JP2017012163A - 耐酸性、耐胆汁性及び細胞付着能に優れたラクトバシラス・プランタラムｌｌｐ５１９３、及びこれを有効成分として含む製品 - Google Patents

Abstract

【課題】キムチから分離され、韓国人の腸内環境に対する適応性が高い植物性乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムを提供する。【解決手段】本発明はキムチから分離された新規の乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３及びこれを有効成分として含む製品に関するものである。ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は植物性乳酸菌で、韓国人の腸内環境に適し、耐酸性及び耐胆汁性に優れており腸内に確実に到逹することができ、腸管細胞付着能に優れて腸内で安定に定着することができる。また、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３に賦形剤を一定濃度で添加して製造した食品は食感及び耐摩損性が良くて剤形化に有利であり、粉末が多く発生せず、食べやすい。【選択図】 図３

Description

本発明はキムチから分離された新規の乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３及びこれを有効成分として含む製品に関するものである。ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は植物性乳酸菌で、韓国人の腸内環境に適し、耐酸性及び耐胆汁性に優れており腸内に無事に到逹することができ、腸管細胞付着能に優れており腸内で安定に定着することができる。また、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３に賦形剤を一定濃度で添加して製造した食品は食感及び耐摩損性が良くて剤形化に有利であり、粉末が多く発生せず、食べやすい。

人間は紀元前から乳酸菌を食品として用いた。乳酸菌は栄養が豊かで多様な生理活性物質を含んでいる。乳酸菌は整腸作用を有しており下痢や便秘を予防し、有害細菌の増殖を抑制して腸癌や老化を防止し、ビタミンを生成して発育を促進し、コレステロールを調節して成人病を予防し、免疫力を増強する効果がある。

また、乳酸菌から作られた食品は乳酸を含んでいるので、保存期間が長く、特有のさわやかな酸味があり、有害な微生物の増殖を抑制し、乳蛋白質の消化率を高め、カルシウム、鉄、リンの吸収を促進するなどの多くの利点がある。

現在、韓国内で使用する乳酸菌は大部分が外国から持ち込んだもので、動物の腸内、原乳などから分離した動物性乳酸菌である。韓国人は西洋人とは違い、植物性食品を主食とするため、腸内環境が違い、腸の長さが長い。したがって、動物性乳酸菌よりは野菜、果物などの植物、キムチなどの果菜類を発酵した食品から分離した植物性乳酸菌を摂取することが効果面でより良い。

大韓民国公開特許第１０−２００１−００７５５７７号は、キムチから分離したラクトバシラス・プランタラム菌株に関するものである。この従来技術によるラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は植物性乳酸菌で、韓国人にうまく適用でき、耐酸性及び耐胆汁性に優れており腸内に無事に到逹することができるという利点を持つ。しかし、乳酸菌の腸管細胞付着能に対する知見がないという問題があった。また、乳酸菌の生存率を高めるためには、耐酸性及び耐胆汁性を一層高める必要がある。

大韓民国公開特許第１０−２００１−００７５５７７号公報

本発明は、キムチから分離され、韓国人の腸内環境に対する適応性の高い植物性乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムを提供することにその目的がある。

また、本発明は、優れた耐酸性及び耐胆汁性を持ち、腸内に確実に到逹することができるラクトバシラス・プランタラムを提供することにその目的がある。

また、本発明は、腸管細胞付着能に優れて乳酸菌の効果を十分に発揮することができるラクトバシラス・プランタラムを提供することにその目的がある。

また、本発明は、ラクトバシラス・プランタラムに賦形剤を添加して食感及び耐摩損性に優れた食品を提供することにその目的がある。

本発明の目的は以上に言及した目的に制限されない。本発明の目的は以下の説明からより明らかになり、特許請求の範囲に記載された手段及びその組合せから実現可能であろう。

本発明は前記目的を達成するために下記のような構成を含む。

本発明は、キムチから分離された耐酸性、耐胆汁性及び腸管細胞付着能に優れた乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３（ＫＣＣＭ１１５９８Ｐ）を提供する。

