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JP2017536847A - 血液障害の予後判断方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、慢性骨髄性白血病を患う個体の化学療法に対する反応の予後判断のためのインビトロ方法であって、（ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の発現レベルの測定ステップ、（ｂ）比較ステップ、および（ｃ）スコアＳの決定ステップを含み、それにより、Ｓが１未満である場合には、前記化学療法に対して反応する４０％を超える確率が前記個体にあり、Ｓが１以上である場合には、前記化学療法に対して反応する４０％未満の確率が前記個体にある、前記方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は血液障害の予後判断方法に関し、より具体的には血液障害の個人化された、またはセラノスティックな予後判断方法に関する。
慢性骨髄性白血病は「骨髄増殖症候群」という名称の下で分類される血液疾患のうちの１つである。慢性骨髄性白血病は骨髄内での異常な白血球（病的多形核好中球）の過剰で持続的な産生を特徴とする。適切な治療を受けないと慢性骨髄性白血病は骨髄内での未成熟細胞の蓄積を特徴とする急性白血病になる。
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はフランスでは毎年約６００件の新患しかいないので比較的に珍しい疾患である。それは女性よりも男性においてやや多い。その頻度は年齢と共に増加する。診断されたときの患者の平均年齢は５３歳である。
その疾患は、フィラデルフィア染色体（この染色体異常が１９６０年に初めて報告された会議が開かれた米国の都市の名前から）という小さな異常染色体が出現する原因となる、骨髄幹細胞における９番染色体と２２番染色体の間での転座に関連する異常の出現と関連付けられている。この異常はＡＢＬと呼ばれる９番染色体の遺伝子をＢＣＲと呼ばれる２２番染色体の遺伝子と間違って一体化することになる。これにより、病的細胞にしか存在しないＢＣＲ−ＡＢＬと呼ばれる遺伝子が作られる。この遺伝子は異常なほど多量のＡｂｅｌｓｏｎチロシンキナーゼ（ＡＢＬ）という酵素を産生し、それがフィラデルフィア染色体を担持する白血球の産生を増加させる原因である。
慢性骨髄性白血病は３段階に進展する。
●慢性期
ほとんどの患者はこの病期にこの疾患であると診断される。この病期の間に白血病が徐々に進展する。症状は非常に少ないか、または全く無い。骨髄中および血液中にはまだ少数の白血球（白芽球）しかない。治療されない場合、この病期は平均して３年から４年間にわたって続く。
●急性期
この病期は血液中および骨髄中の白芽球の割合の増加、ならびにＢＣＲ−ＡＢＬ負荷量の増加と新しい染色体異常の出現に対応する。疲労、食欲不振、はっきりとした理由の無い高熱などの非特異的症状がさらに頻発する。治療を始めないと数か月の内にこの疾患は急性期に進展し、これを移行と呼ぶ。
●移行期
白血病は慢性期から次に急性期に転化する。白芽球が骨髄に浸潤し、以後、骨髄は正確に機能することができない。短期的にはこの二次的な急性白血病の予後は非常に良くない。
慢性骨髄性白血病の治療はチロシンキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬品の投与である。
その治療の目的は急性転化を防止することであり、その最終的な目標はＢＣＲ−ＡＢＬ発現細胞を根絶し、急性白血病への移行を防止することである。
慢性期では１番目に選択される治療はメシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））である。メシル酸イマチニブの後に第２世代阻害剤と呼ばれる他のチロシンキナーゼ阻害剤、すなわちニロチニブおよびダサチニブが開発された。それらは重篤な副作用を引き起こす可能性がある。ニロチニブは１番目に選択される薬品として市場流通が許可されている。
その治療の目標はクローン選択を防止するために可能な限り早く分子遺伝学的大奏功を得ることである。この分子遺伝学的奏功の後に細胞学的寛解および細胞遺伝学的寛解が続く。
したがって患者に可能な限り早く適切な治療を提供することが必要であり、それにより重篤な副作用を引き起こさずに短時間での分子遺伝学的大奏功が可能になる。数種類のチロシンキナーゼ阻害剤が存在し、初年に不適切な治療選択がされると医療システムにとって非常に高額の費用がさらにかかることになる。
治療選択を最適化するためにチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を使用する治療に対する耐性リスクを評価することを特に目的とした予後判断方法が開発されている。この一例は国際出願第２０１２／０４９３２９号であり、それは様々な基質に対するキナーゼ活性を測定することによりＴＫＩ治療に対する患者の反応を予測することを目的としている。
しかしながら、そのような方法は簡単および日常的に実施することが難しい。
また、第１世代ＴＫＩ治療および第２世代または後代のＴＫＩ治療との間での治療法決定の簡単な最適化を可能にするマーカーが存在しないので、ＣＭＬの個人化予後判断方法を提供する必要性がまだ存在する。
本発明の課題の１つはこれらの障害を克服することである。
本発明の別の課題は医療ミスのリスクを最小化するように考案されている予後判断方法を提案することである。
本発明のさらに別の課題は最も適切な治療を最初に患者に提案することにより治療コストを減少させることである。
本発明は、慢性骨髄性白血病を患う個体より採取された白血病生体試料に基づく、治療に対する前記個体の反応についてのインビトロ予後判断方法であって、
（ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
（ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
（ｃ）次の式１に従ってスコアＳを決定するステップであって、
Figure 2017536847
 式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
を含み、それにより
‐Ｓが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％を超える確率が前記個体にあり、および
‐Ｓが１以上である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％未満の確率が前記個体にある、前記方法に関する。
言い換えると、本発明は、慢性骨髄性白血病を患う個体より採取された白血病生体試料に基づく、治療に対する前記個体の反応についてのインビトロ予後判断方法であって、
（ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子に対応する相補性ＤＮＡの量を測定するステップであって、
前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される核酸分子によって特定され、
前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
（ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
（ｃ）次の式１に従ってスコアＳを決定するステップであって、
Figure 2017536847
 式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
を含み、それにより
‐Ｓが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％を超える確率が前記個体にあり、および
‐Ｓが１以上である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％未満の確率が前記個体にある、前記方法に関する。
本発明は、慢性骨髄性白血病の診断後の１年の時点で、言い換えると第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に、慢性骨髄性白血病を患っており、且つ、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されている、すなわち、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標））で治療されている患者の予後を判定するためには配列番号１から配列番号２５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される２５遺伝子からなる群に属し、配列番号１から配列番号７の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される少なくとも７種類の特定の遺伝子が充分であるという本発明者によって成された驚くべき発見に基づいている。
上記の群の２５遺伝子は、活性酸素種が蓄積する細胞の無毒化処理に関与する酵素をコードする遺伝子である。
本発明の方法は次の様に実施される。
‐当業者に知られている方法に従い、患者より採取された試料、特に血液試料から核酸、好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、
