JP2015503920A - 乳癌の予測および診断のためのバイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト乳癌の予測および診断のための、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアント（配列番号４８に示した配列）ならびにＣＳＴ１遺伝子によりコードされたシスタチンＳＮタンパク質（配列番号５２に示した配列）の利用を提供する。本発明は、乳癌および乳癌転移の診断と、乳癌の感受性の解析と、原発性または転移性乳癌患者の治療、医療、有効性および予後の評価と、乳癌またはその転移のリスク評価とに使用することができる。本発明に記載した方法は、感度、特異性および信頼性が高い。本発明は、ＣＳＴ１遺伝子、そのスプライスバリアントおよびシスタチンＳＮのキャプチャーと、乳癌の診断試薬、キットおよびチップの製造におけるその利用とを提供する。乳癌の診断試薬、キットおよびチップは、本発明に含まれる。【選択図】図１２

Description

本発明は、生物医学的技術に関する。癌の予測および診断のための一連のバイオマーカーのほか、バイオマーカーの検出のための試薬、検査キットおよびチップが本発明に含まれる。

ＷＨＯの報告によれば、年間約１２０万人の女性が乳癌と診断され、乳癌関連の死亡者数は毎年５４万人と報告されている。近年、乳癌の発生率は著しく上昇している。したがって、乳癌を予防および治療するための方法を開発することは急務である。こうした方法には、乳癌の早期発見および早期介入、癌治療の評価、ならびに腫瘍の転移および再発のモニタリングがある。乳癌のスクリーニング効率および治療後の予後のモニタリングを向上させる基準の１つは、乳癌に対して感度および特異性の高い診断試薬を開発することである。

腫瘍出現のメカニズムに関する最近の調査から、シスタチンスーパーファミリーがシステインプロテアーゼ阻害剤として腫瘍の発生、発育、浸潤および転移に重要な役割を果たしていることが明らかにされた。腫瘍では、シスタチンスーパーファミリーのいくつかのメンバーの発現が増加する。たとえば、シスタチンＣは、卵巣腫瘍および頭頸部腫瘍において相対的に過剰発現する。別の例として、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞におけるステフィンＡの高発現がある。腫瘍におけるシスタチンＦの発現増加は、カテプシンの腫瘍の発生および増殖への関与によると考えられ、腫瘍の発生および増殖中にカテプシン発現が上昇し、シスタチンの発現を引き起こしてフィードバックメカニズムによりカテプシンの活性亢進を阻害する。しかしながら、シスタチンの発現は、必ず腫瘍増殖と正の相関関係があるとは限らない点に留意されたい。たとえば、シスタチンＣの低発現は、神経膠腫患者において末期、予後不良および転移の可能性の高さを示す。その考えられる理由は、癌末期のシスタチン発現を制御する何らかの未知のメカニズムにある。

ヒトシスタチンスーパーファミリーのメンバーにシスタチンＳＮがある。シスタチンＳＮは、ＣＳＴ１遺伝子によりコードされ、１４１個のアミノ酸残基を含む。このタンパク質は２つのジスルフィド結合を含み、その分子量は１６．４ｋＤａである。シスタチンＳＮは典型的な分泌型タンパク質であり、体液および分泌液、たとえば涙、唾液、血清および血漿中に分布する。文献には、胃癌細胞内のＣＳＴ１発現が正常な胃細胞より高いことが報告されている。胃癌細胞株内のＣＳＴ１発現の物理的分布は、腫瘍細胞と一致する。ＣＳＴ１発現は、細胞株の分化の程度と正の相関関係を有する。予備臨床データから、ＣＳＴ１発現が腫瘍の浸潤、転移状態およびｐＴＮＭ分類に依存することが示された。生存率分析からは、ＣＳＴ１発現のある患者の５年全生存率はＣＳＴ１発現のない患者より著しく高いことが示される。Ｃｏｘ解析は、ＣＳＴ１が予後予測の独立した指標であることを示す。これらすべての調査から、ＣＳＴ１は、胃癌の発生および発育中に腫瘍阻害剤として働く可能性があることが証明される。しかしながら、ＣＳＴ１と乳癌との間の相関関係は、これまで報告されていない。

本発明は、乳癌患者のＣＳＴ１の発現を目的とする。ＣＳＴ１発現と臨床病理パラメーターとの間の相関関係の解析により、乳癌の発生、発育および転移におけるＣＳＴ１の役割が明らかにされるはずである。

第１に、本発明ではヒト組織におけるＣＳＴ１発現を比較した。ＣＳＴ１発現は、唾液腺を除く試験対象のすべての組織で低いことが発見された。乳癌腫瘍と腫瘍隣接組織とのＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２、ＣＳＴ４の発現を比較した。腫瘍と隣接組織とではＣＳＴ１発現の差が最も大きいことが発見された。ＣＳＴ１のｍＲＮＡ（配列番号４４）は２つのスプライスバリアントを有し、スプライス１（配列番号４８）はエクソン１（配列番号４５）、エクソン２（配列番号４６）およびエクソン３（配列番号４７）を含み、スプライス２（配列番号４９）はエクソン１（配列番号４５）およびエクソン２（配列番号４６）のみを含む。我々は、本発明において腫瘍および腫瘍隣接組織のこれら２つの変異体に関する発現差を比較した。我々は、スプライス１がスプライス２より大きな差を有することを発見した。ＣＳＴ１のスプライス１の発現を、乳癌腫瘍、腫瘍隣接組織、乳癌性腫瘍、乳腺炎および正常組織の生検サンプル、乳癌転移のあるおよび乳癌転移のないリンパ節組織、乳癌患者、乳腺炎患者および健常女性の無細胞ＲＮＡにおいて比較した。ＣＳＴ１のスプライス１は乳癌腫瘍および乳癌転移のある組織で過剰発現していることが発見された。ＣＳＴ１のスプライス１の発現の定量測定により、乳癌腫瘍と、腫瘍隣接組織と、正常組織と、乳癌転移のあるおよび乳癌転移のない組織とが高い感度および特異性で差異があることが認識された。

第２に、本発明は、乳癌細胞株および正常血清、乳癌患者および健常者の血清においてシスタチンＳＮ（配列番号５２に示した配列、配列番号５３に示した遺伝子コード）の発現を比較した。シスタチンＳＮが乳癌細胞株および乳癌患者血清において過剰発現することが発見された。シスタチンＳＮ発現の定量測定により、乳癌腫瘍および乳癌患者血清は高い感度および特異性を有し、正常血清と差異があることが認識された。

