JP2015062356A - Evaluation method of odor molecules using olfactory receptors - Google Patents
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Abstract
【課題】ＯＲ非依存性応答による影響を抑制又は回避しつつ匂い分子を評価できる方法を提供する。
【解決手段】嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価方法を、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用したレポーター遺伝子の発現によって被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、を備えるものとし、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制するようにする。
【選択図】図１Provided is a method capable of evaluating odor molecules while suppressing or avoiding the influence of an OR-independent response.
A method for evaluating an odor molecule using an olfactory receptor is evaluated as an odor molecule of a test substance by expressing a reporter gene using activation of a cAMP-responsive element binding protein via the olfactory receptor. An evaluation step is provided, and the activation pathway of cAMP responsive element protein independent of olfactory receptors is suppressed.
[Selection] Figure 1
Description
本明細書は、嗅覚受容体（Olfactory Receptor、以下、単に、ＯＲともいう。）を用いた匂い分子の評価方法及びこの評価方法を利用したマスキング剤のスクリーニング方法、ＯＲのスクリーニング方法、匂い分子評価キット、マスキング剤のスクリーニングキット等に関する。 The present specification describes an odor molecule evaluation method using an olfactory receptor (hereinafter also simply referred to as OR), a screening method for a masking agent using the evaluation method, an OR screening method, and an odor molecule evaluation. The present invention relates to a kit and a screening kit for a masking agent.
近年、生活環境における匂い分子の利用や匂い分子のマスクなどが種々検討されている。こうした匂い分子の利用やマスクのためには、匂い分子に対するヒトなどの動物の応答性、すなわち、嗅覚感度を定量的に評価する必要がある。 In recent years, various studies have been made on the use of odor molecules and odor molecule masks in living environments. In order to use and mask such odor molecules, it is necessary to quantitatively evaluate the response of animals such as humans to odor molecules, that is, olfactory sensitivity.
匂い分子の動物における嗅覚感度の評価方法の１つとして、当該匂い分子に対して応答性のある嗅覚受容体（ＯＲ）を用いた評価方法がある（特許文献１〜５、非特許文献１）。この評価方法は、細胞膜に所望のＯＲを備え、かつ、ｃＡＭＰ応答性エレメント（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＣＲＥ）−ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたＤＮＡを核内に保持する形質転換ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来、アデノウイルス５型による形質転換株）を用いたレポーターアッセイである。 As one method for evaluating the olfactory sensitivity of an odor molecule in an animal, there is an evaluation method using an olfactory receptor (OR) that is responsive to the odor molecule (Patent Documents 1 to 5, Non-Patent Document 1). . In this evaluation method, transformed HEK293 cells (derived from human fetal kidney cells) having a desired OR in the cell membrane and retaining in the nucleus a DNA containing a cAMP responsive element (CRE) -luciferase gene. , A reporter assay using adenovirus type 5 transformed strain).
すなわち、この評価用細胞のＯＲと各種の匂い分子とを接触させこれらを結合させることで、細胞内において、Ｇタンパク質、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が順次活性化されて、ｃＡＭＰが上昇する。これに伴いプロテインキナーゼ（ＰＫＡ）がリン酸化されて下流のシグナル伝達系を活性化する。その一方でＰＫＡが核内に移行して、転写因子ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を活性化し、ＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して、その結果ルシフェラーゼが活性化されて発光する。このＣＲＥを介した応答（以下、単にＣＲＥ応答ともいう。）に基づく発光強度を測定して匂い分子の嗅覚感度を評価する。 That is, by bringing the OR of this evaluation cell into contact with various odor molecules and binding them, G protein and adenylate cyclase (AC) are sequentially activated in the cell, and cAMP increases. Along with this, protein kinase (PKA) is phosphorylated to activate the downstream signal transduction system. On the other hand, PKA moves into the nucleus and activates the transcription factor CRE binding protein (CREB). The CRE binding protein binds to CRE, and as a result, luciferase is activated and emits light. The luminescence intensity based on the response via CRE (hereinafter also simply referred to as CRE response) is measured to evaluate the olfactory sensitivity of the odor molecule.
しかしながら、本発明者らが、ＯＲを細胞膜に発現しない以外は従来の評価用細胞と同様の細胞と匂い分子とを接触させたところ、一部の匂い分子は、ＯＲが存在しないにもかかわらずＣＲＥ応答を示す傾向があることがわかった。すなわち、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答を示すことがわかった。 However, when the present inventors contacted cells and odor molecules similar to conventional evaluation cells except that OR is not expressed in the cell membrane, some of the odor molecules are not present in OR. It was found that there was a tendency to show a CRE response. That is, it was found to show an OR-independent CRE response.
したがって、匂い分子の各種ＯＲ応答を評価する場合には、従来のようにＯＲ存在細胞のみで評価していては、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答によるバックグラウンド値が高くなり、匂い分子に対する嗅覚感度を正確に評価できないことがわかった。また、正確な評価のためには、別途コントロールとしてＯＲ非存在細胞でも評価することが必要になってしまうことがわかった。この場合、特に、匂い分子の濃度依存性を評価する場合には評価労力は一層増大してしまうことになる。 Therefore, when various OR responses of odor molecules are evaluated, the background value due to the OR-independent CRE response becomes higher when the evaluation is performed only with OR-existing cells as in the past, and the olfactory sensitivity to the odor molecules is increased. It turned out that it cannot evaluate correctly. In addition, it has been found that for accurate evaluation, it is necessary to separately evaluate OR-free cells as a control. In this case, particularly when evaluating the concentration dependency of the odor molecule, the evaluation effort is further increased.
また、本発明者らによれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答が認められる匂い分子は、概してバックグラウンド値が高いため、微弱なＯＲ応答を呈していたとしても、判別がほとんど不可能であった。 Further, according to the present inventors, since odor molecules in which an OR-independent CRE response is recognized generally have a high background value, even if they show a weak OR response, discrimination is almost impossible. .
本明細書の開示は、ＯＲ非依存性応答による影響を抑制又は回避しつつ匂い分子の評価できる方法及びその利用を提供する。 The disclosure of the present specification provides a method and its use capable of evaluating odor molecules while suppressing or avoiding the influence of an OR-independent response.
