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JP2016501858A - 転移性癌を処置するためのｃｄ４４ｖ６由来ペプチド - Google Patents

転移性癌を処置するためのｃｄ４４ｖ６由来ペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、様々な型の膵癌を処置するための化合物、医薬組成物および方法に関する。

Description

本発明は、転移型の癌を処置するための化合物、医薬組成物および方法に関する。
様々なタイプの癌が、ｃＭＥＴ、およびＶＥＧＦＲ等の受容体型チロシンキナーゼの過剰活性化を少なくともある程度は伴うことが分かっている。癌として、例えば結腸直腸癌、乳癌および膵癌が挙げられる。
例えばｃＭＥＴ、ＥＲＫおよびＶＥＧＦＲのような受容体型チロシンキナーゼのＨＧＦ依存性活性化にＣＤ４４が関与すると論じられている（特にPonta他、Nature Reviews (2003)、4、33〜45およびTremmel他、Blood (2009)、25、5236〜5244を参照）。更に、受容体型チロシンキナーゼの過剰活性化を特徴とする癌の一部では、ＣＤ４４の選択的スプライシング型の発現、即ちＣＤ４４ｖ６の発現が生じることが分かっている。そのような癌の処置では、受容体型チロシンキナーゼのＣＤ４４ｖ６媒介性活性化をブロックすることができるペプチドが潜在的に有用であると論じられている。
しかしながら、そのような癌の処置、例えば膵癌等の処置を可能とする薬学的活性剤に対する関心が絶えず存在する。
米国では、膵癌は２番目に多い消化管の悪性腫瘍であり、成人において４番目に多い癌関連死である（Cancer Stating Manual、第７版、2010、American Joint Committee on Cancer、Springer）。膵癌は、膵臓を形成する組織で生じる形質転換細胞に由来する悪性新生物である。最も一般的なタイプの膵癌は腺癌または膵外分泌癌であり、これらは、光学顕微鏡検査で、膵臓の外分泌成分と共に生じる腺構造を示す腫瘍である。マイナーなタイプは膵管細胞から生じ、神経内分泌腫瘍と分類される。
膵癌の処置は概して、癌のステージに依存する。現在のところ、限局性癌のみが治癒目的の手術に適していると考えられるが、症例のわずか約２０％が限局性疾患と診断される。悪性腫瘍が十二指腸または結腸に侵入しているまたはこれらを圧迫している場合、緩和を目的として手術を行なうこともできる。更なる処置の選択肢として、放射線および緩和的化学療法が挙げられる。現在の化学療法として、ゲムシタビンによる処置、またはゲムシタビン／オキサリプラチンもしくはゲムシタビン／シスプラチン等のゲムシタビンとの併用療法が挙げられる。集中的な研究努力にもかかわらず、長期の無増悪生存をもたらすと考えられるであろう、現在利用可能な処置は存在しない。従って、膵癌はこれまで、全ての新生物の内で予後が最も悪い悪性腫瘍の一つである。特に転移が肝臓、腹腔および肺等へと体中に広がっている場合、既存の転移の効果的な退縮を可能にするであろう、利用可能で効果的な処置は存在しない。
同様の問題はその他の癌に関しても存在しており、この癌では転移が既に形成されている。これらの癌の多くの場合、緩和的化学療法が唯一の治療上の選択肢であるかもしれない。
そのため、転移性拡散が起きている場合に、膵癌等の癌を処置するために使用することができる新規の化合物および方法の必要性が存在する。
本発明の目的の一つは化合物およびそのような化合物を含む医薬組成物を提供することであり、転移性拡散が起きている場合に、該化合物および医薬組成物はヒトの癌を処置するために使用することができる。
別の目的は、転移性拡散が起きている場合にヒトの癌を処置するための新規の方法を提供することである。
以下の説明から明らかになるであろうこれらの目的およびその他の目的は、独立請求項の主題によって達成される。本発明の好ましい実施形態の一部が従属請求項で述べられる。
本発明は、共受容体分子ＣＤ４４ｖ６の分子機能を解明することを目的の一部とする以下に記載の実験データにある程度基づいている。ＣＤ４４膜貫通糖タンパク質は、細胞接着分子（ＣＡＭ）の大きなファミリーの一部を形成する。ＣＤ４４は、選択的にスプライシングされたバリアントを含み、該バリアントの一部は、受容体型チロシンキナーゼＭｅｔおよびＶＥＧＦＲの活性化による転移のプロセスに関与することが認識されている（Matzke他、Cancer Res (2005)、65(14) 6105〜6109を参照）。
以下に記載の実験から、エクソンｖ６を含む、選択的にスプライシングされたバージョンのＣＤ４４（ＣＤ４４ｖ６）が、例えばヒト膵癌の動物モデルにおける転移の誘導に関与していることが分かる。ＣＤ４４ｖ６はまた、ｃＭＥＴ、ＥＲＫおよびＶＥＧＦＲのような受容体型チロシンキナーゼのＨＧＦ依存性活性化での役割におそらく起因して、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌および乳癌等のその他の癌にも関与している。
以下に記載する実験では、Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ等、５個のアミノ酸のペプチド骨格に組み込まれているトリペプチド配列Ｒ−Ｗ−Ｈを最小必要条件として有するペプチドがヒト膵癌の動物モデルにおいて転移の形成をブロックすることができることが更に示されている。更に、本明細書に記載するデータは、マウスでのヒト膵癌の同所性モデルにおいて、このペプチドにより、全身にわたって既に広がって形成されている転移の効果的な退縮も可能になることを示す。この背景に先立って、このペプチドにより、膵癌に関してだけなく、ＣＤ４４ｖ６の発現が示されているホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌および乳癌等のその他の癌に関しても、形成されて体中に広がっている転移の退縮を可能にすることができると結論付けるのが妥当であると考えられる。
既に上述したように、トリペプチド配列Ｒ−Ｗ−Ｈが５個のアミノ酸のペプチド骨格に組み込まれる場合には、本明細書に記載のペプチドは転移の阻害だけでなく既に形成された転移の実際の除去にも効果的であることが発見されている。このことは、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅのアミノ酸ＮおよびＥをそれぞれＡに変更することにより発見された。これらは非保存的アミノ酸置換であったにもかかわらず、ＭｅｔのＣＤ４４ｖ６媒介性活性化の阻害においてペプチドは依然として活性がある。そのため、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅの第１位のＮをＫ、ＲまたはＱ等のアミノ酸で保存的に置換するだけでなく、任意のその他のアミノ酸またはＶ、ＬもしくはＩ等のＡに相当する非極性側鎖を有するアミノ酸により保存的に置換することができると結論付けるのが正しいと思われる。当然のことながら、同様の考察をペンタペプチドの第５位に適用し、その結果、アミノ酸ＥをＫによる等の保存的置換により置き換えるだけでなく、任意のその他のアミノ酸または特にＶ、ＬもしくはＩ等のアラニンの特性と類似するアミノ酸に置き換えることができる。
更に、ペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅはまた、より長いペプチドに組み込まれる場合に、Ｍｅｔシグナル伝達のＣＤ４４ｖ６媒介性活性化を阻害するのに効果的であることも示されており、より長いペプチドの上限は１４ｍｅｒであると仮定するのが妥当である。保存的アミノ酸置換だけでなく非保存的アミノ酸置換によりペンタペプチドの最初の位置および最後の位置を置換する可能性の発見を前提として、Ｒ−Ｗ−Ｈの必須モチーフ外の任意のアミノ酸を同じ理由に従って置き換えることができたと結論付けるのが妥当であると思われる。
そのため、本発明は一実施形態において、癌が転移を既に形成している場合にヒトの癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物に関する。
そのような癌は、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、肺癌、膵癌および乳癌の転移型であることができ、なぜならば、これらの癌の場合、ＣＤ４４ｖ６の発現が示されているからである。
上記に記載の知見を前提として、即ちペンタペプチドＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ中のアミノ酸Ｎおよびアミノ酸Ｅをアラニンに置き換えることができるという知見を前提として、これらの位置で、Ｖ、ＬまたはＩ等の物理化学特性がアラニンと同程度である保存的アミノ酸置換またはアミノ酸置換のどちらかを含むペプチドが、Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅと同じ活性を実現することもできると仮定するのが妥当であると思われる。同様の考察が、必須のトリペプチドモチーフＲ−Ｗ−Ｈに隣接する位置に関する１４ｍｅｒ由来のペプチドに当てはまる。
そのため、好ましい実施形態では、本発明は、癌が転移を既に形成している場合にヒトの癌の処置において使用するための化合物に関し、前記化合物は以下を含む：
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物。
そのような癌は、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌の転移型であり得、なぜならば、これらの癌の場合、ＣＤ４４ｖ６の発現が示されているからである。
ペンタペプチドまたは以下に記載する１４ｍｅｒ由来の任意のより長いペプチドは、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌等の癌において、転移の予防だけでなく既に形成された転移の実際の除去にも効果的であるだろうが、本発明の好ましい実施形態は、以下に記載するペンタペプチド配列に関し、特に好ましい実施形態はアミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）に注目する。
配列番号１または配列番号２のペンタペプチド等の本明細書に記載のペプチドと同じアミノ酸または該ペプチドと少なくとも同じ全体構成のペプチドを提供する任意の化合物は、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌等の癌において、転移の形成の予防だけでなく既に形成された転移の除去にも効果的であることができることも当業者は理解するだろう。
従って、本発明はいくつかの実施形態において、以下に記載のペプチドの内のいずれかのペプチド模倣物の、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４もしくは５のペプチド模倣物の使用を意図する。このペプチド模倣物は、同じアミノ酸を好ましくは有することができるが骨格が変更されており、該骨格は、ペプチド自体が提供するのと同じ全体構成のペプチド模倣物を提供するが、例えばプロテアーゼ開裂に対してより耐性を示す。好ましいペプチド模倣物は例えば等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。
本発明はまた、本明細書に記載のペプチドおよびペプチド模倣物の更なる改変型も検討する。そのような改変ペプチドまたは改変ペプチド模倣物は、例えばプロテアーゼ分解に対してペプチドをより安定させる、例えば化学的にまたは酵素的に付加された改変を含むことができ、これにより、ペプチドもしくはペプチド模倣物を薬学的に許容される塩として提供することが可能となる、または例えばペプチドもしくはペプチド模倣物の半減期等の生物学的特性を改善することが可能となる。そのようなペプチドまたはペプチド模倣物のそのような好ましい改変型は、このペプチドおよびペプチド模倣物における、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペプチドまたはこれらの配列のペプチド模倣物におけるペグ化型、ヘシル化（hesylated）型、パシル化（pasylated）型、ミリストイル化型、およびグリコシル化型および／または環状型を指す。
そのような改変ペプチドまたは改変ペプチド模倣物は一般に、本発明に関して化合物またはペプチド化合物と称される。この化合物またはペプチド化合物を、例えば吸入による経口投与用に、経鼻投与用に、または皮下投与等の注射による投与用に製剤化することができる。
一実施形態では、本発明はまた、転移が既に形成されている場合に癌の処置において使用するための医薬組成物であって、この癌として、ヒトのホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌の転移型が挙げられ、この医薬組成物は、上記に記載の化合物／ペプチド化合物を含む、医薬組成物に関する。この医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、該医薬組成物を、吸入による等の経口投与用に、経鼻投与用に、または注射による投与用に製剤化することができる。
本発明はまた、転移が既に形成されている場合に癌の処置において使用するための医薬品の製造での、そのようなペプチド、このペプチド模倣物または改変ペプチドおよび改変ペプチド模倣物の使用であって、この癌として、ヒトのホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌の転移型が挙げられる、使用に関する。
更に、本発明は、ペプチド、このペプチド模倣物またはこれらの改変型を、これらを必要とするヒトに投与することにより、即ち、本発明に係る化合物または本発明に係る化合物を含む医薬組成物を、これらを必要とするヒトに投与することにより、転移が既に形成されている場合に癌を処置する方法であって、この癌として、該投与を必要とするヒトのホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌の転移型が挙げられる、方法に関する。
転移が既に形成されており、更に全身に広がっている可能性がある癌を処置するために、本発明に係る化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物またはその改変型、本発明の医薬組成物および本発明に係る方法が検討される。この癌は転移性癌とも呼ばれる。
本発明に係る転移性癌として、癌組織でＣＤ４４ｖ６の発現が観測されている、または例えばＣＤ４４ｖ６抗体による対応する検査時に観測され得る癌の転移型が挙げられる。本発明に係る転移性癌として、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌、頭頸部扁平上皮癌および乳癌の転移型が挙げられる。
ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌等の様々な癌のそのような転移性癌型を、対癌米国合同委員会（American Joint Committee on Cancer）の癌病期分類マニュアル（Cancer Staging Manual）のＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（TNM Anatomic Stage/Prognostic Group System）（7thedition, 2010, Springer）に従って同定することができる。特にＭを１と設定する場合に、ＴＮＭ解剖学的段階／予後群システムに従って、本発明に係る転移性乳癌を典型的にはステージＩＶの癌と分類することができる。対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアル（第7版、2010、Springer）には、ＴＮＭ解剖学的段階／予後群システムと、本明細書で述べた様々な癌に関して癌を例えばステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶとみなす条件とが記載されており、そのため、該癌病期分類マニュアルは参照により援用される。
例えば、特に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト対象の乳癌または結腸直腸癌を処置するために、本発明の化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物またはこれらの改変型、本明細書に記載の医薬組成物および以下に記載の方法を考慮し、乳癌または結腸直腸癌は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（7th edition, 2010, Springer、結腸直腸癌に関して１４５〜１６６頁をおよび乳癌に関して３４７〜３７８頁を参照）に従ってステージＩＶと分類できる。
本発明の全ての態様および実施形態に関して、即ち以下に記載の化合物、医薬組成物および方法に関して、ヒトの転移性癌を処置するために、特に転移性癌を処置するために、本明細書に記載のペンタペプチド、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペンタペプチド、特に配列番号２のペンタペプチドを使用することが常に好ましく、該転移性癌は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＶと分類できることを理解すべきである。
Ｍｅｔに関するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が腫瘍転移に必要であることを示す図である。Ａ：示した箇所ではＢＳｐ７３ＡＳおよびその形質移入体をＨＧＦで導入し、ＭｅｔおよびＥＲＫの活性化を材料および方法に記載したように測定した。数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪにより算出した誘導倍数（fold induction）を示す。全ての実験を少なくとも３回行ない、同様の結果を得た。Ｂ：Ａで使用した細胞を同系ラットの右後脇腹に皮下注射した（材料および方法）。４週間後、免疫組織化学的分析のためにリンパ節および肺を調製した。表したリンパ節は腋窩リンパ節である。肺について２枚の写真を表示しており、矢印は転移を示す。Ｃ：コントロール−ｓｈＲＮＡまたはＭｅｔ−ｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルスに感染させたＡＳｓ６腫瘍のパラフィン切片の免疫組織化学的分析。切片を抗ＧＦＰ抗体で染色してｓｈＲＮＡ形質導入領域をモニタリングした、またはホスホ−Ｍｅｔ抗体で染色した。倍率２０倍。 ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドが腫瘍細胞の転移性拡散をブロックすることを示す図である。Ａ：示したように、ＣＤ４４ｖ６特異的ラットペプチド、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体またはコントロールペプチド（マウス）の存在下でＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞をＨＧＦで誘導した。ホスホ特異的抗体を使用して、ＭｅｔおよびＥｒｋの活性化を測定した。数値は誘導倍数を示す。Ｂ：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞をＢＤ１０ラットの右後脇腹に皮下注射した。腫瘍増殖から１週間後に、動物をＣＤ４４ｖ６ペプチド（腫瘍投与または静脈内注射）、コントロールペプチド、ＣＤ４４ｖ６抗体またはＰＢＳで処理した（材料および方法）。図１に記載したように、転移に関して腋窩リンパ節（左側）および肺（右側）を分析した。Ｃ：ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドのどちらかで処理した動物の肺の切片をＨ＆ＥおよびＰＡＳで染色した。Ｈ＆Ｅ−ヘマトキシリンおよびエオシン；ＰＡＳ−過ヨウ素酸シッフ反応。倍率１．５倍。Ｄ：示すように２８日にわたる処理による動物におけるＢＳｐ７３ＡＳｓ６腫瘍の増殖カーブ。ノギスを使用して、処理の開始後に毎週および２８日にわたり連続して、ＰＢＳ、ＣＤ４４ｖ６抗体、ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（マウス）で処理したラットの平均腫瘍体積を測定した。 インビボでのＣＤ４４ｖ６ペプチドの原発性腫瘍および転移への特異的結合を示す図である。Ａ：左側：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を固定し、１時間にわたりＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドまたはマウスペプチド（コントロール）のどちらかで染色した。２０倍の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ２ ＳＰ２）を使用して撮像した。右側：それぞれＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドとマウスペプチドの存在下においてＨＧＦでＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を誘導し、Ｅｒｋの活性化を測定した。数値は誘導倍数を示す。Ｂ：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞（３週間にわたり増殖させた）の皮下腫瘍を有するラットに、２００μｇのＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１マウスｖ６ペプチド（コントロール）を静脈内注射し、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２（ＡＲＴ、モントリオール、カナダ）を使用するＮＩＲＦ撮像により分析した。蛍光強度をＮＣ（正規化関数）で表示する。指定のペプチドの注射後の様々な時点で得た一連の蛍光データセットでは、２日の範囲内でラットｖ６ペプチドが腫瘍に結合するがマウスｖ６ペプチドは結合しないことを示す２４時間後のおよび４８時間後の蛍光シグナルが見られる。Ｃ：ＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドを注射したラット由来の腫瘍および肺のエクスビボ走査から、腫瘍領域全体だけでなくラットペプチドの転移への結合を示す肺の特定領域において特異的蛍光シグナルが見られた。 膵癌の同所性モデルにおいてＣＤ４４ｖ６ペプチドがヒト腫瘍細胞の転移を防ぐことを示す図である。Ａ：Ｌ３．６ｐｌ細胞をヒトｖ６ペプチドまたはコントロールとしてのラットｖ６ペプチドで処理した後、１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで誘導した。Ｅｒｋの活性化をウェスタンブロットで測定した。数字は誘導倍数を示す。Ｂ：Ｌ３．６ｐｌ細胞を雄のヌードマウス（材料および方法）の膵臓の上部に同所的に注射した。７日後、動物にヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロール（ラット）ペプチド（各２０μｇ）を注射した。ペプチド注射を週当たり３回繰り返した。最初のペプチド処理から２３日後に動物を屠殺した。腫瘍を単離し、ＣＤ４４ｖ６発現（ＢＩＷＡ）またはコントロールとしての二次抗体に関して染色した。ヘマトキシリンで核を染色した。