JP2017534301A - 構成的に発現された遺伝子を含む遺伝子座における標的を狙った組み込みのためのベクター及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンのゲノム配列５’に対して相同である５’核酸と、外因性核酸と、構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンのゲノム配列３’に対して相同である３’核酸と、５’核酸及び外因性核酸に作動可能に連結された翻訳中断−再開シグナルとを含むベクターであって、翻訳中断−再開シグナルが、構成的に発現された遺伝子の前記ゲノム終止コドンに置き換わることができる、ベクターに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ゲノム工学に関し、特に、ゲノムへの標的を狙った組み込みのためのベクター、ならびにこのようなベクターを含む産物及びこのようなベクターまたはそれらから誘導された細胞を使用する方法に関する。

ゲノム生体学における主な関心領域は、１つ以上の関心配列の所望の位置への標的を狙った組み込みである。相同組換えの自然現象を活用することによって、培養細胞中のゲノム配列を変更する試みがなされてきた。

ポリヌクレオチドが、変更される配列を含むゲノム領域に対して十分な相同性を有する場合、ポリヌクレオチドの一部または全てを相同組換えによってゲノム配列に置き換えることが可能である。

しかしながら、このような状況下における相同組換えの頻度は非常に低い。さらに、相同性を欠如するゲノム位置における外因性ポリヌクレオチドの挿入の頻度は、標的を狙った相同組み換えの頻度を数桁のオーダーで超える。

外因性ポリヌクレオチドに対する相同性を有するゲノムの領域における二本鎖切断のゲノムＤＮＡへの導入は、培養細胞中のこの部位における相同組換えを刺激することが示されている。

しかしながら、何処に新しい遺伝子を導入するべきかという疑問が依然として問題である。いくつかの目的のために、組み込みは、欠失可能であると考えられる遺伝子または遺伝子該領域を標的とするべきであると一般的に考えられている。

ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）は、宿主細胞または生体に悪影響を及ぼすことなく新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現を適応させることができるヒトゲノムの遺伝子内または遺伝子外領域である。有用なセーフハーバーは、十分な導入遺伝子の発現を可能にし、ベクターコード化タンパク質または非コードＲＮＡの所望のレベルをもたらさねばならない。ＧＳＨはまた、細胞に悪性形質転換を起こしやすくしても、または細胞機能を変更してもならない。

現在までに、ヒトゲノムにおけるわずか３つの部位が標的を狙った導入遺伝子付加のために使用されており、これらは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトオルソログである。現在のところ、これらの遺伝子座の安全機能に関して現在利用できる情報は、それらのいずれかをＧＳＨと見なすにはあまりに限られている。

しかしながら、構成的発現を提供するゲノム内の遺伝子座への安定な標的を狙った組み込みのための組成物及び方法に対する必要性が未だにある。

第１の態様において、本発明は、
構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンのゲノム配列５’に対して相同である５’核酸と、
外因性核酸と、
構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンのゲノム配列３’に対して相同である３’核酸と、
５’核酸及び外因性核酸に作動可能に連結された翻訳中断−再開シグナルと、を含むベクターであって、
翻訳中断−再開シグナルが、構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンに置き換わることができる、ベクターを提供する。

第１の態様のベクターの一実施形態において、構成的に発現された遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＨＳＰ９０、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬＰ１、ＧＵＳＢ、ＬＤＨＡ、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、ＲＰＬＰ０、またはＴＦＲＣを含む。

第２の態様において、本発明は、第１の態様のベクターを含む細胞を提供する。

第３の態様において、本発明は、第１の態様のベクター、または第２の態様の細胞を含む非ヒト動物を提供する。

第４の態様において、本発明は、細胞中で外因性核酸を発現するための方法を提供し、本方法は、細胞中で構成的に発現された遺伝子を含むゲノムＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断を生成することと、第１の態様のベクターを組み込むことと、構成的に発現された遺伝子の終止コドンを翻訳中断−再開シグナルで置き換えることとを含む。

第５の態様において、本発明は、第４の態様の方法によって得られる場合の細胞を提供する。

第６の態様において、本発明は、第５の態様の細胞を含む非ヒト動物を提供する。

第７の態様において、本発明は、細胞または組織の集団において細胞を同定するための方法を提供し、本方法は、細胞中で構成的に発現された遺伝子を含むゲノムＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断を生成することと、第１の態様のベクターを組み込むことと、構成的に発現された遺伝子の終止コドンを翻訳中断−再開シグナルで置き換えることと、細胞中の外因性核酸の発現を検出することと、を含む。

構成的に発現された遺伝子（ハウスキーピング遺伝子と称されることもある）は、それらの遍在的発現のために潜在的汎用ＧＳＨとして魅力的であり得るが、まさにこの特性が非必須性に相反し、したがってＧＳＨとしての能力に相反すると一般的に考えられている。

本発明は、この先入観を克服し、構成的に発現された遺伝子が、外因性核酸の発現のために貴重な遺伝子座であることを立証する。

本発明の実施形態は、添付の図面を参照して、ここでほんの一例として説明されるであろう。

灰色で示されたエクソン、ベクター（中央線）、及び遺伝子標的導入後に遺伝子改変されたＧＡＰＤＨ遺伝子座を有するＧＡＰＤＨ遺伝子座（頂部線）の構造を示す概略図である。ＧＡＰＤＨプロモーターは、『Ｐ』で示されている。ＴＡＬＥＮによって切断された遺伝子座内の位置も示されている。ベクターのこの実施形態は、３．５ｋｂのホモロジーアームである、内因性ＧＡＰＤＨの終止コドンに置き換わるＴ２Ａ（２Ａ）セグメントを含む。Ｔ２Ａセグメントのアミノ酸は、ＧＡＰＤＨタンパク質のカルボキシル末端を、下流の内因性核酸（Ｇｅｎｅ、遺伝子）によってコードされるタンパク質のアミノ末端に結合するリンクをもたらす。ｍＲＮＡ内のＴ２Ａ配列は、Ｇｅｎｅが同じＲＮＡからではあるが別のタンパク質として（すなわち、融合タンパク質としてではなく）発現されることを可能にする翻訳スキップをもたらす。これは、改変された遺伝子座が、Ｔ２Ａペプチドの２１個のアミノ酸によって伸展されたＧＡＰＤＨタンパク質ならびに下流Ｇｅｎｅによってコードされたタンパク質を生成する。このＴ２Ａ配列から発現された遺伝子が示されている（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＭＹＣ：ＥＲ）。本実施形態における目的の遺伝子に続いて、上流Ｇｅｎｅの翻訳の完了後に、ｍＲＮＡからリボソームが解離すると、翻訳を続けるためにこれらリボソームを再動員する内部リボソーム侵入部位（Ｉで表示）がある。これは、Ｓ、Ｇｅｎｅによってコードされたタンパク質に融合した抗生体質耐性をコードする選択可能なカーカーの翻訳を可能にする。ネオマイシン耐性を特定するＧｅｎｅ（Ｎｅｏ）及びヒグロマイシン耐性を特定する遺伝子（Ｈｙｇｒｏ）も表示されている。選択可能なマーカーの３’は、３’ホモロジーアームであり、これは、５’ホモロジーアームと一緒に、ＧＡＰＤＨへの相同組換えを仲介する。 実施例３によるＧＴ−ＧＦＰとＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣとの共培養物の蛍光顕微鏡写真及びフローサイトメトリープロットを提供する。Ａ：顕微鏡写真の上段は、別々に培養された細胞株の培養物を示す。下段は、両細胞株からの同数の細胞が含まれる共培養ウェルからの画像を示す。Ｂ：フローサイトメトリーデータである。最初の２つのプロットは、別々に培養されたときのＧＴ−ＧＦＴ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｄ０ ｈＥＳＣについてのフローサイトメトリーデータを示す。共培養データを示すプロットは、２つの区別できる集団を示している。 実施例４による造血（中胚葉）分化の概略図である。重要な時間点が示されており：０日目は、浮遊ＥＢステージの開始を示す。４日目に、示された重要な血液細胞増殖因子を含む培地交換を行う。７日目に、ＥＢが、接着細胞を増殖させる追加の増殖因子と共に培養される（ｐｌａｔｅｄ ｄｏｗｎ）。増殖因子は、上段に示され、それらの対応濃度がその下にｎｇ／ｍｌで（Ｕ／ｍｌで示されるＥｐｏを除いて）示されている。ＳｔｅｍＤｉｆｆ ＡＰＥＬを、全てのステージのための基本培地として用いた。 実施例４によるＨ９及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞株についてのフローサイトメトリープロットを提供する。Ｈ９細胞は、分化の全てのステージで、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙに対して二重陰性であった。ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞は、分化のｈＥＳＣ及びＥＢステージの両方で、ｍＣｈｅｒｒｙを高レベルで発現した。 実施例４によるＧＴ−ＧＦＰ細胞株の造血分化の蛍光顕微鏡写真及びフローサイトメトリープロットを提供する。Ａ．培養下のＧＴ−ＧＦＰ ｈＥＳＣと、その下の対応するフローサイトメトリーデータ及び明視野像である。Ｂ．４日目のＧＴ−ＧＦＰ細胞株の胚様体ならびにその下のフローサイトメトリーデータ及び明視野像である。Ｃ〜Ｄ．１４日目の分化ＧＴ−ＧＦＰ組織の蛍光顕微鏡写真、それと共にそれぞれの下の対応する明視野像、ならびに示された内皮細胞及び血液細胞の発現を示す関連するフローサイトメトリーデータである。ＧＬＹは、グリコホリンＡを指す。全てのスケールバーは、２００μｍである。 図５−１の説明を引用する。 図５−１の説明を引用する。 ３日目のＥＢを用いる、造血コロニー形成アッセイの概略図である。Ａ．分化プロトコルの概略図である。使用された増殖因子が、濃度がその下に列記されて示されている。下段は、実験の各段階についての基本培地を示す。Ｂ．３日目のＥＢを用いるＭＣＭ培養の組み立てを示す。 実施例５によるＭＣＭコロニー形成アッセイにおける嚢胞性コロニーの起源を立証する蛍光顕微鏡写真を提供する。Ａ．典型的な「混合コロニー」であり、対応する明視野像、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの顕微鏡写真が左側に示されている。Ｂ．異なった色のコロニー及び混合コロニーの近接度を示すコロニーの視野である。対応する明視野、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ顕微鏡写真が下に示されている。混合コロニーは、概して、単色コロニーよりも非常に大きかった。全てのスケールバーは５００μｍである。 実施例５によるＨ９ ＧＴ−ＧＦＰ／ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＭＣＭ培養におけるコロニー組成の分析の棒グラフ、フローサイトメトリープロット、及び表形式データを提供する。Ａ．未加工の採点データの棒グラフである。『微量緑色』コロニーは、赤色コロニーとはグループ化され緑色で略記される。『微量赤色』コロニーは、緑色コロニーとはグループ分けされ赤色で略記される。Ｂ．示されたＧＦＰ^ＰＯＳ及びｍＣｈｅｒｒｙ^ＰＯＳ集団の割合を有する１８日目のＭＣＭコロニーについてのフローサイトメトリーデータである。Ｃ．全赤色及び全緑色細胞の割合としてのコロニー採点データの表である。 実施例６によるＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙベクターの構造を示す。ベクターのこの実施形態は、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞株で用いられたものと同じベクターに基づいている。このベクターは、ＴｅｔＯ（Ｔｅｔオペレーター）プロモーターの３’に位置する導入遺伝子の発現に必要とされる転写活性タンパク質をコードするｒＴＡを含む。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下において、このｒＴＡタンパク質は、ＴｅｔＯに結合し、ＴｅｔＯからの転写を活性化する。したがって、レポーター遺伝子の発現は誘導性である。この実験のセットにおいて、誘導変異体中で使用されるレポーター遺伝子はｍＣｈｅｒｒｙである。ＩはＩＲＥＳを示し、Ｓは選択可能なマーカー（この場合はネオマイシン）の位置を示す。 ドキシサイクリン処理ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣにおけるｍＣｈｅｒｒｙ誘導を表すフローサイトメトリープロット及び折れ線グラフを提供する。Ａ．陰性対照試料；ドキシサイクリン処理前のＨ９ ｈＥＳＣ及びＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ（Ｎｏ Ｄｏｘ）のフローサイトメトリー分析である。Ｂ．示された時間にわたってドキシサイクリンで処理されたＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣのフローサイトメトリー分析である。Ａに示した対照試料を参照して四分円を位置決めした。データは、３つのセットのうちの１つの代表的な実験からのものである。Ｃ．ドキシサイクリン処理ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣにおける、時間の関数としての平均ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度である。赤い点線は、構成的赤色ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ細胞株の平均蛍光強度を表す（１０８９６＋／−ＳＥＭ：６５０、ｎ＝３）。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 実施例７によるＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙ発現の減衰を表すフローサイトメトリープロット及び折れ線グラフである。Ａ．ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ（陽性対照）及びドキシサイクリンによる誘導の前のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ（陰性対照）のフローサイトメトリー分析である。Ｂ．ドキシサイクリン処理の中止後のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣのフローサイトメトリー分析である。ドキシサイクリン除去からの日数宇が示されている。四分円を、Ａに示した陽性及び陰性集団に関して設定した。データは、３つのセットのうちの１つの代表的な実験からのものである。Ｃ．ドキシサイクリンの除去後の毎日のｍＣｈｅｒｒｙ^ｎｅｇ細胞の分画である。フローサイトメトリーデータの３つのセットを組み合わせて、時点当たりのｍＣｈｅｒｒｙ^ｎｅｇ細胞の平均インドを獲得した。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 実施例７によるドキシサイクリン処理後のＨ９ ｈＥＳＣ及びＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの遺伝子発現分析を定量化する棒グラフを提供する。ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣは、ドキシサイクリンで３日間誘導され、ドキシサイクリンの除去後２、３、及び４日目に採取した。誘導されないＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの試料は、陰性対照として機能した。Ｈ９ ｈＥＳＣは、追加の陰性対照であった。使用されたＴａｑｍａｎ Ｑ−ＰＣＲプローブは、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＡＰＤＨ及びＯｃｔ４（多能性幹細胞（ＰＳＣ）マーカー）であった。統計的分析は、各試料及びＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ Ｎｏ Ｄｏｘについての相対的遺伝子発現データ間の２標本等分散ｔ検定を含んだ。星印は、そのＰ値がこの検定について有意差（ｐ＝０．０５）を示唆したデータ点のみを示す。エラーバーはＳＤ（ｎ＝２）を表す。 実施例８によるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ ｈＥＳＣに由来する分化細胞の形態に及ぼす４ＯＨＴの効果に関する実験プロトコルの概略図及び顕微鏡写真を提供する。Ａ．分化プロトコルの概略図である。使用された増殖因子の濃度をｎｇ／ｍｌで示している。基本培地を、各ステージの下段に表示している。Ｂ．４ＯＨＴの存在または不在下での分化された１２日目のＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ細胞の明視野像である。全ての画像に適用されるスケールバーは１００μｍである。 実施例９によるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲコロニー形成アッセイに関連する実験プロトコルの概略図及び顕微鏡写真を提供する。Ａ．造血及び内皮前駆体細胞を生成するために用いられた分化プロトコルの概略図である。使用された増殖因子の濃度を、Ｕ／ｍｌで示したＥＰＯ以外は、ｎｇ／ｍｌで示す。基本培地は、各ステージの下段に表示する。Ｂ〜Ｆ．２１日目にＭＣＭコロニーの採点で用いられた各部類の例を表す明視野像である。Ｂ．赤色の矢印は、典型的な赤芽球コロニーを示し、一方黒色の矢印は嚢胞性コロニーを示す。Ｃ．嚢胞性コロニーの発生である。Ｄ．骨髄系コロニーである。Ｅ〜Ｆ．『接着シート状』コロニーの２つの型である。全てのスケールバーは１００μｍである。 実施例９によるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲコロニー及びＨ９コロニー形成アッセイについてのコロニー採点データを定量化する棒グラフを提供する。グラフは、３つの独立した実験からの２１日目のコロニーの平均数を示す。橙色の棒は、処理群（＋４ＯＨＴ）からのデータを示し、一方黒色の棒は無処理（対照）を示す。Ａ及びＢ．コロニーの型の部類に分けられた採点データである。Ｃ及びＤ．対照及び＋４ＯＨＴに分けられた全ての部類にわたるコロニーの総数である。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３）である。 実施例９による典型的な接着シート状コロニーの形態及び寸法を示す顕微鏡写真を提供する。顕微鏡写真の中央に、典型的な接着シート状コロニーが見られる。赤色の矢印は、標準骨髄系コロニーを示し、黒色の矢印は、赤芽球コロニーを示す。スケールバーは５００μｍである。 翻訳中断−再開シグナルの核酸配列（配列番号１）を提供する。 ５’核酸の核酸配列（配列番号２）を提供する。 ３’核酸の核酸配列（配列番号３）を提供する。 配列内リボソーム進入部位の核酸配列（配列番号４）を提供する。 ベクターＧＴ−ＧＦＰの核酸配列（配列番号５）を提供する。 図２１−１と同じ。 図２１−１と同じ。 ベクターＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙの核酸配列（配列番号６）を提供する。 図２２−１と同じ。 図２２−１と同じ。 ベクターＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲの核酸配列（配列番号７）を提供する。 図２３−１と同じ。 図２３−１と同じ。 ベクターＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙの核酸配列（配列番号８）を提供する。 図２４−１と同じ。 図２４−１と同じ。 図２４−１と同じ。 ５’核酸及び作動可能に連結された翻訳中断−再開シグナルを含む核酸配列（配列番号９）を提供する。 フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡写真及び組織切片の顕微鏡写真を提供する。Ａ．心臓特異的ＮＫＸ２−５遺伝子座のＧＦＰ発現によって明らかなように、心筋細胞に分化される細胞中のタンデム−トマト赤色蛍光タンパク質の強靭かつ均一な発現を示すフローサイトメトリー分析である。Ｂ．ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ＰＳＣに由来するニューロンを発現するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫蛍光分析である。Ｃ．ＧＴ−ＬａｃＺ ＰＳＣに由来する奇形腫の組織学的部分である。組織は、ＬａｃＺ発現の領域を明らかにするための切片化の前に、Ｘ−ｇａｌで染色された。この分析は、図示するように、複数の異なった細胞において、インビボでの長期にわたる導入遺伝子発現の保持を立証している。

