JP2016047048A - 経口不活化ワクチン及びそれを提供するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微生物により粘膜表層の異常な微生物のコロニー形成に対して、経口不活化ワクチンの使用における微生物の分離体を選択するための方法の提供。【解決手段】各微生物の分離体における活性化データを提供するために、抗原反応性細胞を活性化する微生物の複数の異なる分離体の能力を評価する、各微生物の分離体におけるクリアランスデータを提供するために微生物による粘膜表層の感染を減じる分離体の効果を評価する。ワクチンで活用するために選択される。粘膜表層の異常な微生物のコロニー形成に対して、経口不活化ワクチン。ワクチンで活用するために、他の各分離体と互いにそれぞれ比較して、ＩＬ−１０と相関するＩＬ−１２の最適な発現を誘発する、少なくとも一つの分離体が選択される。【選択図】図１

Description

本発明は、微生物による粘膜表層の異常なコロニー形成に対して防御的な粘膜免疫反応を誘発するための経口不活化ワクチンで使用するための単細胞の微生物の分離体を選択するための方法に関する。また、このような感染症の予防または治療のための経口不活化ワクチンが提供される

抗菌ワクチンは公知技術であり、実施例は破傷風の毒素タンパク質が接合している細菌多糖類から成るインフルエンザ菌Bワクチンを含む。また、予防または消化器官の感染症の治療のための死菌ワクチンは知られており、腸チフスのための死菌ワクチンは市販されている。これらのワクチンが全身抗体反応を刺激して疾患の予防を提供するようにすることを意図するという点で、これらのワクチンは主に注射によって、もしそうでなければ投与されて、古典的なワクチンとして役立つ。

経口投与される抗原は、全身リンパ組織とは異なって、腸管関連リンパ組織（GALT）によって処理される。目的論的に、これは、粘膜炎症にダメージを与えることを犠牲にすることなく、環境抗原が除外されることを必要とする粘膜生理学に関して理解されることができる。したがって、このような抗原に対する免疫反応に潜在的にダメージを与えることを最小にするために、強力な抑制メカニズムが存在する。この概念は、最初は、全身免疫反応（つまり、抗体の生成によって介される）が粘膜抗体反応（寛容）を検出することができないことに関連する、「スプリット トレランス（split tolerance）」として同定された。経口的に投与した不活化インフルエンザ ウィルスを活用する研究は、狭い範囲の抗原用量を超えて、抗体反応が刺激されることを示す。この免疫「領域」は、高低「領域」寛容がある。領域でも、同じ概念は細胞性免疫に適用し、抗体反応がなく起こっている防御については、より広い範囲で、Ｔリンパ球を介する反応が刺激されることができる。GALTとの抗原相互作用の結果は、感染の遠い粘膜部位に対する、Ｂ及びＴリンパ球の選択的な移動であり、そこでは、Ｂ及びＴリンパ球が防御を仲介する。

また、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）による感染に対する経口死菌ワクチンが公知である。ＮＴＨｉは、慢性肺疾患を有する患者の鼻および気管支でのコロニー形成と関連がある、最も一般的な細菌であって、これらの患者の急性気管支炎発症と関連がある。このような患者の急性気管支炎の発症における重要な要因は、コロニーを作っている細菌に応答する気管支ルーメンへの好中球の抑制されていない不適切な移動である。気管支内の好中球の蓄積した（neurophil-laden）流体の蓄積は、化膿した痰に結果としてなる。居合わせた患者による感染の獲得によって評価されるように、経口ＮＴＨｉ死菌ワクチンの活用は、化膿した痰生産、高レベルの気道の細菌コロニー形成および細菌の環境での広がりから防御することを示した。このＮＴＨｉワクチンは、ＧＡＬＴの活性後の一般の粘膜システム、より詳しくは、腸のパイエル板を刺激する。

特に長期慢性肺疾患の患者に粘膜免疫を提供するための死菌を含む経口のノン−アドジュべネイテッド（non-adjuvenated）な単細胞細菌のワクチンが、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８６／０００７１に記載されている。特に、その応用では、ワクチンの免疫化効能がアジュバントの不在に起因することを示している。通常、アジュバントは、免疫反応を促進するために、このようなワクチン処方に含まれる。アジュバントがない場合の免疫反応の発生は、評価される患者の肺の有力なサプレッサーＴ細胞群を引きこすために不十分な死菌によって誘発される反応によると結論された。

Dunkley et al, Immunol. (1994)83, pp.362-369 Remington. "The Science and Practice of Pharmacy." (Mack Publishing Co., 1995)

広義的に述べると、本発明は、異常な微生物のコロニー形成から守るための経口不活化ワクチンの供給に関し、個体群の遺伝的変異を反映する、異種交配された個体群の経口不活化ワクチンによって誘発される、このような感染症のクリアランスに著しい変化があるという認識から生じる。従来技術の経口死菌ワクチンの活用に関連した粘膜免疫の変化は、抗原提示細胞およびＴリンパ球を活性化する微生物の異なる分離体の能力の重要な変化を認めることを見逃すことで、ワクチンのより最適でないか、またはランダムに選ばれる微生物の分離体の活用に起因すると考えられている。変化が観察され、分離体の選択は、異種交配された個体群の異なる個体の一般的な粘膜システムの活性化の程度を最適化するために重要である。本発明の一つ以上の実施例において提供される方法論は、経口不活化ワクチンを最適化するための分離体の選択を可能にする。

より詳細には、本発明の一つの態様において、粘膜表層の異常な微生物コロニー形成に対する経口不活化ワクチンのための微生物の分離体を選択する方法が提供され、当該方法は、各微生物の分離体における活性化データを提供するために、抗原反応性細胞を活性化する単細胞微生物の複数の異なる分離体の能力を評価することと、各微生物の分離体におけるクリアランスデータを提供するために微生物による粘膜表層の感染を減じる分離体の効果を評価することと、微生物の分離体から、活性化データとクリアランスデータが相関し、他の各分離体と互いに比較して微生物に対して粘膜免疫を発生させるために最適である分離体を選択するか、または、さらにワクチンの処方で活用するため他の各分離体と互いにそれぞれ比較して、活性化データが最適であり、なおかつ、さらにクリアランスデータが最適である分離体を選択することよりなる。