また、本発明は、前記ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を有効成分として含む発酵乳及び凍結乾燥物を提供する。
本発明の凍結乾燥物は、デキストリン、米粉及びタピオカ澱粉からなる群から選択された一種以上の賦形剤をさらに含むこともできる。
この賦形剤として、タピオカ澱粉を３〜５重量％添加したものを用いることもできる。

本発明によるラクトバシラス・プランタラムはキムチから分離した植物性乳酸菌なので、韓国人の腸内環境に適する。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムは耐酸性及び耐胆汁性に優れて腸内に確実に到逹することができる。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムは腸管細胞付着能に優れており腸内で安定的に定着することができるので、乳酸菌としての効果を十分に発揮することができる。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムから製造した製品は食感及び耐摩損性が良くて剤形化に有利で、食べやすい。

ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の糖利用性測定結果である。 ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の配列相同性分析結果である。 ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３のＣａｃｏ−２細胞に対する細胞付着能結果である。 ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３に賦形剤を添加して製造した凍結乾燥物である。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の実施例は、発明の要旨が変更されない限り、多様な形態に変形可能である。しかし、本発明の権利範囲が以下の実施例に限定されるものではない。

本発明の要旨をあいまいにすることができると判断されれば、公知の構成及び機能についての説明は省略する。この明細書において、“含む”とは、特に他の記載がない限り、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

本発明はキムチから分離した新規の植物性乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３（寄託番号ＫＣＣＭ１１５９８Ｐ）を提供する。

近年、野菜や果物などの植物、キムチなどの果菜類を発酵した食品から分離した植物性乳酸菌が動物性乳酸菌に比べて優れた効果を持つという研究結果が相次いで発表されている。

動物性乳酸菌（牛乳発酵乳酸菌）は培地栄養分として炭水化物とともに蛋白質、脂肪などを使う。したがって、長期間の発酵過程で蛋白質と脂肪によって腐敗する菌株の数が増加する欠点がある。一方、植物性乳酸菌は培地栄養分として炭水化物のみを使うので、発酵時に腐敗しない。

また、植物性乳酸菌は動物性乳酸菌に比べて栄養分が足りない所で生存するので、低ｐＨ、高塩濃度などの苛酷な環境でも強い生存力を持ち、培養が容易であり、腸内に安定的に到逹することができるという利点がある。さらに、韓国人は植物性食品を主食とするので、植物性乳酸菌に適した腸内環境を持つ。

本発明によるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は優れた耐酸性、耐胆汁性を持つ。

乳酸菌が整腸作用及び静菌作用に役立つためには、腸内に確実に到逹しなければならない。したがって、胃酸によって死滅せずに胃を通過するために、優れた耐酸性を持たなければならなく、十二指腸の上部から分泌される胆汁酸に対しても耐性を持たなければならない。

本発明によるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は優れた細胞付着能を持つ。乳酸菌が腸内で効果を発揮するためには腸管細胞（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）に付着しなければならないので、細胞付着能が重要である。

本発明はラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３に賦形剤を一定含量で添加することで、食感が良くて食べるのに適し、摩損率が低くて剤形化に有利な凍結乾燥物を提供する。

特に、嬰児や幼児は粉末がたくさん飛ぶような食品や硬い食品を食べにくいので、本発明による凍結乾燥物を使えば嬰児や幼児のための乳酸菌含有製品を製造するのに大いに役に立つことができる。

本発明は、キムチ試料を採取し、これから耐酸性、耐胆汁性及び細胞付着能に優れた菌株を選別する過程によって選択された乳酸菌であるラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を提供する。

また、本発明は、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を特定の条件で培養した後、特定の条件で発酵して発酵乳を製造する。また、前記発酵乳に一定含量の賦形剤を添加し、特定の条件で凍結乾燥して凍結乾燥物を製造する。

前記ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は、ＭＲＳ培地または脱脂粉乳が２〜１０重量％（Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ２０〜１００ｇ／Ｌ）含む商用牛乳培地で２５〜４２℃で１８〜３６時間培養できる。

前記ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の培養液０．５〜２重量％を脱脂粉乳が２〜１０重量％含まれた商用牛乳培地に添加した後、２５〜４２℃で１２〜２４時間発酵して発酵乳を製造することができる。