ベクター
本発明は、細胞中で構成的に発現された遺伝子中に組み込まれた外因性核酸の１つ以上の産物（すなわち、タンパク質またはＲＮＡ分子）を発現するための１つ以上の外因性核酸を含むベクターを提供する。

構成的に発現される遺伝子は、一般的に、細胞生存性に必須であると考えられている。したがって、大部分の細胞中で発現されるが、構成的に発現された遺伝子はまた、標的を狙った組み込みの意図しない悪影響の可能性のために、一般的には遺伝子標的化には不適切であるとみなされている。

この偏見に反して、本発明は、構成的に発現された遺伝子が、構成的に発現された遺伝子の内因性発現を維持しつつ、外因性核酸の構成的発現を可能にするように修正され得ることを示す。

本発明は、構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンを、構成的に発現された遺伝子を外因性核酸に作動可能に連結するインフレーム翻訳中断−再開シグナル置き換えることによって達成される。

重要なことには、外因性核酸の産物は、構成的に発現された遺伝子の産物とは別のタンパク質として発現されることであり、すなわち、この産物は融合タンパク質ではない。

したがって、翻訳中断−再開シグナルに作動可能に連結された外因性核酸が、あるタンパク質をコードするという条件で、本明細書に記載されるように、任意の外因性核酸が構成的に発現された遺伝子に導入されてもよい。外因性核酸は、１０〜５，０００個のヌクレオチド（またはこれらの間のヌクレオチドの任意の整数値）の長さの範囲とすることができる。

例示の外因性核酸としては、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーターもしくは他の制御配列、ＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、様々な種類の発現構築物、配列内部リボソーム進入部位、及び／またはポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。外因性核酸は、これが、構成的に発現された遺伝子における細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞中に導入される。次いで、組み込み配列の発現が、構成的に発現された遺伝子の内因性プロモーターにより推進される転写によって確実にされる。このような配列は、標準分子生体学的技術（クローニング、合成等）を用いて容易に得ることができ、及び／または市販されている。

ある特定の実施形態において、外因性核酸は、抗体、抗原、酵素、増殖因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、上記のいずれかの機能性断片、または上記のいずれかの組み合わせをコードするプロモーターレス配列を含む。

他の実施形態において、「タンデム」カセットが、上述したプロモーターレス配列を含むカセットの第１の成分、転写終止配列、及び自律的発現カセットをコードする第２の配列が続くような方法で、構成的に発現された遺伝子に組み込まれる。

ある特定の実施形態において、外因性核酸は、標的を狙った組み込みを受けた細胞の同定、追跡、及び選択を可能にするマーカー遺伝子を含むことができる。

マーカー遺伝子としては、抗生体質耐性（例えば、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）、Ｇ４１８耐性（Ｎｅｏ）、ピューロマイシン耐性、ヒグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒｏ））を仲介するタンパク質をコードする配列、有色、蛍光または発光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、細胞表面抗原（例えば、ΔＮＧＦＲ）、ならびに増強された細胞属色及び／または遺伝子増幅を仲介する融合タンパク質が含まれるタンパク質（例えば、ＭＹＣ、ＫＲＡＳ、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが挙げられる。

いくつかの実施形態において、マーカー遺伝子は、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列を含む。

追加のマーカー遺伝子は、青色／ＵＶタンパク質、例えば、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、アズライト、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、シリウス、サファイヤ、Ｔ−サファイヤ；シアンタンパク質、例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１；緑色タンパク質、例えば、ＥＧＦＰ、エメラルド、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、クローバー、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ；黄色タンパク質、例えば、ＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ；オレンジタンパク質、例えば、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２；赤色タンパク質、例えば、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２；長波長赤色タンパク質、例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ；近赤外タンパク質、例えば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ；長ストロークシフトタンパク質、例えば、ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２、ｍＢｅＲＦＰ；光活性化タンパク質、例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰ；光交換型タンパク質、例えばＫａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ｍＥｏｓ３．２（緑色）、ｍＥｏｓ３．２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ；及び光切替型タンパク質、例えばＤｒｏｎｐａなどの有色または蛍光タンパク質をコードする配列を含む。

ベクターは、１つ以上の切断タンパク質もコードしてもよい。

外因性核酸を含むベクターは、切断タンパク質の発現の前に、これと同時に、またはこれに続いて、細胞に導入され得る。外因性核酸を含むベクターは、相同的組換えを支援するために、構成的に発現された遺伝子のゲノム配列に対して十分な相同性を含む。約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、または１，０００個の塩基、もしくは１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０ｋｂまたはそれ以上の配列相同性（または１０〜１０，０００個、もしくはそれ以上のヌクレオチドの任意の整数値）が、相同組換えを支援するであろう。

一般的に、外因性核酸を含むベクターの相同領域（複数可）は、組換えが望まれるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態においては、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。外因性核酸を含むベクターの長さに応じて、１％〜１００％の配列同一性の任意の値が存在することができる。好ましくは、配列同一性は、内因性発現及び構成的に発現された遺伝子ならびにその産物の活性を維持するために十分に高いものであろう。したがって、構成的に発現された遺伝子のコード配列における配列同一性は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であることができる。配列同一性を計算するとき、構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンは除外されてもよい。

ベクターは、順番に１つ以上の外因性核酸に隣接する２つの相同性の領域に挟まれた非相同配列を含んでもよい。ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター及び抗生体質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を含んでもよい。

ベクターは、いくつかの、ゲノム配列に対する相同性の不連続領域を含んでもよい。例えば、相同性の領域は、外因性核酸を含む２つ以上の領域に隣接することができる。

相同領域は、それが置き換わるゲノム配列に対して必ずしも同一である必要はないということは明らかであろう。例えば、外因性核酸を含むベクターの配列は、相同組換えを可能にし、かつ構成的に発現された遺伝子ならびにその産物の内因性発現及び活性を維持するためのゲノム配列との十分な相同性が存在する限りにおいて、ゲノム配列に対する１つ以上の単塩基変更、挿入、欠失、逆転または再編成を含むことができる。

外因性核酸を含むベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖のものであることができ、線状型または環状型で細胞に導入することができる。線状型で導入される場合、外因性核酸の末端は、当業者に既知の方法によって、保護され得る（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）。さらに、外因性核酸を含むベクターは、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入されることが可能であり、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達されることも可能である。

ベクターは、原核細胞ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、もしくは真核細胞ベクターとすることができる。ある特定の実施形態において、このベクターはプラスミドである。他の実施形態において、このベクターは線状ＤＮＡ分子である。

本明細書に開示されるような外因性核酸の標的を狙った組み込みは、タンパク質発現のための細胞及び細胞株を生成するために用いることができる。

このベクターは化学的に合成されてもよい。あるいは、このベクターは、標準組換え操作技術を用いて生成されてもよい。このような組換え操作技術は、翻訳中断−再開シグナル及び外因性核酸の挿入と共に構成的に発現された遺伝子座をスパンする細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用してもよい。

構成的に発現された遺伝子
構成的に発現された遺伝子は、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−６−リン酸脱水素酵素）、ＡＣＴＢ（アクチン、ベータ）、ＨＳＰ９０ＡＢ１（熱ショックタンパク質、ＨＳＰ ９０−ベータ）、Ｂ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＲＰＬＰ１（巨大リボソームタンパク質、Ｐ１）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、ＬＤＨＡ（乳酸脱水素酵素Ａ）、ＮＯＮＯ（オクタマー結合を含有する非ＰＯＵドメイン）、ＰＧＫ１（ホスホグリセレートキナーゼ１）、ＰＰＩＨ（ペプチジルプロピルイソメラーゼＨ）ＲＰＬＰ０（巨大リボソームタンパク質、Ｐ０）、またはＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体）を含んでもよい。