本発明の別の態様において、粘膜表層の異常な微生物コロニー形成に対して経口不活化ワクチンを提供するための方法が提供され、当該方法は、各微生物の分離体における活性化データを提供するために抗原反応性細胞を活性化する単細胞微生物の複数の異なる分離体の能力を評価することと、各微生物の分離体におけるクリアランスデータを提供するために微生物による粘膜表層の感染を減じる抽出物の効果を評価することと、複数の分離体から、活性化データとクリアランスデータが相関し、他の各分離体と互いに比較して微生物に対して粘膜免疫を発生させるために最適である分離体を選択するか、または、さらにワクチンの処方で活用するため他の各分離体と互いにそれぞれ比較して、活性化データが最適であり、なおかつ、さらにクリアランスデータが最適である分離体を選択することと、選択された分離体（複数可）を用いてワクチンを処方することよりなる。

概して、活性化データとクリアランスデータが他の分離体と比較して最適である分離体が選択される。

好ましくは、粘膜免疫は、主に細胞性免疫反応からなる。

好ましくは、活性化及びクリアランスデータを提供するために活用される分離体は、微生物の不活化された分離体である。しかしながら、本発明はこれに限定されず、活性化およびクリアランスデータは、ワクチンで活用するための生の分離体と、その後不活化される選択された分離物から得られてもよい。

分離体によって活性化された抗原反応性細胞は、一般的に、抗原提示細胞とＴリンパ球の一つ又は両者からなり、好ましくは、両タイプの細胞からなる。概して、抗原提示細胞は、マクロファージからなる。最適には、Ｔリンパ球はＴｈ１細胞である。抗原反応性細胞の活性化は、分離体によって直接のおよび／または間接的な活性化を含むように、最も広義に解される。直接の活性化は、例えば、微生物の分離体が抗原反応性細胞と結合されるかまたはそれらによって食菌される際に、細胞と接触することによって、分離体が少なくとも幾つかの抗原反応性細胞を活性化することを意味する。間接的な活性化は、例えば、分離体と接触するマクロファージなどの細胞と相互作用することによって、又はサイトカイン若しくは分離体により誘導されるか、誘発される放出物の他の化学的な伝達物質によって、あるいは分離体によって分泌される毒素若しくは抗原などの物質によって、あるいは前述した可能性の組み合わせによって、少なくとも幾つかの抗原反応性細胞が活性化されることを意味する。

抗原反応性細胞の活性化レベルは、細胞の活性化と関連する１つ以上のパラメーターを測定することによって評価できる。好ましくは、抗原提示細胞とＴリンパ球を活性化する分離体の能力が評価される。特に好ましい実施態様において、各分離体によって達成される抗原反応性細胞の活性化は、抗原提示細胞の活性化レベルを表す、少なくとも一つのパラメーターと、Ｔリンパ球の活性化レベルを表す、少なくとも他の一つのパラメーターとを測定することによって評価される。最適には、他の試験された分離体と比較して、抗原提示細胞とＴリンパ球を活性化するために適切な活性化データの分離体が、経口不活化ワクチンの調製に活用されるために選択される。

好ましくは、分離体（活性化データは、ＩＬ−１０：ＩＬ−１２の比率が約３０以下であることによって特徴とされるサイトカイン反応を誘導する分離体の能力を表す）は、経口不活化ワクチンの処方に活用するために選択される。

したがって、本発明の別の実施態様において、粘膜表層の異常な微生物コロニー形成に対する経口不活化ワクチンのための微生物の分離体を選択するための方法が提供され、該方法は、抗原反応性細胞でＩＬ−１０及びＩＬ−１２の発現を誘発する単細胞微生物の複数の異なる分離体の能力を評価することと、ワクチンの処方に活用するために、他の各分離体と互いにそれぞれ比較して、ＩＬ−１０と相関するＩＬ−１２の最適な発現を誘発する、微生物の分離体から少なくとも一つの分離体を選択することよりなる。

本発明のさらに別の態様において、粘膜表層の異常な微生物コロニー形成に対する経口不活化ワクチンを提供するための方法が提供され、該方法は、抗原反応性細胞でＩＬ−１０及びＩＬ−１２の発現を誘発する単細胞微生物の複数の異なる分離体の能力を評価することと、ワクチンの処方に活用するために、他の各分離体と互いにそれぞれ比較して、ＩＬ−１０と相関するＩＬ−１２の最適な発現を誘発する、微生物の分離体から少なくとも一つの分離体を選択することと、及び分離体を利用してワクチンを処方することよりなる。

単細胞微生物は、哺乳類の粘膜表層にコロニーを形成する能力を有する、任意の種類の微生物であり得、例えば、細菌、菌類および酵母からなる群から選択されてよい。概して、微生物は細菌であり、したがって、ワクチンは経口死菌ワクチンである。好ましくは、選択された分離体は、不活化全生物体（whole killed organisms）として、本発明のワクチンに使用される。しかしながら、本発明は、不活化全生物体の活用に制限されるものではなく、ワクチンは、選択された分離体の外側の細胞膜に由来する粒子状物質を含んで提供されてよい。

また、別の態様において、本発明は、本発明の方法によって提供される、経口不活化ワクチンに関する。

本発明のワクチンは、慢性および急性の感染症を含む粘膜部位の感染症に対して導かれる。感染症は、通常は、粘膜部位にコロニーを形成しない微生物病原体に対する一時的な露出の結果であり得るか、または、粘膜部位で通常に見られる微生物叢に起因する日和見性の感染であり得る。

したがって、別の態様において、単細胞微生物による哺乳類の粘膜表層の感染症の予防または治療のための方法が提供され、該方法は、微生物に対して粘膜免疫を発生させるための本発明の経口不活化ワクチンの有効量を哺乳類に投与することよりなる。

哺乳類は、本発明の経口不活化ワクチンで処置できる哺乳類であってよく、例えば、霊長類、ラット、マウスのような齧歯目系統の部類、またはウシの部類、豚、羊または馬の系統であってもよい。しかしながら、好ましくは、哺乳類はヒトである。

