JP2015527369A - アミロイド、タウおよびα−シヌクレインの沈着に関連する疾患に関する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

１つまたはそれより多くの免疫原を含む組成物であって、各免疫原が少なくとも２つの領域を含み、一方の領域が少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープもしくはその組み合わせを含み、第２の領域が少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープ、通常は複数の外来Ｔｈエピトープを含む、組成物を開示する。組成物を作製および使用する方法も開示する。

Description

合衆国政府によって支援された研究または開発に関する陳述
アメリカ国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ＡＧ２０２４１、Ｒ０１ＮＳ０５０８９５およびＲ０１ＮＳ０５７３９５の下で合衆国政府の支援を受けた。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。

配列表への言及
本出願に関連する配列表を、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。配列表を含むテキストファイル名は、ＮＩ２０２ＰＣＴ＿ｓｅｑ−ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは２１，８６３バイトであり、２０１３年８月２０日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出される。

発明の分野
本発明は、アルツハイマー病および他のニューロパシーに有効なワクチンの作製のための組成物および方法に関する。

背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者における認知症の最も一般的な形態である。ＡＤは、進行性の記憶喪失、行動障害、および認知機能の低下によって臨床的に特徴づけられる。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、全世界でおよそ１８００万人がアルツハイマー病に罹患している。２０２５年までに、この推定値は３４００万人に増加する見通しであり、発展途上国で最も増加すると予想される。

ＡＤおよび他の神経変性疾患の神経病理学的な特徴には、神経原線維変化、ミスフォールドしたタンパク質の斑状沈着、および罹患脳領域内のニューロンの欠損が含まれる。これらの病理学的変化により、疾患の経過の間にニューロンおよびシナプスが顕著に欠損することとなり、それにより、患者の機能的能力の進行性の低下の一因となる。

概要
本明細書中に開示の組成物は、少なくとも１つの免疫原を含み、ここで、それぞれの少なくとも１つの免疫原が領域Ｂにカップリングした領域Ａを含み、ここで、領域Ａが、少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと、少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと、少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせを含み、領域Ｂが複数の外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む。別の態様では、組成物は、少なくとも２つの免疫原を含み、ここで、各免疫原は異なる。

いくつかの実施形態では、免疫原は、領域Ａと領域Ｂとの間にリンカードメインを含む。他の実施形態では、免疫原は、各エピトープの間にリンカードメインを含む。いくつかの実施形態では、領域の順序はＡ−Ｂであり、他の実施形態では、順序はＢ−Ａである。

いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントもしくは薬学的賦形剤、またはその両方をさらに含む。

別の態様では、組成物は、免疫原をコードする少なくとも１つの核酸分子を含み、ここで、免疫原は、少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、および少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む。

この組成物は、被験体に免疫原を投与する工程を含む、免疫応答を生じる必要のある被験体において免疫応答を生じるために使用される。免疫応答を生じる必要のある被験体は、アルツハイマー病または異常なアミロイド沈着物、Ｔａｕ沈着物、およびα−ｓｙｎ沈着物に関連する１つ以上の容態の発症リスクがあり得るか、前記疾患または容態と診断されている。この組成物は、有効量の免疫原を免疫応答を生じる必要のある被験体に投与する工程を含む、アミロイド、タウ、および／またはα−ｓｙｎの沈着物に関連する容態を防止、処置、または回復（ameliorate）するために使用することができる。

