JP2015534806A - 末梢血試料によるびまん性大細胞型ｂ細胞性リンパ腫のモニタリング関連出願の相互参照本出願は、２０１２年１０月１９日出願の米国特許仮出願第６１／７１６，２７０号の利益を主張するものであり、当該出願は参照により本明細書にその全体が組み込まれる。 - Google Patents

Abstract

本発明は、障害と相関関係がある１以上のクロノタイプにより、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の微小残存病変をモニタリングするための、シーケンシングに基づく方法を対象とする。いくつかの実施形態において、かかる方法は、下記ステップ：（ａ）患者から末梢血の試料を得るステップ；（ｂ）試料から、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む核酸分子を増幅するステップ；（ｃ）増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに（ｄ）このクロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプおよびこれらの系統学的クロノタイプの有無および／またはレベルを決定するステップを含む。【選択図】なし

Description

びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の診断、分類および病期分類は、主に腫瘍塊から採取された細胞の形態学的および免疫表現型分析、組織学的分析、ならびに臨床および放射線分析に基づき、播種を決定する。リンパ腫細胞は患者の血流中に観察されているが、通常これはまれであり、日常の診断またはモニタリングには使用されておらず、例えば、Ｍｉｔｔｅｒｂａｕｅｒ−Ｈｏｈｅｎｄａｎｎｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１８：１１０２−１１０７（２００４）を参照されたい。同様に、無細胞ＤＮＡのレベルの上昇が、リンパ腫の患者において観察されているが、この現象は、日常の診断または予後分析には用いられておらず、例えば、Ｆｒｉｃｋｈｏｆｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、９０（１２）：４９５３−４９６０（１９９７）；Ｈｏｈａｕｓら、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ．、２０：１４０８−１４１３（２００９）；Ｊｏｎｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、８７：２５８−２６５（２０１２）；Ｍｕｓｓｏｌｉｎら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４（４）：３２３−３２９（２０１３）；などを参照されたい。

過去１０年のうちに、新しいＤＮＡシーケンシング技術が、ＤＮＡシーケンシングを、より簡便、低コストおよび桁違いに強力にした。このような進歩は、医療用途におけるＤＮＡシーケンシングの新規の応用の機会を作り出した。例えば、免疫分子、例えばＴ細胞またはＢ細胞受容体もしくはそれらの成分をコードする核酸のプロファイルは、生物の健康または疾患状態についての豊富な情報を含有し、したがってこのようなプロファイルを診断または予後の指標として使用することが広範の病態を提示し、例えば、ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ、米国特許第８，２３６，５０３号；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１８１７−１８２４（２００９）；Ｂｏｙｄら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、１（１２）：１２ｒａ２３（２００９）；Ｈｅら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（Ｍａｒｃｈ ８、２０１１）を参照されたい。このような配列に基づくプロファイルは、免疫レパートリーまたはそれらの構成要素のクロノタイプを測定する他のアプローチより非常に感度を高くすることができ、例えば、ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１７：２２５７−２３１７（２００３）；Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、９１：４２９２−４２９９（１９９８）を参照されたい。

例えば、新しいＤＮＡシーケンシング技術に基づくより感度が高く、簡便なアッセイが、末梢血試料の評価、診断の確定ならびに微小残存病変のモニターおよび検出に利用可能であれば、ＤＬＢＣＬ患者にとって有利であるだろう。

米国特許第８，２３６，５０３号明細書

Ｍｉｔｔｅｒｂａｕｅｒ−Ｈｏｈｅｎｄａｎｎｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１８：１１０２−１１０７（２００４） Ｆｒｉｃｋｈｏｆｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、９０（１２）：４９５３−４９６０（１９９７）； Ｈｏｈａｕｓら、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ．、２０：１４０８−１４１３（２００９） Ｊｏｎｅｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、８７：２５８−２６５（２０１２） Ｍｕｓｓｏｌｉｎら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４（４）：３２３−３２９（２０１３） Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１８１７−１８２４（２００９） Ｂｏｙｄら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、１（１２）：１２ｒａ２３（２００９） Ｈｅら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（Ｍａｒｃｈ ８、２０１１） ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１７：２２５７−２３１７（２００３） Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、９１：４２９２−４２９９（１９９８）

本発明は、末梢血試料の配列ベースの免疫レパートリー分析を使用して、微小残存病変に関してＤＬＢＣＬ患者を診断確定およびモニタリングする方法を対象とする。本発明は、多数の実施および適用で例示され、このうちのいくつかは本明細書の以下およびその全体を通して要約される。

一態様において、本発明は、患者においてびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）疾患をモニタリングする方法を対象とし、該方法は、下記：（ａ）診断用試料から、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプを決定するステップ；（ｂ）患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血試料を得るステップ；（ｃ）末梢血試料のＢ細胞および／または無細胞核酸から、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む核酸分子またはこれらから転写された核酸分子を増幅させるステップ；（ｄ）増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに（ｅ）このクロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプ（これらのこれまでの系統学的クロノタイプを含む）の存在の有無および／またはレベルを決定するステップにより実施される。

本発明の上で特徴づけられた態様および他の態様は、多数の例示的実施および適用で例示され、そのいくつかを図で示し、後述の特許請求の範囲の項で特徴づけられる。しかし、上記の概要は、本発明の個々の例示された実施形態またはすべての実施を記載する意図のものではない。

本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において特殊性を明らかにされる。本発明の特徴および有利性のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を明らかにする下記の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られる。

免疫グロブリン遺伝子を増幅およびシーケンシングするための２段階のＰＣＲスキームを示す図である。 免疫グロブリン遺伝子を増幅およびシーケンシングするための２段階のＰＣＲスキームを示す図である。 免疫グロブリン遺伝子を増幅およびシーケンシングするための２段階のＰＣＲスキームを示す図である。 図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定する一実施形態を詳細に例示する図である。 図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定する別の実施形態を詳細に例示する図である。 ＩｇＨ鎖由来の３つのシーケンシング鋳型を単一反応で作製するためのＰＣＲスキームを例示する図である。 ＩｇＨ鎖由来の３つのシーケンシング鋳型を３つの個別の反応で作製し、その後、得られたアンプリコンを２次ＰＣＲに組み込み、Ｐ５およびＰ７プライマー結合部位に付加するためのＰＣＲスキームを例示する図である。 ＩｇＨ鎖由来の３つのシーケンシング鋳型を３つの個別の反応で作製し、その後、得られたアンプリコンを２次ＰＣＲに組み込み、Ｐ５およびＰ７プライマー結合部位に付加するためのＰＣＲスキームを例示する図である。 ＩｇＨ鎖のために作製された配列リードの位置を例示する図である。

本発明の実践は、特に他のことが示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、バイオインフォマティクス、細胞生物学および生化学の従来の技術および記述を用いることができ、これらは当業者の範囲内である。このような従来の技術としては、限定するものではないが、血液細胞のサンプリングおよび分析、核酸のシーケンシングおよび分析などが挙げられる。適切な技術の具体的例示は、本明細書の下記の実施例を参照することによって可能である。しかし、他の等価の従来の手順も、当然のことながら、使用可能である。このような従来の技術および記述は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）；などの標準実験室マニュアルに見出すことができる。

ＤＬＢＣＬなどの大部分のリンパ系新生物において、疾患細胞は、疾患状態と相関関係があるクロノタイプを発現する。すなわち、クロノタイププロファイル内の疾患細胞により生成されるクロノタイプのレベルまたは頻度は、疾患状態に単調に関係する。リンパ系新生物に関して、相関するクロノタイプのレベルは、通常疾患の範囲または重症度に直接関係し、したがって、クロノタイププロファイル内のこのようなレベルまたは頻度は、疾患の負の予後指標である。ＤＬＢＣＬに相関するクロノタイプは、様々な技術により決定することができる。１つのアプローチにおいて、１以上の相関するクロノタイプは、診断用試料、例えば、リンパ組織、例えば骨髄、リンパ節など由来の生検から、クロノタイププロファイル中の優勢な（１または複数の）クロノタイプとして診断時に同定される。部分的に、本発明は、ＤＬＢＣＬの疾患状態を、末梢血試料に由来するクロノタイププロファイル中の疾患に相関するクロノタイプのレベルを決定することにより、決定、確定および／またはモニターすることができるという認識および評価である。特に、（無傷の細胞または無細胞核酸、例えば無細胞ＤＮＡのいずれかに由来する）ＤＬＢＣＬ患者の末梢血中の相関するクロノタイプの存在は、相関するクロノタイプが検出されない、または低レベルの相関するクロノタイプが検出される場合より、疾患進行の予後不良を示す。

上記のように、一態様において、本発明は、下記：（ａ）診断用試料から、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプを決定するステップ；（ｂ）患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血試料を得るステップ；（ｃ）末梢血試料のＢ細胞および／または無細胞核酸から、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む核酸分子またはこれらから転写された核酸分子を増幅させるステップ；（ｄ）増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに（ｅ）このクロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプ（これらのこれまでの系統学的クロノタイプを含む）の存在の有無および／またはレベルを決定するステップを含む、患者においてびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）疾患の確定またはモニタリング方法を対象とする。いくつかの実施形態において、特に他の診断アッセイの結果を確定する実施形態において、診断用試料は末梢血試料である。他の実施形態において、診断用試料は、腫瘍または疑わしい腫瘍から採取される。このような腫瘍は、リンパ組織、例えば骨髄、リンパ節などにおいて起こり得る。いくつかの実施形態において、本方法に従って分析された核酸分子は、前記末梢血試料の無細胞分画由来である。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記患者においてＤＬＢＣＬ残存病変をモニターするために、上記のステップ（ｂ）から（ｅ）を反復するステップをさらに含む。

さらなる実施形態において、本発明の方法は、下記：（ａ）患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血試料を得るステップ；（ｂ）末梢血試料から核酸試料を抽出するステップ；（ｃ）核酸試料から、ＩｇＨのＶＤＪ領域またはこれらの一部をコードする核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応において増幅するステップ；（ｃ）増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに（ｄ）このクロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプのそれぞれのレベルであって、このような１以上の患者特有のクロノタイプのそれぞれの系統学的クロノタイプを含むレベルを決定するステップを含む。

いくつかの実施形態において、シーケンシングステップは、各クロノタイプの配列を決定するための、２０から４００ヌクレオチドの範囲の配列リードを作製するステップを含む。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、測定された１以上の患者特有のクロノタイプまたはこれらの系統学的クロノタイプのレベルに基づき骨髄を移植することによって患者を治療するステップをさらに含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、移植ステップは、前記１以上の患者特有のクロノタイプおよびこれらの系統学的クロノタイプのレベルが、診断用試料中の１以上の患者特有のクロノタイプのレベルの５０パーセントを超えているかどうかに関わらず実施される。

いくつかの実施形態において、末梢血試料由来のクロノタイププロファイルはそれぞれ、０．１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で、または０．０１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で、または０．００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で、または０．０００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で含む。

いくつかの実施形態において、増幅ステップは、少なくとも１０^５のＢ細胞または少なくとも１０^６のＢ細胞または少なくとも１０^７のＢ細胞または少なくとも１０^８のＢ細胞を含む、末梢血試料由来の核酸分子を増幅するステップを含む。

ＤＬＢＣＬの診断および治療
患者におけるＤＬＢＣＬの最初の兆候は、多くの場合、首、腋窩または鼠径部の無痛の急速な腫脹であり、この腫脹はリンパ節の拡大により引き起こされる。一部の患者に関しては、腫脹は痛みを伴うことがある。他の症状としては、寝汗、原因不明の熱および体重減少が挙げられる。ＤＬＢＣＬはすべての年齢群の人々において見出されているが、中年以上の人々に最も一般的に見出される。診断時の平均年齢は６４歳である。男性は、女性よりわずかにＤＬＢＣＬの発症が多いと思われる。ＤＬＢＣＬにおいて、異常なＢ細胞リンパ球は正常より大きく、通常、細胞の成長および再生を制限するシグナルへの応答を停止していた。ＤＬＢＣＬは、悪性大細胞型Ｂ細胞が、リンパ節内でリンパ節全域にわたるランダムな位置において（びまん性に）、特定のパターンまたは構造がなく成長するので、「びまん性」と呼ばれる。

ＤＬＢＣＬの診断は、生検により拡大したリンパ節の一部またはすべてを摘出することによって確定される。この手順は、関与する組織が比較的皮膚表面に近い場合、局所麻酔により実施することができる。節がもっと深い場合、全身麻酔が必要である。その後、組織由来の細胞を、顕微鏡および他の技術を使用して詳細に検査する。いくつかの実施形態において、本発明の診断用試料は、このような生検から得ることができる。診断が確定したら、さらなる試験を実施して、疾患が体内に広がっている範囲についてのさらなる情報を得る。この過程は、病期分類と呼ばれる。これらの試験の結果は、治療の最も有効なクールを決定する手助けをする。病期分類試験としては、血液検査、骨髄生検、ＣＴスキャンおよび／またはＰＥＴスキャンが挙げられ得る。

