JP2018042503A - Labeling method for target gene, vector system, cell, and kits for editing target gene maintaining gene activity - Google Patents
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Abstract
【課題】標的遺伝子の標識方法、ベクターシステム、細胞、及び遺伝子活性維持標的遺伝子編集キットを提供する。【解決手段】遺伝子活性の確認が可能となる標的遺伝子の標識方法であって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、前記標的遺伝子と置き換える工程を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とする標的遺伝子の標識方法を提供する。【選択図】図１A target gene labeling method, a vector system, a cell, and a gene activity maintaining target gene editing kit are provided. A method for labeling a target gene that enables confirmation of gene activity, wherein a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein is homologously recombined to form the target gene. A method for labeling a target gene, wherein the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeling protein. [Selection] Figure 1
Description
本発明は、標的遺伝子の標識方法、ベクターシステム、細胞、及び遺伝子活性維持標的遺伝子編集キットに関する。 The present invention relates to a target gene labeling method, a vector system, a cell, and a gene activity maintaining target gene editing kit.
これまでヒトＥＳ（Embryonic Stem）細胞やヒトｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞など、ヒト多能性幹細胞を用いて、ヒトの各種組織の細胞が作製されてきたが、これらの分化を確認する方法として、組織に特異的なマーカー遺伝子を標的とし、免疫抗体染色等でラベルする方法が用いられてきた。マウスなどの組織では、マーカー遺伝子のプロモーターとＧＦＰ（Green fluorescent protein）などの蛍光タンパク質遺伝子を組み合わせることにより、遺伝子組み換えによるトランスジェニック動物を作製することで、特異的な細胞のラベルが行われてきた（特許文献１〜３）。 Until now, human pluripotent stem cells, such as human ES (Embryonic Stem) cells and human iPS (induced Pluripotent Stem) cells, have been used to confirm the differentiation of human tissues. A method of targeting a marker gene specific to a tissue and labeling it with immunoantibody staining or the like has been used. In tissues such as mice, specific cell labeling has been performed by producing transgenic animals by genetic recombination by combining a promoter of a marker gene and a fluorescent protein gene such as GFP (Green fluorescent protein). (Patent Documents 1 to 3).
例えば、少なくとも１つの異種タンパク質の発現が内因性調節系により調節されるように、少なくとも１つの異種タンパク質をコードする配列を細胞の染色体内にインテグレートするための方法が報告されている（特許文献１）。
また、標的部位の5’上流領域に相同なDNAと標的部位の3’下流領域に相同なDNAとでポジティブ選択マーカーを挟む構造を持つ遺伝子ターゲティングベクターであって、前記ポジティブ選択マーカーの5’上流にスプライスアクセプター部位とバイシストロン性発現を可能にするDNA配列とが付加されており、さらに、前記標的部位の5’上流領域に相同なDNAの5’上流にもスプライスアクセプター部位が付加されている前記ベクターが報告されている（特許文献２）。
また、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター。標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法が報告されている（特許文献３）。
For example, a method has been reported for integrating a sequence encoding at least one heterologous protein into the chromosome of a cell so that the expression of at least one heterologous protein is regulated by an endogenous regulatory system (Patent Document 1). ).
A gene targeting vector having a structure in which a positive selection marker is sandwiched between DNA homologous to the 5 ′ upstream region of the target site and DNA homologous to the 3 ′ downstream region of the target site, 5 ′ upstream of the positive selection marker In addition, a splice acceptor site and a DNA sequence enabling bicistronic expression are added, and a splice acceptor site is also added 5 'upstream of the DNA homologous to the 5' upstream region of the target site. The aforementioned vector has been reported (Patent Document 2).
A gene targeting vector characterized in that a DNA sequence enabling bicistronic expression is present 5 ′ upstream of a selection marker. A DNA fragment that is homologous to the 5 'upstream region of the target site, a selection marker in which a DNA sequence enabling bicistronic expression exists 5' upstream, and a DNA fragment that is homologous to the 3 'downstream region of the target site A method for producing a gene targeting vector containing the above has been reported (Patent Document 3).
また、２Ａペプチドにより１つのユニットに連結された複数遺伝子は、１つのユニットとして転写翻訳された後、２Ａプロテアーゼにより切断されることが知られている（特許文献４）。また、２Ａペプチドは、蛍光マーカーおよびＴ細胞表面抗原の発現に利用されている。従来、２Ａペプチドは外来性の遺伝子を複数同時に発現させるために用いられてきた（特許文献４）。
この２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）により切断される。すなわち、２Ａペプチドにより連結された複数遺伝子は、１つのユニットとして転写翻訳された後、２Ａペプチダーゼで切断される。
さらに近年、Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9)を用いたゲノム編集技術が開発され、ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集が容易になり、ノックインラインが作製されるようになってきている。
In addition, it is known that a plurality of genes linked to one unit by 2A peptide are transcribed and translated as one unit and then cleaved by 2A protease (Patent Document 4). The 2A peptide is used for the expression of fluorescent markers and T cell surface antigens. Conventionally, 2A peptides have been used to simultaneously express a plurality of exogenous genes (Patent Document 4).
This 2A peptide is a peptide sequence of about 20 amino acid residues derived from a virus, and is cleaved by a protease (2A peptidase) inherent in cells. That is, a plurality of genes linked by 2A peptides are transcribed and translated as one unit, and then cleaved by 2A peptidase.
In recent years, genome editing technology using Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -CRISPR-associated protein 9 (Cas9) has been developed, making gene editing of human pluripotent stem cells easier and creating knock-in-line. It has become like this.
上記特許文献（特許文献１〜３）においては、一般的なノックインを行っており、内在性の遺伝子を欠損させている。このため、細胞が有する対立遺伝子の両方の発現が当該細胞に必須な場合、細胞の増殖に影響を与えるため、正常な遺伝子産物の挙動を観察することができないという問題がある。
また、ヒトの細胞ではマーカー遺伝子のプロモーターとＧＦＰなどの蛍光タンパク質遺伝子をゲノムにランダムに導入すると、プロモーター遺伝子のサイレンシング（不活性化）が強く起こるためにこれを用いることが困難である。
In the above-mentioned patent documents (Patent Documents 1 to 3), general knock-in is performed and an endogenous gene is deleted. For this reason, when the expression of both alleles possessed by a cell is essential to the cell, there is a problem that the behavior of a normal gene product cannot be observed because it affects cell growth.
In human cells, when a promoter of a marker gene and a fluorescent protein gene such as GFP are randomly introduced into the genome, silencing (inactivation) of the promoter gene occurs strongly, making it difficult to use it.
このため、細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく経時的に定量化することができるＤＮＡ解析手段の開発が、要望されている。 Therefore, there is a demand for the development of DNA analysis means that can visualize target genes in cells and organs, and that can accurately quantify the visualized genetically modified animals over time in a living state. Has been.
本発明は、細胞や組織で標的遺伝子産物を可視化することができ、生細胞で精度よく遺伝子発現解析することができるように、細胞に標識タンパク質をコードする遺伝子を導入する方法、ベクターシステム及び導入された細胞を提供することを目的とする。 The present invention provides a method, a vector system, and a method for introducing a gene encoding a labeled protein into a cell so that the target gene product can be visualized in the cell or tissue and the gene expression analysis can be accurately performed in the living cell. It is an object to provide prepared cells.
上記の問題点を解決するために、本願発明者は、細胞内在性の組織特異的マーカー遺伝子（標的遺伝子）の遺伝子を欠損させることなく、標的遺伝子の末端に標識タンパク質の遺伝子を接続する方法について検討し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。 In order to solve the above-mentioned problems, the inventor of the present application relates to a method for connecting a marker protein gene to the end of a target gene without deleting the gene of a cell-specific tissue-specific marker gene (target gene). The present invention has been studied and completed. That is, the present invention is as follows.
[１] 遺伝子活性の確認が可能となる標的遺伝子の標識方法であって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、前記標的遺伝子と置き換える工程を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とする標的遺伝子の標識方法。
[２] 細胞内で遺伝子活性を維持した標的遺伝子に標識タンパク質遺伝子を接続する、１種以上のベクターを含むベクターシステムであって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、前記標的遺伝子の３’末端の配列を有するガイドＲＮＡをコードする遺伝子と、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とするベクターシステム。
[３] 前記融合タンパク質をコードする遺伝子の５’側又は３’側に抗生物質耐性遺伝子を有する[２]に記載のベクターシステム。
[４] 前記抗生物質耐性遺伝子の５’側及び３’側に部位特異的組み換え酵素認識配列をさらに含む[２]又は[３]に記載のベクターシステム。
[５] 細胞内の標的遺伝子の５’末端、及び／又は、３’末端に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを介して、標識タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
[６] ゲノム上の標的遺伝子を編集する標的遺伝子編集キットであって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、前記標的遺伝子の３’末端の配列を有するガイドＲＮＡをコードする遺伝子を含む第２のベクターと、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む第３のベクターと、を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とする遺伝子活性維持標的遺伝子編集キット。
[1] A method for labeling a target gene that enables confirmation of gene activity, wherein a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein is replaced with the target gene by homologous recombination A method for labeling a target gene, wherein the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeled protein.
[2] A vector system comprising one or more vectors for connecting a marker protein gene to a target gene whose gene activity is maintained in a cell, and a fusion protein of the target protein encoded by the target gene and the marker protein A gene encoding a guide RNA having a sequence at the 3 ′ end of the target gene, and a gene encoding Cas9 protein, wherein the fusion protein comprises the target protein and the labeling protein. A vector system comprising a linker having an endogenous enzyme cleavage sequence in between.
[3] The vector system according to [2], which has an antibiotic resistance gene on the 5 ′ side or 3 ′ side of the gene encoding the fusion protein.
[4] The vector system according to [2] or [3], further comprising site-specific recombinant enzyme recognition sequences on the 5 ′ side and 3 ′ side of the antibiotic resistance gene.
[5] A chromosome containing a gene encoding a marker protein through a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of a target gene in a cell, Cells.
[6] A target gene editing kit for editing a target gene on a genome, the first vector comprising a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a marker protein, and the target gene A second vector containing a gene encoding a guide RNA having the sequence at the 3′-end thereof, and a third vector containing a gene encoding a Cas9 protein, wherein the fusion protein comprises the target protein and the label A gene activity maintenance target gene editing kit comprising a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between proteins.