Ｃ：ホスホ−Ｍｅｔ抗体およびＭｅｔ抗体を使用する、ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドで処理した動物由来のＬ３．６ｐｌ腫瘍の免疫蛍光染色。ＤＡＰＩで核を染色する。Ｄの上部：式 体積＝（幅）２×長さ／２を使用して、実験の終了時に、ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドのどちらかで処理した動物の腫瘍体積を測定した。バーは、実験の終了時の平均腫瘍体積を表す。Ｄの下部：１５匹の動物からなる、ペプチドの内の１つで処理した各群の動物。バーは、転移を有する動物のパーセントを示す。ペプチドの内の１つで処理した各群の動物は１５匹の動物から成った。全てのグラフにおいて、スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。 膵癌の同所性モデルにおいてＣＤ４４ｖ６ペプチドがヒト腫瘍細胞の転移を防ぐことを示す図である。Ｅ：コントロールペプチドまたはＣＤ３１特異的抗体を有するｖ６ペプチドで処理したＬ３．６ｐｌ腫瘍の染色。倍率は５０倍である。グラフは、５つの独立した腫瘍から算出した、平均血管数または平均血管サイズを示す。Ｆ：ｖ６ペプチド（培養培地中に２００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でまたは非存在下でＬ３．６ｐｌ細胞により産生されたヒトＶＥＧＦ濃度。バーは、３つの独立した実験で得た３通りからの平均ＶＥＧＦ濃度を反映する。Ｇの左側：ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドで処理した動物の肝臓の巨視的な転移を調べた。右側：バーは転移の平均数を示す。ペプチドの内の１つで処理した各群の動物は１５匹の動物から成った。全てのグラフにおいて、スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。 ヒト膵癌モデルの原発性腫瘍および転移におけるＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的蓄積を示す図である。Ａ：左側：ＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ヒトペプチドまたはＤＹ６８１標識ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドのどちらかでＬ３．６ｐｌ細胞を染色した。レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ２ ＳＰ２）で撮像した。右側：ＤＹ６８１ヒトｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドの存在下でＬ３．６ｐｌ細胞をＨＧＦで誘導し、Ｅｒｋの活性化を測定した。数字は誘導倍数を示す。Ｂ：図４に記載したように３週間にわたりＬ３．６ｐｌ腫瘍を同所的に誘導し、その後、ＤＹ６８１ヒトｖ６ペプチドまたはＤＹ６８１ラットｖ６ペプチドを１回静脈内注射した（各２０μｇ）。Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｉｍｐｕｌｓｅ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して、麻酔したラットにおいて注射から２４時間後にペプチドの結合を分析した。ペプチド処理していない、腫瘍がない動物および腫瘍を有する動物をコントロールとして使用した。 ヒト膵癌モデルの原発性腫瘍および転移におけるＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的蓄積を示す図である。Ｃ：Ｂに示す動物から原発性腫瘍、肝臓および脾臓を切除し、標識ペプチドの蛍光をエクスビボでモニタリングした。横のスケールは同期のシグナル強度を示す。 ＣＤ４４ｖ６ペプチドによる、既存の転移の復帰を示す図である。Ａ：実験手順の略図。ラットまたはヌードマウスにおいてＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞またはＬ３．６ｐｌ細胞を注射した。３週間にわたり腫瘍を成長させ、転移を３週の期間後に検出した。ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（ラットでは２００μｇ、ヌードマウスでは２０μｇ）で処理した群では、３週間後に処理を開始した。更に２１日後に動物を屠殺し、肺または肝臓の転移に関して分析した。Ｂ：ＢＳｐ７３ＡＳｓ６皮下腫瘍を有し、ｖ６ペプチド（ラット）またはコントロールペプチド（マウス）で処理したラットの肺を示す。下部の左側：定量化は転移の平均数を表す。各群で使用した動物の数を表３に示す。下部の右側：転移を有する動物の数のグラフ評価を表す。Ｃ：Ｌ３．６ｐｌ膵臓腫瘍を有し、ｖ６ペプチド（ヒト）またはコントロールペプチド（ラット）で処理したマウス由来の肝臓を示す。下部の右側：コントロールペプチド処理動物およびＣＤ４４ｖ６ペプチド処理動物における肝転移の数を評価するグラフを示す。下部の右側：転移を有する動物の数のグラフ評価を表す。 既に生じた転移においてＣＤ４４ｖ６ペプチドがアポトーシスを誘導することを示す図である。腫瘍細胞の注射から３週間後に肺転移を有する動物に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドを１日おきに注射した。指定の日に、各群の内の１匹の動物を屠殺した。開裂カスパーゼ−３および開裂カスパーゼ−８（材料および方法）に対する抗体を使用して、肺転移におけるアポトーシスをパラフィン切片でモニタリングした。転移の領域に印を付けた（Ｍ）。倍率は４．５倍である。実験を２回行ない、同様の結果であった。 表１から３を示す図である。 ラット膵臓細胞におけるＥＲＫの活性化へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。 ラット膵臓細胞におけるＥＲＫおよびＭｅｔの活性化へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。 結腸癌細胞におけるＨＧＦ誘導性クラスター形成へのペグ化ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を示す図である。 いくつかのＥＣにおいてＭｅｔおよび下流シグナル伝達の活性化にＣＤ４４ｖ６が必要であることを示す図である。様々なＥＣ（ＨＵＶＥＣ、ＨＡＯＥＣおよびＨＣＭＥＣ）を血清飢餓させ、いくつかの試薬（αＣＤ４４ｖ６、ｖ６ １４ｍｅｒならびにコントロールＩｇＧおよびコントロールペプチド）と共にインキュベートした。増殖因子ＨＧＦを添加し、細胞を溶解させた。細胞溶解物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロット分析にかけた。Ｍｅｔおよびその下流標的であるＥｒｋのリン酸化型を検出するホスホ特異的抗体により、ＭｅｔおよびＥｒｋの活性化を検出した。異なる試料の等量のローディングを確認するために、膜をストリッピング溶液と共にインキュベートし、全てのＭｅｔタンパク質およびＥｒｋタンパク質を認識する抗体で再度確かめた。数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪで算出した誘導倍数（fold induction）を示す。 ＶＥＧＦ−Ａ１６５により誘導されるＶＥＧＦＲ−２および信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存することを示す図である。様々なＥＣ（ＨＵＶＥＣ、ＨＡＯＥＣおよびＨＣＭＥＣ）を血清飢餓させ、いくつかの試薬（αＣＤ４４ｖ６、ｖ６ １４ｍｅｒならびにコントロールＩｇＧおよびコントロールペプチド）と共にインキュベートした。次いで、細胞をＶＥＧＦ−Ａ１６５で誘導し、溶解させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、ウェスタンブロット分析にかけた。受容体型チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−２およびその下流標的であるＥｒｋのリン酸化型を検出する抗体により、ＶＥＧＦＲ−２およびＥｒｋの活性化を検出した。総ＶＥＧＦＲ−２濃度および総Ｅｒｋ濃度を認識する抗体により、ローディングコントロールを行なった。数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪで算出した誘導倍数を示す。 Ａ：Ｌ３．６ｐｌ細胞においてＨＧＦにより誘導されるＭｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存することを示す図である。Ｌ３．６ｐｌ細胞をヒトｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールとしてのラットｖ６ペプチドで処理した後、１０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで誘導した。ＭｅｔおよびＥＲＫの活性化をウェスタンブロットで測定した。数字は誘導倍数を示す。実験を少なくとも５回繰り返した。Ｂ：ＨＧＦにより誘導されるｃ−Ｍｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６ ＨｅＬａ細胞に依存することを示す図である。飢餓させたＨｅＬａ細胞またはＨＴ２９細胞を３７℃で１０分にわたりｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共にインキュベートし、次いで指定の時点で、２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで誘導した。次いで、細胞を溶解させ、溶解物をホスホ−ＭｅｔおよびＭｅｔに関するウェスタンブロット分析にかけた。Ｃ：ＨＴ２９細胞においてＨＧＦにより誘導されるｃ−Ｍｅｔおよび信号伝達の活性化がＣＤ４４ｖ６に依存することを示す図である。ホスホ特異的抗体を使用して、上記に記載したようにＨＴ２９におけるＨＧＦ依存性のｃ−ＭｅｔおよびＥｒｋのリン酸化を測定した。示した箇所では、細胞をＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチド（実施例３の材料および方法を参照）で前処理した。ローディングコントロールをそれぞれｃ−Ｍｅｔ抗体とチューブリン抗体で染色した。 ＥＧＦおよびＥＲとは対照的に、ＴＧＦ−α、ＢＣ、Ｈｅｒ、ＨＢ−ＥＧＦまたはＡＲによるＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に完全に非依存的であることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、示したように細胞を２０ｎｇ／ｍｌの様々なＥｒｂＢリガンドで誘導した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥｒｂＢリガンド誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。 ＨＴ２９細胞においてＥｒｂＢ受容体のＥＧＦ依存性の誘導をＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドによりブロックすることができることを示す図である。血清飢餓させたＨＴ２９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４４ｖ６特異的ペプチド（ペプチド１＝１４ｍｅｒ、ペプチド２＝５ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共に５分にわたりプレインキュベートした。その後、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＴＧＦαで誘導して溶解させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ウェスタンブロッティングを使用して、ＥＧＦ誘導性のおよびＴＧＦα誘導性のＥｒｋキナーゼのリン酸化を検出した。 ヒトＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドがＨＧＦ誘導性の細胞散乱およびマトリゲルへの浸潤をブロックすることを示す図である。２４ウェルプレート中でＨＴ２９細胞の散乱を測定した。最初に、４．５×１０４個の細胞を３７℃で播種し、２４時間後に、更に２４時間にわたり細胞を血清飢餓させた。細胞を未処理のままにした（コントロール）、または後に２４時間にわたりＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。示した箇所では、細胞をｖ６特異的ペプチド（ヒトｖ６ ５ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドで処理した後、３０分にわたりＨＧＦで誘導した。位相差顕微鏡を使用して撮像した。倍率４０倍。 ＥＣの遊走にＣＤ４４ｖ６が必要であることを示す図である。ＨＵＶＥＣおよびＨＡＯＥＣをコンフルエンスまで増殖させ、滅菌ピペットチップで細胞単層を傷付けた。洗浄後、示すように、ＣＤ４４ｖ６に対する抗体、ＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドと共に細胞をインキュベートした。リガンドＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはＶＥＧＦ−Ａ１２１を添加し、２４時間後にＥＣの遊走を分析した。数字は、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪにより定量化した、スクラッチ領域における空白領域のパーセントを示す。 ＨＵＶＥＣの球状体（７５０個の細胞）を懸滴で生成したことを示す図である。１ｍｇ／ｍｌラット尾部コラーゲンＩおよび０．６％（重量／体積）メチルセルロースを含有する内皮細胞増殖培地にＨＵＶＥＣの球状体を懸濁させ、４８ウェルプレートに分配した（３０個の球状体／ウェル）。３７℃での凝固後に、１００ｎｇ／ｍｌ ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）またはコントロールペプチドとＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）とを含有する内皮細胞増殖培地で混合物を覆った。４８時間後に撮像し、コンピュータプログラムＩｍａｇｅＪで新芽形成を定量化した。 血管新生ランゲルハンス島により産生された血管新生因子の混合物へのＨＵＶＥＣの反応を、ＣＤ４４ｖ６特異的阻害剤により低減することができることを示す図である。ＨＵＶＥＣ細胞とＣＤ４４ｖ６抗体、ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチドとを混合し、次いで、コラーゲンゲル中に懸濁させた。８〜９週齢のＲＩＰ１ Ｔａｇ２マウスの膵臓から単離した過形成性血管新生ランゲルハンス島をＨＵＶＥＣ／コラーゲン混合物の上部に載置し、培地で覆った。３日毎に新たな抗体またはペプチドを添加し、５〜７日後に撮像した。ＥＣの血管新生反応を誘導した島の数を、分析した全ての島のパーセンテージとして示す。定量化のために、条件当たり６０個の島を分析した。ＣＤ４４ｖ６抗体およびＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）の両方が血管新生反応を低減させ、抗体で得た低減は有意である（ｐ＜０．０５）。 様々な濃度（注射当たり２μｇ、２０μｇおよび２００μｇ）でヒトｖ６ペプチドおよびこのＰＥＧ化誘導体（ＰＥＧ８４０およびＰＥＧ２０００）を使用する、転移および原発性腫瘍の増殖の阻害を示す図である。Ａ：Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を、１週間にわたりヌードマウスに同所的に移植し、その後、３週間にわたり週当たり３回、指定のペプチドを腹腔内注射した。実験の終了時に動物を屠殺して調べた。赤色の矢印は転移を示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。各群は３匹の動物から成った。 様々な濃度（注射当たり２μｇ、２０μｇおよび２００μｇ）でヒトｖ６ペプチドおよびこのＰＥＧ化誘導体（ＰＥＧ８４０およびＰＥＧ２０００）を使用する、転移および原発性腫瘍の増殖の阻害を示す図である。Ｂ：原発性腫瘍体積の定量化。Ｃ：動物当たりのマクロ転移の平均数の概要。 様々な濃度（注射当たり０．２μｇ、２μｇ、１０μｇおよび２０μｇ）でＣＤ４４ｖ６ペプチド（直鎖１４ｍｅｒ）およびヒト環状８ｍｅｒを使用する、転移および原発性腫瘍の増殖の阻害を示す図である。Ａ：Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を、１週間にわたりヌードマウスに同所的に移植し、その後、３週間にわたり週当たり３回、指定のペプチドを腹腔内注射した。実験の終了時に動物を屠殺して調べた。赤色の矢印は転移を示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。各群は５匹の動物から成った。 様々な濃度（注射当たり０．２μｇ、２μｇ、１０μｇおよび２０μｇ）でＣＤ４４ｖ６ペプチド（直鎖１４ｍｅｒ）およびヒト環状８ｍｅｒを使用する、転移および原発性腫瘍の増殖の阻害を示す図である。Ｂ：各動物における巨視的転移の平均数の概要。Ｃは、２μｇの投薬量から始まる転移性伝播の低下および２０μｇでの完全な阻害を示す。Ｃ：ｖ６ １４ｍｅｒおよび環状８ｍｅｒは原発性腫瘍の増殖を低減する。 原発性腫瘍の増殖に関する、ｖ６ １４ｍｅｒと、この誘導体（１４ｍｅｒＰＥＧ８４０、１４ｍｅｒＰＥＧ２０００、ミリストイル化１４ｍｅｒ、Ｄ−アミノ酸誘導体ＤＯＴＡ ＣＤ４４ｖ６−１４［ｄａａ７］およびＤＯＴＡ ＣＤ４４ｖ６−１４［ｒ１４］、環状８ｍｅｒ、環状５ｍｅｒならびにミリストイル化環状８ｍｅｒ）との対照比較を示す図である。Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を、１週間にわたりヌードマウスに同所的に移植し、その後、３週間にわたり週当たり３回、指定のペプチドを腹腔内注射した。実験の終了時に動物を屠殺して調べた。Ａ：指定の化合物（ｎ＝５）で処理した動物の平均腫瘍サイズを示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１を使用して有意性を算出した。各群は５匹の動物から成った。Ｂ：各群における動物の個々の腫瘍サイズ。 転移の阻害に関する、ｖ６ １４ｍｅｒと、この誘導体（１４ｍｅｒＰＥＧ８４０、１４ｍｅｒＰＥＧ２０００、ミリストイル化１４ｍｅｒ、Ｄ−アミノ酸誘導体ＤＯＴＡ ＣＤ４４ｖ６−１４［ｄａａ７］およびＤＯＴＡ ＣＤ４４ｖ６−１４［ｒ１４］、環状８ｍｅｒ、環状５ｍｅｒならびにミリストイル化環状８ｍｅｒ）との対照比較を示す図である。Ａ：指定の化合物に関する原発性腫瘍および肝転移の代表例。赤色の矢印は転移を指す。赤色の円：コントロール群における原発性腫瘍の非常に強力な血管新生に留意すべきである。Ｂ：転移を有する動物の数および動物当たりの転移の平均数の概要。 ＣＤ４４ｖ６ペプチドが十二指腸における腫瘍の数を低減することを示す図である。６週間にわたり、１８週齢のＡＰＣ／Ｍｉｎ／＋マウスをｖ６ １４ｍｅｒで処理し（腹腔内注射）、屠殺して十二指腸における総腫瘍数を評価した。Ａ：腫瘍数の巨視的分析。Ｂ：腫瘍のサイズによる総腫瘍数の統計的評価。 ｖ６ １４ｍｅｒによる処理によって、肺における原発性腫瘍の増殖および巨視的な転移形成が減少することを示す図である。マウス当たり１×１０６個のマウス４Ｔ１細胞を、５０μｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌを加えた５０μｌ ＲＰＭＩに希釈し、１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの第６乳腺脂肪体に注射した。注射から１週間後に、１００μｌ ＰＢＳに溶解した２０μｇのマウスｖ６ １４ｍｅｒまたは１００μｌ ＰＢＳに溶解した２０μｇのコントロールペプチド（ラットｖ６ １４ｍｅｒ）をマウスに腹腔内注射した。２週間にわたり週毎に３回、注射を行なった。２週間後にマウスを屠殺し、原発性腫瘍および肺を摘出した。Ａ：ｖ６ペプチド処理群における腫瘍体積の全般的な減少。Ｂ：原発性腫瘍の血管新生をモニタリングするための内皮マーカーＣＤ３４に関する免疫蛍光染色。全血管領域の減少をグラフで表す。Ｃ：ｖ６ペプチドにより巨視的な肺転移が減少する。黒色の矢印は転移の例に印を付ける。スケールバーは１ｃｍのサイズに相当する。肺転移の平均数の統計的評価。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００５を使用して有意性を算出した。各群は５匹の動物から成った。 Ａ：ｖ６−ＰＥＧ３０００−パルミチン酸アミドおよびＶ６−ＰＥＧ２０００のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。Ｂ：ＰＥＧ−ＱＤ、１０％ｖ６−ＰＥＧ−ＱＤおよび３０％ｖ６−ＰＥＧ−ＱＤのＳＥＭ像を示す図である。 ＣＤ４４ｖ６ペプチド結合量子ドットがＣＤ４４ｖ６発現腫瘍細胞に特異的に結合することを示す図である。Ａ：パネル１〜３：１００μｇ／ｍｌのＰＥＧ化量子ドット（コントロール）、１０％ＣＤ４４ｖ６−ペプチド−ＰＥＧ−ＱＤまたは３０％ＣＤ４４ｖ６−ペプチド−ＰＥＧ−ＱＤと共にインキュベートしたＡＳ１０細胞またはＡＳｓ６細胞をＤＥＰＩで共染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した。パネル４：ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）を遺伝子導入したＡＳ１０細胞およびＣＦＰ（青緑色）を遺伝子導入したＡＳｓ６細胞を共培養し、３０％ｖ６−ペプチド−ＱＤで染色した。倍率４０倍。 ＣＤ４４ｖ６ペプチド結合量子ドットがＣＤ４４ｖ６発現腫瘍細胞に特異的に結合することを示す図である。Ｂ：量子ドット染色細胞の割合を定量化した。Ｃ：ＡＳ１０細胞またはＡＳｓ６細胞を、１０分にわたりＰＢＳまたは１００μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＱＤ、１０％ＣＤ４４ｖ６−ペプチド−ＰＥＧ−ＱＤまたは３０％ＣＤ４４ｖ６−ペプチド−ＰＥＧ−ＱＤと共にインキュベートし、ＦＡＣＳ測定によりＱＤ結合に関して分析した。
いくつかの本発明の好ましい実施形態に関して本発明をより詳細に説明する前に、一般的な定義を以下に記載する。
本明細書で具体的に開示していない任意の構成要素（element）または構成要素（elements）、限定事項（limitation）または限定事項（limitations）の非存在下で、以下で例示的に説明する本発明を適宜実行することができる。
特定に実施形態に関しておよびいくつかの図面を参照して本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
用語「含む」を本発明の説明および特許請求の範囲で使用する場合、該用語は、その他の構成要素を除外しない。本発明の目的のために、用語「からなる」は用語「から構成される」の好ましい実施形態であるとみなす。以下において群が少なくともいくつかの実施形態を含むと定義する場合、このことは、これらの実施形態のみから好ましくはなる群も開示していると理解すべきである。