本明細書の記載において、「有する」、またはその表現の変形としての「含む」、「よりなる」は、他のいかなる要素、整数若しくはステップまたは要素、整数若しくはステップの群の除外でなく、記載された要素、整数若しくはステップまたは要素、整数若しくはステップの群の包含を意味することが理解される。

本明細書で言及したすべての刊行物は、参照としてここに組み込まれる。本明細書に含まれる、いかなる文書の記載、作用、物質、装置、物品等は、単に、本願明細書における関係を提供するためにある。これらのいかなる事項若しくは全ての事項が従来技術の基礎の一部を形成するか、または、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアか他の地域で、本発明に関連する分野の共通の一般知識であったということが承認されるように解されない。

さらに、本発明の特徴及び利点は、下記の好ましい実施態様の記載から明白となる。

経口投与された細菌の不活化全菌体の異なる分離体によって、BALB/cマウスの鼻でS.アウレウスのコロニー形成の減少を示すグラフである。 経口投与された細菌の不活化全菌体の異なる分離体によって、BALB/cマウスの気道でＮＴＨｉコロニー形成の減少を示すグラフである。

本発明によって具体化されたワクチンは、肺および上気道感染症の予防または治療における特定の応用を見出す。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではなく、一般の粘膜システムの活性化から生じる粘膜免疫は、口、鼻、口咽頭、咽頭、消化管、膣、眼関連、および尿粘膜表層などの感染を含む、体の他の粘膜部位での感染に対する防御または治療を含んでよい。ワクチンは、例えば、クラミジア属種、ヘモフィルス属種、無莢膜型ヘモフィルス属種、シュードモナス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、エシェリヒア コリ、マイコプラズマ属種、及びヘリコバクター属種、他にその他から選択される細菌を含むか、細菌の異なる属、または他の単細胞微生物の組み合わせを組み込んでよい。本発明による経口不活化ワクチンで利用されることができる細菌以外の微生物は、カンジダ・アルビカンスなどのカンジダ属種と、サッカロミセス属種のような酵母とを含む。本発明によって具体化される、特に好ましい経口死菌ワクチンは、無莢膜型ヘモフィルス インフルエンザ(ＮＴＨｉ)、Ｓ．アウレウス（aureus）、Ｐｓ．エルギノーサ（aeruginosa）、Ｓ．ニューモニエ（pneumoniae）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細菌による粘膜感染の予防または治療のためのワクチンである。

本発明によって具体化されるワクチンの主な応用は、ワクチンが提供される特定の細菌の感染に対して粘膜免疫を発生させることであり、そして、それはさまざまな粘膜部位で起こることができるが、ワクチンはまた、感染症によって悪化する疾患または症状の治療若しくは予防のために用いられることができる。

例えば、Ｐ．エルギノーサは、気道にコロニーを形成するだけでなく、目粘膜と耳腔に影響を与える。無莢膜型ヘモフィルス インフルエンザ（ＮＴＨｉ）は、また、中耳炎を含んでいる伝染性の状況の範囲において、そして、肺炎および慢性気管支炎の悪化において関係している。したがって、それらの細菌の１つ以上の不活化された分離体を含有するワクチンは、予防またはこの種の関連する状況の治療のために投与されてよい。同様に、不活化インフルエンザ菌、Ｓ．ニューモニエ又はＰ．エルギノーサを含む本発明のワクチンは、気管支炎または肺炎、嚢胞性線維症および慢性閉塞性気道疾患の急性感染症、洞疾患、易感染性の肺機能、並びに他の肺および気道疾患障害の予防と治療において利用されることができる。また、特に年輩者で、これらのワクチンは、インフルエンザ ウイルスまたは他のウイルスによる感染で生じる対応する細菌による二重感染の予防または治療における特定の応用で見られる。

本発明のワクチンにおいて不活化全菌体の分離体（whole killed isolates）（複数可）を用いることが好ましいが、その分離体（複数可）の表面抗原を含む特定の細胞表面物質を不活化全生物体に代わって、同様に活用してもよい。特に好ましい実施態様において、生物の外側の細胞膜分画が活用される。粒子状物質は、超音波処理または他の適切な技術により、不活化若しくは生の選択された分離体を崩壊させることによって、さらに必要に応じて、従来技術において公知の遠心分離、濾過および／または他の適切な技術により、他の細胞構成要素から必要な分画を切り離すことによって、調製されることができる。細胞崩壊の必要なレベルを達成する任意の適切な方法は、超音波処理ならびに適切な界面活性剤および攪拌を利用する分解を含むことを用いる。超音波処理が採用される場合、細胞の崩壊の必要とされる度合い、または望ましい大きさの粒子状物質の生成を得るために、分離体は多くの超音波ステップを受ける。利用される粒子状物質の分画は、抗原応答性細胞の反応を分離体（複数可）の異なる分画と比較して、かつ、細胞による免疫反応を最大にする分画を選択することによって選択されることができる。

抗原反応性細胞を活性化する微生物の分離体またはその粒子状物質の性能を評価するために、細胞の活性化レベルを表す、任意のパラメーターが評価される。特に、好ましいパラメーターは、細胞増殖、細胞表面抗原の発現、細胞エフェクター機能の測定、およびサイトカイン生産の一つ以上を含む。

細胞増殖、特にＴ細胞増殖は、細胞数、^３Ｈ−チミジン取り込み及び／又はＭＴＴ分析によって便利に評価されることができる。

サイトカインの発現は、キャプチャー（capture）若しくはサンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって直接的に測定されるか、又は感心のあるサイトカインが成長因子若しくは阻害剤として作用する細胞成長アッセイによって間接的に測定される。同様に、サイトカインの発現はまた、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、又は、従来技術において周知である、単一細胞及び特定のオリゴヌクレオチドプローブを活用する、in-situハイブリダイゼーションプロトコールを採用することにより、サイトカインをコードするｍＲＮＡの発現レベルを決定することによって評価される。

