JP2014181309A - マクロファージマンノース受容体を認識する新規多糖金属錯体化合物、及び、その医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】煩雑な操作を必要とせず、簡便に製造可能であり、マスキング等の問題を解消し、マンノース受容体を有する細胞が集簇する臓器又は組織に対して正確な診断が可能な新規金属錯体化合物、及び、これを含有する医薬組成物を開発する。
【解決手段】マンノースを成分として含む多糖化合物に、金属錯体を形成するためのリンカーが結合し、金属と金属錯体を形成している多糖金属錯体化合物、その溶媒和物、又は塩を製造し、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変を高集積で正確に検出するための、新規金属錯体化合物、及び、それらの塩、並びに、それらを含有する医薬組成物を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、マンノース受容体に結合する多糖金属錯体化合物、及び、これを含有する医薬組成物に関する。

腫瘍の原発巣を摘出する手術の際、所属リンパ節に転移した腫瘍細胞が残存していると術後に再発する危険性がある。そこで、腫瘍原発巣とその周辺のリンパ管やリンパ節とを広範囲に摘出するリンパ節郭清が施されている。しかし、正常なリンパ節等の組織も摘出するため、患者に対する侵襲が大きい。

センチネルリンパ節は、見張りリンパ節とも呼ばれ、悪性腫瘍病巣などの局所から流れ出たリンパ液が最初に入り込むリンパ節であり、リンパ液を介し、ここに最初の微小転移が生ずるといわれている。そこで、ここに転移が無ければそれ以上のリンパ節の摘出を省略しようとするセンチネルリンパ節生検が行われている。

また、腫瘍原発巣摘出手術の際、患者への侵襲を小さくするために、センチネルリンパ節を特定し、そこに転移がなければ他のリンパ節を摘出せず腫瘍原発巣のみを摘出するという手術が行なわれるようになっている。

このセンチネルリンパ節の検出を目的として、リンパ節に常在するマクロファージを標的とする放射性医薬品であるテクネチウム−９９ｍ（^99mＴｃ）標識コロイド製剤が使用されている。しかし本薬剤は、投与部位に大部分の薬剤が滞留するため、マスキングにより投与部位の近傍に存在するセンチネルリンパ節の検出が困難である場合がある。この問題の解決を目的として、マクロファージのマンノース受容体に選択的に結合する薬剤の開発が進められている（非特許文献１）。

マンノースは、糖の一種であり、本来、哺乳動物の構成成分ではなく、微生物等の細胞膜等に存在する。マクロファージ、脾洞内皮や脾索の細網細胞や肝臓のクッパー細胞等の細網内皮系の細胞はマンノース受容体を有し、これらのマンノースを有する微生物を貪食し排除する。

そこで、前記マンノース受容体のリガンドを有する放射性医薬品として、デキストランに複数のマンノースを結合した^99mＴｃで標識した薬剤（Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋ）が開発され、現在、臨床試験が行われている（非特許文献２−３）。また、本発明者らは、高比放射能の^99mＴｃ標識マンノース結合デキストランを作製する方法を開発した（非特許文献４−５）。

Takagi K. et al., Nucl. Med. Biol. 31, 893-900, 2004 Jeanette M, et al., J. Nucl. Med. 44, 1677-1681, 2003 Anne M. W，et al., Nucl. Med. Biol. 36, 687-692, 2009 Morais M, et al., Mol. Pharmaceutics, 8, 609, 2011 Permettis I, et al., Mol. Pharmaceutics 9, 1681-1692, 2012

これらのデキストランを修飾したマンノース結合デキストランの合成は煩雑との問題が残されている。さらに、前記Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋは^99mＴｃとの錯形成部位にジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を使用しているため、^99mＴｃ標識反応収率や標識体の比放射能に問題が観られる。また、投与部位にも多くの放射活性が依然として観察される。前記高比放射能^99mＴｃ標識方法は、Ｌｙｍｐｈｏｓｅｅｋに比べて錯形成反応収率や比放射能を大きく改善したものの、本薬剤を用いた場合でも投与部位に多くの放射活性が観察され、これらの問題の解決が強く望まれている。

本発明者らは、鋭意研究した結果、比較的簡単に入手可能なマンナンを標識母体に用いることにより、センチネルリンパ節に対する集積効率の高い^99mＴｃ標識誘導体を初めて作製することに成功し、本発明を完成させた。

