JP2015527060A - 脂肪酸の短鎖エステル化におけるリパーゼ - Google Patents

Abstract

ジャガイモから得ることができるリパーゼであるパタチンが、脂肪酸アルキルエステルを得るための脂肪酸のエステル化反応において利点を有することが見出された。様々な工業プロセスにおけるパタチンの使用、およびこのリパーゼ活性を適用するための方法を記載する。

Description

序論
リパーゼが有機媒体中でエステルの形成を触媒し得ることは周知である。したがって、リパーゼを用いて、十分な遊離ヒドロキシ置換化合物の存在下でカルボン酸をエステルに変換することができる。

リパーゼの使用は、工業において一般的である。その例には、ラセミ薬物の分割、脂肪および脂質の修飾、香料の合成、ならびに医薬品および栄養補助食品の生産が含まれる。現在用いられているリパーゼの大半は、真菌または細菌発酵系を用いて得られるが、動物由来のリパーゼも同様にいくらか使用されている。植物由来のリパーゼは、工業への適用は比較的稀である。

工業的に最も適用可能なリパーゼは、細菌発酵混合物から得られる。その後、リパーゼは、厄介な下流加工を用いて単離しなければならない。これは困難でかつ費用のかかるプロセスであり、そのためリパーゼの利用可能性は限定される。したがって、このようなリパーゼは、全体としておよびタンパク質として純度が低い傾向があり、また炭水化物、塩、および起こり得る望ましくない副次的活性を多量に含む。さらに、市販のリパーゼ調製物は一般的に、広範な様々な非タンパク質物質、塩、および非リパーゼ酵素を含む（Bjurlin et al 2001 JAOCS 78-2 p 153-160（非特許文献1））。

通常、脂肪酸を必要とするエステル化反応は、多量の遊離脂肪酸を含む発酵汚泥の使用に依存する。これは非常にばらつきのある混合物をもたらし、この場合、遊離脂肪酸は多くの不純物の中の一成分として存在する。細胞膜中に存在するリン脂質は、これらの不純物の重要な構成成分である。例えば、よく使用されるリパーゼ酵素Novozyme 435は、油からエステルを生成するために脱ガム油を必要とする；リン脂質の存在は、エステル化反応を阻害する。リパーゼは一般的に、多量の不純物に対処することが困難であり、これは脂肪酸エステルの非効率的な合成を招く。

植物由来のリパーゼ酵素は、ジャガイモから得ることができる。ジャガイモタンパク質は、3つのカテゴリー：(i) パタチンファミリー、高度に相同的な酸性43 kDa糖タンパク質（ジャガイモタンパク質の40〜50 wt.%）、(ii) 塩基性5〜25 kDaプロテアーゼ阻害剤（ジャガイモタンパク質の30〜40 wt.%）、および(iii) 主に高分子量タンパク質である他のタンパク質（ジャガイモタンパク質の10〜20 wt.%）に分類され得る。パタチンファミリーは、いくらかのリパーゼ活性を有することが知られており、単一段階クロマトグラフィープロセスならびにその後の濃縮および乾燥によって得ることができる。数ある中でも高純度のパタチンを単離するための非常に簡便なプロセスが、出願WO2008/069650（特許文献1）に記載されている。

しかしながら実際には、パタチンと称されるジャガイモタンパク質リパーゼを含むジャガイモタンパク質は、実際の商用用途がないという理由で、主に動物用の供給原料として用いられている。

WO2008/069650

Bjurlin et al 2001 JAOCS 78-2 p 153-160

本発明は、特定のエステルを合成するためにパタチンを使用する手段を提供する。したがって、パタチンを用いて、C₄〜C₂₆脂肪酸、好ましくはC₄〜C₁₂脂肪酸、およびより好ましくはC₆〜C₁₀脂肪酸、最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸からエステルを生成することができる。本発明の方法を用いて得られるエステルは、C₁〜C₃アルコール、好ましくは一価アルコール、より好ましくはエタノールまたはメタノール、および最も好ましくはメタノールから調製される。