前記発酵乳にタピオカ澱粉１〜５重量％を添加し、零下７０℃で２〜６時間凍結させた後、５０ｍｔｏｒｒ及び零下８０℃を維持する凍結乾燥器で１８〜３６時間凍結乾燥して凍結乾燥物を製造することができる。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１−ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の選別

（１）試料の採取

以下の［表１］のように全国各地の伝統在来市場で約１５０種のキムチ試料を採取した。

採取した試料に滅菌蒸溜水を添加して希釈液を作った後、粉砕均質器（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ、商品名Ｐｒｏ−Ｍｅｄｉａ ＳＨ−００１、ＥＬＭＥＸ社製）で試料の内部を均質化した。

前記希釈液を滅菌食塩水で段階別に希釈した後、０．１ｍｌを取った。これを０．００２重量％のＢＣＰ（Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ ｐｕｒｐｌｅ）と１．５重量％の寒天（Ａｇａｒ）が添加されたＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で維持される培養器で４８時間培養した。

培養後、黄色の環を現すコロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）を選別し、個体別に同一培地に２〜３回継代培養することによって各菌株を純粋分離した。

前記菌株を個体別にＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で４８時間再培養した後、４℃で冷蔵保管しながら使用した。

（２）菌株の選別

カコ−２（Ｃａｃｏ−２）細胞を用いて前記菌株の中で腸管細胞付着能に優れた菌株を選別した。

Ｃａｃｏ−２細胞は６−ウェルプレート（６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で接種した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件を維持する培養器で約１５日間培養し、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成したものを使った。

前記菌株をＭＲＳ液状培地に接種し、３７℃で２４時間培養した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）して菌体を回収した後、リン酸緩衝液（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を添加して菌株懸濁液を用意した。

前記菌株懸濁液を、Ｃａｃｏ−２細胞が入っている６−ウェルプレートに１ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２時間反応させた後、リン酸緩衝液で３回繰り返し洗浄した。

洗浄の終了した６−ウェルプレートにＭＲＳ液状培地２ｍｌを添加した後、滅菌されたスクレーパー（Ｓｃｒａｐｅｒ）でＣａｃｏ−２細胞及び菌株を掻き出した。これを１０ｍｌチューブに移した後、滅菌食塩水で多段希釈した。適正倍数の希釈液０．１ｍｌをＭＲＳ平板培地に接種した後、３７℃で４８時間培養した。ＭＲＳ平板培地上で培養されたコロニー数を確認して菌数を測定した。

菌株の最初に添加した菌体の濃度と洗浄後の菌体濃度をそれぞれ測定して付着率（洗浄後菌体濃度／最初菌体濃度）を確認した。一番優秀な付着率を示した菌株を最終的に選別した。

最終的に選別された菌株をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で４８時間培養して増殖させ、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分）して菌体を獲得した。前記菌体をＭＲＳ液体培地：グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が４：１の割合で含まれた凍結保存溶液（Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に１ｍｌ添加した後、クリオチューブ（Ｃｒｙｏ−ｔｕｂｅ）に入れ、−７０℃で凍結保存した。凍結保存された菌株を後続のテストのためのスターターとして使った。

実施例２−菌株の特徴分析及び同定

（１）特徴分析

選別された菌株の形態学的及び生化学的特徴を分析した。以下の［表２］を参照して、前記菌株はグラム陽性、桿菌、胞子形成能及びカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）は陰性と確認された。

（２）菌株同定

前記菌株の糖利用性をＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社製、Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。以下の［表３］及び図１を参照して、ラクトバシラス・プランタラム標準菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ １）と９９．７％一致するが、トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）に対する利用性は９６％違うことが確認された。

前記菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列は、［配列表］に示す配列番号１の通りである。塩基配列の分析結果、前記菌株はラクトバシラス属菌株と最大９９％の相同性を持つ。これは図２から確認することができる。

よって、本発明者は前記菌株を新規のラクトバシラス・プランタラム菌株に同定し、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３と名付け、韓国微生物保存センターに２０１４年１１月３日付けで寄託した（寄託番号ＫＣＣＭ１１５９８Ｐ）。