マンナンは、マンノースが多重縮合した多糖であり、光分解により低分子化が可能であることから、適切なサイズのマンナン誘導体を用いることで、マンノース結合デキストランで問題とされている投与部位からの緩徐な消失によるセンチネルリンパ節検出に対するマスキング問題等を解消すること、さらに、これらの特性に基づくセンチネルリンパ節の正確な診断を行うことが可能である。

具体的には、本発明は、マンノースを成分として含む多糖化合物に、金属錯体を形成するためのリンカーが結合し、該リンカーは配位子として金属に配位している多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩を提供する。

前記多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩は、マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、該配位子は放射性金属に配位する下記式１で表される、多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩の場合がある。

ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基、Ｍは金属、ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００−６００、α＝３５６−５３４、β＝４４−６６、
γ＝４０−６１である。

本発明の前記多糖金属錯体化合物において、前記スペーサー基はｎ−プロピル基であり、下記式２で表される場合がある。

ただし、Ｍは金属、ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００−６００、α＝３５６−５３４、β＝４４−６６、
γ＝４０−６１である。

本発明の前記多糖金属錯体化合物において、前記多糖化合物はマンナンである場合がある。

本発明の前記多糖金属錯体化合物において、前記金属が、放射性金属、放射線不透過性金属及び常磁性金属からなる群から選択される１種類又は２種類以上の金属の場合がある。

本発明の前記多糖金属錯体化合物において、前記放射性金属が、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵¹Ｃｒ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁴⁷Ｓｃ、⁹⁰Ｙ、⁸⁸Ｙ、⁸⁶Ｙ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰³Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹¹¹Ｉｎ、¹¹⁷ｍＳｎ、¹⁴¹Ｃｅ、¹⁴⁰Ｌａ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶¹Ｔｂ、¹⁶⁵Ｄｙ、¹⁶⁶Ｄｙ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁶⁸Ｙｂ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、²⁰³Ｐｂ、²¹¹Ｂｉ、²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²¹⁴Ｂｉ、及び²²⁵Ａｃからなる群から選択される１種類又は２種類以上の金属の場合がある。

本発明の医薬組成物は、前記金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩を有効成分として含有する場合がある。

本発明の医薬組成物は、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変を検出するために使用される場合がある。

前記マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変は、センチネルリンパ節、肝臓、脾臓、血管内腔の不安定プラークからなる群から選択される１種類又は２種類以上の場合がある。

本発明の医薬組成物は、センチネルリンパ節に対する検出剤の場合がある。

本発明の医薬組成物は、不安定プラークに対する検出剤の場合がある。

本発明の医薬組成物は、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変を検出するために使用される肝脾シンチグラフィーの場合がある。

本発明は、マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、下記式３で表される、金属の担体化合物、その溶媒和物又は塩を提供する。
ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基を表し、
ｎ、α、及びβは整数を表し、
ｎ＝α＋βであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６である。

本発明の前記金属の担体化合物において、前記スペーサー基が、ｎ−プロピル基であり、下記式４で表される場合がある。
ただし、ｎ、α、及びβは整数を表し、
ｎ＝α＋βであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６である。

本発明の医薬組成物は、前記金属に配位子として配位する担体化合物、その溶媒和物又は塩を含有する場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩が、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変の検出剤として使用される場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記担体化合物、その溶媒和物又は塩は、センチネルリンパ節検出剤の金属担体として使用される場合がある。

本発明は、マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、該配位子は放射性金属に配位し、下記式５で表される多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩を被験体に投与するステップを含む、センチネルリンパ節の検出方法を提供する。
ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基、Ｍは金属を表し、
ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
γ＝４０ないし６１である。

本発明の前記センチネルリンパ節の検出方法において、前記スペーサー基はｎ−プロピル基であり、下記式６で表される多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩の場合がある。
ただし、Ｍは金属、ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
γ＝４０ないし６１である。

前記式１ないし式６で表される多糖金属錯体化合物において、好ましくは、ｎ＝５００ないし５５０、α＝４４５ないし４９０、β＝５５ないし６０、γ＝５０ないし５５の場合がある。

本発明の前記センチネルリンパ節の検出方法において、前記多糖化合物がマンナンの場合がある。

本発明の前記センチネルリンパ節の検出方法において、前記金属が、放射性金属、放射線不透過性金属及び常磁性金属からなる群から選択される１種類又は２種類以上の金属の場合がある。