他の構成的に発現された遺伝子は、当業者に既知であろう。

ＧＡＰＤＨへの標的を狙った組み込み
ＧＡＰＤＨは、グルコースが代謝され、多細胞生体中の細胞の生存性及び機能に必須であるエネルギーをＡＴＰの形で生み出すプロセスである解糖に関与する重要な酵素である。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、大部分の細胞型において比較的高レベルで発現されることが広く認識されている。これは、発生起源の組織の年代または性別に関して発現レベルにほとんど変化がない状態で、胚性幹細胞及び大半を占める成体組織型で発現されることが示されている。このために、遺伝子発現分析を行うときに、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、目的の遺伝子の発現を正規化または標準化するために標準物質としてしばしば用いられる。ＧＡＰＤＨは、ヒト染色体１２及びマウス染色体６上に位置する。

ＧＡＰＤＨへの標的を狙った組み込みについては、１つ以上の結合ドメインが、所定の切断部位でまたはこの近辺で標的部位と結合するように操作されることができ、操作された結合ドメインを含む切断タンパク質が、細胞中に導入されまたは細胞中で発現される。切断タンパク質の標的部位への結合の際に、ＤＮＡは、切断ドメインによって、標的部位の近辺で、好ましくは二本鎖切断を介して切断される。

ゲノムＤＮＡ中の二本鎖切断の存在は、相同組換えを介する外因性核酸の組み込みを容易にする。したがって、ＧＡＰＤＨに挿入される外因性核酸を含むベクターは、相同組み込みを容易にするために、ＧＡＰＤＨと相同性の１つ以上の領域を含むであろう。

ＧＡＰＤＨは、導入遺伝子及び他の遺伝要素の遍在的かつ一貫した発現を送達した（実施例を参照）。外因性核酸をＧＡＰＤＨ遺伝子座の３’ＵＴＲに挿入した標的化ベクターが本明細書で開示される。ＧＡＰＤＨは、細胞の生存性にとって重要であるために、ＧＡＰＤＨの発現または機能に及ぼす改変の影響が最小化されることが重要であった。このように、ＧＡＰＤＨ標的化ベクターは、改質ＧＡＰＤＨ対立遺伝子からのＧＡＰＤＨタンパク質発現を維持しつつ、外因性核酸をＧＡＰＤＨ遺伝子座に挿入した。

この結果を達成するために、ＴＡＬＥＮを用いて、ＧＡＰＤＨ終止コドンの３’のすぐ近くのポイントで、内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子座を切断した。この二本鎖切断は、本明細書に開示されるＧＡＰＤＨ標的化ベクターを用いて修復される。このベクターの有用性は、ベクターがＧＡＰＤＨプロモーターを「捕捉し」、及びＧＡＰＤＨゲノム終止コドンを翻訳中断−再開シグナルで置き換えることによって増強される。

翻訳中断−再開シグナル
翻訳中断−再開シグナルは、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）の単一ＯＲＦ転写ユニット内で異なるタンパク質コード配列を分離する２Ａもしくは２Ａ様ペプチドであることができる。ピコルナウイルス科の異なるメンバーからの２Ａペプチド配列は、１８個のアミノ酸のみの硬度に保存されたモチーフを共有する。大部分の２Ａペプチドは、１８〜２２個のアミノ酸である。この２Ａペプチドは、リボソームスキップ機構を担当する。坑井的に発現された遺伝子及び外因性核酸を２Ａペプチドもしくは２Ａ様ペプチドに連結することは、単一のオープンリーディングフレームに由来する、複数の、別個のタンパク質の、本質的に等モル量での細胞発現をもたらす。

ベクターによってコードされ得る２Ａペプチドの例としては、ブタテッショウイルス（ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ゾーシーアシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）（Ｅ２Ａ）、及び口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＤＶ）（Ｆ２Ａ）が挙げられる。

２Ａシグナルは、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸のペプチドをコードすることができる。

細胞
標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞とすることができる。この細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、もしくは多能性幹細胞、胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞から分化した細胞であってもよい。

胚性幹細胞は、Ｈ９ヒト胚性幹細胞及びＭＥＬ １ヒト胚性幹細胞を含む。

さらに、この細胞は、細胞周期のＧ２期において停止されてもよい。

特異的遺伝子の機能を研究するために遺伝子改変を用いる場合、その遺伝子が正常に発現される細胞型において改変の結果がはっきりと表れることが望ましい。これは、細胞型特異的様式で発現されることが知られている遺伝子に対する標的化改変によって、または全てもしくは大部分の細胞型において活性である遺伝子座を活用することによってのいずれかで達成することが可能である。後者の利点は、特異的細胞型における遺伝子機能の分析が、この細胞型が分化細胞の混合培養中で同定され得ることのみを必要とすることである。多くの場合、子の同定は、目的の細胞が、フローサイトメトリーによって単離されることを可能にする細胞表面マーカー発現に基づいている。さらに、構成的に発現された遺伝子座を発現用のプラットフォームとして用いることによって、導入遺伝子の機能を探査する分析は、いかなる特定の結合にも限定されない。したがって、細胞を同定する方法が本明細書に開示され、この方法は、外因性核酸の発現を検出することを含む。

一実施形態において、同定することは、細胞の撮像を含んでもよい。別の実施形態において、同定することは、例えば、細胞選別、酵素アッセイ、リガンド結合、または受容体結合を含んでもよい。

薬剤スクリーニングの方法も開示され、この方法は、構成的に発現された遺伝子に組み込まれた外因性核酸から遺伝子産物を発現する細胞を、候補薬剤と接触させることと、細胞に及ぼす候補薬剤の効果を検出することとを含む。

細胞周期
標的組換えの効率増進は、相同性駆動型修復プロセスが最大限に活性である場合、細胞を細胞周期のＧ２期においてブロッキングすることによって達成することができる。例えば、細胞は、例えば、細胞をＧ２期において停止させるように細胞周期進行に影響を及ぼす薬剤、化合物及び／または小分子で処理され得る。この種類の例示の分子としては、微小管重合に影響を及ぼす化合物（例えば、ビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、ＤＮＡと相互作用する化合物（例えば、シス−白金（ＩＩ）ジアミンジクロリド、シスプラチン、ドキソルビシン）及び／またはＤＮＡ合成に影響を及ぼす化合物（例えば、チミジン、ヒドロキシウレア、Ｌ−ミモシン、エトポシド、５−フルオロウラシル）が挙げられるが、これらに限定されない。組換え効率のさらなる増大は、ゲノムＤＮＡを細胞組換え機構により接近しやすくするために、クロマチン構造を変更するヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬（例えば、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）の使用によって達成される。

細胞周期停止のための追加の方法としては、例えば、阻害タンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞中に導入することによるか、またはＲＮＡｉ法を使用することによる、サイクリン及び／またはＣＤＫ細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質の過剰発現が含まれる。

二本鎖切断
外因性核酸の構成的に発現された遺伝子への組み込みは、ゲノムの構成的に発現された遺伝子の標的を狙った二本鎖切断によって助長される。

ゲノムＤＮＡの標的を狙った切断のための様々な方法及び組成物が言及されている。このような標的を狙った切断事象は、例えば、標的を狙った突然変異誘発を誘導するために、細胞内ＤＮＡ配列の標的を狙った欠失を誘導するために、及び本明細書に開示されるように、所定の染色体遺伝子座における標的を狙った組換えを容易にするために使用することができる。

部位特異的二本鎖破壊を誘導するためのいくつかの方法論が現在入手可能であり、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）が含まれる。

定義
以下に続く特許請求の範囲において、及び発明を実施するための形態において、言語または必要な含意を表現するため文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む、ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、包括的な意味で用いられ、すなわち、記載された特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除しないために用いられる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、外来遺伝物質、すなわち、外因性核酸を、それが発現され得る別の細胞まで搬送するためのビヒクルとして用いられる核酸である。本発明に依れば、外因性核酸の発現は、外因性核酸が作動可能に連結されている状態で、構成的に発現された遺伝子のプロモーターによって推進される。ベクターの４つの種な種類は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体である。

本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられ、直線状もしくは環状立体構造の、及び一本鎖もしくは二本鎖形状のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの類似体、ならびに塩基が修飾されているヌクレオチド、糖及び／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同様な塩基対形成特異性を有し、すなわちＡの類似体は、Ｔと塩基対を形成するであろう。

本明細書で使用される場合、「５’」及び「３’」は、核酸の一本鎖の有向性または端から端までの化学配向性を画定する。５’は、その末端においてデオキシリボースまたはリボースの糖環中に第５番目の炭素を有するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の端部を示す。３’は、その末端においてデオキシリボースまたはリボースの糖環中の第３番目の炭素のヒドロキシル基を有するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の端部を示す。５’リン酸基及び３’ヒドロキシルは、２つのヌクレオチドライゲーション、すなわち、ホスホジエステル結合を形成するための、１つのヌクレオチドの５’−リン酸の別のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基への共有結合を可能にする。５’リン酸の除去は、ライゲーションを阻止する。

「外因性」核酸は、組換えが行われる細胞以外の供給源に由来する核酸である。外因性核酸は、１つ以上の遺伝的、性化学的または他の方法によって、細胞に導入することができる。それでもなお、外因性核酸は、内因性遺伝子と実質的に類似または同一であってもよいが、外因性核酸は、構成的に発現された遺伝子中の核酸の組み込みのために、内因性遺伝子と比べると変更された空間もしくは時間的発現を有する。

本明細書で使用される場合、用語「内因性核酸の産物」は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどの）ポリヌクレオチド及び翻訳産物（ポリペプチド）を含む。

本明細書で使用される場合、用語「内因性」とは、通常細胞中に存在する部分を指す。本発明の目的のために、「内因性」とは、本発明のベクターを用いる相同組換えの前の細胞状態を指す。

本明細書で使用される場合、用語「相同性」及び「相同」とは、それらの配列の所定の領域にわたって類似しまたは同一である核酸（またはタンパク質）を指す。相同性は、多くの場合、配列同一性パーセントに関して定義される。本文脈において、相同性または配列同一性パーセントは、ベクター及びゲノムＤＮＡの結合を可能にし、次には組換えを可能にする。

核酸及びタンパク質の配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野において既知である。通常、このような技術は、遺伝子についてのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること及び／またはそれらによってコードされるアミノ酸配列を決定することと、これらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することとを含む。ゲノム配列もまた、この様式で決定することができる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の、それぞれ正確なヌクレオチド間のまたはアミノ酸間の一致を指す。２つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸であろうとアミノ酸配列であろうと、配列のより短い配列の長さによって割られ、１００を乗じられた２つの整列配列間の完全一致の数である。核酸配列についてのおよそのアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって提供される。

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え」とは、と問えば、細胞中の二本鎖破壊の修復中に起こるこのような交換の特殊な形を指す。

「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の生成を調節する全てのＤＮＡ領域（このような調節配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接していようがいまいが）を含む。したがって、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定される必要はない。

本明細書で使用される場合、用語「ゲノムの」及び「ゲノム」とは、一般的には染色体に含まれる生体の内因性遺伝物質を指す。ゲノムは、コード（遺伝子）及び非コード配列の両方を含む。「ゲノム終止コドン」は、内因性染色体終止コドンであり、「ゲノム配列」は、内因性染色体ＤＮＡ配列であるということになる。

「発現」とは、遺伝情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）もしくはｍＲＮＡの翻訳によって生成されたタンパク質とすることができる。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及びエディティングによって修飾されているＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化、及びグリコシル化などのプロセスによって修飾されたタンパク質も含む。

本明細書で使用される場合、「構成的に発現された」とは、連続的または一貫性のある発現を指す。好ましくは、「構成的に発現された」遺伝子はまた、例えば、分化の全体にわたって、かつ細胞型及び組織型にわたって遍在的に発現される。

本明細書で使用される場合、用語「翻訳中断−再開シグナル」とは、リボソームスキップ機構を担当するペプチドをコードする核酸配列を指す。翻訳中に、１つのＯＲＦが存在し、１つのｍＲＮＡがこのＯＲＦから転写されるが、リボソームスキップ機構は、複数の、別個のタンパク質の細胞発現を、同じプロモーターによって推進される本質的に等モル量の発現でもたらす。

用語「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の構成要素（配列要素など）に関して使用され、ここでは、構成要素は両構成要素が正常に機能し、構成要素の少なくとも１つが他の構成要素の句碑の少なくとも１つに及ぼされる機能を仲介することができる可能性を可能にするように配置されている。例示として、プロモーターなどの転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列にシスで作動可能に連結されるが、これのすぐ隣にある必要はない。例えば、エンハンサーは、これらが隣接していないのだが、コード配列に作動可能に連結されている転写調節配列である。

本明細書で使用される場合、用語「置き換わることができる」は、翻訳中断−開始シグナルおよび終止コドンに関して使用され、適切な条件下でこのような置き換えが十分であることを示す。この用語は、非限定的であり、置き換えを必要とすると解釈されるべき委ではなく、ただ単に置き換えに対する能力及び傾向と解釈されるべきである。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。結合タンパク質は、２つ以上の種類の結合活性を有することができる。

「結合ドメイン」は、配列特異的な方法でＤＮＡに結合するより大きな結合タンパク質内のドメインである。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象」の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらすことができる。用語「二本鎖破壊」、「ＤＳＢ」、及び「二本鎖切断」は互換的であり、染色体のセンス及びアンチセンス鎖の両方の切断または破壊を指す。