ＤＬＢＣＬは非常に早く進行するので、通常早急な治療が必要である。化学療法およびモノクローナル抗体のリツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））および放射線療法の組み合わせ、または放射線療法なしの組み合わせにより、この形態のリンパ腫を有する大多数の人々に治癒をもたらすことができる。ＤＬＢＣＬに最も広範囲に使用される治療は、Ｒ−ＣＨＯＰであり、Ｒ−ＣＨＯＰは、リツキシマブといくつかの化学療法薬（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）との混合物である。ＤＬＢＣＬを有する患者を治療する場合、医師は、別の化学療法薬であるエトポシド（ベプシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ））をＲ−ＣＨＯＰにさらに加え、Ｒ−ＥＰＯＣＨと呼ばれる薬剤の組み合わせを得ることができる。多くの患者では、ＤＬＢＣＬは初期治療後に復帰しないが、一部の患者では疾患が復帰する。疾患が難治性になった（疾患が治療に応答しない）、または再発した（治療後に疾患が復帰する）患者に関しては、二次療法により別の寛解または治癒の提供に成功することがある。

幹細胞移植は、癌が復帰または再発したＤＬＢＣＬ患者のために選択される治療である。高用量化学療法と幹細胞移植との併用は、初期化学療法に失敗したが、二次化学療法レジメンに敏感なＤＬＢＣＬ患者を治療するために使用可能である。幹細胞移植を受ける患者の大部分は、彼ら自身の幹細胞（自家幹細胞移植片）を受容する。場合により、患者はドナー由来の幹細胞（同種幹細胞移植片）を受容する。

本発明のいくつかの実施形態に従って、本発明の方法により（例えば、上記のステップにより）化学療法後にＭＲＤに関してモニターされたＤＬＢＣＬ患者において、ＭＲＤが、２週から６ヶ月の間隔で区切られた連続測定において検出され、レベルが増加した場合、その場合はさらなる患者の治療ステップが実施される。一実施形態において、このようなさらなる治療は、以前の化学療法に使用された以外の少なくとも１種の異なる化学療法薬を使用する化学療法を含む。別の実施形態において、このようなさらなる治療は、肝細胞移植を含む。いくつかの実施形態において、このような連続測定はそれぞれ、少なくとも１０^６のＢ細胞を含有する末梢血試料由来のクロノタイププロファイルの作製を含み、さらなる実施形態において、このような連続測定はそれぞれ、少なくとも１０^７のＢ細胞を含有する末梢血試料由来のクロノタイププロファイルの作製を含む。

試料
本発明の方法のためのクロノタイププロファイルは、患者試料から作製され、このクロノタイププロファイルは、診断用試料の場合、腫瘍または末梢血に由来してよく、または残存病変のモニタリングのための試料の場合、末梢血由来である。ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上のクロノタイプは、診断用試料によって決定される。通常、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上のクロノタイプは、最も高い頻度でクロノタイププロファイル中に存在するクロノタイプである。場合により、単一の相関するクロノタイプが存在することがあり、他の場合には、ＤＬＢＣＬと相関関係がある複数のクロノタイプが存在することがある。腫瘍試料は、ＤＬＢＣＬに侵された任意の組織から採取することができ、この組織は、リンパ節またはリンパ系以外、消化管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨または脳を含む。上記のように、残存病変のモニタリングのためのクロノタイププロファイルは、末梢血から抽出された核酸の試料から作製される。試料の核酸は、末梢血の細胞含有分画由来のＢ細胞由来か、または末梢血の無細胞分画、例えば血漿もしくは血清由来であってよい。一実施形態において、末梢血試料は、少なくとも１，０００のＢ細胞を含むが、より一般的には、このような試料は少なくとも１０，０００のＢ細胞を含み、より一般的には、少なくとも１００，０００のＢ細胞を含む。別の態様において、試料は、１０００から１，０００，０００のＢ細胞の範囲の多数のＢ細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料中の細胞の数は、測定の感度の限界を設定する。すなわち、残存病変の検出感度は、使用する末梢血試料が大きいほど、高くなる。例えば、１，０００のＢ細胞を含有する試料において、このような細胞のＤＮＡがシーケンシングにより分析された場合、シーケンシングのリードがいくつ得られたかに関わらず、検出可能なクロノタイプの最も低い頻度は、１／１０００または０．００１である。

本発明に使用する試料は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ）を含むことができる。この核酸は、例えば循環系から抽出された無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、Ｖｌａｓｓｏｖら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１０：１４２−１６５（２０１０）；Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、５８１：７９５−７９９（２００７）を参照されたい。提供された発明の方法において、分析可能な対象由来のＲＮＡまたはＤＮＡの量は、例えば、いくつかの適用においては単一細胞ほどに少なく（例えば、他の細胞選択基準、例えば形態学的基準による較正試験）、１０００万細胞以上ほどに多く、これらの細胞は６ｐｇから６０ｕｇの範囲の量のＤＮＡおよび１ｐｇから１０ｕｇの範囲の量のＲＮＡに翻訳される。いくつかの実施形態において、核酸試料は、６ｐｇから６０ｕｇのＤＮＡ試料である。他の実施形態において、核酸試料は、１００μＬから１０ｍＬの末梢血由来ＤＮＡ試料であり、他の実施形態において、核酸試料は、１００μＬから１０ｍＬの末梢血からの無細胞分画由来ＤＮＡ試料である。

いくつかの実施形態において、リンパ球または無細胞核酸の試料は、別個のクロノタイプを有する実質的にすべてのＢ細胞がその中で表現され、それによってクロノタイプの「レパートリー」が形成されるように、十分多量である。一実施形態において、すべての別個のクロノタイプの実質的表現を得るために、９９パーセントの確率で、０．００１パーセント以上の頻度で存在する、すべてのクロノタイプの集団を含有する試料が採取される。別の実施形態において、９９パーセントの確率で、０．０００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプの集団を含有する試料が採取される。ならびに別の実施形態において、９９パーセントの確率で、０．００００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプの集団を含有する試料が採取される。一実施形態において、Ｂ細胞の試料は少なくとも５０万細胞を含み、別の実施形態において、このような試料は少なくとも１００万細胞を含む。

核酸試料は、従来の技術を使用して末梢血から得ることができ、例えば、Ｉｎｎｉｓら、編、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）などを参照されたい。例えば、白血球は、血液試料から従来の技術、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して分離することができる。血液試料は、１００μＬから１０ｍＬの範囲の体積であってよく、一態様において、血液試料の体積は、１００μＬから２ｍＬの範囲である。その後、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、このような血液試料から、本発明の方法に使用するための従来の技術、例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出することができる。白血球のサブセット、例えばリンパ球は、従来の技術、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）などを使用してさらに単離することができる。例えば、メモリーＢ細胞は、表面マーカーのＣＤ１９およびＣＤ２７を用いて単離することができる。

無細胞ＤＮＡはまた、末梢血試料から、従来の技術、例えばＬｏら、米国特許第６，２５８，５４０号；Ｈｕａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４４４：２０３−２０８（２００８）；などを使用して抽出することができ、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。限定されない例としては、末梢血は、ＥＤＴＡ管に収集し、その後、血漿、白血球および赤血球成分に遠心分離により分画することができる。無細胞血漿分画（例えば、０．５から２．０ｍＬ）由来ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）などのキットを使用し、製造業者のプロトコルに従って抽出することができる。

同定する組換えは各個体の適応免疫細胞のＤＮＡおよびこれらの関連するＲＮＡ転写産物に存在するので、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかが、提供される発明の方法でシーケンシングされ得る。免疫グロブリン分子またはこれらの一部をコードするＢ細胞由来の組換え配列は、クロノタイプと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡは、抗体をコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子由来の配列に対応し得る。

本発明の方法で分析されたＤＮＡおよびＲＮＡは、重鎖免疫グロブリン（ＩｇＨ）をコードする配列に対応する。各鎖は、定常（Ｃ）領域および可変領域で構成される。重鎖に関しては、可変領域は、可変（Ｖ）、多様（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）および接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）（Ｊ）セグメントで構成される。これらのセグメントの個々の型をコードするいくつかの別個の配列が、ゲノム中に存在する。特定のＶＤＪ組換え事象が、Ｂ細胞の発達の間に起こり、その細胞に特定の重鎖を作製させる。体細胞性突然変異は多くの場合、組換え部位の近くで起こり、いくつかのヌクレオチドの付加または欠失を引き起こし、さらに、Ｂ細胞により産生される重鎖の多様性を増加させる。Ｂ細胞により作製される抗体の多様性候補は、様々な重鎖および軽鎖の産物である。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）の領域または部位の形成に寄与する。この多様性には、いくつかのエピトープに対して特異的応答が惹起された後に起こり得る体細胞性超突然変異の過程が加えられる。

本発明に従って、プライマーを、Ｂリンパ球から抽出された組換え核酸のアンプリコンを作製するように選択することができる。このような配列は、本明細書において「体細胞性再構成領域」または「体細胞性組換え領域」または「組換え配列」と称され得る。体細胞性再構成領域は、発達中のリンパ球または完全に発達したリンパ球由来の核酸を含むことができ、発達中のリンパ球は完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域を有する分子を形成するための免疫遺伝子の再構成が完了していない細胞である。例示的不完全体細胞性再構成領域は、不完全なＩｇＨ分子（例えば、Ｄ−Ｊ領域だけを含有する分子）を含む。

感度強化のための顆粒球の枯渇
いくつかの実施形態において、末梢血中のＤＬＢＣＬ細胞検出の感度は、核酸抽出前の試料から非リンパ球を除去することによって強化することができる。末梢血の重要な非リンパ球成分は顆粒球から成り、顆粒球は、好中球、好塩基球および好酸球を含む。一実施形態において、末梢血の試料から顆粒球を除去するステップは、試料を含む反応混合物において下記：（ｉ）赤血球の溶解ステップ、（ｉｉ）顆粒球の親和性による捕捉ステップ、および（ｉｉｉ）捕捉した顆粒球を反応混合物から分離するステップのように実施することができる。いくつかの実施形態において、親和性による捕捉ステップは、固体支持体、例えば磁気ビーズＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に結合された顆粒球特異的抗体により実施することができる。他の実施形態において、顆粒球またはこれらの成分のサブタイプは、リセットおよび／または密度勾配遠心分離法、例えばＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）；ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により除去することができる。本発明に従って、顆粒球は、好中球、好塩基球または好酸球のすべてまたはいずれか１つだけを別々に除去することによって除去することができる。顆粒球特異的抗体は市販されており、従来の方法を使用して、例えば、顆粒球特異的抗体をビオチン化して、試料と共にインキュベーション後、ストレプトアビジン化磁気ビーズによりコンジュゲートを捕捉することによって、固体支持体に直接または間接的に簡便に結合することができる。

核酸集団の増幅
下記のように、核酸の標的集団のアンプリコンは、様々な増幅技術により作製することができる。本発明の一態様において、多重ＰＣＲを使用して、核酸混合物、特に組換え免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体またはこれらの一部を含む混合物のメンバーが増幅される。このような免疫分子の多重ＰＣＲを実施するためのガイダンスは、下記の文献に見出され、これらは参照により組み込まれる：Ｆａｈａｍら、米国特許公開第２０１１／０２０７１３４号；Ｌｉｍら、米国特許公開第２００８／０１６６７１８号；など。下記により詳細に記載するように、一態様において、個別の核酸分子を空間的に単離するステップは、あらかじめ選択された体細胞性再構成領域またはこれらの一部（すなわち標的配列）の初回多重増幅を、メンバーの配列が、各末端にさらなる操作を可能にする共通配列を有する第１のアンプリコンを作製するための、それぞれが標的配列に非相補的な尾部を有するフォワードおよびリバースプライマーを使用して実施することによって達成される。例えば、このような共通末端は、複数のそれぞれのプライマーの代わりに単一のフォワードプライマーおよび単一のリバースプライマーだけを使用する連続増幅のためのプライマー結合部位、または固体表面の個別分子の架橋増幅のためのプライマー結合部位などを含み得る。このような共通末端は、上記のような単一増幅で加えることができ、またはこのような共通末端は長鎖プライマー（例えば５０−７０塩基以上）の混合物の製造およびこれらにわたる品質管理の実行に伴う困難を回避するために、２ステップ手順で加えることもできる。このような２ステップ工程（下記にさらに詳細に記載）において、プライマー尾部が、第１のアンプリコンの配列の末端にフォワードおよびリバースプライマー結合部位だけを提供する長さに限定されることを除き、初回増幅を上記のように実施する。その後、第２の増幅を、これらのプライマー結合部位に特異的な二次増幅プライマーを使用して、第２のアンプリコンの末端にさらなる配列を付加するように実施する。二次増幅プライマーは、標的配列に非相補的な尾部を有し、これらは、第２のアンプリコンの末端を形成し、第２のアンプリコンのクロノタイプのシーケンシングと関連して使用することができる。一実施形態において、このような付加された配列は、配列リードを作製するためのプライマー結合部位および例えば、Ｓｏｌｅｘａベースのシーケンシングが使用される場合、空間的に単離された個別分子のクローン性集団を作製するために、固体表面においてブリッジＰＣＲを実施するためのプライマー結合部位を含むことができる。この後者のアプローチにおいて、第２のアンプリコン由来の配列の試料は、試料の配列にアニーリング可能な相補的オリゴヌクレオチドに結合された固体表面に配置され、この後、プライマーの伸長、変性、アニーリングのサイクルが、鋳型のクローン性集団が形成されるまで実施される。好ましくは、試料のサイズは、（ｉ）試料が、元々の試料中のクロノタイプの有効な表現を含み、（ｉｉ）固体表面におけるクローン性集団の密度が、クロノタイプの明確な配列決定を可能にする範囲内であるように選択される。