実施例３−ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の耐酸性及び耐胆汁性測定

口腔から乳酸菌を摂取すると、胃酸及び胆汁によって相当数が死滅する。したがって、小腸及び大腸まで到達する乳酸菌の数を増やすためには優れた耐酸性及び耐胆汁性が必要である。

ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３をＭＲＳ平板培地に接種して３７℃で２４時間培養した。培養されたコロニーを採取し、ＭＲＳ液状培地で３７℃で２４時間静置培養して種菌培養液を製造した。

（１）耐酸性試験

種菌培養液１％をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間培養した。取得した培養液に１０％Ｈ_２ＳＯ_４を添加してｐＨ３．０の強酸性条件にし、２時間放置した。その後、試料を多段希釈した希釈液をＭＲＳ平板培地に塗抹し、３７℃で２４時間培養し、初期生菌数とｐＨ３．０処理後の生菌数を測定した。本発明において、耐酸性は（初期生菌数／ｐＨ処理後の生菌数）の割合で示す。

（２）耐胆汁性試験

胆汁（ｂｉｌｅ）を０．１重量％、０．３重量％、０．５重量％で添加して製造したＭＲＳ平板培地を用意した。それぞれのＭＲＳ平板培地に種菌培養液を接種した後、３７℃で２４時間培養し、増殖状態を確認した。

（３）試験結果

それぞれの試験の比較群としてラクトバシラス・プランタラム標準菌株（ＫＣＴＣ２１００４、ＡＴＣＣ１４９１７）を用いた。耐酸性試験及び耐胆汁性試験の結果は以下の［表４］の通りである。

ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３はｐＨ３．０の強酸性条件下で、約２時間処理しても９９．６％の生存率を示した。また、０．５重量％の胆汁が添加された時にも生育が可能なことを確認した。

したがって、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は優れた耐酸性及び耐胆汁性を持って腸まで到逹する確率が高いため、食品または健康機能食品として摂取する場合、乳酸菌の多様な効能を効果的に発揮することができる。

実施例４−ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の腸管細胞付着能測定

以上の実施例３からラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は耐酸性及び耐胆汁性に優れており腸まで到達する割合が他の乳酸菌に比べて高いことを確認した。

しかし、乳酸菌が腸まで到達しても腸管細胞に付着しなければ遺失してしまうため、効果を正常に発揮することができない。したがって、細胞付着能が耐酸性及び耐胆汁性よりもっと重要な特性であると言える。

ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の腸管細胞付着能を定量的に測定するとともに、付着形態を顕微鏡で観察した。

（１）定量的測定

前記実施例１においてＣａｃｏ−２細胞を用いた腸管細胞付着能試験と同様の方法でラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の腸管細胞付着能を測定した。その結果は以下の［表５］の通りである。

総６回の試験を繰り返し遂行した。平均値で調べると、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３が約４．５×１０^９ＣＦＵ／ｍｌ投与されたとき、付着反応後、約５．１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌが付着していた。これから、一般的に微生物の濃度を示すログ値を取って付着率を計算したところ、約９０．２％［（８．７１ｌｏｇ／９．６５ｌｏｇ）×１００］と非常に高かった。

一般的なプロバイオティックス乳酸菌製品の摂取基準が１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ（８．０ｌｏｇ）であることを考慮すれば、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３の腸管細胞付着能が非常に優れることが分かる。

（２）顕微鏡観察

Ｃａｃｏ−２細胞を用いた付着試験において、付着反応の終了後、培養液を一部採取した。前記培養液をスライドガラスに適量移した後、グラム染色（Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ）でラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を染色した。その結果は図３の通りである。

染色されたラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３がＣａｃｏ−２細胞の周りに非常に多く付着されたことを確認することができる。

ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は耐酸性及び耐胆汁性に優れるので、腸まで安定的に到達することができ、優れた細胞付着能を持つので、腸管細胞に多数が付着することができる。したがって、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３は乳酸菌としての効果をとてもよく発揮することができる。

