JP2016032435A - バクテリオファージ、カンキツかいよう病菌の検出剤、カンキツかいよう病菌の検出方法、カンキツかいよう病の防除剤およびカンキツかいよう病の防除方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】幅広いカンキツかいよう病菌に有効に使用できるバクテリオファージ、カンキツかいよう病菌の検出剤、カンキツかいよう病菌の検出方法、カンキツかいよう病の防除剤およびカンキツかいよう病の防除方法を提供する。【解決手段】バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含む。当該バクテリオファージのファージ粒子の頭部の直径は、７０〜９０ｎｍである。当該バクテリオファージは、カンキツかいよう病菌に感染する。【選択図】図１
Description
本発明は、バクテリオファージ、カンキツかいよう病菌の検出剤、カンキツかいよう病菌の検出方法、カンキツかいよう病の防除剤およびカンキツかいよう病の防除方法に関する。
米国への温州みかんの輸出では、バクテリオファージテストによるカンキツかいよう病菌の検疫が義務付けられている（４３農政Ｂ第３４５号、４３農政Ｂ第１９０１号）。バクテリオファージテストの結果判定で、検定果実にカンキツかいよう病菌があったものと判定されないことが、温州みかんの生鮮果実を米国に輸出するための条件の１つになっている。
バクテリオファージテストは、カンキツかいよう病菌に特異的なバクテリオファージＣｐ１およびＣｐ２それぞれを、検定液に添加、培養後、溶菌斑（プラーク）を計数し、対照と比較することで行われる。カンキツかいよう病菌がＣｐ１またはＣｐ２に感受性がある、すなわちＣｐ１またはＣｐ２に感染した場合、カンキツかいよう病菌は溶菌するため、プラークを計数することで、検定果実におけるカンキツかいよう病菌の有無を判定できる。
カンキツかいよう病菌のＣｐ１およびＣｐ２に対する感受性は、菌株によって異なるものの（非特許文献１参照）、カンキツかいよう病菌株の９７％以上は、Ｃｐ１およびＣｐ２の少なくとも一方に感受性を示す。
塩谷 浩、「カンキツかいよう病菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｉ」、微生物遺伝資源利用マニュアル、独立行政法人農業生物資源研究所、２０１０年１２月２５日、第２９巻、ｐ．１−１１
しかし、国内において病害を引き起こすカンキツかいよう病菌株の約３％は、Ｃｐ１およびＣｐ２に感受性を示さない。このため、検定果実にカンキツかいよう病菌があっても判定を誤るおそれがある。したがって、幅広いカンキツかいよう病菌が感受性を示すバクテリオファージが求められている。
また、バクテリオファージは、上記のようにカンキツかいよう病菌に感染することでカンキツかいよう病菌を溶菌させるので、カンキツかいよう病に従来使用されている銅剤に代替する安全な防除技術への応用が期待されている。バクテリオファージに感受性を示さないカンキツかいよう病菌があると、当該バクテリオファージを用いた防除技術の適用範囲が限定されてしまう。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、幅広いカンキツかいよう病菌に有効に使用できるバクテリオファージ、カンキツかいよう病菌の検出剤、カンキツかいよう病菌の検出方法、カンキツかいよう病の防除剤およびカンキツかいよう病の防除方法を提供することを目的とする。
本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含み、
前記頭部の直径が７０〜９０ｎｍであって、
カンキツかいよう病菌に感染する。
ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含み、
前記頭部の直径が７０〜９０ｎｍであって、
カンキツかいよう病菌に感染する。
この場合、前記尾部の長さが、
１８０〜２２０ｎｍであってもよい。
１８０〜２２０ｎｍであってもよい。
また、上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
カンキツかいよう病菌株ＭＡＦＦ３１１１３０に感染する、
こととしてもよい。
カンキツかいよう病菌株ＭＡＦＦ３１１１３０に感染する、
こととしてもよい。
また、上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１４年６月１８日に受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８７７で受領されたＣｐＸである、
こととしてもよい。
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１４年６月１８日に受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８７７で受領されたＣｐＸである、
こととしてもよい。
また、上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
ゲノムＤＮＡが標識されている、
こととしてもよい。
ゲノムＤＮＡが標識されている、
こととしてもよい。
本発明の第２の観点に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。
本発明の第３の観点に係るカンキツかいよう病菌の検出方法は、
上記本発明の第２の観点に係るカンキツかいよう病菌の検出剤を使用する。
上記本発明の第２の観点に係るカンキツかいよう病菌の検出剤を使用する。
この場合、上記本発明の第３の観点に係るカンキツかいよう病菌の検出方法は、
前記カンキツかいよう病菌の検出剤と検体由来の試料とを混合する混合ステップと、
前記混合ステップで得られた混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する検出ステップと、
を含むこととしてもよい。
前記カンキツかいよう病菌の検出剤と検体由来の試料とを混合する混合ステップと、
前記混合ステップで得られた混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する検出ステップと、
を含むこととしてもよい。
また、前記検出ステップでは、
前記混合物を培養し、形成されるプラークに基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
