、支持部材３２ａの流路蓋３５側とは反対側の面から、微細流路６０と切り欠き３８とを通過するように入射され、被測定光４２ｂは、計測部４０に出射し、吸光度測定部にて光量が測定される。これにより、切り欠き３８により微細流路６０の高さが増えた分だけ、Ｈｃｔ値を計測する場合の入射光４１の光路長が長くなる。

このＨｃｔ値を計測する場合の入射光４１の光路長ともなる部分の微細流路６０の高さは、詳細については後述するが、例えば、切り欠き３８が設けられていない部分の微細流路６０の高さが０．１〜１ｍｍであるのに対して、０．１ｍｍを超えて６ｍｍ以下であることが好ましい。ただし、切り欠き３８を設ける箇所は、これに限定されず、Ｈｃｔ値を計測する際の入射光４１の方向によって適宜変更することが可能である。また、切り欠き３８が設けられていない流路蓋３５の底面の部分に隣接する切り欠き３８の部分は、図３に示すように、角を持たない滑らかな構造とすれば、試料液等の液体を微細流路６０から回収した際に、液体が流路蓋３５の底面に付着して微細流路６０内に残留してしまうことを防止することができる。

また、センサチップ３０は、１以上の液体収容部を有する図示しない試薬チップに着脱自在に構成されている。計測を行う際、センサチップ３０は試薬チップに装着され、試薬チップごとに搬送部８０のホルダーに装着される。ただし、センサチップ３０は、必ずしも試薬チップと一体化する必要はなく、試薬チップとは別々に用意し、センサチップ３０のみが搬送部８０のホルダーに装着されるように構成しても良い。また、センサチップ３０又は試薬チップに、ピペットチップを収納する機能を有しても良い。

試薬チップの各液体収容部は、標的物質（トロポニン）を含む検体と、検体を希釈するための希釈液と、測定に実際に使用される試料液と、抗体等の活性を維持するための測定液と、夾雑物等を洗浄するための洗浄液と、標的物質（トロポニン）に蛍光標識を付与するための蛍光標識液と、血液中の血球成分を溶かすための溶血剤と、使用済みの前述した各液体である廃液とをそれぞれ収容する。検体は、受検者から直接に採取した血液である。希釈液は、ＢＳＡ（bovine serum albumin）、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＳＩ、ＮａＮ３、ＣＭＤ（carboxymethyl-dextran）、ＨＡＭＡ（human anti-mouse antibodies）阻害剤、ＰＢＳＴ（phosphate buffered saline with Tween 20）からなる。試料液は、希釈液により希釈された検体である。測定液は、ＢＳＡ、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＳＩ、ＮａＮ_３、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）からなる。洗浄液は、Ａｎｔｉｆｏａｍ ＳＩ、ＮａＮ_３、ＰＢＳＴからなる。蛍光標識液は、ＣＦ６６０を標識した２次抗体、ＰＢＳＴからなる。

（測定装置の動作）
次に、本実施形態に係る計測装置１０の動作について説明する。図６は、計測装置１０の動作を説明するためのフローチャートである。

まずは、Ｔｎ濃度計測用の試料液と、Ｈｃｔ値計測用の試料液とを調製する（ステップＳ１０１）。具体的には、試薬チップの液体収容部に予め収納された検体と希釈液とを用いて、検体を所望の濃度に希釈する。

次に、微細流路６０内を洗浄する（ステップＳ１０２）。具体的には、測定液を微細流路６０内に供給し、微細流路６０内を往復させる。測定液は、洗浄の機能も兼ねているため、これにより、微細流路６０内が洗浄されるとともに、トロポニン捕捉膜６１にトロポニン捕捉抗体の捕捉能力を長期間維持するための保護層が塗布されている場合、保護層が除去される。ただし、測定液の代わりに、洗浄液を用いて前述した微細流路６０内の洗浄を行っても良い。また、トロポニン捕捉膜６１に前述した保護層が塗布されておらず、且つ、微細流路６０内及びトロポニン捕捉膜６１が清潔である場合は、必ずしも洗浄を行う必要はない。

次に、測定液を回収せずに、測定液が微細流路６０に満たされたまま増強角を走査する増強測定を行う（ステップＳ１０３）。この際、センサチップ３０は測定位置Ｂに配置される。具体的には、入射角θを変更しつつ入射光４１を走査させ、散乱光４３の光量が極大になる時の入射角たる増強角を、Ｔｎの濃度を計測する場合の入射光４１の入射角θとして特定する。ただし、既述の通りに、入射角θを変更しつつ入射光４１を走査させ、反射光４４の光量が極小になる時の入射角たる共鳴角を、測定時の入射光４１の入射角θとして特定しても良い。