本発明は、マンノースを成分として含む多糖化合物に、金属錯体を形成するためのリンカーが結合し、該リンカーは配位子として金属に配位している多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩の製造方法を提供する。

本発明の前記製造方法において、前記多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩は、前記マンノースにリンカーが結合している場合がある。

本発明の前記製造方法において、マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、該配位子は放射性金属に配位し、下記式７で表される場合がある。
ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基、Ｍは金属を表し、
ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
γ＝４０ないし６１である。

本発明の前記製造方法において、前記多糖化合物がマンナンの場合がある。

本発明の前記製造方法において、前記リンカーがシステインの場合がある。

本発明の前記製造方法において、前記スペーサー基はｎ−プロピル基であり、下記式８で表されることを特徴とする、請求項１に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩。
ただし、Ｍは金属、ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
γ＝４０ないし６１である。

前記式７又は式８で表される多糖金属錯体化合物において、好ましくは、ｎ＝５００ないし５５０、α＝４４５ないし４９０、β＝５５ないし６０、γ＝５０ないし５５の場合がある。

本発明の前記製造方法において、前記金属が、放射性金属、放射線不透過性金属及び常磁性金属からなる群から選択される１種類又は２種類以上の金属の場合がある。

本発明により、従来の薬剤に比べてセンチネルリンパ節への高い集積を示す^99mＴｃ標識薬剤が簡便な操作で製造されることを認めた。

動脈硬化性病変では、内膜の肥厚による血管内腔の狭窄を認め、この内膜の肥厚した部分はプラークと呼ばれ、この中、不安定プラークは、血流のシアストレスなどにより血管より剥離し、塞栓となり、血流によって末梢組織に運ばれ、循環障害を惹起することにより、不整脈、心筋梗塞、及び、脳梗塞等の循環器系疾患の原因となる。プラークの内部にはコレステロールエステルからなる多くの針状の結晶物が観察され脂質コアと呼ばれ、脂質コアの周囲には多くの細胞浸潤や繊維成分が認められる。そして、 プラーク形成の初期段階として、内膜下へマクロファージの浸入がきわめて重要であり、血流中の単球が内皮細胞に接着した後に、内膜下に浸入し、マクロファージへと成熟・分化する。マクロファージは、過剰のＬＤＬが存在すると、酸化などの変化を受けた変性ＬＤＬを取り込み、泡沫細胞となってコレステロールエステルを細胞内に蓄積する。そこで、 マクロファージが集簇する不安定プラークを検出することは、循環器系疾患の予防及び治療に重要である。

そこで、本発明は、センチネルリンパ節の検出のみならず、不安定プラークの検出や肝脾シンチグラフィーなど、マクロファージをはじめとした細網内皮系細胞を標的とする分子イメージング（核医学診断）へ応用できる。

さらに、本願発明の多糖金属錯体化合物の使用により、標的部位への集積率が向上し、その結果、患者への投与放射能量を低減でき、患者自身、その家族、及び医療従事者の放射線被曝の低減も可能となる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

多糖金属錯体化合物の合成スキームの概略を表す。 化合物１のＮＭＲスペクトルを表す。 化合物１のＮＭＲスペクトルを表す。 ^99mＴｃ標識多糖金属錯体化合物をｄｄＹ系マウスに投与後のスペクト／ＣＴ像を表す。 ^99mＴｃ標識多糖金属錯体化合物をｄｄＹ系マウスに投与後の、臓器分布の結果を表す。

本発明の金属の担体化合物及び多糖金属錯体化合物は、例えば、図１に示された合成経路で製造することができるが、これに限定されない。

本明細書において、「金属」とは、「金属原子」、「金属イオン」、「金属窒化物」、「金属酸化物」、「金属窒化酸化物」、これらの塩又は水和物などの、特に特定しない場合は、金属元素を含み、該金属元素が中心金属として錯体を形成する限り該金属のいずれの化学形であってもよい。

本発明に使用する前記マンナンの重合度は特に制限を受けないが、投与部位からのクリアランス特性、リンパ節への流入性及び滞留性から、好ましい重合度は、４００から６００である。