こととしてもよい。
前記混合物を培養し、形成されるプラークに基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
こととしてもよい。
また、前記検出ステップでは、
前記混合物を培養し、菌体の増殖量に基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
こととしてもよい。
前記混合物を培養し、菌体の増殖量に基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
こととしてもよい。
また、前記カンキツかいよう病菌の検出剤は、
ゲノムＤＮＡが標識されている上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含み、
前記検出ステップでは、
前記バクテリオファージの標識されたゲノムＤＮＡを定量する、
こととしてもよい。
ゲノムＤＮＡが標識されている上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含み、
前記検出ステップでは、
前記バクテリオファージの標識されたゲノムＤＮＡを定量する、
こととしてもよい。
また、前記検出ステップでは、
前記混合物におけるカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量する、
こととしてもよい。
前記混合物におけるカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量する、
こととしてもよい。
本発明の第４の観点に係るカンキツかいよう病の防除剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。
本発明の第５の観点に係るカンキツかいよう病の防除方法は、
上記本発明の第４の観点に係るカンキツかいよう病の防除剤を、植物または植物成長媒体に投与する投与ステップ、を含む。
上記本発明の第４の観点に係るカンキツかいよう病の防除剤を、植物または植物成長媒体に投与する投与ステップ、を含む。
この場合、前記植物は、カンキツ類である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
本発明によれば、バクテリオファージの宿主域が広いため、幅広いカンキツかいよう病菌に有効に使用できる。
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
（実施の形態１）
本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、カンキツかいよう病菌に感染するバクテリオファージを含む。当該バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含む。このようなファージ粒子の構造は、ヘッド−テイル構造、サイフォウィルス（ｓｉｐｈｏｖｉｒｕｓ）様の構造、あるいはｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ型ともいう。尾部にはテイルファイバー（尾繊維）が見られる。なお、ファージ粒子の構造は、ファージ粒子をリンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色し、電子顕微鏡で観察することができる。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、カンキツかいよう病菌に感染するバクテリオファージを含む。当該バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含む。このようなファージ粒子の構造は、ヘッド−テイル構造、サイフォウィルス（ｓｉｐｈｏｖｉｒｕｓ）様の構造、あるいはｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ型ともいう。尾部にはテイルファイバー（尾繊維）が見られる。なお、ファージ粒子の構造は、ファージ粒子をリンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色し、電子顕微鏡で観察することができる。
上記バクテリオファージのファージ粒子の特徴として、頭部の直径が７０〜９０ｎｍであることが挙げられる。頭部の直径は、バクテリオファージのゲノムサイズにもよるが、７５〜８５ｎｍまたは７８〜８２ｎｍであってもよい。下記実施例で示すバクテリオファージＣｐＸは、頭部の直径が８０ｎｍである。ＣｐＸの頭部の形状は、ほぼ正二十面体である。
上記バクテリオファージのファージ粒子の他の特徴としては、尾部の長さが、１８０〜２２０ｎｍであることが挙げられる。尾部の長さは、１９０〜２１０ｎｍまたは１９５〜２０５ｎｍであってもよい。ＣｐＸは、尾部の長さが２００ｎｍほどである。
上記ファージ粒子の頭部の直径および尾部の長さは、カンキツかいよう病菌に感染するバクテリオファージの中でも特異的である。例えば、Ｃｐ１は、そのファージ粒子の構造は、ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ型であるが、その頭部の直径は６０±５ｎｍほどである。Ｃｐ１のファージ粒子の尾部は非収縮性であって、その尾部の長さは、１３５±１０ｎｍほどである。Ｃｐ２の場合、ファージ粒子の構造はｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ型であって、上記バクテリオファージのファージ粒子の構造と異なる。Ｃｐ２のファージ粒子の頭部の直径は、６０±５ｎｍほどである。また、Ｃｐ２のファージ粒子の尾部は、１５±５ｎｍほどであって、本実施の形態に係るバクテリオファージよりもかなり短い。
本実施の形態に係るバクテリオファージが感染するカンキツかいよう病菌は、カンキツ類の果実、葉、枝などに病害を及ぼす病原菌である。カンキツかいよう病菌は、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉである。カンキツかいよう病菌は、例えば、独立行政法人農業生物資源研究所から入手可能なＭＡＦＦ株である。