‐前記試料から採取され、且つ、配列番号１から配列番号７の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される核酸の量を測定し、この測定によって前記遺伝子の各々についての発現レベル値が得られ、
‐前記遺伝子の各々について正規化された値、または比率を得るため、前記遺伝子の各々について得られた値をどんな血液疾患も無い個体の試料から採取された同一の遺伝子について得られた値と比較し、
‐上記の式１に従って前記正規化された値を合算し、その合算は次のようにまとめられ、
Figure 2017536847
 式中、スコアＳを得るためにｉは１から５まで変化し、ｊは５から６まで変化する
‐先行ステップにおいて得られるスコアＳについて得られた値に基づいて予後を判定する。
本発明では「健常生体試料」または「無疾患生体試料」は、それを含む生体物質が１人以上の健康な個体に由来するその生体物質の試料、またはその生体物質に少なくとも血液疾患が無いその生体物質の試料を意味する。
前記健常試料は検査試料と同じ性質であることが有利である。言い換えると、検査試料が血液試料である場合、健常試料も別の個体の血液試料になる。同様に、試料が骨髄試料である場合、健常試料も骨髄試料になる。
健常試料（または無疾患試料）は血液疾患が無い個体より採取された試料をまとめたものに相当し得るが、患者の試料は唯一のものであり、異なる患者より採取された試料の混合物に決して相当しないことに留意されたい。
前記生体試料、およびしたがって健康な個体より採取された前記生体試料は全血試料、白血球試料、循環単核球試料、または骨髄試料であることが有利である。
本発明の背景では配列番号１から配列番号７の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される遺伝子の発現レベルを測定することが必要である。しかしながら、配列番号８から配列番号２５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される前記遺伝子群のうちの１つ以上の他の遺伝子であって、試料の酸化状態を反映するそれらの遺伝子の発現を測定することが、得られた予後反応を変更することなく可能である。
本発明の予後判断方法を実施すると、チロシンキナーゼ阻害剤、とりわけイマチニブ、特にメシル酸イマチニブを使用する１番目に選択される治療の後、患者の予後、および特に患者の生存確率がスコアＳによって次のように一年の最後に判定される。
‐スコアＳが１未満である場合には、メシル酸イマチニブ治療の開始から一年後に分子遺伝学的大寛解を得る少なくとも約４０％の確率が前記メシル酸イマチニブ治療を受けている患者にあり、一方、
‐スコアＳが１以上である場合には、予後は悪くなり、メシル酸イマチニブ治療の開始から一年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％未満の確率が前記メシル酸イマチニブ治療を受けている患者にある。
本発明では「分子遺伝学的大奏功」はＢＣＲ−ＡＢＬ転写物を発現する細胞の消失または実質的な消失を意味し、０．１％以下のＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率を意味することが有利である。患者に対して行われる治療の目的はこの疾患の完全寛解であるので、ＢＣＲ−ＡＢＬ転写物がもはや全く検出可能ではなくなることが明らかに好ましい。しかしながら、大まかに言うと上記の０．１％以下のＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率は非常に満足のいくものであると現在のところ考えられている。これは、Ｂａｃｃａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ｂｌｏｏｄ， １２２（６）， ８７２−８８４において公開されているように、慢性骨髄性白血病を患っている患者のモニタリングについてのＥＵ勧告に適合している。これらの勧告を次のようにまとめることができる。
‐定量的ＰＣＲによって測定されたＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ転写物比率がチロシンキナーゼ阻害剤を使用する３か月の治療の後に１０％以下である場合、６か月の治療の後に１％以下である場合、および１２か月の治療の後に０．１％以下である場合、その治療は最適であり、
‐一方、定量的ＰＣＲによって測定されたＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ転写物比率がチロシンキナーゼ阻害剤を使用する６か月の治療の後に１０％を超える場合、および１２か月の治療の後に１％を超える場合、その治療を変更することが推奨される。
ＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率が０．１と１０の間である場合、それは、したがって、「分子遺伝学的中奏功」を表している。最後に、ＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率が１０を超える場合、それは「低反応者」または「無反応者」を表している。
本発明では発現レベルが測定される遺伝子は前記遺伝子の転写の際に得られるそれらのメッセンジャーＲＮＡ、またはそれらの相補性ＤＮＡによって示される。明確にしておくと、遺伝子の転写は当技術分野では周知のプロセスであるのでその説明は必要ない。
本発明の範囲内で発現レベルが測定される遺伝子には幾つかの変異体、すなわち、配列が異なる幾つかのメッセンジャーＲＮＡ分子を発現することができるものもある。これらの変異体は選択的スプライシングによって得られることが一般的であり、前記スプライシングによって前記遺伝子の発現産物の１か所以上の部分が付加、除去、または修飾され得る。ここでもそのスプライシング機構は当技術分野において周知であり、説明の必要が無い。
本発明による方法にとって中心的である遺伝子は次のものである。
‐カタラーゼをコードする、配列番号１の配列によって表されるＣＡＴ遺伝子、
‐スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ‐Ｚｎ］をコードする、配列番号２の配列によって表されるＳＯＤ１遺伝子、
‐グルタチオンペルオキシダーゼ１をコードする、配列番号３の配列によって表されるＧＰＸ１遺伝子、および特にその変異体１であるＧＰＸ１（１）遺伝子、
‐グルタチオンペルオキシダーゼ４をコードする、配列番号４の配列によって表されるＧＰＸ４（１−２−３）遺伝子、および特にその変異体１〜３、
‐ペルオキシレドキシンをコードする、配列番号５の配列によって表されるＰＤＲＸ１遺伝子、および特にその変異体１〜３、
‐スーパーオキシドジスムターゼ２をコードする、配列番号６の配列によって表されるＳＯＤ２（１−２−３）遺伝子、および
‐グルタチオンペルオキシダーゼ２をコードする、配列番号７の配列によって表されるＧＰＸ２遺伝子。
さらに、上で述べたように、ある特定の遺伝子については変異体が存在するので、
‐遺伝子ＧＰＸ４（１−２−３）の発現を測定するために配列番号４の配列および／または配列番号８の配列および／または配列番号９の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される核酸の発現を測定することができ、
‐遺伝子ＰＲＤＸ１の発現を測定するために配列番号５の配列および／または配列番号１０の配列および／または配列番号１１の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される核酸の発現を測定することができ、そして
‐遺伝子ＳＯＤ２（１−２−３）の発現を測定するために配列番号６の配列および／または配列番号１２の配列および／または配列番号１３の配列を含むか、またはそれらの配列から構成される核酸の発現を測定することができる。
下の表は本発明に従う有利な遺伝子をまとめている。
Figure 2017536847
上に示されている配列は表示されている遺伝子に対応する相補性ＤＮＡ配列に相当する。
変異体を持つ前記遺伝子の発現を測定するための本発明において使用される分子ツールは、同遺伝子の変異体の全ての発現レベルを同時に測定することを可能にするようなものである。
さらに、本発明の範囲内では、配列番号１の配列によって表される遺伝子ＧＰＸ４（１−２−３）の発現レベルを測定するとき、実際には前記遺伝子の変異体の発現を同時に測定しており、すなわち、配列番号４の配列、配列番号８の配列、および配列番号９の配列の核酸分子の発現レベルを同時に測定している。
実験につきものの変動を克服するため、本発明の目的の遺伝子、すなわち、配列番号１から配列番号２５の配列の遺伝子から選択される少なくとも配列番号１から配列番号７の配列の遺伝子、および存在するときにはそれらの変異体の各々の発現レベルを、慢性骨髄性白血病の背景またはより一般的にはあらゆる疾患の背景で発現レベルが変化しない（増加または減少しない）１種類以上の遺伝子の発現レベルに対して正規化する。
正規化を可能にする遺伝子または複数の遺伝子は一般に「ハウスキーピング遺伝子」と呼ばれ、それらはアクチンまたはチューブリンのような細胞の構造に関わるタンパク質をコードする遺伝子に相当し、または例えばグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＡＰＤＨ遺伝子のような代謝酵素コード遺伝子にも相当する。
したがって、実際には所与の遺伝子についてその発現レベルが測定され、１の値が得られる。並行してＧＡＰＤＨの発現レベルが測定され、２のスコアが得られる。