概して、ワクチンによって生じる防御免疫反応は、主に、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの存在で増殖するＣＤ４^＋Ｔ−リンパ球から分化する、Ｔｈ１Ｔリンパ球によって介される。ＩＬ−１２は、活性化の初期段階で、抗原提示細胞によって生成される。Ｔｈ１Ｔリンパ球は、ＩＦＮ−γの分泌とマクロファージによって発現されるＣＤ４０レセプターを有するＴｈ１細胞によって発現されるＣＤ４０リガンドの相互作用により、感染したマクロファージを刺激する。より広義には、Ｔｈ１細胞は、食細胞（例えば、好中球及びマクロファージ）の抗菌性機能を刺激し、このような食細胞を感染の部位に引きつける、サイトカインを放出する。加えて、典型的には、ＩＦＮ−γ、Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−βを分泌する。

Ｔｈ１とＴｈ２の両細胞がＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、例えば、ＴＮＦ−αを分泌する一方で、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞における全体のサイトカインのプロファイルは異なる。より詳細には、Ｔｈ２細胞の活性化は、主に、活性化されたＢ細胞によってＢ-リンパ球の活性および抗体の生成によって特徴とされる体液の免疫反応に結果としてなり、その一方で、Ｔｈ１細胞は、主に、非抗体細胞免疫反応を仲介する。免疫反応を導く、Ｔｈ２細胞に特有のサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ−βを含む。したがって、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、または活性化された抗原提示細胞及びTh1がコミットされたＣＤ４^＋Ｔ−リンパ球（Th1 commited ＣＤ４^＋Ｔ−lymphocytes）に特有の他のサイトカインの１つ以上の分泌の検出は、共通の粘膜システムを活性化するために与えられた微生物の分離体の能力の評価において有用である。好ましくは、ＩＬ−１２の分泌レベルは、評価される微生物の分離体による抗原提示細胞の活性化の度合いの徴候を提供するために測定される。同様に、ＩＦＮ−γ分泌のレベルは、概して、微生物の分離体により活性化されたＴリンパ球の活性化レベルの徴候を提供するために測定される。

特に好ましい実施態様において、活性化データは、ＩＬ−１２と比較してＩＬ−１０の発現を示している比率を含む。ＩＬ−１０は、マクロファージによってＩＬ−１２などのサイトカインの放出を阻害し、Ｔｈ１細胞の活性化を阻害する。したがって、比率は、微生物の分離体によって誘発されるＴｈ１リンパ球の反応レベルを表す。このように、抗原反応性細胞を活性化するために選択された分離体は、望ましくは、ＩＦＮ−γの高い発現ではなく、低いＩＬ−１０：ＩＬ−１２の比率によって特徴とされるサイトカイン反応を誘発する。好ましくは、比率は３０未満であり、より好ましくは、２０、１５、１０、５未満であり、さらに４未満である。

ワクチンは、概して、ワクチン組成の約５％乃至約８０％ｗ／ｗの量の選択された細菌の分離体を含む。認識されるように、ワクチンの各々の分離体の数は、有効用量がワクチンの送達および性質の提案された方法を考慮して、一般の粘膜システムの活性化のために哺乳類に送達されるようなものである（例えば、粉末、液体、エアゾール送達など）。投与される細菌の分離体又は各投与される細菌の分離体の用量は、概して、それぞれ、約１０^９乃至約１０^１２、より好ましくは、約１０^１０乃至約１０^１１ｃｆｕの範囲である。選択された細菌の分離体の最適用量は、その後各々のグループの動物を対応する生菌の病原体に感染させる前に、試験哺乳類の異なるグループに対して、分離体の異なる用量を投与し、熟練した対象者に十分理解されるような病原体の満足なクリアランスを達成するために必要とされる用量レベルを決定することによって決定できる。

ワクチン自体は、フリーズドライにされることができるか、または生理的に受け入れられるバッファー若しくは流体を利用して後の還元のために凍結乾燥されることができる。また、ワクチンは、１つ以上の反固まっている剤、等張性剤、チメロサールのような防腐剤、アミノ酸および砂糖部位のような安定剤、蔗糖、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料、水酸化ナトリウム、塩酸、一ナトリウム・リン酸塩および／またはリン酸ナトリウムのｐＨ調整剤、生理食塩水、適切なバッファー、溶媒、分散媒体及び等張性剤のような薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。薬学的に活性な物質及びワクチンのためのそのような成分及び媒体の使用は、公知技術である。任意の従来の媒体または薬剤が細菌の分離体と適合しないこと以外は、本発明のワクチンにおけるそれらの使用は、特異的に含まれる。また、望ましくは、免疫反応（特に、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−βのようなTh1反応に特有のサイトカイン）を促進するための一つ以上のサイトカインのような補助的な活性剤は、ワクチンに取り入れられることができる。

加えて、本発明により具体化されたワクチンは、また、一つ以上のアジュバントを含むことができる。本発明のワクチン組成で有用な適切なアジュバント、薬学的に許容可能なキャリア及び成分の組み合わせは、例えば、「Remington: The Science and Practice of pharmacy (Mack Publishing Co., 1995)」（この内容は、その全体がここで参照として組み込まれている）などの熟練した対象者にとって知られているハンドブック及びテキストで見ることができる。

経口死菌ワクチンは、乾燥粉末又は液状で投与されてよい。例えば、投与は、投薬液体としてエアゾール吸入によって、またはスプレーとして滴下によって、達成されることができる。経口ワクチンの送達を容易にするための装置が当該技術分野で知られており、メータード ドース インハラー（metered dose inhalers）（ＭＤＩｓ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩｓ）及び超音波エネルギー、または圧縮空気、または原子化を達成する他の推進体を使用するものを含むネブライザー（nebulisers）を含む。ＭＤＩｓにおいて用いられることができる推進体は、例えば、クロロフルオロカーボン類（ＣＦＣｓ）（例えばトリクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ−１１）およびジクロロジフルオロカーボン（ＣＦＣ−１２）およびハイドロ・フルオロ・アルカンを含む。

本発明の性質がより明らかに理解されるために、それの好ましい形態は、下記の制限されない実施例を参照して記載される。

実施例１：不活化されたPs.エルギノーサの経口ワクチンでの経口免疫後のＴリンパ球の活性化の変化
研究は、死菌の選択されない分離体を認識し、反応するレシピエントＴ細胞の能力の変わりやすさを実証するために実行された。気管支拡張症を訴える９人のヒトの被験者の一団は、２コースの不活化されたPs. エルギノーサ（Ｐｓ．ａ）経口ワクチンを与えられた。３日間において、各コースは、1日につき２錠の投与（各錠剤は、１０^１１の死菌を含んだ）からなり、第二のコースは２８日に開始する。使用したPs.エルギノーサの分離体は、動物モデルでの一般の粘膜システムを活性化できることを示す以外は選択されなかった。