本発明の目的のために、用語「得られる」は、用語「得ることができる」の好ましい実施形態であるとみなす。以下において例えば抗体を特定の供給源から得ることができると定義する場合、このことは、この供給源から得られる抗体も開示していると理解すべきである。
単数名詞を示す際に不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を使用する場合、その他に何らかが具体的に述べられている場合を除き、これらはその名詞の複数形を含む。用語「約（about）」または「約（approximately）」は本発明に関連して、当該特徴の技術的効果が依然として保証されると当業者が理解するであろう精度の間隔を意味する。この用語は、示した数値の±２０％の、好ましくは±１５％の、より好ましくは±１０％の、更により好ましくは±５％のずれを典型的には示す。
更に、本明細書および特許請求の範囲において、類似の構成要素を区別するために用語「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等を使用するが、これらを逐次的なまたは経時的な順序で記載する必要はない。そのように使用する用語を適切な状況下で交換可能であること、および本明細書に記載の本発明の実施形態を本明細書に記載以外のまたは本明細書で例示以外の順序で実行可能であることを理解すべきである。
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」または「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」または「（ｉ）」、「（ｉｉ）」、「（ｉｉｉ）」、「（ｉｖ）」等が方法または使用またはアッセイの工程に関する場合、別段の指示がない限り、工程間に時間コヒーレンスまたは時間間隔コヒーレンスは存在しない。即ち、本明細書で上記のまたは下記の用途において別段の指示がない限り、工程を同時に行なうことができる、または各工程間に数秒の、数分の、数時間の、数日の、数週間の、数カ月のもしくは更に数年の時間間隔が存在することができる。
専門用語をその一般的な意味で使用する。ある用語に特定の意味を与える場合、以下のその用語を使用する文脈において、その用語を定義するだろう。
上述したように、本発明は、ヒトの転移性癌の処置に使用するためのペプチドまたはペプチド化合物に関する。
本発明は、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）またはアミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）のペプチドがヒト膵癌細胞の転移を阻害することができるだけでなくヒト膵癌の同所性動物モデルにおいて既に生じた転移を除去することもできるという、以下に記載の実験的発見にある程度基づく。そのため、様々な転移性癌で同じ効果を観測することができると仮定するのが妥当であると思われ、特に、この癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す場合に妥当であると思われる。ＮからＡへのおよびＥからＡへの変異により、アミノ酸配列Ａ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ａ（配列番号３）のペプチドがＭｅｔ活性化を抑止することができることが更に分かった（Matzke他、Cancer Res. (2005)、65 (14)、6105〜6110を参照）。ＫからＡへのおよびＦからＡへの非保存的アミノ酸置換（Matzke他、上記参照）にもかかわらずＮ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）によるＭｅｔ活性化への効果が維持されるならば、アミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（配列番号１）（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択される）のペプチドを膵癌の処置だけでなく一般的な転移性癌の処置にも使用することができると仮定するのが妥当であると思われる。
そのため、本発明は一実施形態において、ヒトの転移性癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹかを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む化合物に関する。
好ましくは、本発明は一実施形態において、ヒトの転移性癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む化合物に関する。一例は、アミノ酸配列Ａ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ａ（配列番号３）のペプチドまたはこのペプチド模倣物である。
更により好ましくは、本発明は一実施形態において、ヒトの転移性癌の処置において使用するための化合物であって、少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、ＥまたはＤを含む群から選択される）（配列番号５）を含むペプチドを含む化合物に関する。最も好ましい実施形態の一例として、ペプチドはアミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）を含むことができ、好ましくは該アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）からなることができる。
用語「ペプチド」は本明細書で使用する場合、少なくとも上述の５個のアミノ酸および最大で１４個のアミノ酸を含む任意の化合物を示す。
本発明に係るペプチドが上述の５個のアミノ酸よりも多くを有する場合、このアミノ酸は、例えばアミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）のペプチドまたはそのバリアント中に見られるものであることができる。配列番号６のアミノ酸７位〜１１位が配列番号２に相当することが留意される。配列番号２のペプチドに関しては、Ｍｅｔ活性化への悪影響を有することなくアミノ酸１位、２位、３位、４位、５位、６位、１２位、１３位または１４位をアラニンに置換することができる、アラニン置換によるリンカースクリーン分析（linker screen analysis）で発見されている。そのため、そのようなペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ７が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１３が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹを含む群から選択される）（配列番号７）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む任意のペプチドであることができる。好ましくは、上記に提示した原理に従って選択を行なう。そのため、Ｘ１は、Ｋに類似のアミノ酸または非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのどちらかであることができる。同様の考察をＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３またはＸ１４に適用する。好ましい一実施形態では、そのようなより長いペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む。更により好ましい実施形態では、そのようなより長いペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）のアミノ酸６〜１２位、５〜１３位、４〜１４位等を含む。
ペプチドは直鎖状であることができ、分枝状であることができ、および分枝しているまたは分枝していない環状であることがきる。環状の、分枝状のおよび分枝した環状のペプチドは、翻訳後の天然プロセスによって生じることができる、または合成方法によって作製され得る。
最も好ましい実施形態のいくつかでは、本発明に係るペプチドは、上述したように５個のまたは１４個のアミノ酸を含み、より好ましくは該アミノ酸から成り、配列番号１、２、３、４、５または６〜１０のペプチドを含む。本発明の最も好ましい実施形態は配列番号２または配列番号６のペプチドに関する。
用語「ペプチドを含む化合物」は、例えば薬学的に許容される塩の形態で、ペプチドを含む化合物を指す。この用語は、例えば化学的にまたは酵素的に改変されているペプチドも同様に指し、その結果、例えば配列番号１、２、３、４または５のペプチドは、以下に記載する更なる改変を含む。配列番号２のペプチドの改変型が特に好ましい。
そのため、用語「ペプチドを含む化合物」およびその文法的バリエーション、例えば「ペプチド化合物」として本明細書に記載のペプチドの塩が挙げられ、好ましくは本明細書に記載のペプチドの薬学的に許容される塩が挙げられる。用語「薬学的に許容される塩」に包含される塩は、本発明のペプチド化合物の非毒性塩を指す。代表的な塩およびエステルとして、以下のものが挙げられる：アセテート、アスコルベート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ボレート、カミシレート（caamsylate）、カーボネート、シトレート、ジヒドロクロリド、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、シクロヘキシルスルファメート、キネート、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルコネート、グルタメート、グリセロホスフェート（glycerophophates）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、ｎ−メチルグルカミン、オレエート、オキサレート、パルモエート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ペルクロレート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクツロネート、サリシレート、ステアレート、スクシネート、スルフェート、スルファメート、サブアセテート、スクシネート、タンエート、タートレート、トシレート、トリフルオロアセテートおよびバレレート。その他の塩として、Ｃａ塩、Ｌｉ塩、Ｍｇ塩、Ｎａ塩およびＫ塩；リシンまたはアルギニン等のアミノ酸の塩；グアニジン、ジエタノールアミンまたはコリン；アンモニウム、置換アンモニウム塩またはアルミニウム塩が挙げられる。従来の方法によりこの塩を調製する。
しかしながら、「ペプチドを含む化合物」のペプチド成分は、配列番号１〜９のいずれかのペプチド配列に加えて、その他のタンパク質由来のアミノ酸配列を含むことができる。従って、本発明のペプチド化合物として、異種アミノ酸配列に融合した配列番号１〜９から本質的になる異種融合ペプチドが挙げられる。異種アミノ酸配列は、１個の、２個の、３個の、４個のまたはより多くのアミノ酸を含むことができる、または該アミノ酸からなることができる。異種アミノ酸配列は、例えば少なくとも５個のまたは少なくとも１０個のまたは少なくとも２０個の異種アミノ酸を含むことができる、または該異種アミノ酸からなることができる。異種アミノ酸を、ＣＤ４４由来の配列である配列番号１〜９のＮ末端および／またはＣ末端に融合させ、細胞膜を横切る転位の改善等の、その他の機能性を付与することができる。
本発明のペプチド成分が単離されたペプチドであることが好ましい。用語「単離」は、自然の状態から「人の手によって」変更されたことを意味する。「単離」された組成物または物質が天然に存在する場合、該組成物または物質は、その元々の環境から変化しているもしくは該環境から取り出されているまたはその両方である。この用語を本明細書で用いる場合、例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの天然の状態で共存する材料から分離されている、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。
本発明のペプチドが純粋な状態であることも好ましい。好ましくは、ペプチドは≧８０％の純度であり、好ましくは≧９０％の純度であり、より好ましくは≧９５％の純度であり、更により好ましくは≧９９％の純度であり、夾雑している巨大分子、特にその他のペプチドに対して９９．９％の純度を超えている薬学的に純粋な状態が特に好ましい。ペプチドが感染因子および発熱因子を含まないことが好ましい。
好ましくは、精製されたペプチドは、その他のペプチドを実質的に含まない。この文脈で使用する場合、用語「純粋な」は、二量体等の別の物理的形態での同じペプチドの存在を排除しない。
本発明のペプチドを、化学合成によりまたは宿主細胞中での組み換え発現により調製することができる。化学合成による調製が好ましい。タンパク質産物として、例えば配列番号２のまたは本発明のその他のペプチドの内のいずれかの化合物の、液相ペプチド合成または固相ペプチド合成の技法による産生が可能である。合成的なペプチド合成アプローチは一般に、自動合成器および固相としての適切な樹脂の使用を伴い、該樹脂には、所望のペプチドのＣ末端のアミノ酸が結合している。次いで、合成が完了するまで、典型的にはＦＭＯＣベースのまたはＢＯＣベースの化学プロトコルのどちらかを使用して、適切に保護された形態の次の所望のアミノ酸を連続的に連結させることにより、Ｎ末端方向へのペプチドの伸長が達成される。次いで、通常は樹脂からのペプチドの開裂と同時に、保護基をペプチドから開裂し、次いで、従来の技法を使用して、例えば、溶媒としてアセトニトリルを使用し、イオン対形成剤としてトリフルオロ酢酸を使用する逆相ＨＰＬＣにより、ペプチドを単離して精製する。そのような手順は一般に、多くの刊行物に記載されており、例えばStewartおよびYoung、「Solid Phase Peptide Synthesis」、第2版、Pierce Chemical Company、Rockford、III. (1984)を参照することができる。
用語「ペプチド模倣物」は、対応するペプチドを模倣するように設計されている低分子タンパク質様鎖を指す。ペプチド模倣物は、既存のペプチドの改変から、またはペプトイドおよびβ−ペプチド等のペプチドを模倣する同様のシステムを設計することにより典型的には生じることができる。アプローチに関係なく、生物活性に悪影響を及ぼすことなく代謝安定性および生物学的利用性等の分子特性を有利に調整するように、改変された化学構造が設計される。
典型的には、ペプチド模倣物は、ペプチド結合のアミド基の代わりにメチル化アミド基等の改変骨格を有し、プロテアーゼによる分解に対するペプチド模倣物の安定性を高めることができる。代わりにまたは加えて、ペプチド模倣物として、非天然アミノ酸またはＤ−鏡像異性体を挙げることができる。ペプチド模倣物の共通のテーマは、骨格構造中のおよび／またはアミノ酸中の分子変化が、ペプチド模倣物の生物活性に悪影響を及ぼさないように、対応するペプチドと比べてペプチド模倣物の全体構造への実質的影響を有すべきでないことである。そのため、ペプチド模倣物は、対応するペプチドの同配体である。好ましいペプチド模倣物は例えば等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。従って、本発明によれば、ペプチド模倣物は、以下に記載する実験において例えば配列番号１、２、３、４または５のペプチド等の以下に記載のペプチドと同じ活性を有するだろう。最も好ましいペプチド模倣物は、配列番号２のペプチド模倣物等の５個のアミノ酸を有するもの、８個のアミノ酸を有するもの（配列番号１６、１７または１８のペプチド模倣物等）または１４個のアミノ酸を有するもの（配列番号６、７、８、９または１０を参照）である。そのようなペプチド模倣物は、好ましくは等配電子のペプトイドであり、該ペプトイドは、骨格のペプチド結合中にポリ−Ｎ−置換グリシンを含む。
本発明はまた、例えばヒトの転移性癌を処置するための医薬組成物としてのペプチドまたはペプチド模倣物の改変型の使用も意図する。そのような改変型は例えば、例えばプロテアーゼによるペプチドまたはペプチド模倣物の分解を減少させるおよびペプチドまたはペプチド模倣物の安定性を高めるために、ＦＭＯＣもしくはＢＯＣ等のブロッキング基によりまたはメチル化等のアルキル化により、各Ｎ末端および／またはＣ末端で化学的に改変されているペプチドまたはペプチド模倣物に関する。その他の改変として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、即ち環状ペプチド、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化した環状の５ｍｅｒ（配列番号２をベースとする）、６ｍｅｒ、８ｍｅｒまたは１４ｍｅｒ等のミリストイル化した環状ペプチド等のミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性の付加、ユビキチン化およびｓｕｍｏ化が挙げられる。そのようなペプチド模倣物の例を表４に示す。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、２０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧまたは２００〜２００００Ｄａの範囲の分子量を有するＰＥＧでペグ化した１４ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、環状８ｍｅｒまたは環状５ｍｅｒである。典型的なペプチド模倣物は１つまたは複数の改変を有することができる、即ち環状であることができる、ならびに該ペプチド模倣物を更にミリストイル化することができる、ペグ化することができるおよび／またはＤ−アミノ酸の使用による等の本明細書に記載の任意のその他の方法で改変することができる。ペプチド模倣物の典型例として、配列番号１〜１８とＬ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸とを有するものが挙げられる。
例えばZitzmann他（2005、Journal of Nuclear Medicine、46(5):782）に記載された、当業者に一般的に既知である方法により、ペプチドの環化を行なう。
本発明の化合物を、細胞毒性化合物および／または化学療法薬と併用投与することもできる。本発明の化合物を１種もしくは複数種の細胞毒性化合物および／もしくは化学療法薬と一緒に投与することが可能である、または、細胞毒性化合物を本発明のペプチドもしくは化合物に共有結合的に接合させることが可能である。好ましい細胞毒性化合物はマイタンシノイドであり、好ましい化学療法化合物はタキサンである。
加えてまたは代わりに、本発明に係るペプチドまたはペプチド模倣物の好ましい改変型として、例えば、生物学的特性が改善されている、例えば溶解性、吸収、生物学的半減期等が改善されている、本発明に係るペプチドまたはペプチド模倣物の化学的なまたは酵素的な改変型が挙げられる。改変により、分子の毒性を選択的に低減することができ、分子のあらゆる望ましくない副作用等を選択的に除去するまたは軽減することができる。例えば生物学的半減期を増加させる改変として、ペグ化、ヘシル化、パシル化、グリコシル化末端でシアル酸残基を有するグリコシル構造を有する等が挙げられる。
用語「ペグ化（pegylated）」およびその文法的バリエーション、例えば「ペグ化（pegylation）」は全て、ペプチドまたはペプチド模倣物が様々な型で（例えば単離型で、薬学的に許容される塩として等）、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド模倣物に共有結合するＰＥＧ部分、即ちポリエチレングリコール（polyethylenglycol）鎖を含むことを説明する。
以下に記載するように、配列番号２のヒトＣＤ４４ｖ６ペンタペプチドのカウンターパートであり、ＰＥＧ７５０またはＰＥＧ３０００で改変されている、配列ＮＥＷＱＧ（配列番号１１）のラットＣＤ４４ｖ６ペンタペプチドは、少なくともＰＥＧ３０００部分が、約６２０Ｄａである配列番号１１の配列の算出した分子量よりも著しく高い分子量、即ち３０００Ｄａを有するにもかかわらず、ＭｅｔおよびＥｒｋのＨＧＦ刺激性のおよびＣＤ４４媒介性の活性化を阻害することができる。更に、そのような分子量のＰＥＧは、長いジグザグ構造を有することが知られている。従って、驚くことに、配列番号１１のペンタペプチド等の比較的小さいペプチドの改変により活性は失われない。同じ事を配列番号２のペンタペプチド、このペプチド模倣物またはより長いペプチド、例えば配列番号６のペプチド等のヒトカウンターパートに適用すべきであると結論付けるのが正しいと思われる。更に驚くことに、非ペグ化ペプチドと比べてペグ化ペプチドによりＥＲＫシグナル伝達がより効果的に阻害される。
用語「ＰＥＧ部分」または「ポリエチレングリコール（Polyethylenglycol）部分」は以下で使用する場合、約２００Ｄａ〜約３５，０００，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧを指す。約４００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの、好ましくは約６００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの、更により好ましくは約７００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧを使用することが好ましい。最も好ましいＰＥＧは、約８００Ｄａ〜約８，０００Ｄａの、約９００Ｄａ〜約７，０００Ｄａの、約１，０００Ｄａ〜約６，０００Ｄａの、例えば約２，０００Ｄａの、約３，０００Ｄａの、約４，０００Ｄａのまたは約５，０００Ｄａの平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、２００〜２００００Ｄａの範囲の平均分子量を有する。
ＰＥＧは概して、その平均分子量により命名される。そのため、９個の繰り返し単位を有するＰＥＧは４００Ｄａの平均分子量を有し、ＰＥＧ−４００と呼ばれるだろう。そのため、本発明のために検討するＰＥＧは、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ５０、ＰＥＧ８４０、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１２０００等のＰＥＧであることができる。なぜならば、これらは例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているからである。
ＰＥＧは、直鎖状の、分枝状の、星状のまたは櫛状のＰＥＧとして生じることができる。分枝状のＰＥＧは、中心コア基から放射状に広がる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。星状のＰＥＧは、中心コア基から放射状に広がる１０〜１００個のＰＥＧ鎖を有する。櫛状のＰＥＧは、通常はポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。
本発明の目的のために、直鎖状のＰＥＧを使用することが通常は好ましく、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ５０００またはより高い分子量のＰＥＧ等の約１，０００〜６，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有する直鎖状のＰＥＧを使用することが特に好ましい。