本実施の形態に係るバクテリオファージの宿主域は、Ｃｐ１およびＣｐ２よりも広い。つまり、当該バクテリオファージは、Ｃｐ１およびＣｐ２が感染できないカンキツかいよう病菌にも感染することができる。当該バクテリオファージが感染するカンキツかいよう病菌株としては、例えば、Ｃｐ１が感染できるＭＡＦＦ３０１０７７、ＭＡＦＦ３０１０８０、ＭＡＦＦ６７３０１１およびＭＡＦＦ６７３０１３など、Ｃｐ２が感染できるＭＡＦＦ３０２１０２、ＭＡＦＦ６７３００１、ＭＡＦＦ６７３０１０、ＭＡＦＦ６７３０１８およびＭＡＦＦ６７３０２１など、さらには、Ｃｐ１およびＣｐ２のいずれも感染しないＭＡＦＦ３１１１３０などが挙げられる。なお、ここに挙げたのは、例示のためであって、本実施の形態に係るバクテリオファージの宿主域は、さらに広いと考えられる。
より具体的には、本実施の形態に係るバクテリオファージは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１４年６月１８日に受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８７７で受領されたＣｐＸである。
上記バクテリオファージは、土壌などを含む試料を、洗浄して遠心分離し、膜フィルターで上清を濾過することで得られる。さらに、宿主として適切な上記カンキツかいよう病菌を用いることで、目的とするバクテリオファージを単離することができる。バクテリオファージの単離および力価の測定には、寒天培地に検定菌とバクテリオファージ試料との混合液を加えた軟寒天培地（０．７５％寒天）を重層してプラークを形成させるプラークアッセイが好適である。
バクテリオファージのカンキツかいよう病菌への感染方法は、当該技術分野で公知である任意の方法を用いることができる。一例としては、ＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地で培養したカンキツかいよう病菌を含む培養液にバクテリオファージを加え、培養することでバクテリオファージをカンキツかいよう病菌に感染させることができる。
本実施の形態に係る検出剤は、例えば、滅菌水、ＳＭバッファなどの溶媒に懸濁した状態で上記バクテリオファージを含む。当該検出剤は、例えば、上記バクテリオファージを、１０２〜１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、あるいは１０４〜１０８ｐｆｕ／ｍＬの濃度で含んでもよい。
当該検出剤は、カンキツかいよう病菌の検出方法での使用に好適である。当該検出剤を、例えばプラークアッセイに用いることで、幅広いカンキツかいよう病菌を検出することができる。当該検出剤を用いたカンキツかいよう病菌の検出方法について、以下例示する。
カンキツかいよう病菌の検出方法は、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤と検体由来の試料とを混合する混合ステップと、混合ステップで得られた混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する検出ステップと、を含む。検体由来の試料とは、例えば、果実などの検体を滅菌水の中で殺菌ガーゼを用いて洗浄し、洗浄後に残った水を採取した検定液などである。
混合ステップでは、検定液に検出剤を添加する。ここで、例えば、検定液中の細菌を濃縮するために、検定液を遠心分離してもよい。この場合、遠心分離によって得られた沈殿に、液体培地、例えばジャガイモ半合成液体培地（ＰＳ培地）またはＮＢ培地を加え懸濁する。得られた懸濁液に、本実施の形態に係る検出剤を適量加える。
本実施の形態に係る検出剤に含まれるバクテリオファージは、カンキツかいよう病菌に特異的に感染するので、検出ステップでは、混合ステップで得られた混合物に含まれる細菌にバクテリオファージが感染したことを検出すればよい。例えば、検出ステップでは、混合物を培養し、形成されるプラークに基づいて、混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する。より具体的には、上記のように沈殿が懸濁された液体培地に検出剤を加え混合後、直ちに遠心分離で回収した混合物の上清に含まれるバクテリオファージの数と、混合後６〜１２時間、２８℃で培養してから遠心分離で回収した混合物の上清に含まれるバクテリオファージの数とを比較することにより確認する。検体由来の混合液にバクテリオファージの宿主となるカンキツかいよう病菌が含まれる場合は、上記６〜１２時間の培養中にバクテリオファージが宿主に感染し増殖するので、直ちに遠心分離した場合よりもバクテリオファージの数は増える。この結果、検体におけるカンキツかいよう病菌を検出することができる。
なお、上記検出ステップでは、無病地区の検体から得られた対照を調製し、検定液のプラーク数が、対照のプラーク数よりも所定の割合以上、例えば２０％以上増加した場合に、検定対象の検体にカンキツかいよう病菌が検出されたものとしてもよい。
また、検出ステップでは、混合物を培養し、菌体の増殖量に基づいて、混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出するようにしてもよい。培養後の菌体の増殖量は、例えば、菌濃度の指標となる６００ｎｍの波長光の吸光度で測定することができる。本実施の形態に係る検出剤に含まれるバクテリオファージは、感染したカンキツかいよう病菌を溶菌するため、カンキツかいよう病菌の増殖量は、バクテリオファージによる溶菌で低下する。したがって、検出剤を加えて培養したときの最終菌体量が、検出剤を加えずに培養した場合と比較して少ない場合、検体にカンキツかいよう病菌が含まれているといえる。なお、カンキツかいよう病菌が存在しない試料およびカンキツかいよう病菌が存在する試料に関して、所定の培養条件における菌体量の基準値をそれぞれ求めておき、検体に係る培養後の菌体量を基準値と比較することでも検体におけるカンキツかいよう病菌を検出することができる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、宿主域が広いバクテリオファージを含むため、種々のカンキツかいよう病菌を正確に検出することができる。
また、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤に含まれるバクテリオファージは、現行のバクテリオファージテストで使用されているＣｐ１およびＣｐ２が感染するカンキツかいよう病菌に加え、Ｃｐ１およびＣｐ２が感染しないカンキツかいよう病菌株ＭＡＦＦ３１１１３０にも感染する。このため、バクテリオファージテストの精度を向上させることができる。また、当該バクテリオファージを使用すれば、バクテリオファージテストで使用するバクテリオファージをＣｐ１およびＣｐ２の２種類から１種類にすることもできるので、バクテリオファージテストを簡素化できる。この結果、２種類のバクテリオファージを用いることに起因する操作ミス、試料汚染等の危険性を極力抑えることができ、カンキツかいよう病菌を効率よく検出することができる。