末梢血単核細胞は、抗原がプライムされたＴ細胞（antigen-primed T cell）の源として使用され、フィコール／パキュー・デンシティ・グラディエント（Ficoll/Paque density gradient）において、ヘパリンで凝血防止された血液から分離された。遠心分離（２００ｇ、４℃で２０分間）の後、細胞はプラズマ：フィコールの界面から収集されて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で二回洗浄されて、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２−メルカプトエタノール（５ｘ１０^−５Ｍ）を含有するＡＩＭ−Ｖ媒体（２ｘ２０^６細胞数／ｍＬ）で再懸濁された。細胞は、総量２００μＬのＡＩＭ−Ｖ媒体でＰｓ抗原（１μｇ／ｍＬ）若しくはＰＨＡ−Ｐ（２μｇ／ｍＬ）の有無において、９６穴のフラットボトムのマイクロタイタープレートのウェルで培養された。ＣＯ２インキュベーターで３７℃、４日間のインキュベーションの後、培養組織は、セルハーベスターを用いてガラスファイバーフィルター上でハーベストする前の最後の８時間において、H^３-チミジンの０．５μＣｉでウェルごとにパルスされた。乾燥後、フィルターは、シンチレーションカウンターでカウントされた。結果は、平均ｃｐｍ±ＳＥとして表された。表１は、経口免疫後の平均カウント（H^３-チミジンの取り込みが、抗原が誘発した増殖を表す）および平均（個々の反応の変化を表す）からの標準誤差（ＳＥ）を示す

表１：ヒトにおけるＴ細胞Ｐｓ．ａ抗原誘発型増殖

結果は、一貫して小さい標準エラーによって、一貫した平均の刺激が、古典的に非特異的なＴ細胞マイトジェンＰＨＡによって研究の全体にわたって誘発されて、比較的類似した増殖的な反応を反映したことを示す。経口免疫前のＰｓ．ａ抗原の刺激で、標準誤差（ＳＥ）はそれがＰＨＡで見られる場合と同じオーダーである。しかしながら、経口免疫後の２８日および５６日で、反応における著しい変化が強調された（６４および４２のＳＥ）。これらの結果は、ほとんどのレシピエントのＴ細胞レセプターを嵌入する分離体が選択できなかったことを反映するin vivoでのＴ細胞反応における相当な変化を示す。

コントロールとして、ＤＡラット（１グループにつき４）が、Ｐｓ．ａの同じ分離体を用いて経口的に免疫された。簡単に言えば、二週間にわたって、一週間につき５日間において、ラットは、５ｘ１０^８のパラホルムアルデヒドで不活化されたシュードモナス エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（ＰＢＳ中）が毎日与えられた。末梢血が抽出されて、H^３-チミジンの取り込みが上記の記載のように評価された。結果は表２に示される。

表２：先天的なラットにおけるＴ細胞Ｐｓ．ａ抗原誘発型増殖

１３の低いＳＥは、先天的なＤＡラットで見られた（つまり、低い遺伝子の変動性を反映する）。ヒトの反応における大きいＳＥ（つまり、個々の変化の程度を反映する）は、主に、選択されないワクチンの候補による、抗原提示細胞Ｔリンパ球ユニットの嵌入機序（engagement）での変化によるものとして結論される。この変化は、３１日で決定される、細菌のコロニー形成（痰の細菌数で測定される）および痰化膿（白血球細胞の総数として測定される）での減少に高レベルの変化によって反映される、ヒトの研究の個人間で観察される保護レベルの相当な差異と相関する。特に、細菌のカウント数は３人の被験者で減少（１、３．０、１．０ log）し、５人の被験者では変化がなく、一人の被験者で増加した（２ logs）。痰白血球細胞数は、50%のSEで40%減少の平均によって減少した。したがって、Ｔ細胞（それは、次の細菌クリアランスで気管支ルーメンへの白血球補充の原因となる。例えば、Dunkley et al (1994) A role for CD4+ T cells from orally immunized rats in enhanced clearance of Ps. aeruginosa from the lung. Immunol 83, 362-369を参照）の活性化も変動であり、活用された死菌の分離体が、一般的なヒトの集団において経口死菌ワクチンとしての利用における最適な分離体でないことを示している。

実施例２：サイトカインの放出を誘発するための最適な分離体の選択
通常のヒトの被験者から得られたＳ．アウレウスおよび無莢膜型Ｈ．インフルエンザ分離体は、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で溶解した２％パラホルムアルデヒドで処理することによって不活化された。室温１時間のインキュベーション後、処理された細菌はＰＢＳで徹底的に洗浄され、次いで、マンニット食塩寒天培地または馬血液寒天培地プレート上で培養することによって生存度を試験された。不活化された細菌は、吸光度対ＣＦＵ（absorbance versus CFU）の標準回帰曲線（standard regression curve）からインターポレーション（interpolation）によって２ｘ１０^９ｃｆｕ／ｍＬに調整された。培養刺激での利用のために、各分離体からの細菌は、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ、５ｘ１０^−５Ｍ）を含有する無血清のＡＩＭ−Ｖ媒体で終濃度２ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍＬに調整された。

Ｓ．アウレウスの分離体において、オスのＢＡＬＢ／ｃマウスのグループは、生菌のＳ．アウレウスで鼻腔内に投与される前に、２週間にわたって週につき２日ごと５ｘ１０^９の不活化全菌体を鼻腔内に投与された。用量は、可変的な経口的な投薬を試験する同様の研究に基づいて決定された。コントロールマウス（ｎ＝５）は、ＰＢＳのみを与えられた。鼻におけるコロニー形成の減少が、投与後２４−４８時間で決定された。ＮＴＨｉ分離体において、オスのＢＡＬＢ／ｃマウスのグループは、生菌のＮＴＨｉでの鼻腔内投与を伴い、２週間にわたって週につき２日ごと５ｘ１０^９の不活化全菌体を胃内に投与された。コントロールマウスは、再度ＰＢＳのみを与えられた。ＮＴＨｉコロニー形成の減少が、生菌投与後４時間で、気管支肺胞の洗浄（bronchoalveolar washings）（ＢＡＬ）および肺ホモジネート（lung homogenates）で決定された。

ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）は、フィコール／パキュー・デンシティ・グラディエント（Ficoll/Paque density gradient）において、遠心分離によってヘパリンで凝血防止された血液から分離された。遠心分離による洗浄後、ＰＢＭＮＣは、９６穴のフラットボトム（flat-bottomed）のマイクロタイタープレートのウェルに、総量３００μＬの２ｘ１０^６／ｍＬまたは２ｘ１０^８／ｍＬ ＣＦＵの死菌で、ウェルごと２ｘ１０^５細胞数でＡＩＭ−Ｖ媒体において培養された。３７℃で空気中５％ＣＯ_２の条件で３日間のインキュベーション後、培養上清は回収されて、ＥＬＩＳＡによるサイトカインアッセイまで−２０℃で保存された。

サイトカインの生成を刺激する個々のＳ．アウレウスおよびＨＴＨｉ分離体の性能は、抗原提示細胞−Ｔ細胞培養組織系を用いて試験された。要するに、ＡＰＣおよびＴ細胞を含有するＰＢＭＮＣ（２ｘ１０^６／ｍＬ）は、ＣＯ２インキュベーターで３７℃において３日間にわたり９６穴プレートのフラットボトムのウェル内で、死菌の段階的な用量で刺激された。培養上清は回収されて、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２およびＩＦＮ−γがアッセイされた。

表３は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成を刺激する、Ｓ．アウレウス分離体（Ａ２、Ａ３、Ａ８、Ａ１５、Ａ２８、Ａ１９、Ａ２０）の能力を試験した結果を示す。結果は、標準化された中央値であり、コントロールのパーセンテージとして表される。ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの可変的な刺激が観察された。分離体Ａ２、Ａ８、Ａ２８およびＡ１９は、分離体Ａ１５、Ａ２０およびＡ３よりもＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成のより大きなスティミュレーター（stimulator）であった。他の分離体と比較して、分離体Ａ２８での刺激は、４−１０倍のＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γの生成をもたらした。

表３：細胞全体を不活化したＳ．ａｕｒｅｕｓ分離体の異なる用量で刺激した末梢血単核細胞の培養組織におけるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成

分離体Ａ２、Ａ８およびＡ２８が５人の健常な被験者からのＰＢＭＮＣを用いて培養組織で試験される場合、すべての被験者において、分離体Ａ２およびＡ２８だけがＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの相当量を刺激することが可能であった（表４および表５）。それらの結果は、分離体Ａ２およびＡ２８が免疫調節性サイトカインの強力なスティミュレーターであり、したがって、候補の免疫スティミュレーター（ほとんどのレシピエントの防御的に粘膜免疫を仲介するような）として適切であることを示す。

表４：細胞全体を不活化したＳ．アウレウス分離体で刺激した健常な被験者からのヒト末梢血単核細胞の培養組織におけるＩＬ−１２の生成

表５：健常な被験者からのヒト末梢血単核細胞の培養組織において細胞全体を不活化したＳ．アウレウス分離体で刺激したＩＦＮ−γの生成

試験したすべてのＮＴＨｉ分離体（Ｂ３、Ｂ４、Ｂ６、Ｂ１０およびＢ１４）は、培養組織の刺激で用いた細菌の可変量の用量にかかわりなく、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成の刺激が可能であることが分かった（表６）。分離体Ｂ３およびＢ６は、他のＮＴＨｉ分離体に比べて、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの多量の発生を刺激した。結果は、中央値であり、コントロールのパーセンテージとして表される。

表６：細胞全体を不活化した無莢膜型Ｈ．インフルエンザ分離体で刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）の培養組織におけるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成

実施例３：粘膜コロニー形成を減ずる免疫スティミュレーターとしての細菌の最適な分離体の選択
２匹のマウスの粘膜コロニー形成のモデルは、鼻腔でのＳ．アウレウスのコロニー形成の減少と、生菌で投与した後の肺における無莢膜型Ｈ．インフルエンザのコロニー形成の減少を決定するために用いられた。

モデル１において、８週齢のオスのＳＰＦ ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）は、２週間にわたって週につき２日ごと３００μｌのＰＢＳに溶解された、不活化されたＳ．アウレウスの全菌体（５ｘ１０^９／マウス）を胃内に投与された。コントロールマウスは、ＰＢＳのみを受けた。分離体Ａ２、Ａ２８、Ａ３、Ａ１５、Ａ１９およびＡ２０からのパラホルムアルデヒドで不活化された細菌は、参照としてのＡＴＣＣ株（ＡＴＣＣ４９２４７）を含んで、それぞれ試験された。最終的に服用した１日後、マウスは、各鼻孔に生のＳ．アウレウス（５ｘ１０^９細菌数／ｍｌ）１０μｌを投与された。投与後２４−４８時間において、マウスは犠牲にされて、鼻組織を削除した。組織はＰＢＳで均質にされてホモジネートが回収され、次いで、マンニット食塩寒天培地プレート上でホモジネートを１０倍で連続して希釈を培養することによって細菌濃度をアッセイした。３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＣＦＵ数が決定された。

図１は、コントロールと比較して、分離体Ａ１９、Ａ２０、Ａ２８、Ａ２、Ａ３、Ａ８およびＡ１５から調製された死菌を受けたマウスのコロニー形成の減少を示す。生成レベルは選択された分離体に依存し、効果はＡ２８＞Ａ２＞Ａ８＞Ａ３＞Ａ１５＞Ａ２０＞Ａ１９であった。さらに、高レベルの防御は、ヒトＰＢＭＮＣの培養組織で高レベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを刺激する分離体Ａ２８、Ａ２およびＡ８の能力と相関して達成される（表２および３参照）。