上記の発見を組み合わせると、ＣＳＴ１のスプライス１およびシスタチンＳＮは乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして使用することができると結論される。臨床常識の結論としてシスタチンＳＮのエピトープペプチド（シグナルペプチド配列の除去後のシスタチンＳＮ配列）も、乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして利用することができる。シスタチンＳＮのエピトープペプチドの配列を配列番号５４に示す。

乳癌は、上述のバイオマーカーの発現を測定することにより予測および診断することができる。用途として、原発性および転移性乳癌の識別および診断、乳癌の感受性解析、原発性または転移性乳癌の治療および医療の有効性評価、ならびに乳癌またはその転移のリスク評価等が挙げられる。たとえば、その方法の１つは以下の通り記載することができる。ＣＳＴ１のスプライス１またはシスタチンＳＮの発現を測定し、カットオフ値と比較する。バイオマーカー（単数または複数）の発現がカットオフ値より高ければ、試験結果は陽性である。カットオフ値は、健常者および乳癌患者の体液もしくは乳房組織のＣＳＴ１のスプライス１またはシスタチンＳＮの発現または含有量を計算および比較することにより得られる。

上記のバイオマーカーの発現の測定には、検査用試薬、キットおよびチップが必要とされる。したがって、本発明では乳癌の予測および診断のためのこれらの試薬、キットおよびチップを検討する。

本発明は、ｍＲＮＡを検出するための複数の方法、以下に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写介在増幅（ＴＭＡ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および高熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ：ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。乳癌の予測および診断の検査用試薬を製造するには、ＣＳＴ１のスプライス１（ＣＳＴ１のスプライス１のキャプチャー）またはそのｃＤＮＡを特異的に認識し、かつ検出方法の要求に合致するプライマーまたはプローブを使用してもよい。本発明ではエクソン１、２および３を認識するプライマーおよびプローブを利用し、なかでもエクソン１特異的プライマーおよびプローブが好ましい。たとえば、本発明に使用することができるプライマーの配列は、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示した少なくとも１つの配列と一致すべきである。配列番号１〜２に示した配列は、特に有利である。適用可能なプローブの配列は、配列番号３、３５〜３８および４３に示した配列の少なくとも１つと一致すべきであり、配列番号３に示した配列が好ましい。

本発明は、タンパク質検出のための複数の方法、以下に限定されるものではないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびその派生法、たとえば競合ＥＬＩＳＡ、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ免疫ブロット等を含む。シスタチンＳＮを認識する抗体（シスタチンＳＮのキャプチャー）を、乳癌の予測および診断の検査用試薬に使用してもよい。上記の抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられ、酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ルシフェラーゼ、オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび様々なフルオロフォアで標識化してもよい。抗体はビオチン標識化してもよく、シグナルはストレプトアビジン−基質複合体により増幅される。定量は、基質と抗体標識化酵素との相互作用時のＵＶ吸光度の変化により実現される。あるいは定量は、フルオロフォア標識抗体のＵＶ励起により実現される。

検査用試薬は、簡便かつ迅速な検査に適した乳癌の予測および診断の検査キットを製造するため、相互に組み合わせても、あるいは他の補助検査用試薬と組み合わせてもよい。乳癌の診断および予測には、上述の検査用試薬を含む市販または文献に報告された任意の検査キットを利用してもよい。

最適化された技術として、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、検体を特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマーの配列を配列番号１〜２に示し、５’末端および３’末端にそれぞれフルオロフォア標識および蛍光クエンチャー標識を有するプローブの配列を配列番号３に示す。

最適化された技術として、フルオロフォアを用いたリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、少なくとも一対のプライマーを含む。ＣＳＴ１のスプライスのキャプチャーは、ＣＳＴ１のスプライスのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーである。プライマー対の配列を配列番号１〜２、または配列番号４〜５、または配列番号６〜７、または配列番号８〜９、または配列番号１０〜１１、または配列番号１２〜１３、または配列番号１４〜１５、または配列番号１６〜１７、または配列番号１８〜１９、または配列番号２０〜２１に示す。

最適化された技術として、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、ＣＳＴ１のスプライス１のｃＤＮＡを特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマー配列を配列番号３４および配列番号２に示す。５’末端および３’末端にそれぞれフルオロフォア標識および蛍光クエンチャー標識を有するプローブ配列を配列番号３に示す。

最適化された技術として、ＬＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、検体を特異的に認識する４つのプローブを含む。５’末端にハプテン標識を有するそれらの配列を配列番号３５〜４０に示す。

最適化された技術として、ｔＳＤＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の検査キットは、ＣＳＴ１のスプライス１のｃＤＮＡを特異的に認識する少なくとも一対のプライマーおよび１つのプローブを含む。プライマーの配列を配列番号３９〜４４に示し、５’末端に放射性標識を有するプローブの配列を配列番号４３に示す。

上述のＣＳＴ１のスプライス１のすべての検査キットに、1以上の補助試薬を加えてもよい。こうした補助試薬は、１）プライマーのそれぞれの増幅産物を目視可能または撮像可能にする試薬であり、本方法として、アガロースゲル電気泳動、酵素結合ゲル電気泳動、化学発光、蛍光インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光顕微鏡検査が挙げられる。２）ＲＮＡ抽出試薬。３）逆転写試薬。４）ｃＤＮＡ増幅試薬、たとえばＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ、ＬＣＲおよびｔＳＤＡに利用される試薬。５）校正用標準物質、たとえばＣＳＴ１のスプライス１を含む組換えプラスミド。６）陽性対照、たとえばヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７。７）陰性対照、たとえば正常乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔがあるが、これに限定されるものではない。

最適化された技術として、競合ＥＬＩＳＡに基づくシスタチンＳＮの検査キットは、シスタチンアンチゲン、抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体、酵素標識二次抗体および酵素の基質を含む。典型的なプロセスでは、ＥＬＩＳＡプレートをシスタチンＳＮアンチゲンでコートする。サンプルおよび抗シスタチンＳＮ抗体をプレート上で連続的にインキュベートする。サンプル中のシスタチンＳＮをレポーティング試薬（酵素標識二次抗体およびそれに対応する基質）のシグナルを測定することにより定量的に判定する。