ＰＥＧ部分を更に改変することができる。例えば、脂肪アルコールおよび脂肪酸でＰＥＧ部分を共有結合的に改変することができる。そのような更なる改変により、改変ペグ化ペプチドおよび改変ペグ化ペプチド模倣物を構築することまたはミセル様構造体またはリポソーム様構造体に少なくとも組み込むことが可能になる。
本発明はまた、そのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体にも関する。ペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物、およびそのようなペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物を含む医薬組成物は、例えば、薬物溶解性の改善、投薬の頻度の低減、循環半減期の延長、薬物安定性の上昇、タンパク質分解からの保護の強化等を提供することができる。脂肪アルコール鎖または脂肪酸鎖等の更なる改変により、細胞膜との相互作用の改善が可能になることから、ミセル様構造体またはリポソーム様構造体により、ペグ化ペプチドまたはペグ化ペプチド模倣物をより効率的に送達することが更に可能になる。更に、ミセル様構造体またはリポソーム様構造体は、化学療法薬等の追加の薬学的活性剤を含むことができる。膵癌の場合、この薬剤として例えばゲムシタビンを挙げることができる。乳癌の場合、この薬剤としてハーセプチンを挙げることができる。
本発明はまた、追加の薬学的活性剤を含むそのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体にも関する。そのようなミセル様構造体またはリポソーム様構造体により、ペグ化ペプチドまたはこのペグ化ペプチド模倣物によるそのような化学療法薬の例えばＣＤ４４ｖ６を発現する腫瘍へのターゲティングが可能になり、そのため、治療のターゲティングおよび改善が可能になる。
ペプチドまたはペプチド模倣物をＰＥＧ部分で改変する方法は当業者に既知である。ＰＥＧ部分の共有結合を化学的にまたは酵素的に行なうことができる。
化学的な改変における最初の工程では概して、ＰＥＧポリマーの一方の末端または両方の末端のどちらかが官能化される。官能化により、単官能性の、ホモ二官能性のまたはヘテロ二官能性のＰＥＧを区別することができる。
化学的なペグ化プロセスは概して、２つのタイプ、即ち溶液相バッチプロセスまたはオンカラムフェドパッチプロセス（on-column fed-batch process）に分類され得る。一般に採用されるバッチプロセスは、好ましくは４〜６℃の温度での、適切な緩衝溶液中での試薬の混合、その後の、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の技法を使用する所望の産物の分離および精製を含む。
ＰＥＧ誘導体に適した官能基の選択は、ＰＥＧに連結され得る分子上の利用可能な反応基の種類に基づく。タンパク質およびペプチドの場合、典型的な反応性アミノ酸として、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンが挙げられる。アルデヒド官能性ポリマーとの接合による部位特異的な部位として、Ｎ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボン酸を使用することもできる。例えばペプチドのＮ末端のみを除いてアミノ酸とＰＥＧとを反応させないことが好ましい場合、例えばＦＭＯＣでアミノ酸の官能基をブロックし、ペプチドをペグ化し、次いでアミノ酸を脱ブロックすることができる。
ペグ化ペプチド等のＰＥＧ誘導体を形成するために使用する技法は一般的に、ＰＥＧポリマーと、ヒドロキシル基と反応する基、典型的には無水物、酸塩化物、クロロギ酸塩および炭酸塩とを反応させている。第２世代のペグ化化学では、アルデヒド、エステル、アミド等のより効果的な官能基を接合に利用可能である。
ヘテロ二官能性ＰＥＧは、２つの構成成分を連結するのに非常に有用であり、この連結では、親水性で柔軟な生体適合性のスペーサが必要である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮＨＳエステルである。
本発明に係るペグ化ペプチドおよびこのペグ化ペプチド模倣物を、場合により薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物の形態で提供することができる。
以下では、本発明に係る化合物、即ちペプチド、このペプチド模倣物およびこれらの改変型、これらの化合物を含む医薬組成物ならびにこれらの化合物を使用する方法をどのようにしてヒトの転移性癌の処置に使用することできるかを述べる。以下において転移性癌の処置を言及する際は常に、この言及は、好ましい実施形態として、以下に記載するペンタペプチド、即ち配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５のペンタペプチド、特に配列番号２のペンタペプチド、これらのペプチド模倣物またはこれらの改変型、例えばこれらのペグ化型の使用を意図すると理解されたい。
以下に記載の実験から導き出すことができるように、実験で使用したペプチドは、膵癌モデルにおける転移の形成を阻害することできただけでなく、既に形成された転移の退縮を誘導することができた。述べたように、本発明は、特定の乳癌、転移性癌を処置するための化合物、医薬組成物の使用ならびに該処置への本明細書に記載の方法の適用に関する。
本発明に係る転移性癌として、ＣＤ４４ｖ６の発現が癌組織で観測されている、または例えばＣＤ４４ｖ６抗体による対応する検査時に観測され得る転移型の癌が挙げられる。そのため、本明細書に記載の化合物および医薬組成物による処置に患者が適格であるかどうかを調べるために、腫瘍組織の組織診およびＣＤ４４ｖ６の発現に関する検査を行なうことができる。腫瘍がＣＤ４４ｖ６を発現することが明らかになり得る場合には、および転移が形成され始めているまたは既に形成されており、おそらく体中に広がっている場合には、この腫瘍を本発明に係る転移性癌とみなす。本発明に係る転移性癌として、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌、頭頸部扁平上皮癌（head and neck sqamous cell cancer）、乳癌およびその他の転移型が挙げられる。
ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌および乳癌等の様々な癌のそのような転移癌型を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（7th edition, 2010, Springer）に従って同定することができる。
本発明に係る転移性癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶの癌と分類することができる。対癌米国合同委員会のＴＮＭ（腫瘍結節転移）病期分類システムにより、所属リンパ節（Ｎ）に転移があるかどうか、および遠隔転移が既に検出され得る（Ｍ）かどうかの問題である病期分類、ここで病期分類とは原発性腫瘍（Ｔ）のサイズおよび範囲による癌の分類である、が可能になる。次いで、この指標は、患者の治療において取るべき様々な経路に関する指標として概して受け取られ、この指標により、疾患の信頼性が高い予後も可能になる。これが、ＴＮＭシステムが腫瘍医にとって不可欠なツールとなっている理由である。遠隔転移を臨床的に検出することができないが、遠隔転移が発生し始めている可能性がある場合、パラメータＭは０の値、即ちＭ０を受け取る。ＭをＭ０に設定する場合、ＴおよびＮの値に応じて患者をステージＩＩＩと分類することができる。そのため、例えば、任意のＴ、Ｎ３およびＭ０の場合、患者をステージＩＩＩまたは例えば乳癌の場合にはステージＩＩＩｃと分類することができる（対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアル（第7版、2010、Springer）の３６２頁を参照）。そのようなステージＩＩＩの患者のまたはステージＩＩＩの最高のサブクラス（例えば乳癌に関するステージＩＩＩＣ）を有する患者の骨髄中において、循環腫瘍細胞および微小転移が更に示される場合、これにより予後が悪化され得る。そのため、本発明の目的のために、転移性癌を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＩＩと分類することができる。
好ましくは、本発明に係る転移性癌の場合、ＭはＭ１である、即ち遠隔転移を臨床的に検出することができ、その結果、転移性腫瘍を、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（第7版、2010、Springer）に従ってステージＩＶと分類することができる。
本発明が転移性癌に言及する場合には常に、最も好ましくは本発明がホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌または乳癌等の癌に関する場合には常に、この癌は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルのＴＮＭ解剖学的段階／予後群システム（7th edition, 2010, Springer）に従ってステージＩＶと分類できることを理解すべきである。対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアル（7th edition, 2010, Springer）の各章（例えば、結腸直腸癌に関しては１４３〜１４６頁、膵癌に関しては２４１〜２５０頁、扁平上皮癌に関しては３０１〜３１４頁、３４７〜３７６頁等を参照）に見出すことができる、本システムによる各癌の分類に関する特定の要件が参照により援用される。
そのため、特に好ましい実施形態は、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌または乳癌等の転移性癌を処置するための、以下に記載するペンタペプチド、例えば配列番号１、２、３、４または５のペンタペプチド、最も好ましくは配列番号２のペンタペプチド、このペプチド模倣物またはこれらの改変型、およびこれらの化合物を含む医薬組成物の使用に関し、該転移性癌は、対癌米国合同委員会の癌病期分類マニュアルに従ってステージＩＶと分類できる。
化合物およびこの塩を、少なくとも１種のそのような化合物のみを含む、または場合により、薬学的に許容される担体、賦形剤および／もしくは希釈剤との混合物で少なくとも１種のそのような化合物を含む、医薬組成物（例えば、液体、懸濁液、エマルション、ロゼンジ剤、サシェ、アンプル、エアロゾル、粉剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射液、溶液等）として上述したように製剤化することができる。
化合物／この塩および医薬組成物を、例えば吸入による経口投与用に、経鼻投与用に、または皮下注射等の注射による投与用に製剤化することができる。
これより実験に関して本発明を説明するが、実験は限定の意味で解釈されるべきではない。
（実施例）
１．材料および方法
１．１ 細胞株
ラット膵癌細胞株ＢＳｐ７３ＡＳ（ＡＳとも表す）およびその形質移入体が説明されており（Orian-Rousseau他、Genes & Development(2002)、16:3074〜3086）、それらを、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ、ケルベ、ドイツ）を加えたＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）中で増殖させた。ヒト膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Bruns他、Neoplasia (1999)、1、50〜62）を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ、ケルベ、ドイツ）、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミンおよびＭＥＭビタミン溶液（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、アイデンバッハ、ドイツ）を補充したＤＭＥＭ（低グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）中で維持した。
１．２ 抗体およびその他の試薬
ＣＤ４４ｖ６に対するヒトモノクローナル抗体（ＶＦＦ１８）はＢｅｎｄｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、キャンパスヴィエナバイオセンター２、Ａ−１０３０、ヴィエナ、オーストリア）からの贈与であり、抗ＥＲＫ１（Ｋ−２３）、ｃ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）およびＧＦＰ抗体（ｓｃ−１０１５２５）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ハイデルベルク、ドイツ）からであり、開裂カスパーゼ−８抗体（ＩＭＧ−５７０３）はＩｍｇｅｎｅｘ（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）からであり、ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ１３．３）はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ハイデルベルク、ドイツからであり、開裂カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）、ホスホ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）、Ｍｅｔ（２５Ｈ２）およびホスホ−ＥＲＫホスホ−ｐ４４／４２抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ビバリー、英国）からであった。ラットエクソンｖ６特異的抗体１．１ＡＳＭＬが説明されている（Gunthert他、Cell(1991)、65、13〜24）。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された二次抗体はＤａｋｏ（グロストルップ、ドイツ）からであった。Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＲ５４６ヤギ抗ウサギ二次抗体をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。ＨＧＦをＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ハンブルク、ドイツ）から購入した。ＣＤ４４ｖ６ラットペプチドおよびＣＤ４４ｖ６ヒトペプチド（１４ｍｅｒおよび５ｍｅｒ）が説明されている（Matzke他、Cancer Res. (2005)、65(14)、6105〜6110）。ラット１４ｍｅｒの配列はＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１０）であり、ラット５ｍｅｒはＮＥＷＱＧ（配列番号１１）に対応する。ヒト１４ｍｅｒはＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号６）に対応し、ヒト５ｍｅｒは以下の配列を有する：ＮＲＷＨＥ（配列番号２）。インビボでの撮像実験用に、ラット１１ｍｅｒ ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１２）、マウス１１ｍｅｒ ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ（配列番号１３）およびヒト１１ｍｅｒ ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号１４）を蛍光色素ＤＹ６８１で標識した。ラット細胞またはラット同系モデルの場合におけるコントロールペプチドとして、特異的ラットｖ６ペプチドと同一の長さのヒトｖ６ペプチドを使用した。ヒト腫瘍細胞またはヒト同所性腫瘍モデルの場合、コントロールとしてラットｖ６ペプチドを使用した。全てのペプチドはＢａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス）またはＩｎｔａｖｉｓ（ケルン、ドイツ）により産生された。凍結乾燥ペプチドを１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌのストック濃度まで再懸濁した。ＰＢＳ中に希釈することにより、最終希釈液を得た。
１．３ ｓｈＲＮＡのレンチウイルス遺伝子導入
Ｍｅｔをサイレンシングするために使用するレンチウイルスシステムは既に説明されている（Corso他、Oncogene (2008)、27(5):684〜93）。他に記載されているようにレンチウイルスを産生した（Vigna他、J.Gene Med. (2000)、2(5):308〜16）。手短にいうと、４×１０６個の２９３Ｔ細胞（ｐ１２〜１５）を１０ｃｍのプレートに播種した。２４時間後にパッケージングベクターＶＳＶ−Ｇ、ＰＭＤＬおよびＲｅｖ、ＴｅｔＲならびにレンチウイルス構築物（Ｍｅｔ−ｓｈＲＮＡ構築物またはコントロール−ｓｈＲＮＡ構築物のどちらか）を混合し、４５０μｌの最終体積までＴＥを添加した。この混合物に、４５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。ボルテックスおよび５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ−ＴＥ−ＣａＣｌ２混合物を全速力でボルテックスしつつ、５００μｌの２×ＨＢＳ溶液を滴加した。沈殿物を２９３Ｔ細胞に添加した。１６時間後、培地を置き換えて５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含有する新鮮培地を添加した。２４時間後および４８時間後に培地を回収した。次いで、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、ウイルス含有培地を標的細胞ＢＳｐ７３ＡＳｓ６（７０％培養密度）に添加した。感染から２４時間後に培地を置き換え、１μｇ／ｍｌの最終濃度までドキシサイクリン（Doxycylcline）を添加することによりｓｈＲＮＡの産生を誘導した。ＴｅｔＲおよびコントロール−ｓｈＲＮＡまたはＭｅｔ−ｓｈＲＮＡを形質導入したＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を７２時間にわたりドキシサイクリンで処理した後、動物でのアッセイまたは注射を開始した。
１．４ ウェスタンブロット分析
血清飢餓させた細胞（２４時間）を、５分にわたり３７℃において増殖因子ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で誘導した。示した箇所では、細胞をペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した後に、１０分にわたり３７℃で誘導した（１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド）。ＨＧＦによる誘導後、細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。活性化されたＭｅｔおよびＥｒｋを検出するために、細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、即ち１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するサンプルバッファーに溶解させ、煮沸し、ホスホ−Ｍｅｔおよびホスホ−ＥＲＫに対する抗体を使用するウェスタンブロット分析にかけた。Ｍｅｔ抗体またはＥＲＫ抗体で確かめることにより、ストリッピング（６２．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．８％ＤＴＴ）後の同じブロットに対してローディングコントロールを行なった。増強化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、シュヴェーアト、ドイツ）を使用してブロットを染色した。ウェスタンブロット分析におけるバンドをプログラムＩｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）で定量化した。
１．５ 細胞培養の上清におけるＨＧＦおよびＶＥＧＦの定量測定
Ｒｏｃｈｅ（マンハイム、ドイツ）およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヴィースバーデン、ドイツ）のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙおよびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを使用して、Ｌ３．６ｐｌ細胞の細胞培養培地におけるヒトＨＧＦおよびヒトＶＥＧＦの濃度の測定を行なった。この目的のために、指定の各ペプチドの存在下で、１５ｃｍのプレート中において５日にわたり３×１０６個の細胞を培養した。上清（２０ｍｌ）を遠心分離し（１２００ｒｐｍ）、メーカーの説明書に従ってアッセイを行なった。
１．６ 動物実験
雄の胸腺欠損のヌードマウス（ＮＣＩ−ｎｕ）をＨａｒｌａｎ（ロスドルフ、ドイツ）から購入した。ＢＤ１０ラットおよびＢＤＸラットを自家で繁殖させた。Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅにより承認された施設内に動物を収容して特定の病原体フリー条件下で維持した。動物実験に関するドイツの規則に従って全ての動物を取り扱った。Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅから動物実験を承認された（３５−９１８５．８１７Ｇ−１９２／１０）。ゲッティンゲンで撮像実験（図３）を行ない、これはＲｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍから認可された（３５−９１８５．８１７Ｇ−１０６／０９）。
ラット同系モデルの場合、１×１０６個の膵臓細胞（ＢＳｐ７３ＡＳおよびその形質移入体）を動物の右後脇腹に皮下注射した。４週間にわたり腫瘍を発育させた。この期間中、Ｍｅｔ−ｓｈＲＮＡまたはコントロール−ｓｈＲＮＡを発現するＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を注射した動物に、飲料水中のドキシサイクリンを与えた。実験の終了時に、原発性腫瘍を単離した。肺および腋窩リンパ節を分析した。組織を、亜鉛固定剤（１Ｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４中の０．５ｇ酢酸カルシウム、５．０ｇ酢酸亜鉛、５．０ｇ塩化亜鉛）中で２４時間にわたりインキュベートし、更なる分析のためにパラフィンに埋め込んだ。ペプチド処理または抗体処理の場合、最初の処理前に１週間にわたり腫瘍を発育させた。そのように表した箇所では、４週間にわたり週当たり３回の注射当たり２００μｇのペプチドまたは抗体を動物に与えた。ノギスを使用して腫瘍の増殖を毎週モニタリングした。処理の開始後２８日目にまたは３０日目に動物を屠殺した。