また、本発明において、マンナンと金属との錯体形成のためのリンカーを結合したマンナン誘導体として、マンノースの水酸基にアリルハライドでアリル基を結合したアリルマンナンを合成し、このアリルマンナンのアリル基に、さらに、システイン、又は、ＥＤＴＡ（１，２−エチレンジアミン−N, N,N'N'−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン-N,N,N',N",N"-五酢酸）、ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、及びＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−N,N',N''−三酢酸）からなる群から選択される１種以上のコンプレキサン型配位子を結合することができるが、特に、システインを結合した化合物が好ましい。アリルハライドとして、臭化アリル、塩化アリル、ヨウ化アリルが好ましく、臭化アリルがもっとも好ましいが、これに限定されない。

本発明において、多糖金属錯体化合物は、前記金属が、放射性金属、放射線不透過性金属及び常磁性金属などの金属と、緩衝水溶液や生理食塩水などの溶媒中で混合させ、錯体を形成させることにより製造される。

本発明において、前記放射性金属として、これらに限定されないが、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵¹Ｃｒ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁴⁷Ｓｃ、⁹⁰Ｙ、⁸⁸Ｙ、⁸⁶Ｙ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰³Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹¹¹Ｉｎ、¹¹⁷ｍＳｎ、¹⁴¹Ｃｅ、¹⁴⁰Ｌａ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶¹Ｔｂ、¹⁶⁵Ｄｙ、¹⁶⁶Ｄｙ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁶⁸Ｙｂ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、²⁰³Ｐｂ、²¹¹Ｂｉ、²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²¹⁴Ｂｉ、及び²²⁵Ａｃなどが挙げられる。好ましくは、^99mＴｃであるが、これに限定されない。

本発明において、前記放射性金属は、他の金属をサロゲート金属として混合して使用される場合がある。放射性金属に^99mＴｃを使用する場合には、サロゲート金属として、好ましくは、レニウム(Re)が挙げられるが、これに限定されない。

本発明において、前記Ｘ線不透過性金属として、ビスマス、タングステン、タンタル、ハフニウム、ランタン、ランタニド、バリウム、モリブデン、ニオブ、ジルコニウム及びストロンチウムが挙げられ、好ましくは、バリウムであるが、これに限定されない。

本発明において、前記常磁性金属として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられ、好ましくは、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、又は、ガドリニウム（ＩＩＩ）であるが、これらに限定されない。

本発明において、前記製造方法により、これに限らないが、好ましくは、標識率９２％以上の多糖金属錯体化合物を製造できる。

本発明の医薬組成物は、前記多糖金属錯体化合物に、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加剤を加えることにより製造できる。前記添加剤は、希釈剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、防腐剤と、安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限定されない。

前記担体化合物を、予め前記医薬品添加剤と混合し、滅菌された緩衝水溶液、生理食塩水、又は、純水に溶解後、凍結乾燥した状態で保存してもよい。

例えば、本発明のマンノースにスペーサー基を介してリンカーであるシステインを結合したマンノース誘導体である担体化合物（ＭＳＣ）１．０ｍｇに、添加物として、塩化スズ（ＩＩ）二水和物０．０７５ｍｇ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物１．０ｍｇ、クエン酸ナトリウム水和物２．６ｍｇ、Ｄ−マンニトール２０．０ｍｇを加えた担体化合物を含有する組成物を製造する。この担体化合物を含有する組成物に、日局「過テクネチウム酸ナトリウム（^99mＴｃ）注射液」３．７〜２２２ＭＢｑ（１〜３ｍＬ）を加えて振り混ぜ、滅菌フィルターでろ過することにより、多糖性金属錯体を含有する医薬組成物を製造できるが、これらに限定されない。

本発明の前記多糖金属錯体化合物を含有する医薬組成物は、これらに限定されないが、ＧＭＰ基準に適合した製造所で製造され、医療機関へ供給されてもよく、又は、本発明の前記担体化合物をＧＭＰ基準に適合した製造所で製造し、医療機関へ供給後、医療機関で該担体化合物と金属とを混合することにより多糖金属錯体化合物を含有する医薬組成物を製造してもよい。

本発明において、前記多糖金属錯体化合物の金属が前記放射性金属の場合には、該多糖金属錯体化合物を含有する医薬組成物を生体内へ投与後、ガンマ線検出装置、シンチレーションカメラ、シンチレーションスキャナー、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトンコンピュータ断層法）装置、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置、ＰＥＴ（ポジトロンコンピュータ断層法）装置、ＰＥＴ／ＣＴ装置などにより多糖金属錯体化合物の生体内分布や蓄積部位を測定、検出又は診断できる。