最適化された技術として、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡに基づくシスタチンＳＮの検査キットは、シスタチンアンチゲン、抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体、ビオチン標識抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体、ストレプトアビジン−酵素複合体および基質を含む。典型的なプロセスでは、ＥＬＩＳＡプレートをシスタチンＳＮアンチゲンで被覆する。サンプルおよびビオチン標識抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体をプレート上で連続的にインキュベートする。サンプル中のシスタチンＳＮをレポーティング試薬（ストレプトアビジン−酵素複合体およびそれに対応する基質）のシグナルを測定することにより定量的に判定する。

上述のシスタチンＳＮのすべての検査キットに、1以上の補助試薬を加えてもよい。こうした補助試薬には、１）ＥＬＩＳＡコーティング溶液、２）抗体希釈用緩衝液、３）洗浄緩衝液、４）反応停止液、５）校正用シスタチンＳＮ標準物質があるが、これに限定されるものではない。

ＣＳＴ１のスプライス１またはそのｃＤＮＡの検出用のプローブは、簡便かつ迅速な検査を目的とした、乳癌の予測および診断用のセンシングチップを作製するため、固体基質に固定化してもよい。乳癌の予測および診断用のセンシングチップの作製には、上述のプローブを含む、文献に報告されたバイオチップまたは市販されているチップを使用してもよい。

本発明に言及した検査用試薬、キットおよびチップは、乳癌罹患の感受性の検査、乳癌のｐＴＮＭステージの判定、癌の発育および治療の有効性の評価、ならびに乳癌の再発および転移の検出に使用してもよい。サンプルとしては、手術組織または生検組織、リンパ節組織、髄、血清、血漿、全血、血液サンプル画分および尿が挙げられる。被試験者は、乳房の不快感のため医療支援を求める人、乳癌の家族歴を有する人および乳癌を有する人である。

本発明の利点は以下の事実にある。乳癌の予測および診断のバイオマーカーとして、それぞれ配列番号４８および５２に示すＣＳＴ１のスプライス１の配列およびそれにコードされたタンパク質シスタチンＳＮが公表される。これらのバイオマーカーの発現を測定することにより、乳癌の発生または転移の区別および診断、乳癌罹患の感受性の検査、原発性および転移性乳癌に対する治療の有効性の評価、癌予後の予測、および人が乳癌に罹患するまたはその転移を起こすリスクの評価を行うことができる。本発明に記載した方法は、感度、特異性および信頼性が高い。本発明では、ＣＳＴ１のスプライスおよびシスタチンＳＮのキャプチャーだけでなく、乳癌の予測および診断用の検査試薬、キットおよびチップの製造におけるその利用も公表される。

ＣＳＴ１のスプライス１を含む組換えプラスミド（ｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＳＴ１）を示す図である。 正常組織（扁桃、下垂体後葉、甲状腺、唾液腺、骨格筋、骨髄、赤血球および血小板を含まない末梢血、肺、胃、肝臓、心臓、腎臓、副腎、腸、結腸、膵臓、脾臓、膀胱、前立腺、乳房、卵巣、子宮、胎盤ならびに精巣）、ヒト乳癌細胞株（ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７）ならびに正常乳房組織細胞株（Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）におけるＣＳＴ１遺伝子の発現を示す図である。 蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲによる、乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２、ＣＳＴ４の発現の比較を示す図である。 蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲによる、乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＡＣＴＢ発現の比較を示す。Ｎ１〜Ｎ２０およびＴ１〜Ｔ２０はそれぞれ乳癌腫瘍サンプルおよび腫瘍隣接組織に対応する図である。 蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲによる、乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１のスプライス１およびスプライス２の発現の比較を示す。 乳癌腫瘍、腫瘍隣接組織および正常組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現のリアルタイムＰＣＲによる定量を示す図である。 乳癌腫瘍および乳腺炎生検サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現のリアルタイムＰＣＲによる定量を示す図である。 乳癌転移のあるおよび乳癌転移のないリンパ節組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現のリアルタイムＰＣＲによる定量を示す図である。 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現のリアルタイムＰＣＲによる定量を示す図である。 本検査の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ：Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）を示す。図から、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が乳癌診断のマーカーとして感度および選択性が高いことが示される図である。 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の、ＬＣＲによる発現差を示す図である。 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の、ｔＳＤＡによる発現差を示す図である。 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の、ＮＡＳＢＡによる発現差を示す図である。 末梢血中のＣＳＴ１のスプライス１の発現と組織学的解析とによる乳癌の微小転移巣の検出感度の比較を示す図である。 骨髄におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現と組織学的解析とによる乳癌の微小転移巣の検出感度の比較を示す図である。 異なるＴＮＭ分類の乳癌患者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の、ＴＭＡによる発現差を示す図である。 乳癌腫瘍細胞株および健常者の血清におけるシスタチンＳＮの発現を示す図である。 乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮの発現を示す図である。 競合ＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮの発現を示す図である。 二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮの発現を示す図である。 乳癌患者血清中のシスタチンＳＮおよびＣＥＡに関する特異性および感度の比較を示す。タンパク質濃度はＥＬＩＳＡにより測定した図である。 ２つの群、すなわちシスタチンＳＮ発現が中央値より大きい群および中央値より小さい群の、治療後の乳癌患者の生存率を示す図である。

以下の本文で、本発明の応用例に関するいくつかの詳細な説明を行う。必要な場合には、図を利用する。こうした例に言及される通常の分子生物学の方法に関する実験の詳細については記載しない。そうした方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅら編）のプロトコルに厳密に従った。我々の実験では、このユーザーマニュアルのバイオ試薬に関するプロトコルが遵守される。こうした例に言及されるパーセンテージが明らかにされていない場合は、すべて重量パーセンテージ（ｗ．ｔ．％）である。

核酸
実施例のサンプルはすべて、患者の署名した同意書の受領後に取得されている。サンプルを取得した医療研究所の規則を厳格に遵守した。腫瘍組織の生検サンプルを正常組織と比較した。手術由来のリンパ節サンプルの取得後直ちにＲＮＡ抽出を行うか、あるいは、サンプルを液体窒素中またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中で保存した。末梢血サンプル、髄サンプルまたは尿サンプルは２０分間（４０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離した。上清をさらに１０分間（１３０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離した。その後直ちにＲＮＡ抽出を行うか、あるいはサンプルを低温（−２０〜−８０℃）下で保存した。