増幅される領域は、完全なクローン性配列または免疫グロブリン遺伝子のＶ−Ｄジャンクション、Ｄ−Ｊジャンクション、免疫グロブリンの完全な可変領域、抗原認識領域またはＣＤＲ、例えば相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、クローン性配列のサブセットを含むことができる。

ゲノムからＤＮＡの増幅（またはＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの形態の核酸増幅）後、個々の核酸分子は単離でき、再増幅されてもよく、その後個別にシーケンシングされる。例示的増幅プロトコルは、Ｄｏｎｇｅｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１７：２２５７−２３１７（２００３）またはｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎら、米国特許公開第２００６／０２３４２３４号に見出すことができ、これらは参照により組み込まれる。簡潔に言うと、例示的プロトコルは下記のようである：反応バッファー：ＡＢＩ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩまたはＡＢＩ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；最終反応体積５０μＬ；１００ｎｇの試料ＤＮＡ；１０ｐｍｏｌの各プライマー（下記の増幅のバランスをとるように調整に供する）；ｄＮＴＰ、最終濃度２００μＭ；ＭｇＣｌ_２ 最終濃度１．５ｍＭ（標的配列およびポリメラーゼに依存して最適化に供する）；Ｔａｑポリメラーゼ（１−２Ｕ／チューブ）；サイクル条件：予備活性化７分、９５℃；アニーリング６０℃；サイクル時間：変性３０秒；アニーリング３０秒；伸長３０秒。本発明の方法において増幅に使用可能なポリメラーゼは、市販されており、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅポリメラーゼまたはＰｆｕを含む。使用するポリメラーゼの選択は、忠実性が好ましいか、または効率が好ましいかに基づくことができる。

プールから核酸を単離する方法は、ＤＮＡベクターへの核酸のサブクローニングおよび細菌の形質転換（細菌クローニング）、固体基材（例えばスライドグラス）における分子の二次元の空間的分離、ミセル内の溶液における分子の三次元の空間的分離（例えば、これは、分子をビーズなどの固体表面に固定して、またはしないで油エマルジョンを使用して達成することができる）または、例えばマイクロ流体チップまたはナノ流体チップ中のマイクロリアクションチャンバー（ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ）の使用を含む。平均して、単一分子が、所与の体積、空間領域、ビーズまたはリアクションチャンバー中に存在することを確保するために、希釈を使用することができる。個別の核酸分子を単離するためのこのような方法のためのガイダンスは、下記の文献中に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１ｓ）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９：１７２８−１７３２（補足事項を含む）（２００５）；米国特許第６，３００，０７０号；Ｂｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４５６：５３−５９（補足事項を含む）（２００８）；米国特許第７，３２３，３０５号；Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２０：１４８２−１４９０（２００５）：米国特許第６，７５３，１４７号；など。

リアルタイムＰＣＲ、ピコグリーン染色、ナノ流体電気泳動（例えばＬａｂＣｈｉｐ）またはＵＶ吸光度測定が、増幅可能材料の機能的量を判断するための初回ステップに使用可能である。

一態様において、多重増幅は、開始集団中の配列の相対量が、増幅される集団またはアンプリコンの相対量と実質的に同じであるように実施される。すなわち、多重増幅は、試料集団のメンバー配列内の増幅のバイアスが最小であるように実施される。一実施形態において、このような相対量は、アンプリコン中の各相対量が、開始試料中のその値の５倍以内である場合、実質的に同じである。別の実施形態において、このような相対量は、アンプリコン中の各相対量が、開始試料中のその値の２倍以内である場合、実質的に同じである。下記により詳細に述べるように、ＰＣＲ中の増幅のバイアスは、ＰＣＲプライマーのセットが任意の試料のバイアスのない増幅を提供する所定のレパートリーのために選択され得るように、従来の技術を使用して検出および補正することができる。

一実施形態において、増幅のバイアスは、（上記のように）２段階増幅を実施することにより回避することができ、この２段階増幅において、標的配列と非相補的な尾部を有するプライマーを使用する第１の、または一次の段階において少数の増幅サイクルを実施する。尾部は、一次アンプリコンの配列の末端に付加されるプライマー結合部位を含み、したがってこのような部位は、単一のフォワードプライマーおよび単一のリバースプライマーだけを使用する増幅の第２段階において使用され、それによって増幅のバイアスの主因を排除する。いくつかの実施形態において、一次ＰＣＲは、異なるプライマーによる差次的増幅を最小化するために十分少数のサイクル（例えば、５から１０）を有するものである。二次増幅は、一対のプライマーにより実施され、したがって差次的増幅の問題は最小である。一次ＰＣＲの１パーセントが、二次ＰＣＲに直接取り込まれる。２つの増幅の間に使用される３５サイクル（１００倍希釈ステップのない約２８サイクルと同等）は、サイクルの内訳に関わらず、一次で１サイクルおよび二次で３４サイクルであっても、または一次で２５および二次で１０であっても堅調な増幅を示すのに十分であった。理想的には、一次ＰＣＲにおいて１サイクルだけを行うことで増幅のバイアスを減少させることが可能ではあるが、他にも考慮すべきことが存在する。この一態様が表現である。これは、出発投入量が、最終的に得られるリードの数を超えない場合に役割を果たす。例えば、１，０００，０００のリードが得られ、１，０００，０００の注入分子で開始した場合、１００，０００分子からの表現だけを二次増幅に取り込むことは、元々の試料中の様々な種の相対的存在量の推定の正確さを下げる。２ステップの間の１００倍希釈は、一次ＰＣＲ増幅が１００分子よりかなり多くを作製しない限り、表現が減少することを意味する。このことは、最低８サイクル（２５６倍）、より楽には１０サイクル（約１，０００倍）が使用できることを示す。その代替としては、一次ＰＣＲの１％より多くを二次に取り込むことであるが、一次ＰＣＲに使用されるプライマーが高濃度であるため、大きな希釈係数を使用して、これらのプライマーが増幅に干渉せず、配列間の増幅のバイアスを悪化させないことを確実にすることができる。別の代替は、精製または酵素的ステップを加えて、一次ＰＣＲからプライマーを除去して、その希釈を小さくすることが可能であることである。この例において、一次ＰＣＲは１０サイクルであり、二次は２５サイクルである。

簡潔には、ＩｇＨコード核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ（上で引用）のスキームを、図１Ａ−１Ｃに例示する。核酸（１２００）は、試料中のリンパ球から抽出され、免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子のＣ領域（１２０３）に特異的なプライマー（１２０２）および様々なＶ領域（１２０６）に特異的なプライマー（１２１２）と、ＰＣＲにおいて組み合わせる。プライマー（１２１２）はそれぞれ、増幅の第２段階のためのプライマー結合部位を提供する同一の尾部（１２１４）を有する。上記のように、プライマー（１２０２）は、Ｃ領域（１２０３）とＪ領域（１２１０）との間のジャンクション（１２０４）に隣接して配置される。ＰＣＲにおいて、Ｃコード領域（１２０３）の一部、Ｊコード領域（１２１０）、Ｄコード領域（１２０８）およびＶコード領域（１２０６）の一部を含有するアンプリコン（１２１６）が作製される。アンプリコン（１２１６）は、第２段階において、プライマーＰ５（１２２２）およびプライマーＰ７（１２２０）を使用してさらに増幅され、これらのプライマーはそれぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡシーケンサーにおける使用のために設計された尾部（それぞれ、１２２４および１２２１／１２２３）を有する。プライマーＰ７（１２２０）の尾部（１２２１／１２２３）は、シーケンシング工程において個別の試料を標識するためのタグ（１２２１）が組み込まれてもよい。第２段階の増幅は、アンプリコン（１２３０）を作製し、このアンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡシーケンサーに使用することができる。

配列リードの作製
核酸をシーケンシングするための任意のハイスループット技術が、本発明の方法に使用可能である。好ましくは、このような技術は、コスト効率の良い様式で、少なくとも１０００のクロノタイプを決定することができる、好ましくは少なくとも１０，０００から１，０００，０００のクロノタイプを決定することができる量の配列データを作製する能力を有する。ＤＮＡシーケンシング技術としては、標識されたターミネーターまたはプライマーおよびスラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離を使用する古典的なジデオキシシーケンシング反応（Ｓａｎｇｅｒ法）、可逆的に終端された標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、４５４シーケンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、後に連結が続く標識クローンのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシーケンシング、重合ステップの間の標識ヌクレオチドの組み込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシングおよびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。分離された分子のシーケンシングは、つい最近、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する逐次的または単回の伸長反応により、ならびにプローブのライブラリを用いる単回または逐次的な差次的ハイブリダイゼーションにより実証された。これらの反応は、多数のクローン配列に対して並列で実施され、現在の商業利用においては、１億を超える配列の並列化が実現している。本発明の一態様において、個別分子を固体表面上で空間的に単離し、その表面上でシーケンシングを並列で行うステップを含むシーケンシングのハイスループット法が用いられる。このような固体表面としては、無孔表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、例えばＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９（２００８）またはＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシング、例えばＤｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７：７８−８１（２０１０））、ビーズまたは粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（４５４など、例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４３７：３７６−３８０（２００５）またはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング、米国特許公開第２０１０／０１３７１４３号または第２０１０／０３０４９８２号）、マイクロマシン・メンブレン（ＳＭＲＴシーケンシングによるなど、例えば、Ｅｉｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２３：１３３−１３８（２００９））またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシーケンシングまたはポロニーシーケンシングによるもの、例えばＫｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１６：１４８１−１４１４（２００７））が挙げられ得る。別の態様において、このような方法は、単離分子が固体表面上で空間的に単離される前または後のいずれかに、単離された分子を増幅するステップを含む。事前増幅は、エマルジョン系増幅、例えばエマルジョンＰＣＲまたはローリングサークル増幅を含み得る。特に興味深いのは、Ｓｏｌｅｘａベースのシーケンシングであり、個別の鋳型分子が固体表面上で空間的に単離され、その後、これらの分子がブリッジＰＣＲにより並列で増幅され、別個のクローン性集団またはクラスタを形成し、その後、Ｂｅｎｔｌｅｙら（上で引用）および製造業者の取り扱い説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ およびＤａｔａ Ｓｈｅｅｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ、２０１０）およびさらに下記の文献：米国特許第６，０９０，５９２号；第６，３００，０７０号；第７，１１５，４００号およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１に記載のようにシーケンシングされ、これらの文献は参照により組み込まれる。一実施形態において、固体表面に配置され、増幅された個別分子は、少なくとも１０^５クラスタ／ｃｍ^２の密度または少なくとも５×１０^５／ｃｍ^２の密度または少なくとも１０^６クラスタ／ｃｍ^２の密度でクラスタを形成する。一実施形態において、比較的高いエラー率を有するシーケンシング化学が用いられる。このような実施形態において、このような化学により作製される平均クオリティスコアは、配列リードの長さの単調に低下する関数である。一実施形態において、このような低下は、配列リードの０．５パーセントが、１から７５位において少なくとも１つのエラーを有し；配列リードの１パーセントが、７６から１００位において少なくとも１つのエラーを有し；配列リードの２パーセントが１０１から１２５位において少なくとも１つのエラーを有することに対応する。