本発明により、標的となる組織特異的マーカー遺伝子（標的遺伝子）を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現させることができる。
また、ゲノム上の標的遺伝子を編集するため、分化誘導処理により細胞が組織に分化する過程において、標識タンパク質の発現を確認することにより標的遺伝子の発現を確認することができる。
According to the present invention, a labeled protein equivalent to the target protein can be expressed in the target cell without losing the target tissue-specific marker gene (target gene).
In addition, since the target gene on the genome is edited, the expression of the target gene can be confirmed by confirming the expression of the labeled protein in the process of differentiation of the cells into tissues by the differentiation induction process.
≪標的遺伝子の標識方法≫
本発明においては、細胞内在性のマーカー遺伝子（標的遺伝子）を欠損させることなく、標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、標的遺伝子を置き換える方法について、検討した。
すなわち、本発明の標的遺伝子の標識方法は、遺伝子活性の確認が可能となる標的遺伝子の標識方法であって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、前記標的遺伝子と置き換える工程を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含む。
以下に、より詳細な説明を行う。
≪Target gene labeling method≫
In the present invention, a method of replacing a target gene by homologous recombination of a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein without losing the cell endogenous marker gene (target gene) Was examined.
That is, the target gene labeling method of the present invention is a target gene labeling method that enables confirmation of gene activity, wherein a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein is selected. A step of replacing the target gene by homologous recombination, wherein the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeled protein.
A more detailed description will be given below.
［第１実施形態］
本実施形態の標的遺伝子の標識方法は、遺伝子活性の確認が可能となる標的遺伝子の標識方法であって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、前記標的遺伝子と置き換える工程を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含む。
本実施形態の標的遺伝子の標識方法は、標的となる組織特異的マーカー遺伝子（標的遺伝子）を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現させることを可能とする。
[First Embodiment]
The target gene labeling method of the present embodiment is a target gene labeling method that enables confirmation of gene activity, and is homologous to a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein. A step of replacing the target gene by recombination, and the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeled protein.
The target gene labeling method of this embodiment makes it possible to express a labeled protein in an amount equal to the target protein in the target cell without losing the target tissue-specific marker gene (target gene).
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、標的タンパク質と標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを有している。すなわち、標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質が、リンカーを介して融合している。標識タンパク質は、標的タンパク質の５’末端、及び／又は、３’末端に融合している。すなわち、相同組み換えに用いるベクターシステムにおいては、標識タンパク質遺伝子は、標的遺伝子末端と標的遺伝子の５’側、及び／又は、３’側の非翻訳領域（UTR:untranslated region）の間に位置する。
標的タンパク質の５’側に標識タンパク質が融合している場合は、標識タンパク質遺伝子の終止コドンを削除するように遺伝子配列を設計する。標的タンパク質の３’側に標識タンパク質が融合している場合は、標的遺伝子の終止コドンを削除するように遺伝子配列を設計する。
したがって、ゲノム上の標的遺伝子の終止コドンを削除するのみであるので、標的タンパク質が無傷である。すなわち、標的遺伝子を欠損させることがないため、標的遺伝子の遺伝子活性を維持することができる。
本発明において、標的遺伝子の遺伝子活性とは、標的遺伝子が転写及び翻訳され、標的タンパク質が生産され機能を発揮することを含む。
(Fusion protein)
The fusion protein of the present invention has a linker having an endogenous enzyme cleavage sequence between the target protein and the labeled protein. That is, the target protein encoded by the target gene and the labeled protein are fused via a linker. The labeled protein is fused to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the target protein. That is, in the vector system used for homologous recombination, the marker protein gene is located between the end of the target gene and the 5 ′ side and / or 3 ′ side of the untranslated region (UTR) of the target gene.
When the labeled protein is fused to the 5 ′ side of the target protein, the gene sequence is designed so that the stop codon of the labeled protein gene is deleted. When the labeled protein is fused to the 3 ′ side of the target protein, the gene sequence is designed so as to delete the stop codon of the target gene.
Therefore, the target protein is intact because it only deletes the stop codon of the target gene on the genome. That is, since the target gene is not deleted, the gene activity of the target gene can be maintained.
In the present invention, the gene activity of a target gene includes transcription and translation of a target gene, production of a target protein, and exerting a function.
（内在性酵素の切断配列を有するリンカー）
本発明のリンカーは、標的タンパク質と標識タンパク質を融合（接続）し、内在性酵素による切断配列を有すれば特に限定されない。例えば、リンカーとしては２Ａペプチドを用いてもよい。２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）により認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断される。２Ａペプチド遺伝子により連結された複数の遺伝子は、１つのユニットとして転写・翻訳された後、細胞に内在する２Ａぺプチダーゼで切断される。２Ａペプチドとしては、Ｔ２Ａペプチドが知られている。
上記特許文献（特許文献４）においては、複数の外来性遺伝子を同時に発現させる発現ベクターにおいて２Ａペプチドが用いられている。
本発明では内在性の標的遺伝子の５’末端、及び／又は、３’末端に２Ａペプチド遺伝子を使って標識タンパク質遺伝子を接続することで、内在性の標的遺伝子の発現の確認、測定及び定量を可能にしている。すなわち、本発明は、細胞内在性の組織特異的マーカー遺伝子（標的遺伝子）を欠損させることなく標的遺伝子の末端に標識タンパク質遺伝子を接続する。したがって、本発明は２Ａペプチドを利用する目的が特許文献４と異なっている。
(Linker with endogenous enzyme cleavage sequence)
The linker of the present invention is not particularly limited as long as it fuses (connects) a target protein and a labeled protein and has a cleavage sequence by an endogenous enzyme. For example, a 2A peptide may be used as the linker. The 2A peptide is a peptide sequence of about 20 amino acid residues derived from a virus, is recognized by a protease (2A peptidase) inherent in cells, and is cleaved at a position of 1 residue from the C-terminus. A plurality of genes linked by 2A peptide genes are transcribed and translated as one unit, and then cleaved by 2A peptidase present in cells. A T2A peptide is known as a 2A peptide.
In the said patent document (patent document 4), 2A peptide is used in the expression vector which expresses several foreign genes simultaneously.
In the present invention, a marker protein gene is connected to the 5 ′ end and / or 3 ′ end of an endogenous target gene using a 2A peptide gene, thereby confirming, measuring, and quantifying the expression of the endogenous target gene. It is possible. That is, in the present invention, the marker protein gene is connected to the end of the target gene without losing the cell-specific tissue-specific marker gene (target gene). Therefore, the present invention differs from Patent Document 4 in the purpose of using the 2A peptide.
（標的遺伝子）
本発明における標的遺伝子はゲノムにコードされる遺伝子であれば、いずれの遺伝子にも適用可能である。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞が分化し、組織を形成する際に組織特異的に発現する遺伝子を標的遺伝子として用いることにより、標識タンパク質が発現することを指標に分化誘導された細胞を選別することができる。具体的には、網膜分化細胞で発現するＣｒｘ遺伝子、心臓の洞房結節のマーカーであるＨＣＮ４遺伝子など、様々な分化マーカー遺伝子が知られている。
(Target gene)
The target gene in the present invention is applicable to any gene as long as it is a gene encoded by the genome. For example, pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are differentiated, and differentiation is induced using the expression of the labeled protein as an index by using a tissue-specific gene as a target gene when forming a tissue. Cells can be sorted. Specifically, various differentiation marker genes such as Crx gene expressed in retinal differentiated cells and HCN4 gene which is a marker of heart sinoatrial node are known.
（標的タンパク質の活性）
生産された融合タンパク質（標的タンパク質−リンカー−標識タンパク質）は、内在性酵素によりリンカー内の配列が切断される。したがって、切断後の標的タンパク質は、アミノ酸の付加が最小限に抑えられているため、本来ゲノムから発現する標的タンパク質と同じ活性を維持している。
また、標識タンパク質の発現は、標的遺伝子のプロモーターに制御されているため、細胞内に標的遺伝子と等量の標識タンパク質を発現させることができる。
(Activity of target protein)
In the produced fusion protein (target protein-linker-labeled protein), the sequence in the linker is cleaved by an endogenous enzyme. Therefore, the cleaved target protein maintains the same activity as the target protein originally expressed from the genome because addition of amino acids is minimized.
In addition, since the expression of the labeled protein is controlled by the promoter of the target gene, it is possible to express the labeled protein in the same amount as the target gene in the cell.
（標識タンパク質）
本発明の標識タンパク質は、標的タンパク質の５’末端、及び／又は、３’末端に融合している。本発明の標識タンパク質は、標的遺伝子の発現を確認できれば限定されない。例えば、標識タンパク質は、抗体のエピトープ配列でもよく、細胞を生きたまま観察するために蛍光タンパクを用いてもよい。蛍光タンパクとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が知られており必要に応じて選択することができる。Ｅ２-クリムゾン（E2-Crimson）は、DsRed-Express2をさらに改変して得られた、より明るく長波長域にシフトした蛍光を示す赤色蛍光タンパク質である。Ｅ２-クリムゾンは、励起極大611 nm、蛍光極大646 nmのスペクトル特性を持ち、長波長赤色蛍光タンパク質中で最も強い蛍光強度を示す。
本発明では、標的遺伝子と等量の標識タンパク質を発現させることができるため、標識タンパク質の発現を確認することにより、標的遺伝子の遺伝子活性の確認が可能である。また、標識タンパクの発現量を測定及び定量することにより、標的遺伝子の遺伝子活性の確認も可能である。
標識タンパクの発現量の測定及び定量は、いかなる方法でもよく、免疫組織化学、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、蛍光活性化セルソーティング、ウェスタンブロッティング、顕微鏡観察などが挙げられる。具体的には、例えば、標識タンパク質に特異的な抗体でウェスタンブロッティングにより確認してもよい。また、標識タンパク質が蛍光を発する場合は蛍光顕微鏡や蛍光活性化セルソーティングを用いて、蛍光強度などを測定することにより定量してもよい。
(Labeled protein)
The labeled protein of the present invention is fused to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the target protein. The labeled protein of the present invention is not limited as long as the expression of the target gene can be confirmed. For example, the labeled protein may be an epitope sequence of an antibody, and a fluorescent protein may be used for observing a cell alive. As the fluorescent protein, green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), and the like are known and can be selected as necessary. E2-Crimson (E2-Crimson) is a red fluorescent protein obtained by further modifying DsRed-Express2 and showing fluorescence shifted to a brighter and longer wavelength region. E2-crimzone has spectral characteristics of an excitation maximum of 611 nm and a fluorescence maximum of 646 nm, and exhibits the strongest fluorescence intensity among long-wavelength red fluorescent proteins.