「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有する１つ以上のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは、一本鎖ポリペプチド中に含まれ得るか、または切断活性は、２つ（またはそれ以上の）ポリペプチドの会合から生じ得る。

「切断ハーフ−ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるか、または異なるのいずれか）と共に、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチドである。

切断タンパク質は、切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメインを含んでもよい。

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合タンパク質が結合すると思われる核酸の一部を画定する核酸配列である。

「標的」または「標的を狙った」とは、指定された位置における所望のもしくは意図された事象を指す。例えば、特定のゲノム位置における所望のもしくは意図された結合、切断または組込み事象を指す。

本明細書で使用される場合、「ＧＴ−」とは、ＧＡＰＤＨプロモーターを「捕捉する」ベクターに依存するベクターの実施形態を指し、「Ｇａｐ Ｔｒａｐ−」とも称される。

切断
ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、二本鎖破壊を導入する、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合させることによって生成された人工エンドヌクレアーゼである。ＤＮＡ結合ドメインは、およそ３４個のアミノ酸のユニットである、ほぼ同一のＴＡＬＥリピートから構成される。ＴＡＬＥリピートは、２つの非常に変わりやすいアミノ酸によって異なり、これがＤＮＡ結合ドメインの塩基認識特異性を構築する。ＴＡＬＥＮは、複雑なゲノム内でユーザー指定のＤＮＡ配列を標的として狙いように操作され得る。ＴＡＬＥＮのペアは、一緒に働き、ＤＮＡ中で二重鎖破壊を生じさせる。ＴＡＬＥＮの機能的ドメインは、Ｆｏｋ１制限エンドヌクレアーゼの修正バージョンであってもよい。

メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、あまりに大きいために（＞１２ｂｐ）、目的のゲノム内においてこれらは発生しないか、または極めて稀にしか発生しない認識配列を有する天然起源の、配列特異的エンドヌクレアーゼである。

ＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲは、塩基配列の短い繰り返しを含むＤＮＡ遺伝子座である。各繰り返しの後に、以前のウイルスへの暴露からの「スペーサーＤＮＡ」の短い断片が続く。ＣＲＩＳＰＲは、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲに関連するタンパク質をコードするｃａｓ遺伝子と関連付けられる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝要素に対する耐性を付与する原核細胞免疫系であり、後天的免疫の一形態を提供する。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核細胞生体におけるＲＮＡｉに類似した方法で、これらの外因性遺伝要素を認識し切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子エディティングのために使用されてもよい。Ｃａｓ９タンパク質及び適切なガイドＲＮＡを細胞中に送達させることによって、生体のゲノムは任意の所望の位置で切断され得る。フリーソフトウェアが、任意の所望の遺伝子を標的とするようにＲＮＡを設計するために利用可能である。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインもしくは切断ハーフ−ドメインと融合させることによって生成された合成タンパク質の部類であり、例えば、切断ハーフ−ドメインは、ＦｏｋＩまたはＳｔｓＩなどのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのものであってもよい。ＤＮＡ結合ドメインは、所望のＤＮＡ配列において二本鎖破壊を誘導するように操作され得る。

切断は、構成的に発現された遺伝子、及び切断ドメインもしくは切断ハーフ−ドメイン内の配列に結合するように操作された、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む切断タンパク質の使用を通して、構成的に発現された遺伝子を標的としてもよい。このような切断は、切断部位またはその近辺において外因性ポリヌクレオチド配列の組み込みを刺激する。

ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のジンクフィンガー）を含むことができるか、または構成的に発現された遺伝子内の任意の配列に結合するように操作することができる。

標的部位
ジンクフィンガードメイン（標的部位）による結合のための構成的に発現された遺伝子中の配列の選択は、例えば、選択された配列に結合するために、ジンクフィンガータンパク質を設計するための方法も記載している米国特許第６，４５３，２４２号に開示された方法により達成することができる。

ジンクフィンガードメインのための標的部位は、一般的には、複数の隣接する標的サブサイトから構成される。標的サブサイトとは、個々のジンクフィンガーによって結合された配列（通常、ヌクレオチドトリプレット、またはヌクレオチドクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）（隣接するクアドルプレットと１つのヌクレオチドで重なり合うことができる）のいずれか）を指す。標的部位は、一般的に、必ずしも必要というわけではないが、少なくとも９個のヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば、４個のフィンガー結合ドメインの１２個のヌクレオチド標的部位への結合、５個のフィンガー結合ドメインの１５個のヌクレオチド標的部位への結合、または６個のフィンガー結合ドメインの１８個のヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかなように、より大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９個またはそれ以上のフィンガー）を、より長い標的部位への結合も可能である。

ジンクフィンガー結合ドメインのための標的部位中の１つ以上のサブサイトは、１、２、３、４、５個またはそれ以上のヌクレオチドによって互いに分離され得る。標的部位を分離するために、切断が２つの切断ドメイン／切断ハーフ−ドメインの結合に依存する、ある特定の実施形態において、２つの標的部位は対向するＤＮＡ鎖上にあることができる。他の実施形態において、両方の標的部位は、同じＤＮＡ鎖上にある。

ヌクレオチド配列の簡単な目視検査もまた、標的部位の選択に用いることができることも、当業者には明らかであるだろう。したがって、標的部位選択のための任意の手段を、本明細書に記載される方法において使用することができる。

ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインを、本明細書に開示される方法において使用することができる。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガータンパク質、またはヌクレアーゼの内因性活性を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、一般的には、２、３、４、５、６個またはそれ以上のジンクフィンガーを含む。

通常、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸の長さである。

あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってもよい。このヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであってもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が既知である。加えて、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩなどの、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤ認識配列が既知である。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。

切断ドメイン
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインがそれから誘導され得る例示のエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを切断する追加の酵素が既知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；緑豆ヌクレアーゼ；膵ＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。ホーミングエンドヌクレアーゼならびにメガヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、及びＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つ以上は、切断ドメインならびに切断ハーフ−ドメインの供給源として使用することが可能である。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種で存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合することができ（認識部位において）、また欠乏部位においてまたはその近辺でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、ＤＮＡを認識部位から除去された部位においてＤＮＡを切断し、引き離せる結合及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素のＦｏｋ Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９個のヌクレオチドの位置で、及び他の鎖上のその認識部位から１３個のヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。

その切断ドメインが、結合部位から引き離せる例示のＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特有の酵素は、二量体として活性である。Ｆｏｋ Ｉ酵素の一部は、切断ハーフ−ドメインと見なすことができる。したがって、Ｆｏｋ Ｉ切断ドメインを用いるゲノム配列の標的を狙った二本鎖切断及び／または標的を狙った置き換えについては、２つの切断Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフ−ドメインを用いて、触媒作用的に活性な切断ドメインを再構成することができる。あるいは、結合ドメインと２つのＦｏｋ Ｉ切断−ハーフドメインとを含む単一のポリペプチド分子も用いることが可能である。

ＩＩＳ型制限酵素の別の例は、ＳｔｓＩである。

切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメインは、切断活性を保持するタンパク質、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化する（例えば、二量体化する）能力を保持するタンパク質の任意の部分とすることができる。

切断特異性を増強するために、切断ドメインは、改質されてもよい。ある特定の実施形態において、切断ハーフ−ドメインの変異体が使用され、この変異体は、切断ハーフ−ドメインのホモ二量体化を最小化または防止する。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小化または防止する走査された切断ハーフ−ドメインを含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、及び５３８位のアミノ酸残基は、全てが、Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフ−ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。

必須のヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの追加の操作された切断ハーフ-ドメインは、本明細書に記載される方法で用いることができる。第１の切断ハーフ−ドメインは、Ｆｏｋ Ｉの４９０及び５３８位でのアミノ酸残基における突然変異を含み、第２の切断ハーフ−ドメインは、アミノ酸残基４８６及び４９９で突然変異を含む。

本方法のある特定の実施形態において、切断ドメインは、２つの切断ハーフ−ドメインを含み、これらの両方共に、結合ドメインをさらに含む一本鎖ポリペプチドの一部である。あるいは、各切断ハーフ−ドメインは、結合ドメインをさらに含むポリペプチドの一部である。切断ハーフ−ドメインは、これらがＤＮＡを切断するように機能する限りにおいて、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。

切断ドメインに対する標的部位は、切断ハーフ−ドメインに、例えば、二量体化によって機能的切断ドメインを形成させることを可能にする互いに対する空間的配向で、それらの対応の標的部位への結合が切断ハーフ−ドメインを配置するように、互いに対して配置されることが好ましい。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドで離間されている。しかしながら、ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の任意の整数の個数が、２つの標的部位間に介入することができる（例えば、２〜５０個またはそれ以上のヌクレオチド）。一般に、切断店は、標的部位の間にある。

切断タンパク質
切断タンパク質（及びそれらをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のための方法は当業者に既知である。ある特定の実施形態において、このような切断タンパク質をコードするポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに挿入されることができ、このベクターは細胞に導入されることができる。

細胞中の２つの切断タンパク質の発現は、２つのタンパク質の細胞への送達、１つのタンパク質及びこのタンパク質をコードする１つの核酸の細胞への送達、それぞれがタンパク質のうちの１つをコードする、２つの核酸の細胞への送達の結果から、または両方のタンパク質をコードする単一の核酸の細胞への送達によって、生じることができる。追加の実施形態において、切断タンパク質は、２つの切断ハーフドメインと１つの結合ドメインとを含む一本鎖ポリペプチドを含む。この場合、単一の切断タンパク質が、細胞中で発現され、理論によって束縛されることを望むものではないが、切断ハーフ−ドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを切断するものと考えられている。

切断タンパク質の構成要素は、結合ドメインが切断タンパク質のアミノ末端に最も近くにあり、また切断ハーフ−ドメインがカルボキシ末端に最も近くにあるように配置されてもよい。機能的ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフ−ドメインの二量体化は、結合部位の５’末端が互いに近接する状態で、反対側のＤＮＡ鎖上の部位に切断タンパク質を結合することによってもたらされる。

あるいは、切断タンパク質の構成要素は、切断ハーフ−ドメインが、切断タンパク質のアミノ末端の最も近くにあり、また結合ドメインがカルボキシ末端の最も近くにあるように配置されてもよい。これらの実施形態において、機能的ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフ−ドメインの二量体化は、結合部位の３’末端が互いに近接する状態で、切断タンパク質の反対側ＤＮＡ鎖上の部位への結合によってもたらされる。

さらに追加の実施形態において、第１の切断タンパク質は、タンパク質のアミノ末端の最も近くに切断ハーフ−ドメインを、及びカルボキシ末端の最も近くに結合ドメインを含み、第２の切断タンパク質は、結合ドメインが切断タンパク質のアミノ末端の最も近くにあり、また切断ハーフ−ドメインがカルボキシ末端の最も近くにあるように配置されている。これらの実施形態においては、カルボキシ末端の最も近くに結合ドメインを含む第１の切断タンパク質の結合部位が、アミノ酸末端の最も近くにある結合ドメインを含む第２の切断タンパク質の結合部位の５’側に位置した状態で、両方の切断タンパク質は同じＤＮＡ鎖に結合する。

２つの切断タンパク質は、同一のまたは反対の極性の目的の領域内で結合することができ、それらの結合部位（すなわち、標的部位）は、任意の数のヌクレオチド、例えば０〜２００個のヌクレオチドまたはこれらの間の任意の整数値のヌクレオチドで離間され得る。ある特定の実施形態において、それぞれが結合ドメイン及び切断ハーフ−ドメインを含む２つの切断タンパク質のための結合部位は、他の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定される５〜１８個のヌクレオチドで離れて、例えば、５〜８個のヌクレオチドで離れて、または１５〜１８個のヌクレオチドで離れて、または６個のヌクレオチドで離れて、または１６個のヌクレオチドで離れて位置することができ、切断は、これら結合部位間で生じる。

ＤＮＡが切断される部位は、一般的には、２つの切断タンパク質のための結合部位の間にある。ＤＮＡの二本鎖切断は、しばしば、１、２、３、４、５、６個以上のヌクレオチドによってオフセットされた２つの一本鎖破壊、または「ニック（ｎｉｃｋ）」から生じる（例えば、天然のＦｏｋ Ｉによる二本鎖ＤＮＡの切断は、４個のヌクレオチドによってオフセットされた一本鎖破壊から生じる）。したがって、切断は、各ＤＮＡ鎖の厳密に反対の部位で必ずしも生じる必要はない。加えて、切断タンパク質の構造及び標的部位間の距離は、切断が単一ヌクレオチド対に隣接して生じようが、または切断がいくつかの部位で生じようが、影響を及ぼすことができる。しかしながら、標的を狙った組み込みのためには、ヌクレオチドのある範囲内の切断で通常十分であり、特定の塩基対間の切断は、要求されない。

以下に詳細に説明されるように、切断タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。一旦細胞に導入され、または細胞中に発現されると、切断タンパク質は、構成的に発現された遺伝子中の標的配列に結合し、この遺伝子内で切断する。

送達
本明細書に記載される核酸は、任意の好適な方法を用いて、細胞中に導入され得る。

細胞中の切断タンパク質の発現は、切断タンパク質の細胞への送達から、または切断タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じることができ、このポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳され、切断タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドライゲーションもまた、細胞中のタンパク質の発現委関与することができる。