図１は、エピトープワクチンの作用機構を示す。アジュバントおよび送達系は、ワクチンの免疫系への効率的な送達を補助する。抗原提示細胞は、送達されたワクチンを取り込んでワクチン内に組み込まれたＴｈエピトープに特異的なＴヘルパー細胞に抗原を提示する。Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体によってワクチンの活性成分（Ｂ細胞エピトープ）を認識し（活性化のための第１のシグナル）、同時に、ワクチンのＴｈエピトープをＡＰＣによって活性化された同一のＴヘルパー細胞に提示してＢ細胞／Ｔ細胞シナプスを作製する。したがって、Ａβ_１１に特異的なＢ細胞がＢ細胞受容体を介して抗原に結合し（第１のシグナル）、活性化Ｔｈ細胞の支援を受ける（第２のシグナル）。この方法で活性されたＢ細胞は、特異的抗体を産生し始める。 図２は、例示的なワクチンのデザインを示す。（Ａ）種々のエピトープワクチン型をコードする構築物の略図。親構築物（ｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥ）を、９個（ＡＶ−１９５５）または１２個（ＡＶ−１９５９）の異なる無差別外来Ｔｈ細胞エピトープと融合され、これらがそれぞれ数個のアミノ酸を有する中性スペーサー（例えば、グリシン−セリンスペーサー）によって分離されている同一の３コピーの活性成分（Ａβ_１１Ｂ細胞エピトープ（遊離Ｎ末端アスパラギン酸を有する１つのエピトープ））を発現するように改変した。かかる構築物を使用して、適切な組換えタンパク質を生成することができる。（Ｂ）ＡＶ−１９５５ワクチンおよびＡＶ−１９５９ワクチンのＴｈエピトープストリング（集合的にＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームと命名する）を形成する種々のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの起源および配列。 図２は、例示的なワクチンのデザインを示す。（Ａ）種々のエピトープワクチン型をコードする構築物の略図。親構築物（ｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥ）を、９個（ＡＶ−１９５５）または１２個（ＡＶ−１９５９）の異なる無差別外来Ｔｈ細胞エピトープと融合され、これらがそれぞれ数個のアミノ酸を有する中性スペーサー（例えば、グリシン−セリンスペーサー）によって分離されている同一の３コピーの活性成分（Ａβ_１１Ｂ細胞エピトープ（遊離Ｎ末端アスパラギン酸を有する１つのエピトープ））を発現するように改変した。かかる構築物を使用して、適切な組換えタンパク質を生成することができる。（Ｂ）ＡＶ−１９５５ワクチンおよびＡＶ−１９５９ワクチンのＴｈエピトープストリング（集合的にＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームと命名する）を形成する種々のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの起源および配列。 図３は、ウェスタンブロットの写真である。ＡＶ−１９５５におけるシグナル配列の正確な切断およびＡβ_１１の第１のコピー中の遊離Ｎ末端アスパラギン酸の生成を、ＩＰ／ＷＢによってｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥ−ＴｈｅｐでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の馴化培地（ＣＭ）（レーン１）およびＡＶ−１９５５でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の馴化培地（ＣＭ）（レーン２）において分析した。両タンパク質を６Ｅ１０モノクローナル抗体（Ｍａｂ）で免疫沈降させ、ブロットを、６Ｅ１０（Ａ）またはＡβペプチドのＮ末端に特異的なウサギ抗体（Ｂ）で染色した。 図３は、ウェスタンブロットの写真である。ＡＶ−１９５５におけるシグナル配列の正確な切断およびＡβ_１１の第１のコピー中の遊離Ｎ末端アスパラギン酸の生成を、ＩＰ／ＷＢによってｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥ−ＴｈｅｐでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の馴化培地（ＣＭ）（レーン１）およびＡＶ−１９５５でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の馴化培地（ＣＭ）（レーン２）において分析した。両タンパク質を６Ｅ１０モノクローナル抗体（Ｍａｂ）で免疫沈降させ、ブロットを、６Ｅ１０（Ａ）またはＡβペプチドのＮ末端に特異的なウサギ抗体（Ｂ）で染色した。 図４は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンＡＶ−１９５９、ＡＶ−１９５５、およびｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥを使用した遺伝子銃によるマウスの免疫の結果を示す。（Ａ）１０^６個の脾細胞あたりのＩＦＮγＳＦＣとして測定した細胞応答；（Ｂ）抗Ａβ抗体濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定した体液性免疫応答。 図４は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンＡＶ−１９５９、ＡＶ−１９５５、およびｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥを使用した遺伝子銃によるマウスの免疫の結果を示す。（Ａ）１０^６個の脾細胞あたりのＩＦＮγＳＦＣとして測定した細胞応答；（Ｂ）抗Ａβ抗体濃度（μｇ／ｍＬ）によって測定した体液性免疫応答。 図５は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンＡＶ−１９５９での免疫の結果を示すグラフを示す。（Ａ）細胞性免疫応答は、ワクチンに組み込まれたＴｈエピトープに特異的であるが、Ａβ_４０には特異的ではない、および（Ｂ、Ｃ）マウス、ウサギ、およびサルにおける抗Ａβ抗体。 図５は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンＡＶ−１９５９での免疫の結果を示すグラフを示す。（Ａ）細胞性免疫応答は、ワクチンに組み込まれたＴｈエピトープに特異的であるが、Ａβ_４０には特異的ではない、および（Ｂ、Ｃ）マウス、ウサギ、およびサルにおける抗Ａβ抗体。 図５は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンＡＶ−１９５９での免疫の結果を示すグラフを示す。（Ａ）細胞性免疫応答は、ワクチンに組み込まれたＴｈエピトープに特異的であるが、Ａβ_４０には特異的ではない、および（Ｂ、Ｃ）マウス、ウサギ、およびサルにおける抗Ａβ抗体。 図６は、治療効力を示すＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種したアカゲザルの結果を示す。ワクチン接種したサルの血清から精製した抗Ａβ抗体は、ＡＤ脳内の皮質斑に結合し（Ａ）、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した場合、固定化されたＡβ_４２モノマー形態、オリゴマー形態、または小繊維形態に結合する（Ｂ）が、無関係のサルＩｇＧは結合しない。抗Ａβ抗体は、Ａβ_４２小線維およびオリゴマー媒介性の神経毒性を阻害する（Ｃ）。 図６は、治療効力を示すＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種したアカゲザルの結果を示す。ワクチン接種したサルの血清から精製した抗Ａβ抗体は、ＡＤ脳内の皮質斑に結合し（Ａ）、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した場合、固定化されたＡβ_４２モノマー形態、オリゴマー形態、または小繊維形態に結合する（Ｂ）が、無関係のサルＩｇＧは結合しない。抗Ａβ抗体は、Ａβ_４２小線維およびオリゴマー媒介性の神経毒性を阻害する（Ｃ）。 図６は、治療効力を示すＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種したアカゲザルの結果を示す。ワクチン接種したサルの血清から精製した抗Ａβ抗体は、ＡＤ脳内の皮質斑に結合し（Ａ）、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した場合、固定化されたＡβ_４２モノマー形態、オリゴマー形態、または小繊維形態に結合する（Ｂ）が、無関係のサルＩｇＧは結合しない。抗Ａβ抗体は、Ａβ_４２小線維およびオリゴマー媒介性の神経毒性を阻害する（Ｃ）。 図７は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種したＡＰＰ／Ｔｇマウスから得たデータを示す。（Ａ）誘導された抗Ａβ_１１抗体は、６Ｅ１０での染色によって検出された散在性および高密度コアＡβ−斑、およびＴｈＳでの染色によって検出された高密度コア斑（Ａ）、ならびに生化学的方法によって検出された可溶性および不溶性のＡβ（Ｂ）を有意に減少させた。 図７は、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種したＡＰＰ／Ｔｇマウスから得たデータを示す。（Ａ）誘導された抗Ａβ_１１抗体は、６Ｅ１０での染色によって検出された散在性および高密度コアＡβ−斑、およびＴｈＳでの染色によって検出された高密度コア斑（Ａ）、ならびに生化学的方法によって検出された可溶性および不溶性のＡβ（Ｂ）を有意に減少させた。 図８は、再刺激後のＴ細胞応答を示す。Ｈ２ｂハプロタイプの近交系マウスに、ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＶ−１９５９ワクチンをワクチン接種し、このワクチン由来の異なるエピトープにてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。 図９は、免疫後の異なるＴｈ細胞エピトープに対する個別の非近交系マカクの応答を示す。（Ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多型性が高い非近交系マカクにおけるＴｈ細胞エピトープのマッピング。（Ｂ）は、ＮＨＰ集団内のＴｈエピトープの出現率の分析を示す。 図９は、免疫後の異なるＴｈ細胞エピトープに対する個別の非近交系マカクの応答を示す。（Ａ）ＭＨＣクラスＩＩ多型性が高い非近交系マカクにおけるＴｈ細胞エピトープのマッピング。（Ｂ）は、ＮＨＰ集団内のＴｈエピトープの出現率の分析を示す。 図１０は、既存のＴｈ細胞の免疫学的潜在性を示す実験デザイン（Ａ）の略図および結果を示す。ｍｕｌｔｉ−ＴＥＰタンパク質を含むＱｕｉｌＡまたはＱｕｉｌＡのみで免疫し、ＡＶ−１９５９で追加免疫した後の（Ｂ）細胞応答および（Ｃ）体液性応答。 図１０は、既存のＴｈ細胞の免疫学的潜在性を示す実験デザイン（Ａ）の略図および結果を示す。ｍｕｌｔｉ−ＴＥＰタンパク質を含むＱｕｉｌＡまたはＱｕｉｌＡのみで免疫し、ＡＶ−１９５９で追加免疫した後の（Ｂ）細胞応答および（Ｃ）体液性応答。 図１０は、既存のＴｈ細胞の免疫学的潜在性を示す実験デザイン（Ａ）の略図および結果を示す。ｍｕｌｔｉ−ＴＥＰタンパク質を含むＱｕｉｌＡまたはＱｕｉｌＡのみで免疫し、ＡＶ−１９５９で追加免疫した後の（Ｂ）細胞応答および（Ｃ）体液性応答。 図１１は、免疫優性Ｂ細胞エピトープのマッピングのために使用したα−ｓｙｎの重複ペプチドを示す（Ａ）。ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに融合したα−ｓｙｎＢ細胞エピトープに基づいたエピトープワクチンの略図（Ｂ）。 図１１は、免疫優性Ｂ細胞エピトープのマッピングのために使用したα−ｓｙｎの重複ペプチドを示す（Ａ）。ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに融合したα−ｓｙｎＢ細胞エピトープに基づいたエピトープワクチンの略図（Ｂ）。 図１２は、α−シヌクレインエピトープベースのワクチンをワクチン接種したマウスにおける免疫応答のデータを示す。（Ａ）α−Ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰまたは無関係のペプチドでの免疫後の抗体濃度。（Ｂ）ＭｕｌｔｉＴＥＰに対する細胞応答およびα−シヌクレインに対する細胞応答。 図１２は、α−シヌクレインエピトープベースのワクチンをワクチン接種したマウスにおける免疫応答のデータを示す。（Ａ）α−Ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰまたは無関係のペプチドでの免疫後の抗体濃度。（Ｂ）ＭｕｌｔｉＴＥＰに対する細胞応答およびα−シヌクレインに対する細胞応答。 図１３は、α−シヌクレインの異なる部分に対する抗体応答を示す。マウスを、α−シヌクレインのＫ_１０ＡＫＥＧ_１４カルパイン切断部位に基づいたエピトープワクチン（α−Ｓｙｎ_{１０−１４}−ＭｕｌｔｉＴＥＰ）で免疫した（Ａ）。α−Ｓｙｎ_{１０−１８}ペプチドへの抗体結合（Ｂ）および全長α−シヌクレインタンパク質への抗体結合（Ｃ）。 図１３は、α−シヌクレインの異なる部分に対する抗体応答を示す。マウスを、α−シヌクレインのＫ_１０ＡＫＥＧ_１４カルパイン切断部位に基づいたエピトープワクチン（α−Ｓｙｎ_{１０−１４}−ＭｕｌｔｉＴＥＰ）で免疫した（Ａ）。α−Ｓｙｎ_{１０−１８}ペプチドへの抗体結合（Ｂ）および全長α−シヌクレインタンパク質への抗体結合（Ｃ）。 図１３は、α−シヌクレインの異なる部分に対する抗体応答を示す。マウスを、α−シヌクレインのＫ_１０ＡＫＥＧ_１４カルパイン切断部位に基づいたエピトープワクチン（α−Ｓｙｎ_{１０−１４}−ＭｕｌｔｉＴＥＰ）で免疫した（Ａ）。α−Ｓｙｎ_{１０−１８}ペプチドへの抗体結合（Ｂ）および全長α−シヌクレインタンパク質への抗体結合（Ｃ）。 図１４は、タウタンパク質における免疫優性Ｂ細胞エピトープのマッピングの結果を示す。マウスを、４Ｒ／２Ｎ Ｔａｕタンパク質で免疫した。タウタンパク質を含む５０マーペプチドに対する生成された抗体の結合を、ＥＬＩＳＡによって分析した。 図１５は、外来Ｔｈ細胞エピトープと融合したＴａｕ_２−１８でのＢ６ＳＪＬマウスの免疫のデータを示す。（Ａ）タウ_２−１８ペプチドに特異的な抗体の力価を、連続希釈した各血清において決定した。線は、マウスの平均を示す。（Ｂ）野生型（４Ｒ／０Ｎ）、変異Ｐ３０１Ｌ、および４Ｒ／０Ｎイソ型の欠失（Δ１９−２９）タウタンパク質への抗Ｔａｕ２−１８抗体の結合（血清の１：６００希釈。線はＯＤ_４５０の平均を示す）。（Ｃ）Ｐ３０ペプチドおよびタウ_２−１８で活性化した免疫脾細胞の培養物中でのＩＦＮ−γ産生細胞の検出。ＩＦＮγ産生脾細胞数を、１０μｇ／ｍｌのタウ_２−１８およびＰ３０ペプチドでの細胞のｅｘ ｖｉｖｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した（Ｃ）。エラーバーは平均±ｓ．ｄ．（Ｐ≦０．００１）を示す。 図１５は、外来Ｔｈ細胞エピトープと融合したＴａｕ_２−１８でのＢ６ＳＪＬマウスの免疫のデータを示す。（Ａ）タウ_２−１８ペプチドに特異的な抗体の力価を、連続希釈した各血清において決定した。線は、マウスの平均を示す。（Ｂ）野生型（４Ｒ／０Ｎ）、変異Ｐ３０１Ｌ、および４Ｒ／０Ｎイソ型の欠失（Δ１９−２９）タウタンパク質への抗Ｔａｕ２−１８抗体の結合（血清の１：６００希釈。線はＯＤ_４５０の平均を示す）。（Ｃ）Ｐ３０ペプチドおよびタウ_２−１８で活性化した免疫脾細胞の培養物中でのＩＦＮ−γ産生細胞の検出。ＩＦＮγ産生脾細胞数を、１０μｇ／ｍｌのタウ_２−１８およびＰ３０ペプチドでの細胞のｅｘ ｖｉｖｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した（Ｃ）。エラーバーは平均±ｓ．ｄ．（Ｐ≦０．００１）を示す。 図１５は、外来Ｔｈ細胞エピトープと融合したＴａｕ_２−１８でのＢ６ＳＪＬマウスの免疫のデータを示す。（Ａ）タウ_２−１８ペプチドに特異的な抗体の力価を、連続希釈した各血清において決定した。線は、マウスの平均を示す。（Ｂ）野生型（４Ｒ／０Ｎ）、変異Ｐ３０１Ｌ、および４Ｒ／０Ｎイソ型の欠失（Δ１９−２９）タウタンパク質への抗Ｔａｕ２−１８抗体の結合（血清の１：６００希釈。線はＯＤ_４５０の平均を示す）。（Ｃ）Ｐ３０ペプチドおよびタウ_２−１８で活性化した免疫脾細胞の培養物中でのＩＦＮ−γ産生細胞の検出。ＩＦＮγ産生脾細胞数を、１０μｇ／ｍｌのタウ_２−１８およびＰ３０ペプチドでの細胞のｅｘ ｖｉｖｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した（Ｃ）。エラーバーは平均±ｓ．ｄ．（Ｐ≦０．００１）を示す。 図１６は、アルツハイマー病（ＡＤ）症例の患者および正常な非ＡＤ症例の患者の脳切片の免疫染色写真を示す。抗体は、タウ_２−１８−Ｐ３０で免疫されたマウス由来の抗タウ_２−１８血清（左パネル）、公知の抗タウ抗体（真ん中のパネル）、および無関係の抗原（Ｂｏｒｉｓ）で免疫されたマウス由来のコントロール抗血清（右パネル）を含む。 図１７は、細胞内タウ反復ドメイン（ＲＤ）の凝集の脳ライセート誘導の抗体ブロッキングの結果を示す。（Ａ）脳ライセートを、未処理または抗タウ_２−１８抗体で処理のいずれかとし、ＦＲＥＴ分析の前にＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に添加した。ＦＲＥＴシグナルの増加は、未処理脳ライセートを有するウェル中で検出された。抗タウ_２−１８抗体でのライセートの処理により、脳ライセート中の全長タウのブロッキングおよびＲＤ凝集誘導の阻害に起因してベースラインレベルまでＦＲＥＴシグナルが減少した。（Ｂ）ＲＤ−ＹＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への抗タウ_２−１８抗体／脳ライセート複合体の例示的な結合の共焦点顕微鏡画像。Ａｌｅｘａ５４６とコンジュゲートした二次抗マウス免疫グロブリンを使用した。 図１７は、細胞内タウ反復ドメイン（ＲＤ）の凝集の脳ライセート誘導の抗体ブロッキングの結果を示す。（Ａ）脳ライセートを、未処理または抗タウ_２−１８抗体で処理のいずれかとし、ＦＲＥＴ分析の前にＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に添加した。ＦＲＥＴシグナルの増加は、未処理脳ライセートを有するウェル中で検出された。抗タウ_２−１８抗体でのライセートの処理により、脳ライセート中の全長タウのブロッキングおよびＲＤ凝集誘導の阻害に起因してベースラインレベルまでＦＲＥＴシグナルが減少した。（Ｂ）ＲＤ−ＹＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への抗タウ_２−１８抗体／脳ライセート複合体の例示的な結合の共焦点顕微鏡画像。Ａｌｅｘａ５４６とコンジュゲートした二次抗マウス免疫グロブリンを使用した。 図１８は、タウＲＤ凝集体の経細胞伝播の抗タウ_２−１８抗体ブロッキングのデータを示す。（Ａ）ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＦＲＥＴ分析の前にＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰで共トランスフェクトした同数のＨＥＫ２９３細胞とともに４８時間にわたって共存培養した。共存培養細胞においてＦＲＥＴシグナルの増加が検出された。精製されたマウス抗タウ_２−１８抗体またはラット抗タウ_{３８２−４１８}抗体の系列希釈物の添加により、凝集したＲＤの経細胞伝播の阻害に起因してＦＲＥＴシグナルが減少した。（Ｂ）ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰでトランスフェクトされたかまたは偽トランスフェクトされた（ＮＴ）ＨＥＫ２９３細胞への抗タウ_２−１８抗体の結合を、共焦点顕微鏡によって分析した。抗タウ_２−１８抗体を培養培地に４８時間にわたって添加した。細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ５４６で標識した抗マウス二次抗体で染色し、共焦点顕微鏡法によって分析した。抗タウ_２−１８／ＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰ複合体は、ＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰが発現される場合に同定されたが、存在しない場合に（ＮＴ）同定されなかった。 図１８は、タウＲＤ凝集体の経細胞伝播の抗タウ_２−１８抗体ブロッキングのデータを示す。（Ａ）ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＦＲＥＴ分析の前にＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰで共トランスフェクトした同数のＨＥＫ２９３細胞とともに４８時間にわたって共存培養した。共存培養細胞においてＦＲＥＴシグナルの増加が検出された。精製されたマウス抗タウ_２−１８抗体またはラット抗タウ_{３８２−４１８}抗体の系列希釈物の添加により、凝集したＲＤの経細胞伝播の阻害に起因してＦＲＥＴシグナルが減少した。（Ｂ）ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰでトランスフェクトされたかまたは偽トランスフェクトされた（ＮＴ）ＨＥＫ２９３細胞への抗タウ_２−１８抗体の結合を、共焦点顕微鏡によって分析した。抗タウ_２−１８抗体を培養培地に４８時間にわたって添加した。細胞を固定し、透過処理し、Ａｌｅｘａ５４６で標識した抗マウス二次抗体で染色し、共焦点顕微鏡法によって分析した。抗タウ_２−１８／ＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰ複合体は、ＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰが発現される場合に同定されたが、存在しない場合に（ＮＴ）同定されなかった。 図１９は、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに基づいた例示的な多価ＤＮＡエピトープワクチンの略図を含む。ＡＶ−１９５３は、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに融合した３コピーのＡβ_１１および３コピーのタウ_２−１８エピトープから構成される２価エピトープである。ＡＶ−１９５０およびＡＶ−１９７８は、Ａβおよびタウに加えてそれぞれα−ｓｙｎエピトープＫＡＫＥＧおよびα−ｓｙｎ_{３６−６９}を含む３価ワクチンである。 図２０は、２価および３価のＤＮＡエピトープワクチンでの野生型マウスの免疫由来のデータを示す。（Ａ）２価ＡＶ−１９５３ワクチンによって得られた抗Ａβ_４２抗体および抗Ｔａｕ抗体の応答。（Ｂ）３価ワクチンＡＶ−１９７８によって得られた抗Ａβ_４２、抗Ｔａｕ、および抗α−ｓｙｎ抗体の応答。ＥＬＩＳＡによって個々のマウスの血清中の抗体応答を測定し、線は抗体の平均値を示す。α−ｓｙｎおよびＡβ_４２に特異的な抗体の濃度を、マウス抗α−ｓｙｎ抗体および６Ｅ１０抗Ａβ_４２抗体をそれぞれ使用して作製した検量線を使用して計算した。抗Ｔａｕ抗体のエンドポイント力価を、カットオフの２倍を超える読み取りが得られた最大血清希釈の逆数として計算した。カットオフを、同一希釈での免疫前血清の力価として決定した。（Ｃ）３価ワクチンＡＶ−１９７８は、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームのエピトープに特異的なＴｈ細胞を活性化したが、Ｂ細胞エピトープに特異的なＴｈ細胞は活性化しなかった。免疫脾細胞の培養物中のＩＦＮγ産生細胞を、表示のペプチド／タンパク質での細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。エラーバーは、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝６）を示す。 図２０は、２価および３価のＤＮＡエピトープワクチンでの野生型マウスの免疫由来のデータを示す。（Ａ）２価ＡＶ−１９５３ワクチンによって得られた抗Ａβ_４２抗体および抗Ｔａｕ抗体の応答。（Ｂ）３価ワクチンＡＶ−１９７８によって得られた抗Ａβ_４２、抗Ｔａｕ、および抗α−ｓｙｎ抗体の応答。ＥＬＩＳＡによって個々のマウスの血清中の抗体応答を測定し、線は抗体の平均値を示す。α−ｓｙｎおよびＡβ_４２に特異的な抗体の濃度を、マウス抗α−ｓｙｎ抗体および６Ｅ１０抗Ａβ_４２抗体をそれぞれ使用して作製した検量線を使用して計算した。抗Ｔａｕ抗体のエンドポイント力価を、カットオフの２倍を超える読み取りが得られた最大血清希釈の逆数として計算した。カットオフを、同一希釈での免疫前血清の力価として決定した。（Ｃ）３価ワクチンＡＶ−１９７８は、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームのエピトープに特異的なＴｈ細胞を活性化したが、Ｂ細胞エピトープに特異的なＴｈ細胞は活性化しなかった。免疫脾細胞の培養物中のＩＦＮγ産生細胞を、表示のペプチド／タンパク質での細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。エラーバーは、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝６）を示す。 図２０は、２価および３価のＤＮＡエピトープワクチンでの野生型マウスの免疫由来のデータを示す。（Ａ）２価ＡＶ−１９５３ワクチンによって得られた抗Ａβ_４２抗体および抗Ｔａｕ抗体の応答。（Ｂ）３価ワクチンＡＶ−１９７８によって得られた抗Ａβ_４２、抗Ｔａｕ、および抗α−ｓｙｎ抗体の応答。ＥＬＩＳＡによって個々のマウスの血清中の抗体応答を測定し、線は抗体の平均値を示す。α−ｓｙｎおよびＡβ_４２に特異的な抗体の濃度を、マウス抗α−ｓｙｎ抗体および６Ｅ１０抗Ａβ_４２抗体をそれぞれ使用して作製した検量線を使用して計算した。抗Ｔａｕ抗体のエンドポイント力価を、カットオフの２倍を超える読み取りが得られた最大血清希釈の逆数として計算した。カットオフを、同一希釈での免疫前血清の力価として決定した。（Ｃ）３価ワクチンＡＶ−１９７８は、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームのエピトープに特異的なＴｈ細胞を活性化したが、Ｂ細胞エピトープに特異的なＴｈ細胞は活性化しなかった。免疫脾細胞の培養物中のＩＦＮγ産生細胞を、表示のペプチド／タンパク質での細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激後にＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。エラーバーは、平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝６）を示す。