実施例１ ヒト組織におけるＣＳＴ１発現
実施例の正常組織はすべて本発明者らと共同した医学研究所から取得した。他のサンプルは市販品を購入し、対応する法規制を遵守した。様々なヒト組織サンプルにおけるＣＳＴ１ ｍＲＮＡの発現をＨＧ−Ｕ９５ＡＶ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で測定した。ユーザーマニュアルのプロトコルに従う。ＣＳＴ１ ｍＲＮＡの発現の定量は、β−アクチンの蛍光検量線により行った。結果を図２に示す。ＣＳＴ１は、唾液腺を除き正常組織に発現していない。この発見からＣＳＴ１が、正常組織において低バックグラウンドという優れた診断バイオマーカーの要件の１つに適合することが証明される。図２の結果からはさらに、ＣＳＴ１が乳癌腫瘍細胞株ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７において過剰発現し、正常乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔにおいて発現しないことが示される。こうした結果は、ＣＳＴ１が乳癌の有望なバイオマーカーであることを示す。

実施例２ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４の発現
蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現を測定した。ＲＮＡ抽出にはトリゾール試薬を使用した。ｍＲＮＡの逆転写は、市販されているキットを用いてユーザーマニュアルに従い行った。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のプライマーは、表１にまとめてある。蛍光色素は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖｅ ＧｒｅｅｎおよびＬＣ Ｇｒｅｅｎ等である。図３に示すように、ＣＳＴ１は、腫瘍と腫瘍隣接組織とにおいて検査した全遺伝子の中で発現差が最も大きい。

実施例３ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１のスプライス１および２の発現
蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＡＣＴＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現を測定した。図４に示すように、ＡＣＴＢ遺伝子のクロスポイント値（ＣＰ：ｃｒｏｓｓ ｐｏｉｎｔ）は近い。次に、蛍光色素をプローブとして用いたリアルタイムｑＰＣＲを使用して、２０個の乳癌腫瘍サンプルおよびそのそれぞれの腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ１の２つのスプライスのｍＲＮＡの発現を測定した。ＰＣＲのプロトコルおよびプライマー設計は実施例２のそれと同一である。図５に示すように、腫瘍および腫瘍隣接組織においてスプライス２よりスプライス１の方が発現差が大きいことから、乳癌の診断バイオマーカーとしてスプライス１の方がスプライス２より有利であることが示される。

実施例４ 乳癌腫瘍および腫瘍隣接組織および正常組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
乳癌腫瘍、腫瘍隣接組織および正常組織におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図６に示すように、ＣＳＴ１のスプライス１は乳癌腫瘍組織において過剰発現する一方、その発現は腫瘍隣接組織および正常組織において比較的に低い。腫瘍におけるスプライス１の発現の中央値は正常組織のそれより１５．６倍高い。癌性腫瘍は、２２３．２０をカットオフ値として使用すれば、正常組織と区別することができ、これを乳癌診断の基準値として提案する。

実施例５ 乳癌および乳腺炎の患者の生検サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
手術由来のサンプルおよび生検由来のサンプルは、生検サンプルにおける癌細胞の割合にばらつきがあるので差が大きい。このため、乳癌または乳腺炎の患者由来の４０の生検サンプルを、リアルタイムＰＣＲを使用して検査した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１〜２に示す。図７に示すように、乳癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は乳腺炎サンプルにおけるより高い。乳癌のＣＳＴ１発現の中央値は乳腺炎のそれより１１．０倍高い。癌性腫瘍は、１２０．６６コピーをカットオフ値として使用すれば、乳腺炎の組織と区別することができ、これを乳癌診断の基準値として提案する。

実施例６ 乳癌転移のあるおよび乳癌転移のないリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
我々は、様々な大きさの乳癌転移がある３０のリンパ節サンプルを集めた。乳癌転移を含まない３０のリンパ節サンプルは、検出不能なリンパ節転移を回避するため初期乳癌患者由来である。これらのリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現の定量のため、リアルタイムＰＣＲを利用した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図８に示すように、乳癌転移を含むリンパ節サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は、転移を含まないリンパ節サンプルより高い。転移サンプルにおけるスプライス１の発現の中央値は、転移を含まないサンプルより６．３倍高い。８２．４５コピーをカットオフ値として定義する場合、乳癌転移を含まない２例がスプライス１の発現陽性と検出される。慎重に組織学的研究を行ったところ、これら２つのサンプルに非常に小さな乳癌転移が発見された。本実施例から、ＣＳＴ１のスプライス１の発現検査は８２．４５コピーをカットオフ値として用いて転移例を区別するだけでなく、組織学的解析より感度が高いことも示される。

実施例７ 乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図９に示すように、乳癌サンプルにおけるスプライス１の発現の中央値は、乳腺炎サンプルより８．８倍高く、健常者サンプルより３２倍高い。６５．３２コピーをカットオフ値とすると、癌と炎症および健常者とを区別することができる。図１０は、本検査の受信者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線であり、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が乳癌診断のマーカーとして感度および特異性が高いことを示す。曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）は０．９８７であり、非侵襲的乳癌診断の特異的マーカーとしてのＣＳＴ１のスプライス１を実証する値である。

実施例８ ＬＣＲによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をＬＣＲにより定量した。ＬＣＲプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１１に示すように、癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の蛍光の相対発光量（ＲＬＵ：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）は、乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ１２．３８倍および４０．１２倍高い。１８．５１ＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。

実施例９ ｔＳＤＡによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をｔＳＤＡにより定量した。ｔＳＤＡプライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１２に示すように、癌サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現は乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ４１．３８倍および４２．８６倍高い。２４．８１ＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。

実施例１０ ＮＡＳＢＡによる、乳癌患者、乳腺炎患者および健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現
無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。５０例の乳癌患者、３０例の乳腺炎患者および３０例の健常者の血清中の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現をＮＡＳＢＡにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１３に示すように、癌サンプルにおける蛍光のＲＬＵは乳腺炎サンプルおよび正常サンプルより高く、中央値はそれぞれ１８倍および１８．８７倍高い。２２．９３のＲＬＵをカットオフとして設定すれば、癌は区別される。

実施例１１ 乳癌患者末梢血中のＣＳＴ１のスプライス１の発現、およびその細胞学検査との比較
乳癌患者の血液から赤血球および血小板を除去して末梢血を得、そこからＲＮＡを抽出した。ＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。その結果を乳腺炎患者および健常者の血液サンプル中のスプライス１の発現と比較した。スプライス１の高発現は癌細胞の存在指標となる。そして、細胞学検査をゴールドスタンダードとして使用して癌細胞の存在を確認した。結果は図１４にまとめてある。細胞診断による乳癌はすべてスプライス１の発現検査により特定される。細胞学検査により判定された、乳癌を含まない一部の例は、後で転移を含む例であると確認されている。これは（Ｔｈｅ）、ＣＳＴ１のスプライス１が細胞診より感度の高い乳癌診断法であることを意味する。