様々なメタノール濃度における残存リパーゼ活性を示す。 パタチンによって合成された脂肪酸アルキルエステル（FAAE）の薄層クロマトグラムを示す。レーン1は遊離脂肪酸（FFA、具体的にはラウリン酸、C₁₂）を含み、レーン2はヤシ油ベースのFAMEを含み、レーン3〜7は、それぞれメタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、およびn-ブタノールとラウリン酸の反応産物を含む。 増加した塩濃度の存在下における脂肪酸の沈殿を示す。左側：オクタン酸と脱塩水の二相系における非沈殿オクタン酸。右側：オクタン酸と飽和KCl水溶液の二相系における脂肪酸オクタン酸の沈殿。

詳細な説明
本発明の範囲に関して、パタチンは、天然ジャガイモタンパク質単離物の高分子量（HMW）画分で、ジャガイモタンパク質の約40〜50 wt.%を構成する、30 kDaまたはそれ以上、好ましくは35 kDaまたはそれ以上、およびより好ましくは約43 kDaの分子量、ならびに5.8未満、好ましくは4.8〜5.5の間の等電点を有する糖タンパク質の高度に相同的なファミリーを意味すると理解される。パタチンは、アシルヒドロラーゼ反応性を示す糖タンパク質のファミリーであり、ジャガイモ塊茎中の全可溶性タンパク質の40 wt %までを占める。出願WO2008/069650において、ジャガイモ果汁（PFJ）またはジャガイモ果実水（PFW）からのパタチンの単離の入念な説明が記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

このプロセスは、ジャガイモ果汁をpH 7〜9において二価金属カチオンによる凝結に供すること、および凝結したジャガイモ果汁を遠心分離し、それによって上清を形成することを伴う。続いて、この上清を、ジャガイモタンパク質と結合し得る吸着剤を用いて、pH 11未満および温度5〜35℃で操作する膨張層吸着クロマトグラフィーに供し、それによって天然ジャガイモタンパク質を吸着剤に吸着させる。最後に、溶出剤を用いて、少なくとも1種の天然ジャガイモタンパク質単離物を吸着剤から溶出させる。この方法は特に、変性タンパク質が最小限に存在し、かつ安定した溶解度を特徴とする、高純度の単離された天然パタチンをもたらす。

ジャガイモ果汁は、pH 7〜9、好ましくはpH 7.0〜7.5において二価金属カチオンで前処理して、望ましくない物質を凝結させ、その後遠心分離によって綿状沈殿物を分離する。特に適切な二価金属カチオンはCa²⁺である。この前処理は、ジャガイモ果汁から、負荷電ポリマー、ペクチン、糖アルカロイド、および微生物などの望ましくない物質を除去する。特に、ペクチンおよび糖アルカロイドの除去は、これらの化合物がジャガイモタンパク質に付着し、凝結を引き起こす可能性があり、それによって溶解度およびその他の物理的特性の観点から不安定なタンパク質単離物をもたらすという理由で、有利である。

このプロセスの第2段階では、上清を膨張層吸着クロマトグラフィーに供する。パタチンのより良い安定性のために、出発材料の温度を35℃未満に保持することが有利である。さらに、典型的に600〜1 200 cm/hという範囲の、中程度に高い流速を用いることが好ましい。膨張層吸着クロマトグラフィーは、pH 11未満、好ましくはpH 10未満で操作する。

前処理したジャガイモ果汁中の天然ジャガイモタンパク質は、それらを膨張層吸着カラム内の適切な吸着剤上に結合させることによって、上清から単離する。一定量の天然ジャガイモタンパク質と結合するカラム材料には、混合モード吸着剤、例えば、Amersham Streamline（商標）Direct CST I（GE Healthcare）、Fastline吸着剤（Upfront Chromatography A/S）、マクロ多孔性吸着剤、例えばAmberlite（商標）XAD7HP（Rohm & Haas Company）、およびイオン交換吸着剤が含まれる。次いで、パタチンなどの天然ジャガイモタンパク質単離物を回収するため、天然ジャガイモタンパク質を吸着している吸着剤を適切な溶出剤で溶出させる。溶出剤は、好ましくは、4〜12の範囲のpH、より好ましくは5.5〜11.0の範囲のpHを有する。