詳細な説明
Ａ．免疫原性組成物
免疫原が領域Ｂにカップリングした領域Ａを含む、免疫原の組成物を本明細書中に開示する。領域Ａは、治療抗体の誘導を担う、ワクチンの活性成分である。領域Ｂは、Ｂ細胞が抗体を産生するのを補助する細胞性免疫応答の誘導を担うヘルパー成分である。

領域Ａは、（ｉ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｉｉ）少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープまたは（ｉｉｉ）少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｉｖ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープまたは（ｖ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｖｉ）少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｖｉｉ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープを含む。複数のエピトープが領域Ａ内に存在する場合、エピトープは、同一のエピトープ性配列（例えば、Ａβ_１−１１の複数のコピー）または異なるエピトープ性配列（例えば、Ａβ_１−１１およびタウ_２−１３）を含むことができる。領域Ａが異なるエピトープを有する場合、エピトープの順序は任意であり得るか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験またはｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて最適化することができる。

領域Ｂは、少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む。複数のＴ細胞エピトープが領域Ｂ内に存在する場合、エピトープは、同一のエピトープ性配列（例えば、ＰＡＤＲＥの複数のコピー）または異なるエピトープ性配列（例えば、ＰＡＤＲＥおよび破傷風毒素ｐ２３）を含むことができる。領域Ｂが異なるエピトープを有する場合、エピトープの順序は任意であり得るか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験またはｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて最適化することができる。

２つまたはそれより多くの免疫原が組成物中に存在する場合、免疫原は、領域Ａ内または領域Ｂ内またはその両方で異なる（すなわち、同一ではない）。本開示の目的のために、２つの領域が同数のエピトープおよび同一配列のエピトープを含む場合、配置が異なると領域が異なり、それ故、免疫原が異なる。すなわち、１−２の順序でエピトープ１およびエピトープ２を含む領域は、２−１の順序のものと異なる。

別の態様では、組成物は、領域Ｂにカップリングした領域Ａを含む免疫原をコードする核酸分子を含む。領域Ａは、（ｉ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｉｉ）少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープまたは（ｉｉｉ）少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｉｖ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープまたは（ｖ）少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープまたは（ｖｉ）少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープおよび少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープおよび少なくとも１つのα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）Ｂ細胞エピトープを含む。領域Ｂは、少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む。複数のエピトープが領域Ａ内に存在する場合、エピトープは、同一のエピトープ性配列（例えば、Ａβ_１−１１の複数のコピー）または異なるエピトープ性配列（例えば、Ａβ_１−１１およびタウ_２−１３）を含むことができる。領域Ａが異なるエピトープを有する場合、エピトープの順序は任意であり得るか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験またはｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて最適化することができる。

領域Ｂは、少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む。複数のＴ細胞エピトープが領域Ｂ内に存在する場合、エピトープは、同一のエピトープ性配列（例えば、ＰＡＤＲＥの複数のコピー）または異なるエピトープ性配列（例えば、ＰＡＤＲＥおよび破傷風毒素ｐ２３）を含むことができる。領域Ｂが異なるエピトープを有する場合、エピトープの順序は任意であり得るか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験またはｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて最適化することができる。

２つまたはそれより多くの免疫原がコードされる場合、免疫原は、領域Ａ内または領域Ｂ内またはその両方で異なる（すなわち、同一ではない）。本開示の目的のために、２つの領域が同数のエピトープおよび同一配列のエピトープを含む場合、配置が異なると領域が異なり、それ故、免疫原が異なる。すなわち、１−２の順序でエピトープ１およびエピトープ２を含む領域は、２−１の順序のものと異なる。複数の免疫原が単一の核酸分子によってコードされてもよく、または単一の免疫原が単一の核酸分子によってコードされてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの免疫原が単一の核酸分子にコードされる。他の実施形態では、各免疫原が別個の核酸分子によってコードされる。さらに他の実施形態では、１つを超える免疫原が単一の核酸分子によってコードされ、少なくとも１つの他の免疫原が別個の核酸分子によってコードされる。

領域Ａおよび領域Ｂ内の少なくとも１つのエピトープは、１〜約１８、または１〜約１５、または１〜約１２、または１〜約９、または１〜約６、または１〜約３、または１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５、または１６、または１７、または１８アミノ酸であり得る。１つを超えるエピトープが存在する場合、エピトープは全て異なる配列であり得るか、エピトープのうちのいくつかが異なる配列であり得る。

いくつかの実施形態では、領域Ｂの少なくとも１つのＴｈエピトープを、被験体の１つ以上の抗原経験Ｔヘルパー細胞集団が認識することができる。組成物は、通常、被験体において体液性免疫応答を活性化することができる。いくつかの実施形態では、体液性免疫応答は、病理学的形態のＡβタンパク質、またはＴａｕタンパク質、またはα−ｓｙｎタンパク質に特異的な１つ以上の抗体を含む。

１．Ｂ細胞エピトープの構造
Ｂ細胞エピトープは、エピトープまたはエピトープを含むタンパク質に結合するＢ細胞によって抗体産生を刺激することができる配列を含むペプチドである。さらに、本開示の文脈内のＢ細胞エピトープは、Ｔ細胞応答を刺激しないことが好ましい。本明細書中のＢ細胞エピトープは、さらなる配列（未変性タンパク質中のエピトープに隣接するアミノ酸など）を含むことができる。例えば、Ｂ細胞エピトープの最小配列がアミノ酸５〜１１である場合、本明細書中のＢ細胞エピトープは、残基３〜１５などのさらなるアミノ酸を含むことができる。典型的なＢ細胞エピトープは、約５〜約３０アミノ酸長である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡβ Ｂ細胞エピトープの配列は配列番号１内に位置し、ここで、エピトープは、４２アミノ酸長未満である。いくつかの実施形態では、エピトープは１５アミノ酸長であり、他の実施形態では、エピトープは１５アミノ酸長未満（すなわち、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４アミノ酸）である。いくつかの実施形態では、エピトープは配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７）を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープの配列は、配列番号２内に位置する。典型的には、エピトープは、約５〜約３０アミノ酸長であろう。いくつかの実施形態では、エピトープは１２アミノ酸長であり、他の実施形態では、エピトープは１２アミノ酸長未満（すなわち、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸）である。いくつかの実施形態では、エピトープは、配列ＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤ（配列番号８）を含む。他の実施形態では、エピトープは、配列ＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲ（配列番号９）、または配列ＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳ（配列番号１０）、または配列ＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫ（配列番号１１）、または配列ＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳ（配列番号１２）、または配列ＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ（配列番号１３）を含む。一定の実施形態では、エピトープは、配列番号８〜１３のうちの少なくとも５個連続するアミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、領域Ａの少なくとも１つのα−ｓｙｎＢ細胞エピトープの配列は、配列番号３内に位置する。エピトープは、しばしば、約５〜５０アミノ酸長であろう。いくつかの実施形態では、エピトープは約５０アミノ酸長であり、他の実施形態では、エピトープは約５０アミノ酸未満であり、さらなる他の実施形態では、エピトープは約３０アミノ酸未満、または約２０アミノ酸未満、または約１５アミノ酸未満、または約１２アミノ酸未満である。一定の実施形態では、フラグメントは、以下の配列を含む。