本発明者らは、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の発生要因について種々検討した。その結果、図１に示すように、ｃＡＭＰ量の増大を介したＣＲＥ結合タンパク質を活性化する可能性のある因子に着目した。そしてこうした因子として、ＰＫＣｓ、ＰＩ３−キナーゼ、ＭＥＫ、Ｓｒｃファミリーキナーゼなどの酵素が挙げられることがわかった。さらに、これらの酵素の阻害剤の併存下でＯＲ非依存性応答の抑制効果を評価したところ、阻害剤はＯＲ非依存性応答によるバックグラウンド値を低減しえた。これにより、高い確度で匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答を評価できるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき、以下の手段を提供する。 The present inventors have studied various factors for generating an OR-independent CRE response. As a result, as shown in FIG. 1, attention was focused on factors that may activate CRE-binding protein through an increase in the amount of cAMP. Such factors include enzymes such as PKCs, PI3-kinase, MEK, and Src family kinases. Furthermore, when the inhibitory effect of the OR-independent response was evaluated in the presence of inhibitors of these enzymes, the inhibitor could reduce the background value due to the OR-independent response. As a result, it was found that the OR-dependent CRE response of odor molecules can be evaluated with high accuracy. The present specification provides the following means based on these findings.
（１）嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、評価方法。
（２）前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃファミリータンパク質及びＭＥＫ経路関連タンパク質からなる群から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含む、（１）に記載の評価方法。
（３）前記活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼ及び／又はプロテインキナーゼＣを含む、（１）又は（２）に記載の評価方法。
（４）前記活性化経路は、プロテインキナーゼＣを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）前記活性化経路を阻害する阻害剤を前記活性化経路に作用させた状態で前記評価工程を実施する、（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法。
（６）前記評価工程は、前記ｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化によるレポーター遺伝子の発現を利用する、（１）〜（５）のいずれかに記載の評価方法。
（７）前記匂い分子のＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）が、１．５以上である、（１）〜（６）のいずれかに記載の評価方法。
（８）嗅覚受容体を用いた匂い分子のスクリーニング方法であって、
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、スクリーニング方法。
（９）嗅覚受容体を用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、嗅覚受容体非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記被験物質による前記嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、スクリーニング方法。
（１０）匂い分子のマスキング剤の評価又はスクリーニング方法であって、
マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制した状態で、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記マスキング剤又はその候補化合物による前記嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、方法。
（１１）匂い分子を評価するための嗅覚受容体の評価又はスクリーニング方法であって、
前記匂い分子に関し、被験嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して前記被験嗅覚受容体の応答性の評価を行う評価工程、
を備え、
被験嗅覚受容体に非依存性的なｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、方法。
（１２）嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用したレポーター遺伝子の発現を利用する匂い分子の評価キットであって、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制する阻害剤、
を備える、評価キット。
(1) A method for evaluating odor molecules using olfactory receptors,
An evaluation process for evaluating a test substance as an odor molecule using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor;
With
An evaluation method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP responsive element binding protein independent of an olfactory receptor.
(2) The evaluation according to (1), wherein the activation pathway includes one or more proteins selected from the group consisting of PI3-kinase, protein kinase C, Src family protein, and MEK pathway-related protein. Method.
(3) The evaluation method according to (1) or (2), wherein the activation pathway includes PI3-kinase and / or protein kinase C.
(4) The evaluation method according to any one of (1) to (3), wherein the activation pathway includes protein kinase C.
(5) The evaluation method according to any one of (1) to (4), wherein the evaluation step is performed in a state where an inhibitor that inhibits the activation pathway is allowed to act on the activation pathway.
(6) The evaluation method according to any one of (1) to (5), wherein the evaluation step utilizes expression of a reporter gene by activation of the cAMP responsive element binding protein.
(7) The evaluation method according to any one of (1) to (6), wherein LogD (pH 7.5) of the odor molecule is 1.5 or more.
(8) A method for screening odor molecules using olfactory receptors,
An evaluation process for evaluating a test substance as an odor molecule using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor;
With
A screening method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP-responsive element binding protein independent of an olfactory receptor.
(9) A reagent screening method for evaluating odor molecules using olfactory receptors,
Measuring the activation level of an olfactory receptor-independent cAMP responsive element binding protein in the presence of a test substance;
With
The screening method which evaluates the suppression degree of the activation pathway of the cAMP responsive element binding protein independent of the said olfactory receptor by the said test substance based on the said activation level.
(10) A method for evaluating or screening an odor molecule masking agent,
Activation of cAMP-responsive element binding protein via olfactory receptor in the presence of a masking agent or a candidate compound thereof in a state where the activation pathway of cAMP-responsive element binding protein independent of olfactory receptor is suppressed Measuring the level,
With
A method for evaluating the degree of inhibition of an activation pathway of a cAMP responsive element protein via the olfactory receptor by the masking agent or a candidate compound thereof based on the activation level.
(11) A method for evaluating or screening an olfactory receptor for evaluating odor molecules,
An evaluation step for evaluating the responsiveness of the test olfactory receptor using the activation of the cAMP responsive element binding protein via the test olfactory receptor with respect to the odor molecule,
With
A method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP responsive element binding protein independent of a test olfactory receptor.
(12) An evaluation kit for an odor molecule using expression of a reporter gene using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor,
An inhibitor that suppresses the activation pathway of cAMP responsive element protein independent of olfactory receptors,
An evaluation kit comprising:
本明細書の開示は、匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答に基づく評価方法等に関する。本明細書の開示によれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答に基づくＣＲＥ結合性タンパク質の活性化の影響を抑制又は回避できる。このため、匂い分子をより正確に評価することができるし、確度の高いスクリーニングができる。また、簡易に精度の高い評価方法及びスクリーニング方法が実現される。 The disclosure of the present specification relates to an evaluation method based on an OR-dependent CRE response of an odor molecule. According to the disclosure of the present specification, it is possible to suppress or avoid the influence of CRE-binding protein activation based on an OR-independent CRE response. For this reason, odor molecules can be evaluated more accurately and screening with high accuracy can be performed. In addition, a highly accurate evaluation method and screening method can be realized easily.
また、本明細書の開示によれば、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の影響を抑制又は回避することで、ＯＲ依存性のＣＲＥ応答を正確に評価できる。このため、マスキング剤の評価やスクリーニング、ＯＲの評価やスクリーニングのほか、ＯＲ非依存性ＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路の阻害剤の評価の正確性やスクリーニングの確度も向上させることができる。以下、本明細書の開示に関し、詳細に説明する。 Further, according to the disclosure of the present specification, the OR-dependent CRE response can be accurately evaluated by suppressing or avoiding the influence of the OR-independent CRE response. For this reason, in addition to the evaluation and screening of masking agents, the evaluation and screening of OR, the accuracy of evaluation of inhibitors of the activation pathway of OR-independent CRE-binding protein and the accuracy of screening can be improved. Hereinafter, the disclosure of this specification will be described in detail.
