JP2016512215A - 陰イオン交換クロマトグラフィーによるビタミンｋ依存性タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、陰イオン交換樹脂材料で、高収量および高純度で、特に活性タンパク質に富む、ビタミンＫ依存性タンパク質を精製する方法、前記方法により入手可能なビタミンＫ依存性タンパク質、ならびに前記方法を実行するための手段を含むキットに関する。

Description

本発明は、陰イオン交換樹脂材料で、高収量および高純度でビタミンＫ依存性タンパク質、特に（組換え）ＦＩＸを精製する方法、好ましくは前記方法により入手可能なビタミンＫ依存性タンパク質、特にＦＩＸ、ならびに前記方法を実行するための手段を含むキットに関する。

組換え技術の出現から、多くの哺乳動物のタンパク質が、宿主細胞中で産生されており、例えば細胞を、前記タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトして、前記タンパク質の発現に好都合な条件下で組換え細胞を成長させることによって産生されている。細胞によって細胞の培養培地に分泌された、または細胞内部にあるタンパク質は、クロマトグラフ技術、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および同種のものを使用して、培養培地および他の成分から分離することができる。さらなる医薬用途のためには、純度が特に重要である。しかしながら、それと同時に、対象のタンパク質を徹底的に精製した後でもタンパク質の生物活性が保存されていなければならない。

ほぼ３０年前、陰イオン交換樹脂から２価陽イオンによってカルシウム結合タンパク質を溶出させるという概念が初めて報告された。ウシ血漿からのウシ第ＶＩＩ因子の単離には成功したが、ヒト第ＶＩＩ因子の精製はそれでもなお問題があり、すなわち産生された材料が部分的にしか純粋ではないか、または極めて少量しか得られなかった。当分野における研究者は、２価陽イオン、すなわちクエン酸バリウムにタンパク質を吸着させ、次いで陰イオン交換クロマトグラフィーでタンパク質を分離することによって十分な量で（およそ３０％の収量で）ヒト血漿からヒト第ＶＩＩ因子を単離することに成功した。さらに、従来のイオン交換樹脂、例えば陰イオン交換樹脂により、２価陽イオン、例えばカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）、バリウムイオン（Ｂａ^２＋）、およびストロンチウムイオン（Ｓｒ^２＋）を含有する溶離液を使用して、様々な特異的な活性を有するビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞培養培地からビタミンＫ依存性タンパク質を回収して精製する方法が利用可能となった。

さらに、溶液中の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を精製する方法であって、ＦＩＸを含有する溶液を陰イオン交換樹脂に適用する工程、樹脂からＦＩＸを溶出させるのに必要な導電率より低い導電率を有する溶液で陰イオン交換樹脂を洗浄する工程、および２価陽イオンを包含する第一の溶離液で陰イオン交換樹脂からＦＩＸを溶出させて、第一の溶出液を形成する工程を含む方法が利用可能となった。次いで第一の溶出液をヘパリンまたはヘパリン様樹脂に適用して、第二の溶出液を形成し、第二の溶出液をヒドロキシアパタイトに適用して、第三の溶出液を形成し、ここで洗浄工程で高い導電率の洗浄剤が利用される。

第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、ペプチダーゼファミリーＳ１に属する凝固系のビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである。ＦＩＸは、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子によって活性化されない限り不活性である。その活性化のためには、カルシウム、および膜リン脂質が必要である。ＦＩＸの欠乏は、遺伝的に劣性の出血障害である血友病Ｂを引き起こすが、これは、翻訳後修飾された、すなわちリン酸化および硫酸化されたＦＩＸの投与によってうまく処置することができる。ＦＩＸはさらに、「活性化された」（さらにプロセシングされた）ＦＩＸ、すなわちＦＩＸａに変換される可能性がある。ＦＩＸａは、所与のＦＩＸ組成物に負の影響を与える可能性があるため（例えば、文献で説明されているように、その血栓形成性を増加させることにより）、ＦＩＸ製品は、選択的に低ＦＩＸａ含量を含有するものでなければならない。「活性化された」ＦＩＸ、すなわち、さらにプロセシングされたＦＩＸであって、上述した場合により負の作用を有するＦＩＸａを、所与の対象において所望の活性を有し、例えばＦＸＩａまたはＦＶＩＩａによってそれ以上プロセシングされていないＦＩＸである活性なＦＩＸと混同しないように注意を払う必要がある。したがって、ＦＩＸ製品は、好ましくは低い含量の「活性化された」ＦＩＸａと共に、高い含量の活性なＦＩＸを有し、かつ低い含量の不活性なＦＩＸを有することが等しく重要である。可能性のある不活性なＦＩＸは、プロペプチドを有するＦＩＸ、低いガンマ−カルボキシル化を有するＦＩＸ、酸化されたＦＩＸ、脱アミド化されたＦＩＸ、不正確な三次構造を有するＦＩＸなどであり得る。

さらに、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、組織因子（ＴＦ）と共に凝固プロセスを開始させるという凝固カスケードにおいて重要な役割を果たすビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである。血管が傷害を受けると、ＴＦは血液に晒されて、ＦＶＩＩを循環させる。ＦＶＩＩは、ＴＦに結合すると、トロンビン、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＸＩＩａ因子、ならびに基質がＦＸおよびＦＩＸであるＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体によって活性化されてＦＶＩＩａになる。

したがって、本発明の根底にある課題は、高収量および高純度で、好ましくは不活性なＦＩＸを低い含量で、ビタミンＫ依存性タンパク質を精製するため改善された方法を提供することである。上記の技術的な課題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって達成される。

本発明は、好ましい実施形態（項目１）において、ビタミンＫ依存性タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）２価陽イオンの非存在下または低い２価陽イオン濃度で、陰イオン交換樹脂材料（以下、「第一の陰イオン交換樹脂材料」ともいう）にローディング緩衝液中のビタミンＫ依存性タンパク質をローディングし、続いて適宜１から３回洗浄する工程；
（ｂ）カルシウムと対陰イオンとを含む溶離液を用いて、ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出させて、ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する溶出液を形成する工程
を含み、ここで、
− 該溶離液には１〜３ｍＭのカルシウムが含まれ、
− 該溶離液は、１４〜２３ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を有し、
− 該溶離液のｐＨは、７．０から９．０の間である、精製方法に関する。

それに関して、上述したような工程（ａ）は、好ましくは、遊離の２価陽イオンの非存在下で実行される。その文脈における「遊離の」２価陽イオンは、錯体化していない２価陽イオンを意味するものとする。すなわち、例えばおよそ１ｍＭのＣａ^＋＋がＥＤＴＡに錯体化された状態で存在したとしても、それは、それでもなお（遊離の）２価陽イオンの非存在下であるとみなされると予想される。

さらに好ましい実施形態において、精製方法は、以下の工程：
（ｃ）得られた溶出液のプールを希釈して（（１）適宜それにより導電率を低下させ）、カルシウムの濃度を増加させる工程、
（ｄ）第二の陰イオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）の後に得られた溶出液をローディングする工程；および
（ｅ）ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する流出液を収集する工程
をさらに含む。

適宜行われる（ｏｐｔｉｏｎａｌ）工程ｃ（１）の導電率を低下させることは、最後の適宜行われる洗浄工程において導電率がまだ低下されていない場合にのみに必要であり、好ましくは、導電率を低下させることは、以下でより詳細に説明されるように、洗浄工程３で実行される。

以下で、不活性なビタミンＫ依存性タンパク質の分離にとって決定的であるものとして示される好ましいパラメーターの組合せを説明する。本明細書で説明される全ての本発明のパラメーターの範囲は、溶出工程（ｂ）に対して述べられる。

工程（ｂ）において：
− 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１８から２０ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１８．５から２１ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１９から２２．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、２０から２３ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１７．０ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１６から１８ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１６．５から１９．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１７．５から２１ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１９．５から２２ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１４．０から１５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１５．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
− 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１４から１６．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、または
− 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１９ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間である、項目１に係る方法。

溶出（ｂ）の特に好ましい実施形態において、導電率およびｐＨの範囲は、１ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ａの斜線の領域から選択され、一方で導電率およびｐＨの範囲は、２ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ｂの斜線の領域から選択され、一方で導電率およびｐＨの範囲は、３ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ｃの斜線の領域から選択される。

溶出（ｂ）のさらに好ましい実施形態において、導電率およびＣａ^＋＋濃度は、
− 図３Ａの斜線の領域に基づき、７．０のｐＨに関して、
− 図３Ｂの斜線の領域に基づき、８．０のｐＨに関して、および
− 図３Ｃの斜線の領域に基づき、９．０のｐＨに関して
選択される。

上述したような溶離液（すなわち溶出緩衝液）のカルシウム濃度、ｐＨおよび導電率のパラメーターは全て、重要なパラメーターである。これら全てが、陰イオン交換樹脂上で起こる溶出に干渉して、所望のタンパク質の最終的な純度に影響を及ぼす可能性がある。

極めて驚くべきことに、本発明者らはまた、有利な結果を達成するために従来技術においてこれまでに考えられていた濃度より低い濃度のＣａ^＋＋が必要であったことを示すこともできた。

本発明者らは、驚くべきことに、不活性な標的タンパク質を活性な標的タンパク質から分離しようとする場合、これらのパラメーターは、これまでに考えられていたよりもより狭い範囲で、特には互いに特異的な関係で制御される必要があることを見出した。本発明者らは、上記のパラメーターを本明細書で説明されているように制御された状態に維持することによって、例えば不活性なｒＦＩＸを活性なｒＦＩＸから分離できることを示した。特に、本発明で説明される精製スキームで、不活性なＦＩＸを効率的に分離することができた。極めて驚くべきことに、本発明者らはまた、パラメーターの範囲を、上述したように、または添付した図（ｅｎｃｌｏｓｅｄ ｆｉｇｕｒｅｓ）の斜線の領域で示されるように固定している限りは、ローディング／洗浄から第一の陰イオン交換材料での溶出へのｐＨのシフトは必要ないことも示すことができた。

「活性なＦＩＸ」は、所与の対象において所望の活性を有するＦＩＸである。本発明者らは、これは単なる仮説であり、それにとらわれるべきでもないが、活性なＦＩＸは、全長の単一鎖の分子であり、Ｎ末端にガンマカルボキシル化を持ち、完全な構造的完全性（正しくジスルフィド結合した二次および三次構造）に加えてグリコシル化を有するプロ−ＦＩＸを含まないと考えている。「不活性なＦＩＸ」は、所与の対象において所望の活性を有さないＦＩＸである。１つの考えられる理論によれば、不活性なＦＩＸは、少ないカルボキシル化、プロペプチド含量、酸化、脱アミド、構造的な崩壊、ジスルフィド結合の転換などに起因して生じる可能性がある。所与の組成物中の不活性なＦＩＸの含量は、不活性なＦＩＸの存在下ではより低い特異的なＦＩＸ活性を測定することによって決定することができる。不活性なＦＩＸのみを含有する画分は、いかなる特異的なＦＩＸ活性も全く有さないと予想される。