一態様において、個体の配列ベースのクロノタイププロファイルは、下記：（ａ）個体のＢ細胞から核酸試料を得るステップ；（ｂ）このような核酸試料に由来する個別分子を空間的に単離し、この個別分子が試料中の核酸から作製された少なくとも１つの鋳型を含み、この鋳型が体細胞性再構成領域またはこれらの一部を含み、各個別分子は少なくとも１つの配列リードを作製可能であるステップ；（ｃ）前記空間的に単離された個別分子をシーケンシングするステップ；および（ｄ）核酸試料由来の核酸分子の様々な配列の存在量を決定し、クロノタイププロファイルを作製するステップを使用して得られる。一実施形態において、体細胞性再構成領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含む。別の実施形態において、シーケンシングステップは、空間的単離個別分子それぞれの双方向にシーケンシングして、少なくとも１つのフォワード配列リードおよび少なくとも１つのリバース配列リードを作製するステップを含む。後者の実施形態に加えて、フォワード配列リードの少なくとも１つおよびリバース配列リードの少なくとも１つは、オーバーラップ領域を有し、したがってこのようなオーバーラップ領域の塩基は、このような配列リードの間の逆相補的関係により決定される。さらに別の実施形態において、体細胞性再構成領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含み、シーケンシングステップは、個別核酸分子のそれぞれの配列を、1以上のそのフォワード配列リードおよびJ領域のある位置から開始して、その付随するＶ領域方向に伸長する少なくとも１つのリバース配列リードから、決定するステップをさらに含む。別の実施形態において、個別分子は、完全ＩｇＨ分子、不完全ＩｇＨ分子からなる群から選択される核酸を含む。別の実施形態において、シーケンシングステップは、単調に低下するクオリティスコアを有する配列リードを作製するステップを含む。後者の実施形態に加えて、クオリティスコアが単調に低下するということは、下記：配列リードの０．２パーセントが塩基位置１から５０において少なくとも１つのエラーを含有し、配列リードの０．２から１．０パーセントが、５１から７５位において少なくとも１つのエラーを含有し、配列リードの０．５から１．５パーセントが７６から１００位において少なくとも１つのエラーを含有する、と同然のエラー率を配列リードが有するということである。別の実施形態において、上記の方法は、下記：（ａ）個体のＴ細胞および／またはＢ細胞から核酸試料を得るステップ；（ｂ）このような核酸試料に由来する個別分子を空間的に単離し、個別分子が、それぞれが試料中の核酸から作製され、それぞれが体細胞性再構成領域またはこれらの一部を含有する鋳型の入れ子セットを含み、それぞれの入れ子セットが、それぞれが、同じ方向に伸長し、それぞれが、入れ子セットが作製された核酸の異なる位置から開始する、複数の配列リードを作製可能であるステップ；（ｃ）前記空間的に単離された個別分子をシーケンシングするステップ；および（ｄ）核酸試料由来の核酸分子の異なる配列の存在量を決定して、クロノタイププロファイルを作製するステップを含む。一実施形態において、シーケンシングステップは、入れ子セットのそれぞれに関する複数の配列リードを作製するステップを含む。別の実施形態において、体細胞性再構成領域のそれぞれは、Ｖ領域およびＪ領域を含み、複数の配列リードはそれぞれ、Ｖ領域の異なる位置から開始し、その付随するＪ領域の方向に伸長する。

一態様において、個体由来の各試料に関して、本発明の方法に使用されるシーケンシング技術は、少なくとも１０００のクロノタイプの配列／ランを作製し、別の態様において、このような技術は、少なくとも１０，０００のクロノタイプの配列／ランを作製し、別の態様において、このような技術は、少なくとも１００，０００のクロノタイプの配列／ランを作製し、別の態様において、このような技術は、少なくとも５００，０００のクロノタイプの配列／ランを作製し、別の態様において、このような技術は、少なくとも１，０００，０００のクロノタイプの配列／ランを作製する。さらに別の態様において、このような技術は、１００，０００から１，０００，０００の間のクロノタイプの配列／ラン／個別試料を作製する。

提供される発明の方法に使用されるシーケンシング技術は、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０、約１２０ｂｐ／リード、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐまたは約６００ｂｐ／リードを作製することができる。

配列データからのクロノタイプの作製
配列リードデータからのクロノタイプの構築は、ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ（上に引用）に開示されており、これは参照により組み込まれる。簡潔には、配列リードデータからのクロノタイプの構築は、方法が異なれば、予想されるリードの長さおよびデータクオリティも異なるので、このようなデータを作製するために使用されるシーケンシング方法に一部依存する。１つのアプローチにおいて、Ｓｏｌｅｘａシーケンサーが、分析用の配列リードデータの作製に用いられる。一実施形態において、少なくとも０．５から１．０×１０^６リンパ球を提供し、少なくとも１００万の鋳型分子を生み出す試料が得られ、その後、任意選択の増幅により、対応する鋳型分子の１００万以上のクローン集団（またはクラスタ）が生み出され得る。Ｓｏｌｅｘａのアプローチを含む大部分のハイスループットシーケンシングのアプローチに関しては、各鋳型配列が、大幅な冗長性を持って決定され、配列決定の精度が上がるように、クラスタレベルにおいてのこのようなオーバーサンプリングが望ましい。Ｓｏｌｅｘａベースの実施に関しては、各々独立した鋳型の配列が１０回以上決定されることが好ましい。予想されるリードの長さおよびデータクオリティが異なる他のシーケンシングのアプローチに関しては、配列決定の同等の精度のためには異なるレベルの冗長性が使用できる。当業者は、上記のパラメーター、例えば、サンプルサイズ、冗長性などが、特定適用に関するデザイン選択であることを認識している。

一態様において、ＩｇＨ鎖（図２Ａに例示）のクロノタイプは、そのＣ領域から開始し、その付随するＶ領域の方向に伸長する少なくとも１つの配列リード（本明細書において「Ｃリード」（２３０４）と称される）およびそのＶ領域から開始し、その付随するＪ領域の方向に伸長する少なくとも１つの配列リード（本明細書において「Ｖリード」（２３０６）と称される）により決定される。このようなリードは、オーバーラップ領域（２３０８）を有しても、または有さなくてもよく、このようなオーバーラップは、図２Ａに示されるＮＤＮ領域（２３１５）を包含しても、または包含しなくてもよい。オーバーラップ領域（２３０８）は、完全にＪ領域中、完全にＮＤＮ領域中、完全にＶ領域中であってもよく、またはＪ領域−ＮＤＮ領域の境界もしくはＶ領域−ＮＤＮ領域の境界もしくはこのような境界の両方を包含してもよい（図２Ａに例示）。通常、このような配列リードは、シーケンシングプライマー、例えば図２Ａの（２３０２）および（２３１０）を、ポリメラーゼにより、合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）反応、例えばＭｅｔｚｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１：３１−４６（２０１０）；Ｆｕｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７：１０１３−１０２３（２００９）で伸長することによって作製される。プライマー（２３０２）および（２３１０）のための結合部位はあらかじめ決まっており、したがって、結合部位は、配列リードの初回アライメントおよび分析の出発点または基準点を提供することができる。一実施形態において、Ｃリードは、ＩｇＨ鎖のＤおよび／またはＮＤＮ領域を包含し、例えば図２Ａおよび２Ｂに例示されるように、隣接するＶ領域の一部を含むように配置される。一態様において、Ｖ領域中のＶリードおよびＣリードのオーバーラップは、互いにリードをアラインするために使用される。他の実施形態において、配列リードのこのようなアライメントは必要なく、したがってＶリードが、クロノタイプの特定のＶ領域を同定するために十分長いだけでよい。この後者の態様を、図２Ｂに例示する。配列リード（２３３０）は、別の配列リードとオーバーラップしている、またはしていないＶ領域を同定するために使用され、別の配列リード（２３３２）はＮＤＮ領域を横切り、これらの配列を決定するために使用される。Ｖ領域内に伸長する配列リード（２３３２）の部分（２３３４）を使用して、配列リード（２３３２）の配列情報と配列リード（２３３０）の配列情報を関連付け、クロノタイプを決定する。Ｓｏｌｅｘａシーケンシング方法のような塩基対塩基アプローチなどの、いくつかのシーケンシング方法に関しては、シーケンシングのランタイムおよび試薬のコストは、分析中のシーケンシングサイクルの数を最小化することによって下げられる。図２Ａに例示するように、アンプリコン（２３００）は、試料タグ（２３１２）と一緒に生成され、異なる生物学的試料、例えば異なる患者からのクロノタイプを識別されてもよい。試料タグ（２３１２）は、プライマーとプライマー結合領域（２３１６）をアニーリングして、それ（２３１４）を、配列リードを越えるタグ（２３１２）を生成するように伸長して、それから試料タグ（２３１２）を解読することによって同定することができる。

本発明の一態様において、クロノタイプの配列は、１以上の配列リードからの情報を、例えば選択された鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域に沿って組み合わせることによって決定することができる。別の態様において、クロノタイプの配列は、複数の配列リードからの情報を組み合わせることによって決定される。このような多数の配列リードは、センス鎖に沿った１以上の配列リード（すなわち「フォワード」配列リード）およびその相補鎖に沿った１以上の配列リード（すなわち「リバース」配列リード）を含むことができる。複数の配列リードが同じ鎖に沿って作製される場合、別個の鋳型が、試料分子を、配列リードの異なる位置に関して選択されたプライマーにより増幅させることによって、まず作製される。このコンセプトは図３Ａに例示され、プライマー（３４０４、３４０６および３４０８）が、単一反応でアンプリコン（それぞれ、３４１０、３４１２および３４１４）を作製するために用いられる。このような増幅は、同じ反応または別個の反応で実施することができる。一態様において、ＰＣＲが用いられればいつでも、別個の増幅反応が、別個の鋳型を作製するために使用され、別個の鋳型は順に組み合わされ、同じ鎖に沿った複数の配列リードを作製するために使用される。この後者のアプローチは、プライマー濃度（および／または他の反応パラメーター）のバランスを取り、複数の鋳型の同等の増幅（時として、本明細書において「バランスのとれた増幅」または「バイアスのない増幅」と称される）を確保する必要を回避するために好ましい。別個の反応における鋳型の作製を、図３Ｂ−３Ｃに例示する。ＩｇＨ（３４００）を含有する試料は、３分割され（３４７０、３４７２および３４７４）、これらはＪ領域プライマー（３４０１）およびＶ領域プライマー（それぞれ、３４０４、３４０６および３４０８）を使用する別個のＰＣＲに加えられ、アンプリコン（それぞれ、３４２０、３４２２および３４２４）が生成される。後者のアンプリコンはその後、Ｐ５およびＰ７プライマーを使用する二次ＰＣＲ（３４８０）において組み合わされ（３４７８）、ブリッジＰＣＲおよびＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡシーケンサーなどの機器におけるシーケンシングのための鋳型（３４８２）が調製される。

本発明の配列リードは、用いられるシーケンシング技術に部分的に依存して、広範囲の長さを有し得る。例えば、いくつかの技術に関して、その実施においていくつかのトレードオフ、例えば、（ｉ）配列リードの数および長さ／鋳型ならびに（ｉｉ）シーケンシング操作のコストおよび期間が生じ得る。一実施形態において、配列リードは２０から３４００ヌクレオチドの範囲内であり、別の実施形態において、配列リードは３０から２００ヌクレオチドの範囲内であり、さらに別の実施形態において、配列リードは３０から１２０ヌクレオチドの範囲内である。一実施形態において、１から４の配列リードが、各クロノタイプの配列を決定するために作製され、別の実施形態において、２から４の配列リードが各クロノタイプの配列を決定するために作製され、別の実施形態において、、２から３の配列リードが各クロノタイプの配列を決定するために作製される。前述の実施形態において、所与の数は、試料を異なる個体から同定するために使用される配列リードを除く。下記の実施形態に使用される様々な配列リードの長さは、リードにより捕捉されることを求める情報に基づき変動し得る；例えば、配列リードの開始位置および長さは、ＮＤＮ領域およびそのヌクレオチド配列の長さを提供するように設計することができ、したがって、全ＮＤＮ領域に及ぶ配列リードが選択される。他の態様において、組み合わせて（しかし別個にではなく）Ｄおよび／またはＮＤＮ領域を包含する１以上の配列リードが、十分である。

本発明の別の態様において、クロノタイプの配列は、一部は、配列リードを、１以上のＶ領域参照配列および１以上のＪ領域参照配列にアライニングすることによって、および一部は、参照配列、例えば高度に可変なＮＤＮ領域にアライメントすることなく塩基決定により決定される。様々なアライメントアルゴリズムが、配列リードおよび参照配列に適用できる。例えば、アライメント法の選択のためのガイダンスは、Ｂａｔｚｏｇｌｏｕ、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６：６−２２（２００５）において利用可能であり、これは参照により組み込まれる。一態様において、（上記の）ＶリードまたはＣリードがＶおよびＪ領域の参照配列にアライメントされればいつでも、例えば、Ｇｕｓｆｉｅｌｄ（上に引用）およびＣｏｒｍｅｎら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ、第３版（Ｔｈｅ ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、２００９）に一般的に記載された樹木探索アルゴリズムが用いられる。