In the present invention, a labeled protein in the same amount as the target gene can be expressed. Therefore, the gene activity of the target gene can be confirmed by confirming the expression of the labeled protein. Moreover, the gene activity of the target gene can be confirmed by measuring and quantifying the expression level of the labeled protein.
Measurement and quantification of the expression level of the labeled protein may be any method, and examples include immunohistochemistry, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, fluorescence activated cell sorting, western blotting, and microscopic observation. Specifically, for example, it may be confirmed by Western blotting with an antibody specific to the labeled protein. Further, when the labeled protein emits fluorescence, it may be quantified by measuring fluorescence intensity or the like using a fluorescence microscope or fluorescence activated cell sorting.
（抗生物質耐性遺伝子）
本発明においては、標識タンパク質が、標的タンパク質の３’末端に融合している場合、抗生物質耐性遺伝子を、標識タンパク質遺伝子の下流（３’側）に位置するように位置することが好ましい。
本発明においては、標識タンパク質が、標的タンパク質の５’末端に融合している場合、抗生物質耐性遺伝子を、標識タンパク質遺伝子の上流（５’側）に位置するように位置することが好ましい。
抗生物質を添加した培地において培養を行うと、抗生物質耐性遺伝子を含む配列がゲノムに導入された細胞は抗生物質耐性遺伝子が組み込まれているため生き残る。したがって、抗生物質耐性遺伝子を含む配列がゲノムに導入されていない細胞を培地から除くことができる。
抗生物質耐性遺伝子としては、ブラストサイジン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、およびゼオシン耐性遺伝子等が知られており、必要に応じて抗生物質耐性遺伝子を選択することができる。
(Antibiotic resistance gene)
In the present invention, when the labeled protein is fused to the 3 ′ end of the target protein, the antibiotic resistance gene is preferably positioned downstream (3 ′ side) of the labeled protein gene.
In the present invention, when the labeled protein is fused to the 5 ′ end of the target protein, the antibiotic resistance gene is preferably located upstream (5 ′ side) of the labeled protein gene.
When culture is performed in a medium to which an antibiotic is added, cells into which a sequence containing an antibiotic resistance gene has been introduced into the genome survive because the antibiotic resistance gene is integrated. Therefore, cells in which a sequence containing an antibiotic resistance gene has not been introduced into the genome can be removed from the medium.
Antibiotic resistance genes include blasticidin resistance gene, kanamycin resistance gene, gentamicin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, spectinomycin resistance gene, streptomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, hygromycin resistance gene In addition, a puromycin resistance gene, a zeocin resistance gene, and the like are known, and an antibiotic resistance gene can be selected as necessary.
（外来性プロモーター）
本発明では、外来性プロモーターにより抗生物質耐性遺伝子を発現させてもよい。このため、外来性プロモーターは、抗生物質耐性遺伝子の発現を制御するように抗生物質耐性遺伝子よりも上流に位置することが好ましい。
外来性プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、及びＥＦ１αプロモーターか等が挙げられる。このように、用いる外来性プロモーターに何らの制限がないため、本発明のベクターシステムは、全ての細胞種に適用可能である。
(Exogenous promoter)
In the present invention, the antibiotic resistance gene may be expressed by an exogenous promoter. For this reason, the foreign promoter is preferably located upstream of the antibiotic resistance gene so as to control the expression of the antibiotic resistance gene.
Examples of the exogenous promoter include CMV promoter, CAG promoter, and EF1α promoter. Thus, since there is no restriction | limiting in the foreign promoter to be used, the vector system of this invention is applicable to all cell types.
本発明で用いる外来性プロモーター及び抗生物質耐性遺伝子の５’側及び３’側には、部位特異的組み換え酵素が認識する部位特異的酵素認識配列が組み込まれていてもよい（図１）。部位特異的組み換え酵素としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐｅ、Ｄｒｅ等が挙げられ、部位特異的酵素認識配列としては、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ 、ｒｏｘが挙げられる。
例えば、部位特異的組み換え酵素Ｃｒｅを発現させることにより外来性プロモーター及び抗生物質耐性遺伝子（図１、ｌｏｘＰ〜ｌｏｘＰまで）をゲノムから取り除くことができる。DNA組換え酵素Ｃｒｅの認識配列は、一対で用いられ、少なくとも一対の組み換え酵素の認識配列の間の遺伝子配列が除去されるようになっている。
ゲノムから外来性プロモーター及び抗生物質耐性遺伝子を取り除くことにより、ゲノムに挿入された配列を最小限にすることができ、遺伝子導入による細胞への影響を最小限にすることができる。
A site-specific enzyme recognition sequence recognized by a site-specific recombinant enzyme may be incorporated into the 5 ′ side and 3 ′ side of the exogenous promoter and antibiotic resistance gene used in the present invention (FIG. 1). Examples of the site-specific recombination enzyme include Cre, Flpe, and Dre, and examples of the site-specific enzyme recognition sequence include loxP, FRT, and rox.
For example, exogenous promoters and antibiotic resistance genes (FIG. 1, loxP to loxP) can be removed from the genome by expressing the site-specific recombination enzyme Cre. The recognition sequences of the DNA recombination enzyme Cre are used in pairs, and at least the gene sequence between the recognition sequences of the pair of recombination enzymes is removed.
By removing exogenous promoters and antibiotic resistance genes from the genome, sequences inserted into the genome can be minimized, and the effects on the cells due to gene transfer can be minimized.
細胞に遺伝子を導入する方法としては、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。 A method for introducing a gene into a cell is not particularly limited, and examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, and a microinjection method.
本発明の標的遺伝子の標識方法は、標的遺伝子及び導入する細胞に特に制限がないため、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化細胞の標的遺伝子の標識し、視細胞、網膜色素上皮細胞、神経細胞、視神経細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、赤血球、白血球、等の体細胞に分化させてもよい。 Since the target gene labeling method of the present invention is not particularly limited to the target gene and the cells to be introduced, the target gene of undifferentiated cells such as iPS cells and ES cells is labeled, and the visual cells, retinal pigment epithelial cells, nerve cells , Differentiation into somatic cells such as optic nerve cells, cardiomyocytes, hepatocytes, kidney cells, erythrocytes, leukocytes, and the like.
（分化誘導）
本発明の標的遺伝子の標識方法は、網膜に分化誘導する工程をさらに含んでもよい。この場合、標的遺伝子の標識方法に、未分化細胞であるｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を用いることが好ましい。細胞を網膜に分化誘導するためには、分化誘導培地で細胞を長期間培養する。網膜は、桿体および錐体などの視細胞を含む。
網膜に分化誘導する工程では、使用する培地等は公知の材料及び方法を用いてもよい（Kaewkhaw R, Kaya KD, Brooks M, et al. Transcriptome Dynamics of Developing Photoreceptors in Three-Dimensional Retina Cultures Recapitulates Temporal Sequence of Human Cone and Rod Differentiation Revealing Cell Surface Markers and Gene Networks. Stem Cells. 2015;33:3504-3518、及び、Nakano T, Ando S, Takata N, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.）。
ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell）は、細胞のリプログラミングによって、その細胞が三胚葉形成能および個体発生能を有する分化多能性を獲得した場合に得られた細胞である。リプログラミングとは、細胞分化とは逆のプロセス、すなわち、分化した細胞がかつて保持していた未分化状態を獲得することをいう。
(Differentiation induction)
The target gene labeling method of the present invention may further include a step of inducing differentiation into the retina. In this case, it is preferable to use iPS cells or ES cells, which are undifferentiated cells, as a target gene labeling method. In order to induce differentiation of cells into the retina, the cells are cultured for a long time in a differentiation-inducing medium. The retina contains photoreceptors such as rods and cones.
In the process of inducing differentiation into the retina, known materials and methods may be used as the medium to be used (Kaewkhaw R, Kaya KD, Brooks M, et al. Transcriptome Dynamics of Developing Photoreceptors in Three-Dimensional Retina Cultures Recapitulates Temporal Sequence of Human Cone and Rod Differentiation Revealing Cell Surface Markers and Gene Networks. Stem Cells. 2015; 33: 3504-3518 and Nakano T, Ando S, Takata N, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from Human ESCs. Cell Stem Cell. 2012; 10: 771-785.).
An iPS cell (induced pluripotent stem cell) is a cell obtained when the cell has acquired differentiation pluripotency having the ability to form three germ layers and ontogeny by reprogramming of the cell. Reprogramming refers to the process opposite to cell differentiation, that is, acquiring an undifferentiated state that a differentiated cell once held.
（ゲノム編集）
本発明の相同組み換えは、標的遺伝子を置き換えることができればいずれの方法でもよい。本発明では、ゲノム編集を用いた標的遺伝子の標識方法の構築を行ったが、これに限定されない。
最近、ゲノム編集技術により、効率的にゲノムを改変する方法が確立されている。図１は、本実施形態の標的遺伝子の標識方法が細胞内の標的遺伝子と置き換わる過程を模式的に示した図である。ベクターシステムを細胞内に導入すると、Ｃａｓ９がガイドＲＮＡにより特定された箇所の二重鎖ＤＮＡを切断する。次に、ゲノム上の二重鎖が切断された近傍の配列を両末端に有するＤＮＡカセットと相同組み換えが起こり、ゲノム上の標的遺伝子が置き換わる（図１）。
ゲノムと相同な配列（図１におけるHA-L及びHA-R）は、相同組み換えが起これば長さに制限はない。一般的に、ゲノムと相同な配列はそれぞれ、８００ｂｐ以上が好ましく、１ｋｂｐ以上がより好ましい。
本発明の標的遺伝子の標識方法により、細胞内の標的遺伝子の５’末端、及び／又は、３’末端に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを介して、標識タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体を有する細胞を作成できる。
ここでHA-Lは、homology arm leftを示し、HA-Rは、homology arm rightを示し、FPはfluorescent proteinを示し、CMVpは、human cytomegalovirus immediate early promoter and enhancerを示し、Bsdは、Blasticidin resistance geneを示す。
(Genome editing)
The homologous recombination of the present invention may be any method as long as the target gene can be replaced. In the present invention, a target gene labeling method using genome editing has been constructed, but the present invention is not limited to this.