もちろん、カンキツかいよう病菌の検出に際して、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤と、Ｃｐ１およびＣｐ２とを併用してもよい。Ｃｐ１およびＣｐ２は、感染するカンキツかいよう病菌の系統が異なるため、Ｃｐ１およびＣｐ２の感染の有無も確認することで、カンキツかいよう病菌を分類（タイピング）できる。
（実施の形態２）
本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、ゲノムＤＮＡが標識されている上記実施の形態１のバクテリオファージを含む。標識は、ゲノムＤＮＡを検出可能なものであれば任意のものでよいが、標識してもバクテリオファージの機能を損なわないものが好ましい。標識は、例えばＤＮＡの塩基に結合させた蛍光色素、ゲノムに組み入れた蛍光タンパク質をコードする遺伝子などである。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、ゲノムＤＮＡが標識されている上記実施の形態１のバクテリオファージを含む。標識は、ゲノムＤＮＡを検出可能なものであれば任意のものでよいが、標識してもバクテリオファージの機能を損なわないものが好ましい。標識は、例えばＤＮＡの塩基に結合させた蛍光色素、ゲノムに組み入れた蛍光タンパク質をコードする遺伝子などである。
蛍光色素としては、ＤＮＡに結合するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）またはＳＹＢＲ（商標） Ｇｏｌｄなどが挙げられる。ゲノムＤＮＡにＤＡＰＩまたはＳＹＢＲ（商標） Ｇｏｌｄなどの蛍光色素が結合した上記バクテリオファージがカンキツかいよう病菌に感染すると、蛍光色素で標識されたバクテリオファージのゲノムがカンキツかいよう病菌内に移行し、蛍光顕微鏡下で蛍光を指標に識別できる。ＤＡＰＩなどの蛍光色素は、公知の手法でゲノムＤＮＡに結合させることができる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、バクテリオファージの構造タンパク質をコードする遺伝子に連結することができる。こうすることで、蛍光タンパク質を発現したバクテリオファージを識別することができる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)をコードする遺伝子などが挙げられる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、標準の分子生物学的手法、遺伝子組み換え技術などでゲノムＤＮＡに組み入れることができる。
本実施の形態に係る検出剤を使用するカンキツかいよう病菌の検出方法を以下で説明する。当該検出方法では、上述の混合ステップの次に、検出ステップにおいて、バクテリオファージの標識されたゲノムＤＮＡを定量する。上記のように蛍光色素で標識した場合は、検出ステップにおいて、蛍光顕微鏡下で観察される蛍光を発するカンキツかいよう病菌を計数すればよい。また、蛍光測定装置を用いて、蛍光色素が発する蛍光の強度、スペクトル、偏光などを測定してもよい。蛍光タンパク質で標識した場合も同様に、蛍光顕微鏡下で観察される蛍光を発するカンキツかいよう病菌を計数するか、あるいは蛍光測定装置を用いて、蛍光タンパク質が発する蛍光の強度、スペクトル、偏光などを測定すればよい。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出剤は、ゲノムＤＮＡが標識されているため、幅広いカンキツかいよう病菌を、より迅速、簡便に検出することができる。
なお、本実施の形態におけるゲノムＤＮＡの標識には、蛍光色素、蛍光タンパク質に限らず、放射性物質を用いてもよい。
（実施の形態３）
上記実施の形態１または実施の形態２に係る検出剤に含まれるバクテリオファージは、下記実施例２に示すように、Ｃｐ１およびＣｐ２のいずれも感染しないＭＡＦＦ３１１１３０を含む幅広いカンキツかいよう病菌に効率よく吸着するという特性を備えている。そこで、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出方法は、バクテリオファージのカンキツかいよう病菌への吸着性を利用する。当該検出方法では、上述の混合ステップに続く検出ステップにおいて、混合物におけるカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量する。
上記実施の形態１または実施の形態２に係る検出剤に含まれるバクテリオファージは、下記実施例２に示すように、Ｃｐ１およびＣｐ２のいずれも感染しないＭＡＦＦ３１１１３０を含む幅広いカンキツかいよう病菌に効率よく吸着するという特性を備えている。そこで、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出方法は、バクテリオファージのカンキツかいよう病菌への吸着性を利用する。当該検出方法では、上述の混合ステップに続く検出ステップにおいて、混合物におけるカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量する。
カンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量するには、電子顕微鏡などを用いて、混合ステップで得られた混合物に含まれるカンキツかいよう病菌の表層に吸着したバクテリオファージを計数すればよい。この場合、上記実施の形態２に係る蛍光色素で標識したバクテリオファージを含む検出剤を用いることで、カンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージの蛍光色素を、蛍光顕微鏡下で容易に計数できる。
