JP2017531629A - レット症候群の処置 - Google Patents

Abstract

本発明は、自閉スペクトラム症、例えばレット症候群を処置するための剤および方法に関する。本発明は、神経疾患、例えば自閉スペクトラム症およびレット症候群の徴候を処置または改善するための剤および方法を提供することによって、先に言及される必要に対処する。一態様において、本発明は、ＭＥＣＰ２遺伝子中の１つまたは複数の突然変異と関連する神経疾患を処置する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１４年９月２５日出願の米国仮出願第６２／０５５４３３号明細書および２０１５年６月２６日出願の米国仮出願第６２／１８５２１４号明細書の優先権の利益を主張し、これらの出願は参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、自閉スペクトラム症、例えばレット症候群の徴候を処置または改善するための剤および方法に関する。

自閉症スペクトラムまたは自閉スペクトラム症は、社会的欠陥およびコミュニケーション障害、ステレオタイプ化されたまたは反復的な行動および関心、そして場合によっては認知障害によって特徴付けられる広範な神経障害である。障害の例として、自閉症、アスペルガー症候群、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、小児期崩壊性障害、およびレット症候群が挙げられる。非特許文献１および非特許文献２参照。

レット症候群は、正常な初期の成長および発達の後に、発達の遅延、目的を持った手の使用の喪失、特有の手の動作、脳および頭部の成長の遅延、歩行の問題、発作、ならびに知的障害が続くことによって特徴付けられる。レット症候群のほぼ全ての症例は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２、またはＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。ＭＥＣＰ２遺伝子は、ヒトの、２つの性染色体の１つであるＸ染色体上に見出される。男性は１つのＸ染色体しか有していないので、ＭＥＣＰ２遺伝子中に欠陥がある男性は、レット症候群の臨床的特徴を高い頻度で示さないが、そもそも生まれてきたときに重篤な問題を経験して、出生直後に死亡する。女性は２つのＸ染色体を有するが、与えられたあらゆる細胞において１つしか活性がない。結果として、レット症候群の患者は、ほぼ独占的に女性であり、レット症候群は、世界中の全ての人種群および民族群において出生女児１０，０００から１５，０００人に１人に影響を与えると推定されている。例えば、非特許文献３参照。

現在、レット症候群の治療法はない。障害の処置は対症的である。すなわち、徴候の管理に集中しており、支持的なものであるので、多分野にわたるアプローチが必要である。例えば、不規則な呼吸および運動困難のための医薬品が用いられ得、そして発作を抑制するための抗痙攣薬が用いられ得る。また、自発的な活動（例えば、身支度、摂食、および美術工芸の訓練）を実行するのに必要な技術を小児が身につけるのを手助けするための作業療法が用いられる一方、理学療法および水治療法が移動度を長くし得る。例えば、前掲の非特許文献３参照。レット症候群および他の自閉スペクトラム症を処置するための剤および方法が必要とされている。

米国特許出願公開第２０１３／００２９３６６号明細書 米国特許第７５０４３８９号明細書 米国特許第７８２９７３７号明細書 米国特許第７５６０４３８号明細書 米国特許第８２０２９８０号明細書 米国特許第８４２０３９１号明細書 米国特許第８４４５２３７号明細書 米国特許第８６８５３６８号明細書 米国特許第８１５３７７７号明細書 米国特許第８０３４３７６号明細書 米国特許第７７３２１２９号明細書 米国特許第７５７２９０６号明細書 米国特許第６４９８０３３号明細書 米国特許第６１６５９９０号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００３４８４７号明細書 米国特許出願公開第２００９／０１７６３１２号明細書 米国特許第７９９４１２７号明細書 米国特許第６７０９８１７号明細書

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｍａｙ １８，２０１３ Ｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ，Ａｕｔｉｓｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０００；２８（２）：３５５−６３ Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ ｂｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ／ｗｗｗ．ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ／ｒｅｔｔ／ｄｅｔａｉｌ＿ｒｅｔｔ．ｈｔｍ Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００１ Ｍａｒ；２７（３）：３２２−６ Ｂｉｅｎｖｅｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｍａｙ ２２；９（９）：１３７７−８４ Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｄｅｃ；６５（６）：１５２０−９ Ａｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｏｃｔ；２３（２）：１８５−８ Ｈｅｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２０１２；４：ａ０１１１８９ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（２００６），１７６０：１５０５−１５１２ Ｐｉｌｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７（３）：１１８−１２６ Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６：９４８−９５８ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０） ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ（ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉｃａｌｄｅｖｉｃｅｓ／ｄｅｖｉｃｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｕｉｄａｎｃｅ／ｇｕｉｄａｎｃｅｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｕｃｍ２６２２９２．ｈｔｍ＃） Ｃａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ ２８（３）：２０５−１１ Ｓｃｈａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ １２６ （２）：１２９−４０ Ｖａｎ ｄｅｎ Ｖｅｙｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ ２３（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１４７−５１ Ｍｉｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ−Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｇ，Ｌａｃｃｏｎｅ Ｆ，２００４，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２（２）：１０７−１５ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００３ Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．１１，ｐｐ．１１．４７−１１．５７，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．） Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，４３rd Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ｈｔｔｐ：／／ｓｆｎ２０１３．ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓｐｏｔ．ｏｒｇ／５５３２１−ｓｎ６−１．２２５９４１／ｔ−０１０−１．２２７１１２／３３５−１２−１．２２７１１９／３３５−１２−１．２２７１２０） Ｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５５８−６６ Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．６６（Ｐｔ ２）：２１３−２１ Ｉｖｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５：１０３００−７ Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．６０（Ｐｔ １２）：２１２６−３２ Ｃｈａｈｒｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｎ ５６：４２２−３７

本発明は、神経疾患、例えば自閉スペクトラム症およびレット症候群の徴候を処置または改善するための剤および方法を提供することによって、先に言及される必要に対処する。

一態様において、本発明は、ＭＥＣＰ２遺伝子中の１つまたは複数の突然変異と関連する神経疾患を処置するための方法を提供する。より概括的に、本発明は、ＰＴＰ１Ｂの細胞間発現、もしくはＰＴＰ１Ｂの細胞内活性、または双方の増大と関連する、自閉スペクトラム症が挙げられる神経疾患を処置するための方法を提供する。本方法は、対象（例えば、ヒト患者）に、必要に応じて、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の阻害剤である治療剤の有効量を投与することを含む。ＰＴＰ１Ｂの阻害剤は、小分子化合物、核酸、またはポリペプチドであってよい。小分子化合物の例として、ＣＰＴ１５７６３３、トリテルペン、例えばウルソール酸（ＵＡ００１）またはＵＡ０７１３、およびこれらの化合物のそれぞれの誘導体が挙げられる。一実施形態において、神経疾患は自閉スペクトラム症である。一例において、自閉スペクトラム症はレット症候群である。ある特定の実施形態において、神経障害を処置する際に、治療剤は、神経疾患が、ＭＥＣＰ２遺伝子中の１つまたは複数の突然変異と関連しているという診断後にのみ、対象に投与される。例えば、診断は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする遺伝子中の突然変異について対象を試験することを含んでよい。より詳細には、診断は、自閉スペクトラム症の診断であってよい。一例において、診断は、レット症候群の診断であってよい。

第２の態様において、本発明は、（ｉ）ＰＴＰ１Ｂの阻害剤である第１の治療剤の有効量を有する第１の医薬組成物、および（ｉｉ）自閉スペクトラム症を診断するためのキットまたは試薬を含有するシステムを提供する。一実施形態において、キットは、ＭＥＣＰ２をコードする遺伝子中の突然変異の検出を可能にする。そのために、キットは、突然変異遺伝子座を包含する当該遺伝子、またはそれ由来の転写産物のアンプリコンを得るためのＰＣＲプライマーを含んでよい。キットはまた、（ｉ）遺伝子の突然変異型もしくは野生型、または（ｉｉ）その相補体に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはプローブを含んでもよい。検出を容易にするために、オリゴヌクレオチドまたはプローブは、レポーター分子が標識されていてよい。好ましい実施形態において、システムはさらに、第２の治療剤の有効量を含む第２の医薬組成物を含んでよい。この第２の治療剤は、ＩＧＦ１またはその類似体であってよい。

第３の態様において、本発明は、（ｉ）ＰＴＰ１Ｂの阻害剤である第１の治療剤の有効量、（ｉｉ）ＩＧＦ１またはその類似体である第２の治療剤の有効量、および（ｉｉｉ）医薬的に許容可能なキャリアを含有する医薬組成物を特徴とする。

別の態様において、本発明は、ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって特徴付けられる神経障害の処置に用いるＰＴＰ１Ｂの阻害剤を含む組成物を提供する。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明において示されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、該説明から、そして特許請求の範囲から明らかである。

図１は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）−ホスホイノシチド−３−キナーゼ−プロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ−ＰＫＢ／Ａｋｔ）に関わるシグナル伝達経路を示す図である。 図２Ａおよび図２Ｂは、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスおよびＭｅｃｐ２^-/+雌マウスが、（Ａ）グルコース不耐性、および（Ｂ）高インスリン血症の徴候を示すことを示す。 図３Ａおよび図３Ｂは、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスにおいて観察されたインシュリンシグナリングの弱まりを示す。 図４は、ＭＥＣＰ２の欠損が、皮質におけるＰＴＰ１Ｂの発現の増大を伴ったことを示す。 図５Ａ〜図５Ｆは、Ｍｅｃｐ２突然変異マウスが、より高いレベルのＰＴＰ１Ｂを発現すること、そして、ＰＴＰ１ＢをコードするＰＴＰＮ１遺伝子が、ＭＥＣＰ２の標的であることを示す。 図６Ａ〜図６Ｅは、ＰＴＰ１Ｂ阻害が、Ｍｅｃｐ２突然変異マウスにおけるグルコースホメオスタシスおよび生存を向上させたことを示す。 図７は、生存に及ぼすＩＧＦ−１およびＰＴＰ１Ｂ阻害剤の組合せ効果を示す。 図８は、グルコース耐性に及ぼすＩＧＦ−１およびＰＴＰ１Ｂ阻害剤の組合せ効果を示す。 図９は、ＰＴＰ１Ｂの構造的に、かつ機構的に異なる阻害剤、ＵＡ０７１３もまた、ＭＥＣＰ２−ｎｕｌｌ雄の生存を向上させたことを示す。 図１０は、ＰＴＰ１Ｂの構造的に、かつ機構的に異なる阻害剤が、ＭＥＣＰ２−ｎｕｌｌ雄マウスの生存を向上させたことを示す。 図１１は、雌Ｍｅｃｐ２非相同マウスが、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤ＣＰＴ１５７６３３による処置後に、仔運びアッセイにおけるパフォーマンスの高まりを示したことを示す。 図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＰＴＰ１Ｂの阻害が、ＴｒｋＢのリン酸化の増大を導き、かつＢＤＮＦに応じるシグナリングを高めたことを示す。 図１３Ａ〜図１３Ｇは、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤ＣＰＴ１５７６３３の生化学的特性評価を示す。 図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＰＴＰ１Ｂの阻害が、雌マウスモデルにおいて、レット症候群の表現型を改善することを示す。

発明の詳細な説明

本発明は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の阻害が、本明細書中に記載されるように、いくつかのレット症候群の徴候を改善したという発見に少なくとも部分的に基づいている。したがって、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤が、ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって特徴付けられる、レット症候群および他の自閉スペクトラム症が挙げられる他の神経疾患を処置するための新しい戦略を提供する。より概括的に、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤が、ＰＴＰ１Ｂの細胞間発現もしくはＰＴＰ１Ｂの細胞内活性、または双方の増大と関連する、自閉スペクトラム症が挙げられる神経疾患を処置するための新しい戦略を提供する。

本明細書中で用いられるレット症候群は、以下に示されるように、罹患細胞におけるＭＥＣＰ２遺伝子の欠陥、例えば遺伝子中の１つまたは複数の突然変異によって特徴付けられ、かつ引き起こされる、神経学的な神経発達障害を指す。先に述べられるように、レット症候群のほぼ全ての症例は、ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異、例えばＭＥＣＰ２機能に影響を及ぼすミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、およびフレームシフト突然変異によって引き起こされる。突然変異の例として、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献および非特許文献７に記載されるものが挙げられる。これらの参考文献は全て、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。例えばこれらとして、非特許文献５および以下の表１によって例示されるミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、およびフレームシフト突然変異を構成する、レット症候群患者において検出されるＭＥＣＰ２遺伝子の様々な点突然変異または欠失が挙げられる。

ＰＴＰ１Ｂおよび関連するシグナル伝達経路
タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰ１Ｂは、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリの創設メンバである酵素である。タンパク質チロシンホスファターゼは、タンパク質上のリン酸化されたチロシン残基からリン酸基を除去した一群の酵素である。例えば特許文献１参照。例示的なＰＴＰ１Ｂのアミノ酸配列および関連する核の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２８２７、ＮＰ＿００２８１８、ＢＴ００６７５２、ＡＡＰ３５３９８、Ｍ３１７２４、ＡＡＡ６０２２３、Ｍ３３６８９、ＡＡＡ６０１５７、ＢＣ０１５６６０、ＡＡＨ１５６６０、ＢＣ０１８１６４、ＡＡＨ１８１６４、ＡＫ３１６５６３、ＢＡＧ３８１５２、またはＵｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｈｓ．４１７５４９（ＵＧＩＤ：２２３３３７）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）ＰＴＰＮ１に関する配列に記載されている。