実施例１２ 乳癌患者の髄におけるＣＳＴ１のスプライス１の発現、およびその細胞学検査との比較
リアルタイムＰＣＲを利用して、乳癌患者の髄サンプルにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現を定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。その結果を健常髄サンプルと比較した。スプライス１の高発現は、癌および癌転移の存在の指標となる。そして、細胞学検査をゴールドスタンダードとして使用して癌細胞の存在を確認した。図１５に示すように、組織学的陽性サンプルの９５％がＣＳＴ１のスプライス１の発現検査により特定された。発現検査は、組織学的検査より高い陽性率を有することから、感度がより高いことが示唆される。

実施例１３ ＣＳＴ１のスプライス１の発現によるｐＴＮＭ分類
様々なｐＴＮＭステージの８０例の乳癌患者（ＩおよびＩＩが３０例、ＩＩＩおよびＩＶが５０例）の無細胞ＲＮＡを市販されているキットにより抽出した。ＴＭＡを利用して、スプライス１の発現を検査した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。図１６に示すように、ステージＩＩＩおよびＩＶのサンプルのＲＬＵはステージＩおよびＩＩのサンプルより高く、中央値は１５倍高い。この結果から、ＣＳＴ１のスプライス１の発現がｐＴＮＭ分類のマーカーであることが証明される。

実施例１４ 乳癌治療のモニタリングにおけるＣＳＴ１のスプライス１の発現の利用
リアルタイムＰＣＲを利用して、乳癌患者（化学療法を受けている６例および放射線療法を受けている４例）の血液中のＣＳＴ１のスプライス１の発現を定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。治療の評価のためスプライス１の発現をモニターした。表２に示すように、治療が効果的な患者では、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が療法を継続するに従い減少し、腫瘍の大きさが小さくなることがイメージングにより観察された。治療が効果的でない患者の場合、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が療法を継続するに従い増加し、腫瘍の大きさが大きくなることがイメージングにより観察された。ＣＳＴ１のスプライス１の発現を、療法の有効性の判断基準として、および癌発育のリアルタイムモニタリングのマーカーとして利用することを提唱する。

実施例１５ 乳癌患者のＣＳＴ１のスプライス１の発現による予後
乳癌患者血液中のＣＳＴ１のスプライス１の発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。プライマーの配列を配列番号１および配列番号２に示す。増幅産物の配列を配列番号５０に示す。癌の予後を手術から１ヶ月後、３ヶ月後および１年後に評価した。表３に示すように、癌再発の症例が２例あり、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が増加し、ＣＳＴ１のスプライス１の発現が１０００コピーに達したとき、イメージングにより転移が確認された。残りの３例では、イメージングによる再発の証拠、またはＣＳＴ１発現の増加が観察されなかった。こうした一貫性は、乳癌の予後マーカーとしてのＣＳＴ１のスプライス１の発現の有効性を立証する。

実施例１６ ＣＳＴ１のスプライス１の、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ測定用の検査キット
本キットは以下を含む。１）ＰＣＲプライマー：５’−ｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号１）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３）。

キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、塩化マグネシウム溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＣＳＴ１のスプライス１の増幅産物の配列（配列番号５１）を含む組換えプラスミド標準物質（図１に示すようなもの。プライマーは５’−ｇｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｃｇｇｇｃｔｃｔｃａｃ−３’（配列番号２２）および５’−ａｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇｔ−３’（配列番号２３）である）、陽性対照（乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７）および陰性対照（乳房組織細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）の1以上を含めてもよい。

典型的な手順では、サンプル、対照および標準物質をＰＣＲにより増幅する。標準物質のＣＰ値を標準物質の濃度に対してプロットし、データフィッティングにより校正式を得る。遺伝子の定量はＣＰ値を検量線と比較して行う。

実施例１７ ＣＳＴ１のスプライス１の、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲ測定用の検査キット
以下のプライマーの少なくとも一対を含むべきである。［１］５’−ｔｃｔｃａｃｃｃｔ−ｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号１）；５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。［２］５’−ｃｃｃｔｇｇｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号４）；５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔ−３’（配列番号５）。［３］５’−ｃａｔｔｃｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａｃ−３’（配列番号６）；５’−ａｇａａｇｃａａ−ｇａａｇｇａａｇｇａｇｇｇａｇ−３’（配列番号７）。［４］５’−ｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃｇ−３’（配列番号８）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号９）。［５］５’−ｃａｔｔｃｇｃａｃｃａｇｃｃａ−ｃｃａｃ−３’（配列番号１０）；５’−ｃａｇｇｇｃｔａｔａｇａａｇｃａａｇａａｇｇａａ−３’（配列番号１１）。［６］５’−ｇｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃ−３’（配列番号１２）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号１３）。［７］５’−ｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇａａ−３’（配列番号１４）；５’−ｇｇｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔ−３’（配列番号１５）。［８］５’−ｔｇｇｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａ−３’（配列番号１６）；５’−ｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号１７）。［９］５’−ｃｃｃｔｇｇｇａｇａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号１８）；５’−ｔｇｇｔｇｇｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔｇｇ−３’（配列番号１９）。［１０］５’−ｔｔｃｃｃｔｇｇｇａｇ−ａａｃａｇａａｇｇｔｃｃ−３’（配列番号２０）；５’−ｔｇｇｔｇｇ−ｃｔｇｇｔｇｃｇａａｔｇｇ−３’（配列番号２１）。

キットには、以下：内部マーカーβ−アクチンのプライマー５’−ａａｇａｔｃａｔｔｇｃｔｃｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３２）、５’−ｃｇｔｃａｔａｃｔｃｃｔｇｃｔｔｇｃ−３’（配列番号３３）、ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、塩化マグネシウム溶液、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光色素（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなど）の1以上を含めてもよい。

実施例１８ ＮＡＳＢＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
本キットは以下を含む。１）プライマー：５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａ−ｃｔａｔａｇｇｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３４）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ダブシル−３’（配列番号３）。

キットには以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ＲＮＡの蛍光色素（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎなど）、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼH、トリ骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）およびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。

