JP2017160187A - カスパーゼ−１４発現促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的はカスパーゼ−１４発現を促進することによって、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善、さらには日焼け防止剤有効な製剤を得ることにある。【解決手段】カミツレの抽出物、エンメイソウの抽出物、アルニカの抽出物、紅茶の抽出物、チョウジの抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分とすることによって、上記の目的を達することがわかった。【選択図】図１

Description

本発明は、カスパーゼ−１４発現を促進し、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善、さらには日焼け防止に有効な製剤に関する。

カスパーゼはCysteine-ASPartic-acid-proteASEを略したもので、システインプロテアーゼの１種であり、現在のところ１４種類知られている。
そのうち、カスパーゼ−１４は、皮膚の保湿に重要な役割を果たすフィラグリンをいくつかのペプチドに分解し、皮膚の自然保湿因子（ＮＭＦ）を維持、増大させる段階の１つとして重要な役割を担っている。(非特許文献１)
さらにカスパーゼ−１４の活性化はアトピー性皮膚炎や乾癬、接触性皮膚炎に有効なことがしられている。（非特許文献２）
また、日焼け防止剤として、カスパーゼ−１４が利用されている。（特許文献１）
さらにカスパーゼ−１４活性化剤として、アツケシソウ、桃、大豆種子、スイートバジル、キュウリ等を配合し、皮膚の湿潤、表皮分化過程の調節、皮膚バリアー強度、または外部ストレス（特に紫外線照射による外部ストレス）に対する保護に有効であることが知られている。（特許文献２）
さらに、日本人皮膚、角質層のカスパーゼ−１４の活性は、白人種皮膚、角質層に比較して半分以下であり、特に日本人にはカスパーゼ−１４活性化剤が必要とされている。（特許文献３）

カミツレ(Matricaria chamomilla）はカモミール、カモマイルとも呼ばれ、ローマンカモミールと区別する場合はジャーマンカモミールと称する。
ヨーロッパ等で健胃・発汗・消炎作用があるとして、婦人病などに用いられていた。
さらに美白化粧料、コラーゲンゲル収縮促進剤、デオドラント剤、コラーゲンゲル収縮促進剤、皮膚ダニ駆除剤等の用途が知られている。（特許文献４〜８）

エンメイソウ（延命草）はシソ科ヤマハッカ属ヒキオコシ（Isodon japonicus）の全草を乾燥した日本の民間薬で消化不良、食欲不振、腹痛等に用いられてきた。さらに、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、抗補体活性剤等、抗肥満化粧料、血小板凝集抑制作用、血管新生抑制剤、タイトジャンクション形成促進剤等の用途が知られている。（特許文献９〜１４）

キク科のアルニカ属（Arnica）の植物は、創傷治癒、抗菌作用、鎮痛作用、消炎作用等があり、リウマチや関節炎、口腔粘膜炎症、打撲、捻挫といった症状の改善に用いられている。Arnica montana、Arnica chamissonis、Arnica unalascensis等が現在薬用に利用され、部位としては主に花や根が用いられている。
さらに美白、抗アレルギー剤、ヒアルロン酸分解阻害剤、頭部用外用剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤、活性酸素消去剤等の用途も知られている。（特許文献１５〜２０）

紅茶は、茶（Camellia sinensis）の葉を原料とし、摘み取った茶葉を発酵させたものである。
勿論飲用が主な用途であるが、プラーク形成阻害剤、メラニン生成抑制剤、アレルゲン不活性化剤、ＯＰＨ活性増強剤等の用途も知られている。（特許文献２１〜２４参照）

チョウジ（丁子）は、フトモモ科の植物チョウジノキ（Syzygium aromaticum、syn. Eugenia aromatica）の花蕾を乾燥させたものであり、芳香健胃剤として利用されている。
また、クローブとも言い、香辛料として広く利用されている。
さらにう蝕予防剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤、毛髪化粧料、抗アレルギー剤等の用途が知られている。（特許文献２５〜２８参照）

国際公開第２００８／０２５８３０号 米国特許出願公開第２０１２／２３０９３０号明細書 特表２０１４−５０７４７２公報 特開平０７−０２５７４２号公報 特開平１０−０７２３３６号公報 特開２００２−２５５７７６号公報 特開２００３−１７６２０８号公報 特開２００５−０６０３２０号公報 特開平０７−１９６５２２号公報 特開平０９−０８７１８９号公報 特開平１０−２０３９９０号公報 特開２００７−１９７３８８号公報 特開２０１２−０２５７７７号公報 特開２０１３−０５６８４１号公報 特開平０８−０１２５６１号公報 特開平０９−０８７１８９号公報 特開平１０−１３０１６２号公報 特開平１１−２２８３５５号公報 特開２００６−０１６３３７号公報 特開２００６−１１７６１２号公報 特開２０００−３４４６４２号公報 特開２００１−１５８７２６号公報 特開２００８−１７４５２６号公報 特開２０１４−１１８４０６号公報 特開平５−２５５０９８号公報 特開平６−９３７１号公報 特開平８−２３１３４８号公報 特開平１０−３６２７６号公報 Hosteら、J. Invest. Dermatol. Abstract、2007、S71 Hvidら、Exp Dermatol. 2011 Aug;20(8):633-6）

本発明の目的はカスパーゼ−１４発現を促進することによって、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善、さらには日焼け防止に有効な製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、カミツレの抽出物、エンメイソウの抽出物、アルニカの抽出物、紅茶の抽出物、チョウジの抽出物が上記目的を達することがわかった。
カミツレ、エンメイソウ、アルニカ、紅茶、チョウジは、必要に応じて乾燥した後、抽出効率を考えると、細切、粉砕等の処理を行った後に抽出する。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。

抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
本発明者らが検討した結果、本発明の効果を発揮する物質は、水にも、８０％のエタノール抽出されるので、ある程度精製する場合は、水で抽出したのち、不溶物を取り除き、等量〜５倍量のエタノールを加えてさらに抽出するとよいこともわかった。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。

本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００００１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５〜１．０重量％である。

また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。

上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。

油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。

本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。

本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができる。

実施例１
カミツレ（花、乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。

実施例２
エンメイソウ（全草、乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。

実施例３
アルニカ属の植物（Arnica montana）（花、乾燥物、細断品）を５０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。

実施例４
紅茶（乾燥物、細断品）を３０ｇに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。

実施例５
チョウジ（乾燥物、細断品）を２０ｇに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液２リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。

確認試験（カスパーゼ−１４遺伝子発現試験）
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるまでＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地を１日おきに交換しながら培養後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に検体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で２日間培養した。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。

確認試験は、実施例１〜２は作用濃度０．１％で、実施例３は作用濃度０．０５％で、実施例４〜５は作用濃度０．０１％で実施した。

実施例１〜５の確認試験結果でカスパーゼ−１４の遺伝子発現量変化を示す図である。 縦軸は実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。

Claims (1)

1. カミツレの抽出物、エンメイソウの抽出物、アルニカの抽出物、紅茶の抽出物、チョウジの抽出物より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するカスパーゼ−１４発現促進剤