配列リードからのＩｇＨクロノタイプの構築は、少なくとも２つの要因：ｉ）アライメントをより困難にする体細胞性突然変異の存在、およびｉｉ）ＮＤＮ領域が、多くの場合、ＶセグメントからＣリードの部分にマッピング不可能なほど長いことによって特徴づけられる。本発明の一態様において、この問題は、Ｖリードを作製するために複数のプライマーセットを使用し、ＶリードがＶ領域に沿った異なる位置、好ましくはプライマー結合部位が非オーバーラッピングであり、離れており、少なくとも１つのプライマー結合部位がＮＤＮ領域に隣接、例えば、一実施形態において、Ｖ−ＮＤＮジャンクションから５から５０塩基、または別の実施形態において、Ｖ−ＮＤＮジャンクションから１０から５０塩基に配置されるようにすることによって克服される。複数のプライマーセットの冗長性は、体細胞性突然変異による影響を受けた結合部位を有する１または２のプライマーの失敗による、クロノタイプの検出の失敗のリスクを最小化する。加えて、ＮＤＮ領域に隣接する少なくとも１つのプライマー結合部位の存在は、ＶリードをＣリードとオーバーラップさせ、したがって、Ｃリードの長さを有効に伸長させる可能性を高くする。このことは、ＮＤＮ領域の全サイズにおよび、実質的にＮＤＮ領域の両側の全ＶおよびＪ領域もまたマッピングできる連続配列の作製を可能にする。このようなスキームを実施するための実施形態を、図３Ａおよび３Ｄに例示する。図３Ａにおいて、ＩｇＨ鎖（３４００）を含む試料は、Ｊ領域プライマー（３４０１）の単一のセットおよびＶ領域（３４０２）のプライマー（３４０４、３４０６、３４０８）の複数（表示の３つ）のセットを含む鎖を増幅させ、すべてが同じＮＤＮ領域を含み、Ｖ領域（３４０２）の連続的に大きい部分を包含する（３４１１、３４１３、３４１５）異なる長さの複数の入れ子アンプリコン（例えば、３４１０、３４１２、３４１４）を生成することによって、各鎖に対する複数のアンプリコンを作製することによってシーケンシングされる。入れ子セットのメンバーは、それら各々のＮＤＮ、Ｊおよび／またはＣ領域の同一性（または実質的同一性）を確認することにより、シーケンシング後にひとつにグループ化することができ、それによって、リードの長さ、および／または配列のクオリティが限定される他のシーケンシングプラットフォームの場合よりも長いＶ（Ｄ）Ｊセグメントの再編成が可能になる。一実施形態において、複数のプライマーセットは、２から５の範囲の数であってよい。別の実施形態において、複数は２−３であり、さらに別の実施形態において、複数は３である。複数中のプライマーの濃度および位置は、大幅に変動し得る。Ｖ領域プライマーの濃度は、同じであっても、または同じでなくてもよい。一実施形態において、ＮＤＮ領域に最も近いプライマーは、例えば、ＮＤＮ領域を含有するアンプリコンが得られたアンプリコン中に表現されることを確実にするために、複数の他のプライマーより高い濃度を有する。複数の３つのプライマーが用いられる特定の実施形態において、６０：２０：２０の濃度比が使用される。ＮＤＮ領域（３４４４）に隣接する１以上のプライマー（例えば、図３Ｄの３４３５および３４３７）を使用して、Ｊ領域プライマー（３４３２）により作製される配列リード（３４４２）とオーバーラップする１以上の配列リード（例えば、３４３４および３４３６）を作製することができ、それによってオーバーラップ領域（３４４０）における塩基コールのクオリティを改善することができる。複数のプライマー由来の配列リードは、隣接する下流のプライマー結合部位および／または隣接する下流の配列リードとオーバーラップしても、またはしなくてもよい。一実施形態において、ＮＤＮ領域（例えば、３４３６および３４３８）の近位にある配列リードを使用して、クロノタイプと関連している特定のＶ領域を同定することができる。このような複数のプライマーは、プライマー結合部位の１つが、免疫グロブリンの発達の間に超突然変異される場合に、不完全な増幅または増幅の失敗の尤度を低下させる。このような複数のプライマーはまた、Ｖ領域の超突然変異により導入される多様性が、クロノタイプ配列中に捕捉される尤度を増加させる。二次ＰＣＲを実施して、例えば、アンプリコン（３４２０、３４２２および３４２４）を生成することが例示されているＰ５（３４０１）およびＰ７（３４０４、３４０６、３４０８）プライマーにより増幅することによって、シーケンシングのための入れ子アンプリコンを調製することができ、これらのアンプリコンは固体表面上の単一分子として分布でき、固体表面上においてブリッジＰＣＲなどの技術によりさらに増幅される。

体細胞性超突然変異。一実施形態において、体細胞性超突然変異を受けたＩｇＨベースのクロノタイプは下記のように決定される。体細胞性突然変異は、（関連するセグメント、通常Ｖ、ＪまたはＣの）参照配列の対応する塩基と異なり、統計的に有意な数のリード中に存在する、シーケンシングされた塩基として定義される。一実施形態において、Ｃリードを使用して、マッピングされたＪセグメントに関する体細胞性突然変異を見出すことができ、ＶリードとＶセグメントに関しても同様である。ＪもしくはＶセグメントに直接マッピングされたか、またはＮＤＮ境界までのクロノタイプ伸長の内側にあるかのいずれかのＣおよびＶリードの一片だけが使用される。この方法において、ＮＤＮ領域は回避され、（実際は単なる異なった組換えＮＤＮ領域であるヌクレオチドを突然変異として誤って分類することを避けるために）クロノタイプ決定に以前に使用された同じ「配列情報」は、突然変異発見には使用されない。各セグメント型に関しては、マッピングされたセグメント（主要対立遺伝子）が足場として使用され、リードマッピング相の間にこの対立遺伝子にマッピングされたすべてのリードが検討される。少なくとも１つのリードがマッピングされた参照配列の各位置は、体細胞性突然変異に関して分析される。一実施形態において、非参照塩基を有効な突然変異として受け入れる基準としては、下記：１）少なくともＮ個のリードが所与の突然変異塩基を含む、２）少なくとも所与の分数Ｎ／Ｍのリード（Ｍがこの塩基位置においてマッピングされたリードの合計数である）ならびに３）二項分布、突然変異塩基におけるＮ個のリードの平均Ｑスコアおよび非突然変異塩基を含むリードの数（Ｍ−Ｎ）に基づく統計的な切捨てが挙げられる。好ましくは上記のパラメーターは、突然変異の偽発見率／クロノタイプが１／１０００未満、より好ましくは１／１００００未満であるように選択される。

ＰＣＲエラーは、ＰＣＲの早期サイクルにおいて突然変異されたいくつかの塩基において濃縮されることが予想される。シーケンシングエラーは、このエラーがいくつかの系統的バイアスを有すると思われるので、全体的にランダムであるとしても、多数の塩基に分散されていることが予想される。いくつかの塩基は、シーケンシングエラーをより高い率、およそ５％（平均の５倍）で有するものと仮定される。これらの仮定を前提として、シーケンシングエラーはエラーの優勢型になる。ＰＣＲエラーと、高度に関連するクロノタイプの発生との識別は、分析において役割を果たすと思われる。２以上の高度に関連するクロノタイプが存在することを決定するための生物学的重要性を前提として、このようなコールを作り出す保守的アプローチが取り入れられる。高い信頼性（およそ９９．９％）で複数のクロノタイプが存在することを確認するために、少数派のクロノタイプの十分な検出が考慮される。１００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプの例に関して、少数派の変異体が、独立したクロノタイプとして指定されるためには、少数派の変異体は１４回以上検出される。同様に、１，０００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプに関しては、少数派の変異体は、独立したクロノタイプに指定されるためには７４回以上検出され得る。このアルゴリズムは、それぞれのシーケンシングされた塩基により得られる塩基クオリティスコアを使用することによって強化され得る。クオリティスコアとエラー率との間の関係が上で有効である場合、その場合はすべての塩基に対して保守的な５％エラー率を用いる代わりに、クオリティスコアを使用して、独立したクロノタイプをコールするために存在することが必要なリードの数を決定することができる。すべてのリード中の特定の塩基のメジアンクオリティスコアが使用でき、またはより厳密には、エラーの存在する尤度を、各リード中の特定の塩基の所与のクオリティスコアをコンピュータで計算でき、その後、この確率を（独立と仮定して）組み合わせて、その塩基に関するシーケンシングエラーの見込み数を推定することができる。結果として、異なるクオリティスコアを有する異なる塩基に関する、シーケンシングエラー仮説を拒絶する異なる閾値が存在する。例えば、１，０００コピー／１，０００，０００で存在するクロノタイプに関しては、少数派の変異体は、エラーの確率が、０．０１および０．０５であったとして、それぞれ２２および７４回検出される場合、独立であると指定される。

シーケンシングエラーの存在下で、真の各クロノタイプは、その配列に関する変動するエラー数を有するリードの「クラウド」に囲まれている。シーケンシングエラーの「クラウド」は、配列スペース中のクロノタイプから距離が増えるので、密度が減る。様々なアルゴリズムが、配列リードのクロノタイプへの変換に利用可能である。一態様において、配列リードの合体（すなわち、１以上のシーケンシングエラーを有することが決定された候補クロノタイプの統合）は、少なくとも３つの要因：比較されるクロノタイプそれぞれから得られる配列の数；異なる塩基の数；および塩基が不一致である位置におけるシーケンシングクオリティスコアに依存する。予測エラー比およびエラーの二項分布に基づく尤度比が構築され、評価され得る。例えば、一方は１５０個のリードを有し、他方は２個のリードを有し、それらの間にシーケンシングクオリティの低い範囲に１つの差がある２つのクロノタイプは、それらがシーケンシングエラーにより作製された可能性があるので、合体される可能性がある。他方で、一方は１００個のリードを有し、他方が５０個のリードを有し、それらの間に２つの相違がある２つのクロノタイプは、それらがシーケンシングエラーにより作製された可能性が低いと見なされるので、合体されない。本発明の一実施形態において、下記のアルゴリズムは、配列リードからクロノタイプを決定するために使用可能である。本発明の一態様において、配列リードはまず候補クロノタイプに変換される。このような変換は、用いるシーケンシングプラットフォームに依存する。高いＱスコア、長い配列リードを作製するプラットフォームに関しては、配列リードまたはこれらの一部は、候補クロノタイプとして直接取り込まれ得る。低いＱスコア、短い配列リードを作製するプラットフォームに関しては、関連する配列リードのセットを候補クロノタイプに変換するために、いくつかのアライメントおよびアセンブリステップが必要とされ得る。例えば、Ｓｏｌｅｘａベースのプラットフォームでは、いくつかの実施形態において、候補クロノタイプは、上記のように、複数のクラスタ、例えば１０以上からペアにされたリードのコレクションから作製される。

各候補クロノタイプを囲む配列リードのクラウドは、二項分布および単一の塩基エラーの確率のための単純モデルを使用してモデル化できる。この後者のエラーモデルは、ＶおよびＪセグメントのマッピングから、またはクロノタイプ発見アルゴリズムそれ自体から、自己一貫性および収束により推論することができる。モデルは、（配列Ｘに関して）リードカウントＣ２およびＥ個のエラーを有する所与の「クラウド」配列Ｙが、完璧なリードカウントＣ１を有する真のクロノタイプ配列Ｘの一部分である確率に関して、Ｘが、配列スペースのこの領域中の唯一の真のクロノタイプであるヌルモデルの下で構築される。判定は、パラメーターＣ１、Ｃ２およびＥに従って、配列ＹをクロノタイプＸに合体するかどうかに関してなされる。任意の所与のＣ１およびＥに関して、配列Ｙを合体する判定のための最大値Ｃ２があらかじめ計算される。Ｃ２の最大値は、ＹがクロノタイプＸの一部分であるというヌル仮説の下で、Ｙを合体しない確率が、配列Ｘの近隣にエラーＥを有するすべての可能性のある配列Ｙにわたって積分した後に、一定値Ｐ未満となるように選択される。値Ｐは、アルゴリズムの挙動を制御し、合体を多少寛容的にする。