実施例１９ ＴＭＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
本キットは以下を含む。１）プライマー：５’−ａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇ−３’（配列番号３４）および５’−ｔｔａｔｃｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｇ−３’（配列番号２）。２）プローブ：５’−ＦＡＭ−ｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｇｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔ−ダブシル−３’（配列番号３）。

キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ＲＮＡの蛍光色素（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎなど）、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼH、トリ骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＮＴＰおよびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。

実施例２０ ＬＣＲに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
キットは、４つのプライマー：５’−ａｇｔａｔｃｔｇａｇｔａｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃ−３’（配列番号３５）、５’−ａｃｃｃｔａｇｃｔｇｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇａｇ−３’（配列番号３６）、５’−ｃａｔａｇａｃｔｃａｔｇｇｇａｃｇａｃｇ−３’（配列番号３７）、５’−ａｃａｃｃｇｇｇａｃｃｇｇａｃｃｔｃ−３’（配列番号３８）を含む。プライマーはすべて、５’末端にヘプタン標識を有する。

キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびｄＮＴＰの1以上を含めてもよい。

実施例２１ ｔＳＤＡに基づくＣＳＴ１のスプライス１の発現の検査キット
キットは以下を含む。１）ＣＳＴ１ Ｂ１のプライマー：５’−ｔｇｇｇｔａｃａｇｃ−ｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔ−３’（配列番号３９）、ＣＳＴ１ Ｓ１のプライマー：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔａｃａｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｔｔｃｇｃ−３’（配列番号４０）、ＣＳＴ１ Ｂ２のプライマー：５’−ｃａａｃｇｇｔｃｔｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号４１）およびＣＳＴ１ Ｓ２のプライマー：５’−ｇａｃｃｔｃｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇｔａｃｃｃｇ−３’（配列番号４２）。２）プローブ：５’末端に^３２Ｐ標識を有する５’−ｇｔｇｃｔｃｇａｇｔｃａｇｃｇａｇｔａｔａａｃａａｇｇ−ｃｃａｃｃａａａｇａｔｇａｃｔａｃ−３’（配列番号３）。

キットには、以下：ＲＮＡ抽出試薬、逆転写試薬、ｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＢｓｏｂＩ酵素、ｅｘｏ−Ｂｃａ酵素の1以上を含めてもよい。

（２）タンパク質
組換えシスタチンＳＮ、ウサギ抗シスタチンＳＮ抗体はＮＯＶＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した。マウス抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体（配列番号５４に示した配列に対して特異的認識を行う）はＲ＆Ｄから購入した。ＴＭＢ溶液Ａおよびペルオキシダーゼ溶液Ｂを含むＴＭＢオキシダーゼ基質は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入した。

血清調製の典型的な手順を以下の通り記載する。全血サンプルを周囲温度下２時間または４℃下一晩保存し、その後サンプルを２０分間（１０００ｇ）遠心分離する。上清を集めて検査を行うか、または−２０℃もしくは−８０℃下保存する。凍結および解凍の繰り返しは避けるべきである。血漿サンプルは以下のプロトコルにより調製する。ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固剤を添加した血液サンプルを１５分間（２〜８℃、１０００ｇ）遠心分離し、上清を集めて検査を行うか、または−２０℃もしくは−８０℃下保存する。凍結および解凍の繰り返しは避けるべきである。血清サンプルおよび血漿サンプルは、検査前にＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０〜７．２）を用いて１０倍希釈する。

実施例２２ 乳癌細胞株および健常ヒト血清におけるシスタチン発現
高発現のＣＳＴ１のｍＲＮＡを含む乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７（レーン１〜２）およびＭＣＦ−７（レーン３〜４）と健常ヒト血清Ｓ１（レーン５〜６）およびＳ２（レーン７〜８）とをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）により解析した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、コーティング溶液（５％スキムミルク粉末および０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）とインキュベートし、その後膜をポリクローナル抗シスタチンＳＮ抗体と一晩インキュベートした。次いで膜を、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ溶液と３７℃下１時間インキュベートし、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、比色検出用のＴＭＢペルオキシダーゼ指示薬で処理した。β−アクチンを内部標準として使用した。図１７に示すように、１６ｋＤａのタンパク質がレーン１〜４で観察された一方、レーン５〜８ではあまり観察されなかった。シスタチンＳＮ発現は乳癌細胞において異常に高いと結論される。

実施例２３ 乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現
健常者（レーン１〜２）および乳癌患者（レーン３〜６）の血清を、実施例２２に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットにより解析した。図１８に示すように、レーン３〜６に検出されたシスタチンＳＮはレーン１〜２より非常に高かったことから、シスタチンＳＮ発現は乳癌患者血清中で異常に高いことが示された。

実施例２４ 競合ＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現。
ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍＬのシスタチンＳＮ溶液でコートし、３％ＢＳＡで再充填した。血清サンプルをシスタチンＳＮモノクローナル抗体と混合し（１：２０００）、混合物をプレートで１時間（３７℃）インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳ緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ（０．０８μｇ／ｍＬ）により３７℃下１時間インキュベートした。プレートを再びＴＢＳにより洗浄した。最後にマイクロプレートリーダーにより定量的検出のため、プレートをｏ−フェニレンジアミンで処理した。健常者由来の２０の血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを処理した。図１９に示すように、健常血清のシスタチンＳＮ濃度の中央値は１．７ｎｇ／ｍＬである一方、乳癌患者のそれは４．１ｎｇ／ｍＬに達する。乳癌サンプルは、３．２５ｎｇ／ｍＬがカットオフ値であれば、区別可能である。

実施例２５ 二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された、乳癌患者および健常者の血清中のシスタチンＳＮ発現
ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍＬのマウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体でコートし、３％ＢＳＡ溶液で再充填した。血清サンプルをプレートで１時間（３７℃）インキュベートし、ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。このプレートでビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体（１：１０００）をインキュベートした。プレートをＴＢＳ洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ基質複合体を添加し、これをさらに１時間インキュベートし、ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。プレートにＴＭＢを加え、比色シグナルをマイクロプレートリーダーにより測定した。健常者由来の２０の血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを検査した。図２０に示すように、健常血清のシスタチンＳＮ濃度の中央値は０．５２５ｎｇ／ｍＬである一方、乳癌患者のそれは２．９９ｎｇ／ｍＬに達する。乳癌サンプルは、１．４８ｎｇ／ｍＬがカットオフ値であれば、区別可能である。