本発明において、センチネルリンパ節の検出及びリンパシンチグラフィーは、例えば、成人には^99mＴｃとして３．７〜２２２ＭＢｑを悪性腫瘍近傍の皮下又は皮内に適宜分割して投与し、１時間以降にガンマ線検出用のプローブで被検部を走査することにより、センチネルリンパ節を検出することができる。また、必要に応じシンチレーションカメラ等で被検部を撮像することによりリンパシンチグラムをとることができる。投与から検査実施までの時間を適宜増減することにより至適なリンパシンチグラムを得ることができるが、これに限定されない。

本発明において、肝脾シンチグラフィーは、例えば、成人には^99mＴｃとして３．７〜２２２ＭＢｑを肘静脈に注射し、１５〜３０分後に、被検部をシンチレーションカメラ又はシンチレーションスキャナーで撮影又は走査することにより、肝脾シンチグラムを得ることができるが、これに限定されない。本願発明の医薬組成物の投与は年齢、体重により適宜増減する。

本発明において、前記多糖金属錯体化合物の金属が前記Ｘ線不透過性金属の場合には、該多糖金属錯体化合物を含有する医薬組成物を生体内へ投与後、Ｘ線撮影装置又はＸ線ＣＴ装置などにより、多糖金属錯体化合物の生体内分布や蓄積部位を測定、検出又は診断できる。

前記多糖金属錯体化合物の金属が前記常磁性金属の場合には、該多糖金属錯体化合物を含有する医薬組成物を生体内へ投与後、ＭＲＩ装置などにより、多糖金属錯体化合物の生体内分布や蓄積部位を測定、検出又は診断できる。

本発明の医薬組成物が、診断用医薬組成物として使用される場合、その適用として、悪性黒色腫又は乳癌等におけるセンチネルリンパ節の同定と転移の検索による診断、肝脾シンチグラムにより肝腫瘍・肝膿瘍によるＳＯＬ（Ｓｐａｃｅ Ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ Ｌｅｓｉｏｎ）の検出及び肝硬変・脾腫による形態変化の診断、並びに、不安定プラークなどの血管病変を有する動脈硬化症等の循環器系疾患の診断などに使用できるが、これらに限定されない。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

以下の実験は、千葉大学の動物倫理委員会によって承認された後に実施された（承認番号：第２２−２４０号，承認日：平成２３年３月１５日，承認番号：第２４−９９号，承認日：平成２４年３月７日）。

多糖金属錯体化合物の担体化合物の合成
材料及び方法
化合物１の合成
アリルマンナンの調製は、まず市販のマンナン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、マンノース重合度５００〜５５０（分子量分布 ８１０００〜８９０００、平均分子量８５０００））１００ｍｇを水５００μＬに溶解し、２．５Ｍ水酸化ナトリウム２５０μＬ及び水素化ホウ素ナトリウムを２ｍｇあるいは４ｍｇ加えた。続いて、反応液を５０℃に加温し、臭化アリル（和光純薬社製、純度９７．０％）３０．５μＬ（Ａ−１）、１２２μＬ（Ｂ−１）あるいは２４５μＬ（Ｃ−１）を加え温度５０℃で３時間反応させた。反応ｐＨは２．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適宜滴下することによりｐＨ１１．０を維持した。反応後、２．５Ｍ酢酸水溶液を加えて中和した後、水１ｍＬを加えて希釈し、フィルター（ポア径；０．４５μｍ）でろ過後、ろ液を限外濾過用遠心チューブＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ Ｍｅｍｂｒａｎｅに付し、２，５００×ｇ、３０分間の遠心分離を繰り返すことにより精製した。精製溶媒として１０倍交換容量の水を用いた。その後、精製サンプルを凍結乾燥によって得た。

結果
図１は、多糖金属錯体化合物の合成スキームの概略を表す。精製サンプルとして、無色個体の下記式９で表されるアリルマンナン（以下、化合物１と記載）６１．０ｍｇ（Ａ−１）、６６．７ｍｇ（Ｂ−１）及び７４．７ｍｇ（Ｃ−１）を得た。図２は、得られた化合物１のＮＭＲスペクトルを示す。