一定の実施形態では、エピトープは、配列番号１４〜１８および４２〜４４のうちの少なくとも５個連続するアミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、領域Ａは複数のＢ細胞エピトープを含む。一定の実施形態では、領域Ａは、１、２、または３個のＢ細胞エピトープを含む。他の実施形態では、領域Ａは、１８個ものエピトープ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個）を含む。複数のエピトープは、同一の配列または異なる配列を有することができる。さらに、複数のエピトープは全て、１つのタイプであり得る（すなわち、全てがタウ配列を有するか、全てがＡβ配列を有するか、または全てがα−ｓｙｎ配列を有する）。いくつかの実施形態では、複数のエピトープは、タウ、Ａβ、およびα−ｓｙｎの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、領域Ａは、３つのＡβエピトープ、３つのタウエピトープ、および３つのα−シヌクレインエピトープを含む。特定の実施形態では、Ａβエピトープは残基１〜１１を含み、タウエピトープは残基２〜１３を含み、α−シヌクレインエピトープは残基３６〜３９を含む。他の実施形態では、領域は、３つのＡβおよび３つのタウエピトープを含む。特定の実施形態では、Ａβエピトープは残基１〜１１を含み、タウエピトープは残基２〜１３を含む。領域Ａが複数のＢ細胞エピトープを含む（または複数のＢ細胞エピトープをコードする）場合、エピトープは、典型的には、タンデムな配置で存在し、その間にリンカーを有する。リンカーは、任意の長さおよび配列のリンカーであり得るが、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くことを許容するグリシンおよびセリンのような可動性残基の短い配列を典型的に使用する。２つの隣接するドメインが相互に立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いリンカーを使用することができる。例示的なリンカー配列はＧＳ（グリシン−セリン）である。

いくつかの実施形態では、Ａβ Ｂ細胞エピトープは、配列番号４中に示す部分配列（sub-sequence）またはアミノ酸をコードする核酸配列によってコードされ得る。同様に、ＴａｕＢ細胞エピトープは、配列番号５中に示す配列もしくは部分配列または同一のアミノ酸をコードする核酸配列によってコードされ得るか、α−ｓｙｎＢ細胞エピトープは、配列番号６中に示す配列もしくは部分配列または同一のアミノ酸をコードする核酸配列によってコードされ得る。

Ａβ、タウ、およびα−ｓｙｎのＢ細胞エピトープを、種々の方法（コンピュータプログラム解析、ペプチドアレイ、ファージディスプレイライブラリー、直接結合アッセイなどが含まれるが、これらに限定されない）で同定することができる。コンピュータプログラムおよび他の試験は市販されているか、または無料で利用可能であり、これらを使用してＢ細胞エピトープを予測するかまたは直接示すことができる。候補配列を合成し、キャリアタンパク質にカップリングし、これを使用して動物（例えば、マウス）を免疫することができる。次いで、血清を、ＥＬＩＳＡまたは候補に対する抗体の存在についての他の公知の方法によって試験することができる。さらに、エピトープを、Ｔ細胞の刺激のための当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載の任意の方法によって試験することができる。

適切なエピトープは、Ｔ細胞を刺激しない。Ａβのいくつかのペプチドは、Ｔ細胞エピトープとして作用することが公知である。これらには、以下の配列が含まれる：ＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１９）、ＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩ（配列番号２０）、ＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬ（配列番号２１）、ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ（配列番号２２）、ＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧ（配列番号２３）、およびＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号２４）。他のＢ細胞エピトープ候補を、組成物を投与した被験体においてヘルパーＴ細胞増殖を誘発し、したがって、ヘルパーＴ細胞免疫応答を潜在的に生じるエピトープ配列を同定するために使用することができる、本明細書中に記載されているかまたは当該分野で公知のアッセイ（刺激の際の［^３Ｈ］チミジン組込み、ＭＨＣ結合アッセイ、細胞内染色、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＣＦＳＥ染色増殖細胞のフローサイトメトリー、ＭＴＡ増殖アッセイなど）のうちの１つを使用してＴ細胞エピトープ機能についてアッセイすることができる。

２．Ｔ細胞エピトープ（ワクチンのためのＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォーム）
免疫原のＴ細胞エピトープは、「外来」である（すなわち、これらは、組成物が投与される哺乳動物および被験体において見出されないペプチド配列であるか、またはこのペプチド配列をコードする）。外来Ｔ細胞エピトープは、非自己非哺乳動物タンパク質に由来してもよく、または人工配列であってもよい。ＰＡＤＲＥは、Ｔ細胞エピトープとしての役割を果たす人工配列の例である（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１，１９９４（その全体が援用される））。「無差別Ｔ細胞エピトープ」（promiscuous Ｔ cell epitope）は、免疫系の多数のＭＨＣ−ＩＩ（例えば、ヒトＤＲ）分子によって認識されることができ、かつこれらの個体の免疫細胞の変化（サイトカインおよびケモカインの産生などであるが、これらに限定されない）を誘導することができるペプチド配列を意味する。これらのエピトープに特異的なＴ細胞は、アミロイドまたはタウまたはα−シヌクレインに特異的なＢ細胞などのＢ細胞がこれらのタンパク質に対する抗体を産生することを補助する。ワクチン接種した被験体の血清中にこれらのタンパク質の病理学的形態に対する抗体が検出可能に産生されること、さらには治療に適切な力価で産生されることが望ましい。

本明細書中で考察するように、Ｔ細胞エピトープは、組成物が投与される被験体に対して外来性であるべきである。いくつかの実施形態では、免疫原の１つまたはそれより多くのうちの少なくとも１つのＴｈエピトープは、１２〜２２アミノ酸長である。領域Ｂは、複数のＴｈエピトープ（全てが同一の配列を有するかまたは同一の配列をコードする）または異なるＴｈエピトープの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、領域Ｂは１〜２０個のエピトープを含み、他の実施形態では、領域Ｂは少なくとも２個のエピトープを含み、さらなる他の実施形態では、領域Ｂは２〜約２０個のエピトープを含む。例示的なＢ領域を、図および実施例に示している。領域Ｂが複数のＴ細胞エピトープを含む（複数のＴ細胞エピトープをコードする）場合、エピトープは、典型的には、タンデム配置で存在し、その間にリンカーを有する。リンカーは任意の長さおよび配列のものであり得るが、小さなアミノ酸の短い配列を通常は使用するであろう。例示的なリンカー配列はＧＳ（グリシン−セリン）である。集合的に、Ｔｈエピトープのストリングを、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームと呼ぶ。

多数の適切なＴ細胞エピトープが存在する。エピトープを、種々の周知の技術（種々のＴ細胞増殖アッセイが含まれる）によって、ならびにタンパク質配列に関するコンピュータアルゴリズムおよびＭＨＣ結合アッセイを使用して同定することができるか、または無数のデータベース（ＭＨＣＢＮ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩで運営）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＢＭＩ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇによって運営され、（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）に見出される）、ＩＥＤＢ（Ｖｉｔａ Ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０ ３８（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ８５４−６２．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｎｏｖ １１，ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで見出される）、およびＳＥＤＢ（Ｐｏｎｄｉｃｈｅｒｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａで運営され、ｓｅｄｂ．ｂｉｃｐｕ．ｅｄｕ．ｉｎで見出される）など）からの選択。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、典型的には、８アミノ酸長と１１アミノ酸長との間の長さのペプチドであるのに対して、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、より長いペプチド（典型的には、１３〜１７アミノ酸長）を提示する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴｈエピトープ（ＭＨＣクラスＩＩに結合してＴｈ細胞を活性化するペプチド）は、破傷風毒素エピトープ、ジフテリア毒素エピトープ、Ｂ型肝炎表面抗原エピトープ、インフルエンザウイルス血球凝集素エピトープ、インフルエンザウイルス基質タンパク質エピトープ、１つもしくはそれより多くのの合成無差別エピトープ、またはその混合物からなる群から選択される。例えば、適切なＴｈエピトープには、配列ＶＳＩＤＫＦＲＩＦＣＫＡＮＰＫ（配列番号２５）を含むＰ２３ＴＴ破傷風毒素エピトープ、配列ＬＫＦＩＩＫＲＹＴＰＮＮＥＩＤＳ（配列番号２６）を含むＰ３２ＴＴ破傷風毒素エピトープ、配列ＩＲＥＤＮＮＴＬＫＬＤＲＣＮＮ（配列番号２７）を含むＰ２１ＴＴ破傷風毒素エピトープ、配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号２８）を含むＰ３０ＴＴ破傷風毒素エピトープ、配列ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号２９）を含むＰ２ＴＴ破傷風毒素エピトープ、配列ＬＥＹＩＰＥＩＴＬＰＶＩＡＡＬＳＩＡＥＳ（配列番号３０）を含む破傷風毒素エピトープ、配列ＬＩＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶＮＱ（配列番号３１）を含む破傷風毒素エピトープ、配列ＮＹＳＬＤＫＩＩＶＤＹＮＬＱＳＫＩＴＬＰ（配列番号３２）を含む破傷風毒素エピトープ、配列ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡ（配列番号３３）を含むＨＢＶ核キャプシドエピトープ、配列ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤ（配列番号３４）を含むＨＢＶ表面抗原エピトープ、配列ＹＳＧＰＬＫＡＥＩＡＱＲＬＥＤＶ（配列番号３５）を含むＭＴインフルエンザマトリックスエピトープ、配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号３６）を含むＰＡＤＲＥエピトープ、および配列ａＫ−Ｃｈａ−ＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号４０）（式中、「ａ」はＤアラニンであり、ＣｈａはＬ−シクロヘキシルアラニンである）を含むＰＡＤＲＥエピトープが含まれる。いくつかの実施形態では、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームは、核酸分子によってコードされる。

Ｂ．免疫原の構築／調製
免疫原をＤＮＡ組成物として送達させるべきである場合、組成物は、典型的には、発現ベクターであろう。いくつかの実施形態では、ベクターは自律複製することができる。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターである。あるいは、ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、またはウイルスであり得る。免疫原をコードする配列は、宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されるであろう。典型的には、ポリＡシグナル配列、１つまたはそれより多くのイントロン、および必要に応じて他の調節配列（エンハンサーなど）も存在するであろう。プロモーターは、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得る。かかるプロモーターは、当該分野で周知である。

核酸構築物を、ポリペプチド免疫原を産生するために使用することもできる。この場合、構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞にトランスフェクトするかまたは導入し、そしてタンパク質を単離する。タンパク質を、種々の技術（沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、およびＨＰＬＣが含まれる）のいずれかによって精製することができる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞が含まれる。宿主細胞の選択は、少なくとも一部が構築物の骨格に依存する。単離精製を容易にするためにアフィニティータグ（ＦＬＡＧおよびｈｅｘａ−Ｈｉｓなど）を、免疫原に添加することができる。

組成物の配列を示す配列データを得る工程および組成物を合成する工程を含む、本明細書中に開示の組成物の作製方法も本明細書中に開示する。得られたタンパク質を、さらに精製することなく使用してもよく、または種々のタンパク質精製方法（ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる）のいずれかによって精製してもよい。

Ｃ．領域のカップリング
少なくとも２つの免疫原のＡ領域およびＢ領域をカップリングする。２つまたはそれより多くの免疫原を使用する場合、２つまたはそれより多くの免疫原もカップリングすることができる。化学的連結またはペプチド連結（例えば、融合タンパク質）または静電相互作用（例えば、ファンデルワールス力）または他のタイプのカップリングによってカップリングすることができる。