実施例２６ 乳癌マーカーとしての血清中のシスタチンＳＮとＣＥＡとの感度および特異性の比較
シスタチンＳＮ発現を実施例２５で測定したプロトコル準じて測定した。ＣＥＡは、市販されている検査キットを使用して測定した。３０の健常血清サンプルおよび乳癌患者由来の３０の血清サンプルを検査し、結果を図２１にまとめてある。シスタチンＳＮおよびＣＥＡのＡＵＣ値はそれぞれ０．９９４および０．８３３であるから、感度および特異性に関する場合、シスタチンＳＮは乳癌マーカーとしてＣＥＡより有利であることが示される。

実施例２７ シスタチンＳＮの定量用の検査キット（競合ＥＬＩＳＡ）
１．キットの組成
以下：シスタチンＳＮ、マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ、酵素基質（ｏ−フェニレンジアミン）を含めるべきである。

キットは、以下：再充填溶液（３％ＢＳＡ）、ＴＢＳ緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を含んでもよい。

２．ガイドライン
ＥＬＩＳＡプレートを５ｍｇ／ｍＬのシスタチンＳＮでコートする。次いでプレートを３％ＢＳＡ溶液で再充填する。血清サンプルおよび抗シスタチンＳＮモノクローナル抗体を混合し（１：２０００）、プレートで１時間（３７℃）インキュベートする。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ−抗ウサギＩｇＧ（０．０８μｇ／ｍＬ）を添加し、１時間インキュベート（３７℃）する。プレートに０．４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミンを加えた。測定にはマイクロプレートリーダーを使用する。

実施例２８ シスタチンＳＮの定量用の検査キット（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）
１．キットの組成
以下：シスタチンＳＮ標準物質（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて一連の溶液を作製する。濃度は、たとえば１０、５、２．５、１、０．５および０．２５ｎｇ／ｍＬとする）、マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体、ビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体、ストレプトアビジン基質複合体、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を含めるべきである。

キットは以下：コーティング溶液（０．０５ＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．０）、再充填溶液（３％ＢＳＡ）、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳ）および停止液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を含んでもよい。

２．ガイドライン
マウス−抗ヒトシスタチンＳＮモノクローナル抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で希釈用緩衝液に溶解し、これをＥＬＩＳＡプレートに加える。プレートを４℃下一晩インキュベートする。残留液体を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液を使用してプレートを３回、合計９分間洗浄する。プレートの穴に２００μＬの再充填溶液を加え、プレートを４℃下または３７℃下１時間インキュベートする。残留液体を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液を使用してプレートを３回、合計９分間洗浄する。ブランク、標準物質、サンプルのサンプル穴を指定する。ブランクの穴、標準物質の穴およびサンプルの穴にそれぞれ１００μＬのＰＢＳ、シスタチンＳＮ標準物質溶液および血清／血漿サンプルを加える。プレートを２時間（３７℃）インキュベートする。残留液体を捨てる。１００μＬのビオチン標識ウサギ−抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体溶液（ＰＢＳＴ−ＢＳＡ緩衝液で１：２００の比率に希釈）を加える。プレートを１時間（３７℃）インキュベートし、各穴の残留液体を捨てる。プレートをＰＢＳＴ緩衝液で３回（合計９分）洗浄する。各穴にストレプトアビジン基質複合体を加え、プレートを１時間（３７℃）インキュベートする。プレートを各サイクル１〜２分で５サイクル洗浄する。各穴に５０μＬのペルオキシダーゼ基質溶液を加え、プレートを暗所に入れておく。約１５分して標準物質の穴が青色のグラデーションを示したら、５０μＬの停止液を加えて反応を停止する（色が青から黄に変化する）。マイクロプレートリーダー（４０５ｎｍ）を使用してＯＤ値を検査する。標準物質のＯＤを濃度に対してプロットして検量線およびＲ^２値を得る（Ｒ^２が０．９５より高い場合、検量線の妥当性が確認される）。シスタチンＳＮ濃度をサンプルの穴のＯＤ値および校正式により算出する。

実施例２９ 乳癌のｐＴＮＭ分類のためのシスタチンＳＮの利用
８０例の乳癌患者（ステージＴが２０例、ステージＮが３０例およびステージＭが３０）の血清サンプルを、実施例２８に記載したプロトコル／キットを使用して検査した。表４にまとめたように、癌発育が継続するに従いシスタチンＳＮ発現が増加する。この結果から、シスタチンＳＮのｐＴＭＮ分類への利用が示される。

実施例３０ シスタチンＳＮレベルによる転移の検出
乳癌患者（転移なし）由来の２０の血清サンプルおよび転移のある乳癌由来の３０の血清サンプルを実施例２８に言及したプロトコルにより検査した。表５に示すように、転移性乳癌患者由来のシスタチンＳＮレベルは、転移のない患者のそれより高いことから、シスタチンＳＮが乳癌転移のマーカーであることが証明される。

実施例３１ 化学療法（ＣＴ）−内分泌療法の併用療法の効果を評価するためのシスタチンＳＮ
２８８５例の乳癌患者（Ｎ０またはＮ１）をＡＣ（ドキソルビシン＋シクロホスファミド）またはＡＴ（ドキソルビシン＋パクリタキセル）で治療した。内分泌療法は、ホルモン受容体（ＨＲ）レベルに基づき選択した。シスタチンＳＮは、実施例２８のプロトコルを用いて測定した。データ解析について７７６例の有効性が確認され、そのシスタチンＳＮ濃度の中央値は４．０６ｎｇ／ｍＬである。それから７６ヶ月にわたり無増悪生存率（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を記録した。図２２に示すように、シスタチンＳＮ発現が中央値より高い患者は２０％のＰＦＳを有する一方、残りの患者は約６０％のＰＦＳを有する。この結果から、シスタチンＳＮが本療法の有効性評価の指標となることが証明される。

上記の例により極めて詳細に本発明が考察された。これらの例は、実際の実施要件に適合するように組み合わせてもよい点に留意されたい。当該分野の研究者にとって交換、改変および変更は必要かつ容易であり、したがって本発明の一部をなすものとする。

Claims (22)