Recently, a method for efficiently modifying the genome by genome editing technology has been established. FIG. 1 is a diagram schematically showing a process in which the target gene labeling method of the present embodiment is replaced with an intracellular target gene. When the vector system is introduced into the cell, Cas9 cleaves the double-stranded DNA at the location specified by the guide RNA. Next, homologous recombination occurs with a DNA cassette having a nearby sequence at which both ends of the double strand on the genome are cleaved, and the target gene on the genome is replaced (FIG. 1).
Sequences homologous to the genome (HA-L and HA-R in FIG. 1) are not limited in length if homologous recombination occurs. Generally, each sequence homologous to the genome is preferably 800 bp or more, more preferably 1 kbp or more.
According to the method for labeling a target gene of the present invention, a gene encoding a labeled protein is included at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the target gene in the cell via a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme. Cells with chromosomes can be created.
Here, HA-L indicates homology arm left, HA-R indicates homology arm right, FP indicates fluorescent protein, CMVp indicates human cytomegalovirus immediate early promoter and enhancer, Bsd indicates Blasticidin resistance gene Indicates.
ゲノム編集法としては、例えばＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム、CRISPR-Cas9システムが使用できる。CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins）は、DNA二本鎖を切断（Double Strand Breaks）してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる遺伝子改変技術である。
CRISPR/Cas9システムは、標的遺伝子の変更や複数遺伝子のターゲットが容易であることから、本発明ではCRISPR-Cas9システムを用いるのが好ましい。CRISPR-Cas9システムにより、遺伝子をノックアウトするには、ドナーベクターを共導入しなければよい。
CRISPR-Cas9 システムを利用して、DNA に二本鎖切断(DSBs) を導入するためには、PAM配列、gRNA(ガイドRNA,guide RNA,sgRNA)、Casタンパク質(Cas9)の3つの要素が必要である。また、ゲノムにDNAをノックインする場合は、ドナーベクターがさらに必要である。
PAM 配列(NGG)に隣接した標的部位に対し、ガイドRNAを設計し、プラスミド、あるいはウイルス粒子でCasと共に細胞に導入する。導入されたgRNA(ガイドRNA)とCasタンパク質(Cas, Cas9)は複合体を形成する。gRNAがゲノム上の標的配列をみつけると、Cas9ヌクレアーゼがゲノムDNAの両鎖を切断し二重鎖切断が生じる。ゲノム上の二重鎖が切断された近傍の配列を両末端に有するDNAカセットを同時に細胞に導入すると、相同な配列が相同組み換えをおこし、配列がゲノムに挿入される。
As a genome editing method, for example, a TALEN system, a Zn finger nuclease system, or a CRISPR-Cas9 system can be used. CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins) is a genetic modification technology that can remove, replace, and insert any place in the genome sequence by double strand breaks. is there.
Since the CRISPR / Cas9 system can easily change a target gene or target multiple genes, it is preferable to use the CRISPR-Cas9 system in the present invention. In order to knock out a gene with the CRISPR-Cas9 system, it is not necessary to co-introduce a donor vector.
In order to introduce double-strand breaks (DSBs) into DNA using the CRISPR-Cas9 system, three elements are required: PAM sequence, gRNA (guide RNA, guide RNA, sgRNA), and Cas protein (Cas9) It is. In addition, when knocking DNA into the genome, a donor vector is further required.
A guide RNA is designed for the target site adjacent to the PAM sequence (NGG) and introduced into the cell together with Cas using a plasmid or virus particle. The introduced gRNA (guide RNA) and Cas protein (Cas, Cas9) form a complex. When gRNA finds a target sequence on the genome, Cas9 nuclease cleaves both strands of the genomic DNA, resulting in double strand breaks. When a DNA cassette having a double-strand cut near the genome at both ends is simultaneously introduced into a cell, the homologous sequence undergoes homologous recombination and the sequence is inserted into the genome.
本発明の細胞内の標的遺伝子の標識方法は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて標的遺伝子が発現している細胞を選別する工程をさらに含んでもよい。この場合、蛍光タンパク質を指標として、標的遺伝子が発現している細胞を選別することができる。
FACS法は常法により行い、使用する蛍光タンパク質に応じて、適時フィルターを選択することができる。
The method for labeling a target gene in a cell of the present invention may further include a step of selecting cells expressing the target gene using fluorescence activated cell sorting (FACS). In this case, cells expressing the target gene can be selected using the fluorescent protein as an index.
The FACS method is performed by a conventional method, and a filter can be selected in a timely manner according to the fluorescent protein to be used.
本実施形態により、標的遺伝子を欠損させることなく、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、標的遺伝子と置き換えることができる。
また、本実施形態により、標的遺伝子を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現させることができる。
また、ゲノム上の標的遺伝子を編集するため、分化誘導処理により細胞が組織に分化する過程において、標識タンパク質の発現を確認することにより標的遺伝子の発現を確認することができる。
According to this embodiment, a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein can be replaced with the target gene by homologous recombination without losing the target gene.
Moreover, according to this embodiment, a labeled protein equivalent to the target protein can be expressed in the target cell without losing the target gene.
In addition, since the target gene on the genome is edited, the expression of the target gene can be confirmed by confirming the expression of the labeled protein in the process of differentiation of the cells into tissues by the differentiation induction process.
≪ベクターシステム≫
本発明のベクターシステムは、細胞に導入することにより、細胞内在性のマーカー遺伝子（標的遺伝子）を欠損させることなく、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、標的遺伝子と置き換えることができる。
≪Vector system≫
The vector system of the present invention is a gene that encodes a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein without losing a cell endogenous marker gene (target gene) by introduction into the cell. Can be replaced with the target gene by homologous recombination.
［第２実施形態］
本実施形態のベクターシステムは、細胞内で遺伝子活性を維持した標的遺伝子に標識タンパク質遺伝子を接続する、１種以上のベクターを含むベクターシステムであって、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、前記標的遺伝子の３’末端の配列を有するガイドＲＮＡをコードする遺伝子と、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、を含み、前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含む。
[Second Embodiment]
The vector system of the present embodiment is a vector system including one or more vectors that connect a marker protein gene to a target gene that maintains gene activity in a cell, and is labeled with the target protein encoded by the target gene. A gene encoding a fusion protein with a protein, a gene encoding a guide RNA having a sequence at the 3 ′ end of the target gene, and a gene encoding a Cas9 protein, the fusion protein comprising the target protein and A linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme is included between the labeled protein.
ベクターシステムを細胞内に導入すると、Ｃａｓ９がガイドＲＮＡにより特定された箇所の二重鎖DNAを切断する。次に、ゲノム上の二重鎖が切断された近傍の配列を両末端に有するDNAカセットと相同組み換えが起こり、ゲノム上の標的遺伝子が置き換わる。
本実施形態により、標的遺伝子を欠損させることなく、前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、標的遺伝子と置き換えることができる。
When the vector system is introduced into the cell, Cas9 cleaves the double-stranded DNA at the location specified by the guide RNA. Next, homologous recombination occurs with a DNA cassette having a nearby sequence where the double strand on the genome is cut at both ends, and the target gene on the genome is replaced.
According to this embodiment, a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein can be replaced with the target gene by homologous recombination without losing the target gene.
また、本実施形態により、標的遺伝子を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現させることができる。
また、ゲノム上の標的遺伝子を編集するため、分化誘導処理により細胞が組織に分化する過程において、標識タンパク質を確認することにより標的遺伝子の発現を確認することができる。
本実施形態の効果は、第１実施形態における効果を含む。
Moreover, according to this embodiment, a labeled protein equivalent to the target protein can be expressed in the target cell without losing the target gene.
In addition, since the target gene on the genome is edited, the expression of the target gene can be confirmed by confirming the labeled protein in the process of differentiation of cells into tissues by differentiation induction treatment.
The effect of this embodiment includes the effect in 1st Embodiment.
≪標的遺伝子を編集した細胞≫
また、本発明は、細胞内の標的遺伝子の５’末端、及び／又は、３’末端に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを介して、標識タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞を提供する。
細胞の作製には、第１実施形態及び第２実施形態で示した、標的遺伝子の標識方法、及びベクターシステムを用いてもよく、説明は上記の通りである。
染色体は、細胞内においてゲノムを含む遺伝情報の発現と伝達を担う。
≪Cells with edited target genes≫
Further, the present invention has a chromosome containing a gene encoding a marker protein through a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of a target gene in the cell. A cell is provided.
For cell preparation, the target gene labeling method and vector system shown in the first and second embodiments may be used, and the description is as described above.
Chromosomes are responsible for the expression and transmission of genetic information, including the genome, within the cell.
≪遺伝子活性維持標的遺伝子編集キット≫
また、本発明は、［第２実施形態］で説明したベクターシステムを含む組成物又は標的遺伝子編集キットを提供する。
ベクターシステム（第１〜第３のベクター）を細胞内に導入すると、Ｃａｓ９がガイドＲＮＡにより特定された箇所の二重鎖DNAを切断する。次に、ゲノム上の二重鎖が切断された近傍の配列を両末端に有するDNAカセットと相同組み換えが起こり、ゲノム上の標的遺伝子が置き換わる。したがって、本発明の遺伝子活性維持標的遺伝子編集キットにより、標的遺伝子を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現させることができる。
≪Gene activity maintenance target gene editing kit≫
The present invention also provides a composition or target gene editing kit containing the vector system described in [Second Embodiment].
When the vector system (first to third vectors) is introduced into the cell, Cas9 cleaves the double-stranded DNA at the location specified by the guide RNA. Next, homologous recombination occurs with a DNA cassette having a nearby sequence where the double strand on the genome is cut at both ends, and the target gene on the genome is replaced. Therefore, the target gene editing kit for maintaining gene activity of the present invention can express a labeled protein in the same amount as the target protein in the target cell without losing the target gene.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[実施例１]
Ｃｒｘ（cone-rod homeobox）遺伝子産物は転写因子で、網膜細胞の発生や機能に必要な遺伝子群の転写を開始する役割を持っている。
本実施例では、２Ａペプチド遺伝子-Ｅ２-クリムゾン遺伝子を ヒトｉＰＳ細胞のゲノムのＣｒｘ遺伝子の３’末端に導入し、３次元網膜分化培養を行った。
また、本実施例では、相同組換え（Homologous recombination）を効率的に引き起こすDNA二本鎖切断は、CRISPR-Cas9システムによって行う。
また、切断の場所を決めるガイドRNAは、Ｃｒｘ遺伝子の３’末端をターゲットとした（図２）。このように、相同組み換え後にＣｒｘ遺伝子のエクソン４の３’末端にリンカー（２Ａ）及び標識タンパク質（ＦＰ）が付加される（図２）。
本実施例の組換えに用いるドナーベクターは、Ｃｒｘ遺伝子の終止コドンよりも上流１ｋｂ（ホモロジーアーム左腕（HA-L））とＣｒｘ遺伝子の終止コドンよりも下流１ｋｂ（ホモロジーアーム右腕（HA-R））、２Ａペプチド遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、抗生物質耐性遺伝子が挿入されている（図３（ａ））。以下により詳細な説明を行う。
[Example 1]
In Crx (c one- r od homeobo x ) gene product transcription factor, has a role of initiating transcription of genes required for retinal cell development and function.