混合モード吸着剤を用いる好ましい態様において、タンパク質は等電点および分子量の両方に対して分画され得る。これによって、例えばパタチン画分とプロテアーゼ阻害剤画分の分離が可能になる。パタチン単離物は、pH 5.7〜8.7、好ましくはpH 5.8〜6.5において溶出される。

アシルヒドロラーゼ反応性は、一般に、水分子によるエステル結合の加水分解を触媒して、構成成分であるカルボン酸とアルコールを形成する酵素（のクラス）の能力として理解される。この反応は、反応条件の適切な調節により逆転させることができ、この場合、カルボン酸とアルコールのエステル化が起こる。反応の方向に影響を及ぼし得る反応条件には、例えば、温度、反応物の独自性、ならびに／または存在する水、カルボン酸、およびアルコールの量が含まれる。

本発明に従って、パタチンが有機環境に対して比較的頑強な耐性を有することが見出された。加えて、パタチンは一般的な植物材料から単離されるため、発酵ブロスおよび厄介な下流加工から得られる単離されたリパーゼよりもはるかに容易に、大量に得ることが容易である。

こうした理由で、パタチンは、C₄〜C₂₆脂肪酸、好ましくはC₄〜C₁₂脂肪酸、およびより好ましくはC₆〜C₁₀脂肪酸、最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸のエステルの調製に非常に適している。エステルは、アルコール、好ましくは小分子アルコール、すなわちC₁〜C₃アルコールとの反応によって得られる。小分子アルコールは、純粋に供給され得るか、またはいくつかの小分子アルコールの混合物として供給され得る。好ましくは、一価アルコールが用いられ、さらにより好ましくはエタノールまたはメタノール、および最も好ましくはメタノールが用いられる。

好ましい態様では、C₁またはC₂一価アルコール、すなわちメタノールもしくはエタノール、またはそれらの混合物を用いて、C₄〜C₂₆脂肪酸、好ましくはC₄〜C₁₂脂肪酸、およびより好ましくはC₆〜C₁₀脂肪酸、最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸のメチルエステルおよびエチルエステルが調製される。

本発明に従って、本発明によるパタチンのアシルヒドロラーゼ反応性が、脂肪酸と小分子アルコールのエステル化をもたらし得ることが発見された。このように、パタチンのアシルヒドロラーゼ反応性を用いて、エステルを合成することができる。したがって、たとえこの混合物が大量の不純物を含むとしても、短鎖脂肪酸アルキルエステルを生成する方法において、パタチンを使用することができる。

したがって、本発明は、脂肪酸アルキルエステルを好ましくは選択的に調製するための方法であって、1種または複数種のC₄〜C₂₆脂肪酸と、1種または複数種のC₁〜C₃アルコールと、天然パタチンとを含む液体媒体を提供する段階、および該1種または複数種の脂肪酸を該1種または複数種のアルコールと反応させて脂肪酸アルキルエステルを得る段階を含む方法に関する。

本発明による方法において、脂肪酸は、C₄〜C₂₆脂肪酸、好ましくはC₄〜C₁₂脂肪酸、より好ましくはC₆〜C₁₀脂肪酸、および最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸である。

1種または複数種のC₁〜C₃アルコールは好ましくは1種または複数種の一価アルコールを含み、その中では、n-プロパノール、i-プロパノール、エタノール、および／またはメタノールが用いられ、ならびにより好ましくはメタノールおよび／またはエタノールが用いられる。

非常に好ましい態様において、アルコールはメタノールおよび／またはエタノールであり、脂肪酸はC₄〜C₁₂脂肪酸であり、かつ脂肪酸アルキルエステルはC₄〜C₁₂脂肪酸のメチルエステルまたはエチルエステルである。