実験の部で、本発明者らは、第一の陰イオン交換工程（ローディングと溶出）中に、およそ２５％の割合の完全に不活性なビタミンＫ依存性タンパク質を分離して除くことができることを示すことができた。これは明らかに、例えばＣＨＯ細胞でのＦＩＸの組換え産生から生じたものなどのローディング材料は、最終的な医薬製剤中に好ましくは含まれるべきではない不活性なＦＩＸをおよそ２５％含むことを示す。本発明の好ましい実施形態において、ビタミンＫ結合タンパク質は、ＣＨＯ細胞中で組換え産生された、ＦＩＸ、ＦＶＩＩまたはＦＸから選択され、最も好ましくはＣＨＯ細胞中で組換え産生されたＦＩＸである。本発明の精製スキームにより活性なビタミンＫ依存性タンパク質から不活性なビタミンＫ依存性タンパク質を分離した後、得られた製剤は、活性なビタミンＫに富み、好ましくは不活性なビタミンＫを本質的に含まない。

このようにして、本発明の陰イオン交換樹脂でのクロマトグラフ法は、活性なおよび不活性なｒＦＩＸ（全長）ポリペプチドの分離を可能にする。

また、溶出工程（ｂ）にとっては以下の実施形態も好ましく、ここで導電率、Ｃａ^＋＋濃度およびｐＨの好ましい組合せは、添付した実験に基づいて再現される。

また添付した図の斜線の領域は、添付した実験に基づき数学的に決定することもできる。

溶出後におけるＦＩＸ Ａｇ［％］の計算
Ｌｏｇ（ＦＩＸ＿Ａｇ［％］溶出後）＝０．１５０４５６×（溶出＿ｐＨ）−０．０５８２９８１×（溶出の導電率［ｍＳ／ｃｍ］）−０．１６６３１７×（溶出のＣａ濃度［ｍＭ］）−０．５１４８８６×（洗浄２＿ｐＨ）−０．３３３００７×（洗浄２＿ＬＦ［ｍＳ／ｃｍ］）＋０．０４４５８２６×（洗浄２＿ｐＨ）×（洗浄２＿ＬＦ［ｍＳ／ｃｍ］）＋５．９０９８９（ＬＦ＝導電率）。

以下に、特に好ましい実施形態を記載する。

標的分子の結合を許容する条件下で（例えば中性ｐＨ、ＮａＣｌ＜２２０ｍＭ）、ポリペプチドの混合物を陰イオン交換樹脂上にローディングする。ｐＨ８．０で、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１８０ｍＭのＮａＣｌを用いて選択的な溶出を行う。これらの条件下では、不活性なｒＦＩＸのおよそ２５％はカラムから溶出せず、活性なｒＦＩＸが溶出する。特に、この工程で全長の不活性なＦＩＸが活性なＦＩＸから分離される。

パラメーターであるカルシウム、ｐＨおよび導電率に関して、選択的な溶出手法のロバスト性および境界を調査するために、「実験計画法」（ＤＯＥ）の研究を行った（実施例を参照）。実験および計算されたモデルから、溶出モデル中に活性なおよび不活性なＦＩＸ種のロバストな分離を確実なものにする溶出緩衝液に関するｐＨ、導電率およびカルシウム濃度のパラメーターの範囲が得られた。実験およびモデルから得られたパラメーターの範囲は、そのパラメーター設定で行われた実験の９９．７％で、活性なおよび不活性なＦＩＸ種のロバストな分離が起こると予想されるという３Ｓ範囲（３Ｓ ｒａｎｇｅ）（中心点の試行の平均値±標準偏差）に関して計算される。ＦＩＸのトランケート型をさらに分離するためには、本明細書で説明される「洗浄２」の工程が特に好適である。

したがって、本発明は、好ましい実施形態において、図１、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、または３ｃのいずれか１つで示される平均値周辺の３Ｓ範囲から選択されるパラメーターの組合せを用いた溶出工程（ｂ）も包含する。

重要なことに、上記モデルはまた、溶出手法の選択性は、カルシウム濃度が所与の範囲を超えて増加したときに失われることも示しており、それによって選択的な溶出挙動を維持する特に有利なパラメーターの組合せがもたらされる。

２． ローディングする工程の後、２価陽イオンの非存在下、ただし対陰イオンの存在下での、洗浄緩衝液（１）、（２）および／または（３）を用いた１回または複数の洗浄工程（１）、（２）および／または（３）が行われる、項目１に係る方法。

好ましい対陰イオンは、これらに限定されないが、塩化物イオン（最も好ましい）、酢酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンである。

３． ローディング緩衝液および／または洗浄緩衝液の少なくとも１つは、工程（ｂ）の溶離液のｐＨより少なくとも０．５ｐＨ単位低いｐＨを有し、好ましくはローディング緩衝液および／または洗浄工程（２）の緩衝液のいずれかは、工程（ｂ）の溶離液のｐＨより少なくとも０．５ｐＨ単位低いｐＨを有する、項目１または２に係る方法。

本明細書で説明される具体的なパラメーター条件が維持される限りは、ビタミンＫ依存性タンパク質の不活性型を活性型から分離するのに上述したｐＨのシフトは必ずしも必要ではない。

４． 工程（ｂ）における溶離液は、工程（ａ）におけるローディング緩衝液の導電率および適宜行われる洗浄緩衝液より高い導電率を有し、工程（ｃ）において補充された溶出液は、工程（ｂ）における溶離液の導電率より低い導電率を有する、項目１から３のいずれか１つまたは複数に係る方法。

好ましい実施形態において、溶出緩衝液の導電率は、１４から２３ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）の間であり、好ましくは１９〜２０ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）である。適宜行われる洗浄工程２が行われる場合（「酸性の洗浄」）、導電率は、好ましくは１４から１９ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）の間であり、より好ましくは１６から１８ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）の間であり、そうすることにより、全てのケースにおいて、上記項目４の必要条件および上記パラメーターに関して説明された範囲（すなわち図の「ｈ」の領域）が満たされると予想される。

５． 第一および第二の陰イオン交換樹脂材料は、それぞれ独立して、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタン（ＤＭＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、および四級アンモニウム（Ｑ）からなる群より選択される正電荷を有する基を有する、項目１から４のいずれか１つに係る方法。

６． 第一および第二の陰イオン交換樹脂材料はそれぞれ独立して、リガンドとして、アミノヘキシル、ベンズアミジン、リジン、およびアルギニンからなる群より選択される第一アミンを有する、項目１から５のいずれか１つに係る方法。

７． ビタミンＫ依存性タンパク質は、２価陽イオン結合タンパク質、好ましくはカルシウム結合タンパク質である、項目１から６のいずれか１つに係る方法。「カルシウム結合タンパク質」は、Ｃａ^＋＋に結合することによって例えばカルシウム細胞シグナル伝達経路に参加するタンパク質である。ビタミンＫ依存性タンパク質のカルシウム結合は、例えば活性化された血小板の負電荷を有する細胞表面へのタンパク質の結合、または例えば細胞のシグナル伝達に必要である

８．本発明のビタミンＫ依存性タンパク質は、好ましくは、Ｇｌａドメインとして広く知られているタンパク質領域中の特異的なグルタミン酸残基の存在を特徴としており、このグルタミン酸残基は、酵素のカスケード、特に補酵素としてビタミンＫを用いるガンマ−カルボキシラーゼおよびビタミン−Ｋ−オキシドレダクターゼのカスケードによってカルボキシグルタメートにカルボキシル化される、項目１から７のいずれか１つに係る方法。この反応は、酸素、二酸化炭素およびビタミンＫの還元型を必要とするビタミンＫ依存性カルボキシラーゼによって触媒される。ビタミンＫは、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）によって再利用される。

９．ビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、およびプロテインＳからなる群より選択され、特に好ましくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）および第Ｘ因子からなる群より選択される、項目１から８のいずれか１つに係る方法。

上記のタンパク質のいずれか１種は、自然源、例えば血漿、または組換え技術のいずれかによって得ることができる。

最も好ましくは、本発明は、ＦＩＸ、特に組換えＦＩＸの精製、さらにより好ましくは、ＣＨＯ細胞中の組換え発現によって産生された組換えＦＩＸの「下流」精製に関する。

１０ａ． 適宜行われる洗浄工程が行われるケースにおいては、工程（ａ）におけるｐＨは、６．８から７．５、好ましくは７．０から７．４であり、適宜行われる洗浄工程が行われないケースにおいては、そのｐＨは、５．５から６．５、好ましくは５．９から６．１である、項目１から１０のいずれか１つに係る方法。

１０ｂ 適宜行われる洗浄工程（３）のｐＨは、７．０から８．２の間であり、好ましくは７．３から８．０の間であり、さらにより好ましくは７．３から７．５の間である、項目１〜１０のいずれか１つに係る方法。

特に好ましい実施形態は、以下の工程：
− 陰イオン交換カラムに、２価陽イオンの非存在下で、７．０〜７．４のｐＨで、組換えＦＩＸ、ＦＶＩＩまたはＦＸ産生からの細胞培養上清をローディングする工程、
− 第一の洗浄、およそ５．５〜６．５のｐＨおよび１６．５〜１９ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を用いた第二の洗浄、ならびに７．３から７．５のｐＨを用いた第三の洗浄を行う工程、
− 好ましくは全て本発明のパラメーターの範囲に従って選択された、１〜３ｍＭのＣａ、１７〜２２ｍＳ／ｃｍ（２５℃）および７〜９のｐＨを含む溶出緩衝液で、溶出させる工程、
− 適宜、ウイルスを不活性化するための溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）工程を行う工程、
− 適宜、希釈して、導電率を好ましくは１５〜１８ｍＳ／ｃｍ（２５℃）に低下させる工程、
− Ｃａ^＋＋の濃度を６ｍＭに増加させ、７．６〜７．８のｐＨに調整する工程、
− 第二の陰イオン交換カラムに希釈した溶出液のプールをローディングする工程、および
流出液を収集する工程
を有する。

１１． ローディングと溶出との間に、活性物質の結合を確実なものにする条件での、例えば６．０〜８．０のｐＨおよび２００ｍＭ未満のＮａＣｌの導電率での、１回または複数の洗浄工程を含む、項目１０に係る方法。

１２． 適宜行われる洗浄工程（１）におけるｐＨは、７．３から７．５であり、適宜行われる洗浄工程（２）のｐＨは、好ましくは５．５から６．５、好ましくは５．９から６．１である、項目１から１０のいずれか１つに係る方法。

１３． 工程（ｂ）における溶出緩衝液（すなわち溶離液）は、２ｍＭのカルシウムを含有し、１８０ｍＭのＮａＣｌの添加により得られた約８．０のｐＨおよび１８〜１９ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を有する、項目１から１２のいずれか１つに係る方法。