連結がペプチド性連結である場合、領域ＡのＣ末端を、領域ＢのＮ末端に連結することができる（または逆も同様）。あるいは、１つのＢ領域のＣ末端をＡ領域のＮ末端にカップリングすることができ、別のＢ領域のＮ末端を同一のＡ領域のＣ末端にカップリングすることができる。さらに、領域Ａを、リンカードメインを介して領域Ｂにカップリングすることができる。リンカードメインは、任意の長さ（数百アミノ酸もの長さ）であり得るが、より典型的には、２〜３０個のアミノ酸または等価の長さであろう。リンカーは、しばしば、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に動くことを許容する、グリシンおよびセリンのような可動性残基から構成される。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いリンカーを使用する。いくつかの例示的なリンカーには、配列ＧＳ、ＧＳＧＳＧ（配列番号３７）、またはＹＮＧＫ（配列番号３８）が含まれる。いくつかの実施形態では、リンカーのうちの１つまたはそれより多くは、ヘリックス形成ペプチド（Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号３９）（式中、ｎは、２、３、４、または５である）など）を含む。あるいは、２つの免疫原を、４個または８個のリジンブランチによってカップリングした複数抗原ペプチド（ＭＡＰ）として合成することができる。

化学的架橋は、領域ＡおよびＢまたは少なくとも２つの免疫原のカップリングの代替手段である。リンカーおよび架橋剤は周知であり、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．およびＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。

Ｄ．製剤および送達
免疫原を、典型的には、薬学的に許容され得る賦形剤を使用して製剤化する。賦形剤としては、通常生理食塩水、他の塩、バッファー、キャリア、バッファー、安定剤、結合剤、保存剤（チメロサールなど）、および界面活性剤などが挙げられる。かかる材料は、好ましくは、無毒性であり、免疫原の有効性を最小にしか妨害しない（または全く妨害しない）。賦形剤または他の材料の詳細な性質は、投与経路（例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路）に依存し得る。いくつかの実施形態では、組成物を、ナノ粒子およびリポソームに製剤化する。

いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。適切なアジュバントには、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムなど）、サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ−２１）、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、モンタナイド、ＣｐＧアジュバント、ＭＦ５９、イヌリンベースのアジュバント、ナノ粒子、およびリポソームアジュバントが含まれる。アジュバントを、スクアレンなどを使用して水中油型乳濁液として製剤化することができるか、ＭＰＬなどの免疫刺激薬と組み合わせて製剤化することができる。アジュバントを、活性薬剤を有する治療組成物の一成分として投与することができるか、免疫原性治療薬の投与前、同時、または投与後に別個に投与することができる。他のアジュバントとしては、ケモカイン（例えば、ＭＤＣ）およびサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）が挙げられる。

組成物を、任意の適切な送達経路（皮内、粘膜（例えば、鼻腔内、経口）、筋肉内、皮下、舌下、直腸、膣など）によって投与することができる。これらおよび他の送達経路は、当該分野で周知である。

筋肉内（ｉ．ｍ．）経路は、組成物に適切なかかる経路の一例である。適切なｉ．ｍ．送達デバイスとしては、針およびシリンジ、無針注射デバイス（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｏｒｅｇ．ＵＳＡ）、またはペン型注射デバイス（インスリンまたはエピネフリンを送達させるための家庭での自己注射で使用されるものなど）が挙げられる。皮内（ｉ．ｄ．）および皮下（ｓ．ｃ．）送達は、他の適切な経路である。適切なデバイスとしては、シリンジおよび針、短い針を有するシリンジ、およびジェット式注射デバイスなどが挙げられる。組成物を、粘膜経路（例えば、鼻腔内）によって投与することができる。多数の鼻腔内送達デバイスが利用可能であり、当該分野で周知である。噴霧デバイスは、かかるデバイスの一例である。経口投与は、被験体に溶液を嚥下させるのと同じぐらい簡単であり得る。

組成物を、単一の部位または複数の部位に投与することができる。複数の部位に投与する場合、投与経路は、各部位で同一であっても（例えば、異なる筋肉への注射）、異なっていてもよい（例えば、筋肉内注射および鼻腔内噴霧）。さらに、組成物を、単一の時点または複数の時点でｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．などにて投与することができる。一般に、複数の時点で投与する場合、投与間の時間は免疫応答を改善するように決定されている。

経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、散剤、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアを含むことができる。液体薬学的組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体キャリアを含む。生理的食塩水、デキストロース、または他のサッカリド溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）を含めることができる。

静脈内注射、皮膚注射、皮下注射、または罹患部位への注射のために、有効成分は、発熱物質を持たず、且つ適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口で許容され得る水溶液の形態であろう。当業者は、例えば、等張性ビヒクル（塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液など）を使用して適切な溶液を十分調製することができるであろう。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加物も含めることができる。

核酸を含む組成物を、例えば、エレクトロポレーションデバイスによって筋肉内、皮内に送達させることができ、例えば、遺伝子銃もしくはバイオジェクター、パッチ、または任意の他の送達系によって皮内に送達させることができる。

個体に投与されるものがポリペプチドであろうと核酸であろうと、投与される量は好ましくは、「治療有効量」または「予防有効量」である。本明細書中で使用する場合、「治療有効量」は、疾患の症状を回復させるのに有効な量をいう。予防は治療でもあるので、治療有効量は、「予防有効量」であり得る。用語「回復」または「回復する」を、疾患状態または疾患状態の症状の処置における任意の治療的に有益な結果（疾患または症状の重症度を軽減すること、疾患の進行を遅延もしくは停止すること、寛解を誘導すること、治癒をもたらすこと、発症を遅延すること、または疾患の重篤な症状の発症時のその疾患の重篤な症状の数を減少させることもしくは程度を軽減することなど）をいうために本明細書中で使用する。

実際の投与量ならびに投与の速度および時間経過は、処置されるタンパク質凝集疾患の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方（例えば、投薬量に関する決定）は、一般医および他の専門医の責任の範囲内であり、典型的には、処置される障害、個々の患者の容態、送達部位、投与方法、および当業者に公知の他の要因を考慮する。上記の技術およびプロトコールの例を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．（編），１９８０に見出すことができる。

本明細書中に開示の組成物を、単独の処置として投与してもよく、または処置される容態に応じて同時または逐次のいずれかで他の処置（医学的処置および非医学的処置）と組み合わせて提供してもよい。

免疫応答の誘導を必要とする被験体における免疫応答を誘導する方法であって、十分な量の本明細書中に開示の組成物を投与する工程を含む方法も本明細書中に開示する。用語「十分な量」を、所望の効果を生じるのに十分な量（例えば、細胞におけるタンパク質凝集を調整するか免疫応答を惹起するのに十分な量）を意味するために本明細書中で使用する。組成物は、免疫原のうちの１つまたはそれより多くを含むことができる。アジュバントなどの添加物は必要に応じてである。通常、投与される組成物は、１つまたはそれより多くの免疫原を含む薬学的組成物である。いくつかの態様では、被験体は、アルツハイマー病、または異常なアミロイド沈着物、Ｔａｕ沈着物、もしくはα−ｓｙｎ沈着物に関連する１つまたはそれより多くの容態と診断されているか、アルツハイマー病、または異常なアミロイド沈着物、Ｔａｕ沈着物、もしくはα−ｓｙｎ沈着物に関連する１つまたはそれより多くの容態に至るリスクがあるであろう。免疫応答は、本明細書中に開示の組成物のうちの１つの投与によって引き起こされる。免疫応答を、Ｔ細胞刺激またはＢ細胞エピトープに対する抗体の産生のアッセイによって確認することができる。抗体産生の免疫アッセイは周知であり、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ドットブロット、フローサイトメトリー、および免疫染色などが挙げられる。Ｔ細胞刺激アッセイも周知であり、増殖アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、およびフローサイトメトリーによる活性化マーカーの検出などが挙げられる。

アミロイド、タウ、またはα−ｓｙｎの沈着物に関連する容態を処置または回復させる方法であって、有効量の本明細書中に開示の組成物を、前記容態の処置または回復を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法も本明細書中に開示する。一般に、アミロイド、Ｔａｕタンパク質、またはα−ｓｙｎの沈着物の総量がコントロールと比較して投与後に減少する場合に回復と決定することができる。他の生化学試験または神経病理学試験（ＣＳＦにおけるＡβ_４２ペプチドに対するリン酸化タウおよび非リン酸化タウの比の決定、脳内のβ−アミロイド斑に結合する色素（例えば、ピッツバーグ化合物Ｂまたは^１８Ｆ−ＦＤＤＮＰ）を使用したＰＥＴ−スキャン、タンパク質凝集の減少、異栄養性神経突起の発達の防止または遅延、およびアストログリオーシスの軽減など）を使用することができる。回復の他の決定方法としては、認知機能アッセイが挙げられる。回復は、認知機能障害または記憶障害の発症の遅延、認知機能低下速度の有意な遅延、および日常生活における活動の改善として現れ得る。

Ａβ、Ｔａｕ、およびα−ｓｙｎに関連する疾患の処置方法も含まれる。β−アミロイド（Ａβ）、タウ、およびα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）は、それぞれ、アミロイド斑（Ａβ−斑）、神経原線維変化（ＮＦＴ）、およびレヴィ小体（ＬＢ）の主成分である。多数の神経変性障害は、これらの病変のうちの１つまたはそれより多くの存在によって特徴付けられる。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）は、Ａβ斑の蓄積および神経原線維変化によって特徴付けられる。ＡＤのサブタイプは、α−ｓｙｎ保有ＬＢも示す。

前記本発明の方法は、治療有効量の本明細書中に開示の単一の組成物および／または複数の組成物を投与する工程を含む。

以下の実施例を例示のみを目的として提供し、本実施例は、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

実施例１
エピトープワクチンのデザイン
エピトープワクチン組成物のデザインは、複数の無差別Ｔヘルパー（Ｔｈ）外来エピトープのプラットフォーム（ＭｕｌｔｉＴＥＰ）に基づく。ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのエピトープワクチンの作用機構を図１に示す。ワクチンのＭｕｌｔｉＴＥＰ成分は、広範なヒトＭＨＣ多型性を提供し、従来のワクチンおよび／または存命中の種々の病原体による感染に応答して生成されるナイーブＴ細胞および既存の記憶Ｔ細胞の両方を活性化する、適応免疫を活性化させる。任意のＢ細胞エピトープに融合したＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームまたはＡβ、タウ、もしくはα−ｓｙｎ由来のエピトープの組み合わせは、治療抗体の産生を誘導する。

実施例２
マウス、ウサギ、およびサルにおけるＤＮＡベースのＭｕｌｔｉＴＥＰエピトープワクチンの免疫原性および有効性
本実施例では、ｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥワクチンの改変バージョンを、第１のコピー中に遊離Ｎ末端アスパラギン酸を保有し、且つＰＡＤＲＥおよび集合的にＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームと命名された８個（ＡＶ−１９５５）または１１個（ＡＶ−１９５９）のさらなる無差別Ｔｈエピトープに融合されたｐ３Ａβ_１１を発現するように操作する。ｐ３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥの構築ストラテジーは記載されている（Ｍｏｖｓｅｓｙａｎ Ｎら、ＰＬｏｓ ＯＮＥ ２００８ ３：ｅ２１−４；Ｍｏｖｓｅｓｙａｎ Ｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００８ ２０５：５７−６３））。ＧＳリンカーによって分離された複数のＴヘルパーエピトープ（ＭｕｌｔｉＴＥＰ）をコードするポリヌクレオチドを合成し、３Ａβ_１１−ＰＡＤＲＥミニ遺伝子にライゲーションする（図２）。シグナル配列の正確な切断およびＡβ_１１の第１のコピー中のＮ末端アスパラギン酸の生成を、ＩＰ／ＷＢ技術によって示した（図３）。

ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＤＮＡエピトープワクチンの免疫原性を、遺伝子銃デバイスを使用した金粒子による送達後にマウスにおいて確立する。示すように、ＭｕｌｔｉＴＥＰワクチンであるＡＶ−１９５９およびＡＶ−１９５５によって誘導された細胞性免疫応答（図４Ａ）および体液性免疫応答（図４Ｂ）は、ＰＡＤＲＥ Ｔｈエピトープのみを有する第１世代のエピトープワクチンの送達から得た応答よりも有意に高い。