本明細書において「匂い分子」とは、特に限定されない。ヒトにおいて官能的に匂いを感じるものである必要はなく、いずれかの動物の嗅覚受容体に結合し、応答する成分であればよい。匂い分子としては、例えば、ＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）が、１．５以上であることが好ましい。こうした疎水性の匂い分子は、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答によるｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化の程度が大きく、この活性化経路の阻害が有効である。なお、ＬｏｇＤ（ｐＨ７．５）は、分配係数の指標であり、ｐＨ７．５における液−液系〔オクタノール−水〕における各相における成分濃度の対数である。本明細書において、ＬｏｇＤは、ＳＰＡＲＣ（SPARC Performs Automated Reasoning in Chemistry ,ジョージア大学）による構造−物性物質計算を使用して取得できる。なお、ＳＰＡＲＣによる計算は、SPARC on-line calculatorで利用可能である。 In the present specification, the “odor molecule” is not particularly limited. It does not need to be sensually scented in humans, and any component that binds to and responds to the olfactory receptor of any animal may be used. As the odor molecule, for example, Log D (pH 7.5) is preferably 1.5 or more. Such hydrophobic odor molecules have a large degree of activation of the cAMP responsive element binding protein by the OR-independent CRE response, and inhibition of this activation pathway is effective. Log D (pH 7.5) is an index of a distribution coefficient, and is a logarithm of a component concentration in each phase in a liquid-liquid system [octanol-water] at pH 7.5. In this specification, LogD can be obtained using structure-physical material calculation by SPARC (SPARC Performs Automated Reasoning in Chemistry, University of Georgia). Note that SPARC calculation can be used with the SPARC on-line calculator.
本明細書において、匂いに関して「マスキング」とは、目的の匂いを認識させなくするか又は認識を弱めるための手段全般を指す。「マスキング」は、化学的手段、物理的手段、生物的手段、及び感覚的手段を含み得る。例えば、マスキングとしては、目的の匂いの原因となる匂い分子を環境から除去するための任意の手段（例えば、匂い分子の吸着及び化学的分解）、目的の匂いが環境に放出されないようにするための手段(例えば、封じ込め)、香料や芳香剤などの別の匂いを添加して目的の匂いを認識しにくくする方法、等が挙げられる。 In this specification, “masking” with respect to an odor refers to all means for making a target odor unrecognized or weakening recognition. “Masking” may include chemical means, physical means, biological means, and sensory means. For example, as masking, any means for removing odor molecules that cause the target odor from the environment (for example, adsorption and chemical decomposition of odor molecules), to prevent the target odor from being released into the environment. (For example, containment), a method of adding another odor such as a fragrance or a fragrance to make it difficult to recognize the target odor, and the like.
本明細書において、ＯＲ（嗅覚受容体）は、嗅細胞（嗅覚受容神経）にあるＧタンパク質結合受容体の一種であればよく、由来動物種を特に限定しない。概して、１つの匂い分子は、１又は２以上の嗅覚受容体に結合し刺激し、１つの嗅覚受容体は、１又は２以上の匂い分子と結合するようになっている。 In the present specification, the OR (olfactory receptor) may be a kind of G protein-coupled receptor in the olfactory cell (olfactory receptor nerve), and the origin animal species is not particularly limited. In general, one odor molecule binds to and stimulates one or more olfactory receptors, and one olfactory receptor binds to one or more odor molecules.
（ＯＲを用いた匂い分子の評価方法）
本明細書に開示される匂い分子の評価方法は、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う評価工程を備えている。
(Odor molecule evaluation method using OR)
The odor molecule evaluation method disclosed in the present specification includes an evaluation step of performing evaluation as an odor molecule using activation of CRE binding protein via OR.
本評価方法では、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う。ＯＲを介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路については、図１に示したとおりであって当業者において周知である。 In this evaluation method, evaluation as an odor molecule is performed using activation of CRE-binding protein via OR. The activation pathway of cAMP responsive element binding protein via OR is as shown in FIG. 1 and is well known to those skilled in the art.
ＯＲは、本明細書において必要な受容体の機能を失わない限り、どのような形態で使用されてもよい。例えば、ＯＲは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然にＯＲを発現する組織や細胞、又はそれらの培養物のほか、当該ＯＲを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用されるＯＲの範囲に含まれる。こうした各種形態のＯＲは当業者であれば公知技術に基づいて適宜準備することができる。 The OR may be used in any form as long as it does not lose the receptor function required herein. For example, OR is genetically engineered to express OR in addition to tissues and cells that naturally express OR, such as olfactory receptors or olfactory cells isolated from living organisms, or cultures thereof. It can be used in the form of a recombinant cell or a culture thereof. All of these forms fall within the OR range used in the present invention. Those skilled in the art can appropriately prepare these various forms of OR based on known techniques.
ＯＲとして、好ましくは、嗅細胞等の天然にＯＲを発現する細胞、又はＯＲを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、ＯＲをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。 As the OR, cells that naturally express OR, such as olfactory cells, recombinant cells genetically engineered to express OR, or cultures thereof are preferably used. The recombinant cell can be prepared by transforming a cell using a vector incorporating a gene encoding OR.
ＯＲは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。あるいは、数十以上のＯＲを組み合わせて用いることもできる。ＯＲは、各細胞に発現させるようにすることが好ましい。ＯＲは、匂い分子に対して特定の組合せであってもよいし、網羅的に多数のＯＲを用いてもよい。匂い分子の評価の目的に応じて決定される。 OR can be used alone or in combination of two or more. Alternatively, several tens or more ORs can be used in combination. OR is preferably expressed in each cell. The OR may be a specific combination with respect to the odor molecule or a comprehensive number of ORs may be used. It is determined according to the purpose of the odor molecule evaluation.