モデル２において、マウス（ｎ＝５）は、ＰＢＳに溶解した生菌（５ｘ１０^９／ｍｌ）１０μｌで鼻腔内に投与される前に、２週間にわたって週につき２日ごと３００μｌのＰＢＳに溶解された、ＮＴＨｉの不活化全菌体（５ｘ１０^９／マウス）を胃内に投与された。分離体Ｂ３、Ｂ１４、Ｂ１６およびＢ１０から調製されたパラホルムアルデヒドで不活化された細菌は、それぞれ試験された。生菌投与の４時間後、細菌のクリアランスに関するコロニー形成の減少は、処理されたマウスおよびコントロールマウスからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および肺のホモジネートで決定された。図２に示されるように、試験された分離体において、参照とするＡＴＣＣ株および分離体１４と比較して、Ｂ３、Ｂ１６およびＢ１０が最良のクリアランス率となった。ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ生成のin vitro刺激において比較する場合、Ｂ３およびＢ６分離体はコロニー形成の減少に最良な相関関係を与えた（表４参照）。

実施例４：in vitroの最適なサイトカイン反応およびin vivo防御に基づくワクチン候補としての細菌の最適な分離体の選択
末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）は、フィコール／パキュー・デンシティ・グラディエント（Ficoll/Paque density gradient）溶液において、遠心分離によって健常な被験者のヘパリンで凝血防止された血液から分離された。細胞はプラズマ：フィコールの界面から収集されて、１５分間・４℃の遠心分離（２００ｇ）によってＰＢＳで三回洗浄された。培養前に、細胞は、無血清のＡＩＭ−Ｖ媒体（２ｘ２０^６細胞数／ｍＬ）で再懸濁されて、生存度は、トリパンブルー除外試験（trypan-blue exclusion test）によって決定された。細胞懸濁の１００マイクロリットルのアリコートが、二重で等量の死菌の段階的な濃度を含有するか、またはフラットボトムの９６穴マイクロタイタープレートのウェルに培地だけを含有するＡＩＭ−Ｖ媒体に添加された。培養組織は、５％ＣＯ２の空気のインキュベーターにおいて、３７℃・３日間インキュベーションされた。インキュベーション後、上澄みが回収されてプールされ、アッセイまで−２０℃で保存された。

培養組織の上澄みのＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γは、基準として組換えタンパク質を有するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡによって測定された。要約すると、フラットボトムのマイクロタイタープレートのウェルは、キャプチャー抗体で４℃・オーバーナイトにわたってコーティングされた。洗浄後、細胞は、ＰＢＳに溶解した２％ＢＳＡ溶液で室温（ＲＴ）・６０分間にわたってブロックされ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎでの洗浄を伴う。１００マイクロリットルの上澄みは、各ウェルに添加された。室温で９０分間のインキュベーションに続き、ウェルは洗浄され、次いで、１００μｌのビオチン化検出抗体が添加された。９０分間のインキュベーション後、ＨＲＰが接合したストレプトアビジン溶液が３０分間にわたって添加された。次いで、ウェルが洗浄され、ＴＭＢ基質溶液が２０分間添加された。カラー展開（colour development）の後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍにおいて読み込む前に、反応は硫黄溶液で停止された。培養組織の上澄みで分泌されたサイトカイン量は、標準曲線を用いてインターポレーションで計算され、結果はｐｇ／ｍＬとして表された。

表７は、マウスモデルのコロニー形成の高い防御レベルと相関する、Ｓ．アウレウス（分離体Ａ２８）およびＮＴＨｉ（分離体Ｂ６）で刺激した末梢血単核細胞によって生成された高レベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２を示す。対照的に、低レベルのサイトカインと高レベルの防御を刺激された分離体間（Ａ３とＢ１０）では相関性がない。逆に、高レベルのサイトカインと低レベルの防御を刺激された分離体間（Ａ１９とＢ１４）で相関性は観察されなかった。この結果は、最適なサイトカイン反応およびin vivo防御が、気道において、粘膜免疫を増大し、コロニー形成を減じるための経口ワクチンまたは免疫スティミュレーターの候補として、細菌の最適な分離体の選択におけるマーカーであることを実証する。

表７：in vivo細菌クリアランスとin vitroサイトカイン生成との相関性

実施例５：ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の異なる生成に基づく最適な分離体の選択、並びにＩＦＮ−γ生成およびin vivo防御を増強する能力
異なる分離体による培養組織のＰＢＭＮＣの刺激は、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の異なる量を生じて、その比率がＩＦＮ−γおよびin vivo防御のレベルと相関した。表８に示されるように、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の低比率のＮＴＨｉ分離体（Ｂ３、Ｂ６）は、コントロールと比較して、不活化ウイルスの分離体で経口免疫されたマウスの気道において、ＩＦＮ−γの最大の生成および細菌の減じられたコロニー形成によって特徴とされるＴｈ１反応の良好なスティミュレーターである。逆に、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の高比率の分離体（Ｂ４、Ｂ１０およびＢ１４）は、ＩＦＮ−γの低い生成および高レベルのコロニー形成と相関性がある。これはまた、高レベルのＩＦＮ−γが、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の低比率および低い率のコロニー形成と相関する際のＳ．アウレウス分離体においても言える（表９）。共に、結果は、細菌の最適な分離体が、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の低比率、高いＩＦＮ−γ、およびin vivo増強した防御に基づいて候補ワクチンとして選択できることを示す。このように、これらの結果に基づき、最適な分離体は、試験された全ての健常な被験者（最低でも３人の被験者）における１５未満のＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率およびＩＦＮ−γの高い生成（ＮＴＨｉでは７８６ｐｇ／ｍｌ、Ｓ．アウレウスでは５００ｐｇ／ｍｌより高いレベル）の区分値と関係している。

表８：ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率、ＩＦＮ−γの生成およびin vivo防御に基づいた無莢膜型Ｈ．インフルエンザ分離体の選択

＊不活化全菌体の分離体で経口免疫されたマウス（ｎ＝１０）またはＰＢＳのみが与えられたマウス（コントロール）の気道におけるコロニー形成

表９：ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率、ＩＦＮ−γの生成およびin vivo防御に基づいたＳ．アウレウス分離体の選択

＊不活化全菌体の分離体で経口免疫されたマウス（ｎ＝１０）またはＰＢＳのみが与えられたマウス（コントロール）の鼻におけるコロニー形成

実施例６：無莢膜型Ｈ．インフルエンザ分離体ＮＴＨｉ１６４による末梢血単核細胞の刺激
不活化全菌体ＮＴＨｉ１６４は、通常に健常なコントロールからのＰＢＭＮＣで培養されて、ＩＦＮ−γが評価された。その結果は表１０に示される。