脂肪酸は、短いものから非常に長いものまで鎖長によって分類される：
・短鎖脂肪酸（SCFA）はC₆よりも短い脂肪酸である。
・中鎖脂肪酸（MCFA）はC₆〜C₁₂脂肪酸である。
・長鎖脂肪酸（LCFA）はC₁₃〜C₂₁脂肪酸である。
・超長鎖脂肪酸（VLCFA）はC₂₂よりも長い脂肪酸である。

一般的に、リパーゼは、エステル化混合物中に存在する不純物に対して感受性がある。一方パタチンは、不純物に対して、特にリン脂質に対して、感受性がはるかに低い。したがって、本発明の方法の利点は、脂肪酸供給原料が、他のリパーゼについてよりも多量の不純物、特にリン脂質を含んでもよいという点である。

他の酵素ベースのエステル化反応において、リン脂質の存在はエステル化反応を阻害する場合が多い。こうした理由で、リン脂質は脂肪酸供給原料から除去しなくてはならない。このために供給原料はより高価となり、したがって産物もより高価となる。したがって、エステル産物は、他のリパーゼベースのエステル化プロセスを用いた場合よりも、パタチンを用いてはるかにより安価に生成することができる。

本発明の方法における脂肪酸は、脂肪酸供給原料によって供給され得る。この供給原料は、特に本発明において使用するための脂肪酸を含む固形または液体媒体である。好ましくは、供給原料は液体媒体である。液体媒体は溶媒を含み得るが、例えば媒体が融解している条件下では、溶媒を使用せずに本発明の方法を行うことも可能である。

脂肪酸供給原料は、C₄〜C₂₆脂肪酸のエステルをもたらすために、C₄〜C₂₆脂肪酸のうちの少なくとも1種またはC₄〜C₂₆脂肪酸の任意の混合物を含む。特に、本発明によるアルコールとの反応のための供給原料は、短鎖または中鎖脂肪酸、すなわちC₄〜C₁₂脂肪酸のうちの少なくとも1種またはその任意の混合物を含む。より好ましくは、供給原料は、C₆〜C₁₀脂肪酸、最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸のうちの少なくとも1種またはその任意の混合物を含む。これは、C₄〜C₁₂脂肪酸の、好ましくはC₆〜C₁₀脂肪酸の、最も好ましくはC₈〜C₁₀脂肪酸のエステルをもたらす。

脂肪酸供給原料中の脂肪酸は、モノグリセリド、ジグリセリド、および／またはトリグリセリドの形態でグリセロールに結合しているなど、任意の形態で存在してよいが、供給原料はまた、リン脂質または部分的に加水分解されたリン脂質を含んでもよい。加えて、脂肪酸は、遊離脂肪酸として供給原料中に存在してもよい。また、これらの成分のいずれかまたはすべての混合物が存在してもよく、同様にその他の非脂肪酸結合成分が存在してもよい。しかしながら好ましくは、脂肪酸は、遊離脂肪酸として少なくともかなりの量で供給原料中に存在する。この文脈におけるかなりの量とは、6 g/L、好ましくはより多い90 g/Lである。

遊離脂肪酸が比較的大量に存在してよいというのが、本方法の利点である。最も好ましくは、遊離脂肪酸の量は、脂肪酸供給原料中に存在する脂肪酸の全量に占める割合として表して、供給原料の重量に基づいて少なくとも25 wt.%であり、好ましくは40 wt.%よりも高い。

適切な脂肪酸供給原料の例は、動物の脂肪または油、植物油であり、その中には、加水分解されたおよび／または酸化した植物油、例えば、使用済み揚げ油、傷んだバター脂肪、および低品質獣脂などが含まれる。

しかしながら別の態様において、脂肪酸供給原料は発酵汚泥である。本方法に従ったパタチンの使用により、不純物に対する許容度が増すため、発酵汚泥供給原料は、それが含む脂肪酸とアルコールのエステル化によく適している。重要なことにはその中にリン脂質も含まれる不純物が、エステル化反応を妨げることなく反応媒体中に大量に存在し得るというのが、本発明の明確な利点である。