ＯＲを介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して評価する形態は、特に限定されない。活性化したＣＲＥ結合タンパク質がＣＲＥに結合して下流の遺伝子の発現を促進することを利用して、当該下流の遺伝子として、レポーター遺伝子を導入し、当該レポーター遺伝子の発現レベルを測定してもよい。レポーター遺伝子としては、公知の蛍光タンパク質をコードする遺伝子など、当業者であれば適宜選択できる。またレポーター遺伝子の発現レベルは、用いるレポーター遺伝子の種類に応じて適宜決定される。 The form evaluated using the activation of cAMP-responsive element binding protein via OR is not particularly limited. Utilizing the fact that the activated CRE-binding protein binds to CRE and promotes the expression of a downstream gene, a reporter gene may be introduced as the downstream gene, and the expression level of the reporter gene may be measured. . The reporter gene can be appropriately selected by those skilled in the art, such as a gene encoding a known fluorescent protein. Further, the expression level of the reporter gene is appropriately determined according to the type of reporter gene used.
本明細書に開示される方法では、ＯＲに非依存性のＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路を抑制する。こうすることで、こうした意図しない活性化による影響を抑制又は回避してＯＲ依存的ＣＲＥ結合タンパク質の活性化に基づく評価が可能となる。 In the methods disclosed herein, the CRE-binding protein activation pathway independent of OR is suppressed. In this way, evaluation based on the activation of the OR-dependent CRE-binding protein can be performed while suppressing or avoiding the influence of such unintended activation.
ＯＲ非依存性ＣＲＥ結合タンパク質の活性化経路（以下、単に、非依存性活性化経路という。）は、本発明者らによれば、ＰＩ３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃファミリータンパク質及びＭＥＫ経路関連タンパク質からなる群から選択される１種又は２種以上のタンパク質を含んでいる。これらのタンパク質は、いずれも、ＯＲ発現細胞内における酵素である。 According to the present inventors, the activation pathway of OR-independent CRE-binding protein (hereinafter simply referred to as “independent activation pathway”) is related to PI3-kinase, protein kinase C, Src family protein and MEK pathway. One or more proteins selected from the group consisting of proteins are included. All of these proteins are enzymes in OR-expressing cells.
ここで、ＰＩ３キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３７）は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基（−ＯＨ基）のリン酸化を行う酵素である
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。イノシトールリン脂質は真核生物の細胞膜を構成する成分の一つであり、ＰＩ３Ｋ（キナーゼ）をはじめとしたキナーゼ（リン酸化酵素）の触媒作用を受けてホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸 ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３となり、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／Ａｋｔの活性化を起こす。このシグナル伝達経路はＰＩ３
Here, PI3 kinase (EC 2.7.1.137) is an enzyme that phosphorylates the hydroxyl group (—OH group) at the 3-position of inositol ring of inositol phospholipid.
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. Inositol phospholipid is one of the components of eukaryotic cell membranes, and phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate is catalyzed by kinases (phosphorylating enzymes) including PI3K (kinase). It becomes PtdIns (3,4,5) P3 and causes activation of protein kinase B (PKB) / Akt. This signaling pathway is PI3
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（ＥＣ２．７．１１．１３）は、少なくとも１０種類以上のアイソザイムから構成されるタンパク質ファミリーである。ＰＫＣは基質に存在するセリンおよびスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化する。 Protein kinase C (PKC) (EC 2.7.11.13) is a protein family composed of at least 10 types of isozymes. PKC phosphorylates the hydroxyl groups of serine and threonine residues present in the substrate.
Ｓｒｃファミリーとは、細胞表面受容体と共役して細胞内情報伝達を行うチロシンキナーゼファミリーであり，Ｓｒｃファミリータンパク質としては、ｃ−Ｓｒｃ，ｃ−Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，ｃ−Ｆｇｒ，Ｈｃｋ，Ｂｌｋが哺乳動物，さらにＹｒｋ（ニワトリ）が挙げられる。 The Src family is a tyrosine kinase family that couples with cell surface receptors and transmits intracellular signals. Examples of Src family proteins include c-Src, c-Yes, Fyn, Lyn, Lck, c-Fgr, and Hck. Blk is a mammal, and Yrk (chicken).
ＭＥＫ経路関連タンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーを意味しており、ＭＥＫ（ＭＥＫ１、ＭＥＫ２）、ＥＲＫ（ＥＲＫ１、ＥＲＫ２）を含んでいる。ＭＥＫはＭＡＰキナーゼキナーゼである。ＭＡＰＫ（キナーゼ）は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Ｍitogen-activated Protein Kinase、ＥＣ ２．７．１１．２４）である。ＭＡＰキナーゼは、ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ：Extracellular Signal-regulated Kinase）である。 MEK pathway-related proteins refer to the MAP kinase family and include MEK (MEK1, MEK2), ERK (ERK1, ERK2). MEK is a MAP kinase kinase. MAPK (kinase) is a mitogen-activated protein kinase (EC 2.7.1.24). MAP kinase is ERK (Extracellular Signal-regulated Kinase).
非依存性活性化経路は、ＰＩ３−キナーゼを含む経路であってもよいし、プロテインキナーゼＣを含む経路であってもよい。これら２つの経路であってもよい。好ましくは、少なくともプロテインキナーゼＣを含む経路とする。この活性化経路によって、意図しないＣＲＥ結合タンパク質の活性化が生じていることが多いからである。 The independent activation pathway may be a pathway including PI3-kinase or a pathway including protein kinase C. These two paths may be used. Preferably, the pathway includes at least protein kinase C. This is because this activation pathway often causes unintended activation of the CRE-binding protein.
こうした非依存性活性化経路を抑制するには、非依存性活性化経路として特定されるタンパク質の活性を抑制することが好ましい。タンパク質の活性を抑制するとは、当該タンパク質量を低減するほか、不活性タンパク質を発現させたり、当該タンパク質の阻害剤を供給すること等が挙げられる。阻害剤を利用することが簡便であり阻害剤の効果をすぐに確認できる点において好ましい。 In order to suppress such an independent activation pathway, it is preferable to suppress the activity of the protein specified as the independent activation pathway. Inhibiting the activity of a protein includes reducing the amount of the protein, expressing an inactive protein, supplying an inhibitor of the protein, and the like. It is preferable to use an inhibitor because it is simple and the effect of the inhibitor can be confirmed immediately.