また、ＭｕｌｔｉＴｅｐワクチンの免疫原性を、マウス、ウサギ、およびサルにおいてエレクトロポレーション媒介針送達後に試験した。マウス、ウサギ、およびサルを、隔週または毎月のＤＮＡワクチンの注射によって数回免疫し、その後にエレクトロポレーションを行った。各免疫の１２〜１４日後に採血した。全ての試験した種において、ＭｕｌｔｉＴｅｐ ＤＮＡワクチンは、外来Ｔｈエピトープ（ＭｕｌｔｉＴｅｐプラットフォーム）に特異的な強い細胞性免疫応答を誘導するが、Ａβ_１１またはＡβ_４０に特異的な細胞性免疫応答を誘導しない（データは示さず）。

マウスの脾細胞ならびにウサギおよびサルのＰＢＭＣを、ワクチンのＴｈエピトープ部分のみを含む組換えタンパク質、Ｔｈエピトープを提示する個々のペプチドのカクテル、またはＡβ_４０ペプチドにてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。タンパク質およびペプチドカクテルの両方が免疫動物の脾細胞およびＰＢＭＣによる等しく強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖およびＩＦＮγ産生を誘導したが、コントロール動物のものでは誘導されなかった。対照的に、免疫動物またはコントロール動物のいずれかの脾細胞またはＰＢＭＣにおけるＡβ_４０ペプチドでの再刺激後に増殖もＩＦＮγ産生も認められなかった（図５Ａ、およびデータは示さず）。データは、活性化されたＴｈ細胞がＢ細胞によるＡβ特異的抗体の大量産生を補助したことを示す。

抗Ａβ抗体の濃度（マウスおよびウサギ由来の血清中の濃度）および力価（サル由来の血清中の力価）を、標準的なＥＬＩＳＡによって決定した。両方のＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームベースのＤＮＡワクチン（ＡＶ−１９５５およびＡＶ−１９５９）は、マウス（ＡＰＰ／ｔｇマウスが含まれる、データは示さず）、ウサギ、およびサルにおいて強力な細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導した。ＡＶ−１９５９ ＤＮＡエピトープワクチンによって生成された抗体の濃度およびエンドポイント力価を、図５Ａ、Ｂ、Ｃに示す。

全種で生成された抗体は、治療的に強力であった。抗Ａβ_１１抗体を、以前に記載のように（Ｍａｍｉｋｏｎｙａｎ Ｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２２３７６−２２３８６，２００７）、Ａβ１８−Ｃペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を固定したアフィニティーカラム（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によってＤＮＡエピトープワクチンで免疫したマウス、ウサギ、またはサルの血清から精製した。精製した抗体を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中での電気泳動によって分析し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して濃度を決定した。

精製した抗体の治療効力を、神経毒性アッセイ（Ｍａｍｉｋｏｎｙａｎ Ｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２２３７６−２２３８６，２００７；Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎ Ａら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ９：１００２−１０１０，２０１３；Ｄａｖｔｙａｎ Ｈら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３：４９２３−４９３４，２０１３）およびヒト脳組織内のＡβ斑への結合によってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで分析した。免疫動物由来の血清を、ＡＤ症例由来のホルマリン固定した皮質組織（Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，ＭＩＮＤ，ＵＣＩ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから受け取った）の５０μｍ脳切片中のヒトＡβ斑に結合する能力について標準的な免疫組織化学を使用してスクリーニングした。

Ａβに対する抗体の評価。異なる形態（例えば、モノマー形態および凝集形態）のＡβ_４２ペプチドへの抗体の結合を、記載のように（Ｍａｍｉｋｏｎｙａｎ Ｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２２３７６−２２３８６，２００７；Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎ Ａら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ９：１００２−１０１０，２０１３；Ｄａｖｔｙａｎ Ｈら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３：４９２３−４９３４，２０１３）、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ ＳＰＲプラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にて行った。モノマー、オリゴマー、および小繊維形態のＡβ_４２ペプチドを調製し、チップのデキストランマトリックス内のカルボキシル基への適切なペプチドの一級アミノ基のアミンカップリングを介してバイオセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の表面に固定した。精製した抗Ａβ_１１抗体または無関係のＩｇＧの系列希釈物を、各固定形態のペプチドに注射した。結合／解離の反応速度を、ＳＰＲシグナル（共鳴単位（ＲＵ）の）の変化として測定した。データを、１：１相互作用モデルを用いたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１．１ソフトウェアを使用して解析して、見かけ上の結合定数を決定した。

ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＡＤエピトープワクチンをワクチン接種した異なる動物モデル（マウス、ウサギ、およびサル）内に生成された抗Ａβ抗体は、機能的に強力であることが示される。サル血清から単離した抗体を使用して得た例示的なデータを、図６に示す。

ＡＶ−１９５５をワクチン接種したアカゲザルの血清から精製した抗Ａβ抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した場合、固定されたＡβ_４２のモノマー形態、オリゴマー形態、および小繊維形態に、それぞれ、１９．２×１０^−８、２．５×１０^−８、９．９×１０^−８の結合親和性で結合するが、無関係のサルＩｇＧではそうではない（図６Ｂ）。抗Ａβ抗体はＡＤ症例の脳内の皮質斑に結合したが、無関係のＩｇＧは結合しなかった（図６Ａ）。さらに、抗Ａβ抗体は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株のＡβ_４２小繊維およびオリゴマー媒介性の神経毒性を阻害する（図６Ｃ）。マウスおよびウサギから得た抗体について、類似の結果を得た。

実施例３
３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおけるＭｕｌｔｉＴＥＰ ＤＮＡエピトープワクチンによって生成された抗体のｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性
本実施例では、ＤＮＡエピトープワクチンの治療有効性を、約４〜５ヶ月齢の３ｘＴｇ−ＡＤマウスにおいて試験した（Ｏｄｄｏ Ｓら、Ｎｅｕｒｏｎ ３９：４０９−２１，２００３）。ワクチン接種したマウスは、ワクチンのＭｕｌｔｉＴＥＰ成分に特異的な強い細胞応答およびＡβ_４２ペプチドに特異的な抗体の高産生を誘導した。

ワクチン接種は、コントロールマウスにおけるものと比較して１８±０．５ヶ月齢の免疫マウスにおける神経病理学的変化を防止した。生成された抗体は、コントロール群に対して免疫マウスの脳におけるアミロイド負荷（散在性および高密度コアの斑）を有意に減少させた（図７Ａ）。エピトープワクチンは、免疫マウスの脳における可溶性のＡβ_４０およびＡβ_４２の統計的に有意な減少を誘導した（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０１）（図７Ｂ）。ワクチン接種したマウスは、高齢３ｘＴｇ−ＡＤマウスで炎症関連病態（小膠細胞活性化、アストロサイトーシス）の発症が有意に低く、脳微小出血の発生率が増加することはなかった（図７Ａ）。Ａβ沈着の減少は、アストロサイトーシスおよびＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の活性化の減少に関連していた。Ｔａｕ病態はまた、コントロール動物においてのものと比較してワクチン接種したマウスで減少する傾向を示した（図７Ａ）。エピトープワクチンで免疫されたマウス脳内へのＴ細胞の浸潤は認められなかった。

実施例４
ＭｕｌｔｉＴＥＰ ＤＮＡエピトープワクチンによって生じたＴ細胞応答のマッピング
本実施例は、マウスおよびサルにおけるＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォーム中の免疫原性Ｔｈ細胞エピトープのマッピングを示す。

ＭｕｌｔｉＴＥＰベースのＤＮＡエピトープワクチンで免疫されたＨ２−ｂハプロタイプのマウスは、エピトープであるＰＡＤＲＥ、Ｐ２１、Ｐ３０、Ｐ２、Ｐ７、およびＰ１７に応答する（図８）。

サルにおけるＴｈ細胞応答のマッピングにより、ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォーム内のＴｈエピトープの免疫原性は個々の動物間で異なっていたにもかかわらず、ＤＮＡエピトープワクチンＡＶ−１９５９が１０匹全てのマカクにおいてＴｈ細胞応答を誘導することが証明された。定量分析により、あるサルで強力なエピトープが他の動物では免疫原性が平凡または弱であり得ることが証明された。例えば、Ｐ３２での免疫ＰＢＭＣ培養物の再刺激後の２匹の動物で強いＴｈ細胞免疫応答（１０^６ＰＢＭＣあたり１００ＩＦＮγ陽性ＳＦＣ超）が検出された一方で、この応答は、１匹のマカクにおいて中程度であり（１０^６ＰＢＭＣあたり５０〜１００ＩＦＮγ陽性ＳＦＣ）、３匹のマカクにおいて弱く（１０^６ＰＢＭＣあたり５０ＩＦＮγ陽性ＳＦＣ未満）、４匹の動物において応答が検出されなかった（図９Ａ）。

図９Ｂ中の表は、ワクチン接種研究で使用したＮＨＰ（非ヒト霊長類）集団内のＴｈエピトープの出現率の分析を示す。データは、多様なＭＨＣクラスＩＩ分子を有する各マカクが異なるＴｈエピトープ組に応答したことを証明している。例えば、ＰＡＤＲＥは１００％のマカクで免疫原性であり、全動物由来のＰＢＭＣは１５種のうちの１４種のヒトＤＲ分子によって認識されることが公知（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１−７６１，１９９４）の合成無差別ＴｈエピトープであるＰＡＤＲＥでの再刺激に応答した。次に高い出現率のＴｈエピトープは、ＴＴ由来のＰ２、Ｐ３２、Ｐ１７、Ｐ２１、およびＨＢＶ由来のＨＢＶｎｃであり、これらは、ワクチン接種した動物のうちの５０〜６０％で免疫原性を示す。残りのＴｈエピトープが動物のうちの２０〜３０％でＴｈ細胞を活性化することができた一方で、１つのＴｈエピトープ（Ｐ７）は、ＡＶ−１９５９ワクチンで免疫された５匹のマカクのいずれにおいても認識されない。

実施例５
ＭｕｌｔｉＴＥＰエピトープワクチンは外来エピトープに特異的な記憶Ｔｈ細胞を活性化する
エピトープワクチンデザインの利点は、既存の記憶Ｔｈ細胞を活性化することによって高齢個体の免疫老化現象を克服することである。本実施例では、本発明者らは、組換えタンパク質ベースのＭｕｌｔｉＴＥＰエピトープワクチンでマウスを免疫した。以前に、Ｔｇ２５７６マウス（ＡＤのＡＰＰ過剰発現モデル）（Ｈｓｉａｏ Ｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７４：９９−１０２）における第１世代のペプチドベースのワクチンおよび組換えタンパク質ベースのワクチンの免疫原性および治療有効性が報告された（Ｐｅｔｒｕｓｈｉｎａ Ｉ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００７，２７：１２７２１−１２７３１；Ｄａｖｔｙａｎ Ｈら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１３，３３：４９２３−４９３４）。

本明細書中に示すように、組換えタンパク質ベースのＭｕｌｔｉＴＥＰワクチンは、既存の記憶Ｔｈ細胞を保有するマウスにおいてより強い免疫応答を誘導することができる。２群のＢ６ＳＪＬマウスを、ＱｕｉｌＡ中に製剤化されたＡＶ−１９５９ワクチンのＭｕｌｔｉＴＥＰ成分のみを含む組換えタンパク質またはＱｕｉｌＡのみで免疫した（図１０Ａ）。６ヶ月の休止期間後、ＭｕｌｔｉＴＥＰプライミングしたマウスおよびコントロールマウスを、組換えタンパク質ベースのＡＶ−１９５９エピトープワクチンで追加免疫し、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を分析した（図１０Ｂ、Ｃ）。ＡＶ−１９５９でのＭｕｌｔｉＴＥＰプライミングしたマウスの追加免疫により、ＭｕｌｔｉＴＥＰタンパク質に特異的な強いＴｈ細胞応答が誘導された。コントロールマウスと比較して非常に多数のＩＦＮγ産生細胞が、既存の記憶Ｔｈ細胞を有するこのマウス群で検出された（図１０Ｂ）。さらに、強力なＴｈ１アジュバントＱｕｉｌＡ中に製剤化したＡＶ−１９５９ワクチンでの単回注射により、既存の記憶Ｔｈ細胞を有するマウスのみにおいて強力な抗Ａβ抗体応答が誘導され、抗Ａβ抗体濃度はコントロールマウスにおける濃度よりも有意に高かった（Ｐ≦０．００１）（図１０Ｃ）。これらの結果は、エピトープワクチンでの１回の免疫でさえもこのワクチンのＴｈエピトープに特異的な既存の記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞を強く活性化し、同一ワクチンのＢ細胞エピトープに特異的な抗体の頑強な産生を迅速に誘導したことを証明している。