本発明において使用するためのアルコールは、少なくとも1種のC₁〜C₃アルコール、好ましくは一価アルコール、ならびにより好ましくはメタノールおよび／またはエタノールである。これらのアルコールと短鎖脂肪酸のエステルは芳香性が高い傾向があるのに対して、中鎖または長鎖脂肪酸とのエステルは有利にバイオディーゼルとして機能し得る。好ましくは、C₁〜C₃一価アルコールは、末端アルコール、すなわち、メタノール、エタノール、および1-プロパノールである。しかしながらより好ましくは、アルコールは、C₁〜C₂アルコール、すなわちメタノールまたはエタノールである。しかしながら最も好ましいのは、脂肪酸アクセプターとしてのメタノールの使用である。より短い鎖のアルコールが好ましいが、それはパタチンの存在下で脂肪酸と反応性がより高いためである。

本発明による方法において、パタチンは担体上に固定化されて存在してもよいが、好ましくは担体なしで用いられる。リパーゼの固定化のための担体は、当技術分野で周知である。一例はceliteである。したがって、パタチンは、反応媒体の性質に応じて、溶解された形態であるか、または分子的に分散された形態で存在し得る。パタチンは反応媒体中に自由に懸濁されていることが好ましい。

リパーゼの欠点は、リパーゼを自由溶液中で安定化するために、一般的に大量の塩、例えば50%までのカリウム塩などを必要とする点である。しかしながら、塩は、結晶化を誘導するために、脂肪酸のエステル化反応に対して妨害効果を及ぼす。先行技術ではこうした理由で、リパーゼは典型的に担体上に固定化された形態で用いられる。パタチンは、担体なしで、すなわち媒体中に自由に懸濁された状態で使用するのに、塩による安定化を必要とせず、こうした理由で、パタチンは本発明による脂肪酸と低分子量アルコールのエステル化に特に適している。

既に述べたように、本発明の方法が行われる反応媒体は好ましくは液体であり、少なくとも本発明の脂肪酸供給原料およびまたは複数種のアルコールを含む。加えて、媒体は、水などの溶媒、および／または溶媒などの有機化合物、例えば、脂肪族化合物、エーテル、エステル、もしくは芳香族化合物などを含み得る。

エステル化反応中にかなりの量の水が存在してよいというのが、パタチンの使用の利点である。したがって、本発明は、反応媒体の体積に基づいて91 体積%までという、反応媒体中の含水量で機能し得る。しかしながら好ましくは、含水量は、反応媒体の体積に基づいて73 体積%よりも低く、さらにより好ましくは40 体積%よりも低く、より好ましくは19 体積%未満である。反応媒体中の含水量が反応媒体の体積に基づいて50 体積%超である場合、これは水性と称される。

しかしながら、本発明の方法はまた、反応媒体の体積に基づいて50 体積%未満の含水量で、本質的に有機媒体中で実施することもできる。この場合、反応容器中の含水量は、反応媒体の体積に基づいて5 体積%まで低くてよく、またはさらには2 体積%まで低くてもよい。たとえ本方法が本質的に有機媒体中で行われるとしても、少なくともいくらかの水、すなわち反応媒体の体積に基づいて少なくとも2 体積%で水が存在することが好ましい。

媒体が本質的に有機媒体である場合、脂肪酸供給原料は少なくとも本発明のアルコールで希釈され、このアルコールは本態様において溶媒および反応物として機能し得る。全反応成分の即時溶解を達成するよう適切に選択され得る、異なる溶媒を使用することも可能である。適切な例には、オクタン、イソオクタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、およびブタノールが含まれる。好ましい溶媒は、オクタンおよびイソオクタンである。1種または複数種の溶媒と、溶媒として機能するアルコールとの組み合わせを含む、溶媒の組み合わせを使用することも可能であることが理解されよう。

反応媒体中の脂肪酸の濃度は、好ましくは反応媒体の重量に基づいて12〜84 wt.%の間である。好ましくは、これらの脂肪酸は遊離脂肪酸の形態で存在する。

反応媒体中のアルコールの濃度は、好ましくは遊離脂肪酸に対してわずかにモル過剰である。融解した媒体中では、遊離脂肪酸は、好ましくは反応媒体の重量に基づいて80 wt.%超、より好ましくは84 wt.%超の濃度で存在する。有機溶媒中では、遊離脂肪酸は、反応媒体の重量に基づいて10 wt.%超、より好ましくは12 wt.%の濃度で存在する。