これらの非依存性活性化経路の阻害剤は、それぞれ上記したタンパク質などの阻害剤を適宜用いることができる。こうした阻害剤は、商業的にも入手可能である。例えば、ＰＩ３キナーゼの阻害剤としては、Wortmannin((1alpha,11alpha)-11-(Acetyloxy)-1-(methoxymethyl)-2-oxaandrosta-5,8-dieno(6,5,4-bc)furan-3,7,17-trione）が挙げられる。また、Ｒｏ−３１−８２２０としては、Ｒｏ−３１−８２２０（Bisindolylmalemimde、ＩＸ）が挙げられる。Ｓｒｃファミリーの阻害剤としては、ＳＵ６６５６（2-oxo-3-4,5,6,7-tetrohydro-1H-indol-3-ylmethylene）-2,3-dihydro-1H0-indol-5-sulfonic acid dimethylamide)が挙げられる。ＭＥＫの阻害剤としては、Ｕ０１２６（1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene）が挙げられる。なかでも、ＰＫＣの阻害剤であるＲｏ−３１−８２２０が好ましい。特に、１-ノナノール、ジヒドロジャスモンにおいてはＲｏ−３１−８２２０が好ましい。 As the inhibitors of these independent activation pathways, inhibitors such as the above-described proteins can be appropriately used. Such inhibitors are also commercially available. For example, as an inhibitor of PI3 kinase, Wortmannin ((1alpha, 11alpha) -11- (Acetyloxy) -1- (methoxymethyl) -2-oxaandrosta-5,8-dieno (6,5,4-bc) furan- 3,7,17-trione). Moreover, as Ro-31-8220, Ro-31-8220 (Bisindolylmalemimde, IX) is mentioned. As an inhibitor of the Src family, SU6656 (2-oxo-3-4,5,6,7-tetrohydro-1H-indol-3-ylmethylene) -2,3-dihydro-1H0-indol-5-sulfonic acid dimethylamide ). Examples of MEK inhibitors include U0126 (1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene). Of these, Ro-31-8220 which is an inhibitor of PKC is preferable. In particular, Ro-31-8220 is preferable for 1-nonanol and dihydrojasmon.
阻害剤を用いて非依存性活性化経路を抑制する方法は特に限定されない。非依存性活性化経路を阻害する阻害剤を非依存性活性化経路に作用させた状態であればよい。例えば、ＯＲを細胞膜上に有する細胞に対して、予め阻害剤を供給しておき、その後、阻害剤を除去した状態で匂い分子と接触させて評価工程を実施してもよいし、阻害剤と匂い分子とを同時にＯＲを有する細胞とに接触させて評価工程を実施してもよい。さらに、阻害剤を予め細胞に供給しておき、その後に、阻害剤の存在下で細胞と匂い分子とを接触させてもよい。 The method for suppressing an independent activation pathway using an inhibitor is not particularly limited. What is necessary is just the state which made the inhibitor which inhibits an independent activation pathway act on the independent activation pathway. For example, an inhibitor may be supplied in advance to cells having OR on the cell membrane, and then the evaluation step may be carried out by contacting the odorant molecule with the inhibitor removed. The evaluation step may be performed by simultaneously contacting the odor molecule with a cell having OR. Furthermore, the inhibitor may be supplied to the cell in advance, and then the cell and the odor molecule may be contacted in the presence of the inhibitor.
以上説明した評価工程を備えることで、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答に基づくＣＲＥ結合性タンパク質の活性化の影響を抑制又は回避できる。このため、匂い分子をより正確に評価することができる。 By providing the evaluation process described above, it is possible to suppress or avoid the influence of activation of the CRE-binding protein based on the OR-independent CRE response. For this reason, odor molecules can be more accurately evaluated.
なお、上記評価工程は、そのまま、匂い分子のスクリーニング方法に用いることもできる。被験物質としての匂い分子の評価を行うことで、高い反応性を示すなどの意図した匂い分子を高い確度でスクリーニングすることができる。 In addition, the said evaluation process can also be used for the screening method of an odor molecule as it is. By evaluating an odor molecule as a test substance, an intended odor molecule that exhibits high reactivity can be screened with high accuracy.
なお、被験物質の評価は、例えば、被験物質添加群と対照群（例えば、被験物質非添加群若しくは対照物質添加群）との間でｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を比較することによって行われ得る。対照群と比較して、被験物質添加群におけるｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化が増大していれば、当該被験物質は、用いたＯＲを介してｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質を活性化できることが肯定でき、用いたＯＲを刺激する匂い分子の候補として選択できる。好ましくは、被験物質添加群における活性化レベルが対照群と比較して２倍以上増加していれば、当該被験物質を、用いたＯＲに対する応答性のある匂い分子の候補物質として選択できる。また、被験物質の濃度を段階的に変化させてｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを比較することによっても行うことができる。活性化レベルが、被験物質の濃度に応じて増大するとき、用いたＯＲに対して反応する匂い分子として肯定でき、用いたＯＲを刺激する匂い分子の候補として選択できる。 The test substance is evaluated by, for example, comparing the activation of the cAMP responsive element binding protein between the test substance added group and the control group (for example, the test substance non-added group or the control substance added group). Can be broken. If the activation of the cAMP responsive element binding protein in the test substance addition group is increased as compared with the control group, the test substance can activate the cAMP responsive element binding protein via the OR used. It can be affirmed and can be selected as a candidate odor molecule that stimulates the OR used. Preferably, if the activation level in the test substance addition group is increased by 2 times or more compared to the control group, the test substance can be selected as a candidate substance of odor molecule having a response to the OR used. It can also be carried out by changing the concentration of the test substance stepwise and comparing the activation level of the cAMP responsive element binding protein. When the activation level increases with the concentration of the test substance, it can be affirmed as an odor molecule that reacts to the OR used, and can be selected as a candidate odor molecule that stimulates the OR used.
（ＯＲを用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法）
本明細書によれば、ＯＲを用いた匂い分子の評価のための試薬のスクリーニング方法も提供される。ここでいう試薬とは、既に説明した非依存性活性化経路のタンパク質の阻害剤を含んでいる。本方法によれば、適切な阻害剤となる試薬をスクリーニングすることができ、こうした阻害剤を用いてより適切な匂い分子の評価系を構築できる。また、阻害剤の適切な濃度も決定することができる。
(Reagent screening method for evaluation of odor molecules using OR)
According to this specification, the screening method of the reagent for evaluation of an odor molecule using OR is also provided. The reagent here includes an inhibitor of the protein of the independent activation pathway already described. According to this method, a reagent that is an appropriate inhibitor can be screened, and a more appropriate odor molecule evaluation system can be constructed using such an inhibitor. An appropriate concentration of inhibitor can also be determined.