前記所与の遺伝子の正規化発現レベルは、それが例えばノーザンブロット法において使用される場合、スコア１／スコア２という比率によって得られる。
これまでに述べたように、上記の予後判断方法において調査される遺伝子の発現レベルは健康な個体より採取された生体試料から採取された同一の遺伝子の発現レベルと比較される。前記健常生体試料から採取された遺伝子の発現レベルも１種類以上の「ハウスキーピング」遺伝子に対して正規化される。
さらに、式１の中で規定されている比率ｉを次のように再定義することができる。
Figure 2017536847
式中、
‐スコア１ｉ（患者）は患者より採取された試料中の遺伝子ｉについて測定された発現レベルであり、
‐スコア２（患者）は患者より採取された試料中のハウスキーピング遺伝子について測定された発現レベルであり、
‐スコア１ｉ（健常者）は健康な個体より採取された試料中の遺伝子ｉについて測定された発現レベルであり、
‐スコア２（健常者）は健康な個体より採取された試料中のハウスキーピング遺伝子について測定された発現レベルである。
したがって、式１を次のように書き直すことができ、
Figure 2017536847
 式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である。
別の式は次の通りである。
Figure 2017536847
遺伝子発現を測定するための定量的方法を使用する特定の事例において、特に定量的ＰＣＲによる定量的方法を使用する事例において、各遺伝子につき２つの独立した試料を使用し、ΔΔＣｔ＝試料１のΔＣｔ−試料２のΔＣｔであり、且つ、ΔＣｔ＝ＲＮＡのＣｔ−基準ＲＮＡのＣｔ（以下参照）である式２−ΔΔＣｔによって比率を計算する。
したがって、別の式は次の通りである。
Figure 2017536847
 式中、ｉは１から５まで変化し、ｊは６から７まで変化する。すなわち
Figure 2017536847
有利な実施形態では本発明は、上で規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、Ｓが１以上であり、且つ、２以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る４０％から１０％の確率が前記個体にある前記方法に関する。
有利なことに、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤、特にメシル酸イマチニブを使用する治療から１年後に患者の予後を精査し、その患者の分子遺伝学的大奏功がどのようなものであるか判定することができる。
したがって
‐スコアＳが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る少なくとも約４０％の確率が前記個体にあり、
‐スコアＳが１より大きいけれども２以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る４０％から１０％の確率が前記個体にある。
これはスコアＳが高くなるほど第１世代チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性を発生させる患者のリスクが大きくなること、言い換えると１年後に分子遺伝学的大寛解を得る確率が小さくなることを意味する。
より有利なことに、本発明は、上で規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、Ｓが２より大きい場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る１０％未満の確率が前記個体にある前記方法に関する。
言い換えると、この有利な実施形態によると本発明は、これまでに規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、
‐スコアＳが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る少なくとも約４０％の確率が前記個体にあり、
‐スコアＳが１より大きいけれども２以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る４０％から１０％の確率が前記個体にあり、そして
‐Ｓが２より大きい場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る１０％未満の確率が前記個体にある、前記方法に関する。
驚くべきことに、本発明者は配列番号１から配列番号７の配列の少なくとも前記７遺伝子の発現レベルが第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療された患者の予後に応じて変化することを観察した。
したがって、本発明は有利なことに、慢性骨髄性白血病を患う個体より採取された白血病生体試料に基づく、治療に対する前記個体の反応についてのインビトロ予後判断方法であって、
（ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
（ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
（ｃ）次の式に従ってスコアＳを決定するステップであって、
Figure 2017536847
 式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
を含み、それにより
‐スコアＳが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る少なくとも約４０％の確率が前記個体にあり、
‐スコアＳが１より大きいけれども２以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る４０％から１０％の確率が前記個体にあり、そして
‐Ｓが２より大きい場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る１０％未満の確率が前記個体にある
前記方法として規定され得る。
さらにより有利なことに、本発明は、
‐スコアＳが１未満である場合には、前記個体に
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る少なくとも約４０％の確率があり、且つ
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的中寛解を得る約６０％未満の確率があり、
‐スコアＳが１より大きいけれども２以下である場合には、前記個体に
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的中寛解を得る最大で４０％の確率があり、且つ
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に低反応者である最大で約２５％の確率があり、
そして
‐Ｓが２より大きい場合には、前記個体に
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的大寛解を得る１０％未満の確率があり、
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、１年後に分子遺伝学的中寛解を得る最大で約４０％の確率があり、且つ
‐第１世代チロシンキナーゼ阻害剤で治療されていれば、低反応者である約５０％以上の確率がある
上記の方法に関する。
本発明では「分子遺伝学的中奏功」は中間レベルの細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ転写物の量を意味し、０．１％と１０％を含むそれらの間（［０．１％〜１０％］）のＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率を意味することが有利である。
本発明では「低反応者」は、細胞中のＢＣＲ−ＡＢＬ転写物の量が中間レベルである患者を意味し、１０％を超えるＢＣＲ−ＡＢＬ／非組換え型ＡＢＬ比率を有する患者を意味することが有利である。
別の実施形態では本発明は、これまでに規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、定量的測定方法、具体的には定量的ＰＣＲ法を用いることによる前記亜群の前記遺伝子の発現測定により前記発現測定値を得る前記方法に関する。
目的の遺伝子の発現レベルを測定するために当業者に知られている様々な技術を用いることができる。
ノーザンブロットはＲＮＡの分析を可能にする分子生物学方法である。それはサザンブロット法から派生しており、ＤＮＡを調査する代わりにＲＮＡが調査される。ＲＮＡをそれらのサイズに基づいて分離することができる電気泳動によってＲＮＡが分析される。その後、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブによってそれらのＲＮＡを検出する。ノーザンブロット法によって組織内でのＲＮＡの分布を評価すること、およびそれらの相対的な量を調査することが可能になる。したがって、これらの観察結果からある特定の遺伝子のより重要な発現とあまり重要ではない発現を推測することが可能である。放射性マーカーまたは蛍光マーカーを使用することで発現レベルを定量することが可能になる。
ＤＮＡチップ： １９９０年代よりＤＮＡチップの使用が広まっており、それは逆転写ＤＮＡ断片の単離断片の支持体への固定とＤＮＡから作製されたプローブを使用するハイブリダイゼーションに基づいているので、ＤＮＡチップの原理はノーザンブロット法に関連する。