１４． ローディングする工程（ｄ）におけるローディング緩衝液のｐＨは、ローディングする工程（ａ）におけるローディング緩衝液のｐＨ、またはローディング（ａ）の後に続く洗浄のｐＨのいずれかより高い、上記項目１〜１３のいずれかに係る、特に項目３に係る方法。

上記文脈において、また下記でも述べられるように、「ローディング（ａ）の後に続く洗浄」は、本明細書において、「酸性の洗浄」または洗浄２を指す。

ここで説明される「酸性の」洗浄は、全長タンパク質から、ビタミンＫ依存性タンパク質、例えばＦＩＸのトランケート型を分離するのに好適である。

１５． ローディングする工程（ｄ）における導電率は、ローディング（ａ）の後に続く洗浄の導電率に等しいか、またはそれより低い、上記項目１〜１４のいずれかに係る、特に項目３に係る方法。

１６． 工程（ｄ）におけるローディング緩衝液のＣａ^＋＋濃度は、工程（ｂ）における溶出緩衝液のＣａ^＋＋濃度より高い、上記項目１〜１５のいずれかに係る、特に上記項目３に係る方法。

１７． 低い導電率を有する得られた溶出液のプールを提供する工程は、適切な希釈緩衝液での希釈によって、その代わりに緩衝液の組成を変化させることによって、またはその代わりに透析、透析ろ過もしくはゲルろ過によって実行される、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。

１８． 上記項目１〜１７のいずれか１つに係る方法により得られた、ビタミンＫ依存性タンパク質。

１９． 上記項目１〜１７のいずれか１つに係る方法により得られた、（ｒ）ＦＩＸ。

２０． 少なくとも２７０ｌ．Ｕ．／ｍｇのＦＩＸ Ａｇの特異的な活性、好ましくは２７０から３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇのＦＩＸ Ａｇの特異的な活性、より好ましくは２７０から３２０Ｉ．Ｕ．／ｍｇのＦＩＸ Ａｇの特異的な活性、特に好ましくは２８０から３００Ｉ．Ｕ．／ｍｇのＦＩＸ Ａｇの特異的な活性を有する、項目１９に係る（ｒ）ＦＩＸ。

２１．約２．５〜３の対数減少値のＣＨＯ ＨＣＰの減少率を有する、項目１９または２０で規定された（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物。

２．５〜３の対数減少値は、全体のＣＨＯ ＨＣＰ減少の対数表示である。ＣＨＯ ＨＣＰ減少は、２２９（工程１から工程２）および１．７５（工程２から工程３）であり、すなわち１．７５×２２９＝およそ４４０と示されるため、それらの対数は２．６となる。

２２． ５０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ Ａｇ、好ましくは２０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ Ａｇ、さらにより好ましくは１０μｇ／ｍｇ未満のＦＩＸ ＡｇのＣＨＯ ＨＣＰ不純物を有する、項目１９もしくは２０で規定された、および／または項目２１に係る（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物。

２３． 組成物は、１０ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯのＤＮＡ、好ましくは５ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯのＤＮＡ、さらにより好ましくは１ｐｇ／ｍｌ未満のＣＨＯのＤＮＡを含む、項目１９もしくは２０に規定された、および／または項目２１または２２に係る（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物。

２４． （ｒ）ＦＩＸ組成物は、１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化されたＦＩＸ）活性／ＦＩＸ凝固活性単位、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位を含む、項目１９もしくは２０で規定された、および／または項目２１〜２３のいずれか１つに係る（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物。

１ｍＵのＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位は、１ＩＵ／ｍｌのＦＩＸ凝固活性当たりの０．１％の発色活性に等しい（後述されるアッセイ方法を参照）。

２５． 組成物は、活性な単一鎖および全長のＦＩＸ種に富んでいる、項目１９もしくは２０のいずれか１つで規定された、および／または項目２１〜２４のいずれか１つに係る（ｒ）ＦＩＸを含む医薬組成物。

好ましくは、得られた組成物は、不活性な（全長）ＦＩＸを本質的に含まない。

２６． 項目１〜１７のいずれか１つに係る方法を実行するための手段を含むキット。

２７． （ｒ）ＦＩＸ組成物は、１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化されたＦＩＸ）活性／ＦＩＸ凝固活性単位、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位を含む、項目１〜１７のいずれか１つに記載の方法により入手可能な（ｒ）ＦＩＸ組成物。

２８． 項目１９〜２５のいずれか１つで規定された特色の１つまたは複数をさらに特徴とする、項目２７に係る（ｒ）ＦＩＸ組成物。

２９． （ｒ）ＦＩＸ組成物は、１ｍＵ未満のＦＩＸａ（活性化されたＦＩＸ）活性／ＦＩＸ凝固活性単位、好ましくは０．７５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、より好ましくは０．５ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位、さらにより好ましくは０．３ｍＵ未満のＦＩＸａ活性／ＦＩＸ凝固活性単位を含む、（ｒ）ＦＩＸ組成物。

３０． 項目２０〜２５のいずれか１つで規定された特色の１つまたは複数をさらに特徴とする、項目２９に係る（ｒ）ＦＩＸ組成物。

したがって、本発明はまた、上記の方法により入手可能な精製されたビタミンＫ依存性タンパク質、および上記の方法を実行するための手段を含むキットにも関する。したがって本発明はまた、本発明の方法により入手可能な、または本発明の方法により得られたＦＩＸ、好ましくは組換えＦＩＸにも関する。本発明はまた、低含量のＦＩＸａを有する、ＦＩＸまたはＦＩＸ組成物、好ましくは組換えＦＩＸまたはＦＩＸ組成物にも関する。ＦＩＸまたはＦＩＸ組成物は、本発明の方法により入手可能なものであってもよく、または本発明の方法によって得られたものでもよく、これらは、それらの特に低含量の不活性なＦＩＸを特徴とする。

一態様において、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）２価陽イオンの非存在下または低い２価陽イオン濃度で、陰イオン交換樹脂材料（以下、「第一の陰イオン交換樹脂材料」ともいう）にローディング緩衝液中のビタミンＫ依存性タンパク質をローディングする工程、適宜それに続く１から３回の洗浄工程；
（ｂ）２価陽イオンと対陰イオンとを含む溶離液を用いて、２価陽イオンに結合しているタンパク質を溶出させて、ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する溶出液を形成する工程
を含み、ここで、
− 該溶離液には１〜３ｍＭのカルシウムが含まれ、
− 該溶離液は、１４〜２３ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を有し、
− 該溶離液のｐＨは、７．０から９．０の間である、精製するための方法に関する。

さらに好ましい実施形態において、精製するための方法は、以下の工程：
（ｃ）得られた溶出液のプールを希釈して（（１）適宜それにより導電率を低下させ）、カルシウム濃度を増加させる工程；
（ｄ）第二の陰イオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）の後に得られた溶出液をローディングする工程；および
（ｅ）２価陽イオンに結合しているタンパク質を含有する流出液を収集する工程
をさらに含む。

本発明の方法は、好ましくは、生成物が結合する様式で操作される第一のカラムと、生成物が結合しない様式で操作される第二のカラムとを有する２種の陰イオン交換カラムによる手法を使用する。

この手法の原理は、好ましい実施形態において、ビタミンＫ依存性タンパク質（例えばｒＦＩＸ）溶液を、キレート化剤、例えばＥＤＴＡの存在下で、中性または酸性ｐＨ（ｐＨ＝６．８〜７．５、好ましくは７．０〜７．４、例えば７．０〜７．２）で陰イオン交換樹脂と接触させること（すなわちそれにローディングすること）を必要とする。生成物の収量をさらに改善しようとする場合、ＥＤＴＡが、好ましい可能性がある。ＥＤＴＡは、２価陽イオンに結合しているタンパク質、例えばＦＩＸの結合を改善することができる。好ましい実施形態において、１回または複数の洗浄（例えば以下でより詳細に規定されるようなｐＨで）の後、１〜３ｍＭのカルシウムを含有する緩衝液（上記で規定されたような極めて具体的な範囲内のｐＨおよび導電率を有する）で、生成物を溶出させる。得られたビタミンＫ依存性タンパク質、例えば溶出液のプール中に含有されるｒＦＩＸは、低含量の不活性なＦＩＸを有し、それに加えて、かつ驚くべきことに、活性な全長の単一鎖ＦＩＸ種に富んでいる。

次いで、好ましい実施形態において、得られた溶出液のプールを希釈して、導電率を低下させ、カルシウム濃度を増加させる。希釈した溶液は、例えば７．６〜７．８のｐＨを有する。次いで第一の陰イオン交換による精製工程の調節された溶出液のプールは、第二の陰イオン交換カラムに移され（例えばポンプ注送され）、ここで、適用された条件下（特には、濃度を増加させた２価陽イオン、およびわずかに塩基性のｐＨ、および約１５〜２１ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）の導電率の存在下）では、例えばｒＦＩＸのようなビタミンＫ依存性タンパク質は結合しないが、それに対してタンパク質不純物は結合する。得られたビタミンＫ依存性タンパク質、例えば第二の陰イオン交換による精製のカラム流出物中に含有されるｒＦＩＸは、高純度および高い特異的な活性を有する。特に、このビタミンＫ依存性タンパク質は、特に低含量の不活性なＦＩＸを有する。

以下の図面により本発明をさらに説明する。

図１：不活性なＦＩＸ形態の除去能力に関する捕獲工程（「ＣＰＮ」）溶出緩衝液の設計空間の評価（可変パラメーター：カルシウムおよび導電率、ｐＨ＝一定）。

捕獲工程のＤＯＥ研究のためのスモールスケールにおけるロバスト性研究のデータの評価を設計し、ソフトウェアツールＭｏｄｅ（バージョン９．１）を用いて評価した。このグラフにおいて、高塩濃度洗浄中のＦＩＸ抗原の含量（溶出後＝画分）を、高塩濃度洗浄緩衝液のパラメーターである導電率およびカルシウム含量を考慮して調査した。斜線の領域は、優れた不活性な全長ＦＩＸ抗原除去能力をもたらすと予想される緩衝液の組成に関する設計空間を提示する。さらなる領域において、不活性なＦＩＸポリペプチドは、主要な生成物のプールを用いて共に溶出させることができた。

ｐＨ＝８における１〜３ｍＭ（カルシウム）および導電率に関して１４〜２３ｍＳ／ｃｍ（２５％）のパラメーター範囲内の、データ評価の等高線図。

図２：不活性なＦＩＸ形態の除去能力に関する捕獲工程（ＣＰＮ）溶出緩衝液の設計空間の評価（可変パラメーター：カルシウムおよび導電率、ｐＨ＝７〜９）。

図２Ａ：Ｃａ^＋＋＝１ｍＭ
図２Ｂ：Ｃａ^＋＋＝２ｍＭ
図２Ｃ：Ｃａ^＋＋＝３ｍＭ。

図３：実験スケールのＤＯＥ実験について範囲を試験することを包含する、ＣＰＮ工程で試験されたプロセスパラメーターの概説。

図面および実施例の部で示される本発明の実験データから導き出せるように、パラメーターである溶出緩衝液の「カルシウム濃度」は、分離と極めて高い関連を有し、パラメーターであるｐＨおよび導電率は、溶出は陰イオン交換樹脂上で起こることから、溶出にとって重要でありそれに干渉する。ｐＨおよび導電率は、溶出中の効率的な分離がうまく実行できる範囲のシフトに関与する。極めて驚くべきことに、１〜３ｍＭの低いＣａ^＋＋濃度におけるローディングからの不活性なビタミンＫ依存性タンパク質の分離を達成することが可能である。