次に、測定液を回収せずに、測定液が微細流路６０に満たされたまま、Ｔｎが存在しない時の蛍光強度を測定する蛍光ブランク測定を行う（ステップＳ１０４）。具体的には、トロポニン捕捉膜６１の位置に対応する底面部材３２の反射面３１ａ上の領域に当たり、且つ、入射角θがステップＳ１０３にて特定された増強角となるように入射光４１を入射させ、計測部４０の蛍光測定部にて被測定光４２ａの光量を測定する。蛍光ブランク測定終了後、微細流路６０内に供給された測定液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、Ｔｎとトロポニン捕捉抗体とを結合させる１次反応を行う（ステップＳ１０５）。具体的には、Ｔｎ濃度計測用の試料液を微細流路６０内に供給し、微細流路６０内を往復させる。Ｔｎ濃度計測用の試料液中にはＴｎが存在するため、当該試料液が微細流路６０に満たされた際、Ｔｎはトロポニン捕捉膜６１に存在するトロポニン捕捉抗体と接触し、特異的反応を起こして捕捉され、トロポニン捕捉膜６１に留まる。反応に充分な時間が経過した後、当該試料液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、微細流路６０内に非特異的に吸着したＴｎや夾雑物などを除去するために、微細流路６０内を洗浄する（ステップＳ１０６）。具体的には、洗浄液を微細流路６０内に供給し、微細流路６０内を往復させる。洗浄終了後、洗浄液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、トロポニン捕捉膜６１に捕捉されたＴｎに蛍光標識を付与する２次反応を行う（ステップＳ１０７）。具体的には、試薬チップの液体収容部に予め収納された蛍光標識液を微細流路６０内に供給し、微細流路６０内を往復させる。蛍光標識液が微細流路６０に満たされた際、蛍光標識液とトロポニン捕捉膜６１とが接触し、蛍光標識液中に存在する標識用蛍光物質とトロポニン捕捉抗体に捕捉されたＴｎとが結合し、トロポニン捕捉抗体に捕捉されたＴｎに蛍光標識が付与される。反応に充分な時間が経過した後、蛍光標識液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、微細流路６０内に非特異的に吸着した標識用蛍光物質や夾雑物などを除去するために、微細流路６０内を洗浄する（ステップＳ１０８）。具体的には、洗浄液を微細流路６０内に供給し、微細流路６０内を往復させる。洗浄終了後、洗浄液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、測定液を微細流路６０内に供給し、トロポニン捕捉膜６１に捕捉されたＴｎから発せられた蛍光のシグナルを測定する蛍光シグナル測定を行う（ステップＳ１０９）。具体的には、入射光４１を、トロポニン捕捉膜６１の位置に対応する底面部材３２の反射面３１ａ上の領域に当たり、且つ、入射角θがステップＳ１０３にて特定された増強角となるように入射させる。入射した入射光４１は、底面部材３２の反射面３１ａで反射されるが、反射する際、反射面３１ａから金属薄膜３２ｃ側にエバネッセント波が発生し浸透する。浸透したエバネッセント波の電場は、金属薄膜３２ｃの表面プラズモンに共鳴し増強され、トロポニン捕捉膜６１に捕捉されたＴｎに付与された蛍光標識を励起する。蛍光標識は、励起されると、表面プラズモン励起蛍光（被測定光４２ａ）を放射する。制御演算部５０は、計測部４０の蛍光測定部に被測定光４２ａの光量を測定させ、測定された被測定光４２ａの光量に基づいてＴｎの濃度を特定する。

蛍光シグナル測定終了後、測定液を回収せずに、測定液が微細流路６０に満たされたまま、試料液が存在しない時に光路を通過した入射光４１の光量を測定する吸光度ブランク測定を行う（ステップＳ１１０）。この吸光度ブランク測定を行うことにより、Ｈｃｔ由来の吸光度変化のみを計測することが可能となる。具体的には、入射光４１を、支持部材３２ａの流路蓋３５側とは反対側の面から、微細流路６０と切り欠き３８とを通過し、且つ、入射角θが０度となるように入射させ、計測部４０の吸光度測定部にて、計測部４０に光路上に存在する測定液を通過した入射光４１の光量を測定する。ただし、この場合の入射角は、支持部材３２ａと微細流路６０との界面の臨界角未満であれば良く、特に限定されるものではない。吸光度ブランク測定終了後、微細流路６０内に供給された測定液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。