マンノースのアノメリックプロトンシグナルの積分値から求めたアリル基の導入率を表１に示す。

前記の反応において、マンナン量に対する臭化アリル量の割合に一致して、マンナンに対するアリル基の導入率は上昇し、Ｃ−１において、マンナンを構成するマンノースへのアリル基の導入率は５７％に達した。

多糖金属錯体化合物の担体化合物の合成
材料及び方法
化合物２の合成
下記式１０で表されるアリルマンナンとシステインの結合体ＭＳＣ（以下、化合物２と記載）の調製は、まず、前記アリルマンナン（化合物１；Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１）５０ｍｇを水に溶解し、システイン３５．８ｍｇあるいは７１．６ｍｇ及びペルオキソ二硫酸アンモニウム３ｍｇあるいは６ｍｇを加え、窒素雰囲気下５０℃で４時間撹拌した。続いて反応溶液を室温に戻し、ｐＨを４．０に調整した後、さらに２４時間撹拌した。次いで、０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）１ｍＬを加え、フィルターろ過（ポア径；０．４５μｍ）後、ろ液を限外濾過用遠心チューブＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ３０Ｋ Ｍｅｍｂｒａｎｅに付し、２，５００×ｇ、３０分間の遠心分離を繰り返すことにより精製した。精製溶媒は０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）、次いで水をそれぞれ５倍交換容量ずつ用いた。その後、精製サンプルを凍結乾燥によって得た。

結果
精製サンプルとして、無色個体の下記式１０で表されるアリルマンナン（以下、化合物２と記載）３０．８ｍｇ（Ａ−２）、２８．１ｍｇ（Ｂ−２）及び４３．１ｍｇ（Ｃ−２）を得た。図３は、得られた化合物２のＮＭＲスペクトルを示す。

マンノースのアノメリックプロトンシグナルの積分値から求めたシステイニル基の導入率を表２に示す。

表１のマンノース当たりのシステイニル基の導入率は、表1に示したマンノース当たりのアリル基の導入率に一致し、上記反応系によりシステインによるキレーターの結合反応が定量的に進むことが示された。

放射性金属標識化合物の合成
材料及び方法
［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺の製造方法
ボラノ炭酸ナトリウム（０．３ｍｇ）、四ホウ酸ナトリウム十水和物 （０．１９ｍｇ）、酒石酸ナトリウム（０．４８ｍｇ）、炭酸ナトリウム（５．７ｍｇ） を含む凍結乾燥キットを作製した。ジェネレータより溶出した^99mＴｃＯ₄ ^-の生理食塩水溶液（０．１ｍＬ）を加え１００℃、３０分間反応した。冷却後、１Ｎ塩酸水を用いてｐＨを７付近に調整した。

化合物３の合成
前記で調製した化合物２（Ａ−２、Ｂ−２及びＣ−２）を水に溶解し、［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺を等量加え、混和した。その後、任意の温度、時間でインキュベートして下記式１１で表される^99mＴｃ−ＭＳＣ（化合物３）を得た。本錯体合成における生成物の確認は逆相クロマトグラフィーにより行った。試料の分離はＳｈｏｄｅｘ Ｃ₁₈Ｍ ４Ｄ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ． ｘ １５０ｍｍ）カラムを用いて、流速１．０ｍＬ／分で行った。溶媒は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ₂Ｏ（Ａ相）と０．１％ ＴＦＡ／メタノール（Ｂ相）を用いて、０分から３０分までＡ相９５％、Ｂ相５％からＡ相０％、Ｂ相１００％まで変化させる直線グラジエント法により流速１．０ｍＬ／分で送液した。

ただし、Ｍは^99mＴｃを表す。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析は、前記Ａ−２の試料を^99mＴｃ標識し、以下に示す展開溶媒で、標識合成したサンプル、未反応の^99mＴｃＯ₄ ^-及び［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺を分離して、放射活性を測定した。展開溶媒Ａ：メチルエチルケトン（ＭＥＫ）の場合、^99mＴｃＯ₄ ^-は溶媒先端（Ｒ_f＝１）、サンプル及び［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺は原点（Ｒ_f＝０）に分離される。展開溶媒Ｂ：５％ ＨＣｌ ６Ｎ／メタノールの場合、^99mＴｃＯ₄ ^-及び［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺は溶媒先端（Ｒ_f＝１）、サンプルは原点（Ｒ_f＝０）に分離される。化合物３の比放射能は９２５ＧＢｑ（２５Ｃｉ）／μｍｏｌ、放射化学的純度は９５％以上であった。