配列Ｙが、そのリードカウントがクロノタイプＸに合体するための閾値Ｃ２を上回っているためにクロノタイプＸに合体されない場合、配列Ｙは別個のクロノタイプをシード（ｓｅｅｄ）するための候補となる。このような原理を実行するアルゴリズムは、この（Ｘとは独立であると見なされた）配列Ｙに「より近い」任意の他の配列Ｙ２、Ｙ３などが、Ｘに集約されないようにする。この「近さ（ｎｅａｒｎｅｓｓ）」のコンセプトは、ＹおよびＸに関するエラーカウントと、ＸおよびＹの絶対リードカウントの両方を含む、すなわち、このコンセプトは、クロノタイプＸの周囲のエラー配列のクラウドに関する上記のモデルと同じ様式でモデル化される。このようにして、「クラウド」配列は、それらが複数のクロノタイプの「近く」にあった場合に、それらの正確なクロノタイプに適切に帰属化させることができる。

一実施形態において、アルゴリズムは、最も高いリードカウントを有する配列Ｘから開始することにより、トップダウン様式で進行する。この配列は、第１のクロノタイプをシードする。隣接する配列は、それらのカウントがあらかじめ計算された閾値（上記を参照されたい）を下回る場合にこのクロノタイプに合体されるか、またはそれらが閾値を上回る、もしくは合体されなかった別の配列に「より近い」場合に放置されるかのいずれかである。最大エラーカウント内のすべての隣接する配列を検索した後、リードをクロノタイプＸに合体する過程が終了する。そのリードおよびそれに合体されたすべてのリードが考慮され、他のクロノタイプを作製するために利用可能なリードのリストから除外される。その後、最も高いリードカウントを有する次の配列に移行する。隣接するリードが、上記のようにしてこのクロノタイプに合体され、そしてこの過程は、所与の閾値を上回るリードカウントを有する配列がそれ以上存在しなくなるまで、例えば、１カウント超のすべての配列が、クロノタイプのシードとして使用されるまで継続される。

上記のように、上記のアルゴリズムの別の実施形態において、候補配列Ｙを既存のクロノタイプＸに合体するかどうかを決定するために、関連する配列リードのクオリティスコアを考慮するさらなる試験が追加され得る。配列ＹおよびＸが異なる場合、（１または複数の）配列Ｙについての（１または複数の）平均クオリティスコア（配列Ｙを有するすべてのリードの平均）が決定される。平均スコアが既定の値を上回る場合、その差は、合体されるべきではない真に異なるクロノタイプを示している可能性が高く、平均スコアがこのような既定の値を下回る場合、配列Ｙはシーケンシングエラーよるものであり、したがってＸに合体されるべきである可能性が高い。

関連するクロノタイプのクラン
高い頻度でリンパ球は関連するクロノタイプを生成する。すなわち、その配列が類似しているクロノタイプを生成する多様なリンパ球が存在または発達し得る。このことは、様々な機序、例えば、ＩｇＨ分子の場合、超突然変異によるものであり得る。別の例の場合、癌、例えばリンパ系新生物において、単一のリンパ球前駆体は（１または複数の）癌関連体細胞性突然変異、例えば、塩基の置換、異常な再構成などにより、それぞれがわずかに異なるＴＣＲまたはＢＣＲ、したがって、異なるクロノタイプを保持および／または発現する、多数の関連する子孫リンパ球を発生させ得る。このような関連するクロノタイプのセットは、本明細書において「クラン」と称される。場合により、クランのクロノタイプは、別のクランメンバーの突然変異から生じ得る。このような「子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）」クロノタイプは、系統学的クロノタイプと称され得る。クラン内のクロノタイプは、親クロノタイプとの、または互いの同系性の１以上の測定により同定することができる。一実施形態において、クロノタイプは、下記により詳細に記載するように、相同性のパーセントにより同じクラン中にグループ化することができる。別の実施形態において、クロノタイプは、Ｖ領域、Ｊ領域および／またはＮＤＮ領域の共通した利用により、あるクランに割り当てることができる。例えば、クランは、共通のＪおよびＮＤ領域を有するが、異なるＶ領域を有するクロノタイプにより定義することができ、またはクランは、同じＶおよびＪ領域（同一塩基置換突然変異を含む）を有するが、異なるＮＤＮ領域を有するクロノタイプにより定義することができ、またはクランは、クランのメンバーを作製するために１から１０塩基、または１から５塩基または１から３塩基の１以上の挿入および／または欠失を受けたクロノタイプにより定義することができる。別の実施形態において、クランのメンバーは、下記のように決定される。

クロノタイプが下記の基準：ｉ）クロノタイプが同じＶおよびＪ参照セグメントにマッピングされ、このマッピングがクロノタイプ配列の同じ相対位置で行われていること、およびｉｉ）クロノタイプのＮＤＮ領域が実質的に同一であることを満たした場合、クロノタイプは、同じクランに割り当てられる。クランのメンバーシップに対する言及における「実質的」は、ＮＤＮ領域における多少の小さな違いが、この領域において体細胞性突然変異が起こり得ることを踏まえて許容されることを意味する。好ましくは、一実施形態において、ＮＤＮ領域において突然変異を誤ってコールすることを避けるために、塩基置換が、癌関連変異として受諾されるかどうかは、クランのＮＤＮ領域のサイズに直接依存する。例えば、ある方法は、クランの（１または複数の）ＮＤＮ配列の長さがｍヌクレオチド以上、例えば９ヌクレオチド以上である場合であって、それが癌関連変異として（１または複数の）クランＮＤＮ配列と１塩基の違いを有する時に、このクロノタイプをクランメンバーとして受託することができ、そうでない場合は、受諾されず、またはクランの（１または複数の）ＮＤＮ配列の長さがｎヌクレオチド以上、例えば２０ヌクレオチド以上の場合であって、それが癌関連変異としてクランの（１または複数の）ＮＤＮ配列と２塩基の違いを有する時に、クロノタイプをクランメンバーとして受託することができ、そうでない場合は、受諾されない。別の実施形態において、クランのメンバーは、下記の基準：（ａ）Ｖリードが同じＶ領域にマッピングされること、（ｂ）Ｃリードが同じＪ領域にマッピングされること、（ｃ）ＮＤＮ領域が（上記のように）実質的に同一であること、および（ｄ）Ｖ−ＮＤＮ境界とＪ−ＮＤＮ境界との間のＮＤＮ領域の位置が同じであること（または同等に、Ｄの下流の塩基付加の数と、Ｄの上流の塩基付加の数が同じであること）を使用して決定される。単一試料のクロノタイプはクランにグループ化され、異なる時点において獲得された連続試料に由来するクランは、互いに比較され得る。特に、本発明の一態様において、疾患、例えばリンパ系新生物に相関するクロノタイプを含有するクランは、各試料のクロノタイプから同定され、疾患状態、例えば寛解の継続、再発の初期段階、さらなるクローン進化の証拠などを決定するために、その直前の試料のクロノタイプと比較される。本明細書において使用する場合、クランに対する言及において、「サイズ」はクラン中のクロノタイプの数を意味する。

上記のように、一態様において、本発明の方法は、個別のクロノタイプではなく、クロノタイプのクランのレベルをモニターする。これは、クローン進化の現象によるものであり、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０５：１３０８１−１３０８６（２００８）；Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０３：１１３９−１１４３（２０１０）を参照されたい。診断用試料中に存在するクローンの配列は、より最近の試料、例えば、疾患の再発において採取された試料中のクローンの配列と正確に同じままではないことがある。したがって、試料が診断用試料の配列と一致した正確なクロノタイプ配列に従った場合、再発の検出はできないと思われる。このような進化したクローンは、シーケンシングにより容易に検出および同定される。例えば、進化したクローンの多くは、Ｖ領域交換（ＶＨ交換と呼ばれる）により現れる。これらのタイプの進化したクローンは、プライマーが間違ったＶセグメントを標的とするので、リアルタイムＰＣＲ技術では見逃される。しかし、Ｄ−Ｊジャンクションが、進化したクローン中に無傷で留まるならば、進化したクローンは、空間的に単離された個別分子のシーケンシングを使用して、本発明において検出および同定することができる。さらに、診断用試料における適切な頻度のこれらの関連するクロノタイプの存在は、クロノタイプの関連性の尤度を上げる。同様に、免疫受容体配列における体細胞性超突然変異の発達は、リアルタイムＰＣＲのプローブ検出に干渉することがあるが、シーケンシングの読み取りに適用される適切なアルゴリズム（上で開示）は、クロノタイプを進化中のクロノタイプとしても認識することができる。例えば、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞性超突然変異は認識され得る。このことは、このクロノタイプを、最も近い生殖細胞系のＶおよびＪ配列にマッピングすることによって行われる。生殖細胞系配列との差は、体細胞性超突然変異に帰属し得る。したがって、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞性超突然変異により進化するクロノタイプは、容易に検出および同定することができる。ＮＤＮ領域における体細胞性超突然変異は予測可能である。残存するＤセグメントが、認識およびマッピングのために十分長い場合、その中のいずれの体細胞性突然変異も容易に認識され得る。Ｎ＋Ｐ塩基における（またはマッピング不可であるＤセグメントにおける）体細胞性超突然変異は、これらの配列が、癌性クロノタイプの子孫ではあり得ない新しい組換え細胞を改変することができるので、確実に認識することはできない。しかし、体細胞性突然変異によるものである塩基変化を同定するための、高い尤度を有するアルゴリズムは容易に構築される。例えば、ＮＤＮ領域において同じＶおよびＪセグメントおよび（１または複数の）元のクローンとの１塩基差を有するクロノタイプは、体細胞性組換えの結果である高い尤度を有する。ＶおよびＪセグメントにおいて他の体細胞性超突然変異が存在する場合、これは、この特定のクロノタイプを、体細胞性超突然変異の対象になったことがあるクロノタイプとして同定するので、この尤度は増加し得る。したがって、元々のクロノタイプからの体細胞性超突然変異の結果であるクロノタイプの尤度は、いくつかのパラメーター：ＮＤＮ領域における差の数、ＮＤＮ領域の長さおよびＶおよび／またはＪセグメントにおける他の体細胞性超突然変異の存在を使用して、コンピュータ計算することができる。

クローン進化のデータは、情報を得るところが多い。例えば、主要なクローンが進化したクローン（以前は不在であり、したがって以前は記録されていなかったクローン）である場合、これは、腫瘍が、潜在的な選択的利益を有する新しい遺伝子変化を獲得したことの表れである。これは、免疫細胞受容体の特定の変化が、選択的利益の原因であるということではなく、この変化は選択的利益のマーカーを提示し得るということである。クロノタイプが進化した腫瘍は、差次的な予後と潜在的に関連があると思われる。本発明の一態様において、リンパ系新生物などの疾患、例えば白血病の患者特有バイオマーカーとして使用される（１または複数の）クロノタイプは、モニターされた（１または複数の）クロノタイプの体細胞性突然変異体である、以前には記録されていないクロノタイプを含む。別の態様において、任意の以前には記録されていないクロノタイプが、患者特有のバイオマーカーとして機能している既存のクロノタイプまたはクロノタイプの群と少なくとも９０パーセント相同であれば常に、このような相同なクロノタイプは、モニターが進行しているクロノタイプまたはクロノタイプの群に含まれる。すなわち、１以上の患者特有のクロノタイプがリンパ系新生物において同定され、疾患を（例えば、低侵襲的に獲得された血液試料を測定することによって）定期的にモニターするために使用された場合、およびこのような測定の一過程において、最新セットのクロノタイプの体細胞性突然変異である新しい（以前に記録されていない）クロノタイプが検出された場合、このクロノタイプは、後続の測定のためにモニターされる患者特有のクロノタイプのセットに加えられる。一実施形態において、このような以前に記録されていないクロノタイプは、最新のセットのメンバーと少なくとも９０パーセント相同であり、患者に実施される次の試験のためのクロノタイプバイオマーカーの患者特有のセットに加えられる、すなわち、このような以前に記録されていないクロノタイプは、（クロノタイプデータの上記の分析に基づき）そのクロノタイプが由来したクロノタイプの最新のセットのメンバーのクランに含まれる。別の実施形態において、このような包含は、以前に記録されていないクロノタイプが、最新のセットのメンバーと少なくとも９５％パーセント相同である場合に実施される。別の実施形態において、このような包含は、以前に記録されていないクロノタイプが、最新のセットのメンバーと少なくとも９８％パーセント相同である場合に実施される。

ＮＤＮ領域を交換するが、ＶおよびＪセグメントがそれらの蓄積された突然変異に沿って保存される過程により細胞が進化する可能性もある。このような細胞は、共通のＶおよびＪセグメントが、十分な数の突然変異を含有し、独立した、派生の小さい、これらの突然変異の変化をもたらすならば、共通のＶおよびＪセグメントの同定により以前に記録されていない癌のクロノタイプとして同定することができる。さらなる制約は、ＮＤＮ領域が、以前にシーケンシングされたクローンと同様のサイズであることであり得る。