切断タンパク質は、ポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドとして導入され得る。それぞれが切断タンパク質をコードする配列を含む、２つのポリヌクレオチドが細胞中に導入されることが可能であり、切断タンパク質が発現され、それぞれがその標的配列に結合するときに、切断が標的配列において、またはその近辺で生じる。あるいは、１つ以上の切断タンパク質をコードする配列を含む単一のポリヌクレオチドが、細胞中に導入されてもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及び／またはＲＮＡの任意の改質型もしくは類似体とすることができる。

ある特定の実施形態において、１つ以上の切断タンパク質は、複製及び／または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換用のベクター中にクローンされ得る。ベクターは原核細胞ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、昆虫ベクター、もしくは真核細胞ベクターとすることができる。本明細書に記載される配列をコードする核酸もまた、標準手法を用いて、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、心筋細胞、細菌細胞、もしくは原生動物細胞への投与のために、発現ベクター中にクローンすることが可能である。

ある特定の実施形態において、外因性核酸を含む及び／または切断タンパク質をコードするベクターは、遺伝子治療で使用するために、インビボまたはエクスビボで送達される。ポリヌクレオチドを細胞に送達するための非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、及びリポソームもしくはポロキソマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは、細胞への送達後にエピソーム性または組み込みゲノムのいずれかを有する。

インビボまたはエクスビボにおける核酸の非ウイルス送達の方法としては、電気穿孔法、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンもしくは脂質、核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ウイルスベクター系（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア及び単純ヘルペスウイルスベクター、及びＤＮＡの薬剤増強化取り込みが挙げられる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いる音響穿孔も、核酸の送達のために使用することができる。

追加の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）及びＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）により提供されるものが含まれる。

例えば、切断タンパク質の一過性発現が好ましい、ある特定の実施形態において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いることで、高力価及び発現の高レベルを得られている。このベクターは比較的簡単な系で大量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生成において、ならびにインビボ及びエクスビボ遺伝子治療法のために、細胞に標的核酸を導入するために使用することができる。

少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが、臨床試験における遺伝子移入のために現在利用可能であり、これらのアプローチは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性が関与するアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で用いられてきたレトロウイルスベクターの例であり、ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療の臨床試験で用いられた最初の治療用ベクターである。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターについて観察されている。

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損及び非病原性のルボウイルス科アデノ随伴ウイルスサブタイプに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５ｂｐの末端逆位反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子移入及び安定な導入遺伝子送達は、このベクター系についての重要な特徴である。（加えて、自己相補型組換えアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）由来のベクターも使用することができる）。

複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成され、多種多様な細胞型に容易に感染することができる。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子に取って代わるように操作され、続いて、複製欠損型ベクターが、欠失遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉で見られるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで導入することができる。通常のＡｄベクターは、大きな積載容量を有する。Ａｄベクターのポリヌクレオチド治療を伴う臨床試験における使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのものである。

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために用いられる。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、レトロウイルスをパッケージングするψ２細胞もしくはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療で用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。これらベクターは、通常、パッケージング及びその後の宿主への組み込み（適用可能な場合）に必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で用いられるＡＡＶベクターは、通常、パッケージング及び宿主細胞への組み込みが必要とされるＡＡＶゲノムからの末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＶＶ遺伝子をコードするヘルパープラスミド、すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐを含むが、ＩＴＲ配列を欠損する細胞株に中にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を推進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠損のために、相当量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって、低減することができる。

多くの遺伝子治療用途において、外因性核酸を含む、及び／または切断タンパク質をコードするベクターが、特定の組織型に対して高度な特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質と共に切断タンパク質としてリガンドを発現することによって、所定の細胞型に対して特異性を有するように改質することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改質されてもよく、組換えウイルスは、ヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染する。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞−表面受容体に対するリガンドを含む、切断タンパク質を発現する他のウイルス−標的細胞対に広げることができる。例えば、繊維状ファージは、実際にはあらゆる選択された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を発現するように操作することが可能である。上述の説明は主としてウイルスベクターンビ適用するが、同じ原理が、非ウイルスベクターに適用されてもよい。このようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みを好む特異的取り込み配列を含むように操作されてもよい。

遺伝子治療用ベクターは、個々の患者への投与によって、通常は全身投与（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）、もしくは以下に記載される局所適用によって、インビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞を患者に再移植することができる。

診断、研究用の、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクト細胞の宿主細胞への再注入を介しての）は、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は対象の生体から単離され、外因性核酸及び／または切断タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトされ、対象生体（例えば、患者）に再注入で戻される。エクソビボのトランスフェクションに適した様々な細胞型が当業者に周知である。

一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクション及び遺伝子治療のためのエクスビボの処置で用いられる。幹細胞を使用することの利点は、これらがインビトロで他の細胞に分化することができること、またはこれらが骨髄中に生着すると思われる哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどのサイトカインを用いて、ＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が知られている。

幹細胞は、既知の方法を用いて、導入及び分化のために単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、及びｌａｄ（分化した光源提示細胞）などの不必要な細胞に結合する抗体でパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）することによって、骨髄細胞から単離される。

本明細書に記載される核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）もまた、インビボで細胞の導入のために生体に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが投与されてもよい。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるように導入するために通常用いられている経路のいずれかにより、例えば、注射、輸注、局所適用及び電気穿孔法が含まれるが、これらに限定されない。このような核酸を投与するための好適な方法が利用可能かつ当業者に周知であり、２つ以上の経路が特定の組成物を投与するために使用することができるが、特定の経路は多くの場合、別の経路と比べてより迅速かつより有効な反応をもたらすことができる。

導入遺伝子の造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞への導入に有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。

導入遺伝子の免疫細胞（例えばＴ細胞）への導入に有用なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクターを含む。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびにこの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、利用可能な医薬組成物の多種多様な好適な製剤がある。

上で述べたように、１つ以上の切断タンパク質も、ポリペプチドとして細胞中に導入することができる。タンパク質送達ビヒクルの非限定的な例としては、「膜転移ポリペプチド」、例えば、膜転移担体として作用する能力を有する、両親媒性または疎水性アミノ酸配列を有するペプチド、毒素分子、リポソームならびに免疫リポソーム（標的を狙ったリポソームを含む）などのリポソーム誘導体が挙げられる。

外因性核酸、切断タンパク質を含むベクター、及び／または切断タンパク質をコードする発現ベクターは、例えば、癌、虚血、糖尿病網膜症、黄斑変性、リウマチ性関節炎、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球貧血症、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、卒中等の治療的または予防的用途のために、構成的に発現された遺伝子への標的を狙った切断組み込みに、患者に直接投与することができる。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびにこの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、利用可能で当業者に既知の医薬組成物の多種多様な好適な製剤がある。

例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下経路によるなどの非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を対象の受容者の血液と等張にする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張滅菌注射用溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。開示された組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内、または髄腔内によって、投与することができる。化合物の製剤は、アンプル及びバイアルなどの単回量または複数回量密封容器で提示することができる。注射用溶液及び懸濁液は、前に記載された滅菌粉末、顆粒、及び錠剤などから調製することも可能である。

治療法
外因性核酸は、以下の遺伝疾患のいずれかを含むがこれらに限定されない遺伝疾患を有する対照において欠損しているかまたは非機能的であるポリペプチドをコードする配列を含むことができる：軟骨発育不全症、色盲、酸マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ Ｎｏ．１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アルカルディ症候群、アルファ−１抗トリプシン欠損症、アルファサラセミア、アンドロゲン不応症、アペール症候群、不整脈原右室異形成症、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化線維異形成、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド沈着症（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ−グロビンの第６コドン中のヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、白血球粘着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ Ｎｏ．１１６９２０）、ロイコジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、プロジェリア、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンスタイン・テービ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー、コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムス症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ Ｎｏ．３０８２４０）。

標的を狙った組み込みによって治療することができる追加の例示的な疾患としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病及びテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）及び血友病が挙げられる。

したがって、外因性核酸は、疾患を引き起こすまたは障害を引き起こす遺伝的変異または突然変異を含んでもよい。

したがって、対象における疾患または障害を予防もしくは治療する方法が本明細書に開示され、この方法は、外因性核酸を含むベクターまたは外因性核酸を含む細胞を対象に投与することを含む。

外因性核酸を含むベクターまたは外因性核酸を含む細胞の、対象において疾患または障害を治療するための医薬品の製造における使用も開示される。

対象における疾患または障害を予防もしくは治療することで使用するための、外因性核酸を含むベクターまたは外因性核酸を含む細胞も開示される。

本方法の実行、ならびに本明細書に開示される組成物の調製及び使用は、別途記載のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに当業者が属する関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は本文献中に十分に説明されている。

本明細書で言及される全ての特許、特許出願及び刊行物は、全ての目的のために、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。

任意の先行技術刊行物が本明細書で参照される場合、このような参照は、これら刊行物が当該技術分野における、オーストラリアにおけるまたは任意の他の国における共通の一般的知識の一部を形成することを認めるものではないことを理解するべきである。

本開示は、理解を明確にする目的で、例証及び例として若干詳細に提供されてきたが、様々な変更及び修正を、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく実行すること可能であることが当業者には明らかであろう。したがって、前述の説明及び例示は、限定的として解釈されるべきではない。

実施例１：ベクター
以下の実施例で使用されるベクターの実施形態を、ＧＡＰＤＨ遺伝子座をスパンする細菌人工染色体（ＢＡＣ）、それと共に翻訳中断−再開信号及び関連する外因性核酸を使用して、標準組換え工学技術を用いて生成した（図１）。

実施例２−ヒト胚性幹細胞
組織培養フラスコを０．１％のゼラチン溶液（ＰＢＳ中）で室温にて１０分間処理した。次いでゼラチン溶液を吸引し、適切な容量のＭＥＦ培地で置き換えた。フィーダー細胞のクライオバイアルを３７℃の水浴中で３分間解凍し、次いで細胞懸濁液を、１０ｍｌのＭＥＦ培地を含む１５ｍｌのファルコンチューブに移した。この溶液の１０μｌのアリコートを用いて細胞算定を完了した。

フィーダー細胞を含んでいるファルコンチューブを、４℃にて３６００ｒｐｍで４分間遠心分離し、細胞をペレット化した。上清を吸引し、細胞を、ＭＥＦ培地中で、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次いで細胞の適切な容量をゼラチン処理フラスコに添加し、その後これを４％のＯ_２の３７℃のインキュベータ内に配置した。

ｈＥＳＣを、これらが９０％の集密度を超えた場合か、４日毎のいずれかで継代させた。

Ｔ７５フラスコ中の細胞を、１５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。２ｍｌのＴｒｙｐＬＥ−Ｓｅｌｅｃｔを添加し、全ての細胞が被覆されることを確実にするために、フラスコを回転させ、その後３７℃で４分間インキュベートした。次にＴｒｙｐＬｅ−Ｓｅｌｅｃｔを、８ｍｌのＰＢＳを添加することにより希釈した。フラスコを軽くたたくことによって細胞を取り外し、繰り返しピペット操作することによって、ＰＢＳ／細胞溶液をフラスコ表面全体に渡した。細胞溶液を１５ｍｌのファルコンチューブに移し、１０μｌのアリコートを採取し、細胞算定を行い、次いで４℃にて３６００ｒｐｍで４分間遠心分離し、細胞をペレット化した。上清を吸引し、細胞をｈＥＳＣ培地中で再懸濁させ、およそ１×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度を得た。このペレットを、ファルコンチューブ内で繰り返しピペット操作することによって解離させた。最後に、細胞の適切な容量を次いで、新しいフィーダーを含む調製されたフラスコ添加した。

ｈＥＳＣは、それらが分化実験の準備が整う前２４時間未満に継代される場合に、分化実験に最適である。これを行うことができるためには２つの方法がある。いくつかの例では、細胞を、ＭＥＦ培地で処理されたプレート上で実験準備が整う前およそ１〜２時間で継代させる。個の短時間処理葉、プラスチックに迅速に接着する生細胞を選択する。およそ１〜２時間後に、プレートをＰＢＳで洗浄し、生接着細胞を採集し、算定し、その後分化に用いる。あるいは、分化前の継代が、分化の前の日に行うことができる。この場合、ｈＥＳＣ培養物を８０％周辺の集密度で、ＭＥＦ培地処理フラスコで継代させて、３７℃で終夜インキュベートする。

分化の直前に、ＳＴＥＭＤｉｆｆ ＡＰＥＬ培地を、サイトカイン及び増殖因子を所望の分化される最終結果に応じて適切な濃度で含むよう調製した（表１を参照）。細胞を採集し、算定かつペレット化し、次いでＳＴＥＭＤｉｆｆ ＡＰＥＬ培地中で、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。この懸濁液の適切な量を、丸底低接着表面９６−ウェルプレートのウェル当たり５０μｌの培地中に３０００個の細胞を含むように、ＳＴＥＭＤｉｆｆ ＡＰＥＬ及びサイトカイン溶液に添加した（表１を参照）。凝集及びその後の胚様体（ＥＢ）の形成（接着し分化している細胞の三次元塊）を促進するために、プレートを４℃にて３６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いでプレートを４％のＯ_２、５％のＣＯ_２で３７℃にてインキュベートした。