一般的に、パタチンは、脂肪酸の量に基づいて1 wt.%、より好ましくは10 wt.%の濃度で存在する。

したがって、本発明はまた、脂肪酸アルキルエステルを好ましくは選択的に調製するための方法を開示し、該方法は、天然パタチンを、脂肪酸、1種または複数種のアルコール、および任意で他の成分と、任意の順序で混合する段階、ならびにエステル化を起こさせる段階を含み、ここで、該混合物はかなりの量のリン脂質を含み、該脂肪酸は好ましくは短鎖または中鎖脂肪酸を含み、かつ該アルコールはC₁〜C₃一価アルコール、好ましくはメタノールおよび／またはエタノールであり、かつ該脂肪酸アルキルエステルはC₄〜C₁₂脂肪酸のC₁〜C₃エステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルである。好ましくは、パタチンが担体上に固定化されずに用いられる場合、前記混合は好ましくは、パタチンが反応媒体中に自由に懸濁されるように行われる。別の態様では、アルコールを有利に、明確な間隔で分割量として添加するか、または反応を通して連続して添加して、反応速度を調節し、かつ酵素の変性を回避することができる。当然のことながら、収率の良い反応を達成するために、アルコールの全量は望ましい変換を達成するために十分でなくてはならない。

好ましい態様において、本発明による方法は、付加的な溶媒の非存在下で行われる。この場合、反応媒体は、短鎖または中鎖脂肪酸を含む脂肪酸供給原料、およびアルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールを含む。本態様に従って、本方法は好ましくは媒体が融解している条件下で行われる。

反応条件は、共通の一般知識に基づいて当業者によって最適化され得る。例えば、反応温度は、パタチンの安定性および反応性に影響を及ぼさない限り、重要ではない。好ましくは、反応は、周囲条件下で、または脂肪酸供給原料の融点を上回る温度で行われる。適切な反応温度は一般的には10〜75℃の間、好ましくは15〜60℃の間、より好ましくは20〜45℃の間である。

好ましくは、得られる脂肪酸アルキルエステルは、反応混合物から単離され、任意で、例えば蒸留、液液抽出、または超臨界CO₂抽出によってさらに精製される。

本発明の方法は、バイオディーゼルを生成するために簡便に使用することができる。したがって、本発明は、バイオディーゼルを生成するための方法であって、パタチンを、1種または複数種のC₄〜C₂₆脂肪酸を含む脂肪酸供給原料および1種または複数種のC₁〜C₃アルコールと混合する段階、ならびに該1種または複数種の脂肪酸を該1種または複数種のアルコールと反応させる段階を含む方法を開示する。本方法において、パタチンは好ましくは供給原料中に自由に懸濁される。

パタチンは一般的な植物から容易に利用しやすく、大量に単離することができるため、本方法においてパタチンを使用することは特に有益である。また、パタチンは、リン脂質などの不純物を比較的大量に含む供給原料からバイオディーゼルを生成することができる。最後に、塩の存在は、バイオディーゼルに変換させるための脂肪酸の融点を上昇させる。他のリパーゼとは対照的に、自由に懸濁されたパタチンの塩による安定化は必要ではないため、バイオディーゼル生成中の塩の存在の悪影響は、パタチンを用いた場合に回避される。これは本発明による脂肪酸アルキルエステルをもたらし、これをバイオディーゼルとして使用することができる。

本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。

実施例1：有機溶媒中のリパーゼ活性
多くの脂質分解プロセスは、有機溶媒中またはそのような溶媒の水性混合物中で行われる。主要な例は、トリグリセリドまたは遊離脂肪酸からのバイオディーゼルの生成である。これらの場合、低MWアルコールが、脂肪酸アルキルエステル（FAAE）を形成するためのアシルアクセプターとして用いられる。アルコールは、反応物と溶媒の両方を兼ねる。得られるバイオディーゼルの価格および品質の理由で、メタノールが好ましいアルコールである。