タンパク質チロシン（ｐＴｙｒ）リン酸化は、タンパク質相互作用および細胞局在化のための認識モチーフを生じさせることができ、タンパク質安定性に影響を及ぼすことができ、かつ酵素活性を調節することができる一般的な翻訳後修飾である。当該酵素は、シグナル伝達経路（例えばＭＡＰキナーゼ経路）および細胞サイクル制御において重要な調節構成要素であり、細胞の成長、増殖、分化、および形質転換の制御において重要である。例えば非特許文献８参照。

処置方法
本明細書中に開示されるように、ＭＥＣＰ２遺伝子突然変異と関連する自閉スペクトラム症、例えばレット症候群が挙げられる、ＰＴＰ１Ｂの発現または活性の増大と関連する神経疾患を処置するために、ＰＴＰ１Ｂは標的とすることができる。種々のＰＴＰ１Ｂ阻害剤が、本発明の方法を実行するために用いられ得る。阻害剤の例として、小分子化合物、核酸、およびポリペプチドが挙げられる。そのような阻害剤は、酵素活性、転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性／分解、タンパク質修飾、およびタンパク質−タンパク質相互作用に及ぶレベルにて機能し得る。より詳細には、本明細書中に記載されるように、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、レット症候群の徴候を改善するために、単独で用いられてもよいし、他の剤と併用されてもよいことが見出された。したがって、一実施形態は、レット症候群を処置するための方法および組成物を提供する。

小分子阻害剤
ＰＴＰ１Ｂの多くの小分子阻害剤が、当該技術分野において知られており、本明細書中に記載される処置方法を実行するのに用いられ得る。例えば、特許文献２および特許文献３参照。これらの参考文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

ＰＴＰ１Ｂの小分子阻害剤は、特許文献２に開示され、そして以下に示される式Ｉおよび式ＩＩａ〜ＩＩｅの化合物を含む：
式Ｉ：
式中：
Ｘ₁は、リンカー基であり、または不在であり；
Ｘ₂は、Ｈであり、不在であり、または、場合によっては１つもしくは複数の二重結合もしくは三重結合を含有する、場合によっては置換されている、好ましくは１から８個の炭素を含む直鎖脂肪族化合物もしくは分枝状脂肪族から好ましくは選択されるリンカー基であり、炭素の１つもしくは複数は、場合によってはＲ^*によって置換されており、Ｒ^*は、場合によっては置換されているシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール；−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹¹−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹¹ＮＲ¹²−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ¹¹ＣＯ₂−、−Ｏ−、−ＮＲ¹¹Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹²−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ¹¹−、−ＮＲ¹¹ＮＲ¹²−、−ＮＲ¹¹Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＮＲ¹¹−、−ＳＯ₂ＮＲ¹¹−、もしくは−ＮＲ¹¹ＳＯ₂−であり、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、Ｈから独立して選択され、場合によっては置換されている脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；あるいはＸ₂は、場合によっては置換されているシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール；−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹¹−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹¹ＮＲ¹²−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ¹¹ＣＯ₂−、−Ｏ−、−ＮＲ¹¹Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹²−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ¹¹−、−ＮＲ¹¹ＮＲ¹²−、−ＮＲ¹¹Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＮＲ¹¹−、−ＳＯ₂ＮＲ¹¹−、または−ＮＲ¹¹ＳＯ₂−であり；但し、Ｘ₁が−ＮＨ−である場合、Ｘ₂は、−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−または置換された−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−ではなく；
Ｒ₁は、Ｈであり、または、場合によっては置換されているＣ₁〜₈脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；
Ｒ²は、Ｈであり、または、場合によっては置換されているＣ₁〜₈脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；あるいはＲ²は、Ｘ₂がＨである場合、不在であり；
Ｒ³およびＲ⁴は独立して、Ｈ、アルキル、またはＣ₅〜₆アリールであり；
Ｒ⁵およびＲ⁶は独立して、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ⁷およびＲ⁸は、独立して、Ｈ、−ＯＲ²³、もしくは−ＮＨＲ²³；または、場合によっては置換されている脂肪族、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；あるいは一緒に、３〜７個の炭素またはヘテロ原子を含み、場合によっては置換されている環を形成しており；
Ｒ⁹は、ＨまたはＣ₁〜₃アルキルであり；
Ｒ¹⁰は、ＨまたはＣ₁〜₃アルキルであり；あるいははＲ⁸およびＲ¹⁰は一緒に、３〜７個の炭素またはヘテロ原子を含み、場合によっては置換された環を形成しており；
各Ｒ^mは独立して、Ｈ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＯ₂、−ＣＮ；場合によっては置換されているＣ₁〜₃アルキル；−ＯＲ²³、−Ｃ（Ｏ）Ｒ²³、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ²³、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ²³、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ²³、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ²³、−Ｓ（Ｏ）Ｒ²³、−ＳＲ²³、−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）；ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）Ｒ²⁴、−ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）ＯＲ²⁴、−ＮＲ²³ＳＯＯＲ²⁴、−ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²⁴）（Ｒ²⁵）、または−ＮＲ²³ＳＯ₂Ｎ（Ｒ²⁴）（Ｒ²⁵）であり；Ｒ²³、Ｒ²⁴、およびＲ²⁵はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁〜₄アルキル、または、場合によっては置換されている、３から８員のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；あるいは２つの隣接するＲ^m基は一緒に、場合によっては置換されている、５〜７個の炭素またはヘテロ原子を含む芳香環または非芳香環を形成しており；ｎは、０、１、２、３、または４であり；あるいはＲ^mおよびＲ⁷は一緒に、場合によっては置換されている芳香環または非芳香環を形成しており；
フェニル環Ａ炭素原子２〜６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置換されており；または隣接するフェニル環Ａ炭素原子２〜６のあらゆる対は場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置換されており；但し、ホスホネート基で置換されているフェニル環Ａ炭素原子が置き換えられている場合は除く；
式ＩＩａ：
式中：
Ｒ_aおよびＲ_bは独立して、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁹、およびＲ³⁰はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＯ₂、−ＣＮ、−ＣＦ₃、−ＣＨＦ₂、−ＣＨ₂ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＣＦ₃、−ＣＦ₂ＣＦ₃、−ＣＨ₂Ｃｌ、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＮＨ₂、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂、−ＣＨ₂ＳＯ₂ＣＨ₃、−ＯＲ²³、−Ｃ（Ｏ）Ｒ²³、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ²³、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ²³、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ²³、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ²³、−Ｓ（Ｏ）Ｒ²³、−ＳＲ²³、−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ²³）（Ｒ²⁴）、−ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）Ｒ²⁴、−ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）ＯＲ²⁴、−ＮＲ²³ＳＯＯＲ²⁴、−ＮＲ²³Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²⁴）（Ｒ²⁵）、−ＮＲ²³ＳＯ₂Ｒ²⁴、もしくは−ＮＲ²³ＳＯ₂Ｎ（Ｒ²⁴）（Ｒ²⁵）；または、場合によっては置換されているＣ₁〜₆アルキル、Ｃ₁〜₆アルコキシ、もしくはアリールであり；Ｒ²³、Ｒ²⁴、およびＲ²⁵はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁〜₄アルキルもしくはＣ₃〜₈シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｒ³¹およびＲ³²はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、またはＣ₅〜₆アリールであり；
Ｒ²⁸は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＮ、−［ＣＨ₂］_n−［Ｃ（Ｈ）_3-p］_X（Ｒ³³）_p、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ₂）_nＲ³³、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ³³、−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（Ｒ³⁴）（Ｒ³⁵）、もしくは−ＣＨＮＲ³⁴−であり；またはＲ²⁸は、Ｒ²⁷もしくはＲ²⁹と一緒に、３から８個の炭素もしくはヘテロ原子を含み、場合によっては置換されている環を形成しており；
各Ｒ³³は独立して、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ＝Ｎ−Ｎ、−Ｎ（Ｒ³⁷）（Ｒ³⁸）、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ₂）_nＲ³⁹、−Ｃ（Ｒ³⁹）（ＮＨ₂）Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、−ＣＨ₂Ｒ³⁵、もしくは−ＣＨ（Ｒ³⁵）ＮＨＳ（Ｏ）₂Ｒ³⁹；または、場合によっては置換されているシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり；
Ｒ³⁴は、Ｈまたは−Ｎ（Ｒ³⁷）（Ｒ³⁸）であり；
Ｒ³⁵は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ³⁴、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、または−Ｎ（ＮＨ₂）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ₂）_nＰｈであり；
Ｒ³⁷およびＲ³⁸はそれぞれ独立して、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、−Ｃ（Ｏ）シクロアルキル−Ｐｈ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ³⁹、−Ｃ（Ｏ）Ｒ³⁹、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ³⁹、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ₂）ｑＲ³⁹、−Ｓ（Ｏ）₂、−Ｓ（Ｏ）₂ＮＨＲ³⁹、−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ⁴⁴）（Ｒ³⁹）、−Ｎ（Ｒ³⁹）（Ｒ⁴⁴）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁴⁴）（Ｒ³⁹）、もしくは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁴⁴）（Ｒ³⁹）；または、場合によっては置換されているＣ₁〜₆アルキル、Ｃ₃〜₈シクロアルキル、Ｃ₅〜₈アリール、３から８員のヘテロシクロアルキル、もしくは５から８員のヘテロアリールであり；
Ｒ³⁹およびＲ⁴⁴はそれぞれ独立して、Ｈ、または、場合によっては置換されているＣ₁〜₆アルキル、Ｃ₃〜₈シクロアルキル、Ｃ₅〜₈アリール、３から８員のヘテロシクロアルキル、もしくは５から８員のヘテロアリールであり；
それぞれの置換基を含むフェニル環Ａ炭素原子２〜６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置き換えられており；または隣接するフェニル環Ａ炭素原子２〜６のあらゆる対、およびそれらのそれぞれの置換基は、場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置き換えられており；
ｎは、０から４までの整数であり；ｍは、０、１、または２であり；ｐは、１から３までの整数であり；ｑは、０から６までの整数であり；ｘは、０または１であり、但しｘが０である場合、ｐは１である；
式ＩＩｂ：
式中、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁸、Ｒ²⁹、Ｒ³¹、およびＲ³²は、先に定義される通りであり；それぞれの置換基を含むフェニル環Ａ炭素原子３〜６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置き換えられており；または隣接するフェニル環Ａ炭素原子３〜６のあらゆる対、およびそれらのそれぞれの置換基は、場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置き換えられている；
式ＩＩｃ：
式中、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁹、Ｒ³¹、およびＲ³²は、式ＩＩａについて先に定義される通りであり；
Ｒ⁴⁰は、Ｈ、アルキル、アルキレン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ³⁷）（Ｒ³⁸）、または−Ｎ（ＮＨ₂）Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ₂）_nＰｈであり；
Ｒ⁴¹は、−Ｎ（Ｒ³⁷）（Ｒ³⁸）であり；Ｒ³⁷およびＲ³⁸は、式ＩＩａについて先に記載される通りであり；
それぞれの置換基を含むフェニル環Ａ炭素原子３、５、もしくは６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置き換えられており；またはフェニル環Ａ炭素原子５および６は一緒に、およびそれらのそれぞれの置換基は、場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置き換えられている；
式ＩＩｄ：
式中、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、およびＲ²⁹は、式ＩＩａについて先に定義される通りであり；
Ｒ³¹およびＲ³²はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、またはＣ₅〜₆アリールであり；
Ｒ⁴⁰は、式ＩＩｃについて先に定義される通りであり；Ｒ⁴²は、Ｈ、場合によっては置換されているＣ₁〜₃アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ³⁹、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ³⁹、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁴⁴）（Ｒ³⁹）、−Ｃ（Ｏ）シクロプロピル−Ｐｈ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ³⁹、−Ｓ（Ｏ）₂ＮＨＲ³⁹、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ₂）_qＲ³⁹であり；それぞれの置換基を含むフェニル環Ａ炭素原子３、５、もしくは６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置き換えられており；またはフェニル環Ａ炭素原子５および６は一緒に、およびそれらのそれぞれの置換基は、場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置き換えられており；
Ｒ³⁹は、式ＩＩａについて先に定義される通りである；ならびに
式ＩＩｅ：
式中、Ｒ²⁶、Ｒ²⁷、Ｒ²⁹、およびＲ⁴⁰は、式ＩＩｄについて先に定義される通りであり；
Ｒ³¹およびＲ³²はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、またはＣ₅〜₆アリールであり；Ｒ⁴³は、Ｈ、−ＮＨＲ³⁹、またはＲ³⁹であり；Ｒ³⁹は、Ｈ、または、場合によっては置換されているＣ₁〜₆アルキル、Ｃ₃〜₈シクロアルキル、３から８員のヘテロシクロアルキル、Ｃ₃〜₈アリール、もしくは３から８員のヘテロアリールであり；それぞれの置換基を含むフェニル環Ａ炭素原子３、５、もしくは６はそれぞれ、場合によっては、Ｎによって置き換えられており；またはフェニル環Ａ炭素原子５および６は一緒に、そしてそれらのそれぞれの置換基は、場合によっては、Ｓ、Ｎ、もしくはＯによって置き換えられている。