放射標識マンナンの安定性評価
^99mＴｃ−ＭＳＣをヒスチジン最終濃度が８７０μＭ、システイン最終濃度が４９０μＭとなるようにＰＢＳで２０倍に希釈し、得られた溶液を３７℃で１、３、６時間インキュベーションした。それぞれの時間に存在する未変化体の割合をＴＬＣにより求めた。

^99mＴｃ−ＭＳＣの安定性の評価
ヒスチジン及びシステインは［^99mＴｃ（ＣＯ）₃（ＯＨ₂）₃］⁺と安定な錯体を形成する。そこで、血漿中濃度のヒスチジン及びシステイン存在下での^99mＴｃ標識ＭＳＣの安定性を検討した。すなわち、^99mＴｃ−ＭＳＣを血漿中濃度の１０倍量のヒスチジン（８７０μＭ）又はシステイン（４９０μＭ）を含むＰＢＳで２０倍に希釈し、得られた溶液を３７℃で１、３、６時間インキュベーションした。その後、未変化体の割合をＴＬＣを用いて算出した。

結果
^99mＴｃ−ＭＳＣは６時間後までヒスチジン存在下では９７．８％、システイン存在下では９５．５％以上が安定な化学形で存在することが明らかとなった。

ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
材料及び方法
ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングのため１ｘ１０^-7ＭのＭＳＣを含む^99mＴｃ−ＭＳＣ溶液（５０μＣｉ／２０μＬ）を調製した。６週齢ｄｄＹ系雄性マウスの左後脚足裏よりサンプル２０μＬを皮下投与し、３０秒間マッサージした。撮像の３０分前から動物用イソフルランによる吸入麻酔を行なった。ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置により、撮像の１５分前から、５穴多孔ピンホールコリメータを用いて、３６０度収集／６０フレーム／１フレーム３０秒の条件で３０分間撮像した。撮像は、^99mＴｃ−ＭＳＣ溶液投与１、３時間後に行った。

結果
結果を図４に示す。投与後１時間で、投与部位に残存する^99mＴｃ−ＭＳＣ溶液でマスキングされることなく、センチネルリンパ節に投与量の１４．９％との高い集積効率を認めた。

マウスｆｏｏｔｐａｄ投与時体内動態の検討
材料及び方法
１ｘ１０^-7ＭのＭＳＣを含む^99mＴｃ−ＭＳＣ溶液（０．８−６．４μＣｉ／２０μＬ）を、それぞれ一群４−７匹で、６週齢ｄｄＹ系雄性マウス (日本ＳＬＣ株式会社、静岡)の左後脚の足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）に２０μＬ皮下投与し、３０秒間マッサージした。投与１、３、６、２４時間後に、前記マウスは麻酔され、断頭により屠殺し、採血した。各臓器（肝、脾、腎、膵、心、肺、胃、腸、投与部位、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）である膝窩リンパ節、第２リンパ節（２ｎｄ ＬＮ）である鼠頸リンパ節、及び第３リンパ節（３ｒｄ ＬＮ）である腸骨リンパ節を摘出し、重量及び放射活性を測定した。リンパ節を可視的に同定するため、採血の１０から１５分前、２％パテントブルー水溶液２０μＬを同じ部位に投与し、３０秒間マッサージを行った。

結果
結果を図５に示す。投与後１、３、及び６時間のいずれにおいても、投与部位を除いて、センチネルリンパ節に最も高い比率で放射活性が集積し、その他第２リンパ節、第３リンパ節及び肝臓にわずかに放射活性を認めた。

総括
多糖にデキストランを、配位子にピラゾールジアミンを使用したマンノーシルデキストラン誘導体のテクネチウム−９９ｍ錯体を投与した場合の生体内分布の評価結果が報告されている。本報告では、投与後１時間と３時間の平均値は、各々、センチネルリンパ節：６．７１％、５．９８％、第２リンパ節：２．５９％、１．４１％、投与部位：８３．８５％、７９．５０％であった（Morais M, et al., Mol. Pharmaceutics, 8, 609, 2011）。また、このデキストラン誘導体でリンカーにシステインを使用したマンノーシル誘導体では、投与後１時間のセンチネルリンパ節への集積効率は、約８％と報告されている（Permettis I, et al、 Mol. Pharmaceutics 9, 1681-1692, 2012）。今回の実験で得られた結果より、本願発明のマンノースを母核とする多糖金属錯体化合物は、投与後、デキストラン誘導体と比較し、著明に高い割合でのセンチネルリンパ節への集積が示された。さらに、本結果により第２リンパ節への漏出が少なく、また、より長期間センチネルリンパ節に滞留し、より長期間の検出時間を確保できることが示された。