本方法は、被験物質の存在下で、ＯＲ非依存性のＣＲＥ結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程を備えることができる。この工程では、活性化レベルに基づいて、被験物質による非依存性活性化経路の抑制程度を評価する。この抑制程度は、例えば、ＯＲ非存在の状態で、阻害剤のない状態でのレポーター遺伝子の発現レベルと、ＯＲ非存在の状態での阻害剤と匂い分子とが併存する状態でのレポーター遺伝子の発現レベルとを比較することによって評価できる。コントロールレベル（阻害剤も匂い分子もない状態）に阻害剤併存下でのレポーター遺伝子の発現レベルが近づくほど、阻害剤としての活性が肯定される。 The method can comprise the step of measuring the activation level of an OR-independent CRE binding protein in the presence of a test substance. In this step, the degree of inhibition of the independent activation pathway by the test substance is evaluated based on the activation level. The degree of suppression is, for example, the level of reporter gene expression in the absence of an OR and without an inhibitor, and the level of reporter gene in the absence of an OR and the presence of an inhibitor and an odor molecule. It can be evaluated by comparing the expression level. As the expression level of the reporter gene in the presence of the inhibitor approaches the control level (in the state where there is neither an inhibitor nor an odor molecule), the activity as an inhibitor is affirmed.
（匂い分子のマスキング剤の評価又はスクリーニング方法）
本明細書によれば、匂い分子のマスキング剤又はその候補化合物の評価又はスクリーニング方法も提供される。本方法によれば、匂い分子に対して適切なマスキング剤を評価及びスクリーニングすることができる。また、マスキング剤の適切な濃度も決定することができる。
(Evaluation or screening method for masking agent of odor molecule)
The present specification also provides a method for evaluating or screening an odor molecule masking agent or a candidate compound thereof. According to this method, an appropriate masking agent for odor molecules can be evaluated and screened. The appropriate concentration of masking agent can also be determined.
本方法は、マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、非依存性活性化経路を抑制した状態で、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程を備えることができる。この工程においては、非依存性活性化経路の影響を抑制又は回避して得られた活性化レベルに基づいて、マスキング剤による匂い分子のＯＲ依存性ＣＲＥ応答活性化経路の抑制程度を評価する。非依存性活性化経路の抑制程度は、上記試薬のスクリーニング方法と同様に実施できる。 This method can comprise the step of measuring the activation level of CRE-binding protein via OR in the presence of a masking agent or a candidate compound thereof in a state where the independent activation pathway is suppressed. In this step, the degree of inhibition of the OR-dependent CRE response activation pathway of the odor molecule by the masking agent is evaluated based on the activation level obtained by suppressing or avoiding the influence of the independent activation pathway. The degree of inhibition of the independent activation pathway can be carried out in the same manner as the above screening method for reagents.
（匂い分子を評価するためのＯＲの評価又はスクリーニング方法）
本明細書によれば、匂い分子を評価するためのＯＲの評価又はスクリーニング方法も提供される。本方法によれば、匂い分子を評価するための１種又は２種以上のＯＲを評価又はスクリーニングできる。
(OR evaluation or screening method for evaluating odor molecules)
According to the present specification, an OR evaluation or screening method for evaluating odor molecules is also provided. According to this method, one or more ORs for evaluating odor molecules can be evaluated or screened.
本方法は、匂い分子に関し、被験ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用して被験ＯＲの応答性の評価を行う評価工程を備えている。この工程において、被験ＯＲに関して非依存性活性化経路を抑制するようにする。こうすることで、非依存性活性化経路の影響を抑制又は回避して、特定の匂い分子を評価するための適切なＯＲを選定することができる。 This method includes an evaluation step for evaluating the responsiveness of the test OR using the activation of the CRE binding protein via the test OR with respect to the odor molecule. In this step, an independent activation pathway is suppressed with respect to the test OR. By doing so, it is possible to select an appropriate OR for evaluating a specific odor molecule while suppressing or avoiding the influence of the independent activation pathway.
（評価キット）
本明細書によれば、ＯＲを介したＣＲＥ結合タンパク質の活性化を利用した匂い分子の評価キットも提供される。このキットは、既に説明した、非依存性活性化経路の阻害剤を備えている。阻害剤は、ＯＲの種類に応じて、あるいは、匂い分子の種類に応じて１種又は２種以上が組み合わされる。
(Evaluation kit)
According to the present specification, an evaluation kit for odor molecules using activation of CRE-binding protein via OR is also provided. This kit comprises an inhibitor of the independent activation pathway already described. One or more inhibitors are combined according to the type of OR or according to the type of odor molecule.
以下、本明細書の開示を具体例を挙げて説明するが、本明細書の開示は、以下の具体例に限定されるものではない。 Hereinafter, the disclosure of the present specification will be described with specific examples, but the disclosure of the present specification is not limited to the following specific examples.
（ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の測定）
ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地にて培養し、以下の表に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で３０分放置した後、３８４ウェル（ポリ−Ｌ−リジンコート・ホワイトプレート）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞を２．８×１０5／ｃｍ2の割合で各ウェルに播種し、ＣＯ2インキュベータ内で２４時間培養して、ＯＲ非発現であってＯＲ非依存性ＣＲＥ応答評価用のＨＥＫ２９３細胞を調製した。
(Measurement of OR-independent CRE response)
HEK293 cells were cultured in a DME medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) -penicillin / streptomycin, and a reaction solution having the composition shown in the following table was prepared. After leaving for 30 minutes in a clean bench, Poly-L-lysine-coated white plate). Next, HEK293 cells were seeded in each well at a rate of 2.8 × 10 5 / cm 2 , cultured for 24 hours in a CO 2 incubator, and HEK293 for evaluation of OR-independent and OR-independent CRE responses. Cells were prepared.
なお、ＣＲＥ応答の測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＬ−ＴＫ）を融合させたものを同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。 The CRE response was measured using a luciferase reporter gene assay that monitors the increase in intracellular cAMP level as a luminescence value derived from the firefly luciferase gene (luc2P / CRE / Hygro). Further, a renilla luciferase gene (pRL-TK) fused to the HSV-TK promoter downstream was simultaneously introduced, and used as an internal standard for correcting errors in gene transfer efficiency and cell number.