一部の例において、阻害剤は、｛［２−ブロモ−４−（２−カルバモイル−２−メタンスルホニルアミノエチル）フェニル］ジフルオロメチル｝−ホスホン酸（ＣＰＴ１５７６３３、Ｃｅｐｔｙｒ，Ｉｎｃ）、またはＣＰＴ１５７６３３の誘導体および類似体からなる群から選択されるものであってよい。一部の例において、阻害剤は、ウルソール酸（ＵＡ００１）もしくはＵＡ０７１３、または別のトリテルペン誘導体もしくは類似体から選択されるものであってよい。非特許文献９参照。用語「誘導体」は、構造および機能が別の化合物と類似する化合物を指す。誘導体は、親化合物と同じ機能を保持するならば、構造的に、単一の元素もしくは基によって、または複数の基（例えば、２、３または４つの基）の修飾によって異なってよい。そのような修飾は、当業者にとってルーチン作業であり、例えば、付加的な、または置換された化学的部分、例えば酸のエステルまたはアミド、保護基、例えばアルコールまたはチオールについてのベンジル基、およびアミンについてのｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が挙げられる。また、挙げられるのは、アルキル側鎖への修飾、例えばアルキル（例えば、メチル、ジメチル、エチルその他）置換、側鎖の飽和または不飽和のレベルへの修飾、および修飾基、例えば置換されたフェニル基およびフェノキシ基の付加である。また、薬物動態特性を変える、例えば半減期をインビボもしくはエクスビボで長くするための、または細胞侵入特性もしくは生物学的利用能を高めるための部分が、本明細書中に記載される剤に加えられてもよい。また、挙げられるのは、医薬の多数の所望される品質（例えば、溶解度、生物学的利用能、製造その他）を高めることが知られているプロドラッグである。用語「類似体」は、元素組成に関して、例えば、ある原子の、別の原子での置き換えによって、またはある官能基の、別の官能基での置き換えによって異なる、親化合物の構造誘導体である化合物を指す。

ＣＰＴ１５７６３３の構造が、以下に示される：

ＣＰＴ１５７６３３の誘導体および類似体として、式Ｉおよび式ＩＩ（ａ）〜（ｅ）を有する化合物が挙げられる。

ウルソール酸（ＵＡ００１）の構造が、以下に示される：

ＵＡ０７１３の構造が、以下に示される：

ＰＴＰ１Ｂのトリテルペン阻害剤として、以下の表２に示されるものが挙げられる。

核酸阻害剤
本明細書中に記載される処置方法を実行するために、対象中の内在性ＰＴＰ１Ｂの発現レベルまたは活性レベルを引き下げる核酸ベースの阻害剤を用いることもできる。そのような阻害剤の例として、細胞内の標的ｍＲＮＡ分子を特異的に分解するＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）、例えば、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用するものが、そしてまた、アンチセンスＤＮＡ分子またはアンチセンスＲＮＡ分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）等の阻害剤が挙げられる。例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７参照。

一実施形態において、核酸阻害剤は、ＰＴＰ１Ｂを標的とし、かつその発現または活性を阻害する低分子干渉ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ剤）をコードしてよい。用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡ干渉を導くのに十分な、標的ＲＮＡとの配列相補性を有するＲＮＡまたはその類似体を指す。例として、ＲＮＡを形成するのに用いられ得るＤＮＡも挙げられる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的分子（例えば、標的遺伝子、標的タンパク質、または標的ＲＮＡ）が下方制御される配列特異的プロセスまたは選択的プロセスを指す。通常、干渉ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ」）は、特定のｍＲＮＡの触媒的分解をもたらす二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、そしてまた遺伝子発現を低下させ、または阻害するのに用いられ得る。例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、非特許文献１０参照。例えば、非特許文献１１参照。

ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、およびａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）分子が、当該技術分野において周知の方法によって設計され得る。あらゆるＲＮＡを一意的に分解することが要求される配列特異性を提供するのに十分な相同性を有するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびａｓＲＮＡ分子は、当該技術分野において知られているプログラムを用いて設計され得、当該プログラムとして、ＡＭＢＩＯＮ，Ｉｎｃ．およびＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，Ｉｎｃ．のウェブサイト上に保持されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびａｓＲＮＡ配列の最適化のために設計された、いくつかの種の系統的試験が、当業者によってルーチン的に実行され得る。干渉核酸低分子を設計する場合の考慮事項として、生物物理学的、熱力学的、および構造学的な考慮事項、センス鎖における特異的な位置での塩基選択性、ならびに相同性が挙げられるが、これらに限定されない。これらの考慮事項は、当該技術分野において周知であり、先に言及されるＲＮＡ分子を設計するためのガイドラインを提供する。例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７参照。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）は、ＰＴＰ１Ｂをコードする遺伝子またはＲＮＡの塩基配列と相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有する限り、いかなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。この塩基配列は、ポリペプチドをコードする遺伝子の相補体と、少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。当該アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ合成装置を用いて合成され得る。例えば、特許文献８、特許文献９および特許文献１０参照。

本発明のアンチセンスＤＮＡは、変更または修飾された糖、塩基、または結合を含有してよい。先に言及されるアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡｉ剤は、リポソーム、マイクロスフェア等の特殊な形態で提供されてもよいし、遺伝子治療に利用されてもよいし、付着部分と併せて提供されてもよい。例えば、特許文献８、特許文献９および特許文献１０参照。

先に言及されるＲＮＡｉ剤の１つまたは複数をコードする、先に議論される核酸は、インビトロまたはインビボでの細胞への送達のために、ベクター中にクローニングされてよい。インビボ用途について、送達は、特定の組織または臓器（例えば脳）を標的とすることができる。例えば、特許文献８、特許文献９および特許文献１０参照。

核酸配列の送達はまた、組換え発現ベクター、例えばキメラウイルス、またはコロイド分散系を用いて達成されてもよい。核酸配列の治療的送達に好ましいのは、標的リポソームの使用である。

遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、またはマウスレトロウイルスもしくはトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。いくつかの更なるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。例えば、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３および特許文献１４参照。

組成物
本発明の範囲内に、適切なキャリア、および先に記載される治療剤の１つまたは複数を含有する組成物がある。当該組成物は、医薬的に許容可能なキャリアを含有する医薬組成物であってよい。

用語「医薬組成物」は、活性剤の、キャリア（不活性または活性である）との組合せを指し、これにより組成物は、インビボまたはエクスビボの診断用途または治療用途に特に適したものとなる。医薬的に許容可能なキャリアの例として、所望される特定の剤型に適したあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液状ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、および潤滑剤等が挙げられる。非特許文献１２。医薬的に許容可能なキャリアは、対象に投与された後、不所望の生理的作用を引き起こさない。医薬組成物中のキャリアはまた、活性成分と適合し、かつこれを安定化させることができるという点で「許容可能」でなければならない。１つまたは複数の可溶化剤が、活性化合物の送達用の医薬キャリアとして利用され得る。医薬的に許容可能なキャリアの例として、剤型として有用な組成物を達成するような、生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他のキャリアの例として、コロイド状の酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃１０が挙げられる。

先に記載される組成物は、先に記載されるあらゆる形態で、レット症候群、または他のあらゆる自閉スペクトラム症もしくは症状（罹患細胞中のＭＥＣＰ２遺伝子の欠陥、例えば、本明細書中に記載される遺伝子中の１つまたは複数の突然変異によって特徴付けられ、かつ引き起こされる）を処置するのに用いられ得る。より概括的に、これは、ＰＴＰ１Ｂの細胞間発現、もしくはＰＴＰ１Ｂの細胞内活性、または双方の増大と関連する自閉スペクトラム症が挙げられる神経疾患を処置するために用いられ得る。有効量とは、処置された対象に治療効果をもたらすのに必要とされる活性化合物／剤の量を指す。有効用量は、当業者によって認識されるように、処置される疾患のタイプ、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療処置による共使用の可能性に応じて変化することとなる。

本発明の医薬組成物は、非経口的に、経口的に、経鼻的に、経直腸的に、局所的に、または経頬的に投与されてよい。本明細書中で用いられる用語「非経口的」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、および適切なあらゆる注入技術を指す。滅菌注射可能な組成物は、非毒性の、非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液であってよい。そのような溶液として、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、および生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。経口投与用の組成物として、カプセル、タブレット、エマルジョン、ならびに水性の懸濁液、分散系、および溶液が挙げられる、経口的に許容可能なあらゆる剤型があり得る。

「対象」は、ヒト、およびヒト以外の動物を指す。ヒト以外の動物の例として、哺乳類、例えばヒト以外の霊長類（特により高等な霊長類）、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、およびネコが挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験動物、または疾患モデル（例えばレット症候群のマウスモデル）として適切な動物である。処置されることになる対象は、障害の標準的な診断技術によって同定され得る。

用語「処置する」または「処置」は、互換的に用いられ、治療処置および防御もしくは予防措置の双方を指す；目的は、標的病状または標的障害を予防または減速（軽減）することである。特に、障害、障害の徴候、障害の二次的な疾患状態、または障害になりやすい素因を治療し、軽減し、和らげ、治し、開始を遅延させ、予防し、または改善する目的を持った、障害（例えばレット症候群）に罹っている対象への化合物または剤の投与を指す。

「有効量」または「治療的に有効な量」は、処置される対象において医学的に所望される結果をもたらすことができる化合物または剤の量を指す。処置方法は、インビボまたはエクスビボで、単独で、または他の薬物もしくは療法と共に実行され得る。治療的に有効な量は、１回または複数回の投与、塗布、または投薬で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることは意図されない。必要とされる正確な量は、対象の種、齢、および一般的な症状、ならびに特定の治療剤等に応じて、対象ごとに変動することとなる。

本発明の化合物は好ましくは、投与の簡略化および投薬の均一性のために、投薬単位形態に製剤化される。本明細書中で用いられる表現「投薬単位形態」は、処置されることになる患者にとって適切な治療剤の、物理的に別個の単位を指す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の毎日の使用総量は、適切な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることとなることが理解され得る。あらゆる特定の患者または生物にとっての具体的な治療的に有効な用量レベルは、処置されることになる障害、および障害の重篤度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成；患者の齢、体重、健康状態、性別、および食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；処置の期間；使用される特定の化合物と併用され、または同時的に用いられる薬物；ならびに医学技術分野において周知の因子が挙げられる種々の因子によって決まることとなる。

治療剤は、インビボまたはエクスビボで、単独で投与されてもよいし、他の薬物または療法と併せて共投与されてもよい（すなわち、カクテル療法）。本明細書中で用いられる用語「共投与」または「共投与される」は、対象への、少なくとも２つの剤または療法の投与（実施）を指す。他の実施形態において、第１の剤／療法は、第２の剤／療法の前に投与（実施）される。当業者であれば、用いられる種々の剤／療法の配合および／または投与（実施）経路が変動し得ることを理解する。

一実施形態において、ＰＴＰ１Ｂの第１の小分子阻害剤は、第１の小分子阻害剤と異なる作用機序を有するＰＴＰ１Ｂの第２の小分子阻害剤と共投与される。例えば、ＣＰＴ１５７３３３ならびにその誘導体および類似体は、ＰＴＰ１Ｂの競合阻害剤であり、ＵＡ０７１３および他のトリテルペン阻害剤は、ＰＴＰ１Ｂの非競合阻害剤である。ゆえに、一実施形態において、ＰＴＰ１Ｂの小分子競合阻害剤は、ＰＴＰ１Ｂの小分子非競合阻害剤と共投与される。

インビボアプローチにおいて、化合物または剤が対象に投与される。通常、化合物は、医薬的に許容可能なキャリア（例えば、限定されないが、生理食塩水）中に懸濁されて、経口的に、もしくは静注によって投与され、注射され、または皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹膜内に、もしくは鼻腔内に注入される。必要とされる投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾病の性質；対象のサイズ、体重、表面積、齢、および性別；投与されることになる他の薬物；ならびに主治医の判断によって決まる。適切な投薬量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。必要とされる投薬量の変動は、利用可能な種々の化合物、および種々の投与経路の様々な効率を考慮して予想されることになる。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い投薬量を必要とすると予想され得る。これらの投薬量レベルの変動は、当該技術分野において十分理解されるように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調整され得る。適切な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子または注入可能なデバイス）中への化合物の封入は、特に経口送達について、送達の効率を高め得る。

本発明はまた、ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって特徴付けられる神経障害の処置に用いる、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤を含む組成物を提供する。一実施形態において、障害は、ＭＥＣＰ２遺伝子突然変異と関連する自閉スペクトラム症、例えばレット症候群である。ＰＴＰ１Ｂの阻害剤として、先に記載される阻害剤、例えばＣＰＴ１５７６３３およびその誘導体または類似体が挙げられる。

コンパニオン診断アッセイ
本発明の方法はさらに、対象がＭＥＣＰ２遺伝子中に突然変異を有するかを試験する診断アッセイを含んでよい。そのようなアッセイは、病変組織または他の患者サンプル中の遺伝子またはタンパク質の発現レベルに関する、診断上も治療的にも重要な情報を提供し、コンパニオン診断アッセイとしても知られている。例えば、特許文献１５、特許文献１６、および関連する非特許文献１３参照。