分化実験の目的に応じて、細胞を、マルチチャネルアスピレータ及びマルチウェルピペットを用いて、３日毎または４日毎のいずれかで培地交換した。心筋細胞の最終結果に向かって推進される細胞は、増殖因子を補充されることなく、ＳｔｅｍＤＩＦＦ ＡＰＥＬ培地単独で、３日目に交換した（１００μｌ／ウェル）。内皮細胞及び血液細胞の分化培地の交換は、表２に概説するように、増殖培地を含んだ。新たに形成されたＥＢを吸引することがないように、特に注意が払われる必要がある。

成熟細胞型が出現する段階まで分化実験を継続するために、ＥＢを時折新しいプレートに移し、このことが、細胞がプレートに付着し増殖することを可能にした。非造血中胚葉分化については、７日目にＥＢをゼラチン処理した１０ｃｍの組織培養皿に移した。移す前に、既存の培地を９６ウェルプレートのウェルから吸引し１００μｌのＢＥＬ培地と交換した。これらの新しい培地中のＥＢを採集し、１０ｃｍの組織培養皿に移した（１つの培養皿に対しておよそ１００個のＥＢ）。これらの培養物は、それから、長時間にわたって維持することができたが、但し、培地は、細胞密度に応じて３〜７日毎に規則的に交換した。

血液増検査実験の場合。６ウェルプレートは試料でゼラチン化され、造血前駆体を含むＥＢを移す（プレートダウン）。７日目にＥＢを既存の培地の９６ウェルプレートから６ウェルプレートに、ウェルあたりおよそ２０〜２５個のＥＢを移し、一晩３７℃でインキュベートした。８日目にＥＢをプレートに取り、培地を特殊な血液増殖因子でＡＰＥＬに交換した（表３を参照）。

胚様体を９６ウェルプレートからチューブに採取し、重力によりペレットに沈殿させた。上清を吸引し、ＥＢを５ｍｌのＰＢＳで濯ぎ、次いで遠心分離機内で４℃にて３６００ｒｐｍで４分間、ペレット化した。ＰＢＳを吸引し、ＥＢのペレットを１ｍｌのＴ−Ｓｅｌｅｃｔ中で再懸濁させた。ＥＢのチューブを、３７℃の水浴中で７分間インキュベートした。

懸濁液に３ｍｌの注射器に取り付けた２１ゲージの針を最大３回まで通過させることによって、ＥＢを単一細胞に解離させた。１ｍｌのＳｔｅｍＤＩＦＦ ＡＰＥＬを単一細胞懸濁液に添加し、これをその後、遠心分離（４℃にて３６００ｒｐｍで４分間）によってペレット化させた。上清を除去し、ペレットを１ｍｌのＳｔｅｍＤＩＦＦ ＡＰＥＬ中で再懸濁させ、その後、１ｍｌのＧｉｌｓｏｎピペットを用いてＦＡＣＳチューブフィルターキャップに移した。濾過した細胞懸濁液を、遠心分離機内でペレット化した（３６００ｒｐｍ、４℃、２分）。最後に、過剰の培地を除去し、細胞算定を行うために、ペレットをＳｔｅｍＤＩＦＦ ＡＰＥＬの適当な容量中（１ｍｌ以下、ペレットのサイズに応じて）に再懸濁させた。

２倍量のアルブミン（ａｌｂｕｃｕｌｔ）及び補助剤ならびに２％のＭＣを含むＡＰＥＬ培地を、メチルセルロースコロニー形成アッセイに用いた。この培地を、ファルコンチューブ内でＡＰＥＬ−ＩＭＤＭで１：１に希釈し、ローラー上で４℃にて少なくとも３０分混合した。増殖因子を添加し（表４）、チューブをさらに１０分間ローラー上で混合した。この溶液を『ＭＣ−ＡＰＥＬ』と称する。

各試料に対して、平底型２４ウェル低接着表面２４ウェルプレートにおいてウェル当たり３，０００個の細胞を含む三通りのウェルを準備した。アッセイを行いために、各試料を代表する９，０００個の細胞を、１０ｍｌのチューブに添加し、これと共に増殖因子を含む１．８ｍｌのＭＣ−ＡＰＥＬを、１８ゲージの針及び３ｍｌの注射器を用いて分配した。３０μｌのマトリゲルをこの時点でチューブに添加した。細胞及びＭＣ−ＡＰＥＬの溶液を、針及び注射器で吸引と穏やかな放出とを繰り返すことによって、注意深くかつ完全に混合し、次いで溶液全体を、２４ウェルプレートの各ウェルに分配した（５００μｌ／ウェル）。可能な場合、ＭＣ培養物をプレートの内側の得ウェルに配置し、外側のウェルを１ｍｌの滅菌水で満たし、湿度を提供して乾燥を防止した。次いでプレートを３７℃で最長２１日までインキュベートした。

細胞を、分化の過程全体にわたって（胚性幹細胞期、ＥＢ期、またはこれらが成熟細胞を形成した段階のいずれかで）フローサイトメトリーによって分析した。Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔを用いての解離の前に、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。未分化ｈＥＳＣの場合、全ての細胞が被覆されるような適切な容量のＴ−Ｓｅｌｅｃｔ細胞を添加することによって、細胞を採取した。次いで試料を３７℃でインキュベートした（表５を参照）。ＥＢ及び成熟組織の場合、５ｍｌの注射器に取り付けられた２３Ｇ針で解離する前に、細胞をＴ−Ｓｅｌｅｃｔ中で、表５に支持された時間でインキュベートした。得られた単一細胞懸濁液を、ＰＢＳで洗浄し、その後、遠心分離（４分、３６００ｒｐｍ、４℃）によりペレット化した。

細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ洗浄液中で再懸濁させ、その後もう一度ペレット化した。上清を吸引し、試料を５００μｌのＦＡＣＳ洗浄液中で再懸濁させた。細胞集塊を除去するために、試料を、ＦＡＣＳチューブのキャップを通して濾過し、４℃にて３６００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清の吸引後に、使用される抗体染色毎に５０μｌの細胞懸濁液を有するのに十分な容量があるように、ペレットをＦＡＣＳブロック中で再懸濁させた。

細胞表面受容体に対して特異的な抗体を、５０μｌの細胞懸濁液を含有するＦＡＣＳチューブに添加し、暗所において氷上で少なくとも１５分間インキュベートするよう放置した。その後、試料を３００μｌのＦＡＣＳ洗浄液の添加によって洗浄し、その後遠心分離によってペレット化した。上清を吸引し、第２のＦＡＣＳ洗浄を、同様な方法で行った。染色後には、非結合の抗体を完全に除去することを確実にするために、２回の洗浄が必要である。

全ての抗体染色が完了したら、各試料を、１０％のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む３００μｌのＦＡＣＳ洗浄液中で再懸濁させた。ＰＩは、死細胞に侵入し、ＤＮＡに結合し、外部光源によって励起されるときに蛍光を放つ小分子である。生細胞はＰＩを含まず、したがって、ＦＡＣＳ洗浄溶液中のＰＩの封入は、死細胞を同定する手段を提供し、これら死細胞は、その後フローサイトメーターを用いて行われる分析から除外される。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）のための調製物におけるＲＮＡ合成を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔマニュアルに従って行った。ｃＤＮＡ合成を、Ｔｅｔｒｏ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて製造元マニュアルに従って行った。

ＧＡＰＤＨ及びＯｃｔ４ Ｔａｑｍａｎプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから注文した（それぞれ、カタログ番号Ｈｓ９９９９９９＿ｍ１及びカタログ番号Ｈｓ０１８９５０６１＿ｕ１）。ｍＣｈｅｒｒｙ Ｔａｑｍａｎプローブを特注設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから注文した。Ｑ−ＰＣＲを、標準プロトコルに従って行った。

統計的分析を、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ及び／またはエクセルを用いて行った。使用された特異的試験は、結果で概説する。

実施例３−ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの共培養中の細胞の蛍光タンパク質の自律的保持
ｍＣｈｅｒｒｙ^ｎｅｇ細胞が今日培養中で増殖されたｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞からのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を獲得することができることが可能である。本当であれば、ｍＣｈｅｒｒｙによって遍在的にタグ付けされる細胞の有用性が危うくされ得る。これを試験するために、同数のＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣを、無フィーダー条件下で、６ウェルプレートで一緒に２週間培養した。図２は、１週間の共培養後の共培養物を描写する蛍光顕微鏡画像のセットを示す。

混合培養の試験は、これらが、単一の細胞型を含む細胞集塊ならびに混在した両方の細胞型を含む集塊からなることを示した。さらに一週間後に、更なる継代後に、混合集塊をフローサイトメトリーにより分析した（図２Ｂ）。この分析は、混合培養物が２つの別個の集団を含むことを示し、これは、細胞間でＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ の交換がなかったこと、及び導入遺伝子の機能が、それが発現される特異的細胞に対して限定されたままであることを示唆している。

実施例４−分化全体を通してのベクター機能性
我々は、ＧＡＰＤＨ遺伝子座から挿入された遺伝子が、分化の過程中に発現し続けるであろうと仮定した。これを試験するために、図３に示した概略図に従って、ＧＴ−ＧＦＰ ｈＥＳＣを造血系に分化させた。

フローサイトメトリー分析及び蛍光顕微鏡法を０日目に（すなわち、未分化のｈＥＳＣで）、胚様体形成の４日目に、及び分化細胞が造血幹細胞のマーカーを発現し始めた時点の１４日目に行った。これらのマーカーとしては、血液前駆細胞／内皮細胞マーカーＣＤ３４、骨髄性血液マーカーＣＤ４５、内皮細胞マーカーＣＤ３１、成熟赤血球マーカーグリコホリン−Ａ及び白血球−内皮細胞接着分子ＶＣＡＭ−１が含まれた。

図４に示すように、検討された核実験段階において、高比率の（９５％を超える）細胞が、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現を保持した。加えて、各時間点において、発現の強度は殺減細胞の集団全体にわたって比較的均一であった（３つの時間点にわたる平均蛍光強度は、一貫して４，０００任意単位以上であった）。これらの結果は、蛍光顕微鏡観察によって裏付けられた（図５を参照）。

１４日目の培養物の検査は、内皮性外観を有するコロニー、及びこの内皮性物質から出芽しているか、または培地中に懸濁した丸い血液細胞の発生を示した。抗体染色の後に、フローサイトメトリー分析は、細胞の６０％が血液前駆細胞／内皮細胞マーカーＣＤ３１を発現し、４０％の細胞が、成熟赤血球細胞のマーカーであるグリコホリン−Ａを発現し、１６％が汎造血マーカーＣＤ４５（とりわけ、図５に示されたもの）を発現して、分化細胞型の存在を確認した。これらの集団の全ては、強靭なＧＦＰ発現を維持した。

ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙの発現を検討するために、同様な実験をさらに行った。両有色株（ＧＴ−ＧＴＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ）についてのフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡実験において、親（無色）Ｈ９ ｈＥＳＣを陰性対照として用いた（図４）。

これらの実験は、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙが、分化した子孫において強靭なレベルを持続し、したがって、混合集団を含む培養内で細胞を同定または追跡する手段として機能し得ることを示している。

実施例５−メチルセルロース−マトリゲル培養中のＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ前駆細胞のクローン挙動
コロニー形成アッセイは、細胞集団内の前駆細胞の頻度を挙げるための方法である。このアッセイでは、細胞のコロニーは、メチルセルロース（ＭＣ）などの半固体培地中に懸濁された単一細胞から発生する。各コロニーは、コロニー形成能力を有する単一の前駆細胞の存在を表すものとして取られる。ＭＣ培養中で生じるコロニーはクローンに由来することが以前に確立されているが、この同様な問題は、ＭＣ−マトリゲル（ＭＣＭ）培養に直接対処されてはいない。

この疑問に対処するために、我々は、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ株を代表する３日目の前駆細胞が一緒に播種されるＭＣＭ培養を組み立てた。この実験では、各株の３日目のＥＢを、細胞を造血中胚葉の最終結果に向かわせるように設計された条件下で生成した。解離させた後に、次いで、分化している細胞の単一細胞懸濁液を、低接着表面２４ウェルプレートのウェル内に分配した（図６）。３種類の細胞密度を使用し、すなわち、５００個のＨ９ ＧＴ−ＧＦＴ細胞及び５００個のＨ９ ＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞（低密度）、ウェル当たり各株の１５００個の細胞（中間密度）ならびに各株の２０００個の細胞（高密度）である。密度の範囲は、形成されるコロニーがそれらを計数することを可能にするのに十分に離れていることを確実にするように選択した。ＧＴ−Ｃｈｅｒｒｙ及びＧＴ−ＧＦＰ細胞の同数を、各密度に用いた。