２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で調整した匂い分子（各１ｍＭ）を添加し、４時間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。匂い分子は４８種類を評価した。 After culturing for 24 hours, the medium was removed, odor molecules (1 mM each) adjusted with serum-free medium were added, and left in a CO 2 incubator for 4 hours. 48 kinds of odor molecules were evaluated.
ルシフェラーゼ活性はDual-Glo Luciferase assay system（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の添付プロトコルに準じて測定した。匂い分子刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値をコントロール群の発光値で割った値をFold induction of luciferaseとして、応答強度の指標とした。コントロール群は、非匂い分子処理群であり、各匂い分子の代わりにＤＭＳＯを添加した。結果を図２に示す。 Luciferase activity was measured according to the attached protocol of Dual-Glo Luciferase assay system (Promega). A value obtained by dividing the luminescence value derived from firefly luciferase induced by odor molecule stimulation by the luminescence value of the control group was used as Fold induction of luciferase, which was used as an indicator of response intensity. The control group was a non-odor molecule treatment group, and DMSO was added instead of each odor molecule. The results are shown in FIG.
図２に示すように、４８種類の匂い分子のうち、２２種類の匂い分子のFold induction of luciferaseが2以上を示した。また、これらの匂い物質は、いずれも、ＳＰＡＲＣによって取得したＬｏｇＤが１．５以上を示していることがわかった。 As shown in FIG. 2, the fold induction of luciferase of 22 kinds of odor molecules out of 48 kinds of odor molecules showed 2 or more. Moreover, it turned out that all of these odorous substances have LogD acquired by SPARC of 1.5 or more.
（細胞死評価）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養し、実施例１の表１と同様の組成で同様に遺伝子導入してＯＲ非発現ＨＥＫ２９３細胞を調製し播種した。ただし、９６ウェル透明プレートを用いた。２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で目的濃度調整した各阻害剤を各々に２０μＬずつ添加し、１時間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。用いた阻害剤はＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６である。
(Evaluation of cell death)
HEK293 cells were cultured in the same manner as in Example 1, and gene transfer was performed in the same manner as in Table 1 of Example 1 to prepare OR seeded OR-nonexpressing HEK293 cells. However, a 96-well transparent plate was used. After culturing for 24 hours, the medium was removed, 20 μL of each inhibitor whose target concentration was adjusted with a serum-free medium was added to each, and left in a CO 2 incubator for 1 hour. Inhibitors used are Ro-31-8220, Wortmannin, U0126 and SU6656.
放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（各１ｍＭ）および阻害剤の混合液を２０μＬずつ添加した。匂い分子は１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンを用いた。なお、本検討にはＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いた。製品プロトコルに従い、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を１０μＬずつ添加し、４時間ＣＯ2インキュベータ内で呈色反応させた。その結果、実施例２で使用した阻害剤および匂い分子の濃度域では細胞死は確認されなかった。 After standing, the medium was removed, and 20 μL each of a mixture of odor molecules (1 mM each) adjusted to the target concentration with a serum-free medium and an inhibitor was added. As the odor molecule, 1-nonanol and dihydrojasmon were used. In this study, Cell Counting Kit-8 (DOJINDO) was used. According to the product protocol, 10 μL of Cell Counting Kit-8 was added, and color reaction was performed in a CO 2 incubator for 4 hours. As a result, cell death was not confirmed in the concentration range of the inhibitor and odor molecule used in Example 2.
（阻害剤によるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養し、実施例１の表１と同様の組成で遺伝子導入してＯＲ非発現ＨＥＫ２９３細胞を調製して播種し、ルシフェラーゼアッセイを適用した。２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地で目的濃度に調整した各阻害剤を各々に２０μｌずつ添加し、３０分間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。用いた阻害剤はＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６であった。
(Inhibition of OR-independent CRE response by inhibitors)
HEK293 cells were cultured in the same manner as in Example 1, and transfected with the same composition as in Table 1 of Example 1 to prepare and seed OR-unexpressed HEK293 cells, and a luciferase assay was applied. After culturing for 24 hours, the medium was removed, 20 μl of each inhibitor adjusted to the target concentration with a serum-free medium was added to each, and left in a CO 2 incubator for 30 minutes. Inhibitors used were Ro-31-8220, Wortmannin, U0126 and SU6656.
放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（各１ｍＭ）および阻害剤の混合液を２０μＬずつ添加した。匂い分子は１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンを用いた。実施例１と同様の手順で、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３及び図４に示す。 After standing, the medium was removed, and 20 μL each of a mixture of odor molecules (1 mM each) adjusted to the target concentration with a serum-free medium and an inhibitor was added. As the odor molecule, 1-nonanol and dihydrojasmon were used. Luciferase activity was measured in the same procedure as in Example 1. The results are shown in FIGS.
図３に示すように、１−ノナノールはＲｏ−３１−８２２０、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｕ０１２６およびＳＵ６６５６で濃度依存的にＣＲＥ応答が抑制された。また、図４に示すように、ジヒドロジャスモンはＲｏ−３１−８２２０およびＵ０１２６で抑制された。Ｒｏ−３１−８２２０により、１−ノナノールおよびジヒドロジャスモンのＣＲＥ応答値は基準応答値（匂い分子がない状態での応答値）に近づくことがわかった。 As shown in FIG. 3, the CRE response of 1-nonanol was suppressed in a concentration-dependent manner by Ro-31-8220, Wortmannin, U0126, and SU6656. Moreover, as shown in FIG. 4, dihydrojasmon was suppressed by Ro-31-8220 and U0126. From Ro-31-8220, it was found that the CRE response values of 1-nonanol and dihydrojasmon approach the reference response values (response values in the absence of odor molecules).
（阻害剤によるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の抑制）
実施例１と同様にしてＨＥＫ２９３細胞を培養した。以下の表２に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で３０分放置した後、３８４ウェル（ポリーＬ−リジンコート・ホワイトプレート）の各ウェルに添加してＯＲ発現細胞を調製した。ＯＲは、ＰＣＲにより増幅した各ＯＲ遺伝子をＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されるようにｐＦ５Ａ ＣＭＶ−ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)に挿入し、ＯＲ発現ベクターとして構築したものを用いた。次いで、ＯＲ発現ＨＲＫ２９３細胞を２．８×１０5／ｃｍ2の割合で各ウェルに播種し、ＣＯ2インキュベータ内で２４時間培養した。その後、実施例１と同様の手順によるルシフェラーゼアッセイを行った。
(Inhibition of OR-independent CRE response by inhibitors)
HEK293 cells were cultured in the same manner as in Example 1. A reaction solution having the composition shown in Table 2 below was prepared and allowed to stand in a clean bench for 30 minutes, and then added to each well of 384 wells (poly L-lysine-coated white plate) to prepare OR-expressing cells. The OR was used as an OR expression vector constructed by inserting each OR gene amplified by PCR into pF5A CMV-neo Flexi Vector (Promega) so that the FLAG sequence was added to the N-terminus. Subsequently, OR-expressing HRK293 cells were seeded in each well at a rate of 2.8 × 10 5 / cm 2 and cultured in a CO 2 incubator for 24 hours. Then, the luciferase assay by the procedure similar to Example 1 was performed.