用語「２価陽イオンの非存在下」は、本明細書で使用される場合、緩衝液中に遊離の２価陽イオンが存在しないことを指し、ここでタンパク質に結合するか、または例えばキレート化剤、例えばＥＤＴＡによって錯体化される２価陽イオンは存在する可能性がある。用語「低い２価陽イオン濃度で」は、μＭ範囲の２価陽イオン濃度を指し、特に最大で１０００μＭ、好ましくは最大で８００μＭ、さらにより好ましくは最大で５００μＭの濃度を指す。本出願に関して、用語「２価陽イオンの非存在下」は、上記の「低い２価陽イオン濃度で」に関する定義も包含するように意図されている。

すでに上述した通り、一実施形態において、タンパク質に結合したカルシウム、例えばＥＤＴＡに結合したカルシウムが許容され得る。カルシウムがタンパク質に結合している場合、それは、本発明の状況においては「不活性な」カルシウムとみなされる。したがって、そのようなカルシウムは生成物の結合に干渉しない。一方で、遊離のカルシウムは生成物の結合に干渉する可能性がある。

２価陽イオンの非存在下で、第一の陰イオン交換樹脂材料にローディング緩衝液中のビタミンＫ依存性タンパク質をローディングすること（ａ）は、当業界において公知のあらゆる方法によって実行することができる。特に、陰イオン交換樹脂材料にビタミンＫ依存性タンパク質をローディングするのに好適な条件は、当業者に周知である。生成物の結合を許容するローディング緩衝液の導電率に関する具体的な条件は、タンパク質および使用される陰イオン交換樹脂材料（例えばリガンドの密度、リガンドの提示など）の特定の特性によって決まる。２価陽イオンは、通常高度に酸性な（すなわち負電荷を有する）領域でタンパク質に結合する。２価陽イオンが結合すると、負電荷はマスキングされる。しかしながら、２価陽イオンの非存在下で陰イオン交換材料にビタミンＫ依存性タンパク質をローディングすることによって、例えば、キレート化剤、例えばＥＤＴＡにより結合した２価陽イオンを取り除くことによって、タンパク質は、陰イオン交換リガンドへの強い結合を可能にする表面上に高度に負電荷を有する区画を持つようになる。さらに陰イオン交換樹脂材料上にタンパク質をローディングするための条件は、ｐＨと対イオン、例えばＣｌ⁻の濃度とのバランスを常に必要とする。対イオンの化学的性質も溶出挙動に影響を与え、例えばＣｌ⁻は１の負電荷を有し、中性ｐＨでのリン酸イオンは２の負電荷を有する。後者は、導電率がより低い場合であっても、Ｃｌ⁻と比較してより高い溶出力を有する可能性がある。

陰イオン交換カラム１（すなわち工程（ａ））のローディングを、好ましくは、６．８〜７．５、好ましくは７．０〜７．４のｐＨで行い、それに続いて洗浄１を７．３〜７．５のｐＨで行いローディングを完了させ、洗浄２を酸性条件（ｐＨ５．５〜６．５、好ましくは５．８〜６．２、より好ましくは５．９〜６．１）で行う。さらなる実施形態において、適宜、カラムを溶出用に調製するためのｐＨ７．０〜８．２、好ましくは７．３〜８．０、例えばｐＨ７．３〜７．５での洗浄３（低い導電率での洗浄、これは、溶出の直前に実行される洗浄である）を実行してもよい。溶出は、７．５〜８．５、より好ましくは７．８〜８．２のｐＨで行われる。本発明の一実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、先行する洗浄２（高い導電率での洗浄、上述したような導電率の条件を参照）のｐＨより少なくとも０．５ｐＨ単位高い。この第二の「酸性」の高い導電率での洗浄は、それでもなお溶出の導電率より低い導電率を有する。しかしながら、添付した図面の斜線の領域、加えて上記の好ましいパラメーター範囲の説明から明らかなように、ｐＨが一定に維持されていたとしても、活性なＦＩＸからの不活性なＦＩＸの優れた分離を達成することが可能である。

一実施形態において、第一の陰イオン交換のローディングする工程は、適宜行われる洗浄工程（複数可）が行われる場合、中性からわずかに酸性のｐＨで、例えば６．８〜７．５で、好ましくは７．０〜７．４のｐＨで実行される。好ましくは、このローディングする工程に続いてｐＨ＝７．３〜７．５での第一の洗浄を行いローディングを完了させ、酸性条件（ｐＨ５．５から６．５、好ましくは５．８から６．２）での第二の洗浄および７．３〜７．５のｐＨでのでの洗浄３を行い、溶出用にカラムを調製する。第一の陰イオン交換カラムのローディングする工程のｐＨは、適宜行われる洗浄工程（複数可）が行われる場合、５．５から６．５、より好ましくはｐＨ５．９〜６．１に設定される。一実施形態において、溶出工程を実行する前に、好ましくは、ｐＨを少なくとも０．５ｐＨ単位高くする。この増加は、全ての段階で行うことができ、例えば、間に洗浄工程が実行されない場合、ローディングする工程から直接溶出工程までの間に行うことができる。代替の実施形態において、ｐＨの増加は、上述したような酸性の洗浄の後に行われる。溶出は、後述するように、好ましくは、溶出工程に関するパラメーター範囲の好ましい実施形態で説明したようなｐＨで実行される。

１回のみの洗浄工程、すなわち洗浄工程（１）が実行されるケースでは、この洗浄工程は、塩を添加せずに実行されると予想される。その結果として、ｐＨは、洗浄工程において差し迫った重要性は持たない。

好ましい一実施形態において、２回の洗浄工程、すなわち洗浄工程（１）および（２）が実行される場合、またはストリンジェントな洗浄工程（２）のみ（以下も参照）が実行される場合、このローディング緩衝液は、上記で規定されたような中性からわずかに酸性の領域のｐＨを有していてもよいが、第二の洗浄工程（すなわち洗浄工程２）が５．５から６．５、または５．９〜６．１のより低いｐＨを有していた場合に限り、本発明の原理に従って許容できると予想される。ローディングする工程がこのより低いｐＨですでに実行された場合、洗浄工程（２）も、好ましくはこのより低いｐＨを有すると予想される。洗浄工程（２）は、好ましい実施形態において、上記で規定されたような高い導電率で実行される。

さらに好ましい実施形態において、３回の洗浄工程、すなわち洗浄工程（１）、（２）および（３）が実行される場合、洗浄工程（３）は、好ましくはいかなる塩も含有しないと予想される。その結果として、２回の洗浄工程を用いたケースに関して述べられたような上記条件が規定され、溶出工程中に、好ましくはローディングおよび／または洗浄工程（２）と比較してｐＨが少なくとも０．５ｐＨ単位高い限りは、この工程におけるｐＨは重要ではないと予想される。洗浄（３）は、好ましくは、低い導電率での洗浄である（このケースにおいて、得られた溶出液の導電率がすでに低い場合、工程ｃ（１）は実行する必要はない、）。

特に好ましい実施形態において、洗浄工程（３）におけるｐＨは、溶出工程のｐＨのレベルにすでに高められている。したがって、洗浄工程（３）の好ましいｐＨは、７．０から８．２の間であり、好ましくは７．３から８．０の間であり、さらにより好ましくは７．３〜７．５である。この特定のｐＨ条件で洗浄工程（３）が行われる場合、洗浄工程（３）が行われないか、または前記工程が、異なるｐＨで、例えばおローディングならびに／洗浄工程（１）および（２）中に使用されるｐＨとそれでもなお同等に低いｐＨで行われる状況と比較して、溶出した所望の生成物に含まれる不純物の程度がさらに低下することを本発明者らは見出した。本発明者らは、この仮説に縛られることを望まないが、洗浄工程（３）のｐＨを溶出と同じｐＨに調整することにより、溶出中のｐＨ勾配が回避されると考えている。溶出中のｐＨ勾配は、一部の不純物を生成物と共に溶出させる干渉の原因となり得る。上述したような洗浄３は、溶出に有利なようにカラムを調整する。この洗浄の高いｐＨおよび低い導電率は、それに続く溶出中に不純物が共に溶出されることを防ぐ。

さらにより好ましくは、洗浄工程（３）は、極めて低い、またはゼロに近い導電率、特に溶出力を有する。このような極めて低い導電率は、好ましくは１〜１５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）であり、より好ましくは５ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ）未満であると予想される。

好ましい実施形態において、ローディングする工程（ａ）におけるローディング材料は、タンパク質、所望の生成物、およびアミノ酸、ビタミン、糖、微量金属などを包含する細胞培養培地の全ての化合物（ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｃａを包含し、約１３ｍＳ／ｃｍ（ＲＴ））を含む溶液である。ローディングする工程の後、好ましくは、洗浄工程１を実行して、次いでローディングを完了させる（好ましくは中性ｐＨの近くかまたは中性ｐＨで、低い導電率で）。その後、好ましくは第二の洗浄工程２が続いて行われ、これは、ストリンジェントな洗浄とみなされ、好ましくは低いｐＨおよび１５０から２１０、好ましくは１７０から１９０ｍＭ、最も好ましくは１８０ｍＭを用いて実行され（ＮａＣｌを用いて実行される場合、様々な塩ごとの好ましい条件は当業者の知識の範囲内と予想される）、さらに好ましい実施形態において、それに続いて溶出用にローディングされたカラムを準備する洗浄工程３が行われる。この第３の洗浄工程は、好ましくは、上記で規定されたような低い導電率およびｐＨで実行される。この洗浄工程は、カラム中の導電率を低下させて、以前の洗浄が低いｐＨであったためにｐＨを中性に戻し、さらには上述したようにカラムを溶出のｐＨに近づけるという主要なタスクがある。これらの処置は、カルシウムを用いて擬似的な親和性溶出のためにカラムを準備し、溶出緩衝液と洗浄２緩衝液との間の境界面で不純物が共に溶出されることを予防する。

溶出は、好ましくは、カルシウムと、１５０から２１０、好ましくは１７０から１９０ｍＭ、最も好ましくは１８０ｍＭのＮａＣｌとを含有する緩衝液を用いて実行される。第一の陰イオン交換カラムからの溶出にとって好ましいパラメーター範囲に関して上述したように、対イオン、例えばＮａＣｌの含量は、所望の導電率が得られるように調整される。上記の塩化物イオン（最も好ましい）に加えて、これらに限定されないが、例えば酢酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどの他の対陰イオンも可能であると予想される。