ヒト同所性モデルの場合、Ｌ３．６ｐｌ膵癌細胞（２４〜２６継代）をトリプシン処理後にハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）に懸濁した。説明されたように細胞を雄のヌードマウスの膵臓に同所的に注射した（Bruns CJ他(1999) Neoplasia 1(1):50〜62）。７日後に、１５匹のマウスからなる２つの群それぞれにヒトｖ６ペプチドまたはラットコントロールペプチド（２０μｇ）のどちらかを腹腔内注射した。本明細書に記載した実験および示した実験全てに、ラット１４ｍｅｒコントロールペプチドまたはヒト１４ｍｅｒペプチドのどちらかを使用した。次いで、全ての実験をラット５ｍｅｒコントロールペプチドまたはヒト５ｍｅｒペプチド（Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ）で繰り返した。１４ｍｅｒペプチドの場合と同じ結果を観測した。注射を２１日にわたり週当たり３回繰り返した。最終処理から２日後に動物を屠殺した。
調べるために、上記に記載したように、退縮した転移（ＢＳｐ７３ＡＳｓ６またはＬ３．６ｐｌのどちらか）を移植した。３週間にわたり腫瘍が増殖した。このとき、コントロール群において全ての動物で転移が発症した。週当たり３回、動物に２０μｇのペプチド（Ｌ３．６ｐｌ同所性マウスモデル：ヒトｖ６ペプチドもしくはラットコントロールペプチド）を腹腔内注射した、または２００μｇのペプチド（ラット同系モデル：ラットｖ６ペプチドもしくはマウスコントロールペプチド）を静脈内注射した。ペプチド処理の開始から２３日後に動物を屠殺した。
１．７ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２を使用するインビボでの撮像
既に説明されているように（Napp他、Int J Cancer(2010)、127:1958〜1974）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像システムＯｐｔｉｘ ＭＸ２（ＡＲＴ、モントリオール、カナダ）を使用して、ＢＤ１０ラットまたはＢＤＸラットにおいて皮下で増殖したＢＳｐ７３ＡＳｓ６腫瘍のインビボでの撮像を行なった。毛皮の自己蛍光を避けるために、撮像前に腫瘍周囲のラットの毛を剃った。その後、２％イソフルランを使用して動物に麻酔をかけ、データの取得の間中、装置の加熱プレート上に動物を静かに固定した。蛍光バックグラウンドを低減するために、ＮＩＲＦ撮像前に１週間にわたり、ラットにクロロフィル低減飼料（Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ＡＧ、カイザーアウークシュト、スイス）を与えた。いかなる蛍光プローブも注射しない動物のネイティブ走査により、全てのインビボ分析を先行させた。インビボ分析の場合、尾静脈を介してラットにＤＹ６８１標識したラットｖ６の１１ｍｅｒペプチドまたはヒトｖ６の１１ｍｅｒペプチド２００μｇを注射した。等量のＤＹ６８１標識マウスｖ６の１１ｍｅｒペプチドをコントロールに注射した。ラット１１ｍｅｒは配列ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１２）を有し、マウス１１ｍｅｒは配列ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ（配列番号１３）を有し、ヒト１１ｍｅｒは配列ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ（配列番号１４）を有した。全てのペプチドを蛍光色素ＤＹ６８１で標識した。ペプチドの注射から指定された時間後にデータを取得した。エクスビボでのモニタリングの場合、ペプチド注射から２４時間で動物を屠殺し、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２を使用して目的の腫瘍および器官をエクスビボで走査した。
７００ｎｍのロングパスエミッションフィルタと共に６７０ｎｍでの励起を使用して、ＤＹ６８１の蛍光を測定した。１．５ｍｍのラスター、走査点当たり０．５〜１秒の光子収集時間および可変レーザー出力で走査を行なった。ＯｐｔｉＶｉｅｗ（ＡＲＴ）でデータセットを解析した。蛍光強度データを、測定した蛍光強度（数値）を可変レーザー出力および積分時間に関して正規化した正規化数値（ＮＣ）で表示し、これにより様々な設定での測定の比較が可能になる。
１．８ Ｐｅａｒｌ撮像装置を使用するインビボでの撮像
Ｐｅａｒｌ（商標）撮像装置（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、バートホンブルク、ドイツ）を使用して、Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を有するマウスのインビボでの撮像を行なった。このシステムは、励起用に２つのレーザー（６８５ｎｍおよび７８５ｎｍ）を使用し、シグナル検出用に電荷結合素子検出器を使用する。レーザー励起により、深組織への浸透が可能になる。近赤外検出により、組織の自己発光の低減に起因して高感度が達成される。画像を標準化するために、発明者らはＰｅａｒｌ Ｃａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した。撮像の１週間前にクロロフィル低減飼料を動物に与え、蛍光バックグラウンドを低減させた（Ｒｅｇｉｍｅ２１０、安全な飼料、オジー、フランス）。撮像前に、２．０％イソフルランでマウスに麻酔をかけた。動物を撮像装置の加熱プレート上に置き、撮像ドロワー（imaging drawer）中のノーズコーンを介してイソフルランを継続的に送った。７００ｎｍおよび８００ｎｍの白色光で撮像した。ペプチドの静脈内注射前に、およびＤＹ６８１標識ヒトｖ６ペプチドまたはコントロールとしてのＤＹ６８１標識ラットｖ６ペプチドのどちらかの注射から２４時間後に、動物を撮像した。各撮像セッション直後に動物を屠殺し、腫瘍、肝臓および脾臓を単離し、７００ｎｍおよび８００ｎｍの白色光においてエクスビボで走査した。
１．９ 免疫蛍光
ＡＳｓ６細胞またはＬ３．６ｐｌ細胞を、Ｌａｂ−ＴｅｋＲ Ｃｈａｍｂｅｒ ＳｌｉｄｅＴＭ（Ｎｕｎｃ、ネーピアビル、イリノイ州、米国）のウェル当たり５，０００個の細胞で播種した。翌日に細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、室温で３０分にわたり４％ホルマリンで固定した。室温で１時間にわたり、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡにより非特異的結合をブロックした。細胞をＤＹ６８１標識ペプチドと共に１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる３回の洗浄工程後、蛍光マウンティング培地（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）と共にカバーガラスを載置し、レーザー走査型共焦点顕微鏡Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ２ ＳＰ２（Ｅｘｔｏｎ、ペンシルバニア州、米国）により免疫蛍光を測定し、Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェアを使用して処理した。２０倍の対物レンズを撮像に使用した。
１．１０ 組織学的検査
組織形態学的分析のために、肺のパラフィン埋め込み切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびに過ヨウ素酸シッフ（Ｈ＆ＥまたはＰＡＳ）で染色した。２０μｍおきに切片を分析することにより全組織ブロックの連続切片を調べ、各切片において、微小転移の存在を評価するために病理学者によって定常的に使用される手順に従って、転移性沈着物の存在および進展を評価した。
１．１１ 免疫組織学的分析および免疫蛍光分析
７μｍ厚のパラフィン切片を脱パラフィンして再水和した。Ｐ−Ｍｅｔ染色の場合、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中でスライドを煮沸し、続いて沸点より低い温度で１５分にわたりインキュベートすることにより抗原アンマスキングを実現し、ＣＤ３１染色の場合、切片を３７℃で１０分にわたりプロテイナーゼＫ（８μｇ／ｍｌ）で処理した。Ｐ−Ｍｅｔによる免疫蛍光染色の場合、６０分にわたり５％ヤギ血清（ＤＡＫＯ、グロストルップ、デンマーク）（１×ＰＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に希釈した）で非特異的結合をブロックした。免疫組織化学的検査の場合、内因性ペルオキシダーゼをＰＢＳ中の３％Ｈ２Ｏ２で最初にブロックし、続いてビオチンブロッキングシステム（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）と共にインキュベートし、次いでＰＢＳ中の５％ＦＣＳと共にインキュベートすることにより非特的結合を阻害した。切片を４℃で、Ｐ−Ｍｅｔ抗体（Ｄ２６、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に１：５０で希釈）、Ｍｅｔ抗体（Ｃ−２８、１：５０で希釈）、ＧＦＰ抗体（ｓｃ−１０１５２５、１：５０で希釈）もしくはＣＤ３１抗体（５μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした、またはＶＦＦ１８（５μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。ＰＢＳ中での洗浄後、切片を４５分にわたり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｒ ５４６ヤギ抗ウサギ（免疫蛍光Ｐ−Ｍｅｔ染色および免疫蛍光Ｍｅｔ染色の場合、１：５００で希釈）またはビオチン化二次抗体（免疫組織化学染色の場合、ＶＦＦ１８およびＣＤ３１用にウサギ抗ラット抗体、Ｐ−Ｍｅｔ用にヤギ抗ウサギ、ＧＦＰ用に開裂カスパーゼ−３および開裂カスパーゼ−８およびウサギ抗マウス、１：５００で希釈）と共にインキュベートした。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）染色の場合、切片をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体（Ｄａｋｏ、グロストルップ、デンマーク）で処理し、ＤＡＢ基材システム（３，３’−ジアミノベンジジン；Ｂｉｏｚｏｌ、エヒング、ドイツ）で現像した。免疫蛍光の場合、核染色にＤＡＰＩを使用した。
２．結果
２．１ Ｍｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能は、ラット膵臓腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段である
Ｍｅｔ受容体に対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段であるかどうかを調べるために、エクソンｖ６のみを含有するまたはＣＤ４４ｖ１〜１０アイソフォームに含まれる全てのバリアントエクソンｖ１〜１０を含有するＣＤ４４アイソフォームがラットＢＳｐ７３ＡＳ細胞に転移能を付与することができたかどうかを最初に調べた。この細胞では、ＣＤ４４ｖ６含有アイソフォームが遺伝子導入されている場合を除いて、ＨＧＦによりＭｅｔを誘導することできない（図１Ａ）。例えばＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６におけるエクソンｖ６の除去により、ＨＧＦによるＭｅｔの活性化が損なわれた（図１Ａ）。
親ＢＳｐ７３ＡＳ細胞および上述した構築物（ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ１〜１０およびＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６）を安定的に遺伝子導入した細胞を同質遺伝子的ラットに皮下注射した。全ての動物において、１週間後に原発性腫瘍を既に触知することができた。ＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ１〜１０を遺伝子導入した細胞の場合、対応する動物の腋窩リンパ節が注射から２週間後に既に肥大しており、６週間後に動物を屠殺した。肺およびリンパ節の組織形態学的実験から、腫瘍を発現するＣＤ４４ｖ６またはＣＤ４４ｖ１〜１０を有する全てのラットが結節性の肺内転移を発症したことが明らかになった。対照的に、リンパ節または肺のどちらにおいても、親細胞またはＣＤ４４ｖ１〜１０Δｖ６を遺伝子導入した細胞から原発性腫瘍が発生したが転移は発生しなかった（図１Ｂおよび表１）。この動物の肺では、微小転移を検出しなかった（表１）。そのため、Ｍｅｔ活性化が可能である、ＣＤ４４ｖ６等のＣＤ４４アイソフォームはまた、ＢＳｐ７３ＡＳ細胞に転移能も付与する。
次に、Ｍｅｔ ｓｈＲＮＡ配列を発現するレンチウイルスをＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞（ＣＤ４４に加えてＣＤ４４ｖ６アイソフォームを発現するＢＳｐ７３ＡＳ細胞）に安定的に遺伝子導入した。細胞がＭｅｔを発現しないことを確認した（図１Ａ、最後の２つのレーン）。次いで、この細胞（またはコントロールｓｈ−ＲＮＡ配列を発現するレンチウイルスを感染させた細胞）を同系動物に注射した。注射から６週間後に動物を調べた。全ての動物が原発性腫瘍を発症した（表１）。しかしながら、コントロールｓｈ−ＲＮＡ発現レンチウイルスを感染させた細胞の原発性腫瘍でのみＭｅｔ活性化を観測し、Ｍｅｔ ｓｈ−ＲＮＡを発現する原発性腫瘍では観測しなかった（図１Ｃ）。更に、Ｍｅｔ発現が消失しなかった場合、肺または腋窩リンパ節のどちらにおいても転移または微小転移を検出せず（図１Ｂ、表１）、このことは転移プロセスに対するＭｅｔの重要性を示す。このデータから、ＣＤ４４ｖ６およびＭｅｔの両方がＢＳｐ７３ＡＳ細胞の転移性拡散に必要であると結論付けることができる。
次に、共受容体機能を妨げる配列番号２（ヒトＣＤ４４ｖ６の５ｍｅｒペプチド）または配列番号６（ヒトＣＤ４４ｖ６の１４ｍｅｒペプチド）のペプチドのラット対応物も転移形成を阻害するかどうかを調べた。ラットペプチドは、配列ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ（配列番号１０）およびＮＥＷＱＧ（配列番号１１）を有した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射し、配列番号１０または配列番号１１のラットＣＤ４４ｖ６ペプチド（もしくはマウスのコントロールペプチド）またはＣＤ４４ｖ６抗体（もしくはコントロールとしてのＩｇＧ）を腫瘍内にまたは静脈内に週に３回注射した。ｖ６特異的抗体による処理またはｖ６特異的ペプチドによる処理の両方とも転移を完全に阻害した（図２Ｂ、表２）。ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物由来の肺切片では、ＰＡＳおよびＨ＆Ｅ染色を使用する組織学的分析で転移または微小転移のどちらも検出することができなかった（図２Ｃおよび表２）。このことは、肺で多数の転移を検出した、コントロールペプチド（またはコントロールＩｇＧ）で処理した動物から得た結果との対比において明らかである（図２Ｂ、Ｃ）。興味深いことに、原発性腫瘍の増殖はどちらの処理の影響も受けなかった（図２Ｄ）。このことは、ＢＳｐ７３ＡＳ細胞またはＢＳｐ７３ＡＳｖ１〜１０Δｖ６細胞もｖ６形質移入体と同様に原発性腫瘍の形成を誘導することができるという事実と両立することができる。まとめると、実験から、Ｍｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能がラット膵臓細胞系における転移性拡散の決定的な手段であること、およびＭｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能が原発性腫瘍の増殖の主要因ではないことが示唆される。
２．２ インビボでのＣＤ４４ｖ６ペプチドの腫瘍細胞への特異的結合
ＣＤ４４ｖ６ペプチドの腫瘍部位へのおよび転移への結合の特異性を検証するために、ならびにインビボでの結合反応速度を推定するために、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２による近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像を行なった。この目的のために、以下の２種のＣＤ４４ｖ６ペプチドをフルオロフォアＤＹ６８１で標識した：ラット特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチド、即ちｒｖ６ペプチドＤｙ６８１、およびコントロールとしてのマウス特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチド、即ちｍｖ６ペプチドＤｙ６８１。図３Ａの右側に示すように、インビトロでの試験により、実際には標識ラットペプチドのみがＭｅｔ活性化を阻害し、マウスペプチドはＭｅｔ活性化を阻害しなかったことが明らかとなった。更に、組織培養液中において、ＤＹ６８１標識ラットｖ６ペプチドはＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞に結合したが、ＤＹ６８１標識マウスｖ６ペプチドはＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞に結合しなかった（図３Ａの左側）。
インビボでの実験の場合、ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射した。３週間後、尾静脈（tail vain）への注射により、どちらかの標識ｖ６ペプチドをラットに投与した。指定の時点で、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２により、腫瘍領域における蛍光の蓄積を測定した。Ｄｙ６８１標識ペプチドの静脈内（ｉ．ｖ．）注射前に、マウスをネイティブに走査して自己蛍光バックグラウンドの濃度を測定した。次いで、Ｄｙ６８１標識ｖ６ペプチドの皮下腫瘍へのインビボ結合反応速度を測定した。ペプチド注射から１日後に、２日後に、３日後および７日後に撮影した一連の代表的なＮＩＲＦ画像に示すように、インビボで少なくとも２日にわたり腫瘍領域全体で高蛍光強度を検出し、１日目で最大であった。コントロールペプチドであるｍ６ペプチドＤｙ６８１の注射では、腫瘍領域全体で蛍光シグナルが全く生じなかった（図３Ｄ）。
腫瘍中におけるｖ６ペプチドの分布を特に調べるために、および肺中におけるｖ６ペプチドの分布も特に調べるために、ペプチドの注射から２４時間後に両方の組織を摘出し、Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２によりエクスビボで調べた（図３Ｃ）。エクスビボで走査したおよびｒｖ６ペプチドＤｙ６８１を投与したマウスから摘出した腫瘍および肺の特定領域においてのみ蛍光強度を検出することができ、ｍｖ６ペプチドＤｙ６８１を事前に注射した全てのコントロールラット由来の腫瘍および肺では蛍光強度を検出することができなかった（図３Ｃ）。この結果は、ラットペプチドが皮下のラット膵臓腫瘍に特異的に結合するというインビボでの観測を裏付けており、転移にインビボで結合することもまた更に示唆する。実際に、組織学的分析により、全ての動物の肺において転移の存在が明らかになった。
２．３ 配列番号２または配列番号６のヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドによりヒト膵臓腫瘍細胞の転移形成が阻害される
ヒト膵臓腫瘍への研究を発展させるために、高転移性ヒト膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Bruns他、Neoplasia (1999)、1(1):50〜62）を調べた。この細胞は、該細胞を更に転移させる手段である、肝臓中でおよび膵臓中で数回継代しているＣＯＬＯ３７５細胞が起源である。この細胞ではＭｅｔがその活性化およびシグナル伝達をＣＤ４４ｖ６に依存していることを確認した（図４Ａ）。配列番号２または配列番号６のヒトｖ６ペプチドの存在下でまたは非存在下で、Ｌ３．６ｐｌ細胞をＨＧＦで処理し、Ｍｅｔ活性化およびＥＲＫへの下流シグナル伝達を測定した。ヒトｖ６ペプチドによりＭｅｔおよびＥＲＫの両方のリン酸化が阻害された。対応するラットｖ６ペプチド（コントロールペプチド、配列番号１０または１１）による処理は、受容体活性化および信号伝達に影響を及ぼさなかった（図４Ａ）。
腫瘍増殖および転移形成へのペプチドの影響を検証するために、免疫不全マウス（ＮＣＩ−ｎｕ）の膵臓中にＬ３．６ｐｌ細胞を同所的に注射した。このマウスは原発性腫瘍を発症し、４週間後に肝臓中に多数の転移を示した。原発性腫瘍は多量のＣＤ４４ｖ６を発現する（図４Ｂ）。腫瘍におけるホスホ−ＭｅｔおよびＭｅｔに関する免疫蛍光染色で示すように、３週間にわたる週当たり３回のヒト特異的ペプチドの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、Ｍｅｔ活性化が完全に抑圧された（図４Ｃ）。このデータは、ペプチドがインビボでＭｅｔに対するＣＤ４４ｖ６の共受容体機能を妨げるおよびＭｅｔリン酸化を抑止することを示す。Ｍｅｔの活性化は種特異的であり、ヒトＨＧＦによってのみヒトＭｅｔ受容体を活性化することができることから、この結果は、Ｌ３．６ｐｌ細胞が自らＨＧＦを産生することを示唆する。興味深いことに、ラット系とは対照的に、膵臓における原発性腫瘍の増殖はヒトｖ６ペプチドにより強力に抑圧された（図４Ｄ上部）。膵臓における原発性腫瘍の増殖も強力に抑圧された（図４Ｄ下部）。ラット特異的ペプチド（コントロールペプチド）では転移形成へのいかなる影響または原発性腫瘍の増殖のどちらもなかった（図４Ｄ）。この結果は、Ｌ３．６ｐｌ細胞が自らＨＧＦを産生することを示唆する。実際に、培養から５日後の上清（材料および方法を参照）中にヒトＨＧＦを３３７５ｐｇ／ｍｌの濃度で検出した（データを示さず）。
マウス特異的ｖ６ペプチドによる腫瘍血管新生の阻害により原発性腫瘍の増殖が遅延したことを観測した。ここで、ｖ６ペプチド処理腫瘍における血管の数および血管のサイズの減少で例示されるように、ヒトペプチドによる処理は血管新生も縮小させたことが分かる。血管新生の縮小で腫瘍体積の減少が説明される（図４Ｄ、Ｅ）。ｖ６ペプチドが種特異的な方法で作用することから、血管新生の阻害は、ヒト膵癌細胞によるＶＥＧＦ産生の阻害よりもマウスの内皮細胞への影響への影響に起因し得ない。実際に、ヒトＬ３．６ｐｌ細胞は、ヒトｖ６ペプチドによる処理によってブロックされ得る分泌物であるｈＶＥＧＦを産生する（図４Ｆ）。最も目立つ観測は、ヒト特異的ペプチドが肝臓内での転移形成を完全に阻害したことをであった（図４Ｇ）。ラット特異的ペプチド（コントロールペプチド）は転移形成または原発性腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった（図４Ｃ〜Ｇ）。