コロニーを１４日目に採点し、５つの異なるグループ：完全な赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ）、完全な緑色（ＧＦＰ^ｐｏｓ）、混合色（相当数の両方の赤色及び緑色細胞）、微量赤色、または微量緑色に分類した（図７）。ほぼ同数の赤色及び緑色細胞を含む混合色コロニーは、播種時の２つの細胞型の並置の結果であり得る。微量コロニーは、大部分は１つの色であるが反対色の１つまたは２つの細胞を含んだものである。「微量」コロニーについては多くの可能な説明がある。例えば、コロニーの微量成分が、他の場所からそのコロニーに移動した細胞を表したことも可能である。別の可能性は、制限された増殖能力を有した細胞が反対色の増殖細胞に飲み込まれたことである。微量コロニーはまた、完全に有色のコロニーが反対色の細胞の進路まで増殖し、それを包み込み、その発色を阻害した結果から生じた可能性もある。

コロニー採点データを図８Ａに表示する。各段は、最低密度ウェルの技術的反復から取られたコロニーの平均数を表す。中間及び高密度ウェルは、正確な計数を行うためにはあまりに過密であった。最も一般的なコロニー型は、全体的に緑色であり、２番目に最も一般的なコロニーは「混合色」コロニーであった。比較的稀であった微量コロニーは別として、全体的に赤色のコロニーは、最も少なかった。

１８日目に、コロニーをＭＣＭ培養から採取し、フローサイトメトリーによって分析するために単一細胞に解離させた。図８Ｂに示すように、この分析は、細胞の６３％がＧＦＰを発現し（ＧＦＰ^ｐｏｓ）、一方３１％がｍＣｈｅｒｒｙを発現した（ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ）ことを示した。これは、採点データと相関し、「混合色」コロニーが、緑色及び赤色細胞の同数を含むと推定される場合、培養全体におけるＧＦＰ^ｐｏｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞の分画は、それぞれ、６６％及び３３％となるであろう（図８Ｃ）。

実施例６−ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ株の誘導の動態
本明細書に開示されるベクターの重要な使用は、遺伝子の条件付き過剰発現の基礎としてのものであろう。ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙベクターを、この点を考慮して構築した（図９）。ベクターのこの実施形態において、ｍＣｈｅｒｒｙを、リバースＴｅｔ活性化因子（ｒＴＡ）タンパク質のための結合部位を含む人工プロモーターの下流に配置した。ドキシサイクリンの存在下で、同じＧＴベクターからも発現されるこのタンパク質は、正確な結合配列を含むプロモーターに結合し、この転写を活性化する（図９中のＴｅｔＯとして示す）。正確に組み込まれたＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙベクターを含む細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙが、ドキシサイクリンの添加後に発現されるであろうことを我々は予期した。

ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙベクターから発現されたｍＣｈｅｒｒｙ誘導の動態を試験する目的で、経時的な実験を行い、ドキシサイクリンによる処理の最適な持続時間を決定した。ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンに１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間曝し、フローサイトメトリーで分析した。薬剤で処理されていないＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの試料及びＨ９ ｈＥＳＣの試料を陰性対照として使用した。フローサイトメトリー分析については、未処理ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ試料中の全ての細胞が、ｍＣｈｅｒｒｙ軸上で負であるように、ＦＡＣＳプロット上に四分円を設定することによって、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性領域を決定した。

図１０に報告されたフローサイトメトリーの結果は、ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ集団の出現が、ドキシサイクリンの添加後１２時間で間もなく見られることを示している。２４時間までに、この集団は、導入遺伝子に切り替わることに失敗した細胞からは明確に区別される。細胞株の潜在的非クローン性、または遺伝子サイレンシングの可能性に関与する多くの説明はあるが、なぜ細胞の実質的な分画がｍＣｈｅｒｒｙ陰性のままでいるのかは明らかではない。陽性及び陰性集団は、処理後３６時間にはより明確に区別されるようになり、７２時間までに、ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞は、区別される高蛍光性の均一な集団を形成した。

図１０Ｃに示す分析は、ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞の平均蛍光強度（ｎ＝３）に基づいており、ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ細胞株に対する理想的な処理時間は、４８時間〜７２時間であることを示唆している。これは、平均蛍光強度が、この例では陽性対照として機能したＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ（ｎ＝３）のものと等しいところである。

実施例７−ドキシサイクリン処理の停止後のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙ発現の減衰
ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ細胞株の挙動をさらに画定するために、我々は、ドキシサイクリンの除去後にｍＣｈｅｒｒｙレベルがベースラインに戻るのに要する時間量を検討した。これらの実験において、ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣを、フィーダーを含まない６ウェルプレートに播種し、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）を含むｈＥＳＣ培地中で３日間培養した。次いで、培地を標準ｈＥＳＣ培地に交換し、実験のその後の日数を培養した。フローサイトメトリーを用いて、ドキシサイクリン除去後毎日、ｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞の割合を定量化した。加えて、この実験は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ傾向の強度に関する情報も提供した。

図１１に示すように、ドキシサイクリン処理が除かれたＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙ発現の持続は、最長で６日間であった。この時点で、集団の１００％は、誘導されなかったＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ細胞株（陰性対照）の試料と等しいｍＣｈｅｒｒｙ^ｎｅｇになった。

我々は、ドキシサイクリンでもはやそれ以上処理されない細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の持続の裏に潜むメカニズムを調査した。ドキシサイクリン誘導中止後２日目−４日目のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの試料を、Ｑ−ＰＣＲによって分析し、ドキシサイクリンで誘導されていないＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙの試料と比較した。これは、ｍＣｈｅｒｒｙのＲＮＡ発現をタンパク質発現と比較した。

フローサイトメトリーの結果（図１１）は、ドキシサイクリン除去から３日目に、細胞の最大で５３％がｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓのままであったことを示した。これと対比して、図１２に表示したＱ−ＰＣＲ分析は、ｍＣｈｅｒｒｙ ＲＮＡレベルが、フローサイトメトリーの結果が示唆したよりも３日早く、３日目までにベースラインレベルに戻ったことを示した（ｐ＞０．０５）。実際、ドキシサイクリン誘導後３及び４日目のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの相対的レベルは、誘導無しのＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙのものと有意差はない（ｐ＞０．０５）。この結果は、ドキシサイクリン除去後３日目までに、誘導ベクター系は、ゲノムレベルにおいては活性ではなく、観察されたいかなる傾向も、実際には、細胞中に残存するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質に起因する。ＧＡＰＤＨ発現データは、この遺伝子、及び推測してそのプロモーターが、試験を行った全ての試料中で同等に活性であることを確認している（ｐ＞０．０５）。同様に、予期したように、ＯＣＴ４発現は、実験の時間枠にわたってほとんど変動を示していない（ｐ＞０．０５）。

実施例６及び７のＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ細胞株での実験から、我々は、誘導のピークが誘導後４８〜７２時間で起こること、及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、それがベースラインレベルに戻る前に皿に６日間を要することを推定した。しかしながら、Ｑ−ＰＣＲ分析は、ドキシサイクリン除去後のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のゆっくりとした減衰が、転写進行の不在下でのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の粘り強い永続性によって、起因している可能性が高いことを示唆した。

実施例８−内皮性分化におけるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ誘導
我々の初期の実験は、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかが、ＧＴベクター中のＴ２Ａ配列から発現されるとき、これらは、ｈＥＳＣ中において高レベルで生成されることを示した。この高い発現レベルは、細胞が造血細胞を含む多くの異なる中胚葉系統に分化されるときに保持された。我々はまた、このベクターの実施形態を用いて、高レベルの発現が、ｈＥＳＣが神経及び内胚葉細胞型に向かって分化される場合に、蛍光レポーターのものでも観察されることの証拠を有している。しかしながら、このベクターのドキシサイクリン誘導性実施形態を用いた我々の実験は、さらなる研究が、分化した子孫におけるその能力を観察することに移行する前に、ｈＥＳＣ中の長期ベクター組み込みを確実にするために必要であることを示している。

このために、我々は、Ｈ９ ｈＥＳＣ株に組み込まれた誘導ベクターの第２の実施形態の機能性を試験しようとした。この細胞株は、ＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質を含み、その発現は、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙベクター中に存在する同じＴ２Ａリンカーを介してＧＡＰＤＨプロモーターに連結されている。ＭＹＣは、増殖を推進するが、適切な増殖因子シグナル伝達の不在下で過剰発現するとき、アポトーシスを引き起こすことができる癌遺伝子である。ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ株においては、ＭＹＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ）に対するホルモン類似体である、誘導薬のタモキシフェン（４ＯＨＴ）の存在下でのみ活性である。４ＯＨＴはＥＲに結合し、これが、立体配座変化をもたらし、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）からのその放出をもたらす。解放されたＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質は、次いで自由に核に転移する。このホルモン結合事象なしでは、ＨＳＰ７０は、ＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質に固定されたままであり、それを細胞質内で保持する。

以前の研究は、ＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質の活性を特性化した。線維芽細胞及びｈＥＳＣの両方でのＭＹＣの適切な活性化が、アポトーシスをもたらすことも示されている。これに基づいて、エストロゲン類似体４ＯＨＴが、標準培養条件下で増殖された細胞に投与されるとき、ｈＥＳＣ培養中の広範にわたる死滅を引き起こすことを示すことによって、我々は、ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ ｈＥＳＣ中のＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質の機能性を裏付けることができた。

アポトーシスを誘導するその能力に加えて、ＭＹＣの最も良く知られた機能は、細胞増殖の推進である。実際に、ＭＹＣは、多くのヒト腫瘍で過剰発現することが見出されており、その強化された発現は、有効な研究ツールとして役立ち得る不死化細胞株を生成するために使用することができる。したがって、この研究の重要な目的は、４ＯＨＴによるＭＹＣの誘導が、分化細胞中のＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質の作用を介して、『不死化』経路を活性化することができるかを試験することであった。さらに、ＥＲを他のタンパク質融合させることは、ｈＰＳＣから発生した分化物質中の様々なこのようなタンパク質の外因性調節を可能にすることができる。この系は、一方では、インビボにおいて成熟組織内の特定のタンパク質の生物学的機能を観察するために、他方では、タンパク質をある特定の時点で導入することによって、所望の経路または表現型に向かうｈＰＳＣ誘導分化産物の発生を推進するために極めて有効なツールである可能性を有する。

この目的を試験するための予備的実験において、内皮性分化実験を、図１３Ａに概説したプロトコルに従って組み立てた。胚様体を、６日目に単一細胞に解離させ、ＰＢＳ中二５μｇ／ｍｌで溶解したフィブロネクチンで被覆した６ウェルプレート上に再プレートした。この単層培養段階において、細胞を内皮細胞前駆体に対して高度に選択的であるＡＥＬ培地条件において、３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦのみで補充した。ウェルの半分が、１μＭの濃度でそれらに添加した４ＯＨＴを有し、培地をさらに４週間にわたって２〜３日毎に交換した。

図１３Ｂの顕微鏡写真から見ることができるように、４ＯＨＴで処理された細胞は、それらの縁部周辺の『輝き』によって観察可能なより屈折性であるように見える。この屈折性形態は、これらの細胞が増殖していること及び／または基材に対する接着性の低下を示しているかのいずれかの考えと一致する。接着性の低下は、腫瘍性形質転換及び／またはアポトーシスを受けている細胞の頻繁に観察される特性である。４ＯＨＴ処理を受けない細胞は、ウェルのフィブロネクチン被覆基部にしっかりと固定された長時間プロセスによって、非常に平坦であった。正式な細胞算定は、この予備実験では行わなかったが、時間が経つにつれて、＋４ＯＨＴのウェルは、４ＯＨＴ処理を受けていないウェルよりも非常に多くの細胞を含むように見えた。

４ＯＨＴで処理されたＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ分化細胞の培養で観察された明らかに増加した細胞数と相まっての細胞形態に及ぼす効果は、誘導性ＭＹＣ：ＥＲ導入遺伝子が、分化細胞中で機能的であることを示唆した。これらの観察を用いて、我々は、本明細書に記載される造血／内皮性分化系におけるＭＹＣ過剰発現の効果を定量化することについて次に組み立てを行った。

実施例９−メチルセルロース−マトリゲルコロニー形成アッセイにおけるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ誘導
４ＯＨＴ処理済みの分化細胞型中のＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ導入遺伝子の機能性を検査するために、我々は、３日目のＥＢからの細胞を用いて、メチルセルロース−マトリゲル（ＭＣＭ）コロニー形成アッセイを組み立てた。図１４Ａは、分化プロトコルを示す。ＥＢ期中の増殖因子は、造血及び内皮性前駆細胞の両方を含む中胚葉の形成を推進した。ＭＣＭ培養に添加された増殖因子は、造血及び内皮増殖ならびに分化を刺激した。

親Ｈ９ ｈＥＳＣＳ及びＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ株を代表する分化された３日目のＥＢを、解離し、単一細胞をＭＣＭ培地（１．５％のマトリゲルを含むＭＣ培地）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を２４ウェルプレートの個々のウェルにわたって分配し、このうち６つのウェルがＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲのためのものであり（このうち３つのウェルは、濃度１μＭでＭＣＭ培地に添加された４ＯＨＴを含み、３つのウェルが４ＯＨＴを含まなかった）、同一条件下のＨ９株の６つのウェルは、対照として機能したコロニーを２１日目に採点し、分類：赤血球系、骨髄系、嚢胞性、嚢胞発生中、または接着シート状にグループ分けした。これらの分類の例を図１４に示す。