さらに、ビタミンＫ依存性タンパク質が陰イオン交換材料に結合するという条件下で、本発明の方法の工程（ａ）における陰イオン交換材料にビタミンＫ依存性タンパク質をローディングするのに好適なローディング緩衝液は、当業界において周知である。例えば、上述したように適宜行われる洗浄工程（複数可）が実行される場合、ローディング緩衝液は、ｐＨ６．８から７．５、好ましくはｐＨ７．０から７．４のｐＨを有していてもよい。ローディング緩衝液は、ビタミンＫ依存性タンパク質が陰イオン交換樹脂材料に結合するのに好適なあらゆる塩濃度を含有していてもよく、このような濃度は当業者によって容易に決定することができる。好ましい実施形態において、ローディング緩衝液は、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、好ましくは０．５から１０ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは１から５ｍＭのＥＤＴＡ、好ましくはおよそ２ｍＭのＥＤＴＡを含有していてもよい。また可能性のある代替のキレート剤を使用してもよく、それらは当業者に周知である。本発明の方法において陰イオン交換樹脂材料に適用され得るビタミンＫ依存性タンパク質を含有するローディング緩衝液は、例えば２０ｍＭのＭＥＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有していてもよい。ＭＥＳは、ｐＨ６の場合の緩衝剤の例であり、ｐＨ７およびそれを超える場合、例えばトリス緩衝液の使用が考えられる。好ましい実施形態において、ローディング材料は、例えばＣＨＯ細胞株での組換え産生からの細胞培養上清であり、これは基本的に炭酸塩およびアミノ酸によって緩衝化されていることから、ローディング緩衝液は必ずしも存在しなければならないとは限らない。

本発明の方法は、好ましくは、２価陽イオンの非存在下で、ローディングされた陰イオン交換樹脂材料を洗浄緩衝液で洗浄する工程を含む。この洗浄工程は、当業界において公知のあらゆる方法によって実行することができる。ビタミンＫ依存性タンパク質を本質的に溶出させることなく陰イオン交換材料から不純物を洗浄して除くのに好適な洗浄緩衝液は当業界において周知である。例えば、洗浄緩衝液は、ローディング緩衝液のｐＨより少なくとも１．０または少なくとも０．５ｐＨ単位低いｐＨを有し、好ましくは、５．５〜６．５、好ましくは５．９〜６．１である。洗浄緩衝液は、ビタミンＫ依存性タンパク質を有意な量で溶出させることなく、陰イオン交換樹脂材料を洗浄するのに好適なあらゆる塩濃度を含有していてもよく、このような濃度は当業者によって容易に決定することができる。例えば、洗浄緩衝液は、例えばビストリス、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液のような好適な緩衝化剤を含有していてもよく、好ましくは２０ｍＭビストリスを含有していてもよい。好ましくは、洗浄１および３は洗浄緩衝液としてトリスを有し、一方で洗浄２はＭＥＳを有する。加えて、洗浄緩衝液は、例えばＥＤＴＡのようなキレート剤を含有していてもよく、好ましくは０．５から１０ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは１から５ｍＭのＥＤＴＡ、好ましくはおよそ２ｍＭのＥＤＴＡを含有していてもよい。さらに、洗浄緩衝液は、例えばＮａＣｌのような、洗浄緩衝液の導電率を調節するための好適な塩、例えば以下の陽イオンと陰イオンとの塩：Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｌｉ^＋、ＮＨ_４ ^＋と、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、酢酸イオンのような陰イオンとの塩を含有していてもよく、これらは、≦２００ｍＭの濃度で存在していてもよく、好ましくは１００ｍＭから２００ｍＭ、より好ましくは１５０ｍＭから２００ｍＭ、より好ましくは１７０ｍＭから１９０ｍＭ、最も好ましくは１７５ｍＭから１８５ｍＭの濃度で存在していてもよい。本出願の別の好ましい実施形態において、洗浄緩衝液は、１００から２００ｍＭのＮａＣｌを含有する。塩濃度の絶対値は、精製しようとするビタミンＫ依存性タンパク質によって決まり、最適な純度を達成するために、どのビタミンＫ依存性タンパク質がより低いまたはより高い塩濃度を必要とするかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。

好ましくは、本発明のビタミンＫ依存性タンパク質を精製するための方法によれば、第二の洗浄工程は、上述の第一の洗浄工程の後に実行される。この洗浄工程は、溶出の直前の洗浄である場合、低い導電率で実行される。この導電率は、好ましくは、ローディングおよび第一の洗浄工程における導電率より低い。さらにより好ましくは、第３の洗浄工程を行うことができる。この実施形態は、上記で詳細に説明されている。

カルシウムを含む溶離液でビタミンＫ依存性タンパク質を溶出させる工程は、当業界において公知のあらゆる方法によって実行することができる。特に、好適な対陽イオンを含有する好適な溶離液は当業界において周知である。溶出緩衝液は、洗浄緩衝液のｐＨより高いｐＨを有していてもよい。ｐＨは、好ましくは、少なくとも０．５、好ましくは１．０ｐＨ単位高い。溶出緩衝液は、本明細書に示された好ましい組合せの実施形態に従って選択されたようなｐＨ、特に図１〜３の斜線の領域内の実施形態を有していなければならない。溶出緩衝液は、不純物、特に不活性なＦＩＸを有意な量で溶出させずに、第一の陰イオン交換樹脂材料からビタミンＫ依存性タンパク質を溶出させる工程にとって好適であると本発明者らによって決定されたような塩濃度を含有する。

特に、第一の陰イオン交換カラムからの溶出工程のためにｐＨ、導電率およびＣａ^＋＋濃度のパラメーターに関するパラメーター範囲内で作業することにより、２５％もの不活性なビタミンＫ依存性タンパク質を活性なビタミンＫ依存性タンパク質から分離して、その活性なビタミンＫ依存性タンパク質含量で得られたビタミンＫ依存性タンパク質に富み、好ましくは不活性型を本質的に含まない、特に不活性な全長型を含まない製剤にすることが現在可能である。

例えば、溶出緩衝液は、例えばＨＥＰＥＳ、トリス、好ましくは２０ｍＭトリス、トリス／酢酸塩、ヒスチジン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ＭＯＰＳ、またはトリシンのような好適な緩衝化剤を、典型的には５から５０ｍＭの範囲の濃度で含有していてもよい。また溶出緩衝液は、例えばＮａＣｌのような、緩衝液の導電率を調節するための好適な塩、例えば以下の陽イオンと陰イオンとの塩：Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｌｉ^＋、ＮＨ_４ ^＋と、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、酢酸イオンのような陰イオンとの塩を含有していてもよく、これらは、１２０〜２０５ｍＭの濃度で存在していてもよい。

以下は、特に好ましい緩衝液の一覧である：
トリス：ｐＨ＝８．０６±１．０での緩衝液、
ＨＥＰＥＳ：ｐＨ＝７．７±１．０での緩衝液、
ＭＯＰＳ；ｐＨ＝７．３±１．０での緩衝液、
トリシン：ｐＨ＝８．３±１．０での緩衝液、
ヒスチジン：ｐＨ＝７．６±１．０での緩衝液、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：ｐＨ＝７．４±１．０での緩衝液、
ビストリス：ｐＨ＝６．３５±１．０での緩衝液、
ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）：ｐＨ＝７．０±１．０での緩衝液、
ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸）：ｐＨ＝７．０±１．０での緩衝液、
ＭＥＳ：ｐＨ＝およそ６．０での緩衝液。

溶出緩衝液はまた、例えばＮａＣｌのような、洗浄緩衝液の導電率を調節するための好適な塩を含有していてもよく、これらは、１２０〜２０５ｍＭの濃度で存在していてもよい。

溶出工程の後、得られた溶出液のプールを希釈して、導電率を低下させ、陰イオンの濃度、好ましくはカルシウム濃度を増加させる。この処置は、第二の陰イオン交換樹脂への生成物の結合を防ぎ、宿主細胞のタンパク質の結合を容易にする条件をもたらす。このような希釈は当業者公知であり、周知の方法に従って行われる。例えば、１カラム容積の希釈緩衝液の添加は、Ｃａ^＋＋を増加させて、導電率をわずかに低下させる。希釈された溶液は、好ましくは７から８、より好ましくは７．５から７．９の最終的なｐＨを有する。

当業者は、得られた溶出液のプールの導電率を減少させるさらなる手法も、溶出液のプールを希釈して導電率を低下させることの定義に含まれることを理解している。したがって、溶出液のプールの導電率を低くするさらなる可能性は、例えば低塩緩衝液での希釈によって、または透析によって、または透析ろ過を使用することによって緩衝液の組成を変化させることと予想される。

本明細書で使用される場合、用語「陰イオン交換樹脂材料」は、具体的な限定の基礎とならない。本発明によれば、第一および第二の樹脂としては、当業界において公知の陰イオン交換クロマトグラフィーに好適なあらゆる材料が挙げられ、例えばアガロースベースのクロマトグラフィー材料、例えばＦａｓｔ ＦｌｏｗまたはＣａｐｔｏのようなセファロース、高分子合成材料、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌのようなポリメタクリレート、ポリスチレン／ジビニルベンゼン、例えばＰｏｒｏ、Ｓｏｕｒｃｅ、またはセルロース、例えばＣｅｌｌｕｆｉｎｅが挙げられる。本発明の具体的な実施例において、第一および第二の陰イオン交換樹脂材料は、改変されたアガロースをベースとするセファロースであり、その多糖鎖は架橋されて三次元ネットワークを形成している。好ましい実施形態において、第一および第二の陰イオン交換樹脂材料としては、これらに限定されないが、リガンドとして第一アミンを有する樹脂、例えばアミノヘキシルセファロース、ベンズアミジンセファロース、リジンセファロース、またはアルギニンセファロースなどが挙げられる。別の好ましい実施形態において、第一および第二の陰イオン交換樹脂材料としては、これらに限定されないが、中性ｐＨで正電荷を有する部分を有する樹脂、例えばジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタン（ＤＭＡＥ）、またはトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）のようなアルキルアミノエタン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、四級アンモニウム（Ｑ）、および同種のものなどが挙げられる。特に好ましい実施形態において、陰イオン交換樹脂材料は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）である。本発明の方法によれば、第一および第二の陰イオン交換樹脂材料は、同じであってもよいし、または異なっていてもよい。

第二の陰イオン交換工程のためのローディング緩衝液（工程ｄ）は、第一の陰イオン交換工程で上述したものと同じであってもよい。本発明に従って提供されるような２つの陰イオン交換工程間の差は、本質的に以下の通りである。

ａ）第一の陰イオン交換カラムに、出発原料、すなわち好ましい実施形態においては細胞培養材料をローディングする。これは、高度に不純物を含む出発原料である。第二の陰イオン交換カラムに、すでにある程度精製された材料をローディングし、ここでこのような材料は、溶出（および補充）工程後に得られた材料である。