次に、予め調製され、試薬チップの液体収容部に収納されているＨｃｔ値計測用の試料液に、溶血剤を添加して混合させる（ステップＳ１１１）。溶血剤を試料液に添加することにより、血液中の血球成分が溶解し、その濃度分布がより均一になるため、吸光度測定におけるノイズが低減される。

次に、溶血剤が添加されたＨｃｔ値計測用の試料液を微細流路６０内に供給し、当該試料液の吸光度を測定する吸光度シグナル測定を行う（ステップＳ１１２）。具体的には、入射光４１を、支持部材３２ａの流路蓋３５側とは反対側の面から、微細流路６０と切り欠き３８とを通過し、且つ、入射角θが０度となるように入射させる。ただし、この場合の入射角は、支持部材３２ａと微細流路６０との界面の臨界角未満であれば良く、特に限定されるものではない。入射した入射光４１は、光路上に存在する試料液を通過し、計測部４０に出射する。制御演算部５０は、計測部４０の吸光度測定部に試料液を通過し出射した光（被測定光４２ｂ）の光量を測定させ、測定された被測定光４２ｂの光量に基づいて血液のＨｃｔ値を特定する。吸光度シグナル測定終了後、微細流路６０内に供給された試料液は制御演算部５０の制御により微細流路６０から回収され、試薬チップの廃液を収容する液体収容部に移転される。センサチップ３０は廃棄される。

次に、制御演算部５０は、蛍光ブランク測定及び吸光度ブランク測定の測定結果、並びに、蛍光シグナル測定及び吸光度シグナル測定により得られたＴｎの濃度及びＨｃｔ値等に基づいて、Ｔｎ濃度の正確値を算出する後処理（ステップＳ１１３）を行い、計測を終了する。

また、本実施形態は、Ｈｃｔ値を計測する前にＴｎの濃度計測を行うことで、Ｈｃｔ値計測時にＴｎとトロポニン捕捉抗体とが反応してしまい、その後に行われるＴｎの濃度計測の計測精度を低下させてしまうことを防止することができる。ただし、本発明に係る測定方法は、この順序に限定されず、Ｔｎとトロポニン捕捉抗体とが反応してしまうことを防止できれば、Ｔｎの濃度計測の前にＨｃｔ値の計測を行っても良い。

以上により、切り欠き３８を設けることでＨｃｔ値を計測する場合の入射光４１の光路長が長くなるため、同一流路内において、Ｔｎの濃度を計測するとともに、血液のＨｃｔ値を精度良く計測することができ、蛍光光量測定及び吸光度測定といった単純な方法によりＴｎの濃度を正確に計測することが可能となる。

（Ｈｃｔ値を計測する場合の入射光の光路長と試料液濃度との関係）
切り欠き３８が設けられており、Ｈｃｔ値を計測する場合の入射光４１の光路長ともなる部分の微細流路６０の高さは、以下に説明するように、Ｈｃｔ値計測用の試料液の濃度に合わせて、吸光度の分解能が最適になるように調整することできる。

既述の通りに、Ｈｃｔ値は、試料液の吸光度に基づいて特定される。Ｈｃｔ値を計測する場合、被測定光４２ｂの光量が実際に測定され、既述の式１により、被測定光４２ｂ強度と入射光４１強度との比率（Ｉ_１／Ｉ_０）を算出し試料液の吸光度Ａを算出する。なお、被測定光４２ｂ強度と入射光４１強度との比率（Ｉ_１／Ｉ_０）は、試料液の透過率Ｔである。そのため、試料液の透過率Ｔを精度良く測定することができれば、得られる吸光度Ａの精度も向上し、Ｈｃｔ値を精度良く計測することが可能となる。

図６は、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）と入射光４１の光路長との相関関係を示すグラフである。

透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）とは、人の血液のＨｃｔ値の通常範囲にわたって分布する既知のＨｃｔ値を有する複数の検体を、所定の希釈倍率で希釈し、希釈して得た複数の試料液を異なる光路長にて測定した場合、同一光路長にて測定して得た最大の透過率Ｔｍａｘと最小の透過率Ｔｍｉｎとの差をいう。同一希釈倍率で希釈して得た複数の試料液を異なる光路長にて測定して得た個々の透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）は、図６における同一希釈倍率の曲線をなす。