In this example, the 2A peptide gene-E2-crimson gene was introduced into the 3 ′ end of the Crx gene in the genome of human iPS cells, and three-dimensional retinal differentiation culture was performed.
In this example, DNA double-strand breaks that efficiently cause homologous recombination are performed by the CRISPR-Cas9 system.
In addition, the guide RNA that determines the location of cleavage targeted the 3 ′ end of the Crx gene (FIG. 2). Thus, after homologous recombination, the linker (2A) and the labeled protein (FP) are added to the 3 ′ end of exon 4 of the Crx gene (FIG. 2).
The donor vector used for recombination in this example is 1 kb upstream from the stop codon of the Crx gene (homology arm left arm (HA-L)) and 1 kb downstream from the stop codon of the Crx gene (homology arm right arm (HA-R)). ) A 2A peptide gene, a fluorescent protein gene, and an antibiotic resistance gene are inserted (FIG. 3 (a)). A more detailed description is given below.
＜プラスミド構築＞
組換えに用いるドナーベクターでは、標的遺伝子の終止コドンよりも上流の配列と標的遺伝子の終止コドンよりも下流の配列とを用い、標的遺伝子の終止コドンを削除し、２Ａペプチド遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子を標的遺伝子とインフレームで接続するよう設計した。また、切断の場所を決めるガイドRNAは、標的遺伝子の３’末端をターゲットとするように設計した。
終止コドンなしのＣｒｘ遺伝子の３'末端領域（HA-L：1 kbpのホモロジーアーム左腕）、コード領域の後の配列（HA-R ：1 kbpのホモロジーアーム右腕）は、細菌人工染色体（BAC; RP11-108F6、Advanced GenoTechs）からサブクローン化した。
Ｔ２Ａペプチド遺伝子およびＥ２-クリムゾン遺伝子（PE2-クリムゾン、Clontech）、ブラストサイジン耐性遺伝子発現カセット（pCMV / BSD、ThermoFisher）は、ドナープラスミド（図３（ａ））に挿入した。
Cas9タンパク質は標的ゲノム側のPAM配列NGG（Nはどの塩基でもよい）を認識し、その上流3〜4塩基を切断する。そのため、ガイドRNA（single guide RNA； sgRNA）は、ゲノム上のPAM配列NGGの上流２０塩基をターゲット領域としてデザインするだけで設計が可能である。また、標的配列を認識する塩基配列において、PAM配列上流の10〜12 bpがオフターゲットのリスクを低減する上で重要となる領域とされている。
標的とするＣｒｘ遺伝子の３'末端の配列（GGAAGTTTCAGATCTTGTAG）（配列番号１）をガイドRNA（sgRNA）の発現ベクター（PRGEN-U6-sgRNA、ToolGen）に挿入した。
Cas9は、発現ベクター（PRGEN-Cas9-CMV、ToolGen）から発現した。
<Plasmid construction>
In the donor vector used for recombination, the sequence upstream from the stop codon of the target gene and the sequence downstream from the stop codon of the target gene are used, the stop codon of the target gene is deleted, and the 2A peptide gene and fluorescent protein gene are It was designed to connect with the target gene in-frame. The guide RNA that determines the location of cleavage was designed to target the 3 ′ end of the target gene.
The 3 ′ end region of the Crx gene without a stop codon (HA-L: 1 kbp homology arm left arm) and the sequence after the coding region (HA-R: 1 kbp homology arm right arm) are bacterial artificial chromosomes (BAC; RP11-108F6, Advanced GenoTechs).
The T2A peptide gene, E2-crimson gene (PE2-crimson, Clontech), and blasticidin resistance gene expression cassette (pCMV / BSD, ThermoFisher) were inserted into the donor plasmid (FIG. 3 (a)).
Cas9 protein recognizes the PAM sequence NGG (N may be any base) on the target genome side and cleaves 3 to 4 bases upstream. Therefore, guide RNA (single guide RNA; sgRNA) can be designed simply by designing 20 bases upstream of the PAM sequence NGG on the genome as a target region. Further, in the base sequence for recognizing the target sequence, 10 to 12 bp upstream of the PAM sequence is an important region for reducing off-target risk.
The sequence (GGAAGTTTCAGATCTTGTAG) (SEQ ID NO: 1) of the target Crx gene was inserted into a guide RNA (sgRNA) expression vector (PRGEN-U6-sgRNA, ToolGen).
Cas9 was expressed from an expression vector (PRGEN-Cas9-CMV, ToolGen).
＜細胞へのプラスミドの導入＞
次に、エレクトロポレーションシステム（Nucleofector、 Lonza）を用いて、ドナープラスミド、ガイドRNA（sgRNA）発現ベクター（PRGEN-U6-sgRNA）、Cas9発現ベクター（PRGEN-Cas9-CMV）を、ヒトｉＰＳ細胞（マテリアル名：４５４Ｅ２、寄託先番号：HPS0077）にトランスフェクションした。
エレクトロポレーション後、ヒトｉＰＳ細胞をマトリゲルでコーティングした６ウェルプレートにプレーティングし、Nutristem培地（Stemgent）で培養した。ドナープラスミドの配列が相同組み換えによりゲノム導入されたヒトｉＰＳ細胞を選択するため、エレクトロポレーション後の２日目に培地に１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Wako）を添加した。
<Introduction of plasmid into cells>
Next, using an electroporation system (Nucleofector, Lonza), a donor plasmid, a guide RNA (sgRNA) expression vector (PRGEN-U6-sgRNA), a Cas9 expression vector (PRGEN-Cas9-CMV) were transferred to human iPS cells ( Material name: 454E2, deposit number: HPS0077).
After electroporation, human iPS cells were plated on a 6-well plate coated with matrigel and cultured in Nutristem medium (Stemgent). In order to select human iPS cells whose donor plasmid sequence was genomically introduced by homologous recombination, 10 μg / ml blasticidin (Wako) was added to the medium on the second day after electroporation.
＜遺伝子型の確認＞
形質転換したヒトｉＰＳ細胞を２〜３週間選択培養した後、生き残った細胞のコロニーを採取し、別のプレート中でヒトｉＰＳ細胞を増殖した。このコロニーのゲノムDNAをDNAeasy血液および組織キット（QIAGEN）を用いて抽出した。
遺伝子の挿入は、以下のプライマーとLATaq（TaKaRa）を用いてＰＣＲにより遺伝子型を決定した。
ＣｒｘHAR_R： gcatgattggatgactggatgg（配列番号２）
Ｃｒｘgene_F： gctggttcgggttgctttctcaggaat（配列番号３）
この結果、図３（ｂ）の電気泳動後の写真に示すように、単離した細胞のコロニー＃１０〜＃１６は、配列が挿入された分だけ長いDNA（約4.1 kbp、KI：Knock In）の増幅が確認され、ゲノム上に正しい配列が挿入されたことが確認された。なお、ゲノム上に正しい配列が挿入されていない場合は、約1.7 kbp（WT：Wild Type）のDNAが増幅する。
次に、ゲノムに遺伝子が挿入されたコロニーが、多能性を有していることを確認するため、コロニーを多能性幹細胞のためのプローブであるFITC標識rBC2LCN（1/200希釈）（Wako）で染色した（図３（ｃ））。rBC2LCNプローブは、未分化ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞の細胞表面に存在する糖鎖に高い特異性を持っているため、細胞が未分化状態にあることを確認することができる。図３（ｃ）に示すように、ブラストサイジン耐性の細胞がrBC2LCNにより染色され、コロニーが多能性を有していることを確認できた（rBC2LCNは黒で示し、DAPIは灰色で示す）。したがって、ヒトｉＰＳ細胞にゲノム上に正しい配列が挿入されたことが、確認できた。
<Confirmation of genotype>
After transformed human iPS cells were selectively cultured for 2 to 3 weeks, surviving cell colonies were collected, and human iPS cells were grown in another plate. The genomic DNA of this colony was extracted using DNAeasy blood and tissue kit (QIAGEN).
For gene insertion, the genotype was determined by PCR using the following primers and LATAq (TaKaRa).
CrxHAR_R: gcatgattggatgactggatgg (SEQ ID NO: 2)
Crxgene_F: gctggttcgggttgctttctcaggaat (SEQ ID NO: 3)
As a result, as shown in the photograph after electrophoresis in FIG. 3 (b), colonies # 10 to # 16 of the isolated cells are long DNA (about 4.1 kbp, KI: Knock In) as long as the sequence is inserted. ) Was confirmed, and it was confirmed that the correct sequence was inserted on the genome. If the correct sequence is not inserted on the genome, DNA of about 1.7 kbp (WT: Wild Type) is amplified.
Next, in order to confirm that the colony into which the gene was inserted into the genome has pluripotency, the colony was used as a probe for pluripotent stem cells FITC-labeled rBC2LCN (1/200 dilution) (Wako ) (FIG. 3 (c)). Since the rBC2LCN probe has high specificity for sugar chains present on the cell surface of undifferentiated human ES cells or human iPS cells, it can be confirmed that the cells are in an undifferentiated state. As shown in FIG. 3 (c), blasticidin-resistant cells were stained with rBC2LCN, confirming that the colonies were pluripotent (rBC2LCN is shown in black and DAPI is shown in gray). . Therefore, it was confirmed that the correct sequence was inserted into the genome of human iPS cells.