また、混合ステップで得られた混合物を所定時間静置し、遠心分離し、上清をフィルター滅菌して得た試料に関して、プラークアッセイを行うことでもカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量できる。この場合、カンキツかいよう病菌に吸着しなかったバクテリオファージの数に依存して、プラークが形成される。ここで、コントロールとして、例えば、検定液の代わりにバクテリオファージを滅菌水で希釈した希釈液を遠心分離し、その上清についてプラークアッセイを行う。希釈液にはカンキツかいよう病菌が含まれていないため、希釈液中のバクテリオファージは、カンキツかいよう病菌に吸着しない。このため、上清に含まれるバクテリオファージは、検定液よりも多くなり、より多くのプラークが形成される。この場合、コントロールのプラーク数に対するコントロールのプラーク数と上記試料のプラーク数との差が、吸着したバクテリオファージの割合を示す。この割合を算出することで、カンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量できる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病菌の検出方法は、カンキツかいよう病菌を溶菌させなくてもバクテリオファージが吸着した段階で検出が可能なため、培養時間等を含む検出にかかる時間を短縮することができる。
なお、上記バクテリオファージは、カンキツかいよう病菌への吸着性を利用して、カンキツかいよう病菌の除去、捕捉などにも利用できる。例えば、当該バクテリオファージを固定した担体を充填したカラムに、カンキツかいよう病菌を含む試料液を通すことで、バクテリオファージが試料液中のカンキツかいよう病菌に吸着し、カンキツかいよう病菌を担体に捕捉することができる。
（実施の形態４）
上記実施の形態１に係るバクテリオファージは、下記実施例１に示すように幅広い宿主域を有しており、感染したカンキツかいよう病菌を溶菌する。このため、当該バクテリオファージは、カンキツかいよう病の防除剤の有効成分として好適である。
上記実施の形態１に係るバクテリオファージは、下記実施例１に示すように幅広い宿主域を有しており、感染したカンキツかいよう病菌を溶菌する。このため、当該バクテリオファージは、カンキツかいよう病の防除剤の有効成分として好適である。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤は、上記実施の形態１に係るバクテリオファージを含む。該防除剤は、例えば、滅菌水に懸濁した状態で、バクテリオファージを、１０３〜１０１４ｐｆｕ／ｍＬ、１０４〜１０１２ｐｆｕ／ｍＬまたは１０３〜１０８ｐｆｕ／ｍＬで含む。当該防除剤は、有効成分であるバクテリオファージ以外にも、一般に薬学的または植物学的に許容される他の物質、組成物等を含んでもよい。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤は、カンキツかいよう病の防除方法に利用できる。カンキツかいよう病の防除方法は、上記カンキツかいよう病の防除剤を、植物または植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。植物は、カンキツかいよう病菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよいが、好ましくはカンキツ類である。さらに好適には当該植物は、レモン、ネーブルオレンジ等の高級カンキツ類である。
カンキツかいよう病の防除剤を投与する方法は、植物または植物成長媒体を、当該防除剤に暴露することができる方法であれば任意である。防除剤を投与する方法は、例えば、カンキツかいよう病の防除剤を噴霧、注射すること、あるいは当該防除剤を植物または植物成長媒体に浸透させることなどである。植物に注射する場合、当該防除剤を注射筒に入れ、圧迫接種してもよいし、注射針を介して接種してもよい。
当該カンキツかいよう病の防除剤を、噴霧などにより植物に投与することで、病原性のカンキツかいよう病菌に未感染の植物であれば、該植物へのカンキツかいよう病菌の感染、あるいはカンキツかいよう病菌の病害が該植物に及ぶことを防止できる。病原性のカンキツかいよう病菌に感染後の植物であれば、当該カンキツかいよう病予防剤を投与することで病害の拡大を阻止できる。
植物成長媒体は、土壌、マット、固形培地などの構造体、養液栽培における養液、および水栽培における水などである。カンキツかいよう病の防除剤を植物成長媒体に投与することで、カンキツかいよう病の防除剤に含まれるバクテリオファージを、潜在的な病原性のカンキツかいよう病菌に感染させることができる。この結果、カンキツかいよう病を防除できる。ここで、「防除」とは、カンキツかいよう病菌の植物への感染の予防、カンキツかいよう病菌による植物の病害の予防、カンキツかいよう病菌による植物の病害の拡大防止および病原性のカンキツかいよう病菌の駆除を含む。なお、植物成長媒体は、植物が成長する媒体であれば任意のものでよい。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤に含まれるバクテリオファージの用量は、植物個体あたり１０２〜１０１０ｐｆｕ、好ましくは１０４〜１０８ｐｆｕである。カンキツかいよう病の防除剤は、上記用量のバクテリオファージを好適な担体又は希釈剤中に含み、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積などに応じて、例えば１００μＬ〜１００ｍＬまたは１〜１０ｍＬである。カンキツかいよう病の防除剤は、バクテリオファージの濃度に応じて、植物個体あたり１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。当該カンキツかいよう病の防除剤を含む懸濁液を植物成長媒体に投与する場合、例えば、植物成長媒体の表面積１ｍ２あたり、１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを散布することで投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。
本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤は、植物または植物成長媒体に単回で投与されてもよいし、任意の時間間隔で植物または植物成長媒体に複数回投与されてもよい。例えば、カンキツかいよう病の防除剤は、１週間に１回または複数回、あるいは２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回などの間隔で植物などに投与されてもよい。投与間隔は、投与対象の植物または植物成長媒体に応じて、適宜決定することができる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤は、幅広いカンキツかいよう病菌を溶菌させることができる。このため、当該カンキツかいよう病の防除剤は、カンキツかいよう病を防除できる。