透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が大きければ、測定によって得られる吸光度Ａの精度、ひいてはＨｃｔ値の精度が向上し、既存の設備を改造などすることなくＨｃｔ値を精度良く計測することが可能となる。すなわち、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）は、測定によって得られる吸光度Ａの分解能を反映した指標の１つである。

表１は、各希釈倍率において、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が１５％以上となる時の光路長の最大値（最大光路長）と、その最小値（最小光路長）と、それらと試料液の濃度Ｃ（希釈倍率の逆数）とのそれぞれの積Ｃ・ｌ（最小積Ｃ・ｌｍｉｎ及び最大積Ｃ・ｌｍａｘ）とを表すものである。既述の式１によれば、試料液の吸光度Ａは、試料液のモル吸光係数εと、試料液の濃度Ｃと、光路長ｌとの積で表すことができることから、一定のε下では、試料液の吸光度Ａは、試料液の濃度Ｃと光路長ｌとの積Ｃ・ｌに比例する。従って、同一希釈倍率において、最小積Ｃ・ｌｍｉｎと最大積Ｃ・ｌｍａｘとは、吸光度Ａを、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が１５％以上となる条件下で測定可能な条件として、試料液濃度Ｃと光路長ｌとの２つの要因を含んだ指標である積Ｃ・ｌの下限と上限を、それぞれ表している。すなわち、同一希釈倍率において、積Ｃ・ｌが最小積Ｃ・ｌｍｉｎ以上で最大積Ｃ・ｌｍａｘ以下となるように光路長ｌを設定すれば、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が１５％以上となるように試料液の吸光度Ａを測定することができ、Ｈｃｔ値を精度良く計測することが可能となる。

更に、表１から分かるように、各希釈倍率における測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が１５％以上となる積Ｃ・ｌの範囲の共通部分は、各最小積Ｃ・ｌｍｉｎの中の最大値である２６と、各最大積Ｃ・ｌｍａｘの中の最小値である１５６とにより規定される。この共通部分の範囲内に、すなわち、積Ｃ・ｌが２６以上で１５６以下となるように光路長ｌを設定すれば、検体を１．５倍以上で２４倍以下のどの希釈倍率で希釈して調製したものを試料液として使用しても、透過率の測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が１５％以上となるように試料液の吸光度Ａを測定することができ、Ｈｃｔ値を精度良く計測することが可能となる。ただし、各積Ｃ・ｌの具体的な数値は、厳密に限定されるものではなく、多少の誤差があっても、同様の効果を奏するものである。

一方、図６から分かるように、光路長ｌが増加するにつれて測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が大きくなるが、各希釈倍率下では、測定可能範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）が最大となり、ひいては吸光度Ａの分解能が最適となる最適光路長がそれぞれ存在する。表２は、希釈倍率が１．５倍、３倍及び６倍の場合における最適光路長を表すものである。これらの希釈倍率において、入射光４１の光路長ｌを、表２に示す各々の最適光路長（具体的には、希釈倍率が１．５倍の場合は１７５μｍ、希釈倍率が３倍の場合は３５０μｍ、希釈倍率が６倍の場合は７００μｍ）とすれば、その環境下において得られる最大の分解能にて吸光度Ａを測定することができ、Ｈｃｔ値の精度を確保することが可能となる。ただし、最適光路長の具体的な数値は、厳密に限定されるものではなく、多少の誤差があっても、同様の効果を奏する。

１０ 計測装置
２０ 投光部
３０ センサチップ
４０ 計測部
５０ 制御演算部
８０ 搬送部
９０ 送液部
３２ 底面部材
３２ａ 支持部材
３２ｂ プリズム
３２ｃ 金属薄膜
３３ 流路シート
３５ 流路蓋
３８ 切り欠き
６０ 微細流路
６１ トロポニン捕捉膜
４１ 入射光
４２ 被測定光
４３ 散乱光
４４ 反射光

Claims (20)