ｂ）２価陽イオンの非存在下で第一の陰イオン交換カラムにローディングした後、生成物を溶出するために、２価陽イオンを用いて第一の陰イオン交換工程を実行する。

ｃ）第二の陰イオン交換のためのローディングのｐＨおよび２価陽イオンの濃度は、好ましい実施形態において、ローディング（ｄ）のｐＨがより高くなり、ローディング（ａ）後の（酸性、例えば洗浄２）洗浄または洗浄工程が使用されない場合はローディング（ａ）それ自体のいずれかのｐＨになるように選択される。さらに、ローディング（ｄ）の導電率は酸性の洗浄と等しいが、この洗浄が実行される場合、好ましくはそれより低い。２価陽イオン濃度、例えばＣａ^＋＋濃度は、ローディング（ｄ）において、工程（ｂ）の溶出緩衝液より高い。

ｄ）その結果として、第一の陰イオン交換カラムでは、生成物はカラムに結合し、第二の陰イオン交換カラムでは、生成物は結合しない。

本発明に係るビタミンＫ依存性タンパク質は、例えばカルシウム結合タンパク質のような２価陽イオンに結合しているタンパク質である。好ましい実施形態において、ビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、およびプロテインＳからなる群より選択され、特に好ましくは第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子からなる群より選択される。

ビタミンＫ依存性タンパク質のための出発原料（「サンプル」）は、当業者に公知の方法を使用して得てもよく、例えば血漿由来タンパク質、遺伝子導入により産生されたタンパク質、または例えばＣＨＯ細胞を使用して組換え産生されたタンパク質が挙げられる。細胞培養からタンパク質を抽出するための分泌による方法および分泌によらない方法が当業者に周知である。その例としては、（ｉ）遺伝子工学による、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介した組換えＤＮＡ産生、（ｉｉ）トランスフェクションによる、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介した原核または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）例えば連続式またはバッチ式での前記形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的な、または誘導による、ビタミンＫ依存性タンパク質の発現、および（ｖ）未精製ビタミンＫ依存性タンパク質を得るための、例えば培養培地からの、または形質転換細胞を回収することによるタンパク質の単離に関する当業界において公知のあらゆる方法を挙げることができる。加えて、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする組換えＤＮＡ、例えばプラスミドはまた、組換えＤＮＡでうまくトランスフェクトされた細胞を選択するための選択マーカーをコードするＤＮＡ配列を含有していてもよい。

本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法の出発原料は、ＦＩＸを含む材料、好ましくはＦＩＸまたは組換え産生されたＦＩＸを含む血漿である。ＦＩＸの組換え産生は当業界において周知である。ｒＦＩＸは、組換えＦＩＸであり、好ましい実施形態に従って細胞培養上清（ＣＣＳ）中に分泌され、次いでこのＣＣＳは本発明の方法のための出発原料として使用される。

不純物を減らすために、例えばゲル電気泳動、クロマトグラフィー、ゲルろ過、遠心分離、ろ過、沈殿、結晶化または他のあらゆる当業界において公知の方法によってタンパク質を予備精製してもよい。用語「不純物」は、本明細書で使用される場合、ビタミンＫ依存性タンパク質産生によって発生するあらゆる不純物を包含し、例えば、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）不純物、核酸不純物、ポリペプチド不純物、緩衝液および塩不純物、細胞培養培地から発生する不純物、目的物質由来不純物（ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）、例えば二量体またはフラグメント、ならびにそれらの組合せを挙げることができる。

本明細書で説明されているような本発明の方法は、活性なＦＩＸ生成物からの、例えばＦＩＸの不活性型およびトランケート型の除去または分離を可能にする。また本方法は、目的物質由来不純物（例えば分解産物、生成物の凝集体、粒子）の形成を極めて低いレベルに制御または維持することも可能にする。さらには、本方法は、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）の量を特に低いレベルに維持する条件を提供する。

加えて、活性なＦＩＸ生成物から製造工程由来不純物（ｐｒｏｃｅｓｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）（ＣＨＯ ＨＣＰ、ＣＨＯのＤＮＡ、培地成分）を分離して除くことにおいて、本方法は特に強力である。

特にＦＩＸ製剤中に、さらにはＦＩＸ医薬製剤中にも存在する追加の不純物は、活性化されたＦＩＸ、すなわちＦＩＸａである。ＦＩＸａは、血栓形成性を高めることから、得られた所望のＦＩＸ製剤に負の影響を与えることが示されている。したがって、ＦＩＸ製剤中のＦＩＸａ含量を低下させる方法を提供することが極めて望ましい。

本発明の方法は、本発明の方法により入手可能な製剤中でのＦＩＸａの形成を防ぐことによってこの目的を達成する。

有利で驚くべき方法において、使用される出発原料が、細胞培養または細胞培養上清中の組換え産生されたＦＩＸである場合、本発明に従って宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）、特にＣＨＯ細胞ＨＣＰの含量を低下させることも可能である。

さらなる有利で驚くべき方法において、本発明の方法により入手可能な組成物中の、宿主細胞のＤＮＡ、特にＣＨＯのＤＮＡの含量を低下させることが追加で可能である。

上記の結果はさらに、本発明によって提供される収量および特異的な活性における改善に対するものである。

好ましい実施形態において、本発明の方法に従って精製されたビタミンＫ依存性タンパク質は、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）不純物に関して、総タンパク質中、少なくとも９５％ｗ／ｗ、最も好ましくは少なくとも９９．５％ｗ／ｗのビタミンＫ依存性タンパク質の純度を有する。したがって、好ましい実施形態において、精製されたビタミンＫ依存性タンパク質中のＨＣＰ不純物の含量は、５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは２％ｗ／ｗ未満、より好ましくは１％ｗ／ｗ未満、最も好ましくは０．５％ｗ／ｗ未満である。ＨＣＰ不純物のパーセンテージ値は、生成物、すなわち精製されたビタミンＫ依存性タンパク質のｗ／ｗを指し、例えばＨＰＬＣまたはＥＬＩＳＡによって測定することができる。

さらに、本発明の別の態様において、本発明の方法により入手可能な、または本発明の方法により得られた精製されたビタミンＫ依存性タンパク質が提供され、またさらには、本発明の方法を実行するための手段を含むキットも提供される。特に、本発明のキットは、本発明に係る陰イオン交換樹脂材料を使用したビタミンＫ依存性タンパク質の精製に好適な、ローディング緩衝液および／または溶離液および／または洗浄緩衝液および／または２価陽イオンの溶液を含有していてもよい。好ましい実施形態において、ローディング緩衝液、洗浄緩衝液および／または溶離液は、上記で規定された通りである。さらに、本発明のキットは、好適な陰イオン交換樹脂材料を含有していてもよい。

本発明はさらに、ビタミンＫ依存性タンパク質を精製するための、上記で規定されたような本発明の方法および／または上記で規定されたような本発明のキットの使用に関する。

本発明は、生成物の高収量に付随する製造工程由来タンパク質不純物を高度に低下させることを可能にする、陰イオン交換樹脂材料を使用したビタミンＫ依存性タンパク質を精製するための効率的な方法を提供する。

次いで第一の陰イオン交換による精製工程の希釈された溶出液のプールを、第二の陰イオン交換カラム上にローディングし、ここでビタミンＫ依存性タンパク質は、適用された条件下では結合しないと予想される。得られた、第二の陰イオン交換による精製のカラム流出物（ａｆｆｌｕｅｎｔ）中に含有されるビタミンＫ依存性タンパク質は、高純度および高い特異的な活性を有する。さらに、上記カラム流出物は、低含量の（ＣＨＯ）ＨＣＰ、低含量の（ＣＨＯ）ＤＮＡおよび低含量のＦＩＸａを有する。

第ＦＩＸａ因子の含量は、その活性によって測定され、第ＩＸ因子活性に対する活性のパーセンテージとして示される。

組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）生成物の効力（国際単位、ＩＵで）は、世界保健機関（ＷＨＯ）の第ＩＸ因子濃縮物に関する国際規格に対して較正された参照を使用した広く公知の容認されたインビトロの１段階凝固アッセイを使用して決定される。１国際単位は、１ｍＬのプールした正常ヒト血漿中に存在するＦＩＸ活性の量である（Barrowcliffe TW, Standardization of FVIII and FIX assays, Haemophilia 2003;9:397-402）。

前記生成物中のＦＩＸａは、一般的に当業者に周知のアッセイを使用して測定される。一例は、世界保健機関（ＷＨＯ）の第ＩＸａ因子に関する国際規格に対して較正された参照を用いた市販の発色ＦＩＸａキット（例えば、Ｒｏｘ ＦＩＸ−Ａ、商品番号９５００３０；Ｒｏｓｓｉｘ、Ｍｏｌｎｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）である。このようなアッセイを実行するために、ＦＶＩＩＩ、トロンビン、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、ＦＩＸａによりヒトＦＸをＦＸａに活性化する。切断されるとＦＸａの量に比例する量でｐ−ニトロアニリンを放出すると予想される特異的なＦＸａ基質を用いて、生成したＦＸａの量を測定する。このアッセイは、ＦＩＸａに対して極めて高感度であり、定量下限濃度は０．１０ｍＩＵ／ｍＬである。

最終産物（例えば本発明の方法により得られたもの）中の予備活性化されたＦＩＸ（ｒＦＩＸａ）のレベルは、一貫して極めて低かった。認められた限定は、≦０．１０％のＦＩＸａ活性（発色ＩＵ／ｍＬ）／ＦＩＸ活性（凝固ＩＵ／ｍＬ）と設定される。しかしながら、１５種の試験された本発明のバッチの実際のＦＩＸａ含量は、≦０．０２％のＦＩＸａ／ＦＩＸもの低さであった。ここで特許請求された精製プロセス後に得られた全てのＦＩＸ製剤は、０．０２％未満のＦＩＸａ／ＦＩＸ値を有していた。単一のＢｅｎｅＦＩＸロット（Ｅ９４７９１、市販の比較製品として）を同じアッセイで分析したところ、相対的なＦＩＸａ含量は、０．１１％として測定された。

総合すると、全てのロットの相対的なＦＩＸａ含量は一貫して低く、見たところ比較製品のＦＩＸａ含量より最大１０分の１低かった。

特に、本発明の方法は、以下の一般的な原理に基づく。一般的に、陰イオン交換樹脂材料へのタンパク質の結合は、より低い導電率およびより高いｐＨ値で増加する。逆もまた同様であり、陰イオン交換樹脂材料へのタンパク質の結合は、より高い導電率およびより低いｐＨ値で減少する。本発明の方法において、ビタミンＫ依存性タンパク質は、好ましくは、上記で詳細に説明したように低いｐＨでローディングおよび／または洗浄され、なおそれでも第一の陰イオン交換材料へのビタミンＫ依存性タンパク質の結合は可能であり、ビタミンＫ依存性タンパク質の構造的な完全性または活性も害されない。多くのタンパク質不純物は、第一の陰イオン交換樹脂材料に結合しないと予想されることから、生成物を確かに第一の陰イオン交換カラムに結合させながらも、第一の陰イオン交換樹脂材料への不純物の結合を大幅に低下させる。これらの条件下で第一の陰イオン交換樹脂材料に結合し、洗浄で除かれないタンパク質不純物は、溶出中のｐＨを増加させることにより共に溶出されないようにする。溶離液中のｐＨ増加を可能にすることで、全てのタンパク質を第一の陰イオン交換樹脂材料によりいっそう強く結合させながらも、カルシウムは、溶出を引き起こす生成物と特異的に相互作用する。