なお、本実施の形態に係るカンキツかいよう病の防除剤に含まれるバクテリオファージは、種々のカンキツかいよう病菌に特異的に感染する性質を有するため、特異性が高く、他の有用な微生物に影響を与えない。これにより、当該防除剤は、環境への影響を極力小さくすることができる。したがって、当該防除剤は、化学農薬よりも安全性が高く、耐性菌の増加、有効散布量の増大、環境汚染、残留農薬、健康への影響などの問題を回避できる。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。以下では、バクテリオファージを、単に「ファージ」ともいう。
（実施例１：バクテリオファージの単離および宿主域の検討）
試験に用いたカンキツかいよう病菌であるＭＡＦＦ株は独立行政法人農業生物資源研究所から分譲された。ＭＡＦＦ株は、栄養寒天培地（ＮＡ ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ（商標）、ＢＢＬ ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー製、米国メリーランド州コッキーズヒル）を用いて２８℃で培養した。液体培養が必要な場合は、ＮＢ培地（ＢＢＬ ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー製）で、２８℃、２４時間振盪培養した（２２０ｒｐｍ）。ＭＡＦＦ株は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む０．８％のＮＢ培地中で、−８０℃で保管した。
試験に用いたカンキツかいよう病菌であるＭＡＦＦ株は独立行政法人農業生物資源研究所から分譲された。ＭＡＦＦ株は、栄養寒天培地（ＮＡ ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ（商標）、ＢＢＬ ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー製、米国メリーランド州コッキーズヒル）を用いて２８℃で培養した。液体培養が必要な場合は、ＮＢ培地（ＢＢＬ ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー製）で、２８℃、２４時間振盪培養した（２２０ｒｐｍ）。ＭＡＦＦ株は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む０．８％のＮＢ培地中で、−８０℃で保管した。
日本の農地から採取した土壌試料からバクテリオファージＣｐＸを、次のように単離した。およそ１０ｇの土壌試料を、滅菌した５０ｍＬの円錐状の遠心分離チューブに入れ、当該チューブを水道水で満たし、２０分毎に反転させた。次に、チューブを、２０分間、１５００×ｇで遠心分離し、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルター（ミリポア社製、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて、上清を濾過した。
次に、土壌濾液１００μＬを、宿主としてＭＡＦＦ株を用いて軟寒天培地（０．７５％寒天）と混合し、１．５％（ｗ／ｖ）寒天を含むＮＢプレートに重層してプラークを形成させた（プラークアッセイ）。ＮＢプレート上の単一のプラークをチップの先を切ったマイクロピペットを用いて採取し、５００μＬのＳＭバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４および０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ））に懸濁した。ボルテックスした後、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルターで上清を濾過滅菌したものを用いて、プラークアッセイを行い、ＣｐＸの力価を決定した。
次のように、プレートライセート法でスモールスケールでのＣｐＸの増殖を行った。ＮＢプレート一面にプラークが出来る条件（１０３〜１０４ｐｆｕ程度）でプラークアッセイを行った後、プレートにＳＭバッファを６ｍＬ加えた。これにパラフィルムで封をし、４℃で一晩振盪培養した。膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルターで上清を濾過滅菌したものを用いてプラークアッセイを行い、力価を確認した。
ラージスケール（１００ｍＬ〜１Ｌ）での増殖は、次のとおり行った。４．５ｍＬのＮＢ液体培地が入った試験管で、ＭＡＦＦ３０１０７７を前培養した（２８℃、一晩、振盪培養）。前培養液から適量を、１００ｍＬ〜１Ｌの本培養用のＮＢ液体培地（Ｄｉｆｃｏ（商標）、ＢＢＬ ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー製、米国メリーランド州コッキーズヒル）に加えた。ＭＡＦＦ３０１０７７株がＯＤ６００＝０．０２〜０．１となった時点で、ＣｐＸの懸濁液をＭ．Ｏ．Ｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．５〜１となるように加えて、２８℃に３０分間静置後、１００または１２８ｒｐｍで６〜８時間振盪培養した。この培養液を５０ｍＬの遠心プラスチックチューブに移し、冷却遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、８０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して菌体を沈殿させた。その上清をＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理（５０ｍＬの上清に対しＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ溶液をそれぞれ１０μＬずつ加え、３０℃の湯浴で１時間静置）した後、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルターで濾過滅菌した。