以上の結果より、マンナンを母核とし、^99mＴｃを放射性金属として配意した本発明の多糖金属錯体化合物が、２ステップの簡便な方法で製造され、投与部位にマスキングされることなく、センチネルリンパ節を検出又はイメージングできることが示された。

すなわち、センチネルリンパ節の検出や肝脾シンチグラフィーにおいて、本発明のマンノースを有する多糖類の放射性金属錯体化合物の使用により、センチネルリンパ節等の診断部位への放射能の集積性が向上する。その結果、標的臓器や組織に対して高感度で正確な検出が可能となり、診断精度が向上するのみならず、被験者への投与放射能量を低下させることも可能であり、被験者、その家族、及び、医療従事者の放射線被曝量の低減効果も可能である。

Claims (13)

1. マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、該配位子は放射性金属に配位し、下記式１で表されることを特徴とする、多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩。
   ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基、Ｍは金属を表し、
   ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
   ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
   ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
   γ＝４０ないし６１である。
   
2. 前記スペーサー基はｎ−プロピル基であり、下記式２で表されることを特徴とする、請求項１に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩。
   ただし、Ｍは金属、ｎ、α、β、γ、及びδは整数を表し、
   ｎ＝α＋β、β＝γ＋δであり、
   ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６、
   γ＝４０ないし６１である。
   
3. 前記多糖化合物はマンナンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩。
   
4. 前記金属は、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁵¹Ｃｒ、⁶²Ｃｕ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁴⁷Ｓｃ、⁹⁰Ｙ、⁸⁸Ｙ、⁸⁶Ｙ、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰³Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁰⁹Ｐｄ、¹¹¹Ｉｎ、^117mＳｎ、¹⁴¹Ｃｅ、¹⁴⁰Ｌａ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁵³Ｓｍ、¹⁶¹Ｔｂ、¹⁶⁵Ｄｙ、¹⁶⁶Ｄｙ、¹⁶⁶Ｈｏ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁶⁸Ｙｂ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹Ａｕ、²⁰³Ｐｂ、²¹¹Ｂｉ、²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²¹⁴Ｂｉ、及び²²⁵Ａｃからなる群から選択される１種類又は２種類以上の放射性金属であることを特徴とする、請求項１ないし３に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩。
   
5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物、又は塩を含有することを特徴とする、医薬組成物。
   
6. 前記医薬組成物は、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変を検出するために使用されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
   
7. 前記マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変は、センチネルリンパ節、肝臓、脾臓、血管内腔の不安定プラークからなる群から選択される１種類又は２種類以上であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
   
8. 前記医薬組成物は、センチネルリンパ節検出剤であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
   
9. マンノースを主成分とする多糖化合物にアルキル基をスペーサー基として結合し、さらに、該スペーサー基にＬ−システイニル基を配位子として結合し、下記式３で表されることを特徴とする、金属の担体化合物、その溶媒和物又は塩。
   ただし、ＲはＣ₁〜Ｃ₅の直鎖又は分岐していてもよいアルキル基を表し、
   ｎ、α、及びβは整数を表し、
   ｎ＝α＋βであり、
   ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６である。
   
10. 前記スペーサー基が、ｎ−プロピル基であり、下記式４で表されることを特徴とする、請求項９に記載の担体化合物、その溶媒和物又は塩。
    
    ただし、ｎ、α、及びβは整数を表し、
    ｎ＝α＋βであり、
    ｎ＝４００ないし６００、α＝３５６ないし５３４、β＝４４ないし６６である。
    
11. 請求項９又は１０に記載の担体化合物、その塩又は溶媒和物を含有することを特徴とする、医薬組成物。
    
12. 請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の多糖金属錯体化合物、その溶媒和物又は塩の、マンノース受容体を有する細胞が集簇及び／又は存在する臓器、組織及び／又は病変の検出剤としての使用。
    
13. 請求項９又は１０に記載の担体化合物、その溶媒和物又は塩の、センチネルリンパ節検出剤での金属担体としての使用。