次いで、小動物撮像システムＰｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅを使用して、ヒトＣＤ４４ｖ６ペプチドのインビボでの腫瘍への結合の特異性を調べた。ヒト標識ペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞中においてＭｅｔ活性化を阻害したがラットペプチドは阻害せず（図５Ａの右側）、細胞培養液中で、ヒト標識ペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞に結合したが、ラットペプチドはＬ３．６ｐｌ細胞に結合しなかった（図５Ａの左側）。インビボで、蛍光標識（ＤＹ６８１）ヒトペプチドは、同所的に注射したＬ３．６ｐｌ細胞により誘導された腫瘍中に特異的に蓄積した（図５Ｂ）。コントロールペプチドで処理した動物では蛍光を検出しなかった。更に、腫瘍を発症したかどうかに関わらずペプチドを投与しなかった動物ではシグナルを観測しなかった（図５Ｂ）。標識ヒトｖ６ペプチドで処理した動物から単離した器官のエクスビボでの分析により、原発性腫瘍だけでなく転移にほぼ確実に対応する肝臓の領域への結合の検出が可能になった（図５Ｃ）。そのため、この実験から、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは原発性腫瘍だけでなく遠位の転移も標的とすることが明らかになる。
２．４ 既に生じた転移がＣＤ４４ｖ６ペプチドにより除去される
ラット系における肺のおよびヒトモデルにおける肝臓の特定の領域へのＣＤ４４ｖ６ペプチドの特異的結合から、このペプチドが既に生じた転移に影響を及ぼすことができたかどうかの疑問が惹起される。図２および４に記載の実験において、腫瘍細胞の注射直後にペプチドを投与し、該ペプチドは転移の発生を完全に抑圧した。既に生じた転移へのＣＤ４４ｖ６ペプチドの効果を測定するために、その他の実験的設定を使用した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットに皮下注射し、Ｌ３．６ｐｌ細胞を雄のヌードマウスに同所的に皮下注射し、３週間にわたり増殖させた。このとき、コントロール群由来の全ての動物は、ペプチド処理に使用した群の場合と同様であることを示唆する転移（表３）を発症していた。次いで、動物を種特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（ラット系の場合はマウスおよびヒト系の場合はラット）のどちらかで更に３週間にわたり週当たり２回処理し（図６Ａのスキーム）、次いで転移の存在に関して検証した。実験の終了時に、コントロールペプチドで処理した全ての動物で転移を検出することができた（ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞の場合は表３、図６Ｂ、Ｌ３．６ｐｌ細胞の場合は表３、図６Ｃ）が、種特異的ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物には転移がなかった。そのため、既に生じた転移はＣＤ４４ｖ６ペプチドでの処理により除去される。
転移の消失に関する１つの仮説は、ペプチドが第２の器官におけるＣＤ４４ｖ６発現転移性細胞のアポトーシスを誘導することである。この仮説を検証するために、ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を使用して上記に記載の実験を繰り返した。ＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞を同系ラットで皮下注射し、３週間にわたり腫瘍を成長させた。その後、動物を、特異的ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドまたはコントロールペプチド（マウス）のどちらかを１日おきに注射した１０匹の動物からなる２つの群に分けた。ペプチドの各注射から１日後に１匹の動物の肺を取り出し、カスパーゼ３の開裂型を検出する抗体を使用してアポトーシスを測定した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物の腫瘍領域において、ペプチドの最初の注射から早くも３日後にアポトーシス性細胞を検出した。コントロールペプチドを注射した動物ではアポトーシスを全く検出しなかった（図７）。ＣＤ４４ｖ６ペプチドの最初の注射から８日後に最大のアポトーシスを測定した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドの注射から１２日後にはアポトーシスをほとんど観測しなかった。２２日目に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理した動物では転移をもはや検出することができなかったが、コントロール動物の肺では転移性拡散が明らかだった（図７）。この実験から、ＣＤ４４ｖ６ペプチドが転移性細胞のアポトーシスを誘導すると結論付けられる。
ミトコンドリアタンパク質の放出を特徴とする内因性経路、またはアポトーシスに関する、リガンドが結合した細胞死受容体により活性化された外因性経路のどちらがｖ６ペプチドにより誘導されたかを識別するために、ｖ６ペプチドで処理した転移における開裂カスパーゼ−８の発現を調べた。ｖ６ペプチド処理動物の肺における、カスパーゼ−３の場合に得たものと同様のカスパーゼ−８の活性化の動力学を観測した。この実験から、発明者らは、ＣＤ４４ｖ６ペプチドは外因性のアポトーシス経路を介して転移性細胞のアポトーシスを誘導すると結論付ける。
ペグ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドはＨＧＦ依存性のＣＤ４４ｖ６媒介シグナル伝達を阻害する
１．材料および方法
１．１ ペグ化ペプチドの合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ペプチド合成機（モデル４３３Ａ）でペプチド合成を行ない、分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。配列ＮＥＷＱＧ（配列番号１１）のペプチドおよびコントロールペプチドＮＡＡＡＧ（配列番号１５）を合成した。質量分析計に接続されたＬＣ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ−Ｂｒｅｍｅｎ（ドイツ）製のμＴＯＦ ＬＣＭＳ）により、粗製物および精製物の特徴を明らかにした。
標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコル（例えばFields他、Int J Pept Protein Res. (1990)、35、161〜214、Maisch他、J Am Chem Sco. (2009)、131、15596〜15597、Strandberg他、Biophys J. (2006)、90、1676〜1686およびWadhwani他、J Org Chem. (2006)、71、55〜61を参照）を使用してペプチド合成を行なった。ＮＭＰ中の２０〜２２％ピペリジンによりＦｍｏｃ脱保護を行なった。ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−アミノ酸：ＨＯＢｔ：ＨＢＴＵ：ＤＩＥＡ（４：４：３．９：８）の混合物を使用してカップリングを行なった。ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ（９３．５：２．５：４）の混合物を使用して、ペプチドを固体支持体から切断した。Ｎ２フロー下で切断試薬を除去し、ジエチルエーテルを使用して標識ペプチドを沈殿させた。
ダイオードアレイ検出器が取り付けられたＪａｓｃｏ−ＨＰＬＣシステム（東京、日本）を使用して、３５℃において逆相Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２４０ｍｍ）で分取ＨＰＬＣを行なった。アセトニトリル／水勾配が０．１％のＴＦＡを使用して、エピマー型ペプチドを分離した。
全てのアミノ酸をＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（シュヴァルバッハ、ドイツ）から購入した。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（分子量７５０Ｄａおよび２０００Ｄａ）ならびにカップリング試薬（ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ）ならびにＤＩＥＡはＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）製であり、溶媒およびその他の試薬はＶＷＲ−Ｍｅｒｃｋ（ブルフザル、ドイツ）製であった。
以下の化合物を合成した：
ＰＥＧ−コントロールペプチド：ＰＥＧ−ＮＡＡＡＧ、
ＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチド：ＰＥＧ−ＮＥＷＱＧ
パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−コントロールペプチド
パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−ラットＣＤ４４Ｖ６ペプチド
Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ分子量３０００Ｄａを配列番号１１または配列番号１５のどちらかに最初にカップリングさせることにより、パルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−コントロールペプチドおよびパルミチン酸−ＮＨ−ＰＥＧ−ＣＯＮＨ−ラットＣＤ４４Ｖ６ペプチドを合成した。次いで、ペグ化ペプチドをパルミチン酸と反応させた。
１．２ 活性化アッセイ
ＰＥＧ−コントロールペプチドおよびＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドを、受容体型チロシンキナーゼＭｅｔおよびＥＲＫのＨＧＦ誘導性活性化をブロックする能力に関して比較した。
ラット膵癌細胞ＢＳｐ７３ＡＳｓ６（Ａｓｓ６とも表す）を、コントロールペプチド（配列番号１５）、非ペグ化ｖ６ペプチド（配列番号１１）および高濃度のペグ化ペプチド、即ちＰＥＧ−ラットコントロールペプチドならびにＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドのいずれかと共に３７℃で１０分にわたりインキュベートした後、ＨＧＦで誘導した（１０ｎｇ／ｍｌ；３７℃で５分）。
ホスホ−Ｍｅｔおよびホスホ−Ｅｒｋ特異的抗体（ホスホ−ＭｅｔクローンＤ１６細胞シグナル伝達、ホスホ−Ｅｒｋ ｐ４２／４４細胞シグナル伝達）を使用する標準的なＳＤＳおよびウェスタンブロッティング技法により、ＥＲＫおよびＭｅｔの活性化を測定した。
１．３ 細胞アッセイ
散乱アッセイを更に行なった。ＨＴ２９結腸癌細胞を１０％ＦＣＳ含有培地中で増殖させた。播種から１日後に細胞を飢餓させた。３日目に、細胞をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で誘導し、ペプチドなし、コントロールペプチド（配列番号１５）、非ペグ化ｖ６ペプチド（配列番号１１）またはペグ化ペプチド、即ちＰＥＧ−ラットコントロールペプチドおよびＰＥＧ−ラットＣＤ４４ｖ６ペプチドのいずれかと共にプレインキュベートした。
２．結果
図９および１０は、ペグ化ペプチドがＭｅｔおよびＥＲＫのＨＧＦ依存性活性化の阻害で効果的であることを示す。非ペグ化ペプチドと比べてペグ化ペプチドによりＥＲＫがより効果的に阻害される。
図１１は、ペグ化ペプチド、更に非ペグ化ペプチドにより細胞が細胞クラスターから離れて解離して遊走するが、コントロールペプチドにより細胞が細胞クラスターから離れて解離して遊走しないことを示す。
インビトロでの結果
本明細書の記載の直鎖ＣＤ４４ｖ６ペプチド
ラット：１４ｍｅｒ ＫＥＫＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ、５ｍｅｒ ＮＥＷＱＧ、ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ ＷＦＥＮＥＷＱＧＫＮＰ
ヒト：１４ｍｅｒ ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ、５ｍｅｒ ＮＲＷＨＥ、ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ ＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ
マウス：ＤＹ６８１標識１１ｍｅｒ ＷＦＱＮＧＷＱＧＫＮＰ
１．ヒトｖ６ペプチドを使用するＲＴＫのインビトロでの阻害
直鎖ペプチド（ヒト、１４ｍｅｒ ＫＥＱＷＦＧＮＲＷＨＥＧＹＲ、５ｍｅｒ ＮＲＷＨＥ）
使用した細胞株
ＨＴ２９（結腸直腸癌）
ＨｅＬａ（子宮頸癌）
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）
ＨＣＭＥＣ（ヒト心微小血管ＥＣ）
ＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈ＥＣ）
Ｌ３．６ｐｌ（ヒト膵癌細胞）
ＭＣＦ７（ヒト乳癌）
１．１ 内皮細胞
血管新生においてＣＤ４４ｖ６がＭｅｔの共受容体として作用するかどうかを分析するために、様々な種類のヒト血管から単離したいくつかの一次ＥＣを使用した。
ＥＣは、該ＥＣが局在化する血管に応じて形状、機能および細胞間結合のタイプが異なることができる。静脈中のＥＣ（ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞））と比べて、動脈中のＥＣ（ＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈ＥＣ））には高圧がかかっている。毛細血管では、ガスおよび栄養素の主要な交換が行なわれる。ＥＣ（例えばＨＣＭＥＣ（ヒト心微小血管内皮細胞））は、この交換を制御するための唯一のバリアである。
このＥＣをＨＧＦで処理した場合、受容体型チロシンキナーゼＭｅｔがリン酸化され、Ｍｅｔの下流標的であるＥｒｋへのシグナル伝達が促進された（図１２）。様々なツールを使用して、この細胞におけるＣＤ４４ｖ６のＭｅｔシグナル伝達への寄与を分析した。エクソンｖ６にコードされた配列を認識する抗体（αＣＤ４４ｖ６と呼ぶ）およびｖ６領域に由来する１４個のアミノ酸から構成されるペプチド（ｖ６ペプチドと呼ぶ）（Matzke他、2005）の両方とも、ＨＧＦによる誘導前に細胞に添加した場合にＭｅｔおよびその下流標的であるＥｒｋの活性化を防ぐことができた（図１２を参照）。コントロール抗体とのおよびコントロールペプチドとのインキュベーションによりＭｅｔの活性化およびシグナル伝達が妨げられなかったことから、この結果から、使用したＥＣの全てのタイプでＭｅｔ活性化にＣＤ４４ｖ６が必要であることが分かる。
ＣＤ４４のアイソフォームがＶＥＧＦＲ−２活性化に必要であるかどうかを調べるために、ＶＥＧＦＲ−２がＶＥＧＦ−Ａ１６５により活性化された実験で、ＣＤ４４ｖ６活性を阻害する３つのツールを使用した。予想したように、全てのＥＣがＶＥＧＦ−Ａ１６５処理に反応し、ＶＥＧＦＲ−２がリン酸化されてＥｒｋにシグナル伝達された。ＣＤ４４ｖ６を認識する抗体およびＣＤ４４ｖ６ １４ｍｅｒは、ＶＥＧＦ−Ａ１６５により誘導されるＶＥＧＦＲ−２の活性化およびＥｒｋへの下流信号伝達をブロックした（図１３）。そのため、ＣＤ４４ｖ６は、この細胞における機能的なＶＥＧＦ−Ａ１６５／ＶＥＧＦＲ−２システムにも必要である。
１．２ 上皮細胞
ＣＤ４４ｖ６ペプチド（ｖ６ １４ｍｅｒ；ｖ６ ５ｍｅｒも検証した、データを示さず）を使用して、ヒト上皮膵癌細胞Ｌ３．６ｐｌ（Ｃｏｌｏ３５７に由来する）、子宮頸癌細胞ＨｅＬａおよび結腸癌細胞ＨＴ２９におけるＣＤ４４ｖ６のＭｅｔシグナル伝達への寄与を分析した。ＨＧＦによる誘導前に細胞に添加した場合に、Ｍｅｔのおよびその下流標的Ｅｒｋの活性化を妨げることができた（図１４Ａ、ＢおよびＣ）。コントロールペプチドとのインキュベーションによりＭｅｔ活性化およびシグナル伝達を妨げられなかったことから、この結果から、この細胞株全てにおけるＭｅｔ活性化にＣＤ４４ｖ６が必要であることが分かる。
ＶＥＧＦＲおよびＭｅｔに加えて、ＥｒｂＢ１のＣＤ４４ｖ６への依存性を調べた。ＥＧＦおよびその他の５種のリガンド、即ちＡＲ、ＢＣ、ＥＲ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは、ＥｒｂＢ１受容体を活性化することができる。ＥＧＦ、ＡＲおよびＴＧＦ−αは、ＥｒｂＢ１ホモ二量体またはＥＲｂＢ１／２ヘテロ二量体のどちらかに結合する。これらの二量体に加えて、ＢＣ、ＥＲおよびＨＢ−ＥＧＦは、Ｅｒｂ４／４ホモ二量体またはＥｒｂＢ２／４ヘテロ二量体にも結合することができる。ここで、指定のリガンドによるＥｒｂＢ受容体の活性化もＣＤ４４ｖ６に依存しているかどうかを調べた。
この目的のために、ＨＴ２９細胞を２４時間にわたり血清飢餓させ、ｖ６特異的ペプチドまたはコントロールペプチドで前処理した。次いで、ＨＴ２９細胞を、指定のＥｒｂＢリガンドで誘導した。Ｅｒｋキナーゼのリン酸化を、受容体活性化のリードアウトとして使用した。全てのリガンドはＥｒｋキナーゼを活性化することができた。ＨＴ２９細胞のＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）とのプレインキュベーションにより、ＥＧＦ依存性のおよびＥＲ依存性のＥｒｋのリン酸化が阻害されたが、コントロールペプチドは効果が見られなかった（図１５）。このことは、ＥＧＦに加えて、ＥＲが、共受容体としてのＣＤ４４ｖ６に依存している別のＥｒｂＢ１リガンドであることを示す。対照的に、ＣＤ４４ｖ６をブロックすることによりＥｒｂＢ受容体のＡＲ依存性の、ＢＣ依存性の、ＨＢ−ＥＧＦ依存性のおよびＴＧＦ−α依存性の活性化を阻害することはできなかった（図１５）。これらのリガンドでは、それらのＥｒｂＢ受容体の誘導がＣＤ４４ｖ６に非依存的である。このことは特に印象的である。なぜならば、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは同じ受容体対（ＥｒｂＢ１／１またはＥｒｂＢ１／２）に焦点を当てるからである。これらのデータは、ＥｒｂＢ活性化の共受容体として使用される特異的なＣＤ４４アイソフォームは、ＥｒｂＢ受容体を活性化させるリガンドにより決定されるが、受容体のタンパク質自体により決定されないことを示唆する。
ＭＣＦ７では、ＣＤ４４ｖ６特異的ペプチドにより、Ｅｒｋのリン酸化がＥＧＦ処理でブロックされるがＴＧＦα誘導ではブロックされない。５ｍｅｒおよび１４ｍｅｒの両方のペプチドが同様の効果を示した。コントロールペプチドはＥｒｋのリン酸化に対する効果を有しなかった（図１６）。
２．細胞アッセイ
２．１ 散乱アッセイ
受容体型チロシンキナーゼＭｅｔおよびＲｏｎは、それらのリガンドでの処理により、細胞遊走および散乱を誘導する。ｖ６ブロッキングペプチドの散乱および遊走への効果を調べた。ＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ ５ｍｅｒ、１０ｍｅｒおよび１４ｍｅｒ）は、細胞外マトリックスにより散乱および浸潤を完全に防いだ（図１７）。
２．２ スクラッチアッセイ
このアッセイでは、細胞遊走に対するＣＤ４４ｖ６の必要性を検証した。スクラッチ閉塞アッセイでは、静脈のＥＣまたは動脈のＥＣのどちらかの遊走を検証した。この細胞をコンフルエンスまで増殖させ、滅菌ピペットチップを使用して、コンフルエントな単層にスクラッチを付けた。スクラッチの端に並んでいる細胞が、隙間を閉塞するために、この空隙に向かって遊走し始めた。ＨＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ１６５またはＶＥＧＦ−Ａ１２１のいずれかの存在下では、細胞はリガンドの非存在下に比べて早く遊走し、スクラッチが１日以内に閉塞された。ＣＤ４４ｖ６抗体またはＣＤ４４ｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）が受容体活性化を妨げた場合、ＥＣの遊走は基礎レベルまで低下した（図１８）。
２．３ 血管新生アッセイ
２．３．１ 新芽形成アッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞のクラスター、いわゆる球状体を懸滴で生成し、３次元コラーゲンマトリックスに埋め込んだ。これを、ブロッキング物質および増殖因子を含有する培地で覆った。増殖因子ＶＥＧＦ−Ａ１６５およびＶＥＧＦ−Ａ１２１による活性化によって、球状体からＥＣが増殖し始めた（図１９）。細胞をｖ６ペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）で処理した場合、ＶＥＧＦ−Ａ処理に反応して新芽形成するこの能力は完全にブロックされた。コントロールペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａ誘導性の新芽形成に影響を及ぼさなかった。１つの球状体に由来する全ての新芽の全長を解析することにより、ＥＣの新芽形成を定量化した。
２．３．２． マトリゲル／フィブリンプラグ
ランゲルハンス島は、コラーゲンマトリックス中でＨＵＶＥＣ細胞と共培養した場合に血管新生反応を刺激することができる。ランゲルハンスのそのような血管新生過形成性の島をコラゲナーゼかん流により単離した。この島は血管新生因子の混合物を産生し、それにより、ＥＣを誘引して毛細血管様構造体に組織化する。ＣＤ４４ｖ６抗体またはｖ６特定的ブロッキングペプチド（ヒトｖ６ １４ｍｅｒ）によりＥＣのヒトＣＤ４４ｖ６をブロックした場合にＥＣの血管新生反応は低下したが、コントロールペプチドは血管新生反応を妨げなかった。コントロール実験では、公表されたデータと一致して島の約６０％が血管新生反応を刺激した（図２０）。
１．直鎖ペプチドおよびＰＥＧ化ｖ６ ５ｍｅｒによる用量の増減
ポリエチレングリコールポリマー鎖の共有結合のプロセスであるＰＥＧ化は、免疫原性および抗原性を低下させることが知られている。ＰＥＧ化により、化合物の流体力学的サイズが増大し、腎クリアランスの低下により動物中での循環時間が延びる。
３種のＣＤ４４ｖ６特異的化合物（ヒト由来のｖ６ ５ｍｅｒ、ＰＥＧ８４０−ｖ６ ５ｍｅｒおよびＰＥＧ２０００−ｖ６ ５ｍｅｒ）ならびにコントロールペプチドを、４週間にわたり週当たり３回３種の濃度（注射当たり２μｇ、２０μｇ、２００μｇ）で腹腔内投与した。処理の開始１週間前に、Ｌ３．６ｐｌ腫瘍細胞をヌードマウスに同所的に移植した。結果は、ＰＥＧ化はペプチドの効果に影響を及ぼさないことを示した。全てのｖ６特異的化合物が腫瘍細胞の転移性拡散を防ぎ、原発性腫瘍の増殖が減少した。注射当たり２０μｇの場合に転移の完全なブロックを観測したが、１０倍低い濃度を使用して阻害効果を既に観測した（図２１）。更に、処理用量を注射当たり２００μｇまで増加しても動物に副作用は生じなかった。
２．直鎖ｖ６ １４ｍｅｒおよび環状ｖ６ ８ｍｅｒの用量の減少に関する結果
この実験では、ペプチドの用量の減少を調べた。週当たり３回の注射の処理サイクルを維持した。更に、共受容体機能に必要である３つの重要なアミノ酸を含有する直鎖配列に基づく環状ｖ６ ８ｍｅｒを、その阻害効果に関してインビボで検証した。インビトロでのデータは、全てのペプチドによるリン酸化アッセイおよび細胞アッセイでＭｅｔおよびＥｒｋの活性化が既にブロッキングされていることを示した。