ＣｐＸの宿主域を調べるために、ＭＡＦＦ株培養液をＯＤ６００＝０．３０に調製し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに２５０μＬ入れた。これにＣｐＸの懸濁液を適量（１０〜１００μＬ）注入し、２８℃で２０分間、静置培養した。全量をＴｏｐ ａｇａｒ（５ｍＬ程度）に加え、ＮＢプレートに広げた。２８℃の培養室で１〜２日間静置培養し、プラークを確認した。
（結果）
ＭＡＦＦ３０１０７７にＣｐＸを感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．５〜１．０）、ＮＢ液体培地で振とう培養した（２８℃，１００ｒｐｍ）。菌体増殖の経時変化を未感染ＭＡＦＦ３０１０７７と比較した。図１に示すように、ＣｐＸ感染株の菌体増殖速度および最終菌体増殖量は、未感染株に比して、大幅に低下していた。このため、ＣｐＸは、カンキツかいよう病菌の増殖を強く抑制することが示された。
ＭＡＦＦ３０１０７７にＣｐＸを感染させ（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．５〜１．０）、ＮＢ液体培地で振とう培養した（２８℃，１００ｒｐｍ）。菌体増殖の経時変化を未感染ＭＡＦＦ３０１０７７と比較した。図１に示すように、ＣｐＸ感染株の菌体増殖速度および最終菌体増殖量は、未感染株に比して、大幅に低下していた。このため、ＣｐＸは、カンキツかいよう病菌の増殖を強く抑制することが示された。
表１は、ＣｐＸの宿主域の一部を示す。“＋”はＣｐＸが感染することを示し、“−”はＣｐＸが感染しないことを示す。
ＣｐＸは、Ｃｐ１およびＣｐ２が感染しないＭＡＦＦ３１１１３０を含むすべてのＭＡＦＦ株に感染することが確認できた。なお、ここでは、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ）の病原菌株を中心に調べているが、ＣｐＸの宿主域はさらに広いと考えられる。
（実施例２：ＣｐＸのカンキツかいよう病菌への吸着の評価）
バクテリオファージの宿主への感染過程では、バクテリオファージが宿主表層に吸着する。このため、バクテリオファージの吸着特異性は、宿主域を決定する重要な要因である。そこで、ＣｐＸの細菌への吸着性を評価した。
バクテリオファージの宿主への感染過程では、バクテリオファージが宿主表層に吸着する。このため、バクテリオファージの吸着特異性は、宿主域を決定する重要な要因である。そこで、ＣｐＸの細菌への吸着性を評価した。
ＣｐＸの希釈系列を調製し（１０６〜１０３ｐｆｕ／ｍＬ）、１．５ｍＬプラスチック試験管に５０μＬ分注した。ＯＤ＝０．１に調製した検定する菌の培養液を４５０μＬこれに加え（１０６ｐｆｕ／ｍＬの際、Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．００１となる）、２８℃で２０分間静置した。サンプルを８０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、２００μＬの上清をフィルター滅菌した。この上清１０μＬについて、ＭＡＦＦ３０１０７７を用いてプラークアッセイを行い、２８℃で一晩放置後、プラーク数を計測した（これを「実測値」とする）。また、コントロールとして検定用の培養液の代わりにｄｄＨ２Ｏを用いてＣｐＸの希釈液を遠心分離し、１０μＬの上清に対して、ＭＡＦＦ３０１０７７を用いてプラークアッセイを行い、プラーク数を計測した（これを「理論値」とする）。
吸着率は、
吸着率（％）＝１００×（理論値−実測値）／理論値
により算出した。なお、比較用の大腸菌としてＸＬ１０−ＧＯＬＤを用いた。
吸着率は、
吸着率（％）＝１００×（理論値−実測値）／理論値
により算出した。なお、比較用の大腸菌としてＸＬ１０−ＧＯＬＤを用いた。
（結果）
表２は、３回の上記試験結果と平均値を示す。ＣｐＸは、大腸菌には吸着せず、ＭＡＦＦ株に対して特異的に吸着することが示された。ＭＡＦＦ株の中でも、Ｃｐ１およびＣｐ２が感染できないＭＡＦＦ３１１１３０への吸着率が極めて高いことが示された。
表２は、３回の上記試験結果と平均値を示す。ＣｐＸは、大腸菌には吸着せず、ＭＡＦＦ株に対して特異的に吸着することが示された。ＭＡＦＦ株の中でも、Ｃｐ１およびＣｐ２が感染できないＭＡＦＦ３１１１３０への吸着率が極めて高いことが示された。
（実施例３：ＣｐＸのゲノム抽出とゲノムＤＮＡによる特徴付け）
ＣｐＸのゲノムＤＮＡを解析するために、まずは、ＰＥＧ沈殿によりファージを濃縮した。ＣｐＸの懸濁液に対して等量の２０％ＰＥＧ溶液（２Ｍ ＮａＣｌ）を加え、十分に混合した後、４℃で一晩静置した。冷却遠心分離機で４℃、８０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離し、沈殿をＴＥ溶液に懸濁した。
ＣｐＸのゲノムＤＮＡを解析するために、まずは、ＰＥＧ沈殿によりファージを濃縮した。ＣｐＸの懸濁液に対して等量の２０％ＰＥＧ溶液（２Ｍ ＮａＣｌ）を加え、十分に混合した後、４℃で一晩静置した。冷却遠心分離機で４℃、８０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離し、沈殿をＴＥ溶液に懸濁した。
濃縮したファージ懸濁液（１０１０〜１０１２ｐｆｕ／ｍＬ程度）に対してプロテイナーゼＫ（最終濃度：１ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（最終濃度：１％）を加え、５５℃で、２時間インキュベートした。これに等量のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて穏やかに５分間混合し、４℃、１５，０００ｒｐｍで、１５分間、遠心分離した。得られた上清を新しい１．５ｍＬプラスチック試験管に移し、等量のフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて穏やかに５分間混合し、４℃、１５，０００ｒｐｍで、１５分間、遠心分離した。上清に１０％量の３Ｍ酢酸ナトリウム、等量のイソプロピルアルコールを加えて軽く混合した。−５０℃で１時間静置した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで、２５分間遠心分離し、沈殿を７０％エタノールでリンスした後、１０〜１５分間、真空乾燥して適量のＴＥ溶液またはｄｄＨ２Ｏに溶解し、これをＤＮＡサンプルとした。
（結果）