タンパク質ＭＥＣＰ２は、多量に発現されるＤＮＡ結合タンパク質であり、核中に位置決めされ、そして５−メチルシトシン（５−ｍＣ）リッチヘテロクロマチンを伴う。その４８６個のアミノ酸（ａａ）は、２つの既知の機能的ドメイン：８４位のａａメチル−ＣｐＧ−結合ドメイン（ＭＢＤ）および１０４位のａａ転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）を含有する。ＭＢＤは、対称的にメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドに結合する；ＴＲＤは、抑制補体Ｓｉｎ３Ａと相互作用して、一緒に、ヒストンデアセチラーゼを動員する。コアヒストンＨ３およびＨ４の、結果として生じた脱アセチル化は、クロマチンを圧縮して、転写機構へのアクセスを不可能にする。ＤＮＡメチル化依存的な抑制は、Ｘ染色体不活化およびゲノムインプリンティングにとって重要である。ＭＥＣＰ２は、全ての組織において発現されており、包括的な転写リプレッサとして作用すると考えられている。ＭＥＣＰ２は、神経細胞の正常な機能に必須であり、特に、成熟した神経細胞にとって重要であり、高いレベルで存在する。ＭＥＣＰ２遺伝子は、Ｘ染色体の長（ｑ）腕上のバンド２８（「Ｘｑ２８」）中に位置決めされ、塩基対１５２，８０８，１１０から塩基対１５２，８７８，６１１である。例えば、特許文献１７および特許文献１８参照。

現在のところ、レット症候群のほぼ全ての症例は、ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって引き起こされている。例えば、非特許文献７、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６および非特許文献１７参照。ＭＥＣＰ２遺伝子は、レット症候群の個体において適切に機能しないので、不十分な量の、または構造的に異常な形態のタンパク質が産生されて、他の遺伝子が異常に発現される虞がある。したがって、本明細書中に記載されるコンパニオン診断アッセイは、レット症候群のステージまたは程度を診断し、かつ患者が最も応答しそうである治療剤を判定するように設計されてよい。より詳細には、そのようなアッセイの結果が用いられて、組織サンプルが収集かつ保存された患者または対象の特異的な組織サンプル内のＭＥＣＰ２遺伝子またはタンパク質の正確な発現レベルの相関を示すことができる。これにより、障害に関する診断情報が提供されるだけでなく、医師または他の医療の専門家が、患者にとって適切な療法を判定することも可能になる。

ＭＥＣＰ２遺伝子中の種々の突然変異が同定されてきた。したがって、当業者は、当該技術分野において周知である標準的な臨床診断法を用いて、対象がこれらの突然変異の１つまたは複数を有するかを試験することができる。典型的には、これらの方法は、対象から、限定されないが、組織サンプル、生検、流体サンプル（例えば、血液、尿、唾液、および脳脊髄液）その他であってよいサンプルを得てから、このサンプルを診断手順にかけることを含む。サンプルを分析するための、実務者が利用可能である多くの周知の方法論として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの方法が挙げられる種々の核酸検出法および増幅法、ならびに、抗体ベースの検出法が挙げられる種々のタンパク質検出法がある。他の例において、非侵襲性診断に撮像技術を用いることが可能であり得る。ＭＥＣＰ２突然変異に加えて、いくつかの他の遺伝子（例えば、ＣＤＫＬ５遺伝子およびＦＯＸＧ１遺伝子）中の突然変異もまた、レット症候群に寄与する。例えば、非特許文献３参照。したがって、本発明のコンパニオン診断アッセイは、場合によっては、これらの遺伝子の１つまたは複数を試験することを含んでよい。

一態様において、本発明のコンパニオン診断アッセイは、対象がレット症候群に罹っているか、レット症候群の傾向があるかを判定するための質的情報および量的情報を提供する。レット症候群に罹っている、またはその傾向がある対象は、対象由来の試験サンプル中の、先に記載されるＭＥＣＰ２遺伝子、またはその発現産物（ＲＮＡまたはポリペプチド）の発現レベル、パターン、またはプロファイルに基づいて判定され得る。言い換えると、産物は、障害の有無を示すマーカーとして用いられ得る。本発明のコンパニオンアッセイの診断および予後の態様として、産物の発現レベルを評価する方法が挙げられる。本方法およびキットにより、レット症候群を検出することができる。例えば、サンプル中の正常な野生型ＭＥＣＰ２遺伝子の発現の欠如は、障害の存在または障害の高いリスクを示す。逆に、正常な発現レベルは、障害の欠如を示す。

先に記載される方法およびマーカーは、レット症候群を発症している対象のリスクを評価するのに用いられてよい。特に、本発明のコンパニオン診断アッセイは、早期検出の決定的な洞察を得るために、既にリスクがある高リスクコホートの対象に用いられてよい。

レット症候群と関連する、遺伝子産物レベルの変化は、疾患表現型の発症の前の、またはその早期ステージにある対象の細胞中に検出され得る。したがって、本発明の処置方法はまた、レット症候群の発症のリスクに曝されている対象をスクリーニングすることを含み、これは、適切な試験サンプル中のＭＥＣＰ２遺伝子発現または遺伝的突然変異のレベル、そして場合によっては他のマーカーの１つまたは複数のレベルを評価することを含む。したがって、コントロールサンプル中の遺伝子産物または遺伝子産物の組合せのレベルと比較した、生体サンプル中の対応する遺伝子産物のレベルの差異または変化は、レット症候群の発症のリスクに曝されている対象を示す。そのようなスクリーニングに用いられる生体サンプルとして、正常である対象、または障害があると疑われる対象の血液由来の細胞集団が挙げられ得る。レット症候群と関連する１つもしくは複数の遺伝子産物のレベルに変化がある対象、またはＭＥＣＰ２遺伝子中に１つまたは複数の突然変異を有する対象は、更なる監視および試験の候補である。そのような更なる試験は、当該技術分野の範囲内の技術を用いた組織学的調査、神経学的調査、または行動に関する調査を含んでよい。

コンパニオン診断アッセイの精度を高めるために、対象または患者はさらに、関連する身体的状況および神経学的状況に基づいて、評価されてよい。例えば、患者の初期の成長および発症中の徴候を観察し、かつ患者の身体的状況および神経学的状況の継続的評価を行うことによって、レット症候群を臨床的に診断することができる。そのために、小児神経科医、臨床遺伝医、または発達小児科医に意見を求めることで、レット症候群の臨床診断を確かめることができる。医師は、臨床基準の３つのタイプ：当該技術分野において知られているメイン、サポーティブ、およびエクスクルージョンに分けられる、高度に特異的なガイドラインセットを用いることができる。例えば、非特許文献１および非特許文献３参照。

レット症候群は、患者の齢および徴候に基づいて、４つのステージにカテゴリ化されてきた。前掲。ステージＩＩ（齢１〜４）、ＩＩＩ（齢２〜１０）、およびＩＶ（齢１１以上）の患者は、レット症候群に特有の特定の身体的状況および神経学的状況を示す一方、ステージＩ（典型的には生後６から１８月齢）の患者の徴候は、漠然としていることがあり、多くの場合見落される。前掲。したがって、先に記載されるコンパニオン診断アッセイは、これらのステージＩの若い患者にとって特に所望される。

先に言及されるように、レット症候群およびＭＥＣＰ２遺伝子突然変異は、より厳しい影響を男児に及ぼす。というのも、男児は、１つのＸ染色体しか有しておらず、欠陥があると出生直後に死亡するからである。したがって、本発明のコンパニオン診断アッセイは、レット症候群に罹っていることが疑われる男性において、かなり初期に実行されるべきである。例えば、出生前診断または出生前スクリーニングが、出生前の男性胎児または胚に実行されてよい。一般的な試験手順として、羊水穿刺、項部透過性超音波が挙げられる超音波検査、血清マーカー試験、または遺伝的スクリーニングが挙げられる。前掲。

「診断」または「評価」によって言及されるのは、レット症候群の診断、レット症候群のステージの診断、レット症候群のタイプもしくは分類の診断、レット症候群の再発の診断もしくは検出、レット症候群の退行の診断もしくは検出、レット症候群の予後、または処置された対象の、療法に対する奏効の評価である。通常、疾患または障害の診断は、疾患を示す１つまたは複数の因子および／または徴候の評価に基づく。すなわち、診断は、疾患または症状の存在または不在を示す因子の存在、不在、または量に基づいてなされ得る。特定の疾患の診断のための指標であると考えられる各因子または各徴候は、特定の疾患に排他的に関係している必要はない；すなわち、診断的な因子または徴候から推測され得る識別診断であってよい。同様に、特定の疾患を示す因子または徴候が、特定の疾患に罹っていない個体に存在する例があり得る。診断法は、独立して用いられてもよいし、特定の疾患または障害、例えば、レット症候群のための、医療技術において知られている他の診断法および／またはステージング法と併用されてもよい。

システムおよびキット
本発明の一部の実施形態において、先に記載される治療法は、個体が、自閉スペクトラム症、例えばレット症候群と相関することが知られている突然変異遺伝子のキャリアであるかを判定する、遺伝的試験またはゲノム試験と併用されてよい。疾患または障害に対する対象の傾向、および療法に対する感受性を発見し、かつそれに応じて対象を処置するような個別化医療アプローチが用いられ得る。

したがって、本発明の別の態様は、自閉スペクトラム症、例えばレット症候群を診断するための、先に記載される治療剤のいずれか（またはそれらの組合せ）の有効量を含有するシステム、およびキットを提供する。当該キットは、核酸含有サンプルを収集するためのコンテナ、例えば血液を収集するためのチューブを含んでよい。本発明に従うキットは、核酸増幅法、コピー法、プライマー伸長法、検出法、同定法、および／または定量化法が挙げられる診断を実行するための試薬を含有することを含んでよい。そのために、本明細書中に開示される方法のための反応構成要素の１つまたは複数が、標的核酸の検出に用いられるキットの形態で供給されてよい。そのようなキットにおいて、１つまたは複数の反応構成要素の適切な量が、１つまたは複数のコンテナ中に提供され、または担体上に（例えば、静電的相互作用または共有結合によって）保持される。

本明細書中に記載されるキットは好ましくは、ＭＥＣＰ２遺伝子のコード領域およびエキソン／イントロン境界の１つまたは複数のＰＣＲベースの配列決定のための試薬を含む。当該キットは、先に記載されるＭＥＣＰ２遺伝子ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なプライマーの１つまたは複数を含んでよい。キットは、１つまたは複数のプライマーを含有する１つまたは複数のコンテナを含んでよい。キットは、単一のコンテナ中の単一のプライマー、同じプライマーを含有する複数のコンテナ、本発明の２つ以上の異なるプライマーを含有する単一のコンテナ、または異なるプライマーを含有する、もしくは２つ以上のプライマーの混合物を含有する複数のコンテナを含有してよい。プライマーおよびコンテナのあらゆる組合せおよび順列が、本発明のキットによって包含される。

キットはまた、先に記載される方法を実行するための付加的な材料を含有してもよい。ゆえに、キットは、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実行するための試薬の一部または全てを含有してよい。キットの構成要素の一部または全ては、本発明のプライマーを含有するコンテナとは別のコンテナ中に提供されてよい。キットの付加的な構成要素の例として、１つまたは複数の異なるポリメラーゼ、コントロール核酸に、または標的核酸に特異的である１つまたは複数のプライマー、コントロール核酸に、または標的核酸に特異的である１つまたは複数のプローブ、重合反応用のバッファ（１×または濃縮形態）、重合産物を検出する１つまたは複数の色素または蛍光分子が挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、以下の構成要素の１つまたは複数を含んでもよい：支持体、ターミネーティング試薬、修飾試薬、または消化試薬、オスモライト、および検出プローブを検出するための装置。

増幅プロセスおよび／または検出プロセスに用いられる反応構成要素は、種々の形態で提供されてよい。例えば、構成要素（例えば、酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されてもよいし、フリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末、ペレット、またはビーズとされてもよい。後者の場合、構成要素は、再構成される場合、アッセイに用いられる構成要素の完全な混合物を形成する。

キットまたはシステムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、本明細書中に記載される構成要素のあらゆる組合せを含有してよく、そしてさらに、構成要素に用いられる、有形の形式で記録された説明を含んでよい。一部の用途において、１つまたは複数の反応構成要素が、個々の、典型的には使い捨て可能な、チューブまたは等価のコンテナ中に、予め測定された単回使用量で提供されてよい。そのような構成により、標的核酸の存在が試験されることになるサンプルは、個々のチューブに加えられて、増幅が直接実行され得る。キット内に供給される構成要素の量は、適切なあらゆる量であってよく、そして製品が向けられるターゲット市場によって決まってよい。適切な量を決定するための一般的なガイドラインは、例えば、非特許文献１８および非特許文献１９において見出され得る。

本発明のシステムまたはキットは、本発明の方法を実行するのに有用である付加的な試薬または物質をいくつ含んでもよい。そのような物質として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞を単離するための試薬（バッファを含む）、細胞溶解用試薬、二価カチオンキレート化剤、または不所望のヌクレアーゼを阻害する他の剤、プライマー、ポリメラーゼ、および他の反応構成要素が適切に機能することを確認するのに用いられるコントロールＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ単離試薬（バッファを含む）、増幅反応試薬（バッファを含む）、ならびに洗浄液。本発明のキットは、あらゆる温度にて提供され得る。例えば、タンパク質構成要素またはその複合体を液体中に含有するキットの貯蔵について、０℃未満、好ましくは−２０℃以下で、またはそれ以外では凍結状態で提供かつ維持されることが好ましい。