重要なことに、既存の記憶Ｔ細胞の活性化および高濃度の抗Ａβ抗体の迅速な産生は、Ｔｇ２５７６マウスにおいて治療効果があり、認知障害および病理学的Ａβの沈着を遅延させた。

２群の５ヶ月齢のマウスに、ＱｕｉｌＡ中に製剤化したＭｕｌｔｉＴＥＰタンパク質またはＱｕｉｌＡのみ（コントロール）のいずれかを２週間毎に３回注射した。最後の注射から６ヶ月後、１１ヶ月齢のときにマウスに、ＱｕｉｌＡ中に製剤化したタンパク質ベースのＡＶ−１９５９エピトープワクチンをマウスが１６ヶ月齢に到達するまで毎月追加免疫した。コントロールマウスに、ＱｕｉｌＡのみを注射した。エピトープワクチンでの単回追加免疫後、既存の記憶Ｔｈ細胞を有するマウスで強い抗Ａβ抗体応答が検出された。これらのマウス中の抗Ａβ抗体濃度は、ＱｕｉｌＡのみでプライミングし、ワクチンで追加免疫したマウスよりも有意に高かった（Ｐ≦０．００１）（それぞれ、３２．２０±１０．５５μｇ／ｍｌ対０．８２±０．２４μｇ／ｍｌ）。追加免疫後、抗体応答は両群で類似のレベルに到達した（データは示さず）。

マウスにおける認知障害の遅延に及ぼすワクチン接種の影響を、「新規物体認識」試験によって試験した。各マウスを、試験１日前に空の活動領域に５分間馴化させた。試験１日目に、マウスを、活動領域の反対側に配置した２つの同一の物体に５分間曝した。２４時間後、マウスを、１つの既知の物体および１つの新規の物体を有する活動領域に戻した。物体探索に費やした時間を、５分間記録した。認識指標は、マウスが新規物体を探索するのに費やした時間の百分率を示す。このタスクで使用する物体を、好き嫌いの行動を生じないように慎重に選択した。両実験群で行動の改善を示したが、既存の記憶Ｔ細胞を有するマウスのみがコントロールマウスより有意に高い認識指標を達成した（データは示さず）。したがって、両群由来のマウスが行動試験時に同等レベルの抗体を有していたにもかかわらず、追加免疫の開始時に既存の記憶Ｔ細胞を有するマウスにおける高濃度の抗Ａβ抗体のより迅速な生成がマウスにより有利であった。認知機能の改善は、追加免疫注射時にコントロール非免疫マウスまたは既存の記憶Ｔｈ細胞を持たないマウスの両方と比較して既存の記憶Ｔｈ細胞を有するマウスの脳の顕著な神経病理学的変化が小さいことに関連していた。

実施例６
α−シヌクレインを標的にするエピトープワクチン
本実施例は、α−ｓｙｎベースのエピトープワクチンがこの自己分子に特異的な細胞性免疫応答を生じることなく強い抗α−ｓｙｎ抗体応答を誘導することを証明する。

α−シヌクレインの免疫優性Ｂ細胞エピトープを同定するために、マウスを、無差別な強いＴｈ細胞エピトープＰＡＤＲＥと融合した全長α−シヌクレインをコードするＤＮＡで免疫した。３回目の免疫後に採取したワクチン接種済みマウス由来の血清を、α−ｓｙｎタンパク質を構成する９つの重複２０マーペプチドを使用したＢ細胞エピトープのマッピングのために使用した。６つの異なるペプチドに特異的な抗体が検出された（図１１Ａ）。α−ｓｙｎのＣ末端領域に局在する６つのＢ細胞エピトープのうちの３つが、以前に検出されたエピトープと一致する（Ｍａｓｌｉａｈ Ｅら、Ｎｅｕｒｏｎ ４６：８５７−８６８，２００５）。選択したペプチドを、これらがＴｈ細胞エピトープを保有するかどうかについて試験した（データは示さず）。エピトープ３６−６９を、エピトープワクチン生成のために選択した。組換えタンパク質は、大腸菌から精製されたＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに結合したα−ｓｙｎ_{３６−６９}（図１１Ｂ）から構成されていた。Ｂ６ＳＪＬマウスを、ＱｕｉｌＡアジュバント中に製剤化したこの免疫原で免疫した。Ｂ細胞応答およびＴ細胞応答の両方を、２週間毎の３回の免疫後に分析した。コントロール動物に、アジュバントのみを注射した。α−ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰは、適切なペプチド（データは示さず）および全長ヒトα−ｓｙｎ（図１２Ａ）に特異的な強い抗体応答を誘導した。細胞性免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した（図１２Ｂ）。α−ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰで免疫したマウスは、ＭｕｌｔｉＴＥＰタンパク質での再刺激後に頑強なＴ細胞応答を誘導したが、全長α−シヌクレインタンパク質（図１２Ｂ）またはα−ｓｙｎ_{３６−６９}ペプチド（データは示さず）では誘導しなかった。したがって、Ｈ２ｂｘｓハプロタイプのマウスにおいてα−ｓｙｎ_{３６−６９}がＴ細胞エピトープを保有しないことが確認された。

最近、カルパインＩが病理学的形態のα−ｓｙｎを切断して固有のα−ｓｙｎフラグメントを生成することが示された。このα−ｓｙｎフラグメントは、Ｎ末端配列ＫＡＫＥＧ（ａａ１０−１４）を有する。ＫＡＫＥＧを、Ｂ細胞エピトープ（中枢神経系内のα−ｓｙｎの異常な沈着を阻害する抗体の生成のための新規の免疫療法標的）として試験した。ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォームに融合したＫＡＫＥＧをコードするＤＮＡワクチンを生成し、遺伝子銃を使用してＣ５７Ｂｌ／６マウスを免疫した（２週間毎、３回）。ワクチン接種したマウスは、ＫＡＫＥＧに対して強い抗体応答を生じた（図１３Ａ）。さらに、このワクチンは、全長α−ｓｙｎに特異的な抗体を誘導しなかった一方で、このヒトタンパク質は、α−ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰで免疫したマウスから採取した免疫血清（ポジティブコントロール）によって認識された（図１３Ｂ）。

ワクチン接種したマウス由来の免疫血清を、ＩＨＣまたはＩＰ／ＷＢによってＤＬＢ症例由来のヒト脳中の病理学的形態のα−ｓｙｎの認識について試験した。全長α−ｓｙｎを認識しなかったα−ｓｙｎ_{３６−６９}−ＭｕｌｔｉＴＥＰおよびＫＡＫＥＧ−ＭｕｌｔｉＴＥＰの両方での免疫後に生成された抗体は、脳切片の陽性染色を示し、これは、これらの抗体が病理学的形態のα−ｓｙｎを認識したことの指標である。コントロール脳切片は、陰性染色を示した。

これらの実験は、以下を証明している：（ｉ）外来Ｔｈ細胞エピトープ（ＭｕｌｔｉＴＥＰプラットフォーム）と融合したα−ｓｙｎ_{３６−６９}に基づくエピトープワクチンが高力価の抗α−ｓｙｎ抗体を誘導したこと；（ｉｉ）エピトープワクチンによって生成された抗体は、未変性のα−ｓｙｎにｅｘ ｖｉｖｏで結合するので機能的であること、（ｉｉｉ）ペプチドα−ｓｙｎ_{３６−６９}が自己反応性Ｔｈ細胞エピトープを含まなかったので、エピトープワクチン中で使用することができたこと；（ｉｖ）ＫＡＫＥＧ−ＭｕｌｔｉＴＥＰエピトープワクチンがＫＡＫＥＧに特異的な強い抗体応答を誘導したが、全長α−ｓｙｎ特異的な強い抗体応答は誘導されなかったこと；および（ｖ）ＫＡＫＥＧネオエピトープに特異的な抗体が病理学的形態のα−ｓｙｎを認識し、ＤＮＡエピトープワクチン生成のために使用することもできたこと。

実施例７
病理学的タウタンパク質を標的にするエピトープワクチン
本実施例は、タウエピトープの選択ならびに病理学的タウを標的にするエピトープワクチンの生成および試験を記載する。

タウＢ細胞エピトープのマッピング。治療抗体の生成に潜在的に重要な非リン酸化タウ領域をマッピングするために、抗血清を、全長タウ（Ｎ２／４Ｒ）で免疫されたタウトランスジェニックマウスｒＴｇ４５１０（導入遺伝子は、サイトメガロウイルス最小プロモーターおよび上流テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）によって調節されたＰ３０１Ｌ変異を保有するヒト４反復タウである）から得た。ＥＬＩＳＡを使用して、１ａａ〜５０ａａ、５０ａａ〜１００ａａ、１００ａａ〜１５０ａａ；１５０ａａ〜２００ａａ、２００ａａ〜２５０ａａ；２５０ａａ〜３００ａａ；３００ａａ〜３５０ａａ；３５０ａａ〜４００ａａ；４００ａａ〜４４１ａａの組換えタウタンパク質へのポリクローナル血清の結合を検出した（したがって、本発明者らは、Ｎ２／４Ｒ分子の配列全体をチェックした）。データは、抗タウ抗体がタウタンパク質のａａ１〜５０にわたる領域に強く結合し、ａａ５０〜１００にも２５０〜３００にも結合しない（図１４）ことを証明した。ａａ１５０〜２００、２００〜２５０；３５０〜４００；および４００〜４４１にわたる組換えタウタンパク質でコーティングしたウェルにおいて中程度の結合が検出された。最後に、ａａ１００〜１５０および３００〜３５０にわたる組換えタウタンパク質でコーティングしたウェルにおいて低い結合が検出された。これらのデータから、タウオパシー（ｔａｕｐａｔｈｙ）を有する被験体の能動免疫療法に重要なタウ標的化エピトープワクチンの生成のためのエピトープの選択の基礎が得られた。２〜１８ａａを含むタウ領域を、エピトープワクチン生成のために選択した。

タウのａａ２〜１８領域は、通常、タンパク質折りたたみのために隠れており、タウの凝集中に露呈する（Ｍｏｒｆｉｎｉ ＧＡら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００９，２９：１２７７６−１２７８６；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ＰＭら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００４，２４：７８９５−７９０２）。ホスファターゼ活性化ドメイン（ＰＡＤ）とも呼ばれるａａ２〜１８領域は、前向ＦＡＴ阻害をもたらすタンパク質ホスファターゼＩおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３が関与するシグナル伝達カスケードの活性化で役割を果たす。ＦＡＴ阻害に必要なＰＡＤの露呈を、ＰＡＤのリン酸化およびＮＦＴ形成中に起こるタウタンパク質のＮ末端短縮によって調節することができる。Ｙ１８のリン酸化およびタウのＮ末端領域の短縮により、有毒領域が除去され得、防御の役割を果たし得る。したがって、このエピトープに対して生成された抗体は、正常なＴａｕではなく病理学的なＴａｕを認識することができる。かかる場合、エピトープワクチンは、タウオパシーの非常に初期の段階を標的にする抗体を誘導することができる。