実施例５−ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を有効成分として含む製品の製造

（１）発酵乳の製造
ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３をＭＳ固体（ａｇａｒ）培地に接種した後、３７℃で２４時間培養して活性化した。活性化したラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３のコロニーを、牛乳１００ｍｌに脱脂粉乳を５重量％添加した培地に接種し、カード（ｃｕｒｄ）が作られるまで３７℃で約１２時間培養した。種菌培養物１重量％を脱脂粉乳が５重量％添加された牛乳１Ｌと混合した後、カード（ｃｕｒｄ）が形成されるまで３７℃で約１２時間培養して発酵乳を製造した。

（２）凍結乾燥物の製造

前記発酵乳に一定濃度の賦形剤を添加して作った凍結乾燥物の生菌数、食感及び摩損率を測定した。

前記発酵乳にデキストリン、米粉、タピオカ澱粉を１重量％、３重量％、５重量％で添加した。その混合物を成形のためのモールドに投入し、極低温冷凍機（零下７０℃維持）で２時間急速冷凍させた。これを凍結乾燥器（イルシンバイオベース、ＭＣＦＤ Ｓｅｒｉｅｓ、大韓民国）に移した後、５０ｍｔｏｒｒ、零下８０℃で１８時間凍結乾燥して凍結乾燥物を製造した。

凍結乾燥物の生菌数を測定した。凍結乾燥物を滅菌食塩水で希釈した後、適度な希釈液を取った。これをＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した後、コロニーを計数した。

凍結乾燥物の食感を測定した。任意に５人を選別し、凍結乾燥物を摂取した後、硬さを評価した。

凍結乾燥物の摩損率を測定した。凍結乾燥物をローリング機に投入した後、５０回転させた。回転前の凍結乾燥物の重量と回転後の重量を測定した。摩損率は（回転前重量−回転後重量）／回転前重量×１００で示した。

賦形剤を添加した凍結乾燥物の生菌数、食感及び摩損率の結果は以下の表６の通りである。

＊ １：硬い→５：柔らかい

賦形剤を添加することで、無添加の場合に比べて生菌数が高くなることが分かった。ただ、賦形剤の種類による違いは大きくないことが確認された。

賦形剤の添加による摩損率及び食感を調べたところ、賦形剤無添加の場合、食感は軟らかかったが、摩損率が６６．７％と高く、凍結乾燥した形態を保存することがほぼできなかった。

デキストリンと米粉を使用した場合、同一濃度のタピオカ澱粉を使用した場合に比べて食感はほぼ同じ程度であったが摩損率が高かった。一番優れた耐摩損性と食感が見られたものはタピオカ澱粉を３重量％添加した凍結乾燥物であった。

したがって、タピオカ澱粉３重量％を添加したとき、耐摩損性が良くて粉末が多く発生せず、食感が良いので、嬰児や幼児のための食品を製造することができるという利点がある。

凍結乾燥物にタピオカ澱粉を３重量％添加した実製品を図４に示した。

本発明によるラクトバシラス・プランタラムはキムチから分離した植物性乳酸菌として韓国人の腸内環境に適する。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムは耐酸性及び耐胆汁性に優れており腸内に確実に到逹することができる。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムは腸管細胞付着能に優れており腸内に安定的に定着することができるので、乳酸菌としての効果を十分に発揮することができる。

また、本発明によるラクトバシラス・プランタラムから製造した製品は食感及び耐摩損性が良いので、剤形化に有利で、粉末が多く発生せず、食べやすい。

以上、本発明について詳細に説明した。ただ、本発明の権利範囲はこれに限定されなく、以下の特許請求の範囲によって決定される。

ＫＣＣＭ１１５９８Ｐ

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Claims (4)

1. キムチから分離された耐酸性、耐胆汁性及び腸管細胞付着能に優れた、ラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３（ＫＣＣＭ１１５９８Ｐ）。
2. 請求項１のラクトバシラス・プランタラムＬＬＰ５１９３を有効成分として含む、凍結乾燥物。
3. 前記凍結乾燥物は、デキストリン、米粉及びタピオカ澱粉からなる群から選択された一種以上の賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の凍結乾燥物。
4. 前記賦形剤は、タピオカ澱粉を３〜５重量％添加したものであることを特徴とする、請求項３に記載の凍結乾燥物。