制限酵素処理したＤＮＡサンプルの電気泳動の結果を図２および図３に示す。図２は、Ｃｐ１、Ｃｐ２およびＣｐＸそれぞれを、ＨｉｎｃＩＩ（レーンａ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーンｂ）、およびＰｓｔＩ（レーンｃ）で消化した場合のバンドパターンを示す。レーンＭは、マーカーとして、ラムダファージのゲノムＤＮＡをＳｔｙＩで消化したものである。ＣｐＸのバンドパターンは、Ｃｐ１およびＣｐ２いずれのバンドパターンとも明らかに異なっており、ＣｐＸがＣｐ１およびＣｐ２とは異なるファージであることが示された。ＣｐＸのゲノムサイズは約５０ｋｂｐであり、Ｃｐ１（４３，８７０ｂｐ）およびＣｐ２（４２，９６３ｂｐ）よりもやや大きい。
制限酵素処理したＤＮＡサンプルの電気泳動の結果を図２および図３に示す。図２は、Ｃｐ１、Ｃｐ２およびＣｐＸそれぞれを、ＨｉｎｃＩＩ（レーンａ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーンｂ）、およびＰｓｔＩ（レーンｃ）で消化した場合のバンドパターンを示す。レーンＭは、マーカーとして、ラムダファージのゲノムＤＮＡをＳｔｙＩで消化したものである。ＣｐＸのバンドパターンは、Ｃｐ１およびＣｐ２いずれのバンドパターンとも明らかに異なっており、ＣｐＸがＣｐ１およびＣｐ２とは異なるファージであることが示された。ＣｐＸのゲノムサイズは約５０ｋｂｐであり、Ｃｐ１（４３，８７０ｂｐ）およびＣｐ２（４２，９６３ｂｐ）よりもやや大きい。
図３は、ＣｐＸを、ＨｉｎｃＩＩ（レーン１）、ＥｃｏＲＶ（レーン２）、ＳａｃＩ（レーン３）、ＤｒａＩ（レーン４）、ＣｌａＩ（レーン５）、およびＸｂａＩ（レーン６）それぞれで消化した場合のバンドパターンを示す。レーンＭは、上記同様、ラムダファージのゲノムＤＮＡをＳｔｙＩで消化したものである。これらのバンドパターンから、ＣｐＸのゲノム構成を推定することができる。
（実施例４：ＣｐＸのファージ粒子の構造）
ＭＡＦＦ３０１０７７を宿主として得られたＣｐＸのファージ粒子(１０１１ｐｆｕ／ｍＬ)をリンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡（日立Ｈ６００Ａ）で観察した。図４に示すように、ＣｐＸのファージ粒子は、頭部径８０ｎｍ、尾部長２００ｎｍのＳｉｐｈｏｖｉｒｕｓ様構造を呈していた。
ＭＡＦＦ３０１０７７を宿主として得られたＣｐＸのファージ粒子(１０１１ｐｆｕ／ｍＬ)をリンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡（日立Ｈ６００Ａ）で観察した。図４に示すように、ＣｐＸのファージ粒子は、頭部径８０ｎｍ、尾部長２００ｎｍのＳｉｐｈｏｖｉｒｕｓ様構造を呈していた。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
本発明は、果樹、主にカンキツ類に対するかいよう病の防除、拡大防止またはカンキツかいよう病菌の駆除に好適である。特に、かいよう病に感受性のあるレモン、ネーブルオレンジなどの高級カンキツ類におけるかいよう病の防除および拡大防止に好適である。
Claims (15)
- ファージ粒子の構造が、頭部と尾部とを含み、
前記頭部の直径が７０〜９０ｎｍであって、
カンキツかいよう病菌に感染する、
バクテリオファージ。 - 前記尾部の長さが、
１８０〜２２０ｎｍである、
請求項１に記載のバクテリオファージ。 - カンキツかいよう病菌株ＭＡＦＦ３１１１３０に感染する、
請求項１または２に記載のバクテリオファージ。 - 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１４年６月１８日に受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８７７で受領されたＣｐＸである、
請求項１から３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。 - ゲノムＤＮＡが標識されている、
請求項１から４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。 - 請求項１から５のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含む、
カンキツかいよう病菌の検出剤。 - 請求項６に記載のカンキツかいよう病菌の検出剤を使用する、
カンキツかいよう病菌の検出方法。 - 前記カンキツかいよう病菌の検出剤と検体由来の試料とを混合する混合ステップと、
前記混合ステップで得られた混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する検出ステップと、
を含む請求項７に記載のカンキツかいよう病菌の検出方法。 - 前記検出ステップでは、
前記混合物を培養し、形成されるプラークに基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
請求項８に記載のカンキツかいよう病菌の検出方法。 - 前記検出ステップでは、
前記混合物を培養し、菌体の増殖量に基づいて、前記混合物に含まれるカンキツかいよう病菌を検出する、
請求項８に記載のカンキツかいよう病菌の検出方法。 - 前記カンキツかいよう病菌の検出剤は、
請求項５に記載のバクテリオファージを含み、
前記検出ステップでは、
前記バクテリオファージの標識されたゲノムＤＮＡを定量する、
請求項８に記載のカンキツかいよう病菌の検出方法。 - 前記検出ステップでは、
前記混合物におけるカンキツかいよう病菌に吸着したバクテリオファージを定量する、
請求項８に記載のカンキツかいよう病菌の検出方法。 - 請求項１から４のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含む、
カンキツかいよう病の防除剤。 - 請求項１３に記載のカンキツかいよう病の防除剤を、植物または植物成長媒体に投与する投与ステップ、を含む、
カンキツかいよう病の防除方法。 - 前記植物は、カンキツ類である、
請求項１４に記載のカンキツかいよう病の防除方法。
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-
2014
- 2014-07-30 JP JP2014155585A patent/JP2016032435A/ja active Pending
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