環を形成するペプチド結合を有するアミノ末端とカルボキシル末端との連結により、環化による直鎖ペプチドの改変が実現される。環化は、ペプチドの安定性を高めるのに、および透過性を改善するのに効果的な方法である。
Ｌ３．６ｐｌ細胞を動物に同所的に移植した。１週間にわたり腫瘍を増殖させた後、直鎖ｖ６ １４ｍｅｒ、環状ｖ６ ８ｍｅｒおよびコントロールペプチド（ラットｖ６ １４ｍｅｒ）による処理を開始した。３週間にわたり注射当たり０．２、２および１０μｇの濃度で、週当たり３回、全てのペプチドを注射した。処理の終了時に動物を屠殺した。
コントロール群の全ての動物は、巨視的な転移を示した。０．２および２μｇのｖ６ １４ｍｅｒを注射した動物は、肝転移を示したが、動物当たりの転移の平均数は減少した。注射当たり１０μｇの用量により、転移性拡散が完全に阻害された（図２２Ａ、Ｂ）。更に、ｖ６ １４ｍｅｒによる処理により、コントロール群と比較して原発性腫瘍のサイズが有意に減少した（図２２Ｃ）。
環状ｖ６ ８ｍｅｒは、注射当たり２μｇでおよび２０μｇで転移性拡散を非常に効率的にブロックしており、このことは、環化による構造的変化はペプチドの機能の喪失につながらなかったことを示す（図２２Ａ、Ｂ）。環状ｖ６ ８ｍｅｒはまた、原発性腫瘍の増殖への劇的な影響も示した（図２２Ｃ）。
３．Ｌ３．６ｐｌ同所的異種移植片モデルにおける様々なＣＤ４４ｖ６ペプチド誘導体の対照比較
同所的Ｌ３．６ｐｌ腫瘍を有する動物において、様々なＣＤ４４ｖ６ペプチド誘導体の比較を行なった。それぞれ５匹の動物からなる１０個の群に、３週間にわたり週当たり３回、注射当たり２０μｇの用量のペプチドを投与し、化合物を表４に列挙する。処理の開始から３週後に動物を屠殺し、巨視的な転移および腫瘍の体積を分析した。
転移に関する組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）、ならびに腫瘍血管新生（抗ＣＤ３１染色）および腫瘍中における様々なＲＴＫの活性化に関する免疫組織学的分析はまだ途中である。
ＣＤ４４ｖ６ １４ｍｅｒで処理した、ＰＥＧ化１４ｍｅｒ（ＰＥＧ８４０およびＰＥＧ２０００）で処理した、Ｄ−アミノ酸改変を含有する１４ｍｅｒで処理した、および環状ペプチド（ミリストイル化環状ペプチドを含む）で処理した動物は、コントロールペプチドと比べて、腫瘍増殖の有意な減少を示した。ミリストイル化直鎖１４ｍｅｒは、腫瘍増殖に対して阻害効果を示さなかった。コントロール動物と比べて、ＰＥＧ２０００ １４ｍｅｒ、ｖ６ １４ｍｅｒ、環状８ｍｅｒおよび環状５ｍｅｒ（図２３Ａ）により腫瘍サイズの最大の減少が達成された（ここで、原発性腫瘍の強い可視血管新生（図２４Ａ）に留意すること）。これらの４種の化合物はまた、群内の個々の腫瘍サイズの低い変動性も示した（図２３Ｂ）。
肝臓の分析により、ＰＥＧ８４０−１４ｍｅｒ、ＰＥＧ２０００−１４ｍｅｒ ｖ６−１４［ｄａａ７］およびミリストイル化環状８ｍｅｒの場合に転移性拡散の減少が分かった。動物をｖ６ １４ｍｅｒ、ｖ６−１４［ｒ１４］、環状８ｍｅｒおよび環状５ｍｅｒで処理した場合に、転移の完全な阻害を観測した（図２４Ａ、Ｂ）。
この対照比較によりｖ６ １４ｍｅｒの効果を確認したが、インビボでの安定性の増加を示すことができた直鎖ペプチド配列の有望な改変としてのｖ６−１４［ｒ１４］、環状８ｍｅｒおよび環状５ｍｅｒが明らかになった。
４．その他の癌型の評価
４．１ 結腸癌
４．１．１ 背景
大腸腺腫様ポリポーシス（Ａｐｃ）腫瘍抑制遺伝子の変異および不活化は、結腸直腸癌の進行での初期現象である。腺腫様ポリープの約８０％でＡｐｃの不活化が起こり、該不活化は、遺伝子疾患である家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）の原因でもあり、該家族性腺腫性ポリポーシスは、結腸癌を生じる小腸および大腸での腺腫性ポリープの形成につながる。この遺伝性疾患を研究するために、ＡＰＣ／Ｍｉｎ／＋マウスモデルを生成した。この遺伝子操作マウスは、結腸腫瘍に加えて、小腸中に１００個以下のポリープを発症することができる。このマウスとＣＤ４４ノックアウトマウスとの交配により腺腫の数が大幅に低下し、このことは、大腸の発癌におけるＣＤ４４の役割を示す。このことを、腺腫も減少させたｓｈＲＮＡによる、特にＡＰＣ／Ｍｉｎ／＋マウスの腸におけるＣＤ４４ｖ６の除去により更に確認することができた。
４．１．２ 予備データ
１８週齢のマウスを使用して、ｖ６ １４ｍｅｒの効果をＡＰＣ／Ｍｉｎ／＋マウスモデルで検証した。６週間にわたり週当たり３回、２０μｇのｖ６ １４ｍｅｒ（マウス１４ｍｅｒ）またはコントロールペプチド（ラット１４ｍｅｒ）を動物に腹腔内注射した。実験の終了時に動物（各群３匹）を屠殺し、腫瘍の総数に関して十二指腸を分析した（図２５）。
ｖ６ １４ｍｅｒでの処理により、十二指腸において腫瘍サイズが大幅に減少した。注目すべきことは、この減少は小さい腫瘍の場合により顕著なこと（０〜１ｍｍ＞１〜２ｍｍ＞２〜５ｍｍ）である。５ｍｍよりも大きな腫瘍の場合の腫瘍数は、ｖ６ １４ｍｅｒの場合より高い。
これらのデータから、発癌イニシエーションにおけるＣＤ４４の寄与が明らかになる。
４．２ 乳癌
４．２．１ 背景
多種多様な癌において、ＲＴＫのＥｒｂＢファミリーの様々なメンバーが過剰発現される、または変異される。例えば、乳腺癌腫を含む癌腫の大部分で高ＥｒｂＢ１発現が見られ、転移性乳癌の病巣の２０〜３０％でＥｒｂＢ２遺伝子の増幅を見ることができる。この乳癌型の造腫瘍性はＥｒｂＢ受容体の構成的活性化に依存する。
いくつかの乳癌細胞株ではＥＧＦによるＥｒｂＢ受容体の活性化がＣＤ４４ｖ６により可能になることが分かった。従って、ＣＤ４４ｖ６は、造腫瘍性をＥＧＦに基づくＥｒｂＢ活性化に依存している乳癌型に関与することができた。そして実際に、１００個の原発性の侵襲性乳房腫瘍および１８個のリンパ節転移の評価から、ＣＤ４４ｖ６の発現と造腫瘍性とが関連付けられた。このＣＤ４４バリアントの存在は低い生存率と相関する。２つのより近年の研究が同様の結果となった。
しかしながら、乳癌におけるＣＤ４４ｖ６の役割に関して相反するデータが存在する。ステージＩＩの乳房新生物を患っている１０９例の患者を評価する研究では、例えばＣＤ４４ｖ６発現と無病生存率または全生存期間とが全く関連付けられていなかった。相反する研究では、ＣＤ４４ｖ６は全ての乳癌型の共受容体として作用しないと解釈され得た。ＥｒｂＢ受容体の活性化がＴＧＦ−αにより媒介される癌型では、ＴＧＦ−αによる活性化がＣＤ４４ｖ６に非依存的であることが示され得たことから、例えば、ＣＤ４４ｖ６は共受容体として必要ないであろう。
４．２．２ ＣＤ４４ｖ６ １４ｍｅｒの効果
マウス乳癌細胞４Ｔ１の同所的注射により、同系マウスモデルにおいてＣＤ４４ｖ６ １４ｍｅｒの効果を検証した。４Ｔ１細胞は元々、自然発生的なＢＡＬＢ／ｃ乳腺腫瘍に由来した。同所的に誘導した場合、４Ｔ１細胞は原発性部位で急速に増殖し、３〜６週の期間内に肺およびリンパ節中で転移を形成する。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４Ｔ１細胞の腫瘍増殖および転移性拡散は、ヒト乳癌ステージＩＶを非常に密に模倣する。
４Ｔ１細胞を第６乳腺脂肪体に同所的に注射した。次いで、それぞれ移植腫瘍細胞を有する５匹の動物からなる２つの群を実験に使用した。１つの群をｖ６ １４ｍｅｒペプチドで処理し、もう１つの群をコントロール（ラット）ペプチドで処理した。ペプチドの注射を週当たり３回行ない、３〜４週間にわたり計画したが、コントロール群が大きな腫瘍を患ったことから２週間後に中止した。
原発性腫瘍の分析から、ｖ６ １４ｍｅｒ処理群では腫瘍サイズの著しい減少が明らかになった（図２６Ａ）。腫瘍血管新生をモニタリングするための免疫蛍光分析（抗ＣＤ３４染色）から、ｖ６ １４ｍｅｒ処理群では血管の総数が著しく減少したことが分かった（図２６Ｂ）。
ｖ６ １４ｍｅｒ処理動物とコントロールペプチド処理動物との間の差異を転移性拡散の場合でも見ることができた。肺の巨視的分析から、コントロールペプチドで処理した全てのマウスが転移を発症したことが明らかになった。転移の平均数は肺当たり６個の転移であった。ｖ６ペプチド処理群において、３匹の動物では巨視的な転移が全く見られず、２匹の動物は１つの転移のみを有した。従って、ｖ６ペプチドでの処理により、肺における転移の形成が大幅に減少する（図２６Ｃ）。
まとめると、結腸癌に関するおよび乳癌に関する予備データから、ｖ６ １４ｍｅｒは、膵癌以外の症状に有望なツールでもあることが明らかになった。
腫瘍細胞上に選択的に結合したＣＤ４４ｖ６ペプチド官能化ナノ粒子
材料および方法
Ａ．Ｚｗｅｉｂａｕｍ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ、フランス）からの贈与であるヒト腺癌細胞株ＨＴ２９を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ、ケルベ、ドイツ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）中で増殖させた。ラット膵癌細胞ＢＳｐ７３ＡＳ１０（ＡＳ１０）およびその形質移入体ＢＳｐ７３ＡＳｓ６（ＡＳｓ６）（ペーパーベロ（paper vero））を、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。５５０ｎｍで発光する疎水性ＣｄＴｅ量子ドット（粒子分子量は３２０００ｇ／ｍｏｌである）を、ＰｌａｓｍａＣｈｅｍ ＧｍｂＨ（ドイツ）から得た。アルファ−（９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル）アミノ−オメガ−カルボキシポリ（エチレンングリコール）（ＰＥＧ−ＭＷ３．０００ダルトン）およびアルファ−メトキシ−オメガ−カルボン酸ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＭＷ２．０００ダルトン）を、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ（ドイツ）から得た。パルミチン酸（９９％）およびポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（ＭＷ ２０００ｇ／ｍｏｌ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ドイツ）から得た。
計測手段
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン、ドイツ）で動的光散乱を行なった。量子ドットナノ粒子を、０．１ｍｇ／ｍｌの量子ドットの濃度までＭｉｌｌｉＱ水で希釈した。７５０μｌのナノ粒子溶液をキュベット中に加え、粒子サイズ（流体力学的径）および表面電荷（ゼータ電位）を測定した。
ＬＥＯ１５３０Ｇｅｍｉｎｉ走査型電子顕微鏡（ツァイス、ドイツ）を使用する走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により、量子ドットナノ粒子をキャラクタライズした。粒子を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させることにより、ＳＥＭ用の試料を調製した。生じた分散液をシリコンウェハ上に滴加し、空気中で乾燥させた。次いで、ＳＥＭ測定前に、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ１０８自動スパッターコーターを使用して、２０秒にわたり粒子に金をスパッターコーティングした。
４８００ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フラミンガム、マサチューセッツ州、米国）で、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を行なった。Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ４．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してピークリストを作成した。２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する１ｍｌのテトラヒドロフラン中に１０ｍｇ）を、ＰＥＧ化ペプチドおよびペプチド−ＰＥＧ−パルミチン酸アミド用のマトリックスとして使用した。１０μｌのＰＥＧ化ペプチドおよびペプチド−ＰＥＧ−パルミチン酸アミド（１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ中に１ｍｇ）と１０μｌのマトリックスとを混合し、１μｌの混合溶液をステンレス鋼ＭＡＬＤＩ担体上にスポッティングした。
ナノ粒子の調製
様々な密度のＣＤ４４ｖ６ペプチド官能化量子ドットナノ粒子を以下のように調製した：（ａ）４ｍｌのバイアル中において、３００μｌのＰＥＧ２０００−パルミチン酸エステル（クロロホルム中に４ｍｇ／ｍｌ）と３０μｌのＱＤ（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合することにより、ＰＥＧ−ＱＤを調製した。２０秒にわたる撹拌後、混合溶液を一晩にわたり、開口したバイアル中に入れてクロロホルムを確実に蒸発させた。３００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を４ｍｌのバイアルに添加し、３０秒にわたり撹拌してナノ粒子を形成した。（ｂ）４ｍｌのバイアル中において、２７０μｌのＰＥＧ２０００−パルミチン酸エステル（クロロホルム中に４ｍｇ／ｍｌ）と１２０μｌのｖ６−ＰＥＧ−パルミチン酸アミド（クロロホルム中に０．５ｍｇ／ｍｌ）と３０μｌのＱＤ（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合することにより、１０％ｖ６−ＰＥＧ−ＱＤを調製した。２０秒にわたる撹拌後、混合溶液を一晩にわたり、開口したバイアル中に入れてクロロホルムを確実に蒸発させた。３００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を４ｍｌのバイアルに添加し、３０秒にわたり撹拌してナノ粒子を形成した。（ｃ）４ｍｌのバイアル中において、２１０μｌのＰＥＧ２０００−パルミチン酸エステル（クロロホルム中に４ｍｇ／ｍｌ）と３６０μｌのｖ６−ＰＥＧ−パルミチン酸アミド（クロロホルム中に０．５ｍｇ／ｍｌ）と３０μｌのＱＤ（クロロホルム中に１０ｍｇ／ｍｌ）とを混合することにより、３０％ｖ６−ＰＥＧ−ＱＤを調製した。２０秒にわたる撹拌後、混合溶液を一晩にわたり、開口したバイアル中に入れてクロロホルムを確実に蒸発させた。３００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を４ｍｌのバイアルに添加し、３０秒にわたり撹拌してナノ粒子を形成した。
ウェスタンブロッティングならびにＭｅｔおよびＥｒｋの活性化
２４時間にわたり血清飢餓させたＡＳｓ６細胞を、５分にわたり３７℃においてＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で誘導した。示した箇所では、細胞をＰＥＧ化ペプチドまたは非ＰＥＧ化ペプチドで処理した後、１０分にわたり３７℃で誘導した（１５０ｎＭ）。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、煮沸した、１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）−試料緩衝液中で溶解させた。その後、溶解物を、リン酸化Ｍｅｋおよびリン酸化Ｅｒｋ（細胞シグナル伝達）に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析にかけた。同じブロットに関してＭｅｋおよびＥｒｋのローディンコントロールを行ない、ストリッピングし（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．８％ＤＴＴ）、Ｍｅｋ体およびＥｒｋ抗体で調べた。増強化学発光システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してブロットを染色した。
散乱アッセイ
２４ウェルプレート中において、ＨＴ２９細胞の散乱を測定した。最初に、４×１０５個の細胞を３７℃で播種し、細胞を未処理のままにした後、または４８時間後に２４時間にわたりＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、またはＰＥＧ化ペプチドもしくは非ＰＥＧ化ペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、３０分にわたりＨＧＦで誘導した。
免疫蛍光アッセイ
ウェル当たり１×１０４個のＡＳ１０細胞およびＡＳｓ６細胞を、３７℃で２４時間にわたり８ウェル顕微鏡チャンバースライド上に播種した。細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、−２０℃で１５分にわたりメタノールで固定し、再びＰＢＳで３回洗浄した。その後、暗所において室温で１時間にわたり、指定の改変量子ドットと共に細胞をインキュベートした。その後、細胞を、室温で３０分にわたり、ＰＢＳ中の４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、マウンティング培地に埋め込んだ。６３倍の対物レンズのＬｅｉｃａ ＳＰＥ共焦点蛍光顕微鏡を使用して、蛍光像を得た。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
１０ｃｍのペトリ皿中で培養したＡＳｓ６細胞およびＡＳ１０細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにより、８０％の培養密度で回収した。ＰＢＳ中の３％ＦＣＳで細胞を３回洗浄した。その後、１０分にわたり、３％ＦＣＳ／ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌの量子ドットと共に細胞をインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ中の３％ＦＣＳで３回洗浄し、ＦＣＳを含まないＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ測定にかけた。
結果および考察
ＣＤ４４ｖ６ペプチドおよびＰＥＧ化ペプチドの合成およびキャラクタリゼーション
上記に記載したように、様々な癌細胞株において、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達のＨＧＦ誘導性の活性化をブロックするのにＣＤ４４ｖ６ペプチド（ＣＤ４４ｖ６ペプチド）を使用することができる。更に、このペプチドは、ＨＴ２９腺癌細胞において、ＨＧＦ誘導性の細胞散乱（細胞塊からの単細胞の分離および遊走を説明する用語）を効果的にブロックすることができる。このペプチドは腫瘍増殖および転移を効果的に阻害することができ、更に、既に生じた転移を除去することができる。要するに、これにより、このペプチドは癌治療用の非常に有望な潜在的薬物候補となる。ＣＤ４４ｖ６ペプチドはＣＤ４４ｖ６発現細胞に特異的に結合することから、このペプチドを量子ドット（ＱＤ）表面で更に官能化し、このペプチドの腫瘍細胞に対する選択的結合を明らかになる。
ＰＥＧ化は、インビボでのペプチド、タンパク質およびナノ粒子の安定性を高めるために一般的に使用される技法である。ここで、ＣＤ４４ｖ６ペプチドを、Ｎ末端で特異的にＰＥＧ化した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドおよびＰＥＧ化ペプチドをＷａｎｇ樹脂上で順次合成し、分取ＨＰＬＣで精製した。ＣＤ４４ｖ６ペプチドおよびＰＥＧ化ペプチドの純度を更に分析し、分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでキャラクタライズした（図２７）。
ＣＤ４４ｖ６ペプチドおよびＰＥＧ化ペプチドのブロッキングアッセイ
また、２０００ダルトンのＰＥＧ鎖の付着後に、ペプチドのブロッキング能力を検証した。ＣＤ４４ｖ６を高度に発現するラット膵癌細胞株ＢＳｐ７３ＡＳｓ６をＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドで処理し、この処理により、ＲＴＫ ＭｅｔおよびＥｒｋ経路を介する該ＲＴＫ Ｍｅｔの下流シグナル伝達のＨＧＦ誘導性の活性化がブロックされ得るかどうかを検証した。陽性コントロールとして、非ＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチド（Ａ＝本発明者らが産生した、Ｂ＝Ｂａｃｈｅｍにより産生された）を使用し、陰性コントロールとして、非ＰＥＧ化コントロールペプチドまたはＰＥＧ化コントロールペプチドを使用し、３つの必須アミノ酸をアラニンに置き換えた。確かに、ＰＥＧ化は、ＣＤ４４ｖ６ペプチドの機能性に影響を及ぼさなかった。ＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドによるＡＳｓ６細胞の処理により、ＨＧＦはＭｅｔ−リン酸化の誘導およびＥｒｋシグナル伝達の活性化に完全に失敗したが、ＰＥＧ化コントロールペプチドでは効果が見られなかった（図１０）。また、ＨＧＦ誘導性のＨＴ２９細胞の散乱は、ＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドによる前処理によって強力に阻害されたが、ＰＥＧ化コントロールペプチドでは阻害されなかった（図１１）。これらの結果は、ＰＥＧ化はＣＤ４４ｖ６ペプチドの機能性に影響を及ぼさないことを明確に示す。
ＣＤ４４ｖ６ペプチド官能化ナノ粒子の調製およびキャラクタリゼーション
ＱＤでＣＤ４４ｖ６ペプチドを官能化するために、本発明者らは、固相合成を順次使用してｖ６−ＰＥＧ３０００−パルミチン酸アミドを合成した。両親媒性ｖ６−ＰＥＧ３０００−パルミチン酸アミドを分取ＨＰＬＣで更に精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでキャラクタライズした。
ＣＤ４４ｖ６ペプチド官能化ナノ粒子の結合アッセイ
ＣＤ４４ｖ６発現は癌の進行期と相関することが多く、多様な癌型での予後不良と密接な関係がある。そのため、多くの悪性癌細胞は、その表面上で多量のＣＤ４４ｖ６を発現し、この細胞を標的とするための重要なマーカーとしてＣＤ４４ｖ６を示す。従って、ＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドを使用して、細胞上でのＣＤ４４ｖ６発現を標的とするためにおよび可視化するために使用することができる多価複合ナノ粒子を作成することができる。この目的のために、ＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドを、鮮やかに輝くおよび非常に安定した蛍光プローブとして使用することができる、小型半導体ナノ粒子である量子ドット（ＱＤ）に接合させた。ＱＤの大きな利点は、様々な濃度でＰＥＧ化ＣＤ４４ｖ６ペプチドと量子ドットの表面とを結合させる多価であるということである。３つの異なるタイプのナノ粒子、即ち量子ドットにＰＥＧ鎖のみが付着しているナノ粒子（ＰＥＧ−ＱＤ）、量子ドットの周囲のＰＥＧ鎖の１０％および３０％がＣＤ４４ｖ６ペプチドに結合しているナノ粒子（それぞれ１０％−ｖ６ペプチド−ＱＤおよび３０％−ｖ６ペプチド−ＰＥＧと表す）を作成した。これらの量子ドットがＣＤ４４ｖ６発現細胞に特異的に結合して該ＣＤ４４ｖ６発現細胞を染色することができるかどうか、およびＣＤ４４ｖ６ペプチド濃度が結合能力に影響を及ぼすかどうかを検証した。