定量的ＰＣＲ： 「リアルタイム」ＰＣＲとして知られる定量的ＰＣＲの原理はＰＣＲの最後（エンドポイントＰＣＲ）ではなくあらゆる時点の反応中に存在するＤＮＡの量を追跡することができることにある。蛍光プローブは二本鎖ＤＮＡ（ＳＹＢＲテクノロジー）または正確なＤＮＡ配列（ＴａｑｍａｎおよびＢｅａｃｏｎテクノロジー）のどちらかに固着する。これらのプローブは（「クエンチャー」か、または蛍光発光には二本鎖ＤＮＡが必要となることのどちらかのために）そのＤＮＡに固着したときにのみ蛍光発光する。リアルタイムＰＣＲマシーンのプログラムによって蛍光閾値が確定される。ＤＮＡ量のために蛍光プローブがこの閾値を超えると「サイクル閾値」を意味する「Ｃｔ」と呼ばれるＰＣＲサイクル数が得られる。この値がＤＮＡを絶対的または相対的に定量するための計算の基礎となる。ＰＣＲの効率Ｅを明らかにすることが重要である。このため、（目的の座位に特異的な）使用プライマーペアに対応する検量線を得るために希釈度を上昇させた試料に対してリアルタイムＰＣＲを実施する。例えば、１／２希釈シリーズ（Ｄ＿｛ｎ＋１｝＝Ｄ＿ｎ／２）は理論的にはいつもＰＣＲサイクルのオフセット増殖曲線を生じるはずである。この通りであれば、その反応の効率は２（各サイクル時にＤＮＡ量が二倍になる）である。実際にはリアルタイムＰＣＲマシーンのプログラムによって反応の効率Ｅが計算され得る。既知の初期量のＤＮＡを使用する希釈シリーズに対するリアルタイムＰＣＲによって反応効率の計算が可能になることのほうが多い。対数スケールでＣｔをグラフにプロットし、これらのポイントを通過する一次回帰式によって効率（この場合、傾きである）が与えられる。
特異的なプライマーペアによる増幅と分子数の定量を可能にするクエンチャープローブの存在によって遺伝子の発現を追跡するＴａｑｍａｎおよびＢｅａｃｏｎテクノロジーを採用している定量的ＰＣＲを使用することが実用性と特異性を理由として本発明の範囲内では有利である。
より有利なことに、本発明は、これまでに規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドを最低でも使用することにより、具体的には配列番号３２から配列番号４５の配列および次の配列、すなわち、５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’、５’−ｃｔｇｃｔｇｇｇ−３’、５’−ｔｇｃｔｇｇａｇ−３’、５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’、５’−ｃａｇｇａｇａａ−３’、５’−ｃｔｇｃｃｃｃａ−３’および５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’を含むか、それらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドを使用することにより実施される前記亜群の前記遺伝子の発現測定によって発現レベル測定値を得る前記方法に関する。
本発明では次のオリゴヌクレオチドを使用して配列番号１から配列番号７の配列の前記７遺伝子および配列番号２６から配列番号３１の配列によって表される上で予測された変異体の発現レベルを決定することが有利である。
Figure 2017536847
言い換えると、この有利な実施形態は、上で規定されたようなインビトロ予後判断方法であって、配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドを最低でも使用することにより実施される前記亜群の前記遺伝子の発現測定によって発現レベル測定値が得られ、それにより
‐配列番号３２と配列番号３３のオリゴヌクレオチドによって配列番号１の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３４と配列番号３５のオリゴヌクレオチドによって配列番号２の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３６と配列番号３７のオリゴヌクレオチドによって配列番号３の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３８と配列番号３９のオリゴヌクレオチドによって配列番号４の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号４０と配列番号４１のオリゴヌクレオチドによって配列番号５の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号４２と配列番号４３のオリゴヌクレオチドによって配列番号６の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号４４と配列番号４５のオリゴヌクレオチドによって配列番号７の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
特に、配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドを最低でも使用することにより実施される前記亜群の前記遺伝子の発現測定によって発現レベル測定値が得られ、それにより
‐配列番号３２、配列番号３３および５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号１の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３４、配列番号３５および５’−ｃｔｇｃｔｇｇｇ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号２の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３６、配列番号３７および５’−ｔｇｃｔｇｇａｇ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号３の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号３８、配列番号３９および５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号４の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号４０、配列番号４１および５’ｃａｇｇａｇａａ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号５の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、
‐配列番号４２、配列番号４３および５’−ｃｔｇｃｃｃｃａ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号６の配列の遺伝子の発現測定が可能になり、且つ
‐配列番号４４、配列番号４５および５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’のオリゴヌクレオチドによって配列番号７の配列の遺伝子の発現測定が可能になる
前記方法に関する。
配列番号４６および配列番号４７のオリゴヌクレオチド、および配列５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’のオリゴヌクレオチドを使用することによりＧＡＰＤＨの発現を用いて上記の遺伝子の各々の発現を正規化することも有利である。
有利なことに、本発明は、これまでに記載されたようなインビトロ予後判断方法であって、前記発現レベル測定値が前記亜群の前記遺伝子の発現測定により得られ、前記測定が次のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号１の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３２および３３のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号２の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３４および３５のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号３の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３６および３７のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号４の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３８および３９のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号５の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４０および４１のオリゴヌクレオチド、
‐配列番号６の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４２および４３のオリゴヌクレオチド、および
‐配列番号７の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４４および４５のオリゴヌクレオチド
を使用する前記方法に関する。
本発明は、慢性骨髄性白血病を患う個体のインビトロ個別化診断方法またはインビトロセラノスティック診断方法であって、
（ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、
前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
（ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
（ｃ）次の式に従ってスコアＳを決定するステップであって、
Figure 2017536847
 式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
を含み、それにより
‐Ｓが１未満である場合には、前記個体の慢性骨髄性白血病は第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を含む治療に対して優先的に反応する可能性がある慢性骨髄性白血病であり、および
‐Ｓが２以上である場合には、前記個体の慢性骨髄性白血病は第２世代または後代のチロシンキナーゼ阻害剤を含む治療に対して優先的に反応する可能性がある慢性骨髄性白血病である
前記方法にも関する。
本発明のこの個人化診断方法、すなわちインビトロ方法では、分子遺伝学的大奏功を得るためにどのタイプの治療を慢性骨髄性白血病の患者に提供することが有利になるのか決定することが可能である。
本発明者は、配列番号１から配列番号７の配列の核酸によって代表される遺伝子群に属する遺伝子の発現レベルを測定し、そして上記の式１を適用することでどれが患者に提供するのに最良の治療になるのか決定することが可能であるという驚くべき観察を行った。実際には、これまでに示されたように計算されると、次の通りである。
Ｓが１以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤、特にメシル酸イマチニブで治療されていれば治療開始から１年後に分子遺伝学的大奏功を得る４０％を超える確率がその患者にある。したがって、メシル酸イマチニブを使用する治療が推奨され、その治療がこの患者に適切である。
Ｓが２以上である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤、特にメシル酸イマチニブで治療されていれば治療開始から１年後に分子遺伝学的大奏功を得る１０％未満の確率がその患者にある。したがって、この患者に別の治療を提供すること、特に第２世代または後代のチロシンキナーゼ阻害剤による治療を提供することが適切になる。
１＜Ｓ＜２という特定の事例では、医師は第１世代の阻害剤を使用する治療と第２世代または後代の阻害剤を使用する治療との間で選択を迫られる。この状況では医師は臨床情報、潜在的副作用に関連する共存症、および臨床生物学的予後スコア（ソーカルスコア等）を考慮することになる。
有利なことに、本発明は、前記第１世代チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブまたはその塩のうちの１つである、これまでに規定された方法のような方法に関する。
メシル酸イマチニブはＡＢＬ上にある結合部位のために強力で選択的なＡＴＰ競合性阻害剤であり、チロシンキナーゼ活性を阻害する。現時点ではメシル酸イマチニブは１番目に選択される治療である。メシル酸イマチニブは４００ｍｇ／日の経口用量で使用される。メシル酸イマチニブによって１〜３か月以内に血液学的奏功を得ることが通常は可能になる。
３か月以内に血液学的完全奏功が無い場合はその治療は失敗したと見なされる。５年後の血液学的寛解率は９８％を超え、５年後の細胞遺伝学的完全寛解率は８７％を超えている。
吐き気、下痢、こむら返り、浮腫、および皮膚発疹のような副作用が頻発するが、中強度のものである。それらの副作用は高齢の患者では悪化する。しかしながら、それらの副作用のために治療が停止されることはまれである。
好中球減少症および血小板減少症のリスクのために最初の３か月の間は２週間毎にヘモグラムを定期的にモニターする必要がある。
いわゆる一次耐性と他の二次（獲得）耐性が存在する。
一次耐性は正確な治療期間の後の血液学的、細胞遺伝学的、および分子的な背景での非奏功状況として規定される。そこで、これらの一次耐性には他の代替的治療法または用量の増加の提案が付随する。
対照的に、二次耐性は初期奏功の喪失、または変質によって規定される。イマチニブの細胞内生物学的利用率の変化、ＭＤＲ（多剤耐性）遺伝子の過剰発現、ＢＣＲ−ＡＢＬの増幅、ＡＢＬキナーゼドメインの突然変異（５０件を超える様々な突然変異）、および独立したＢＣＲ−ＡＢＬ機構といった幾つかの耐性機構が特定されている。これらの事例では用量の増加（６００ｍｇ／日またはさらに８００ｍｇ／日）が有効である場合があり、他にはいわゆる第２世代または後代のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に切り替えることが有効である場合がある。
別の有利な実施形態では本発明は、上で規定されたような方法であって、前記第２世代チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブまたはニロチニブ、またはそれらの塩のうちの１つである前記方法に関する。
ダサチニブ（スプリセル（登録商標））はいわゆる第２世代ＴＫＩであり、グリベック（登録商標）に忍容性のない患者、またはグリベック（登録商標）のために獲得した突然変異による耐性機構を有する患者において有効であることが示されている。ダサチニブは１００ｍｇ／日の用量で使用される。ダサチニブはＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼ活性の阻害に加えてＳｒｃファミリーキナーゼなどの他の伝達経路を阻害する。イマチニブと異なり、ダサチニブは同時に活性立体構造と非活性立体構造のＡＢＬキナーゼドメインに結合し、そのことがダサチニブの高効率性を説明している。イマチニブに対する感受性を低下させる突然変異の大半はダサチニブに対して感受性であるが、完全耐性に関連するＡＢＬのＡＴＰ部位の突然変異（コドン３１５におけるトレオニンからイソロイシンへの変異、Ｔ３１５Ｉ）が除外される。
最近、この分子は２番目に選択される薬品として市場流通の許可を得た。
望ましくない効果のうち、最も頻発するものは体液貯留（胸水貯留および心嚢水貯留）、血液毒性、および下痢である。したがって、高血圧、心臓病、または呼吸器疾患の病歴がある場合にはこの分子を差し控える必要がある。幾つかの肺動脈高血圧の事例が報告されている。
ニロチニブ（タシグナ（登録商標））はダサチニブのようにいわゆる第２世代ＴＫＩであり、グリベック（登録商標）に忍容性のない患者、またはグリベック（登録商標）のために獲得した突然変異による耐性機構を有する患者において有効であることが示されている。ニロチニブはより強力なイマチニブ類似体である。ニロチニブはｃ−Ｋｉｔ受容体のような他のプロテインキナーゼを標的とすることもできる。イマチニブのようにニロチニブは非活性立体構造のキナーゼに結合する。ニロチニブの推奨用量は１２時間間隔で食事中を避けて一日に４００ｍｇが２回である。食事はニロチニブの生物学的利用率に影響する。
ニロチニブは忍容性が良好である。主な望ましくない効果は血液毒性の外にリパーゼの増加、ビリルビンの増加、血糖の増加、低リン酸血症、および皮膚毒性であり、ダサチニブのときと比べてあまり目立たない。膵炎または管理不良の糖尿病の病歴がある患者、ならびに動脈疾患の患者に対してはニロチニブの使用を控える必要がある。
後代のチロシンキナーゼ阻害剤は具体的にはボスチニブ、ポナチニブ、またはバフェチニブなどの臨床開発中の化合物である。
本発明は、
（ａ）最低でも配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチド、具体的には配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドならびに次の配列、５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’、５’−ｃｔｇｃｔｇｇｇ−３’、５’−ｔｇｃｔｇｇａｇ−３’、５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’、５’−ｃａｇｇａｇａａ−３’、５’−ｃｔｇｃｃｃｃａ−３’および５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’によって構成されるオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）１つ以上の健常生体試料に由来する核酸、特に１人以上の非白血病個体由来、言い換えると、白血病を患っていない１人以上の個体由来の末梢血の多形核細胞または好中球からなる１つ以上の試料に由来する核酸
を含むキットまたはパックにも関する。
健常生体試料は上で規定した通りである。
前記キットまたはパックが