以下に、ゲノム上に挿入されたDNAカセットの分化誘導後の生体内での挙動を確認するために、免疫組織化学（検出物質：タンパク質）、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（検出物質：ｍＲＮＡ）、蛍光活性化セルソーティング（検出物質：蛍光タンパク質）を用いて、細胞の挙動の確認及び、目的遺伝子が発現している細胞の選別方法について述べる。 Below, immunohistochemistry (detection substance: protein), quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (detection substance: mRNA) are performed to confirm the behavior of the DNA cassette inserted on the genome after differentiation induction. In addition, a method for confirming cell behavior and selecting a cell expressing a target gene using fluorescence activated cell sorting (detection substance: fluorescent protein) will be described.
＜分化細胞における標的遺伝子及び蛍光タンパク質の発現の確認＞
網膜への分化過程において、Ｃｒｘ遺伝子産物及びＥ２-クリムゾンの発現を確認した。胚様体は、分化誘導後６０日（Ｄ６０）において、層構造及びＥ２-クリムゾン陽性細胞が見られた（図３（ｄ））。分化誘導後６０日（Ｄ６０）において、Ｅ２-クリムゾンの発現（矢印頭）が確認された。いくつかの胚様体は色素上皮様の細胞集団が観察された（図３（ｄ））。
<Confirmation of target gene and fluorescent protein expression in differentiated cells>
In the process of differentiation into the retina, the expression of the Crx gene product and E2-crimson was confirmed. In the embryoid body, a layer structure and E2-crimson positive cells were observed 60 days after induction of differentiation (D60) (FIG. 3 (d)). On the 60th day after differentiation induction (D60), the expression of E2-crimson (arrow head) was confirmed. In some embryoid bodies, pigment epithelium-like cell populations were observed (FIG. 3 (d)).
Ｅ２-クリムゾンは細胞全体に局在するのに対し、Ｃｒｘタンパク質は核に局在していた（不図示）。また、Ｄ９０では、ほとんどのＥ２-クリムゾン陽性細胞はＣｒｘタンパク質を発現し（９３．２％±６．５％）、すべてのＣｒｘタンパク質陽性細胞はＥ２-クリムゾンを発現していた（１００％）。したがって、Ｅ２-クリムゾンの発現がＣｒｘタンパク質の発現と相関していることが確認できた。 E2-crimson was localized throughout the cell, whereas Crx protein was localized in the nucleus (not shown). In D90, most E2-crimson positive cells expressed Crx protein (93.2% ± 6.5%), and all Crx protein positive cells expressed E2-crimson (100%). Therefore, it was confirmed that the expression of E2-crimson correlates with the expression of Crx protein.
以上のように、本発明の標的遺伝子の標識方法及びベクターシステムにより、ヒトｉＰＳ細胞のゲノム上の標的遺伝子(Ｃｒｘ)に２Ａペプチド遺伝子を介してＥ２-クリムゾン遺伝子を接続し、遺伝子活性を維持したまま標的遺伝子及び標識タンパク質の発現を確認することができた。 As described above, by the target gene labeling method and vector system of the present invention, the E2-crimson gene was connected to the target gene (Crx) on the genome of human iPS cells via the 2A peptide gene to maintain gene activity. The expression of the target gene and the labeled protein could be confirmed as it was.
＜遺伝子ネットワークの作動確認＞
さらに、標的遺伝子が編集された細胞において、標的遺伝子を含む関連遺伝子の遺伝子活性を確認するために、種々の実験を行った。
Pax６は、目の発生に不可欠な役割を有する。また、Ｃｒｘ遺伝子の発現は他のホメオボックス遺伝子のOtx2により活性化され、光受容体の運命を決定することが知られている。したがって、胚様体の分化状態をモニターするために、分化誘導後３０日目（Ｄ３０）、分化誘導後９０日目（Ｄ９０）において、Pax6、Otx2の発現を免疫組織化学により確認した（図５（ａ）及び図５（ｂ））。
分化の初期段階（Ｄ３０）では、Ｅ２-クリムゾン陽性細胞は、層にまばらに分布しており、Pax6はＥ２-クリムゾン陽性細胞及びＥ２-クリムゾン陰性細胞に発現している（図５（ａ））。
分化の後期段階（Ｄ９０）では、より多くのＥ２-クリムゾン陽性細胞が層に存在し、ほとんどのＥ２-クリムゾン陽性細胞はOtx2を発現している（図５（ｂ））。Ｄ９０におけるＥ２-クリムゾン陽性細胞中のOtx2を発現細胞の比率は、94.8%±7.7%, n=1646であった。したがって、Ｅ２-クリムゾンの発現と、Otx2の発現は高い相関性を示す。
<Operation check of gene network>
Furthermore, various experiments were conducted in order to confirm the gene activity of related genes including the target gene in the cells in which the target gene was edited.
Pax6 has an essential role in eye development. It is also known that Crx gene expression is activated by another homeobox gene, Otx2, and determines the fate of the photoreceptor. Therefore, in order to monitor the differentiation state of embryoid bodies, the expression of Pax6 and Otx2 was confirmed by immunohistochemistry on day 30 after induction of differentiation (D30) and on day 90 after induction of differentiation (D90) (FIG. 5). (A) and FIG.5 (b)).
In the initial stage of differentiation (D30), E2-crimson positive cells are sparsely distributed in the layer, and Pax6 is expressed in E2-crimson positive cells and E2-crimson negative cells (FIG. 5 (a)). .
At the late stage of differentiation (D90), more E2-crimson positive cells are present in the layer, and most E2-crimson positive cells express Otx2 (FIG. 5 (b)). The ratio of cells expressing Otx2 in E2-crimson positive cells at D90 was 94.8% ± 7.7%, n = 1646. Therefore, the expression of E2-crimson and Otx2 are highly correlated.
図５に示したPax6、Otx2の発現をRT-PCR法によってさらに確認した。
図６（ａ）は、FACS法により分離したＥ２-クリムゾン陽性細胞（Ｄ３４、Ｄ５７、Ｄ９０、Ｄ１１１）のＣｒｘの発現量をRT-PCR法により測定した図である。Ｅ２-クリムゾン陽性細胞において、Ｃｒｘが発現していることがわかる。
図６（ｂ）は、FACS法により分離したＥ２-クリムゾン陽性細胞（Ｄ３４、Ｄ５７、Ｄ９０、Ｄ１１１）のPax6の発現量をRT-PCR法により測定した図である。Ｅ２-クリムゾン陰性細胞において、Pax6が発現していることがわかる。
図６（ｃ）は、FACS法により分離したＥ２-クリムゾン陽性細胞（Ｄ３４、Ｄ５７、Ｄ９０、Ｄ１１１）のOtx2の発現量をRT-PCR法により測定した図である。Ｅ２-クリムゾン陽性細胞において、Otx2が発現していることがわかる。
図６（ｄ）は、FACS法におけるAPC-Aの強度を示す図である。図６（ａ）に示す、Ｃｒｘの発現量をRT-PCR法により測定した図と同様に、FACS法によってもＣｒｘの発現量を測定することができる。
図６（ｅ）全細胞におけるＥ２-クリムゾン陽性細胞（Ｄ３４、Ｄ５７、Ｄ９０、Ｄ１１１）の割合（％）を示す図である。分化誘導後にＥ２-クリムゾン陽性細胞の割合が増加していることがわかる。
図６（ｆ）FACS法におけるAPC-Aの強度とRT-PCR法により測定したＣｒｘの発現量の相関関係を示した図である。FACS法におけるAPC-Aの強度とRT-PCR法により測定したＣｒｘの発現量が相関していることがわかる。
The expression of Pax6 and Otx2 shown in FIG. 5 was further confirmed by RT-PCR.
FIG. 6 (a) is a diagram in which the expression level of Crx in E2-crimson positive cells (D34, D57, D90, D111) separated by FACS method is measured by RT-PCR method. It can be seen that Crx is expressed in E2-crimson positive cells.
FIG. 6 (b) is a graph showing the expression level of Pax6 in E2-crimson positive cells (D34, D57, D90, D111) separated by FACS method, measured by RT-PCR method. It can be seen that Pax6 is expressed in E2-crimson negative cells.
FIG. 6 (c) is a diagram in which the expression level of Otx2 in E2-crimson positive cells (D34, D57, D90, D111) separated by FACS method was measured by RT-PCR method. It can be seen that Otx2 is expressed in E2-crimson positive cells.
FIG. 6D is a diagram showing the intensity of APC-A in the FACS method. The expression level of Crx can also be measured by the FACS method in the same manner as shown in FIG. 6A in which the expression level of Crx is measured by the RT-PCR method.
FIG. 6 (e) is a graph showing the ratio (%) of E2-crimson positive cells (D34, D57, D90, D111) in all cells. It can be seen that the percentage of E2-crimson positive cells is increased after differentiation induction.
FIG. 6 (f) shows the correlation between the intensity of APC-A in the FACS method and the expression level of Crx measured by the RT-PCR method. It can be seen that the intensity of APC-A in the FACS method and the expression level of Crx measured by the RT-PCR method are correlated.
＜蛍光活性化セルソーティング（FACS）によりＥ２-クリムゾン陽性細胞の収集＞
FACS法により、Ｅ２-クリムゾン陽性細胞（Ｐ６）、Ｅ２-クリムゾン陰性細胞（Ｐ５）の分布が確認できる。なお、非特異的な蛍光を発する細胞（PE-A及びAPC-A陽性）は、除いてある。分化誘導した細胞（Ｄ３４、Ｄ５７、Ｄ９０、Ｄ１１１）において、Ｅ２-クリムゾン陽性細胞（Ｐ６）をFACS法により確認することができた（図７（ａ）〜図７（ｄ））。
<Collection of E2-crimson positive cells by fluorescence activated cell sorting (FACS)>
The distribution of E2-crimson positive cells (P6) and E2-crimson negative cells (P5) can be confirmed by the FACS method. In addition, cells that emit nonspecific fluorescence (PE-A and APC-A positive) are excluded. In the differentiation-induced cells (D34, D57, D90, D111), E2-crimson positive cells (P6) could be confirmed by FACS method (FIGS. 7 (a) to 7 (d)).