第一の陰イオン交換カラムの溶出緩衝液を調節して、
− 導電率を（上述したような範囲に）、特にｐＨおよびＣａ^＋＋濃度のパラメーターと関連して具体的な範囲内に調整したり、
− ｐＨを、導電率およびＣａ^＋＋濃度のパラメーターと関連して特定された範囲内に調整したり、
− カルシウム濃度を、（ローディング（ａ）の場合より多くに）、１〜３ｍＭの間になるように、ただしここでもｐＨおよび導電率のパラメーターと関連して選択されるように増加させたりする。

これらの処置は、陰イオン交換樹脂における、不純物、特に不活性なＦＩＸの選択的な結合、ならびに選択的な非結合および活性物質の溶出のための条件をもたらす。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、本明細書で説明されているように、溶出液中のパラメーターの選択により、ビタミンＫ依存性タンパク質だけが第二の陰イオン交換材料に結合しないように、溶出液がさらに調節される。この状況において、注目すべきことに、上述したように、一般的にタンパク質はより高いｐＨ値でより強く陰イオン交換樹脂材料に結合することから、陰性クロマトグラフィー、すなわち流出液中に精製しようとするタンパク質が存在すると予測される陰イオン交換クロマトグラフィーにとって、工程（ｄ）でローディングするためにｐＨを酸性の洗浄と比較して増加させることは、極めて異例である。

重要なことに、１〜３ｍＭのＣａ^＋＋を含む第一の陰イオン交換樹脂材料のための溶出緩衝液を使用することによって、本発明の方法は、驚くべきことに、かつ有利なことに、陰イオン交換クロマトグラフィーによる活性なビタミンＫ依存性タンパク質生成物の優れた含量を達成する。

また、工程（ｂ）のＣａによって誘導された生成物溶出中の適宜行われるｐＨ増加（溶出緩衝液は、工程（ａ）のローディング緩衝液または工程（ａ）の酸性の洗浄より高いｐＨを有する）、および工程（ｄ）のためのローディングの調節（工程（ａ）の酸性の洗浄より高いｐＨ、工程（ｂ）の溶離液より高いカルシウム）も、ビタミンＫ依存性タンパク質の選択的な精製を提供し、不純物が共に溶出されることを防ぐ。高いｐＨおよび高いカルシウムでの第二の陰イオン交換樹脂材料のローディングは、２価陽イオンを補充することによって精製しようとするタンパク質の結合を防ぎつつ、不純物を第二の陰イオン交換樹脂材料に結合させる。本発明によれば、上記の条件は、高純度および高収量のビタミンＫ依存性タンパク質をもたらす。本発明の方法は、例えば、低いｐＨで陰イオン交換樹脂材料上にタンパク質溶液をローディングし、具体的に選択されたｐＨおよび導電率で、１〜３ｍＭのカルシウムを含む溶離液により生成物を溶出させ、高いｐＨ、および増加させたカルシウム濃度下で、ただし特に溶出中の具体的に選択されたパラメーターによって、第二の陰イオン交換樹脂材料上に溶出液をローディングし、流出液を収集することによる、製造工程由来ポリペプチド不純物の有意な低減を提供することができる。

精製の方策は、とりわけビタミンＫ依存性タンパク質の独特な生化学的特性に基づく。例えばＧｌａ−ドメインにおいて、約１２の負電荷が短いアミノ酸ストレッチ内に集中している。この負電荷は、系に２価陽イオン（例えばＣａ２^＋）を添加することによって中和することができ、または正電荷にも変換することができる。この作用に基づき、例えばｒＦＩＸは、１の比電荷状態でイオン交換樹脂に結合して、Ｃａ２^＋の除去（または付加）により電荷を変換することによってゲルから溶出させることができる。この分離の原理は、「偽親和性クロマトグラフィー」と呼ばれる。この原理は、Ｇｌａ−ドメインを含まないビタミンＫ依存性タンパク質にも反映される。例えばｒＦＩＸのようなビタミンＫ依存性タンパク質の精製に適用される本発明の方法は、活性なビタミンＫ依存性タンパク質に富み、好ましくは不活性なビタミンＫ依存性タンパク質、特に不活性な全長ビタミンＫ依存性タンパク質を本質的に含まない、優れたビタミンＫ依存性タンパク質の医薬製剤の提供を可能にする特定のパラメーター（ｐａｒａｍｅｎｔｅｒ）範囲を導入する。

ｒＦＩＸの精製手法
本発明者らは、ＣＨＯ ＤＸＢ１１親（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）細胞株をベースとした組換えヒト第ＩＸ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞株を開発した。プロ−ＦＩＸのＦＩＸへの細胞内成熟を改善するために組換えヒトフューリンを共に発現するように細胞株を加工した。産生プロセスのために、ケモスタット様式で細胞を懸濁液中で成長させ、それらを、哺乳動物または血漿由来タンパク質が全く添加されていない化学組成が既知の培地に適応させた。成長培地にダイズペプトンを添加して、クローンの生産性を改善した。

ケモスタット生産作業において、Ｃｕｎｏ深型フィルター（正のゼータ電位を有する）およびＰＶＤＦまたはＰＥＳフィルター膜上の０．２ｐｍの膜ろ過での深層ろ過によって、収集された細胞培養の回収物を透明化し、細胞と死細胞片を除去した。ろ過した細胞非含有の回収物を、ｒＦＩＸの精製プロセスを開発するための出発原料の代表的なものとした。

説明された本発明の方法および生成物における様々な改変およびバリエーションは、本発明の範囲および本質から逸脱することなく、当業者に明らかであると予想される。具体的な好ましい実施形態に関連して本発明を説明したが、このような実施形態に過度に限定されないものとする。

パラメーター範囲の決定および不活性なＦＩＸの除去
目的
この一連の実験では、緩衝液のパラメーターであるｐＨ、導電率およびカルシウム含量の、捕獲工程の性能に対する影響を調査する。統計的設計アプローチを使用して、生成物の収量および製品品質に対する作用を評価した。

導入
ｒＦＩＸの下流の産生工程「ＣＰＮ」は、陰イオン交換カラムでの、この実施例ではＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでのクロマトグラフによる精製である。ローディング材料は、２ｍＭのＥＤＴＡを補充した発酵からの透明化した回収材料である。ｒＦＩＸの臨床的産生に適用されたラージスケールでの精製プロセスは、典型的には、２ｍＭのＥＤＴＡが補充されｐＨが約７．０〜７．４の透明化した回収物をローディングしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗでの、陰イオン交換クロマトグラフィーによる捕獲工程から開始される。この捕獲工程の主要な目的は、製造工程由来不純物（培地成分、産生細胞由来不純物）の低減、目的物質由来不純物（トランケート型ｒＦＩＸ種、カルシウム感受性のないｒＦＩＸ種、ＦＩＸ−ｄｅｓＧＬＡ）の除去、および生成物の濃縮である。「偽」親和性溶出のためにカルシウムの作用を利用するクロマトグラフの陰イオン交換による精製工程にとって重要なパラメーターをリスクアセスメントによって規定した。ｒＦＩＸの下流プロセス工程であるＣＰＮ（捕獲工程）をさらに評価するために、ＤＯＥアプローチを適用して、重要とみなされたパラメーター、すなわちｐＨ（洗浄２の緩衝液および溶出緩衝液）、導電率（洗浄２の緩衝液および溶出緩衝液）およびカルシウム含量（溶出緩衝液）を包含するスモールスケールでの研究を行った。パイロット規模でのｒＦＩＸの臨床第ＩＩＩ相生産から試験材料を得た。適切な条件を満たした、またはバリデーションされた分析方法を適用することによって、クロマトグラフによる精製の試行を分析した。得られたデータを、臨床生産データと比較して評価し、現行のパラメーター設定に関して工程のロバスト性に関する情報を得た。ＦＩＸ捕獲工程のクロマトグラフの詳細は、後述される。サンプルローディングのためのタンパク質のローディング量は、樹脂１ｍｌ当たり０．８〜１．１ｍｇのＦＩＸ抗原であった。収集は、０．２ＡＵより大きいかまたはそれに等しいＵＶ_２８０傾きの有意な増加（光路長（ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｓｓ ｌｅｎｇｔｈ）：５ｍｍ）に応じて開始させ、４．５ＣＶの後に終わらせた。平衡化、洗浄１および洗浄３にはＱＦＦ−平衡緩衝液を使用し、洗浄２にはＱＦＦ−洗浄緩衝液を使用した。溶出にはＱＦＦ−溶出緩衝液を使用した。２００ｍＭのＥＤＴＡストック溶液は、室温でｐＨ７．４±０．１であった。上記ストック溶液は、２５℃で３０〜３５ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。バリエーションおよび数種のパラメーターの作用を決定するために計画されたバリエーションを、研究される設計に対応する洗浄および溶出緩衝液ごとに導入した。臨床第３相生産作業から、凍結／融解工程を用いずに、ｒＦＩＸローディング材料を採取した。捕獲工程は、カラムの活性化、平衡、生成物のローディング、洗浄１、２、３および溶出を包含する。カラムのクリーニング手法を使用して、確実に変性タンパク質のバッチ間の持越しが起こらないようにし、カラム性能に影響を及ぼす可能性があるカラムの汚染を防いだ。

実験の設計
表１に示すように、ＱＦＦ−洗浄（洗浄２）緩衝液およびＱＦＦ−溶出（溶出）緩衝液の、ｐＨ、導電率およびカルシウム濃度などの５種のパラメーターを変更した。

以下の表２において、捕獲工程で実際に使用されたプロセスパラメーターを確認する。

驚くべきことに、１〜３ｍＭのカルシウム範囲が特に好適であり、極めて具体的に選択された導電率およびｐＨの範囲と組み合わせる必要があることを見出した本発明者らによって行われた調査の後初めて、微調整ができるようになった。