（ａ）最低でも配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチド、具体的には配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドならびに次の配列、５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’、５’−ｃｔｇｃｔｇｇｇ−３’、５’−ｔｇｃｔｇｇａｇ−３’、５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’、５’−ｃａｇｇａｇａａ−３’、５’−ｃｔｇｃｃｃｃａ−３’、５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’、５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’および５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’によって構成されるオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）健常生体試料に由来する核酸、特に非白血病個体の末梢血の多形核細胞または好中球からなる試料に由来する核酸
を含むことが有利である。
前記健常試料の核酸は分解を制限する条件下で保存されたＲＮＡであることが有利である。
前記パックまたはキットは上記の診断方法またはセラノスティック方法の実施を可能にする適切な媒体上の命令を含むこともできる。この媒体は、例えば、定量的ＰＣＲプログラムを規定する命令（サイクル数、温度等）を含んでよく、上記の式の支援を得てＳの計算を可能にする適切な媒体上のコンピュータープログラム製品を含んでもよい。
本発明の別の態様は、上記の方法を実施するように設計されており、および／または前記プログラムがコンピューター上で実行されるときに前記方法を実施するためのプログラムコードの一部／手段／命令を含むソフトウェアまたはコンピュータープログラム製品に関する。コンピューターが読み込むことが可能なデータ記憶媒体上に前記プログラムが提供されることが有利である。そのような媒体はＣＤ−ＲＯＭのような携帯型記憶媒体に限定されず、コンピューターの内部メモリー（例えばＲＡＭおよび／またはＲＯＭ）を含む装置、またはハードディスクまたはＵＳＢスティックなどの外部メモリー装置、またはプロキシミティサーバーもしくはリモートサーバーの一部をなすこともできる。
有利なことに、本発明は上で規定された予後判断方法のステップｂおよびｃを実施するための上記のコンピュータープログラム製品に関する。
次の４つの図面と実施例から本発明がより良く理解される。
３５人の被験患者における検査された２５遺伝子の発現レベルを示すグラフを表す図である。対照レベル（健常試料における遺伝子の発現に対応する）は１に正規化されている。スケールは対数スケールである。
それらの遺伝子は次の通りである：＃１：ＳＯＤ２、＃２：ＧＬＲＸ１（１−２）、＃３：ＧＳＲ、＃４：ＰＲＤＸ５（１−３）、＃５：ＰＲＤＸ３（１−３）、＃６：ＴＸＮ、＃７：ＣＡＴ、＃８：ＳＯＤ１、＃９：ＧＰＸ１（１）、＃１０：ＧＰＸ４（１−２−３）、＃１１：ＰＲＤＸ２（１）、＃１２：ＰＲＤＸ１（１−２−３）、＃１３：ＧＰＸ１（２）、＃１４：ＧＰＸ３、＃１５：ＧＰＸ７、＃１６：ＴＸＮ２、＃１７：ＰＲＤＸ５（２）、＃１８：ＧＬＲＸ２（２）、＃１９：ＧＬＲＸ５、＃２０：ＰＲＤＸ２（３）、＃２１：ＰＲＤＸ４、＃２２：ＧＬＲＸ３、＃２３：ＰＲＤＸ６、＃２４：ＧＰＸ２および＃２５：ＧＬＲＸ２（１）。
前記３５人の患者において検査され、且つ、それらの患者の分子遺伝学的奏功に応じてグループ、すなわち、Ａ：分子遺伝学的大奏功、Ｂ：分子遺伝学的中奏功およびＣ：低反応者に分けられた２５遺伝子の発現レベルを示すグラフを表す図である。
計算されたスコアＳに応じた分子遺伝学的奏功の種類のパーセンテージ換算の分布を示すヒストグラムを示す図である。黒塗り領域は分子遺伝学的大奏功に対応し、斜線領域は分子遺伝学的中奏功に対応し、灰色領域は低反応者に対応する。
診断から１年後に得られたメシル酸イマチニブに対する分子遺伝学的奏功に応じた患者の分布に基づくスコアＳの値（Ｙ軸）を示すグラフを示す図である（Ｘ軸上左から右に向かって、大奏功患者、中奏功患者、または無反応者）。
材料と方法
１．多形核血液細胞の単離
末梢血の多形核細胞はｄ＝１．０７７の密度を有するフィコール上での遠心分離により単離された。
２．ＲＮＡ抽出
５×１０６細胞からＲＮＡを抽出した。それらの細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、引き続いて１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。細胞を完全に溶解するようにチューブを１５分間にわたって撹拌（Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標））した。３相を得るために２００μＬのクロロホルムを添加し、続いてチューブごとにチューブを４５秒間のボルテックにかけ、そして４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離にかけた。上部の水相にＲＮＡが含まれ、中間相にタンパク質が含まれ、下相はクロロホルムとフェノールに相当した。ＲＮＡを含む上相に対して２回目のクロロホルム抽出を行った。その後、その２回目のクロロホルム抽出の上相に５００μＬのイソプロパノールを添加した。イソプロパノールがＲＮＡを沈殿させるようにチューブを約１０回転倒し、その後、ＲＮＡを１２，０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離した。１ｍＬの７５％エタノールを添加し、続いて７，５００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離してチューブの底でＲＮＡの１回目の洗浄を行った。５００μＬの７５％エタノールを用いて２回目の洗浄を行った。転倒させて上清をもう一回除去し、チューブを少なくとも２０分間にわたってパッド上に逆さまに置いてエタノールの全てを蒸発させた。その後、ＲＮＡを４０μＬのＤＥＰＣ水に溶解し、チューブを１時間にわたって−２０℃に放置してＲＮＡを適切に溶解させた。
３．ＲＮＡの定量およびそれらの純度と品質の分析
ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計の助けを得て２６０ｎｍでの吸光度を読むことによりＲＮＡ濃度を評価した。２８０ｎｍでの吸光度に対して２６０ｎｍでの吸光度を比較することによりＲＮＡ汚染混入を判定した。Ａ２６０／Ａ２８０の比率が１．９と２．１の間であったときにそのＲＮＡに汚染混入が無いと見なした。その後、製造業者の推奨に準拠してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによりＲＮＡの品質を検査した。
４．逆転写（ＲＴ）
逆転写（ＲＴ）は一本のＲＮＡ鎖を鋳型として使用する一本のＤＮＡ鎖の合成反応である。逆転写酵素はＲＮＡ鎖のいわゆる相補性ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。また、この酵素はＲＮＡのプライマーとのハイブリダイゼーションによって作られた二重鎖領域からしかｃＤＮＡを合成することができない。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＴを行った。それまでのアリコットに分割した５μｇのＲＮＡのチューブを用いて反応を行った。ｃＤＮＡのより良好な合成のために７０℃で１０分間のチューブの保温によってＲＮＡを直線状にした。その後、５０μＬの次のリアクションミックスを各チューブに添加した：２０μＬのＤＥＰＣ水、ランダムプライマー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、およびＲＴ用に最適化された緩衝液を含む２０μＬの５×ＶＩＬＯ緩衝液、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ（ＲＮａｓｅＨ活性を低減したＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）とＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）組換え型リボヌクレアーゼ阻害剤を含む１０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）酵素ミックス１０Ｘ。チューブを外界温度で１０分間にわたって保温し、次にＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴがｃＤＮＡを合成するのに最適な温度である４２℃で１〜３時間にわたって保温した。チューブを８５℃で５分間にわたって保温することにより鋳型ＲＮＡ鎖を破壊した。
ＲＴの品質を検証するため、全ての非筋肉細胞に存在するβ‐アクチンのコード遺伝子に対して対照ＰＣＲを行った。次のリアクションミックスを反応のために調製した：３５．６μＬのＤＥＰＣ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５μＬの１０×緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、１μＬのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１μＬのフォワードプライマー、１μＬのリバースプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬのＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）および０．４μＬのＴａｑ（ＥｕｒｏＢｉｏ）。リアクションミックスに４μＬのＲＴ産物を添加した。ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｃ１０００（商標）サーマルサイクラー上で次のプログラムに従ってＰＣＲを行った：９５℃を３分間、（９４℃を３秒間、６０℃を３０秒間、７２℃を３０秒間）を３４回繰り返す、７２℃を２分間、その後１２℃。ＴＢＥを染み込ませたアガロースゲル上で泳動を行い、ＵＶ光下で画像化を行った。