図１５は、３つの独立した実験から平均化した結果を示す。４ＯＨＴの添加は、分化Ｈ９細胞のコロニー形成能力全体に影響を及ぼすようには見えなかった（ｐ＞０．０５）（図１５Ｄ）。初期の実験から予想されたように、ＭＣＭ培養系は、造血性コロニーよりはむしろ嚢胞性コロニーの形成を推進した。両方の型のコロニーについて、４ＯＨＴ添加の統計的に有意な効果はなかった。

ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ培養において、４ＯＨＴの存在は、合計で、また嚢胞発生中のコロニーを除いた全ての部類で非常に多数のコロニーをもたらした。最も注目すべきは、４ＯＨＴ処理が、ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ培養中で接着製シート状コロニーの発生をもたらしたことである。これはＨ９培養では発生せず、４ＯＨＴを含まないＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ培養でも発生しなかった。

接着性シート状コロニーが４ＯＨＴ処理されたＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ培養に限定されたのみならず、それらのサイズも他の培養条件下で見られたいかなるコロニー型よりも実質的に大きかった。典型的な接着シート状コロニーを示す図１４Ｆだけではなく、これらのコロニーのサイズは、図１６でも他のコロニーと比較してみることができる。

述べたように、統計的分析は、処理と対照群との間の唯一の有意差が、ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲデータにおいて接着シート状の部類について生じたことを示唆した（２標本等分散ｔ検定；ｐ＝０．０４６、ｎ＝３）。

実施例１０−構成的レポーター細胞系としてそれらがＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙに関わるときの例の論議
本試験の目的は、分化の異なる段階の全体を通しての本明細書に開示されたベクターの実施形態の機能性を検討することである。これを行うために、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙをコードする導入遺伝子を含むＰＳＣを、それらの未分化状態で、またそれらが造血／内皮細胞に向かって分化したときに検査した。これらの試験は、ベクター中のＴ２Ａ配列から発現された蛍光レポーター遺伝子が、フローサイトメトリー分析及び蛍光顕微鏡によって決定される強靭な蛍光強度及び周波数を維持することを明らかにした。我々はまた、土岐氏サイクリンによる処理の際にｍＣｈｅｒｒｙを発現した誘導ベクターの実施形態も観察した。最後に、我々は、細胞が４ＯＨＴによって処理されるとき、このベクターから発現されたＭＹＣ：ＥＲ融合タンパク質が、造血／内皮性分化を変更することを示すことによって、このベクター系の有用性を裏付けた。総じて、これらのデータは、このベクターがｈＥＳＣ分化実験のための発現系であることを立証している。

ＧＴ−ＧＦＰ ｈＥＳＣを用いた初期の実験は、細胞が造形通中胚葉及び内皮性細胞に分化されるときに、この細胞株が、強靭なＧＦＰ発現を維持することを示した。このベクターを含む細胞はまた、高レベルのレポーター発現を維持する神経細胞、心筋細胞及び膵細胞型を生成した。ＧＴ−導入遺伝子を有するｈＥＳＣが、全ての３つの胚葉を表す細胞の運命を取り入れるための能力を示したことを考慮すれば、このことは、これらの細胞株がそれらの多能性の能力を維持すること、及びＧＴ構築物の組み込みがこれらの細胞が分化するための能力に影響を及ぼさないように思われることを示唆する。ＧＴ−ＧＦＰ細胞株で行われた我々の実験において、ＧＦＰの発現レベルは、分化の全体を通して一般して高いままであり、導入遺伝子が遺伝子サイレンシング効果を受けないという強力な証拠を提供している。

細胞をレポータータンパク質で永久的にタグ付けすることの重要な使用のうちの１つは、細胞が混合集団内で同定されることを可能にすることである。この使用は、１つの細胞によって発現されるたんぱく質が、周辺の細胞によって取り込まれないと想定する。しかしながら、ある状況下では、蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現していた細胞と共培養された細胞によって取り込まれる可能性がある。このような移行のメカニズムは明らかではないが、我々は、この可能性を、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣの共培養実験において公式に試験した。顕微鏡画像及びフローサイトメトリーデータの両方が、ＧＦＰ^ｐｏｓ及びｍＣｈｅｒｒｙ^ｐｏｓ細胞集団が、重なり合うことなく、または『二重陽性』細胞なく、離れたままであることを示した。この実験から、我々は、細胞間の蛍光タンパク質移動が生じない場合には、これが細胞型特異的な現象である可能性が高いことを結論付けた。

蛍光タンパク質発現が分化中に維持されたこと、及び蛍光タンパク質がそれらを発現しない細胞によって取り込まれることはほとんどないことを示す証拠が得られたため、我々は、この系を用いて、ＭＣＭ培養中に生じる嚢胞性コロニーのクローン性を試験した。この実験では、ＧＴ−ＧＦＰ及びＧＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞株の３日目の前駆細胞を、ＭＣＭ中で一緒に１８日間培養した。赤色及び緑色細胞の両方を含む相当数の「混合色」コロニーを見たために、コロニーがクローン性を生じなかったことを見出した。偶然に、この実験は、一緒に分化した後であっても、時として、混合された造血／内皮性コロニーにおいて、蛍光タンパク質の発現が互いに排他的であって、これは、レポータータンパク質の細胞間移動が生じなかったことを示唆することを見出した。

実施例１１−ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ ｈＥＳＣ中のｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析にそれらが関わるときの例の論議
本明細書に開示されるベクターの有用性は、これが、目標とする遺伝子の誘導発現を可能にするように操作され得る場合に増加すると思われる。これに関して、我々は、目標とする遺伝子のドキシサイクリン誘導発現を送達するように設計されたベクターのバージョンにおいてｍＣｈｅｒｒｙの発現を検査した。ＧＴ−ｉＣｈｅｒｒｙ細胞株を用いた初期誘導実験は、ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの最大誘導のための最適ドキシサイクリン処理が、４８時間〜７２時間であることを示した。

実施例１２−中胚葉分化におけるＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ誘導にそれらが関わるときの例の論議
ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ ｈＥＳＣを用いた我々の予備実験は、４ＯＨＴで処理されるとき、内皮性分化プロトコルに由来する細胞が、ＭＹＣを過剰発現する他の細胞型の報告されたものと似た形態を取り入れることを示した。この結果を踏まえて、造血／内皮性分化中のＭＹＣの誘導の効果を観察するために、我々は、ＭＣＭにおいてコロニー形成アッセイ実験を行った。このアッセイは、これが細胞増殖（コロニーサイズ）、前駆細胞頻度（コロニー数）、及び分化（コロニー型）に及ぼす効果を観察する機会を提供するので選択された。

この分析から２つの明確な結果が得られた。第１に、４ＯＨＴ処理ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ ＭＣＭ培養が、未処理コロニーよりも非常に多数のコロニーを含んだことである。これと同じ効果は、Ｈ９対照培養では観察されなかった。この結果は、４ＯＨＴで処理されたＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ培養が、恐らくはＭＹＣの活性化に起因する、生存及び／または増殖能力のより高い可能性を有したことを示唆している。第２に、ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ ＭＣＭ培養の４ＯＨＴ処理が、４ＯＨＴ ＧＴ−ＭＹＣ：ＥＲ処理試料の数に限定されるのみならず、最大かつ最も優勢な細胞型として観察もされた、特有の接着シート状細胞型の外観を促進したことである。この接着シート状コロニーは、内皮細胞型に既知の細胞形態におけるいくつかの類似点のために、実際には内皮性物質であること、及びＭＣＭ中の増殖因子組み合わせが内皮の増殖を支援することができることを推定することができる。これは、分化のこの段階における異所性ＭＹＣ発現が、この誘導無しでは通常存在しない特有の細胞運命経路を活性化することができることを示唆している。したがって、ＭＹＣの過剰発現が、増殖が増大し、広がる接着シート状コロニーをもたらすように細胞周期を変更することが可能である。

実施例１３
この実施例は、図２６に提供された結果に関連するものである。
Ａ．親ＮＫＸ２−５ＧＦＰ／ｗ ｈＥＳＣ（Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｄ．Ａ．，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０３７）またはＧＴ−タンデムトマト発現ベクターを含有するように改質されたＮＫＸ２−５ＧＦＰ／ｗｈＥＳＣを、細胞をアクチビンＡ及びＧＳＫ−３阻害薬ＣＨＩＲ−９９０２１で処理することによって、分化させた。３日目に培地を、ＷＮＴ拮抗薬ＩＷＰ−２を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７で交換した。７日目から先は、細胞をＲＰＭＩ／Ｂ２７中で維持した。分化７日目に、以前に記載された（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ，２０１１）フローサイトメトリー用に細胞を採取した。

Ｂ．神経分化を、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ，２００９（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７：２７５）によって最初に記載された二重ｓｍａｄ阻害法の修正型を用いて行った。神経伸長の証拠が培養中で見られたら、細胞を固定し、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）またはｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体で標識した。細胞をＤＡＰＩで染色することによって、核を可視化させた。全ての画像は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１で撮影した。

Ｃ．約１０^６細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ＩＬ２Ｒガンマ欠損マウスの肩甲骨に皮下注射することによって奇形腫を作り出した。およそ３か月後に、触知腫瘤が検出されたときに、動物を頸椎脱臼によって殺滅し、奇形腫を切開し、１ｍｍ×１ｍｍの切片に切断し、４％のＰＦＡ中で固定化した。固定化の後に、奇形腫片をＸ−ｇａｌで染色し、細固定子、次いで組織検査用に処理した。組織検査用切片をヘマトキシリン及びエオシンで対比染色して、細胞下部構造を明らかにした。画像をＺｅｉｓｓ ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡で捕捉した。

本実施例のこのデータは、Ｇａｐ Ｔｒａｐベクター系が、インビトロ及び免疫不全マウスへの移植後の両方で、分化細胞型のある範囲においての様々な導入遺伝子の発現を維持することを示している。

Claims (21)

1. ベクターであって、
   構成的に発現された遺伝子のゲノム終止コドンのゲノム配列５’に対して相同である５’核酸と、
   外因性核酸と、
   前記構成的に発現された遺伝子の前記ゲノム終止コドンのゲノム配列３’に対して相同である３’核酸と、
   前記５’核酸及び前記外因性核酸に作動可能に連結された翻訳中断−再開シグナルと、を含み、
   前記翻訳中断−再開シグナルが、前記構成的に発現された遺伝子の前記ゲノム終止コドンに置き換わることができる、前記ベクター。
2. 前記構成的に発現された遺伝子が、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＨＳＰ９０、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬＰ１、ＧＵＳＢ、ＬＤＨＡ、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、ＲＰＬＰ０、またはＴＦＲＣを含む、請求項１に記載のベクター。
3. 前記翻訳中断−再開シグナルが、２Ａペプチドをコードする、請求項１または２に記載のベクター。
4. 前記翻訳中断−再開シグナルが、配列番号１の配列を含む、請求項３に記載のベクター。
5. 前記５’核酸が、約２５〜１００塩基、約２００〜１０００塩基、約１ｋｂ〜５ｋｂ、または約３．５ｋｂを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
6. 前記５’核酸が、配列番号２の配列を含む、請求項５に記載のベクター。
7. 前記３’核酸が、約２５〜１００塩基、約２００〜１０００塩基、約１ｋｂ〜５ｋｂ、または約４ｋｂを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
8. 前記３’核酸が、配列番号３の配列を含む、請求項７に記載のベクター。
9. 配列内リボソーム進入部位と、第２の外因性核酸とをさらに含み、前記配列内リボソーム進入部位が、前記外因性核酸及び前記第２の外因性核酸に作動可能に連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
10. 前記配列内リボソーム進入部位が、配列番号４の配列を含む、請求項９に記載のベクター。
11. 前記外因性核酸または前記第２の外因性核酸が、マーカータンパク質、任意に蛍光タンパク質または抗生物質耐性タンパク質をコードするか、もしくは任意にチミジンキナーゼをコードする自殺遺伝子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
12. 前記第１の外因性核酸または前記第２の外因性核酸が、誘導プロモーターを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
13. 配列番号９の配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
14. 配列番号５、６、７、または８の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
16. 多能性幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または多能性幹細胞、胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞から分化した細胞を含む、請求項１５に記載の細胞。
17. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターか、または請求項１５または１６に記載の細胞を含む、非ヒト動物。
18. 細胞中で外因性核酸を発現するための方法であって、前記細胞中で、構成的に発現された遺伝子を含むゲノム配列を切断し、前記ゲノム配列中に二本鎖切断を生成することと、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターを、前記細胞中に組み込むことと、前記構成的に発現された遺伝子の前記終止コドンを前記翻訳中断−再開シグナルで置き換えることとを含む、前記方法。
19. 請求項１８に記載の方法によって得られる、細胞。
20. 請求項１９に記載の細胞を含む、非ヒト動物。
21. 細胞または組織の集団において細胞を同定するための方法であって、前記細胞中で構成的に発現された遺伝子を含むゲノム配列を切断し、前記ゲノム配列中に二本鎖切断を生成することと、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターを、前記細胞中に組み込むことと、前記構成的に発現された遺伝子の前記終止コドンを前記翻訳中断−再開シグナルで置き換えることと、前記細胞中の前記外因性核酸の発現を検出することとを含む、前記方法。