＜Ｅ２-クリムゾン陽性細胞の桿体への分化＞
Nrlは、桿体細胞の運命を決めるMafサブファミリーの転写因子である。Nrlの発現が、D150のＥ２-クリムゾン陽性細胞に見出され、３次元網膜分化培養中で増加した（図８（ａ））。
後期（Ｄ１５０）では、桿体マーカーであるRecoverin及びRhodopsinを発現している（図８（ｂ）及び（図８（ｃ））。桿体への分化には長期間の分化培養が必要である。Ｅ２-クリムゾン陽性細胞が、後期にある比率で桿体に分化するか、３つのノックインヒトｉＰＳ細胞で２９４日間の長期間の３次元網膜分化培養を行った。
また、発現の割合が異なっているものの、Ｅ２-クリムゾン陽性細胞（Ｐ６）中の（図９（ａ）〜図９（ｃ））Ｃｒｘ遺伝子の発現がRT-PCR法により確認できた（不図示）。
<Differentiation of E2-crimson positive cells into rods>
Nrl is a transcription factor of the Maf subfamily that determines the fate of rods. Nrl expression was found in D150 E2-crimson positive cells and increased in three-dimensional retinal differentiation cultures (FIG. 8 (a)).
In late stage (D150), Recoverin and Rhodopsin, which are rod markers, are expressed (FIGS. 8B and 8C). Differentiation into rods requires long-term differentiation culture. The E2-crimson positive cells differentiated into rods at a certain ratio in the late stage, or three knock-in human iPS cells were subjected to long-term three-dimensional retinal differentiation culture for 294 days.
Although the expression ratios were different, the expression of Crx gene in E2-crimson positive cells (P6) (FIG. 9 (a) to FIG. 9 (c)) was confirmed by RT-PCR (not shown) ).
以上の結果より、本発明により作製された細胞の標的遺伝子の遺伝子活性が維持され、細胞内の関連遺伝子の働きも予想通り行われていることが確認できた。したがって、本発明は、標的遺伝子を欠損させることなく、標的遺伝子の遺伝子活性を確認することができる。 From the above results, it was confirmed that the gene activity of the target gene of the cell prepared according to the present invention was maintained, and the function of the related gene in the cell was performed as expected. Therefore, this invention can confirm the gene activity of a target gene, without deleting a target gene.
本実施例で用いられた、その他の材料及び方法の詳細を以下に示す。
＜細胞の培養＞
次に、ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導実験に使用するため、ヒトｉＰＳ細胞（454E2、理研BRC）を無フィーダー条件で培養し、マトリゲル（hESC-qualified Matrigel, BD）コーティングした６ウェルプレートで、E8培地（GIBCO）中で維持した。
細胞は、継代または分化のためにD-PBS（nacalai tesque）で希釈した0.5 mMのEDTAで解離した。
Details of other materials and methods used in this example are shown below.
<Cell culture>
Next, in order to use human iPS cells for differentiation induction experiments, human iPS cells (454E2, RIKEN BRC) were cultured in a feeder-free condition and coated with Matrigel (hESC-qualified Matrigel, BD) in an E8 medium. Maintained in (GIBCO).
Cells were dissociated with 0.5 mM EDTA diluted in D-PBS (nacalai tesque) for passage or differentiation.
＜細胞の分化誘導＞
Ｃｒｘ遺伝子産物は、網膜細胞の発生や機能に必要な遺伝子群の転写を開始する役割を持っている。ヒトｉＰＳ細胞を３次元網膜細胞分化培地により網膜細胞に分化することができる。
網膜細胞への分化のために、ウェルあたり９,０００細胞になるように細胞をＶ底細胞凝集９６ウェルプレート（Greiner bio-one）で、１００μlの培地（０日目）（表１参照）で収集した。
分化誘導後２日目（Ｄ２）に、１００μlの培地（２日目）（表１参照）を各ウェルに添加した。分化誘導後６日目（Ｄ６）に、各ウェル中の培地の半分を培地（６日目）（表１参照）に入れ替えた。 分化誘導後１２日目（Ｄ１２）に、細胞をぺトリ皿(ASNOL Sterilization Plate, AS ONE)に移し、培地を培地（１２日目）（表１参照）に入れ替えた（図４（ｃ）参照）。分化誘導後１８日目（Ｄ１８）に、培地（１８日目）（表１参照）に入れ替えた。
その後、分化した網膜細胞を維持培地中で培養し、３日毎に培地を入れ替えた。これらの概要を模式的に図４（ａ）に示す。
<Induction of cell differentiation>
The Crx gene product has a role of initiating transcription of genes necessary for retinal cell development and function. Human iPS cells can be differentiated into retinal cells using a three-dimensional retinal cell differentiation medium.
For differentiation into retinal cells, cells were plated in a V-bottom cell aggregate 96-well plate (Greiner bio-one) to 9,000 cells per well in 100 μl medium (Day 0) (see Table 1). Collected.
On the second day after differentiation induction (D2), 100 μl of medium (day 2) (see Table 1) was added to each well. On day 6 after differentiation induction (D6), half of the medium in each well was replaced with medium (day 6) (see Table 1). On the 12th day after differentiation induction (D12), the cells were transferred to a Petri dish (ASNOL Sterilization Plate, AS ONE), and the medium was replaced with the medium (day 12) (see Table 1) (see FIG. 4 (c)). ). On the 18th day after differentiation induction (D18), the medium was replaced with the medium (18th day) (see Table 1).
Thereafter, the differentiated retinal cells were cultured in a maintenance medium, and the medium was changed every 3 days. These outlines are schematically shown in FIG.
＜免疫組織化学＞
培養された胚様体を、４％のパラホルムアルデヒドで、１５分間室温にて固定した。固定後、胚様体をPBSで洗浄し、段階的な脱水溶液で処理した。すなわち、１０％、２０％、３０％スクロースを有するPBSで、それぞれ４℃で一晩インキュベートした。
次に、胚様体をOCT(Optimal Cutting Temperature)コンパウンド（Sakura Finetek）に包埋し、クライオスタット（HM500、MICROM）で切片にするか、使用するまで−８０℃で保存した。
切片を、膜透過性のために、PBS-0.05％のTween20（PBS-T）およびPBS-0.3％Triton-Xで２回処理した。その後、室温で1時間、PBS中の5％ヤギ血清を含有するブロッキング溶液とともにインキュベートし、PBS中1％ヤギ血清を含む一次抗体（表２参照）で一晩インキュベートした。
その後、サンプルをPBS-Tで洗浄し、4 '、6- diamidino- 2-phenyindole（DAPI：1：1000で;nacalai tesque）、又はPBS中1％ヤギ血清を含む二次抗体（表２参照）でインキュベートした。
PBS-Tで洗浄した後、サンプルをフルオロKEEPER（nacalai tesque）に搭載し、蛍光顕微鏡（BZ9000、KEYENCE）または共焦点顕微鏡（LSM710、カールツァイス）を用いて蛍光画像を得た。
<Immunohistochemistry>
The cultured embryoid bodies were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature. After fixation, embryoid bodies were washed with PBS and treated with stepwise dewatering. That is, each of them was incubated overnight at 4 ° C. in PBS containing 10%, 20%, and 30% sucrose.
Next, embryoid bodies were embedded in OCT (Optimal Cutting Temperature) compound (Sakura Finetek) and sectioned with cryostat (HM500, MICROM) or stored at −80 ° C. until use.
Sections were treated twice with PBS-0.05% Tween20 (PBS-T) and PBS-0.3% Triton-X for membrane permeability. Subsequently, it was incubated with a blocking solution containing 5% goat serum in PBS for 1 hour at room temperature and incubated overnight with a primary antibody containing 1% goat serum in PBS (see Table 2).
Samples were then washed with PBS-T and secondary antibody containing 4 ', 6-diamidino-2-phenyindole (DAPI: 1: 1000; nacalai tesque), or 1% goat serum in PBS (see Table 2) Incubated with.
After washing with PBS-T, the sample was mounted on a fluoro KEEPER (nacalai tesque), and a fluorescence image was obtained using a fluorescence microscope (BZ9000, KEYENCE) or a confocal microscope (LSM710, Carl Zeiss).
＜定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）＞
遺伝子の発現を確認するために、ヒトｉＰＳ細胞から全RNAを調製した。ヒトｉＰＳ細胞を、ISOGEN-LS（Wako）中で溶解し、RNAをクロロホルムで抽出した。その後、イソプロピルアルコールでRNAを沈殿させ、75％エタノールで洗浄し乾燥させた。 RNAペレットをRNaseフリー水およびRNaseインヒビター（TaKaRa）に再懸濁し、その後のReverTraエースのqPCR RTキット（TOYOBO）を用いて逆転写しcDNAを合成した。
得られたcDNAを、SYBRプレミックスExTaqII（TaKaRa）遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した（表３）。リアルタイムPCR解析は、サーマルサイクラーダイス（TaKaRa）を用いておこなった。遺伝子の相対的発現は、アクチン-β（ACTB）と比較することにより行い、delta- delta CT（ddCT）法で定量した。
<Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)>
Total RNA was prepared from human iPS cells to confirm gene expression. Human iPS cells were lysed in ISOGEN-LS (Wako) and RNA was extracted with chloroform. Thereafter, RNA was precipitated with isopropyl alcohol, washed with 75% ethanol and dried. The RNA pellet was resuspended in RNase-free water and RNase inhibitor (TaKaRa) and then reverse transcribed using a ReverTra Ace qPCR RT kit (TOYOBO) to synthesize cDNA.
The resulting cDNA was amplified using SYBR premix ExTaqII (TaKaRa) gene specific primers (Table 3). Real-time PCR analysis was performed using a thermal cycler die (TaKaRa). The relative expression of the gene was performed by comparing with actin-β (ACTB) and quantified by the delta-delta CT (ddCT) method.
＜統計分析＞
統計分析は、ウェルチｔ検定を用いて行った。一元配置分散分析は、多重比較用のダネット検定を用いておこなった。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えられる。
<Statistical analysis>
Statistical analysis was performed using Welch t test. One-way analysis of variance was performed using Dunnett's test for multiple comparisons. A p value <0.05 is considered statistically significant.
＜蛍光活性化セルソーティング（FACS）＞
遺伝子発現プロファイルの詳細を解析するために、FACS法によりＥ２-クリムゾン陽性細胞を収集した。
細胞群の蛍光強度は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で確認することができる。
培養された胚様体を１５分間 Accumax（Innovative Cell Technologies）を用いて分離した。細胞は、遠心分離し（５分間、1000rpm）、死細胞を標識するために、near-IR fluorescent reactive dye（Life technologies）を含有するPBS中に再懸濁した。
細胞は、細胞ストレーナー（100μm, Falcon）を用いてろ過し、FACS分析の前に氷上で維持した。細胞を回収し、BD FACSARIA IIセルソーター（BD Bioscience）を用いて分析した。 APC-AまたはPE-Aフィルター（BD Bioscience）を細胞選別のために使用した。
<Fluorescence activated cell sorting (FACS)>
In order to analyze the details of the gene expression profile, E2-crimson positive cells were collected by FACS method.