表１０：不活化全菌体ＮＴＨｉ１６４で刺激されたＰＢＭＮＣでのＩＦＮ−γの刺激

実施例２の表６と比較して、ＮＴＨｉ１６４は、ＲＣにおいてＩＦＮγの相当レベルを表し、ＰＣにおいてＮＴＨｉ分離体Ｂ３またはＢ６によって誘発されるよりも、高いレベルのＩＦＮγを表した。また、ＮＴＨｉ分離体の粒子分画が調製され、ＩＦＮ−γ生成を刺激する分画の能力が評価された。その結果を表１１に示す。要約すると、ＮＴＨｉ１６４は、−８０℃の保存からチョコレート寒天プレート上へ回復され、次いで、チョコレート寒天に二次培養された。細菌は収穫され、ペレットにされて、ＰＢＳで１０１０／ｍｌに再懸濁された。懸濁液は、３０秒のオン（on）および６０秒のオフ（off）の１０サイクルを使用して、６μの振幅において超音波で破壊された。この懸濁は７０００ｇで遠心分離され、上澄みが回収され、無菌濾過されて、タンパク質の含有量がＰｉｅｒｃｅＢＣＡプロテインアッセイによって決定された。アリコートは、使用するまで−２０℃で凍結保存された。

表１１：不活化全菌体ＮＴＨｉ１６４分離体のＰＢＭＮＣ粒子抗原でのＩＦＮ−γ生成の刺激

表１０および１１は、不活化全菌体ＮＴＨｉ１６４およびその分離体の粒子抗原の抽出物が、ＩＦＮ−γを生成するために末梢血単核細胞を刺激することを示す。ＩＦＮ−γの生成は、ＩＬ−１２に依存する。

以上、本発明の好ましい実施例について詳述したが、本発明はかかる特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。

Claims (19)

1. 粘膜表層の微生物コロニー形成に対する経口不活化ワクチンの製造に使用される少なくとも一つの単細胞微生物の分離体を選択するための方法であって、
   前記少なくとも一つの分離体は第１の分離体であり、前記第１の分離体は、前記第１の分離体の第１の能力に基づいて前記微生物の分離体の群から選択され、前記第１の能力は、前記群のそれぞれ他の分離体と比較して、抗原反応性細胞を最適に活性化し、前記微生物による粘膜表層の感染を取り除く能力であり、前記第１の能力は、ＩＬ−１０：ＩＬ−１２の比率によって特徴づけられるサイトカイン生産を評価することによって、及び、前記第１の分離体によって達成されるｉｎ ｖｉｖｏでの前記粘膜表層の感染の減少のレベルを評価することによって決定されるか、又は、
   前記少なくとも一つの分離体は第２の分離体及び第３の分離体であり、前記第２の分離体は、前記第２の分離体の第２の能力に基づいて分離体の群から選択され、前記第２の能力は、前記群のそれぞれ他の分離体と比較して、前記抗原反応性細胞を最適に活性化する能力であり、前記第２の能力は、ＩＬ−１０：ＩＬ−１２の比率によって特徴づけられるサイトカイン生産を評価することによって決定され、さらに、前記第３の分離体は、前記第３の分離体の第３の能力に基づいて前記群から選択され、前記第３の能力は、前記群のそれぞれ他の分離体と比較して、前記微生物による前記粘膜表層の感染を最適に取り除く能力であり、前記第３の能力は、前記第３の分離体によって達成されるｉｎ ｖｉｖｏでの前記粘膜表層の感染の減少のレベルを評価することによって決定される、方法。
2. 前記微生物の分離体が、死菌の分離体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記群のそれぞれ他の分離体と比較して、前記活性化も前記取り除きも最良である第１の分離体が選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記群のそれぞれ他の分離体と比較して、前記活性化が最良である第２の分離体、さらに、前記取り除きが最良である第３の分離体が選択される、請求項１に記載の方法。
5. 粘膜免疫が、主に細胞性免疫反応を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記抗原反応性細胞が、抗原提示細胞とＴリンパ球とを含む群から選択される１又は複数の細胞タイプを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記抗原反応性細胞が、抗原提示細胞もＴリンパ球も含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記抗原提示細胞がマクロファージを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記抗原反応性細胞が末梢血単核細胞を含む、請求項７に記載の方法。
10. 前記Ｔリンパ球が、Ｔｈ１リンパ球又はＴｈ１がコミットされたＴリンパ球である、請求項７に記載の方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、前記第１又は第２の分離体が、前記分離体の能力に基づいて前記微生物の分離体の群から選択され、前記分離体の能力は、前記群の他の分離体と比較して、ＩＬ−１２に対するＩＬ−１０のより低い比率にてＩＬ−１２及びＩＬ−１０の発現を前記抗原反応性細胞において誘発する能力である、方法。
12. 前記ＩＬ−１０：ＩＬ−１２の比率が、３０以下である、請求項１に記載の方法。
13. 前記比率が１５以下である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記活性化が、抗原提示細胞を活性化する能力、及び、Ｔリンパ球を活性化するさらなる能力を含み、さらに、前記抗原提示細胞を活性化する能力と前記Ｔリンパ球を活性化するさらなる能力が相関する、請求項１に記載の方法。
15. 前記Ｔリンパ球を活性化するさらなる能力が、前記抗原反応性細胞によるＩＦＮ−γの発現を誘発する能力を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記分離体によって誘発されるγ−ＩＦＮの発現が、前記群のそれぞれ他の分離体と比較して最良である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記微生物が、細菌を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
18. 前記微生物が、クラミジア属種、ヘモフィルス属種、無莢膜型ヘモフィルス属種、シュードモナス属種、ストレプトコッカス属種、スタフィロコッカス属種、エシェリヒア コリ、マイコプラズマ属種及びヘリコバクター属種を含む群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記微生物が、無莢膜型Ｈ．インフルエンザ、Ｓ．アウレウス、Ｐs．エルギノーサ、及びＳ．ニューモニエから選択される、請求項１８に記載の方法。

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