［実施例］
方法：本研究は、ＩＲＢにより承認され、患者からの同意が得られている。ユニバーサルプライマーセットを使用して、本発明者らは、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ＠）の可変、多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）および接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子セグメントを、初回診断において収集された腫瘍生検および末梢血試料（血漿および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）区画）中のゲノムＤＮＡから増幅した。増幅産物を、シーケンシングして、＞１００万のリード（＞１０×シーケンシングカバレッジ／ＩｇＨ分子）を得、クロノタイプ決定に関する標準化されたアルゴリズムを使用して分析した。腫瘍特異的クロノタイプを、リンパ節生検試料中のＢ細胞レパートリー内のそれらの高頻度に基づき、各患者に関して同定した。腫瘍特異的クロノタイプの存在を、その後診断用血液試料由来の無細胞およびＰＢＭＣ区画において定量した。診断用試料中のすべての白血球の中のクローンレベルの定量的および標準化測度を、内部参照ＤＮＡを使用して決定した。

結果：本発明者らは、高頻度ＩｇＨクローン再構成を、全部で５つのリンパ節生検試料において検出した。腫瘍生検において同定されたリンパ腫クロノタイプはまた、診断時に５人すべての患者において血漿および／またはＰＢＭＣ区画中に検出された。具体的には、リンパ腫クロノタイプが、４患者において血漿区画に検出され、一方３人の患者は、ＰＢＭＣ区画においてリンパ腫クロノタイプの存在を明示した（表１）。本発明者らは、血漿中の陽性リンパ腫クローンは、原発腫瘍の急速な増殖および壊死、リンパ腫の分解された成分の血流中への放出によるものと仮定する。しかし、この小さい試料サイズにおいて、本発明者らは、検出レベル（ＰＢＭＣまたは血漿）と臨床パラメーター（ＬＤＨ、病期段階、腫瘍サイズ、腫瘍Ｋｉ６７、細胞起源）との間の明らかな相関を観察しなかった。初回治療および４回の治療後に完全な応答を得たすべての患者が先に進む。本発明者らは、患者らが寛解中に血液標本の分析を計画する。

結論：ＩｇＨのクローン性再構成を、すべての腫瘍生検試料においてシーケンシングによって検出した。重要なことには、すべての末梢血試料が、診断時に血漿またはＰＢＭＣ区画のいずれかにおいて循環するリンパ腫物質の兆候を示した。追加のＤＬＢＣＬ患者由来の診断用試料および療法後試料の分析を進める。これらのデータは、シーケンシングアッセイが、療法への応答および再発のモニタリングに対する強力な指標となるかどうかを決定するものである。

本発明を、いくつかの特定の実施例、実施形態を参照して記載しているが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これらの実施例、実施形態に多数の変更がなされ得ることを認識しているものと思われる。本発明は、上記に加えて、様々なセンサの実行および他の主題に適用可能である。

定義
本明細書において他のことが特に定義されない限り、本明細書において使用する核酸化学、生化学、遺伝学および分子生物学の用語および記号は、当分野における標準的な論文およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５）；ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９）；Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版（Ｓａｕｎｄｅｒｓ、２００７）の用語および記号に従っている。

「アラインすること」とは、配列リードなどの試験配列を１以上の参照配列と比較して、どの参照配列が、または参照配列のどの部分が、何らかの配列距離尺度に基づいて最も近いのかを判定する方法を意味する。ヌクレオチド配列をアラインする例示的な方法は、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムである。距離尺度には、Ｈａｍｍｉｎｇ距離、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ距離などが含まれ得る。距離尺度は、比較される配列のヌクレオチドのクオリティ値に関連した構成要素を含み得る。

「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物；すなわち、一本鎖または二本鎖であってよく、１以上の出発配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団を意味する。１以上の出発配列は、同じ配列の１以上のコピーであってもよいし、またはそれらは異なる配列の混合物であってもよい。好ましくは、アンプリコンは、単一の出発配列の増幅によって形成される。アンプリコンは、その産物が１以上の出発核酸または標的核酸の複製物を含む、様々な増幅反応によって作製され得る。一態様において、アンプリコンを作製する増幅反応は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかである反応物の塩基ペアリングが、反応産物の創出に必要な相補体を鋳型ポリヌクレオチドにおいて有するという点で、「鋳型駆動型」である。一態様において、鋳型駆動型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長、または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチド連結である。このような反応としては、限定するものではないが、参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号（「ｔａｑｍａｎ」プローブによるリアルタイムＰＣＲ）；Ｗｉｔｔｗｅｒら、米国特許第６，１７４，６７０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）；Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号；Ａｏｎｏら、特開平４−２６２７９９（ローリングサークル増幅）などに開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線形ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅などが挙げられる。一態様において、本発明のアンプリコンはＰＣＲによって作製される。増幅反応の進行に伴った反応産物の測定を可能にする検出化学が利用可能な場合、増幅反応は「リアルタイム」増幅であってよく、例えば、以下に記載される「リアルタイムＰＣＲ」、またはＬｅｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６：２１５０−２１５５（１９８８）、および同様の参考文献に記載されているような「リアルタイムＮＡＳＢＡ」であってよい。本明細書において使用する場合、「増幅すること」という用語は、増幅反応の実施を意味する。「反応混合物」とは、反応を実施するために必要な反応物をすべて含有する溶液を意味し、この反応物には、限定するものではないが、反応中にｐＨを選択されたレベルに維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャーなどが含まれ得る。

本明細書において使用する場合、「クローン性」とは、あるレパートリーのクロノタイプの中でクロノタイプ存在量の分布が単一または数種のクロノタイプに偏っている度合いの尺度を意味する。大まかに言うと、クローン性はクロノタイプ多様性の逆の尺度である。多くの尺度または統計学が、本発明に従ったクローン性尺度に使用することができ、種と存在量の関係を説明する生態学、例えば、Ｐｉｅｌｏｕ、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙの第１７、１８章（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９６９）から利用できる。一態様において、本発明に使用されるクローン性尺度はクロノタイププロファイル（すなわち、検出される別個のクロノタイプの数およびそれらの存在量）の関数であり、したがって、クロノタイププロファイルを測定した後、そこからクローン性をコンピュータ計算して、単数を得ることができる。１つのクローン性尺度はＳｉｍｐｓｏｎの尺度であり、これは単純に、ランダムに選び出された２つのクロノタイプが同じである確率である。他のクローン性尺度には、情報ベースの尺度、およびＰｉｅｌｏｕ（上記で引用）に開示されているＭｃＩｎｔｏｓｈの多様性指数が含まれる。

「クロノタイプ」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはその一部分をコードする、Ｔ細胞またはＢ細胞の組換えヌクレオチド配列を意味する。一態様において、ある個体のあるリンパ球集団の別個のクロノタイプすべてのコレクションは、このような集団の１つのレパートリーであり；例えば、Ａｒｓｔｉｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：９５８−９６１（１９９９）；Ｙａｓｓａｉら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、６１：４９３−５０２（２００９）；Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５（３）：６０７−６１８（２００８）などを参照されたい。本明細書において使用する場合、「クロノタイププロファイル」または「レパートリープロファイル」とは、レパートリーのクロノタイプおよびそれらの相対存在量の実質的にすべてを含めた、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の試料（このような細胞を含有する末梢血試料など）のクロノタイプの集計である。「クロノタイププロファイル」、「レパートリープロファイル」、および「レパートリー」は、本明細書において互換的に使用される。（すなわち、以下にさらに詳述する「レパートリー」という用語は、リンパ球の試料から測定されるレパートリーを意味する）。本発明の一態様において、クロノタイプは、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）またはＴＣＲβ鎖の一部分を含む。本発明の他の態様において、クロノタイプは、免疫グロブリン軽鎖もしくはＴＣＲα鎖またはそれらの一部分などの他の組換え分子に基づき得る。

「合体させること」とは、配列相違のある２つの候補クロノタイプを、このような相違が実験的エラーまたは測定エラーによるものであり、真の生物学的相違によるものではないと判定することにより、同じものとして扱うことを意味する。一態様において、より高頻度の候補クロノタイプの配列をより低頻度の候補クロノタイプの配列と比較し、所定の基準が満たされる場合に、より低頻度の候補クロノタイプの数をより高頻度の候補クロノタイプの数に加え、より低頻度の候補クロノタイプをその後無視する。すなわち、より低頻度の候補クロノタイプと関連したリードカウントは、より高頻度の候補クロノタイプのリードカウントに加えられる。

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とは、免疫グロブリン（すなわち、抗体）またはＴ細胞受容体の領域を意味するものであり、この領域において分子は抗原の立体構造を補完し、それによって分子の特異性を決定し、特定の抗原と接触する。Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンはそれぞれ、３つのＣＤＲを有する：ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は可変（Ｖ）ドメイン中に見出され、ＣＤＲ３は、Ｖの一部、多様部（Ｄ）（重鎖のみ）および結合部（Ｊ）のすべて、ならびに定常（Ｃ）ドメインの一部を含む。

「リンパ系新生物」とは、悪性または非悪性であってよいリンパ球の異常な増殖を意味する。リンパ系癌とは、悪性のリンパ系新生物である。リンパ系新生物は、限定するものではないが、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、移植後のリンパ球増殖障害、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫などを含むリンパ球増殖障害の結果であるか、またはそれに付随し、例えば、Ｊａｆｆｅら、Ｂｌｏｏｄ、１１２：４３８４−４３９９（２００８）；Ｓｗｅｒｄｌｏｗら、ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ（第４版）（ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００８）を参照されたい。

「微小残存病変」とは、治療後に残存する癌細胞を意味する。この用語は、リンパ腫および白血病の治療に関連して最も頻繁に使用される。

参照配列および別の配列（「比較配列」）との比較に関して使用される「相同性パーセント（Ｐｅｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」、「同一性パーセント」などの用語は、２つの配列の間の最適なアライメントにおいて、比較配列が、示される百分率に等しいサブユニット位置の数において参照配列と同一であることを意味し、このサブユニットは、ポリヌクレオチド比較に関してはヌクレオチドであり、またはポリペプチド比較に関してはアミノ酸である。本明細書において使用する場合、比較される配列の「最適なアライメント」とは、サブユニット間の一致を最大にし、アライメントの構築において用いられるギャップの数を最小にするアライメントである。同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３−４５３（１９７０）（「ＧＡＰ」ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などによって記載されているようなアルゴリズムの市販されている実行によって決定することができる。アライメントを構築し、同一性の百分率または類似性の他の尺度を算出するための、当分野における他のソフトウェアパッケージとしては、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２−４８９（１９８１）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のアルゴリズムに基づく「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムが挙げられる。言い換えれば、例えば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５パーセント同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５パーセントまでが欠失されるか、もしくは別のヌクレオチドで置換されてよく、または参照配列中の全ヌクレオチド数の５パーセントまでのヌクレオチド数が参照配列中に挿入されてよい。