1. 血液を流すための第１流路と、
   前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、
   を有することを特徴とする血液検査用センサチップ。
2. 前記第１流路中の前記血液に対して第１測定を行い、前記血液に関する第１情報を取得し、
   前記第２流路中の前記血液に対して第２測定を行い、前記血液に関する第２情報を取得することを特徴とする請求項１に記載の血液検査用センサチップ。
3. 前記第１情報は、前記血液中に存在する標的物質の濃度であり、
   前記第２情報は、前記血液のヘマトクリット値であることを特徴とする請求項２に記載の血液検査用センサチップ。
4. 前記第１流路と前記第２流路とは、底面が同じ平面であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の血液検査用センサチップ。
5. 波長が２００〜９００ｎｍの光を通す材料からなることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の血液検査用センサチップ。
6. アクリル樹脂からなることを特徴とする請求項５に記載の血液検査用センサチップ。
7. 前記第１流路の幅が０．１〜１ｍｍであり、前記第２流路の幅が０．１ｍｍを超え６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の血液検査用センサチップ。
8. 前記第１流路の底面に、前記血液中に存在する標的物質と反応して前記標的物質を留める反応系が設けられていることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の血液検査用センサチップ。
9. 血液を流すための第１流路と、前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、を有する血液検査用センサチップと、
   前記血液検査用センサチップに光を照射する投光部と、
   前記血液検査用センサチップから出射した光の光量を測定する計測部と、
   を有することを特徴とする血液検査装置。
10. 前記投光部及び計測部の動作を制御する制御部を更に有し、
    前記制御部は、前記第２流路の幅を前記光が通過するように、前記投光部に前記光を照射させることを特徴とする請求項９に記載の血液検査装置。
11. 前記制御部は、前記第２流路の幅を前記光が通過するように、又は、前記第１流路に前記光が当たるように、前記投光部の動作を切り替えることを特徴とする請求項１０に記載の血液検査装置。
12. 前記計測部は、前記第２流路の幅を通過した前記光の光量を測定し、
    前記制御部は、前記第２流路の幅を通過した前記光の光量に基づいて前記血液のヘマトクリット値を計測することを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の血液検査装置。
13. 前記血液検査用センサチップは、前記第１流路の底面に、前記血液中に存在する標的物質と反応して前記標的物質を留める反応系が設けられていることを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の血液検査装置。
14. 前記制御部は、前記反応系の反応結果に基づいて前記標的物質の濃度を行うことを特徴とする請求項１３に記載の血液検査装置。
15. 血液を流すための第１流路と、前記第１流路の上流又は下流に位置し、前記第１流路よりも流路の幅が広い第２流路と、を有する血液検査用センサチップを用いて、
    前記血液中に存在する標的物質を含む試料液を、前記第１流路及び前記第２流路に供給し、
    前記第１流路を用いて前記標的物質の定量的計測を行うとともに、前記第２流路を用いて前記血液のヘマトクリット値を計測することを特徴とする血液検査方法。
16. 前記血液検査用センサチップに、前記第２流路の幅を通過するように光を照射して、前記試料液の吸光度を測定することで前記血液のヘマトクリット値を計測することを特徴とする請求項１５に記載の血液検査方法。
17. 前記第１流路の底面に、前記標的物質と反応して前記標的物質を留める反応系を設けて、前記反応系の反応結果に基づいて前記標的物質の濃度を行うことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の血液検査方法。
18. 前記試料液は、受検者から直接に採取した血液を希釈して得たものであり、
    前記第２流路の幅と、前記試料液における前記血液の濃度とは、前記試料液における前記血液の濃度が０．０４１７以上０．６６６７以下である場合、下記式（１）に示す関係にあることを特徴とする請求項１５から１７のいずれか一項に記載の血液検査方法。
    ２６＜Ｃ・ｌ＜１５６ （１）
    なお、上記式（１）において、Ｃは前記試料液における前記血液の濃度で、即ち前記試料液を得るための前記血液の希釈倍率の逆数であり、ｌは前記第２流路の幅で、単位がμｍである。
19. 前記試料液を得るための前記血液の希釈倍率が１．５倍、即ち前記試料液における前記血液の濃度が０．６６６７である場合、前記第２流路の幅を１７５μｍとし、
    前記試料液を得るための前記血液の希釈倍率が３倍、即ち前記試料液における前記血液の濃度が０．３３３３である場合、前記第２流路の幅を３５０μｍとし、
    前記試料液を得るための前記血液の希釈倍率が６倍、即ち前記試料液における前記血液の濃度が０．１６６７である場合、前記第２流路の幅を７００μｍとすることを特徴とする請求項１８に記載の血液検査方法。
20. 前記血液のヘマトクリット値を計測する前に、前記標的物質の定量的計測を行うことを特徴とする請求項１５から１９のいずれか一項に記載の血液検査方法。

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