構成要素が供給されるコンテナは、供給された形態を保持することができるあらゆる従来型のコンテナであってよく、例えば、マイクロフュージチューブ、アンプル、ボトル、または一体化された試験装置、例えば流体機器、カートリッジ、ラテラルフロー、もしくは他の類似の装置である。キットは、標的核酸の増幅または検出に用いられる標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブを含んでよい。一部の実施形態において、キットはさらに、本明細書中に記載されるあらゆる方法、例えば、核酸の抽出および／または精製のない粗マトリックスを用いる方法に構成要素を用いるための説明を含んでよい。

キットまたはシステムはまた、コンテナまたはコンテナの組合せを保持するためのパッケージング材を含んでもよい。そのようなキットおよびシステムのための典型的なパッケージング材として、反応構成要素または検出プローブを、種々のあらゆる構成（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、およびマイクロアレイ等）で保持する固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、および微粒子等）が挙げられる。

コンパニオン診断テストの使用に関する説明は、本発明の化合物、組成物、またはキットと共にパッケージされる文書資料上に提供されてよい。文書資料は、例えば、ラベルであってよい。文書資料は、レット症候群または本発明の治療化合物に関連した条件または遺伝的特徴を示してよい。説明は、対象および担当医師に、療法の実施から最適な臨床結果を達成するための最良のガイダンスを提供する。例えば、本発明のシステムは、キット構成要素を含有することに加えて、アッセイを行うための機器、例えば、標識プローブのシグナルを検出するためのルミノメータ、および／または捕捉プローブにハイブリダイズされた核酸を分離するための磁気装置をさらに含んでよい。

本発明のキットまたはシステムの使用を詳述する説明、例えば文書による指示またはビデオ録画された実演が、場合によっては、キットまたはシステムに提供される。更なる態様において、本発明は、本明細書中のあらゆる組成物もしくはキットの使用、本明細書中のあらゆる方法もしくはアッセイの実行、および／または本明細書中のあらゆるアッセイもしくは方法を実行するためのあらゆる装置もしくはキットの使用を提供する。

場合によっては、本発明のキットまたはシステムはさらに、データの生成、分析、および／または記憶を迅速化し、かつデータベースへのアクセスを促進するソフトウェアを含む。キットは、処置されることになる対象の生理的状況のデータ分析用のソフトウェアパッケージを含んでよく、これは、関連する試験プロファイルとの比較のための参照プロファイルを含んでよい。ソフトウェアは、論理命令、命令セット、または、データの収集、記憶および／もしくは分析に用いられ得る適切なコンピュータープログラムを含む。データの比較分析および関係分析が、提供されるソフトウェアを用いて可能である。

そのようなキットはまた、情報、例えば科学文献の参照、添付文書、臨床試験結果、および／またはこれらの要約等を含んでもよく、これらは、組成物の活性および／もしくは利点を示す、もしくは確立する、かつ／または投薬、投与、副作用、薬物相互作用、もしくは健康治療プロバイダに有用な他の情報を記載する。そのような情報は、種々の研究、例えば、インビボモデルを含む実験動物を用いた研究、およびヒト臨床試験に基づく研究の結果に基づいてよい。本明細書中に記載されるキットは、医師、看護師、薬剤師、および処方職員等が挙げられる健康プロバイダに提供、販売、かつ／または販売促進されてよい。キットはまた、一部の実施形態において、消費者に直接販売されてもよい。

更なる定義
「核酸」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡ）、またはＤＮＡ類似体もしくはＲＮＡ類似体を指す。ＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成され得る。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。

本明細書中で用いられる用語「標的核酸」または「標的配列」は、標的核酸配列を含有する核酸を指す。標的核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、多くの場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体、またはそれらの組合せである。「標的核酸配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、一本鎖核酸の配列の全てまたは一部を含む特異的な配列を意味する。標的配列は、核酸鋳型内にあってよく、これは、一本鎖核酸または二本鎖核酸のあらゆる形態であってよい。

本明細書中で用いられる用語「増幅」およびその変形は、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分の複数のコピーまたは相補体を生産するあらゆるプロセスを含み、前記ポリヌクレオチドは典型的に、鋳型と呼ばれる。鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。鋳型は、精製または単離された核酸であってもよいし、精製も単離もされていなくてもよい。所与の鋳型の増幅により、ポリヌクレオチド増幅産物の集団が生じ得、これは一括して「アンプリコン」と呼ばれる。アンプリコンのポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいし、双方の混合物であってもよい。典型的には、鋳型は、標的配列を含むこととなり、結果として生じたアンプリコンは、標的配列と実質的に同一であり、または実質的に相補的である配列を有するポリヌクレオチドを含むこととなる。一部の実施形態において、特定のアンプリコンのポリヌクレオチドは、互いに実質的に同一であり、または実質的に相補的である；これに対して、一部の実施形態において、所与のアンプリコン内のポリヌクレオチドは、互いに異なるヌクレオチド配列を有してもよい。増幅は、直線的に、または指数関数的に進み得、繰り返される連続的な所与の鋳型の複製を伴って、２つ以上の増幅産物を形成することができる。一部の典型的な増幅反応は、鋳型ベースの核酸合成の連続的に繰り返されるサイクルを伴って、鋳型の少なくとも一部のヌクレオチド配列を含有し、かつ鋳型との少なくともある程度のヌクレオチド配列同一性（または相補性）を共有する複数の娘ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態において、核酸合成のそれぞれの例（増幅の「サイクル」と呼ばれ得る）は、フリーな３’末端を（例えば、ｄｓＤＮＡの一方の鎖にニックを入れることによって）生じさせることによって、プライマーおよびプライマー伸長工程を生じさせることを含む；場合によっては、鋳型が部分的にまたは完全に変性する付加的な変性工程が含まれてもよい。一部の実施形態において、増幅の１ラウンドは、所与の繰返し数の増幅の単回サイクルを含む。例えば、増幅の１ラウンドは、特定のサイクルの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の繰返しを含んでよい。例示的な一実施形態において、増幅は、特定のポリヌクレオチド鋳型が核酸合成の２つの連続サイクルにかけられるあらゆる反応を含む。合成は、鋳型依存的な核酸合成を含み得る。

用語「プライマー」または「プライマーオリゴヌクレオチド」は、核酸合成用の鋳型核酸の組成に従って、鋳型核酸にハイブリダイズし、かつ伸長ヌクレオチドを組み込むための開始点として作用することができる核酸またはオリゴヌクレオチドの鎖を指す。「伸長ヌクレオチド」は、増幅中に伸長産物中に組み込まれ得るあらゆるヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）を、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、ＲＮＡの誘導体を指し、これらは標識を含んでもよい。

本明細書中で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチド、典型的には３００ヌクレオチド長以下（例えば、５から１５０ヌクレオチド長の範囲、好ましくは１０から１００ヌクレオチド長の範囲、より好ましくは１５から５０ヌクレオチド長の範囲）を指す。しかしながら、本明細書中で用いられる用語は、より長い、またはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図される。「オリゴヌクレオチド」は、他のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るので、ポリヌクレオチドの検出用のプローブ、またはポリヌクレオチド鎖の伸長用のプライマーとして機能し得る。

本明細書中で用いられる用語「プローブ」は、１つまたは複数のタイプの化学結合によって、通常、相補的な塩基対形成によって、通常、水素結合形成によって、相補的な配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合し得る。標的配列と、本明細書中に記載される一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションに干渉することとなる塩基対ミスマッチはいくつ存在してもよい。しかしながら、最も低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下ですらハイブリダイゼーションが起こり得ないほど突然変異数が多ければ、配列は、相補的な標的配列でない。プローブは、一本鎖であってもよいし、部分的に一本鎖であり、かつ部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖の状態は、標的配列の構造、組成、および特性によって決定される。プローブは、直接的に標識されてもよいし、ストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチン等の標識で間接的に標識されてもよい。

「標識」または「レポーター分子」は、核酸（単一のヌクレオチドが挙げられる）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質リガンド、例えば、アミノ酸もしくは抗体を標識するのに有用な化学的部分または生化学的部分である。例として、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、クエンチング剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子、および当該技術分野において知られている他の部分が挙げられる。標識またはレポーター分子は、測定可能なシグナルを発生させることができ、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド（例えば非天然ヌクレオチド）、またはリガンドに共有結合的に結合してもよいし、非共有結合的に結合してもよい。

核酸に言及するために本明細書中で用いられる「相補体」または「相補的な」は、核酸分子のヌクレオチド間またはヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック塩基対形成（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）を意味してもよいし、フーグスティーン塩基対形成を意味してもよい。完全な相補体または完全に相補的な、は、核酸分子のヌクレオチド間またはヌクレオチド類似体間の１００％相補的な塩基対形成を意味してよい。

「ハイブリダイゼーション」もしくは「ハイブリダイズする」、または「アニールする」は、特定のハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、完全に、または部分的に相補的な核酸鎖同士が、パラレルな、または好ましくはアンチパラレルな配向で一体となって、２つの構成鎖が水素結合によって結合されている安定した二本鎖構造または二本鎖領域（時折「ハイブリッド」とも呼ばれる）を形成する能力を指す。典型的には、アデニンとチミンまたはウラシルと（ＡとＴまたはＵと）の間で、またはシトシンとグアニンと（ＣとＧと）の間で水素結合が形成されるが、他の塩基対が形成されてもよい（例えば、非特許文献２０）。

用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、プローブまたはオリゴマーが、その意図される標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、かつ別の配列には特異的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、周知の因子、例えば、ＧＣ含量および配列の長さに応じて変化し得、そして、分子生物学の当業者に周知の標準的な方法を用いて予測、または実験に基づいて決定され得る（例えば、非特許文献２１）。

「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は典型的には：（１）洗浄に低いイオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃にて使用し；（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．５による）を、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと４２℃にて使用し；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波破壊されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃にて使用して、４２℃での０．２×ＳＳＣ中および５５℃での５０％ホルムアミド中の洗浄の後に、５５℃での、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が続く。

「適度にストリンジェントな条件」は、従来通りに同定され得、先に記載されるストリンジェント条件未満の洗浄溶液条件およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、およびＳＤＳ％）の使用を含み得る。適度にストリンジェントな条件の例が、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ剪断変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での一晩のインキュベーションの後に、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中のフィルタ洗浄が続くものである。当業者であれば、温度、イオン強度その他を、必要に応じて、因子、例えばプローブ長に適合するように、メーカーの説明（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムの説明参照）を用いて調整する方法を理解し得る。

用語「サンプル」は、生物（例えば患者）から、または生物の構成要素（例えば細胞）から得られるサンプルを指す。サンプルは、あらゆる生物学的組織、細胞、または流体のものであってよい。サンプルは、対象、例えばヒト患者または獣医学的対象に由来するサンプルである「臨床サンプル」であってよい。そのようなサンプルとして、唾液、痰、血液、血球（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、ならびに、組織サンプルもしくは細針生検サンプル、尿、腹水、および胸水、またはそれら由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。生体サンプルとして、組織の切片、例えば、組織学的目的で採られた凍結切片もまた挙げられ得る。生体サンプルは、「患者サンプル」と呼ぶこともできる。生体サンプルとして、実質的に精製され、または単離された核酸、タンパク質、膜調製物、または細胞培養体もまた挙げられ得る。

用語「判定」、「測定」、「評価」、「試験」、および「アッセイ」は、互換的に用いられ、定量的測定および定性的測定の双方を含み、そして特性、形質、または特徴が存在するか否かを判定することを含む。評価は、相対的であっても絶対的であってもよい。標的の存在を評価することは、存在する標的の量を判定すること、および存在するか不在であるかを判定することを含む。

本明細書中に開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。文脈上明らかに他の値に規定すべき場合を除いて、その範囲の上限と下限との間に介在する値はそれぞれ、下限の１０分の１単位までも具体的に開示されていると理解される。示される範囲において示されるあらゆる値または介在する値と、当該示される範囲において示される他のあらゆる値または介在する値との間のより小さな範囲はそれぞれ、本発明の範囲内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、当該範囲において含まれてもよいし、除外されてもよく、そして、より小さな範囲に上限および下限のいずれかが含まれる、いずれも含まれない、または双方が含まれる範囲もまたそれぞれ、当該示される範囲において具体的に除外されるあらゆる上限および下限に基づいて、本発明の範囲内に包含される。示される範囲は、上限および下限の一方または双方を含む場合、当該含まれる上限および下限のいずれか一方または双方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

用語「約」は概して、示された数のプラスマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％から１１％の範囲を示してよく、「約１」は、０．９から１．１を意味してよい。「約」の他の意味は、文脈から明らかとなり得、例えば四捨五入であれば、例えば「約１」は、０．５から１．４までを意味してもよい。