２４時間培養後、培地を取り除き、無血清培地でＲｏ−３１−８２２０（５μＭ）を各々に２０μＬずつ添加し、３０分間ＣＯ2インキュベータ内に放置した。放置後、培地を取り除き無血清培地で目的濃度に調整した匂い分子（１−ノナノール、ジヒドロジャスモン各１ｍＭ）およびＲｏ−３１−８２２０の混合液を２０μＬずつ添加した。実施例１と同様の手順で、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図５〜図８に示す。 After culturing for 24 hours, the medium was removed, and Ro-31-8220 (5 μM) was added to each serum-free medium in an amount of 20 μL and left in a CO 2 incubator for 30 minutes. After standing, the medium was removed, and 20 μL each of a mixed solution of odor molecules (1-nonanol and dihydrojasmon 1 mM each) adjusted to the target concentration with a serum-free medium and Ro-31-8220 was added. Luciferase activity was measured in the same procedure as in Example 1. The results are shown in FIGS.
図５及び図６に示すように、各種ＯＲ発現細胞において、１−ノナノールによるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答は、阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）の添加により、基準応答値（各種ＯＲ発現細胞における非匂い分子処理群の蛍光強度）に近づくことがわかった。また、図７及び図８に示すように、各種ＯＲにおいて、ジヒドロジャスモンによるＯＲ非依存性ＣＲＥ応答は、阻害剤（Ｒｏ−３１−８２２０）の添加により、基準応答値（各種ＯＲ発現細胞における非匂い分子処理群の蛍光強度）に近づくことがわかった。 As shown in FIGS. 5 and 6, in various OR-expressing cells, the OR-independent CRE response by 1-nonanol was determined by adding an inhibitor (Ro-31-8220) as a reference response value (in various OR-expressing cells). It was found that the fluorescence intensity of the non-odor molecule treatment group approached. Moreover, as shown in FIGS. 7 and 8, in various ORs, the OR-independent CRE response by dihydrojasmon is increased by adding an inhibitor (Ro-31-8220) to a reference response value (non-reactivity in various OR-expressing cells). It was found that the fluorescence intensity of the odor molecule treatment group approached.
以上のことから、ＯＲを用いた匂い分子の評価にあたり、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答を抑制することで、ＯＲと匂い分子との反応性が正確に評価できることがわかった。したがって、ＯＲを用いた匂い分子、匂い分子のマスキング剤、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答の阻害剤を評価したりあるいはスクリーニングするのにあたっては、ＯＲ非依存性ＣＲＥ応答レベルを考慮し必要に応じてそれを抑制することが重要であることがわかった。 From the above, it was found that the reactivity between OR and odor molecules can be accurately evaluated by suppressing the OR-independent CRE response in the evaluation of odor molecules using OR. Therefore, in evaluating or screening odor molecules, odor molecule masking agents, and OR-independent CRE response inhibitors using OR, the OR-independent CRE response level should be considered as necessary. It was found that it is important to suppress this.
Claims (12)
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、評価方法。 A method for evaluating odor molecules using olfactory receptors,
An evaluation step of performing evaluation as an odor molecule by using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor;
With
An evaluation method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP responsive element binding protein independent of an olfactory receptor.
嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して被験物質の匂い分子としての評価を行う評価工程、
を備え、
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、スクリーニング方法。 A screening method for odor molecules using olfactory receptors,
An evaluation process for evaluating a test substance as an odor molecule using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor;
With
A screening method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP-responsive element binding protein independent of an olfactory receptor.
被験物質の存在下で、嗅覚受容体非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記被験物質による前記嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、スクリーニング方法。 A screening method for a reagent for evaluation of odor molecules using an olfactory receptor,
Measuring the activation level of an olfactory receptor-independent cAMP responsive element binding protein in the presence of a test substance;
With
The screening method which evaluates the suppression degree of the activation pathway of the cAMP responsive element binding protein independent of the said olfactory receptor by the said test substance based on the said activation level.
マスキング剤又はその候補化合物の存在下で、嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制した状態で、嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化レベルを測定する工程、
を備え、
前記活性化レベルに基づいて、前記マスキング剤又はその候補化合物による前記嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路の抑制程度を評価する、方法。 A method for evaluating or screening a masking agent for odor molecules,
Activation of cAMP-responsive element binding protein via olfactory receptor in the presence of a masking agent or a candidate compound thereof in a state where the activation pathway of cAMP-responsive element binding protein independent of olfactory receptor is suppressed Measuring the level,
With
A method for evaluating the degree of inhibition of an activation pathway of a cAMP responsive element protein via the olfactory receptor by the masking agent or a candidate compound thereof based on the activation level.
前記匂い分子に関し、被験嗅覚受容体を介したｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化を利用して前記被験嗅覚受容体の応答性の評価を行う評価工程、
を備え、
被験嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質の活性化経路を抑制することを特徴とする、方法。 An olfactory receptor evaluation or screening method for evaluating odor molecules comprising:
An evaluation step for evaluating the responsiveness of the test olfactory receptor using the activation of the cAMP responsive element binding protein via the test olfactory receptor with respect to the odor molecule,
With
A method comprising suppressing an activation pathway of a cAMP responsive element binding protein independent of a test olfactory receptor.
嗅覚受容体に非依存性のｃＡＭＰ応答性エレメントタンパク質の活性化経路を抑制する阻害剤、
を備える、評価キット。 An evaluation kit for an odor molecule using expression of a reporter gene using activation of a cAMP responsive element binding protein via an olfactory receptor,
An inhibitor that suppresses the activation pathway of cAMP responsive element protein independent of olfactory receptors,
An evaluation kit comprising:
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