1. ヒト乳癌の予測および診断のために、ＣＳＴ１遺伝子のスプライスバリアント、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントによりコードされたシスタチンＳＮ、ならびにシスタチンＳＮのエピトープペプチドを包含するＣＳＴ１遺伝子の利用方法であって、前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントの配列が配列番号４８に示され、前記シスタチンＳＮの配列が配列番号５２に示される、利用方法。
2. シスタチンＳＮの前記エピトープペプチドの配列が配列番号５４に示される、請求項１に記載の方法。
3. 予測および診断される乳癌が原発性および転移性ヒト乳癌を含み、乳癌の感受性と、治療、医療、原発性または転移性乳癌のための治療の有効性および評価ならびに乳癌またはその転移のリスク評価が包含される、請求項１または2に記載の利用方法。
4. 乳癌の予測および診断用の診断試薬、キットおよびチップの製造における、ＣＳＴ１遺伝子、そのスプライスバリアントおよびシスタチンＳＮの「キャプチャー」の利用方法であって、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスのキャプチャーがＣＳＴ１またはそのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブを含み、シスタチンＳＮキャプチャーがシスタチンＳＮの抗体を含み、前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントの配列が配列番号４８に示され、前記シスタチンＳＮの配列が配列番号５２に示される、利用方法。
5. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのプライマーが、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示された配列から選択され、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示された配列の少なくとも１つを含む、請求項４に記載の利用方法。
6. 配列番号１〜２に示された配列を有するプライマーに対応するプローブが、配列番号３に示された配列を有する、請求項５に記載の利用方法。
7. 乳癌の予測および診断のための診断キットの製造における、ＣＳＴ１遺伝子と、そのスプライスと、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスによりコードされたタンパク質シスタチンＳＮとのキャプチャーを含む前記診断キットの利用方法であって、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーがＣＳＴ１またはそのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブを含み、シスタチンＳＮキャプチャーがシスタチンＳＮの抗体を含み、前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントの配列が配列番号４８に示され、前記シスタチンＳＮの配列が配列番号５２に示される、利用方法。
8. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのプライマーが、配列番号１〜２、４〜２１、３４および３９〜４２に示された配列から選択され、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのプローブが配列番号３、３５〜３８および４３に示された配列の１つから選択される、請求項７に記載の利用方法。
9. 前記プライマーが配列番号１〜２に示された配列を有し、対応するプローブが配列番号３に示された配列を有する、請求項８に記載の利用方法。
10. 乳癌の予測および診断の利用方法における、ＣＳＴ１遺伝子（そのスプライスを含む）キャプチャーを固定化したチップであって、ここでのキャプチャーが、ＣＳＴ１、ＣＳＴ１のスプライスおよびそれらのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブを含み、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントの配列が配列番号４８に示される、利用方法。
11. 前記プローブが配列番号３、３５〜３８および４３の配列から選択される、請求項１０に記載の利用方法。
12. 前記プローブが配列番号３に示された配列である、請求項１１に記載の利用方法。
13. ＣＳＴ１遺伝子のキャプチャーおよびそのスプライスバリアントのキャプチャーを使用する予測および診断キットであって、ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーが、ＣＳＴ１またはそのｃＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブを含み、前記プライマーの配列が配列番号１〜２に示され、前記プローブの配列が５’末端にフルオロフォア標識および３’末端に蛍光クエンチャー標識を有する配列番号３に示される、予測および診断キット。
14. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライス（増幅産物）の組換えプラスミドの標準物質を含み、その配列が配列番号５１に示される、請求項１３に記載の予測および診断キット。
15. 陽性対照としての乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、および陰性対照としての正常乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔを含む、請求項１４に記載の予測および診断キット。
16. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスのキャプチャーがＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスのｃＤＮＡに特異的なプライマーおよびプローブを含む乳癌の予測および診断キットであって、前記プライマーの配列が配列番号３４および２に示され、前記プローブの配列が５’末端にフルオロフォア標識および３’末端に蛍光クエンチャー標識を有する配列番号３に示される、乳癌の予測および診断キット。
17. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーを含む乳癌の予測および診断キットであって、ここでのキャプチャーが前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのｃＤＮＡのプライマーおよびプローブであり、前記プライマーの配列が配列番号３９〜４４に示され、前記プローブの配列が５’末端に放射性標識を有する配列番号４３に示される、乳癌の予測および診断キット。
18. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーを含む乳癌の予測および診断キットであって、ここでのキャプチャーがＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのｃＤＮＡのプライマーであり、その配列が配列番号１〜２、または配列番号４〜５、または配列番号６〜７、または配列番号８〜９、または配列番号１０〜１１、または配列番号１２〜１３、または配列番号１４〜１５、または配列番号１６〜１７、または配列番号１８〜１９、または配列番号２０〜２１に示される、乳癌の予測および診断キット。
19. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーを含む、乳癌の予測および診断キットであって、前記ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのキャプチャーがＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントのｃＤＮＡの特異的プローブであり、前記プローブの配列は５’末端にハプテン標識を有する配列番号３５〜３８に示される、乳癌の予測および診断キット。
20. ＣＳＴ１にコードされたタンパク質シスタチンＳＮのキャプチャーを含む乳癌の予測および診断キットであって、前記シスタチンＳＮキャプチャーがシスタチンＳＮのモノクローナル抗体であるキットであり、シスタチンＳＮアンチゲン、イムノアッセイ用の二次抗体および酵素基質を含む、乳癌の予測および診断キット。
21. ＣＳＴ１にコードされたタンパク質シスタチンＳＮのキャプチャーを含む乳癌の予測および診断キットであって、シスタチンＳＮの前記キャプチャーがシスタチンＳＮのモノクローナル抗体およびビオチン標識抗シスタチンＳＮポリクローナル抗体であり、シスタチンＳＮ標準物質、ストレプトアビジン酵素複合体および酵素基質を含む、乳癌の予測および診断キット。
22. ＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアント、またはＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントにコードされたタンパク質（たとえば、サンプルにおけるシスタチンＳＮ）の測定されたレベルまたは発現がカットオフ値と比較される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の、乳癌の予測および診断のための任意の方法または乳癌の予測および診断のための任意のキットであって、前記検査の結論は、測定された値が前記カットオフ値より高ければ、陽性であり、前記カットオフ値は、健常者および乳癌患者の組織または体液におけるＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアント、ならびにＣＳＴ１遺伝子およびそのスプライスバリアントによりコードされたタンパク質シスタチンＳＮのレベルまたは発現の統計学的有意性との比較により得られ、サンプルは、手術または生検由来の組織、リンパ節組織、髄、血清、血漿、全血、血液および尿の画分を含む、乳癌の予測および診断のための方法または乳癌の予測および診断のためのキット。