実施例１
以下の材料および方法を、以降の実施例において用いた。

マウス。全ての動物実験を、ＣＳＨＬのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルを用いて行った。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（００３８９０）から購入したＢ６．１２９−ＭｅＣＰ２^tm1.1Bird/Jマウスを本研究に用いた。ＣＢＡ／ＣａＪマウスを仔運びアッセイ（pup retrieval assays）に用いた。

薬物投与。ＣＰＴ１５７６３３（ＣＥＰＴＹＲ Ｉｎｃ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）およびＵＡ０７１３（ＴＣＲＳ ＬＬＣ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＰＡ）を滅菌生理食塩水溶液中に溶解して、腹膜内にまたは皮下に投与した。ＣＰＴ１５７６３３を、毎日５ｍｇ／体重ｋｇの単回用量で与え、ＵＡ０７１３を、１日おきに５ｍｇ／ｋｇの用量で与えた。ＷＴおよびＭｅｃｐ２^-/yの雄マウスで、化合物投与をＰ２にて開始し、そしてＷＴおよびＭｅｃｐ２^-/+の雌マウスで、化合物投与を１０週齢で開始した。

抗体および試薬。特に明記しない限り、全ての試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。研究に用いた抗体は、以下に対するものであった：ＰＴＰ１Ｂ（Ｃａｔ＃０４−１１４０、ＥＰ１８４１Ｙ（クローン）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、４Ｇ１０（Ｃａｔ＃０５−３２１、４Ｇ１０（クローン）、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐＹ１１６２／１１６３−ＩＲβ（Ｃａｔ＃７００３９３、９７Ｈ９Ｌ７（クローン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＲ−Ｂ（Ｃａｔ＃ｓｃ−７１１、Ｃ７１１（クローン）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｆｌａｇ（Ｃａｔ＃Ｆ３０４０、Ｍ１（クローン））およびＡｃｔｉｎ（Ｃａｔ＃Ａ２２２８、ＡＣ−７４（クローン）（Ｓｉｇｍａ）、ＩＲＳ１（Ｃａｔ＃２３８２、５９Ｇ８（クローン））、ｐＴ３０８ＡＫＴ（Ｃａｔ＃１３０３８、Ｄ２５Ｅ６（クローン））、ｐＳ４７３ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４０５１、５８７Ｆ１１（クローン））、ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４６９１、Ｃ６７Ｅ７（クローン））、ｐＴＦＯＸＯ１（Ｃａｔ＃２５９９、４Ｇ６（クローン））、ＦＯＸＯ１（Ｃａｔ＃２８８０、Ｃ２９Ｈ４（クローン））、ｐ−ＧＳＫ３Ｂ（Ｃａｔ＃８４５２、Ｄ１Ｇ２（クローン））、ＧＳＫ３Ｂ（Ｃａｔ＃１２４５６、Ｄ５Ｃ５Ｚ（クローン））、ｐＹ７０５／７０６ＴＲＫＢ（Ｃａｔ＃４６２１、Ｃ５０Ｆ３（クローン））、ｐＹ５１５ＴＲＫＢ（Ｃａｔ＃４６１９、Ｃ５３Ｇ９（クローン））、ＴＲＫＢ（Ｃａｔ＃４６０３、８０Ｅ３（クローン）、ならびにＭＥＣＰ２（Ｃａｔ＃３４５６、Ｄ４Ｆ３（クローン）（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。コントロールおよびレット患者由来の線維芽細胞を、Ｃｏｒｒｉｅｌｌレポジトリから得た。ＴＲＫＡおよびＴＲＫＣの発現構築体を、Ｍｏｓｅｓ Ｃｈａｏ博士（ＮＹＵ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ＮＹ）からいただいた。

代謝測定。ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈ Ｂａｓｉｃ；Ｌｉｆｅｓｃａｎ、ＣＡ）を用いて、尾部の血中グルコースを測定した。グルコース耐性試験（ＧＴＴ）のために、マウスを１０時間断食させてから、２０％Ｄ−グルコース（２ｍｇ／体重ｇ）を注射して、血中グルコースを、注射の直前に、そして注射後１５、３０、６０、および１２０分にて監視した。インシュリン耐性試験（ＩＴＴ）のために、４時間断食させた動物にインシュリン（０．７５ｍＵ／ｇ）を与え、血中グルコースを、注射の直前に、そして注射後３０、６０、および１２０分にて測定した。血清インシュリン、コレステロール、トリグリセリド（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｓ、ＴＸ）、ＢＤＮＦ（Ａｂｎｏｖａ）、ＩＧＦ１およびＩＧＦＢＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、酵素結合免疫吸着アッセイによって判定した。

ＣｈＩＰおよび定量ＰＣＲ。ＣｈＩＰのために、ＷＴ雄マウス由来の３つのマウス脳全体を用いた。簡潔に、急速冷凍した脳をすり潰して、粉末に１％ホルムアルデヒドを加えた。固定を室温にて１５分間続けて、０．１２５Ｍグリシン溶液で終わらせた。細胞を、ダウンス型ホモジェナイザ内でペレット化し、かつ均質化した。遠心分離後、細胞を、５ｍｌの溶解バッファ（１０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．２％ＮＰ−４０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、コンプリートプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁した。溶解物を２５ゲージニードルに通して塊を除去し、５ｍｌの溶解バッファ中でさらに１５分間インキュベートした。５分間の遠心分離（４，０００×ｇ）によって核を回収し、ペレットを２ｍｌの核溶解バッファ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁した。核を室温にて５分間溶解させて、１ｍｌのＣｈＩＰ希釈バッファ（２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトン、プロテアーゼ阻害剤）中に希釈した。クロマチンを超音波で破壊した（５分、デューティサイクル５０、出力８）。超音波処理後、クロマチンを遠心分離によって除去し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓａｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で予め除去し、抗ＭｅＣＰ２抗体で一晩免疫沈降させた。抗体沈降物を１時間、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合させて、１回（０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８］）、ＣｈＩＰ洗浄バッファＩで３回（０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８］）、ＣｈＩＰ洗浄バッファＩＩＩで１回（０．２５Ｍ ＬｉＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコレート、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８］）、そしてトリス−ＥＤＴＡで３回洗浄した。

ＤＮＡ抗体沈降物を１％ＳＤＳ、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムで２回溶出し、架橋結合を６５℃で６時間反転させた。ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ｐｃｒ精製キットで精製した。最終溶出液から、２μｌをＰＣＲに用いた。遺伝子発現研究のために、総ＲＮＡをＷＴ雄マウスおよびＭｅｃｐ２−ｎｕｌｌ雄マウスから抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７０−８８９０）によりｃＤＮＡを合成した。ＷＴおよびＭｅｃｐ２−ｎｕｌｌの脳サンプルから合成したｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ機器を使用する定量ＰＣＲに用いた。ＲＴプロファイラＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３３０２３１−００６ＺＡおよび３３０２３１−００３０ＺＡ）を用いて、インシュリンシグナリング経路およびグルコース代謝における遺伝子発現の変化を見た。

ＰＴＰ１Ｂの基質としてのＴｒｋＢの同定。生理食塩水および／またはＰＴＰ１Ｂ阻害剤で処置したＷＴ雌マウスおよびＭｅｃｐ２^-/+雌マウスから得た脳溶解物（１ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍＭパーバナデートの存在下で、そして不在下で、ビーズに結合した、Ｈｉｓ−タグを付けた野生型ＰＴＰ１ＢおよびＤ１８１Ａ ＰＴＰ１Ｂの融合タンパク質（１０μｇ／μｌ）の２０μｌとインキュベートした。数回の洗浄後、複合体をイムノブロッティングによって分析した。

仔運びアッセイ（pup retrieval assays）。仔運びアッセイを、非特許文献２２によって記載されるように実行した。

ＰＴＰ１Ｂプロモータアッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、供給会社のプロトコルに従ってトランスフェクトした。典型的には、様々な長さのプロモータを含有する１μｇのレポータープラスミドを、１μｇの、トランスフェクション効率の内部コントロールとしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクター、ｐＲＬ−Ｔｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に用いた。おおよそ１．０×１０⁵個の細胞を、２４ウェルプレートにおいて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）による各トランスフェクションに用いた。ホタルルシフェラーゼの発現用の１μｇのレポータープラスミドを用いた。ヒトＭＥＣＰ２−Ｅ１（０．１μｇ／ｍｌ）、ＭＥＣＰ２−Ｅ２（０．１μｇ／ｍｌ）の発現プラスミド、または挿入なしのコントロールプラスミド（０．１μｇ／ｍｌ）を共トランスフェクションした。細胞を、ＤＮＡ脂質複合体と２４時間インキュベートして、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性をアッセイした。

足クラスピングアッセイ（paw-clasping assay）。足クラスピングアッセイのために、マウスを尾部によって吊り下げて、３０秒間観察した。動物が足をつかんだ期間を用いて、パーセンテージ（足クラスピング（％）＝足をつかんで過ごした時間（秒）／３０（秒））×１００）を算出した。齢がマッチしたマウス（Ｍｅｃｐ２^-/+ビヒクル、ｎ＝１８；ＣＰＴ１５７６３３処置、ｎ＝１８）を用いた。エラーバーは、ＳＥＭを表す。統計的分析は、ペアｔ検定、Ｐ＝０．００１を用いて実行した。

ロータロッドパフォーマンス。角速度上昇ロータロッド系（Ａｃｃｕｓｃａｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を１２〜１４週齢の雌マウスに用いた。速度が着実に上昇する（４〜６ｒｐｍ）３つの９０秒試験を行う試験装置に、ＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスの双方を順応させた。この順応の後、４回の試験を行った。これらの試験を翌日、順応期間なしで繰り返した。各試験について落下までの潜時を記録した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。統計的分析は、ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０１を用いて実行した。

ＮＭＲ研究用のタンパク質の発現および精製。ＰＴＰＴ１Ｂ触媒ドメイン（残基１〜３０１；ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて、非特許文献２３によって以前に記載されるように精製した。簡潔に、１ｇ／Ｌ¹⁵Ｎ ＮＨ₄Ｃｌ、１００％Ｄ₂Ｏ、および¹³Ｃ−Ｄ−グルコースまたは¹²Ｃ−Ｄ−グルコースの４ｇ／Ｌを含有するＭ９最少培地中で増殖させた大腸菌培養体において、同位体標識ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁を発現させた。約０．６のＯＤ₆₀₀になるまで、培養体を激しい振盪（２５０ｒｐｍ）下で３７℃にて増殖させた。タンパク質の発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導して、培養体を１８℃、２５０ｒｐｍにて約２０時間、インキュベートした。タンパク質収率は、ルリアブロス中で約４６ｍｇ／Ｌ、²Ｈ、¹⁵Ｎ Ｍ９培地中で約３４ｍｇ／Ｌ、そして²Ｈ、¹⁵Ｎ、¹³Ｃ Ｍ９培地中で約１７ｍｇ／Ｌであった。Ｎｉ²⁺親和性クロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６０）（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ（最終のＮＭＲバッファとして））によって、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁を精製した。

ＮＭＲ分光法。ＴＣＩ ＨＣＮ Ｚ−勾配クリオプローブを装備したＢｒｕｋｅｒ ＡｖａｎｃｅＩＩＩＨＤ ８５０ＭＨｚ分光計上で、ＮＭＲデータを２９８Ｋにて収集した。²Ｈ、¹⁵Ｎ標識タンパク質または²Ｈ、¹⁵Ｎ、¹³Ｃ標識タンパク質を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、および９０％Ｈ₂Ｏ／１０％Ｄ₂Ｏ中０．２ｍＭの最終濃度にて用いて、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁のＮＭＲ測定値を記録した。以下の８５０ＭＨｚ¹Ｈのラーモア頻度での実験を用いて、ＣＰＴ１５７６３３が結合した状態のＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁の配列特異的バックボーンアサインメントを達成した：２Ｄ［¹Ｈ，¹⁵Ｎ］ＴＲＯＳＹ、３Ｄ ＴＲＯＳＹ−ＨＮＣＡ、および３Ｄ ＴＲＯＳＹ−ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ。アサインメントおよび滴定スペクトルを、Ｔｏｐｓｐｉｎ ３．１（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で処理し、データを、ＳＰＡＲＫＹ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅ／ｓｐａｒｋｙ／）を用いて評価した。

阻害剤結合のＮＭＲ分析。０．１：１、０．２：１、０．４：１、０．５：１、１：１、１．５：１、３：１、および５：１のＣＰＴ１５７６３３：ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁のモル比にて２００μＭ［²Ｈ，¹⁵Ｎ］−ＰＴＰ１Ｂ中にＣＰＴ１５７６３３を滴定し、各滴定点について２Ｄ［¹Ｈ，¹⁵Ｎ］ＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。ＣＰＴ１５７６３３は水中で１００ｍＭにて可溶化した。以下の等式を用いて、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁スペクトルとＣＰＴ１５７６３３が結合したＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁（１．５：１のモル比）スペクトルとの化学シフト差（Ｄｄ）を算出した：

ＣＰＴ１５７６３３が結合したＰＴＰ１Ｂの全化学シフトを、ＢｉｏＭａｇＲｅｓＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｍｒｂ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ）に寄託した（受託番号２５３７５）。