このようなアプローチは反応混合物中の水を許容し得るが、高濃度のアルコールに耐えて、反応が起こるための駆動力を提供する酵素を必要とする。

様々なメタノール濃度において、パタチン（Solanic 206P）を10 mM pH 6.5緩衝液中の1 mMの発色性酪酸パラニトロフェニルと接触させた。これらの系におけるパタチン活性を、BioRad Model 680プレートリーダーで405 nmの吸光度の増加を測定することにより決定した。該パタチン活性をmOD／分で表す。結果から、パタチンが活性を失うことなく20%までのメタノールを許容し得ること、および40%を超えるメタノールが存在し得た後にすべての活性が失われることが示される。

実施例2：融解した基質中でのパタチンによる脂肪酸アルキルエステルの合成
脱塩水100μL中10 mgのパタチン（Solanic 206P）を、5 mmol（1.0 g）のラウリン酸（Merck 8.05333）、ならびに当モル量のメタノール（Merck 1.06007）、エタノール（Prolabo 83804.360）、n-プロパノール（Alfa Aesar A19902）、イソプロパノール（Prolabo 437423R）、またはn-ブタノール（Merck 1.01990）のいずれかと接触させた。脱塩水を添加して、20%（v:v）アルコール水溶液を作製した。この混合物を、激しい撹拌下において45℃で一晩インキュベートした。

参照脂肪酸メチルエステル（FAME）は、1.85%の濃縮塩酸（Merck 1.00317）を含むメタノール100 mL中に1グラムのヤシ脂肪（SigmaAldrich C1758）を溶解し、その混合物を4時間還流させることによって調製した。反応産物を蒸発させて、透明な黄色い油を得た。

反応産物は、50%水性エタノール中の2.4%ホウ酸（Fluka 15663）で前処理したシリカプレート（Uniplate Z26529-2）上で、TLCによって解析した。

全試料を、80:20:2の比率のn-ヘキサン（Merck 1.04367）、エーテル（Merck 1.00921）、および酢酸（Prolabo 20104.334）からなるTLC溶離液で20倍希釈し、単一毛細管容量をプレート上にスポットした。プレートを溶離液中で展開し、風乾した。プレートに濃縮硫酸（Merck 1.00371）をスプレーした。この処理により、ラウリン酸およびそのエステルが、青色バックグラウンドに対する白色スポットとして出現した（図10）。

発色させたTLCプレートは、レーン1においておおよそ中間の高さに遊離ラウリン酸を示し、レーン2において先端近くに移動したFAMEを示す。

パタチンおよびアルコールと共にインキュベートしたラウリン酸は、下部から中間の位置に残存量の遊離脂肪酸を示し、プレートの上部近くの先端において脂肪酸アルキルエステルを示す。パタチンは、遊離脂肪酸および小アルコールからのFAAEの形成を触媒し、メタノール、エタノール、およびn-プロパノールの順に高変換が起こる。

実施例3：有機溶媒中でのパタチンによる脂肪酸アルキルエステルの合成
オクタン酸（Merck 8.00192.1000）および20%メタノール（Merck liChrosolv 1.06007.1000）をイソオクタン（SigmaAldrich 360597）中に混合して、オクタン酸とメタノールがおよそ等モル量となるようにした（イソオクタン中にオクタン酸11.0 mLおよび20%メタノール16.8 mL）。500 mgのパタチン（Solanic 206P）および40 mgの水を添加した。パタチンを除外すること以外は同様の方法で、ブランク試料を調製した。反応は閉塞チューブ中で行い、閉蓋を備えた水浴中でチューブを加熱した。溶液を50 Cで4時間インキュベートした。反応容器から分割量を採取し、純粋アセトニトリル（Merck LiChrosolv 1.00030.25007）で10倍希釈し、HPLCによって解析した。HPLCに逆相シリカゲルカラム（C18セファロース）、202 nmで作動するUV検出器（Knauer Smartline UV検出器2600）、および勾配ミキサー（Smartline Manager 5000溶離液ミキサー）を取り付けた。アセトニトリル勾配をHPLC実験に適用した。