The fluorescence intensity of the cell group can be confirmed by fluorescence activated cell sorting (FACS).
The cultured embryoid bodies were separated using Accumax (Innovative Cell Technologies) for 15 minutes. Cells were centrifuged (5 minutes, 1000 rpm) and resuspended in PBS containing near-IR fluorescent reactive dye (Life technologies) to label dead cells.
Cells were filtered using a cell strainer (100 μm, Falcon) and kept on ice prior to FACS analysis. Cells were harvested and analyzed using a BD FACSARIA II cell sorter (BD Bioscience). APC-A or PE-A filters (BD Bioscience) were used for cell sorting.
＜低分子化合物による阻害実験＞
γセクレターゼ阻害剤であるDAPT（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル）は、間接的にγセクレターゼ基質であるNotchを阻害し、Ｃｒｘ陽性細胞の数を増加させることが知られている（Osakada F, Ikeda H, Mandai M, et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2008;26:215-224.）。Notchシグナル経路阻害物質、DAPTの効果が、ノックイン細胞株において検出され得るかどうかを調べるために10μMのDAPT（Wako）を培地に添加した。Ｄ３０〜Ｄ９０の６０日間処理されたＥ２-クリムゾン陽性細胞でのＣｒｘ遺伝子の発現レベルを調べた。実際に、Ｃｒｘの発現とＥ２-クリムゾンの蛍光は、未処理細胞に比べDAPT処理細胞において高かった（不図示）。したがって、本発明においてＥ２-クリムゾン陽性細胞を効率よく収集する際にDAPTを添加してもよい。
<Inhibition experiment with low molecular weight compounds>
DAPT (N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester), a γ-secretase inhibitor, indirectly inhibits Notch, a γ-secretase substrate. It is known to increase the number of Crx-positive cells (Osakada F, Ikeda H, Mandai M, et al. Toward the generation of rod and cone neurons from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2008; 26: 215-224.). To examine whether the effects of the Notch signaling pathway inhibitor, DAPT, can be detected in knock-in cell lines, 10 μM DAPT (Wako) was added to the medium. The expression level of the Crx gene in E2-crimson positive cells treated for 60 days from D30 to D90 was examined. In fact, Crx expression and E2-crimson fluorescence were higher in DAPT-treated cells than in untreated cells (not shown). Therefore, DAPT may be added when E2-crimson positive cells are efficiently collected in the present invention.
[実施例２]
他の標的遺伝子と標識タンパク質の組み合わせでも実施例１と同様な結果が得られることを検証するためにさらなる実験を行った。心臓の洞房結節のマーカーであるＨＣＮ４遺伝子を用いた。実施例１の標的遺伝子（Ｃｒｘ）、標識タンパク質（Ｅ２-クリムゾン）を、それぞれＨＣＮ４、ＹＦＰにかえた以外は、実施例１と同様に実施した（図１０（ａ））。ドナーベクターのHA−R、HA−Lは、ＨＣＮ４遺伝子の終止コドンよりも上流（HA-L）とＨＣＮ４遺伝子の終止コドンよりも下流（HA-R）を用いた。また、ガイドＲＮＡの配列にはＨＣＮ４遺伝子の末端部分を用いた。
図１０（ｂ）に示すように、相同組み換えにより標的遺伝子が置き換わった細胞では、ＨＣＮ４とＹＦＰの融合タンパク質を発現することが確認された。したがって、本発明のベクターシステム、方法は任意の標的遺伝子及び標識タンパク質に適用可能である。
[Example 2]
Further experiments were performed to verify that the same results as in Example 1 were obtained with other target gene and labeled protein combinations. The HCN4 gene, a marker for cardiac sinoatrial node, was used. The same procedure as in Example 1 was performed except that the target gene (Crx) and labeled protein (E2-crimson) in Example 1 were replaced with HCN4 and YFP, respectively (FIG. 10 (a)). The donor vectors HA-R and HA-L were used upstream (HA-L) from the stop codon of the HCN4 gene and downstream (HA-R) from the stop codon of the HCN4 gene. Further, the terminal portion of the HCN4 gene was used as the guide RNA sequence.
As shown in FIG. 10 (b), it was confirmed that a cell in which the target gene was replaced by homologous recombination expressed a fusion protein of HCN4 and YFP. Therefore, the vector system and method of the present invention can be applied to any target gene and labeled protein.
以上のように実施例を示したが、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々変更を加え得ることは勿論である。
例えば、本発明の実施例では、正常なヒトｉＰＳ細胞を用いたが、特定の遺伝子に欠損のある疾患を有するヒトｉＰＳ細胞を用いることにより、標的遺伝子の発現等を指標とした低分子化合物等のスクリーニングにも利用できる。
Although the embodiment has been described as above, it goes without saying that various modifications can be made without departing from the scope of the present invention.
For example, in the examples of the present invention, normal human iPS cells were used, but by using human iPS cells having a disease deficient in a specific gene, a low molecular compound or the like using target gene expression as an index, etc. It can also be used for screening.
本発明による組織特異的マーカーの蛍光タンパク質の標識は、細胞移植後のトレースのドナー細胞のための任意のマーカー遺伝子にも適用可能である。
光受容体の多くは、網膜色素変性症または加齢性黄斑変性症などの網膜変性疾患を有する患者における細胞移植治療に必要とされるため、効率的な網膜の分化プロトコルが求められている。このため、本発明によれば、例えば、網膜色素変性症の治療において、患者の体細胞から、ヒトｉＰＳ細胞を樹立し、その後、視細胞を分化誘導する際に、正確に視細胞に分化した細胞を特定することができる。
The fluorescent protein labeling of tissue specific markers according to the present invention is also applicable to any marker gene for donor cells in traces after cell transplantation.
Since many photoreceptors are required for cell transplantation treatment in patients with retinal degenerative diseases such as retinitis pigmentosa or age-related macular degeneration, there is a need for an efficient retinal differentiation protocol. Therefore, according to the present invention, for example, in the treatment of retinitis pigmentosa, human iPS cells are established from somatic cells of a patient, and then differentiated into photoreceptor cells accurately when the photoreceptor cells are induced to differentiate. Cells can be identified.
また、本発明によれば、細胞の分化状態の特定及び分化した細胞集団をFACSセルソーターにより選別及び回収することができる。そして、回収した細胞を動物に移植する場合においても、移植した細胞を蛍光標識によって追跡することができる。 In addition, according to the present invention, the differentiation state of the cells can be specified and the differentiated cell population can be selected and collected by the FACS cell sorter. And also when transplanting the collect | recovered cell to an animal, the transplanted cell can be traced by a fluorescent label.
本発明は、以上の実施形態に限られず、他の組織に特異的に発現する遺伝子を用いて実施することができる。
本発明は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞に限られず、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、造血子孫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞を用いてゲノムの改変をおこなってもよい。
これらの細胞を培養する培地は、培養可能な培地であれば特に制限されず、DMEM培地、BME培地、IMDM培地、及びこれらの混合培地を使用することができる。上記培地成分としては、通常の動物細胞用の培地に含有される成分、グルコース、塩化ナトリウム、ビタミン・ミネラル類、アミノ酸類等の栄養成分、成長因子、細胞増殖因子、分化誘導因子、抗菌剤、抗真菌剤などを加えてもよい。
The present invention is not limited to the above embodiment, and can be carried out using genes that are specifically expressed in other tissues.
The present invention is not limited to iPS cells and ES cells, but fibroblasts, keratinocytes, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic progeny cells, T cells, B cells, glial cells, nerve cells, glial progenitor cells, Genomic modification may be performed using glial stem cells, muscle cells, lung cells, pancreatic cells, liver cells, and cells in the reticulo system.
The medium for culturing these cells is not particularly limited as long as it can be cultured, and a DMEM medium, a BME medium, an IMDM medium, and a mixed medium thereof can be used. Examples of the above-mentioned medium components include components contained in normal medium for animal cells, nutrients such as glucose, sodium chloride, vitamins and minerals, amino acids, growth factors, cell growth factors, differentiation inducing factors, antibacterial agents, An antifungal agent or the like may be added.
本発明により、標的遺伝子を欠損することなく、目的細胞内に標的タンパク質と等量の標識タンパク質を発現することができる。これにより、標的遺伝子の活性を保ったまま、遺伝子活性の確認を行うことができる。 According to the present invention, a labeled protein equivalent to the target protein can be expressed in the target cell without losing the target gene. Thereby, the gene activity can be confirmed while maintaining the activity of the target gene.
Claims (6)
前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を相同組み換えにより、前記標的遺伝子と置き換える工程を含み、
前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とする標的遺伝子の標識方法。 A method for labeling a target gene that enables confirmation of gene activity,
A step of homologous recombination of a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein with the target gene,
The method for labeling a target gene, wherein the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeling protein.
前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、
前記標的遺伝子の３’末端の配列を有するガイドＲＮＡをコードする遺伝子と、
Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子と、を含み、
前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とするベクターシステム。 A vector system comprising one or more vectors for connecting a labeled protein gene to a target gene that has maintained gene activity in a cell,
A gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein;
A gene encoding a guide RNA having a sequence at the 3 ′ end of the target gene;
A gene encoding Cas9 protein,
The fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeled protein.
前記標的遺伝子にコードされる標的タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、
前記標的遺伝子の３’末端の配列を有するガイドＲＮＡをコードする遺伝子を含む第２のベクターと、
Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む第３のベクターと、を含み、
前記融合タンパク質は、前記標的タンパク質と前記標識タンパク質との間に、内在性酵素の切断配列を有するリンカーを含むことを特徴とする遺伝子活性維持標的遺伝子編集キット。
A target gene editing kit for editing a target gene on the genome,
A first vector comprising a gene encoding a fusion protein of a target protein encoded by the target gene and a labeled protein;
A second vector comprising a gene encoding a guide RNA having a sequence at the 3 ′ end of the target gene;
A third vector containing a gene encoding Cas9 protein,
The gene activity maintenance target gene editing kit, wherein the fusion protein includes a linker having a cleavage sequence of an endogenous enzyme between the target protein and the labeling protein.
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