５．リアルタイムＰＣＲ
ＤＮＡ量に蛍光が比例するフルオロクロームを使用して少数のサイクル数にわたってリアルタイムＰＣＲを行った。
ここで検出される蛍光の種類はプローブに由来した。目的の遺伝子に対応するＤＮＡ鎖に結合したプローブを使用することによってＤＮＡ量に比例する蛍光曲線が得られた。実際には、プローブは標的遺伝子に対して相補的なＤＮＡから構成されており、一端にフルオロフォアを含み、他方の末端にフルオロフォア消光体の「クエンチャー」を含んだ。プライマーが特異的にＤＮＡ鎖に固着し、ＴａｑポリメラーゼがそのＤＮＡ鎖に沿って進行すると（前記プローブが固定されている場合に）フルオロフォアが解離され、その蛍光を発光する。サイクルが進行すると発光される蛍光が増加し、形成されたアンプリコンの量に比例することになる。
前記プローブは、遺伝子の最適なカバレッジを可能にするトランスクリプトーム中での出現率を有する８〜９ヌクレオチドパターンの検出を可能にする配列を有する。この種類のプローブを使用するとＰＣＲの特異度はプライマーに由来する。閾値サイクル（Ｃｔ）は増幅されたＤＮＡの蛍光がバックグラウンドノイズから著しく異なってくるサイクルに相当する。この閾値によって全ての増幅を指数増幅期において比較することが可能になる。この関係を存在させるためには増幅効率が１００％であること、言い換えると、その系の効率Ｅが１であることが必要である。実際には、Ｅが１と異なる場合、ＣｔとＲＮＡの初期量Ｎ０との間の関係はもはや線形ではなく、したがって、どんな定量も不可能である。プライマーペアの希釈度に基づいてＣｔを示す曲線をプロットすることによりＰＣＲの効率Ｅを規定することができる。次の式によるとその直線の傾きは−１／（ｌｏｇ（１＋Ｅ））に相当する。この式に基づき、我々はＥを１０−１／傾き−１と書くことができる。それで、ＰＣＲの効率Ｅが１であるとき、その直線の傾きは−１／ｌｏｇ２＝３．３２に等しい。プライマーペアは０．８５を超える効率Ｅを有していなければならず、その下の任意閾値ではそのＰＣＲはもはや定量的ではない。また、２つの異なる試料中に存在するＲＮＡ量を比較するため、別の不変ＲＮＡが基準として必要であり、すなわち、調査されるＲＮＡの増幅効率に近い増幅効率を有するＲＮＡが必要である。これらのＲＮＡはいわゆる「ハウスキーピング」遺伝子、すなわち転写が変化しない、またはわずかにしか変化しない遺伝子から逆転写される。２つの試料の間で目的のＲＮＡの相対量を比較するため、基準ＲＮＡの量と比較した目的物の量を最初に正規化しなければならない。この測定値はΔＣｔと呼ばれ、次の計算に相当する：
ΔＣｔ＝ＲＮＡのＣｔ−基準ＲＮＡのＣｔ。次に２−ΔΔＣｔの数で表される相対変動値を得るために試料１のΔＣｔ−試料２のΔＣｔであるΔΔＣｔを計算する。
Ｒｏｃｈｅ「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０プローブマスター」キットを使用してリアルタイムＰＣＲステップを実施した。
反応用に次のリアクションミックスを調製した：１．４μＬの「ＰＣＲグレード」水、５μＬの２×リアクションプレミックス（ＴａｑＭａｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰを含む）、０．２５μＬの定量予定の遺伝子の各プライマー、および０．１μＬのＵＰＬプローブ。リアルタイムＰＣＲの効率を評価するためにｃＤＮＡを３分の１に希釈し、その標準範囲を１０−１から１０−３まで作製し、次にそれも３分の１に希釈した。そのリアクションミックスとｃＤＮＡをＶａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｅｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）自動化ピペッティングシステムにより３８４ウェルプレート中に分配した。１反応当たり７μＬのリアクションミックスと３μＬの３倍希釈ＤＮＡを分配した。次のプログラムに従ってＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した：プライマー間の相互作用を回避し、そうして感度を向上させ、９５℃で５分間の保温、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒間を４５サイクルのＰＣＲ、４０℃で３０秒間の冷却で終止。プローブの励起波長は４６５ｎｍであり、検出波長は５１０ｎｍであった。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０を使用して得られた結果を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアを使用して解析した。
７遺伝子（アイソフォーム）、すなわちＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＣＡＴ、ＳＯＤ１、ＧＰＸ１（１）、ＧＰＸ４（１−２−３）、ＰＲＤＸ１（１−２−３）についてｑＲＴ−ＰＣＲを実施し、（ＧＡＰＤＨと比較して）ΔＣｔの計算を行った。各遺伝子についてΔΔＣｔ（ΔＣｔ−ΔＣｔｍ）の計算を行った。その後、健常対照と比較した変動係数、すなわち、ＲＱ＝各遺伝子の２ｅｘｐ（−ΔΔＣｔ）を決定した。各遺伝子について計算されたＲＱを次の式に従って使用することにより患者のスコアＳを計算した。
Figure 2017536847
Figure 2017536847
結果
本発明者は、慢性骨髄性白血病の事例の予後不良は白血病幹細胞の頻度と関連するだろうという出発仮説を最初に立てた。白血病幹細胞は低下した活性酸素種（ＲＯＳ）発生率を有する。さらに、低ＲＯＳ発生率を維持するために白血病幹細胞は高いＲＯＳの無毒化代謝活性を有する必要がある。
ＲＯＳ無毒化代謝を向上させる１つの方法はこの過程に関与する酵素をコードする遺伝子の発現レベルを変えることである。
最初に、本発明者はＲＯＳ無毒化処理に関与する主な酵素をコードする（そして配列番号１から配列番号２５の配列、または存在するならこれらの配列の変異体によって示される）２５遺伝子の発現レベルを（多形核好中球が精製される、白血病を患っていないドナー由来の血液試料である）幾つかの生体試料において定量的ＰＣＲによりＧＡＰＤＨの発現レベルに対してこの発現レベルを正規化することで測定した。
この発現レベル測定により健常細胞における標準的発現レベルを確定することが可能になった。
次に、発明者はフランスのトゥール大学病院血液生物学部によって慢性骨髄性白血病を患っていると診断された３５人の患者の試料に対して同じ種類の発現レベル測定を行った。
３５人の患者の各々について前記２５遺伝子の各々の発現レベルを健常試料における前記２５遺伝子の発現レベルと比較した
図１はこの比較を示している。
前記２５遺伝子の発現は健常試料において測定された発現レベルと比較して変化しており、ある特定の遺伝子については患者間で大きな変動があることを示していることがこの図において観察される。これは特に遺伝子ＳＯＤ２：＃１、遺伝子ＣＡＴ：＃７、遺伝子ＳＯＤ１：＃８、遺伝子ＧＰＸ１（１）：＃９、遺伝子ＧＰＸ４（１−２−３）：＃１０、遺伝子ＰＲＤＸ１（１−２−３）：＃１２および遺伝子ＧＰＸ２：＃２４に当てはまる。
長期にわたって定期的に３５人の患者をモニターしたので本発明者は彼らのデータ、特にメシル酸イマチニブを使用する治療の１年後の彼らの分子遺伝学的奏功を利用することができた。
３５人の患者のうち、１年後に１０人に分子遺伝学的大奏功があり、１６人に分子遺伝学的中奏功があり、９人は前記治療に対する低反応者であった。
上記の奏功カテゴリーに応じて患者をグループ分けすることにより、本発明者は上記７遺伝子の発現レベルが分子遺伝学的奏功に応じて変化することを観察することができた。それらの結果が図２に提示されている。
このことに基づき、本発明者は低反応者において発現が高い遺伝子の発現レベルを合算し、低反応者において最低の発現を有する遺伝子の発現レベルをそこから減算することを各患者に提唱した。
本発明者は次の式も提唱した。
Figure 2017536847
話が前後するが、本発明者はメシル酸イマチニブを使用する治療の前の診断において採取された各患者の試料より得られたデータを用いてスコアＳを計算することができた。
次の表にデータが示されている。
Figure 2017536847
Figure 2017536847
Figure 2017536847
それらの患者のスコアＳに応じて彼らを再分類することにより本発明者は驚くべき発見をした。
Ｓが１未満である場合、約４０％の患者に１年後の分子遺伝学的大奏功があり、約６０％の患者に１年後の中奏功がある。言い換えると、１００％の患者に分子遺伝学的奏功があり、低反応者である者はいない。
Ｓが１より大きく、且つ、２未満である場合、約３０％の患者に１年後の分子遺伝学的大奏功があり，約４０％の患者に１年後の中奏功があり、特筆すべきことに約３０％の患者が低反応者である。言い換えると、約７０％の患者に分子遺伝学的奏功がある。
Ｓが２より大きい場合、１０％の患者にしか分子遺伝学的大奏功がなく、約３０％の患者に中奏功があり、５０％を超える患者が低反応者である。言い換えると、約４０％の患者しかイマチニブを使用する治療に対して反応しない。