50%アセトニトリル溶離液は、milliQ水と混合し、0.5μm濾過することによって調製した。カラムを溶離液で前処理した。試料をアセトニトリル中に直接注入し、20分にわたって50〜100%アセトニトリル勾配で溶出した。脂肪酸メチルエステルの定量は、純粋オクタン酸メチル（SigmaAldrich 260673-23G）から調製した検量線に対して行った。

パタチン試料は、オクタン酸から対応するメチルエステルへの12%の変換を示し、このことからエステル化の成功が示された。

実施例4：パタチンのホスホリパーゼ活性
異なるアシル鎖長のリン脂質を、0.5%アラビアゴムおよび100 mM Triton X100を含む水溶液中に、30分間超音波処理することによって分散させた。100 mgまでの量のパタチンを添加し、水酸化ナトリウムの消費を、pH 7.5で作動するpHスタット設定によりモニターした。

鎖長が9までのジアシル-グリセロリン酸コリンは、パタチン加水分解に対して感受性がある。

（表２）mmol／分／gパタチンで表示した、周囲温度での様々な基質に対するパタチン活性

本実験から、パタチンがリン脂質を加水分解できることが示され、そのため、パタチンはエステル化媒体中のリン脂質の存在によって不活化されないことが予測される。

実施例5：遊離脂肪酸に及ぼす塩の影響
オクタン酸（Merck 8.00192.1000）の1 mL分割量を、脱塩水または飽和塩化カリウム（SigmaAldrich P9311）溶液のいずれかと混合し、50℃まで短時間加熱した。冷却時に、オクタン酸‐塩溶液混合物は、有機相中に濁りおよび界面上に石鹸カスを示したのに対して、オクタン酸‐水混合物は、透明でかつ石鹸のないままであった。濁りは部分沈殿を示す。結果から、塩の存在が遊離脂肪酸の取り扱いをより困難にすることが示される。

Claims (12)

1. 脂肪酸アルキルエステルを選択的に調製するための方法であって、1種または複数種のC₄〜C₂₆脂肪酸と、1種または複数種のC₁〜C₃アルコールと、天然パタチンとを含む液体媒体を提供する段階、および該1種または複数種の脂肪酸を該1種または複数種のアルコールと反応させて脂肪酸アルキルエステルを得る段階を含む、方法。
2. パタチンが液体媒体中に自由に懸濁されている、請求項1に記載の方法。
3. アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、脂肪酸がC₄〜C₁₂脂肪酸であり、かつ脂肪酸アルキルエステルがC₄〜C₁₂脂肪酸のメチルエステルまたはエチルエステルである、請求項1または2に記載の方法。
4. 媒体が本質的に、短鎖または中鎖脂肪酸を含む脂肪酸供給原料、およびメタノールまたはエタノールのみを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
5. 媒体が融解している、請求項4に記載の方法。
6. アルコールがメタノールである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. バイオディーゼルを生成するための方法であって、パタチンを、1種または複数種のC₄〜C₂₆脂肪酸を含む脂肪酸供給原料および1種または複数種のC₁〜C₃アルコールと混合する段階、ならびに該1種または複数種の脂肪酸を該1種または複数種のアルコールと反応させる段階を含む、方法。
8. パタチンが供給原料中に自由に懸濁される、請求項1に記載の方法。
9. アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、脂肪酸がC₄〜C₁₂脂肪酸であり、かつ脂肪酸アルキルエステルがC₄〜C₁₂脂肪酸のメチルエステルまたはエチルエステルである、請求項7または8に記載の方法。
10. 供給原料が本質的に、短鎖または中鎖脂肪酸を含む脂肪酸供給原料、およびメタノールまたはエタノールのみを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
11. 供給原料が融解している、請求項10に記載の方法。
12. アルコールがメタノールである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

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