結晶化および構造の判定。ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁を、先に記載したように精製した（同上）。但し、最終のタンパク質バッファが、２０ｍＭトリス ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰであることを例外とした。ＣＰＴ１５７６３３（１０：１のモル比）をＰＴＰ１Ｂに加えて、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁：ＣＰＴ１５７６３３を形成し、結晶化のためにタンパク質：リガンド複合体を５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁：ＣＰＴ１５７６３３の結晶を、０．１Ｍトリス、ｐＨ７．４、２０％ＰＥＧ８０００、０．２Ｍ ＭｇＣｌ₂中に得た。初期の小結晶を、同じ母液中の以降の結晶化試験のためのシードとして用いた。３０％グリセロールおよび１０％ＣＰＴ１５７６３３（１００μＭ）を補った母液中での１０秒の浸漬によって結晶を凍結防止処理し、液体窒素中で直ちに急速凍結した。Ｒｉｇａｋｕ ＦＲ−Ｅ＋Ｓｕｐｅｒｂｒｉｇｈｔを用いて、銅陽極Ｘ線発生装置を回転させて、Ｘ線データを単結晶上で１１２Ｋにて、Ｓａｔｕｒｎ ９４４ ＨＧ ＣＣＤ検出器（Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）により収集し、データを１．９Åに処理した。サーチモデルとしてＰＴＰ１Ｂ（ＰＤＢＩＤ：１Ｃ８８（非特許文献２５））を用いる分子置換（ＰＨＥＮＩＸにおいて実施されるＰｈａｓｅｒ（非特許文献２４））を用いて、ＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁：ＣＰＴ１５７６３３データを段階的に処理した。結合したＣＰＴ１５７６３３の明確な電子密度が、初期のマップにおいて見ることができた。Ｐｈｅｎｉｘ．ＡｕｔｏＢｕｉｌｄ（非特許文献２４）を用いてＰＴＰ１Ｂ₁〜₃₀₁：ＣＰＴ１５７６３３の初期モデルを構築した後に、ＰＨＥＮＩＸにおける改良の反復ラウンド、およびＣｏｏｔ（非特許文献２６）を用いる手動構築を行った。ＣＰＴ１５７６３３ ｓｍｉｌｅｓ文字列ＣＮＣ（＝Ｏ）［Ｃ＠Ｈ］（Ｃｃ１ｃｃｃ（Ｃ（Ｆ）（Ｆ）Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ）Ｏ）ｃ（Ｂｒ）ｃ１）ＮＳ（Ｃ）（＝Ｏ）＝Ｏを用いるＰｈｅｎｉｘ．ｅＬＢＯＷ（非特許文献２４）を用いて、ＣＰＴ１５７６３３リガンドのＲｅｓｔｒａｉｎｔファイルを生じさせた。データ収集および改良統計を、附表２に報告している。ＣＰＴ１５７６３３が結合したＰＴＰ１Ｂの全座標をＰＤＢに寄託した（受託番号４Ｙ１４）。

統計。全ての結果を、平均±ｓｅｍとして表す。統計的有意性を判定するのに、ＡＮＯＶＡおよびスチューデントのｔ検定（両側）を用いた；０．０５以下のＰ値を有意と考えた。グラフの全統計分析および作成は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン７；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実行した。

実施例２
グルコースおよびインシュリンの耐性試験（ＧＴＴおよびＩＴＴ）を、雄Ｍｅｃｐ２^-/yマウスおよび雌Ｍｅｃｐ２^-/+マウスの双方において実行した。ヘミ接合雄Ｍｅｃｐ２^-/yマウスはグルコース不耐性を示し、コントロール野生型マウスと比較して非常に遅い速度でグルコースを一掃した。ヘテロ接合雌Ｍｅｃｐ２^-/+マウスもまた、グルコース不耐性であることが判明した（図２Ａ）。Ｍｅｃｐ２ノックアウトマウスが、ＷＴマウスのようにインシュリンに応答するかを判定する研究を実行した。Ｍｅｃｐ２^-/yおよびＭｅｃｐ２^-/+の双方において、血中グルコースレベルは、投与したインシュリンに応答しないことが判明した（図２Ｂ）。グルコースおよびインシュリンの不耐性が、Ｍｅｃｐ２^-/yマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスの双方において観察された。しかしながら、これは雄Ｍｅｃｐ２^-/yマウスにおいてより顕著であった。このことは、Ｍｅｃｐ２発現レベルの差によって説明することができる。また、インシュリンレベルは、ＷＴ対照と比較して、Ｍｅｃｐ２^-/yマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスの双方において、より高いことも判明した。さらにこのことを特徴付けるために、Ｍｅｃｐ２^-/yマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウス双方におけるインシュリンシグナリング経路を研究した。Ｍｅｃｐ２ ＫＯマウスは、インシュリン受容体（ＩＲ−β）およびインシュリン受容体基質１（ＩＲＳ１）のチロシンリン酸化の低下によって特徴付けられるインシュリンシグナリングの低下を示すことが判明した。受容体へのリン酸化ＩＲＳ１の動員が、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化、および下流シグナリング分子、例えばＰＫＢ／ＡＫＴの刺激をトリガーし、これがグルコーストランスポータの移行、グルコース吸収、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ３β）の不活化をもたらす。それゆえに、キナーゼＡＫＴのリン酸化および下流シグナリングを研究した。ＷＴマウスと対照的に、Ｍｅｃｐ２^-/yマウスは、ＡＫＴ、ならびにその基質ＦＯＸＯおよびＧＳＫ−３βのリン酸化の減弱を示した。Ｍｅｃｐ２突然変異マウスは、インシュリンの循環レベルがより高い。しかしながら、ホルモンによって誘発されるシグナリングは阻害されている。インシュリン受容体（ＩＲ−β）、ＩＲＳ１のチロシンリン酸化の低下、およびＡＫＴの活性化の低下の類似した傾向が、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスにおいて観察された。

マウスにおけるインシュリンシグナリングをさらに調査するために、各コントロールマウスまたは各Ｍｅｃｐ２−ｎｕｌｌマウス由来の皮質を、ＲＩＰＡバッファ中に溶解し、等量の溶解物を、インシュリンシグナリング経路の種々の構成要素を認識する抗体を用いてイムノブロッティングした。図３Ａおよび図３Ｂに示すように、インシュリンシグナリングは、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスにおいて弱まった。例えば、コントロールマウスおよびＭｅｃｐ２−ｎｕｌｌマウスにおける総ＡＫＴタンパク質の量は、ほぼ同じであったが、Ｍｅｃｐ２−ｎｕｌｌマウスにおけるＡＫＴタンパク質リン酸化は有意に低下し、または無効にされた。

また、抗ＰＴＰ１Ｂ抗体を用いて、類似したイムノブロットアッセイを行った。ＭＥＣＰ２の欠損が、皮質におけるＰＴＰ１Ｂの発現の増大を伴うことが判明した。図４参照。

インシュリン経路においてＭｅｃｐ２によって特異的に調節される遺伝子を同定するために、前脳領域における遺伝子発現分析を実行した。Ｍｅｃｐ２^-/y（ＫＯ）およびそのＷＴ同腹子から得た脳から、総ＲＮＡを単離した。インシュリンシグナリングおよびグルコース代謝に関係する重要な遺伝子の定量ＰＣＲを実行した（図５Ａおよび図５Ｂ）。Ｍｅｃｐ２^-/yの発現がＷＴと比較して１．５倍を超えるまで変化した遺伝子を選択した。ＫＯマウスにおいて４遺伝子が有意に上方制御され、５遺伝子が下方制御されることが判明したので、インシュリンシグナリング経路に集中した。Ｐｔｐｎ１がＭｅｃｐ２の直接的な標的であるかを試験するために、ルシフェラーゼの発現がＰｔｐｎ１プロモータ要素によって駆動される一連のレポータープラスミドを用いた。様々な長さのＰｔｐｎ１プロモータ配列およびＭｅｃｐ２（Ｍｅｃｐ２−Ｅ１およびＭｅｃｐ２−Ｅ２）のいずれかのアイソフォームを含有するレポータープラスミドを発現させた。Ｍｅｃｐ２のないプロモータ構築体だけを発現した細胞と対照的に、Ｍｅｃｐ２の双方のアイソフォームは、Ｐｔｐｎ１プロモータ活性を抑制することができることが観察された（図５Ｃ）。さらに、野生型ＭＥＣＰ２とは異なり、タンパク質、ＭＥＣＰ２−Ｒ１６８Ｘの、臨床的に関連する機能喪失突然変異型の発現は、ＰＴＰＮ１プロモータ活性を抑制しなかった（図５Ｃ）。

データは、Ｐｔｐｎ１がＭｅｃｐ２の直接的な標的であることを示す。Ｍｅｃｐ２がＰｔｐｎ１遺伝子プロモータと相互作用することをさらに確認するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実行した。Ｍｅｃｐ２がＰｔｐｎ１を特異的に標的とするか試験するために、インシュリンシグナリングに関与することが示されているいくつかの遺伝子を調査した。ＣｈＩＰ分析によって試験した遺伝子のうち、Ｍｅｃｐ２が、２つのタンパク質、すなわちＰｔｐｎ１およびＥｙａ２のプロモータ領域に強く結合することが判明した。次に、Ｍｅｃｐ２突然変異マウスにおいて、ｑＰＣＲによって観察されるｍＲＮＡレベルの増大が、タンパク質レベルと相関するかを判定した。ＷＴおよびＭｅｃｐ２^-/yの脳切片由来の等量の溶解物を、Ｐｔｐ１Ｂについてイムノブロッティングした。Ｍｅｃｐ２を欠く雄マウスにおいて、ＷＴ対照と比較した場合に、Ｐｔｐ１Ｂ発現が約１．５〜２倍高いことが判明した（図５Ｄ）。同様に、Ｐｔｐ１Ｂ発現はまた、Ｍｅｃｐ２を欠く雌マウスにおいてもより高かった（図５Ｅ）。Ｍｅｃｐ２発現レベルは、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスにおいて、Ｐｔｐ１Ｂレベルと相関した。ＲＴＴ患者由来の線維芽細胞におけるＰｔｐ１Ｂレベルを調査した。ＭＥＣＰ２突然変異マウスにおける観察と一致して、レット症候群患者に由来する線維芽細胞におけるＰＴＰ１Ｂタンパク質の上昇が観察された（図５Ｆ）。

実施例３
ＰＴＰ１Ｂの活性の増進による異常なチロシンリン酸化媒介シグナリングがＲＴＴに寄与し得るかを試験するために、ホスファターゼの薬理学的阻害剤を用いた。ＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２^-/y突然変異マウスを、ＰＴＰ１Ｂの活性部位指向性阻害剤ＣＰＴ１５７６３３（５ｍｇ／Ｋｇ）、またはアロステリック阻害剤ＵＡ０７１３（５ｍｇ／Ｋｇ）で処置した。処置の２週後に、血清グルコースレベルを評価して、以前に観察したグルコース不耐性が著しく低下することが判明した（図６Ｂ）。生理食塩水処置マウスと比較した場合に、ＣＰＴ１５７６３３を投与したＭｅｃｐ２^-/yマウスの体重に少しの増量が観察された（図６Ｅ）。インシュリンの循環レベルおよびコレステロールレベルの有意な向上があった。データは、ＰＴＰ１Ｂ阻害が、代謝における全体的な向上を引き起こしたことを示している。さらに、当該処置は、生存を２倍増大させ、メジアン寿命は、生理食塩水処置マウスの４０日と比較して、ＣＰＴ１５７６３３について７５日、そしてＵＡ０７１３処置マウスについて９５日であった（図６Ａ）。小分子阻害剤がＰＴＰ１Ｂを選択的に標的としているかを試験するために、ホスファターゼの２つの真の基質、ＩＲ−ＢおよびＩＲＳ１のチロシンリン酸化を調査した。阻害剤の処置により、ＣＰＴ１５７６３３を与えていないマウスから得たサンプルと対比して、ＩＲ−ＢおよびＩＲＳ１双方のチロシンリン酸化が増進した（図６Ｃ）。ＲＴＴ徴候の改善におけるグルコース代謝の役割を理解するために、抗糖尿病性を有することが示されている３つの他の小分子阻害剤、すなわちメトホルミン、ロシグリタゾン、およびＡＩＣＡＲを試験した。３つの阻害剤はいずれも、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤ほど有効でないことが判明した（図６Ｄ）。データは、ＰＴＰ１Ｂ阻害が、インシュリンシグナリングおよびグルコース代謝だけでなく、異なるシグナリング経路をも調節していることを示しており、これは、観察される表現型の反転に重要である。さらに、阻害剤が雌Ｍｅｃｐ２^-/+マウスに影響を及ぼすかを判定した。確立されたグルコースホメオスタシスに及ぼす阻害剤投与の効果を研究した。ＣＰＴ１５７６３３投与の３週以内に、生理食塩水未処置雌マウスで観察したグルコース不耐性が改善され、Ｍｅｃｐ２^-/+は、ＧＴＴのより正常なグルコースクリアランスを示すことが判明した。一貫して、インシュリンシグナリングの向上が見られた。