「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による、特定のＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を意味する。言い換えると、ＰＣＲは、プライマー結合部位によって挟まれた標的核酸の複数のコピーまたは複製物を作製するための反応であり、このような反応は以下：（ｉ）標的核酸を変性させるステップ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせるステップ、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させるステップの１回以上の反復を含む。通常、反応は、サーマルサイクラー装置において、各ステップに最適化された異なる温度の間で繰り返される。特定の温度、各ステップにおける持続時間、およびステップ間の変化の速度は、当業者に周知の多くの要因に依存し、例えば参考文献、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、編、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ａｎｄ ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、それぞれ１９９１および１９９５）によって例示される。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる従来のＰＣＲでは、＞９０℃の温度で二本鎖標的核酸が変性され得、５０から７５℃の範囲の温度でプライマーがアニーリングされ得、そして７２〜７８℃の範囲の温度でプライマーが伸長され得る。「ＰＣＲ」という用語は、限定するものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重ＰＣＲなどを含む、該反応の派生形態を包含する。反応容量は、数百ナノリットル、例えば２００ｎＬから数百μＬ、例えば２００μＬの範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、標的ＲＮＡを相補的な一本鎖ＤＮＡへと変換する逆転写反応が先行し、次いで増幅が行われるＰＣＲを意味し、例えば、Ｔｅｃｏｔｔら、米国特許第５，１６８，０３８号を参照されたく、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応の進行と共に反応生成物、すなわちアンプリコンの量がモニターされるＰＣＲを意味する。主に反応産物のモニタリングに使用される検出化学が異なる多くの形態のリアルタイムＰＣＲが存在し、例えば、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号（「ｔａｑｍａｎ」）；Ｗｉｔｔｗｅｒら、米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号（インターカレーター性色素）；Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコン）を参照されたく、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる。リアルタイムＰＣＲのための検出化学は、Ｍａｃｋａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：１２９２−１３０５（２００２）において概説されており、該文献もまた参照により本明細書に組み込まれる。「ネステッドＰＣＲ」とは、第１ＰＣＲのアンプリコンが、プライマーの新たなセットを使用する第２ＰＣＲのための試料となる二段階ＰＣＲを意味し、そのセットのうちの少なくとも一方は第１アンプリコンの内部の位置に結合する。本明細書において使用する場合、ネステッド増幅反応に関する「初期プライマー」とは、第１アンプリコンを生成するために使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」とは、第２または入れ子アンプリコンを作製するために使用される１以上のプライマーを意味する。「多重ＰＣＲ」とは、複数の標的配列（または単一の標的配列および１以上の参照配列）が同じ反応混合物中で同時に行われるＰＣＲを意味し、例えば、Ｂｅｒｎａｒｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７３：２２１−２２８（１９９９）（２色リアルタイムＰＣＲ）を参照されたい。通常、増幅される各配列について、プライマーの別個のセットが用いられる。典型的には、多重ＰＣＲにおける標的配列の数は、２から５０、または２から４０、または２から３０の範囲内である。「定量的ＰＣＲ」とは、試料または標本中の１つ以上の特定の標的配列の存在量を測定するために設計されたＰＣＲを意味する。定量的ＰＣＲは、このような標的配列の絶対的な定量および相対的な定量の両方を含む。定量的な測定は、標的配列と別々にまたは共にアッセイされ得る１以上の参照配列または内部標準を使用してなされる。参照配列は、試料または標本にとって内因性であっても外因性であってもよく、後者の場合には、１以上の競合鋳型を含んでもよい。典型的な内因性の参照配列には、下記：β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β_２−ミクログロブリン、リボソームＲＮＡなどの遺伝子の転写物のセグメントが含まれる。定量的ＰＣＲのための技法は当業者に周知であり、参照により組み込まれる以下の参考文献：Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６：１１２−１２６（１９９９）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：９４３７−９４４７（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２１：２６８−２７９（１９９６）；Ｄｉｖｉａｃｃｏら、Ｇｅｎｅ、１２２：３０１３−３０２０（１９９２）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：９４３７−９４４６（１９８９）などにおいて例示される。

「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型との二重鎖の形成において、核酸合成の開始点として働くことができ、伸長された二重鎖が形成されるように、鋳型に沿ってその３’末端から伸長され得る、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼを用いて実施される。伸長過程において付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用する線形増幅反応、または２以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用に関してプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込まれる下記の参考文献：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、編、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００３）によって明らかなように、当業者に周知である。

「クオリティスコア」とは、特定の配列位置における塩基の割り当てが正しい確率についての尺度を意味する。特定の状況、例えば、異なるシーケンシング化学、検出システム、塩基コールアルゴリズムなどの結果としてコールされる塩基に関するクオリティスコアを計算するための様々な方法が、当業者に周知である。概して、クオリティスコア値は、正しい塩基コールの確率に単調に関連している。例えば、クオリティスコアまたはＱが１０であれば、塩基が正しくコールされる可能性が９０パーセントあることを意味し得、Ｑが２０であれば、塩基が正しくコールされる可能性が９９パーセントあることを意味し得る。いくつかのシーケンシングプラットフォーム、特に合成時解読化学を使用するシーケンシングプラットフォームでは、平均クオリティスコアは配列リードの長さに応じて低下し、その結果、配列リードの始めのクオリティスコアは配列リードの終わりのクオリティスコアよりも高く、このような低下は、不完全な伸長、フォワード伸長の実施、鋳型の喪失、ポリメラーゼの喪失、キャップ形成の失敗、脱保護の失敗などの現象によるものである。

本明細書において使用する場合、「レパートリー」または「免疫レパートリー」とは、ある個体のあるリンパ球集団中の、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）またはこれらの断片それぞれをコードする別個の組換えヌクレオチド配列のセットを意味し、該セットのヌクレオチド配列は、該集団のリンパ球の実質的にすべてについて、別個のリンパ球またはそれらのクローン亜集団と１対１の対応を有する。一態様において、レパートリーが決定されるリンパ球集団は、１以上の組織試料、例えば１以上の血液試料から採取される。レパートリーのメンバーヌクレオチド配列は、本明細書において「クロノタイプ」と称される。一態様において、レパートリーのクロノタイプは、ＢＣＲの発達中に体細胞性組換えを起こしたＢ細胞集団に共通する核酸の任意のセグメントを含み、これには正常なまたは異常な（例えば、癌と関連する）これらの前駆体分子が含まれ、限定するものではないが、下記：免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）またはこのサブセット（例えば、ＩｇＨ可変領域、ＣＤＲ３領域など）、不完全なＩｇＨ分子、免疫グロブリン軽鎖またはそのサブセット（例えば、可変領域、ＣＤＲ領域など）、ＣＤＲ（ＢＣＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３、またはこのようなＣＤＲの組み合わせを含む）、ＢＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域、ＩｇＨ可変領域の超変異領域などのうちのいずれかが含まれる。一態様において、レパートリーのクロノタイプを規定する核酸セグメントは、それらの多様性（すなわち、セット中の別個の核酸配列の数）が十分に高く、したがって個体中の実質的にすべてのＢ細胞またはこのクローンがこのようなレパートリーの特有の核酸配列を保有するように選択される。すなわち、本発明に従って、施術者は、Ｂ細胞の集団の完全な多様性を反映しない、ＢＣＲをコードする組換え核酸の特定のセグメントまたは領域を、クロノタイプを規定するために選択してもよいが、好ましくは、クロノタイプは、それらの由来元であるＢ細胞の集団の多様性を反映しないように規定される。すなわち、好ましくは、試料の異なるクローンはそれぞれ異なるクロノタイプを有する。（当然ながら、いくつかの適用においては、白血病またはリンパ腫患者由来の試料の場合のように、プロファイル内には１以上の特定のクロノタイプの複数のコピーが存在する）。本発明の他の態様において、レパートリーに対応するリンパ球集団は、循環Ｂ細胞、または細胞表面マーカーによって規定される他の亜集団などであってよい。このような亜集団は、特定の組織、例えば骨髄もしくはリンパ節などから試料を採取することによって、または１以上の細胞表面マーカー、サイズ、形態などに基づいて試料（末梢血など）から細胞を選別もしくは濃縮することによって獲得され得る。さらなる他の態様において、レパートリーに対応するリンパ球集団は、腫瘍組織、感染組織などの疾患組織に由来し得る。一実施形態において、ヒトＩｇＨ鎖またはこれらの断片を含むレパートリーは、０．１×１０^６から１．８×１０^６種の範囲、または０．５×１０^６から１．５×１０^６種の範囲、または０．８×１０^６から１．２×１０^６種の範囲内の多数の別個のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、本発明のレパートリーは、ＩｇＨ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。一態様において、本明細書において使用する場合「実質的にすべての」とは、０．００１パーセント以上の相対存在量を有するすべてのセグメントを意味し、別の態様において、本明細書において使用する場合「実質的にすべての」とは、０．０００１パーセント以上の相対存在量を有するすべてのセグメントを意味する。別の特定の実施形態において、本発明のレパートリーは、ＴＣＲβ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的にすべてのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態において、本発明のレパートリーは、２５から２００ヌクレオチドの範囲の長さを有し、ＩｇＨ鎖のＶ、Ｄ、およびＪ領域のセグメントを含むヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態において、本発明のレパートリーは、別個のＩｇＨ鎖を発現するリンパ球の数と実質的に等しい多数の別個のヌクレオチド配列を含む。さらなる別の実施形態において、「実質的に等しい」とは、ヌクレオチド配列のレパートリーが、ある個体のある集団の、０．００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのリンパ球によって保有または発現される、ＩｇＨまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を、９９パーセントの確率で含むことを意味する。さらなる別の実施形態において、「実質的に等しい」とは、ヌクレオチド配列のレパートリーが、０．０００１パーセント以上の頻度で存在するすべてのリンパ球によって保有または発現される、ＩｇＨまたはこの一部分をコードするヌクレオチド配列を、９９パーセントの確率で含むことを意味する。前述の２文に記載されるクロノタイプのセットは、本明細書において、ＩｇＨ配列の「完全なレパートリー」を表現すると見なされる場合がある。上記のように、クロノタイププロファイル（またはレパートリープロファイル）を測定または作製する場合には、このようなプロファイルが、特定の適用に対してレパートリーのかなり正確な表現を提供するように、十分に多量のリンパ球の試料が得られる。一態様において、特に１から１０ｍＬの末梢血試料から得られる場合、１０^５から１０^７個のリンパ球を含む試料が用いられる。

「配列リード」とは、シーケンシング技術によって作製された一連のデータまたはデータストリームから決定されたヌクレオチドの配列を意味し、この決定は、例えば、この技術と関連した塩基コーリングソフトウェア、例えばＤＮＡシーケンシングプラットフォームの商業的供給業者による塩基コーリングソフトウェアを用いてなされる。配列リードは通常、配列内の各ヌクレオチドに関するクオリティスコアを含む。典型的には、配列リードは、例えばＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを用いて、鋳型核酸に沿ってプライマーを伸長させることによって作られる。データは、このような伸長に付随する光学的、化学的（例えば、ｐＨ変化）、または電気的シグナルなどのシグナルを記録することによって生成される。このような初期データが配列リードに変換される。

Claims (19)

1. 患者においてびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）疾患をモニタリングする方法であって、
   （ａ）診断用試料から、前記ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプを決定するステップ；
   （ｂ）前記患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血試料を得るステップ；
   （ｃ）前記末梢血試料の前記Ｂ細胞および／または無細胞核酸から、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む核酸分子またはこれらから転写された核酸分子を増幅させるステップ；
   （ｄ）前記増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに
   （ｅ）前記クロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプ（これらのこれまでの系統学的クロノタイプを含む）の存在の有無および／またはレベルを決定するステップ
   を含む方法。
2. 前記診断用試料が末梢血試料である、請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸分子が、前記末梢血試料の無細胞分画に由来する、請求項２に記載の方法。
4. 前記診断用試料が腫瘍試料である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ステップ（ｂ）から（ｅ）を反復し、前記患者においてＤＬＢＣＬ残存病変をモニターするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記末梢血試料由来の前記クロノタイププロファイルがそれぞれ、０．１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記末梢血試料由来の前記クロノタイププロファイルがそれぞれ、０．０１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で含む、請求項５に記載の方法。
8. 前記増幅させるステップにおいて、少なくとも１０^５のＢ細胞を含む末梢血試料由来の前記核酸分子を増幅させることを含む、請求項５に記載の方法。
9. 前記増幅させるステップにおいて、少なくとも１０^６のＢ細胞を含む末梢血試料由来の前記核酸分子を増幅させることを含む、請求項５に記載の方法。
10. ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプにより、患者においてびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）をモニタリングする方法であって、
    （ａ）前記患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血試料を得るステップ；
    （ｂ）前記末梢血試料から核酸試料を抽出するステップ；
    （ｃ）前記核酸試料から、ＩｇＨのＶＤＪ領域またはその一部をコードする核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応において増幅するステップ；
    （ｃ）前記増幅された核酸分子をシーケンシングして、クロノタイププロファイルを形成するステップ；ならびに
    （ｄ）前記クロノタイププロファイルから、ＤＬＢＣＬと相関関係がある１以上の患者特有のクロノタイプのそれぞれのレベルであって、このような１以上の患者特有のクロノタイプのそれぞれの系統学的クロノタイプを含むレベルを決定するステップ
    を含む方法。
11. 前記シーケンシングするステップが、各クロノタイプの配列を決定するための、２０から４００ヌクレオチドの範囲の配列リードを作製することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１以上の患者特有のクロノタイプの前記レベルに基づき、骨髄を移植することによって前記患者を治療するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記移植が、前記１以上の患者特有のクロノタイプおよびこれらの系統学的クロノタイプの前記レベルが、診断用試料中の前記１以上の患者特有のクロノタイプのレベルの５０パーセントを超えているかどうかに関わらず実施される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記患者においてＤＬＢＣＬ残存病変をモニターするために、前記ステップ（ａ）から（ｄ）を反復するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
15. 前記末梢血試料由来の前記クロノタイププロファイルがそれぞれ、０．１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記末梢血試料由来の前記クロノタイププロファイルがそれぞれ、０．０１パーセント以上の頻度で存在するすべてのクロノタイプを９９パーセントの確率で含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記増幅させるステップにおいて、少なくとも１０^５のＢ細胞を含む、末梢血試料由来の前記核酸分子を増幅することを含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記増幅させるステップにおいて、少なくとも１０^６のＢ細胞を含む、末梢血試料由来の前記核酸分子を増幅することを含む、請求項１４に記載の方法。
19. 前記末梢血試料を得る前記ステップが、前記末梢血試料の顆粒球を枯渇させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

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