３５人の患者について得られた結果が次の表に示されている。
Figure 2017536847
 ＲＭＭ：分子遺伝学的大奏功；ＲＭＩ：分子遺伝学的中奏功；Ｒ：奏功；ＭＲ：低反応者。
図３はこれらの結果をグラフで表したものであり、スコアＳに応じた１年後の分子遺伝学的奏功の分布（黒：大奏功；斜線：中奏功；灰色：無反応者）を示している。
図４は患者のスコアＳに応じたそれらの患者の分布を示している。
本発明は提示された実施形態に限定されず、他の実施形態は当業者にとって明らかとなる。

Claims (14)

  1. 慢性骨髄性白血病を患う個体より採取された白血病生体試料に基づく、治療に対する前記個体の反応についてのインビトロ予後判断方法であって、
    （ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、
    前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
    前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
    前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
    （ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
    （ｃ）次の式に従ってスコアＳを決定するステップであって、
    Figure 2017536847
     式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
    式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
    を含み、それにより
    ‐Ｓが１未満である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％を超える確率が前記個体にあり、および
    ‐Ｓが１以上である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る約４０％未満の確率が前記個体にある、前記方法。
  2. Ｓが１以上であり、且つ、２以下である場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る４０％から１０％の確率が前記個体にある、請求項１に記載のインビトロ予後判断方法。
  3. Ｓが２より大きい場合には、第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療の開始から１年後に分子遺伝学的大寛解を得る１０％未満の確率が前記個体にある、請求項１または２に記載のインビトロ予後判断方法。
  4. 前記発現レベル測定値が、定量的測定方法、具体的には定量的ＰＣＲ法を用いることによる前記亜群の前記遺伝子の発現測定により得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインビトロ予後判断方法。
  5. 前記発現レベル測定値が、配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチドを最低でも使用することにより実施される前記亜群の前記遺伝子の発現測定によって得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロ予後判断方法。
  6. 前記発現レベル測定値が前記亜群の前記遺伝子の発現測定により得られ、前記測定が次のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号１の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３２および３３のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号２の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３４および３５のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号３の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３６および３７のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号４の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号３８および３９のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号５の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４０および４１のオリゴヌクレオチド、
    ‐配列番号６の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４２および４３のオリゴヌクレオチド、および
    ‐配列番号７の核酸配列を含む、またはその配列から構成される遺伝子の発現を測定するための配列番号４４および４５のオリゴヌクレオチド
    を使用する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインビトロ予後判断方法。
  7. 慢性骨髄性白血病を患う個体のインビトロセラノスティック方法であって、
    （ａ）ある遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子亜群の遺伝子の発現レベルを測定するステップであって、
    前記遺伝子群が２５遺伝子からなり、前記２５遺伝子が配列番号１から配列番号２５の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
    前記亜群が７遺伝子からなり、前記７遺伝子が配列番号１から配列番号７の核酸配列からなるか、またはそれらの核酸配列から構成されており、
    前記亜群の遺伝子の各々について発現レベル測定値を得る前記ステップ、
    （ｂ）前記亜群の前記遺伝子の各々についての健常試料における発現レベルに対する前記白血病生体試料における発現レベルの比率を得るため、前記亜群の前記遺伝子の各々について先行ステップで生じた値を健常生体試料から得られた前記亜群の前記遺伝子の各々によって生じる値と比較するステップ、および
    （ｃ）次の式に従ってスコアＳを決定するステップであって、
    Figure 2017536847
     式中、比率ｉと比率ｊはそれぞれ配列番号ｉまたは配列番号ｊの核酸配列を含むか、またはそれらの核酸配列から構成される前記亜群の前記遺伝子について得られた比率を表し、
    式中、ｉとｊは、ｉが１から５まで変化し、ｊが６から７まで変化する整数である、前記ステップ
    を含み、それにより
    ‐Ｓが１未満である場合には、前記個体の慢性骨髄性白血病は第１世代チロシンキナーゼ阻害剤を含む治療に対して優先的に反応する可能性がある慢性骨髄性白血病であり、および
    ‐Ｓが２より大きい場合には、前記個体の慢性骨髄性白血病は第２世代チロシンキナーゼ阻害剤を含む治療に対して優先的に反応する可能性がある慢性骨髄性白血病である、前記インビトロセラノスティック方法。
  8. 前記第１世代チロシンキナーゼ阻害剤がイマチニブまたはその塩のうちの１つである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第２世代チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブまたはニロチニブ、またはそれらの塩のうちの１つである、請求項７に記載の方法。
  10. （ａ）少なくとも配列番号３２から配列番号４５の配列を含むか、またはそれらの配列から構成されるオリゴヌクレオチド、および
    （ｂ）１つ以上の健常生体試料の核酸
    を含むキット。
  11. 次の配列、５’−ｔｇｇｇｇａａｇ−３’、５’−ｃｔｇｃｔｇｇｇ−３’、５’−ｔｇｃｔｇｇａｇ−３’、５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇ−３’、５’−ｃａｇｇａｇａａ−３’、５’−ｃｔｇｃｃｃｃａ−３’および５’−ｃｔｇｇｃｔｇｇ−３’によって構成されるオリゴヌクレオチドも含む、請求項１０に記載のキット。
  12. 前記生体試料が１人以上の非白血病個体由来の末梢血の多形核細胞または好中球からなる１つ以上の試料に由来する核酸である、請求項１０または１１に記載のキット。
  13. 適切な媒体上のコンピュータープログラム製品であって、請求項１〜９のいずれか一項において規定される予後判断方法を実施するように設計されており、且つ／または前記プログラムがコンピューター上で実行されるときに前記予後判断方法を実施するためのプログラムコードの一部または手段または命令を含む前記コンピュータープログラム製品。
  14. 請求項１〜９のいずれか一項において規定される予後判断方法のステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を実施するための請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品。
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