ｒＦＩＸ分解産物のさらなる調査
方法
・ＦＩＸ欠乏血漿を使用した１工程での凝固手法によりＦＩＸの効力を決定した。
・ 反応速度論評価方法を用いて形成された活性を測定する発色アッセイによって、ＦＩＸの効力を決定した。ＦＩＸは、キット中に含有されるＦＸＩａおよびトロンビンによってＦＩＸａに変換される。
・コーティングおよび検出に親和性によって精製されたポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＦＩＸ抗原を分析した。
・ リン脂質、カルシウムおよび活性化されたＦＶＩＩＩの存在下でＦＸａを生成する発色アッセイにより、ＦＩＸａを決定した。ＦＸａは、発色性ペプチド基質を切断して、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡを放出する。
・ 還元条件下で１２％ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。一次抗体としてポリクローナル抗ＦＩＸＩｇＧを用いて、分離したポリペプチドのウェスタンブロット分析を行った。
・ 濃度測定：
Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｅｒ ＩＩＩ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＬａｂｓｃａｎ６．０ソフトウェアを使用して、新たに展開させたウェスタンブロットをデジタル化した。ソフトウェアパッケージＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて濃度測定を行った。縦軸に沿ってバンドの強度と幅を決定し、濃度曲線下面積とバンドの抗原量とを相関させる。全てのバンドの合計を１００％として固定し、個々のバンドを総量のパーセンテージで示す。

結果
具体的なパラメーター範囲で作業することにより（データ示さず）、捕獲のための陰イオン交換による精製工程での不活性な全長ｒＦＩＸ種の除去が可能になった。結果は、ＤＯＥ計算に反映され、図１〜２に示される。本発明者らは、（「第一の」）陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出工程における導電率およびｐＨの両方に対して、１〜３ｍＭのカルシウムの濃度に関するパラメーター範囲を同定することに成功したことが明らかになる。これらの範囲内で作業する場合、これらの図で示されるような斜線の領域内で溶出が行われている限りは、問題となっているプロセスの要求にパラメーターを適応させることができる。またこれらの領域は、上記した本発明の概説部分における好ましい実施形態としても規定される。

したがって、本発明は、不活性な全長ＦＩＸを本質的に含まないＦＩＸ製剤を提供することに関する分野に貢献するものとして有利なパラメーター範囲を提供する。

捕獲による精製は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂で、低いｐＨでの高塩濃度洗浄および高いｐＨでのカルシウムによって誘導された生成物溶出を適用して行われる。表３に、ｒＦＩＸの臨床生産のために適用されるような精製手法を概説し、表４に、緩衝液調合物を要約する。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＩＸウェスタンブロッティングによってサンプルを分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで（結果は示さず）、ローディング、洗浄２中に、有意な量の不純物（ＣＨＯ ＨＣＰおよびトランケート型ＦＩＸタンパク質）が除去されるか、またはカラムに残り、高塩濃度のクリーニング工程で溶出されることを示すことができる。ｐＨ＝８．０でのカルシウムによって誘導された溶出中に、生成物は、高純度および均一に溶出する。主要なトランケートされた形態が存在する場所は、主として洗浄２である。

流出液画分
この画分において、６０ｋＤａの類似の分子量を有する主要なトランケート型ＦＩＸ種と、５１ｋＤａの分子量を有する微量のｒＦＩＸ種とを見出すことができる。このゲル系において、全長ＦＩＸは、約７５ｋＤａの見かけの分子量を示す。この画分中でのトランケート型ｒＦＩＸポリペプチドの量は極めて低く、凝固または発色活性を測定することはできなかった（データ示さず）。抗原のＥＬＩＳＡデータによれば、この洗浄画分中にローディングされた抗原総量の約１〜１．５％を見出すことができ、濃度測定分析によれば、ローディングされたタンパク質総量の約０．４〜０．５％が、この画分中で見出されたトランケート型ＦＩＸ種であることが示される。

洗浄２の画分
この画分において、６０ｋＤａの類似の分子量を有するトランケート型ＦＩＸ種は、カラムから洗浄されて除かれる。全長ＦＩＸは、このゲル系において約７５ｋＤａの見かけの分子量を示す。トランケート型ｒＦＩＸポリペプチドは、凝固または発色活性を有さない。Ｎ末端の配列決定結果から、トランケーションはＣ末端でなければならないこと、Ｎ末端のＧＬＡドメインは不完全であることが示された。抗原のＥＬＩＳＡデータによれば、この洗浄画分にローディングされた抗原総量の約６〜８％を見出すことができ、濃度測定分析によれば、ローディングされたタンパク質総量の約１５〜１６％が、この画分中で見出されたトランケート型ＦＩＸ種であることが示される。

ろ過した回収物とＣＰＮ捕獲工程のクロマトグラフ画分と比較したところ、トランケート型ＦＩＸ種の量が増加していないことから、ｒＦＩＸのトランケーションは、細胞内で、または細胞培養上清中で、まだ未同定の細胞プロテアーゼにより発酵中に起こる可能性が強い。下流工程であるＣＰＮは、このトランケート型ｒＦＩＸ種の含量に寄与しないかまたはそれを増加させない。

溶出液のプール画分
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、全長ＦＩＸ種は、溶出液のプール中で富化され、トランケート型ＦＩＸ種はほんのわずかしか検出できないことが示される。ＦＩＸの特異的な活性から、特異的な活性は溶出液のプール中でより有意に高いことが示される。溶出液のプール中での特異的な活性の増加は、洗浄２および高塩濃度でのカラムクリーニング工程中、この精製工程で有意な量の不活性なＦＩＸ種が除去されるという事実と相関する。ＥＬＩＳＡ方法によってろ過した回収物（＝ローディング）中で検出されたＦＩＸ抗原の約６１〜７２％が、捕獲による精製工程ＣＰＮの溶出液のプール中に見出される。濃度測定分析から、ＣＰＮ工程でローディングされたＦＩＸ総量の約６８〜７５％が、溶出液のプール中では全長ｒＦＩＸとして見出され、これは、ＦＩＸのＥＬＩＳＡデータ（データ示さず）と相関することが示される。

高塩濃度クリーニング画分（溶出後液）
カラムの高塩濃度クリーニング画分中で、有意な量の不活性な全長ＦＩＸを検出することができる。抗原のＥＬＩＳＡデータによれば、ローディングされたＦＩＸ抗原総量の約２３〜２８％を、このカラムクリーニング画分中に見出すことができ、濃度測定分析によれば、ローディングされたＦＩＸ抗原総量の約２２〜３０％が、この分画中で全長の不活性なＦＩＸとして見出されることが示される。

ＣＰＮ工程における不活性なＦＩＸ種の除去のロバスト性
スモールスケールにおけるロバスト性研究の際に、溶出条件に関連するプロセスパラメーターを調査した。

溶出緩衝液に関して、パラメーターである導電率、ｐＨおよびカルシウム濃度をスモールスケールのＤＯＥ研究で調査した。６ｍＭのカルシウムの溶出条件下では、不活性なＦＩＸ抗原の一部は生成物と共に溶出するようであり、高塩濃度のクリーニング画分中のＦＩＸ抗原は５．９％に低下する。高い導電率の溶出緩衝液の条件下でも、不活性なＦＩＸ抗原の一部は生成物と共に溶出するようであり、高塩濃度のクリーニング画分中のＦＩＸ抗原は１６．４％に低下する。どちらのケースにおいても、ＦＩＸ生成物のプールは、所定のパーセンテージの全長不活性なＦＩＸで汚染されていると予想される。

標的タンパク質としてＦＶＩＩを使用したさらなる実験を行った。説明されたパラメーター範囲で作業している際、不活性なタンパク質の除去を確認することができた（データ示さず）。

Claims (13)

1. ビタミンＫ依存性タンパク質を精製する方法であって、
   （ａ）２価陽イオンの非存在下または低い２価陽イオン濃度で、陰イオン交換樹脂材料（以下、「第一の陰イオン交換樹脂材料」ともいう）にローディング緩衝液中のビタミンＫ依存性タンパク質をローディングし、続いて適宜１から３回洗浄する工程；
   （ｂ）カルシウムと対陰イオンとを含む溶離液を用いて、ビタミンＫ依存性タンパク質を溶出させて、ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する溶出液を形成する工程
   を含み、ここで、
   − 該溶離液には１〜３ｍＭのカルシウムが含まれ、
   − 該溶離液は、１４〜２３ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を有し、
   − 該溶離液のｐＨは、７．０から９．０の間である、精製方法。
2. 以下の工程：
   （ｃ）得られた溶出液のプールを希釈して（（１）適宜それにより導電率を低下させ）、カルシウムの濃度を増加させる工程、
   （ｄ）第二の陰イオン交換樹脂材料に、工程（ｃ）の後に得られた溶出液をローディングする工程；および
   （ｅ）ビタミンＫ依存性タンパク質を含有する流出液を収集する工程
   をさらに含む、請求項１に記載の精製方法。
3. 工程（ｂ）において：
   − 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１８から２０ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１８．５から２１ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、１９から２２．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび１ｍＭのＣａ^＋＋で、２０から２３ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１７．０ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１６から１８ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１６．５から１９．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１７．５から２１ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび２ｍＭのＣａ^＋＋で、１９．５から２２ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．０〜７．４のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１４．０から１５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．４〜７．６のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１５．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、
   − 導電率が、７．６〜８．０のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１４から１６．５ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間であるか、または
   − 導電率が、８．０〜９．０のｐＨおよび３ｍＭのＣａ^＋＋で、１５から１９ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の間である、請求項１または２に記載の方法。
4. 導電率およびｐＨの範囲が、１ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ａの斜線の領域から選択され、一方で導電率およびｐＨの範囲は、２ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ｂの斜線の領域から選択され、一方で導電率およびｐＨの範囲は、３ｍＭのＣａ^＋＋の濃度に関しては図２Ｃの斜線の領域から選択される、請求項１から３に記載の方法。
5. Ｃａ^＋＋の導電率および濃度が、
   − 図３Ａの斜線の領域に基づき、７．０のｐＨに関して、
   − 図３Ｂの斜線の領域に基づき、８．０のｐＨに関して、および
   − 図３Ｃの斜線の領域に基づき、９．０のｐＨに関して
   選択される、請求項１から４に記載の方法。
6. ローディングする工程の後、２価陽イオンの非存在下、ただし対陰イオンの存在下での、洗浄緩衝液（１）、（２）および／または（３）を用いた１回または複数の洗浄工程（１）、（２）および／または（３）が行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第一および第二の陰イオン交換樹脂材料が、それぞれ独立して、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエタノール（ＤＭＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、四級アミノアルキル、四級アミノエタン（ＱＡＥ）、および四級アンモニウム（Ｑ）からなる群より選択される正電荷を有する基を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. ビタミンＫ依存性タンパク質が、２価陽イオン結合タンパク質、好ましくはカルシウム結合タンパク質であり、より好ましくは、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、およびプロテインＳからなる群より選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ｂ）における溶出緩衝液（すなわち溶離液）が、２ｍＭのカルシウムを含有し、１８０ｍＭのＮａＣｌの添加により得られた約８．０のｐＨおよび１８〜１９ｍＳ／ｃｍ（２５℃）の導電率を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により得られたビタミンＫ依存性タンパク質。
11. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により得られた（ｒ）ＦＩＸ。
12. 請求項１０に記載のビタミンＫ依存性タンパク質または請求項１１に記載の（ｒ）ＦＩＸを含む医薬製剤。
13. 活性ＦＩＸに富み、好ましくは不活性なＦＩＸを本質的に含まないことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬製剤。

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