エピトープワクチンを生成するために、タウ２−１８エピトープを、ＴＴの外来無差別Ｔｈエピトープ（Ｐ３０）と融合した。Ｈ２ｂｘｓハプロタイプのＢ６ＳＪＬマウスを、強力なＴｈ１アジュバントＱｕｉｌＡ（ＱＳ２１と同一）中に製剤化したタウ_２−１８−Ｐ３０ワクチンで免疫した。体液性免疫応答（ＥＬＩＳＡ）および細胞性免疫応答（ＥＬＩＳＰＯＴ）の両方を測定した。免疫によって高力価のタウ_２−１８特異的抗体が誘導され（図１５Ａ）、これは、ＥＬＩＳＡにおいて４Ｒ／０Ｎ野生型Ｔａｕ、４Ｒ／０Ｎ Ｐ３０１Ｌ Ｔａｕ、および領域１９〜２９ａａが欠失した４Ｒ／０Ｎ Ｔａｕも認識した（図１５Ｂ）。重要なことに、エピトープワクチンは、Ｐ３０に特異的であるが、タウ_２−１８に特異的ではない強いＴ細胞応答も誘導した（図１５Ｃ）。したがって、ＱｕｉｌＡアジュバント中に製剤化したタウ_２−１８−Ｐ３０ワクチンは、自己反応性Ｔｈ細胞を活性化しなかった一方で、このワクチンは強い非自己細胞性免疫応答を生じ、種々のＴａｕタンパク質に特異的な抗体を産生した。

実施例８
抗タウ抗体はＡＤ症例由来の脳内の病理学的なタウに結合する
本実施例では、本発明者らは、抗タウ抗体がＡＤ症例由来の脳切片内の病理学的タウに結合する能力を証明する。エピトープワクチンで免疫した実験マウスおよび無関係の抗原で免疫したコントロール動物由来の血清を、ＡＤ症例および非ＡＤ症例由来の脳切片についてアッセイした。結果は、１：５００希釈の実験マウス由来の免疫血清がＡＤ症例由来の脳内のＮＦＴを認識したが、コントロールマウス由来の免疫血清はそうではなかったことを示した（タングル段階Ｖ、斑段階Ｃ；図１６）。同一の免疫血清は、非ＡＤ症例の正常なタウに結合しなかった。したがって、タウエピトープワクチンは、病理学的形態のタウに特異的な抗体応答を誘導した。

実施例９
抗体は、Ｔａｕ凝集体の細胞間伝播をブロッキングする
本実施例では、本発明者らは、全長タウ凝集体が細胞に侵入して細胞内タウ反復ドメイン（ＲＤ）（２８０位に変異（ΔＫ２８０）を有するＴａｕタンパク質の凝集しやすいコア［ＲＤ（ΔＫ）］）の凝集を誘導するのをブロッキングする抗タウ抗体の治療可能性を証明する（Ｋｆｏｕｒｙ Ｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８７：１９４４０−１９４５１，２０１２）。より具体的には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを、図１７中で（ΔＫ−Ｃ）：（ΔＫ−Ｙ）と呼ばれる言及したタンパク質を発現する構築物で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中のＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰタンパク質およびＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰタンパク質の凝集を追跡するために使用した。共トランスフェクトした細胞の培養物への全長Ｔａｕ凝集体を含むＰ３０１Ｓ Ｔｇマウスの脳ライセートの添加によって誘導された、より活発な凝集が、ＦＲＥＴシグナルを増加させた。抗タウ_２−１８抗体での脳ライセートの前処理によって細胞表面上のタウ凝集体が捕捉されて（ΔＫ−Ｃ）：（ΔＫ−Ｙ）凝集の誘導を阻害し、ＦＲＥＴシグナルをベースラインレベルに低下させた（図１７Ａ）。さらに、共焦点顕微鏡法を使用して、脳ライセート／抗タウ_２−１８抗体複合体は、ＲＤ−ＹＦＰトランスフェクション細胞に内在化されることが示される（図１７Ｂ）。タウ凝集体の非存在下では非トランスフェクション（ＮＴ）細胞中にもＹＦＰ細胞中にも抗体は検出されなかった（データは示さず）。重要なことに、βシート形成および線維化を阻害する２つのプロリン置換であるＩ２２７ＰおよびＩ３０８Ｐ（ＰＰと呼ぶ）を含む変異形態のタウでＲＤ（ΔＫ）が置換された場合、抗体の内在化は認められなかった（データは示さず）。

別の一組の実験では、抗タウ_２−１８抗体が凝集したタウの経細胞移動をブロッキングする能力を試験した。ＨＥＫ２９３細胞を、タンパク質凝集能力を増加させる２つの疾患関連変異（Ｐ３０１ＬおよびＶ３３７Ｍ）（ＬＭ）を含む血球凝集素タグ化タウ（ＲＤ）を発現する構築物（ＬＭ−ＨＡ）でトランスフェクトした。これらの細胞集団を、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰタンパク質およびＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞と共存培養した場合、ドナー細胞（ＬＭ−ＨＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞）由来のＬＭ−ＨＡ凝集体の経細胞伝播は、ＣＦＰとＹＦＰとの間でＦＲＥＴによって検出したところ、レシピエント細胞（ＲＤ−ＣＦＰ／ＲＤ−ＹＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３）中でのΔＫ−Ｃ：ΔＫ−Ｙの凝集を誘導する。抗タウ抗体をこの系に添加してタウ伝播がブロッキングされる場合、ＦＲＥＴシグナルが減少する。４８時間の共存培養期間中に表示の希釈（１０^−２、１０^−３、および１０^−４）で培養培地に添加したタウ_２−１８およびＴａｕ_{３８２−４１２}に特異的な２つの抗体（Ｔａｕ_{３８２−４１２}−ＰＡＤＲＥでの免疫によってラットで生成される）は、タウ凝集体の細胞−細胞間伝播を阻害した。各試験群間の相対ＦＲＥＴを、図１８Ａに示す。さらに、共焦点顕微鏡法を使用して、抗タウ抗体は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面上のＲＤ−ＹＦＰ凝集体に結合することが証明される（図１８Ｂ）。

これらデータは、α−タウ_２−１８抗体およびα−タウ_{３８２−４１２}抗体が、凝集したＲＤ中の高次構造上の抗原決定基（ミモトープ）を認識することを示唆する。さらに、リン酸化タウ分子またはその誘導体（例えば、Ｂ細胞エピトープ）を免疫原として使用することなく治療抗タウ抗体を生成することができる。その代わりとして、タウオパシーを有する被験体に投与しても安全である治療抗体の生成のために非リン酸化タウを使用することができる。これは、かかる抗体が細胞内に侵入して正常なタウ分子の機能を阻害することがないからである。

実施例１０
多価ＤＮＡエピトープワクチンの生成および試験
本実施例では、Ｂ細胞エピトープの異なる組み合わせ（図１９）を含むＤＮＡエピトープワクチンを生成し、試験する。生成されたワクチンは、以下を含む：（ｉ）ａａ１〜１１を含むＡβ Ｂ細胞エピトープの３コピーおよびａａ２〜１８を含むＴａｕＢ細胞エピトープの３コピー；（ｉｉ）ａａ３６〜６９を含むα−ｓｙｎのＢ細胞エピトープの３コピー、ａａ２〜１８を含むＴａｕエピトープの３コピー、およびａａ１〜１１を含むＡβエピトープの３コピー；ならびに（ｉｉｉ）α−ｓｙｎのＫＡＫＥＧエピトープ、ａａ２〜１８を含むＴａｕエピトープの３コピー、およびａａ１〜１１を含むＡβエピトープの３コピー。全構築物において、Ｂ細胞エピトープを、外来Ｔ細胞エピトープのストリングに融合した。Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの各コピーを、ＧＳ小リンカー配列によって分離した（図１９）。これらの構築物を含むプラスミドからの免疫原の発現を、一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用して証明した（データは示さず）。

ＤＮＡエピトープワクチンを、Ｈ２ｂｘｓ免疫ハプロタイプのＢ６ＳＪＬマウスの免疫（６匹／群、３ヶ月毎に注射）のために使用した。コントロール動物に、無関係のＤＮＡワクチンを注射した。２価エピトープワクチン（ＡＶ−１９５３）をワクチン接種したマウスは、Ａβ_４２およびＴａｕタンパク質に対して強い抗体応答を生じた（図２０Ａ）。３価エピトープワクチン（ＡＶ−１９５０およびＡＶ−１９７８）をワクチン接種したマウスは、α−ｓｙｎ、Ａβ_４２、およびＴａｕタンパク質に対して強い抗体応答を生じた（図２０Ｂ）。細胞性免疫応答も測定し、多価エピトープワクチンで免疫したマウスが組換えタンパク質ＭｕｌｔｉＴＥＰまたは構築物中のＴｈエピトープを示すペプチドの混合物での再刺激後に頑強なＴ細胞応答を誘導したが（図２０Ｃ）、α−ｓｙｎ、Ｔａｕ、またはＡβ_４０では誘導されなかったことが証明された。
本発明の精神および範囲を逸脱することなく形態および詳細の種々の変更を行うことができると当業者に理解されるであろう。

Claims (21)

1. 少なくとも１つの免疫原を含む組成物であって、ここで、それぞれの少なくとも１つの免疫原が領域Ｂにカップリングした領域Ａを含み、
   ここで、領域Ａが、
   少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと、少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと、少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせを含み、
   領域Ｂが複数の外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含む、組成物。
2. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 少なくとも１つの免疫原が、領域Ａを領域Ｂにカップリングするリンカードメインを含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の組成物。
4. 前記リンカードメインが、ＧＳ、ＧＳＧＳＧ（配列番号３７）、ＹＮＧＫ（配列番号３８）、およびＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号３９）（式中、ｎは２〜５である）からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
5. 領域Ａが領域ＢのＮ末端にカップリングしているか、領域Ａが領域ＢのＣ末端にカップリングしている、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
6. 前記少なくとも１つのＡβ Ｂ細胞エピトープが配列番号１内に位置する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
7. 前記エピトープが配列ＥＦＲＨ（配列番号４１）を含む、請求項６に記載の組成物。
8. 前記少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープが配列番号２内に位置する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
9. 前記エピトープが、
   ＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤ（配列番号８）、ＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲ（配列番号９）、ＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳ（配列番号１０）、ＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳ（配列番号１２）、およびＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹ（配列番号１３）からなる群から選択される配列を含む、請求項８に記載の組成物。
10. 前記少なくとも１つのα−ｓｙｎＢ細胞エピトープが配列番号３内に位置する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
11. 前記エピトープの配列が、
    ＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ（配列番号１４）；ＡＧＳＩＡＡＡＴＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号１５）、ＱＥＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号１６）、ＥＭＰＳＥＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号１７）、ＫＡＫＥＧ（配列番号１８）、ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ（配列番号４２）、ＥＧＶＶＨＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫＥＱＶＴＮＶＧＧＡ（配列番号４３）、およびＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ（配列番号４４）からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記Ｔｈエピトープが１２〜２２アミノ酸長である、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
14. 免疫原をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む組成物であって、前記免疫原が、
    少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープもしくは少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、または少なくとも１つのアミロイド−β（Ａβ）Ｂ細胞エピトープと少なくとも１つのＴａｕＢ細胞エピトープと少なくとも１つのα−シヌクレインＢ細胞エピトープとの組み合わせ、および
    少なくとも１つの外来Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープ
    を含む、組成物。
15. 前記核酸分子が、配列番号４内に位置するＡβ Ｂ細胞エピトープ配列をコードする、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記核酸分子が、配列番号５内に位置するＴａｕＢ細胞エピトープ配列をコードする、請求項１４に記載の組成物。
17. 前記核酸分子が、配列番号６内に位置するα−ｓｙｎＢ細胞エピトープ配列をコードする、請求項１４に記載の組成物。
18. 請求項１４に記載の組成物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物。
19. 被験体に免疫原を投与する工程を含む、免疫応答を生じる必要のある被験体において免疫応答を生じるための請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原。
20. 前記被験体が、アルツハイマー病または異常なアミロイド沈着物、Ｔａｕ沈着物、およびα−ｓｙｎ沈着物に関連する１つまたはそれより多くの容態の発症リスクがあるか、あるいはアルツハイマー病または前記容態と診断されている、請求項１９に記載の免疫原。
21. アミロイド、タウ、および／またはα−ｓｙｎの沈着物に関連する容態を防止、処置、または回復するための請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫原であって、有効量の前記免疫原を前記容態の防止、処置、または回復の必要のある被験体に投与する工程を含む、免疫原。