実施例４
この実施例では、レット症候群の動物モデルにおいて高められたＰＴＰ１Ｂレベルの有意性を判定するために、ホスファターゼの小分子阻害剤の影響を試験した。パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として用いて、ＣＰＴ１５７６３３によるＰＴＰ１Ｂ阻害を研究した（図１３Ａ）。化合物は、親和性の高い、ホスファターゼの競合阻害剤であることが判明し（図１３Ｂ）、阻害定数（ｋ_i）は４０ｎＭであった。類似した結果が、タンパク質基質として³²Ｐ標識ＲＣＭＬを用いて得られた（図１３Ｃ）。ＰＴＰ１Ｂと比較して、ＣＰＴ１５７６３３は、６つのＰＴＰおよび２つの二重特異性ホスファターゼのパネルに対して著しく有効ではなかった（図１３Ｄ）。これは、阻害剤の効果における特異性を示している。ＰＴＰ１Ｂ−ＣＰＴ１５７６３３相互作用の構造的な洞察を得るために、生体分子ＮＭＲ分光法およびＸ線結晶解析の双方を用いた。ＰＴＰ１Ｂの触媒ドメイン由来の残基１〜３０１を、Ｄ₂Ｏベースの培地において発現させて、２Ｄ［¹Ｈ，¹⁵Ｎ］ＴＲＯＳＹスペクトルを、ＣＰＴ１５７６３３の不在下および存在下で記録した。ＮＭＲ化学シフト摂動（ＣＳＰ）マッピングは、活性部位を取り囲む残基が、タンパク質に結合するＣＰＴ１５７６３３によって最も影響を受けることを示した（図１３Ｅ、図１３Ｆ）。このことは、ＰＴＰ１Ｂ：ＣＴＰ１５７６３３複合体の結晶構造によって確認され、これは、非共有結合的な相互作用を示した。化合物によって形成される、重要な活性部位残基との静電的な相互作用が、図１３Ｇにおいて強調されている。全体として、これらのデータは、ＣＰＴ１５７６３３が、ＰＴＰ１Ｂの選択的な、可逆的な、活性部位指向性の阻害剤であることを実証している。

酵素に及ぶ影響を異なる機構によって発揮する、ＰＴＰ１Ｂの第２の阻害剤を特徴付けた。トリテルペン構造を有する化合物（いくつかはＰＴＰ１Ｂの非競合阻害剤であることが判明した）を同定した。アッセイしたこれらの化合物のうち、ＵＡ０７１３が、ＰＴＰ１Ｂの最も強力な阻害剤であることが判明した。ＵＡ０７１３は、酵素を阻害する、ＰＴＰ１Ｂの非競合阻害剤であることが観察され、ｋ_iは１５０ｎＭであった。これは、調査した８つのホスファターゼのパネルと比較して、選択性をもってＰＴＰ１Ｂを阻害した。この実施例は、ＰＴＰ１Ｂの２つの高親和性阻害剤が、構造的に異なり、そして２つの異なる機構によって酵素を阻害することを実証している。

実施例５
この実施例では、阻害剤ＣＰＴ１５７６３３とＩＧＦ１との相乗効果を調査するアッセイを実行した。簡潔に、生存試験およびグルコース耐性試験を、先に記載したのと同様に、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスおよびコントロールマウスに行った。但し、マウスを４群に分けて、ＣＰＴ１５７６３３（５ｍｇ／Ｋｇ）、ＩＧＦ１（１ｍｇ／Ｋｇ）、ＣＰＴ１５７６３３（５ｍｇ／Ｋｇ）およびＩＧＦ１（１ｍｇ／Ｋｇ）の組合せ、ならびに生理食塩水を与えたことを除く。結果を図７および図８に示す。ＩＧＦ−１およびＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、組み合わせた場合、生存およびグルコース代謝を相乗的に向上させることが判明した。

先の結果は、ＣＰＴ１５７６３３およびＩＧＦ１が、生存およびインシュリンシグナリングを相乗的に向上させたことを示す。

実施例６
この実施例では、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスにおける生存およびグルコース代謝に及ぶ効果について、付加的なＰＴＰ１Ｂ阻害剤を調査した。アッセイを、先に記載したのと同様に、ＰＴＰ１Ｂの構造的に、かつ機構的に異なる阻害剤、ＵＡ０７１３またはＵＡ００１（それぞれ５ｍｇ／ｋｇ）を用いて行った。図９および図１０において示すように、ＵＡ０７１３およびＵＡ００１の双方が、Ｍｅｃｐ２^-/-雄マウスにおける生存をＣＰＴ１５７６３３よりも向上させた。結果は、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤ＵＡ００１およびＵＡ０７１３もまた、レット症候群を処置する際に用いることができることを示している。

実施例７
ヘテロ接合雌Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、雄ｍｅｃｐ２−ｎｕｌｌマウスよりも、ヒトにおけるレット症候群に近い反映であり、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤を当該動物において試験した。第１の工程として、ＣＰＴ１５７６３３投与の効果を、グルコースホメオスタシスで試験した。雄マウスにおける観察と一致して、生理食塩水処置雌Ｍｅｃｐ２^-/+マウスにおいて直面するグルコース不耐性は、阻害剤により、処置の３週以内に改善することが観察された（図１４Ａ）。一貫して、インシュリンシグナリングの向上が観察された（図１４Ｂ）。したがって、ＣＰＴ１５７６３３による処置が、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスの神経の徴候および行動面の徴候にも影響を及ぼしたかを判定した。

足クラスピングは、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスにおいて一貫して観察される古典的な表現型であり、レット患者において一般的に注目される特徴的なハンドリンギングに類似する。非特許文献２７参照。尾部によって持ち上げると、野生型マウスは四肢を伸ばすが、対照的に、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、監視時間中、足を特に大きく動かすことなく、前足を自発的に握った。ＣＰＴ１５７６３３を投与したＭｅｃｐ２^-/+マウスは、野生型動物と同様に、足クラスピングの著しい低下を示し、足を伸ばした（図１４Ｃ）。

運動技術の退行もまた、患者における、レット症候群と関連する一般的な徴候の１つであり、これはＭｅｃｐ２^-/+マウスにおいても観察される。ＰＴＰ１Ｂの阻害が、運動技術を向上させるかを試験するために、生理食塩水処置済み、そしてＣＰＴ１５７６３３処置済みのＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスを、ロータロッドパフォーマンス試験にかけた。ＷＴマウスと比較すると、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、ロータロッド上での活性レベルがより低いことを示した。ＷＴマウスの４回の連続試験では、回転ロッド上で費やした時間に劇的な向上が観察されたが、生理食塩水で処置したＭｅｃｐ２^-/+マウスでは向上が観察されなかった。しかしながら、ＣＰＴ１５７６３３処置Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、パフォーマンスの有意な向上を示したが、これは部分的な回復であり、野生型レベルのパフォーマンスを達成しなかった（図１４Ｄ）。さらに、ＣＰＴ１５７６３３処置を一週間止めて運動能力を再試験すると、処置により生じる運動能力の向上が失われていることが観察された。このことは、ＣＰＴ１５７６３３の効果が可逆的であることを示しており、化合物による長期にわたる処置は、これらのマウスにおいて副作用がないように思われる。

実施例８
この実施例では、仔運びアッセイを用いて、行動に及ぼすＰＴＰ１Ｂ阻害剤ＣＰＴ１５７６３３の効果を調査するために、行動分析を実行した。

妊娠中の母親と共に３週間収容した場合のＷＴマウスは、仔マウスを仔運びするときの完全な母体行動をとり、この行動は、仔のにおい、および声による苦痛コールによってトリガーされると考えられている。ＷＴマウスと対照的に、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、母親から母性行動を学習せず、このことは、Ｍｅｃｐ２発現が、母性行動の学習および効率的な履行に必要とされることを示唆している。それゆえに、行動に及ぼすＰＴＰ１Ｂ阻害の効果を理解するために、生理食塩水処置Ｍｅｃｐ２^-/+マウスおよびＣＰＴ１５７６３３処置Ｍｅｃｐ２^-/+マウスの行動を研究した。仔に向ける雌マウスの母性行動の１つが仔運びであり、これは、仔をねぐらの中に戻すマウスの能力である。試験日に、４頭の仔をケージの４隅に配置して、４頭全ての仔を回収する能力を、潜時およびエラーによって測定した。完全にねぐらの中に戻された仔のみを、回収されたとカウントした。ポジティブコントロールとして母親（この仔らを研究に用いた）にアッセイを実行した。潜時について０から１までスコアリングした。０が迅速な回収であり、１が緩慢な回収であった。０．１５のスコアで仔を回収した母親との比較において、ＷＴマウスは、０．３の平均潜時スコアで仔を回収したが、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、０．７の平均潜時で回収した（図３Ｅ）。ＣＰＴ１５７６３３で２週間処置したＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスに、同じアッセイを実行した。生理食塩水処置Ｍｅｃｐ２^-/+マウスで観察された０．７のより長い潜時と比較した場合、ＣＰＴ１５７６３３処置は、ＷＴマウスが仔を回収する割合において僅かな向上をもたらし、仔を回収するＭｅｃｐ２^-/+マウスの能力の有意な向上があり、潜時の引下げは０．３であった（ＣＰＴ１５７６３３処置）（図１３）。データは、ＰＴＰ１Ｂ阻害が、Ｍｅｃｐ２^-/+マウスにおいて仔運び行動を救うことができることを示している。ゆえに、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、レット症候群の患者の学習能力および神経機能を向上させるのに用いることができる。

実施例９
ＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２ノックアウトマウスにおける脳内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の量を定量化した。Ｍｅｃｐ２^-/yマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスの双方において、ＢＤＮＦのレベルは、コントロールＷＴマウスと比較して、約３０％しか引き下げられなかった（図１２Ａ）。ＢＤＮＦ受容体トロポミオシン関連キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）のチロシンリン酸化および活性化を調査した。生理食塩水処置Ｍｅｃｐ２^-/+マウスは、ＷＴマウスと比較すると、ＴｒｋＢリン酸化を引き下げたことが判明した。対照的に、ＣＰＴ１５７６３３処置は、ＷＴマウスおよびＭｅｃｐ２^-/+マウスの双方において、ＴｒｋＢリン酸化を高めた（図１２Ｂ）。ＰＴＰ１Ｂの組換えＤ１８１Ａ ＰＴＰ１Ｂ基質トラップ突然変異型を用いて、ＴｒｋＢがＰＴＰ１Ｂの直接的な基質である可能性を調査した。生理食塩水またはＰＴＰ１Ｂ阻害剤で処置したマウスから脳溶解物を生じさせて、等量の溶解物を、ＰＴＰ１ＢのＷＴ型およびＤ１８１Ａ突然変異型とインキュベートした（図１２Ｃ）。ＷＴ酵素ではなく、Ｄ１８１Ａ ＰＴＰ１Ｂ基質トラップ突然変異体が、ＰＴＰ１Ｂを免疫沈降させることができることが観察された（図１２Ｃ）。さらに、活性部位システインの酸化を促進して、その活性を阻止する、パーバナデートによるＰＴＰタンパク質の処置は、ＴｒｋＢへの結合を許さなかった。

好ましい実施形態の前述の実施例および説明は、特許請求の範囲によって定義されるような本発明の限定としてではなく、例示としてとられるべきである。先の示される特徴の多数の変形および組合せが、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱しない範囲で利用され得ることは容易に理解される。そのような変形は、本発明の範囲からの逸脱とみなされず、そのような変形は全て、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本明細書中の全ての引用文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (13)

1. レット症候群を処置する方法であって、ヒト対象に、必要に応じて、｛［２−ブロモ−４−（２−カルバモイル−２−メタンスルホニルアミノエチル）フェニル］ジフルオロメチル｝−ホスホン酸（ＣＰＴ１５７６３３）またはその誘導体もしくは類似体である治療剤の有効量を投与することを含む方法。
2. 該治療剤は、レット症候群の診断後に該対象に投与される、請求項１に記載の方法。
3. メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする遺伝子中の突然変異について該対象を試験することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 該試験は、核酸検出を含み、該核酸検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ、核酸配列決定、核酸マイクロアレイ分析、および蛍光インサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択されるアッセイである、請求項３に記載の方法。
5. 該試験は、該ＭＥＣＰ２遺伝子のコード領域およびエキソン／イントロン境界の１つまたは複数の核酸配列決定を含む、請求項３に記載の方法。
6. ＰＴＰ１Ｂの小分子阻害剤である第１の治療剤の有効量を含む第１の医薬組成物、およびレット症候群を診断するキットを含むシステム。
7. ＰＴＰ１Ｂの該小分子阻害剤は、ＣＰＴ１５７６３３である、請求項６に記載のシステム。
8. 該キットは、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）をコードする遺伝子中の突然変異を検出するための試薬を含む、請求項６に記載のシステム。
9. 該試薬は、該ＭＥＣＰ２遺伝子のコード領域およびエキソン／イントロン境界の１つまたは複数の、ＰＣＲベースの配列決定のためのＰＣＲプライマーを含む、請求項８に記載のシステム。
10. ＭＥＣＰ２遺伝子中の突然変異によって特徴付けられる神経障害の処置に用いる、ＰＴＰ１Ｂの小分子阻害剤を含む組成物。
11. 該障害は自閉スペクトラム症である、請求項１１に記載の組成物。
12. 該障害はレット症候群である、請求項１１に記載の組成物。
13. ＰＴＰ１Ｂの該小分子阻害剤は、ＣＰＴ１５７６３３である、請求項１１または１２に記載の組成物。