本発明者らは、ＣＤ４４ｖ６を発現するＢＳｐ７３ＡＳｓ６細胞（ＡＳｓ６）またはＣＤ４４ｖ６陰性ＢＳｐ７３ＡＳ１０細胞（ＡＳ１０）を様々な量子ドットと共にインキュベートし、免疫蛍光顕微鏡により染色を可視化した。ＰＥＧ化ＱＤの細胞への非特異的な結合を除いて、ＰＥＧ鎖のみにより囲まれたＱＤはＡＳｓ６細胞もＡＳ１０細胞も染色しなかった（図２８Ａ）パネル１）。ＣＤ４４ｖ６ペプチドに結合したＰＥＧ鎖の１０％を含有するＱＤも、いずれの細胞型も染色しなかった（図２８Ａ）パネル２）。しかしながら、ＱＤ表面でＰＥＧ鎖の３０％がＣＤ４４ｖ６ペプチドに付着する場合、ＣＤ４４ｖ６陽性ＡＳｓ６細胞の膜でのみ量子ドットを検出することができたが、ＣＤ４４ｖ６陰性ＡＳ１０細胞では検出せず、このことは、ＣＤ４４ｖ６発現細胞の特異的染色を示す（図２８Ａ）パネル３）。このこととは対照的に、ＣＤ４４ｖ６の発現に関係なく、両方の細胞型の表面で５０％ｖ６ペプチド−ＱＤを検出することができた（データを示さず）。
これらの結果を更に分析し、いくつかの独立した実験（ｎ＝５）の量子ドット染色細胞の割合を定量化した。ＰＥＧ−ＱＤは、ＡＳ１０細胞またはＡＳｓ６細胞を染色しなかった。１０％ｖ６−ＱＤを、ＡＳ１０細胞またはＡＳｓ６細胞のわずか１０％の表面上で見出した。しかしながら、ＡＳｓ６の９０％が３０％ｖ６−ＱＤで染色されたが、ＡＳ１０細胞ではわずか１５％であり、このことは、３０％ｖ６−ＱＤのＣＤ４４ｖ６発現細胞への高度に特異的な結合を示す。３０％−ｖ６ペプチド−ＱＤの特異性を更に確かめるために、ＡＳ１０細胞にｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクターを遺伝子導入し、ＡＳｓ６細胞に、ＣＦＰを含有する発現ベクターを遺伝子導入し、両方の細胞株を共培養した。これらの共培養細胞を３０％−ｖ６ペプチド−ＱＤで処理し、免疫蛍光顕微鏡により染色を可視化した。確かに、３０％−ｖ６ペプチド−ＱＤは、ＣＦＰ陽性のおよびＣＤ４４ｖ６を発現するＡＳｓ６細胞にのみ結合した。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性ＡＳ１０細胞は未染色のままであった（図２８Ａ）パネル４）。
免疫蛍光顕微鏡に加えて、蛍光活性化細胞選別分析（ＦＡＣＳ分析）により、様々なＣＤ４４ｖ６ペプチド結合量子ドットの結合を分析した。顕微鏡結果により、本発明者らは、ＣＤ４４ｖ６を発現するＡＳｓ６細胞上でのみ３０％ｖ６ペプチド−ＱＤの結合を検出することができた（図２８Ｃ）。要約すると、ＰＥＧ化は、ＨＧＦ誘導性のＭｅｔシグナル伝達および細胞散乱への影響をブロックすることに関してＣＤ４４ｖ６ペプチドの機能性に影響を及ぼさないことをデータは明確に示す。このＰＥＧ化ペプチドを量子ドットに結合させることができ、これにより、ＣＤ４４ｖ６発現癌細胞を標的とするおよび染色するための特異的なバイオマーカーとして容易に使用することができる多機能なナノ粒子を提供することができる。
結論
ＣＤ４４ｖ６発現は、癌の進行期および予後不良と相関することが多い。更に、ＣＤ４４ｖ６発現は、おそらくｃ−ＭＥＴ受容体型チロシンキナーゼおよびＶＥＧＦＲ受容体型チロシンキナーゼの共受容体としての機能に起因して、非転移性癌細胞に転移能を付与する可能性がある。３つのアミノ酸、即ちＲ−Ｗ−ＨがＣＤ４４ｖ６の機能に必須であり、これら３つのアミノ酸を含む少なくとも５つのアミノ酸長の小ペプチドを、ＣＤ４４ｖ６の機能を効果的にブロックするために使用することができる。膵癌に関するインビボのマウスモデルおよびラットモデルにおいて、ＣＤ４４ｖ６のブロッキングにより、ＨＧＦ誘導性のｃ−Ｍｅｔシグナル伝達またはＶＥＧＦ−Ａ誘導性のＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達が完全に阻害され、その結果、血管新生および転移がブロックされる。更に、ＣＤ４４ｖ６ペプチドはＣＤ４４ｖ６発現細胞に結合し、これにより、悪性のＣＤ４４ｖ６発現腫瘍細胞または組織に対するマーカーとして、このペプチドを使用することが可能になる。
この実施例では、ＣＤ４４ｖ６ペプチドをＰＥＧ化し、分子レベルでのＰＥＧ化ペプチドの機能性を確認し、ＰＥＧ化ペプチドを量子ドットに結合させた。このＣＤ４４ｖ６−ＱＤナノ粒子はＣＤ４４ｖ６発現細胞に特異的に結合して染色し、このことを、免疫蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により確認した。
ペプチドの量子ドットへの結合にはいくつかの利点があり、一方では、明るく輝くおよび非常に安定した、ＣＤ４４ｖ６発現細胞に対するバイオマーカーが作成され、該バイオマーカーをＣＤ４４ｖ６発現腫瘍細胞または組織の検出およびより良好なキャラクタリゼーションに使用することができ、更に患者におけるＣＤ４４ｖ６発現転移を検出するために使用することもできる。他方では、多価のため、従来の抗癌剤のようなその他の化合物とＣＤ４４ｖ６−ＱＤとを結合させてＣＤ４４ｖ６発現腫瘍細胞を特異的に標的とする多機能性薬物を作成する可能性がある。
本発明の実施形態の内のいくつかは以下に関する。
１．ヒトの転移性癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物。
２．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１に記載の使用のための化合物。
３．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２に記載の使用のための化合物。
４．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態１、２または３に記載の使用のための化合物。
５．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態１、２、３または４に記載の使用のための化合物。
６．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態５に記載の使用のための化合物。
７．化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態１、２、３、４または５に記載の使用のための化合物。
８．ヒトの転移性癌の処置において使用するための医薬組成物であって、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む医薬組成物。
９．前記医薬組成物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態８に記載の使用のための医薬組成物。
１０．前記医薬組成物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態９に記載の使用のための医薬組成物。
１１．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態８、９または１０に記載の使用のための医薬組成物。
１２．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態８、９、１０または１１に記載の使用のための医薬組成物。
１３．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、グリコシル化型、ミリストイル化型および／または環状型である、
実施形態１２に記載の使用のための医薬組成物。
１４．前記医薬組成物が薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態８、９、１０、１１、１２または１３に記載の使用のための医薬組成物。
１５．前記医薬組成物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３または１４に記載の使用のための医薬組成物。
１６．ヒトの転移性癌の処置において使用するための医薬品の製造における化合物の使用であって、
前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、化合物の使用。
１７．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１６に記載の化合物の使用。
１８．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態１７に記載の化合物の使用。
１９．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態１６、１７または１８に記載の化合物の使用。
２０．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態１６、１７、１８または１９に記載の化合物の使用。
２１．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態２０に記載の化合物の使用。
２２．前記医薬品が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態１６、１７、１８、１９、２０または２１に記載の化合物の使用。
２３．化合物を、それを必要とするヒトに化合物を投与することによりヒトの転移性癌を処置する方法であって、前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、方法。
２４．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷもしくはＹまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２３に記載の方法。
２５．前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮもしくはＱを含む群から選択され、Ｘ５が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥもしくはＤを含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ２が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ３が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ４が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばＡ、Ｖ、ＬもしくはＩを含む群から選択され、Ｘ１３が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばＦ、ＷまたはＹを含む群から選択され、Ｘ１４が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、ＮＨ２基を有するアミノ酸、例えばＫ、Ｒ、ＮまたはＱを含む群から選択され、Ｘ１１が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばＥまたはＤを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、実施形態２３、２４または２５に記載の方法。
２７．前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、実施形態２３、２４、２５または２６に記載の方法。
２８．前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および／または環状型である、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、実施形態２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の方法。
３０．前記転移性癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、実施形態１、２、３、４、５、６もしくは７のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９のいずれかに記載の方法。
３１．前記転移性癌が対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶと分類できる、実施形態１、２、３、４、５、６、７もしくは３０のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは３０のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは３０のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０のいずれかに記載の方法。
３２．前記転移性癌が対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類できる、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０もしくは３１のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０もしくは３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記転移性癌がホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌、頭頸部扁平上皮癌または乳癌の転移型を含む群から選択される、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２のいずれかに記載の方法。
３４．前記転移性癌が、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌または乳癌の転移型を含む群から選択され、前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類でき、前記転移性癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、実施形態１、２、３、４、５、６、７、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用のための化合物、実施形態８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、実施形態１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の使用または実施形態２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３のいずれかに記載の方法。

Claims (12)

  1. ヒトの転移性癌の処置において使用するための化合物であって、
    少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（Ｘ１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択され、Ｘ５が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号１）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
    アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３もしくはＸ１４が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）（配列番号７）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号７の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７およびＸ１１が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷもしくはＹを含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
    を含む化合物。
  2. 前記化合物が、
    少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号４）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
    アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ２が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ３が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ４が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１３が、Ｆ、ＷもしくはＹのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１４が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号８）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号８の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはＡ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
    を含む、請求項１に記載の使用のための化合物。
  3. 前記化合物が、
    少なくともアミノ酸配列Ｘ１−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ５（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮもしくはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、ＥもしくはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号５）含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
    アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４（式中、Ｘ１が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ２が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ３が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ４が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ５が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ６が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１２が、Ｇまたは、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１３が、Ｆ、ＷまたはＹのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１４が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択される）（配列番号９）の内の少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個のまたは１４個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号９の少なくともＸ７−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｘ１１（式中、Ｘ７が、Ｋ、Ｒ、ＮまたはＱのようなＮＨ２基を有するアミノ酸を含む群から選択され、Ｘ１１が、ＥまたはＤのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される）を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
    を含む、請求項２に記載の使用のための化合物。
  4. 前記化合物が、アミノ酸配列Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ（配列番号２）、アミノ酸配列Ｋ−Ｅ−Ｑ−Ｗ−Ｆ−Ｇ−Ｎ−Ｒ−Ｗ−Ｈ−Ｅ−Ｇ−Ｙ−Ｒ（配列番号６）を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の使用のための化合物。
  5. 前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、請求項１、２、３または４のいずれかに記載の使用のための化合物。
  6. 前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、グリコシル化型、ミリストイル化型および／または環状型である、請求項５に記載の使用のための化合物。
  7. 化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の使用のための化合物。
  8. 前記転移性癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれかに記載の使用のための化合物。
  9. 前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＩＩまたはステージＩＶと分類できる、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の使用のための化合物。
  10. 前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類できる、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれかに記載の使用のための化合物。
  11. 前記転移性癌が、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌、頭頸部扁平上皮癌または乳癌の転移型を含む群から選択される、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のいずれかに記載の使用のための化合物。
  12. 前記転移性癌が、ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、例えば扁平上皮癌または基底細胞癌、頭頸部癌、胃癌、膵癌または乳癌の転移型を含む群から選択され、前記転移性癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのＴＮＭ解剖学的／予後群システムに従ってステージＩＶと分類でき、前記転移性癌がＣＤ４４ｖ６の発現を示す、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のいずれかに記載の使用のための化合物。
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